CN110283910B - 目标基因dna甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了目标基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，该目标基因DNA甲基化为COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1基因的一种或多种。本发明首次发现SEQ ID NO.1～4所示的DNA甲基化分子标志物能够用于判别结直肠组织癌变进展，获得的模型具有较好的鉴别诊断效能，其AUC为0.662‑0.734。合并4条目标基因DNA甲基化标志物的模型AUC为0.764。使用本发明提供的DNA甲基化分子标志物判别结直肠息肉与结直肠癌，具有高灵敏度、高特异性的特点，并且能够辅助监测结直肠息肉进展到结直肠癌。

Description

目标基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织 癌变进展试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及临床检验诊断技术领域，尤其涉及目标基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。据国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)统计，2018年全球约有180万结直肠癌新发病例，分别是女性第二位、男性第三位高发肿瘤。近几十年来，随着我国社会经济的快速发展，“西方化”带来了生活方式和饮食结构的转变，我国结直肠癌发病率上升趋势明显，并呈现年轻化特点。结直肠癌已然成为严重威胁我国居民健康的重大公共卫生问题。

目前认为，结直肠癌的发生发展是多因素共同作用下发生的多阶段、多步骤的由“正常粘膜-腺瘤-癌”的转变过程。除外界环境因素和机体自身的遗传变异外，表观遗传的改变例如DNA甲基化、组蛋白修饰以及多种非编码RNA的调节等均与结直肠癌的发生发展相关。

DNA甲基化是最早发现的表观修饰途径之一，其可在不改变DNA原始序列的情况下调控基因表达。在哺乳动物中，CpG以两种形式存在：一种是分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状态，人们称之为CpG岛。在正常组织中，CpG岛常处于非甲基化状态，而散在分布的CpG位点中有70％-90％处于甲基化状态，抑制所在基因的表达。目前已有许多研究证实DNA甲基化水平的异常与包括结直肠癌在内的多种癌症的发生发展相关。由于CpG岛局部异常甲基化改变早于细胞的恶性增生，且甲基化状态相对稳定并易于检测，DNA甲基化作为恶性肿瘤早期诊断标志物具有很大的优越性。因此，寻找结直肠癌的发生发展的相关基因的DNA甲基化，有助于结直肠癌的早发现、早诊断和早治疗。

目前，关于结直肠癌相关的DNA甲基化分子标志物的研究已有大量报道，例如：

申请公告号为CN102686744A的发明专利申请文献公开了结直肠癌早期诊断的特异性的甲基化生物标志物，标志物为SORCS3、SIMI和SDC2中的一种或多种基因的CpG岛或基因的启动子CpG岛。

申请公告号为CN108315418A的发明专利申请文献公开了男性结直肠癌诊断、筛查与预测的外周血细胞DNA甲基化标志物，标志物为基因RPS24转录起始点前后序列的以下三组CpG位点中第(1)组或者第(1)组与第(2)组或第(3)组组合：(1)+22、+27和+29；(2)-24、-18、+89和+92；(3)+136。

申请公告号为CN108660209A的发明专利申请文献公开了一种基于BMP3基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，通过检测BMP3基因启动子区的一段甲基化序列是否发生甲基化，辅助诊断早期结直肠癌。

申请公告号为CN108676878A的发明专利申请文献公开了一种基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，通过检测NDRG4基因启动子区的一段甲基化序列是否发生甲基化，辅助诊断早期结直肠癌。

然而，以上研究均是针对于诊断结直肠癌的分子标志物的研究，对于判别结直肠组织癌变进展的标志物却少有研究；而且，结直肠癌的发生发展是一个多阶段的漫长过程，研究发现，近95％的结直肠癌是由息肉演变而来，经历正常黏膜→增生→腺瘤形成→腺瘤癌变的过程，一般需要5～10年的时间。这就为结直肠癌的预防提供了极有利的机会，如果能够在癌前病变阶段就采取预防控制措施，就能有效防止结直肠癌的发生。

因此，有必要专门针对判别结直肠息肉与结直肠癌、辅助监测结直肠息肉进展到结直肠癌的组织水平标志物进行研究，以实现结直肠息肉与结直肠癌的有效判别，并监测结直肠息肉进展到结直肠癌，从而进行早期干预，有效降低结直肠癌的发病率和死亡率。

发明内容

基于上述目的本发明提供了一种目标基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，能够判别结直肠息肉与结直肠癌、辅助监测结直肠息肉进展到结直肠癌。

