CN111662978B - 结直肠癌的dna甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预测结直肠癌(CRC)的风险的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒。

Description

结直肠癌的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方 法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域。特别地，本发明涉及用于预测结直肠癌(CRC)的风险的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒。

背景技术

在全世界范围内，每年都有很多人被诊断出患有CRC，也有很多患者死于此病。尽管现有的治疗手段(包括手术、放射疗法、化学疗法)对CRC具有显著的临床治疗价值，然而，手术后癌症的复发和转移使得这些治疗手段不能成功治愈结直肠癌。因此，对CRC早期的诊断不仅可以降低死亡率，还可以减少手术治疗的费用。

目前诊断CRC的手段如结肠镜检查是侵入式检查，被检查的患者在受检过程中可能会感觉不舒服甚至厌恶。便潜血试验则需要多次采样，会给病人带来很多不便，从而造成受检者筛查意愿降低，依从性差。

在结直肠癌的发生发展过程中，甲基化的异常影响了相关基因的表达，科学家发现可以通过检测特异位点的甲基化水平检测癌症的发生。循环游离DNA(circulatingcell-free DNA,ccfDNA)是指循环血中处于细胞外游离状态的DNA。近年来，针对ccfDNA的“液态活检”技术迅速发展，显现出应用于临床癌症筛查与监测的良好前景。

发明内容

本发明人通过甲基化CpG短串联扩增与测序技术(MCTA-Seq)对结直肠癌进行了分析。通过比较配对的癌与癌旁组织(n＝66)，发现2410个在结直肠癌组织中甲基化水平特异性升高的CGCGCGG-CpG区域。比较结直肠癌患者(n＝147)与对照者(n＝136)的血浆样本，发现1233个在结直肠癌患者血浆中甲基化水平升高的CGCGCGG-CpG区域。由80个表现最佳的血浆CGCGCGG-CpG区域组成的分类器检测结直肠癌的灵敏性为74％，特异性为90％，从而建立了特定CGCGCGG-CpG区域甲基化水平与结直肠癌发生的关联。

具体地，本发明人发现了人的血浆中循环游离DNA中的多个甲基化位点与结直肠癌发生显著相关，可以用于预测结直肠癌发生、作为早期筛查标志物。

因此，在一个方面，本发明提供了用于在个体中评估结直肠癌倾向性或检测结直肠癌的DNA甲基化标志物集，所述标志物集包括一个或多个如表1所记载的CGCGCGG-CpG区域，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGCGCGG-CpG区域的较高甲基化水平指示所述个体具有结直肠癌倾向性或患有结直肠癌。

根据本发明，已经确定某些特定基因系列(panel)就其甲基化水平的差异性变化而言受到调节，这取决于所讨论细胞是否具有肿瘤性或不具有肿瘤性。应当理解将所讨论的基因在本文中通过提到它们的名称和它们的染色体坐标来描述。染色体坐标与2009年2月发布的人类基因组数据库Hg19版(本文中称作“Hg19坐标”)一致。

因此，本发明的一个方面涉及一种评估个体中结直肠癌倾向性或检测结直肠癌的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中检测一个或多个CGCGCGG-CpG区域并将述位点的甲基化水平与对照进行比较，其中所述CGCGCGG-CpG区域的具体信息如表1所记载，其中相对于对照而言，所述区域的较高甲基化水平指示所述个体具有结直肠癌倾向性或患有结直肠癌。

在另一个方面，本发明提供了用于检测本发明所述的甲基化的CGCGCGG-CpG区域的引物，所述引物扩增如表1所记载的CGCGCGG-CpG区域。优选地，所述引物的序列如SEQ IDNO:1-7所示。

在另一个方面，本发明提供了一种检测本发明所述的CGCGCGG-CpG区域的方法，所述方法包括：

1)提取DNA样品，

2)扩增至少一个CGCGCGG-CpG区域，CGCGCGG-CpG是指特定CGCGCGG至其下游特定CG之间的一段基因组区域，具体地，所述CGCGCGG-CpG区域的详细位置信息如本文表1所记载；

3)测定所述CGCGCGG-CpG区域的甲基化程度，其中相对于对照而言，所述CGCGCGG-CpG区域的较高甲基化水平指示所述个体具有结直肠癌倾向性或患有结直肠癌。

在另一个方面，本发明提供了一种用于检测CGCGCGG-CpG区域的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的引物对和扩增DNA所需的试剂，包括但不限于PCR缓冲液、脱氧核苷酸；和热稳定性聚合酶等。

