ES2539001T3 - Deleción de ADN mitocondrial de 3,4 kb para uso en la detección de cáncer - Google Patents

Deleción de ADN mitocondrial de 3,4 kb para uso en la detección de cáncer Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo, que comprende: a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo; b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una secuencia correspondiente a la secuencia identificada en la SEQ ID NO: 1 usando un par de cebadores de amplificación, en el que uno del par de cebadores de amplificación usados en la amplificación de la región diana se superpone con un sitio de reinserción de la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, después de recircularizar la secuencia; c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra correspondiente a la SEQ ID NO: 1 recircularizada con al menos un valor de referencia conocido.

Description

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resultados de biopsia con aguja usados para este estudio. Uno de los individuos que generó originalmente una muestra benigna, pero se predijo por este estudio que tenía una malignidad, generó una muestra maligna. Como resultado, uno de los falsos positivos se volvió un verdadero positivo. Por lo tanto, el estado patológico se predijo correctamente en un 86 % de los casos examinados en este estudio. El valor predictivo positivo definitivo (VPP, en que VPP= verdaderos positivos/(verdaderos positivos + falsos positivos)) para este estudio era de un 91 % y el valor predictivo negativo (VPN, en que VPN= verdaderos negativos/(verdaderos negativos + falsos negativos)) era de un 80 %.
Ejemplo 3: Estudio de deleción de 3,4 kb-Procedimientos (n= 76)
Se examinó en 76 muestras de tejido de próstata la deleción de 3,4 kb en este estudio. Todas las muestras de tejido se fijaron con formalina, siendo 25 malignas, siendo 12 normales y teniendo 39 enfermedad prostática mostrada histológicamente. Del último grupo, más de la mitad tenía hiperplasia. Se tomaron biopsias con aguja de todos los especímenes de los archivos de tejido de los investigadores.
Especímenes de próstata
Se efectuó una toma de muestra con cinta en cada portaobjetos usando Prep-Strips (número de catálogo LCM0207) de Arcturus Bioscience Inc. Esto permitió la retirada de cualquier material particulado o tejido no adherente del portaobjetos antes de la extracción de ADN. Con el tejido restante sobre los portaobjetos, se aclararon los portaobjetos con PBS (solución salina tamponada con fosfato) para retirar todo el fijador posible. Se rasparon las 1-2 secciones de biopsia con aguja sobre los portaobjetos en tubos de microcentrífuga estériles usando cuchillas de afeitar quirúrgicas esterilizadas envasadas individualmente. Se aisló entonces el ADN y se purificó usando un kit QIAamp® DNA Mini (Qiagen, nº de cat. 51304) según las especificaciones del fabricante. Se procesó un control de extracto negativo en paralelo con las extracciones de portaobjetos como comprobación del control de calidad. Se determinó la concentración total de ADN y la relación de pureza para cada muestra mediante espectrofotometría (Nano-Drop™ ND-1000) y se prepararon diluciones de 2 ng/ml con el fin de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCRc).
Cebadores (Oligonucleótidos)
Se sintetizaron químicamente los cebadores oligonucleotídicos purificados por Invitrogen (California, EE.UU.). Se enumeran en la Tabla 1 las secuencias de los cebadores y los tamaños esperados de los productos de PCR amplificados. Además, el análisis por PCR de las detecciones de ADNmt incluía controles positivos (ADN de una fuente conocida por portar el ADNmt mutante). Se comprobó cada conjunto de cebadores, con la excepción del TNF (factor de necrosis tumoral), frente a una línea celular rho 0 exenta de mitocondrias para confirmar la ausencia de coamplificación pseudogénica.
