DE2710810A1

DE2710810A1 - Verfahren zur radioimmunologischen bestimmung der antigen- oder antikoerperkonzentration in proben und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2710810A1
Application number: DE19772710810
Authority: DE
Inventors: Gary Brooker; Michael G Price; Wesley L Terasaki
Original assignee: University of Virginia UVA
Current assignee: University of Virginia UVA
Priority date: 1976-03-12
Filing date: 1977-03-11
Publication date: 1977-09-29
Also published as: US4128628A; DE2804657A1

Description

" Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung der Antigen- oder Antikörperkonzentration in Proben und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens"

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Verfahren zur
Bestimmung der Konzentration eines Antigens oder Antikörpers in einer Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung einen automatisierten Radioimmuntest (Radiοimmunoassay) zum Messen der Antigen- oder Antikörperkonzentration mittels einer selektiven Antikörper-Antigen-Reaktion unter Bedingungen, die eine sehr rasche Analyse erlauben.

Über die Isotopenverdrängung unter Verwendung von spezifischen Antikörpern zur Messung von sehr geringen Insulinmengen berichteten zuerst Yalow u. Mitarb, (vgl. Nature Bd. 184, S.1648).

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Dieses Verfahren hat eine breite Anwendung zur Analyse von verschiedenen biologisch wichtigen Substanzen geführt. Radioimmuntests sind mit die wichtigsten Verfahren zur routinemäßigen Analyse von hunderten von biochemisch und klinisch wichtigen Substanzen. Der Radioimmuntest ist heutzutage die Methode der Wahl zur Analyse von vielen Substanzen, da Antikörper mit sehr hoher Selektivität und Affinität hergestellt werden können, die eine Messung von beliebigen Verbindungen in recht unreinen Proben erlauben. Die Menge an Verunreinigungen kann in vielen

Fällen 1O⁷ mal so groß sein wie die zu bestimmende Verbindung, ohne daß eine Störung der Messung eintritt. Diese außerordentliche Selektivität und Fähigkeit zum Nachweis von Substanzen in Femtomolmengen (10 ^MoI) hat dazu geführt, daß der gelegentlich auch im deutschen Schrifttum als Radioimmunoassay bezeichnete Radioimmuntest eines der wichtigsten Hilfsmittel der modernen analytischen Chemie geworden ist.

Venn der Radioimmuntest überhaupt irgendwelchen Beschränkungen unterliegt, so besteht diese in der notwendigen manuellen Arbeit und der erforderlichen Zeit, um die Ergebnisse zu erhalten. Zur Durchführung einer typischen Bestimmung wird zunächst eine Kombination aus unbekannter Probe oder Standard, einem spezifischen Isotopentracer und einem Antikörper hergestellt. Diese Lösung wird anschließend in der Kälte oder bei Raumtemperatur mindestens 20 bis 30 Minuten bis mehrere Tage inkubiert, bis das Gleichgewicht zwischen dem Antigen (zu messendes Ligandenmolekül) und dem Antikörper erreicht ist.

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Das Antikörper-gebundene Ligandenisotop wird anschließend von der Lösung abgetrennt. Dies erreicht man im allgemeinen durch Zusatz von mit Dextran überzogener Aktivkohle zur Absorption des freien Liganden, durch Fällung des Antikörper-Isotopen-Komplexes mit Ammoniumsulfat oder Äthanol oder durch andere Verfahren, beispielsweise durch Molekularsiebchromatographie. Der Isotopen-Antikörper-Komplex wird nach dem Zentrifugieren oder nach dem Auffangen einer speziellen Säulenfraktion gewonnen und im allgemeinen in einem automatischen ß- oder /-Zähler einer Radioaktivitätsbestimmung unterzogen. Die Menge der vorhandenen unbekannten Substanzen wird mittels einer Eichkurve bestimmt, die gleichzeitig durch Messungen von Standardproben aufgestellt wird. Zunehmende Mengen an unbekannter Probe verringern die spezifische Aktivität des Isotopentracers, wodurch sich eine geringere, an den Antikörper gebundene Radioaktivität ergibt.

Die Probenverarbeitung von Hand für Radioimmuntests ist sehr zeitraubend, kostspielig und erfordert ein peinlich genaues Arbeiten. In einem einzigen Labor können pro Monat 8000 bis 10 000 Reagenzgläser für Radioimmuntests eingesetzt werden. Die ständige Wiederholung und die hohe Präzision dieser Bestimmungen sind verantwortlich für beträchtliche Schwankungen in bezug auf Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Eine vollständige Automatisierung derartiger Verfahren wäre somit von großem Vorteil. Verschiedene Versuche zur Automatisierung von Radioimmuntests haben bisher aber nur zu Teil-

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erfolgen geführt.

Erfindungsgemäß wird ein vollautomatisiertes und kontinuierliches Bestimmungsverfahren zur raschen und genauen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern mittels spezifischer Antikörper-Antigen-WechselWirkungen zur Verfügung gestellt. Erfindungsgemäß wird ein neues immunologisches Verfahren und eine Vorrichtung zur raschen automatischen Durchführung von Immuntests eingesetzt.

Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von Immuntests einer einzigen Probe oder einer Mehrzahl von Proben zur Verfügung gestellt, wobei die einzelnen Proben gegebenenfalls ein zu bestimmendes Antigen oder einen zu bestimmenden Antikörper enthalten. Dabei werden die einzelnen Proben mit einer Lösung mit einem Gehalt an nachweisbarem Antigen oder Antikörper unter Bildung einer Mehrzahl von Gemischen inkubiert, wobei die Gemische jeweils als Bestandteile komplexierten Antigen-Antikörper, nicht komplexiertes Antigen und nicht komplexierten Antikörper enthalten. Sodann wird mindestens einer der Bestandteile dieses Gemisches abgetrennt und anschließend die Menge an nachweisbarem Antigen oder Antikörper in einer der abgetrennten Anteile des Gemisches bestimmt.

Einfachheitshalber wird das erfindungsgemäße System nachstehend für den Fall erläutert, wo ein unbekanntes Antigen unter Ver-

wendung eines markierten Antigens und eines Antikörpers von bekanntem Titer gemessen wird. Selbstverständlich ist es einfach, eine unbekannte Menge eines Antikörpers unter Verwendung des gleichen markierten Antigens zu messen. Ferner kann auch eine unbekannte Menge an Antigen unter Verwendung eines markierten Antikörpers bestimmt werden. In all diesen Fällen ist das Verfahren im wesentlichen das gleiche: Nach dem Eintreten der Antigen-Antikörper-Wechselwirkung werden die Antigen-Antikörper-Komplexe von den nicht komplexierten Formen abgetrennt.

Anstelle einer Verwendung der Radioaktivität zum Nachweis können Antigene oder Antikörper durch Umsetzung mit einem nachweisbaren Liganden nach einer Reihe von bekannten Verfahren nachweisbar gemacht werden, beispielsweise durch Umsetzung mit einer fluoreszierenden Verbindung, einer lumineszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einem Enzym, einem weiteren Antikörper oder einem weiteren Antigen.

Das Gemisch wird sodann inkubiert, so daß das nachweisbare Antigen oder der nachweisbare Antikörper mit dem zu bestimmenden, gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Antikörper oder Antigen komplexiert wird. Es ist beispielsweise möglich, ein nachweisbares Antigen zur Komplexierung mit gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Antikörpernzu verwenden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, einen nachweisbaren Antikörper zur Komplexierung mit gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Antigenen zu

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verwenden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Vermischen und Inkubieren einer Antikörperlösung und einer Lösung eines nachweisbaren Antigens mit der zu bestimmenden Probe, bei der ein Antigengehalt vermutet wird, so daß das nachweisbare Antigen mit in der Probe vorhandenem Antigen um den zugänglichen Antikörper konkurriert.

Anschließend wird eine Abtrennung von einem der Bestandteile des inkubierten Gemisches durchgeführt, wonach mit einem der abgetrennten Anteile des Gemisches eine Messung auf die Anwesenheit von nachweisbarem Antigen oder nachweisbarem Antikörper durchgeführt wird. Die bei dieser Messung ermittelte Menge ist dann ein Maß für die relative, in der Probe enthaltene Menge des Antigens oder Antikörpers.

Kurz zusammengefaßt, stellt die Erfindung (wie anhand der Ausführungsform des Radioimmuntests mit unbekanntem Antigen erläutert) eine Vorrichtung zur Verfügung, bei dem eine Lösung eines Antigens von bekannter Konzentration, das mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, und eine Lösung mit einer bekannten Konzentration eines Antikörpers mit einer Probe, die ein mit dem Antikörper reaktionsfähiges Antigen in unbekannter Konzentration enthält, vermischt werden. Die Antikörperkonzentration der Lösung wird so gewählt, daß sie nicht ausreicht, um mit dem gesamten Antigen, das in der das markierte Antigen enthaltenden Lösung vorhanden ist, zu reagieren. Das Gemisch wird für eine feste, vorbestimmte Zeitdauer inkubiert und anschließend in eine

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Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität (Radioaktivitätsdetektor) geleitet, wo die in einer feststehenden Menge der gemischten Probe vorhandene Radioaktivität kinetisch gemessen wird. Die gemischte Probe wird anschließend in einen Anteil mit einem Gehalt an Antikörper-Antigen-Komplex und einen Anteil mit einem Gehalt an nicht umgesetztem Antigen aufgetrennt. Eine dieser Lösungen wird anschließend in einen Radioaktivitätsdetektor geleitet, wo eine zweite Radioaktivitätsmessung vorgenommen wird. Das Verhältnis der Radioaktivität bei der zweiten Messung zur Radioaktivität bei der ersten Messung kann mit vorher auf die gleiche Weise erhaltenen Eichkurven in Beziehung gesetzt werden, wodurch die Menge an in der unbekannten Probe vorhandenem Antigen bestimmt werden kann. Gemäß diesem Verfahren kann die Probe zunächst beim Durchlaufen des Radioaktivitätsdetektors kinetisch gemessen werden, wobei man einen Faktor erhält, der zur Kontrolle von Variablen, Isotopenverlust während des Durchlaufs oder Änderungen der Fließgeschwindigkeit während einer langen Zeitdauer verwendet werden kann. Die kinetische Messung ist auch insofern wichtig, als sie von der Vorrichtung dazu verwendet wird, um festzustellen, wann eine Probe zur Bestimmung vorhanden ist, d.h. es wird ein vorbestimmter Schwellenwert der Strahlung festgestellt, der anschließend eine Folge von Steuersignalen erzeugt, die das restliche Bestimmungsverfahren steuern.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich zur Durchführung eines Immuntests an Einfach- oder Mehrfachproben, die gegebenen-

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falls ein zu bestimmendes Antigen oder einen zu bestimmenden Antikörper enthalten. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Vorrichtung zum Inkubieren der einzelnen Proben mit einem Gehalt an nachweisbarem Antigen oder Antikörper unter Bildung einer Mehrzahl von inkubierten Gemischen auf, wobei jedes Gemisch komplexen Antigen-Antikörper, nicht komplexiertes Antigen und nicht komplexierten Antikörper enthält. Ferner weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Trennvorrichtung auf, mit der mindestens einer der Bestandteile aus den einzelnen Gemischen abgetrennt werden kann, sowie eine Vorrichtung zum Nachweis der Menge an nachweisbarem Antigen oder Antikörper in einem der abgetrennten Bestandteile der einzelnen Gemische.