具体技术方案如下：

本发明提供了COL25A1基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了GALR1基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了INHBA基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了HKDC1基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了目标基因DNA甲基化组合作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，所述目标基因DNA甲基化组合由COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1基因中的至少两种组成；核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～4所示。

进一步地，所述COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1均来源于结直肠组织。

通过比较上述DNA甲基化标志物在增生性息肉/息肉旁组织、结直肠腺瘤/腺瘤旁组织和结直肠癌/癌旁组织的甲基化水平，可发现：甲基化水平在增生性息肉病变组织中已有升高，在腺瘤和结直肠癌组甲基化水平中均发生有统计学意义的增加；并且该DNA甲基化改变在三组病例中呈递增趋势，能够用于结直肠息肉与结直肠癌的鉴别诊断，并辅助监测结直肠息肉进展到结直肠癌。

对单个COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1基因DNA甲基化标志物判别结直肠组织癌变进展的模型效能进行评估，发现其ROC曲线下面积(AUC)分别为：0.662、0.677、0.706和0.734，模型效能较好；合并4条基因DNA甲基化标志物后模型的AUC为0.764。

将息肉旁组织作为低风险正常组织，癌旁组织作为高风险正常组织，根据低风险正常组织、高风险正常组织、增生性息肉、腺瘤、结直肠癌五类不同组织的甲基化程度，对不同的甲基化基因分别建立线性混合效应模型，可以观测到随着进展程度不断加剧而甲基化程度递增或递减的趋势，模型具有统计学意义，能够辅助监测结直肠息肉进展到结直肠癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明首次发现SEQ ID NO.1～4所示的DNA甲基化分子标志物能够用于判别结直肠组织癌变进展，获得的结直肠息肉与结直肠癌鉴别诊断模型具有较好的诊断效率，其AUC为0.662-0.734；合并4条DNA甲基化基因后鉴别诊断模型的AUC为0.764。

(2)使用本发明提供的DNA甲基化分子标志物判别结直肠息肉与结直肠癌，具有高灵敏度、高特异性的特点。

(3)使用本发明提供的DNA甲基化分子标志物能够辅助监测结直肠息肉进展到结直肠癌。

附图说明

图1为实施例1中4种甲基化标志物在增生性息肉/息肉旁组织、腺瘤/腺瘤旁组织和癌/癌旁组织的甲基化水平；

其中，HP-N：息肉旁正常组织；HP：息肉组织；AD-N：腺瘤旁正常组织；AD：腺瘤组织；CA-N：癌旁正常组织；CA：癌组织

图2为实施例1中4种DNA甲基化标志物对判别结直肠组织癌变进展的模型效能。

图3为实施例1中4种DNA甲基化标志物分别构建的线性混合效应模型；

其中，LRN：低风险正常组织，HRN：高风险正常组织，HP：息肉组织；AD：腺瘤组织；CA：癌组织。

具体实施方式

实施例1

甲基化标志物的筛选过程分为三个阶段，分别为筛选阶段、验证阶段I和验证阶段II。

(1)在筛选阶段时，采用IlluminaInfinium Methylation EPICBeadChip(850K)甲基化芯片筛选阳性位点，送检12例结直肠癌(癌与癌旁组织)、3例结直肠息肉(息肉与息肉旁组织)的标本。筛选出癌与癌旁正常组织差异甲基化位点共计5616个，癌组织/息肉组织差异甲基化位点共计183个。

最终，在组织水平，筛选了13个CpG位点进入验证阶段I分析。

(2)在验证阶段I时，46例结直肠癌病例，采用焦磷酸测序方法检测癌/癌旁正常组织的甲基化水平，实验结果与芯片结果一致。

从中挑选了差异最显著的4个CpG位点(COL25A1cg08193528，GALR1cg03032214，INHBA cg09138133，HKDC1cg23341612)进入验证阶段II。

(3)在验证阶段II时，通过焦磷酸测序定量检测法，在142例结直肠息肉病例(其中13例增生性息肉病例，129例腺瘤病例)和256例结直肠癌病例病变组织及配对正常组织样本中对上述4个基因区域进行检测。

步骤(2)和步骤(3)的具体内容见实施例2。

实施例2

1、研究对象

组织样纳入142例结直肠息肉病例(其中13例增生性息肉病例，129例腺瘤病例)和302例结直肠癌病例病变组织及配对正常组织样本。

结直肠息肉病例为嘉善县结直肠癌筛查队列中的肠息肉病例，结直肠癌病例来自绍兴市人民医院肛肠外科的确诊病例。所有研究对象均经病理学确诊并排除具有术前放化疗史、家族性腺瘤性息肉病史、结直肠癌史的病例。研究通过浙江大学医学院伦理委员会审查并获得研究对象知情同意。

