CN102140498B

CN102140498B - 体外预测肿瘤转移和侵袭能力的方法及核苷酸片段

Info

Publication number: CN102140498B
Application number: CN201010111138.0A
Authority: CN
Inventors: 邓大君; 刘兆君
Original assignee: Beijing Inst Of Tumor Prevention & Cure
Current assignee: Beijing Inst Of Tumor Prevention & Cure; Beijing Institute for Cancer Research
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2010-02-03
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2030-02-03
Also published as: EP2537941A1; CN102140498A; WO2011095067A1; EP2537941A4

Abstract

本发明通过了一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法，其中，该方法包括以下步骤：a)从手术切缘或癌旁组织中提取DNA；b)检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5’-端CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度；c)当步骤b)中测得存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA序列时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。另一方面，本发明还提供了四种人工核苷酸片段。本发明的发明人首次发现通过检测组织中是否存在CpG岛中的甲基化胞嘧啶的血清反应因子核苷酸序列以快速并准确地预测恶性肿瘤的侵袭和转移的能力。此外，本发明提供的人工核苷酸片段可以用于准确快速检测血清反应因子核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化。

Description

体外预测肿瘤转移和侵袭能力的方法及核苷酸片段

技术领域

本发明涉及一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法及所使用的人工核苷酸片段。

背景技术

恶性肿瘤的侵袭和转移能力是决定患者预后的重要因素。肿瘤组织侵袭破坏邻近器官和远处转移既是使患者失去手术治疗机会的主要因素，也是手术后复发导致治疗失败的基本原因。建立预测恶性肿瘤的侵袭和转移能力的方法是人们长期追求的目标，对制定肿瘤患者手术后治疗方案有重要指导价值。

根据肿瘤的病理形态学变化很难对患者手术后的转移和复发情况做出判断，人们对是否可用分子生物学的手段来对恶性肿瘤进行分子分型寄予了厚望，在MMP7等基因的蛋白和mRNA水平改变方面做出了许多的努力。尽管国内外在这一领域进行了大量的研究，但至今仍然缺乏一种能够早期准确识别恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法。

在分子生物学飞速发展的今天，人们对细胞癌变机制已经有了更加全面的认识。例如，研究者除了发现p53、APC等肿瘤抑制基因结构变异导致基因失活之外，他们还发现p15、p16、hMLH1等基因CpG岛的异常甲基化也将导致这些基因的表观遗传(epigenetic)失活。组织中存在这种表观遗传失活的细胞数目较少时，目的基因的总蛋白和总mRNA水平往往不会有明显变化。由于CpG岛甲基化检测方法及其灵敏，可检测到少数细胞中存在的CpG岛异常甲基化变化，在肿瘤的分子分型上可能发挥特殊作用。

血清反应因子(Serum Response Factor，SRF)调节许多细胞增殖相关基因的表达，通过肿瘤间质来影响肝癌、胰腺癌、结肠癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤细胞的侵袭能力(Nature Cell Biology 2009，11：257-268)，具有癌基因的作用。目前未见利用SRF甲基化失活来测定机体抵御恶性肿瘤侵袭和转移能力的报道。

发明内容

现有技术中还未见可以预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法。为了填补这一空白，本发明提供了一种通过检测组织中是否存在5’端的CpG岛中的甲基化的胞嘧啶的血清反应因子核苷酸序列以预测恶性肿瘤的侵袭和转移的能力的方法。

一方面，本发明通过了一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法，其中，该方法包括以下步骤：

a)从手术切缘组织或癌旁活检组织中提取DNA；

b)检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5’-端CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度；

c)当步骤b)中测得存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA序列时，则推定被测组织具有抵御恶性肿瘤侵袭和转移能力。

另一方面，本发明还提供了四种人工核苷酸片段，一条片段的特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序，或者具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序；另一条片段的特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序或者具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序；另一条片段的特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序或者具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序；另一条片段的特征在于，该人工核苷酸片段具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序或者具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序。

本发明的发明人首次发现通过检测组织中是否存在5’-端的CpG岛中的甲基化胞嘧啶的SRF核苷酸序列以快速并准确地预测恶性肿瘤的侵袭和转移的能力。此外，本发明的发明人还提供了四种人工核苷酸片段，利用这四种核苷酸片段可以准确快速地检测SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度。

附图的简要说明

图1为SRF基因CpG岛(A)、胃癌及手术切缘组织中SRF的CpG岛中的胞嘧啶甲基化比率(B)及其PCR扩增产物的变性高效液相色谱技术(DHPLC)色谱图(C)。

图2为胃癌手术切缘组织SRF甲基化阳性和阴性胃癌患者术后总生存时间(月)比较。

图3为克隆测序结果展示胃癌组织中SRF关键性CpG位点(即SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第86-161位中的CpG位点)存在胞嘧啶甲基化。测定2个SRF CpG岛中胞嘧啶甲基化阳性(F0859和F0860)和1个阴性(F0974)样品的克隆测序结果。每一行代表一个克隆；每个圆点代表一个CpG位点，黑色和白色圆点分别代表甲基化和非甲基化CpG位点；方框所在为关键性甲基化CpG位点所在区域。

图4为甲状腺癌旁组织中存在SRF基因PCR扩增产物中甲基化CpG岛的DHPLC色谱图。

图5为口腔癌旁组织中存在SRF基因PCR扩增产物中甲基化CpG岛的DHPLC色谱图。

具体实施方式

SRF基因是重要的原癌基因，其启动子区包含CpG岛，该CpG岛的甲基化状态调控该基因的表达。本申请的发明人发现在正常组织中该基因保持非甲基化的低表达状态，而在肿瘤组织中该基因的表达明显上调。本申请的发明人猜想在肿瘤发生时，如果宿主靶器官中的正常组织(包括肿瘤间质和癌旁组织)细胞发生SRF基因甲基化失活，也许可以抵御肿瘤细胞的侵袭和转移。基于此，本申请的发明人进一步猜想可能通过检测癌旁组织中SRF基因甲基化水平，可能预测出机体抵御肿瘤细胞侵袭和转移的能力。