在另一个方面，本发明提供了本发明所述DNA甲基化标志物或者本发明所述的引物用于癌症诊断与风险预测的用途，例如制备用于癌症诊断与风险预测的试剂的用途。

在一个具体实施方案中，所述生物样品是包含循环游离DNA(circulating cell-free DNA,ccfDNA)的样品。

本发明的另一个方面涉及一种评估个体中结直肠癌倾向性或检测结直肠癌的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中检测一个或多个DNA区域并将述区域的甲基化水平与对照进行比较，其中所述DNA区域选自下列一个或多个CGI：

(1)chr1:121260857-121261525

(2)chr10:26727061-26727992

(3)chr19:58238585-58239028

(4)chr12:104850253-104852395

(5)chr2:144694666-144695180

(6)chr7:127744194-127744554，

(7)chr8:9762661-9764748，

其中相对于对照而言，一个或多个所述区域的较高甲基化水平指示所述个体具有结直肠癌倾向性或患有结直肠癌。

详细描述

本文所用的术语具有本发明相关领域的普通技术人员所通常理解的含义。术语如“一个”、“一种”和“所述”不旨在仅指单数的实体，而是包括可用于说明特定实施例的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施例，但它们的使用并不限定本发明，除非在权利要求中指出。

本发明所述“个体”可以是任何的人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物的例子包括灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、伴侣动物(例如犬、猫)和圈养野生动物(例如鹿、狐)。优选地，所述哺乳动物是人。根据本发明，所述生物样品优选是血浆样品。

本文中所指明的一系列DNA区域(标记)不仅相对于现有技术方法提供改进的诊断结果，另外还使开发下述筛查方法成为可能，所述筛查方法可以设计成专注于提供高水平的诊断特异性或高水平的诊断灵敏度。如本领域技术人员将理解，在诊断学的语境下，“灵敏度”是指正确鉴定的阳性结果的比例，即，正确鉴定为具有所讨论疾病的个体的百分数。然而，“特异性”是指正确鉴定的阴性结果的比例，即，正确鉴定为不具有所讨论疾病的个体的百分数。

本发明所述的“DNA区域”应当理解为指称基因组DNA的特定区段。这些DNA区域通过提到基因名称或一组染色体坐标来指定。这些基因名称和染色体坐标均将是本领域技术人员熟知并理解的。如前文中详述，染色体坐标对应于基因组的Hg19版。通常，一个基因可以通过参考其名称常规地确定，其中可以借助所述名称常规地获得其序列和染色体位置，或通过参考其染色体坐标常规地确定，其中也可以借助所述染色体坐标常规地获得基因名称及其序列。

DNA甲基化

DNA甲基化普遍存在于细菌、植物和动物中。DNA甲基化是一种类型的DNA化学修饰，所述化学修饰经过多轮细胞分裂是稳定的，但是不涉及生物的基础性DNA序列变化。染色质修饰和DNA修饰是表观遗传学的两个重要特征并且在细胞分化过程中发挥作用，允许细胞即便含有相同的基因组物质但仍稳定维持不同的特征。在真核生物中，DNA甲基化仅在胞嘧啶的嘧啶环的编号5碳处发生。在哺乳动物中，DNA甲基化大多在CpG二核苷酸的编号5碳处发生。CpG二核苷酸占据大约1％人类基因组。

70-80％的全部CpG是甲基化的。CpG可以成簇地群集，称作“CpG岛”，其存在于许多基因的5'调节区中并且经常是非甲基化的。在许多疾病过程如癌症中，基因启动子和/或CpG岛获得异常的过度甲基化，这与可遗传的转录性沉默相关。DNA甲基化可以按两种方式影响基因的转录。首先，DNA的甲基化本身可以物理地阻碍转录蛋白与基因结合，因此阻断转录。其次，甲基化DNA可以被称作甲基-CpG-结合结构域蛋白(MBD)的蛋白质结合。MBD蛋白随后向基因座召集额外的蛋白质，如组蛋白脱乙酰酶和可以修饰组蛋白的其他染色质重塑蛋白，从而形成紧凑无活性的染色质，称作沉默染色质。DNA甲基化和染色质结构之间的这种联系非常重要。具体而言，甲基-CpG-结合蛋白2(MeCP2)的丢失已经在Rett综合征中显示意义并且甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)介导癌症中过度甲基化基因的转录性沉默。