Die den Radioimmuntest betreffende Ausführungsform der Erfindung weist folgende Merkmale auf:

eine Vorrichtung zur zeitlich gesteuerten Inkubation einer Mehrzahl von Erobenlösungen, von denen jede ein Gemisch aus

(a) einer Probe, gegebenenfalls mit einem Gehalt an einem zur Bestimmung vorgesehenen Antigen oder Antikörper,

(b) eine Lösung eines mit einem radioaktiven Isotop markierten Antigens oder Antikörpers von bekannter Konzentration und

(c) eine Lösung eines mit dem genannten Antigen oder Antikörper reaktionsfähigen Antikörpers oder Antigens von bekannter Konzentration;

eine Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität, mit der eine

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kinetische Radioaktivitätsmessung einer kontinuierlich durchlaufenden Lösung und eine statische Radioaktivitätsmessung einer statisch in der Vorrichtung gehaltenen Lösung vorgenommen werden kann;

eine Vorrichtung zum Einbringen der inkubierten Probe in die Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität;

eine Zeitmeßvorrichtung, die durch die Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität aktivierbar ist, wenn die Nachweisvorrichtung einen vorbestimmten Radioaktivitätsschwellenwert feststellt, mit der die Zeitfolgen gemessen und Steuersignale in vorbestimmten Zeitfolgen erzeugt werden können;

eine mit der Nachweisvorrichtung gekoppelte Aufzeichnungsvorrichtung zum Aufzeichnen der in der Nachweisvorrichtung festgestellten Radioaktivität;

eine Trennvorrichtung zum Auftrennen der kinetisch gemessenen Lösung in einen ersten Teil mit einem Gehalt an nicht mit dem Antikörper umgesetztem Antigen;

eine Vorrichtung zum Einbringen einer der Teile aus der Trennvorrichtung in die Vorrichtung zur Messung der Radioaktivität zum statischen Nachweis;

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eine Vorrichtung zum Isolieren der inkubierten Probe von zusätzlichen in die Testvorrichtung eingebrachten Probelösungen, wobei die Vorrichtung zum Isolieren durch ein von der Zeitmeßvorrichtung ausgegebenes Signal aktivierbar ist, die Vorrichtung zum Isolieren das System bei einem ersten vorbestimmten Signal der Zeitmeßvorrichtung isoliert und die Vorrichtung zum Isolieren bei einem zweiten vorbestimmten Signal der Zeitmeßvorrichtung das System wieder mit der Inkubationsvorrichtung verbindet und wobei die zweite vorbestimmte Zeitdauer so festgelegt ist, daß genügend Zeit zur Beendigung der statischen Messung bleibt, bevor die nächste inkubierte Probe in der Nachweisvorrichtung zur nächstfolgenden kinetischen Radioaktivitätsmessung ankommt; und

eine Vorrichtung zum Spülen der Probe aus dem System nach deren statischer Messung, um die Nachweisvorrichtung für die statische Messung der nächstfolgenden Probe bereit zu machen.

Figur 1 ist eine schematische Darstellung eines vorzugsweise verwendeten Probenbereitungssystems.

Figur 2 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform einer Probenscheibe zur Verwendung im System von Fig. 1.

Figur 3 ist eine schematische Abbildung der Vorrichtung der Erfindung.

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Figur 4 ist eine schematische Abbildung eines in der Vorrichtung von Fig. 3 verwendeten Inkubationssystems.

Figur 5 ist ein Zeitdiagramm, das zeigt, in welcher Folge in der Vorrichtung von Fig. 3 die Ventile geöffnet und geschlossen werden.

Figur 6 ist eine Eichkurve für cyclisches AMP.

Figur 7 ist eine Eichkurve für cyclisches GMP.

Figur 8 ist eine Eichkurve für Digoxin.

Figur 9 zeigt einen Vergleich von handelsüblichen Digoxin-Standards mit erfindungsgemäß bestimmten Standards.

Figur 10 ist eine Eichkurve für Angiotensin I.

Figur 11 ist eine Eichkurve für Insulin.

Figur 12 ist eine Eichkurve für Thyroxin.

Figur 13 erläutert die Messung von Anti-cyclo-AMP-Antikörpern.

Figur 14 ist eine Eichkurve für Digoxin unter Verwendung einer Anti-Digoxin-Trennsäule.

Figur 15 ist eine Eichkurve für Digoxin unter Verwendung einer Kaninchen-Anti-Schaf-IgG-Säule.

Die nachstehend aufgeführten Bezugszeichen beziehen sich auf einige der vorgenannten Figuren.

Zur Erläuterung der Erfindung wird ein kontinuierlicher und automatisch ausgeführter Hadioimmuntest beschrieben, bei der der Reagentienzusatz, die Abtrennung von gebundenem Liganden von dem gesamten Inkubationsgemisch und die Radioaktivitätsbestimmung nacheinander ohne menschlichen Eingriff vorgenommen

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werden.Die ersten Ergebnisse sind innerhalb von 3 bis 30 Minuten erhältlich und gelegentlich auch schneller. Eine neue Probe wird alle 11/2 bis 3 Minuten verarbeitet. Ein erfindungsgemäßes System kann täglich 400 Proben verarbeiten, eine Menge, die von mehreren Beschäftigten bei Verwendung der üblichen automatischen Strahlungszählgeräte nur schwer zu erreichen ist.

Bei der hier erläuterten Ausführungsform wird die Antigenprobe mit einer Lösung eines Antigens, das mit einem radioaktiven Isotop umgesetzt oder markiert worden ist, und mit einer Lösung eines Antikörpers vermischt. Die Antigenprobe kann aus biologischen Quellen, wie Blut, Serum, Plasma, Ascites oder dergl., stammen,von denen angenommen wird, daß sie spezifische Antigene enthalten. Die Antikörperlösung erhält man aus üblichen, handelsüblichen Quellen. Der Antikörper wird je nach dem zum Nachweis vorgesehenen spezifischen Antigen (oder Antigenen) ausgewählt. Der Titer des Antikörpers im Antiserum ist bekannt, ebenso die Konzentration des mit dem Isotop markierten Antigens.Die Verdünnung der Antikörperlösung wird so gewählt, daß die Menge des vorhandenen Antikörpers nicht ausreicht, um mit der Gesamtmenge des im System erwarteten Antigens zu reagieren. Der Antikörper kann in diesem System in sehr hoher Verdünnung, beispielsweise 1/500 000, verwendet werden. Es ist überraschend, daß der Antikörper für die Zwecke dieses Systems ausreichend stabil bleibt.

Die -Markierung des Antigens mit Isotopen kann nach üblichen Verfahren vorgenommen werden, beispielsweise durch Umsetzung

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des Antigens mit Resten, durch die Mengen von ^J oder * J oder anderen geeigneten radioaktiven Isotopen, wie '"Ί3θ, H,

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C oder ^ P, eingeführt werden können.

Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung von nicht radioaktiven Markierungen ("tags");die eingesetzt werden können, wenn entsprechende Nachweisvorrichtungen vorhanden sind. Beispiele dafür sind lumineszierende, biolumineszierende sowie im UV-, sichtbaren und IR-Bereich absorbierende Verbindungen.

Die Konzentration der markierten Antigenlösung kann von 1 millimolar bis zu den Konzentrationsgrenzen, bei denen das Isotop durch Radioaktivitätsmessung nachweisbar ist, im allgemeinen 1 Pemtomol, variieren. Die Verdünnung der Antiseren in der Antikörperlösung kann 1:10 bis 1:500 000 betragen, je nach den Eigenschaften der jeweiligen Antiseren. Anstelle eines einzigen Antikörpers oder eines einzigen Antigens können auch zwei oder mehrere verschiedene markierte Antigene und verschiedene Antikörper in Kombination miteinander verwendet werden, wodurch man gleichzeitig eine Mehrfachbestimmung erhält. Spezielle Beispiele für markierte Antigensysteme, die verwendet werden können sind: -\j-Digoxin, ¹ ^¹ J-Thyroxin, ¹²^J-Secretin, ^²P-CyCIo-AMP,

* J-Insulin, ^J-Glucagon, '^Se-Cortisol, ^J-Angiotensin I, »T-carcinoembryonales Antigen, ''j-Somatostatin, ^ J-Insulin,

^D J-Trijodothyronin, ^J-Thyroxin, ^J-Wachstumshormon,

¹²⁵J-cyclo -AMP, ¹⁵¹J-cyclo -GMP, ¹²⁵J-Morphin, ⁱ²⁵J-Vasopressin

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und J-Aldosteron sowie deren Derivate und entsprechende

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Antikörper. Die Antigene und Antikörper können in Sertun, Urin oder anderen bei Radioimmuntests üblichen Puffersystemen enthalten sein, wie Natriumacetat, Tris-HCl, Barbital, Phosphat, MES und TES. Die zu bestimmende Probe kann bei mehreren Verdünnungen, beispielsweise 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:100 und 1:1000, gemessen werden.

Die zwei Lösungen und die zu bestimmende Probe werden vor dem Vermischen in getrennten Behältern aufbewahrt. Ein bevorzugtes Probenbereitungssystem ist die in Figur 1 gezeigte Probenscheibe. Bei diesem System hält eine drehbare Scheibe eine Mehrzahl von kleinen Bechern 3· Ferner sind bei diesem System Behälter für eine Antikörperlösung 5 und eine Lösung mit einem Gehalt an mit einem radioaktiven Isotop markierten Antigen 8 vorgesehen. Eine Probe wird mit der Pipette 9 aus einem der Becher entnommen. Die Pipette befindet sich an einem heb- und schwenkbaren Arm, so daß sie nach der Probenentnahme nach oben und vom Becher weg bewegt werden kann. Dadurch kann sich die Scheibe drehen, wodurch der nächstfolgende Becher auf die Pipette 9 eingestellt wird. Während der Zeit, in der sich die Scheibe 1 dreht, in der keine Proben entnommen werden, können die Pipetten 9 und 15 in einen Behälter 11 gebracht werden, der eine Pufferlösung enthält. Auf diese Weise ergibt sich schließlich in der Leitung 13 eine Menge an Pufferlösung, die zwei nebeneinanderliegende wandernde Proben trennt. Die Antikörperlösung von der Quelle 5 und die markierte Antigenlösung von der Quelle 8 werden durch die Pipetten 15 entnommen. Die Aufnahme der markierten Lösung erfolgt intermittie-

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rend, während die Aufnahme der Antikörperlösung und der Proben intermittierend oder kontinuierlich erfolgen kann. Mit anderen Worten kann eine kontinuierliche Probenzufuhr und intermittierende Antikörperaufnähme oder eine kontinuierliche Antikörperzufuhr und eine intermittierende Probenaufnahme stattfinden. Somit kann man die gleiche Probenlösung mit verschiedenen Antikörpern oder verschiedene Proben mit dem gleichen Antikörper analysieren. Beispielsweise kann in die stationären Behälter 5 oder 8 ein Patientenserum gebracht werden, das dann gleichzeitig mit einer Reihe von auf der Drehscheibe angeordneten, verschiedenen Antigen-Antikörper-Paaren aufgezogen wird.

Die Saugwirkung zur Betätigung der Pipetten 9 und 15 wird durch einen Unterdruck gewährleistet, der durch eine laminare Strömungspumpe, beispielsweise eine peristaltische Mehrkanalpumpe 17, erzeugt wird. Die Probe und die Lösungen werden in die Leitungen 7 gezogen und gleichzeitig in der Leitung 13 vermischt und zwar

1 bis 30 Sekunden, bevor sie in den Inkubator 19 geleitet werden. Die Aufnahme und das Vermischen einer neuen Probenlösung kann alle 1 bis 3 Minuten erfolgen.

Anstelle von zwei getrennten Lösungsquellen 5 und 8 kann auch eine sehr zweckmäßige Anordnung vorgesehen sein, bei der kleine Becher oder Ampullen 21 in Serie auf der Drehscheibe 1 angeordnet werden. Dabei enthält ein Becher die Probe und die anderen

2 oder 3 Becher in der Serie die anderen Lösungen. Somit ist es möglich, eine Serie von Bechern zur Messung von Insulin und

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Digoxin, eine weitere Serie von Bechern zur Messung von Thyroidverbindungen und dergl. zu verwenden. Diese Bestimmungen können gegebenenfalls alle für den gleichen Patienten vorgenommen werden. Dabei enthält jede Serie einen Becher der gleichen Probe, die verschiedene Antigene enthalten kann. Das System kann auch zur Untersuchung von vielen Proben von verschiedenen Patienten auf kontinuierliche Weise verwendet werden. Probenscheiben sind beispielsweise aus den üS-PSen 3 902 371, 3 038 JAO, 3 4-24 557, 3 134 263 und 3 230 776 bekannt.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, anstelle einer Probenscheibe einen herkömmlichen Fraktionsseparator zur Einführung der Proben in das System zu verwenden.

Nach dem Vermischen der Lösungen durch die Pumpwirkung wird das Gemisch durch die Leitung I3 in eine Inkubationskammer geleitet, wo es für eine feste, vorbestimmte Inkubationszeit unter standardisierten Bedingungen gehalten wird.

Die Inkubationskammer kann unterschiedliche Formen aufweisen. Eine besonders bevorzugte Form ist eine lange spiralenartige Leitung 23 gemäß Fig. 4-, die auf einer vorbestimmten Inkubationstemperatur gehalten wird. Die Strömungsgeschwindigkeit der Probenlösung durch die Inkubationsvorrichtung kann so eingestellt werden, daß die Umsetzung dann in ausreichendem Maße beendet ist, wenn die Probenlösung die Länge der Leitung durchlaufen hat. In der Inkubationsleitung können gleichzeitig

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mehrere Probenlösungen 25 vorhanden sein, die jeweils durch eine Pufferlösung 27 getrennt sind. Der Puffer 27 trennt nicht nur die Probenlösungen, sondern nimmt auch Rückstände auf, so daß die nächstfolgende Probe nicht verunreinigt wird. Da die Lösungen in der Leitung 23 sich in laminarer Strömung bewegen, besteht ein mögliches Strömungsproblem, da sich die Flüssigkeit im Innern des Rohrs rascher als an den Seiten bewegt. Dieses Problem läßt sich leicht beseitigen, indem man intermittierend Luftblasen in regelmäßigen Abständen in die Leitung 13 mittels der Blasenbildungsvorrichtung 14 einleitet. Diese Luftblasen dienen dazu, daß sich die Flüssigkeit mit einer gleichmäßigeren Geschwindigkeit bewegt. Diese Technik ist beispielsweise in den US-PSen 2 797 Ή9 und 2 879 141 beschrieben.