为了验证上述猜想是否正确，本申请的发明人设计了以下实验方法进行了大量的实验进行验证，获得了大量的实验结果，从这些结果中完全可以推出上述猜想是完全可行的。所述实验方法包括以下基本步骤：

1、组织DNA提取：分别提取来自肿瘤切缘组织或癌旁活检组织、SRF甲基化阳性对照细胞和未甲基化阴性对照细胞DNA(不少于10ng)；

2、SRF CpG岛中胞嘧啶甲基化序列测定：利用化学修饰法将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶；根据SRF CpG岛修饰后序列，设计和合成不含CpG位点、可同时扩增甲基化和非甲基化序列的通用PCR上游和下游引物[或者可与该序列所含甲基化CpG位点特异性互补的甲基化特异性PCR上游和下游引物]；用这些引物对修饰后待测样品中的SRF进行PCR扩增，然后利用DHPLC、克隆测序等方法，检测甲基化和非甲基化SRF CpG岛扩增产物的存在；或者利用其它现有技术进行检测。

3、根据SRF CpG岛中胞嘧啶甲基化程度判断肿瘤侵袭和转移的能力。

验证1：本申请的发明人从胃癌转移相关DNA甲基化组芯片数据库中发现非转移性胃癌手术切缘组织SRF的CpG岛中胞嘧啶的甲基化水平明显高于转移性胃癌切缘组织的，利用DHPLC测定该CpG岛中胞嘧啶的甲基化，得到相同的结果(图1)。

验证2：本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得甲状腺癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。

验证3：本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得口腔癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。

验证4：本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得肝癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。

验证5：本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得乳腺癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。

验证6：本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得结肠癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。

验证7：本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得胰腺癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。

验证8：本申请的发明人利用DHPLC研究方法，测得肺癌切缘组织中同样存在SRF CpG岛胞嘧啶的甲基化。

基于以上结果，本发明提供了一种体外预测恶性肿瘤侵袭和转移能力的方法，其中，该方法包括以下步骤：

a)从手术切缘组织或癌旁活检组织中提取DNA；

c)当步骤b)中测得存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA序列时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。

对于步骤a)中的DNA的提取可以采用本领域任何常规的方法进行提取，还可以采用DNA提取试剂盒进行提取，例如Qiagen公司提供的DNA提取试剂盒。当步骤b)中测得存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子基因DNA序列时，完全可以预测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力，例如，图3显示当检测的组织中的血清反应因子基因DNA序列中存在一个5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶时，就能确定该组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。

为了进一步提高检测准确率，作为一种优选的实施方式，在上述步骤b)中检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5’-端关键性CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度，即检测5’-端第86-161位中的CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度或者在步骤b)中检测步骤a)中所获得的DNA中血清反应因子基因DNA序列5’-端的367-505位中的CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度。

所述血清反应因子基因DNA序列5’-端的片段具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，具体如下；所述5’-端关键性CpG岛的位点所在位置在以下序列中用下划线表示：

5’- GGCCCAGGTCGGCCCGGGCGTGCAGGGGCCCCGGGTTCGCAGCGGCGGCCGCGGCAGCGATAGCGGCACTAGCAGCAGCGGGAGTGCCGGGTTGAGCCGGGAAGCCGATGGCGGCGGCTGCGGCGGCTCCGATTCCTCGCTGACTGCCCGTCCGCCCTCCTGCATCGAGCGCCATGTTACCGACCCAAGCTGGGGCCGCGGCGGCTCTGGGCCGGGGCTCGGCCCTGGGGGGCAGCCTGAACCGGACCCCGACGGGGCGGCCGGGCGGCGGCGGCGGGACACGCGGGGCTAACGGGGGCCGGGTCCCCGGGAATGGCGCGGGGCTCGGGCCCGGCCGCCTGGAGCGGGAGGCTGCGGCAGCGGCGGCAACCACCCCGGCGCCCACCGCGGGGGCCCTCTACAGCGGCAGCGAGGGCGACTCGGAGTCGGGCGAGGAGGAGGAGCTGGGCGCCGAGCGGCGCGGCCTGAAGCGGAGCCTGAGCGAGATGGAGATCGGTATGGTGGTCGGTGGGCCCGAGGCGTCGGCAGCGGCCACCGGGGGCTACGGGCCGGTGAGCGGCGCGGTGAGCGGGGCCAAGCCGGGTAAGAAGACCCGGGGCCGCG -3’

对于上述步骤b)中的血清反应因子基因DNA序列5’-端CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测可以采用本领域任何常规的DNA甲基化检测技术进行检测。但为了提高准确率，作为一种优选的实施方式，其中，步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测是通过以下步骤实现的：

1)通过化学修饰方法将步骤a)中所获得的DNA中未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，获得含有甲基化的胞嘧啶的DNA和不含有胞嘧啶和甲基化胞嘧啶的DNA的混合物；

2)根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者根据SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列设计的引物对对步骤1)所获得的混合物进行PCR扩增；

3)通过变性高效液相色谱法或测序法测定是否存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的血清反应因子DNA片段；

