CN115896281A

CN115896281A - 甲基化生物标记物、试剂盒及用途

Info

Publication number: CN115896281A
Application number: CN202210578062.5A
Authority: CN
Inventors: 阮微媚; 王军; 杨婷; 陶锦胜; 陈志伟
Original assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Current assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-05-25
Also published as: WO2023226938A1; CN115896281B

Abstract

本发明公开了甲基化生物标记物、试剂盒及用途。本发明提供了一种用于结直肠癌淋巴结转移诊断的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包含：(i)如SEQ ID NO:1～15所示的序列的至少一种；和/或(ii)与SEQID NO:1～15所示的序列互补的序列中的至少一种。本发明提供的DNA甲基化生物标记物、试剂盒可以用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移，具有良好的敏感性、特异性及准确度。

Description

甲基化生物标记物、试剂盒及用途

技术领域

本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及一种甲基化生物标记物、试剂盒及用途。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界第三大恶性肿瘤，全世界每年结直肠癌死亡率呈上升趋势，据最新统计，目前全球CRC的发病率逐渐升高，死亡率仍然高居不下，并CRC呈现出年轻化趋势。其发病率和死亡率已攀升到第三位和第二位，其中，CRC淋巴结转移是术后复发和死亡率升高的主要原因。

转移是恶性肿瘤的主要特征，这也是导致患者术后复发、死亡率高的主要原因。大多数恶性肿瘤的转移主要包括了淋巴结转移、种植转移、血道转移、直接转移。相似地，CRC也经血行转移，比如CRC最常见的是转移到肝脏，其次是肺、骨头、脑。除此之外，结直肠癌也可以直接侵犯肿瘤周围组织如膀胱、子宫、输尿管等。脱落的癌细胞也可以导致腹腔的种植转移。但是，CRC淋巴结转移是最主要的方式，而CRC淋巴结的转移决定了其预后及死亡率。由于CRC淋巴结转移与否决定了患者的重要分期，也是术后复发和预后的重要影响因素，同时也决定了不同的治疗方案，所以一直以来都受到临床上的广泛关注。因此，有必要在CRC治疗前了解患者有无合并淋巴结转移。目前广泛应用于临床的主要有血清学指标和影像学诊断，其中血清学指标主要包括胃肠道相关肿瘤抗原(CA199)、血清癌胚抗原(CEA)，但其检验效能有限，它们尚不能将CEA、CA199用于鉴别淋巴结转移。虽然目前对于CRC淋巴结转移诊断的金标准仍然是通过术后的淋巴结病理活检，但这明显滞后。因此术前的影像学诊断仍被广泛用于对CRC淋巴结转移的判断。但目前关于影像学在CRC淋巴结转移的诊断准确性仍然偏低。有研究指出MRI、 CT对CRC淋巴结诊断结果与CRC组织病理学结果的符合率分别只有为57.6％和54.7％，而MRI和CT的敏感性分别为42.6％和25.0％，特异性分别为74.1％和41.3％，且MR和CT评估5年无病生存率和总生存率的符合率分别为56.7％和43.8％。虽然总体MRI诊断性能优于CT，但诊断效能仍十分有限。而近年来被广泛认可的用于肿瘤诊断，尤其是微小病灶具有高度敏感性和特异性的 PET-CT，其在关于CRC淋巴结转移的诊断效能也非常有限。有实验证明， PET-CT检测CRC近端淋巴结的灵敏度为66％，特异性为60％，准确度为63％，其特异性及准确性同比高于CT特异性的29％，准确性的59％，但仍到不到70％以上甚至更高的水平。

综上，亟需开发一种新的DNA甲基化标志物，鉴别早期肠癌淋巴结转移，辅助临床准确诊断和指导治疗。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于利用DNA甲基化生物标记物来检测结直肠癌淋巴结转移与非转移，本发明提供的甲基化生物标记物可以实现精准检测/诊断的目的。

用于解决问题的方案

本发明的一些方面提供了一种用于结直肠癌淋巴结转移诊断的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包含：

(i)如SEQ ID NO:1～15所示的序列的至少一种；和/或，

(ii)与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列中的至少一种。

在一些实施方案中，所述的甲基化生物标记物至少包含SEQ ID NO:10 所示的序列和/或与SEQ ID NO:10所示的序列互补的序列。

在一些实施方案中，所述的甲基化生物标记物包含SEQ ID NO:10所示的序列和/或与SEQ ID NO:10所示的序列互补的序列，与选自以下的序列的组合：

(a)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15 中所示的序列的至少一种；和/或，

(b)与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15 所示的序列互补的序列中的至少一种。

在一些实施方案中，所述诊断是区分患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移。

在一些任选的实施方案中，所述结直肠癌选自TNM分期中T分期的T1期、 T2期、T3期或T4期的结直肠癌。

在本发明的一些方面提供了上述的甲基化生物标记物在制备用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途。

在本发明的一些方面提供了一种用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中上述的甲基化生物标记物的甲基化程度的试剂。

在一些实施方案中，所述的试剂为选自以下的检测甲基化程度的方法中所使用的试剂：荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序和DNA甲基化质谱中的一种或多种。

在一些具体的实施方案中，所述的试剂包括引物和/或探针；其中，所述引物特异扩增包含SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列；所述探针至少部分地与SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列杂交。