In einem derartigen System, das hier angewendet wird, befinden sich 15 Proben gleichzeitig in verschiedenen Inkubationsstadien.

Die Inkubationstemperatur hängt natürlich von dem speziellen, angewendeten Antikörper-Antigen-System ab. Im allgemeinen kann die Inkubationstemperatur von O bis 60⁰C variieren. Häufig wird die Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt.

Dieses System hat eine ausgezeichnete Flexibilität und kann zur · kontinuierlichen Bestimmung von verschiedenen Systemen verwendet werden. Dabei können die einzelnen, entnommenen und in die Leitung 13 eingebrachten Probenlösungen verschiedene Antigen-Antikörper-Systeme enthalten. In vielen Fällen ist es nicht einmal

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erforderlich, die Inkubatorbedingungen neu einzustellen, wenn das Antikörper-Antigen-System geändert wird. Es ist nur notwendig, daß die Eichung der Vorrichtung für standardisierte Proben unter den gleichen Bedingungen vorgenommen wird, mit denen die unbekannten Eroben untersucht werden. Somit ist es nicht notwendig, daß die Inkubationsdauer so lange ist, daß die Reaktion beendet ist. Es ist nur erforderlich, daß die Inkubationsdauer für die Proben gleich lang ist wie bei der Eichung. Dies steht im scharfen Gegensatz zu herkömmlichen Systemen, bei denen für eine erfolgreiche Durchführung eine Beendigung der Reaktionen erforderlich ist. Selbstverständlich ist die Bestimmung umso empfindlicher, je näher das System während der Inkubation an die vollständige Reaktion und das Gleichgewicht herangeführt wird. Die Inkubationsdauer kann 1 bis 30 Minuten und bis zu 1 Tag betragen, je nach dem speziellen System. Wenn die Inkubationszeit unannehmbar lang ist, ist es möglich, die Inkubation durch Zugabe von mehr Antikörper oder durch Veränderung der Temperatur zu beschleunigen.

Die Probe kann auch in einen von mehreren Behältern gebracht werden, der unter vorbestimmten Inkubationsbedingungen gehalten wird, wonach eine Pipette oder eine ähnliche Vorrichtung die inkubierte Probe aus dem Behälter entfernt und zum Isolierventil 31 bringt.

Am Ende der Inkubationsdauer wird die Probe durch die Leitung 29» wie in Pig. 3 gezeigt, in ein Isolations- oder Umgehungs-

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ventil/geleitet. Die Antriebskraft für die Bewegung der Probe durch das System bis zu dieser Stelle ist im allgemeinen auf den Druck zurückzuführen, den die peristaltische laminare Strömungspumpe erzeugt.

Das Isolations-Umgehungsventil 31 verbindet die Leitung 29 mit der Leitung 33 und alternativ mit der Abfalleitung 41. Die Leitung 33 führt zum Radioaktivitätsdetektor 35· Bei Strömungsbeginn wird das Ventil y\ zur Leitung 33 geöffnet und die inkubierte Probe in den Radioaktivitätsdetektor 35 dirigiert.

Beim Durchlaufen der Leitung/ innerhalb des Radioaktivitätsdetektors 35 wird die Strahlungsmenge gemessen. Es wird ein herkömmlicher Radioaktivitätsdetektor verwendet. Es können alle üblichen Detektoren verwendet werden, beispielsweise ein NaJ-/*- Detektor. Es kann auch ein üblicher Flüssig-Szintillationszähler verwendet werden. Das Auftreten eines Radioaktivitätsschwellenwerts im Detektor löst eine vorbestimmte Zeitabfolge aus, womit die Messung der Probe für eine vorbestimmte Zeitdauer, im allgemeinen 1 Minute, beginnt. Die Zeitmessvorrichtung 48 wird gestellt, nachdem eine Abwägeschaltung 47 anzeigt, daß der Schwellenwert der Strahlung vorhanden ist. Kontrollsignale von der Zeitmeßvorrichtung 48 betätigen anschließend verschiedene Ventile in einer Reihenfolge, die notwendig ist, um die Probenlösung zu einem Separator y\ zu bringen, wo ein Teil des freien Antigens und des freien isotopenmarkierten Antigens von einem Teil des Antigen-Antikörper- und markierten Antigen-Antikörper-Komplexes getrennt werden. Anschließend

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wird einer der Anteile in einen kleinen becherförmigen Behälter 55 in einem Radioaktivitätsdetektor gebracht und eine vorbestimmte Zeit, im allgemeinen etwa 1 Minute, gemessen.

Somit tastet der Radioaktivitätsdetektor die Probe ab und es kann die auf die Säule aufgebrachte Probenmenge sowie die Menge der gebundenen Radioaktivität endgültig genau und mit einer üblichen statischen Messung bestimmt werden. Anschließend ist es einfach, das Verhältnis von gebundenem Radioliganden zur gesamten Radioaktivität in jeder Probe zu berechnen und Eichkurven für diese Verhältnisse aufzustellen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, Eichkurven auf der Basis von ausschließlich der gebundenen Radioaktivität aufzustellen, wenn die Strömungscharakteristika ausreichend konstant und stabil sind. Die Zeit

nicht

für jede Probe ist somit genau gleich und wird/durch geringfügige Veränderungen in der Pumpgeschwindigkeit, die während einer längeren Zeit auftreten können, beeinflußt. Eine geringe Variation in der auf die Säule aufgebrachte Probenmenge hat somit keine Folgen, da das Verhältnis von gebundener zur gesamten Radioaktivität, das für jede Probe berechnet wird, nicht von der konstanten Probenradioaktivität abhängt.

Die Zeitmeßvorrichtung 48 mißt vorbestimmte zeitliche Abfolgen, wonach sie Steuersignale durch die Leitung 39 zur Betätigung des Isolationsventils 31 aussendet, wodurch sie den Messungsantjeil des Systems vom Inkubationsanteil des Systems trennt. Der vor der Betätigung des Ventils 31 gemessene Zeitabschnitt

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ist ausreichend, um zumindest die ganze Probe in den Detektor kommen zu lassen, bevor das Messungssystem isoliert wird. Mit anderen Worten schließt das Ventil y\ rechtzeitig an einem Punkt, wenn die Zwischenräume mit Pufferlösung 27, die zu messende, aneinanderliegende Probelösungen 25 trennen, durch das Ventil 31 laufen.

Ein sehr interessanter Gesichtspunkt der Erfindung besteht darin, daß die erste Strahlungsmessung durchgeführt wird, wenn die Probe kinetisch durch die Detektorleitung läuft. Im allgemeinen gelten kinetisch vorgenommene Messungen für die praktische Anwendung als zu ungenau. Erfindungsgemäß wurde jedoch festgestellt, daß die kinetische Messung sich proportional zur

Verluste statischen Messung verhält und somit zum Ausgleich für Isotopen-/ im System verwendet werden kann. Die kinetische Messung ist auch ausreichend genau, um sie zur Kontrolle der Vorrichtung zu verwenden, wie es erfindungsgemäß geschieht. Eine Aufzeichnungsvorrichtung 49 ist vorgesehen, die mit der Abwägeschaltung 47 und der Zeitmeßvorrichtung 48 gekoppelt ist und zum Aufzeichnen der Radioaktivität bei der kinetischen und bei der anschließenden statischen Messung verwendet wird. Diese Messungen werden zur endgültigen Bestimmung der Menge des spezifischen Antigens in der unbekannten Probe mit Eichwerten verglichen, wobei ein Rechengerät 80 verwendet wird, das zwischen der Aufzeichnungsvorrichtung 49 und der Zeitmeßvorrichtung 48 angeordnet ist.

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Nach dem Schließen des Isolationsventils y\, wodurch die Zufuhr von der Leitung 29 in die Abfalleitung 41 umgeleitet wird, kann eine Vorrichtung zur Steigerung der Geschwindigkeit der Probenlösung vorgesehen sein. In Fig. 3 liegt diese Vorrichtung in Form eines Einlaßventils 43 für eine Pufferlösung von hoher Strömungsgeschwindigkeit vor. Dieses Ventil 43 wird gleichzeitig mit dem Schließen des Isolationsventils 31 durch ein vorbestimmtes Signal aus der Zeitineßvorrichtung 48 über die Leitung 45 geöffnet. Eine Pufferlösung von hoher Geschwindigkeit tritt durch die Leitung 44 in die Leitung 33 ein. Die Pufferlösung von hoher Strömungsgeschwindigkeit treibt die Probenlösung durch die Leitung 50 in und durch die Trennkolonne 51· Diese hohe Strömungsgeschwindigkeit kann erforderlich sein, da der Widerstand der Trennkolonne sonst den freien Durchfluß der Lösung verhindern könnte. Die turbulent mit hoher Geschwindigkeit strömende Pufferlösung bewirkt auch ein Waschen von Rückständen aus der Probenlösung in die Trennkolonne, so daß eine Verunreinigung der nachfolgenden Probenlösungen verhindert und das Auftreten der Isotopenlösung im Strahlungsdetektor beschleunigt wird. Im allgemeinen kann diese Leitung Puffer mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min bis 50 ml/min und vorzugsweise 3 ml/min bis 10 ml/min einführen, was natürlich von der Schlauch- bzw. Ventilgröße abhängt.

Die Strömungsgeschwindigkeit wird durch den hydrostatischen Kopf gesteuert, der durch den Auslaß der Leitung 54- erzeugt wird, wenn das Luftfallenventil 85 betätigt wird, um die Leitung

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86 mit der Leitung 84, die unter Atmosphärendruck steht, zu verbinden. Wie in Fig. 5 gezeigt, wird die Tätigkeit des Luftfallenventils 85 zum gleichen Zeitpunkt beendet, an dem das Einlaßventil für den schnellströmenden Puffer betätigt und das Isolationsventil y\ geschlossen wird. Dies bewirkt ein Ansteigen des hydrostatischen Drucks in der Kolonne 60. Somit steigt die Strömungsgeschwindigkeit durch die Kolonne mit dem Austreten durch die Leitung 52. Die Strömungsgeschwindigkeit erreicht nun nahezu die Strömungsgeschwindigkeit des schnell durch die Leitung 44 strömenden Puffers.

Die Trennkolonne 5^ dient zur Trennung der Probenlösung in 2 Teile: Ein erster Teil, der das nicht umgesetzte Antigen und mit dem Isotop markiertes nicht umgesetztes Antigen enthält, und ein zweiter Teil, der den Antikörper-Antigen-Komplex und den Antikörper-markiertes-Antigen-Komplex enthält. Diese Trennung kann durch verschiedene Vorrichtungen erreicht werden, von denen einige bekannt und einige nicht bekannt sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Trennvorrichtung aus einer Säule, die mit einem Adsorbens 60 gefüllt ist, das jedes nicht an einen Antikörper gebundene Antigen adsorbiert.

Zur Füllung der Kolonne können alle Arten von Adsorptionsmitteln verwendet werden, die selektiv das freie Antigen in Lösung adsorbieren und den Antigen-Antikörper-Komplex nicht adsorbieren. Entsprechende Adsorptionsmittel zur Verwendung in der Säule sind Anionen- und Kationenaustauscherharze, wie

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Dowex 1, Dowex 2, Dualite A-2, DEAE-Cellulose, Amberlite CG-400, Permutit S-1, Dowex 50, .Amberlite CG-50, CM-Cellulose, DEAE-Sephadex und dergl. Es können auch Molekularsiebe verwendet werden, wie Sephadex G-10, G-25, G-50, G-75 oder G-100, Bio-Gel P-20, P-30, P-60 oder dergl. Ferner kann auch eine hohe Konzentration eines speziellen Antikörpers, der an einen festen Träger gebunden ist, zur Adsorption von nicht umgesetztem radioaktivem Antigen verwendet werden. Die Säule kann 0,1 bis 20 cm hoch sein und 0,1 bis 100 g Adsorbens aufnehmen. Sie kann bei Temperaturen von 0 bis 90⁰C betrieben werden.

Das Adsorptionsmittel kann nicht-teilchenförmig sein, beispielsweise kann eine Beschichtung der Innenwände einer Fließkolonne vorliegen. Das Adsorptionsmittel kann aber auch teilchenförmig sein. Sofern das Adsorptionsmittel in Teilchenform vorliegt, kann es Teilchengrößen von 10 bis 1000 mesh, je nach den hydraulischen Eigenschaften des Systems, aufweisen. Teilchenförmige Adsorptionsmittel können durch die Schwerkraft unter Verwendung einer Aufschlämmung der adsorbierenden Teilchen in die Säulen gepackt werden. Ist eine dichtere Packung erwünscht, kann Druck angelegt werden.

