TW202003547A - 腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及生物技術領域，特別涉及腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用。本發明通過研究發現：通過檢測TLX2基因啟動子區的甲基化水平或聯合檢測COL4A2和TLX2基因啟動子區的甲基化水平，可以非常準確地從正常人的糞便標本中區分出結直腸癌標本。本發明就是利用含有TLX2這個基因或COL4A2和TLX2這兩個基因的甲基化檢測試劑來檢測結直腸癌的，並且對腸癌的檢測敏感性和特異性非常高。

Description

腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用
本發明涉及生物技術領域，特別涉及腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用。
結直腸癌，又稱為大腸癌，是一種常見的消化道惡性腫瘤。其發病率在我國逐年升高，在我國部分沿海地區比如上海和廣州，大腸癌發病率已躍居第二位，僅次於肺癌。目前認為腸癌的形成是遺傳缺陷和表觀遺傳缺陷累積的結果。結直腸癌早期發病隱匿，常無明顯症狀，晚期可出現便血、腹痛、腹瀉等症狀。而當出現症狀就診時常常是晚期，這給病人帶來極大的痛苦和昂貴的治療費用。因此早發現、早診斷、早治療是降低結直腸癌發病率和死亡率的一項重要措施。
篩查可以早期發現腸癌和癌前病變，並去除病灶，從而阻止腸癌的發生。目前大腸癌的篩查方法主要有隱血試驗和腸鏡檢查。隱血試驗存在易受食物影響或對腺瘤檢出率不高的問題。腸鏡雖是腸癌診斷金標準，但作為篩查手段使用時人群依從性不高。因此急需一種準確性高、依從性高的腸癌篩查方法。
糞便基因檢測作為一種新的腸癌篩查方法，現在越來越受到重視。該方法（Cologuard®）於2016年納入美國的腸癌篩查指南。該方法具有方便、無創、對腸癌和癌前病變腺瘤的檢出率高等特點。要做成對腸癌檢測高性能的糞便基因檢測試劑盒，主要需要克服兩大障礙：糞便DNA的提取和標誌物選擇。一方面，糞便中成分複雜，對下游反應的抑制物多，還有許多細菌DNA，要從這樣的混合物中提取出人的目標基因，需要一套高敏的基因提取和純化方法；另一方面，目前和腸癌相關的標誌物很多，尤其是DNA甲基化標誌物，因為研究表明，DNA甲基化是腫瘤形成的早期事件。但很多甲基化標誌物在細胞、組織層面表現很好，當用於糞便、血液等篩查媒介時，其對腸癌的敏感性和特異性就降下來了，比如vimentin基因，其在組織中的敏感性有83%，在糞便標本中就降到了46% ( J Natl Cancer Inst .2005Aug 3；97( 15 ):1124-32 .)，類似的還有 SFRP1、SFRP2、CDH4等基因，這樣的標誌物無法滿足真正用於腸癌臨床檢測的需求。因此，挑選在糞便中對腸癌有極高檢測敏感性和特異性的標誌物或標誌物組合是腸癌糞便基因檢測的關鍵，並且這樣的標誌物有望真正用於腸癌的臨床檢測。
有鑑於此，本發明提供一種腫瘤標誌物、捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用。該腫瘤標誌物組合在糞便中對腸癌有極高敏感性和特異性。
本發明的另一個目的在於提供一種無創檢測腫瘤的標誌物、捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑、試劑盒及方法。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了TLX2基因和／或COL4A2基因在製備腫瘤標誌物組合中的應用。
在本發明的一些具體實施方案中，所述TLX2基因的序列與Genebank Accession No. NC_000002.12所示的序列具有至少97.8%，至少98.9%，至少99.9%或100%的同一性；
在本發明的一些具體實施方案中，所述COL4A2基因的序列與Genebank Accession No. NC_000013.11所示的序列具有至少97.8%，至少98.9%，至少99.9%或100%的同一性。
在本發明的一些具體實施方案中，所述腫瘤為結直腸腫瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，所述腫瘤為結直腸癌或腺瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，待測樣本為組織、體液或排泄物。
在本發明的一些具體實施方案中，所述組織為腸組織。
在本發明的一些具體實施方案中體液包括但不限於血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水。
在本發明的一些具體實施方案中，所述排泄物為痰液、尿液或糞便。
本發明還提供了TLX2基因和／或COL4A2基因的甲基化檢測試劑在製備腫瘤檢測試劑或者試劑盒中的應用。
所述的TLX2基因和／或COL4A2基因的甲基化檢測試劑可以是現有技術中的甲基化檢測試劑，現有技術中，已經有多種方法可以檢測目的基因的甲基化，如甲基化特異性PCR（MSP）、甲基化特異性定量PCR（qMSP）、甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR，定量PCR以及DNA芯片、甲基化敏感的限制性內切酶、重亞硫酸鹽測序法或者焦磷酸測序等等。每種檢測方法均有其相對應的試劑，這些試劑均可以用本發明檢測COL4A2和TLX2基因基因的甲基化。
本發明還提供了一種捕獲序列，所述捕獲序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XVII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
XVIII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XIX、與SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XX、如XVII、XVIII或XIX所示序列的互補序列。
本發明還提供了一種引子對，上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XXI、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
XXII、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XXIII、與SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XXIV、如XXI、XXII或XXIII所示序列的互補序列；
下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XXV、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