或者步骤b)中所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化程度的检测是通过以下步骤实现的：

1)将步骤a)中所获的DNA超声碎裂或酶切裂解成200bp左右大小的片断；

2)用甲基化DNA结合蛋白或者5-甲基胞嘧啶抗体富集甲基化DNA的方法，富集步骤1)中的甲基化DNA；

3)以步骤2)所获DNA为模板，利用根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列设计的对胞嘧啶甲基化特异性引物对进行PCR扩增，如果能够扩增出血清反应因子基因DNA的5’-端片段，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者将步骤2)所获DNA直接进行序列测定，如果能够检测到血清反应因子基因DNA的5’-端片段的存在，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；或者将步骤2)所获DNA进行标记，然后与能与血清反应因子基因DNA的5’-端片段结合的探针进行杂交，如果能够检测到杂交信号，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化；

将步骤a)所获DNA利用甲基化敏感酶进行酶切消化，然后与带标记的能与血清反应因子基因DNA的5’-端片段结合的DNA探针杂交，如果能够检测到杂交信号，则存在所述CpG岛中胞嘧啶的甲基化。

尽管所述引物对可以为任何基于所述序列设计的通用引物对，但为了进一步提高检测准确率，作为一种优选的实施方式，所述根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者根据SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列设计的引物对为可以为通用引物对，且该引物对的上游引物可以为5’-gttataggggtaggaaagtgag-3’，下游引物可以为5’-ataaactccatcttaatcttcac-3’；或者上游引物可以为5’-atgaattttattttgattttta-3’，下游引物可以为5’-ccacaaaaacaaaaaaataaa-3’。

在本发明的一种实施方式种，所述根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者根据SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列设计的引物对可以为胞嘧啶甲基化特异性引物对，且胞嘧啶甲基化特异性引物对的上游引物可以为5’-ggtattagtagtagcgggagtgtc-3’，下游引物可以为5’-ccaacttaaatcgataacataacg-3’。为了排除假阴性结果，可以涉及针对未被甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶的引物对，其上游引物可以为5’-gtattagtagtagtgggagtgttgg-3’，下游引物可以为5’-ccccaacttaaatcaataac ataaca-3’

为了进一步提高诊断准确率，作为一种优选的实施方式，其中，当步骤b)中所测得存在5’-端片段的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于4的血清反应因子DNA序列时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。更优选为当步骤b)中所测得存在5’-端片段的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于6的血清反应因子DNA序列时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。或者更优选当测得存在血清反应因子基因DNA序列5’-端的第86-161位中的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于4的DNA片段时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。或者更优选当测得存在血清反应因子基因DNA序列5’-端的367-505位中的CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于4的DNA片段时，则推定被测组织具有抵抗恶性肿瘤侵袭和转移能力。

尽管本文中所述恶性肿瘤可以为任何表达血清反应因子的癌症，但作为一种优选的实施方式，其中，所述恶性肿瘤可为实体瘤，更优选为胃癌、甲状腺癌、口腔癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌或结肠癌等。

所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为CpG岛中胞嘧啶被全部甲基化和非CpG位点胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血清反应因子DNA序列的正意义链的5’-端片段。该序列可以用于在检测血清反应因子DNA序列的5’-端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方法中。具体地说，该序列可以用作设计PCR引物的基准，以便检测血清反应因子DNA序列的5’-端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶。

所述SEQ ID NO：2所示的核苷酸序为CpG岛中胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血清反应因子DNA序列的正意义链的5’-端片段。该序列可以用于在检测血清反应因子DNA序列的5’-端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方法中。具体地说，该序列可以用作设计PCR引物的基准，以便排除检测血清反应因子DNA序列的5’-端不存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的假阴性结果。

所述SEQ ID NO：3所示的核苷酸序为CpG岛中胞嘧啶被全部甲基化和非CpG位点胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血清反应因子DNA序列的反意义链的5’-端片段。该序列的作用与SEQ ID NO：1相同。

SEQ ID NO：4所示的核苷酸序为CpG岛中胞嘧啶被全部修饰成尿嘧啶的血清反应因子DNA序列的反意义链的5’-端片段。该序列的作用与SEQ ID NO：2相同。

上述SEQ ID NO：1-4所示的核苷酸序分别如下文所示。

SEQ ID NO：1所示的核苷酸序如下所示：(下划线标出的为关键性CpG位点的胞嘧啶被甲基化的区域；加框序列为通用引物匹配部位。)

5’- GGUUUAGGTCGGUUCGGGCGTGUAGGGGUUUCGGGTTCGUAGCGGCGGUCGCGGUAGCGATAGCGGUAUTAGUAGUAGCGGGAGTGUCGGGTTGAGUCGGGAAGUCGATGGCGGCGGUTGCGGCGGUTUCGATTUUTCGUTGAUTGUUCGTUCGUUUTUUTGUATCGAGCGUUATGTTAUCGAUUUAAGUTGGGGUCGCGGCGGUTUTGGGUCGGGGUTCGGUUUTGGGGGGUAGUUTGAAUCGGAUUUCGACGGGGCGGUCGGGCGGCGGCGGCGGGAUACGCGGGGUTAACGGGGGUCGGGTUUUCGGGAATGGCGCGGGGUTCGGGUUCGGUCGUUTGGAGCGGGAGGUTGCGGUAGCGGCGGUAAUUAUUUCGGCGUUUAUCGCGGGGGUUUTUTAUAGCGGUAGCGAGGGCGAUTCGGAGTCGGGCGAGGAGGAGGAGUTGGGCGUCGAGCGGCGCGGUUTGAAGCGGAGUUTGAGCGAGATGGAGATCGGTATGGTGGTCGGTGGGUUCGAGGCGTCGGUAGCGGUUAUCGGGGGUTACGGGUCGGTGAGCGGCGCGGTGAGCGGGGUUAAGUCGGGTAAGAAGAUUCGGGGUCGCG -3’