Wie bereits erwähnt, können bei der hier erläuterten Ausführungsform zur Füllung der Kolonne beliebige Adsorptionsmittel verwendet werden, die selektiv das freie Antigen in Lösung adsorbieren und den Antigen-Antikörper-Komplex nicht adsorbieren. Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine hohe Konzentration

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einer immunreaktiven Substanz anzuwenden, beispielsweise einen speziellen Antikörper, der zur Adsorption von nicht umgesetztem Antigen an einen festen Träger gebunden sein kann. Umgekehrt können zur Entfernung von Antikörpern aus einem Gemisch von Antikörper-Antigen-Komplex und freiem Antikörper gekuppelte Antigene verwendet werden. Ferner können auch gekuppelte Antikörper zur Entfernung von anderen Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen aus einer Lösung verwendet werden, wobei das freie Antigen in Lösung bleibt.

Für jedes Antigen oder für jeden Antikörper stehen eine Vielzahl von Trennmaterialien zur Verfügung. Beispielsweise können die in nachstehender Tabelle IV angegebenen Materialien einzeln oder in Kombination miteinander verwendet werden.

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Tabelle III

Spezielle Beispiele für immunoreaktive Materialien die zu Immuntest-Trennungen verwendet iverden können

fester Träger

Agarose

Verfahren zum Kuppeln von Antikörper oder Antigen

Bromcyan-Aktivi erung

Perjodat-Aktivierung

N-Hydroxysuccinimid-

Derivatbildung

Hydrazid-Derivat-

bildung

Kuppeln an N-Hydroxy- Affi-Gel succinimid-Derivat e

Beispiele für handelsübliche Materialien, die verwendet werden können

Sepharose Biogel A

Polyacrylamid

Carbodiimid-Kupplung

Carbodiimid-Kupplung Glutaraldehyd-Aktivierung

Styrol-Divinyl- Chlormethylierung benzol-Polymeri-

sat, Polystyrol

Affi-Gel CM Biogel

Biogel D Biogel CM-2 Bio-Beads S

p-Nitroaryl- und

p-Aminoaryl-Derivat-

bildung

Bindung an Dextran

Carbodiimid-Kupplung

N-Hydroxysuc cinimid-

Derivatbildung

Phenylhydrazin-HCl-

Derivatbildung

Thioharnstoff-Kupplung

Glutaraldehyd-Aktivierung

Perjodat-Aktivierung Porenglas von kontrollierter Körnung

Glycophase G

Cellulose Carbodiimid-Kupplung Acryl-Polymerisat Carbodiimid-Kupplung CM-Cellulose Bio-Rex

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Tabelle IV

Zu bestimmende Antigene und Materialien zur Abtrennung von freien und antikörpergebundenen Formen

Antigene Digoxin

Thyroidstimulierendes Hormon (TSH)

Angiotensin I

Thyroxin Insulin

Cortisol

Cyclische Nucleotide Glycoproteine (verschiedene)

Materialien zur Abtrennung (Beispiele)

Absorption an Aktivkohle Bindung an Ionenaustauscher/Absorption an Dowex-Harz

Bindung an Anti-Digoxin-Antikörper, gekuppelt an Agarose

Ionische Bindung an QAE-Sephadex-Ionenaustauschermaterial

Bindung an Anti-TSH-Antikörper, gekuppelt an Agarose

Anionenaustauschbindung an Dowex-Harz bei hohem pH-Wert

Bindung an Anti-Angiotensin I-Antikörper, gekuppelt an Polyacrylamid

Absorption an Aktivkohle

Ionenaustauschbindung / Absorption an Dowex-Harz

Bindung an Anti-Thyroxin-Antikörper, gekuppelt an Siliciumdioxid-Glas

Ionenaustauschbindung an Dowex-Harz bei hohem pH-Wert

Absorption an Polystyrol-Divinylbenzol-Harz oder Aktivkohle

Absorption an Aktivkohle

Ionenaustauschbindung/Absorption an Dowex-Harz

Bindung an Anti-cyclische Nucleotid-Antikörper gekuppelt an Agarose

Bindung an Conconavalin A, gekuppelt an Agarose

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Bei einer Ausführungsform der Trennmaterialien wird die Säule in einem Abschnitt mit Aktivkohle und in einem weiteren Abschnitt mit einem Anionenaustauscherharz gepackt. Im allgemeinen trägt das Antigen eine partielle Ladung, mit Hilfe derer es an das Ionenaustauschharz adsorbiert werden kann. Wenn radioaktive Verunreinigungen im radioaktiven Antigen vorhanden sind und diese keine Ladung aufweisen, werden diese nicht am Ionenaustauscherharz, sondern an der Aktivkohle adsorbiert. Außerdem treten häufig radioaktive Verunreinigungen auf, die am Ionenaustauscherharz, aber nicht an der Aktivkohle adsorbiert werden. Infolgedessen können bei Verwendung der beiden vorgenannten Materialien als Adsorptionsmittel weniger reine Reagentien bei der radioimmunologischen Bestimmung eingesetzt werden. Da das (die) Adsorptionsmittel in der Kolonne in der Lage sind, nicht gebundenes Antigen aus einer Mehrzahl von Proben zu adsorbieren, muß das Adsorbens in der Kolonne nicht häufig gewechselt werden. Anstelle einer Verwendung der vorgenannten Adsorptionsmittel in der Kolonne ist es möglich, die Trennung von nicht gebundenem Antigen von dem gebundenen Komplex unter Verwendung einer semipermeablen Membran oder eines chromatographischen Molekularsiebs, wie Sephadex, vorzunehmen. Jedoch ist die Verwendung von Membranen nicht bevorzugt, da die Trennung bei diesem Verfahren zu langsam abläuft.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Adsorptionsverfahren in der Kolonne umgekehrt werden, indem der gebundene Antigen-Antikörper-Komplex adsorbiert wird, während das freie Antigen die Säule passiert und zur Messung gelangt.

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Im Gegensatz zu allen früheren Verfahren^bei denen adsorptiv wirkende Trennmaterialien verwendet werden, muß das Adsorbens beim erfindungsgemäßen Verfahren zwischen den einzelnen Proben nicht regeneriert werden. Das adsorbierte Material muß nicht entfernt werden, es kann vielmehr das adsorbierte Material von mehreren aufeinanderfolgenden Proben auf der Säule gesammelt werden, ohne daß eine merkliche Beeinträchtigung des Säulenverhaltens eintritt. Besonders bemerkenswert ist, daß als Trennmaterial immobilisierte Antikörper oder beliebige immunoreaktive Materialien oder Gemische aus verschiedenen Trennmaterialien verwendet werden können, wobei diese immunreaktiv sein können oder nicht.

Im Gegensatz zu allen früheren in fester Phase arbeitenden, manuellen und automatisierten Immuntestverfahren ist die Bindungskapazität des erfindungsgemäß verwendeten adsorbierenden Materials in einem ausreichenden Überschuß gegeben, so daß im wesentlichen alle gewünschten Bestandteile aus der Lösung entfernt werden können. Tatsächlich ist die Kapazität des Adsorptionsmaterials so beschaffen, daß hunderte von Proben nacheinander verarbeitet werden können, ohne daß ein Verlust an Trennwirkung eintritt. Im Gegensatz dazu erfordern herkömmliche, in fester Phase arbeitende Immuntestverfahren so geringe Mengen an immobilisiertem Antikörper, daß nur eine Fraktion des Antigens gebunden wird.

Die restliche Probe wird aus dem Separator 51 durch den rasch strömenden Puffer eluiert und gelangt durch die Leitung 52

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in das Füllventil 53» das durch ein vorbestimmtes Signal der Zeitmeßvorrichtung 48 geöffnet worden ist. Sobald der gesamte eluierte Anteil das Füllventil 53 passiert hat, wird dieses wieder geschlossen, wobei zusätzlicher, aus der Trennkolonne kommender Puffer durch die Abfalleitung 5^· geleitet wird. Bei Anwendung der Molekularsiebchromatographie zur Trennung von antikörpergebundenem Radioliganden von freiem Radioliganden, erscheint der antikörpergebundene Radioligand zuerst aus der Trennkolonne 51» wird dort eluiert und gelangt durch die Leitung 52 über das Füllventil 53 in die statische Zähl kammer 55» bevor der freie Radioligand wieder aus der Säule auftaucht. Sobald der antikörpergebundene Radioligand von der Säule eluiert ist, schließt das Füllventil 53 und der freie Radioligand wird von der Säule durch die Leitung 52 in das Ventil 53 eluiert und durch die Leitung 54- in einen Abwasserbehälter geleitet.

Die Säule ist nunmehr zur Aufnahme der nächsten Probe bereit. Der zu messende Anteil gelangt auf diese Weise durch die Leitung 56 in den statischen Meßteil 55 des Detektors 35 zur Messung der Radioaktivität. Der statische Meßteil 55 ist in Fig. 3 als Becher gezeigt, der unten eine Einlaßöffnung 57 aufweist. Die restliche Probe fließt aus dem Ventil 53 durch die Leitung 56 und die untere öffnung 57 in den Becher 55· Nachdem die restliche Probe den Becher gefüllt hat, wird eine Radioaktivitätszählung für eine vorbestimmte Zeit, die durch die Zeitmeßvorrichtung 48 gesteuert wird, vorgenommen und durch die Aufzeichnungsvorrichtung 49 aufgezeichnet.

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Zu einer vorbestimmten Zeit während des Zeitraums, in dem die Strahlungsmenge bestimmt wird, sendet die Zeitmeßvorrichtung 48 ein Steuersignal an das Umgehungsventil y\, das wieder die Leitung 29 mit der Leitung 33 verbindet und somit ermöglicht, daß die nächstfolgende Probenlösung in den Detektor 35 steigen kann. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt, nachdem die Leitung 29 mit der Leitung 33 wieder verbunden ist, sendet die Zeitmeßvorrichtung 48 ein Signal zur öffnung des Ventils 59 aus, wodurch die Leitung 61 mit der mit einer Vakuumquelle verbundenen Leitung 63 verbunden wird. Dabei wird die Flüssigkeit durch die peristaltische Pumpe durch die Leitung 63 aus dem Ventil 59 gepumpt. Die Lösung im Becher 55 gelangt dabei durch Unterdruck aus der Austrittsöffnung 65 und wird entfernt. Gegebenenfalls kann der Steuermechanismus so eingestellt werden, daß bei Beendigung einer Steuersequenz und somit bei Beendigung der Analyse einer Probe die Anzeigekonzentration auf eine vorbestimmte minimale Grundlinie zurückkehren muß, bevor der Mechanismus zum Beginn der Analyse der nächsten Probe in Tätigkeit gesetzt wird.

Bei der vorstehend erläuterten Anordnung können die Innenwände des Bechers 55 aus einem nicht haftenden Material, wie Teflon oder Polyphenylensulfid, bestehen. Außerdem kann der Becher so mit Einlaß- und Auslaßöffnungen am Becherboden versehen sein, daß ein Spritzen vermieden wird und der Becher sauber geleert wird, ohne daß eine Puffer-Waschlösung eingeführt wird. Gleichzeitig mit der Betätigung des Ventils 59 sendet die Zeitmeß-

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vorrichtung ein Signal zum Abstoppen der Aufzeichnungsvorrichtung 49, wodurch die Aufzeichnungsvorrichtung den Zählwert auf die Rechenvorrichtung 80 überträgt, wo die Werte nach einem bestimmten Programm ausgewertet werden. Die Aufzeichnungsvorrichtung 49 wird dann wieder in Gang gesetzt und ist zur Aufzeichnung der Daten für die nächste Probe bereit.

Vor der Wiederöffnung des Isolationsventils 31 wird die Einlaßöffnung für den rasch strömenden Puffer durch ein Kontrollsignal von der Zeitmeßvorrichtung geschlossen. Beim Wiederöffnen des Isolationsventils 31, wobei die Leitungen 29 und miteinander verbunden werden, erreicht der Druck in der Leitung 33 den Druck in der Leitung 29» so daß kein plötzliches Rückwaschen durch das Inkubationssystem erfolgt. In ähnlicher Weise erreicht bei geschlossenem Umgehungsventil JA , wobei die Leit ungen 29 und 41 verbunden sind, der Druck in der Leitung 41 etwa den Druck in der Leitung 33, da die Auslaßöffnungen der Leitungen 41 und 5^- physikalisch unter dem gleichen hydrostatischen Druck gehalten werden. Somit ändert sich die Strömungsgeschwindigkeit der Proben nicht, wenn das Ventil 3I betätigt oder außer Tätigkeit gesetzt wird. Eine typische zeitliche Abfolge der Aussendung der Steuersignale ißt in Fig. gezeigt. Bemerkenswert ist, daß der Zeitunterschied zwischen dem Abstellen des Isolationsventils 31 und dem Abstellen des Ventils 43 für den raschen Strom und dem Betätigen des Kolonnen-Luftfallenventils 85 es ermöglicht, daß die Leitung 33 den gleichen hydrostatischen Druck wie die Leitung 29 erreicht,

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so daß ein Rückfließen oder eine Änderung der Strömungsgeschwindigkeit nicht auftritt, wenn die Leitungen 29 und 33 verbunden werden. Zusätzlich ist der Luftraum 70 über dem Säulenbett 60 nun auf Atmosphärendruck.