在一些更具体的实施方案中，所述的试剂包括选自以下的至少一组引物和探针：

(1)如SEQ ID NO:16～17所示的引物，如SEQ ID NO:46所示的探针；

(2)如SEQ ID NO:18～19所示的引物，如SEQ ID NO:47所示的探针；

(3)如SEQ ID NO:20～21所示的引物，如SEQ ID NO:48所示的探针；

(4)如SEQ ID NO:22～23所示的引物，如SEQ ID NO:49所示的探针；

(5)如SEQ ID NO:24～25所示的引物，如SEQ ID NO:50所示的探针；

(6)如SEQ ID NO:26～27所示的引物，如SEQ ID NO:51所示的探针；

(7)如SEQ ID NO:28～29所示的引物，如SEQ ID NO:52所示的探针；

(8)如SEQ ID NO:30～31所示的引物，如SEQ ID NO:53所示的探针；

(9)如SEQ ID NO:32～33所示的引物，如SEQ ID NO:54所示的探针；

(10)如SEQ ID NO:34～35所示的引物，如SEQ ID NO:55所示的探针；

(11)如SEQ ID NO:36～37所示的引物，如SEQ ID NO:56所示的探针；

(12)如SEQ ID NO:38～39所示的引物，如SEQ ID NO:57所示的探针；

(13)如SEQ ID NO:40～41所示的引物，如SEQ ID NO:58所示的探针；

(14)如SEQ ID NO:42～43所示的引物，如SEQ ID NO:59所示的探针；

(15)如SEQ ID NO:44～45所示的引物，如SEQ ID NO:60所示的探针。

在一些具体实施方案中，所述的待测样本选自组织、血液、血浆、唾液、血清、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。

本发明的一些方面提供了一种用于结直肠癌淋巴结转移诊断的系统，其中，所述系统包括检测装置、计算装置和输出装置；

所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样本，所述检测器用于检测所述样本中上述的甲基化生物标记物的甲基化程度；

所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：

将所述样本中所述的甲基化生物标记物的甲基化程度与判定阈值相比较，判别所述样本对应的受试者的是否存在结直肠癌淋巴结转移。

本发明的一些方面提供了选自以下的引物和探针的组合中的至少一组在制备用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述引物和探针的组合用于检测上述的甲基化生物标记物的甲基化程度：

(1)如SEQ ID NO:16～17所示的引物，如SEQ ID NO:46所示的探针；

(2)如SEQ ID NO:18～19所示的引物，如SEQ ID NO:47所示的探针；

(3)如SEQ ID NO:20～21所示的引物，如SEQ ID NO:48所示的探针；

(4)如SEQ ID NO:22～23所示的引物，如SEQ ID NO:49所示的探针；

(5)如SEQ ID NO:24～25所示的引物，如SEQ ID NO:50所示的探针；

(6)如SEQ ID NO:26～27所示的引物，如SEQ ID NO:51所示的探针；

(7)如SEQ ID NO:28～29所示的引物，如SEQ ID NO:52所示的探针；

(8)如SEQ ID NO:30～31所示的引物，如SEQ ID NO:53所示的探针；

(9)如SEQ ID NO:32～33所示的引物，如SEQ ID NO:54所示的探针；

(10)如SEQ ID NO:34～35所示的引物，如SEQ ID NO:55所示的探针；

(11)如SEQ ID NO:36～37所示的引物，如SEQ ID NO:56所示的探针；

(12)如SEQ ID NO:38～39所示的引物，如SEQ ID NO:57所示的探针；

(13)如SEQ ID NO:40～41所示的引物，如SEQ ID NO:58所示的探针；

(14)如SEQ ID NO:42～43所示的引物，如SEQ ID NO:59所示的探针；

(15)如SEQ ID NO:44～45所示的引物，如SEQ ID NO:60所示的探针。

发明的效果

本发明提供的DNA甲基化生物标记物、试剂盒可以用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移，具有良好的敏感性、特异性及准确度。

附图说明

图1为甲基化生物标记物的ΔCT聚类效果图。

图2为比较SEQ ID NO:10所示标记物与CA199、CEA、影像诊断方法的 AUC差异的示意图。

具体实施方式

以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值 A、B的范围。

本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素 (例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本说明书中，术语“结直肠”指的是结肠、直肠和/或阑尾，即整个大肠。

本说明书中，术语“癌症”(也称为癌)通常指任何类型的恶性新生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(genetic re-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。因此，术语“结直肠癌”指的是结肠、直肠和阑尾的癌性生长。

最常见的结直肠癌细胞类型是腺癌，大约占95％。其他类型的CRC包括尤其是淋巴瘤和鳞癌。

本说明书中，TNM(Tumor Node Metastasis)是肿瘤学中对肿瘤的一种分期形式，其中T(Tumor)指肿瘤原发灶的情况，随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加，依次用T1～T4来表示；N(Node)指区域淋巴结 (regional lymph node)受累情况。淋巴结未受累时，用N0表示。随着淋巴结受累程度和范围的增加，依次用N1～N3表示；M(Metastasis)指远处转移 (通常是血道转移)，没有远处转移者用M0表示，有远处转移者用M1表示。在此基础上，用TNM三个指标的组合划出特定的分期。

本说明书中，术语“样本”是指可能包含需要进行分析的靶分子的任何物质，包括生物样本。如本文所用，“样本”或“生物样本”是指从活的或病毒性(或朊病毒的)来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样本，并且包括可以从之获得核酸、蛋白质和/或其他大分子的受试者的任何细胞类型或组织。样本或生物样本可以是直接从生物来源获得的样本或者是被处理的样本。样本或生物样本包括，但不限于，体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓样本、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)和植物的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。

本说明书中，术语“受试者”可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。在本发明中，哺乳动物是指任何种类的哺乳动物，优选人(包括人、人受试者或人患者)。受试者和哺乳动物包括，但不限于，农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫和啮齿类动物如小鼠和大鼠。