Tabla 1. Cebadores de amplificación
Par cebador
Posición amplificada 5’-3’ Longitud del producto amplificado (pares de bases)
Deleción de 3,4 en tiempo real ADNmt de 12s TNF
10729-14379 (menos 3379 pb en 10744-14124) 708-945 3756-3886 273 238 131
de codificación de 3,4 (10729-10743 -14125-14139) 5’TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3’ SEQ ID NO: 2 Inverso de 3,4 (14361-14379) 5’-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3’ SEQ ID NO: 3 de codificación de 12s (708-728) 5’-CGTTCCAGTGAGTTCACCCTC-3" SEQ ID NO: 4 inverso de 12s (923-945) 5’-CACTCTTTACGCCGGCTTCTATT-3’ SEQ ID NO: 5 de codificación de TNF (3756-3775) 5’ -CCTGCCCCAATCCCTTTATT-3’ SEQ ID NO: 6 inverso de TNF (3866-3886) 5’-GGTTTCGAAGTGGTGGTCTTG-3’SEQ ID NO: 7
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
Se efectuaron 3 PCR separadas en cada muestra. Cada reacción tenía un volumen total de 25 ml e incluía ADN de molde, un par de cebadores (de 12s o deleción 3,4 o TNF), un kit iQ™ SYBR Green Supermix™ (número de catálogo 170-8882, Bio-Rad Laboratories Inc.) y agua desionizada destilada (H2Odd). TNF (factor de necrosis tumoral) comprendía cebadores de gen nuclear de una copia y 12s comprendía cebadores del genoma mitocondrial total. Se enumeran a continuación el volumen y concentraciones de ADN de molde, cebadores y tampón de reacción.
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Tabla 2.Componentes de la PCRc
Reactivo
Concentración por reacción Volumen por reacción
Tampón de reacción
1X 12,5 µl
Cebador (de codificación e inverso)
250 nM 0,0625 µl de cada solución madre de 100 µmol
H2Odd
N/A 2,375 µl
ADN de molde
20 ng 10,0 µl
Total
25 µl
Se enumeran en la Tabla 3 los parámetros de ciclación para cada amplicón.
Tabla 3. Parámetros de ciclación
Etapa
Temperatura (° C) Duración
1
95 3 min
2
95 30 s
3
66 (cebadores de deleción 3,4) o 61,5 (cebadores de 12s) o 61,5 (cebadores de TNF) 30 s
4
72 30 s
5
Lectura de placa
6
72 10 min
7
Curva de fusión de 50 °C-110 °C, lectura cada 1 ºC 3 s
Repetir las etapas 2-5 44 veces para un total de 45 ciclos.
Se llevaron a cabo el ciclamiento térmico, detección en tiempo real y análisis de las reacciones usando un sistema de detección de fluorescencia continua DNA Engine Opticon® 2 equipado con software Intuitive Opticon Monitor™ (MJ Research Inc.). Se utilizó el procedimiento de la curva patrón para la cuantificación de ADN. Se
10 efectuó un conjunto de diluciones en serie (106, 105, 104, 103, 102, 101) de tres moldes generados por PCR purificados, un producto de la deleción 3,4, otro de los cebadores de 12s y otro de TNF. A partir de esto, se generaron tres curvas patrón diferentes que muestran el número de copias de ADNmt total (cebadores del genoma mitocondrial total del amplicón 12s), teniendo la cantidad de ADNmt la deleción de 3,4 kb, o ADN nuclear total (cebadores de gen nuclear de una copia TNF). Se convirtieron entonces los valores de CT de las
15 muestras en el número de copias de ADN comparando la CT de la muestra con la de los patrones. La deleción 3,4 se consideraba ausente o a bajos niveles si no se detectaba la deleción al cabo de 37 ciclos.
La determinación de la malignidad está basada en la cantidad de la deleción de 3,4 kb presente en la muestra
normalizada, como se indica por la localización del umbral de ciclo. Esta localización puede ser absoluta como
20 en más de 25 ciclos pero menos de 35 ciclos, o más probablemente una relación entre el ADN mitocondrial total presente como se indica por el amplicón 12s y la deleción de 3,4 kb. Esto puede expresarse como un porcentaje del ADN mitocondrial total. El número de células, como se representa por el amplicón de TNF, puede incorporarse para refinar la distinción entre tejidos benignos y malignos.
25 Para automatizar los análisis de estas muestras, se emplearon herramientas bioinformáticas. Las tres variables que se consideraron para estos análisis fueron el umbral de ciclo CT de factor de necrosis tumoral (TNF), las especies totales de mitocondrias que contienen estos sitios cebadores específicos y aquellas mitocondrias que albergan la deleción de interés.
