DE2548427C2 - Einrichtung zur Verwendung bei der Festphasen-Immunanalyse einer Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Einrichtung zur Verwendung bei der Festphasen-Immunanalyse einer Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
6. Einrichtung gemäß Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet daß die Oberfläche eine Polystyroloberfläche
ist
7. Einrichtung gemäß einem der Ansprache 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-Antikörperreaktion die von Digoxin, Human-Wachstumshormon öder cyclischen! Adenosinmonophosphat und deren
8. Verfahren zur Herstellung einer Einrichtung gemäß Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein
Teil der inneren Oberfläche eines Untersuchungsröhrchens aus einem wasserunlöslichen undurchdringlichen
polymeren Material mit einer wäßrigen Lösung von Antikörpern .iur adsorptiven Bindung der Antikörper an
die Oberfläche in Kontakt gebracht, die Lösung anschließend abgesaugt und die Oberfläche gewaschen wird,
und daß danach eine wäßrige Lösung von markiertem Antigen eingeführt und mit der Oberfläche bei
niederen Temperaturen, nicht höher als etwa der Gefriertemperatur, in Kontakt gebracht und darauf das
Wasser durch Lyophilisieren entfernt wird.
Der Radioimmunoassay (Rl A) ist ein sehr empfindliches Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern, mit dessen Hilfe Mengen bis herab zu 10-l2 g bestimmt werden können.
Das Verfahren beruht auf der Konkurrenz zwischen radiomarkiertem und nicht markiertem Antigen für eine
fixierte und limitierte Menge Antikörper, wie dies von R. Yalow et al, in J. Clin. Invest, 39. 1157 (1960)
beschrieben wurde. Die Menge des nicht markierten Antigens beeinflußt die Verteilung des markierten Antigens
in Antikörper-gebundenem und Antikörper-freiem markierten Antigen. Je mehr nicht markiertes Antigen
vorhanden ist desto weniger markiertes Antigen erhält die Möglichkeit, sich mit Antikörpern zu verbinden.
Der Ausdruck »Antikörper« bezeichnet eine Gruppe von Serumproteinen, für die auch der Name ^-Globuline
oder Immunoglobuline verwendet wird, die mit einem Antigen oder Hapten spezifisch reagieren können. Die
meisten dieser Antikörper gehören zu der IgG-Klassc, während die anderen Klassen als IgA. IgM, IgD und IgE
bezeichnet werden. Die hier verwendete Bezeichnung umfaßt ebenso auch bestimmte Bindeproteine, die bestimmte Antigene kenntlich machen, beispielsweise Proteine für cyclisches AMP und für Cortison.
Unter der Bezeichnung »Antigen« wird hier eine Substanz verstanden, die mit einem Antikörper reagieren
kann. Antigene sind häufig dadurch gekennzeichnet, daß sie die Bildung eines Antikörpers induzieren und mit
diesem Antikörper reagieren. Im Falle von »Haptenen« ist es jedoch zur Einleitung der Antikörperbildung
notwendig, daß diese an einen Träger gekuppelt sind, wie beispielsweise an inerte adsorbierende Teilchen,
synthetische Peptide oder natürliche Proteinmoleküle. Materialien, die herkömmlicherweise als Träger verwen
det werden, sind beispielsweise Albumine (Human-, Rinder- oder Kaninchenalbumin), synthetische Peptide
(beispielsweise Polylysin), inerte adsorbierende Teilchen (beispielsweise mit Dextran beschichtete Aktivkohle)
und Polymerisate (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon). Jedoch können die Haptene auch ohne einen Träger mit
Antikörpern reagieren und in den mit Hilfe der erfindungsgemäßen Einrichtungen durchgeführten Nachweisverfahren der Antigen-Antikörper-Reaktionen entweder mit oder ohne Träger eingesetzt werden.
Ein wesentliches Erfordernis für schlüssige Ergebnisse des RIA-Verfahrens ist die Trennung des Antikörpergebundenen und Antikörper-freien Antigens. Durch die Entwicklung verschiedener Festphasen-Verfahren ist
eine schnelle und wirksame Trennung möglich. Bei dem Festphasentyp des Nachweisverfahrens ist der Antikörper oder das Antigen an ein Adsorbens gebunden oder fixiert, das die Abtrennung oder Ausfällung gebundener
oder freier Fraktionen erleichtert (vgl. beispielsweise die US-PS 36 46 346).
In der Veröffentlichung von K. Catt et al, Science, 158, 1570 (1967) werden mit Antikörper beschichtete
Röhrchen für ein Standard-RIA-Verfahren beschrieben, wobei die andere Phase als Probe in flüssiger Form
zugesetzt wird. Hierbei wird keine bevorzugte Bindung einer Phase zum Analysenröhrchen erwähnt, während
die andere Phase ungebunden und unmarkiert bleibt. Die US-PS 38 25 410 beschreibt ein Analysenverfahren, in
dem unter anderem zwar die Stabilisierung der Reaktanten durch Gefriertrocknung erwähnt wird, jedoch beide
Reaktanten gleich behandelt werden. Eine bevorzugte Bindung einer Phase zum Analysenröhrchen, während die
andere Phase ungebunden verbleibt, wird dort nicht beschrieben. In Spalte 1, Zeilen b6 bis 68 wird insbesondere
erwähnt, daß die Reaktanten während des Dispensierens vermischt werden. In einem allcrnaiiven Vorgehen
eemäß der Lehre dieser Patentschrift werden die Reaktanten in getrennten Kammern gehalten (Spalte 2, Zeilen
2 bis 4) und sind demzufolge nicht unmittelbar benachbart Aus K. E Kirkham, W. M. Hunter (Editors), Radioimmunoassay Methods, Edinburgh 1971, S. 405 bis 412 ist es bekannt daß an der festen Phase eine Komponente
adsorbiert ist und die markierte Komponente in flüssiger Form erst im Laufe des Analyseverfahrens hinzugefügt
wird.
Die Antikörper-Arbeitsweisen in fester Phase verwenden Antikörper, die an unlösliche Polymerisate kovalent
gebunden oder fixiert kovalent vernetzt oder physikalisch an ein Material, wie beispielsweise Kunststoffe, Glas
oder frisch gefällte Metalle adsorbiert sind. Zu unlöslichen Trägern oder lmmunoadsorbentien gehören Bentonitteilchen. Bromäthylcellulose, vernetzte Dextrane (Sephadex) und geperlte Agarose (Sepharose).
Obgleich in den Antikörpersystemen in fester Phase große Mengen an Antikörpern erforderlich sind, haben
sie jedoch gewisse Vorteile. Die Bindung des Antigens erfolgt schnell, ist im Prinzip nicht umkehrbar und die
zwei Phasen können durch einfaches Dekantieren oder durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit
voneinander getrennt werden. In vielen Fällen können Antikörperlösungen zur Adsorption wiederverwendet
werden.
Polymerisierte Antikörper, kovalent vernetzt mit Äthylchlorformiat oder Glutaraldehyd, ermöglichen ein
praktisches und genaues Verfahren für Analysen, jedoch ist ein Zentrifugieren mit hoher Geschwindigkeit zur
Ausfällung des Antigen-Antikörper-Komplexes erforderlich.
