ES2484044T3 - Deleción de 3,4 kb en el ADN mitocondrial para uso en la detección de cáncer - Google Patents

Deleción de 3,4 kb en el ADN mitocondrial para uso en la detección de cáncer Download PDF

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Abstract

Un método para detectar un cáncer en un individuo que comprende: a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo; b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del genoma de ADNmt; c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con al menos un valor de referencia conocido; en el que el cáncer es cáncer de mama.

Description

Deleción de 3,4 kb en el ADN mitocondrial para uso en la detección de cáncer
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud PCT no. PCT/CA2006/000652 presentada el 18 de abril, 2006 que reivindica prioridad de las solicitudes provisionales U.S. nos. 60/672,016 presentada el 18 de abril, 2005, 60/721,522 presentada el 29 de septiembre, 2005, y 60/789,872 presentada el 7 de abril, 2006.
Campo de la invención
Esta invención se refiere al campo de la genómica mitocondrial. En particular se refiere a una deleción de 3,4 kb en el genoma mitocondrial y a su utilidad como un indicador del cáncer.
Descripción de la técnica anterior
ADN mitocondrial (ADNmt) como una herramienta de diagnóstico
Las dinámicas de la secuencia del ADNmt son herramientas de diagnóstico importantes. Las mutaciones en el ADNmt son frecuentemente indicadores preliminares de una enfermedad en desarrollo, frecuentemente asociado con mutaciones nucleares, y actúan como biomarcadores relacionados específicamente con: enfermedad, tal como pero no limitado a, daño tisular y cáncer producidos por el tabaquismo y exposición pasiva a humo de tabaco (Lee et al., 1998; Wei, 1998); longevidad, basado en la acumulación de mutaciones en el genoma mitocondrial empezando aproximadamente a los 20 años de edad e incrementándose a partir de ahí (von Wurmb, 1998); enfermedad metastásica causada por mutación o exposición a carcinógenos, mutágenos, radiación ultravioleta (Birch-Machin, 2000); osteoartritis; enfermedad cardiovascular, de Alzheimer, de Parkinson (Shoffner et al., 1993; Sherratt et al., 1997;Zhang et al, 1998); pérdida auditiva asociada con la edad (Seidman et al., 1997); degeneración del nervio óptico y disrritmia cardiaca (Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988); exoftalmoplejía externa progresiva crónica (Taniike et al., 1992); aterosclerosis (Bogliolo et al., 1999); carcinomas tiroideos papilares y tumores tiroideos (Yeh et al., 2000); así como otros (por ejemplo, Naviaux, 1997; Chinnery y Turnbull, 1999).
Las mutaciones en sitios específicos del genoma mitocondrial pueden asociarse con determinadas enfermedades. Por ejemplo, las mutaciones en las posiciones 4.216, 4.217 y 4.917 están asociadas con la Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) (Mitochondrial Research Society; Huoponen (2001); MitoMap). Se encontró que una mutación en 15.452 en 5/5 pacientes estaba asociada con deficiencia en ubiquinol citocromo c reductasa (complejo III) (Valnot et al. 1999).
Específicamente, estas mutaciones o alteraciones incluyen mutaciones puntuales (transiciones, transversiones), deleciones (una base a miles de bases), inversiones, duplicaciones, (una base a miles de bases), recombinaciones e inserciones (una base a miles de bases). Además, se ha encontrado que alteraciones de pares de bases específicos, deleciones o combinaciones de éstas estaban asociadas con el inicio temprano de cáncer de próstata, piel y pulmón, así como envejecimiento (por ejemplo Polyak et al., 1998), envejecimiento prematuro, exposición a carcinógenos (Lee et al., 1998), etc.
Cáncer de próstata
El cáncer de próstata es un tumor sólido diagnosticado frecuentemente que lo más probablemente se origina en el epitelio de la próstata (Huang et al. 1999). En 1997, cerca de 10 millones de hombres americanos se cribaron para antígeno específico de la próstata (PSA), cuya presencia sugiere cáncer de próstata (Woodwell, 1999). De hecho, esto indica un número incluso mayor de hombres cribados por un examen rectal digital inicial (DRE). En el mismo año, 31 millones de hombres se sometieron a un DRE (Woodwell, 1999). Además, se estima que el número anual de casos diagnosticados de nuevas de cáncer de próstata en los Estados Unidos es 179.000 (Landis et al., 1999). Es el segundo cáncer diagnosticado más comúnmente y la segunda causa principal de mortalidad por cáncer en los hombres canadienses. En 1997 el cáncer de próstata representó 19.800 de los cánceres diagnosticados de nuevas en los hombres canadienses (28%) (National Cancer Institute of Canada). Se estima que 30% a 40% de todos los hombres por encima de la edad de cuarenta y nueve (49) tienen algunas células de la próstata cancerosas, pero sólo el 20% a 25% de estos hombres tienen una forma clínicamente significativa de cáncer de próstata (SpringNet -CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm). El cáncer de próstata presenta una amplia variedad de comportamiento histológico que implica factores tanto endógenos como exógenos, es decir, situaciones socioeconómicas, dieta, geografía, desequilibrio hormonal, historial familiar y constitución genética (Konishi et al. 1997; Hayward et al. 1998). Aunque determinadas alteraciones en el ADNmt se han asociado previamente con el cáncer de próstata, existe la necesidad de marcadores adicionales para la detección del cáncer de próstata.
Deleción de 3,4kb en el ADNmt y la detección del cáncer de próstata.
En la solicitud PCT en tramitación del solicitante que presenta el no. de publicación WO/06/111029 se identificó una deleción de un segmento de 3.379 pb de ADNmt mediante la amplificación del genoma mitocondrial completo de tejido de próstata. Se determinó que la deleción de 3.379 pb (referida como la deleción de 3,4 kb) estaba localizada entre los nucleótidos 10.744-14.124 del genoma mitocondrial. Se determinó que la detección de esta deleción podría usarse en el diagnóstico del cáncer de próstata cuando se ensayan muestras de tejido. WO 2006/111029 no enseña el uso de ADNmt que tiene la deleción objeto en la detección de cánceres distintos del cáncer de próstata.
La deleción de 3,4 kb elimina todo o parte de los genes siguientes del genoma de ADNmt: (i) subunidad 4L de la NADH deshidrogenasa, (ii) subunidad 4 de la NADH deshidrogenasa, (iii) subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa,
(iv) ARNt histidina, (v) ARNt serina2, y (vi) ARNt leucina2.