Das erfindungsgemäße analytische Verfahren liefert dem Analytiker die Daten für ein Verhältnis, das proportional zur gebundenen Radioaktivität dividiert durch die gesamte Eadiοaktivität ist und folgendermaßen auszudrücken ist:

Statische radioaktive Zählung des Antigen-Antikörper-Komplexes

Kinetische Strömungszählung der Radioaktivität in der gesamten Probe

IM die Antigenkonzentration in der ursprünglichen Probe zu erhalten, wird der Wert dieses Verhältnisses mit einer vorher ermittelten Kurve verglichen. Diese Kurve wird durch Auftragen

mit
einer Reihe von an Eichlösungen/bekannten Antigenkonzentrationen gemessenen Verhältnissen ermittelt. Die Eichlösungen werden unter Einhaltung der gleichen Inkubationszeit und der gleichen Temperaturbedingungen, die bei den zu analysierenden Lösungen angewendet werden, dem Testverfahren unterworfen. Die erhaltenen Werte werden in Verhältnisse umgewandelt und anschließend zu einer Eichkurve aufgetragen. Erweist sich das analytische Verfahren in bezug auf sämtliche Parameter der Proben, Antikörper- und Isotopenzusatz und andere für eine hohe Reproduzierbarkeit wesentliche Parameter als konstant, so kann die zweite statische Messung des Antigen (Radioligand)-Antikörper-Komplexes als alleinige Basis für die Berechnung der Eichkurve und die nach-

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folgenden Testergebnisse verwendet werden.

Der Hauptvorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es eine vollautomatisierte Messung der Antigenkonzentration in einer Testprobe in einem Bruchteil der Zeit liefert, die bei herkömmlichen Radioimmuntests erforderlich war. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, eine Testreihe von stark unterschiedlichen Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen ohne Unterbrechung der kontinuierlichen Arbeitsweise der Vorrichtung durchzuführen. Infolgedessen muß das System nicht von qualifiziertem Personal überwacht werden. Es können auch unqualifizierte Arbeitskräfte eingesetzt werden, um die relativ einfachen Arbeiten zur Ingangsetzung des erfindungsgemäßen Systems durchzuführen. Zur Zeit werden tatsächlich hunderte von Arzneistoffen, Hormonen und biochemisch wichtigen Verbindungen durch manuelle Radioimmuntests bestimmt, beispielsweise Digoxin, Insulin, Angiotensin I, Thyroxin, Cyclo-AMP und dergl. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine rasche und genaue Durchführung derartiger Analysen.

Ferner erlaubt das erfindungsgemäße System auch den gleichzeitigen Nachweis von mehreren Antigenen in der gleichen Probe. In diesem Fall werden mehrere verschiedene Isotope zusammen mit den verschiedenen Antigenen verwendet. Der Radioaktivitätsdetektor weist dann die von den einzelnen Isotopen emittierten unterschiedlichen Radioaktivitäten nach und berechnet diese selektiv. Somit können gleichzeitig zwei oder mehrere Antigene bestimmt werden.

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Bei der Trennung unter Verwendung einer Adsorbenssäule muß das Adsorbens nicht verworfen oder nach jeder Trennung regeneriert werden. Vielmehr kann es mehrfach für die einzelnen Proben verwendet werden. In vielen Fällen kommt eine Verwendung für bis zu 1000 Proben in Frage. Kritisch ist nur, daß die Kontaktzeit der Probe mit dem Adsorbens für eine ausreichende Adsorption des gewünschten Bestandteils ausreicht, während sie nicht ausreicht, eine merkliche Disassoziation des vorher adsorbierten Bestandteils zu erlauben. Außerdem darf die Verweilzeit nicht ausreichend sein, daß zusätzliche Bestandteile des Gemisches an zusätzlichen Adsorptionsstellen, die am Adsorbens durch vorherige Adsorptionen der Bestandteile von früheren Gemischen geschaffen worden sind, adsorbiert werden. Es wurde festgestellt, daß bei inkubierten Gemischen in einer Menge von 10,Ul bis 10 ml, die in engem Kontakt mit 100,Ul bis 100 ml des Adsorptionsmaterials gebracht werden, die Kontaktzeit 1 bis 120 Sekunden, vorzugsweise 10 bis 30 Sekunden beträgt.

Als Medium zur Ausführung dieses Kontakts wird vorzugsweise eine gepackte Kolonne mit einem teilchenförmigen Adsorbens verwendet. Die Teilchen des Adsorbens können eine Größe von 10 bis 1000 mesh aufweisen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß das Adsorbens in Form eines Schwamms vorliegt, der mit der Lösung in Kontakt gebracht wird. Das Adsorbens kann auch auf inerte Teilchen oder auf die Wände von dünnen Rohren als Beschichtung aufgebracht sein. Ferner kann das Adsorbens als Aufschlämmung, beispielsweise als wäßrige Aufschlämmung,

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vorliegen, wobei das zu trennende Gemisch zusammen mit der Aufschlämmung gerührt wird.

Die Temperatur zum Zeitpunkt des Kontakts zwischen dem inkubierten Gemisch und dem Adsorbens kann O bis 9O⁰C betragen. Vorzugsweise liegt die Temperatur bei Umgebungstemperatur. Selbstverständlich müssen bei höheren Temperaturen kürzere Kontaktzeiten angewendet werden, um die Antikörper-Antigen-Reaktion auf ein Minimum herabzusetzen. Der obere Teraperaturbereich ist auch deswegen nicht so erwünscht, wie eine Temperatur im Bereich der Umgebungstemperatur, da höhere Temperaturen eine nachteilige Wirkung auf die Stabilität der im Gemisch enthaltenen Antikörper oder Antigene aufweisen.

Anschließend an den Kontakt zwischen dem inkubierten Gemisch und dem Adsorptionsmittel wird das nicht adsorbierte Material von der Kontaktstelle entfernt.

Ist die Kontaktstelle eine Adsorptionssäule, so kann die Säule mit einer Pufferlösung gewaschen werden. Dies bedeutet nicht, daß dabei das Adsorptionsmaterial regeneriert wird. Der Zweck des Waschens besteht nur darin, Rückstände des vorher behandelten Gemisches zu entfernen, so daß eine Verunreinigung der nachfolgenden Probe vermieden wird. Bekanntlich erfordert eine Regeneration der Säule, bei der das adsorbierte Material entfernt werden muß, eine viel längere Zeit als sie für das einfache Spülen des Adsorbens zur Entfernung von lose haftenden, nicht adsorbierten Rückständen

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aus den vorher behandelten Gemischen erforderlich ist.

Die nicht adsorbierten Bestandteile des Gemisches werden dann in eine Meßstation gebracht, wo wie in herkömmlichen Systemen eine quantitative Bestimmung von nachweisbarem Antigen oder Antikörper vorgenommen wird.

Das Adsorbens ist anschließend bereit zur Aufnahme des nächstfolgenden inkubierten Gemisches zur Adsorption von Bestandteilen. Da zu dieser Adsorption, wie vorstehend erläutert, nur eine kurze Zeit erforderlich ist, kann in rascher Folge eine große Anzahl von inkubierten Gemischen behandelt werden. Während eine Probe, die bereits der Adsorptionsbehandlung unterworfen worden ist, sich bei endgültigen Messung befindet, kann die nächste Probe bereits in die Trennvorrichtung zur Adsorption eingeführt und zur endgültigen Messung vorbereitet werden. Somit erlaubt das erfindungsgemäße System eine sehr rasche, wirksame und kontinuierliche Arbeitsweise, was in vollkommenem Gegensatz zu herkömmlichen automatisierten Verfahren zur Immunbestimmung steht. Nachstehend sind die Merkmale der vorstehend beschriebenen Ausführungsform zusammengefaßt:

Es wird ein Verfahren zur Durchführung eines Immuntests an einer Mehrzahl von Eroben, die gegebenenfalls ein zu bestimmendes Antigen oder einen zu bestimmenden Antikörper enthalten, zur Verfügung gestellt, wobei jede Probe mit einer Lösung mit einem Gehalt an nachweisbarem Antigen oder Antikörper zur Bildung einer Mehrzahl von Gemischen inkubiert

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wird und wobei jedes Gemisch komplexierten Antigen-Antikörper, nicht komplexiertes Antigen und nicht komplexierten Antikörper enthält. Mindestens einer der Bestandteile dieses Gemisches wird durch Adsorption getrennt. Anschließend wird die Menge des nachweisbaren Antigens oder Antikörpers in den nicht adsorbierten Anteilen des Gemisches nachgewiesen.

Bei der Trennung wird kontinuierlich und nacheinander mindestens ein zu trennender Bestandteil von jedem einzelnen Gemisch getrennt, wobei

aus
ein erstes Gemisch/der Mehrzahl der Gemischeuber ein Adsorbens gegeben wird, das die zur Trennung vorgesehenen Bestandteile aus dem Gemisch adsorbiert, der nicht adsorbierte Anteil des Gemisches vom Adsorbens getrennt wird und

in Wiederholung das jeweils nächstfolgende Gemisch aus der Mehrzahl der Gemische über das gleiche Adsorbens gegeben wird, ohne daß die aus dem vorhergehenden Gemisch bereits adsorbierten Bestandteile zwischenzeitlich entfernt werden, und bei jedem Schritt der nicht adsorbierte Anteil vom Adsorbens entfernt wird,

wobei jedes der aufeinanderfolgenden Gemische mit dem Adsorbens ausreichend lang in Eontakt steht, daß eine Adsorption des Bestandteils erfolgt, während die Kontaktzeit nicht ausreicht, daß eine merkliche Disassoziation des vorher adsorbierten Bestand-

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teils erfolgt und daß eine Adsorption von zusätzlichen Bestandteilen des Gemisches an zusätzlichen Adsorptionsstellen, die durch vorhergehende Adsorption der Bestandteile aus dem vorhergehenden Gemisch am Adsorbens geschaffen worden sind, erfolgt.

Zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird also·eine Vorrichtung zur Durchführung des Immuntests an einer

die
Mehrzahl von Proben,/gegebenenfalls ein zu bestimmendes Antigen

gestellt, oder einen zu bestimmenden Antikörper enthalten, zur Verfugung / Diese Vorrichtung weist eine Vorrichtung zum Inkubieren jeder Erobenlösung mit einem Gehalt an nachweisbarem Antigen oder Antikörper unter Bildung einer Mehrzahl von inkubierten Gemischen auf, wobei jedes Gemisch komplexierten Antigen-Antikörper, nicht komplexiertes Antigen und nicht komplexierten Antikörper enthält, sowie eine Vorrichtung zum Abtrennen von mindestens einem der Bestandteile der einzelnen Gemische durch Adsorption, und eine Vorrichtung zum Nachweis der Menge an nachweisbarem Antigen oder Antikörper in einem der nicht adsorbierten Anteile des Gemisches.

Dabei ist die Trennvorrichtung so ausgestattet, daß sie kontinuierlich und nacheinander mindestens einen der Bestandteile, die zur Trennung aus den einzelnen Gemischen vorgesehen sind, trennt.