SEQ ID NO：2所示的核苷酸序如下所示，SEQ ID NO：1中的未被甲基化的胞嘧啶被修饰成尿嘧啶(下划线标出的为关键性CpG位点未被甲基化的胞嘧啶被修饰成尿嘧啶区域，加框序列为通用引物匹配部位)：

5’- GGUUUAGGTUGGUUUGGGUGTGUAGGGGUUUUGGGTTUGUAGUGGUGGUUGUGGUAGUGATAGUGGUAUTAGUAGUAGUGGGAGTGUUGGGTTGAGUUGGGAAGUUGATGGUGGUGGUTGUGGUGGUTUUGATTUUTUGUTGAUTGUUUGTUUGUUUTUUTGUATUGAGUGUUATGTTAUUGAUUUAAGUTGGGGUUGUGGUGGUTUTGGGUUGGGGUTUGGUUUTGGGGGGUAGUUTGAAUUGGAUUUUGAUGGGGUGGUUGGGUGGUGGUGGUGGGAUAUGUGGGGUTAAUGGGGGUUGGGTUUUUGGGAATGGUGUGGGGUTUGGGUUUGGUUGUUTGGAGUGGGAGGUTGUGGUAGUGGUGGUAAUUAUUUUGGUGUUUAUUGUGGGGGUUUTUTAUAGUGGUAGUGAGGGUGAUTUGGAGTUGGGUGAGGAGGAGGAGUTGGGUGUUGAGUGGUGUGGUUTGAAGUGGAGUUTGAGUGAGATGGAGATUGGTATGGTGGTUGGTGGGUUUGAGGUGTUGGUAGUGGUUAUUGGGGGUTAUGGGUUGGTGAGUGGUGUGGTGAGUGGGGUUAAGUUGGGTAAGAAGAUUUGGGGUUGU -3’

SEQ ID NO：3所示的核苷酸序如下所示(下划线标出者为关键性CpG位点甲基化区域)：

5’-ATGAAUTUUATUTTGATUTTUACGCGGUUUCGGGTUTTUTTAUUCGGUTTGGUUUCGUTUAUCGCGUCGUTUAUCGGUUCGTAGUUUUCGGTGGUCGUTGUCGACGUUTCGGGUUUAUCGAUUAUUATAUCGATUTUUATUTCGUTUAGGUTUCGUTTUAGGUCGCGUCGUTCGGCGUUUAGUTUUTUUTUUTCGUUCGAUTUCGAGTCGUUUTCGUTGUCGUTGTAGAGGGUUUUCGCGGTGGGCGUCGGGGTGGTTGUCGUCGUTGUCGUAGUUTUUCGUTUUAGGCGGUCGGGUUCGAGUUUCGCGUUATTUUCGGGGAUUCGGUUUUCGTTAGUUUCGCGTGTUUCGUCGUCGUCGUUCGGUCGUUUCGTCGGGGTUCGGTTUAGGUTGUUUUUUAGGGUCGAGUUUCGGUUUAGAGUCGUCGCGGUUUUAGUTTGGGTCGGTAAUATGGCGUTCGATGUAGGAGGGCGGACGGGUAGTUAGCGAGGAATCGGAGUCGUCGUAGUCGUCGUUATCGGUTTUUCGGUTUAAUUCGGUAUTUUCGUTGUTGUTAGTGUCGUTATCGUTGUCGCGGUCGUCGUTGCGAAUUCGGGGUUUUTGUACGUUCG GGUCGAUUTGGGUUUTUAUTTTUUTGUUUUTGTGG-3’

SEQ ID NO：4所示的核苷酸序如下所示，它为SEQ ID NO：3中的未被甲基化的胞嘧啶被修饰成尿嘧啶的相应序列(下划线标出的为未被甲基化的胞嘧啶被修饰成尿嘧啶区域)：

5’-ATGAAUTUUATUTTGATUTTUAUGUGGUUUUGGGTUTTUTTAUUUGGUTTGGUUUUGUTUAUUGUGUUGUTUAUUGGUUUGTAGUUUUUGGTGGUUGUTGUUGAUGUUTUGGGUUUAUUGAUUAUUATAUUGATUTUUATUTUGUTUAGGUTUUGUTTUAGGUUGUGUUGUTUGGUGUUUAGUTUUTUUTUUTUGUUUGAUTUUGAGTUGUUUTUGUTGUUGUTGTAGAGGGUUUUUGUGGTGGGUGUUGGGGTGGTTGUUGUUGUTGUUGUAGUUTUUUGUTUUAGGUGGUUGGGUUUGAGUUUUGUGUUATTUUUGGGGAUUUGGUUUUUGTTAGUUUUGUGTGTUUUGUUGUUGUUGUUUGGUUGUUUUGTUGGGGTUUGGTTUAGGUTGUUUUUUAGGGUUGAGUUUUGGUUUAGAGUUGUUGUGGUUUUAGUTTGGGTUGGTAAUATGGUGUTUGATGUAGGAGGGUGGAUGGGUAGTUAGUGAGGAATUGGAGUUGUUGUAGUUGUUGUUATUGGUTTUUUGGUTUAAU UUGGUAUTUUUGUTGUTGUTAGTGUUGUTATUGUTGUUGUGGUUGUUGUTGUGAAUUUGGGGUUUUTGUAUGUUUGGGUUGAUUTGGGUUUTUAUTTTUUTGUUUUTGTGG-3’

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：5所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：1中的接近5’-端的划线部分，也即SEQID NO：1中的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：1相同。但当该序列用于在检测血清反应因子DNA序列的5’-端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方法中时，其准确率更高。