XXVI、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XXVII、與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XXVIII、如XXV、XXVI或XXVII所示序列的互補序列。
本發明還提供了一種探針，所述探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XXIX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
XXX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XXXI、與SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XXXII、如XXIX、XXX或XXXI所示序列的互補序列。
本發明還提供了COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化檢測試劑，包括針對COL4A2基因和／或TLX2基因的捕獲序列、引子和／或探針。
在本發明的一些具體的實施方案中，包括針對COL4A2基因和／或TLX2基因的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針。
在本發明的一些具體的實施方案中，引子和／或探針通過甲基化特異性定量PCR（quantitative Methylation-Specific PCR, qMSP）檢測COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化。
在本發明的一些具體的實施方案中，本發明提供的甲基化檢測試劑通過檢測COL4A2基因和／或TLX2基因的基因體、基因間區或啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平。
腫瘤組織中存在的甲基化被認為是具有潛在臨床價值的DNA表觀修飾。基因體以、基因間區、啟動子或其附近區域均存在甲基化，且這些區域的甲基化均可能與腫瘤相關。目前，在多種腫瘤中已經證實，抑癌基因啟動子或其附近區域的CpG島異常甲基化導致了轉錄失活。在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑包括針對COL4A2基因和／或TLX2基因的啟動子區或所述啟動子區附近區域的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述COL4A2基因的捕獲序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
I、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
II、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
III、與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
IV、如I、II或III所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述COL4A2基因的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
V、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
VI、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
VII、與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
VIII、如V、VI或VII所示序列的互補序列；
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述COL4A2基因的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
IX、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
X、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XI、與SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XII、如IX、X或XI所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述COL4A2基因的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XIII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
XIV、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XV、與SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述TLX2基因的捕獲序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XVII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
XVIII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XIX、與SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XX、如XVII、XVIII或XIX所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述TLX2基因的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XXI、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
XXII、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XXIII、與SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XXIV、如XXI、XXII或XXIII所示序列的互補序列；
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述TLX2基因的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XXV、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