Die Trennvorrichtung weist folgende Merkmale auf:

Eine Vorrichtung, mit der ein erstes Gemisch von den einzelnen

Gemischen über ein Adsorbens, das die zur Trennung aus dem

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Gemisch vorgesehenen Bestandteile adsorbiert, gegeben wird;

ein Adsorbens, das beim Kontakt mit dem Gemisch die speziellen Bestandteile adsorbieren kann;

eine Vorrichtung zum Entfernen des nicht adsorbierten Anteils des Gemisches vom Adsorbens; und

eine Vorrichtung, mit der in Wiederholung das jeweils nächstfolgende Gemisch aus der Mehrzahl der Gemische über das gleiche Adsorbens gegeben werden kann, ohne daß eine zwischenzeitliche Entfernung der Bestandteile des Gemisches, die am Adsorbens aus den vorhergehenden Gemischen adsorbiert worden sind, erfolgt, und eine Vorrichtung zur Entfernung des nicht adsorbierten Anteils vom Adsorbens nach jedem Durchlauf.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können eine Reihe von verschiedenen Antigenen und Antikörpern und Komplexen derselben behandelt werden. Nachstehend sind Beispiele für Antigene und entsprechende Antikörper und Komplexe, die getrennt werden können, angegeb en:

Hypophysenhormone:

Wachstumshormon adrenocorticotropes Hormon (ACTH)

iaelanocytenstimulierendes Hormon (MSH) cc-MSH ß-MSH

Glycoproteine:

thyroidstimulierendes Hormon (TSH)

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follikelstimulierendes Hormon (FSH) luteinisierendes Hormon (LH)

Prolactin Lipοtropin (LPH) Vasopressin Qxytocin chorionische Hormone:

menschliches chorionisches Gonadotropin (HCG) menschliches chorionisches Somatomammotropin (HCS)

pankreatische Hormone:

Insulin Proinsulin C-Peptid Glueagon

calcitrope Hormone:

parathyroides Hormon (PTH) Calcitonin (CT)

gastrointestinale Hormone:

Gastrin Secretin Cholecystokinin-Pancreozymin (CCK-PZ) Enteroglucagon

vasoaktive Gewebshormone:

Angiotensine Bradykinine

Hypothalamus releasing-Faktoren:

Thyrotropin-releasing-Faktor (TEP) Steroide:

Aldosteron

Testosteron

Dihydrotestosteron

östradiol

Östron

Östriol

2-Hydroxyö stron

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Pro staglandine Thyroidhormone:

Tri j odthyronin Thyroxin

Arzneistoffe:

Digoxin Digitoxin Morphin LSS

cyclische Nucleotide:

cAMP cGMP cIMP cXJMP

Enzyme:

CpEsterase

Fructose-1,6-diphosphatase

Viren:

Australia-Antigen (HAA) Tumor-Antigene:

carcinoembryonisches Antigen-Fötoprotein Serumproteine:

Thyroxin-bindendes Globulin Immunoglobulin G (IgG) Albumin

Weitere:

Intrinsic-Paktor rheumatoider Faktor Folsäure Neurophysin

Nachstehend sind Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Adsorptionsmittel aufgeführt:

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Nicht-spezifische Materialien, die zu Antigen-Antikörper-Trennunp;en verwendet werden können

Beispiele für handelsübliche Materialien, die Material Art der Bindung verwendet werden können

Styrol-Divinylbenzol Ionenaustausch Aminex Amberlite Polystyrol Dowex

Epoxyamin Bio-Rad AG Dualite

Polyalkylenamin Bio-Rex

Acryl-Polymerisat Chelex Permutit

Cellulose CM-Cellulose

Dextran-Polymerisat DEAE-Cellulose

Agarose DEAE-Sephadex

Glas und Siliciumdioxid QAE-Sephadex

DEAE-Biogel CM-Biogel

Hydroxyapatit Absorption Biogel HT Cellulose Dowex

Silicagel Cellex N

Aluminiumoxid Bio-Sil A

Polystyrol
Aktivkohle

Der hier verwendete Ausdruck "Adsorbens" soll im breitesten Sinn Materialien umfassen, die Antigene oder Antikörper durch Absorption,Adsorption oder Bindung durch relativ stabile Assoziation von zwei Substanzen ohne Rücksicht auf die tatsächliche chemische Natur der Assoziation binden.

sich
Erfindungsgemäß lassen/Digoxin, Cyclo-AMP, Cyclo-GMP, Insulin, Angiotensin I und Thyroxin leicht bestimmen. In diesen Fällen werden die Probe, die Isotopenlösung und die Antiseren 30 Sekunden aufgezogen ,mit einer 2 1/2-minütigen Waschzeit zwischen den Proben. Die Zeit vorrichtung wird gemäß Fig. 5 eingestellt. Luftblasen werden in einer Geschwindigkeit von 0,32 ml/min in die Leitung 14 eingeführt. In der Leitung 63 erfolgt ein Pump-

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Vorgang mit 3»9 ml/min, um eine Saugwirkung zu erzeugen, wodurch beim öffnen des Ventils 59 die statische Zählzelle 55 rasch entleert wird. Die Tabelle I enthält die wesentlichen Angaben für diese Bestimmungen in bezug auf Reagentien und Strömungsgeschwindigkeiten. Der Variationskoeffizient bei diesen Bestimmungen beträgt etwa 2 Prozent.

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Tabelle 1 Reagentien für die automatisierte RadioimmunbestiTmminp;

CD OO tA> CD ">. O OO O

Ge-

0,1 ml/min

—η u υ—

0,1 ml/min

Trenn

0,23 ml/min 7,8 ml/min

Puffer

1

3390

zeit

Tem-

*

Um-

schwin- 0,1 ml/min

ligand
(0,2 ^iCi/ml)8

säule 60

leitung 30

rasch Zählung

liche

pe-

ge-

dipikeit —>

125-

Antiseren 5

strömend für Β_Λ

Verzö

ra-

•

bungs-

Verbindung (Probe)

Pufferlösunger

3325

gerung

tur

tem-

2153

in der

pera-

Spiral ι

tur

Digoxigenin

(min)

3-0-Tyrosin

Lösung 1

1990

3

39⁰C

AG 1-X8

plus 5 mg/ml

Lösung 1

ScAMP-TME

1:30 000

100-200

Rinderserum

ohne

ScGMP-TME

mesh plus

albumin

Brij-35

21

Digoxin

Aktiv

21

1:2000

kohle

Monokodiertes

1:1000

60-200

cyclo-AMP

Insulin

mesh

Lösung 2

2290

21

Um

cyclo-GMP

oder

Lösung 2

1540

ge
bung s-

2000

ohne

tem

Röhrchen

Brij-35

pera

Insulin

handels

tur

Mono^odiertes

übliche ·

AG 1-X8

Angiotensin I

Antiseren

100-200

Thyroxin

in 100 ml

mesh

21

9x45 mm

9

1:2500

Angiotensin I

500

Röhrchen

Thyroxin (T-4)

handels-

übliche

in 50 ml

Antiseren

Lösung 1 ist eine 50 millimolare Natriumacetatlösung vom pH-Wert 4,7 mit einem Gehalt an 0,015 Brij-35· Lösung 2 ist eine 50 millimolare Tris-HCl-Lösung vom pH-Wert 9»2 mit einem Gehalt an 0,015 Prozent Brij-35- Die Thyroxin-Isotopen-Lösung enthält auch 1:5000 Natrium-merthiolate (Thiomersal). Der Radioligand wird im Waschpuffer gelöst. Die Antiseren werden im Puffer in der Pufferleitung verdünnt. ScAMP-TME (2'-0-Succinyl-cyclo-AMP-tyrosinmethylester) und ScGMP-TME (2'-0-Succinyl-cyclo-GMP-tyrosin-

125
methylester) werden mit *V markiert. Die spezifische Aktivität beträgt 100 bis 200 Ci/mMol. ²^J-Digoxigenin-3-0-tyrosin (spezifische Aktivität I5OO Ci/mMol). Monojodiertes Insulin (100 χ jiCi^ig), monojodiertes Angiotensin I (687 ^iCi/^ig). Thyroxin- ^J (118 piCiy^ug) verdünnt in Lösung 1 oder 2.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Fig. 6 zeigt eine Eichkurve für cyclo-AMP,nachdem die Standards acetyliert worden sind (500^1 Standard + 1O_xUl Triäthylamin + ^ Essigsäureanhydrid). Diese Werte und sämtliche folgenden Werte der Eichkurve werden mit der Konzentration des zu messenden Liganden auf den Abszissen (log) gegen das Verhältnis der für die Standards gefundenen Radioaktivität zu der Radioaktivität, wenn nur der Radioligand vorhanden ist, aufgetragen (B/B -Verhältnis). Unabhängig davon, ob die Ergebnisse durch Korrektur unter Verwendung der ersten Zählung (Zählung 1) normalisiert werden, ist das Endergebnis das gleiche, da die ersten Zählungen

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gleich wären, wenn eine vollkommene Reproduzierbarkeit beim Pumpen aufträte. Die untersuchte Verbindung gilt als wichtiger Vermittler der Hormonwirkung.

Beispiel2

Fig. 7 zeigt eine Eichkurve für cyclo-GMP nach der Acetylierung der Standards. Wahrscheinlich ist cyclo-GMP ein wichtiger Regulator für Prozesse, die durch das parasympathische Nervensystem gesteuert werden. Teilweise wird auch angenommen, daß cyclo-GMP einen wichtigen Indikator des Zellwachstums darstellt, so daß sein Auftreten im Urin zum Nachweis von bestimmten malignen Organerkrankungen eingesetzt werden könnte. Die hier gezeigte Empfindlichkeit ist ausreichend, um cyclo-GMP in weniger als 1 ^l von menschlichem Urin zu messen.

Beispiel 3

Fig. 8 zeigt eine Eichkurve für Digoxin. Für eine Messung sind weniger als 4- Minuten erforderlich. Digoxin ist ein wichtiges Herzglycosid, das allein in den Vereinigten Staaten von 3 bis Millionen Personen eingenommen wird. Dieser Wirkstoff stimuliert das Herz bei Patienten mit kongestiven Herzstörungen. Dieser Arzneistoff ist jedoch auch sehr stark toxisch, da er Herzrythmusstörungen hervorruft. Digoxinkonzentrationen im Serum von 1,4- ng/ml sind als therapeutisch anzusehen, während Serumkonzentrationen von etwa 2,5 bis 3 ng/ml als toxisch gelten. Es ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Testverfahren ausreichend empfindlich ist, um diesen Unterschied festzustellen.

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Venn handelsübliche Serum-Digoxinstandards wiederholt bestimmt werden, ergibt sich eine ausgezeichnete Übereinstimmung, wie in Fig. 9 gezeigt ist. Diese Figur zeigt auch die ausgezeichnete Stabilität der erfindungsgemäßen Vorrichtung über einen langen Zeitraum hinweg.

Beispiel 4

Fig. 10 zeigt eine Eichkurve für Angiotensin I. Während die Plasmakonzentrationen sehr gering sind, ist der Radioimmuntest für Angiotensin I sehr wertvoll zur Bestimmung der Plasmareninaktivität (PEA). Die normale PRA beträgt etwa 1 bis 6 ng/ml Angiotensin I/Stunde, während abnormale Werte bei 10 bis 100 ng/ml Angiotensin I/Stunde liegen. Somit läßt sich erfindungsgemäß leicht eine Unterscheidung treffen.

Beispiel 5

Insulin ist ein wichtiges Hormon zur Regelung des physiologischen Gleichgewichts von Glucose. Die Messung von Insulin im Serum oder Plasma ist ein wertvolles Hilfsmittel bei der Diagnose und Behandlung von Patienten mit Diabetes. Die InsulinbeStimmung dauert mit herkömmlichen Verfahren im allgemeinen mehrere Tage. Fig. 11 zeigt eine Eichkurve für Insulin. Die gesamte Testzeit für eine einzelne Insulinprobe beträgt erfindungsgemäß nur 21 Minuten. Dies ist sehr wertvoll in solchen Fällen, wo die Kenntnis der Insulinkonzentration im Serum kritisch ist, um einen Therapieplan für einen Diabetespatienten mit Insulinstörung zu entwickeln. Die Empfindlichkeit dieses Tests ist ausreichend, um

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Insulin in solchen Konzentrationen, die normalerweise in der klinischen Medizin auftreten, zu bestimmen.

Beispiel 6

Fig. 12 zeigt eine Eichkurve für Thyroxin. Die Empfindlichkeit der automatischen Bestimmung ist mit der von anderen Radioimmuntests für Thyroxin vergleichbar.

Beispiel 7

Der automatisierte Eadioimmuntest der Erfindung ist besonders vielseitig, da er alternierend zur Bestimmung von unterschiedlichen Proben verwendet werden kann. Die folgenden 9 Substanzen werden in den angegebenen Konzentrationen auf die Probenscheibe gebracht. Bei der Verarbeitung der einzelnen Proben werden die entsprechenden Isotopenlösungen aufgezogen. Die Inkubationszeit beträgt 21 Minuten bei 39°C. Zwischen den einzelnen Proben tritt keine Verzögerung auf. Es dauert 27 Minuten, bis alle 9 Proben in die Vorrichtung aufgezogen sind. Besonders bemerkenswert ist die ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit zwischen den verschiedenen Antigenen zu wechseln, ohne daß eine Äquilibrierungszeit erforderlich ist.