本说明书中，诊断包括受试者疾病状态或病症的检测或鉴定、确定受试者将患给定疾病或病症的可能性、确定患有疾病或病症的受试者将对治疗有反应的可能性、确定患有疾病或病症的受试者的预后(或其可能的进展或消退)以及确定治疗对患有疾病或病症的受试者的效果。

在本发明的一些具体实施方案中，诊断还意指区分患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移。

术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列 3′-T-C-A-5′互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。

术语“聚合酶链式反应”用于扩增靶序列，该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“PCR扩增”，是“PCR产物”或“扩增子”。

本说明书中，术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样本模板”。

本说明书中，术语“样本模板”是指来源于样本的用于分析“靶”的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样本模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样本中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样本中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样本的背景存在。

本说明书中，术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。

本说明书中，术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如，“捕获探针”)。预期在一些实施方案中，本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，使得在任何检测系统中可检测。

本说明书中，“扩增”通常是指产生所需序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”是指至少两个拷贝。“拷贝”并不一定意味着与模板序列具有完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物如脱氧肌苷，有意的序列改变(例如通过包含与模板可杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)，和/或在扩增过程中发生的序列错误。

本说明书中，“序列确定”等包括确定与核酸的核苷酸碱基序列有关的信息。这样的信息可以包括对核酸的部分或全部序列信息的鉴定或确定。可以以不同程度的统计可靠性或置信度来确定序列信息。在一个方面，所述术语包括确定核酸中多个连续核苷酸的身份和顺序。

本说明书中，术语“测序”、“高通量测序”或“下一代测序”包括使用这样的方法进行序列确定：所述方法以本质上平行的方式确定许多(通常数千至数十亿)个核酸序列，即在这种方法中，制备DNA模板并不是用于每次测序一个，而是以批量过程进行，并且在这种方法中许多序列优选地被并行读取，或者使用本身可以并行化的超高通量串行过程读取。此类方法包括但不限于焦磷酸测序(例如，如454Life Sciences,Inc.,Branford,CT所商业化的)；通过连接进行测序(例如，如SOLiDTM技术，Life Technologies,Inc.,Carlsbad, CA所商业化的)；使用修饰的核苷酸通过合成进行测序(例如，如Illumina,Inc., San Diego,CA所商业化的TruSeqTM和HiSeqTM技术，Helicos Biosciences Corporation,Cambridge,MA所商业化的HeliScopeTM；和Pacific Biosciences of California,Inc.,Menlo Park,CA所商业化的PacBio RS)，通过离子检测技术进行测序(例如，Ion TorrentTM技术,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)；DNA 纳米球测序(Complete Genomics,Inc.,MountainView,CA)；基于纳米孔的测序技术(例如，由Oxford Nanopore Technologies,LTD,Oxford,UK所开发的) 等高度并行的测序方法。

本说明书中，“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。

本说明书中，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的 5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于DNA中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。

本说明书中，核酸分子的“甲基化状态”、“甲基化谱”和“甲基化状况”是指在核酸分子中存在或不存在一个或多个甲基化核苷酸碱基。例如，包含甲基化胞嘧啶的核酸分子被视为甲基化的(例如，核酸分子的甲基化状态为甲基化的)。不含任何甲基化核苷酸的核酸分子被视为未甲基化的。

本说明书中，甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。“甲基化程度”或“共甲基化程度”由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内(例如本发明提供的甲基化生物标记物)，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。

本说明书中，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite) 或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。

以下对于本发明甲基化生物标记物、试剂盒及用途进一步说明。

<甲基化生物标记物>

(i)如SEQ ID NO:1～15所示的序列的至少一种；和/或，

(ii)与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，如SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列中包含至少一个由CG指示的甲基化位点，即如SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列为包含由CG指示的甲基化位点的甲基化区域。

在本发明的一些实施方案中，所述的甲基化生物标记物包含如SEQ ID NO:1～15所示的序列的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种。在本发明的另一些实施方案中，所述的甲基化生物标记物包含与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种。在本发明的一些实施方案中，所述的甲基化生物标记物可以包含如SEQ ID NO:1～15所示的序列的至少一种和与 SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述的甲基化生物标记物至少包含 SEQ IDNO:10所示的序列和/或与SEQ ID NO:10所示的序列互补的序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的甲基化生物标记物包含SEQ ID NO:10所示的序列和/或与SEQ ID NO:10所示的序列互补的序列，与选自以下的序列的组合：

在本发明的一些具体实施方案中，所述的组合可以为但不限于：

(1)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:10，或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10 互补序列的组合；

(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11互补序列的组合；

(3)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:15，或与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 15互补序列的组合；

(4)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12，或与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 12互补序列的组合；

(5)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或与SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11互补序列的组合；

(6)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:15，或与SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15互补序列的组合；

(7)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12，或与SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12互补序列的组合；

(8)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15，或与SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:15互补序列的组合；

(9)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，或与SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12互补序列的组合；

(10)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15，或与SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:15互补序列的组合；

(11)SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15，或与SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15互补序列的组合；

(12)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15，或与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15互补序列的组合；

(13)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15，或与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15互补序列的组合；

(14)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，或与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12互补序列的组合；

(15)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12 和SEQ ID NO:15，或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15互补序列的组合。

在本发明的一些实施方案中，所述诊断是区分患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的受试者是哺乳动物；优选地，所述的哺乳动物是人；进一步优选地，所述的受试者是结直肠癌患者。

在本发明的一些具体实施方案中，所述结直肠癌选自TNM分期中T分期的T1期、T2期、T3期或T4期的结直肠癌。

<甲基化生物标记物的用途>

在本发明的一些方面中，提供了上述的甲基化生物标记物在制备用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途。