“甲基化状态”应当理解为指甲基化在DNA区域内部一个特定核苷酸或多个核苷酸处的存在、不存在和/或其量。特定DNA序列(例如，如本文所述的DNA区域)的甲基化状态可以表示这个序列中每个碱基的甲基化状态，或可以表示这个序列中碱基对亚集的甲基化状态(例如，胞嘧啶的或一种或多种特定限制性酶识别序列的甲基化状态)，或可以表示这个序列内部关于区域甲基化密度的信息，而不提供该序列中何处发生甲基化的精确信息。甲基化状态可以任选地由“甲基化值”代表或表示。可以例如通过对采用甲基化依赖限制性酶进行限制酶切消化后存在的完整DNA的量定量，产生甲基化值。在这个例子中，如果DNA中的特定序列使用定量PCR定量，则与模拟处理的对照大致相等的模板DNA的量表示该序列未高度甲基化，而比模拟处理的样品中出现的模板量明显更少的模板量表示这个序列中存在甲基化DNA。因此，例如来自上述例子的值(即，甲基化值)代表甲基化状态并且因此可以用作甲基化状态的定量指示物。当需要将样品中序列的甲基化状态与阈值比较时，这特别有用。

本发明的方法基于生物样品的特定DNA区域的甲基化水平与这些DNA区域的对照甲基化水平比较。“对照水平”是“正常水平”，所述正常水平是无肿瘤性的相应结直肠细胞或细胞群体的DNA区域的甲基化水平或可以从中分离DNA用于分析的另一种生物样品中的甲基化水平。

因此，在一个方面，本发明提供了一种筛查个体中结直肠癌倾向性或检测结直肠癌的方法，所述方法包括在来自所述个体的生物样品中评估DNA区域的甲基化状态，所述DNA区域如表1所示，其中相对于对照而言，该组中DNA区域的较高甲基化水平指示所述个体具有结直肠癌倾向性或患有结直肠癌。

进一步地，本发明人还确定了这些区域内的CGCGCGG-CpG区域在这方面是特别有用的，这项研究结果使这些CGCGCGG-CpG区域成为特别有用的分析靶。

具体而言，本发明所述的CGCGCGG-CpG区域是指：特定CGCGCGG至其下游特定CG之间的一段基因组区域。下表1中列出了本发明的80个CGCGCGG-CpG区域的详细位置信息及相应的CG岛(CGI)的位置信息，其中CGCGCGG-CpG名称中基因名称下划线后“n-m”表示该CGCGCGG-CpG区域包括相应CpG岛内从第n个CGCGCGG位点至其下游第m个CpG位点之间的序列。

如下文实施例所证明，本发明人通过比较配对的癌与癌旁组织(n＝66)，发现2410个在结直肠癌组织中甲基化水平特异性升高的CGCGCGG-CpG区域。通过比较结直肠癌患者与对照者的血浆样本，由80个表现最佳的血浆CGCGCGG-CpG区域组成的分类器检测结直肠癌的灵敏性为74％，特异性为90％，从而建立了特定CGCGCGG-CpG区域甲基化水平与结直肠癌发生的关联。

DNA甲基化的检测

可以在本发明方法中使用用于检测DNA甲基化的任何方法。许多方法可用于原代组织样品中或患者样品如血液、尿粪便或唾液中检测在特定基因座处差异性甲基化的DNA(综述见Kristensen和Hansen Clin Chem.55:1471-83,2009；Ammerpohl等人,BiochimBiophys Acta.1790:847-62,2009；Shames等人,Cancer Lett.251:187-98,2007；Clark等人,Nat Protoc.1:2353-64,2006)。基于亚硫酸氢钠处理的方法是分析靶基因中DNA甲基化的比例或程度的常用方法之一，DNA正常情况下用亚硫酸氢钠处理，并且使用将与甲基化状态无关地扩增DNA的引物和PCR条件扩增目的区域。随后可以通过测序(包括焦磷酸测序法)、限制性酶消化(COBRA)或通过解链曲线分析法评估整体扩增子或各个CpG位点的甲基化。可选地，可以使用基于连接的用于分析特定CpG位点处甲基化的方法。正在开发异常甲基化DNA的检测作为癌症诊断的手段，其中所述异常甲基化DNA从肿瘤中释放并进入体液。这里，在过度甲基化的序列情况下，需要使用允许从未甲基化的正常细胞DNA的背景中选择性扩增甲基化DNA序列的敏感方法。这类方法基于亚硫酸氢盐处理的DNA，例如；包括甲基化选择性PCR(MSP)、重度甲基(Heavymethyl)PCR、HeadloopPCR和辅助物依赖性链反应(Helper-dependent chain reaction)(PCT/AU2008/001475)。