XXVI、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XXVII、與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XXVIII、如XXV、XXVI或XXVII所示序列的互補序列。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化檢測試劑中所述TLX2基因的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：
XXIX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
XXX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列；
XXXI、與SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列；
XXXII、如XXIX、XXX或XXXI所示序列的互補序列。
本發明還提供了一種檢測腫瘤的試劑盒，包括所述的捕獲序列、引子對、探針或甲基化檢測試劑。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的試劑盒包括：劃分成其內接收試劑的一個或多個容器。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的試劑盒包括：第一容器，其包含捕獲序列；第二容器，其包含用於擴增的引子對；第三容器，其包含探針。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的試劑盒還包括試劑盒中的常用試劑，如qMSP中常用轉化劑，用於將非甲基化的胞嘧啶鹼基轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶鹼基保持不變。所述的轉化劑包括但不限於亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽等等。又如擴增COL4A2和TLX2基因基因中常用的DNA 聚合酶、dNTPs、Mg²⁺離子和緩衝液等等。
本發明還提供了上述的捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑、試劑盒在檢測腫瘤中的應用。
本發明還提供了一種腫瘤的檢測方法，通過檢測COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平，區分正常樣本和腫瘤樣本。
在本發明的一些具體實施方案中，其包含以下步驟：
（1）檢測受試者COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平；
（2）將受試者COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平與正常對照樣本的甲基化水平相比較；
（3）根據所述受試者TCOL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平與正常對照樣本的甲基化水平相比的升高，指示所述受試者患有或者有風險患上腫瘤，以區分正常樣本和腫瘤樣本。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明通過檢測COL4A2基因和／或TLX2基因的基因體、基因間區或啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平。
在本發明的一些具體實施方案中，通過檢測COL4A2基因和／或TLX2基因啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平，區分正常樣本和腫瘤樣本。
在本發明的一些具體實施方案中，所述甲基化水平通過甲基化特異性PCR，或者甲基化特異性定量PCR（qMSP），或者甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR、定量PCR、以及DNA芯片，或者甲基化敏感的限制性內切酶，或者重亞硫酸鹽測序法，或者焦磷酸測序檢測。
在本發明的一些具體實施方案中，通過甲基化特異性定量PCR（qMSP）檢測甲基化水平。
在本發明的一些具體實施方案中，甲基化水平採用所述的捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑或所述的試劑盒檢測。
在本發明的一些具體實施方案中，步驟（1）中，檢測受試者COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平包含以下步驟：
採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA；
待測樣品的DNA採用亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽進行轉化；
甲基化特異性定量PCR(qMSP)檢測；
優選地，採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA包括以下步驟；
取待測樣本在保護液中混合研磨、離心、取上清；
上清再離心，取上清，加入裂解液和帶有特定互補寡核苷酸捕獲序列的磁珠至上清液中孵育；
棄部分上清後洗下磁珠轉移至乾淨離心管，加入洗液，室溫100~2000 rpm孵育0.5~5 min，置於磁力架上吸去上清，重複3次；
用緩衝液將目標基因DNA洗脫。
在本發明的一些具體實施方案中，檢測判讀標準為：COL4A2基因和／或TLX2基因兩個基因聯合檢測，當有至少一個基因的檢測結果為陽性時，判讀結果為腫瘤標本；當兩個基因的檢測結果均為陰性時，判讀結果為正常標本。根據兩基因聯合診斷時預測概率的Ct值的界值判斷腫瘤標本和正常標本，COL4A2基因糞便標本中的Ct值的界值為30~40，優選地，COL4A2基因糞便標本中的Ct值的界值為34，COL4A2基因糞便標本中的Ct值小於所述Ct值的界值為陽性，COL4A2基因糞便標本中的Ct值大於等於所述Ct值的界值為陰性；TLX2基因糞便標本中的Ct值的界值為32~42，優選地，TLX2基因糞便標本中的Ct值的界值為38，TLX2基因糞便標本中的Ct值小於所述Ct值的界值為陽性，TLX2基因糞便標本中的Ct值大於等於所述Ct值的界值為陰性。該界值可根據實際情況進行調整。
本發明還提供了一種腫瘤的檢測系統，所述的系統包含有以下構件；COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化檢測構件；數據處理構件；結果輸出構件。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的甲基化檢測構件含有熒光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種；