Cáncer de mama
El cáncer de mama es un cáncer del tejido glandular de la mama y es la quinta causa más común de muerte por cáncer. En 2005, el cáncer de mama causó 502.000 muertes (7% de las muertes por cáncer; casi 1% de todas las muertes) en el mundo (Organización Mundial de la Salud Cancer Fact Sheet No. 297). Entre las mujeres en el mundo, el cáncer de mama es el cáncer más común y la causa más común de muerte por cáncer (Organización Mundial de la Salud Cancer Fact Sheet No. 297). Las deleciones y mutaciones del genoma mitocondrial en el cáncer de mama se investigaron en Zhu et al. (2004, Cancer detection and prevention, 28(2):119-26), Tan Duan-Jun et al. (2002, Cancer Research, 62(4):972-6) y Parella et al. (2001, Cancer Research, 61(20):7623-6). Por ejemplo, Zhu et al. publica una relación entre el cáncer de mama y un ADNmt que comprende una deleción de 4.576 pb en una deleción denominada común de 4.977 pb. La publicación también describe que no se encontró que dos deleciones más en esta deleción común, las deleciones de 3.938 pb y 4388 pb, se correlacionaran con cáncer de mama. Ninguno de estos documentos describe una deleción de aproximadamente 3.379 pb como un marcador para cáncer de mama. Aunque determinadas alteraciones en el ADNmt se han asociado previamente con el cáncer de mama, por ejemplo en Parrella et al. (Cancer Research: 61, 2001), existe la necesidad de marcadores adicionales para la detección del cáncer de mama.
Resumen de la invención
En una realización, la presente invención proporciona un método para detectar un cáncer en un individuo que comprende:
a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo;
b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del genoma de ADNmt;
c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con al menos un valor de referencia conocido;
en el que el cáncer es cáncer de mama.
En una realización, el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.
En una realización adicional, el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.
En otra realización, el valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido, en el que una cantidad elevada de la deleción en la muestra biológica comparada con la muestra de referencia es indicativa de cáncer. En esta realización, el método puede comprender además la etapa de comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.
En una realización, el valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido, en el que un nivel similar de la deleción en la muestra biológica comparado con la muestra de referencia es indicativo de cáncer. En esta realización, el método puede comprender además la etapa de comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.
La presente invención proporciona además un método para monitorizar a un individuo para el desarrollo de un cáncer que comprende:
a) extraer ADNmt de una muestra biológica del individuo;
b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del genoma de ADNmt;
c) repetir las etapas a) a b) durante una duración de tiempo,
en el que un nivel incrementado de la deleción durante la duración de tiempo es indicativo de cáncer, y en el que el cáncer es cáncer de mama.
En una realización, este método comprende además al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en:
(a) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido; y (b) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.
En realizaciones adicionales, la deleción tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia identificada en SEQ ID NO: 1 en los métodos de la presente invención.
En otras realizaciones, la cuantificación de la deleción en los métodos de la presente invención incluye en primer lugar amplificar una región diana de ADNmt que es indicativa de la deleción, y cuantificar la cantidad de la región diana amplificada. En estas realizaciones, la amplificación de la región diana puede llevarse a cabo usando una pareja de cebadores de amplificación, uno de la pareja de cebadores de amplificación se superpone a un empalme que une regiones en los extremos opuestos de la deleción.
En realizaciones adicionales, la etapa de cuantificación se lleva a cabo usando PCR en tiempo real en los métodos de la presente invención.
En una realización de la invención, la etapa de cuantificación se lleva a cabo usando PCR en tiempo real y el valor de referencia es un umbral de ciclo.
En otras realizaciones se usa un cebador de PCR que tiene una secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 2 como parte de una pareja de cebadores de amplificación para amplificar la región diana.
En realizaciones adicionales, uno de una pareja de cebadores de PCR usado en la amplificación de la región diana se superpone a una región con empalme de ADNmt después de la deleción de la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1.
En realizaciones adicionales, la muestra biológica es un tejido corporal o fluido corporal. En otras realizaciones, la muestra biológica se selecciona de tejido de mama y orina.
Descripción breve de los dibujos
Se describirá ahora una realización de la invención sólo como ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra el diseño y secuencia de un cebador útil para la detección de la deleción de 3,4 kb.
La Figura 2 es un gráfico que muestra una comparación de umbral de ciclo entre participantes malignos y benignos sintomáticos en el estudio 3,4 kb.
La Figura 3 es un gráfico que muestra umbral de ciclo relacionado con el Ejemplo 1.
La Figura 4 muestra una curva ROC que ilustra la especificidad y sensibilidad de una realización de la presente invención.
La Figura 5 muestra una curva ROC que ilustra la especificidad y sensibilidad de otra realización de la presente invención.
La Figura 6 muestra datos de PCR en tiempo real relacionados con los niveles de la deleción de 3,4kb en el ADNmt asociados con cáncer de mama.
La Figura 7 muestra una curva ROC que ilustra la especificidad y sensibilidad de otra realización de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Tal y como se usa en la presente memoria, "umbral de ciclo " (CT) es el punto en el que la amplificación de la diana usando PCR en tiempo real sube por encima del fondo, como se indica por una señal tal como una señal fluorescente. El CT es inversamente proporcional a la cantidad de la secuencia que se está investigando.
Tal y como se define en la presente memoria, "sensibilidad" se refiere a la fracción de resultados positivos verdaderos (proporción de positivos verdaderos) obtenida usando el método de la presente invención.
Tal y como se define en la presente memoria, "especificidad" se refiere a la fracción de resultados positivos falsos (proporción de positivos falsos) obtenida usando el método de la presente invención.
En una realización de la presente invención, se proporcionan métodos para monitorizar y diagnosticar cáncer a través de la detección y cuantificación de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt mencionada anteriormente. Por ejemplo, la presente invención puede usarse para detectar la presencia de pre-neoplasia, neoplasia y progresión hacia malignidad potencial de cáncer de mama. En un aspecto, la presente invención implica la detección y cuantificación de la deleción de 3,4kb en el ADNmt (SEQ ID NO:1) para la detección, diagnóstico y/o monitorización de cáncer. En este método, el ADNmt se extrae de una muestra biológica (por ejemplo tejido corporal o fluidos corporales tales como orina, fluido por masaje de próstata). El ADNmt extraído se ensaya con el fin de determinar los niveles (es decir, cantidad) de la deleción de 3,4 kb en la muestra. En los ensayos realizados por los presentes inventores, se encontró que los niveles de la deleción estaban elevados en las muestras obtenidas de sujetos con cáncer cuando se comparó con las muestras obtenidas de sujetos sin cáncer. Tomando como base la información y datos suministrados más adelante, los inventores han concluido que los niveles elevados de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt son indicativos de cáncer.
Como se describe en PCT WO/06/111029, la deleción de 3,4kb abarca aproximadamente los nucleótidos 10.744 a
14.124 del genoma de ADNmt. El genoma de ADNmt se lista como SEQ ID NO:8 (no. de registro Genbank AC_000021). Los inventores han determinado, como se proporciona en el ejemplo más adelante, que esta deleción también está asociada con cáncer y en particular cáncer de próstata y de mama. Por lo tanto, dicha deleción proporciona un biomarcador exacto y, por lo tanto, una herramienta valiosa para la detección, diagnóstico o monitorización de cáncer en al menos estos tejidos.
La deleción resulta en la creación de dos monómeros de deleción, uno con un tamaño de 3,4kb (sublimon pequeño) y otro con un tamaño de aproximadamente 12,6kb (sublimon grande). La aparición de la deleción puede detectarse bien identificando la presencia del sublimon pequeño o determinando que la secuencia de 3,4 kb se ha delecionado del sublimón grande.
Como se ha discutido anteriormente, la deleción es de aproximadamente 3.379 pb, y comprende genes que codifican la subunidad 4L de la NADH deshidrogenasa, subunidad 4 de la NADH deshidrogenasa, subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa, ARNt histidina, ARNtserina2, y ARNt leucina2.
