CN104878121A - 一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于与结直肠癌相关的基因PCDHB3而开发得到的一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，该试剂盒包括以下试剂中的至少一种：用于检测PCDHB3基因表达水平的引物对、用于检测PCDHB3基因甲基化水平的引物对、用于检测PCDHB3蛋白含量的试剂。本发明通过对结直肠癌进行差异表达基因筛选，发现了位于人类染色体5q31的PCDHB3是一个与结直肠癌密切相关的基因。PCDHB3的mRNA和蛋白表达水平在结直肠癌病人的肿瘤组织中显著下调，而该下调与基因启动子区域CpG碱基高度甲基化密切相关。同时，在TNM III-IV期结直肠癌病人中的预后分析发现，PCDHB3在肿瘤细胞高水平表达或肿瘤细胞核膜表达指示良好预后。

Description

一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒
技术领域
本发明属于分子诊断领域，具体涉及基于与结直肠癌相关的基因PCDHB3而开发得到的一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒。
背景技术
目前，结直肠癌是世界范围内最常见的肿瘤之一，每年的新发病例数超过百万，死亡人数超过60万。在中国，结直肠癌死亡率为7.25/10万，仅次于肺癌、肝癌、胃癌和食管癌。近年来，随着我国人民生活水平的提高，膳食结构改变、缺乏运动、吸烟等因素，结直肠癌发病率呈上升趋势，特别是在沿海经济发达的大中城市，结直肠癌发病率已达到甚至超过西方发达国家的平均水平，成为恶性肿瘤死亡的重要原因，严重危害我国人民健康。
UICC/AJCC将结直肠癌TNM分期分为I-IV四期。其中I期癌肿未穿出深肌层，没有发生淋巴结转移；II期癌肿侵犯浆膜层，亦可侵入浆膜外或肠外周围组织，但尚能整块切除，无淋巴结转移；III期癌肿侵犯肠壁全层或未侵犯全层，但伴有淋巴结转移；IV期癌肿伴有远处器官转移、局部广泛浸润或淋巴结广泛转移，不能根治性切除。
在临床治疗中，结直肠癌Ⅲ、IV期患者由于发生了淋巴结或远处转移，往往预后较差；并且即使同是处于结直肠癌I-II期的病人，其临床预后也不一样，表现为手术及辅助治疗后患者转移复发或生存的时间不同，导致预后差异明显。然而，结直肠癌的发生、发展是一个涉及多步骤、多基因的复杂过程。由于肿瘤异质性的存在，临床工作中常常遇到病理分期相同而预后差异明显的情况。因此，寻找新的辅助诊断和/或判断预后的分子指标，作为对结直肠癌TNM病理分期系统的有益补充已成为研究重点。
PCDHB3基因(protocadherinβ3，Gene ID：56132)作为PCDH家族中β亚家族的一份子，其编码的蛋白质由6个胞外cadherin结构域和一次跨膜结构组成。对PCDH家族的研究表明，该类蛋白主要涉及胚胎时期胎儿形态发生发育和成人大脑中的选择性神经连接的维持。一些肿瘤研究曾报道PCDH家族分子在癌症中的功能，如在Wilm’s肿瘤中发现所有PCDH基因存在启动子高度甲基化；PCDH10在多种肿瘤中由于被高度甲基化而表达沉默，被认为是一个潜在的抑癌基因；PCDH24在结直肠癌HCT116细胞系中可以导致细胞接触抑制，从而在体外实验中完全阻滞肿瘤形成，而这种作用可能是通过负调控Wnt通路而达到的，但目前尚无PCDHB3的有关报道。因此，明确PCDHB3与结直肠癌诊断和/或预后之间的关系，可能对结直肠癌个体化治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C或试剂D中的至少一种：
试剂A：用于检测PCDHB3基因表达水平的引物对，为以下引物中的任意一对：
引物1：其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
引物2：其序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
引物3：其序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
引物4：其序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
引物5：其序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；
引物6：其序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示；
引物7：其序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；
引物8：其序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示；
引物9：其序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示；
引物10：其序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；
引物11：其序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示；
引物12：其序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示；
引物13：其序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；
引物14：其序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示；