30 Análisis de agrupamiento
El agrupamiento no se normalizó ni se usaron funciones logarítmicas debido al intervalo de datos similar y
pequeño.
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La Figura 3 muestra el recorrido real y las tendencias de los datos. El eje x es el número de paciente y el eje y es el umbral de ciclo obtenido por PCR en tiempo real.
Es importante observar que cuanto mayor es el umbral de ciclo, menor cantidad de deleción está presente.
5 La tendencia general mostrada en la Figura 3 está basada en las diferencias/relaciones entre las variables de deleción, total y TNF. La deleción es de baja a ausente para las muestras benignas/normales (lado derecho) y aumenta (hacia la izquierda) con las muestras benignas anormales y malignas. Las muestras benignas anormales y malignas empiezan a diferenciarse entre sí basándose en la relación de umbral de ciclo de deleción
10 a TNF.
Aprendizaje supervisado
El aprendizaje supervisado está basado en los intentos del sistema de predecir las respuestas para muestras
15 conocidas. Se usaron la mitad de los datos para ajustar y la otra mitad para ensayar el algoritmo. El aprendizaje supervisado compara sus predicciones con la respuesta objetivo resultado y “aprende” de sus errores. Pero, si la salida predicha es mayor o menor que la respuesta real de los datos, se retropropaga el error por el sistema y se ajustan los pesos en consecuencia.
20 Conjunto de datos: 5 % a 35 % -Benigna 35 % a 65 % -Hiperplasia 65 % a 95 % -Maligna
Algoritmo de red neuronal artificial (RNA) (mostrado esquemáticamente a continuación):
25 La mitad del conjunto de datos usado para el ajuste del RNA La otra mitad usado para comparar la exactitud. Exactitud: comparar el conjunto de datos esperados con el conjunto de datos obtenidos → 86,6 %
imagen6
Aprendizaje supervisado de los datos de deleción usando la red neuronal artificial (RNA)
30 Tres clasificaciones: Benigna Hiperplasia Maligna
35 Se usaron tres variables para cada clasificación basándose en el umbral de ciclo CT de PCR en tiempo real: Factor de necrosis tumoral (TNF)-control de copia nuclear Mitocondrias totales-control de copia mitocondrial Deleción-mitocondrias en estado de deleción.
40 Resultados: Se usa la mitad del conjunto de datos para ajustar la RNA y se usa la mitad restante para comparar la exactitud. Exactitud de las tres clasificaciones = 86,6 %
45 Valor de predicción positiva (VPS): Benigna a maligna= 88,2 % Valor de predicción negativa (VPN):
Benigna a maligna= 76,5 % 50
Ejemplo 4: Deleción de 3,4 kb en ADNmt asociado a cáncer de mama
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Se ensayaron en 18 muestras de tejido de mama maligno y benigno, siendo 9 malignas y 9 benignas, la presencia de la deleción de 3,4 kb anteriormente mencionada. Se clasificaron las muestras como malignas o benignas usando análisis histopatológicos convencionales.
5 Se aisló ADN y se purificó de las muestras usando un kit QIAamp® DNA Mini (Qiagen, nº de cat. 51304) según las instrucciones del fabricante.
Se sintetizaron químicamente los cebadores oligonucleotídicos purificados por Invitrogen (California, EE.UU.). Se enumeran en la Tabla 1 anterior las secuencias de los cebadores y los tamaños esperados de los productos de
10 PCR.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
Se efectuaron tres PCR separadas en cada muestra. Cada reacción tenía 25 µl de volumen total e incluía ADN
15 de molde, un par de cebadores (de 12s o deleción 3,4 o TNF), un kit iQ™ SYBR Green Supermix (número de catálogo 170-8882, Bio-Rad Laboratories Inc.) y agua desionizada destilada (H2Odd). El TNF (factor de necrosis tumoral) comprendía cebadores de gen nuclear de una copia y 12s comprendía cebadores del genoma mitocondrial total. Se enumeran a continuación el volumen y las concentraciones de ADN de molde, cebadores y tampón de reacción:
20
Tabla 4. Componentes de PCRc.
