CN113038951B - 治疗肌萎缩侧索硬化的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了治疗有需要的受试者中的ALS的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的至少两种代谢产物。

Description

治疗肌萎缩侧索硬化的方法
相关申请
本申请要求于2018年9月20日提交的以色列专利申请号261908、以及于2019年6月27日提交的以色列专利申请号267752的优先权利益，所述专利申请的内容整体引入本文作为参考。
上述申请的内容全部整体引入作为参考，如同在本文中完全阐述一样。
序列表声明
与本申请的提交同时递交，包含22,138个字节，于2019年9月19日创建，名称为78818 Sequence Listing.txt的ASCII文件引入本文作为参考。
技术领域和背景技术
在其一些实施方案中，本发明涉及治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法，并且更具体地但非排他地，涉及用细菌群体或其代谢产物的治疗。
肌萎缩侧索硬化(ALS)是进行性、特发性神经退行性病症，其特征在于运动神经元的过早死亡和距诊断3-5年的平均存活率。大多数ALS病例为散发性的(sALS)，而10-20%的病例为家族性的(fALS)，并且由基因如超氧化物歧化酶1 (SOD1)中的遗传突变驱动。正在广泛努力开发ALS靶向药物如依达拉奉，但到目前为止，还没有一种药物已产生最终有效的疾病缓解活性。尽管过去的流行病学研究并未鉴定与ALS发生和严重程度相关联的明确环境因素，但中枢神经系统(CNS)越来越多地被公认为受周围信号的影响，所述周围信号例如循环小分子量代谢产物，其可能从GI道吸收到血流并且通过脑血屏障(BBB)到达CNS，在其中所述代谢产物可以调节神经元和其它常驻细胞中的代谢、转录和表观遗传程序。
肠道微生物组，影响多重宿主生理功能的微生物生态系统，是此类潜在生物活性的CNS疾病调节代谢产物的巨大潜在来源。事实上，越来越多的证据提示了，肠道微生物组的组成和功能在神经性障碍的发病机制中起重要作用，所述神经性障碍如孤独症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化和癫痫发作。通过肠道微生物组分泌、消耗或修饰的代谢产物显示参与神经元传递、突触可塑性、髓鞘形成和宿主复杂行为。一些线索提示了，宿主-肠道微生物组界面可能潜在地涉及ALS的过程。在2月龄的SOD1-Tg小鼠中报告了破坏的肠屏障，伴随着较低水平的结肠紧密连接蛋白闭锁小带蛋白(Zonula occludens)-1 (ZO-1)和粘附蛋白E-钙粘着蛋白，潜在地导致标志在于产生丁酸盐的细菌溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)减少的生态失调。尽管微生物组评价在单个时间点且以3只动物/组执行，但对SOD1-Tg小鼠的丁酸盐施用改变了其微生物组组成，从而妨碍了在这种设置下生态失调的范围、重要性和机制的准确评价。ALS患者的16S rDNA分析产生了相矛盾的结果，其中一项研究指出与5个健康对照相比，6个ALS患者中的生态失调配置，而另一项研究显示了在25个ALS患者与32个健康对照之间没有明显的组成差异。在这种设置下，没有执行直接的功能性微生物组调查。
背景技术包括Richard Bedlack&The ALSUntangled Group (2018)ALSUntangled 42: Elysium health’s “basis”，AmyotrophicLateral Sclerosis andFrontotemporal Degeneration，19:3-4,317-319，DOI: 10.1080/21678421.2017.1373978；以及Harlan等人，2016，The Journal of Biological Chemistry291，10836-10846。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的ALS的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的至少两种代谢产物，从而治疗ALS，其中所述至少两种代谢产物中的至少一种选自4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、烟酰胺、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC (P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE + 9-HODE。
根据本发明的一个方面，提供了至少两种代谢产物用于治疗ALS的用途，其中所述至少两种代谢产物中的至少一种选自4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、烟酰胺、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC(P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE +9-HODE。
根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的ALS的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的益生菌，从而治疗ALS，所述益生菌包含选自以下的细菌群体：嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌、Anaerostipes hadrus、嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)、厌氧原体属、普雷沃氏菌属、Distanosis、副拟杆菌属、理研菌科、另枝菌属、Candidatus Arthromitus、伊格尔兹氏菌属、颤杆菌属、罕见小球菌属和乳杆菌属。
根据本发明的一个方面，提供了益生菌用于治疗ALS的用途，其中所述益生菌包含选自以下的细菌群体：嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌、Anaerostipes hadrus、嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)、厌氧原体属、普雷沃氏菌属、Distanosis、副拟杆菌属、理研菌科、另枝菌属、Candidatus Arthromitus、伊格尔兹氏菌属、颤杆菌属、罕见小球菌属和乳杆菌属。
根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的ALS的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的药剂，从而治疗ALS，所述药剂选择性地减少受试者的肠道微生物组中选自以下的细菌群体的量：大肠杆菌、柔嫩梭菌、活泼瘤胃球菌、系结梭菌、鲍氏梭菌、脆弱拟杆菌、Catenibacterium mitsuokai、齿双歧杆菌、巨球菌属、Parasutterella excrementihominis、伯克氏菌目细菌、多枝梭菌、咽峡炎链球菌、Flavonifractor_ plautii、史氏甲烷短杆菌、肠氨基酸球菌、扭链瘤胃球菌、瘤胃球菌属、双歧杆菌属、红蝽杆菌科、拟杆菌属、副拟杆菌属、S24_7、梭菌科、flavefaciens、脱硫弧菌科、Allobaculum、萨特氏菌属、螺杆菌科、粪球菌属、颤螺菌属。
根据本发明的一个方面，提供了药剂用于治疗ALS的用途，所述药剂选择性地减少选自以下的细菌群体的量：大肠杆菌、柔嫩梭菌、活泼瘤胃球菌、系结梭菌、鲍氏梭菌、脆弱拟杆菌、Catenibacterium mitsuokai、齿双歧杆菌、巨球菌属、Parasutterella excrementihominis、伯克氏菌目细菌、多枝梭菌、咽峡炎链球菌、Flavonifractor_ plautii、史氏甲烷短杆菌、肠氨基酸球菌、扭链瘤胃球菌、瘤胃球菌属、双歧杆菌属、红蝽杆菌科、拟杆菌属、副拟杆菌属、S24_7、梭菌科、flavefaciens、脱硫弧菌科、Allobaculum、萨特氏菌属、螺杆菌科、粪球菌属、颤螺菌属。
根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的ALS的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的选自以下的代谢产物：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC (P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE +9-HODE，从而治疗ALS。
根据本发明的一个方面，提供了选自以下的代谢产物用于治疗ALS的用途：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC (P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE + 9-HODE。
根据本发明的一个方面，提供了诊断受试者的ALS的方法，其包括分析受试者的微生物代谢产物，其中与健康受试者中的微生物代谢产物的丰度相比，选自以下的微生物代谢产物的丰度的统计学上显著的减少指示ALS：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC (P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE + 9-HODE，和/或与健康受试者中的微生物代谢产物的丰度相比，选自牛磺胆酸盐的微生物代谢产物的丰度的统计学上显著的增加指示ALS。
根据本发明的一个方面，提供了诊断受试者的ALS的方法，其包括分析受试者的微生物组中的瘤胃球菌属的量和/或活性，其中与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，瘤胃球菌属的丰度和/或活性中的统计学上显著的增加指示ALS。
根据本发明的实施方案，至少两种代谢产物中的至少一种选自烟酰胺、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐和肉桂酸盐。
根据本发明的实施方案，至少两种代谢产物中的至少一种选自4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、烟酰胺、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐和1-棕榈酰基-2-十二碳六烯酰基-GPC。
根据本发明的实施方案，至少两种代谢产物选自4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、烟酰胺、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐和1-棕榈酰基-2-十二碳六烯酰基-GPC。
根据本发明的实施方案，至少两种代谢产物中的至少一种是烟酰胺。
根据本发明的实施方案，至少两种代谢产物中的至少一种包含在细菌群体中。
根据本发明的实施方案，细菌群体选自嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌、Anaerostipes hadrus、嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)、厌氧原体属、普雷沃氏菌属、Distanosis、副拟杆菌属、理研菌科、另枝菌属、Candidatus Arthromitus、伊格尔兹氏菌属、颤杆菌属、罕见小球菌属和乳杆菌属。
根据本发明的实施方案，细菌群体包含嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)。
根据本发明的实施方案，细菌群体包含嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌和Anaerostipes hadrus。
根据本发明的实施方案，细菌群体选自瘤胃球菌属、脱硫弧菌科、Allobaculum、萨特氏菌属、螺杆菌科、粪球菌属和颤螺菌属。
根据本发明的实施方案，细菌群体选自选自大肠杆菌、柔嫩梭菌、活泼瘤胃球菌、系结梭菌、鲍氏梭菌、脆弱拟杆菌、Catenibacterium mitsuokai、齿双歧杆菌、巨球菌属、Parasutterella excrementihominis、伯克氏菌目细菌、多枝梭菌、咽峡炎链球菌、Flavonifractor_plautii、史氏甲烷短杆菌、肠氨基酸球菌和扭链瘤胃球菌。
根据本发明的实施方案，细菌群体包含瘤胃球菌属。
根据本发明的实施方案，瘤胃球菌属包含扭链瘤胃球菌或活泼瘤胃球菌。
根据本发明的实施方案，药剂是抗生素。
根据本发明的实施方案，药剂是细菌噬菌体。
根据本发明的实施方案，瘤胃球菌属包含扭链瘤胃球菌或活泼瘤胃球菌。
根据本发明的实施方案，该方法进一步包括分析选自以下的至少一种细菌的量和/或活性：大肠杆菌、柔嫩梭菌、系结梭菌、鲍氏梭菌、脆弱拟杆菌、Catenibacterium mitsuokai、齿双歧杆菌、巨球菌属、Parasutterella excrementihominis、伯克氏菌目细菌、多枝梭菌、咽峡炎链球菌、Flavonifractor_plautii、史氏甲烷短杆菌和肠氨基酸球菌，其中与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，细菌的丰度的统计学上显著的增加指示ALS。
根据本发明的实施方案，该方法进一步包括分析选自以下的至少一种细菌的量和/或活性：嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌、Anaerostipes hadrus，其中与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，细菌的丰度的统计学上显著的减少指示ALS。
根据本发明的实施方案，分析包括分析受试者的微生物组的样品。
根据本发明的实施方案，微生物组选自肠道微生物组、口腔微生物组、支气管微生物组、皮肤微生物组和阴道微生物组。
根据本发明的实施方案，微生物组是肠道微生物组。
根据本发明的实施方案，样品包含粪便样品。
根据本发明的实施方案，分析在受试者的血液样品中实现。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了示例性的方法和/或材料，但与本文描述的那些类似或等价的方法和材料，可以用于本发明的实施方案的实践或测试中。在冲突的情况下，以专利说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不预期必然是限制性的。
附图说明
参考附图，仅作为示例，在本文中描述了本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所示出的细节是作为示例并且用于本发明的实施方案的说明性讨论的目的。在这方面，结合附图进行的描述对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以如何实践本发明的实施方案。
在附图中：
图1A-K. 抗生素治疗恶化ALS小鼠模型中的运动症状。(A)实验设计。通过跨越疾病过程的行为(B)转棒、(C)吊线抓握测试和(D)神经学评分的运动症状评估。*P<0.05，**P<0.005，曼怀二氏U检验。实验重复3次(N=5-10只小鼠)。(E) 140日龄的水和Abx治疗的SOD1-Tg小鼠的组织学图像和(F)脊髓中的下运动神经元的定量。*P<0.05，曼怀二氏U检验。在疾病进展自始至终，在水和Abx治疗的SOD1-Tg小鼠之间的相应区域中的(G) T2图和(H-1) T2弛豫时间的定量。**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。实验重复两次(N=5只小鼠)。(J) GF (N=14)和SPF (N=17) SOD1-Tg小鼠的存活。**P<0.005，时序检验(log-ranktest)。实验重复两次(K)。Abx和水治疗的TDP43-Tg (每组中的N=10)小鼠的存活。****P<0.0001，时序检验。实验重复两次。
图2A-H. 与WT同窝对照相比，SOD1-Tg小鼠发展早期肠道微生物组组成和功能差异。在(A)第40天(症状发生前)，(B)第100天(疾病发作)和(C)第140天(晚期疾病)时的加权UniFrac PCoA。实验重复3次(每组中的N=6只小鼠)。(D)在疾病进展过程中，WT和SOD1-Tg大便样品通过肠道微生物组宏基因组学鸟枪法测序获得的物种水平分类群概括。(E) WT和SOD1-Tg微生物组的KEGG条目的PCA。p=1.57x10-14，斯皮尔曼相关系数。色氨酸代谢的细菌基因丰度的(F)图示和(G)热图。(H)烟酰胺和烟酸盐生物合成途径的细菌基因丰度的热图。N=6只小鼠，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。
图3A-H. 嗜粘蛋白艾克曼氏菌定殖改善SOD1-Tg小鼠中的运动退化并增加寿命。(A)随着时间过去，SOD1-Tg和WT大便的AM相对丰度(16S rDNA测序)的线性回归，以及(B)粪便DNA提取物(N=6小鼠)中的AM 16S基因拷贝的qPCR。通过(C)转棒、(D)吊线抓握测试和(E)神经学评分指示的，用AM治疗的SOD1-Tg和WT小鼠的运动功能。在140日龄的PBS和AM治疗的SOD1-Tg小鼠中的(F)组织学图像和(G)脊髓运动神经元定量。*P<0.05，**P<0.005，曼怀二氏U检验。(H) PBS-、AM-、产黑普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica) (PM)和加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) (LG)治疗的小鼠的存活，***P<0.0005，时序检验。实验重复6次(N=5-26只小鼠)。
图4A-F. 嗜粘蛋白艾克曼氏菌治疗与SOD1-Tg小鼠中增强的烟酰胺生物合成相关。(A)用AM治疗的SOD1-Tg小鼠(右上象限N=7-8只小鼠)中显著增加的血清代谢产物。(B)用AM或PBS治疗的SOD1-Tg和WT小鼠中的血清水平烟酰胺途径代谢产物。(C)细菌培养物中的烟酰胺水平。**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。在(D)第100天和(E)第140天时，用AM或PBS治疗的SOD1-Tg和WT小鼠的CSF烟酰胺水平。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。(F)在AM治疗的SOD1-Tg粪便样品中，微生物组衍生的烟酰胺产生基因的图示。在AM治疗(N=7-8只小鼠)之后，所指示的基因的丰度增加，曼怀二氏U秩和检验。
