JP5734947B2 - 異常型ミトコンドリアdna、関連融合転写物および翻訳産物、並びにそのハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents
異常型ミトコンドリアdna、関連融合転写物および翻訳産物、並びにそのハイブリダイゼーションプローブ Download PDFInfo
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Description
この出願は、米国仮出願61/040,616号(2008年3月28日出願)の優先権を主張するPCT出願PCT/CA2009/000351号(2009年3月27日出願)の部分継続出願である。このような先願の記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される。
本発明は、ミトコンドリアのゲノミックス及びプロテオミクス分野に関する。一態様では、本発明は、ミトコンドリアゲノム融合転写物、及びそれにハイブリダイズするプローブといった翻訳産物の同定並びに利用に関する。
<ミトコンドリアゲノム>
ミトコンドリアゲノムは、小規模であるが重要な核酸配列である。ミトコンドリアDNA、すなわち「mtDNA」は、33億bpという莫大な核ゲノム(一倍体)と対比して、16,569核酸塩基対(bp)(Anderson et al., 1981;Andrews et al., 1999)の小ゲノムを含む。その遺伝子相補体は、その核細胞メイトよりも実質的に小さい(0.0005%)。しかしながら、個々の細胞は、特定の細胞機能に依存して、およそ103〜104個のミトコンドリアを保有する(Singh and Modica-Napolitano 2002)。情報伝達または化学的シグナル伝達は、一般的に、核およびミトコンドリアゲノム間で起こる(Sherratt et al., 1997)。さらに、特定の核構成成分がミトコンドリア配列の維持および安定性に関与する(Croteau et al., 1999)。一旦受精が起きると、卵細胞内のミトコンドリアのクローン拡大のため、所定の個体におけるmtDNAゲノムは全て同一である。しかしながら、突然変異誘発性事象は、体細胞突然変異として反映される配列多様性を誘導し得る。これらの突然変異は、異形成として知られている状態で身体全体の異なる組織中に蓄積し得る。
約3,000個の核遺伝子がミトコンドリアを構築し、操作し、維持するために必要とされるが、ミトコンドリアゲノムによりコードされるのはこれらのうちの37個のみである。このことは、ミトコンドリアが核遺伝子座に重度に依存していることを示す。ミトコンドリアゲノムは、正しい翻訳を保証する、2つのrRNA及び22のtRNAを含む24の遺伝子の相補体、ならびに電子伝達に不可欠である残り13の遺伝子をコードする(図1参照)。ミトコンドリアゲノムは、ミトコンドリアゲノムにより供給される13のポリペプチドのほかに、この生命機能に必要な酸化および還元反応を成し遂げるために70の核コード化タンパク質に依存する。核およびミトコンドリアタンパク質の両方は、ミトコンドリア内膜に及ぶ複合体を形成し、細胞代謝に必要な化学燃料である、アデノシン三リン酸、すなわちATPの80〜90%を集合的に生成する。エネルギー産生のほかに、ミトコンドリアは、同様に他の代謝経路においても中心的役割を果たす。ミトコンドリアの重要な機能は、細胞死またはアポトーシスの媒介である(Green and Kroemer, 2005参照)。本質的に、ミトコンドリア外膜を、あるいはさらに、同様にミトコンドリア内膜を透過するシグナル経路が存在する。特定のミトコンドリアタンパク質が細胞基質に放出される場合、不可逆的細胞死が始動される。このプロセスは、いくつかのミトコンドリアタンパク質が有する多機能な役割を強調する。これらのマルチタスク型タンパク質は、同様に、代替的機能を有し得る他のミトコンドリアタンパク質が存在する、ということを示唆する。
ミトコンドリアゲノムは、環状であり、イントロンがないDNA分子であるという点で異常型である。上記ゲノムは、特定長の配列と隣接する反復モチーフが点在する。これらの反復間の配列は、欠失する傾向にあり、十分に理解されていない状況下である。ミトコンドリアゲノム中の反復の数を考えると、多数の考え得る欠失が存在する。最も良く知られた例は、4977の「共通欠失」である。この欠失は、いくつかの名を挙げられた症状および疾患と関連付けられてきており、老化に伴い頻度が増大すると考えられる(Dai et al., 2004;Ro et al., 2003;Barron et al., 2001;Lewis et al., 2000;Muller-Hocker, 1998;Porteous et al., 1998)(図4)。ミトコンドリアゲノムの分野における最新の見解は、ミトコンドリア欠失が、活性酸素種およびUVRのような作用物質によるミトコンドリアゲノムに対する損傷の単なる有害副産物である、というものである(Krishnan et al 2008, Nature Genetics)。さらに、高レベルのmtDNA欠失は、細胞呼吸に必要な遺伝子配列を失う結果として、ATPの形態でエネルギーを産生する細胞の能力に重篤な結果を及ぼし得ると認識されているが、これらの欠失ミトコンドリア分子は、下流経路の一構成成分であり、意図された機能的役割を有し、そして、ミトコンドリアの認識遺伝子の代替的天然形態としてより適切である、とは予測されない。
融合タンパク質およびこれらの結果として生じる癌に対する影響について、重要な核の優位が存在する。核内のMLL遺伝子パートナーの転座は、急性白血病及び治療に関連した急性骨髄性白血病に続きトポイソメラーゼIIを標的とする作用物質で処理する危険性が高いこととの密接な相関を確立する(Libura et al., 2005)。最近、ヒトMLL遺伝子の約50の転座がこれら癌に関連していることが知られている(Meyer et al., 2005)。これらの突然変異に関し破断する点は、部分的なタンデム複製であろうと転座であろうと、これら主たる事象について、核内の、AluIといった特定の反復モチーフ内で起きる。これら突然変異のほとんどは、相互転座(84%)であり、約40の相違した遺伝子を含む(Libura et al. 2005)。
本発明の目的は、異常型ミトコンドリアDNA、関連融合転写物および翻訳産物、並びにそのハイブリダイゼーションプローブを提供することにある。
以下の添付の図面を参照しながら、単なる例として本発明の実施形態をここで説明する。
本発明は、癌を予測し、診断および/またはモニタリングするのに有用な、新規のミトコンドリア融合転写物、親突然変異化mtDNA分子、及びその結果として生じる翻訳産物を提供する。本発明はさらに、融合転写物および関連mtDNA分子の検出のためのハイブリダイゼーションプローブ、このようなプローブの使用を提供する。