在一个优选实施方案中，本发明采用一种可用于研究ccfDNA甲基化模式的方法——甲基化CpG短串联扩增与测序技术(Methylated CpG Tandems Amplification andSequencing,MCTA-Seq)(Wen L,Li J,Guo H,Liu X,Zheng S,Zhang D,et al.Genome-scale detection of hypermethylated CpG islands in circulating cell-free DNAof hepatocellular carcinoma patients.Cell Res.2015；25:1250–64.)。该方法通过靶向捕获富含CGCGCGG的甲基化CGIs区域(多位于基因表达调控区)，从而实现富集并构建文库，再基于illumina二代测序平台，获得高通量测序数据，而后通过分析获得全基因组甲基化谱。

在一个具体实施方案中，首先亚硫酸氢盐将未甲基化的C转化成U，甲基化的C仍保留为C，区分不同甲基化状态的C。随后加入引物A，与转化后的序列进行互补配对，引物A由三部分组成：随机序列(random sequence,RS)、唯一分子标记(unique molecularidentifier,UMI)以及锚定序列。之后加入引物B，捕获含有甲基化CGCGCGG的序列，引物B由CpG短串联序列CGCGCGG和锚定序列构成。最后加入引物C和D通过锚定序列对与引物B配对的序列进行指数扩增，同时加上测序接头。

附图说明

下面结合附图说明，本发明公开的各个方面及其优势将变得显而易见，从而更容易被理解。

图1显示了结直肠癌与癌旁组织差异甲基化位点。

图2显示了7个新发现的CGI岛以及其中的10个CGCGCGG-CpG区域在结直肠癌患者血浆与正常人血浆以及结直肠癌与癌旁组织中的甲基化的差异。

图3显示了IRF4基因启动子CpG岛中的4个CGCGCGG-CpG区域

图4显示了80个CGCGCGG-CpG在结直肠癌与癌旁组织中的甲基化值与检测灵敏度。

图5显示了80个CGCGCGG-CpG组合区分结直肠癌患者血浆与正常人血浆的灵敏度与特异性。

图6显示了80个CGCGCGG-CpG在结直肠癌患者血浆与正常人血浆的甲基化值，检测效果，及与CEA检测结果比较。

具体实施方式

下面将结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。除非另有说明，份数和百分比以重量计,温度以摄氏度表示。本领域技术人员将理解，下列实施例虽然指出了本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出，所用试剂均可以通过商业途径得到。

一般方法

I.获取样本

获取66例配对的结直肠癌与癌旁组织，包括结直肠癌与癌旁组织各33例。作为训练组，获取73例结直肠患者血浆和70例年龄、性别匹配的无癌志愿者的血浆。作为验证组，获取74例结直肠患者血浆和66例年龄、性别匹配的无癌志愿者的血浆。其中，训练组中有4例样本(2例患者与2例对照)，测试组中有5例样本(3例患者与2例对照)由于唯一比对读数小于10000而被丢弃。

分离血浆，步骤如下：

1)抽取3-10ml外周静脉血，放置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝血管中4℃保存。患者于术前三天，部分患者于术后三天同样抽取外周静脉血。此处EDTA的抗凝血作用非常必要，可以使血液样本稳定保存，并且防止白细胞裂解。体细胞的裂解会增加检测来自正常体细胞基因组的背景，稀释ctDNA的浓度。

2)全部外周血样本在6小时内处理，将血细胞和血浆进行分离。必须严格控制从抽取血液到血浆处理的时间，以及离心的条件，以使最终ctDNA产量最大化。

3)首先以1350g低转速离心血液样本12分钟，分离出血浆、白细胞及血小板、红细胞三层，吸出白细胞及血小板层，弃去红细胞层，将血浆层再次进行1350g离心12分钟，随后13500g高速离心5分钟，进一步去除红细胞和杂质。

4)所有抽提的DNA均利用Qubit或Nanodrop检测浓度并记录。此处不但起到质控作用，以免抽提试剂某特定批次质量不佳，而且对于样品后续定量分析提供数据依据。