在另一些实施方案中，提供了检测上述的甲基化生物标记物的甲基化程度的试剂在制备用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途。

<结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒>

在本发明的一些方面中，提供了用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中上述的甲基化生物标记物的甲基化程度的试剂。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述的试剂为选自以下的检测甲基化程度的方法中所使用的试剂：荧光定量PCR(qPCR)、甲基化特异性PCR (MSP)、数字PCR(ddPCR)、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序(Whole Genome BisulfiteSequencing,WGBS)、DNA甲基化质谱(MassArray)中的一种或多种。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述的试剂为荧光定量PCR和/或甲基化特异性PCR中所使用的试剂。具体地，所述的试剂包括引物和/或探针。在一些实施方案中，所述引物扩增(特异性扩增)包含SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列。在一些实施方案中，所述探针至少部分地与SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15 所示的序列互补的序列杂交。

在本发明的一些更具体的实施方案中，所述的试剂包括选自以下的至少一组引物和探针：

(1)如SEQ ID NO:16～17所示的引物，如SEQ ID NO:46所示的探针；

(2)如SEQ ID NO:18～19所示的引物，如SEQ ID NO:47所示的探针；

(3)如SEQ ID NO:20～21所示的引物，如SEQ ID NO:48所示的探针；

(4)如SEQ ID NO:22～23所示的引物，如SEQ ID NO:49所示的探针；

(5)如SEQ ID NO:24～25所示的引物，如SEQ ID NO:50所示的探针；

(6)如SEQ ID NO:26～27所示的引物，如SEQ ID NO:51所示的探针；

(7)如SEQ ID NO:28～29所示的引物，如SEQ ID NO:52所示的探针；

(8)如SEQ ID NO:30～31所示的引物，如SEQ ID NO:53所示的探针；

(9)如SEQ ID NO:32～33所示的引物，如SEQ ID NO:54所示的探针；

(10)如SEQ ID NO:34～35所示的引物，如SEQ ID NO:55所示的探针；

(11)如SEQ ID NO:36～37所示的引物，如SEQ ID NO:56所示的探针；

(12)如SEQ ID NO:38～39所示的引物，如SEQ ID NO:57所示的探针；

(13)如SEQ ID NO:40～41所示的引物，如SEQ ID NO:58所示的探针；

(14)如SEQ ID NO:42～43所示的引物，如SEQ ID NO:59所示的探针；

(15)如SEQ ID NO:44～45所示的引物，如SEQ ID NO:60所示的探针。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述的待测样本选自组织、血液、血浆、唾液、血清、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在一些优选的实施方案中，所述的待测样本为组织，例如结直肠癌组织。

<引物和探针的组合的用途>

在本发明的一些方面，提供了选自以下的引物和探针的组合的至少一组在制备用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述引物和探针的组合用于检测上述的甲基化生物标记物的甲基化程度：

(1)如SEQ ID NO:16～17所示的引物，如SEQ ID NO:46所示的探针；

(2)如SEQ ID NO:18～19所示的引物，如SEQ ID NO:47所示的探针；

(3)如SEQ ID NO:20～21所示的引物，如SEQ ID NO:48所示的探针；

(4)如SEQ ID NO:22～23所示的引物，如SEQ ID NO:49所示的探针；

(5)如SEQ ID NO:24～25所示的引物，如SEQ ID NO:50所示的探针；

(6)如SEQ ID NO:26～27所示的引物，如SEQ ID NO:51所示的探针；

(7)如SEQ ID NO:28～29所示的引物，如SEQ ID NO:52所示的探针；

(8)如SEQ ID NO:30～31所示的引物，如SEQ ID NO:53所示的探针；

(9)如SEQ ID NO:32～33所示的引物，如SEQ ID NO:54所示的探针；

(10)如SEQ ID NO:34～35所示的引物，如SEQ ID NO:55所示的探针；

(11)如SEQ ID NO:36～37所示的引物，如SEQ ID NO:56所示的探针；

(12)如SEQ ID NO:38～39所示的引物，如SEQ ID NO:57所示的探针；

(13)如SEQ ID NO:40～41所示的引物，如SEQ ID NO:58所示的探针；

(14)如SEQ ID NO:42～43所示的引物，如SEQ ID NO:59所示的探针；

(15)如SEQ ID NO:44～45所示的引物，如SEQ ID NO:60所示的探针。

<结直肠癌淋巴结转移诊断系统>

将所述样本中如上述的甲基化生物标记物的甲基化程度与判定阈值相比较，判别所述样本对应的受试者的是否存在结直肠癌淋巴结转移。

在一些具体的实施方案中，所述输出装置用于输出所述检测装置的检测结果和/或所述计算装置的判别结果，所述输出装置包括显示器、打印机和音频输出装置中的至少一种；所述计算装置包括电脑主机、中央处理器和网络服务器中的至少一种。

在一些具体的实施方案中，所述判定阈值可以通过以下方式获得：根据结直肠癌淋巴结非转移受试者及淋巴结转移受试者中上述的甲基化生物标记的甲基化程度，建立判别淋巴结转移发生的诊断模型(例如 ROC曲线)，并根据诊断模型(例如ROC曲线)获得划分是否存在淋巴结转移的判定阈值。

<结直肠癌淋巴结转移诊断方法>

在本发明的一些方面，提供了一种结直肠癌淋巴结转移诊断方法，其包括以下步骤。

获得受试者的样本；

提取所述样本的基因组DNA和/或游离DNA；

检测所述DNA中，上述的甲基化生物标记物的甲基化程度；

判别受试者是否存在直肠癌淋巴结转移，即患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移。

以下通过实施例与测试例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例与测试例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例与测试例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料及方法