图5A-G. 烟酰胺治疗改善SOD1-Tg小鼠中的ALS进展。NAM和媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠(N=10只小鼠)中的(A)CSF和(B)血清NAM水平。通过(C)转棒、(D)吊线抓握测试和(E)神经学评分指示的，使用皮下渗透泵，NAM或媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠的运动表现。*P<0.05***P<0.0005，曼怀二氏U检验。实验重复3次(N=10只小鼠)。(F) NAM和媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠的存活评价，p=0.1757，时序检验。(G)用WT或nadA大肠杆菌接种的Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠的神经学评分。***P<0.0005，曼怀二氏U检验。
图6A-E. 揭示AM和NAM治疗的潜在下游运动神经元调节机制。(A)在NAM治疗的SOD1-Tg小鼠(N=10只小鼠)的脊髓中的FDR校正的差异表达基因的热图。(B)在AM和NAM治疗的SOD1-Tg小鼠之间，脊髓转录物的log2倍数变化的斯皮尔曼相关性。(C) NAM治疗之后的显著差异表达的基因与分类成4个神经病理学组的KOG数据库的比较。(D) NAM治疗和(E)AM治疗的SOD1-Tg小鼠的脊髓转录物在生物学过程、分子功能和细胞组分内的FDR校正的基因集合富集分布。
图7A-F. 微生物组衍生的烟酰胺代谢在ALS患者中是受损的。通过来自ALS患者(N=32)和健康对照(家庭成员，N=27)的大便样品的宏基因组学鸟枪法测序获得的，(A)细菌物种组成的PCA(对于PC1p=3.3x10-6，斯皮尔曼相关系数)或(B) KEGG直向同源物(KO)注释的细菌基因(对于PC1p=2.8x10-9，斯皮尔曼相关系数)。(C) ALS和健康大便样品中的烟酰胺途径的微生物组相关基因的KO相对丰度。(D)通过非靶向代谢物组学获得的ALS患者和健康个体中的色氨酸/烟酰胺途径的血清代谢产物水平。ALS患者(对于血清N=41，且对于CSF N=12)和健康对照(对于血清N=21，且对于CSF N=17)的(E)血清和(F) CSF NAM水平，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。
图8A-I. 抗生素治疗恶化SOD1-Tg小鼠中的ALS症状。从40日龄直到实验终点，SOD1-Tg和WT同窝对照小鼠未进行治疗，或用在其饮用水中的广谱Abx进行治疗。在第60、80、100、120和140天时，通过(A、D和G)转棒、(B、E和H)吊线抓握测试和(C、F和I)神经学评分，来评价小鼠的运动表现。(N=5-10只小鼠)，*P<0.05，**P<0.005，曼怀二氏U检验。
图9A-P. 抗生素治疗对SOD1-Tg小鼠中的ALS症状的作用。通过(A)转棒、(B)吊线抓握测试和(C)神经学评分指示的，在治疗的SOD1-Tg和WT中，随着时间过去的运动功能的线性回归。(D)在ALS自始至终，在水和Abx治疗的SOD1-Tg小鼠之间的脑区域的MRI及其相应的(E-I) T2弛豫时间定量。*P<0.05，**P<0.005，****P<0.00005，曼怀二氏U检验。(J)第100-101天，经过46小时的时期的室笼运动分析(N=5只小鼠)。*P=0.03。在水和Abx治疗的SOD1-Tg小鼠之间，在第50天(O)和第140天(P)时，小肠(K-L)、结肠(M-N)、脊髓中的免疫细胞亚群的分布。(N=5只小鼠)，曼怀二氏U检验。
图10A-D. GF相对于SPF-SOD1-Tg小鼠和Abx治疗的TDP43-Tg小鼠的存活。在第115天时自发定殖的SPF-和GF-SOD1-Tg小鼠的存活。*P<0.05，时序检验。实验进行两次：(A) (N=13只SPF-和6只GF SOD1-Tg小鼠)和(B) (N=5只SPF-和8只GF-SOD1-Tg小鼠)。(C-D) Abx和水治疗的TDP43-Tg小鼠的存活，**P<0.005，****P<0.0001，时序检验。实验进行两次(每组中的N=5-10只小鼠)。
图11A-O. 跨越ALS进展，在SOD1-Tg小鼠模型中的微生物组成动力学。(A)在ALS过程中，在个别WT和SOD1-Tg小鼠中的细菌门的分类群概括，以及(B)通过大便样品的16SrDNA测序获得的属(平均时间点)。(N=6只小鼠)，实验重复3次。(C)跨越疾病进展，在SOD1-Tg和WT小鼠之间显著差异表现的属的相对丰度。(D-M)在WT和SOD1-Tg大便之间，在ALS进展过程中，代表性细菌相对丰度变化的FDR校正的线性回归比较。斯皮尔曼相关系数。(N)随着时间过去，SOD1-Tg和WT微生物组的α多样性。实验重复3次(每组中的N=6只小鼠。(O)从SOD1-Tg和WT小鼠(N=5- 6只小鼠)的大便样品中提取的1 ng DNA中，基于qPCR的总16S拷贝数定量。
图12A-M. 跨越ALS进展，在Abx治疗的SOD1-Tg小鼠模型中的微生物组成动力学。(A)在ALS过程期间，个别Abx治疗的WT和SOD1-Tg小鼠中的细菌门的分类群概括。在慢性Abx方案下，在疾病的(B)第47天(预先Abx)和(C-G)第60-140天时的加权的UniFrac PCoA。(H-M)在ALS过程期间，Abx治疗的WT和SOD1-Tg小鼠的显著富集的细菌属的FDR校正的火山图。
图13A-I. 跨越ALS进展的Ex-GF SOD1-Tg小鼠模型中的微生物自发定殖。(A)在ALS过程期间，经历自发细菌定殖的个别Ex-GF WT和SOD1-Tg中的细菌属的分类群概括。(B-E)在自发定殖之后的第4、5、53和63天时，Ex-GF WT和SOD1-Tg小鼠的加权的UniFrac PCoA。(F-1)在自发定殖之后的第4、5、53和63天时，在ALS过程期间，Ex-GF WT和SOD1-Tg的显著富集的细菌属的FDR校正的火山图。
图14A-E. SOD1-Tg小鼠模型中的受动物饲养所(vivarium)影响的生态失调。在4、6、8和12周龄时，在不同的无障碍动物饲养所(动物饲养所B，Ben-Gurion University)中饲养的WT和SOD1-Tg小鼠的(A)加权的UniFrac PCoA和(B) α多样性。在动物饲养所A(Weizmann Institute of Science)和动物饲养所B (Ben-Gurion University)下的80日龄的WT小鼠中的细菌属的(C)个别和(D)平均分类群概括。(E)在两种设施中的WT动物中的前20个高度丰富的微生物组属的丰度百分比概括，以及其在SOD1-Tg动物中的相应丰度。比较已执行一次，每组中的(N=5-8)只小鼠。
图15A-N. WT和SOD1-Tg粪便微生物组之间的宏基因组学差异。(A)通过宏基因组学鸟枪法测序获得的，WT和SOD1-Tg小鼠的肠道微生物组的物种水平下的细菌组成的PCoA图和(B)分类群概括表示。实验重复两次(N=6只小鼠)。(C-N)在WT和SOD1-Tg大便之间，在ALS进展过程中，代表性细菌相对丰度变化的FDR校正的线性回归比较。斯皮尔曼相关系数。
图16A-L. SOD1-Tg和WT同窝仔畜中的代谢测量。60日龄的WT (N=8)和SOD1-Tg (N=7)小鼠的食物摄取(A、B)、水消耗(C、D)、呼吸交换率(E、F)、O2消耗(G、H)、产热(I)、运动(J)和速度(K、L)的代表性记录(A、C、E、G、I、J、K)和定量(B、D、F、H、L)。
图17A-L. Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠由所选择的ALS相关微生物组菌株的单一定殖。通过(A)转棒、(B)吊线抓握测试和(C)神经学评分指示的，用PBS、迟缓埃格特菌(Eggerthella lent) (EL)、Coprobacillus cateniformis(CC)、戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii) (PG)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus) (LM)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis) (PD)、加氏乳杆菌(LG)、产黑普雷沃氏菌(PM)或嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM，ATCC 835)治疗的，Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠的运动功能。(D-F)用PBS或Eisenbergiella tayi(ET)或(G-I) Subdoligranulum variabile (SV)治疗的，Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠的运动功能。(J-L)用PBS、LM、PD、LG、PM或AM治疗的，Abx预治疗的WT同窝对照的运动功能。(N=6-8只小鼠) *P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。
图18A-M. 扭链瘤胃球菌单一定殖对SOD1-Tg小鼠中的ALS进展的作用。(A) SOD1-Tg和WT大便(N=6只小鼠)的扭链瘤胃球菌(RT)相对丰度(16S rDNA测序)的线性回归。用PBS和RT治疗的Abx预治疗的WT和SOD1-Tg (N=5-9只小鼠)的(B)转棒、(C)吊线抓握测试和(D)神经学评分，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。140日龄的PBS和RT治疗的SOD1-Tg小鼠的脊髓运动神经元的(E)组织学图像和(F)定量。(G)在疾病自始至终，PBS和RT治疗的SOD1-Tg小鼠之间的脑区域及其相应的(H-M) T2弛豫时间定量。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，****P<0.00005，曼怀二氏U检验。实验重复两次(N=5只小鼠)。
图19A-I. 扭链瘤胃球菌治疗恶化SOD1-Tg小鼠中的ALS症状。通过(A、D和G)转棒、(B、E和H)吊线抓握测试和(C、F和I)神经学评分，在三个生物重复中，用扭链瘤胃球菌(RT)治疗的Abx预治疗的SOD1-Tg和WT同窝仔畜的评价。(N=5-10只小鼠)，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。
图20A-O. 嗜粘蛋白艾克曼氏菌治疗减轻SOD1-Tg小鼠中的ALS症状。从60日龄直到实验终点，Abx预治疗的SOD1-Tg和WT同窝对照小鼠用AM (ATCC 835)或作为媒介物的PBS进行经口治疗。在第60、80、100、120和140天时，通过(A、D、G、J和O)转棒、(B、E、H、K和M)吊线抓握测试和(C、F、I、L和N)神经学评分，来评价小鼠的运动表现。(N=5-26只小鼠)，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，曼怀二氏U检验。
图21A-L. 嗜粘蛋白艾克曼氏菌治疗对SOD1-Tg小鼠中的ALS表现和微生物组组成的作用。(AD)在第100和140天，PBS和AM (ATCC 835)治疗的Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠中的T2弛豫时间定量。***P<0.0005，****P<0.00005，曼怀二氏U检验。(E)在用PBS、AM、产黑普雷沃氏菌(PM)或加氏乳杆菌(LG)治疗的WT和SOD1-Tg中，在120天的系统FITC-右旋糖酐测量。(F)用PBS或AM治疗的SOD1-Tg小鼠中的细菌物种组成的PCoA。(G)用PBS或AM治疗的SOD1-Tg的细菌属概括。用PBS或AM治疗的(H) SOD1-Tg或(I)WT小鼠中的AM相对丰度。*P<0.05，***P<0.0005，****P<0.00005，曼怀二氏秩和检验。跨越140日龄的AM或PBS治疗的WT和SOD1-Tg小鼠的GI道的粘膜和腔内样品中，嗜粘蛋白艾克曼氏菌16S拷贝数的(I)个别和(J)基于qPCR的平均倍数变化。用PBS或AM治疗的(K) SOD1-Tg或(L) WT小鼠的细菌属概括。
图22A-C. 嗜粘蛋白艾克曼氏菌(ATCC 2869)治疗减轻SOD1-Tg小鼠中的ALS症状。从60日龄直到实验终点，Abx预治疗的SOD1-Tg和WT同窝对照小鼠用AM (ATCC 2869)或作为媒介物的PBS进行经口治疗。在第60、80、100、120和140天时，通过(A)转棒、(B)吊线抓握测试和(C)神经学评分，来评价小鼠的运动表现。(N=8-10只小鼠)，**P<0.005，曼怀二氏U检验。
图23A-J. 嗜粘蛋白艾克曼氏菌治疗改变SOD1-Tg小鼠的粘液特性。140日龄的(A)PBS-和(B) AM- (BAA-835) Abx预治疗的WT和SOD1-Tg小鼠的远端结肠粘膜的免疫组织化学评价。DNA用Sytox绿(绿色)进行染色，而粘液用抗MUC2C3抗血清和山羊抗Ig (红色)进行染色。上皮和外部粘液/腔内细菌之间的非染色区域是内部粘液层，允许指向其中的细菌。(C)总粘液蛋白质组学概况和(D) AM相关肽的热图表示，以及(E-J)关键代表性粘液组分的定量。(N=4-8只小鼠)，曼怀二氏U检验。
图24A-G. 血清代谢物组学谱受ALS SOD1-Tg小鼠中的抗生素或AM治疗影响。100日龄的(A)首次用于实验的SOD1-Tg及其WT同窝仔畜、(B)水或Abx治疗的SOD1-Tg小鼠、(C)PBS或AM治疗的SOD1-Tg小鼠的血清代谢产物的热图表示。(D)通过其肠道微生物组起源的潜力，通过SOD1-Tg小鼠中的Abx治疗显著改变的前六种血清代谢产物的评分。通过(E)转棒、(F)吊线抓握测试和(G)神经学评分指示的，使用皮下渗透泵，苯酚硫酸盐或媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠的运动表现。
图25A-B. 色氨酸和烟酰胺代谢受ALS SOD1-Tg小鼠中的抗生素或AM治疗影响。(A)水和Abx治疗或(B)PBS和AM治疗的100日龄的SOD1-Tg小鼠的色氨酸代谢的非靶向代谢物组学评价。
图26A-I. 烟酰胺治疗改善SOD1-Tg小鼠中的ALS进展。通过(A、D和G)转棒、(B、E和H)吊线抓握测试和(C、F和I)神经学评分指示的，使用皮下渗透泵，NAM或媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠的运动表现(N=10只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，****P<0.00005，曼怀二氏U检验。
图27A-C. SOD1-Tg小鼠用肠道共生体的单一接种损害NAM产生。(A) WT或△nadA大肠杆菌培养物中的烟酰胺水平。***P<0.0005，曼怀二氏U检验。通过(B)转棒和(C)吊线抓握测试指示的，WT或△nadA大肠杆菌接种的Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠的运动表现。
图28. NAM差异表达与核呼吸因子1 (NRF-1)相关的基因。通过RNA-seq分析获得的脊髓转录物的表示，所述脊髓转录物在SOD1-Tg小鼠的AM和NAM治疗后类似地改变，并且共享核呼吸因子1 (NRF-1)转录因子的结合位点。使用G:Profiler平台进行分析85。
图29A-B. ALS患者中的不同肠道微生物组组成和血清代谢产物谱。(A)通过宏基因组学鸟枪法测序获得的，健康家庭成员和ALS患者的肠道微生物组的物种水平下的分类群概括表示，以及在ALS患者和健康对照个体之间的前20个改变的细菌物种的表。(B)通过非靶向代谢物组学获得的，健康个体(N=13)和ALS患者(N=23)之间的前97种差异表示的血清代谢产物。
具体实施方式
在其一些实施方案中，本发明涉及治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法，并且更具体地但非排他地，涉及用细菌群体或其代谢产物的治疗。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解，本发明在其应用中并不一定限于下述描述中阐述的或由实施例例示的细节。本发明能够具有其它实施方案，或者能够以各种方式进行实践或执行。
肌萎缩侧索硬化(ALS)是特发性、遗传影响的神经退行性病症，其可变发作和临床过程可能由未知的环境因素引起。
本发明人目前已证实，在最常用的ALS小鼠模型(SOD1-Tg小鼠模型)中，广谱抗生素诱导的肠道微生物组耗竭导致疾病症状恶化(图1A-K)。此外，甚至在运动性临床症状发作之前，SOD1-Tg小鼠的肠道微生物组组成和宏基因组学功能与WT同窝仔畜相比是改变的，导致这些小鼠中明显改变的全身代谢物组学谱(图2A-H)。
几个微生物物种被鉴定为与SOD1-Tg小鼠中的疾病严重程度相关联或反相关。其中，SOD1-Tg由嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)的厌氧单一培养物的抗生素后定殖，导致改善的运动症状和存活(图3A-H)，而由瘤胃球菌属的定殖与疾病症状恶化相关(图14A-M和15A-I)。此外，烟酰胺(NAM)生物合成途径的关键AM衍生的微生物基因在AM补充的SOD1-Tg小鼠的肠道微生物组中富集，而在这种设置下，NA及其生物合成中间产物在AM治疗的SOD1-Tg小鼠的脑脊髓液(CSF)和血清中富集(图4A-F)。此外，SOD1-Tg小鼠的全身NAM补充诱导了运动神经元症状中的临床改善，加上独特的有益的CNS转录组修饰(图5A-F和6A-E)。在人中，与健康的家庭对照相比，在ALS患者中注意到生态失调的肠道微生物组宏基因组学配置、偏向的血清代谢物组学谱、以及改变的血清和CSF NAM水平(图7A-E)。总之，这些结果提示了，在ALS动物模型中以及潜在地在人中，不同的肠道共生体、其调节的代谢产物和运动表现之间可能存在调节联系。
因而，本教导建议使用肠道微生物组相关调节剂用于治疗ALS。
因此，根据本发明的第一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的ALS的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的选自以下的代谢产物：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC (P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE + 9-HODE，从而治疗ALS。
如本文使用的，术语“治疗”包括取消、基本上抑制、减慢或逆转ALS的进展，基本上改善ALS的临床或美学症状，或者基本上预防ALS的临床或美学症状的出现。
如本文使用的，术语“治疗”指抑制、预防或停止病理状态(即ALS)的发展，和/或引起病理状态的减少、缓解或消退。如本文进一步公开的，本领域技术人员将理解，各种方法和测定可以用于评价病理状态的发展，或者病理状态的减少、缓解或消退。