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：6所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：2中的接近5’-端的划线部分，也即SEQID NO：2中的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：2相同。但当该序列用于在检测血清反应因子DNA序列的5’-端是否存在CpG岛中甲基化胞嘧啶的方法中时，其准确率更高。

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：7所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：3中的接近3’-端的划线部分，也即SEQID NO：3中的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：5相同，并具有相同的效果。

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：8所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：4中的接近3’-端的划线部分，也即SEQID NO：4中的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：6相同，并具有相同的效果。

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：9所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：1中的接近3’-端的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：5相同，并具有相同的效果。

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：10所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：2中的接近3’-端的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：6相同，并具有相同的效果。

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：11所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：3中的接近5’-端的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：5相同，并具有相同的效果。

本发明还提供了一种人工核苷酸片段，其中，该人工核苷酸片段具有SEQ IDNO：12所示的核苷酸序，该序列为SEQ ID NO：4中的接近5’-的一个关键片段。该序列的作用与SEQ ID NO：6相同，并具有相同的效果。

上述SEQ ID NO：5-12所示的核苷酸序分别如下文所示。

SEQ ID NO：5具有以下具体序列：

5’-CGGUAUTAGUAGUAGCGGGAGTGUCGGGTTGAGUCGGGAAGUCGATGGCGGCGGUTGCGGCGGUTUCGATTUUTC-3’

SEQ ID NO：6具有以下具体序列：

5’-UGGUAUTAGUAGUAGUGGGAGTGUUGGGTTGAGUUGGGAAGUUGATGGUGGUGGUTGUGGUGGUTUUGATTUUTUGU-3’

SEQ ID NO：7具有以下具体序列：

5’-CGAGGAATCGGAGUCGUCGUAGUCGUCGUUATCGGUTTUUCGGUTUAAUUCGGUAUTUUCGUTGUTGUTAGTGUCG-3’

SEQ ID NO：8具有以下具体序列：

5’-UGAGGAATUGGAGUUGUUGUAGUUGUUGUUATUGGUTTUUUGGUTUAAUUUGGUAUTUUUGUT GUTGUTAGTGUUG-3’

SEQ ID NO：9具有以下具体序列：

5’-CGGGAGGUTGCGGUAGCGGCGGUAAUUAUUUCGGCGUUUAUCGCGGGGGUUUTUTAUAGCGGUAGCGAGGGCGAUTCGGAGTCGGGCGAGGAGGAGGAGUTGGGCGUCGAGCGGCGCGGUUTGAAGCGGAGUUTGAGCG-3’

SEQ ID NO：10具有以下具体序列：

5’-UGGGAGGUTGUGGUAGUGGUGGUAAUUAUUUUGGUGUUUAUUGUGGGGGUUUTUTAUAGUGGUAGUGAGGGUGAUTUGGAGTUGGGUGAGGAGGAGGAGUTGGGUGUUGAGUGGUGUGGUUTGAAGUGGAGUUTGAGUG-3’

SEQ ID NO：11具有以下具体序列：

5’-CGUTUAGGUTUCGUTTUAGGUCGCGUCGUTCGGCGUUUAGUTUUTUUTUUTCGUUCGAUTUCGAGTCGUUUTCGUTGUCGUTGTAGAGGGUUUUCGCGGTGGGCGUCGGGGTGGTTGUCGUCGUTGUCGUAGUUTUUCG-3’

SEQ ID NO：12具有以下具体序列：

5’-UGUTUAGGUTUUGUTTUAGGUUGUGUUGUTUGGUGUUUAGUTUUTUUTUUTUGUUUGAUTUUGAGTUGUUUTUGUTGUUGUTGTAGAGGGUUUUUGUGGTGGGUGUUGGGGTGGTTGUUGUUGUTGUUGUAGUUTUUUG-3’

实施例

实施例1：通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力

1、实验对象：102对胃癌及其手术切缘配对冷冻组织，其中50％的患者存在淋巴结转移灶和脉管癌栓(或远处转移灶)，50％的配对患者胃癌组织既无淋巴结转移也未见脉管癌栓(或远处转移灶)，均有完整的临床病理资料和随访资料；

2、获取组织细胞：从上述手术切缘组织的不同部位切取米粒体积大小(15～20mm³)的5块冷冻组织，收集到硅化的微型离心管(1.5ml)中；

3、提取细胞DNA：向上述离心馆中加入300μl组织细胞裂解液(含10mMTris.Cl/pH 7.6、10mM NaCl、10mM EDTA和0.5％SDS)，再加入蛋白酶K 10μl(20mg/ml)，37℃过夜消化，酚氯仿抽提DNA约10μg；

4、化学修饰未甲基化胞嘧啶

1)用18μl去离子蒸馏水将约1μg上述DNA溶解于1.5ml EP管中；95℃水浴变性20min，冰浴；

2)加2μl新鲜配制的3M NaOH，混匀，42℃水浴20min，以使DNA变性解链；

3)各管加入新鲜配置的5.0M NaHSO₃ 380μl，混匀，再加入200μl液体石蜡阻止管内液体蒸发，置50℃～55℃水浴中过夜修饰(12-16h)，未甲基化胞嘧啶修饰为尿嘧啶；

4)吸去顶层液体石蜡，用DNA纯化试剂盒(Promega Wizard DNA Clean-UpSystem，A7280)，按说明书所示提取修饰后DNA：加入混匀的树脂1ml，混匀后静置5分钟；将树脂-DNA混合物转移至下接微柱的注射管内，抽真空法滤去液相，并将DNA等固相转移到微柱滤膜上；加入80％异丙醇2ml，抽真空；弃注射管，将微柱套入1.5ml离心管上，高速离心(10000g20秒)去除柱内残留液体；将微柱转移至新离心管上，向微柱内加入80℃无菌三蒸水50μl，静置15分钟，高速离心(10000g 20秒)，收集洗脱液；再向微柱内加入80℃无菌三蒸水50μl，静置15分钟，高速离心(10000g 20秒)，合并洗脱液；