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Tabelle II

Probe Nr.	Verbindung	ηκ/ml	B/B_
1	Angiotensin I	O	¹ " ¹O¹ 1,00
2	Angiotensin I	25	0,23
3	Insulin	O	1,00
4	Thyroxin	0	1,00
5	Insulin	25	0,45
6	Thyroxin	O	1,05
7	Insulin	25	0,42
8	Angiotensin I	25	0,20
9	Insulin	0	0,95

Beispiel 8

Fig. 13 zeigt die Messung von Anti-cyclo-AMP-Antikörpern in Ziegenseren, die von Ziegen gewonnen worden sind, die mit cyclo-AMP, das chemisch an menschliches Serumalbumin gekuppelt worden ist, immunisiert worden sind. Das erfindungsgemäße automatisierte Immuntest-System wird zur Bestimmung von Anti-cyclo-AMP-

125 Antikörpern unter Verwendung von mit -^J markiertem Succinylcyclo-AMP-tyrosin-methylester eingesetzt. Kurve A ist die Verdünnungskurve von Antiserum von einer Ziege, 17 Tage nach einer Wiederholungsimmunisierung. Kurve B stellt ein Antiserum, das 37 Tage nach der gleichen Auffrischung gewonnen worden ist, dar. In ähnlicher Weise stellen die Kurven C und D die Anti-cyclo-AMP-Antikörper in Antiseren einer zweiten Ziege 14 Tage (C) und 37 Tage (D) nach der Wiederholungsimmunisierung dar. E stellt ein Kontrollserum einer nicht immunisierten Ziege dar.

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Beispiel 9

Fig. 14 zeigt einen Immuntest für Digoxin, bei dem die Eichkurve unter Verwendung einer Trennvorrichtung erhalten worden ist, bei der Antiseren gegen Digoxin (aus Schafen) kovalent an Agaroseperlen von 50 bis 100 mesh gebunden sind.

Beispiel 10

Pig. 15 zeigt einen Immuntest für Digoxin. Bei der anfänglichen Inkubation wird Schaf-Anti-Digoxin-Serum verwendet. Die Trennung wird an einer Säule mit einem Gehalt an immobilisiertem raschem Anti-Schaf-IgG erreicht.

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75.. Leerseite

Claims

DIPL-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUS PATENTANWALT

MÜNCHEN PS, SIEBERTSTRASSE 4 P.O. BOX M 07 67 PHONE: (0 89) 47 40 75

CABLE ADDRESS: BENZOLPATENT MÖNCHEN

TELEX 5-294S3 VOPAT D

u.Z.: M 112

Case: M-666, 302-UVA

THE HECTOR AHD VISITORS OP THE UNIVERSITY OF VIRGINIA

Charlottesville, Virginia, V.St.A.

11. März 1977

"Verfahren, zur radioimmunologischen Bestimmung der Antigen- oder Antikörperkonzentration in Proben und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens"

!Priorität: 12. März 1976, V.St.A., Nr. 666 302 7. Oktober 1976, V.St.A., Nr. 730 630

Patentansprüche

' 1.jAutomatisierte Vorrichtung zur Durchführung von Radioimmuntests, gekennzeichnet durch

eine Vorrichtung zur zeitlich gesteuerten Inkubation einer Mehrzahl von Probenlösungen, von denen jede ein Gemisch aus

(a) einer Probe, gegebenenfalls mit einem Gehalt an einem zur Bestimmung vorgesehenen Antigen oder Antikörper,

(b) einer Lösung eines mit einem radioaktiven Isotop mar-

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ORIGINAL INSPECTED

kierten Antigens oder Antikörpers von bekannter Konzentration und

(c) einer Lösung mit einem bekannten Titer eines Antiserums

mit einem Gehalt an Antikörpern oder Antigenen, die mit dem genannten Antigen oder Antikörper reagieren können,

enthält,

eine Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität, mit der eine kinetische Radioaktivitätsmessung einer kontinuierlich durchlaufenden Lösung und eine statische Radioaktivitätsmessung einer statisch in der Vorrichtung gehaltenen Lösung vorgenommen werden kann,

eine Vorrichtung zum Einbringen der inkubierten Probe in die Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität,

eine Zeitmeß vorrichtung, die durch die Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität aktivierbar ist, wenn die Nachweisvorrichtung einen vorbestimmten Radioaktivitätsschwellenwert feststellt, mit der Zeitfolgen gemessen und Regelsignale in vorbestimmten Zeitfolgen erzeugt werden können,

eine mit der Nachweisvorrichtung gekoppelte Aufzeichnungsvorrichtung zum Aufzeichnen der in der Nachweisvorrichtung festgestellten Radioaktivität,

eine Trennvorrichtung zum Auftrennen der kinetisch gemessenen

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Lösung in einen ersten Teil mit einem Gehalt an nicht mit dem Antikörper umgesetztem Antigen und einen zweiten Teil mit einem Gehalt an mit dem Antikörper umgesetztem Antigen,

eine Vorrichtung zum Einbringen von einem der Teile aus der Trennvorrichtung in die Vorrichtung zur Messung der Radioaktivität zum statischen Nachweis und

eine Vorrichtung zum Isolieren der inkubierten Probe aus zusätzlichen, in die Testvorrichtung eingebrachten Probelösungen, wobei die Vorrichtung zum Isolieren durch ein von der Zeitmeßvorrichtung ausgegebenes Signal aktivierbar ist, das System bei einem ersten vorbestimmten Signal der Zeitmeßvorrichtung isoliert und bei einem zweiten vorbestimmten Signal der Zeitmeßvorrichtung das System wieder mit der Inkubationsvorrichtung verbindet und wobei die zweite vorbestimmte Zeitdauer so festgelegt ist, daß genügend Zeit zur Beendigung der statischen Messung bleibt, bevor die nächste inkubierte Probe in der Nachweisvorrichtung zur nächstfolgenden kinetischen Radioaktivitätsmessung ankommt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jede Probelösung ein Gemisch aus

(a) einer Probe, gegebenenfalls mit einem Gehalt an einem zur Bestimmung vorgesehenen Antigen,

(b) einer Lösung eines mit einem radioaktiven Isotop markierten Antigens und

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(c) einer Lösung mit einem bekannten Titer eines Antiserums mit einem Gehalt an Antikörpern, die mit dem genannten Antigen reagieren können,

enthält.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufzeichnungsvorrichtung die Menge der Radioaktivität in der Probe aufzeichnet, während diese kinetisch die Nachweisvorrichtung durchläuft, und daß die Testergebnisse von der Aufzeichnungsvorrichtung als Verhältnis der statischen Messung zur kinetischen Messung erhalten werden.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch g e kennz ei chnet, daß die Nachweisvorrichtung einen ersten Abschnitt, der zum Nachweis der Radioaktivitätsmenge einer kinetisch durchlaufenden Probe geeignet ist, und einen zweiten Abschnitt, der zum Nachweis der Radioaktivitätsmenge einer im wesentlichen in statischem Zustand gehaltenen Probelösung geeignet ist, aufweist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung zur Erhöhung

Strömungs

der/geschwindigkeit der inkubierten Probe durch die Trennvorrichtung vorgesehen ist, die durch ein Signal von der Zeitmeßvorrichtung nach der kinetischen Messung aktiviert wird.

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6. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, zusätzlich gekennzeichnet durch eine Vorrichtung zur Aufnahme der Probe (a), eine Vorrichtung zur Aufnahme der Lösung (b) mit einer bekannten Konzentration des markierten Antigens und eine Vorrichtung zur Aufnahme der Lösung (c) mit einer bekannten Konzentration des Antikörpers sowie eine Vorrichtung zum Entnehmen und Mischen der Flüssigkeiten der einzelnen Aufnahmevorrichtungen zu einem Erobengemisch und zum Eintreiben der Probenlösung in die zeitlich gesteuerte Inkubationsvorrichtung.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmevorrichtung der Probe (a) aus einer Scheibe besteht, die eine Mehrzahl von nacheinander angeordneten Bechern hält, wobei die Scheibe so drehbar ist, daß jeder Becher nacheinander in eine Beschickungsstellung gebracht werden kann, und daß eine mit der Pumpvorrichtung gekoppelte Pipette sich in der Beschickungsstellung befindet, wobei die Pipette zwischen einer ersten Stellung, in der sie in den in die Beschickungsstellung gebrachten Becher getaucht werden kann, und einer zweiten Stellung, in der sie keine Probe aufnehmen kann, beweglich ist, aber nicht die Drehung der Scheibe behindert, wobei zum Einbringen der jeweils nächsten Probe in das System die Scheibe in die Beschickungsstellung für den am nächsten angeordneten Becher und die Pipette ebenfalls in ihre Beschickungsstellung gebracht wird, worauf eine

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Probe aus dem Becher in die Pipette durch einen in der Pipette mittels der Pumpvorrichtung erzeugten Unterdruck entnommen wird.

β. Vorrichtung nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe eine Mehrzahl von nacheinander angeordneten Becherserien hält, wobei jede Serie einen Becher mit der zu bestimmenden Probe, einen Becher mit der Lösung des markierten Antigens und einen Becher mit der Antikörperlösung umfaßt, daß die Scheibe so drehbar ist, daß jede dieser Serien in die Beschickungsstellung gebracht werden kann, und daß eine der Becheranzahl in diesen Serien entsprechende Anzahl von Pipetten vorgesehen sind, die jeweils mit den Pumpvorrichtungen gekoppelt sind, so daß nach

in

der Drehung der Scheibe/die Beschickungsstellung die einzelnen Pipetten in einen Becher dieser Serien gebracht werden und somit die Einführung dieser Serien gleichzeitig erfolgt, wobei die pipettierten Lösungen und die Proben mittels der Pumpvorrichtung vermischt und in die zeitlich gesteuerte Inkubationsvorrichtung gebracht werden.

9· Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zeitlich gesteuerte Inkubationsvorrichtung aus einem Becher besteht, in dem die Probenlösung für eine vorbestimmte Zeitdauer deponiert wird, bevor sie mittels der Einbringvorrichtung in die Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität gebracht wird.

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10. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einbringvorrichtung eine temperaturgesteuerte Leitung ist, durch die die Probenlösung läuft, wobei die Länge dieser Leitung so beschaffen ist, daß beim Durchlaufen der Lösung mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit, die durch die Pumpvorrichtung gesteuert wird, eine ausreichende Inkubation erreicht wird.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mehrzahl von zu bestimmenden Probenlösungen nacheinander in die Leitung eingeführt wird, so daß die Inkubation von mehreren Proben gleichzeitig

und nacheinander erfolgt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben durch Einführen einer Pufferlösung zwischen die aufeinanderfolgenden Proben getrennt werden, wobei die Pufferlösung mittels einer Pufferzuführvorrichtung in die Leitung eingeführt wird.

13. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennz eichnet, daß die Pumpvorrichtung aus einer peristaltischen Pumpe besteht.

Vorrichtung nach Anspruch 13, zusätzlich gekennzeichnet durch eine Blasenbildungsvorrichtung, die zwischen der Pumpvorrichtung und der Inkubationsvor-

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richtung angeordnet ist, wodurch in den aus der Pumpvorrichtung kommenden Flüssigkeitsstrom intermittierend Luftblasen injiziert werden, um ein gleichmäßigeres Fließen der Flüssigkeit durch die Inkubationsvorrichtung zu erreichen.

15· Vorrichtung nach Anspruch 14-, zusätzlich gekennzeichnet durch eine Vorrichtung zum Entfernen der Blasen aus der Probe nach dem Durchlaufen der Inkubationsvorrichtung.

16. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolationsvorrichtung ein zwischen der ersten und der zweiten Stellung drehbares Ventil aufweist, das eine Leitung von der Inkubationsvorrichtung mit einer Leitung zur Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität und mit einer Abfalleitung verbindet, wobei in der ersten Stellung diese Leitung mit der Abfallleitung verbunden ist und wobei eine Drucksteuervorrichtung vorgesehen ist, so daß der Druck innerhalb dieser Leitung für die Inkubationsvorrichtung unabhängig davon, ob sich das Ventil in der ersten oder in der zweiten Stellung befindet, relativ konstant gehalten wird.

17· Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum Nachweis der Radioaktivität ein /^-Detektor ist.

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18. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Abschnitt einen Becher zur Aufnahme einer Lösung aufweist, der am Boden Einlaß- und Auslaßöffnungen aufweist, so daß er unter minimalem Verspritzen der Lösung an die Wände gefüllt und entleert werden kann.

19. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennvorrichtung eine gepackte Säule mit kontinuierlichem Strom ist, die ein Adsorbens enthält, das selektiv das während der Inkubation nicht mit dem Antikörper umgesetzte Antigen adsorbiert.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in eine erste, mit Aktivkohle gepackte und eine zweite, mit einem Ionenaustauscherharz gepackte Zone unterteilt ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennvorrichtung eine Säule mit kontinuierlichem Fluß ist, die ein Adsorbens enthält, das selektiv den während der Inkubation gebildeten Antigen-Antikörper-Reaktionskomplex adsorbiert.

22. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Steigerung der Strömungsgeschwindigkeit der inkubierten Probe aus

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einer Vorrichtung zum Einführen einer relativ rasch fließenden Pufferlösung in die die inkubierte Probe befördernde Leitung besteht, so daß die Probe in und durch die Trennvorrichtung bewegt wird und gleichzeitig Rückstände in die Trennvorrichtung bewegt werden.