肌萎缩侧索硬化(ALS)，也称为Lou Gehrig病和运动神经元疾病(MND)，是由运动神经元退化引起的进行性、致命性神经退行性疾病，所述运动神经元是中枢神经系统中控制随意肌运动的神经细胞。ALS通常引起遍及全身的肌无力和萎缩，因为上运动神经元和下运动神经元两者退化，不再向肌肉发送信息。无法工作，肌肉逐渐变弱，由于去神经支配而发展肌束震颤(抽搐)，并且最终由于去神经支配而萎缩。受累的受试者最终可能丧失发起且控制所有随意运动的能力；膀胱和肠括约肌以及负责眼球运动的肌肉通常(但不一定)幸免。认知或行为功能障碍也与该疾病相关；约一半的ALS受试者经历认知和行为中的轻度变化，并且10 – 15 %显示额颞叶痴呆的体征。语言功能障碍、执行功能障碍、以及社会认知和言语记忆障碍是ALS中最常报告的认知症状。
如本文使用的，术语“ALS”包括本领域已知的所有ALS分类，包括但不限于经典ALS(通常影响下运动神经元和上运动神经元两者)、原发性侧索硬化(PLS，通常仅影响上运动神经元)、进行性延髓麻痹(PBP或延髓发作，通常始于吞咽、咀嚼和说话困难的ALS形式)、以及进行性肌萎缩(PMA，通常仅影响下运动神经元)。
根据具体实施方案，ALS是经典ALS。
术语“ALS”包括散发性和家族性(遗传性)ALS，以任何进展速率(即快速进展或缓慢进展)的ALS，以及处于任何阶段(例如，在ALS发作前、发作时和晚期阶段)的ALS。
根据具体实施方案，ALS是散发性ALS。
根据具体实施方案，ALS是家族性ALS。
根据具体实施方案，ALS是快速进展性ALS。
如本文使用的，短语“快速进展性ALS”指这样的ALS，其中症状连续进展，并且可以在不到一年内观察到运动神经元的显著降解，伴随距诊断最多4年的受试者存活。根据具体实施方案，快速进展性ALS的特征在于经过1个月的时期，超过0.65个ALSFRS-R点的变化。
根据具体实施方案，ALS是ALS相关性抑郁。
如本文使用的，短语“ALS相关性抑郁”指在ALS发作之后开始的抑郁和/或焦虑。根据具体实施方案，ALS相关性抑郁是ALS作用机制的部分，并且可以归于例如假性延髓效应和额叶痴呆。诊断和监测抑郁的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于ALS抑郁量表(ADI-12)、贝克抑郁量表(BDI)；以及医院焦虑抑郁量表(HADS)问卷。
如上文提到的，本发明的方法尤其涉及治疗ALS。可以在疾病的任何阶段，包括在检测到ALS症状之后开始治疗。
ALS的检测可以通过不同症状的出现来确定，取决于体内的哪些运动神经元首先受损(并且因而，体内的哪些肌肉首先受损)。一般而言，ALS症状包括最早的症状，其通常是明显的无力和/或肌肉萎缩。其它症状包括受累肌肉的肌肉肌束震颤(抽搐)、抽筋或僵硬，影响手臂或腿部的肌肉无力和/或口齿不清。大多数ALS患者经历在手臂或腿部中的最初症状。其它人首先注意到清晰说话或吞咽方面的困难。其它症状包括吞咽困难，舌活动度丧失和呼吸困难。
也可以通过退化的神经元系统部分，即上运动神经元和下运动神经元，对症状进行分类。上运动神经元退化的症状包括紧绷和僵硬的肌肉(痉挛)和过度反射(反射亢进)，包括活动过度的呕吐反射。下运动神经元退化的症状包括肌无力和萎缩，肌肉抽筋和在皮肤下可见的短暂肌肉抽搐(肌束震颤)。为了诊断为ALS，患者必须具有不能归于其它原因的上运动神经元和/或下运动神经元损害的体征和症状。
可替代地，可以在疾病的进展阶段开始治疗，例如当肌无力和萎缩扩散到身体的不同部位，并且受试者具有越来越多的运动[例如，受试者可能遭受紧绷和僵硬的肌肉(痉挛)、过度反射(反射亢进)、肌无力和萎缩、肌肉抽筋、和/或在皮肤下可见的短暂肌肉抽搐(肌束震颤)]、吞咽(吞咽困难)、说话或构词(构音障碍)问题时。
监测ALS进展的方法是本领域众所周知的。此类方法的非限制性实例包括通过医生的体力评估；重量；心电图(ECG)；ALS功能评定量表(ALSFRS或ALSFRS-R)评分；呼吸功能，其可以通过例如肺活量(用力肺活量或缓慢肺活量)进行测量；肌肉强度，其可以通过例如手持测功法(HHD)、手握力测功法、手动肌肉测试(MMT)、电阻抗肌电图(EIM)和最大随意等长收缩测试(MVICT)进行测量；运动单位数估计(MUNE)；认知/行为功能，其可以通过例如ALS抑郁量表(ADI-12)、贝克抑郁量表(BDI)和医院焦虑抑郁量表(HADS)问卷进行测量；生活质量，其可以通过例如ALS评价问卷(ALSAQ-40)进行评估；以及Akt磷酸化和pAkt:tAkt比率(参见国际专利申请公开号WO2012/160563，其内容完全引入本文作为参考)。
根据具体实施方案，通过ALS功能评定量表(ALSFRS)；呼吸功能；肌肉强度和/或认知功能来监测受试者。
根据具体实施方案，通过选自以下的方法来评估肌肉强度：手持测功法(HHD)、手握力测功法、手动肌肉测试(MMT)和电阻抗肌电图(EIM)；每种可能性代表本发明的分开的实施方案。
如本文使用的，术语“受试者”指处于任何年龄和具有任何性别的人受试者，其被诊断有疾病(即，ALS)、或处于发展疾病(即，ALS)的风险中。
根据具体实施方案，受试者患有快速进展性ALS和/或ALS相关性抑郁。
根据具体实施方案，受试者满足关于可能和确定的ALS的El Escorial标准，即受试者呈现：
1. 通过临床、电生理或神经病理学检查的下运动神经元(LMN)退化的体征，
2. 通过临床检查的上运动神经元(UMN)退化的体征，和
3. 体征在一个区域内或向其它区域的逐步传播，连同以下的不存在：
- 其它疾病过程的电生理证据，其可能解释了LMN和/或UMN退化的体征；和
- 其它疾病过程的神经影像学证据，其可能解释了观察到的临床和电生理体征。
根据具体实施方案，在根据本发明的治疗之前，受试者具有26-42的ALSFRS-R评分。
根据具体实施方案，在根据本发明的治疗之前的最后3-12个月内，受试者具有大于0.65个ALSFRS-R点/月的疾病进展速率。
如提到的，该方法包括向受试者施用治疗有效量的下述细菌代谢产物中的至少一种：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC(P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE + 9-HODE。
根据一个特定实施方案，提供了选自以下的至少一种代谢产物：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐和1-棕榈酰基-2-十二碳六烯酰基-GPC。
在另一个实施方案中，细菌代谢产物烟酰胺连同上文提到的代谢产物之一一起提供。
在另外一个实施方案中，不提供细菌代谢产物烟酰胺。
如本文使用的，术语“肉桂酸盐”指肉桂酸、其盐、肉桂酸酯、对-二甲基氨基肉桂酯、肉桂醛、乙酸肉桂酯、肉桂醇、苯甲酸肉桂酯、肉桂酸肉桂酯、甲酸肉桂酯、异丁酸肉桂酯、异戊酸肉桂酯和苯乙酸肉桂酯及其组合。
本发明的这个方面的雌马酚可以是(S)-雌马酚(例如AUS-131，其目前正在开发用于治疗绝经妇女中的潮热)。在一个实施方案中，雌马酚是雌马酚盐，例如雌马酚硫酸盐。
烟酰胺(NA)，也称为“尼克酰胺”，是维生素B3 (烟酸)的酰胺衍生物形式。NA具有化学式C6H6N2O。
烟酰胺(NA)
本领域技术人员将理解，烟酰胺以及本发明中使用的其它化合物可能能够形成盐、复合物、水合物和溶剂化物，并且本文考虑了此类形式在定义的治疗中的用途。高纯度例如97%或99%纯度的烟酰胺制剂是商购可得的。此类商业制剂可以适当地用于制备用于本方法中的烟酰胺组合物。此外，高纯度烟酰胺的合成方法是本领域技术人员已知的。
根据一个特定实施方案，烟酰胺是烟酰胺衍生物或烟酰胺模拟物。如本文使用的，术语“烟酰胺(NA)的衍生物”指示其为天然NA的化学修饰的衍生物的化合物。在一个实施方案中，化学修饰可以是经由酰胺部分的氮或氧原子取代基本NA结构的吡啶环(经由环的碳或氮成员)。当取代时，一个或多个氢原子可以被替换为取代基和/或取代基可以与N原子附着，以形成四价带正电荷的氮。因此，本发明的烟酰胺包括取代或未取代的烟酰胺。在另一个实施方案中，化学修饰可以是单个基团的缺失或替换，例如以形成NA的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些如有机化学的熟练技术人员所了解的。在本发明的上下文中的衍生物还包括NA的核苷衍生物(例如烟酰胺腺嘌呤)。描述了NA的各种衍生物，一些也与PDE4酶的抑制活性有关(WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A)，或作为VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(WO01/55114)。例如，制备4-芳基-烟酰胺衍生物的方法(WO05/014549)。WO01/55114和EP2128244中公开了其它示例性烟酰胺衍生物。
烟酰胺模拟物包括烟酰胺的修饰形式，以及烟酰胺的化学类似物，其重现烟酰胺在来自多能细胞的RPE细胞分化和成熟中的效应。示例性烟酰胺模拟物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。可以充当烟酰胺模拟物的另一类化合物是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的抑制剂。示例性的PARP抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、Iniparib (BSI 201)、奥拉帕利(AZD-2281)、鲁卡帕尼(AG014699、PF- 01367338)、维利帕尼(ABT-888)、CEP 9722、MK4827和BMN-673。
在一个实施方案中，烟酰胺是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。在另一个实施方案中，烟酰胺是烟酰胺核糖核苷。
本文所述的细菌代谢产物的示例性剂量包括每天1至500 mg/kg。在本发明的一个实施方案中，治疗包括>10 mg/kg的每天施用，例如10-500 mg/kg的每天施用。
本发明人考虑了上述细菌代谢产物的组合，例如两种代谢产物、三种代谢产物、四种代谢产物、五种代谢产物、六种代谢产物、七种代谢产物、八种代谢产物、九种代谢产物或更多种。
因此，例如，组合可以包括：
烟酰胺和苯酚硫酸盐；
烟酰胺和雌马酚；
烟酰胺和肉桂酸盐；
烟酰胺、苯酚硫酸盐和雌马酚；
烟酰胺、苯酚硫酸盐和肉桂酸盐；
烟酰胺、雌马酚和肉桂酸盐；
烟酰胺、雌马酚、苯酚硫酸盐和肉桂酸盐。
烟酰胺和选自以下的至少一种代谢产物：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐和1-棕榈酰基-2-十二碳六烯酰基-GPC。
细菌代谢产物可以本身或作为药物组合物的部分提供，在所述药物组合物中，它与合适的载体或赋形剂混合。
如本文使用的，“药物组合物”指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学组分，如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施用。
在本文中，术语“活性成分”指本文所述的可导致生物效应的一种或多种细菌代谢产物。
在下文中，可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指这样的载体或稀释剂，其不引起对生物体的明显刺激，并且不取消所施用化合物的生物活性和特性。佐剂包括在这些短语下。
在本文中，术语“赋形剂”指加入药物组合物中，以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种类型的糖和淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
关于药物配制和施用的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack PublishingCo.，Easton，PA，最新版本中找到，所述参考文献引入本文作为参考。
合适的施用途径可以例如包括经口，直肠，经粘膜，尤其是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射，以及鞘内、直接心室内、心内例如在右心室腔或左心室腔内、在普通冠状动脉内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
根据一个特定实施方案，药剂是经口或直肠施用的。
可替代地，可以例如经由将药物组合物直接注射到患者的组织区域内，以局部而非全身方式施用药物组合物。
术语“组织”指设计为执行一种或多种功能的由细胞组成的生物体的部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨骼、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
本发明的一些实施方案的药物组合物可以通过本领域众所周知的工艺来制造，例如，借助于常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、水飞、乳化、包囊、包埋或冻干工艺。
因此，用于根据本发明的一些实施方案使用的药物组合物可以以常规方式进行配制，使用包含赋形剂和助剂的一种或多种生理学上可接受的载体，其促进活性成分加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于选择的施用途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中进行配制，优选在生理学相容的缓冲液中，例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用对于待渗透的屏障适当的渗透剂。此类渗透剂是本领域一般已知的。
对于经口施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合，来容易地配制药物组合物。此类载体使得药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆料、悬浮液等等，用于被患者经口摄取。用于经口使用的药物制剂可以通过以下进行制备：使用固体赋形剂，任选地研磨所得到的混合物，并且在需要时加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉蜀黍淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
糖衣丸芯提供有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖衣丸包衣中，用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以经口使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可以含有与填料如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮于合适的液体中，所述液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于经口施用的所有制剂应该为适合于选择的施用途径的剂量。
对于颊部施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入的施用，用于根据本发明的一些实施方案使用的活性成分，以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾呈现的形式方便地递送，其中使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。可以配制用于分配器中的例如明胶的胶囊和药液筒，其含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外施用，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在于例如安瓿或多剂量容器中，具有任选添加的防腐剂。组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂，并且可以含有配制试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物组合物包括以水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，可以将活性成分的悬浮液制备为适当地基于油或水的注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或者合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
可替代地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前由合适的媒介物例如无菌、无热原的水基溶液构造。
本发明的一些实施方案的药物组合物也可以使用例如常规的栓剂基质，例如可可脂或其它甘油酯配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。
适用于本发明的一些实施方案的背景下的药物组合物包括这样的组合物，其中有效成分以有效达到预期目的的量包含。更具体而言，治疗有效量意指这样的活性成分(例如烟酰胺)的量，其有效预防、减轻或改善病症(例如，ALS)的症状，或者延长待治疗受试者的存活。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。
对于本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养测定进行估计。例如，可以在动物模型中制定剂量，以达到所需的浓度或滴度。此类信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过在体外、细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可以用于制定用于在人中使用的剂量范围。剂量可以根据采用的剂型和利用的施用途径而变。确切的制剂、施用途径和剂量可以由各个医生考虑到患者的状况加以选择。(参见例如，Fingl等人，1975，于"The Pharmacological Basis of Therapeutics"，第1章，第1页)。
剂量的量和间隔可以个别地调整，以提供活性成分的血液、脑或CSF水平，其足以诱导或压制生物效应(最小有效浓度，MEC)。MEC对于每种制剂不同，但可以从体外数据进行估计。达到MEC必需的剂量取决于个体特征和施用途径。检测测定可以用于确定血浆浓度。
取决于待治疗状况的严重性和响应性，给药可以是单次施用或多次施用，其中治疗过程持续数天至数周，或者直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。
当然，待施用的组合物的量取决于待治疗的受试者、病痛的严重性、施用方式、开处方医生的判断等。