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
上記で考察したように、ミトコンドリア融合転写物は、大豆(Morgens et al 1984)、および稀な神経筋障害に罹患しているヒト(Nakase et al 1990)で、報告されている。しかしながら、ヒト癌と関連した融合転写物は記載されていない。
ミトコンドリアDNA(mtDNA)動力学は、重要な診断ツールである。mtDNAにおける突然変異は、しばしば、疾患発症の予備的指標であり、疾患開始に関連した危険因子を示すバイオマーカーとして振舞う。本発明によれば、ミトコンドリアゲノムにおける突然変異の結果、癌に関連した融合転写物が生成される。したがって、このような転写物をコードするmtDNAならびに癌の検出、診断およびモニタリングのためにそれに向けられるプローブの使用が提供される。
本発明による突然変異体mtDNA配列は、融合転写物の生成を引き起こす任意の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、挿入、転座、欠失、重複、組換え、再配列またはその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。修飾または変化はわずか2〜3塩基から数キロ塩基までサイズを大きく変え得るし、好ましくは、修飾は、かなり多くの欠失またはその他の大規模ゲノム異常を生じる。
FUS10744:14124(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L(ND4L)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号3)
FUS7974:15496(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号4)
FUS7992:15730(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号5)
FUS8210:15339(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号6)
FUS8828:14896(ATPシンターゼF0サブユニット6(ATPアーゼ6)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号7)
FUS10665:14856(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L(ND4L)〜シトクロムb(Cytb))(配列番号8)
FUS6075:13799(シトクロムcオキシダーゼサブユニットI(COI)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号9)
FUS6325:13989(シトクロムcオキシダーゼサブユニットI(COI)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号10)
FUS7438:13476(シトクロムcオキシダーゼサブユニットI(COI)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号11)
FUS7775:13532(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号12)
FUS8213:13991(シトクロムcオキシダーゼサブユニットII(COII)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号13)
FUS9191:12909(ATPシンターゼF0サブユニット6(ATPアーゼ6)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号14)
FUS9574:12972(シトクロムcオキシダーゼサブユニットIII(COIII)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号15)
FUS10367:12829(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット3(ND3)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号16)
FUS11232:13980 (NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4(ND4)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5)(配列番号17)
FUS8469:13447(OrigMet)(ATPシンターゼF0サブユニット8〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット)(配列番号18)
FUS9144:13816(ATPシンターゼF0サブユニット6(ATPアーゼ6)〜NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5(ND5))(配列番号54)。
配列番号2(FUS8469:13447;AltMet)
配列番号3(FUS10744:14124)
配列番号4(FUS7974:15496)
配列番号5(FUS7992:15730)
配列番号6(FUS8210:15339)
配列番号7(FUS8828:14896)
配列番号8(FUS10665:14856)
配列番号9(FUS6075:13799)
配列番号10(FUS6325:13989)
配列番号11(FUS7438:13476)
配列番号12(FUS7775:13532)
配列番号13(FUS8213:13991)
配列番号14(FUS9191:12909)
配列番号15(FUS9574:12972)
配列番号16(FUS10367:12829)
配列番号17(FUS11232:13980)
配列番号18(FUS8469:13447;OrigMet)
配列番号54(FUS9144:13816)
および、その断片またはバリアント。
本発明の別の態様は、本発明の異常型mtDNA配列を認識し得るハイブリダイゼーションプローブを提供することである。本明細書中で用いる場合、「プローブ」という用語は、標的領域中の配列とプローブ中の少なくとも1つの配列との相補によって、標的核酸中の配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、当該技術分野で既知の方法に従って標識され得る。