Das Antikörperverfahren in fester Phase durch Bindung-Adsorption umfaßt die Verwendung von Poly(tetrafluoräthylen-g-aminostyrolH»Protapol«)-Pulver, Poly(tetrafluoräthylen-g-isothiocyanatostyrol)-Pulver (»Protapol DI/1«) oder von mit Polypropylen beschichteten Scheiben und von Polypropylen oder Polystyrol-Kunststoffröhrchen. Die Herstellung von mit Antikörpern beschichteten Scheiben oder Röhrchen kann durch den
PH-Wert die Molarität die Temperatur und die Proteinkonzentration der Inkubationslösung beeinträchtigt
werden. Jedoch ermöglicht es diese Arbeitsweise, viele Bestimmungen rasch durchzuführen und sie ist sehr
empfindlich und leicht reproduzierbar.
Bei einem von T. Goodfriend et al, Immunochemistry, 6,484 (1969) beschriebenen modifizierten Festphasen-Verfahren wird ein Acrylamidgel verwendet das den Antikörper einzuschließen scheint, jedoch die Diffusion
von Antigenen mit niedrigem Molekulargewicht ermöglicht.
Obwohl der RIA für die klinische Praxis ein wertvolles Nachweisverfahren darstellt ist seine Verwendung
relativ eingeschränkt Ein möglicher Grund ist der, daß die Durchführung, besonders bei einer Nicht-Routine-Untersuchung, schwierig ist und daß die im Handel erhältlichen Einrichtungen häufig unzuverlässig und kompli-
ziert sind, eine schlechte Stabilität und kurze Lagerfähigkeit besitzen und zur Verwendung ein fachmännisch
ausgebildetes Personal erfordern.
Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Einrichtung zur Verwendung bei der Festphasen-Immunanalyse einer Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion, bestehend aus einem Aufnahmegefäß, das an mindestens einem Teil seiner inneren Oberfläche eine der beiden Reaktionskomponenten in fester
Form gebunden enthält, während die andere markierte Reaktionskomponente nicht an die Oberfläche gebunden
ist, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.
Diese Aufgabt wurde nun dadurch gelöst, daß die markierte Reaktionskomponente in fester, ungebundener
Form auf der inr'eren Oberfläche des Aufnahmegefäßes in dispergierter Form vorliegt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Ausnahmegefäß ein polymeres Kunststoffröhrchen mit einer relativ undurchdringlichen glatten Oberfläche.
Es wird ferner bevorzugt daß das Aufnahmegefäß eine inerte, feuchtigkeitsfreie Atmosphäre enthält und
hermetisch verschlossen ist
Eine ferner noch bevorzugte Einrichtung dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper an
die polymere Kunststoffoberfläche des Aufnahmegefäßes adsorbiert sind.
Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Einrichtungen sind solche, bei denen die innere Oberfläche eine
Polyolefinoberfläche, und besonders bevorzugt eine Polystyroloberfläche ist.
Es wird gemäß dieser Erfindung auch bevorzugt, daß sie für die Antigen-Antikörper-Reaktion von Digoxin,
Human-Wachstumshormon oder cyclischem Adenosinmonophosphat und deren Antikörpern eingesetzt wird.
Schließlich betrifft diese Erfindung noch ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Einrichtungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Teil der inneren Oberfläche eines Untersuchungsröhrchens aus
einem wasserunlöslichen undurchdringlichen polymeren Material mit einer wässerigen Lösung von Antikörpern
zur adsorptiven Bindung der Antikörper an die Oberfläche in Kontakt gebracht, die Lösung anschließend
abgesaugt und die Oberfläche gewaschen wird, und daß danach eine wässerige Lösung von markiertem Antigen
eingeführt und mit der Oberfläche bei niederen Temperaturen, nicht höher als etwa der Gefriertemperatur, in
Kontakt gebracht und darauf das Wasser durch Lyophilisieren entfern« wird.
Die Art der Markierung der nicht gebundenen Reaktionskomponente spielt für die Verwendung der Einrichtung keine Rolle und kann beispielsweise durch ein radioaktives Atom, ein Enzym oder eine fluoreszierende
Gruppe bewirkt sein. Aus Gründen der Vereinfachung wird die Erfindung jedoch nachstehend unter Verwendung von durch radioaktive Atome markierte Reaktionskomponenten beschrieben, ohne jedoch hierauf be-
schränkt zu sein.
Eine gemäß dieser Erfindung verwendete Einrichtung bei dem RIA in fester Phase hat gegenüber den bisher
eingesetzten Einrichtungen erhebliche Vorteile, die nachstehend angegeben sind:
(1) Der Laborant muß das radioaktive Material zum Vereinigen der Komponenten in dem Analysenverfahren
nicht mehr verdünnen oder pipetiieren, so daß sich eine erhöhte Sicherheit für das Personal ergibt;
(2) mit Ausnahme der dem Patienten entnommenen Probe braucht kein weiteres Material verdünnt oder
DiDcttiert werden, wodurch Irrtümer vermieden und die Untersuchungszeit verkürzt wird; und
(3) die Stabilität und Lagerfähigkeit der Einrichtung ist erhöht.
Die erfindungsgemäße Einrichtung ermöglicht daher wesentliche Einsparungen an Zeit für das Laborpersonal,
an Ausrüstungskosten für das Laboratorium und an Untersuchungskosten für den Patienten, wobei infolge
der Einfachheit der Methode die Gefahr von Verwechslungen stark eingeschränkt wird.
Mehr im einzelnen beschrieben betrifft die Erfindung eine Einrichtung zur Verwendung bei der Festphasen-Immunanalyse
einer Komponente der Antigen-Antikörper-Reaktion, bei der eine der Komponenten an eine
feste Oberfläche gebunden und eine der Komponenten markiert und in fester Phase an der Oberfläche, aber
nicht mit dieser, noch mit den anderen Komponenten, gebunden oder verbunden, dispergiert ist, d. h. ungebunden
vorhanden ist.
Die Lagerung der erfindungsgemäßen Einrichtung vor ihrer Verwendung geschieht zweckmäßig unter einer
inerten Atmosphäre, um eine gute Stabilität zu gewährleisten.
Bei der Durchführung einer Festphasen-Immunanalyse einer Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion
unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Einrichtung geht man so vor, daß man die innere Oberfläche
t5 der Einrichtung mit einer Lösung, welche die zu bestimmende Komponente enthält, in Kontakt bringt, die
Lösung von der Oberfläche abtrennt und die markierte Konponente an der Oberfläche oder in der Lösung mißt.
So wird beispielsweise für die Durchführung des RIA als erfindungsgemäße Einrichtung ein Reagenzröhrchcn
aus Kunststoff verwendet, bei dem an einem Teil seiner Innenoberfläche Antikörper adsorbiert sind und
radioaktiv markiertes Antigen in fester Form, das jedoch nicht mit der Oberfläche oder mit den Antikörpern
verbunden ist, vorhanden ist. Die Innenoberfläche wird mit einer, die zu bestimmende Komponente enthaltenden
Lösung unter Bildung eines Zweiphasensystems, das aus einer festen Phase (Reagenzröhrchcn und damit
verbundenes Material) und einer flüssigen Phase besteht, in Kontakt gebracht, die beiden Phasen voneinander
getrennt und die Strahlung von wenigstens einer dieser Phasen gemessen. Bei der üblichen Durchführung dieses
Verfahrens enthält die Probe Antigen, so daß die Menge der an den Feststoff gebundenen markierten Komponente
durch die Konkurrenzreaktion zwischen dem markierten Antigen und dem Antigen in der zu untersuchenden
Probe bestimmt wird.