需要时，本发明的一些实施方案的组合物可以存在于包装或分配器装置，例如FDA批准的试剂盒中，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包含金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可能伴随有施用说明书。包装或分配器也可以容纳伴随容器的通告，所述通告为由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述通告反映了组合物的形式或者人或兽医学施用通过机构的批准。例如，此类通告可以是由美国食物药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准用于处方药的标签，或者批准的产品插页。如上文进一步详述的，还可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明的制剂的组合物，置于适当的容器中，并且标记用于治疗指示的状况。
本发明的代谢产物可以在食物(例如食物棒、饼干、休闲食物和本领域众所周知的其它标准食物形式)，或饮料制剂中提供。饮料可以含有调味料、缓冲剂等等。还考虑了包含本发明的代谢产物的营养补充剂。
本发明的这个方面的代谢产物可以经由益生菌组合物提供，所述益生菌组合物包含生成代谢产物的微生物。
如本文使用的，术语“益生菌”指一种或多种微生物，当适当施用时，所述微生物可以对宿主或受试者赋予健康益处，和/或降低宿主生物体中的疾病(例如ALS)、病症、状况或事件的风险和/或症状。
因此，根据本发明的另一个方面，提供了治疗ALS的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的细菌组合物，所述细菌组合物包含以下中的至少一种：嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌、Anaerostipes hadrus、嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)、厌氧原体属、普雷沃氏菌属、Distanosis、副拟杆菌属(例如狄氏副拟杆菌、戈氏副拟杆菌)、理研菌科、另枝菌属、Candidatus Arthromitus、伊格尔兹氏菌属、颤杆菌属、罕见小球菌属和乳杆菌属(例如鼠乳杆菌)。
根据一个具体实施方案，细菌组合物包含以下中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种：嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌和Anaerostipes hadrus。
根据一个特定实施方案，细菌组合物包含嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)。
益生菌微生物可以是任何合适的形式，例如干粉形式。另外，益生菌微生物可能已经历加工，以便使其增加其存活。例如，微生物可以被包被或封装在多糖、脂肪、淀粉、蛋白质或糖基质中。可以使用本领域已知的标准封装技术。例如，可以使用美国专利号6,190,591中讨论的技术，所述美国专利在此整体引入作为参考。
根据一个特定实施方案，益生菌组合物在食物产品、功能性食物或营养食品中进行配制。
在一些实施方案中，食物产品、功能性食物或营养食品是或包含乳制品。在一些实施方案中，乳制品是或包含酸奶产品。在一些实施方案中，乳制品是或包括乳产品。
在一些实施方案中，乳制品是或包含干酪产品。在一些实施方案中，食物产品、功能性食物或营养食品是或包含衍生自水果的果汁或其它产品。在一些实施方案中，食物产品、功能性食物或营养食品是或包含源自蔬菜的产品。在一些实施方案中，食物产品、功能性食物或营养食品是或包含谷物产品，包括但不限于谷类食品、薄脆饼干、面包和/或燕麦片。在一些实施方案中，食物产品、功能性食物或营养食品是或包含大米产品。在一些实施方案中，食物产品、功能性食物或保健食物是或包含肉制品。
在施用之前，可以用减少微生物组中天然存在的微生物数目的药剂(例如，通过抗生素治疗)，对受试者进行预治疗。根据一个特定实施方案，治疗使天然存在的肠道菌群显著消除了至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%。
在一些特定实施方案中，可以从剂量应答曲线外推待施用的益生菌的适当剂量或量，所述剂量应答曲线衍生自体外或动物模型测试系统。可以根据个体的需要，随着时间过去改变(例如，增加或减少)待施用于特定个体的有效剂量或量。在一些实施方案中，当施用细菌时，适当剂量包含至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个细菌细胞。在一些实施方案中，本发明涵盖以下认识：可以通过提供大于约1000个或更多个(例如，大于约1500、2000、2500、3000、35000、4000、4500、5000、5500、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1x106、2x106、3 x106、4x106、5 x106、6 x106、7 x106、8 x106、9 x106、1 x107、1 x108、1 x109、1 x1010、1 x1011、1x1012、1 x1013个或更多个细菌)的细菌细胞数目来实现更大的益处。
本发明人已进一步显示了，特定细菌群体的水平在患有ALS的受试者的微生物组中增加。
因此，根据本发明的另外一个方面，提供了治疗有需要的受试者中的ALS的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的药剂，所述药剂选择性地减少受试者的肠道微生物组中选自以下的细菌群体的量：大肠杆菌、柔嫩梭菌、系结梭菌、鲍氏梭菌、脆弱拟杆菌、Catenibacterium mitsuokai、齿双歧杆菌、巨球菌属、Parasutterella excrementihominis、伯克氏菌目细菌、多枝梭菌、咽峡炎链球菌、Flavonifractor_ plautii、史氏甲烷短杆菌、肠氨基酸球菌、瘤胃球菌属例如扭链瘤胃球菌或活泼瘤胃球菌、双歧杆菌属、红蝽杆菌科、拟杆菌属、副拟杆菌属、S24_7、梭菌科、flavefaciens、脱硫弧菌科、Allobaculum、萨特氏菌属、螺杆菌科、粪球菌属和颤螺菌属，从而治疗ALS。
根据一个特定实施方案，细菌群体选自大肠杆菌、柔嫩梭菌、瘤胃球菌属(例如扭链瘤胃球菌或活泼瘤胃球菌)、系结梭菌、鲍氏梭菌、脆弱拟杆菌、Catenibacterium mitsuokai、齿双歧杆菌、巨球菌属、Parasutterella excrementihominis、伯克氏菌目细菌、多枝梭菌、咽峡炎链球菌、Flavonifractor_plautii、史氏甲烷短杆菌和肠氨基酸球菌。
根据一个特定实施方案，细菌群体选自瘤胃球菌属、脱硫弧菌科、Allobaculum、萨特氏菌属、螺杆菌科、粪球菌属和颤螺菌属。
在一个进一步的实施方案中，下调的细菌群体是下述细菌中的至少一种：Bacteroides dorei、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、多尔氏菌属(Dorea)、肝螺杆菌(Helicobacter_hepaticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus_johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)、乳杆菌属物种(Lactobacillus_sp)_ASF360、脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio_desulfuricans)、阴道乳杆菌(Lactobacillus_vaginalis)、Mucispirillum_schaedleri、副拟杆菌属(例如约氏副拟杆菌(Parabacteroides_johnsonii))和扭链瘤胃球菌。
在一个实施方案中，上述物种/属中的至少两种是下调的，上述物种/属中的至少三种是下调的，上述物种/属中的至少四种是下调的，上述物种/属中的至少五种是下调的，所有上述物种或属都是下调的。
本发明考虑了一种药剂，其下调上述公开物种的至少一种菌株、10%的菌株、20%的菌株、30%的菌株、40%的菌株、50%的菌株、60%的菌株、70%的菌株、80%的菌株、90%的菌株或所有菌株。
如本文使用的，术语“下调”指降低特定细菌物种/属的量(绝对量或相对量)和/或活性(绝对活性或相对活性)的能力。
在一个实施方案中，药剂特异性地下调指定的细菌物种/属。
因此，例如，与受试者的微生物组的至少一种其它细菌物种/属相比，药剂可以将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与微生物组的至少一种其它细菌物种/属相比，药剂将特定细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少10%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少10%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少20%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少20%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少30%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少30%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少40%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少40%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少50%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少50%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少60%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少60%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少70%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少70%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少80%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少80%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
在另一个实施方案中，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少90%相比，药剂将指定的细菌物种/属的量降低到至多1/2。根据一个特定实施方案，与受试者的微生物组的总细菌物种/属的至少90%相比，药剂将指定的细菌物种/属下调到至多1/5、1/10或更少。
能够降低特定细菌属、物种或菌株的示例性药剂是抗生素。
如本文使用的，术语“抗生素药剂”指主要用于传染病的治疗中的一组化学物质，其从自然来源中分离或衍生自从自然来源中分离的抗生素药剂，具有抑制细菌及其它微生物生长或者破坏细菌及其它微生物的能力。抗生素药剂的实例包括但不限于；阿米卡星；阿莫西林；氨苄西林；阿奇霉素；阿洛西林；氨曲南；氨曲南；羧苄西林；头孢克洛；头孢吡肟；头孢他美；头孢噻唑；头孢克肟；头孢尼西；头孢哌酮；头孢噻肟；头孢替坦；头孢西丁；头孢泊肟；头孢丙烯；头孢磺啶；头孢他啶；头孢唑肟；头孢曲松；头孢呋辛；头孢氨苄；头孢噻吩；喹红霉素；氯霉素；西诺沙星；环丙沙星；克拉霉素；克林霉素；氯唑西林；阿莫西林-克拉维酸盐组合(Co-amoxiclavuanate)；达巴万星；达托霉素；双氯西林；多西环素；依诺沙星；依托红霉素；琥珀酸乙酯红霉素；葡庚糖酸红霉素；乳糖酸红霉素；硬脂酸红霉素；红霉素；非达霉素；氟罗沙星；庆大霉素；亚胺培南；卡那霉素；洛美沙星；氯碳头孢；甲氧西林；甲硝唑；美洛西林；米诺环素；莫匹罗星；萘夫西林；萘啶酸；奈替米星；呋喃妥因；诺氟沙星；氧氟沙星；苯唑西林；青霉素G；哌拉西林；瑞他莫林；利福沙明、利福平；罗红霉素；链霉素；磺胺甲噁唑；替考拉宁；四环素；替卡西林；替加环素；妥布霉素；甲氧苄啶；万古霉素；哌拉西林和他唑巴坦的组合；及其各种盐、酸、碱和其它衍生物。抗菌抗生素药剂包括但不限于氨基糖苷、碳头孢烯、碳青霉烯、头孢菌素、头霉素、氟喹诺酮、糖肽、林可酰胺、大环内酯、单内酰胺、青霉素、喹诺酮、磺胺和四环素。
抗菌剂还包括抗菌肽。实例包括但不限于abaecin；andropin；蜜蜂抗菌肽；铃蟾抗菌肽；brevinin；buforin II；CAP18；天蚕素；ceratotoxin；防御素；皮抑菌肽(dermaseptin)；皮离蛋白(dermcidin)；果蝇素(drosomycin)；秦皮乙素(esculentin)；吲哚美定(indolicidin)；LL37；蛙皮素(magainin)；maximumH5；蜂毒素；家蚕抗菌肽(moricin)；prophenin；protegrin；和或鲎素肽(tachyplesin)。
根据一个特定实施方案，抗生素是不可吸收的抗生素。
本发明人还考虑了不是抗生素的其它药剂。
在一个实施方案中，能够下调特定细菌属/物种/菌株的药剂是与细菌属/物种/菌株竞争必需资源的细菌群体。细菌组合物在下文进一步描述。
在另外一个实施方案中，能够下调特定细菌属/物种/菌株的药剂是竞争细菌群体(或甚至来自相同物种/菌株)的代谢产物，其作用于减少细菌物种/菌株的相对量。
可以特异性降低特定细菌属、物种或菌株的另外药剂是本领域已知的，并且包括多核苷酸沉默药剂。
优选地，本发明的这个方面的多核苷酸沉默药剂靶向编码细菌中的至少一个必需基因(即，与生命相容)的序列。靶向的序列应该对期望下调的特定细菌物种是特异性的。此类基因包括核糖体RNA基因(16S和23S)，核糖体蛋白基因，tRNA合成酶，以及显示为必需的另外基因，例如dnaB、fabI、folA、gyrB、murA、pytH、metG和tufA(B) 。
根据本发明的一个实施方案，多核苷酸沉默药剂对靶RNA是特异性的，并且不交叉抑制或沉默其它靶或剪接变体，所述剪接变体显示出与靶基因99%或更低的总体同源性，例如与靶基因小于98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%的总体同源性；如通过PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学和/或流式细胞术确定的。
能够下调必需细菌基因的一种药剂是RNA引导的核酸内切酶技术，例如CRISPR系统。
如本文使用的，术语“CRISPR系统”也称为成簇规律间隔短回文重复，共同地指涉及CRISPR相关基因的表达或指导CRISPR相关基因的活性的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列(例如CRISPR相关核酸内切酶9)、tracr (反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分的tracrRNA)、tracr-配对(mate)序列(包含“直接重复”和tracrRNA处理的部分直接重复)、或引导序列(也称为“间隔子”)，包括但不限于crRNA序列(即，赋予靶特异性，但需要tracrRNA以结合Cas的内源细菌RNA)、或sgRNA序列(即，单引导RNA)。
在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自I型、II型或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统(例如，Cas)的一个或多个元件衍生自包含内源性CRISPR系统的特定生物体，例如化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、嗜热链球菌或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。
一般而言，CRISPR系统的特征在于促进CRISPR复合物在靶序列的位点处形成的元件(在内源性CRISPR系统的背景下，也称为前间隔序列)。
在形成CRISPR复合物的背景下，“靶序列”指引导序列(即，引导RNA，例如sgRNA或crRNA)被设计为与之具有互补性的序列，其中靶序列和引导序列之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补性，条件是存在足够的互补性，以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。因此，根据一些实施方案，与靶序列的总体同源性可以是50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列定位于细胞的核或细胞质中。
因此，CRISPR系统包含两个不同的组分：与靶序列杂交的引导RNA (gRNA)、以及核酸酶(例如II型Cas9蛋白)，其中gRNA靶向靶序列，而核酸酶(例如Cas9蛋白)切割靶序列。引导RNA可以包含内源性细菌crRNA和tracrRNA的组合，即，gRNA将crRNA的靶向特异性与tracrRNA的支架特性(Cas9结合所需的)组合。可替代地，引导RNA可以是能够直接结合Cas的单个引导RNA。
通常，在内源性CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交，并且与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成，导致在靶序列中或附近(例如在距靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链切割。不希望受理论的束缚，可以包含野生型tracr序列的全部或一部分(例如，野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)、或者由其组成的tracr序列也可以形成CRISPR复合物的部分，例如通过沿着tracr序列的至少一部分与tracr配对序列的全部或一部分杂交，所述tracr配对序列与引导序列可操作地连接。
在一些实施方案中，tracr序列与tracr配对序列具有足够的互补性，以杂交并参与CRISPR复合物的形成。与靶序列一样，不需要完全的互补性，条件是存在足够的功能性。在一些实施方案中，当最佳比对时，tracr序列沿着tracr配对序列的长度具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互补性。