生物学的試料中の異常型mtDNAのレベルの測定は、被験者における1つ以上の癌の存在を確定し得る。したがって、本発明は、癌を予測する、診断する、あるいはモニタリングするための方法であって、1つ以上の生物学的試料を得ること、上記試料からmtDNAを抽出すること、ならびに以下の:試料中の1つ以上の異常型mtDNAの量を定量し、そして検出された量を参照値と比較することにより異常型mtDNAに関して試料をアッセイすることを含む方法を包含する。当業者に理解されるように、参照値は、上記方法が、癌を予測する、診断する、あるいはモニタリングしようとするかに基づいている。したがって、参照値は、1つ以上の既知の非癌性生物学的試料から、1つ以上の既知の癌性生物学的試料から、および/または長期間に亘って採取された1つ以上の生物学的試料から収集されたmtDNAデータと関連し得る。
a)プローブのうちの少なくとも1つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行し、少なくとも1つのプローブを相補的な異常型ミトコンドリアDNA配列とハイブリダイズさせるステップ;
b)少なくとも1つのプローブとハイブリダイズされるミトコンドリアDNAの量を定量することにより、上記試料中の少なくとも1つの異常型ミトコンドリアDNA配列の量を定量するステップ;および
c)上記試料中のミトコンドリアDNAの量を少なくとも1つの既知の参照値と比較するステップ
を包含する方法を提供する。
本発明はさらに、癌を予測し、診断し、および/またはモニタリングするための方法において有用な、融合転写物および関連ハイブリダイゼーションプローブの同定を提供する。当業者に明らかなように、このような分子は、天然転写物の単離により、あるいは、本発明の方法に従って単離されるmtDNAの組換え発現により得られる。上記のように、このようなmtDNAは、典型的には、第一遺伝子からの開始コドンおよび第二遺伝子の終止コドンを有する、スプライスされた遺伝子を含む。したがって、それらから得られる融合転写物は、スプライスされた遺伝子に関連した接合点を含む。
天然融合転写物は、生物学的試料から抽出され、当該技術分野で既知の任意の適切な方法に従って同定され得る、あるいは実施例に記載される方法に従って実行され得る。本発明の一実施形態では、ポリ−Aテールを有する転写物を標的とするオリゴ(dT)プライマーを用い、その後、上記標的転写物に対して設計されたプライマー対を用いたRT−PCRにより、安定なポリアデニル化融合転写物が同定される。
配列番号20(転写物2;10744:14124)
配列番号21(転写物3;7974:15496)
配列番号22(転写物4;7992:15730)
配列番号23(転写物5;8210:15339)
配列番号24(転写物6;8828:14896)
配列番号25(転写物7;10665:14856)
配列番号26(転写物8;6075:13799)
配列番号27(転写物9;6325:13989)
配列番号28(転写物10;7438:13476)
配列番号29(転写物11;7775:13532)
配列番号30(転写物12;8213:13991)
配列番号31(転写物14;9191:12909)
配列番号32(転写物15;9574:12972)
配列番号33(転写物16;10367:12829)
配列番号34(転写物17;11232:13980)
配列番号35(転写物20;8469:13447;OrigMet)
配列番号53(転写物13;9144:13816)。
融合転写物が一旦特性化されれば、生物学的試料中の転写物を標的にするように、プライマーまたはプローブが開発され得る。このようなプライマーおよびプローブは、(上述した)任意の既知の方法を用いて、あるいは以下で提供される実施例に記述されるように、調製され得る。プローブは、例えば、融合転写物のために生成され得、例えばPanomics(商標)によるQuantiGene 2.0(商標)といった検出技術が、試料中の転写物の存在を検出するために用いられる。プライマーおよびプローブは、本発明の例示的な融合転写物に対して直接的に、あるいはその断片またはバリアントに対して生成され得る。例えば、表1に開示される配列と同様に、配列番号18〜35および53に示された配列は、所望の融合配列を含む核酸配列を検出するプローブを設計するために用いられ得る。
生物学的試料中のミトコンドリア融合転写物のレベルの測定は、被験者における1つ以上の癌の存在を確定し得る。したがって、本発明は、癌を予測する、診断する、あるいはモニタリングするための方法であって、1つ以上の生物学的試料を得ること、上記試料からミトコンドリアRNAを抽出すること、ならびに以下の:試料中の1つ以上の融合転写物の量を定量し、検出された量を参照値と比較することにより融合転写物に関して試料をアッセイすることを包含する方法を提供する。当業者に理解されるように、参照値は、癌を予測する、診断する、あるいはモニタリングしようとするかに基づいている。したがって、参照値は、1つ以上の既知の非癌性生物学的試料から、1つ以上の既知の癌性生物学的試料から、および/または長期間に亘って採取された1つ以上の生物学的試料から収集された転写物データと関連し得る。
a)上記プローブのうちの少なくとも1つを用いてハイブリダイゼーション反応を実行し、少なくとも1つのプローブを相補的異常型ミトコンドリア融合転写物とハイブリダイズさせるステップ;
b)少なくとも1つのプローブとハイブリダイズされた転写物の量を定量することにより、試料中の少なくとも1つのミトコンドリア融合転写物の量を定量するステップ;および、
c)試料中のミトコンドリア融合転写物の量を少なくとも1つの既知の参照値と比較するステップ
を包含する方法を提供する。
現在まで、ミトコンドリア融合タンパク質は、検出または単離されていなかった。しかしながら、下記に提示する実施例からミトコンドリア融合転写物のレベルが観察されたこと、およびこれらはポリアデニル化されたという明示は、そのようなミトコンドリア融合タンパク質の存在を支持する証拠を提示する。よって、本発明は、癌を予測し、診断し、および/またはモニタリングするための融合タンパク質の同定を提供する。
配列番号37(転写物2)
配列番号38(転写物3)
配列番号39(転写物4)
配列番号40(転写物5)
配列番号41(転写物6)
配列番号42(転写物7)
配列番号43(転写物8)
配列番号44(転写物9)
配列番号45(転写物10)
配列番号46(転写物11)
配列番号47(転写物12)
配列番号48(転写物14)
配列番号49(転写物15)
配列番号50(転写物16)
配列番号51(転写物17)
配列番号52(転写物20)
配列番号55(転写物13)。
本発明の融合タンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性荷電相互作用クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む、公知の方法によって生物学的試料から回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)が、精製のために用いられる。