En una realización, se obtienen muestras, por ejemplo, de orina o tejido de mama, de un individuo y se ensayan durante un periodo de tiempo (por ejemplo, años) con el fin de monitorizar la génesis o progresión del cáncer. Los niveles incrementados de la deleción de 3,4 kb con el tiempo podrían ser indicativos del comienzo o progresión del cáncer.
La acumulación relacionada con la edad de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt puede predisponer a un individuo, por ejemplo, a cáncer de próstata o cáncer de mama, que es predominante en hombres de mediana edad y mayores, y mujeres de mediana edad y mayores, respectivamente. Según un aspecto de la invención, se proporciona un método en el que puede tener lugar un cribado regular del cáncer mediante la monitorización con el tiempo de la cantidad de la deleción de 3,4 kb en tejidos corporales tales como tejido de mama o fluidos corporales tales como orina.
El sistema y método de la presente invención puede usarse para detectar cáncer en un estadio temprano, y antes de cualquier anormalidad histológica. Por ejemplo, el sistema y método de la presente invención puede usarse para detectar pre-neoplasia en tejido de mama.
Se prefieren las secuencias de cebador siguientes para la detección de la deleción de 3,4 kb:
3,4 directo (se une a las bases 10.729-10.743/14.125-14.139 del genoma de ADNmt) 5'-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3' (SEQ ID NO: 2);
3,4 inverso (se une a las bases 14.361-14.379 del genoma de ADNmt) 5'-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3' (SEQ ID NO: 3).
En una realización de la presente invención, se usa una pareja de cebadores de amplificación para amplificar una región diana indicativa de la presencia de la deleción de 3,4 kb. En esta realización, uno de la pareja de cebadores de amplificación se superpone con una región con empalme de ADNmt después de que haya ocurrido la deleción de la secuencia de 3,4 kb (es decir, un empalme en una posición entre 10.743 y 14.125 del genoma de ADNmt). Por lo tanto, la extensión del cebador que se superpone sólo puede ocurrir si la sección 3,4 kb está delecionada.
En otra realización de la presente invención, se usa una pareja de cebadores de amplificación para amplificar una región diana asociada con la secuencia de 3,4 kb delecionada. La secuencia de 3,4 kb delecionada, después de la deleción, puede reformarse como una molécula de ADNmt circular. En esta realización, uno de la pareja de
cebadores de amplificación se superpone con el sitio de reunión de los extremos de la secuencia de 3,4 kb. Así, un incremento en la cantidad de la molécula de 3,4 kb detectado en una muestra es indicativo de cáncer. Se prefiere la pareja de cebadores siguiente para la detección del ácido nucleico de 3,4 kb delecionado.
Directo 14.115/10.755 5'-CCCACTCATCACCTAAACCTAC-3' (SEQ ID NO: 9)
Inverso 10.980R 5'-GGTAGGAGTCAGGTAGTTAG-3' (SEQ ID NO: 10).
En un aspecto de la invención, se proporciona un kit para diagnosticar cáncer, por ejemplo cáncer de mama, que comprende medios para la extracción de ADNmt, cebadores que tienen las secuencias de ácido nucleico recitadas en SEQ ID NOS: 2 y 3, o SEQ ID NOS: 9 y 10, reactivos e instrucciones.
Otro aspecto de la invención proporciona métodos para confirmar o refutar la presencia de un ensayo de biopsia de cáncer de una muestra de biopsia (por ejemplo, cáncer de mama), que comprende: obtener tejido no canceroso de una muestra de biopsia; y detectar y cuantificar la cantidad de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt en el tejido no enfermo.
En una realización, la presente invención proporciona un método para cribar individuos para cáncer de mama a partir de una muestra de fluido corporal que comprende; obtener una muestra de fluido corporal, y detectar y cuantificar el nivel de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt en el fluido corporal.
Aunque los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en los ejemplos más adelante, representan el medio preferido para detectar y cuantificar la presencia o ausencia de la deleción de 3,4kb, también podrían utilizarse otros métodos que serán muy conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, la cuantificación de la deleción podría hacerse usando la tecnología de Sistema Bioplex™ y Matriz de Suspensión de Bio-Rad. Generalmente, el método requiere la amplificación y cuantificación de secuencias usando cualquier método conocido.
Los ejemplos proporcionados más adelante ilustran que esta deleción puede usarse para detectar la presencia de cáncer en muestras biológicas, por ejemplo orina y tejido de mama. Tomando como base los descubrimientos en estos ejemplos, la deleción de 3,4 kb en el ADNmt puede usarse como un biomarcador para cáncer.
Los diferentes ejemplos proporcionados ilustran una diferencia en la cantidad de ADNmt que tiene la deleción de 3,4 kb entre las muestras obtenidas de sujetos que tienen cáncer, y los sujetos sin cáncer. Se encontró que la cantidad de la deleción de 3,4 kb era mayor en las muestras obtenidas de sujetos que tienen cáncer. Esta determinación se hizo comparando la cantidad de la deleción de 3,4 kb en las muestras de ensayo con las cantidades de células cancerosas conocidas y/o células no cancerosas conocidas.
Ejemplo 1: Deleción de 3,4 kb en el ADNmt de Tejido de Próstata
Se identificó una deleción de aproximadamente 3,4 kilobases (kb) mediante la amplificación del genoma mitocondrial completo de tejido de próstata fresco congelado. Usando regresión lineal, se estimó que el tamaño de la deleción era entre 3.000 pares de bases (pb) y 3.500 pb. Se identificaron dos posibles deleciones candidatas usando Mitomap™ (Brandon, M. C., Lott, M. T., Nguyen, K. C., Spolim, S., Navathe, S. B., Baldi, P. y Wallace, D. C., MITOMAP: a human mitochondrial genome database--2004 update. Nucleic Acids Research 33 (Database Issue):D611-613, 2005; www.mitomap.org), la deleción de 3.397 pb en 9.574-12.972, y la deleción de 3.379 pb en 10.744-14.124. Con el fin de determinar cuál de las dos deleciones estaba asociada con cáncer de próstata, si alguna, se desarrolló un cebador directo que conectaba la unión de la deleción para cada una de las dos candidatas, asegurando que el cebador se extendía más allá de las regiones repetidas que flanquean las deleciones. La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra el diseño y secuencia del cebador (es decir, SEQ ID NO: 2). Se obtuvieron resultados de amplificación positivos para el amplicón correspondiente a la deleción de 3.379 pb (referida como la deleción de 3,4 kb) en 10.744-14.124.
Como se ha indicado anteriormente, la deleción de 3,4 kb elimina todo o parte de los genes siguientes: (i) subunidad 4L de la NADH deshidrogenasa, (ii) subunidad 4 de la NADH deshidrogenasa, (iii) subunidad 5 de la NADH deshidrogenasa, (iv) ARNt histidina, (v) ARNt serina2, y (vi) ARNt leucina2.
Se determinó que la deleción de 3,4kb estaba presente en el 91% de 33 muestras de próstata frescas congeladas. Con los cebadores de deleción específicos, se ensayaron tejidos fijados con formalina con el fin de incrementar el valor de n.