将CRISPR/Cas引入细胞内可以使用一种或多种载体来实现，所述载体驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达，使得CRISPR系统的元件的表达指导CRISPR复合物在一个或多个靶位点处的形成。例如，Cas酶、连接至tracr-配对序列的引导序列和tracr序列，可以各自可操作地连接至分开的载体上的分开的调控元件。可替代地，由相同或不同调控元件表达的两个或更多个元件可以在单个载体中组合，伴随提供第一载体中不包括的CRISPR系统的任何组分的一种或多种另外载体。在单个载体中组合的CRISPR系统元件可以在任何合适的方向上排列，例如一个元件相对于第二元件定位于5' (“上游”)或相对于第二元件定位于3' (“下游”)。一个元件的编码序列可以定位于第二元件的编码序列的相同链或相反链上，并且以相同方向或相反方向定向。单个启动子可以驱动编码CRISPR酶的转录物以及以下中的一种或多种：引导序列、tracr配对序列(任选地可操作地连接至引导序列)、以及嵌入一个或多个内含子序列内的tracr序列(例如各自在不同的内含子中、至少一个内含子中两个或更多个、或全部在单个内含子中)的表达。
应了解，除了治疗ALS之外，本发明人进一步提出测试受试者的微生物组中的特定细菌物种，以便诊断该疾病。
因此，根据本发明的另一个方面，提供了诊断受试者的ALS的方法，其包括分析受试者的微生物组中的瘤胃球菌属的量和/或活性，其中与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，瘤胃球菌属的丰度和/或活性的统计学上显著的增加指示ALS。
如本文使用的，术语“诊断”指确定疾病的存在，对疾病进行分类，确定疾病的严重程度(等级或阶段)，监测疾病进展和对疗法的应答，预测疾病的结果和/或恢复的前景。
可以进行分析、可以帮助诊断的另外细菌物种/属包括嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)、厌氧原体属、Distanosis、普雷沃氏菌属、副拟杆菌属(例如狄氏副拟杆菌和戈氏副拟杆菌)、理研菌科、另枝菌属、Candidatus Arthromitus、伊格尔兹氏菌属、颤杆菌属、罕见小球菌属、乳杆菌属(例如鼠乳杆菌)。
可以进行分析、可以帮助诊断的另外细菌物种/属包括大肠杆菌、柔嫩梭菌、系结梭菌、鲍氏梭菌、脆弱拟杆菌、Catenibacterium mitsuokai、齿双歧杆菌、巨球菌属、Parasutterella excrementihominis、伯克氏菌目细菌、多枝梭菌、咽峡炎链球菌、Flavonifractor_plautii、史氏甲烷短杆菌和肠氨基酸球菌，其中与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，上文提到的细菌的丰度的统计学上显著的增加指示ALS。
可以进行分析、可以帮助诊断的另外细菌物种/属包括嗜热链球菌、普拉梭菌、直肠真杆菌、平常拟杆菌、粪球菌属、人罗斯拜瑞氏菌、凸腹真杆菌、毛螺菌科、霍氏真杆菌、拟杆菌目、假小链双歧杆菌、Anaerostipes hadrus，其中与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，上文提到的细菌的丰度的统计学上显著的减少指示ALS。
与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，上述细菌物种的量在患有ALS的受试者中通常是减少的。
与其在健康受试者的微生物组中的丰度相比，上述细菌物种的量在患有ALS的受试者中通常是增加的。
为了将受试者诊断为患有ALS，通常分析上文公开的物种/属中的至少1种(例如瘤胃球菌属)、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或甚至更多种。
通常，与该微生物在健康受试者(例如，没有ALS的受试者)的微生物组中的量相比，上述细菌物种/属中的任一种高于预定水平的增加是至少1.5倍的量、2倍的量、3倍的量、4倍的量、5倍的量。
通常，与该微生物在健康受试者(例如，没有ALS的受试者)的微生物组中的量相比，上述细菌物种/属中的任一种低于预定水平的减少是至多1/1.5的量、1/2的量、1/3的量、1/4的量、1/5的量。
应了解，当比较特定细菌物种的丰度和/或活性时，应注意比较同一器官或组织的微生物组。
在一个实施方案中，分析了上文公开的细菌的丰度。
测量微生物的水平或存在可以通过分析微生物组分或微生物副产物的存在来实现。因此，例如，微生物的水平或存在可以通过测量DNA序列的水平来实现。在一些实施方案中，微生物的水平或存在可以通过测量16S rRNA基因序列或18S rRNA基因序列来实现。在其它实施方案中，微生物的水平或存在可以通过测量RNA转录物来实现。在另外其它实施方案中，微生物的水平或存在可以通过测量蛋白质来实现。在另外其它实施方案中，微生物的水平或存在可以通过测量代谢产物来实现。
获得微生物样品
为了分析微生物组，从受试者获取样品。
受试者通常是哺乳动物受试者 - 例如人受试者。
因此，例如可以获取大便样品来分析肠道微生物组，可以获取支气管样品来分析支气管微生物组，可以获取唾液样品来分析口腔微生物组等。根据一个特定实施方案，受试者的微生物组衍生自受试者的大便样品。
本发明人已显示了进食模式中的变化(例如，由于昼夜节律失调)影响了微生物组的组成。因此，优选在一天中的固定时间获取样品。
可以使用常规技术，例如如上文引用的Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual中公开的，来实现从微生物组中获得染色体(基因组)DNA。在一些情况下，特别是如果在特定步骤中采用少量DNA，则每当仅少量样品DNA可用，并且存在通过例如与容器壁的非特异性结合而丧失的危险等等时，提供待与样品DNA混合并使用的载体DNA，例如无关的环状合成双链DNA是有利的。
在一个实施方案中，获得了染色体DNA的长片段。将细胞裂解，并且用温和的离心步骤使完整的核沉淀。然后释放基因组DNA(例如通过蛋白酶K和RNA酶消化数小时(例如1-5小时))。可以例如通过透析一段时间(即2-16小时)和/或稀释，来处理该材料以降低残留的细胞废物的浓度。由于此类方法不需要采用许多破坏性过程(例如乙醇沉淀、离心和涡旋)，因此基因组核酸在很大程度上保持完整，产生大部分长度超过150千碱基的片段。在一些实施方案中，片段的长度为约5至约750千碱基。在进一步的实施方案中，片段的长度为约150至约600、约200至约500、约250至约400和约300至约350千碱基。
任选地，然后通过常规技术，包括酶促消化、剪切或超声处理(其中后两种在本发明中特别有用)，将靶基因组DNA分级或片段化至所需大小。
靶核酸的片段大小可以取决于来源靶核酸和使用的文库构建方法而变，但对于标准的全基因组测序，此类片段的长度范围可以为50至600个核苷酸。在另一个实施方案中，片段的长度为300至600或200至2000个核苷酸。在再一个实施方案中，片段的长度为10-100、50-100、50-300、100-200、200-300、50-400、100-400、200-400、300-400、400-500、400-600、500-600、50-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、700-900、700-800、800-1000、900-1000、1500-2000、1750-2000和50-2000个核苷酸。还考虑了更长的片段。
在一个进一步的实施方案中，分离了特定大小或在特定大小范围内的片段。此类方法是本领域众所周知的。例如，凝胶分级可以用于产生在一定范围的碱基对，例如500个碱基对+50个碱基对内的特定大小的片段群体。
在许多情况下，不需要所提取的DNA的酶促消化，因为在裂解和提取过程中产生的剪切力生成在所需范围内的片段。在一个进一步的实施方案中，可以使用限制性核酸内切酶，通过酶促片段化来生成较短的片段(1-5 kb)。
定量微生物水平：
应了解，通过考虑到微生物组的任何特征，可以影响微生物丰度的确定。因此，通过考虑到不同系统发育水平下的丰度；在基因丰度水平下；基因代谢途径丰度；亚种菌株鉴定；SNP以及在特定细菌区域中的插入和缺失；细菌的生长速率、微生物组的微生物多样性，可能影响微生物的丰度，如下文进一步描述的。
在一些实施方案中，确定一种或多种类型的微生物或其组分或产物的水平或一组水平，包括确定一种或多种DNA序列的水平或一组水平。在一些实施方案中，一种或多种DNA序列包含可以用于区别不同微生物类型的任何DNA序列。在某些实施方案中，一种或多种DNA序列包含16S rRNA基因序列。在某些实施方案中，一种或多种DNA序列包含18S rRNA基因序列。在一些实施方案中，扩增1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、1,000、5,000种或更多种序列。
16S和18S rRNA基因序列分别编码原核和真核核糖体的小亚基组分。rRNA基因在区分微生物类型方面特别有用，因为尽管这些基因的序列在微生物物种之间不同，但该基因具有高度保守的区域用于引物结合。保守的引物结合区之间的这种特异性，允许用单组引物扩增许多不同类型的微生物的rRNA基因，然后通过扩增的序列加以区分。
在一些实施方案中，微生物群样品(例如粪便样品)直接就一种或多种DNA序列的水平或一组水平进行测定。在一些实施方案中，从微生物群样品中分离DNA，并且分离的DNA就一种或多种DNA序列的水平或一组水平进行测定。分离微生物DNA的方法是本领域众所周知的。实例包括但不限于苯酚-氯仿提取和广泛多样的商购可得的试剂盒，包括QIAamp DNAStool Mini Kit (Qiagen，Valencia，Calif.)。
在一些实施方案中，一种或多种DNA序列的水平或一组水平通过使用PCR(例如，标准PCR、半定量或定量PCR)扩增DNA序列来确定。在一些实施方案中，一种或多种DNA序列的水平或一组水平通过使用定量PCR扩增DNA序列来确定。这些和其它基本的DNA扩增程序是本领域从业者众所周知的，并且在Ausebel等人(Ausubel F M，Brent R，Kingston R E，Moore D，Seidman J G，Smith J A，Struhl K (编辑). 1998. Current Protocols inMolecular Biology. Wiley:New York)中进行描述。
在一些实施方案中，使用对一种或多种序列特异性的引物来扩增DNA序列，所述一种或多种序列将个别微生物类型与其它不同的微生物类型区别开。在一些实施方案中，使用对于16SrRNA基因序列特异性的引物来扩增16S rRNA基因序列或其片段。在一些实施方案中，使用对于18S DNA序列特异性的引物来扩增18S DNA序列。
在一些实施方案中，使用系统发育芯片(phylochip)技术，来确定一种或多种16SrRNA基因序列的水平或一组水平。系统发育芯片的使用是本领域众所周知的，并且在Hazen等人("Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria."Science，330，204-208，2010)中进行描述，所述参考文献整体引入作为参考。简言之，16SrRNA基因序列从由微生物群样品中提取的DNA进行扩增并标记。然后使扩增的DNA与含有用于微生物16S rRNA基因的探针的阵列杂交。然后定量与每种探针的结合水平，提供与所探测的16S rRNA基因序列相对应的微生物类型的样品水平。在一些实施方案中，系统发育芯片分析由商业供应商执行。实例包括但不限于SecondGenome Inc. (San Francisco，Calif.)。
在一些实施方案中，任何上述细菌物种/菌株的丰度通过DNA测序进行确定。
用于序列测定的方法是本领域技术人员一般已知的。优选的测序方法是下一代测序方法或并行高流通量测序方法。例如，可以通过使用大规模平行签名测序(MPSS)来获得细菌基因组序列。所设想的测序方法的实例是焦磷酸测序，特别是454焦磷酸测序，例如基于Roche 454 Genome Sequencer。这种方法在油溶液中的水滴内部扩增DNA，其中每个液滴含有附着到单个引物包被的珠的单个DNA模板，所述珠然后形成克隆菌落。焦磷酸测序使用萤光素酶来生成光，用于检测加入新生DNA中的个别核苷酸，并且组合的数据用于生成序列读出。再一个设想的实例是Illumina或Solexa测序，例如通过使用基于可逆染料终止剂的IlluminaGenome Analyzer技术。DNA分子通常附着至玻片上的引物上，并且这样进行扩增，使得形成局部克隆菌落。随后，可以一次添加一种类型的核苷酸，然后将未掺入的核苷酸洗掉。随后，可以获取荧光标记的核苷酸的图像，并且从DNA中化学去除染料，允许下一个循环。再一个实例是Applied Biosystems的SOLiD技术的使用，所述技术采用边连接边测序。这种方法基于使用固定长度的所有可能寡核苷酸的池，所述寡核苷酸根据测序位置进行标记。将此类寡核苷酸退火并连接。随后，通过DNA连接酶对于匹配序列的优先连接通常导致提供在该位置处的核苷酸信息的信号。由于通常通过乳液PCR扩增DNA，因此可以将所得到的珠(各自仅含有同一DNA分子的拷贝)沉积到载玻片上，导致数量和长度与Illumina测序可比较的序列。进一步的方法基于Helicos的Heliscope技术，其中片段通过栓系至阵列的聚T寡聚物进行捕获。在每个测序循环下，添加聚合酶和单一荧光标记的核苷酸，并且对阵列进行成像。随后去除荧光标签，并且重复该循环。本发明的方法内包含的测序技术的进一步实例是通过杂交测序，通过使用纳米孔测序，基于显微镜检查的测序技术，微流体桑格测序或基于微芯片的测序方法。本发明还设想了这些技术的进一步发展，例如序列测定的准确度的进一步改善、或生物体的基因组序列测定所需的时间等。
根据一个实施方案，测序方法包括深度测序。
如本文使用的，术语“深度测序”指这样的测序方法，其中靶序列在单个测试中多次读取。单个深度测序运行由在相同靶序列上运行的许多测序反应组成，并且每个测序反应生成独立的序列读出。
在一些实施方案中，确定一种或多种类型的微生物的水平或一组水平包括确定一种或多种微生物RNA分子(例如，转录物)的水平或一组水平。定量RNA转录物水平的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于RNA印迹分析、半定量逆转录酶PCR、定量逆转录酶PCR和微阵列分析。
在一些实施方案中，确定一种或多种类型的微生物的水平或一组水平包括确定一种或多种微生物多肽的水平或一组水平。定量多肽水平的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于蛋白质印迹分析和质谱法。
如上文提到的，以及(或者代替)分析微生物的丰度，本发明还考虑了分析微生物产物的水平。
微生物产物的实例包括但不限于mRNA、多肽、碳水化合物和代谢产物。
如本文使用的，“代谢产物”是代谢的中间产物产物或产物。术语代谢产物一般限于小分子，并且不包括聚合化合物如DNA或蛋白质。代谢产物可以充当代谢途径的酶的底物、此类途径的中间产物或通过代谢途径获得的产物。
在优选的实施方案中，代谢产物包括但不限于糖、有机酸、氨基酸、脂肪酸、激素、维生素、寡肽(长度小于约100个氨基酸)及其离子片段。细胞也可以进行裂解，以便测量细胞内存在的细胞产物。特别地，代谢产物的分子量小于约3000道尔顿，且更特别地为约50至约3000道尔顿。
本发明的这个方面的代谢产物可以是主要代谢产物(即对于微生物生长必需的)，或次要代谢产物(在生长、发育或繁殖方面不起作用，并且在生长的静止期结束过程中或附近形成)。
其中涉及本发明的代谢产物的代谢途径的代表性实例包括但不限于柠檬酸循环、呼吸链、光合作用、光呼吸、糖酵解、糖原异生、己糖单磷酸途径、氧化戊糖磷酸途径、脂肪酸的产生和β-氧化、尿素循环、氨基酸生物合成途径、蛋白质降解途径(如蛋白酶体降解)、氨基酸降解途径、以下的生物合成或降解：脂质、聚酮(包括例如类黄酮和异类黄酮)、类异戊二烯(包括例如萜烯、固醇、类固醇、类胡萝卜素、叶黄素)、碳水化合物、类苯基丙烷和衍生物、生物碱、苯型化合物、吲哚、吲哚硫化合物、卟啉、花青素、激素、维生素、辅因子(例如辅基或电子载体)、木质素、芥子油苷、嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸和相关分子例如tRNA、微小RNA(miRNA)或mRNA。
在一些实施方案中，代谢产物的水平通过质谱法进行确定。在一些实施方案中，代谢产物的水平通过核磁共振波谱法进行确定，如下文进一步描述的。在一些实施方案中，代谢产物的水平通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行确定。在一些实施方案中，代谢产物的水平通过比色法进行确定。在一些实施方案中，代谢产物的水平通过分光光度法进行确定。
根据一个特定实施方案，分析了下述代谢产物中的至少一种的丰度：4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、烟酰胺、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC、草酸盐、硬脂酰鞘磷脂、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-GPC (16:0/22:6)、3-脲基丙酸盐、1-(1-烯基-棕榈酰基-)-2-花生四烯酰基-GPC (P-16:0/20:4)、棕榈酰基鞘磷脂(d18:1/16:0)、鞘磷脂(d18:1/18:1、d18:2/18:0)、丙酮酸盐、牛磺胆酸盐、N-乙酰酪氨酸、牛磺-β-鼠胆酸盐、牛磺熊去氧胆酸盐、苯酚硫酸盐、雌马酚硫酸盐、肉桂酸盐、苯基丙酰甘氨酸、2-氨基苯酚硫酸盐、4-烯丙基苯酚硫酸盐、雌马酚葡糖苷酸、棕榈油酰基-亚油酰基-甘油、油酰基-亚麻酰基-甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基-GPE、氢醌硫酸盐、愈创木酚硫酸盐、二酰基甘油、棕榈酰基-亚油酰基-甘油、龙胆酸盐和13-HODE + 9-HODE。
根据一个特定实施方案，分析烟酰胺的量。
根据另一个实施方案，代谢产物选自4-羟基苯甲酸丙酯、三乙醇胺、血清素、2-酮-3-脱氧葡糖酸盐、烟酰胺、N-三甲基5-氨基戊酸盐、苯丙氨酰甘氨酸、可可碱、cys-gly、谷氨酸盐和1-棕榈酰基-2-十二碳六烯酰基-GPC。
为了将受试者诊断为患有ALS，通常分析上文公开的代谢产物中的至少1种(例如烟酰胺)、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或甚至更多种。
通常，与该代谢产物在健康受试者(例如，没有ALS的受试者)的微生物组中的量相比，上述代谢产物中的任一种高于预定水平的增加是至少1.5倍的量、2倍的量、3倍的量、4倍的量、5倍的量。
通常，与该代谢产物在健康受试者(例如，没有ALS的受试者)的微生物组中的量相比，低于预定水平的减少是至多1/1.5的量、1/2的量、1/3的量、1/4的量、1/5的量。
如提到的，以及(或代替)确定指定的微生物物种/菌株的丰度用于诊断ALS，本发明人还考虑了分析微生物组的微生物的生长动力学。
术语“生长动力学”指细菌的生长期(例如，滞后期、静止期、指数生长、死亡期)和生长速率本身。