2、标本采集

所有纳入的结直肠癌病例均于术中切除和采集其相应的癌组织和癌旁正常组织，结直肠息肉病例为嘉善县结直肠癌筛查队列中做肠镜时切除和采集其相应的息肉组织和息肉旁正常组织。其中，结直肠癌/息肉组织是从肿瘤瘤体/息肉上切取的直径0.5厘米左右的癌组织/息肉，癌/息肉旁正常组织取自距离瘤体/息肉3厘米以上的直径0.5厘米左右的远端组织。

为防止组织的DNA和RNA降解，采集的组织标本在手术切除后立即取回，仔细分装后，浸没于组织RNA保存液后转移至-80℃冰箱冻存。

3、DNA甲基化的定量检测

3.1DNA的提取

采用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取组织样中的DNA(美国Omega公司)提取组织样品中对的DNA，具体步骤如下：

(1)将20mg组织切碎并放入裂解板中，向每个样品中加入200μl TL缓冲液和25μl蛋白酶K溶液并用硅胶垫密封，涡旋使混合彻底。

(2)以2000-3000×g短暂离心裂解板用来收集硅胶垫残留溶液。

(3)在60℃孵育过夜或直至样品完全溶解，从一侧到另一侧用力摇动板确保裂解液完全均匀。

(4)向每个样品中加入1体积BL缓冲液和1体积100％乙醇。白色沉淀形成，用新的硅胶垫密封裂解板。用力摇动板混合样品1分钟。

(5)以2000-3000×g短暂离心裂解板用来收集硅胶垫残留溶液。

(6)将E-Z 96DNA板置于96孔方孔板的顶部并将步骤5中的所有裂解物转移到E-Z96DNA板的每个孔中，用AeraSeal薄膜密封E-Z 96DNA板。

(7)以2000-6000×g离心10分钟。

(8)取下并丢弃AeraSeal薄膜。

(9)向E-Z 96DNA板每个孔中加入500μl HBC缓冲液，用新的AeraSeal薄膜密封E-Z96DNA板。

(10)以4000-6000×g离心5分钟。丢弃滤液并重复使用96孔方孔板。

(11)取下并丢弃AeraSeal薄膜。

(12)向E-Z 96DNA板每个孔中加入600μL DNA洗涤缓冲液，用新的AeraSeal薄膜密封E-Z 96DNA板。

(13)以4000-6000×g离心5分钟。丢弃滤液并重复使用96孔方孔板。

(14)重复步骤11-13。

(15)将空板以4000-6000×g离心15分钟。丢弃滤液和96孔方孔板。

(16)将E-Z 96DNA板转移到一组96孔Racked Microtubes中。

(17)取下并丢弃AeraSeal薄膜。

(18)将加热至70℃的150μl洗脱缓冲液加入E-Z 96DNA板的每个孔中，用新的AeraSeal薄膜密封-Z 96DNA板。在室温下静置2-5分

(19)以4000-6000×g离心5分钟。

(20)用盖子密封96孔Racked Microtubes，在-80℃下储存DNA。

3.2DNA重亚硫酸化

重亚硫酸盐处理釆用EZ DNA Methylation-Gold Kit^TM(美国Zymo公司),具体步骤如下：

(1)样本均一化

①使用NanoDrop ND-2000分光光度计，确定样本浓度。

②确保样本的浓度大于50ng/μl，样本的总量大于500ng。

(2)试剂准备

①加900μl水，300μl M-Dilution Buffer，50μl M-Dissolving Buffer到CTConversion Reagent管中。室温下震荡10min。