本発明のアッセイでの使用のためのタンパク質特異的な抗体は、本発明の野生型または発現融合タンパク質、またはその抗原性ポリペプチド断片に対して産生し得る。これらは、動物系(例えばラビットまたはマウス)においてアルブミンといったキャリアタンパク質と一緒に存在し得る、あるいは十分に長い(少なくとも約25アミノ酸)場合、キャリアなしに存在し得る。
生物学的試料中の、融合タンパク質といった翻訳産物の測定は、被験者における1つ以上の癌の存在を確定し得る。したがって、本発明は、癌を予測する、診断する、あるいはモニタリングするための方法であって、1つ以上の生物学的試料を得ること、上記試料からミトコンドリア融合タンパク質を抽出すること、ならびに以下の:試料中の1つ以上の分子を定量し、そして検出された量を参照値と比較することによりそのような分子に関して試料をアッセイすることを含む方法を包含する。当業者に理解されるように、参照値は、上記方法が、癌を予測する、診断する、あるいはモニタリングしようとするかに基づいている。したがって、参照値は、1つ以上の既知の非癌性生物学的試料から、1つ以上の既知の癌性生物学的試料から、および/または長期間に亘って採取された1つ以上の生物学的試料から収集されたタンパク質データと関連し得る。
(診断装置)
本発明は、特定の疾患を診断する、あるいは特定の突然変異を同定するのに用いられる、バイオチップ、遺伝子チップ、またはマイクロアレイといった診断装置を包含する。シークエンシングされた全ミトコンドリアゲノムは、塩基対の配置のコンセンサス(consenus)構造を形成するよう評価され、特定疾患または病気に関連した塩基対欠失および突然変異の比率に関する禁止インデックス(a prohibiting index)が割り当てられた。そして、上記診断構成は、バイオチップ、遺伝子チップ、またはマイクロアレイを形成するのに用いられる。
ポリヌクレオチドアレイは、1つ以上の標的核酸配列を包含する試料について多数のポリヌクレオチドをアッセイし得る高い生産性を有する技術である。本発明のアッセイは、遺伝子発現分析、疾患の診断、および病気の予後診断(例えば治療に対する患者の応答をモニタリングする等)に有用である。
マイクロアレイは、固体支持体の一表面に付着した複数の固有ポリヌクレオチドを包含し、ポリヌクレオチドはそれぞれ、非同定の予め選択された領域における固体支持体の表面に付着している。上記アレイに関連する試料はそれぞれ、下記により詳述するように、公知の同定物(通常は公知の配列)のポリヌクレオチド成分を含む。本発明では、任意の考え得る基板が利用され得る。
マイクロアレイの標的は、1つ以上の生物学的試料に由来し得る。ハイブリダイゼーション前に標的核酸試料を増幅することが望ましい。当該技術分野の当業者であれば、定量結果が必要な場合にどのような増幅方法が用いられるか、増幅したポリヌクレオチドの相対頻度を維持する、あるいは制御する方法を用いるためにそのような対処をとるべきか、理解できるであろう。「定量」増幅の方法は、当該技術分野の当業者によく知られている。例えば、定量PCRは、同じプライマーを用いて既知量のコントロール配列を同時に共増幅することを包含する。これにより内部基準が供され、PCR反応を校正するのに用いられる。よって、高密度アレイは、増幅されたポリヌクレオチドの定量のための内部基準に特異的なプローブを含み得る。定量PCRの詳細なプロトコールは、PCRプロトコール、A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990)に提供されている。他の適した増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)(Innis, et al., PCR Protocols. A guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, (1990))に限定されず、リガーゼ連鎖反応法(LCR)(Wu and Wallace, Genomics, 4: 560 (1989), Landegren, et al., Science, 241: 1077 (1988) およびBarringer, et al., Gene, 89: 117 (1990)参照)、転写増幅法(Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989))、並びに自家持続配列複製法(Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990))を包含する。
ハイブリダイゼーションおよび任意の洗浄ステップ、および/またはそれに続く慣習的な自然処理後に、結果としてハイブリダイゼーションパターンが検出される。ハイブリダイゼーションパターンを検出する、あるいは可視化するに際し、標識の強度またはシグナル値は、検出されるだけでなく定量される。これにより意味することは、ハイブリダイゼーションスポットそれぞれからのシグナルは、測定され、既知数の末端標識された標的ポリヌクレオチドにより放射されたシグナルに対応する単位値と比較されて、ハイブリダイゼーションパターンにおけるアレイ上の特定スポットに対しハイブリダイズされた末端標識標的のコピー数(copy number)の数値すなわち絶対値を得るということである。
検出または可視化に続いて、ハイブリダイゼーションパターンは、試料が形成された、組織、体液、器官、細胞等の状態すなわち健康状態とともに、アレイに接触されハイブリダイゼーションパターンを生成した、標識された標的ポリヌクレオチド試料の遺伝子プロファイルに関する定量的情報を確定するのに用いられる。この点で、本発明は、さらに、癌を検出するための診断試験を提供する。本発明は、患者の健康状態のモニタリングを提供する。本発明の方法によれば、癌の存在は、患者から生物学的試料を得ることにより検出される。核酸を含む試験試料は、生物学的試料から調製される。上記試料から抽出された核酸は、アレイにハイブリダイズされる。このアレイは、固体支持体および複数の核酸構成要素を包含し、各構成要素は、疾患の存在または癌の素因を明示している。この診断試験によれば、アレイ上の1つ以上の核酸構成要素に対する、核酸を含む試料のハイブリダイゼーションは、癌または癌の素因を明示する。
本発明の方法はさらに、1つ以上のアッセイ結果に基づいたモニタリングレジメまたは療法コースを推奨するステップを包含し得る。これにより、個別化医療、例えば、患者の癌の進行をモニタリングすることによる(例えば初期またはその後の突然変異がいつ起きたかを認識することによる)癌療法、あるいは治療(例えば、突然変異が安定化された時を認識することによる)を臨床医が実施できるようになる。