测量生长动力学可以使用WO 2016/079731中描述的方法来实现，所述专利的内容引入本文作为参考。
分析细菌生长动力学的其它方法是本领域已知的，并且包括例如分析在一段时间内细菌接种物的光密度。
一旦已做出阳性诊断，就可以进行另外的测试，以确证该诊断 - 例如成像、肌肉活组织检查等。受试者可以在诊断之后进行治疗 - 例如使用本文所述的细菌群体/代谢产物，或通过任何其它已知的ALS黄金标准治疗。
如本文使用的，术语“约”指± 10 %。
术语“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”及其词形变化意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”意指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变所请求保护的组合物、方法或结构的基础和新型特征的情况下。
如本文使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
本申请自始至终，本发明的各个实施方案可以以范围形式呈现。应该理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简洁起见，而不应该被解释为对本发明的范围的硬性限制。相应地，范围的描述应该被视为已具体地公开了所有可能的子范围、以及在该范围内的各个数值。例如，范围如从1到6的描述应该被视为已具体地公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
每当在本文中指示数值范围时，它意欲包括在指示范围内的任何引用数字（分数或整数）。短语“范围为第一指示数目至第二指示数目之间/范围在第一指示数目和第二指示数目之间”、以及“范围为第一指示数目到第二指示数目/范围从第一指示数目到第二指示数目”在本文中可互换使用，并且意欲包括第一指示数目和第二指示数目、以及其间的所有分数和整数。
如本文使用的，术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的，或者从已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
应了解，为了清楚起见，在分开的实施方案的背景下描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的背景下描述的本发明的各种特征，也可以分开地或以任何合适的子组合或如本发明的任何其它所述实施方案中合适地提供。在各个实施方案的背景下描述的某些特征，不应被视为那些实施方案的必要特征，除非该实施方案没有那些要素是不可操作的。
如上文描绘的以及如所附权利要求部分中请求保护的，本发明的各个实施方案和方面在下述实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下述实施例，其连同上文说明书一起，以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。
一般地，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到详尽解释。参见例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual" Sambrook等人，(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"第I-III卷Ausubel，R. M.编辑(1994)；Ausubel等人，"CurrentProtocols inMolecular Biology"，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，"APractical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等人，"Recombinant DNA"，Scientific American Books，New York；Birren等人(编辑)"GenomeAnalysis: A Laboratory Manual Series"，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法学；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，第I-III卷Cellis，J. E.编辑(1994)；"Culture of Animal Cells - A Manual of BasicTechnique" by Freshney，Wiley-Liss，N. Y.(1994)，第三版；"CurrentProtocols inImmunology"第I-III卷Coligan J. E.编辑(1994)；Stites等人(编辑)，"Basic andClinical Immunology"(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，"SelectedMethods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，NewYork(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中得到广泛描述，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis" Gait，M. J.编辑(1984)；“Nucleic AcidHybridization" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑(1985)；"Transcription andTranslation" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑(1984)；"AnimalCell Culture"Freshney，R. I.编辑(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,(1986)；"APractical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.,(1984)，以及"Methods inEnzymology"第1-317卷，Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods AndApplications"，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，"StrategiesforProtein Purification and Characterization - A Laboratory CourseManual" CSHLPress(1996)；所有这些都引入作为参考，如同它在本文中充分阐述一样。本文件自始至终提供了其它一般参考文献。其中的程序被认为是本领域众所周知的，并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作为参考。
材料和方法
小鼠
使用C57BL/6背景的G93A mSOD1-Tg小鼠。在所有实验中，使用年龄和性别匹配的小鼠，并且使用WT同窝仔畜作为对照。在实验开始时，小鼠为40日龄。所有小鼠保持在严格的24小时反向光暗周期，其中灯从10pm到10am打开。从40日龄直到实验终点应用色氨酸缺乏饮食(A10033Yi，Research diets，NJ，USA)。对于抗生素治疗，从40日龄开始，小鼠在其饮用水中给予万古霉素(0.5 g/l)、氨苄西林(1g/l)、卡那霉素(1 g/l)和甲硝唑(1 g/l)的组合，如先前所述(Levy等人，2015)。对于嗜粘蛋白艾克曼氏菌或扭链瘤胃球菌定殖，40日龄的小鼠用抗生素治疗2周，并且在2天清洗期后，每周用200 μl PBS悬浮细菌(O.D.=0.7)进行管饲，直至实验终点。
代谢产物的施用
对于NAM和苯酚硫酸盐的体内施用，使用了Alzet渗透微型泵型号1004 (CharlesRiver) (以0.11 μL/小时的速率输注化合物共4周)。泵填充有在无菌水中稀释的100 μL50 mg/ml烟酰胺(Cymit Quimica，Barcelona，西班牙)或33.33 mg/ml苯酚硫酸钠盐(TLC，Ontario，加拿大) (等价于49.28 mg/kg/周的NAM和30.8 mg/kg/周的苯酚硫酸盐)。媒介物对照泵含有等体积的超纯水。6周龄的SOD1-Tg和WT同窝小鼠通过氯胺酮(100 mg/kg)和赛拉嗪(10 mg/kg)的i.p.注射进行麻醉，将颈部皮肤剃毛并用70%乙醇消毒，在皮肤上切开1cm的切口，在最低限度的钝器解剖后，将渗透性微型泵插入并置于右后胁上方。然后用无菌手术夹闭合切口，并且仔细监测动物的应激、出血、疼痛或异常行为的任何体征。微型泵每4周进行更换，共3次，直到小鼠为5月龄。
小鼠中的运动功能评价
转棒：为了评价运动协调和平衡，每只小鼠用转棒装置(Panlab Le8500 HarvardApparatus，西班牙)，以加速模式(在10分钟过程中从4 rpm增加到40 rpm)进行测试，其中最大测试时间为5分钟。在正式测试之前，使小鼠习惯于在水平旋转棒上，并且预训练3次试验。每只小鼠分别在60、80、100、120和140日龄时记录3次。当小鼠从转轴跌落时，仪器自动记录经过的时间。
吊线抓握测试：允许小鼠用其前爪抓握2 mm厚的水平金属线(悬吊在工作表面上方80 cm)，并且记录成功举起其后腿来抓握线的等待时间。观察小鼠30秒并如下评分：0 =在10秒内跌落；1 = 通过两个前爪挂在杆上；2 = 尝试爬上杆；3 = 通过两个前爪加上一个或两个后爪挂在杆上；4 = 通过所有四个爪子加上缠在杆周围的尾巴悬挂；5 = 主动逃跑到杆的末端。
神经学评分：通过经由ALS TDI (Hatzipetros等人，2015)开发的系统，对小鼠进行神经学评分：评分0：当小鼠通过其尾巴悬垂时，后腿远离横向中线而完全伸展，并且小鼠可以保持这个姿势两秒，悬垂两至三次。评分1：在尾巴悬垂过程中，朝向横向中线的腿部伸展塌陷或部分塌陷(虚弱)或后腿发抖。评分2：在12英寸的行走过程中，脚趾向下弯曲至少两次，或者脚的任何部分沿着笼底部/桌子拖动。评分3：刚性麻痹或最低限度的关节活动，脚未用于生成向前运动。评分4：在置于任一侧后30秒内，小鼠无法自行直立。
室笼运动：通过使用InfraMot (TSE-Systems)的体热图像的自动感测，在室笼经过46小时的时期，对动物的运动进行定量。每30分钟概括各个动物运动。
存活
从130日龄开始，每天对小鼠进行监测。通过达到神经学评分4和/或体重的多于15%减轻来定义终点。使用卡普兰迈耶方法来计算存活概率，并且使用时序检验来执行统计分析。
脑脊髓液(CSF)提取
小鼠通过氯胺酮(100 mg/kg)和赛拉嗪(10 mg/kg)的i.p.注射进行麻醉。将颈部的皮肤剃毛，并且将小鼠俯卧置于立体定位仪上。用头部适配器将头部固定。手术部位用70%乙醇擦拭，并且在枕骨下方制备皮肤的矢状切口。在解剖显微镜下，通过用镊子的钝器解剖，来分开皮下组织和肌肉(头棘肌和头背侧大直肌)。一对微型牵引器用于将肌肉保持分开。用无菌棉签将硬脑膜吸干。使用毛细管穿过硬脑膜，从脊髓背侧动脉侧面进入小脑延髓池内，来收集CSF，立即在液氮中冷冻并贮存于-80℃下。
磁共振成像(MRI)
在MRI扫描过程中，小鼠用与氧(1升/分钟)混合的异氟烷(5%用于诱导，1-2%用于维持)进行麻醉，并且通过鼻罩进行递送。一旦麻醉，就将动物置于头部固定器中，以确保在磁体内部的可重复定位。监测呼吸速率，并且在实验期自始至终维持约60-80次呼吸/分钟。MRI实验在配备有梯度线圈系统的9.4 Tesla BioSpec磁铁94/20 USR系统(Bruker，德国)上执行，所述系统能够在三个方向各自上产生高达40高斯/cm的脉冲梯度。所有MR图像都用
接收正交小鼠头表面线圈和发射器线性线圈(Bruker)进行采集。使用具有以下参数的多层自旋回波(MSME)成像序列采集T2图：3000 ms的重复延迟(TR)，16次回波(TE)增量(从10到160ms线性地)，矩阵尺寸256 x 128(内插至256 x 256)和两个均值，对应于12分48秒的图像采集时间。T2数据集由16个图像/切片组成。用2.0 x 2.0 cm2的视野(FOV)采集切片厚度为1.00 mm的十三个连续切片。
图像分析：从多回波T2加权图像生成定量T2图。使多回波信号拟合至单指数衰减，以提取关于每个图像像素的T2值。所有图像分析都使用在Matlab R2013B中编写的自制脚本来执行。在MRI数据集分析之前，应用在受试者之间和受试者内部的共配准。为了最佳适应小鼠脑图谱(头部运动图像伪影的校正)，所有图像都经过图谱配准：使用SPM软件(版本12，UCL，London，UK)的重新切片，重新对齐和平滑处理。结果报告为平均值 ± SD。使用t检验来比较两组的平均值。小于0.01的p值被视为统计学显著的。
组织学
将来自脊髓(C3-T6)的切片在低聚甲醛中固定，并且在石蜡中包埋，用于由luxol坚牢蓝和焦油紫染色。随后，通过不知情的研究者检查切片，并且计数腹角中的焦油紫阳性的运动神经元，以评估神经元存活。将结肠组织在无水甲醇- Carnoy中固定，并且用核染剂Sytox绿进行染色，并且Muc2粘蛋白用抗MUC2C3抗血清和山羊抗兔-Alexa 555(ThermoFisher Scientific)进行染色66。
通过FITC-右旋糖酐测量肠道上皮屏障通透性
在测定法当天时，使4 kDa异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐在PBS中溶解至80 mgml‐1的浓度。在用150μl右旋糖酐管饲之前，将小鼠禁食4小时。在管饲之后3小时将小鼠麻醉，并且收集血液并在4℃下以1,000 x g离心12分钟。收集血清，并且在485 nm的激发波长和535nm的发射波长下定量荧光。
流式细胞术
自40日龄以后用Abx或作为对照的水治疗的WT和SOD1-Tg小鼠，用于在第140天时(对于小肠和结肠)或在第60和140天时(对于脊髓)的小肠、结肠和脊髓细胞构成分析。将小肠和结肠样品彻底洗掉粪便物，随后为在37°C下30分钟的2 mM EDTA解离。在充分振荡后，弃去上皮级分。然后使用DNA酶I和胶原酶消化样品用于粘膜固有层分析。脊髓样品从各小鼠中进行收获，匀浆化并且与HBSS溶液一起温育，所述HBSS溶液含有2% BSA (Sigma‐Aldrich)、1 mg/ml胶原酶D (Roche)和0.15 mg/ml DNA酶1，通过70 μm网筛过滤。在密度离心(在20°C下1000 × g. 15分钟，伴随低加速度且无制动)之前，将匀浆化的切片重悬浮于40% percoll中。分离的细胞用冷PBS洗涤，并且重悬浮于含有1% BSA的PBS中，用于直接细胞表面染色。单细胞悬浮液在冰上用抗体染色45分钟，所述抗体针对CD45、CD11b、CD11c、F4/80、Ly6C、Ly6G、B220、CD3、CD4、CD8和NK1.1。染色的细胞在BD‐LSRFortessa细胞计数器进行分析，并且用FlowJo软件进行分析。
粘液蛋白质组学分析
对于蛋白质组分析，使分离的粘液样品在还原缓冲液(6M盐酸胍，0.1M Tris/HCl，pH 8.5，5mM EDTA，0.1MDTT (Merck))中在37°C下温育过夜，并且在旋转过滤器(10 kDa，PALL，Port Washington，NY)的顶部上添加可溶性级分，用于遵循先前方案67的过滤器辅助的样品制备，其中使用6M GuHCl代替尿素。过滤器上的蛋白质是烷基化的，随后用LysC(Wako，Richmond，VA)消化4小时，随后为过夜胰蛋白酶(Promega，Fitchburg，WI)消化。在胰蛋白酶消化之前添加重肽(SpikeTides TQL，JPT Peptide Technologies，Berlin，德国)，用于Muc2绝对定量(10种肽，各100 fmol68)。在离心后从过滤器中释放的肽用StageTip C18柱进行清洗69。在EASY-nLC 1000系统(Thermo Fisher Scientific)上执行NanoLC–MS/MS，所述系统通过纳米电喷雾离子源连接至QExactive HF Hybrid Quadrupole-OrbitrapMass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific)。使用300 nl/分钟的流速，通过从10到45%的缓冲液B (A：0.1%甲酸，B：0.1%甲酸/80%乙腈)的30分钟梯度，用内部填充的反相柱(150 x 0.075 mm内径，C18-AQ3 µm)来分离肽。获得了来自350–1,600 m/z的完整质谱，其中分辨率为60,000 (m/z 200)。对多达15个最强的峰(电荷状态≥ 2)进行片段化，并且用15,000的分辨率和20 s动态排除来获得串联质谱。对于绝对定量，使用分开的靶向质谱方法，其中仅以30,000的分辨率扫描重肽和相应的轻肽的前体及其片段。通过针对小鼠(下载的11.07.2018)UniProt蛋白质数据库搜索，并且补充含有所有小鼠粘蛋白序列的内部数据库(www(dot)medkem(dot)gu(dot)se/mucinbiology/databases/)，用MaxQuant程序(版本1.5.7.470)鉴定了蛋白质。以完全的胰蛋白酶特异性，最多2次错过的切割，在用于重新校准的第一次搜索中20 ppm的前体耐受性，随后为用于主要搜索的7 ppm和用于碎片离子的0.5Da来执行搜索。将半胱氨酸的脲基-甲基化设定为固定修饰，并且将甲硫氨酸氧化和蛋白质N端乙酰化设定为可变修饰。所需的假发现率(FDR)对于肽和蛋白质水平两者设定为1%，而所需的最小肽长度设定为6个氨基酸。使用最少两种肽用于定量，基于MaxQuant的无标记定量(LFQ)选项，来定量蛋白质。用Skyline (版本4.2.071)执行Muc2的绝对定量。
细菌培养物：嗜粘蛋白艾克曼氏菌(ATCC BAA-835)、嗜粘蛋白艾克曼氏菌(ATCCBAA-2869)、扭链瘤胃球菌(ATCC 27756)、加氏乳杆菌(ATCC 33323)、产黑普雷沃氏菌(ATCC25845)、链状粪杆菌(Coprobacillus cateniformis)(DSM-15921)、戈氏副拟杆菌(DSM-19448)、鼠乳杆菌(DSM-100194)、狄氏副拟杆菌(ATCC 8503)、Eisenbergiella tayi(DSM-24404)、Subdoligranulum variabile(SDM-15176)，在碎肉培养基(BD 297307)中，在厌氧条件下(Coy Laboratory Products，75% N2，20% CO2，5% H2)，在37℃下无需振荡进行生长。迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta) (DSM-15644)在补充有0.5%精氨酸的碎肉培养基中进行生长。通过全基因16S桑格测序验证了所有菌株的纯度。WT和ΔnadA大肠杆菌最初得自“Keio保藏中心72”，并且在LB培养基(WT)或补充有30 μg/ml卡那霉素的LB (ΔnadA)上生长。为了测量细菌的体外烟酰胺分泌，使细菌菌株在碎肉培养基中生长直至静止相，离心并用具有微量元素和葡萄糖(4 g/l)的M9基本培养基洗涤两次，然后在厌氧条件下重悬浮于M9中3小时。在离心之后，收集50 μl上清液用于靶向烟酰胺测量，并且使用BCA方法，从沉淀中提取蛋白质：简言之：将细菌沉淀在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆化，在4°C下温育45分钟，并且在4°C下以14,000 r.p.m.离心20分钟。然后将培养基中的烟酰胺测量针对每种样品中的总蛋白水平进行标准化。