5)向各管加入3M NaOH 11μl，混匀，37℃温浴15分钟，以终止修饰反应；

6)向各管加入5M醋酸铵166μl，100％冰乙醇750μl，混匀，-20℃沉淀4小时，10000g离心30分钟，弃上清；向各管加入200μl 80％冰乙醇，混匀，再离心，弃上清；

7)干燥后用60μl无菌三蒸水溶解修饰纯化后样品DNA，-20℃保存备用；

5、PCR引物对的设计：根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序，设计、合成不含CpG位点的通用型PCR引物对。根据SEQ ID NO：1设计的引物对的上游引物5’-gttataggggtaggaaagtgag-3’；下游引物5’-ataaactccatctta atcttcac-3’；

6、PCR扩增：采用步骤5所设计的引物对步骤4中所获得的DNA样品进行热启动PCR扩增。其中PCR扩增扩增条件是：95℃保持15分钟；然后进行40个以下的循环：95℃保持30秒，58℃保持30秒，72℃保持1分钟；最后在72℃保持10分钟。

7、然后利用变性高效液相色谱(DHPLC，Transgenomic，Inc.，OM，USA)测定是否存在5’-端甲基化CpG岛特异性的SRF DNA序列色谱峰(图1C)，克隆测序法验证甲基化胞嘧啶位点的存在(图3)；

8、结果：

在51例转移性胃癌切缘组织中只有4例(7.8％)存在SRF甲基化，而51例非转移性胃癌切缘组织中有16例(31.4％)存在SRF甲基化，差异存在统计学显著性(p＝0.003)。

在30例胃癌TNM分期为T₄期的胃癌切缘组织中只有1例存在SRF甲基化，而72例T_1-3的切缘组织中有19例存在SRF甲基化(p＝0.014)；

切缘组织SRF甲基化阳性者手术后总生存率明显高于甲基化阴性者，中位生存时间分别为32个月和23个月，在单因素和多因素分析中差异有统计学显著性(p＝0.006和0.040；图2)。

9、结论：胃癌手术切缘组织中甲基化SRF CpG岛序列是一种能够用来测定胃癌侵袭和转移能力的标志物。

实施例2：通过测定是否存在甲状腺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测甲状腺癌侵袭和转移能力

1、实验对象：20对甲状腺癌冷冻组织，其中50％的患者存在淋巴结转移灶和脉管癌栓(或远处转移灶)，50％的配对患者组织既无淋巴结转移也未见脉管癌栓(或远处转移灶)，均有完整的临床病理资料和随访资料；

2、步骤2-7与实施例1相同；

3、结果(图4)和结论与实施例1相同。

实施例3：通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力

步骤1-5与实施例1相同；在步骤6中除了测定是否存在5’-端CpG岛中甲基化胞嘧啶的数目大于或等于6的血清反应因子基因DNA序列外，其余与实施例1中的步骤6相同；测得的结果的特异性高于实施例1，为100％。

实施例4：通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化存在预测胃癌侵袭和转移能力

步骤1-4与实施例1相同；

5、PCR引物对的设计：上游引物为5’-atgaattttattttgattttta-3’，下游引物为5’-ccacaaaaacaaaaaaataaa-3’；

6、PCR扩增：采用步骤5所设计的引物对步骤4中所获得的DNA样品进行热启动PCR扩增。其中PCR扩增扩增条件是：95℃保持15分钟；然后进行40个以下的循环：95℃保持30秒，54℃保持30秒，72℃保持1分钟；最后在72℃保持10分钟。

7、结果和结论与实施例1相同。

实施例5：通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力

步骤1-4与实施例1相同；

5、PCR引物对的设计：胞嘧啶甲基化特异性引物对的上游引物为5’-ggtattagtagtagcgggagtgtc-3’，下游引物为5’-ccaacttaaatcgataaca taacg-3’；

采用步骤5所设计的引物对步骤4中所获得的DNA样品进行热启动PCR扩增。其中PCR扩增扩增条件是：95℃保持15分钟；然后进行40个以下的循环：95℃保持30秒，57℃保持30秒，72℃保持30秒；最后在72℃保持10分钟。

7、结果和结论与实施例1相同。

实施例6：通过测定是否存在口腔癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测口腔癌侵袭和转移能力

用口腔鳞癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验，得到的结果如图5所示。

实施例7：通过测定是否存在胰腺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测胰腺癌侵袭和转移能力

用胰腺癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验，得到相似的结果。

实施例8：通过测定是否存在结肠癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测结肠癌侵袭和转移能力

用结肠癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验，得到相似的结果。

实施例9：通过测定是否存在乳腺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测乳腺癌侵袭和转移能力

用乳腺癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验，得到相似的结果。

实施例10：通过测定是否存在肝癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测肝癌侵袭和转移能力

用肝癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验，得到相似的结果。

实施例11：通过测定是否存在肺癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测肺癌侵袭和转移能力

用肺癌切缘组织代替胃癌切缘组织，并按照实施例1的方式进行了相应的实验，得到相似的结果。

实施例12：通过测定是否存在胃癌切缘组织中SRF核苷酸序列中CpG岛中胞嘧啶的甲基化预测胃癌侵袭和转移能力

步骤1-6与实施例1相同；

7、直接采用克隆测序法对步骤6所获得的PCR产物进行克隆测序，每个样品测定至少10个克隆，测定是否存在5’-端CpG岛中关键性区域甲基化胞嘧啶的SRFDNA序列的克隆；