在本發明的一些具體實施方案中，所述的甲基化檢測構件還含有所述的捕獲序列、引子對、探針、甲基化檢測試劑或試劑盒。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的數據處理構件被配置於a.接收待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；b.儲存待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；c.比對同種類型的待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；d.根據比對結果，響應於測試者罹患腫瘤的概率或者可能性。
在本發明的一些具體實施方案中，所述的結果輸出構件用於輸出測試者罹患腫瘤的概率或者可能性。
本發明的一些具體實施方案中，數據處理構件的判斷標準為：
COL4A2基因和／或TLX2基因兩個基因聯合檢測，當有至少一個基因的檢測結果為陽性時，判讀結果為腫瘤標本；當兩個基因的檢測結果均為陰性時，判讀結果為正常標本；
根據兩基因的Ct值的界值判斷檢測結果為陽性或陰性，COL4A2基因糞便標本中的Ct值的界值為30~40，優選地，COL4A2基因糞便標本中的Ct值的界值為34，COL4A2基因糞便標本中的Ct值小於所述Ct值的界值為陽性，COL4A2基因糞便標本中的Ct值大於等於所述Ct值的界值為陰性；
TLX2基因糞便標本中的Ct值的界值為32~42，優選地，TLX2基因糞便標本中的Ct值的界值為38， TLX2基因糞便標本中的Ct值小於所述Ct值的界值為陽性，TLX2基因糞便標本中的Ct值大於等於所述Ct值的界值為陰。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明所述腫瘤為結直腸腫瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明所述腫瘤為結直腸癌或腺瘤。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明提供的待測樣本或者樣本類型為組織、體液或排泄物。
在本發明的一些具體實施方案中，所述組織為腸組織。
在本發明的一些具體實施方案中，所述體液包括血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水。
在本發明的一些具體實施方案中，所述排泄物為痰液、尿液、唾液或糞便。
本發明通過研究發現：通過聯合檢測COL4A2和／或TLX2基因啟動子區的甲基化水平，可以非常準確地從正常人的糞便標本中區分出結直腸癌標本。本發明就是利用含有這兩個基因的甲基化檢測試劑來檢測結直腸癌的，並且對腸癌的檢測敏感性和特異性非常高。
與現有的檢測腸癌的標誌物相比，本發明提供的標誌物和標誌物組合，以及技術方案能夠以極高的敏感性和特異度來檢測出結直腸癌，具體有以下幾點：
1、在上述的一個技術方案中，本發明提供的含有COL4A2基因的甲基化檢測試劑在糞便標本中能夠在特異性為91.6%時，檢測出92.5%的結直腸癌。
2、在上述的一個技術方案中，本發明提供的含有TLX2基因的甲基化檢測試劑在糞便標本中能夠在特異性為96.4%時，檢測出88.8%的結直腸癌，可以簡便地糞便做為檢測樣本，對結直腸癌進行可靠的診斷。糞便樣品獲得非常容易，取樣無創簡單，而且不會對病人造成任何的痛苦和不便。
3、在一次驗證中，含有COL4A2和TLX2基因組合的甲基化檢測試劑在糞便標本中能夠在特異性為98.8%時，檢測出91.3%的結直腸癌。該組合試劑能非常方便、準確地判斷出結直腸癌和正常人，該基因的甲基化檢測試劑有望用於糞便基因檢測試劑盒，並服務於腸癌的臨床檢測。
4、上述的一個技術方案中，COL4A2和／或TLX2這兩個基因不管是單獨檢測還是聯合檢測，其對結直腸癌都具有極高的敏感性和特異性，因此當其他基因聯合這兩個基因中的一個或兩個用於檢測結直腸腫瘤時，也可能達到類似本發明的高敏感性和特異性。
5、上述的一個技術方案中，試劑／試劑盒是通過甲基化水平來檢測和診斷癌症，越來越多的研究證實甲基化改變是腫瘤發生過程中的早期事件，檢測甲基化異常更易發現早期病變。
本發明公開了一種腫瘤標誌物、甲基化檢測試劑、試劑盒及其應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明提供的腫瘤標誌物、甲基化試劑、試劑盒及其應用中所用原料、輔料及試劑均可由市場購得或者合成。
只要有可檢測差異性甲基化的CpG位點，COL4A2和／或TLX2基因的任何核酸片段可以用於本發明。CpG島是核酸序列中CpG富集區域。CpG島開始於啟動子的上游，向下游延伸至轉錄區域。在啟動子上的CpG島的甲基化通常抑制基因的表達。啟動子內的CpG島為甲基化的一部分，基因體中的CpG open sea存在保守的DNA甲基化靶標。最近的研究揭示了非啟動子區域（如基因體和UTR）甲基化對基因表達的協同效應，基因體甲基化可能是癌症中潛在的治療靶點。
通常來說，CpG島是指富含CpG二核苷酸的一些區域，通常位於啟動子及其附近的區域，本發明中的CpG島，不僅指啟動子及其附近的區域富含CpG二核苷酸，也包括雜合甲基化的CpG位點，或者是孤立的CpG位點。
通常，含CpG的核酸是DNA。然而，本發明可適用，例如，包含DNA、或者DNA和含有mRNA的RNA的樣品，其中DNA或者RNA可以是單鏈的或者雙鏈的，或者DNA-RNA雜交鏈也可能包括在樣品中。
本發明中的「引子」或「探針」是指一種寡核苷酸，其包含與靶核酸分子（例如靶基因）的至少6個連續核苷酸的序列互補的區域。在一些實施方案中，引子或探針包含與靶分子的至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個連續或不連續的分塊核苷酸的序列互補的區域。當引子或探針包含與靶分子的至少x個連續核苷酸互補的區域時，所述引子或探針與靶分子的至少x個連續核苷酸至少95％互補。在一些實施方案中，引子或探針與靶分子至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互補。
本發明中的「檢測」同診斷，除了結直腸腫瘤的早期診斷，還包括結直腸腫瘤中期和晚期的診斷，且也包括結直腸腫瘤篩選、風險評估、預後、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。
結直腸腫瘤標誌物COL4A2和／或TLX2基因的應用使得結直腸腫瘤的早期診斷成為可能。當確定在癌症細胞中甲基化的基因在臨床上或形態學上正常表像的細胞中甲基化時，這就表明該正常表像的細胞向癌症發展。這樣，結直腸癌可在早期通過在正常表像的細胞中的結直腸腫瘤特異性基因COL4A2和／或TLX2基因的甲基化而診斷。
其中，早期診斷指的是在轉移之前發現癌症的可能性，優選在可觀察到組織或者細胞的形態學變化之前。
除了結直腸腫瘤的早期診斷，本發明的試劑／試劑盒還有希望用於結直腸腫瘤篩選、風險評估、預後診斷、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的選擇。
作為病症階段可選的實施方式，可通過在結直腸腫瘤在不同階段或時期的進展可通過從樣品中獲取的COL4A2和／或TLX2基因的甲基化程度的測量進行診斷。通過比較從結直腸癌的每個階段的樣品中分離出的核酸的COL4A2和／或TLX2基因基因甲基化程度與從沒有細胞增殖性異常的腸組織中的樣品中分離出的一個或多個核酸的COL4A2和／或TLX2基因基因甲基化程度，可檢測樣品中結直腸腫瘤的具體階段。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例 1