23· Verfahren zur Durchführung eines kontinuierlichen Radioimmuntests, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

eine Mehrzahl von Probenlösungen wird für eine vorbestimmte Zeit inkubiert, wobei jede Probenlösung ein Gemisch aus

(a) einer Probe, gegebenenfalls mit einem Gehalt an einem zur Bestimmung vorgesehenen Antigen oder Antikörper,

(b) einerLösung eines mit einem radioaktiven Isotop markierten Antigens oder Antikörper von bekannter Konzentration und

(c) einerLösung mit einem bekannten Titer eines Ant_serums mit einem Gehalt an Antikörpern oder Antigenen, die mit dem genannten Antigen oder Antikörper reagieren können,

enthält, wobei die Konzentration des Antikörpers oder Antigens so gewählt wird, daß sich eine inkubierte Probe mit einem Gehalt an einem Antikörper-Antigen-Komplex, nicht umgesetztem Antigen oder Antikörper und markiertem Antigen oder Antikörper bildet, sofern die Probe ein Antigen oder einen Antikörper enthält;

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die inkubierte Probe wird einem Radioaktivitätsdetektor zugeführt, der in der Lage ist, eine kinetische Radioaktivitätsmessung einer kontinuierlich durchlaufenden Lösung auszuführen;

die Menge der Radioaktivität in der konzentrierten Probe wird mit einem vorbestimmten Schwellenwert verglichen und eine Zeitmeßvorrichtung wird aktiviert, wenn dieser Schwellenwert überschritten wird;

auf ein vorbestimmtes Signal der Zeitmeßvorrichtung wird die inkubierte Probe von allen weiteren, zu inkubierenden Proben isoliert;

die inkubierte Lösung wird in einen ersten Teil mit einem Gehalt an nicht umgesetztem Antigen oder Antikörper und markiertem Antigen oder Antikörper und einen zweiten Teil mit einem Gehalt an Antikörper-Antigen- und markierten Antikörper-Antigen-Komplexen getrennt;

jeder dieser Teile wird in einen Radioaktivitätsdetektor geleitet, der die Radioaktivitätsmenge in der Probe feststellt, während die Probe unter praktisch statischen Bedingungen gehalten wird, und die Messung wird aufgezeichnet ;

dieser Teil wird entfernt und verworfen;

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eine folgende inkubierte Probe wird auf ein vorbestimmtes Signal der Zeitmeßvorrichtung in den Radioaktivitätsdetektor geleitet, so daß die nächste inkubierte, zu bestimmende Probe im Radioaktivitätsdetektor zur nächsten kinetischen Messung ankommt, nachdem die vorhergehende statische Radioaktivitätsmessung beendet ist; und

das Verhältnis der statischen Radioaktivitätsmessung zur kinetischen Messung wird mit einem vorher geeichten Verhältnis zur Bestimmung der zu ermittelnden Antigenmenge verglichen.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß jede Probenlösung ein Gemisch aus

(a) einer Probe, gegebenenfalls mit einem Gehalt an einem zur Bestimmung vorgesehenen Antigen,

(b) einerLösung eines mit einem radioaktiven Isotop markierten Antigens und

(c) einerLösung mit einem bekannten Titer eines Antiserums mit einem Gehalt an Antikörpern, die mit dem genannten Antigen reagieren können, enthält.

25· Kontinuierliches Verfahren nach den Ansprüchen 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß die inkubierte Probe isoliert wird und die Fließgeschwindigkeit der inkubierten Probe durch eine Abtrennvorrichtung erhöht wird, die durch ein vorbestimmtes Signal der Zeit-

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meßvorrichtung aktivierbar ist.

26. Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 23 und 24,

dadurch gekennzeichnet, daß die Probenlösung in einem laminarem Strom durch eine bei einer gesteuerten Inkubationstemperatur gehaltene Leitung geleitet wird und daß Blasen intermittierend in diese Leitung eingeführt werden, um eine gleichmäßige Bewegung der Probenlösung durch die Leitung zu gewährleisten, wobei die Blasen am Ende der Inkubation freigesetzt werden.

27· Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß die inkubierte Probe durch eine Leitung durch ein Isolationsventil, das die Probe von allen weiteren inkubierenden Proben isoliert und in den Radioaktivitätsdetektor leitet, wobei die zum Isolationsventil führende Leitung auf einem bestimmten konstanten Druck gehalten wird.

28. Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des ersten und zweiten Teils in einer Adsorptionskolonne durchgeführt wird, wobei das Antigen und das isotopenraarkierte Antigen adsorbiert und der Antigen-AntikÖrper-Komplex sowie der markierte Antigen-Antikörper-Komplex durchgelassen werden.

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29. Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung des ersten und zweiten Teils der einzelnen inkubierten Erobenlösungen in einer Adsorptionskolonne durchgeführt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29,dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens zur Trennung von mehr als einer inkubierten Probenlösung verwendet wird.

- Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierten Anteile der inkubierten Probenlösungen an der Adsorptionskolonne zurückgehalten werden.

32. Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 28 bis y\, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorptionskolonne eine Kombination eines ersten, mit Aktivkohle gepackten Abschnitts und eines zweiten, mit Dowex 1-Anionenaustauscherharz gepackten Abschnitts ist.

33· Verfahren nach Anspruch 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorptionsmittel Aktivkohle verwendet wird.

34. Verfahren nach Anspruch 28 bis y\ ,dadurch gekennzeichnet, daß als Säulenmaterial ein MoIe-

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kularsieb vom Sephadex-Typ verwendet wird.

35· Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Strömungsgeschwindigkeit der inkubierten Probe durch die Trennvorrichtung erhöht wird, indem ein schnell fließender Strom einer Pufferlösung in die zum Radioaktivitätsdetektor führende Leitung injiziert wird.

36. Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mehrzahl von Probenlösungen einen kontinuierlichen Strom bildet, wobei jede Probenlösung durch Anteile einer Pufferlösung, die zwischen die einzelnen Probenlösungen innerhalb der Inkubationsleitung eingeführt werden, isoliert sind.

37· Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 23 und 24·,

dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmenden, aufeinanderfolgenden Probenlösungen unterschiedliche Antikörper-Antigen-Systeme enthalten.

38. Kontinuierliches Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennz ei chnet, daß die aufeinanderfolgenden, zu bestimmenden Probenlösungen die gleiche Probe von der gleichen Probenquelle, aber unterschiedliche Lösungen von Antikörpern und markierten Antigenen enthalten, so daß die aufeinanderfolgenden Bestimmungen zum Nachweis von unter-

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schiedlichen Antigenen an der Probe des gleichen Patienten durchgeführt werden.

39. Verfahren zur Durchführung eines Radioimmuntests an einer Mehrzahl von Proben, von denen jede gegebenenfalls ein zu bestimmendes Antigen oder einen zu bestimmenden Antikörper enthält, wobei jede Probe mit einer Lösung mit einem Gehalt an nachweisbarem Antigen oder Antikörper unter Bildung einer Mehrzahl von Gemischen, die jeweils komplexierten Antigen-Antikörper, nicht komplexiertes Antigen und nicht komplexierten Antikörper enthalten, inkubiert wird, mindestens einer der Bestandteile dieses Gemisches durch Adsorption getrennt wird und anschließend die Menge des nachweisbaren Antigens oder Antikörpers in den nicht adsorbierten Anteilen des Gemisches nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Abtrennung verwendete Abtrennvorrichtung kontinuierlich und nacheinander mindestens eine der zu trennenden Komponenten aus jedem der Mehrzahl von Gemischen abtrennt, indem

ein erstes Gemisch über ein Adsorbens, an dem die abzutrennenden Komponenten aus dem Gemisch abgetrennt werden, geleitet wird,

vom Adsorbens der nicht adsorbierte Anteil des Gemisches entfernt wird und

anschließend das jeweils folgende Gemisch aus der Mehrzahl

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ohne daß von Gemischen über das gleiche Adsorbens geleitet wird, / dazwischen die an dem Adsorbens aus den vorhergehenden Gemischen adsorbierten Bestandteile entfernt werden, und vom Adsorbens der nach jedem Durchlauf nicht adsorbierte Anteil entfernt wird,

wobei jedes aufeinanderfolgende Gemisch ausreichend lang mit dem Adsorbens in Kontakt steht, so daß die Adsorption des Bestandteils erfolgt, während die Kontaktzeit nicht ausreicht, um eine merkliche Disassoziation des vorher adsorbierten Bestandteils zu bewirken, und die auch nicht ausreicht, um eine Adsorption der zusätzlichen Bestandteile des Gemisches an zusätzlichen Adsorptionsstellen, die durch vorherige Adsorption der Bestandteile aus dem vorhergehenden Gemisch am Adsorbens geschaffen worden sind, zu bewirken.

40. Verfahren nach Anspruch 39»dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation nicht bis zur Erreichung des Gleichgewichts durchgeführt wird, so daß das inkubierte Gemisch wesentliche Mengen an komplexiertem Antigen-Antikörper, nicht komplexiertem Antigen und nicht komplexiertem Antikörper enthält.

41. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die auf das Adsorbens aufgebrachten Proben ein Volumen von 1O₇Ul bis 10 ml pro 100 ^il bis 100 ml

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' des Adsorbens aufweisen und daß die Verweilzeit 1 bis Sekunden bei einer Temperatur von O bis 9O°C beträgt.

42. Verfahren nach Anspruch 39»dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in der Lage ist, die Antigene aus einem Gemisch aus nicht komplexierten Antigenen, nicht komplexiertem Antikörper und Antigen-Antikörper-Komplex zu adsorbieren.

43. Verfahren nach Anspruch 39»dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens ein Anionenaustauscherharz ist.

44. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens ein überschüssiger
immobilisierter Antikörper ist, der in der Lage ist,
das nicht komplexierte Antigen zu adsorbieren.

45. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens ein immobilisierter
Antikörper ist, der in der Lage ist, den Antikörper oder den Antigen-Antikörper-Komplex zu adsorbieren.

46· Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennz eichnet, daß das Adsorbens eine Kombination aus zwei oder mehr adsorbierenden Materialien ist.

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47. Vorrichtung zur Durchführung eines Immuntests an einer Mehrzahl von Proben, von denen jede gegebenenfalls ein zu bestimmendes Antigen oder einen zu bestimmenden Antikörper enthält, wobei eine Vorrichtung zur Inkubation der einzelnen Probenlösungen mit einem Gehalt an nachweisbarem Antigen oder Antikörper unter Bildung einer Mehrzahl von inkubierten Gemischen, wobei jedes Gemisch komplexierten Antigen-Antikörper, nicht komplexiertes Antigen und nicht komplexierten Antikörper enthält, eine Vorrichtung zum Abtrennen von mindestens einem der Bestandteile der einzelnen Gemische durch Adsorption und eine Vorrichtung zum Nachweis der Menge des nachweisbaren Antigens oder Antikörpers in einem der nicht adsorbierten Anteile der einzelnen Gemische vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennvorrichtung eine Vorrichtung zum kontinuierlichen und aufeinanderfolgenden Abtrennen von mindestens einem der Bestandteile, die zur Trennung aus den einzelnen Gemischen vorgesehen sind, aufweist, wobei folgende Merkmale vorgesehen sind:

eine Vorrichtung, mit der ein erstes Gemisch aus der Mehrzahl von Gemischen über ein Adsorbens geleitet wird, das die zur Abtrennung aus dem Gemisch vorgesehenen Bestandteile adsorbiert;

ein Adsorbens, das in der Lage ist, die speziellen Bestandteile innerhalb des mit dem Adsorbens in Kontakt gebrachten

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Gemisches zu adsorbieren,

eine Vorrichtung zum Entfernen des nicht adsorbierten Anteils des Gemisches vom Adsorbens und

eine Vorrichtung, mit der das darauffolgende Gemisch aus der Mehrzahl von Gemischen über das gleiche Adsorbens geleitet wird, ohne daß dazwischen die Bestandteile des Gemisches, die am Adsorbens von den vorhergehenden Gemischen adsorbiert sind, abgetrennt werden, sowie eine Vorrichtung zum Entfernen des nicht adsorbierten Anteils vom Adsorbens nach jedem Durchlauf.

48. Vorrichtung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens in Teilchenform vorliegt und in einer Adsorptionskolonne enthalten ist.

49. Vorrichtung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens ein Ionenaustauscherharz ist.

50. Vorrichtung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens aus einem überschüssigen immobilisierten Antikörper besteht, der in der Lage ist, nicht komplexiertes Antigen zu adsorbieren.

51. Vorrichtung nach Anspruch 47, dadurch gekenn-

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zeichnet, daß das Adsorbens aus einem immobilisierten Antikörper besteht, der in der Lage ist, einen Antikörper oder Antigen-Antikörper-Komplex zu adsorbieren.

52. Vorrichtung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens aus einer Kombination von 2 oder mehr adsorbierenden Materialien besteht.

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