核酸提取
DNA纯化：根据制造商的建议，使用PureLink™ Microbiome DNA PurificationKit (Invitrogen)，从小鼠粪便样品中分离DNA。
使用针对自动化平台优化的PowerSoil DNA Isolation Kit (MOBIOLaboratories)，从患者大便拭子中分离DNA。
RNA纯化：脊髓、结肠和肌肉(股外侧肌)样品从小鼠中进行收获，并且在液氮中进行速冻。将组织在Tri Reagent (Sigma Aldrich)中匀浆化。使用标准氯仿提取来纯化RNA。两微克总RNA用于生成cDNA(HighCapacity cDNA Reverse Transcription试剂盒；AppliedBiosystems)。
在Viia7仪器(Applied Biosystems)上，使用Kapa Sybr qPCR试剂盒(KapaBiosystems)执行PCR。PCR条件为95°C 20 s，随后为95°C 3 s和60°C 30 s的40个循环。使用∆∆Ct方法来分析数据，其中16S充当参考管家基因。确保16S循环对实验条件不敏感。
核酸加工和文库制备
用于细菌DNA定量的16S qPCR方案：将DNA模板稀释至1 ng/ul，然后使用FastSybrTMGreen Master Mix (ThermoFisher)，一式两份地用引物组(表1中所示)进行扩增。用于嗜粘蛋白艾克曼氏菌的扩增条件为：95℃变性3分钟，随后为95℃变性3秒；66℃退火30秒的40个循环，随后为解链曲线。关于总细菌(16SrRNA)的扩增条件为：95℃变性3分钟，随后为95℃变性3秒；60℃退火30秒的40个循环，随后为解链曲线。从分析中排除具有>2个循环差异的重复。将在40个循环后未扩增的任何样品的CT值定义为40(检测阈值)。
表1. qPCR分析中使用的引物。
16S rDNA测序
对于16S扩增子焦磷酸测序，使用16S rRNA基因的引物515F/806R，跨越V4区域执行PCR扩增，然后使用2x250 bp配对末端测序(Illumina MiSeq)进行测序。将定制引物加入IlluminaMiSeq试剂盒中，导致在配对末端连接之后测序至110,998 ± 66,946个读数(平均值±SD)深度的253 bp片段。
读数1：TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA (SEQ ID NO：8)
读数2：AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT (SEQ ID NO：9)
索引序列引物：ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACTATTAGAA (SEQ ID NO：10)
全基因组鸟枪法测序
用Covaris E220X超声仪剪切100 ng纯化的DNA。Illumina相容的文库如所述的(Suez等人，2014)进行制备，并且在Illumina NextSeq平台上用80bp的读数长度，对于人样品测序至10M读数的深度、对于AM治疗的小鼠样品测序至1M读数的深度、且对于首次用于实验的WT和SOD1-Tg小鼠之间的比较测序至5M读数的深度。
RNA-Seq
根据公开方法(Adiconis等人，2013)的修改版本，通过RNA酶H (New EnglandBiolabs，M0297)选择性地耗竭核糖体RNA。具体而言，将与鼠rRNA18S和28S互补的50bp DNA寡核苷酸(25 nM，IDT，表3中所示)库重悬浮于75 µl 10 mM TrispH 8.0中。将总RNA(在10µl H2O中100-1000 ng)与等量的rRNA 寡核苷酸库混合，稀释至2 µl，并且添加3 µl 5xrRNA杂交缓冲液(0.5 M Tris-HCl，1 M NaCl，用HCl滴定至pH 7.4)。使样品在95°C下温育2分钟，然后将温度缓慢降低(-0.1°C/s)至37°C。在杂交结束前5分钟，制备RNA酶H酶混合物(2 μl 10U RNA酶H，2μl 10 x RNA酶H缓冲液，1 μl H2O，总共5 μl混合物)，并且预热至37°C。当样品达到37°C时，将酶混合物加入样品中，并且使它们在此温度下温育30分钟。根据制造商的说明书，用2.2xSPRI珠(Ampure XP，Beckmann Coulter)纯化样品。通过与5 µl DNA酶反应混合物(1 µlTrubo DNA酶，2.5 µl Turbo DNA酶10 x缓冲液，1.5 µl H2O)一起在37°C下温育30分钟，用DNA酶处理(ThermoFisher Scientific，AM2238)去除残留的寡核苷酸。样品再次用2.2x SPRI珠进行纯化，并且悬浮于3.6 µl引发混合物(New EnglandBiolab的0.3 µl随机引物，E7420，3.3 µl H2O)中。随后将样品在65°C下引发5分钟。然后将样品转移至冰，并且加入2 µl第一链混合物(1 µl 5x第一链缓冲液，NEB E7420；0.125µlRNA酶抑制剂，NEB E7420；0.25 µl ProtoScript II逆转录酶，NEB E7420；以及0.625 µl的0.2 µl/ml放线菌素D，Sigma，A1410)。根据制造商的说明书，使用用于Illumina的NEBNextUltra Directional RNA Library Prep Kit (NEB，E7420)，来执行第一链合成和所有后续文库制备步骤(所有反应体积都减少至四分之一)。
表3.用于rRNA耗竭的DNA寡核苷酸
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16S rDNA分析
重叠的配对末端FASTQ文件在Qiime 2版本2018.4.0 (Qiime2) (Caporaso等人，2010)中实现的数据管理管道(data curationpipeline)中进行匹配和加工。使用Qiime2demux-emp-paired，根据样品特异性条形码，对配对末端序列数据进行多路分解。使用DADA2 (Callahan等人，2016)，来进行修整和扩增子序列变体(ASV)挑选。α稀疏曲线使用Qiime2α稀疏进行绘制，并且用于对于每个比较设定适当的二次采样深度。使用Qiime2特征表稀疏，对样品进行稀疏处理(Weiss等人，2017)。从分析中排除读数深度低于有关二次采样深度的样品。使用于2013年8月训练的Naïve-Bayes拟合分类器，97%同一性的GreengenesrRNA数据库(McDonald等人，2012)，将ASV分配分类群注释。相对丰度表使用Qiime2特征表概括分类群进行计算。使用主坐标分析(PCoA)，从Unweighted和Weighted UniFrac距离矩阵计算排序图(ordination plot)。
宏基因组学分析
对于宏基因组分析，过滤含有Illumina衔接子的宏基因组学读数和低质量读数，并且修整低质量读数边缘。通过用GEM (Marco-Sola等人，2012)映射到人或小鼠基因组(分别为hg19或mm10)，用内含参数来检测宿主DNA，并且去除宿主读数。对于小鼠宏基因组，对1百万次读数进行二次采样，并且对于人，对7-10百万次读数进行二次采样。使用MetaPhlAn2(Loh等人，2016)与缺省参数，来计算来自宏基因组学测序的相对丰度。MetaPhlAn相对丰度上限为5x10−4。KO相对丰度通过使用DIAMOND (Buchfink等人，2015)映射到KEGG (Kanehisa等人，2006)细菌基因数据库来获得，仅考虑了首次命中，并且允许e值<0.0001。KO的相对丰度确定为映射到与该KO相关的细菌基因的所有读数总和除以样品中的映射读数总数。KO相对丰度的上限对于小鼠为2x10-5，且对于人为2x10-7。少于10%的样品中存在的分类群和K0被弃去。
代谢产物的选择：使用WT和SOD1-Tg小鼠中通过Abx改变的前12种重要的血清代谢产物，我们首先下载了KEGG基因的所有核苷酸序列，其具有合成或降解12种代谢产物的潜力。接下来，我们构建了KEGG基因的bowtie索引，并且将其映射到SOD1-Tg和WT宏基因组样品。最后，我们获得了所有映射读数，并且对于每一个样品和KEGG基因，我们报告了映射到KEGG基因的读数数目及其平均评分。评分由bowtie284定义，且范围为0至-45，其中0表示完全匹配。
RNAseq分析
数据预处理：将bcl文件转换为fastq，并且使用bcl2fastq执行衔接子修整。然后，使用STAR(剪接位点识别比对)，将读数与mm10参考基因组(UCSC)进行比对。使用samtools视图-h -F 256 -F 1024去除二次比对和PCR/光学重复。使用htseq-count(htseq-count -a 5 -s reverse -r)，将比对与基因框并。使用RSeQC计算转录物完整性数目(TIN)中值。(tin.py.bed文件：从sourceforgedotnet/projects/rseqc/files/BED/Mouse_Mus_musculus/下载的mm10 RefSeq.bed.gz)
差异基因表达：对于每个比较，在每个比较中，在总读数中具有读数≥ 10-4且在一组的至少五分之一中表达的基因都包括在分析中。Deseq2模型对于每个比较分开拟合[设计：计数~组+中值(TIN)]。使用Wald检验在Deseq2目标上发现差异表达的基因。热图使用正则化的对数转换数据(rlog)来产生。
基因集富集分析：对于每种基因，我们从其DESeq结果中计算下述评分：-log(padj} sign(log2FoldChange)。使用来自liger软件包的bulk.gsea函数，其中www(dot)ge-lab(dot)org/gskb/2-MousePath/MousePath_GO_gmtdotgmt作为通用模型。
非靶向代谢物组学
收集血清和盲肠样品，立即在液氮中冷冻并贮存于-80℃下。样品制备和分析通过Metabolon Inc执行。样品使用自动化MicroLab STAR系统(Hamilton)进行制备。为了去除蛋白质、与蛋白质结合或在沉淀的蛋白质基质中截留的解离的小分子，并回收化学上不同的代谢产物，用甲醇来沉淀蛋白质。将所得到的提取物分为五个级分：一个用于通过UPLC-MS/MS用负离子模式电喷雾电离的分析，一个用于通过UPLC-MS/MS用正离子模式电喷雾电离的分析，一个用于LC极性平台，一个用于通过GC-MS的分析，且一个样品保存用于备份。将样品短暂地置于TurboVap(Zymark)上，以去除有机溶剂。对于LC，样品在准备用于分析之前在氮下贮存过夜。对于GC，每个样品在准备用于分析之前在真空下干燥过夜。
数据提取和化合物鉴定：使用Metabolon的硬件和软件，来提取原始数据，进行峰鉴定和QC处理。通过与纯化标准的文库条目或重复性未知实体的比较来鉴定化合物。
代谢产物定量和数据标准化：使用曲线下面积对峰进行定量。对于跨越多天的研究，执行数据标准化步骤，以校正起因于仪器日间调整差异的变化。
靶向代谢物组学
将50ng/ml的D5-谷氨酸和50ng/ml的D4-烟酰胺(Cambridge IsotopeLaboratories)作为内部标准加入所有样品中。样品(在50%甲醇中)在speed vac中进行干燥，以吹干甲醇，然后在冻干器中干燥至完全。将所有样品重新溶解于100 µl的0.1%甲酸中。
液相层析：液相层析在Waters Acquity UPLC系统上执行。使用10分钟程序，在40°C下，在Acquity HSS T3柱(2.1 × 150 mm，1.8 μm粒径；Waters)上分离代谢产物。流动相由各自含有0.1%甲酸的(A)水和(B)乙腈组成。梯度条件为：0至1分钟 = 99.9% A 0.1% B；1至6分钟 = 0.1%至10.0% B；6至7分钟= 10%至100% B；7.0至7.2分钟 = 100% B；7.2至10分钟 = 99.9% A，0.1%B。注入体积为1.0 μl，且流速为0.3 ml/分钟。
质谱法：LC-MS/MS分析在配备有Zspray ESI源的Waters Xevo三重四极杆上执行。MRM以阳离子模式执行。其它MS参数包括：在600°C下的去溶剂化温度，以900L/Hr的去溶剂化气流，以7巴的150L/Hr雾化器压力下的锥气流，以2.53kV的毛细管电压(CV)。使用的MRM跃迁为：(a)谷氨酸：分别为148.1>84.1和148.1>102，碰撞能量(CE) 15和11V。(b)L-D5-谷氨酸：分别为153.1>88.1和153>107，CE 15和11 V。(c)烟酰胺：分别为123>78和123>80，CE19，13 V，以及(d) D4-烟酰胺：分别为127>81和127>84，CE 19，17 V。使用氩 (0.10 mg/分钟)作为碰撞气体。TargetLynx (Waters)用于定性和定量分析。
患者和对照个体
临床试验：人体试验通过Hadassah医学中心机构审查委员会(Hadassah MedicalCenter Institutional Review Board) (IRB批准号HMO-16-0396)和魏茨曼科学研究所生物伦理学和胚胎干细胞研究监督委员会(Weizmann Institute of Science BioethicsandEmbryonic Stem Cell Research oversight committee) (IRB批准号365-1)批准。从所有受试者获得书面知情同意。
排除和纳入标准(人组)：所有受试者都符合下述纳入标准：18-70岁的男性和女性，其目前并未遵循任何饮食方案或营养师咨询，并且能够提供知情同意。排除标准包括：(i)妊娠或生育治疗；(ii)在参与之前三个月内使用抗生素或抗真菌药；(iii)在参与之前一个月内消费以任何形式的益生菌，(iv)在入选之前三年内的慢性活动性炎症或肿瘤性疾病；(v)慢性胃肠道病症，包括炎性肠病和腹腔疾病；(vi)在参与之前6个月内的心肌梗塞或脑血管意外；(vii)凝血障碍；(viii)慢性免疫抑制药剂使用；(ix)预先诊断的I型或II型糖尿病或者用抗糖尿病药剂治疗。纳入和排除标准的遵守已由医生加以确认。
表4：参与者详细信息
#参与者 性别 组 年龄(岁) 重量(kg) 高度(cm) ALS FRS 亲属
ALS_728 F ALS 33 39.3 170 19
ALS_747 M ALS 61 84.5 181 28
ALS_1890 M ALS 67 83.5 171 42
ALS_1447 M ALS 68 80.2 170 37
ALS_1633 M ALS 40 69.4 175 25
ALS_1640 M ALS 76 92 170 39
ALS_1641 M ALS 51 68.3 181 27
ALS_1659 F ALS 55 48.7 165 8
ALS_1671 F ALS 55 51.3 163 28
ALS_1680 F ALS 53 55.7 170 38
ALS_1717 M ALS 39 69.9 173 29
ALS_1730 F ALS 70 54.9 150 19
ALS_1731 M ALS 68 102.3 178 42
ALS_1739 M ALS 61 66.4 165 26
ALS_1745 M ALS 47 64 175 24
ALS_1753 F ALS 72 156 18
ALS_1764 M ALS 49 79.5 180 37
ALS_1781 M ALS 53 83.2 176 39
ALS_1784 F ALS 51 73.5 165 28
ALS_1787 M ALS 55 63.5 171 32
ALS_1789 M ALS 60 80.2 160 38
ALS_1799 M ALS 57 78 167 40
ALS_1814 M ALS 59 64.3 178 43
ALS_1841 M ALS 47 69.7 186 37
ALS_1779 M ALS 58 86.2 179 38
ALS_1825 M ALS 56 100 174 22
ALS_1851 M ALS 65 67 174 38
ALS_1869 M ALS 64 62.4 160 38
ALS_1883 M ALS 71 180 27
ALS_1857 F ALS 75 72.7 154 41
ALS_1823 M ALS 67 74 176 36
ALS_1888 M ALS 57 89.8 187 42
C_728 F 健康的 46 73 160 48 妻子
C_747 F 健康的 56 65 163 48 妻子
C_1742 F 健康的 43 75 164 48 母亲
C_1633 F 健康的 42 80 167 48 妻子
C_1640 F 健康的 72 54 158 48 妻子
C_1641 M 健康的 48 丈夫
C_1659 M 健康的 58 88 187 48 丈夫
C_1671 M 健康的 55 99 185 48 丈夫
C_1680 M 健康的 59 87 193 48 丈夫
C_1717 F 健康的 46 75 155 48 妻子
C_1730 M 健康的 74 80 176 48 丈夫
C_1731 F 健康的 67 50 162 48 妻子
C_1739 F 健康的 59 71 141 48 妻子
C_1745 F 健康的 46 65 175 48 妻子
C_1753 M 健康的 50 70 172 48 丈夫
C_1764 F 健康的 44 85 163 48 妻子
C_1781 F 健康的 50 90 160 48 妻子
C_1784 M 健康的 50 104 174 48 丈夫
C_1799 F 健康的 56 65 165 48 妻子
C_1814 F 健康的 55 71 163 48 妻子
C_1851 F 健康的 66 68.4 167 48 妻子
C_1833 F 健康的 48 妻子
C_1857 M 健康的 48 丈夫
C_1888 F 健康的 59.5 78 160 48 妻子
C_1890 F 健康的 67 73 164 48 妻子
统计分析
数据表示为平均值 ± SEM。p值<0.05被视为显著的(∗p<0.05；∗∗p<0.05；∗∗∗p<0.005；∗∗∗∗p<0.0005)。使用斯氏t检验来执行成对比较。当分布未知为正态时，使用曼怀二氏U检验。使用ANOVA来执行多重组之间的比较，并且使用FDR校正来调整多重比较。我们使用线性回归，以时间依赖性方式，通过建模神经表型测量(转棒、抓握测试评分和神经学评分)，作为时间和治疗的函数，分析了Abx随着时间过去在对照和SOD1-Tg小鼠中的效应：