本発明は、1つ以上の生物学的試料を取得する、あるいは収集することを含む診断的試験を提供する。本発明の内容において、「生物学的試料」は、mtDNA、mtRNA、並びに翻訳産物若しくは融合タンパク質が取得され得る細胞を含有する組織または体液を指す。例えば、生物学的試料は、皮膚、肺、乳房、前立腺、神経、筋肉、心臓、胃、結腸、直腸組織等(これらに限定されない)を含めた組織から、あるいは血液、唾液、脳脊髄液、痰、尿、粘液、滑液、腹水、羊水等から得られる。生物学的試料は、癌性または非癌性組織から得られ、外科検体または生検検体(これらに限定されない)であり得る。
本発明は、臨床環境において癌を検出するための診断/スクリーニングキットを提供する。このようなキットは、1つ以上の試料採取手段を、本発明による1つ以上のプローブと組合せて包含し得る。代替的に、あるいはそれに加えて、上記キットは、本発明の翻訳産物を検出する手段を包含し得る。
本発明の種々の態様を、以下の実施例を用いた例証により記載する。本明細書中で提供される実施例は、本発明のある具体的実施形態を例証するだけのものであって、如何なる点でも本発明の範囲を限定するよう意図されない。
ミトコンドリア4977「共通欠失」、およびPCT出願番号PCT/CA2007/001711(WO2009/039601として公開、この記載内容は参照により本明細書中で援用される)で本出願人により以前に同定された3.4kb欠失は、結果として、前立腺組織においてオリゴ−dT選抜により同定されるような活性転写物を有する独特のオープンリーディングフレームとなる(図2および3)。乳房組織試料の検査も、3.4kb欠失に起因する安定なポリアデニル化融合転写物の存在を明示する(図4)。
(RNA単離cDNA合成)
メーカーの使用説明書に従って、Aurum(商標)total RNA Fatty and Fibrous Tissue kit(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて、急速凍結前立腺および乳房組織試料(腫瘍に隣接する悪性試料および正常試料の両方)からトータルRNAを単離した。この実験では、ゲノムDNAのコンタミネーションは回避されるべきものであったため、当該技術分野で一般に知られているような方法を用いて、DNアーゼI処理ステップが包含された。ND−1000分光光度計(NanoDrop(登録商標) technologies)により、RNAの量および質を確定した。約100gの出発物質から、トータルRNA濃度は、260/280比で1.89〜2.10であり、100から1000ng/μLまで変化した。RNA濃度を100ng/μLに調整し、メーカーの使用説明書に従って、SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)における一次鎖DNA合成のために、各鋳型2μLを用いた。安定ポリアデニル化融合転写物を同定するために、ポリ−Aテールを有する転写物を標的とするオリゴ(dT)プライマーを用いた。
リアルタイムPCRは、DNAエンジンOpticon(登録商標)2連続蛍光検出システム(Bio-Rad, Hercules, CA)で、iQ(商標)SYBR(登録商標)Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA)とともに5μLの各cDNA鋳型を用いて実施された。4977bp欠失を標的とするプライマー対は:8416F 5’−CCTTACACTATTCCTCATCAC−3’、13637R 5’−TGACCTGTTAGGGTGAGAAG−3’であり、3.4kb欠失に対するプライマー対は:ND4LF 5’−TCGCTCACACCTCATATCCTC−3’、ND5R 5’−TGTGATTAGGAGTAGGGTTAGG−3’である。反応カクテルは、以下のものを含む:2×SYBR(登録商標)Green Supermix(100mMのKCl、40mMのトリス−HCl(pH8.4)、0.4mMの各dNTP[dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP])、iTaq(商標)DNAポリメラーゼ(50ユニット/ml)、6mMのMgCl2、SYBR(登録商標)Green1、20nMのフルオロセイン、並びに安定剤)、250nMの各プライマー、並びにddH2O。PCRサイクルパラメーターを以下に示す:(1)95℃、2分間、(2)95℃、30秒間、(3)55℃(4977bp欠失に関して)および63℃(3.4kb欠失に関して)、30秒間(4)72℃、45秒間、(5)プレート読取、その後、ステップ3〜5を39サイクル、そして4℃で最終インキュベーション。サイクル閾値および融解曲線の分析とは別に、増幅産物を具体的に可視化するためにアガロースゲルにおいて試料を泳動させた(図2〜4参照)。
3.4kb欠失のような突然変異ミトコンドリアゲノムに起因する新規の転写物の存在を検出し、さらに実証するために、種々のハイブリダイゼーションプローブを設計した。この目的のために、定量的遺伝子発現解析用のシングルプレックス分枝DNAプラットホーム(QuantiGene 2.0(商標)、Panomics(商標))を利用した。この実施例で列挙した特定の欠失および配列は、配列番号1で示される全mtDNAゲノムに関するそれらの相対的位置に基づいている。本実施例においてプローブが設計された4つの転写物の核酸配列は、本明細書中で以下のように同定される:転写物1(配列番号18)、転写物2(配列番号19)、転写物3(配列番号20)および転写物4(配列番号21)。
上記の4つの融合転写物、すなわち転写物1〜4を用いて、一患者からの2つの前立腺組織試料を分析して、新規の予測融合転写物の定量的差を評価した。実験結果を、以下の表2に示すが、この場合、「Homog 1」は、一患者からの凍結前立腺腫瘍組織のホモジネートを指し、「Homog 2」は、その患者の当該腫瘍に隣接する凍結正常前立腺組織のホモジネートを指す。これらの試料を、25.8mgのHomog 1および28.9mgのHomog 2で出発して、メーカーのプロトコール(QuantiGene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantiGene(登録商標)2.0 Reagent System User Manual)に従って処理した(表5aおよび5bに検定設定を示す)。
3.4kb mtゲノム欠失に関連した新規の融合転写物である転写物2のみに絞ることを除き、実施例3と同一プロトコールを用いて、乳房腫瘍の2つの試料およびその腫瘍に隣接する無腫瘍組織の2つの試料、ならびに前立腺腫瘍組織の3つの試料(1試料は隣接無腫瘍組織を含む)に関して、分析を実行した。本実施例に関する結果を、表4に示す。対応する正常組織切片を有する前立腺腫瘍組織は、腫瘍組織が、正常隣接組織の約2倍の量の融合転写物を有するという点で、実施例3で分析した前立腺試料と同様のパターンを実証した。乳房腫瘍試料は、隣接する非腫瘍組織と比較した場合、融合転写物レベルが顕著に増大したことが実証された。ホモジネートの1:100希釈液は、実施例3で言及した実験において最も再現可能的に実施されるので、この分析のために用いられた。