步骤8-9与实施例1相同。

序列表

<110>北京市肿瘤防治研究所

<120>体外预测肿瘤转移和侵袭能力的方法及核苷酸片段

<160>13

<210>1

<211>647

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GUUAUAGGGG UAGGAAAGTG AGGGUUUAGG TCGGUUCGGG CGTGUAGGGG UUUCGGGTTC 60

GUAGCGGCGG UCGCGGUAGC GATAGCGGUA UTAGUAGUAG CGGGAGTGUC GGGTTGAGUC 120

GGGAAGUCGA TGGCGGCGGU TGCGGCGGUT UCGATTUUTC GUTGAUTGUU CGTUCGUUUT 180

UUTGUATCGA GCGUUATGTT AUCGAUUUAA GUTGGGGUCG CGGCGGUTUT GGGUCGGGGU 240

TCGGUUUTGG GGGGUAGUUT GAAUCGGAUU UCGACGGGGC GGUCGGGCGG CGGCGGCGGG 300

AUACGCGGGG UTAACGGGGG UCGGGTUUUC GGGAATGGCG CGGGGUTCGG GUUCGGUCGU 360

UTGGAGCGGG AGGUTGCGGU AGCGGCGGUA AUUAUUUCGG CGUUUAUCGC GGGGGUUUTU 420

TAUAGCGGUA GCGAGGGCGA UTCGGAGTCG GGCGAGGAGG AGGAGUTGGG CGUCGAGCGG 480

CGCGGUUTGA AGCGGAGUUT GAGCGAGATG GAGATCGGTA TGGTGGTCGG TGGGUUCGAG 540

GCGTCGGUAG CGGUUAUCGG GGGUTACGGG UCGGTGAGCG GCGCGGTGAG CGGGGUUAAG 600

UCGGGTAAGA AGAUUCGGGG UCGCGTGAAG ATUAAGATGG AGTTUAT 647

<210>2

<211>647

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GUUAUAGGGG UAGGAAAGTG AGGGUUUAGG TUGGUUUGGG UGTGUAGGGG UUUUGGGTTU 60

GUAGUGGUGG UUGUGGUAGU GATAGUGGUA UTAGUAGUAG UGGGAGTGUU GGGTTGAGUU 120

GGGAAGUUGA TGGUGGUGGU TGUGGUGGUT UUGATTUUTU GUTGAUTGUU UGTUUGUUUT 180

UUTGUATUGA GUGUUATGTT AUUGAUUUAA GUTGGGGUUG UGGUGGUTUT GGGUUGGGGU 240

TUGGUUUTGG GGGGUAGUUT GAAUUGGAUU UUGAUGGGGU GGUUGGGUGG UGGUGGUGGG 300

AUAUGUGGGG UTAAUGGGGG UUGGGTUUUU GGGAATGGUG UGGGGUTUGG GUUUGGUUGU 360

UTGGAGUGGG AGGUTGUGGU AGUGGUGGUA AUUAUUUUGG UGUUUAUUGU GGGGGUUUTU 420

TAUAGUGGUA GUGAGGGUGA UTUGGAGTUG GGUGAGGAGG AGGAGUTGGG UGUUGAGUGG 480

UGUGGUUTGA AGUGGAGUUT GAGUGAGATG GAGATUGGTA TGGTGGTUGG TGGGUUUGAG 540

GUGTUGGUAG UGGUUAUUGG GGGUTAUGGG UUGGTGAGUG GUGUGGTGAG UGGGGUUAAG 600

UUGGGTAAGA AGAUUUGGGG UUGUGTGAAG ATUAAGATGG AGTTUAT 647

<210>3

<211>647

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ATGAAUTUUA TUTTGATUTT UACGCGGUUU CGGGTUTTUT TAUUCGGUTT GGUUUCGUTU 60

AUCGCGUCGU TUAUCGGUUC GTAGUUUUCG GTGGUCGUTG UCGACGUUTC GGGUUUAUCG 120

AUUAUUATAU CGATUTUUAT UTCGUTUAGG UTUCGUTTUA GGUCGCGUCG UTCGGCGUUU 180

AGUTUUTUUT UUTCGUUCGA UTUCGAGTCG UUUTCGUTGU CGUTGTAGAG GGUUUUCGCG 240

GTGGGCGUCG GGGTGGTTGU CGUCGUTGUC GUAGUUTUUC GUTUUAGGCG GUCGGGUUCG 300

AGUUUCGCGU UATTUUCGGG GAUUCGGUUU UCGTTAGUUU CGCGTGTUUC GUCGUCGUCG 360

UUCGGUCGUU UCGTCGGGGT UCGGTTUAGG UTGUUUUUUA GGGUCGAGUU UCGGUUUAGA 420

GUCGUCGCGG UUUUAGUTTG GGTCGGTAAU ATGGCGUTCG ATGUAGGAGG GCGGACGGGU 480

AGTUAGCGAG GAATCGGAGU CGUCGUAGUC GUCGUUATCG GUTTUUCGGU TUAAUUCGGU 540

AUTUUCGUTG UTGUTAGTGU CGUTATCGUT GUCGCGGUCG UCGUTGCGAA UUCGGGGUUU 600

UTGUACGUUC GGGUCGAUUT GGGUUUTUAU TTTUUTGUUU UTGTGGU 647

<210>4

<211>647

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ATGAAUTUUA TUTTGATUTT UAUGUGGUUU UGGGTUTTUT TAUUUGGUTT GGUUUUGUTU 60