Die erfindungsgemäße Einrichtung enthält somit eine gebundene Komponente und eine nicht gebundene
markierte Komponente in fester Form in unmittelbarer Nachbarschaft, wobei jedoch vor ihrer Verwendung
eine vorzeitige Reaktion zwischen den Komponenten vermieden werden muß. Bei der mit der erfindungsgemä-Ben
Einrichtung durchzuführenden Analyse ist es natürlich erforderlich, daß die Komponenten, d. h. ein gebundener
Antikörper und ein markiertes Antigen, miteinander reagieren können. Diese Bedingungen werden durch
die Einrichtung gemäß dieser Erfindung erfüllt. Die Tatsache, daß derartige Komponenten zusammen in einer
Einrichtung vorverpackt zur Verfügung stehen, ist von erheblichem Vorteil. Es ist daher zur Verwendung
lediglich erforderlich, die dem Patienten entnommene Probe mit der zu bestimmenden Komponente zuzugeben.
Nach einer geeigneten Inkubationszeit kann eine vollständige und schnelle Abtrennung der gebundenen Komponente,
sowohl der markierten als auch der nicht markierten, von der freien Komponente durch Dekantieren
und Waschen erzielt werden, so daß die Aktivität der festen Phase gemessen werden kann, wobei der Wert der
Aktivität eine Funktion der Konzentration der zur Bestimmung vorgesehenen Komponente in der Probe ist.
Es wurde gefunden, daß bei der erfindungsgemäßen Einrichtung eine übliche relativ glatte und undurchdringliehe feste Oberfläche, wie beispielsweise eine gepreßte Kunststoffoberfläche, wie sie in gewöhnlichen Reagenzröhrchen aus Kunststoff vorhanden ist, sehr gut geeignet ist, weil eine Flüssigkeit von einer solchen Oberfläche ohne Zentrifugieren, Absaugen oder ähnlichen Verfahren durch einfaches Dekantieren abgetrennt werden kann. Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Einrichtung entwickelte Verfahren ermöglicht es, die markierte Komponente in fester Form auf der Oberfläche anzubringen, ohne daß eine vorzeitige Reaktion eintritt Dies wird, bevor man den Kontakt mit der Lösung der markierten Komponente herstellt, durch Vorkühlen der Oberfläche auf niedrige, nahe dem Gefrierpunkt liegende Temperaturen und rasches Einfrieren der Lösung, wie beispielsweise durch schnelles Abkühlen auf Temperaturen von -50° C oder darunter, bewirkt. Sowohl die niedrige Temperatur als auch die rasche Umwandlung in die feste Form führen dazu, daß eine Reaktion vermieden wird. Nach dem Lyophilisieren ist die markierte Komponente als über die Oberfläche des Reagenzröhrchens dispergierter Feststoff vorhanden. Es kann zwar eine gewisse Anziehung zwischen der Oberfläche und der markierten Komponente vorliegen, jedoch ist die markierte Komponente dennoch ungebunden, weil sie mit Flüssigkeiten, wie z. B. Proben enthaltenden Lösungen leicht von der Oberfläche entfernt werden kann.
Es wurde gefunden, daß bei der erfindungsgemäßen Einrichtung eine übliche relativ glatte und undurchdringliehe feste Oberfläche, wie beispielsweise eine gepreßte Kunststoffoberfläche, wie sie in gewöhnlichen Reagenzröhrchen aus Kunststoff vorhanden ist, sehr gut geeignet ist, weil eine Flüssigkeit von einer solchen Oberfläche ohne Zentrifugieren, Absaugen oder ähnlichen Verfahren durch einfaches Dekantieren abgetrennt werden kann. Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Einrichtung entwickelte Verfahren ermöglicht es, die markierte Komponente in fester Form auf der Oberfläche anzubringen, ohne daß eine vorzeitige Reaktion eintritt Dies wird, bevor man den Kontakt mit der Lösung der markierten Komponente herstellt, durch Vorkühlen der Oberfläche auf niedrige, nahe dem Gefrierpunkt liegende Temperaturen und rasches Einfrieren der Lösung, wie beispielsweise durch schnelles Abkühlen auf Temperaturen von -50° C oder darunter, bewirkt. Sowohl die niedrige Temperatur als auch die rasche Umwandlung in die feste Form führen dazu, daß eine Reaktion vermieden wird. Nach dem Lyophilisieren ist die markierte Komponente als über die Oberfläche des Reagenzröhrchens dispergierter Feststoff vorhanden. Es kann zwar eine gewisse Anziehung zwischen der Oberfläche und der markierten Komponente vorliegen, jedoch ist die markierte Komponente dennoch ungebunden, weil sie mit Flüssigkeiten, wie z. B. Proben enthaltenden Lösungen leicht von der Oberfläche entfernt werden kann.
Die erfindungsgemäße Einrichtung ist besonders zur Bestimmung von jeder der beiden Komponenten der
Antigen-Antikörper-Reaktion geeignet Obwohl die Erfindung aus Zweckmäßigkeitsgründen in dieser Beschreibung
besonders im Hinblick auf die Bestimmung der Antigenkomponente erläutert wird, muß jedoch darauf
hingewiesen werden, daß die Einrichtung in analoger Weise für die Bestimmung von Antikörpern anwendbar ist.
Ebenso ist darauf hinzuweisen, daß an Stelle des als Beispiel beschriebenen Reagenzröhrchens Einrichtungen
verwendet werden können, die andere Formen besitzen, wie z. B. Schalen oder Küvetten.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer Einrichtung für die Verwendung
in dem RIA kann wie nachfolgend beschrieben vorgegangen werden.
Die innere Oberfläche eines Reagenzröhrchens aus einem Material, das geeignet ist Antikörper gegen das zu
bestimmende Antigen zu binden, wird mit einer verdünnten Lösung von Antikörpern (Antiserum) in Kontakt
gebracht Die Flüssigkeit wird dann durch Absaugen entfernt und die Röhrchen nacheinander mit einer verdünnten
Lösung, von Natriumbicarbonat-Puffer, einer verdünnten Lösung, die Natriumphosphai und eine geringe
Menge reines Protein enthält um die nicht spezifische Bindung des Antigens zu verringern, und schließlich mit
einer verdünnten Lösung von Natriumphosphat-Puffer gewaschen.
Unter der Bezeichnung »reines Protein« oder vereinfachend »Protein« sind hier Proteine und Polypeptide zu
verstehen, die frei von Verunreinigungen sind. Die Verwendung derartiger reiner Materialien verhindert das
Auftreten von bceinträchiigenden Faktoren.
Nach der Beendigung der Waschvorgänge werden die Röhrchen auf eine Temperatur zwischen etwa — 100C
und etwa 5"C gekühlt und hierzu eine verdünnte Lösung des radioaktiven Antigens gegeben. Der Inhalt wird bei
der Temperatur von festem Kohlendioxid (etwa — 78°C) sehr rasch, vorzugsweise innerhalb von 5 bis 15
Sekunden, gefroren. Die Lyophilisierung der Röhrchen während etwa 8 bis 16 Stunden beendet den Herstellungsablauf.
Die Röhrchen können in einer inerten und feuchtigkeitsfreien Atmosphäre, wie beispielsweise unter
Stickstoff, mehrere Monate oder länger ohne einen signifikanten Verlust ihrer Aktivität gelagert werden. Die
Temperatur, bei der die Röhren sicher gelagert werden können, liegt im Bereich von unterhalb O0C bis etwa
40° C oder sogar noch höher. Ein geeigneter Temperaturbereich liegt jedoch zwischen etwa 4° C bis etwa 25° C.