選取163例糞便標本（80例結直腸癌，83例正常，均經腸鏡或病理確診），進行研磨離心，加入100 μl捕獲磁珠（含有COL4A2、TLX2基因的捕獲序列，以及內參基因ACTB），並按如下所述技術方案操作，最後得到Bisulfite轉化後的DNA 15 μl。然後進行qMSP檢測COL4A2、TLX2的甲基化水平。qMSP反應體系、反應程序和甲基化水平計算方法與對比例相同。用Logistic回歸模型構建兩基因聯合診斷的模型。
技術方案如下：
1）收集有腸鏡結果的正常人和結直腸腫瘤病人的糞便標本，按1 g糞便：4 mL保護液混合研磨後5000 rpm離心10 min，取上清棄沉澱；
2）取出10 mL上清再次離心，取上清3.2 mL加入2 mL裂解液和100 μl捕獲磁珠M1，92°C孵育10 min，然後室溫放置1 h；
3）置於磁力架上棄部分上清後洗下磁珠轉移至2 mL離心管，加入800 μl洗液W1，室溫1300 rpm孵育1 min，置於磁力架上吸去上清，重複3次；
4）加入55 μl洗脫液，92 °C 1300 rpm孵育10 min，置於磁力架上，3 min內轉移50 μl洗脫液至新的EP管中；
5）用EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）對上一步驟中的DNA片段進行甲基化處理，最後的洗脫液15 μl用於qMSP檢測。
qMSP反應體系：25 μl（無核酸酶水8.2 μl，5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 5 μl，MgCl₂（25 mM）5μl，dNTPs（10 mM）1μl，GoTaq Hot Start polymerase 0.5 μl，Forward primer（100 μM）0.125 μl ，Reverse primer（100 μM）0.125 μl，Probe（100 μM）0.05 μl， DNA 5 μl）。反應程序：95°C 4 min，（95 °C 20 s，56 °C 30 s，72 °C 30 s）×45 Cycles， 37 °C 30s。
最後根據標準曲線計算基因在標本中的拷貝數（方法參照前期的研究成果：Niu F, Wen J, Fu X, Li C, Zhao R, Wu S, Yu H, Liu X, Zhao X, Liu S, Wang X, Wang J, Zou H. Stool DNA test of MethylatedSyndecan-2 for the early detection of colorectal neoplasia. CANCER EPIDEMIOLOGY BIOMARKERS & PREVENTION 2017; 26(9): 1411-1419.）。
COL4A2、TLX2基因發生甲基化的位點相對恒定，主要位於啟動子區或附近的CpG島上。針對這些區域設計了其中一組優選的捕獲序列、引子和探針，並用於COL4A2、TLX2基因甲基化檢測試劑中。
試劑中含有的捕獲序列、引子探針如下：
COL4A2的捕獲序列（SEQ ID NO:1）： 5’-GCTGCTGCCCGAACGCATTGGCCCTTCCAGAAGCA-3’
COL4A2的qMSP引子探針： Forward Primer（SEQ ID NO:2）：5’-AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGTC-3’ Reverse Primer（SEQ ID NO:3）：5’-GACTTCAAAAACTACTACCCG-3’ Probe（SEQ ID NO:4）：5’-TGTCGGTGTGTCGTCGGC-3’
TLX2的捕獲序列（SEQ ID NO:5）： 5’- CCAGCGGGCGGCGGCACAGGCAGCGGGCGGTGCGCAGGGA -3’
TLX2的qMSP引子探針： Forward Primer（SEQ ID NO:6）：5’- ATTACGGAGTTTCGGGTTAC -3’ Reverse Primer（SEQ ID NO:7）：5’- GACGACACAAACAACGAACG -3’ Probe（SEQ ID NO:8）：5’- CGTTGTTCGGTAGTTTCGGAGTGG -3’
糞便實驗中，COL4A2、TLX2基因檢測結直腸癌的點狀圖和ROC曲線如圖1(A)、圖1(B)所示：
對於結直腸癌，COL4A2基因的檢測敏感性是92.5%，特異性為91.6%，ROC曲線下面積是0.966（95% CI：0.941–0.991，p ＜ 0.0001） 。TLX2基因的檢測敏感性是88.8%，特異性為96.4%，ROC曲線下面積是0.955（95% CI：0.922–0.989，p ＜ 0.0001）。兩基因聯合檢測時，在特異性為98.8%（82/83）的情況下，敏感性是91.3% （73/80）， ROC曲線下面積是0.985（95% CI：0.971–1，p ＜ 0.0001）。結果表明，在兩基因聯合診斷的情況下，可以以非常高的敏感性和特異性來區分正常人群和結直腸癌患者。
[ 表 1]
Figure 108117748-A0304-0001
 表1 註：「無擴增」表示無擴增曲線，無Ct數據，屬於大於界值的範圍。
對比例 1
有研究表明SFRP1基因甲基化與腸癌有關，在糞便中檢測該基因的甲基化程度，可以檢出結直腸癌。在53例糞便標本（29例腸癌、7例腺瘤、17例正常）實驗中，在特異性為86%時，可檢出89%的結直腸腫瘤。（Zhang W, Bauer M, Croner RS, Pelz JO, Lodygin D, Hermeking H, Sturzl M, Hohenberger W, Matzel KE. DNA stool test for colorectal cancer: Hypermethylation of the secreted frizzled-related protein-1 gene. DISEASES OF THE COLON & RECTUM 2007; 50(10): 1618-26; discussion 1626-7.）。另有研究顯示甲基化的CDH4基因也可作為檢測結直腸癌的標誌物。甲基化的CDH4基因可檢出78%（38/49）的結直腸癌，特異性達100%（0/10）（Frequent Aberrant Methylation of the CDH4 Gene Promoter in Human Colorectal and Gastric Cancer.CANCER RESEARCH. 2004）
對比例 2
在36例糞便標本中同樣檢測了SFRP1、CDH4基因的甲基化水平。選取36例糞便標本（18例結直腸癌，18例正常，均經腸鏡或病理確診），進行研磨離心，加入100 μl捕獲磁珠（含有SFRP1和CDH4基因的捕獲序列，以及內參基因ACTB），並按如下技術方案操作，最後得到Bisulfite轉化後的DNA 15 μl。然後進行qMSP檢測SFRP1、CDH4的甲基化水平。