Los presentes investigadores secuenciaron genomas mitocondriales completos de 32 muestras de tejido microdiseccionadas por microdisección por captura láser y 12 biopsias con aguja de próstatas histológicamente normales. Se usaron secciones de tejido de archivo de cada una de estas muestras para el estudio siguiente. Se retiraron 1-2 secciones seriadas de cada muestra. Se extrajo el ADN de cada muestra en su totalidad en lugar de como una microdisección. Así, cada muestra consistió en una mezcla de tejido de la próstata glandular así como tejido de la próstata estromal. Esta extracción se realizó usando el Mini Kit de ADN QIAamp™ de Qiagen (No de Cat 51304). Después de la extracción, las muestras se cuantificaron usando un espectrofotómetro Nano-Drop™ y las
concentraciones se normalizaron posteriormente a 2ng/ul. Cada muestra se amplificó usando 20ng de ADN de entrada y un kit iQ™ SYBR Green Supermix™ (Bio-Rad Laboratories Inc.). Las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de PCR en tiempo real con dos colores Opticon® (MJ Research).
Como se muestra en la Figura 2, se observó una diferencia marcada en el umbral del ciclo y, por extensión, en la cantidad de la deleción entre las muestras de próstata malignas y las muestras de próstata benignas sintomáticas. Las muestras malignas presentaron un umbral de ciclo consistentemente antes que las muestras benignas.
Ejemplo 2: Estudio Ciego de la Deleción de 3,4kb - Comparación de Umbral de Ciclo
Se seleccionaron 21 muestras adicionales de tejido de próstata, 10 de las cuales eran benignas y 11 de las cuales eran malignas. El estado patológico se determinó por biopsias con aguja llevadas a cabo por un patólogo cualificado. Las muestras se hicieron ciegas de manera que los presentes investigadores ignoraban su estado patológico cuando llevaron a cabo este ensayo. Los presentes investigadores fueron capaces de predecir el estado patológico correctamente en el 81% de los casos examinando el umbral de ciclo. De los 4 casos incorrectos, dos eran muestras malignas que se determinó que eran benignas y 2 eran muestras benignas que se determinó que eran malignas. El médico requirió la información clínica de seguimiento para los 2 individuos en el último escenario para determinar si se les había diagnosticado cáncer de próstata con posterioridad a los resultados de la biopsia con aguja usados para este estudio. Uno de los individuos que originalmente produjo una muestra benigna pero para el que se predijo por este estudio que tenía una malignidad produjo posteriormente una muestra maligna. Como resultado, uno de los positivos falsos se convirtió en un positivo verdadero. Por lo tanto, el estado patológico se predijo correctamente en el 86% de los casos examinados en este estudio. El valor predictivo positivo (PPV, en el que PPV=positivos verdaderos/(positivos verdaderos+positivos falsos)) final para este estudio fue 91% y el valor predictivo negativo (NPV, en el que NPV=negativos verdaderos/(negativos verdaderos+negativos falsos)) fue 80%.
Ejemplo 3: Estudio de la Deleción de 3,4kb - Métodos (n=76)
En este estudio se examinaron setenta y seis muestras de tejido de próstata para la deleción de 3,4 kb. Todas las muestras de tejido se fijaron con formalina, siendo 25 malignas, siendo 12 normales, y teniendo 39 enfermedad prostática benigna como se muestra histológicamente. DEl último grupo, más de la mitad tenían hiperplasia. Todos los especímenes eran biopsias con aguja tomadas de los archivos de tejido de los investigadores.
Especímenes de Próstata
Se realizó una retirada de cinta adhesiva aplicada con presión en cada portaobjetos usando Prep-Strips (Número de Catálogo LCM0207) de Arcturus Bioscience Inc. Esto permitió la eliminación de toda materia particulada o tejido no adherente del portaobjetos antes de la extracción de ADN. Con el tejido todavía en los portaobjetos, los portaobjetos se lavaron con PBS (Disolución Salina Tamponada con Fosfato) para eliminar tanto fijador como fuera posible. Las 1-2 secciones de biopsia con aguja en los portaobjetos se rasparon en tubos de microcentrífuga estériles usando cuchillas quirúrgicas esterilizadas, envueltas individualmente. El ADN se aisló y purificó usando un Mini Kit de ADN QIAamp® (Qiagen, No. de Cat. 51304) según las especificaciones del fabricante. Se procesó un control de extracto negativo en paralelo con las extracciones de los portaobjetos como punto de evaluación de control de calidad. La concentración total de ADN y la proporción de pureza para cada muestra se determinaron por espectrofotometría (Nano-Drop™ ND-1000) y se prepararon diluciones de 2ng/µl para el propósito de la Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa (qPCR).
Cebadores (Oligonucleótidos)
Los cebadores oligonucleotídicos purificados fueron sintetizados químicamente por Invitrogen (California, EEUU). Las secuencias de los cebadores y los tamaños esperados de los productos de PCR amplificados se listan en la Tabla 1. Además, los análisis por PCR de las deleciones en el ADNmt incluyeron controles positivos (ADN de una fuente que se sabe que porta el ADNmt mutante). Cada conjunto de cebadores con la excepción de TNF (factor de necrosis tumoral) se evaluó frente a la línea celular rho 0 sin mitocondrias para confirmar la ausencia de coamplificación de pseudogenes.
Tabla 1 Cebadores de amplificación.
Pareja de Cebadores
Posición Amplificada 5'- 3' Longitud del producto amplificado (pares de bases)
Deleción 3,4 Tiempo Real
10.729-14.379 (menos de 10.744-14.124) 3.379pb en 273
12s ADNmt
708-945 238
Reacción en cadena de la Polimerasa en Tiempo Real
Se realizaron tres PCR separadas en cada muestra. Cada reacción tuvo un volumen total de 25µl e incluyó ADN molde, una pareja de cebadores (12s o Deleción 3,4 o TNF), un kit iQ™ SYBR Green Supermix™ (Número de Catálogo 170-8882, Bio-Rad Laboratories Inc.) y agua desionizada destilada (ddH2O). El TNF (factor de necrosis tumoral) comprendía cebadores de genes nucleares de copia única, y 12s comprendía cebadores de genoma mitocondrial total. El volumen y concentraciones para el ADN molde, cebadores y tampón de reacción se listan a continuación.
Tabla 2 Componentes de qPCR.
Los parámetros de ciclado para cada amplicón se listan en la Tabla 3.
Tabla 3 Parámetros de Ciclado.
Etapa
Temperatura (°C) Duración
61,5 (cebadores TNF)
4
72 30 seg
5
Lectura de Placa
6
72 10 min
7
Curva de Fusión 50°C - 110°C lectura cada 1°C 3 sec
Repetir las etapas 2-5, 44 veces para un total de 45 ciclos.