一、DNA甲基化生物标记物

本发明以下实施例中，用于结直肠癌淋巴结转移诊断的DNA甲基化生物标记物，其包含：

(i)如SEQ ID NO:1～15所示的序列的至少一种，和/或

(ii)与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列中的至少一种。

DNA甲基化生物标记物具体如下表1所示，SEQ ID NO:1～15所示的序列及其互补序列为包含由CG指示(表1中粗体显示)的多个甲基化位点的甲基化区域。本发明通过上述甲基化区域中的多个甲基化位点的共甲基化程度 (或称为甲基化程度)判别是否存在结直肠癌淋巴结转移。

在下表中，根据2009年2月human genome assembly GRCh37/hg19(参见例如Rosenbloom等(2012)“ENCODE whole-genome data in the UCSC Genome Browser：update2012”Nucleic Acids Research 40：D912-D917)对碱基编号。

表1 DNA甲基化生物标记物

二、引物及探针

针对上述的DNA甲基化生物标记物的甲基化区域，设计了相应的特异性引物及探针，具体如下表2和表3所示。特异性引物及探针可以用于检测甲基化区域中甲基化位点的甲基化状态，从而判断甲基化区域的甲基化程度，可以构成用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，包括多个甲基化区域甲基化特异性引物对及探针。

表2针对DNA甲基化生物标记物的特异性引物

表3针对DNA甲基化生物标记物的探针

标记物	SEQ ID NO:	探针
			ACHE	46	AACTAACTACATCCCGAAAACCCGACACGC
C21orf33,ICOSLG	47	CCCGCCAACCCCGTACACTCGCTC
			RPS15,APC2-1	48	CCGCCTCCAACAAATACCTCAACTAAACCC
RPS15,APC2-2	49	ACCCGCAAACGCCGAAACCAAACCTAA
			BAHCC1	50	CCCAACGCCTACCACCACATCCCCT
LEFTY1,PYCR2	51	CCCACGCAACCTCGCCTATAACCCCA
			RTN4RL2	52	AACAACCAACACGCACCGACGCAAC
KCNQ1	53	ACCCGAAACAAACACAATCTCACTCCACAC
			IZUMO1	54	AAATACTCTCACCCCAAACCGAAAACAAAA
LBX2	55	TCCGCTCCAAACCACTCTCTTCTCGAAA
			STMN3	56	ACAAACACCAAACCGAACGCGACTAAATCC
SS18L1	57	AAACCACGACACACCCTCTACTTCCTCAAA
			CYTH2	58	CCACCCGCGTCCCGATCCCTACTAAA
LINC01072,GJA3	59	CACTCGATCCTCCTTACGAACGACTCTCT
			PDE9A	60	CGCACTCACCGAAACAAACCGATAACGAT

内参引物及探针如下表4所示：每次试验选择任一组使用。

表4：

本发明上述引物探针购于Thermo Fisher、金唯智生物科技有限公司或生工生物工程股份有限公司，多重PCR反应试剂购于NEB公司，荧光定量PCR试剂购于NEB公司、TAKARA公司或诺唯赞公司。

三、多重PCR

具体流程如下：

1、DNA提取：提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。

2、DNA亚硫酸氢盐转化：DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于 Zymo公司，按照试剂盒说明书进行。

3、多重PCR扩增：采用15个甲基化区域的引物对，在每个反应孔中进行多重PCR，扩增出含目标区域的目标序列，产物大小在 70-130bp左右。

具体包括以下步骤：

1)配置单个引物浓度为10μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个甲基化区域的正向和反向引物，共1个反应孔。

2)PCR混合液配置：根据下表5配制PCR混合液：

表5 PCR混合液配置方案

3)打开PCR仪，将反应体系放入PCR仪进行反应，多重PCR反应程序如下：98℃30秒→20×[98℃，15秒→63℃15秒→72℃15 秒]→72℃5分钟→4℃保存。

四、荧光定量PCR

1、配置荧光定量PCR反应体系如下：配置单个标志物的引物和探针混合液，一般标志物的引物(正向引物/反向引物)终浓度为 0.4μM，探针终浓度为0.2μM；选择一组内参引物(以下实施例中使用如SEQ ID NO:61～63所示的引物组和探针)，内参的引物(正向引物/反向引物)终浓度为0.8μM，探针终浓度为0.4μM。

2、把该反应体系加入96孔板，每个孔18μL，然后将上述经过多重PCR的产物用DECP水稀释，根据孔的个数计算稀释的体积，充分振荡混匀；向每个孔加入2μL稀释过的多重PCR产物；

3、打开qPCR仪器，设定好程序如下：95℃5分钟→40×[95 ℃15秒→62℃30秒]，将96孔板放入qPCR仪按该程序运行；

4、获得CT值。

实施例

共收集145例石蜡结直肠组织样本(CRC淋巴结阴性79例和CRC 淋巴结阳性66例)，以及76例新鲜结直肠组织样本(CRC淋巴结阴性39例和CRC淋巴结阳性37例)所有患者临床资料，其中包括年龄、性别、TNM分期、肿瘤大小、淋巴管浸润状态、血管浸润状态、神经浸润状态、溃疡型等如下表6所示：

表6患者临床资料

对这221个样本，如材料和方法部分所述，用这15对引物进行多重PCR及荧光定量PCR，得到这15个标记物在每个样本里面的ΔCT。具体地，检测所得每个甲基化区域的CT值通过内参CT值进行校正，得到目标区域的相对循环数ΔCT＝CT(目标区域，即甲基化区域)-CT(内参)；若目标区域未检出，则赋予目标区域的相对循环数ΔCT＝35。