Reactivo
Concentración por reacción Volumen por reacción
Tampón de reacción
1X 12,5 µl
Cebador (de codificación e inverso)
250 nM 0,0625 µl de cada solución madre de100µmol
H2Odd
N/A 2,375 µl
ADN de molde
20 ng 10,0 µl
Total
25 µl 25 µl
Se enumeran en la Tabla 5 los parámetros de ciclación para cada amplicón.
Tabla 5. Parámetros de ciclación
Etapa
Temperatura (°C) Duración
1
95 3 min
2
95 30 s
3
66 (cebadores de deleción de 3,4) o 61,5 (cebadores de 12s) o 61,5 (cebadores de TNF) 30 s
4
72 30 s
5
Lectura de placa
6
72 10 min
7
Curva de fusión de 50-110 ºC, lectura cada 1 ºC 3 s
Repetir las etapas 2-5 44 veces para un total de 45 ciclos.
Se llevaron a cabo la ciclación térmica, detección en tiempo real y análisis de las reacciones usando un sistema de detección continua de fluorescencia DNA Engine Opticon® 2 equipado con software Intuitive Opticon Monitor™ (MJ Research Inc.). Se utilizó el procedimiento de la curva patrón para la cuantificación de ADN. Se
30 efectuó un conjunto de diluciones en serie (106, 105, 104, 103, 102, 101) de los tres moldes generados por PCR, un producto de la deleción de 3,4, otro de los cebadores de 12s y otro de TNF. A partir de esto, se generaron tres curvas patrón diferentes que muestran el número de copias de ADNmt total (amplicón 12s-cebadores del genoma mitocondrial total), deleción de 3,4 o ADN nuclear total (TNF-cebadores de gen nuclear de una copia). Se convirtieron entonces los valores de CT de las muestras en el número de copias de ADN comparando el CT de
35 muestra con el de los patrones. 10
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26,8400
0,556 0,000
27,4800
0,556 0,111
28,1600
0,556 0,222
28,8800
0,667 0,222
29,1900
0,778 0,222
28,4600
0,778 0,333
29,8750
0,778 0,444
30,5850
0,778 0,556
31,2200
0,778 0,667
31,5000
0,889 0,667
31,7650
0,889 0,778
32,9900
1,000 0,778
34,3350
1,000 0,889
36,6400
1,000 1,000
a. El menor valor de corte es el valor de prueba observado mínimo menos 1, y el mayor valor de corte es el valor de prueba observado máximo más 1. Todos los valores de corte son las medias de dos valores de prueba observados ordenados consecutivos
Ejemplo 5: La deleción de 3,4 kb en el fluido de masaje prostático de individuos con cáncer de próstata en comparación con el fluido de aquellos sin evidencia histológica de cáncer de próstata
5 Se recogieron 40 muestras de fluido de masaje prostático por urólogos de pacientes que se diagnosticaron posteriormente con cáncer de próstata o no mostraron evidencia histológica de cáncer de próstata después de un procedimiento de biopsia con aguja de próstata. Se depositó la muestra en una IsoCode Card™ (Schleicher y Shuell), se secó y se extrajo entonces según el protocolo del fabricante. Se cuantificaron todos los extractos de ADN usando un espectrofotómetro NanoDrop™ ND-1000 y se normalizó la concentración de ADN a 2 ng/µl. Se
10 amplificó entonces cada muestra según los siguientes parámetros:
1X iQ SYBR Green Supermix™ (Bio-Rad P/N 170-8880) 150 nmol de cebador de codificación (5’-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3’) (SEQ ID NO: 2).
15 150 nmol de cebador inverso (5’-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3’) (SEQ ID NO: 3) 20 ng de ADN de molde en una reacción de 25 µl.
20 Se ciclaron las reacciones en un Opticon™ 2 DNA Engine (Bio-Rad Canada) según el siguiente protocolo:
1.
95 ºC durante 3 minutos
2.
95 ºC durante 30 segundos
3.
66 ºC durante 30 segundos
4.
72 ºC durante 30 segundos
25 5. Lectura de placa
6.
Repetir las etapas 2-5 44 veces
7.
72 ºC durante 10 minutos
8.