El ciclado térmico, detección en tiempo real y análisis de las reacciones se llevó a cabo usando un Motor de ADN Opticon® 2 Sistema de Detección de Fluorescencia Continua equipado con software Intuitive Opticon Monitor™ (MJ Research Inc.). Se utilizó el método de la curva estándar para la cuantificación del ADN. Un conjunto de diluciones seriadas (106, 105, 104, 103, 102, 101) de los tres moldes generados por PCR purificados, un producto para la deleción de 3,4, uno para los cebadores 12s, y uno para TNF. A partir de esto, se generaron tres curvas estándar diferentes que muestran el número de copias de ADNmt total (amplicón 12s-cebadores de genoma mitocondrial total), la cantidad de ADNmt que tiene la deleción de 3,4 kb, o ADN nuclear total (TNF-cebadores de gen nuclear de copia única). Los valores CT de las muestras se convirtieron en el número de copias de ADN comparando el CT de la muestra con el de los estándares. Se consideró que la deleción de 3,4 estaba ausente o a niveles bajos si la detección no se detectó en 37 ciclos.
La determinación de malignidad se basa en la cantidad de la deleción de 3,4kb presente en la muestra normalizada como se indica por la localización del umbral de ciclo. Esta localización puede ser absoluta, como en más de 25 ciclos pero menos de 35 ciclos, o más probablemente una proporción entre el ADN mitocondrial total presente como se indica por el amplicón 12s, y la deleción de 3,4kb. Esto puede expresarse como un porcentaje del ADN mitocondrial total. El número de células, como se representa por el amplicón TNF, puede incorporarse para refinar la distinción entre tejidos benignos y malignos.
Con el fin de automatizar los análisis de estas muestras, se emplearon herramientas de bioinformática. Las tres variables que se consideraron para estos análisis fueron el umbral de ciclo CT del Factor de Necrosis Tumoral (TNF), especies totales de mitocondrias que contienen los sitios de cebador específicos, y las mitocondrias que portan la deleción de interés.
Análisis de Grupos
El agrupamiento no se normalizó ni se usaron funciones logarítmicas debido al intervalo similar y pequeño de datos.
La Figura 3 muestra el movimiento y tendencia real de los datos. El eje de las x es el número de paciente y el eje de las y es el umbral de ciclo obtenido a partir de PCR en tiempo real.
Es importante indicar que cuanto mayor es el umbral de ciclo, menor es la cantidad de la deleción que está presente.
La tendencia general mostrada en la Figura 3 se basa en las diferencias/proporciones entre las variables de Deleción, Total, y TNF. La deleción es baja a ausente para las muestras benignas/normales (lado derecho) y se incrementa (hacia la izquierda) con muestras benignas anormales y malignas. Las muestras benignas anormales y malignas empiezan a diferenciarse entre sí tomando como base la proporción de umbral de ciclo de Deleción a TNF.
Aprendizaje Supervisado
El aprendizaje supervisado se basa en el intento del sistema de predecir resultados para muestras conocidas. Se usó la mitad de los datos para entrenar y la otra mitad para ensayar el algoritmo. El aprendizaje supervisado compara sus predicciones con la respuesta diana y "aprende" de sus errores. Pero, si el resultado predicho es mayor
o menor que el resultado real en los datos, el error se propaga a través del sistema y los pesos se ajustan de acuerdo con esto.
CONJUNTO de Datos: 5% a 35% -Benigno 35% a 65% -Hiperplasia 65% a 95% -Maligno
Algoritmo de Red Neuronal Artificial (ANN) (mostrado esquemáticamente más adelante): La mitad del conjunto de datos usado para en el entrenamiento de ANN La otra mitad se usó para comparar la exactitud Exactitud = Comparar conjunto de datos esperados con conjunto de
datos obtenidos → 86,6%
Aprendizaje supervisado de datos de deleción usando la Red Neuronal Artificial (ANN)
Tres Clasificaciones: Benigno Hiperplasia
15 Maligno
Se usaron tres variables para cada clasificación tomando como base el Umbral de ciclo de PCR en tiempo real CT: Factor de necrosis tumoral (TNF) - Control de copia nuclear. Mitocondria total - control de copia mitocondrial Deleción - Mitocondria en el estado delecionado.
20 Resultados: La mitad del conjunto de datos se usa para entrenar el ANN, y la mitad remanente se usa para comparar la
exactitud. Exactitud de las Tres Clasificaciones = 86,6% Valor Predictivo Positivo (PPV);
25 Benigno a Maligno = 88,2%
Valor Predictivo Negativo (NPV)
Benigno a Maligno = 76,5%
Ejemplo 4: Deleción de 3.4 kb en el ADNmt Asociada con Cáncer de Mama
Se ensayaron 18 muestras de tejido de mama maligno y benigno, siendo 9 malignas y siendo 9 benignas, para la 30 presencia de la deleción de 3,4 kb mencionada anteriormente. Las muestras se clasificaron como malignas o benignas usando análisis histopatológico convencional.
Se aisló y se purificó el ADN de las muestras usando un Mini Kit de ADN QIAamp® (Qiagen, No. de Cat. 51304) según las especificaciones del fabricante.
Los cebadores oligonucleotídicos purificados fueron sintetizados químicamente por Invitrogen (California, EEUU). Las secuencias de los cebadores y los tamaños esperados de los productos de PCR amplificados se listan en la 5 Tabla 1 anterior.
Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real
Se realizaron tres PCR separadas en cada muestra. Cada reacción tuvo un volumen total de 25µl e incluyó ADN molde, una pareja de cebadores (12s o Deleción 3,4 o TNF), un kit iQ™ SYBR Green Supermix™ (Número de Catálogo 170-8882, Bio-Rad Laboratories Inc.) y agua desionizada destilada (ddH2O). El TNF (factor de necrosis
10 tumoral) comprendía cebadores de genes nucleares de copia única, y 12s comprendía cebadores de genoma mitocondrial total. El volumen y concentraciones para el ADN molde, cebadores y tampón de reacción se listan a continuación:
Tabla 4 Componentes de qPCR.
Reactivo
Concentración por Reacción Volumen por Reacción
Tampón de Reacción
1X 12,5µl
Cebador (directo e inverso)
250nM 0,0625µl de cada preparación madre de 100 µmoles
ddH2O
N/A 2,375.µl
ADN Molde
20ng 10,0µl
Total
25µl
15 Los parámetros de ciclado para cada amplicón se listan en la Tabla 5.
Tabla 5 Parámetros de Ciclado.
Etapa
Temperatura (°C) Duración
1
95 3 min
2
95 30 seg
3
66 (cebadores de deleción de 3,4) o 30 seg
61,5 (cebadores 12s) o
61,5 (cebadores TNF)
4
72 30 seg
5
Lectura de Placa
6
72 10 min
7
Curva de Fusión 50°C - 110°C lectura cada 1°C 3 seg
Repetir las etapas 2-5, 44 veces para un total de 45 ciclos.
El ciclado térmico, detección en tiempo real y análisis de las reacciones se llevó a cabo usando un Motor de ADN Opticon® 2 Sistema de Detección de Fluorescencia Continua equipado con software Intuitive Opticon Monitor™ (MJ Research Inc.). Se utilizó el método de la curva estándar para la cuantificación del ADN. Se realizó un conjunto de diluciones seriadas (106, 105, 104, 103, 102, 101) de los tres moldes generados por PCR purificados, un producto para la deleción de 3,4, uno para los cebadores 12s, y uno para TNF. A partir de esto, se generaron tres curvas estándar diferentes que muestran el número de copias de ADNmt total (amplicón 12s-cebadores de genoma mitocondrial total), la deleción de 3,4 kb, o DNA nuclear total (TNF-cebadores de gen nuclear de copia única). Los valores CT de las muestras se convirtieron en el número de copias de ADN comparando el CT de la muestra con el de los estándares.