技術方案如下：
1）收集有腸鏡結果的正常人和結直腸腫瘤病人的糞便標本，按1 g糞便：4 mL保護液混合研磨後5000 rpm離心10 min，取上清棄沉澱；
2）取出10 mL上清再次離心，取上清3.2 mL加入2 mL裂解液和100 μl捕獲磁珠M1，92 °C孵育10 min，然後室溫放置1 h；
3）置於磁力架上棄部分上清後洗下磁珠轉移至2 mL離心管，加入800 μl洗液W1，室溫1300 rpm孵育1 min，置於磁力架上吸去上清，重複3次；
4）加入55 μl洗脫液，92°C 1300 rpm孵育10 min，置於磁力架上，3 min內轉移50 μl洗脫液至新的EP管中；
5）用EZ DNA Methylation Kit（Zymo Research）對上一步驟中的DNA片段進行甲基化處理，最後的洗脫液15 μl用於qMSP檢測。
qMSP反應體系：25 μl（無核酸酶水8.2 μl，5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 5 μl，MgCl₂（25 mM）5 μl，dNTPs（10 mM）1 μl，GoTaq Hot Start polymerase 0.5 μl，Forward primer（100 μM）0.125 μl ，Reverse primer（100 μM）0.125 μl，Probe（100 μM）0.05 μl， DNA 5 μl）。反應程序：95 °C 4 min，（95 °C 20 s，56 °C 30 s，72 °C 30 s）×45 Cycles， 37 °C 30 s。
最後根據標準曲線計算基因在標本中的拷貝數（方法參照前期的研究成果：Niu F, Wen J, Fu X, Li C, Zhao R, Wu S, Yu H, Liu X, Zhao X, Liu S, Wang X, Wang J, Zou H. Stool DNA test of MethylatedSyndecan-2 for the early detection of colorectal neoplasia. CANCER EPIDEMIOLOGY BIOMARKERS & PREVENTION 2017; 26(9): 1411-1419.）。
36例糞便實驗中，SFRP1和CDH4基因檢測結直腸癌的ROC曲線如圖2(A)、圖2(B)所示：
對於結直腸癌，SFRP1基因的檢測敏感性是67%，特異性為94%，ROC曲線下面積是0.892（95% CI：0.790–0.994，p ＜ 0.0001）。CDH4基因的檢測敏感性也是67%，特異性為94%，ROC曲線下面積是0.867（95% CI：0.745–0.990，p ＜ 0.001）。兩個基因聯合時，檢測判讀標準為：當有至少一個基因為陽性時，判讀結果為腫瘤標本；當兩個基因均為陰性時，判讀結果為正常標本。根據兩基因聯合診斷時預測概率的Ct值界值判斷腫瘤標本和正常標本，SFRP1基因糞便標本中的Ct界值為32，小於界值為陽性，大於等於界值為陰性；CDH4基因糞便標本中的Ct界值為33，小於界值為陽性，大於等於界值為陰性。兩基因聯合檢測時，在特異性為94%（17/18）的情況下，敏感性是67% （12/18）。
[ 表 2]
Figure 108117748-A0304-0002
 表2 註：「無擴增」表示無擴增曲線，無Ct數據，屬於大於界值的範圍。
通過上述數據作為對比可看出，TLX2基因檢測，COL4A2基因和TLX2基因聯合檢測對結直腸癌的敏感性和特異性更高，效果更好。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
無。
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1示實施例1糞便實驗中，COL4A2、TLX2基因檢測結直腸癌的點狀圖和ROC曲線；其中，圖1(A)示糞便實驗中，COL4A2、TLX2基因檢測結直腸癌的點狀圖；圖1(B)示COL4A2、TLX2基因檢測結直腸癌的ROC曲線；
圖2示對比例的36例糞便實驗中，SFRP1和CDH4基因檢測結直腸癌的ROC曲線；
圖2(A)示36例糞便實驗中，SFRP1基因檢測結直腸癌的ROC曲線；
圖2(B)示36例糞便實驗中，CDH4基因檢測結直腸癌的ROC曲線。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (14)

  1. 一種TLX2基因和／或COL4A2基因在製備腫瘤標誌物中的應用； 優選地，該TLX2基因的序列與Genebank Accession No. NC_000002.12所示的序列具有至少97.8%，至少98.9%，至少99.9%或100%的同一性； 優選地，該COL4A2基因的序列與Genebank Accession No. NC_000013.11所示的序列具有至少97.8%，至少98.9%，至少99.9%或100%的同一性； 優選地，該腫瘤為結直腸腫瘤； 優選地，該腫瘤為結直腸癌或腺瘤； 優選地，該標誌物所針對的待測樣本為組織、體液或排泄物； 優選地，該組織為腸組織； 優選地，該體液為血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水； 優選地，該排泄物為痰液、唾液、尿液或糞便。
  2. 一種TLX2基因和／或COL4A2基因的甲基化檢測試劑在製備腫瘤檢測試劑或者試劑盒中的應用； 優選地，該TLX2基因的序列與Genebank Accession No. NC_000002.12所示的序列具有至少97.8%，至少98.9%，至少99.9%或100%的同一性； 優選地，該COL4A2基因的序列與Genebank Accession No. NC_000013.11所示的序列具有至少97.8%，至少98.9%，至少99.9%或100%的同一性； 優選地，該腫瘤為結直腸腫瘤； 優選地，該腫瘤為結直腸癌或腺瘤； 優選地，檢測試劑所針對的待測樣本為組織、體液或排泄物； 優選地，該組織為腸組織； 優選地，該體液為血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水； 優選地，該排泄物為痰液、尿液、唾液或糞便。
  3. 一種捕獲序列，具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； XVIII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XIX、與SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XX、如XVII、XVIII或XIX所示序列的互補序列。