Curva de fusión de 50 a 105 ºC, lectura cada 1 ºC, mantener durante 3 segundos
9. Mantener a 10 ºC 30
Tabla 9. Resultados que muestran los valores medios de CT para la prueba de fluido de masaje prostático
Estadística de grupo
Grupo
N Media Desviación estándar Error estándar de la media
DEL3.4
benigna maligna 25 15 37,1869 33,7712 3,18495 3,98056 0,63699 1,02778
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Las Tablas 9 y 10 muestran una diferencia significativa entre los valores medios de CT obtenidos para los grupos de muestras benignas y muestras malignas (p= 0,005).

Tabla 10. Resultados que muestran la diferencia (p= 0,005) para los valores de CT de muestras
Prueba de muestras independientes
Prueba de Levene para la igualdad de varianzas
Prueba de t para la igualdad de medias
F
Señ. t df Señ. (bilateral) Diferencia media Error estándar de la diferencia Intervalo de confianza del 95 % de la diferencia
Inferior
Superior
DEL3.4
Suponiendo varianzas iguales No suponiendo varianzas iguales 1,251 0,270 2989 2825 38 24,696 0,005 0,009 3,41570 3,41570 1,14283 1,20917 1,10217 0,92382 5,72923 5,90758
5 La Figura 5 es una curva de característica operativa del receptor (COR) que ilustra la especificidad y sensibilidad de la deleción de ADNmt de 3,4 kb como marcador de cáncer de próstata cuando se ensaya fluido de masaje prostático. Se obtuvieron estos resultados usando un corte CT de 37,3683. La sensibilidad del marcador a este CT es de 87 %, mientras que la especificidad es de 64 %.
10 La exactitud de la prueba depende de lo bien que la prueba separe el grupo que se ensaya en aquellos con y sin cáncer de próstata. La exactitud se mide por el área bajo la curva COR. La Tabla 11 muestra el cálculo del área bajo la curva para el presente ejemplo.
15 Tabla 11. Resultados que muestran el área bajo la curva COR
Área bajo la curva Variable(s) del resultado de la prueba: DEL3,4
Área
Error estándara Señal asintóticab Intervalo de confianza del 95 % asintótico
Límite inferior
Límite superior
0,768
0,074 0,005 0,622 0,914
a. Bajo la hipótesis no paramétricab. Hipótesis nula: área verdadera: 0,5

Tabla 12. Determinación de especificidad y sensibilidad
Coordenadas de la curva Variable(s) del resultado de la prueba: DEL3,4
Positiva si es menor o igual aa
Sensibilidad 1-Especificidad
26,2992 27,3786 28,2484 29,5193 30,1757 30,4580
0,000 0,067 0,133 0,200 0,200 0,200 0,000 0,000 0,000 0,000 0,040 0,080
E13169334
08-06-2015
30,5980
0,267 0,080
31,5709
0,333 0,080
32,5712
0,333 0,120
32,9500
0,333 0,160
33,3314
0,400 0,160
33,8547
0,467 0,160
33,9247
0,533 0,160
34,3554
0,533 0,200
34,9058
0,533 0,240
35,4650
0,533 0,280
35,9172
0,533 0,320
36,0648
0,600 0,320
36,3816
0,667 0,320
38,6421
0,733 0,320
36,8531
0,733 0,360
37,1188
0,800 0,360
37,3683
0,867 0,360
37,5200
0,867 0,400
37,8341
0,867 0,440
38,2533
0,867 0,480
38,5198
0,933 0,480
38,8519
0,933 0,520
38,8552
0,933 0,580
39,1258
0,933 0,600
39,2734
0,933 0,640
39,4952
0,933 0,680
39,7323
1,000 0,680
39,8956
1,000 0,720
41,0000
1,000 1,000
El menor valor de corte es el valor de prueba observado mínimo menos 1, y el mayor valor de corte es el valor de prueba máximo observado más 1. Todos los demás valores de corte son la media de dos valores de prueba observados ordenados consecutivos. 5 Se muestra en la tabla 12 anterior la determinación del corte CT de 37,3683. Los resultados enumerados en la tabla 12 ilustran que un corte CT de 37,3683 proporcionaba la máxima sensibilidad y especificidad.