ΔCT值与样品中DNA量呈负相关，ΔCT值的高低反映了样本中该标记物共甲基化的DNA片段的含量的高低，通常甲基化水平或者共甲基化DNA含量越高，ΔCT值越低。根据15个甲基化区域共甲基化在结直肠癌淋巴结非转移人群及淋巴结转移人群中的相对循环数ΔCT值建立单个甲基化区域判别淋巴结转移发生的诊断模型 ROC曲线，并根据ROC曲线计算AUC值及划分该区域的判定阈值。根据阈值对比标准诊断计算该甲基化区域的判别灵敏度、特异性等。具体地，在本实施例中，利用R(R version 3.6.1)软件里面的pROC (version1.12)包计算每个标记物的AUC及敏感性(Sensitivity,SE)、特异性(Specificity,SP)、准确率(Accuracy,ACC)、阳性预测值 (Positive predictive value,PPV)、阴性预测值(Negative predictive value,NPV)如下表7所示，可以看到每个标记物在区分结直肠癌淋巴结转移和非转移方面均有区分能力，ACC均在0.54以上，最高可达约0.82；图1是ΔCT聚类效果图。

表7 15个标记物区分结直肠癌淋巴结转移和非转移的统计结果

从上表7中单个标记物的表现可以看出SEQ ID NO:10所示的生物标记物表现最佳(AUC约为0.87，ACC约为0.82)，选取SEQ ID NO:10所示的生物标记物，与SEQ ID NO:3、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15中的一个或多个标记物进行随机组合，用221样本，随机切分100次，用逻辑回归建模，在100次试验(test) 里面平均AUC如下表8所示，可以看出这些标记物的组合同样具有良好的区分肠癌淋巴结转移的能力。

表8标记物组合区分结直肠癌淋巴结转移和非转移的统计结果

同样通过221个样本，比较了如SEQ ID NO:10所示标记物的Δ CT与CA199、CEA、影像的差异，如图2及下表9所示，可以看出如 SEQ ID NO:10所示标记物远优于CA199、CEA和影像，如SEQ ID NO:10所示标记物的AUC约为0.87，CA199的AUC约为0.58，CEA 的AUC约为0.56，影像的AUC约为0.52。