この試験は、結腸直腸癌を検出するに際して本発明のいくつかの転写物の有効性を確定することを目的としている。9例のコントロール(良性)組織試料(試料1〜9)および10例の腫瘍(悪性)組織試料(試料10〜19)を含む合計19の試料を調製した。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(QuantiGene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantiGene(登録商標)2.0 Reagent System User Manual)。7つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物を、前記実施例にて述べた方法で調製した。転写物の特性を、以下のように要約する:
a)3回反復アッセイでのCV(変動係数)を確定する;≦15%である場合は、許容可能である。
上記分析の結果を図6a〜6g(試料番号に対する、log2aRLU−log2hRLUのプロットを含む)に示す。各転写物に関する結果から確定された、それぞれのROC(受信者動作特性)曲線も示す。
上記の結果は、結腸直腸癌の検出、および正常結腸直腸組織から悪性組織の区別に際して、転写物2、3、8、9、10、11および12の有用性を例証する。上記のように、転写物2および3は、前立腺癌の検出において有用性があることも見出された。転写物2は、乳癌の検出において有用性があることも見出された。転写物11は、黒色腫皮膚癌の検出において有用性があることも見出された。転写物8は、肺癌の検出において有用性があることも見出された。列挙したいくつかの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における結腸直腸癌の特性化の検出のためのツールとして用いられ得る。
この試験は、肺癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定することを目的としている。実施例5の場合と同様に、9例のコントロール(良性)組織試料(試料1〜9)および10例の腫瘍(悪性)組織試料(試料10〜19)を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(QuantiGene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantiGene(登録商標)2.0 Reagent System User Manual)。ホモジネートを1:8に希釈し、4つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物の量を、Glomax(商標)マルチ検出システム(Promega)によって、相対的発光強度単位(RLU)で転写物の量を測定した。各転写物について、全試料を3回反復してアッセイした。バックグラウンドの測定(鋳型なし)についても、同様に3回反復して実行した。
転写物6:正常(良性)および悪性群(p=0.06)の平均(p<0.1)間に統計学的有意差が存在する。ROC曲線により実証されるようなカットオフ値−6.5691の使用は、結果として、感受性が80%になり、特異性が71%になった。曲線下面積は0.77であり、これは適正な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。
実施例6からの結果は、肺癌腫瘍の検出における本発明の転写物6、8、10および20の有用性、および悪性および正常肺組織間の区別を例証する。これら3つの転写物のいずれかを、臨床設定における肺癌の検出または特性化のために用い得る。
この試験は、黒色腫の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定することを目的としている。この試験では、5例のコントロール(良性)組織試料および9例の悪性組織試料を含む合計14の試料を用いた。全試料をホルマリン固定し、パラフィン包埋した(FFPE)。FFPE組織試料を切片にして試験管に入れ、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(Quantigene(登録商標)2.0 Sample Processing Kit for FFPE Samples;およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual)。ホモジネートを1:4に希釈し、7つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物の量を、Glomax(商標)マルチ検出システム(Promega)によって、相対的発光強度単位(RLU)で測定した。各転写物について、全試料を3回反復してアッセイした。バックグラウンドの測定(鋳型なし)についても、同様に3回反復して実行した。
転写物6:正常および悪性群(p=0.01)の平均(p≦0.01)間に統計学的有意差が存在する。さらに、ROC曲線により実証されるようなカットオフ値−5.9531の使用は、結果として、感受性が89%になり、特異性が80%になった。曲線下面積は0.96であり、これは、非常に良好な試験精度を示す。選択される閾値を、特定用途に関する試験の特異性または感受性を増大するよう調整し得る。
実施例7からの結果は、悪性黒色腫の検出における本発明の転写物6、10、11、14、15、16および20の有用性を例証する。上記のように、転写物10および11は、結腸直腸癌を検出するのに有用性を有する一方、転写物6は肺癌の検出において有用性があることも見出された。疾患による転写物の概要を、表6に示す。
この試験は、卵巣癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定することを目的としている。10例のコントロール(良性)組織試料(試料1〜10)および10例の腫瘍(悪性)組織試料(試料11〜20)を含む合計20の試料を調製した。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(Quantigene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual)。8つの標的転写物および1つのハウスキーピング転写物を、前記の実施例で示したように調製した。
a)3回反復アッセイでのCV(変動係数)を確定する;≦15%である場合は、許容可能である。