Ejemplo 6: La deleción de 3,4 kb en la orina de individuos con cáncer de próstata en comparación con el 10 fluido de aquellos sin evidencia histológica de cáncer de próstata
Se recogieron muestras de orina de 5 pacientes que se habían diagnosticado con cáncer de próstata y 5 que habían experimentado un procedimiento de biopsia con aguja que no pudo detectar malignidad de próstata. Se recogieron estas muestras después de un examen rectal digital (ERD) para facilitar la recogida de células de 15 próstata.
Tras la recepción de las muestras, se retiró una alícuota de 5 ml y se centrifugaron entonces 2 ml a 14.000 x g, formando un sedimento. Se retiró el sobrenadante y se desechó. Se resuspendieron los sedimentos en 200 µl de solución salina tamponada con fosfato. Se sometieron tanto el sedimento resuspendido como la muestra de orina 20 completa a un procedimiento de extracción de ADN usando el kit QiaAMP™ DNA Mini (Qiagen P/N 51304) según las instrucciones del fabricante. Se cuantificaron entonces los extractos de ADN resultantes usando un espectrofotómetro NanoDrop™ ND-1000 y se normalizaron a una concentración de 0,1 ng/µl.
Se analizaron las muestras mediante PCR en tiempo real cuantitativa con los cebadores específicos de deleción 25 de 3,4 kb según lo siguiente: 1X iQ SYBR Green Supermix™ (Bio-Rad P/N 170-8880) 100 nmol de cebador de codificación (5’-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3’) (SEQ ID NO: 2) 100 nmol de cebador inverso (5’-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3’) (SEQ ID NO: 3) 1 ng de ADN de molde
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en una reacción de 25 µl.
Se ciclaron las reacciones en un Opticon™ 2 DNA Engine (Bio-Rad Canada) según el siguiente protocolo:
1. 95 ºC durante 3 minutos
5 2. 95 ºC durante 30 segundos
3.
69 ºC durante 30 segundos
4.
72 ºC durante 30 segundos
5.
Lectura de placa
6.
Repetir las etapas 2-5 44 veces
10 7. 72 ºC durante 10 minutos
8.
Curva de fusión de 50 a 105 ºC, lectura cada 1 ºC, mantener durante 3 segundos
9.
Mantener a 10 ºC

Tabla 13. Valores medios para las puntuaciones de CT
Estadísticas de grupo
GRPfluid38
N Media Desviación estándar Error estándar de la media
CTf3.4
Benigna Maligna 5 5 33,2780 30,6980 1,10900 2,55767 0,49596 1,14382
Las Tablas 13 y 14 muestran una diferencia significativa entre los valores medios de CT obtenidos para grupos de muestras benignas y muestras malignas (p= 0,005).

Tabla 14. Resultados que muestran la diferencia (p= 0,005) para valores de CT de muestras
Prueba de muestras independientes
Prueba de Levene para la igualdad de varianzas
Prueba de t para la igualdad de medias
F
Señ. t df Señ. (bilateral) Diferencia media Error estándar de la diferencia Intervalo de confianza del 95 % de la diferencia
Inferior
Superior
CTf
Suponiendo varianzas iguales No suponiendo varianzas iguales 1,272 0,292 2069 2069 8 5,453 0,072 0,089 258000 258000 1,24672 1,24672 -0,29494 -0,54639 5,45494 5,70639
20 La Figura 6 es una curva de característica operativa del receptor (COR) que ilustra la especificidad y sensibilidad de la deleción de ADNmt de 3,4 kb como marcador para cáncer de próstata cuando se ensaya orina. Se obtuvieron estos resultados usando un corte CT de 31,575. La sensibilidad del marcador a este CT es de 80 %, mientras que la especificidad es de 100 %.
25 Se muestra en la Tabla 15 la determinación del corte CT de 31,575. Los resultados enumerados en la tabla 15 muestran que el corte CT de 31,575 proporcionaba las máximas sensibilidad y especificidad.

Tabla 15: Determinación del corte CT.