表9本发明生物标记物与CA199、CEA、影像的对比

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市基准医疗有限责任公司

<120> 甲基化生物标记物、试剂盒及用途

<130> 2233309IP

<160> 66

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 104

<212> DNA

<213> 人类

<400> 1

gtggtcgccc accacatcgc tcagggcctc cctcaggcgt gccgggtcct cgggatgcag 60

ccagtctgtg taatgcagga ccacagcctc ggctgccagg tcac 104

<210> 2

<211> 77

<212> DNA

<213> 人类

<400> 2

ggaccatgct gtaaacctgc gcggctccga gcgagtgcac ggggctggcg ggccctcgat 60

tcgtcagcag tcggggt 77

<210> 3

<211> 114

<212> DNA

<213> 人类

<400> 3

agtcctgggt ggccccgaag cctccccggc agccgcacgg ctccgtcccc gctccagggt 60

tcagctgagg cacctgctgg aggcggcctg tccccgccgc cctgctaaag cggc 114

<210> 4

<211> 103

<212> DNA

<213> 人类

<400> 4

catctgtgcc gtctcagaca gacagctccg tcctcatcag gttcaggtct ggccccggcg 60

cttgcgggtc agctgccttc aggccctgtc ctggttcccg gcg 103

<210> 5

<211> 93

<212> DNA

<213> 人类

<400> 5

ctgccgcggg agaatccagg gatggtgggc gctaggtgtg cgctgagggg atgtggtggc 60

aggcgctggg ggcaggcggc gcccaggtcc tgg 93

<210> 6

<211> 99

<212> DNA

<213> 人类

<400> 6

cggggagctc cgctaagctg cccgacctcc catgtgcaga gggcgctgct ggggccacag 60

gcgaggctgc gtggggaagc ggagcgtgga ttccagcgc 99

<210> 7

<211> 102

<212> DNA

<213> 人类

<400> 7

gggcccggcg ctcacacaca cgcggaggac agccagcacg caccgacgca gcaccgacgc 60

agcgccagga ggggccgggg acactcacgg tggggcccaa aa 102

<210> 8

<211> 125

<212> DNA

<213> 人类

<400> 8

aacgttcgcc attcggtgcc aataaaggcc gcctttatcc cgaccgtaaa tggtttctgt 60

gtggagtgag actgtgcctg tcccgggcct aaccccccaa gggccagaga ggcgaaatta 120

gatcc 125

<210> 9

<211> 128

<212> DNA

<213> 人类

<400> 9

cgcacagttc ccgaagaccg ttaggaaggg tgctctcacc ccaaaccgag agcaggagaa 60

cgctaaacgg agaaaagcca aaatccatct taagaaatcc cactgggccg cctatccatg 120

gggtccgc 128

<210> 10

<211> 97

<212> DNA

<213> 人类

<400> 10

gcgcccagtg ctgcgccaag ggctttctgc tccttgactc ccctcgagaa gagagtggct 60

tggagcggag cttggtcacc cggaaagact cgactct 97

<210> 11

<211> 107

<212> DNA

<213> 人类

<400> 11

ccaccgccct gggtttacca cggtcaccgc cacctctctc acagggcccc cgggggaccc 60

agccgcgccc ggcctggtgt ctgcaccgag ggaccgcgtc tcacgcc 107

<210> 12

<211> 121

<212> DNA

<213> 人类

<400> 12

cggctttgag cgtcgttcac atgttcctcg tggctcattg tgtccacatc ttgctccttc 60

tgaggaagca gagggtgtgc cgtggcctct tgtttcacac acagatgcgc catgctgccc 120

g 121

<210> 13

<211> 130

<212> DNA

<213> 人类

<400> 13

ggcggattgg gaggtcccat gtcactctcc catgcccgcc tttgaagctg aggcgctctt 60

tagttaacaa actacaagtc ccagcaggga ccgggacgcg ggtgggagag gcgcctgtgg 120

ccccgaggcg 130

<210> 14

<211> 125

<212> DNA

<213> 人类

<400> 14

gggggacacc cggcacaaga agggtggagg aatggggctg cgcgtcactc ccacagcttc 60

ttagagagcc gttcgcaagg aggaccgagt gtcacgtgag tgagctggag gaggtcacgt 120

tacct 125

<210> 15

<211> 94

<212> DNA

<213> 人类

<400> 15

actgcaactc cagcgacatc atggacctgt tctgcatcgc caccggcctg cctcggtgag 60

tgcgcgctgc gggctctgcc cggtgacgcc acgc 94

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACHE正向引物

<400> 16

tggtcgttta ttatatcgtt tagggttt 28

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACHE反向引物

<400> 17

ataacctaac aaccgaaact ataatcctac 30

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C21orf33,ICOSLG正向引物

<400> 18

gattatgttg taaatttgcg cggttt 26

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C21orf33,ICOSLG反向引物

<400> 19

accccgacta ctaacgaatc gaa 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPS15,APC2正向引物

<400> 20

gttttgggtg gtttcgaagt ttt 23

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPS15,APC2反向引物

<400> 21

gccgctttaa caaaacgacg aa 22

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPS15,APC2正向引物

<400> 22

atttgtgtcg ttttagatag atagtttcgt 30

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPS15,APC2反向引物

<400> 23

cgccgaaaac caaaacaaaa ccta 24

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAHCC1正向引物

<400> 24

tgtcgcggga gaatttaggg at 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAHCC1反向引物

<400> 25

ccaaaaccta aacgccgcct a 21

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LEFTY1PYCR2正向引物

<400> 26

ggggagtttc gttaagttgt tcg 23

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LEFTY1PYCR2反向引物

<400> 27

acgctaaaat ccacgctccg 20

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RTN4RL2正向引物

<400> 28

aacccgacgc tcacacaca 19

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RTN4RL2反向引物

<400> 29

ttttgggttt tatcgtgagt gttttcg 27

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNQ1正向引物

<400> 30

acgttcgtta ttcggtgtta ataaagg 27

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNQ1反向引物

<400> 31

gaatctaatt tcgcctctct aaccctta 28

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IZUMO1正向引物

<400> 32

gcacaattcc cgaaaaccgt taa 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IZUMO1反向引物

<400> 33

gcggatttta tggataggcg gtt 23

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LBX2正向引物

<400> 34

cgtttagtgt tgcgttaagg gttt 24

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LBX2反向引物

<400> 35

aaaatcgaat ctttccgaat aaccaaa 27

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STMN3正向引物

<400> 36

tatcgttttg ggtttattac ggttatcg 28

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STMN3反向引物

<400> 37

aacgtaaaac gcgatccctc g 21

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SS18L1正向引物

<400> 38

ggttttgagc gtcgtttata tgtttt 26

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SS18L1反向引物

<400> 39

cgaacaacat aacgcatcta tatataaaac 30

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYTH2正向引物

<400> 40

gcggattggg aggttttatg ttat 24

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYTH2反向引物

<400> 41

cgcctcgaaa ccacaaacg 19

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LINC01072,GJA3正向引物

<400> 42

ggggatattc ggtataagaa gggtg 25

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LINC01072,GJA3反向引物

<400> 43

aaataacgta acctcctcca actca 25

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDE9A正向引物

<400> 44

attgtaattt tagcgatatt atggatttgt 30

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDE9A反向引物

<400> 45

gcgtaacgtc accgaacaaa a 21

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACHE探针

<400> 46

aactaactac atcccgaaaa cccgacacgc 30

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C21orf33,ICOSLG探针

<400> 47

cccgccaacc ccgtacactc gctc 24

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPS15,APC2探针

<400> 48

ccgcctccaa caaatacctc aactaaaccc 30

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPS15,APC2探针

<400> 49

acccgcaaac gccgaaacca aacctaa 27

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BAHCC1探针

<400> 50

cccaacgcct accaccacat cccct 25

<210> 51

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LEFTY1PYCR2探针

<400> 51

cccacgcaac ctcgcctata acccca 26

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RTN4RL2探针

<400> 52

aacaaccaac acgcaccgac gcaac 25

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KCNQ1探针

<400> 53

acccgaaaca aacacaatct cactccacac 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IZUMO1探针

<400> 54

aaatactctc accccaaacc gaaaacaaaa 30

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LBX2探针

<400> 55

tccgctccaa accactctct tctcgaaa 28

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STMN3探针

<400> 56

acaaacacca aaccgaacgc gactaaatcc 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SS18L1探针