Die zur Verwendung in der RIA in fester Phase hergestellte Einrichtung gemäß dieser Erfindung ist, wie sich
aus dem Verlauf der Standardkurve bei Zeituntersuchungen, die dann abgebrochen wurden, ergibt, wenigstens
fünf Monate lang stabil. Die Neigung der Standardkurve nimmt zwar während der langzeitigen Lagerung ab,
jedoch niemals so stark, daß die Reagenzröhrchen nicht weiterhin für eine gute Analyse geeignet wären.
Beispielsweise wurde im Falle von Digoxin eine Standard-Serumreferenzprobe von 3,3 Nanogramm pro ml jede
Woche über zwei Monate lang untersucht. Der während dieser Zeil erreichte Durchschnittswert betrug 3,J
Nanogramm pro ml mit einer Standardabweichung von 0,3 und einem Schwankungskoeffizienten von 9,6%.
Natürlich müssen Toleranzen für den normalen radioaktiven Zerfall vorgesehen werden. Das Antigen kann in
herkömmlicher Weise mit irgendeinem Markierungsmaterial, das für Immunoanalysen geeignet ist, beispielsweise
mit radioaktiven Isotopen, Enzymen, fluoreszierenden Gruppen und Spin-Markierungsgruppen, markiert
werden. Zu den häufig für diesen Zweck verwendeten Isotopen gehören Jod-125 (J125), Jod-131 (J131), Kohlenstoff-14
(C14) und Wassersioff-3 (HJ), allgemein als Tritium bekannt. Für die radioaktive Isotopenmarkierung
besonders geeignet ist J125. Es hat eine Halbwertzeit von etwa 60 Tagen und reagiert leicht mit den meisten
Antigenen. Es hat weiterhin eine höhere spezifische Aktivität als H3, C14 oder J131. Weiterhin hat es eine
geringere Gammastrahlenenergie als J131 und das Fehlen von Betastrahlung verringert das Potential der Autodistinktion
des markierten Antigens.
In der nachstehenden Tabelle I sind einige Assays von nachgewiesenem klinischem Wert, die typisch für solche
Untersuchungen sind, für welche das Einstufensystem in fester Phase mit Einzelröhrchen gemäß der vorliegenden
Erfindung geeignet ist, angegeben.
Einige Analysen von nachgewiesenem klinischem Wert
Peptid- und Proteinhormone Hypophysenvorderlappen
Hypophysenhinterlappen Parathyroid Pankreas Placenta
Andere Andere Peptide und Proteine
Plasmaproteine Mikrobcnantigene Spezifische Tumorantigene
Haptenhormone
Thyroid Adrenal Gonadal
Weitere Haptene
Arzneimittel Andere
Luteinisierungshormon (LH); follikelanregendes Hormon (FSH);
Thyroidstimulierendes Hormon (TSH); Wachstumshormon (HGH);
Prolactin; Corticotrophin (ACTH);
Arginin-vasopressin (AVP);
Parathyroidhormon (PTH);
Insulin;
humanes placentares Lactogen(HPL);
humanes Choriongonadotropin (HCG);
Angiotensin I und 11; Renin; Gastrin.
lmmunoglobulin (IgE); Fibrinogen; andere Gerinnungsfaktoren;
mit Hepatitis in Verbindung stehende Antigene;
Ä-Fetoprotein;Carcinoembryoantigen.
mit Hepatitis in Verbindung stehende Antigene;
Ä-Fetoprotein;Carcinoembryoantigen.
Thyroxin (T4); Trijodthy romin (T3);
Cortison-deoxycorticosteron; Aldosteron;
Testosteron; Progesteron; verschiedene östrogene.
Cortison-deoxycorticosteron; Aldosteron;
Testosteron; Progesteron; verschiedene östrogene.
Digoxin; Morphin; Cannabis (Hanf); Diphenylhydantoin;
Folsäure; cyclisches Adenosinmonophosphat (C-AMP);
Vitamin B12; Vitamin D.
Folsäure; cyclisches Adenosinmonophosphat (C-AMP);
Vitamin B12; Vitamin D.
Bei der Verwendung der Einrichtungen geht man so vor, daß man die nicht markierten Antigenkomplexlösungen
und die Standard-Referenzprobenlösungen in die als Einrichtung verwendeten Reagenzröhrchen einfüllt, sie
die gewünschte Zeit bei der gewünschten Temperatur bebrütet, wäscht, die Lösungen entfernt und die Radioaktivität
der gebundenen markierten Antigenprobe in einem analytischen Gammaspektrometer zählt Wahlweise
wird die Aktivität der Lösung gezählt Die Zahl der Zählimpulse pro Zeit der Standardröhrchen wird in Prozent
gebundenes (%B) Antigen-J125, bezogen auf die Gesamtmenge des den Röhrchen zugeführten Antigen-)125,
umgerechnet. Die erhaltenen Prozentsätze werden zur Herstellung der Standardkurve aufgetragen, wie dies in
den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt ist. Aus der Standardkurve kann die Antigenkonzentration in der unbekannten
Probe leicht durch direkten Vergleich bestimmt werden.
In den anliegenden Zeichnungen stellen die F i g. 1 bis 3 Standardkurven dar, die durch Messen von Standardkonzentrationen bestimmter Antigene unter Verwendung der erfindungsgemäßen Einrichtungen bestimmt
wurden, in den F i g. 4 und 5 wird eine Einrichtung gemäß dieser Erfindung erläutert.
F i g. 1 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält, daß man den Prozentsatz gebundenes Digoxii>-j: ■"'
entlang der Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration von Digoxin in Nanogranim pro ml entlang der
tο Abszisse aufträgt (vgl. nachfolgendes Beispiel 1);
Fig.2 zeigt eine Standardkurve, die man dadurch erhält, daß man den Prozentsatz gebundenes (cyclisches
Adenosinmonophosphat)-]125 [(C-AMP)-J"5] entlang der Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration
von C-AMP in Picomol pro ml entlang der Abszisse aufträgt (siehe nachfolgendes Beispiel 2): und
wachstumshormon)-]t25 [(HGH)-J125] entlang der Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration von
HGH in Nanogramm pro ml entlang der Abszisse aufträgt (siehe Beispiel 3).