引物15：其序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示；
试剂B：用于检测PCDHB3基因甲基化水平的引物对，为以下引物中的任意一对：
引物16：其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
引物17：其序列如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示；
试剂C：用于检测PCDHB3基因甲基化水平的两对引物，其序列分别如SEQID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
试剂D：用于检测PCDHB3蛋白含量的试剂。
所述用于检测PCDHB3基因表达水平的引物是指用于在PCR中合成PCDHB3基因cDNA链的PCR引物。
所述用于检测PCDHB3基因甲基化水平的引物是指用于在MSP、BSP中合成PCDHB3基因启动子甲基化岛DNA链的PCR引物。
所述用于检测PCDHB3蛋白含量的试剂包括抗PCDHB3蛋白的抗体。
通过实验发现：与正常肠上皮组织相比，PCDHB3(protocadherinβ3，GeneID：56132)蛋白在肿瘤细胞中呈低水平表达，PCDHB3启动子在肿瘤细胞中呈高度甲基化；因此，对肠上皮组织中PCDHB3表达水平和其启动子甲基化水平的检测可用于结直肠癌的检测；
所述的低水平表达是指肿瘤细胞内PCDHB3mRNA及蛋白表达水平低于正常对照；所述的高度甲基化是指在肿瘤细胞内PCDHB3启动子CpG碱基甲基化程度高于正常对照；所述的肿瘤细胞为TNM I-IV期结直肠癌病人肿瘤组织细胞。
通过实验也发现：PCDHB3在肿瘤细胞高水平表达指示良好预后；PCDHB3在肿瘤细胞核膜表达指示良好预后。因此，对PCDHB3表达水平及PCDHB3是否在核膜中表达的检测可用于结直肠癌的预后判断。
所述的高水平表达是指H-SCORE评分≥1.57；H-SCORE指免疫组织化学染色强度×阳性率；所述的核膜表达是指在肿瘤细胞核膜上有PCDHB3免疫组织化学染色；良好预后具体为肿瘤细胞核膜表达PCDHB3病人总生存期、无进展生存期比肿瘤细胞核膜不表达PCDHB3病人长。所述肿瘤细胞为TNM III-IV期结直肠癌病人肿瘤组织细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过对结直肠癌进行差异表达基因筛选，发现了位于人类染色体5q31的PCDHB3是一个与结直肠癌密切相关的基因。PCDHB3的mRNA和蛋白表达水平在结直肠癌病人的肿瘤组织中显著下调，而该下调与基因启动子区域CpG碱基高度甲基化密切相关。同时，在TNM III-IV期结直肠癌病人中的预后分析发现，PCDHB3在肿瘤细胞高水平表达或肿瘤细胞核膜表达指示良好预后。基于上述发现得到一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，其对于更好地理解结直肠癌的发生机理，制定结直肠癌风险评估和早期检测的有效措施具有极其重要的意义。
附图说明
图1是定量PCR检测PCDHB3在结直肠癌组织中mRNA水平。
图2是定量PCR检测PCDHB3在结直肠癌细胞株中mRNA水平。
图3是免疫组织化学染色检测PCDHB3在结直肠癌组织中蛋白水平。
图4是是免疫组织化学染色示例PCDHB3在肿瘤组织(黑箭头所示)和癌旁组织(红箭头所示)的表达量。
图5是免疫组织化学实验证实PCDHB3在癌旁组织中表达于胞浆和核膜，在部分肿瘤组织中仅表达于胞浆。
图6是MSP法定性检测结直肠癌细胞株PCDHB3启动子甲基化情况。
图7是BSP法定量检测结直肠癌细胞株和组织PCDHB3启动子甲基化程度。
图8是去甲基化处理结直肠癌细胞株前后PCDHB3启动子甲基化及mRNA水平。
图9是Kaplan-Meier生存分析证实在晚期结直肠癌病人中PCDHB3高表达者预后优于低表达者。
图10是Kaplan-Meier生存分析证实在晚期结直肠癌病人中PCDHB3表达于肿瘤细胞核膜者预后优于仅表达于胞浆者。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
以下是实施例所用到的部分实验材料来源：
人胚肠上皮细胞株FHC、人胚肾上皮细胞株293T、结直肠癌细胞株LoVo、HCT-15、HT29、HCT116、SW480、SW620均购自美国菌种保藏委员会(AmericanType Culture Collection，ATCC)。
细胞培养基DMEM、胎牛血清购自Gibco公司。
实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Green PCR Kit购自Invitrogen公司。抗体anti-PCDHB3(AP12159a)购自Abgent公司。5-Aza-2’deoxycytidine购自Sigma公司。基因组DNA亚硫酸钠处理试剂盒EZ DNA Methylation-Gold Kit，Zymo TaqDNA Polymerase购自ZYMO Research公司。实施例中所用到的其它原始试剂和材料均可商购得到。
实施例1、临床样本收集
对于mRNA含量测定标本：选取中山大学肿瘤防治中心2010年2月至2012年8月结直肠癌各期标本共98例，于术后取新鲜组织保存于液氮中；对于蛋白含量测定样本：选取中山大学肿瘤防治中心2000年9月至2006年1月结直肠癌各期标本共210例，石蜡标本室温保存，切取的白片保存于4℃冰箱。
对于每个入选病例，入选标准为初诊、经病理学诊断为结直肠单发腺癌、无术前放化疗，TNM I、II、III期病例要求行根治术。每例病人包含肿瘤和正常对照(距离切缘5cm以上的正常粘膜)。