上記分析の結果を図9a〜9h(試料番号に対するlog2aRLU−log2hRLUのプロットを含む)に示す。各転写物に関する結果から確定された、それぞれのROC(受信者動作特性)曲線も示す。
上記の結果は、卵巣癌の検出、および正常卵巣組織から悪性組織の区別に際して、転写物1、2、3、6、11、12、15および20の有用性を例証する。転写物1、2および3は、前立腺癌の検出において有用性があることも見出された。転写物6は、黒色腫および肺癌の検出において有用性があることも見出された。転写物11は、黒色腫皮膚癌、結腸直腸癌および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物12は、結腸直腸癌および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物15は、黒色腫および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物20は、結腸直腸癌、黒色腫および精巣癌の検出において有用性があることも見出された。列挙した8つの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における卵巣癌の検出または特性化のためのツールとして用いられ得る。
この試験は、精巣癌の検出における本発明のいくつかの転写物の有効性を確定することを目的としている。8例のコントロール(良性)組織試料(試料1〜8)および9例の腫瘍(悪性)組織試料(試料9〜17)を含む合計17の試料を調製した。悪性試料のうちの5例は非精上皮腫(試料9〜13)であり、4例は精上皮腫(試料14〜17)であった。試料を、メーカーの推奨に従ってホモジナイズした(Quantigene(登録商標)Sample Processing Kit for Fresh or Frozen Animal Tissue;およびQuantigene 2.0 Reagent System User Manual)。10の標的転写物および1つのハウスキーピング転写物を、前記の実施例で示したように調製した。
a)3回反復アッセイでのCV(変動係数)を確定する;≦15%である場合は、許容可能である。
上記分析の結果を図10〜18(試料番号に対するlog2aRLU−log2hRLUのプロットを含む)に示す。各転写物に関する結果から確定されるそれぞれのROC(受信者動作特性)曲線も示す。
上記の結果は、精巣癌および亜型精巣癌の検出、および正常精巣組織から悪性組織の区別に際して、転写物2、3、4、11、12、13、15、16および20の有用性を例証する。転写物2は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物3は、前立腺癌、乳癌、黒色腫、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物4は、前立腺癌および結腸直腸癌における有用性を有することも見出された。転写物11は、結腸直腸癌、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物12は、結腸直腸癌および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物15は、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。転写物16は、黒色腫皮膚癌の検出において有用性があることも見出された。転写物20は、結腸直腸癌、黒色腫および卵巣癌の検出において有用性があることも見出された。列挙した9つの転写物の何れも、個別に、または組合せて、臨床設定における精巣癌の検出または特性化のためのツールとして用いられ得る。
(細胞株)
融合タンパク質の存在は、2つのヒト前立腺細胞株において研究されていた。第1に、正常な前立腺細胞株(ATCC Cat# CRL-11609)、これら細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍化せず、組織学的に正常な成人前立腺細胞をパピローマウィルス18型で感染することにより確立された。第2に、腫瘍化細胞株WPE1−NA22が検査された(ATCC Cat# CRL-2849)。これらの細胞は、N−メチル−N−ニトロソウレアへの露出に続いて、RWPE−1細胞に由来する。これらの細胞は、その親細胞RWPE−1と異なり、ヌードマウスにおいて腫瘍化する。
Qプロテオームミトコンドリア単離キット(Qiagen Cat#37612)を用いて、RWPE1細胞株およびWPE1−NA22細胞株の両方から、細胞画分が抽出された。1×107の細胞からミトコンドリア画分および細胞質画分の両方が抽出された。そして、タンパク質濃度は、キュビットフルオロメーター(Qubit fluorometer)(Invitrogen Cat#Q32857)で計測される蛍光タンパク質アッセイ(Quant-IT Protein, Invitrogen Cat#Q33211)を用いて算出された。
Qプロテオームミトコンドリア単離キットを用いて調製された、ミトコンドリア画分および細胞質画分について、SDS−PAGEゲル電気泳動が行われた。4−12%プレキャスト(invitrogen Nupage Cat#NP0321)ビス−トリスゲル還元ゲルの各レーンに、MES泳動バッファー(Invitrogen Cat# NP00020)を用いて、20μgのタンパク質が泳動された。上記ゲルは、コロイダルブルーゲル染色液(Invitrogen Cat# LC6025)で一晩染色された。結果を図19に示す。図19に示した8つのゲルスライスそれぞれに含まれると推定される、タンパク質の概算サイズ(kD)範囲は、以下の通りである。
8つのゲルスライスは、コロイダルブルーで染色された1D SDS−PAGE(図19)の各レーンから切断され、標準的な手順に続いてゲルについてトリプシン消化された。
X!タンデム(X!Tandem)カスタムデータベース検索の完了時に、全ての同定されたタンパク質および融合転写物が戻された。タンパク質は、そのlog(e)+値によりスコアが付けられ、log(e)+が−3よりも小さいタンパク質に付与されるのに優先して、log(e)+が−1よりも小さい場合、有意であるとして分類される。融合タンパク質は、同じゲルスライスにおいて融合転写物に寄与する遺伝子それぞれから少なくとも1つのペプチドが存在することにより同定される。LC/MS−MSにより同定されたペプチドからのタンパク質配列の範囲は、赤色で表示される。実験条件に起因してペプチドを観察することが困難であり得るタンパク質の配列は、緑色で明示される。最後に、黒色で表示されたタンパク質配列は、ペプチドを同定する中立的可能性を示す。
この方法論を用いて、多くのミトコンドリア融合タンパク質が同定された。そのような融合タンパク質のうち4つを代表例として、以下に示す。