Im allgemeinen beruht die Einrichtung der vorliegenden Erfindung auf der Konkurrenz zwischen einer
markierten Komponente und einer Komponente der Probe, die durch eine Komponente gebunden werden soll,
die mit der festen Oberfläche verbunden ist. Daher ist die gebundene Komponente in einer zur Bindung der
Probenkomponente und der markierten Komponente nicht ausreichenden Menge vorhanden. Die geeigneten
Mengen der Komponenten für ein solches Verhältnis können leicht durch Annäherungsverfahren bestimmt
werden. Für eine zweckmäßige Ablesung ist besonders bei J125 eine Strahlung mit einer Zählrate im Bereich von
2000 bis 60 000 Impulsen pro Minute (I/min) geeignet. Die Menge der markierten Komponente von 10 000 I/min
bei Beginn der Untersuchung sorgt für eine geeignete Flexibilität, und es wird oftmals erwünscht sein, viel
höhere Mengen zu verwenden, um Einrichtungen herzustellen, die den radioaktiven ZerfaM während einer
längeren Lagerzeit erlauben. Die radioaktiv markierte Komponente in Lösung kann so stark verdünnt werden,
daß etwa 0,1 ml die geeignete Menge für die gewünschte Zählrate I/min enthält, und diese 0.1 ml können dann ■·;
die erfindungsgemäße Einrichtung, z. B. in das Reagenzröhrchen, zum Zwecke der Beschichtung eingebracht
werden. Die Menge der gebundenen Komponente in dem Reagenzröhrchen kann so eingestellt werden, daß ein
wesentlicher Anteil der markierten Komponente, etwa 40 bis 60%, gebunden werden kann, wenngleich auch
andere Mengen, wie z. B. von 20 bis 80%, oder sogar noch breitere Bereiche, angewandt werden können. Eine
Menge, die etwa 50% der markierten Komponente bindet, ermöglicht es, das Assay-Verfahren flexibel durchzuführen. Beispielsweise ist für Digoxinbestimmungen etwa 1 Picogramm in dem Reagenzröhrchen gebundener
Digoxin-Antikörper eine zweckmäßige Menge. Das Assay-Verfahren wird dann gewöhnlich für die Untersu
chung von Proben verwendet, die Konzentrationen der unbekannten Komponente enthalten, so daß man
Prozentsätze der gebundenen markierten Komponente im Bereich von 10 bis 20 und bis zu 50%. oder etwa in
diesem Bereich liegende Prozentwerte erhält, in Abhängigkeit von der besonderen unbekannten Komponente
und der Breite des Bereichs, in dem sie gewöhnlich in der biologischen oder einer anderen zu untersuchenden
Flüssigkeit auftritt Falls gewünscht, kann die zu untersuchende Flüssigkeit verdünnt oder konzentriert werden,
um die Konzentration für eine geeignete Bestimmung einzustellen. Jedoch liegt beispielsweise der normale
toxische Bereich von 2,4 bis 8,5 Nanogramm pro ml, so daß ein wirksamer Assay-Bereich von 0.2 bis 10
ten eingesetzt werden, wobei es erwünscht ist, Standardverfahren für die Aufbereitungen zu verwenden, um
Assay-Ergebnisse zu erhalten, die sich zu Vergleichszwecken mit Standards eignen, wie dies dem Fachmann
bekannt ist Nachdem daher geeignete Mengt-n bestimmt worden sind, sollten die gleichen bestimmten Mengen
für einen jeweiligen Satz von als erfindungsgemäße Einrichtungen verwendeten Reagenzröhrchen vorgesehen
werden. Solche Aufbereitungen können nach den hier erläuterten Verfahren hergestellt werden. Es ist nicht
erforderlich, die Mengen numerisch, wie beispielsweise durch Analyse, zu bestimmen, da solche Mengen unter
Verwendung besonderer Aufbereitungsverfahren festgelegt werden können. Beispielsweise können geeignet
identische Mengen an Antikörpern in einem Satz von Reagenzröhrchen dadurch erhalten werden, daß man die
gleiche Meng; verdünntes Antikörperserum einführt eine Standardzeit bebrütet absaugt und wäscht Das
Absaugen des Serums läßt einen Film zurück und die Menge der auf dieser Weise adsorbierten Antikörper ist
gewöhnlich so gering, daß ein Antikörperserum von ausreichender Konzentration so angewandt werden kann,
daß es möglich ist das abgesaugte Serum zur Beschichtung weiterer Reagenzröhrchen zu verwenden. Die
markierte Komponente wird, falls man sie in einer geringen Menge Flüssigkeit zuführt gewöhnlich so eingebracht, daß sie auf den Teil des Reagenzröhrchens beschränkt wird, der vorher mit Antikörpern beschichtet
wurde. Die markierte Komponente kann jedoch auch an einem anderen Teii des Reagenzröhrchens oder an
irgendeiner anderen Oberfläche anwesend sein, solange sie für den Kontakt mit der Probenlösung zur Verfügung steht, wenn diese in das Reagenzröhrchen eingeführt wird.
In den hier beschriebenen Verfahren werden puffernde Proteinbeschichtungslösungen und andere dem Fachmann bekannte Hilfsmittel verwendet wobei deren Definition in dieser Hinsicht für die Erfindung nicht wesentlich ist Geeignete puffernde und ähnliche Lösungen werden sich, wie dies dem Fachmann bekannt ist mit dem
jeweiligen Antikörper-Antigen-System ändern. Der Zweck der Verwendung von Proteinbeschichtungen. wie
beispielsweise von Serumalbumin, ist der, die nicht-spezifische Bindung von ungebundenen Komponenten
während des Assays zu beschränken, wobei jedoch dieses individuelle Merkmal dem Fachmann bekannt ist.
Darüber hinaus können jedoch Toleranzen für nicht-spezifische Bindungen beim Eichen der Assays vorgesehen
werden. Außerdem haben einige Komponenten, wie beispielsweise Digoxin, nur eine sehr geringe Tendenz an
Kunstsioffflächen adsorbiert zu werden und es bringt daher in solchen Fällen die Verwendung von Beschichtungen zum Vermeiden nicht-spezifischer Bindungen nur wenig Nutzen. Protein oder andere eingesetzte maskierende Beschichtungen können die in Belrachl kommenden Oberflächen im wesentlichen abdecken, jedoch ist
dies nicht wesentlich, da nur die nicht-spezifische Bindung verringert werden soll und es nicht notwendig ist, sie
vollkommen zu eliminieren. Darüber hinaus ist, wenn hier in allgemeiner Weise Materialien angesprochen
werden, die mit Oberflächen von Reagenzröhrchen oder anderen Substraten verbunden sind ober mit diesen in
Kontakt stehen, dies so zu verstehen, daß intermediäre Schichten oder Teile derselben, oder Teilchen zwischen
der Oberfläche und den in Betracht kommenden Materialien vorliegen können und es wird eine blanke Oberfläche oder eine solche, die verschiedene Schichten enthält, hier in gleicher Weise noch als Oberfläche bezeichnet.
Die hier verwendeten Puffer, Waschlösungen usw. werden als biologisch geeignete Träger und dergleichen
verwendet, welche die Wirksamkeit und die Eigenschaften der in Betracht kommenden Komponenten erhalten.
In ähnlicher Weise sind häufig pharmazeutisch verträgliche Träger und schwach basische Puffer für die hier
vorgesehenen Zwecke im allgemeinen geeignet.
Die Einführung der markierten Komponente in die Einrichtung der vorliegenden Erfindung erfolgt im allge- is
meinen durch das hier beschriebene, rasche Gefrier- und Lyophilisierungsverfahren. Es ist dies ein sehr geeignetes Verfahren, die markierte Komponente einzuführen, ohne daß eine Reaktion derselben erfolgt. Jedoch
können auch andere Verfahren angewandt werden, sofern diese sicherstellen, daß die markierte Komponente in
fester ungebundener und nicht reagierter Form vorliegt. Theoretisch könnte die Komponente als festes Pulver
zugegeben werden, jedoch wäre dies nicht praktisch, weil hinsichtlich des Messens der sehr geringen Mengen
Probleme eintreten wurden. Weiterhin kann die markierte Komponente gelöst in einem niedrig siedenden
Lösungsmittel, das dann schnell verdampft wird, eingeführt werden. In Abhängigkeit von der Aktivität der
jeweiligen Antikörper-Antigen-Reaktion kann die Verdampfung rasch genug erfolgen, um eine wesentliche
Reaktion zu vermeiden. Zur Unterstützung der Verdampfung kann zweckmäßigerweise im Vakuum gearbeitet
werden. Als Lösungsmittel können in solchen Verfahren Alkohole dienen, vorausgesetzt, daß die Löslichkeit
ausreichend ist und keine Denaturierung erfolgt. Im allgemeinen können niedrig siedende Lösungsmittel, welche
die markierte Komponente ohne Änderung ihrer Eigenschaften lösen, eingesetzt werden. Jedoch ist es gewöhnlich zweckmäßiger und zufriedenstellender. Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren, wie hier beschrieben,
anzuwenden.