5)分离所得的血浆与白细胞分别编号归档并立即冻于-80℃保存。组织样品于手术中收集后仔细用PBS清洗干净，分成小份冻于-80℃保存。此处的白细胞是非常好的体细胞的样本来源，因为与对应的血浆样本来自同一个个体，具有相同的遗传背景，并且可以用于ccfDNA中体细胞基因组背景的验证。

随后，采用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒抽提循环游离DNA，用DNeasy Blood&Tissue试剂盒抽提白细胞DNA和组织样品DNA，具体方法依据说明书试剂公司提供的说明书。

II.扩增与检测CGCGCGG-CpG甲基化标记物

1.步骤一、亚硫酸氢盐处理DNA样品。

采用试剂盒MethylCode^TMBisulfite Conversion Kit(Invitrogen)，并按照制造商提供的说明书进行操作，具体步骤如下：

1.1 DNA样品中掺入0.5％Lambda DNA(Thermo Scientific,SD0021)掺入作为内参，以评估亚硫酸氢盐转化效率。

1.2制备CT转换试剂(CT Conversion Reagent)溶液：从试剂盒中取出CT转换试剂，加入700μl水、50μl重悬缓冲液和300μl稀释缓冲液，室温短时震荡混匀10分钟待其溶解，室温避光保存；

1.3将2ml血浆中提取的DNA样品共40μl加入PCR管中；

1.4将110μl CT转换试剂溶液加入DNA样品，轻弹或用枪头吹打混匀；

1.5将PCR管在一台热循环仪上进行如下程序：98度----10分钟，65度----2.5小时，4度保存(不超过20小时)备用；

1.6将DNA纯化柱放入收集管中，加入600μl结合缓冲液，并加入100ng carriertRNA；

1.7将1.5步骤中的DNA样品加入结合结合缓冲液中，避盖上下颠倒混匀数次；

1.8最大转速(>10,000g)离心30秒，弃过柱液；

1.9加入100μl洗涤缓冲液(已加乙醇)，最大转速离心30秒，弃过柱液；

1.10加入200μl Desulphonation缓冲液，将纯化柱在室温站立15-20分钟；

1.11最大转速离心30秒，弃过柱液；

1.12加入100μl洗涤缓冲液(已加乙醇)，最大转速离心30秒，弃过柱液；

1.13重复1.12一次，将纯化柱放置到一个新的1.5ml离心管中；

1.14加入10μl无菌水，最大转速离心30秒以洗脱DNA；

1.15产物可以用Qubit ssDNA Assay Kit进行DNA定量，作为质量控制。

2.步骤二、使用引物A和DNA聚合酶进行扩增。

2.1将步骤1中得到的DNA在一个PCR管中在冰上配置如下扩增反应体系：

内容	体积
		DNA样品与水	10.5μl
NEBuffer 2	1.5μl
		dNTP(2.5mM)	1.5μl
引物A(5μM)*	1μl
		Klenow(exo-)**	0.5μl
总体积	15μl

*:引物A为以下四种引物的等摩尔混合物，总浓度为5μM：

其中H＝A/T/C，下划波浪线部分为引物的3’端随机序列部分，下划直线部分为引物的5’端锚定序列部分，下划双直线部分为引物的独特分子识别标签序列部分。

**:在2.3步骤中加入

2.2将PCR管放入PCR热循环仪中进行如下程序：95度----2分钟，4度----暂停；

2.3离心，4度13000rpm共1分钟；

2.4在冰上加入0.5μl Klenow片段(exo-)(NEB目录号M0212S)，震荡混匀；

2.5离心，4度13000rpm共1分钟；

2.6在PCR热循环仪中进行如下程序进行1轮扩增反应：4度----50秒，10度----1分钟，20度----4分钟，30度----4分钟，37度----4分钟；

2.7在PCR热循环仪中进行如下程序以灭活Klenow片段：75度----20分钟，4度----暂停；

2.8离心，4度13000rpm共1分钟；

3.步骤三、使用引物B和DNA聚合酶进行扩增。

3.1在一个PCR管中在冰上配置如下扩增反应体系：

*：引物B为：

D＝A/T/G，其中下划波浪线部分为引物的3’端CpG短串联序列部分，下划直线部分为引物的5’端锚定序列部分，下划双直线部分为随机序列部分。

3.2将上述混合物加入2.8的扩增反应产物中，震荡混匀；

3.3离心，4度13000rpm共1分钟；

3.4在PCR热循环仪中进行如下程序：95度---3分钟，50度----2分钟，72度----1分钟，4度----暂停；

3.5离心，4度13000rpm共1分钟；

4.步骤四、使用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行指数扩增。

4.1在一个PCR管中在冰上配置如下扩增反应体系：

内容	体积
		Ex Taq Buffer	3μl
接头引物C(100uM)*	0.6μl
		接头引物D(100uM)**	1.2μl
dNTP(2.5mM)	3μl
		水	22.2μl
总体积	30μl