図20aは、P0026として同定された融合転写物に対応する融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、ミトコンドリアNA22細胞株(図19)のスライス7において、チトクロムcオキシダーゼサブユニット2(CO2)N−末端ペプチドILYMTDEVNDPSLTIKおよびNADH−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖3(ND3)C−末端ペプチドSTPYECGFDPMSP(図20a)の存在から同定された(log(e)+=−13.2)。
図21aは、P0062として同定された融合転写物に対応する融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、ミトコンドリアNA22細胞株(図19)のスライス5(20−30kDa)において、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット1(ND1)N末端ペプチドKGPNVVGPYGLLQPFADAMKおよびYDQLMHLLWK、並びにATPシンセターゼサブユニット6C末端ペプチドLITTQQWLIKの存在から同定された(log(e)+=−41.2)。
図22は、P0064として同定された融合転写物に対応する融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、図19に示される、ミトコンドリアNA22細胞株のスライス4(log(e)+=−22)において、ND1のN末端からのペプチドKGPNVVGPYGLLQPFADAMKおよびNADHデヒドロゲナーゼサブユニット2(ND2)C末端ペプチドWAIIEEFTKとともに同定された。ND1C末端ペプチドYDQLMHLLWKは、ゲルスライス4で観察されず、P0064およびND2の推定サイズに基づくと、ゲルスライス4はP0064およびND2を含有することが示唆される。
図23aは、P0176として同定された融合転写物に対応する融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、図19に示される、ミトコンドリアNA22細胞株のスライス4(log(e)+=−33)において、ND1N末端からのペプチドKGPNVVGPYGLLQPFADAMK、ならびにチトクロムcオキシダーゼサブユニット1(CO1)C末端ペプチドVFSWLATLHGSNMKおよびVLMVEEPSMNLEWLYGCPPPYHTFEEPVYMKとともに同定された。CO1の両ペプチドはともに、推定サイズが55kDaであるのに関わらず、ミトコンドリアNA22細胞株のスライス4(30〜40kDa)でのみ観察された。さらに、このことは、全てのゲルスライスについてヒト(SwissProt)データベース(融合転写物なし)を検索した後、ミトコンドリアNA22細胞株のゲルスライス4でのみCO1野生型(log(e)+=−14.6)(図23b)を同定したことにより確認された。
LC−MS/MS実験で用いられた一連の2つの細胞株、具体的には、浸潤能が低い悪性細胞株である、RWPE−1およびWPE1−NA22について、これら4つの融合タンパク質それぞれに関連する融合転写物の定量的測定を実行した。これら測定結果を、上述した4つのタンパク質に対応させて、図24a〜24dに示す。図24a〜dでは、細胞株RWPE−1はNOとして明示され、細胞株WPE1−NA22はLIとして明示されている。この実験にて包含される付加的な細胞株は、中程度の浸潤能(MI)、高い浸潤能(HI)、および非常に高い浸潤能(VH)という連続的な悪性度の進行を表す。
特に以下の参考文献を、前記の説明中で引用した。これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される。
Claims (15)
- ミトコンドリアDNAの突然変異に対応するミトコンドリア融合転写物の翻訳の結果生じたアミノ酸配列を有し、上記アミノ酸配列は、配列番号58に示されている、単離ミトコンドリア融合タンパク質。
- 癌に関連した少なくとも1つのミトコンドリア融合タンパク質の存在に関して哺乳類からの組織試料をアッセイし、上記哺乳類における癌を検出するためのキットの製造における、請求項1に記載のミトコンドリア融合タンパク質の少なくとも一部と特異的に結合する抗体または抗原結合断片の使用。
- 上記癌は、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌または黒色腫皮膚癌である、請求項2に記載の使用。
- 請求項1に記載のタンパク質に対して特異性を有する、抗体またはその抗原結合断片。
- ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項4に記載の抗体。
- 上記アッセイは、免疫学的アッセイを包含する、請求項2に記載の使用。
- 上記アッセイは、請求項5に記載の抗体または抗原結合断片とともに行われる、請求項6に記載の使用。
- 哺乳類における癌の存在を検出するアッセイを行うためのキットであって、請求項4に記載の抗体または抗原結合断片を包含する、キット。
- 配列番号56に示された核酸配列を有する、単離ミトコンドリア融合転写物。
- 請求項9に記載の融合転写物をコードする単離mtDNA。
- 配列番号57に示された配列を有する、請求項10に記載の単離mtDNA。
- 請求項9に記載のミトコンドリア融合転写物または請求項10もしくは11に記載のmtDNAの少なくとも一部と相補する核酸配列を有する、ハイブリダイゼーションプローブであって、上記一部は、スプライスされた遺伝子の接合点を含む、ハイブリダイゼーションプローブ。
- 癌に関連した少なくとも1つのミトコンドリア融合転写物の存在に関して哺乳類からの組織試料をアッセイし、上記哺乳類における癌を検出するためのキットの製造における、請求項9に記載の単離ミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補する核酸配列を有するハイブリダイゼーションプローブであって、上記一部は、スプライスされた遺伝子の接合点を含む、ハイブリダイゼーションプローブの使用。
- 上記癌は、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌または黒色腫皮膚癌である、請求項13に記載の使用。
- 哺乳類における癌の存在を検出するアッセイを行うためのキットであって、請求項9に記載の単離ミトコンドリア融合転写物の少なくとも一部と相補する核酸配列を有する少なくとも1つのハイブリダイゼーションプローブであって、上記一部は、スプライスされた遺伝子の接合点を含む、ハイブリダイゼーションプローブを包含する、キット。
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