Es wurde gefunden, daß die hier beschriebenen Einrichtungen, bei denen sowohl Antikörper als auch Antigen
in festem Zustand anwesend sind und eines von diesen markiert ist, nicht nur zur Verwendung und Vorausaufbereitung geeignet und fähig sind, sondern auch erstaunlicherweise bei einer Lagerung über längere Zeiträume
eine gute Stabilität aufweisen. Es ist möglich, diese Einrichtungen bis zu drei oder sechs Monate oder noch langer
in einer inerten Atmosphäre, zum Beispiel unter Stickstoff, in Abwesenheit von Feuchtigkeit zu lagern. Es wurde
weiterhin gefunden, daß für eine solche Stabilität niedrige Temperaturen nicht erforderlich sind, da auch
Temperaturen von 25°C und 37°C zur Lagerung als geeignet befunden wurden. Es ist daher möglich, die
Einrichtungen der vorliegenden Erfindung vakuumverpackt oder hermetisch verschlossen in ungekühlten Pakkungen zu versenden, ohne daß ihre Wirksamkeit trotz möglicherweise langer Beförderungslaufzeiten abnimmt
Als Vorsichtsmaßnahme kann es erwünscht sein, die Einrichtungen gekühlt, gegebenenfalls nahe des Gefrierpunkts oder von etwa 4°C zu halten, jedoch ist die Stabilität bei gewöhnlichen Temperaturen insofern noch
vorteilhaft, da die erfindungsgemäßen Einrichtungen vor der Verwendung möglicherweise solchen Temperaturen ausgesetzt sein können, oder wegen des wirtschaftlichen Vorteils, daß sie ohne Kühlung zum Versand
gebracht werden können. Die Reagenzröhrchen können einzeln unter Vakuum oder Stickstoff verschlossen
werden, wozu man übliche Abdicht- und/oder Verschlußvorrichtungen verwendet, um den Inhalt gegenüber der
Atmosphäre zu schützen. Die einzelnen Reagenzröhrchen können dann in geeigneter Weise in einem geschlossenen Behälter verpackt werden, der zusätzlich noch Antigen- oder Antikörper-Standardlösungen und Anweisungen zur Verwendung enthalten kann. Zum hermetischen Verschließen der Reagenzröhrchen können beispielsweise Gummistopfen oder ähnliche Verschlußmittel verwendet werden. Ein zweckmäßiges Verschlußmittel ist ein geschlitzter Gummistopfen, der so in das Reagenzröhrchen eingesetzt werden kann, daß der Schlitz
oder die Schlitze den Zugang zum Inneren ermöglichen. Ein Satz von Reagenzröhrchen, die solche Stopfen
aufweisen, kann in Behältern unter Stickstoff angeordnet werden, wobei dann eine Druckleiste die Stopfen
vollständig unter Bildung eines hermetischen Verschlusses abdichtet und der Behälter kann weiterhin noch unter
Stickstoff verschlossen werden.
Der größte Teil dieser Beschreibung betrifft eine Eirnichtung, bei welcher der Antikörper an eine unlösliche
Oberfläche gebunden, das Antigen markiert ist und die Antigenmenge in einer unbekannten Probe bestimmt
wird. Die Erfindung betrifft jedoch ebenso auch Einrichtungen für andere Bestimmungen, beispielsweise für
solche, bei denen Antigen an eine Oberfläche gebunden und markierte Antikörper in fester Form, aber ungebunden, vorliegen, sowie die Verwendung derartiger Vorrichtungen zur Bestimmung von Antikörpern in einer
Probe. Beispielsweise kann Human-Wachstumshormon (HGH) als Schicht auf ein Polystyrol-Reagenzröhrchen
aus einer Lösung nach den hier beschriebenen Verfahren zur Beschichtung mit Antikörpern aufgetragen werden
und Antikörper, die man aus HGH-Antiserum erhalten hat, können mit radioaktivem Jod markiert und in das
Reagenzröhrchen nach dem oben beschriebenen Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren eingebracht
werden. Das Reagenzröhrchen wird dann das HGH an die innere Oberfläche gebunden und die festen markierten Antikörper ungebunden enthalten.
Die Einrichtung der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen angewandt, um die markierte Komponente es
der Antigen-Antikörper-Reaktion zu bestimmen, sie kann aber auch zur Bestimmung der anderen Komponente
eingesetzt werden. Beispielsweise kann bei gebundenem Antikörper und markiertem Antigen eine Probe mit
unbekanntem Antikörper eingeführt werden. Das markierte Antigen wird sich dann als solches über den
gebundenen Antikörper und den freien Antikörper verteilen und es können dann die festen und flüssigen Phasen
getrennt und die Markierung von wenigstens einer derselben gemessen werden. Bei diesem Verfahren werden
sich die Konzentrationen insoweit unterscheiden, als die Menge an markiertem Antigen nicht ausreichend sein
sollte, um mit dem gesamten Antikörper zu reagierea Wenn die Einrichtung so hergestellt wurde, daß der
was erreicht werden solL
!0 tung dafür eingesetzt werden, Antigen in einer Probe unter Verteilung des markierten Antikörpers selbst
zwischen gebundenem Antigen und freiem Antigen zu bestimmen, wobei die oben beschriebenen Trenn- und
um mit dem gesamten Antigen, das in gebundener und freier Form vorliegt, zu reagieren.
gebundene Komponente mit der gleichen markierten, aber ungebundenen Komponente kombiniert wird mit
dem Ziel, die entgegengesetzte Komponente in einer Probe zu messen. Beispielsweise kann auf die innere
Oberfläche eines Reagenzröhrchens Antikörper als Schicht aufgebracht und der gleiche radioaktiv markierte
Antikörper dann durch Schnellgefrier- und Lyophilisierungsverfahren. wie hier beschrieben, zugegeben werden.
Dann kann eine Serumprobe, die das entsprechende Antigen enthält eingebracht werden und das Antigen wird
dann sowohl mit dem gebundenen Antikörper, als auch mit dem markierten Antikörper reagieren, wodurch ein
Teil des markierten Antikörpers durch indirekte Bindung desselben an die Oberfläche des Reagenzröhrchens
immobilisiert und dadurch die übliche Abtrennung der festen und flüssigen Phase und die Bestimmung des
markierten Antikörpers in einer oder in beiden Phasen ermöglicht wird. Dieses unter Verwendung der erfindungsgemäßen Einrichtung durchgeführte Verfahren kann besonders dann brauchbar sein, wenn ein Antigen
nicht in einfacher Weise isoliert und radioaktiv markiert werden kann. E findet Verwendung bei der Bestimmung solcher Antigene, wie dem Hepatitis-Antigen, usw. In ähnlicher Weise kann dieses Verfahren mit gebundenem Antigen und freiem markiertem Antigen angewandt werden, um die Antigenmenge in einer Probe zu
messen. Bei solchen Verfahren sollten sowohl die gebundenen als auch die markierten Komponenten der
Einrichtung gegenüber den Mengen im Überschuß vorhanden sein, die zur Umsetzung mit der Komponente in
der Probe erforderlich sind.
Für die Aufbereitungen und Assays ist es zweckmäßig, wässerige Medien, welche die angegebenen Komponenten enthalten, zu verwenden, und zwar aus Löslichkeitserwägungen und im Hinblick auf die Tatsache, daß
biologische Probenflüssigkeiten und dergleichen im allgemeinen wässeriger Natur sind. Es können jedoch auch
andere Flüssigkeiten verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Komponenten darin löslich sind und sie nicht mit
den Komponenten reagieren oder sie beeinflussen.