La determinación de malignidad se basó en la cantidad de la deleción de 3,4kb presente en la muestra normalizada como se indica por la localización del umbral de ciclo. Esta localización puede ser absoluta, como en más de 25 ciclos pero menos de 30 ciclos, o más probablemente una proporción entre el ADN mitocondrial total presente como se indica por el amplicón 12s, y la deleción de 3,4kb. Esto puede expresarse como un porcentaje del ADN mitocondrial total.
Con el fin de automatizar los análisis de estas muestras, se emplearon herramientas de bioinformática. Las tres variables que se consideraron para estos análisis fueron el umbral de ciclo CT del Factor de Necrosis Tumoral (TNF), especies totales de mitocondrias que contienen los sitios de cebador específicos, y las mitocondrias que portan la deleción de interés.
La Tabla 6 y la figura 7 muestran la diferencia en las puntuaciones medias de CT para muestras de tejido maligno y tejido benigno. El valor medio de CT para tejido normal fue 30,5889, mientras el CT medio para tejido maligno fue 27,8533 ilustrando de esta manera una diferencia en la cantidad de ADNmt que tiene la deleción de 3,4 kb en tejido de mama maligno comparado con tejido de mama normal.
Tabla 6 Valores medios para puntuaciones de CT
Estadísticas de Grupo
GRP N Media Desviación Estd. Error Estd. de la Media
del3,4
normal 9 30,5889 2,53897 ,84632
maligno 9 27,8533 2,52253 ,84084
La Figura 8 es una curva ROC que ilustra la especificidad y sensibilidad de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt como un marcador para cáncer de mama cuando se ensaya tejido de mama. Estos resultados se obtuvieron usando un punto de corte de CT de 29,1900. La sensibilidad del marcador a este CT fue 77,8%, mientras la especificidad fue 77,8%.
La Tabla 7 muestra el cálculo del área bajo la curva para el presente ejemplo. Como una medida de la exactitud del ensayo.
Tabla 7 Resultados que Muestran el Área Bajo la Curva
Área Bajo la Curva
Variable(s) Resultado del Ensayo: del3,4
Área
Error Estd.a Sig. Asintótica.b Intervalo de Confianza de 95% Asintótico
Límite Inferior
Límite Superior
,790
,112 ,038 ,570 1,010
a.
Bajo asunción no paramétrica
b.
Hipótesis nula: área real = 0,5
La determinación del punto de corte de CT de 29,1900 se muestra en la tabla 8 siguiente. Los resultados listados en la tabla 8 muestran que un punto de corte de CT de 29,1900 proporcionó la mayor sensibilidad y especificidad al 78% y 78% respectivamente.
Tabla 8: Determinación de punto de corte de CT.
Coordenadas de la Curva Variable(s) Resultado del Ensayo: del3,4
Positivo si es Menor de o Igual aa
Sensibilidad 1 - Especificidad
24,6000
,000 ,000
25,6800
,111 ,000
25,7700
,222 ,000
25,9250
,333 ,000
26,2050
,444 ,000
26,8400
,556 ,000
27,4800
,556 ,111
28,1600
,556 ,222
28,8800
,667 ,222
29,1900
,778 ,222
29,4600
,778 ,333
29,8750
,778 ,444
30,5850
,778 ,556
31,2200
,778 ,667
31,5000
,889 ,667
31,7650
,889 ,778
32,9900
1,000 ,778
34,3350
1,000 ,889
35,6400
1,000 1,000
a. El valor de punto de corte más bajo es el valor de ensayo mínimo observado menos 1, y el valor de punto de corte
5 más alto es el valor de ensayo máximo observado más 1. Todos los demás valores de punto de corte son los promedios de dos valores de ensayo ordenados consecutivos.
Ejemplo 5: La Deleción de 3,4kb en el Fluido por Masaje de Próstata de Individuos con Cáncer de Próstata Comparado con el Fluido de aquellos sin Evidencia Histológica de Cáncer de Próstata
Se recogieron cuarenta muestras de fluido de masaje de próstata por urólogos de pacientes a los que se diagnosticó
10 posteriormente cáncer de próstata o que no mostraron evidencia histológica de cáncer de próstata después de un procedimiento de biopsia con aguja de próstata. La muestra se depositó en un IsoCode Card™ (Schleicher & Shuell), se secó y se extrajo según el protocolo del fabricante. Todos los extractos de ADN se cuantificaron usando un Espectrofotómetro NanoDrop™ ND-1000 y la concentración de ADN se normalizó a 2ng/ul. Cada muestra se amplificó según los parámetros siguientes:
1X iQ SYBR Green Supermix™ (Bio-Rad P/N 170-8880) 150nmoles de cebador directo (5'-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3') (SEQ ID NO: 2). 150 nmoles de cebador inverso
5 (5'-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3') (SEQ ID NO: 3) 20 ng de ADN molde en una reacción de 25ul.
Las reacciones se sometieron a ciclado en un Motor de ADN Opticon™ 2 (Bio-Rad Canadá) según el protocolo siguiente:
10 1. 95°C durante 3 minutos
2.
95°C durante 30 segundos
3.
66°C durante 30 segundos
4.
72°C durante 30 segundos
5.
Lectura de la Placa
15 6. Repetir las etapas 2-5 44 veces
7.
72°C durante 10 minutos
8.
Curva de Fusión de 50°C a 105°C, lectura cada 1°C, espera durante 3 segundos
9.
10°C Espera
Tabla 9 Resultados que muestran los Valores medios de CT para el Ensayo de Fluido por Masaje de Próstata
20 Estadísticas de Grupo
Grupo N Media Desviación Estd. Error Estd. de la media
DEL3,4
benigno 25 37,1869 3,18495 ,63699
maligno 15 33,7712 3,98056 1,02778
Las Tablas 9 y 10 muestran una diferencia significativa entre los valores medios de CT obtenidos para los grupos de muestra benigna y muestra maligna (p=0,005).
Ensayo de Muestras Independiente

Tabla 10 Resultados que Muestran Diferencia (p=0,005) para los valores de CT de las muestras.
Ensayo de Levene para Igualdad de Varianzas ensayo t para Igualdad de medias
Intervalo de Confianza de 95% de la Diferencia
F Sig. t df Sig. (2 colas) Diferencia Media Error Estd. de la Diferencia Inferior Superior
Ensayo de Levene para Igualdad de Varianzas ensayo t para Igualdad de medias
Intervalo de Confianza de 95% de la Diferencia
F Sig. t df Sig. (2 colas) Diferencia Media Error Estd. de la Diferencia Inferior Superior
DEL3,4
Asunción de Varianzas Iguales 1,251 ,270 2.989 38 ,005 3,41570 1,14283 1,10217 5,72923
Sin asunción de varianzas iguales 2.825 24,696 ,009 3,41570 1,20917 ,92382 5,90758
La Figura 5 es una curva Característica Operativa del Receptor (ROC) que ilustra la especificidad y sensibilidad de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt como un marcador para cáncer de próstata cuando se ensaya fluido por masaje de próstata. Estos resultados se obtuvieron usando un punto de corte de CT de 37,3683. La sensibilidad del
5 marcador a este CT es 87%, mientras la especificidad es 64%.