②在M-Wash Buffer中加入6mL(D5005)或者96mL(D5006)的100％乙醇。

(3)根据表1，在200μl PCR管中在配制重亚硫酸化反应试剂。

表1 DNA修饰体系组成

注：DNA和RNase-free水的总体积为20μl；DNA模板量为500ng-2μg，根据提

取DNA的浓度计算其所需体积，其余用水补齐

(4)关闭PCR管，将重亚硫酸化反应试剂混合完全。

(5)根据表2设定反应程序。使用带热盖的热循环仪。如果热循环仪不允许设定反应体积(150μl),将反应体积设定为仪器所允许的最大值。

表2 DNA修饰PCR反应条件

3.3转化后DNA的纯化

(1)向Zymo-Spin^TMIC纯化柱子中加600μl M-Binding Buffer。

(2)将150μl转化样本加入含有M-Binding Buffer的纯化柱子中，颠倒混匀。

(3)以大于10000x g的转速离心30s，丢弃废液。

(4)向纯化柱中加100μl M-Wash Buffer，离心30s，弃液。

(5)向纯化柱中加200μl M-Desulphonation Buffer，室温放置15-20min，之后离心30s，弃液。

(6)向纯化柱中加200μl M-Wash Buffer，离心30s，重复加200μlM-Wash Buffer，离心30s，弃液。

(7)将柱子放在一个新的1.5ml离心管中，加10μl M-Elution Buffer，离心30s洗脱DNA。注意：纯化后的DNA在2-8℃最长存放24小时。-20℃长期保存。

3.4 PCR扩增反应

(1)将TaKaRa EpiTap^TM HS和引物等试剂置于冰上解冻。

(2)根据表3配制反应体系。

表3甲基化DNA样本PCR扩增反应体系

(3)轻轻吹打反应液上下颠倒混匀完全，将混合液分到每个PCR管。

(4)在每个PCR管中加入重亚硫酸化的DNA(10-20ng/反应)。

(5)根据表4设置反应程序。

表4甲基化DNA样本PCR扩增反应程序

(6)将PCR管置于热循环仪中，开始反应。

3.5 Pyrosequencing焦磷酸测序上机反应

3.5.1设计焦磷酸测序引物进行PCR扩增

(1)COL25A1(SEQ ID NO.1)

具体信息如下:COL25A1Chr4:109745039-110223799

>hg19_wgEncodeHaibMethyl450Gm12878SitesRep1_cg07095995

range＝chr4:110223480-110224480 5'pad＝0 3'pad＝0strand＝+

repeatMasking＝none

反向序列设计引物：

(2)GALR1(SEQ ID NO.2)

具体信息如下：GALR1Chr18:74962008-74982096；NM_001480Chr18:74962008-74982096

>hg19_wgEncodeHaibMethyl450Gm12878SitesRep1_cg03032214

range＝chr18:74961309-74962309 5'pad＝0 3'pad＝0strand＝+

repeatMasking＝none

反向序列设计引物：

注：下游引物上有一个CG位点避不开。

(3)INHBA(SEQ ID NO.3)

具体信息如下:INHBA chr7:41728601-41742706；NM_002192chr7:41724712-41742706

cg09138133

>hg19_wgEncodeHaibMethyl450Gm12878SitesRep1_cg09138133range＝chr7:41740929-41741929 5'pad＝0 3'pad＝0strand＝-repeatMasking＝none

(4)HKDC1(SEQ ID NO.4)

具体信息如下:HKDC1Chr10:70980059-71027315；NM_025130Chr10:70980059-71027315

cg23341612

>hg19_wgEncodeHaibMethyl450Gm12878SitesRep1_cg23341612range＝chr10:70979277-70980277 5'pad＝0 3'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none

3.5.2甲基化水平统计

采用上述引物进行焦磷酸测序，对测序产物进行甲基化水平统计分析，结果如图1所示。

4、统计分析

(1)数据采用R3.2.2软件进行统计分析，样本DNA甲基化水平的差异用配对t检验进行比较，P<0.05被认为具有统计学差异。应用于图1。

(2)采用ROC曲线评价单个COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1基因甲基化标志物判别结直肠组织癌变进展的模型效能，并计算曲线下面积(AUC)。应用于图2.a-d。

(3)通过ROC曲线和约登指数确定每个基因甲基化水平的最佳截断值(cut-off),将每个基因的甲基化水平定义为：低甲基化为0，高甲基化为1。采用单因素logistic回归模型，分析目标基因甲基化与结局之间的关系，得到每个基因相应的回归系数(β)，该系数即为效应权重系数。对于每位研究对象，按照以下公式计算权重MRS：

用以β值作为权重的甲基化危险度评分(MRS)综合评价多个甲基化基因联合判别结直肠组织癌变进展的作用，构建判别结直肠组织癌变进展的模型。模型公式为：

MRS＝(1.397*COL25A1+1.374*GALR1+1.432*INHBA+1.742*HKDC1)/4

(公式中的“COL25A1”、“GALR1”、“INHBA”和“HKDC1”分别表示相对应的DNA甲基化水平)将四种基因DNA甲基化水平分别代入上述公式，计算MRS，采用ROC曲线及曲线下面积AUC进行评价。应用于图2.e。