*：接头引物C：

其中下划直线部分与引物A的5’端部分相同；

**：接头引物D：

其中下划直线部分与引物B的5’端部分相同，下划双直线处为标签序列(Illumina index 9，用不同index标记不同样品)；

4.2将混合物加入3.5的扩增反应产物中，震荡混匀；

4.3离心，4度13000rpm共1分钟；

4.4在PCR热循环仪中进行如下程序：95度----3分钟；

4.5在PCR热循环仪中进行如下程序：95度----30秒，65度----30秒，72度----1分钟，共13个循环；

4.6循环后72℃5分钟，4度暂停。

5.步骤五、片段选择、纯化、进行高通量测序和数据分析。

5.1制备3％琼脂糖凝胶，加入1×SYBR Safe(Invitrogen)；

5.2将4.6的扩增产物在3％琼脂糖凝胶中进行电泳分离；

5.3对凝胶中的DNA进行成像分析；

5.4切胶回收180-250bp的目的片段；

5.5将目的片段进行胶回收纯化(Qiagen，QIAquick Gel Extraction Kit)；

5.6用Fragment Analyzer分析系统(Agilent)检测高通量测序文库插入片段的大小，并利用QPCR对文库的浓度进行绝对定量分析，如果片段正常，直接进入步骤5.12；

5.7回收后的DNA文库如果仍有引物二聚体，则增加额外扩增如下：

内容	体积
		Ex Taq Buffer	5μl
Q-P1(100uM)*	0.25μL
		Q-P2(100uM)**	0.25μL
dNTP(2.5mM)	5μl
		HS Ex Taq	0.5μL
DNA样品与水	39μl
		总体积	50μl

*：引物Q-P1：

5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’其中下划直线部分与引物C的5’端部分相同；

**：引物Q-P2：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA_-3’其中下划直线部分与引物D的5’端部分相同；

5.8在PCR热循环仪中进行如下程序：95度----3分钟；

5.9在PCR热循环仪中进行如下程序：95度----30秒，65度----30秒，72度----1分钟，共6-8个循环；

5.10循环后72℃5分钟，4度暂停。

5.11重复5.1-5.6一次；

5.12在Illumina HiSeq2000/2500测序仪上，按照读长为100bp的双末端测序，对文库进行高通量测序分析，获得大约1千万条原始测序数据；

5.13数据分析：首先去除任何接头序列和低质量序列，然后应用Bismark软件将数据与参考人类基因组序列(Hg19)进行比对，并以此为基础进行后续的生物信息学分析。

III.根据CGCGCGG-CpG标记物及其组合的甲基化程度判断结直肠癌倾向或者患有 结直肠癌

我们鉴定到80个CGCGCGG-CpG甲基化标记物能够有效地检测结直肠癌。这80个CGCGCGG-CpG甲基化标记物的检测效果明显优于目前临床上常用的血清癌胚抗原CEA检测。

表2显示了80个CGCGCGG-CpG区域在结直肠癌组织、癌旁正常肠粘膜组织、结直肠癌患者血浆和正常对照着血浆中的甲基化值。

Tcrc：结直肠癌组织，Tnm：癌旁正常肠粘膜组织，Pcrc：结直肠癌患者血浆，Pn：正常对照着血浆。甲基化值的表示形式为全部样本的平均值(标准差)。

表2

图1显示结直肠癌与癌旁组织MCTA-Seq检测结果的火山图，共发现2410个在结直肠癌组织中异常高甲基化的CGCGCGG(双尾Mann-Whitney-Wilcoxon(MWW)检验,FDR<0.05,平均甲基化程度差别2倍以上)。

图2显示7个结直肠癌DNA甲基化区域(CGI)，包括基因EMBP1，APBB1IP，ZNF671，CHST11中的CGI和INTERGENIC CGI16622，INTERGENIC CGI22834和INTERGENIC CGI25189，这些CGI的详细位置起止坐标见表1，其中的每一个相对于对照而言均显示显著较高的甲基化水平。