La exactitud del ensayo depende de cómo separe de bien el ensayo el grupo que se está ensayando en aquellos con y sin cáncer de próstata. La exactitud se mide por el área bajo la curva ROC. La Tabla 11 muestra el cálculo del área bajo la curva para el presente ejemplo.
Tabla 11 Resultados que Muestran el Área Bajo la Curva ROC
10 Área Bajo la Curva
Variable(s) de Resultado del Ensayo: DEL 3,4
Área
Error Estd.a Sig. Asintótica b Intervalo de Confianza de 95% Asintótico
Límite Inferior
Límite Superior
,768
,074 ,005 ,622 ,914
a.
Bajo la asunción no paramétrica
b.
Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
Tabla 12 Determinación de Especificidad y Sensibilidad
Coordenadas de la Curva
Variable (s) de Resultado del Ensayo: DEL3,4
Positivo si es Menor de o Igual a a
Sensibilidad 1 -Especificidad
26,2992
,000 ,000
27,3786
,067 ,000
Positivo si es Menor de o Igual a a
Sensibilidad 1 -Especificidad
28,2484
,133 ,000
29,5193
,200 ,000
30,1757
,200 ,040
30,4580
,200 ,080
30,5980
,267 ,080
31,5709
,333 ,080
32,5712
,333 ,120
32,9500
,333 ,160
33,3314
,400 ,160
33,6547
,467 ,160
33,9247
,533 ,160
34,3554
,633 ,200
34,9056
,533 ,240
35,4650
,533 ,280
35,9172
,533 ,320
36,0648
,600 ,320
36,3616
,667 ,320
36,6421
,733 ,320
36,8531
,733 ,360
37,1188
,800 ,360
37,3683
,867 ,380
37,5200
,867 ,400
37,8341
,867 ,440
38,2533
,867 ,480
38,5198
,933 ,480
38,6519
,933 ,520
Positivo si es Menor de o Igual a a
Sensibilidad 1 -Especificidad
38,8552
,933 ,580
39,1258
,933 ,600
39,2734
,933 ,640
39,4952
,933 ,680
39,7323
1,000 ,680
39,8956
1,000 ,720
41,0000
1,000 1,000
El valor de punto de corte más bajo es el valor de ensayo mínimo observado -1, y el valor de punto de corte más alto es el valor de ensayo máximo observado más 1. Todos los demás valores de punto de corte son los promedios de dos valores de ensayo observados, ordenados consecutivos.
5 La determinación del punto de corte de CT de 37,3683 se muestra en la tabla 12 anterior. Los resultados listados en la tabla 12 ilustran que un punto de corte de CT de 37,3683 proporcionó la sensibilidad y especificidad más altas.
Ejemplo 6: La Deleción de 3,4kb en la Orina de Individuos con Cáncer de Próstata Comparada con el fluido de aquellos sin Evidencia Histológica de Cáncer de Próstata
Se recogieron muestras de orina de 5 pacientes a los que se había diagnosticado cáncer de próstata y 5 que se
10 habían sometido a un procedimiento de biopsia con aguja que fue incapaz de detectar malignidad de próstata. Estas muestras se recogieron después de un examen rectal digital (DRE) para facilitar la recolección de células de la próstata.
Después de la recepción de las muestras, se retiró una alicuota de 5ml y se centrifugaron 2mls a 14.000 x g para formar un sedimento. El sobrenadante se retiró y desechó. Los sedimentos se resuspendieron en 200ul de
15 disolución salina tamponada con fosfato. Tanto el sedimento resuspendido como la muestra de orina completa se sometieron a un procedimiento de extracción de ADN usando el Mini Kit de ADN QiaAMP™ (Qiagen P/N 51304) según las directrices del fabricante. Los extractos de ADN resultantes se cuantificaron usando un Espectrofotómetro NanoDrop™ ND-1000 y se normalizaron a una concentración de 0,1ng/ul.
Las muestras se analizaron por PCR cuantitativa en tiempo real con los cebadores específicos de la deleción de 20 3,4kb según lo siguiente:
1X iQ SYBR Green Supermix™ (Bio-Rad P/N 170-8880)
100 nmoles de cebador directo (5'-TAGACTACGTACATACTAACCCTACTCCTA-3') (SEQ ID NO: 2)
100 nmoles de cebador inverso (5'-GAGGTAGGATTGGTGCTGT-3') (SEQ ID NO: 3)
1 ng de ADN molde
25 en una reacción de 25ul.
Las reacciones se sometieron a ciclado en un Motor de ADN Opticon™ 2 (Bio-Rad Canadá) según el protocolo siguiente:
1.
95°C durante 3 minutos
2.
95°C durante 30 segundos
30 3. 69°C durante 30 segundos
4.
72°C durante 30 segundos
5.
Lectura de la Placa
6.
Repetir las etapas 2-5 44 veces
7.
72°C durante 10 minutos
8.
Curva de Fusión de 50°C a 105°C, lectura cada 1°C, espera durante 3 segundos
9.
10°C Espera
Tabla 13 Valores medios para las puntuaciones CT
Estadísticas de Grupos
GRPfluido38 N Media Desviación Estd. Error Estd. de la Media
CTf3,4
Benigno 5 33,2780 1,10900 ,49596
Maligno 5 30,6980 2,55767 1,14382
Las Tablas 13 y 14 muestran una diferencia significativa entre los valores medios de CT obtenidos para los grupos de muestra benigna y muestra maligna (p=0,005).
10 Tabla 14 Resultados que Muestran Diferencia (p=0.,005) para valores de CT de las muestras.
Ensayo de Muestras Independiente
Ensayo de Levene para Igualdad de Varianzas ensayo t para Igualdad de Medias
Intervalo de Confianza de 95% de la Diferencia
F Sig. t df Sig. (2 colas) Diferencia Media Error Estd. de la Diferencia Inferior Superior
CTf
Asunción de varianzas iguales 1,272 ,292 2.069 8 ,072 258.000 1,24672 -,29494 5,45494
Sin asunción de varianzas iguales 2.069 5,453 ,089 258.000 1,24672 -,54639 5,70639
La Figura 6 es una curva Característica Operativa del Receptor (ROC) que ilustra la especificidad y sensibilidad de la deleción de 3,4 kb en el ADNmt como un marcador para el cáncer de próstata cuando se ensaya orina. Estos
15 resultados se obtuvieron usando un punto de corte de CT de 31,575. La sensibilidad del marcador a este CT es 80%, mientras la especificidad es 100%.
La determinación del punto de corte de CT de 31,575 se muestra en la tabla 15. Los resultados listados en la tabla 15 muestran que un punto de corte de CT de 31,575 proporcionó la sensibilidad y especificidad más altas.
Coordenadas de la Curva
Variable(s) Resultado de Ensayo; CTf

Tabla 15: Determinación del punto de corte de CT.