(4)将息肉旁组织作为低风险正常组织，癌旁组织作为高风险正常组织，根据低风险正常组织、高风险正常组织、增生性息肉、腺瘤、结直肠癌五类不同组织的甲基化程度，对不同的甲基化位点分别建立线性混合效应模型，以观测随着进展程度不断加剧而甲基化程度的变化趋势。应用于图3。

5、实验结果：

如图1所示，甲基化水平在增生性息肉病变组织中已有升高，在腺瘤和CRC组甲基化改变均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，可观察到，DNA甲基化改变在三组病例中逐渐增加。

如图2所示，对COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1基因甲基化标志物对判别结直肠组织癌变进展的模型效能评估，发现其ROC曲线下面积分别为0.662，0.677，0.706和0.734。合并4条基因DNA甲基化标志物后模型的AUC为0.764。

如图3所示，将息肉旁组织作为低风险正常组织，癌旁组织作为高风险正常组织，根据低风险正常组织、高风险正常组织、增生性息肉、腺瘤、结直肠癌五类不同组织的甲基化程度，对不同的甲基化位点分别建立线性混合效应模型，可以观测到随着进展程度不断加剧而甲基化程度递增或递减的趋势，模型具有统计学意义。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 目标基因DNA甲基化作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

cagaggaccg acacctcttt cgagggcccc aacagtggcc gctcagggtc cgagggcaac 60

ggccgaggcg ccacgcgggg ccgcggctcg ccctggccac ggaggaccgg acctgttgcg 120

cctctgtgag tttgccttat ttctacctac tcggtgtctt tcggcacgcc gacctgtttc 180

ccacctgcat tcagttcaag gcaaaaaggc tgtgagagca cgctacagcg cagcgcgaaa 240

ggggcgacta aggtggagaa gagagaggaa aacgaaataa acccaaggaa ccaatgctac 300

tcgcgaagcc gaagtcgcgg ctgcccgaag gatctccgca gccccgcgtg cgcgatcctt 360

aaataccctt cgcgatgctc gcgtgagtgt gtgtgtgagt gtgtgagtgc gcgcgcgctc 420

cgagcacgac gtccctcccc cgaccccctc ccggcgcccg gcgtccggcc tgccgctccc 480

gctgctgcgc gccccccttc cgaaggcaaa gcaggagccc gccttattat cataatgtat 540

tcaccttggc ccagcccgcg ggccggcccg gggaaccccc aagggaggcg ggaagcttgg 600

gtgggagcgg ggcaggaggt ctgttattag cataatgtat gcaaatagct ggagcggcca 660

ccgtgattgg agaggagcct ggcgacccct ccccctgcgc ggagtaactt cagcatctcc 720

gagggccacc tctctggcct gggccggggc cgaagcgggg tcggctgcgc aagaggcggc 780

aactttggct tatactgact cagcccagcg cccccttttt atcccacata aaaatggaga 840

aatggcctcc gggaggaaga tgtgaagcgg cacgctctat ctctactgat cttcactcaa 900

aagcagccgc aggagctgtt gctatctcgc tgtggtgcag cgcttttccc tcctccctca 960

ctttcccaca tgcccagagg caaagtgtct ggccgacgtc t 1001

<210> 2

<211> 1001

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

ggtgtgaaca gccttcccct tccatgtcag ccacgtctat agagaagctc acgcggccct 60

ttccctttgc acttctctcc tctgtagcag gccgcggggt gagggtggga ttaggcggcc 120

aattttacaa aactccaggg agcgtcgcca gcctcgattt cctggggtta ttcctgggag 180

agaggcgttc tcacggacag ccaccctggg gaggaggagg aggaaaggca ctaatggatg 240

aggaggcccg cgcacccctc cgcctcccac cccggcgcgc cctggaacgc cctggagcgc 300

gcccggcttc cctcgcccgc ctggcccgcg gcatccggca gccccgcctt cagcccgccg 360

ggcaggtccg cactccgcag aggcgagcgc gctccggttc cagccgggag gtgggcggcg 420

acccatcccg ctagaatccg tccagtctct gctcgcgcac cgtgacttct aaggggcgcg 480

gatttcagcc gagctgtttt cgcctctcag ttgcagcaga gaagcccctg gcacccgact 540

ctatccacca ccaggaagcc tcccaaaaga gctctcgccc tgtggacgac tcggaatccc 600

tggaaaagcc gggagggagt cggaggcgcc agcccactgg ggaggtggcg ctgggcgcgc 660

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tccacctgcg cggctgcagc cggcggatcc ctcttcccag gctccgtggt cgcgcagcgg 900