  4. 一種引子對，其中， 上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXI、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； XXII、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XXIII、與SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XXIV、如XXI、XXII或XXIII所示序列的互補序列； 下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXV、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列； XXVI、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XXVII、與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XXVIII、如XXV、XXVI或XXVII所示序列的互補序列。
  5. 一種探針，具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXIX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； XXX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XXXI、與SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XXXII、如XXIX、XXX或XXXI所示序列的互補序列。
  6. 一種COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化檢測試劑，包括針對COL4A2基因和／或TLX2基因的捕獲序列、引子和／或探針； 優選地，包括針對COL4A2基因和／或TLX2基因的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針； 優選地，包括針對COL4A2基因和／或TLX2基因的基因體、基因間區、啟動子區或該啟動子區附近區域的CpG島獲得的捕獲序列、引子和／或探針； 優選地，該COL4A2基因的捕獲序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： I、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列； II、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； III、與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； IV、如I、II或III所示序列的互補序列； 優選地，該COL4A2基因的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： V、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； VI、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； VII、與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； VIII、如V、VI或VII所示序列的互補序列； 該COL4A2基因的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： IX、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； X、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XI、與SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XII、如IX、X或XI所示序列的互補序列； 優選地，該COL4A2基因的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XIII、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列； XIV、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XV、與SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互補序列； 優選地，該TLX2基因的捕獲序列具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XVII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； XVIII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列或具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XIX、與SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XX、如XVII、XVIII或XIX所示序列的互補序列； 優選地，該TLX2基因的上游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXI、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； XXII、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XXIII、與SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XXIV、如XXI、XXII或XXIII所示序列的互補序列； 該TLX2基因的下游引子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXV、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列； XXVI、具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XXVII、與SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XXVIII、如XXV、XXVI或XXVII所示序列的互補序列； 優選地，該TLX2基因的探針具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項： XXIX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列； XXX、具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失或添加一個或多個鹼基獲得的核苷酸序列； XXXI、與SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的序列或具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的CpG島獲得的功能相近的核苷酸序列； XXXII、如XXIX、XXX或XXXI所示序列的互補序列。