对于所有纳入研究的病例，其临床病理资料均来自中山大学肿瘤防治中心病案报告，相应的随访资料来自随访科。病人的肿瘤分级均按照UICC/AJCC(第七版)的标准分级。手术病人在术后两年内每三个月随访一次，术后三到四年内每半年随访一次，术后五年及以后每一年随访一次，随访时记录病人复发/转移/死亡情况并记录日期，末次随访日期是2014年12月31日。整体生存期(Overall survival,OS)的计算方法是从病人手术日期到死亡日期止，无进展生存期(Progression-free survival，PFS)的计算方法是从病人手术日期到病人复发、转移或最后一个随访日期止。
实施例2、定量PCR检测PCDHB3在结直肠癌组织和细胞株中mRNA水平
1)使用TRIZOL法提取98例结直肠癌组织及其正常对照、8个结直肠癌细胞株和两个正常对照细胞株的总RNA，分别取2μg总RNA逆转录为cDNA。
2)查询NCBI的Gene数据库，得到PCDHB3和GAPDH(内参)的cDNA序列，根据序列设计PCR引物如下：
3)建立以下反应体系，每个样本设置三个反应复孔：
混匀以上组分，加入8联管各孔，盖紧盖子，排除气泡，离心使液体聚集到管底。热循环参数如下：95℃ 10min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 40s，40个循环，95℃ 1min，60℃ 30s，95℃ 30s。
结果如图1-2。
图1所示，有83.7％的肿瘤样本(83/98)比其正常对照有显著的PCDHB3mRNA水平下降(P<0.001)。
图2显示PCDHB3在FHC(人胚肠上皮细胞株)中的含量最高，CCD-18Co(人肠成纤维母细胞)次之，而全部结直肠癌细胞株则低于正常对照。
图1-2证实PCDHB3在结直肠癌的肿瘤组织及细胞株的含量显著低于正常对照。
实施例3、PCDHB3蛋白含量在结直肠癌组织标本中的测定
1)实验时取出210例结直肠癌病例石蜡切片白片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、0.3％H2O2去组织过氧化物酶、枸橼酸盐溶液微波修复、Abgent公司anti-PCDHB3(AP12159a)抗体(1:100)和相应种属二抗孵育、DAB和苏木素显色、盐酸酒精分化、梯度酒精脱水，二甲苯透明步骤后，中性树胶封片。
2)组织标本的染色评估由200×倒置显微镜拍照，癌旁、癌组织各取5个视野/病例，然后用inForm1.4.0软件对图片进行分析。细胞中PCDHB3的染色强度分为：阴性(0)，弱阳性(1)，中等阳性(2)和强阳性(3)四个等级。判断每个标本染色的最终指标为强度×阳性率(H-score)。
结果如图3-5所示。
图3证明PCDHB3蛋白在肿瘤组织中的含量(H-score)显著低于癌旁组织：PCDHB3在肿瘤组织中表达阳性率为82.3％，H-score评分为1.64；而PCDHB3在癌旁组织中表达阳性率为92.0％，H-score评分为2.34(P<0.001，P<0.001)。
图4证明PCDHB3蛋白在肿瘤组织(黑箭头)中的含量显著低于癌旁组织(红箭头)。
图5显示PCDHB3表达呈两种状态：在癌旁组织和部分肿瘤组织中PCDHB3存在于细胞浆和核膜上，而某些肿瘤组织中PCDHB3仅存在于细胞浆。
实施例4、MSP(甲基化特异性PCR)法定性检测结直肠癌细胞株PCDHB3启动子甲基化情况
1)提取8个结直肠癌细胞株和3对肿瘤组织的DNA，测定浓度。随后使用EZDNA Methylation-Gold Kit(ZYMO Research)对DNA进行亚硫酸氢盐处理，DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化。
2)针对PCDHB3启动子区域DNA模板甲基化(M)或未被甲基化(U)设计以下相应的引物，随后进行引物特异性MSP。
反应体系：
热循环条件：95℃ 10min，95℃ 30s，58℃ 35s，72℃ 30s，40个循环，72℃7min，4℃。
3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，若用针对甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。
结果如图6所示，相较于FHC(人胚肠上皮细胞株)PCDHB3基因启动子CpG岛的低度甲基化，实验中8株结直肠癌细胞该区域均表现出高度甲基化，而HCT-15细胞甚至已完全被甲基化。
实施例5、BSP(重亚硫酸盐直接测序)法定量检测结直肠癌细胞株和组织PCDHB3启动子甲基化程度
1)对重亚硫酸盐处理后的DNA设计以下2对引物进行PCDHB3启动子区域(2个区域)PCR扩增：
2)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、连接至pMD19-T载体、转化DH5α感受态细胞、提取5-7个阳性单克隆质粒进行测序并且与未经处理的序列比较，其中未发生甲基化的胞嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变。
结果如图7所示，PCDHB3基因启动子区域的大部分CpG碱基在结直肠癌细胞及组织中比正常对照样本的甲基化程度高出许多。
实施例6、PCDHB3表达下调与基因启动子区域CpG碱基高度甲基化密切相关
以六株PCDHB3表达缺失的结直肠癌细胞株(HCT-15，HT-29，HCT116，SW480，SW620，THC8307)为例，本实施例对这六株细胞进行去甲基化处理。方法：
1)5-Aza-2’deoxycytidine(Sigma)以DMEM-10％FBS+0.5％DMSO溶解，配成浓度为10mM的工作母液，0.22μm滤膜除菌，使用时用DMEM稀释成10μM的工作液；