AUUGUGUUGU TUAUUGGUUU GTAGUUUUUG GTGGUUGUTG UUGAUGUUTU GGGUUUAUUG 120

AUUAUUATAU UGATUTUUAT UTUGUTUAGG UTUUGUTTUA GGUUGUGUUG UTUGGUGUUU 180

AGUTUUTUUT UUTUGUUUGA UTUUGAGTUG UUUTUGUTGU UGUTGTAGAG GGUUUUUGUG 240

GTGGGUGUUG GGGTGGTTGU UGUUGUTGUU GUAGUUTUUU GUTUUAGGUG GUUGGGUUUG 300

AGUUUUGUGU UATTUUUGGG GAUUUGGUUU UUGTTAGUUU UGUGTGTUUU GUUGUUGUUG 360

UUUGGUUGUU UUGTUGGGGT UUGGTTUAGG UTGUUUUUUA GGGUUGAGUU UUGGUUUAGA 420

GUUGUUGUGG UUUUAGUTTG GGTUGGTAAU ATGGUGUTUG ATGUAGGAGG GUGGAUGGGU 480

AGTUAGUGAG GAATUGGAGU UGUUGUAGUU GUUGUUATUG GUTTUUUGGU TUAAUUUGGU 540

AUTUUUGUTG UTGUTAGTGU UGUTATUGUT GUUGUGGUUG UUGUTGUGAA UUUGGGGUUU 600

UTGUAUGUUU GGGUUGAUUT GGGUUUTUAU TTTUUTGUUU UTGTGGU 647

<210>5

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

CGGUAUTAGU AGUAGCGGGA GTGUCGGGTT GAGUCGGGAA GUCGATGGCG GCGGUTGCGG 60

CGGUTUCGAT TUUTCG 76

<210>6

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

UGGUAUTAGU AGUAGUGGGA GTGUUGGGTT GAGUUGGGAA GUUGATGGUG GUGGUTGUGG 60

UGGUTUUGAT TUUTUG 76

<210>7

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

CGAGGAATCG GAGUCGUCGU AGUCGUCGUU ATCGGUTTUU CGGUTUAAUU CGGUAUTUUC 60

GUTGUTGUTA GTGUCG 76

<210>8

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

UGAGGAATUG GAGUUGUUGU AGUUGUUGUU ATUGGUTTUU UGGUTUAAUU UGGUAUTUUU 60

GUTGUTGUTA GTGUUG 76

<210>9

<211>139

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

CGGGAGGUTG CGGUAGCGGC GGUAAUUAUU UCGGCGUUUA UCGCGGGGGU UUTUTAUAGC 60

GGUAGCGAGG GCGAUTCGGA GTCGGGCGAG GAGGAGGAGU TGGGCGUCGA GCGGCGCGGU 120

UTGAAGCGGA GUUTGAGCG 139

<210>10

<211>139

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

UGGGAGGUTG UGGUAGUGGU GGUAAUUAUU UUGGUGUUUA UUGUGGGGGU UUTUTAUAGU 60

GGUAGUGAGG GUGAUTUGGA GTUGGGUGAG GAGGAGGAGU TGGGUGUUGA GUGGUGUGGU 120

UTGAAGUGGA GUUTGAGUG 139

<210>11

<211>139

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

CGUTUAGGUT UCGUTTUAGG UCGCGUCGUT CGGCGUUUAG UTUUTUUTUU TCGUUCGAUT 60

UCGAGTCGUU UTCGUTGUCG UTGTAGAGGG UUUUCGCGGT GGGCGUCGGG GTGGTTGUCG 120

UCGUTGUCGU AGUUTUUCG 139

<210>12

<211>139

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

UGUTUAGGUT UUGUTTUAGG UUGUGUUGUT UGGUGUUUAG UTUUTUUTUU TUGUUUGAUT 60

UUGAGTUGUU UTUGUTGUUG UTGTAGAGGG UUUUUGUGGT GGGUGUUGGG GTGGTTGUUG 120

UUGUTGUUGU AGUUTUUUG 139

<210>13

<211>647

<212>DNA

<213>天然序列

<400>13

GCCACAGGGG CAGGAAAGTG AGGGCCCAGG TCGGCCCGGG CGTGCAGGGG CCCCGGGTTC 60

GCAGCGGCGG CCGCGGCAGC GATAGCGGCA CTAGCAGCAG CGGGAGTGCC GGGTTGAGCC 120

GGGAAGCCGA TGGCGGCGGC TGCGGCGGCT CCGATTCCTC GCTGACTGCC CGTCCGCCCT 180

CCTGCATCGA GCGCCATGTT ACCGACCCAA GCTGGGGCCG CGGCGGCTCT GGGCCGGGGC 240

TCGGCCCTGG GGGGCAGCCT GAACCGGACC CCGACGGGGC GGCCGGGCGG CGGCGGCGGG 300

ACACGCGGGG CTAACGGGGG CCGGGTCCCC GGGAATGGCG CGGGGCTCGG GCCCGGCCGC 360

CTGGAGCGGG AGGCTGCGGC AGCGGCGGCA ACCACCCCGG CGCCCACCGC GGGGGCCCTC 420

TACAGCGGCA GCGAGGGCGA CTCGGAGTCG GGCGAGGAGG AGGAGCTGGG CGCCGAGCGG 480

CGCGGCCTGA AGCGGAGCCT GAGCGAGATG GAGATCGGTA TGGTGGTCGG TGGGCCCGAG 540

GCGTCGGCAG CGGCCACCGG GGGCTACGGG CCGGTGAGCG GCGCGGTGAG CGGGGCCAAG 600

CCGGGTAAGA AGACCCGGGG CCGCGTGAAG ATCAAGATGG AGTTCAT 647

Claims

1.一种人工核苷酸片段，其特征在于，该人工核苷酸片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：1-4任一所示。