Gemäß dieser Erfindung ist eine der Komponenten der Antigen-Antikörpcr-Reaktion an die Oberfläche eines
unlöslichen Feststoffs gebunden, der gewöhnlich ein wasserunlöslicher Feststoff ist, sofern im allgemeinen
wässerige Medien verwendet werden. Die Bindung kann chemischer, physikalisch-chemischer oder physikalischer Art sein und sie kann mittels kovalenter chemischer Bindungen oder durch Adsorption erfolgen. Es kann
jedes unlösliche feste Material, das für eine solche Bindung geeignet ist, eingesetzt werden, wie beispielsweise
Oberflächen von frisch abgeschiedenen Metallen, wie Chrom und Tantal, von Glas und polymeren Kunststoffen,
eingeschlossen Kohlenwasserstoffpolymerisate und Polyolefine, wie Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen und
von solchen Polymerisaten, wie Nitrocellulose, Copolymeren von Acrylnitril mit Styrol, wie Poly(styrol-co-acrylnitril), Polytetrafluorethylen), Pcly^tetrafluoräthylenJ-Styrol, Polytetrafluorethylen)-lsothiocyanatostyrol, usw.
Es wurde festgestellt, daß einfache polymere Kunststoffröhrchen, wie Polystyrolröhrchen, eine ausreichende
Bindung ermöglichen und andere Kunststoffe in ähnlicher Weise Antikörper adsorbieren, so daß rs im allgemeinen nicht erforderlich ist, Materialien mit reaktionsfähigen Gruppen zu verwenden, wie beispielsweise die
-NCS-Gruppen an Isothiocyanat-Styrol-gepfropftem Polytetrafluorethylen, wobei jedoch derartige Materialien
mit reaktionsfähigen Gruppen, falls gewünscht, verwendet werden können. Metalle liefern schlechte Ergebnisse,
so wenn die Oberfläche mit einem Oxidfilm bedeckt ist. Glasmaterialien können eine Spczialbehandlung oder
Selektion, wie bei Verwendung von Quarzglas, oder die Verwendung von Kupplungsmitteln oder dergleichen,
erforderlich machen, um eine geeignete Bindung zu erzielen.
Die gemäß dieser Erfindung für den RIA hergestellte Festphasen-Einrichtung kann so modifiziert werden, daß
ein vollständig automatisches Modell vorliegt. Beispielsweise kann anstelle der einzelnen Reagenzröhrchen ein
kontinuierliches Kunststoffband zur Aufnahme der Assay-Reagentien in eingepreßten Flecken auf dem Band
verwendet werden, wobei die Proben und Standardlösungen automatisch auf das Band aufgetragen und dieses
durch eine Bebrütungs-, Wasch- und Zählvorrichtung mit automatischem Ausdrucken der Ergebnisse geführt
wird.
den RIA in fester Phase ausgebildeten Einrichtung.
Beispiel 1
Einrichtung für den RIA in fester Phase für Digoxin
Verwendet wurde Digoxin-Antiserum von dem Collaborative Research, Wallham Massachusetts; jodiertes
Digoxinderivat von Schwartz-Mann, Orangeburg, New lersey; und Pol>
,tyrol-Reagenzröhrchen (#2052) von Falcon Plastics, Los Angeles, Californien.
Ein kleiner Teil der Innenseite der Polystyrol-Reagenzröhrchen vnrde durch Einbringen von 200 Mikroliter
Digoxin-Antiserum (Verdünnung 1 :5000 mit einer O.OSmolaren Lösung von Natriumbicarbonat; pH-Wert -9.6)
am Boden beschichtet und 1 bis 3 Stunden lang bei einer Temperatur zwischen etwa 200C und etwa 300C
bebrütet Nach Absaugen der Flüssigkeit wurden die Reagenzröhrchen nacheinander mit Bicarbonat-Puffer,
einem 0,05molaren Natriumphosphat, einer 0,02molaren Lösung von Dinatriumsalz der Äthylendiamintetracssigsäure (Na2EDTA-LoSUPg), die zur Verringerung der nicht spezifischen Bindung des Antigens 1% Rinderserumalbumin enthielt, und schlieBlich mit einem 0,05molaren Natriumphosphat-Puffer allein gewaschen. Das
jodierte Digoxinderivat wurde im Verhältnis von 1 :5 mit Phosphat-Puffer verdünnt und in die Reagenzröhrchen 100 Mikroliter (7200 i/min) davon eingebracht, wobei die Röhrchen vorher in einem Eisbad auf etwa 00C
abgekühlt worden waren. Der Inhalt wurde sofort (innerhalb von 5 bis 15 Sekunden) in festem Kohlendioxid
gefroren. Die Reagenzröhrchen wurden 8 bis 16 Stunden lang lyophilisiert und schlieBlich unter Ausschluß von
Luft und Wasser über Phosphorpentoxid und unter Stickstoff in kleinen Exsikkatoren gelagert, und zwar sin
Satz bei 4° C und ein weiterer Satz bei 25° C. Keiner der beiden gelagerten Sitze hatte nach einer Lagerzeit von
acht Wochen einen bemerkenswerten Verlust an Brauchbarkeit, wie dies durch den Verlauf der Standardkurve
und der Reproduzierbarkeit einer Vergleichsprobe wahrend dieser Dauer festgestellt wurde.
Zum Zeitpunkt der Verwendung wurden die Reagenzröhrchen soweit erforderlich auf Raumtemperatur
gebracht Standard-Digoxinproben (nicht markiert) und Standard-Referenzproben, die 33 Nanogramm Digoxin
pro ml enthielten, wurden in die Reagenzröhrchen eingebracht, diese dann bei etwa 25° C etwa eine Stunde lang
bebrütet mit Phosphat-Puffer gewaschen und schließlich mittels eines analytischen Gammaspektrotneters die
impulse gezählt
Die anliegende F i g. 1 der Zeichnung zeigt eine Standardkurve, die unmittelbar nach dem Trocknen der
Reagenzröhrchen auf der Lyophilisiervorrichtung erhalten wurde. Die Anzahl der Impulse pro Zeit der Standardröhrchen wurde bestimmt und in Prozent gebundenes (%B) Digoxin-J1", bezogen auf die Gesamtmenge
Digoxin-J125,die in die Einrichtung eingebracht worden war, umgerechnet. Die erhaltenen Prozentsätze wurden
auf der Ordinate gegen den Logarithmus der Konzentration von Digoxin in Standardlösungen auf der Abszisse
aufgetragen. Aus dieser Standardkurve kann die Konzentration von Digoxin in einer unbekannten Probe leicht
bestimmt werden.
Eine 3,3 ng/ml Probe Digoxin wurde wöchentlich acht Wochen lang analysiert. Der Durchschnitt der bestimmten Werte war 3,1 ng/ml bei einer Standardabweichung von 0,3.
30 Beispiel 2
Sowohl das c-AMP-Antiserum als auch das jodierte c-AMP wurden von der Biotek Co, St. Louis, Missouri,
bezogen.