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gtccagctcc gggctcccga acccaccctc tctcagaagg t 1001

<210> 3

<211> 1001

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

agttgttttg gaaaagggga cagtatatat aattcagaaa gcattgttaa cctgtgcaaa 60

ctgtaattat aacttagtgt cacaattttc ttgccctctt ccccttgcac tcagatctta 120

tcttgtagta atgatattta ttaactcttt ccacctaaac tgcattgctt gactgtaatg 180

ctatgaacac actaggtgtc agatataagc tgagtgtatc ttcagaaacc aagagggctt 240

atgtgtggga aagaaaccga gagggaagga acgctttaac agatggaccc cttaaagatt 300

cttctgcaag ataaaagcaa taagacagaa aatgaaaaag aggggagggg gaagaatttt 360

ttttaagcct tagaaaggca ttgttaaaaa attcacattt ttctttttct gtgcacacta 420

aaatccatga tgatttcatc tgcactgttc ctttgaggga aaaagaagca gtcaaggagg 480

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ccggcagaag ggggcagctg aacgcgacgg ggagaaagcg cttctggaac ttgggcttgt 780

gacaggctgc ctgccctctg gtccttcagt gccctgctgc atttcacagt tgggaagagt 840

ggagtgtatt atatgacccc aaacaaaagt tccattgcgc tctcctcaga ttgcctgcca 900

gtgttgatga cctgaacatt taaatatgaa tgaattgggg gaaaggacca tctcccctgg 960

atcccatcag gccagaacaa tcctctgtta cccctgagtc c 1001

<210> 4

<211> 1001

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

gtagagatgg ggtttcacca tgttggccag gctggtctcg aactcctgac ctcatgatct 60

gcctgcctcg gcctccccaa gtgctgcgat tgttacaggc gtgagtcact gcacccggct 120

ggactgagac atttcttatc tgtgacttcc ttctctccag cagtgattcc cagtgagcac 180

tggtgacttc agttcactct ttctcaggaa tattttttcc tgggtcacta cctgtgaact 240

aaagattttc tggcttaaca ctgtgaatag gtaaacattt attgatcatt ttctgttaac 300

catgggctat tagttaagag atctgatctg tcacaaatgg aagaatctgc cccaacattc 360

ttgaaatccc attgaccagg acaatgttta gttttagtta gttcagtgct tctgaggagc 420

agggggtcac agagttatgc cactggcata aaaaactaaa gagaaaagcc tgggactgga 480

aatttgcaga gcagctccac cggttgaaag ttggctttgt ttagtgccca acttcgcaga 540

agattttcct cggctgagtg ggcttggcag agccccggct tgagagggtt gcttagcaat 600

gagatttggt ggcacccaat tctcaagtag tcaagcaacc catcaatacc ctgcttcccc 660

ctccactaaa cctcagctac catccagagc ctcctattag acaatcaagt gtgtgccaga 720

gggagggacc aaaggggtgg ggtggggggg agtttaatca ttgaaccaag caggctggag 780

gtatttagtc cgcaacacct cgctccccag gaggtctgcc agcctggact ggaagcgtgc 840

aacactccag agtcgtagga gtgaacactg cacaggaatc tctgcccatc tcaggagaaa 900

ccaaacttgg ggaaaatgtt tgcggtccac ttgatggcat tttacttcag caagctgaag 960

gaggaccaga tcaagaaggt aaggaggacc cacgaagctg a 1001

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggttgggtta aggtgaatat attatgat 28

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

acccaaaaaa ccaatactac t 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

aggtgaatat attatgataa taagg 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gaggtttttt ggtggtggat aga 23

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

acaacccccc cttcaaccc 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ttttgttgta attgagagg 19

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

aagaagtagt taaggaggtt gtttatgaat 30

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cttaaccttt cccacatcct ttta 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ggttgtttat gaatgtattg g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

agagaaaagt ttgggattgg a 21

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

acttaaaaat taaataccac caaatctcat 30

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

attggaaatt tgtagagtag 20

Claims (2)

1.目标基因DNA甲基化组合作为分子标志物在制备判别结直肠组织癌变进展试剂盒中的应用，其特征在于，所述目标基因DNA甲基化组合由COL25A1，以及GALR1、INHBA、HKDC1三种中的至少一种组成；COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～4所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述COL25A1、GALR1、INHBA和HKDC1均来源于结直肠组织。

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