<400> 57

aaaccacgac acaccctcta cttcctcaaa 30

<210> 58

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CYTH2探针

<400> 58

ccacccgcgt cccgatccct actaaa 26

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LINC01072,GJA3探针

<400> 59

cactcgatcc tccttacgaa cgactctct 29

<210> 60

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDE9A探针

<400> 60

cgcactcacc gaaacaaacc gataacgat 29

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 内参正向引物

<400> 61

tttgtatgtg gtgggagggt tt 22

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 内参反向引物

<400> 62

acaaaaaaac acaccactcc caa 23

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 内参探针

<400> 63

tatgtggaag tgtaataatg 20

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 内参正向引物

<400> 64

gtgatggagg aggtttagta agtt 24

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 内参反向引物

<400> 65

ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 内参探针

<400> 66

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims

1.一种用于结直肠癌淋巴结转移诊断的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包含：

(i)如SEQ ID NO:1～15所示的序列的至少一种；和/或，

(ii)与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌淋巴结转移诊断的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物至少包含SEQ ID NO:10所示的序列和/或与SEQ ID NO:10所示的序列互补的序列。

3.根据权利要求1或2所述的用于结直肠癌淋巴结转移诊断的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包含SEQ ID NO:10所示的序列和/或与SEQ ID NO:10所示的序列互补的序列，与选自以下的序列的组合：

(a)如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15中所示的序列的至少一种；和/或，

(b)与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15所示的序列互补的序列中的至少一种。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的用于结直肠癌淋巴结转移诊断的甲基化生物标记物，其中，所述诊断是区分患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移；

任选地，所述结直肠癌选自TNM分期中T分期的T1期、T2期、T3期或T4期的结直肠癌。

5.权利要求1～4中任一项所述的甲基化生物标记物在制备用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途。

6.一种用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中权利要求1～4中任一项所述的甲基化生物标记物的甲基化程度的试剂。

7.根据权利要求6所述的用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，其中，所述的试剂为选自以下的检测甲基化程度的方法中所使用的试剂：荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序和DNA甲基化质谱中的一种或多种。

8.根据权利要求6或7所述的用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，其中，所述的试剂包括引物和/或探针；其中，

所述引物扩增包含SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列；

所述探针至少部分地与SEQ ID NO:1～15所示的序列或与SEQ ID NO:1～15所示的序列互补的序列杂交。

9.根据权利要求6～8中任一所述的用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，其中，所述的试剂包括选自以下的至少一组引物和探针：

(1)如SEQ ID NO:16～17所示的引物，如SEQ ID NO:46所示的探针；

(2)如SEQ ID NO:18～19所示的引物，如SEQ ID NO:47所示的探针；

(3)如SEQ ID NO:20～21所示的引物，如SEQ ID NO:48所示的探针；

(4)如SEQ ID NO:22～23所示的引物，如SEQ ID NO:49所示的探针；

(5)如SEQ ID NO:24～25所示的引物，如SEQ ID NO:50所示的探针；

(6)如SEQ ID NO:26～27所示的引物，如SEQ ID NO:51所示的探针；

(7)如SEQ ID NO:28～29所示的引物，如SEQ ID NO:52所示的探针；

(8)如SEQ ID NO:30～31所示的引物，如SEQ ID NO:53所示的探针；

(9)如SEQ ID NO:32～33所示的引物，如SEQ ID NO:54所示的探针；

(10)如SEQ ID NO:34～35所示的引物，如SEQ ID NO:55所示的探针；

(11)如SEQ ID NO:36～37所示的引物，如SEQ ID NO:56所示的探针；

(12)如SEQ ID NO:38～39所示的引物，如SEQ ID NO:57所示的探针；

(13)如SEQ ID NO:40～41所示的引物，如SEQ ID NO:58所示的探针；

(14)如SEQ ID NO:42～43所示的引物，如SEQ ID NO:59所示的探针；

(15)如SEQ ID NO:44～45所示的引物，如SEQ ID NO:60所示的探针。

10.根据权利要求6～9中任一项所述的用于结直肠癌淋巴结转移诊断的试剂盒，其中，所述的待测样本选自组织、血液、血浆、唾液、血清、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。

11.一种用于结直肠癌淋巴结转移诊断的系统，其中，所述系统包括检测装置、计算装置和输出装置；

所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样本，所述检测器用于检测所述样本中权利要求1～4中任一项所述的甲基化生物标记物的甲基化程度；

12.选自以下的引物和探针的组合中的至少一组在制备用于诊断患有结直肠癌的受试者是否存在淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述引物和探针的组合用于检测权利要求1～4中任一项所述的甲基化生物标记物的甲基化程度：

(1)如SEQ ID NO:16～17所示的引物，如SEQ ID NO:46所示的探针；

(2)如SEQ ID NO:18～19所示的引物，如SEQ ID NO:47所示的探针；

(3)如SEQ ID NO:20～21所示的引物，如SEQ ID NO:48所示的探针；

(4)如SEQ ID NO:22～23所示的引物，如SEQ ID NO:49所示的探针；

(5)如SEQ ID NO:24～25所示的引物，如SEQ ID NO:50所示的探针；

(6)如SEQ ID NO:26～27所示的引物，如SEQ ID NO:51所示的探针；

(7)如SEQ ID NO:28～29所示的引物，如SEQ ID NO:52所示的探针；

(8)如SEQ ID NO:30～31所示的引物，如SEQ ID NO:53所示的探针；

(9)如SEQ ID NO:32～33所示的引物，如SEQ ID NO:54所示的探针；

(10)如SEQ ID NO:34～35所示的引物，如SEQ ID NO:55所示的探针；

(11)如SEQ ID NO:36～37所示的引物，如SEQ ID NO:56所示的探针；

(12)如SEQ ID NO:38～39所示的引物，如SEQ ID NO:57所示的探针；

(13)如SEQ ID NO:40～41所示的引物，如SEQ ID NO:58所示的探针；

(14)如SEQ ID NO:42～43所示的引物，如SEQ ID NO:59所示的探针；

(15)如SEQ ID NO:44～45所示的引物，如SEQ ID NO:60所示的探针。