Coordenadas de la curva Variable(s) del resultado de la prueba: CTf
Positiva si es menor o igual aa
Sensibilidad 1 -Especificidad
26,2900 28,4950 30,3850
0,000 0,200 0,400 0,000 0,000 0,000
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imagen10
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c) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción en la secuencia de ácido nucleico entre los residuos 10743 y 14125 del genoma de ADNmt; d) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido; 5 en el que un nivel similar de deleción en la muestra biológica en comparación con la muestra de referencia es indicativo de cáncer.
24.
El procedimiento de la realización 23, en el que la deleción tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia identificada en la SEQ ID NO: 1.
25.
El procedimiento de la realización 23, que comprende adicionalmente la etapa de comparar la cantidad de
10 ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.
26.
El procedimiento de la realización 23, en el que la cuantificación de la deleción incluye amplificar una región diana del ADNmt que es indicativa de la deleción, y cuantificar la cantidad de región diana amplificada.
27.
El procedimiento de la realización 26, en el que se usa un cebador de PCR que tiene la secuencia
15 correspondiente a la SEQ ID NO: 2 como parte de un par de cebadores de amplificación para amplificar la región diana.
28. El procedimiento de la realización 26, en el que se realiza la etapa de cuantificación usando PCR en tiempo real.
29. El procedimiento de la realización 23, en el que el cáncer es cáncer de próstata. 20 30. El procedimiento de la realización 23, en el que el cáncer es cáncer de mama.
31.
El procedimiento de la realización 23, en el que la muestra biológica es un tejido corporal o fluido corporal.
32.
El procedimiento de la realización 31, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo consistente en tejido de mama, tejido de próstata, fluido de masaje prostático y orina.
33.
Un procedimiento de monitorización en un individuo del desarrollo de un cáncer, que comprende:
25 a) obtener una muestra biológica; b) extraer ADNmt de la muestra; c) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción en la secuencia de ácido
nucleico entre los residuos 10743 y 14125 del genoma de ADNmt; d) repetir las etapas a) a c) durante un periodo de tiempo; 30 en el que un nivel creciente de deleción durante el periodo de tiempo es indicativo de cáncer.
34.
El procedimiento de la realización 33, en el que la deleción tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia identificada en la SEQ ID NO: 1.
35.
El procedimiento de la realización 33, que comprende adicionalmente al menos una etapa seleccionada del grupo consistente en: (a) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de
35 deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido y (b) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.
36. El procedimiento de la realización 33, en el que la cuantificación de la deleción incluye amplificar una región
diana de ADNmt que sea indicativa de la deleción, y cuantificar la cantidad de región diana amplificada. 40 37. El procedimiento de la realización 36, en el que se realiza la etapa de cuantificar usando PCR en tiempo real.
38. El procedimiento de la realización 36, en el que se usa un cebador de PCR que tiene una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 2 como parte de un par de cebadores de amplificación para amplificar la región diana.
39. El procedimiento de la realización 33, en el que el cáncer es cáncer de próstata. 45 40. El procedimiento de la realización 33, en el que el cáncer es cáncer de mama.
41.
El procedimiento de la realización 33, en el que la muestra biológica es un tejido corporal o fluido corporal.
42.
El procedimiento de la realización 41, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo consistente en tejido de mama, tejido de próstata, fluido de masaje prostático y orina.
43.
El procedimiento según una cualquiera de las realizaciones 6, 16 o 26, en el que se realiza la amplificación
50 de la región diana usando un par de cebadores de amplificación, superponiéndose uno de los pares de cebadores de amplificación con las regiones de inserción de corte y empalme en extremos opuestos de la deleción.
44. Un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo, que comprende: a) obtener una muestra biológica del individuo; 55 b) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de la muestra; c) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una secuencia correspondiente a la secuencia identificada en la SEQ ID NO: 1; d) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra correspondiente a la SEQ ID NO: 1 con al menos un valor de referencia conocido.
60 45. El procedimiento de la realización 44, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1 en una muestra de referencia de ADNmt de un tejido o fluido corporal no canceroso.
46. El procedimiento de la realización 44, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de
secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1 en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal 65 canceroso conocido.

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  1. imagen1
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