Es wurden die gleichen Verfahren und Bedingungen wie im Beispiel 1 angewandt, mit der Ausnahme, daß als
Assay-Puffer 0.02molares Natriumacetat mit einem pH-Wert von 6,4 verwendet wurde. Das System wurde drei
Monate lang ohne einen wesentlichen Verlust an Brauchbarkeit gelagert. Eine auf 1 :100 verdünnte Urinprobe
wurde wöchentlich während eines Zeitraums von 10 Wochen untersucht. Der Mittelwert war 7,26 ng/ml mit
einem Standardfehler von 0,43.
Die in F i g. 2 gezeigte Standardkurve wurde in der gleichen Weise wie die Kurve der F i g. 1 erhalten, mit der
Ausnahme, daß die Konzentration von c-AMP auf der Abszisse in Picomol pro ml angegeben ist.
Das HGH-Antiserum wurde von Biotek Co., St. Louis, Missouri, erhalten. Die Jodierung von HGH wurde
nach Standardverfahren durchgeführt [vgl. beispielsweise W. M. Hunter und F. C. Greenwood, Nature, 194,495
(1962)}
Die Einrichtung für HGH wurde gemäß dem Verfahren und bei den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1
hergestellt und fünf Monate lang ohne einen signifikanten Verlust an Brauchbarkeit gelagert. F i g. 3 zeigt eine
Standardkurve, die in Analogie zu F i g. 1 erhalten wurde. Eine einzelne Humanserumprobe wurde wöchentlich 8
Wochen lang analysiert. Der Durchschnittswert betrug 2,24 mit einem Standardfehler von 0,14.
Geschmolzene Quarzstäbchen (1 χ 20 mm) wurden in heißer 50%iger Salpetersäure zwei Stunden lang gereinigt. Die überschüssige Säure wurde mit entionisiertem Wasser abgewaschen und die Stäbchen an der Luft
getrock ct. Jedes Stäbchen wurde in ein Reagenzglas mit den Abmessungen von 6 χ 50 mm eingebracht, wozu
man in einem Verhältnis von 1 :500 mit 0,05molarem Natriumbicarbonat (pH-Wert = 9,6) verdünntes Antihuman-Wachstumshormonserum zur Abdeckung der Stäbchen gab. Die Inkubation wurde zwei Stunden lang bei
25° C durchgeführt. Das Antiserum wurde dann abgesaugt und die Stäbchen gründlich mit Bicarbonat-Puffer
gewaschen und wie im Beispiel 1 mit Rinderserumalbumin beschichtet. Der weitere Assay erfolgte wie im
Beispiel 3 unter Verwendung von Polystyrol-Reagenzröhrchen. Das Quarzstäbchen wurde zusammen mit
jodiertem HGH in das Reagenzröhrchen gegeben und der HGH-Gehalt in den Proben und Standardldsungen
geipsssen. Man erhielt eine geeignete Standardkurve aus der graphischen Darstellung von Prozent gebundenes
markiertes Wuchshormon gegen den Logarithmus der Konzentration der Wuchshormon-Standardlösungen.
Während aus ZweckmiBigkeitsgrflnden in diesem Falle ein Quarzstab verwendet wurde, können Qüarzstäbe
ebenso auch zum Binden der Antikörper verwendet und das markierte Antigen dann in das Reagenzröhrchen in
fester Form durch die Beschichtungs- und Lyophilisierungsverfahren, wie sie hier beschrieben wurden, eingebracht werden. Die Reagenzröhrchen können anschließend gelagert und für die wie hier beschriebenen Analysen verwendet werden.
ίο Beispiel 5
pH-Wert—9,6) wurde in den Boden eines Polystyrolkonststoffröhrchens mit den Abmessungen von 12 χ 75 mm
einpipettiert Den Antikörper KeB man an der Oberflache des Reagenzröhrchens etwa zwei Stunden lang bei
24° C adsorbieren. Radiojodiertes (J125) gereinigtes Anti-Humanwuchshormon (100 μΙ, 10 800 l/min) wurde in
den unteren Teil des Reagenzrfthrchens bei 00C einpipettiert, sofort bei -70°C gefroren und lyophilisiert. Die
Röhrchen waren dann für den Assay von Humanwachstumshormon in Humauserum geeignet.
Zu diesen Röhrchen gab man dann Humanwachstumshormon-Standardlösungen, die Humanserum mit 100.10
und I ng enthielten. Man ließ die Antigen-Antikörper-Reaktion 18 Stunden lang bei 24"C ablaufen. Die Reagenzröhrchen wurden dreimal mit Wasser gewaschen und in einem Gammaspektrometer gezählt Es wurde eine
geeignete Sundardkurve hergestellt. Die Hormonkonzentration ist eine logarithmische Funktion des in den
Reagenzröhrchen gebundenen radiojodierten Hormons.
Ein Aufnahmegefäß, wie es in der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung verwendet wird, ist in F i g. 4
abgebildet Es wird das Aufnahmegefäß, das hier ein Röhrchen ist, gezeigt, wie es vorliegt bevor man die Probe
zugibt, wobei es den Antikörper und das markierte Antigen in festem Zustand enthält. Das Röhrchen 1 hat
Wandungen 2 und weist einen Stopfen 3 und eine Reaktionszone 4 auf. Falls gewünscht, kann der Stopfen, wie
hier beschrieben, geschlitzt sein (nicht erläutert). Die Reaktionszone wird in vergrößertem Maßstab in F i g. 5
erläutert, wobei die Kreise 5 Antikörper darstellen, die an die Wandung 2 gebunden sind und die festen Punkte 6
markierte Antigene bedeuten, die im allgemeinen in der Reaktionszone 4 verteilt aber nicht mit den Wandungen
des Reagenzröhrchens verbunden sind. Es kann aber auch das Antigen mit der Oberfläche verbunden sein und
markiertes Antigen in ungebundener Form in dem Reagenzröhrchen verteilt sein. In einer weiteren Kombination kann gebundenes Antigen mit markierten ungebundenen Antikörpern vorhanden sein, oder gebundenes
Antigen mit markiertem ungebundenem Antigen. Es ist ebenso auch möglich, daß die vorhandenen Komponenten an verschiedenen Stellen in dem Reagenzröhrchen vorhanden sind, beispielsweise die Antikörper an den
Seitenwänden des Reagenzröhrchens und das markierte Antigen am Boden des Reagenzröhrchens gebunden
vorliegen. Es besteht jedoch keine Notwendigkeit für eine derartige getrennte Beschichtung. Bei der Lagerung
enthält das Reagenzröhrchen trockenen Stickstoff oder ein anderes inertes trockenes Gas, oder es befindet sich
unter Vakuum.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
!0
Claims (4)
1. Einrichtung zur Verwendung bei der Festphasen-Immunanalyse einer Komponente einer Antigen-Antikörper-Reaktion, bestehend aus einem Aufnahmegefäß, das an mindestens einem Teil seiner inneren Obcr-
S fläche eine der beiden Reaktionskomponenten in fester Form gebunden enthält, während die andere markierte Reaktionskomponente nicht an die Oberfläche gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß
die markierte Reaktionskomponente (6) in fester, ungebundener Form auf der inneren Oberfläche des
Aufnahmegefäßes {i) in dispergierter Form vorliegt
2. Einrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufnahmegefäß (1) ein polymeres
ίο Kunststoffröhrchen mit einer relativ undurchdringlichen glatten Oberfläche ist.
3. Einrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufnahmegefäß (1) eine inerte,
feuchtigkeitsfreie Atmosphäre enthält und hermetisch verschlossen ist
4. Einrichtung gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper an die polymere
Kunststoffoberfläche des Aufnahmegefäßes (1) adsorbiert sind.
is 5. Einrichtung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche eine Polyolefinoberflächc
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