图3显示IRF4基因启动子CpG岛中的4个CGCGCGG-CpG区域及其甲基化信息。上方图显示IRF4基因启动子CpG岛(CpG island)区域，其中三角形表示5个CGCGCGG位点。下方图横坐标表示每个CGCGCGG下游的CpG位点，纵坐标显示CGCGCGG至CpG区域在结直肠癌组织中的甲基化值的中值(Methylation of tissue,MePM,Methylated reads per millionuniquely-mapped reads)，以及这些CGCGCGG-CpG在正常人血浆中的甲基化阳性检测频率(Frequency of plasma,％),FMMs:fully methylated molecules，全甲基化分子。AllMolecules:全部分子。全甲基化分子比全部分子具有更好地检测效果。5个位点中，第2至5个位点被选入80个CGCGCGG-CpG，其在结直肠癌组织中具有高甲基化值，而在正常人血浆中具有低甲基化阳性检测频率，虚线表示相应的CpG位点。

图4显示80个CGCGCGG-CpG在结直肠癌与癌旁组织中的甲基化情况与检测结直肠癌组织的灵敏度。(A)热图80个CGCGCGG-CpG区域能有效地区分结直肠癌与癌旁组织。Tcrc：结直肠癌组织，Tnm：癌旁正常结直肠粘膜组织。这些CGCGCGG-CpG在大多数结直肠癌组织中高度甲基化，表明癌症异质性对这些标记物的检测灵敏度影响较小。图(B)显示，为了评估这80个CGCGCGG-CpG的检测灵敏度，将全部结直肠癌组织样品梯度稀释至人白细胞DNA样品之中，结果表明，结直肠癌的检测率低至0.016％。

图5显示80个CGCGCGG-CpG区分结直肠癌患者血浆与正常人血浆的效果。图5A,B显示训练组结果。与对照组相比，早期和晚期结直肠癌患者中80个标志物的阳性计数显着增加(图5A)。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示，80个CGCGCGG-CpG组的曲线下面积(AUC)值为0.881,I，II和III/IV期肿瘤患者分别为0.814,0.902和0.880.902(图5B)。采用3个阳性计数(≥3)的阈值，I期，II期，III/IV期和所有时期肿瘤患者的阳性率分别为65％，76％和81％，特异性为94％。图5C,D显示验证组结果。对于I，II，III/IV期和所有阶段，AUC值分别为0.853、0.886、0.904和0.887(图5D)。对于I，II，III/IV期和所有阶段，灵敏度分别为62％，81％，85％和79％，特异性为86％。联合训练组和验证组，80个CGCGCGG-CpG对于在早期(I期和II期)结直肠癌患者的阳性检出率为74％，特异性为90％。

图6显示80个CGCGCGG-CpG在结直肠癌患者血浆与正常人血浆的甲基化值，检测效果，及与癌胚抗原CEA检测结果比较。CEA(≥5.0ng/mL)对I期，II期和III期/IV期的灵敏度分别为28％，35％和36％。因此，采用80个CGCGCGG-CpG的甲基化检测显著优于CEA检测。

尽管已示出和描述了说明性实施方案，但本领域技术人员将理解，上述实施方案不应当被理解为对本发明内容进行限制，并且可在不背离本发明内容的精神、原则和范围的情况下进行变化、替换和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

北京大学第三医院

<120> 结直肠癌的DNA甲基化标志物以及利用其检测结直肠癌的方法和试剂盒

<130> IDC180049

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttccctaca cgacgctctt ccgatcthhh hhhhhcgch 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttccctaca cgacgctctt ccgatcthhh hhhhcghch 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttccctaca cgacgctctt ccgatcthhh hhhcghhch 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttccctaca cgacgctctt ccgatcthhh hhcghhhch 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctddddcg cgcgg 45

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<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caagcagaag acggcatacg agatctgatc gtgactggag ttcagacgtg tgct 54

Claims (1)

1.检测CGCGCGG-CpG区域甲基化的试剂在制备用于评估个体中结直肠癌倾向性或检测结直肠癌的试剂中的用途，其中所述CGCGCGG-CpG区域是下表中序号1-80所示的80个CGCGCGG-CpG区域，其中相对于对照而言，一个或多个所述区域的较高甲基化水平指示所述个体具有结直肠癌倾向性或患有结直肠癌：

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