Positivo si es Menor que o Igual aa
Sensibilidad 1 - Especificidad
26,2900
,000 ,000
28,4950
,200 ,000
30,3850
,400 ,000
31,0800
,600 ,000
31,5750
,800 ,000
32,1400
,800 ,200
32,8150
,800 ,400
33,8700
,800 ,600
34,3350
,800 ,800
34,3550
1,000 ,800
35,3700
1,000 1,000
a. El valor de punto de corte más bajo es el valor de ensayo mínimo observado -1, y el valor de punto de corte
5 más alto es el valor de ensayo máximo observado más 1. Todos los demás valores de punto de corte son los promedios de dos valores de ensayo observados, ordenados consecutivos.
Ejemplo 7: Detección de la Secuencia de 3,4kb Delecionada Re-circularizada en Tejido de Próstata Maligno y Benigno
En este ejemplo, se ensayó la cantidad de moléculas de mtADN con deleción de 3,4 kb re-circularizadas en
10 muestras como un indicador para cáncer de próstata. Como se ha mencionado anteriormente, la secuencia de 3,4 kb, después de la deleción, puede reformarse como una molécula de ADNmt circular. La amplificación de una región diana del sublimón de ADNmt con deleción de 3,4 kb se llevó a cabo usando una pareja de cebadores (SEQ ID NOS: 9 y 10). El cebador directo (SEQ ID NO: 9), se superpone con el sitio de reunión de los extremos de la secuencia de 3,4 kb.
15 El tejido de próstata era biopsias con aguja de tejido de próstata fijadas con formalina e incluidas en parafina.
La configuración de reactivos para este ejemplo fue como sigue: 250nmoles de cada cebador 12,5ul de 2X mezcla de reacción, 20ng (10ul de 2ng/ul) de molde en un volumen de reacción de 25 ul.
20 Los parámetros de ciclado fueron como sigue:
1.
95 grados Celsius durante 3 minutos
2.
95 grados Celsius durante 30 segundos
3.
62 grados Celsius durante 30 segundos
4.
72 grados Celsius durante 30 segundos
5.
Lectura de la Placa
6.
Repetir las etapas 2-5 44 veces
7.
72 grados durante 10 minutos
8.
Curva de Fusión de 50-100 grados, lectura cada 1 grado durante 3 segundos
5 9. 4 grados ESPERA.
La amplificación de una región diana del sublimón de ADNmt con la deleción de 3,4 kb se llevó a cabo usando una pareja de cebadores (SEQ ID NOS: 9 y 10).
La Tabla 16 siguiente proporciona un resumen del ensayo llevado a cabo para la detección del 3,4 kb real delecionado en ADNmt obtenido a partir de tejido de próstata maligno y benigno. Usando una puntuación de CT de 10 30,0, fue posible una identificación clara de tejido maligno y benigno. Como tal, un incremento en la cantidad de la molécula de 3,4 kb presente en una muestra fue indicativo de cáncer.

Tabla 16: Puntuaciones CT para la Detección de Cáncer en Tejido de Próstata
Descripción
CT
Muestra benigna 1
33,75
Muestra maligna 1
28,79
Muestra benigna 2
30,96
Muestra maligna 2
28,4
Muestra benigna 3
32,19
Muestra maligna 3
27,38
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<130> 102222/00031
<160> 10 10
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 3379 15 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> cebador directo de detección de la deleción de 3,4 kb
<400> 2
<210> 3 15 <211> 19
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> cebador inverso de detección de la deleción de 3,4 en el ADNmt
<400> 3
25 <210> 4
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> cebador directo de genoma de ADNmt
<400> 4
35
<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> cebador inverso de genoma de ADNmt
45
<400> 5
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> cebador directo de gen nuclear de TNF
55
<400> 6
<210> 7
<211> 21
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> cebador inverso de gen nuclear de TNF
<400> 7
<210> 8 5 <211> 16569
<212> ADN
<213> homo sapiens
<220> 10 <221> característica_misc
<222> (3107)..(3107)
<223> n es a, c, g, ó t
<300> 15 <308> AC_000021
<309>
<313> (1)..(16569)
<400> 8
<210> 9
<211> 22
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Cebador directo para la detección de la secuencia de 3,4 kb delecionada en el ADNmt
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> ADN 10 <213> artificial
<220>
<223> Cebador inverso para la secuencia de 3,4 kb delecionada.
15 <400> 10

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para detectar un cáncer en un individuo que comprende: a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo; b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares
    de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del
    genoma de ADNmt; c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con al menos un valor de referencia conocido;
    en el que el cáncer es cáncer de mama.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1, en el que el valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido,
    en el que una cantidad elevada de la deleción en la muestra biológica comparada con la muestra de referencia es indicativa de cáncer.
  5. 5.
    El método de la reivindicación 4, que comprende además la etapa de comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.
  6. 6.
    El método de la reivindicación 1, en el que el valor de referencia conocido es la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido,
    en el que un nivel similar de la deleción en la muestra biológica comparado con la muestra de referencia es indicativo de cáncer.
  7. 7.
    El método de la reivindicación 6, que comprende además la etapa de comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.
  8. 8.
    Un método para monitorizar a un individuo para el desarrollo de un cáncer que comprende: a) extraer ADNmt de una muestra biológica del individuo; b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción de aproximadamente 3.379 pares
    de bases en la secuencia de ácido nucleico que abarca aproximadamente los residuos 10.744 a 14.124 del genoma de ADNmt; c) repetir las etapas a) a b) durante una duración de tiempo, en el que un nivel incrementado de la deleción durante la duración de tiempo es indicativo de cáncer; en el que el cáncer es cáncer de mama.
  9. 9.
    El método de la reivindicación 8, que comprende además al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en: (a) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido; y (b) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de la deleción en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.
  10. 10.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la deleción tiene una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia identificada en SEQ ID NO: 1.
  11. 11.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cuantificación de la deleción incluye en primer lugar amplificar una región diana de ADNmt que es indicativa de la deleción, y cuantificar la cantidad de la región diana amplificada.
  12. 12. El método según la reivindicación 11, en el que la amplificación de la región diana se lleva a cabo usando una pareja de cebadores de amplificación, uno de la pareja de cebadores de amplificación que se superpone con un empalme que une las regiones en extremos opuestos de la deleción.
  13. 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de cuantificación se lleva a 5 cabo usando PCR en tiempo real.
  14. 14.
    El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de cuantificación se lleva a cabo usando PCR en tiempo real y en el que el valor de referencia es un umbral de ciclo.
  15. 15.
    El método de la reivindicación 11 ó 14, en el que se usa un cebador de PCR que tiene una secuencia
    correspondiente a SEQ ID NO: 2 como parte de una pareja de cebadores de amplificación para amplificar la región 10 diana.
  16. 16. El método de la reivindicación 11 ó 14, en el que uno de una pareja de cebadores de PCR usado en la amplificación de la región diana se superpone con una región con empalme de ADNmt después de la deleción de la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 1.
  17. 17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biológica es un tejido 15 corporal o fluido corporal.
  18. 18. El método de la reivindicación 17, en el que la muestra biológica se selecciona de tejido de mama y orina.
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