  7. 一種試劑盒，包括如請求項3所述的捕獲序列、請求項4所述的引子對、請求項5所述的探針或請求項6所述的甲基化檢測試劑； 優選地，該試劑盒包括：第一容器，其包含捕獲序列；第二容器，其包含用於擴增的引子對；第三容器，其包含探針。
  8. 一種如請求項3所述的捕獲序列、請求項4所述的引子對、請求項5所述的探針或請求項6所述的甲基化檢測試劑，在製備檢測腫瘤的試劑盒中的應用； 優選地，該腫瘤為結直腸腫瘤； 優選地，該腫瘤為結直腸癌或腺瘤； 優選地，檢測所針對的待測樣本為組織、體液或排泄物； 優選地，該組織為腸組織； 優選地，該體液為血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水； 優選地，該排泄物為痰液、唾液、尿液或糞便。
  9. 一種請求項3所述的捕獲序列、請求項4所述的引子對、請求項5所述的探針、請求項6所述的甲基化檢測試劑或請求項7所述的試劑盒在檢測腫瘤中的應用； 優選地，該腫瘤為結直腸腫瘤； 優選地，該腫瘤為結直腸癌或腺瘤； 優選地，檢測所針對的樣本為組織、體液或排泄物； 優選地，該組織為腸組織； 優選地，該體液為血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水； 優選地，該排泄物為痰液、尿液、唾液或糞便。
  10. 一種腫瘤的檢測方法，包括， （1）檢測受試者COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平； （2）將受試者COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平與正常對照樣本的甲基化水平相比較； （3）根據該受試者TCOL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平與正常對照樣本的甲基化水平相比的升高，指示該受試者患有或者有風險患上腫瘤，以區分正常樣本和腫瘤樣本； 優選地，通過檢測COL4A2基因和／或TLX2基因的基因體、基因間區或啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平； 優選地，通過檢測COL4A2基因和／或TLX2基因啟動子區及啟動子區附近區域的甲基化水平，區分正常樣本和腫瘤樣本； 優選地，該甲基化水平通過甲基化特異性PCR，或者甲基化特異性定量PCR，或者甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR、定量PCR、以及DNA芯片，或者甲基化敏感的限制性內切酶，或者重亞硫酸鹽測序法，或者焦磷酸測序檢測； 優選地，該甲基化水平通過甲基化特異性定量PCR檢測； 優選地，甲基化水平採用如請求項3所述的捕獲序列，或者請求項4所述的引子對，或者請求項5所述的探針，或如請求項6所述的甲基化檢測試劑，或者如請求項7所述的試劑盒檢測； 優選地，步驟（1）中，檢測受試者COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化水平包含以下步驟： a) 採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA； b) 待測樣品的DNA採用亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽進行轉化； c) 甲基化特異性定量PCR檢測； 優選地，步驟a)中，採用磁珠捕獲法提取待測樣品的DNA包括以下步驟； 取待測樣本在保護液中混合研磨、離心、取上清； 上清再離心，取上清，加入裂解液和帶有特定互補寡核苷酸捕獲序列的磁珠至上清液中孵育； 棄部分上清後洗下磁珠轉移至乾淨離心管，加入洗液，室溫100-2000rpm孵育0.5-5min，置於磁力架上吸去上清，重複3次； 用緩衝液將目標基因DNA洗脫。
  11. 如請求項10所述的方法，其中，檢測標準為：COL4A2基因和／或TLX2基因兩個基因聯合檢測，當有至少一個基因的檢測結果為陽性時，判讀結果為腫瘤標本；當兩個基因的檢測結果均為陰性時，判讀結果為正常標本； 根據兩基因的Ct值的界值判斷檢測結果為陽性或陰性，COL4A2基因糞便標本中的Ct值的界值為30~40，COL4A2基因糞便標本中的Ct值小於該Ct值的界值為陽性，COL4A2基因糞便標本中的Ct值大於等於該Ct值的界值為陰性； TLX2基因糞便標本中的Ct值的界值為32~42， TLX2基因糞便標本中的Ct值小於該Ct值的界值為陽性，TLX2基因糞便標本中的Ct值大於等於該Ct值的界值為陰性。
  12. 一種腫瘤的檢測系統，包含： （1） COL4A2基因和／或TLX2基因的甲基化檢測構件； （2） 數據處理構件； （3） 結果輸出構件； 優選地，該甲基化檢測構件含有熒光定量PCR儀、PCR儀、測序儀中的一種或多種； 優選地，該甲基化檢測構件還含有如請求項3所述的捕獲序列，或者請求項3所述的引子對，或者請求項3所述的探針，或者如請求項6所述的甲基化檢測試劑，或者如請求項7所述的試劑盒； 優選地，該數據處理構件被配置於a. 接收待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；b.儲存待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；c. 比對同種類型的待測樣本以及正常對照樣本的測試數據；d. 根據比對結果，響應於測試者罹患腫瘤的概率或者可能性； 優選地，該結果輸出構件用於輸出測試者罹患腫瘤的概率或者可能性； 優選地，數據處理構件的判斷標準為：根據界值判斷腫瘤標本和正常標本； COL4A2基因和／或TLX2基因兩個基因聯合檢測，當有至少一個基因的檢測結果為陽性時，判讀結果為腫瘤標本；當兩個基因的檢測結果均為陰性時，判讀結果為正常標本； 根據兩基因的Ct值的界值判斷檢測結果為陽性或陰性，COL4A2基因糞便標本中的Ct值的界值為30~40，COL4A2基因糞便標本中的Ct值小於所述Ct值的界值為陽性，COL4A2基因糞便標本中的Ct值大於等於所述Ct值的界值為陰性； TLX2基因糞便標本中的Ct值的界值為32~42， TLX2基因糞便標本中的Ct值小於所述Ct值的界值為陽性，TLX2基因糞便標本中的Ct值大於等於所述Ct值的界值為陰。
  13. 如請求項10或11所述的方法，或請求項12所述的系統，其中，該腫瘤為結直腸腫瘤；優選地，該腫瘤為結直腸癌或腺瘤。
  14. 如請求項10或11所述的方法，或請求項12所述的系統，其中，該系統或該方法的檢測樣本類型為組織、體液或排泄物； 優選地，該組織為腸組織； 優選地，該體液為血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、淋巴液、腦脊液或房水； 優選地，該排泄物為痰液、尿液、唾液或糞便。
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