2)胰蛋白酶消化结直肠癌细胞成单细胞悬液，于显微镜下记数，按每孔1×105个细胞接种6孔板；
3)24h后加入5-Aza-2’deoxycytidine或空白对照，每24h重新更换含新鲜培养液的药液，连续作用3d；
4)弃去药液，用完全培养液继续培养1d，提取细胞的DNA、RNA，用以验证PCDHB3表达量是否恢复。
结果如图8所示，经过5-Aza-2’deoxycytidine处理后，结直肠癌细胞PCDHB3启动子区的甲基化水平明显降低，而其mRNA水平则显著升高。因此，我们可以认为PCDHB3启动子区的异常高甲基化显著抑制了其mRNA转录。
实施例7、Kaplan-Meier生存分析TNM III-IV期结直肠癌病人预后
根据210例结直肠癌病例的总生存期数据，利用ROC曲线最高特异性和最强灵敏度的点来确定PCDHB3的表达临界值(H-score＝1.57)，将PCDHB3分为高表达和低表达两个等级，然后使用SPSS 16.0软件中的Kaplan-Meier方法对病人预后进行分析。
图9为在TNM III-IV期结直肠癌病例中进行的Kaplan-Meier生存分析显示，肿瘤组织高表达PCDHB3的病例(H-score≥1.57)其总生存期和无进展生存期显著长于肿瘤组织低表达PCDHB3的病例(H-score≥1.57；P值分别为0.002，0.019)。
图10证实，按照PCDHB3在核膜表达与否将结直肠癌病人分为两组，在TNMIII-IV期结直肠癌病例中进行的Kaplan-Meier生存分析显示，肿瘤组织PCDHB3核膜表达的病人总生存期和无进展生存期显著好于那些PCDHB3无核膜表达(仅表达于细胞浆)的病人(P值分别为0.025，0.044)。
以上实验表明，PCDHB3是一个与结直肠癌密切相关的基因。PCDHB3的mRNA和蛋白表达水平在结直肠癌病人的肿瘤组织中显著下调，而该下调与基因启动子区域CpG碱基高度甲基化密切相关。同时，在TNM III-IV期结直肠癌病人中的预后分析发现，PCDHB3在肿瘤细胞高水平表达或肿瘤细胞核膜表达指示良好预后。基于上述发现，我们开发了一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒可以包括以下试剂中的至少一种：用于检测PCDHB3基因表达水平的引物、用于检测PCDHB3基因甲基化水平的引物、用于检测PCDHB3蛋白含量的试剂。本发明对于更好地理解结直肠癌的发生机理，制定结直肠癌风险评估和早期检测的有效措施具有极其重要的意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C或试剂D中的至少一种：
试剂A：用于检测PCDHB3基因表达水平的引物对，为以下引物中的任意一对：
引物1：其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
引物2：其序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
引物3：其序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
引物4：其序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
引物5：其序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；
引物6：其序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示；
引物7：其序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；
引物8：其序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示；
引物9：其序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示；
引物10：其序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；
引物11：其序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示；
引物12：其序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示；
引物13：其序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；
引物14：其序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示；
引物15：其序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示；
试剂B：用于检测PCDHB3基因甲基化水平的引物对，为以下引物中的任意一对：
引物16：其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
引物17：其序列如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示；
试剂C：用于检测PCDHB3基因甲基化水平的两对引物，其序列分别如SEQID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
试剂D：用于检测PCDHB3蛋白含量的试剂。
2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，其特征在于：所述试剂D包括抗PCDHB3蛋白的抗体。
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