表型~时间+时间x治疗+时间x基因型+时间x治疗x基因型
其中时间是天(60、80、100、120和140)，治疗(± Abx)和基因型(WT或SOD1-Tg)是二元指标。然后，通过时间x治疗预测物的p值来推断治疗的显著性。对于此分析，我们使用python statsmodels.api.ols版本0.8.0statsmodels。
使用线性回归来评估随着时间过去的微生物丰度变化：
OUT~时间+时间x基因型
在关于多重OUT的5% FDR校正后，通过时间x基因型预测物的p值，来推断影响OUT丰度的基因型的显著性。
为了分析烟酰胺和色氨酸代谢途径的KO，使用曼怀二氏U秩和检验比较各组间的K0水平。对于此分析，使用python stats.HigherLevelRanksum.directed_mannwhitneyu。
结果
改变的肠道微生物组恶化ALS小鼠模型中的运动症状
为了评价肠道微生物组在ALS中的潜在调节作用，我们使用了用于肌萎缩侧索硬化(ALS)的高拷贝数mSOD1 G93A (在本文中“SOD1-Tg”)小鼠模型。我们通过施用万古霉素(0.5 g/l)、氨苄西林(1 g/l)、新霉素(1 g/l)和甲硝唑(1 g/l) (广谱抗生素，Abx)的组合，通过耗竭在我们的设施中的雄性和雌性SOD1-Tg或同窝对照的肠道微生物组来开始调查，所述组合已一致地显示从40日龄开始显著地耗竭小鼠中的原生微生物组25(图1A)。使用多重方法，即转棒运动测试26、吊线抓握测试27和神经学评分28，对运动能力进行定量。在项目自始至终，关键的重复实验通过两个不知情的研究者独立地评分。出乎意料的是，与水治疗的SOD1-Tg组相比，Abx治疗伴随在ALS进展至始至终显著和实质恶化的运动异常。合并结果(N=15-30只小鼠/组，图1B-D)和每次重复的独立结果((每次重复的每组中的N=5-10只小鼠，三个独立的重复，图8A-I)两者，在转棒运动测试(图1B、图8A、8D和8G)、吊线抓握测试(图1C、图8B、8E和8H)和神经学评分(图1D、图8C、8F和8I)中证实恶化的结果。值得注意的是，与非Abx治疗的WT小鼠相比，Abx治疗并未影响我们的动物饲养所中的WT同窝对照中的转棒或抓握测试表现(图1B-D和图8A-I)。线性回归分析进一步支持了Abx治疗对SOD1-Tg小鼠中的这些神经病理学测量的统计学显著的负面作用(图9A-C)。
与这些发现一致，在140天时的神经元数目的脊髓组织病理学分析(使用luxol坚牢蓝染色)揭示了，与水治疗的SOD1-Tg小鼠相比，Abx治疗的SOD1-Tg小鼠的运动神经元细胞计数显著降低(图1E- F)，提示了在慢性Abx暴露之后增加的运动神经元细胞死亡。此外，在SOD1-Tg模型中已知退化的区域中，鼠脑干的T2加权的磁共振成像(MRI) (图9D29,30)证实了，Abx治疗的SOD1-Tg小鼠的T2弛豫时间延长(图1G-I、图9D-I)，指示了更高水平的游离水、增强的脑萎缩和神经退化31。自动化的室笼运动系统揭示了，与水治疗的SOD1-Tg对照相比，在第100天时，Abx治疗的SOD1-Tg小鼠的活性显著降低(p=0.03) (图9J)。与水治疗的SOD1-Tg小鼠相比，Abx诱导的SOD1-Tg小鼠的运动功能恶化与脊髓(包括活化的小胶质细胞)、小肠或结肠粘膜固有层中的主要免疫细胞亚群的改变无关(图9K-P)，提示了Abx相关的表型差异并非由明显的免疫异常介导。
重要的是，SOD1-Tg小鼠进入无菌设置的净化(rederivation)尝试与SOD1-Tg的高死亡率相关，但与WT同窝对照无关(经过18个月的时期，30只怀孕母鼠的净化尝试失败)。一旦净化成功，与GF WT同窝仔畜或定殖的SOD1-Tg小鼠相比，GF SOD1-Tg小鼠的特征就在于显著增加的死亡率(图1J，合并结果，N=9-22只小鼠/组，图10A-B，两次独立的重复，N=5-13/组)。即使当GF小鼠在第115天时自发定殖时，增加的死亡率仍然存在，提示了微生物驱动因素在较早的疾病阶段影响ALS进展。此外，在另外的ALS小鼠模型TDP43-Tg小鼠中，通过Abx治疗的微生物组耗竭基本上并显著地增加了死亡率(图1K为合并结果，且图10C-D为个别重复)，提示了这种有害的微生物组耗竭效应并非局限于SOD1突变。总的来说，这些结果指示了在我们的动物饲养所中，Abx介导的微生物组改变(或其在GF小鼠中的不存在)对SOD1-Tg小鼠中的ALS表现的潜在有害作用，提示了局部生态失调的肠道微生物组配置可能调节这种模型中的疾病进展。
SOD1-Tg小鼠发展了动物饲养所依赖性临床前生态失调
在我们的动物饲养所中的SOD1-Tg模型中这些提示的微生物介导的对ALS神经病理学的作用，呈现了鉴定潜在地调节ALS过程的局部流行的共生菌株的机会。实际上，在我们的设施中的SOD1-Tg和WT同窝对照中通过16s rDNA测序评价粪便微生物组组成和功能，指示了在疾病过程期间持续存在的早期且明显的微生物组组成差异(图2A-C、图11A-C)。值得注意的是，在我们的动物饲养所中，SOD1-Tg小鼠中的生态失调主要通过艾克曼氏菌属、厌氧原体属、普雷沃氏菌属、副拟杆菌属、理研菌科和乳杆菌属驱动，与WT同窝对照相比，所述细菌在SOD1-Tg粪便中全部显著降低(图11C-G)，而瘤胃球菌属、脱硫弧菌科、Allobaculum、萨特氏菌属、螺杆菌科、粪球菌属和颤螺菌属在SOD1-Tg粪便微生物组中的16SrDNA丰度富集(图11H-M)。此外，在所有时间点，观察到的属的总数(α多样性)在SOD1-Tg大便中更高(图11N)，提示了与WT同窝仔畜相比，在SOD1-Tg小鼠中改变的群落结构。然而，总粪便细菌负荷在SOD1-Tg和WT对照之间并未改变(图11O)。此外，即使在我们的动物饲养所中Abx治疗的SOD1-Tg及其WT同窝对照的肠道微生物组配置，在跨越疾病进展的所有检查时间点也产生了显著差异的微生物组组成(图12A-G)，其通过Abx治疗的WT微生物组中的拟杆菌属、副拟杆菌属和梭菌属，以及Abx治疗的SOD1-Tg小鼠中的萨特氏菌属和肠杆菌科的增殖驱动(图12H-M)。重要的是，在我们的动物饲养所中的GF SOD1-Tg和WT同窝仔畜的自发定殖与从头的生态失调的发展相关(图13A-I)，而在第二种无障碍(非SPF)动物饲养所中未观察到设施依赖性的生态失调差异，其特征在于艾克曼氏菌属、副拟杆菌属、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)和螺杆菌科的几乎不存在(图14A-E)。总之，这些设施依赖性变化提示了，鼠ALS遗传易感性加上局部流行的共生标志的组合，驱动了早期临床前生态失调，可能促成在该设施中的ALS调节。
为了进一步评价在我们的动物饲养所中与ALS进展相关的物种水平的组成和功能微生物组差异，在不同时间点下，与WT同窝仔畜相比，我们进行了SOD1-Tg小鼠的粪便微生物DNA的鸟枪法宏基因组学测序。实际上，使用MetaPhlan2，与同窝对照相比，在SOD1小鼠的微生物组组成中注意到显著差异(图2D和图15A-B)，其起源于多重物种水平的分类群差异。例如，与WT同窝对照相比，狄氏副拟杆菌、未分类的另枝菌属、鼠乳杆菌、未分类的伊格尔兹氏菌属、戈氏副拟杆菌、未分类的罕见小球菌属和嗜粘蛋白艾克曼氏菌(图15C-H和图3A)在SOD1-Tg微生物组中显著减少，而肝螺杆菌、约氏乳杆菌、普通拟杆菌、假长双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌和脱硫脱硫弧菌(图15I-N)是富集的。在功能上，SOD1-Tg和WT粪便细菌宏基因组就微生物基因而言分开地聚簇(对于PC1：第40天，p=0.0002，第60天，p=0.0002，第80天，p=0.0005，第100天，p=0.0005，KEGG直向同源物，KO，图2E)，包括编码参与色氨酸代谢的酶的基因表示的显著降低(图2F-G)，以及编码涉及烟酰胺和烟酸代谢的酶的基因的实质改变(图2H)。为了排除这些早期的微生物组效应是继发于SOD1-Tg小鼠中改变的新陈代谢，我们在临床前60天执行详细的代谢评价，并且没有发现在食物和水摄入、呼吸交换率、氧耗量、运动和产热方面的明显变化(图16A-L )。
总的来说，这些结果证实了，即使在临床运动神经元功能障碍症状出现之前，在我们的动物饲养所中，单基因型饲养的SOD1小鼠在其肠道微生物组成和功能方面也不同于其WT同窝仔畜配置。
共生微生物促成ALS恶化
接下来，我们寻求确定上述动物饲养所依赖性的丰度差异的肠道共生微生物与鼠ALS相关的运动功能的调节之间的可能因果关系。我们总共测试了11种菌株，包括迟缓埃格特菌、链状粪杆菌、戈氏副拟杆菌、鼠乳杆菌、狄氏副拟杆菌、加氏乳杆菌、产黑普雷沃氏菌、Eisenbergiella tayi(毛螺菌科的成员)、Subdoligranulum variabile、扭链瘤胃球菌和嗜粘蛋白艾克曼氏菌，通过我们的复合16S rDNA和鸟枪法宏基因组学分析提示的，全部与在我们的动物饲养所中的SOD1-Tg模型中的ALS进展的严重程度相关联(图11A-O和图15A-N)。为此，我们将上述菌株(静止期O.D.＝0.4-0.7)各自的厌氧培养物单一接种到Abx预治疗的SOD1-Tg和WT小鼠内，通过以6天间隔的重复经口施用，总共15次治疗。这些小鼠由大多数所示细菌的单一定殖并不影响ALS症状(图17A-L)。Abx治疗的SOD1-Tg小鼠用两种菌株(狄氏副拟杆菌(PD，图17A-L)和扭链瘤胃球菌(RT，图18A-M和图19A-I))的补充恶化了疾病进展，而加氏乳杆菌和产黑普雷沃氏菌治疗(分别为LG和PM)在一些但并非所有行为测试中显示了促进疾病的效应(图17A-L)。实际上，RT水平与SOD1-Tg小鼠中的ALS进展正相关(图18A)，在施用后使运动功能恶化，如通过转棒、抓握测试和神经学评分指示的，如通过4种独立治疗的合并结果指示的(N＝20-40只小鼠/组，图18B-D)，尽管在独立分析的重复之间注意到一些变化性(每次重复的每组中的N＝5-10只小鼠，图19A-1)。与媒介物治疗的小鼠相比，在RT治疗的SOD1-Tg小鼠中，并未发现神经元死亡率中的组织学差异(图18E-F)，但使用T2加权的MRI扫描(图18G-M)发现较高的早期发作(第100天)萎缩。值得注意的是，测试的11种细菌菌株无一影响WT动物中的运动能力(图17G-I为9种测试细菌菌株，且图18A-M和图19A-I为RT)。共同地，这些结果提示了，在SOD1-Tg ALS小鼠模型中，多重共生体可能促成运动神经元退化。
AM定殖改善鼠ALS并延长存活
在我们的动物饲养所中的SOD1-Tg小鼠中的差异改变的物种之一是嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)，其中16S rDNA (图11C)和鸟枪法宏基因组学测序(图15B和图3A)两者证实了，与WT同窝仔畜微生物组中的稳定高表示相比，随着SOD1-Tg小鼠中的疾病进展，其丰度逐渐降低。使用AM特异性qPCR，在SOD1-Tg大便样品中验证了在我们的动物饲养所中AM 16SrDNA拷贝的水平减少(图3B)。用厌氧单一培养的AM菌株(BAA-835，O.D. =0.7，静止期)治疗Abx预治疗的SOD1-Tg和WT小鼠(以6天间隔经口施用，共15次治疗)，与AM治疗的SOD1-Tg小鼠中改善的运动功能相关，如通过转棒、抓握和神经学评分测试定量的，并且在合并样品(N=34-62只小鼠/组，图3C-E)或由6次重复(每次重复的每组中的N=5-25只小鼠，图17A-C和图20A-O)独立地评价的。与媒介物治疗的Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠相比，这种AM介导的功能改善伴随着AM治疗的SOD1-Tg脊髓中更高的运动神经元存活(图3F-G，p=0.0041)。重要的是，与媒介物治疗的小鼠或用充当细菌对照的其它共生微生物组物种治疗的SOD1-Tg小鼠相比，AM治疗显著地并实质地延长SOD1-Tg小鼠的寿命(图3H)。如通过MRI测量的，通过在特异性ALS受累脑区域中降低的T2弛豫时间所指示的，AM治疗在第140天也减轻脑萎缩(图21A-D)。AM对ALS进展的有益效应并非起因于在其它背景下，通过这种细菌可能诱导的肠道通透性改变32，因为在120天在AM-、PBS-和其它微生物治疗的SOD1-Tg和WT小鼠之间，并未发现全身FITC-右旋糖酐流入中的差异(图21E)。AM治疗的SOD1-Tg小鼠的微生物组宏基因组与PBS治疗的SOD1-Tg对照不同地聚簇(图21F)。如预计的，与媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠相比，AM相对丰度在AM治疗的SOD1-Tg小鼠的大便样品中是显著增加的(图21G)。相比之下，在我们的动物饲养所中具有高和稳定的原生AM水平的WT小鼠的特征在于外源施用的AM的竞争性排斥，所述外源施用的AM的水平仅在长期施用后上升(图21H)。此外，与WT GI道相比，发现AM在SOD1-Tg GI道的不同区域中更广泛和有效地定殖(图21I-J)。因而，在Abx治疗之后的AM补充以不同的方式改变WT和SOD1-Tg小鼠两者中的微生物组组成(图21K、L)。
为了进一步验证我们的结果，我们用另一种AM菌株(ATCC 2869)对Abx预治疗的SOD1-Tg和WT同窝仔畜进行进行单一定殖。类似于用AM(ATCC BAA 835)观察到的结果，AM2869定殖的SOD1-Tg小鼠呈现了在其运动能力方面的显著改善(图22A-C)，提示了所观察到的AM对ALS症状的有益效应可能跨越不同的AM菌株。由于AM是粘蛋白聚糖降解细菌33，我们在第140天进一步进行AM或PBS治疗的SOD1-Tg的远端结肠粘液的组织病理学分析。在AM补充和PBS治疗的SOD1-Tg小鼠中，观察到完整的内部粘液层粘液(图23A)。与PBS治疗的对照SOD1-Tg小鼠形成对比，AM治疗的SOD1-Tg小鼠具有渗透到内部粘液中的细菌，以及在极少数情况下进入隐窝内的细菌(图23B，白色箭头)。蛋白质组学分析并未发现AM补充的小鼠的粘液组分的显著差异(图23C-J)。总的来说，通过其单一接种到SOD1-Tg小鼠内的多重差异表达的肠道共生体的评价，鉴定了不利地(PD、RT以及潜在的LG和PM)或有利地(AM)调节小鼠ALS疾病过程和严重程度的所选共生体。
AM通过系统性升高烟酰胺水平来减轻鼠ALS
不同肠道共生体对鼠ALS临床过程的上述调节影响很可能通过各种机制促成。作为一个实例，我们接下来评价了微生物组诱导的机制，潜在地解释了在我们的动物饲养所中AM介导的对小鼠ALS疾病过程的有益作用。鉴于肠道微生物组距CNS疾病部位较远，我们假设肠道微生物组调节的代谢产物可能通过易位至CNS，而影响SOD1-Tg小鼠中的运动神经元易感性9,10。为此，我们在ALS的早期阶段(第100天)，利用非靶向的代谢物组学概况分析，以鉴定在AM补充和媒介物对照的血清中丰度不同的候选的微生物组依赖性分子。在SOD1-Tg小鼠中鉴定的711种血清代谢产物中，84种代谢产物通过AM补充显著改变，其中51种通过AM治疗而升高(图4A和图24A-C)。在这些中，仅6种代谢产物的生物合成基因(核苷酸序列，KEGG数据库)与我们的宏基因组学指标对准，其中两种代谢产物，烟酰胺和苯酚硫酸盐，特征在于在我们的动物饲养所中，相对于SOD1-Tg小鼠微生物组，由WT微生物组合成的最高宏蛋白组学概率(图24D)。使用确保对于鼠ALS过程持续时间的连续药物施用的皮下植入的缓释微型渗透泵，对SOD1-Tg小鼠施用苯酚硫酸盐，并不影响体内的ALS症状(图24E-G)。
几个关键的观察结果提示了，NAM可能涉及AM介导的鼠ALS的正调节。在Abx治疗后注意到宏基因组学NAM生物合成途径中的显著改变(图2H)。在AM补充后，注意到NAM生物合成中间产物的血清水平的富集(图4B)。另外，鸟枪法宏基因组学测序揭示了，肠道微生物组衍生的色氨酸代谢途径的几个基因(图2F-G) (其也已显示为涉及NAM的生成34,35)，在首次用于实验的SOD1小鼠中显著降低，而色氨酸途径的系统性代谢产物在Abx治疗或AM补充后改变(图25A-B)，提示了色氨酸代谢的微生物组调节可能潜在地促成这些设置下的NAM水平改变。
为了检查AM是否能够产生且分泌NAM，我们使用靶向代谢物组学，测量了厌氧生长的AM以及对照革兰氏阳性和阴性共生分离物中的NAM水平。实际上，与从热灭活的AM或从其它共生分离物中收集的上清液相比，在AM培养物的培养基中发现显著更高水平的NAM (图4C)。为了进一步探索AM分泌/诱导的NAM可能到达CNS并影响运动神经元的可能性，与媒介物治疗的SOD1-Tg和WT同窝小鼠相比，我们测量了在我们的动物饲养所中AM治疗的CSF中的NAM水平。实际上，早在100日龄时(早期疾病)，CSF NAM水平在AM治疗的SOD1-Tg和WT小鼠两者中显著更高(图4D)。在疾病的晚期过程中(第140天)，与未治疗的对照相比，CSF NAM水平在AM治疗的SOD1-Tg小鼠中显著更高，但在AM治疗的WT小鼠中则不是(图4E)，潜在地反映了在WT和SOD1-Tg小鼠之间注意到的肠道定殖稳定性差异(图21G-L)。重要的是，与媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠相比，在AM治疗的SOD1-Tg小鼠中，编码参与NAM代谢的酶的10种AM基因组有关基因中的8种是显著富集的(图4F)，指示了SOD1-Tg小鼠中的AM补充可能直接修饰功能性NAM的生物合成。
为了将增加的全身NAM水平与AM补充后注意到的相关表型效应因果联系起来，我们向SOD1-Tg小鼠连续补充通过植入的微型渗透泵皮下施用的NAM，所述微型渗透泵以0.11μl/小时的恒定速率和49.28 mg/kg/周的累积剂量释放NAM。通过每28天更换泵，在40-152日龄之间总共4次，我们确保了在疾病自始至终对小鼠稳定和连续的NAM施用。实际上，与水治疗的对照相比，NAM水平在NAM治疗的SOD1-Tg小鼠的CSF和血清中显著增加(图5A-B)。重要的是，在行为和神经运动测试两者中，NAM治疗的SOD1-Tg小鼠表现显著优于媒介物治疗的SOD1-Tg小鼠，如通过合并分析(N=30只小鼠/组，图5C-E)或三次重复(每次重复的每组中的N=10只小鼠，图26A-I)中独立地指示的。值得注意的是，NAM治疗导致并非显著地改善存活的趋势(图5F)，可能反映了在达到所观察到的AM诱导的存活益处方面，给药或暴露时间不足，或者需要其它AM介导的调节机制的整合(图3H)。
为了检查通过GI细菌产生的NAM是否能够影响运动能力，我们用作为对照的WT大肠杆菌或ΔnadA大肠杆菌(其具有受损的NAD产生)接种了Abx预治疗的SOD1-Tg小鼠(图27)。值得注意的是，大肠杆菌被视为小鼠GI道的弱定殖者36。尽管ΔnadA大肠杆菌补充并不影响转棒和抓握测试性能(图27)，但与WT大肠杆菌治疗的动物相比，它显著改善了SOD1-Tg小鼠的神经学评分(图5G)，提示了即使具有弱定殖能力，由肠道细菌分泌的NAM也能够影响这种ALS小鼠模型中的一些运动能力。
ALS调节的潜在AM和NAM机制
为了探索通过其AM和NAM可能支持SOD1-Tg小鼠中的运动神经元存活并改善ALS进展的潜在分子机制，我们对脊髓样品进行大量RNA测序(RNA-seq)，所述脊髓样品从我们的动物饲养所中的AM和NAM治疗的小鼠中收集，并且比较了通过AM或NAM补充治疗与其相应的对照(在AM和NAM治疗的实验中，分别为PBS治疗或水治疗的对照)诱导的转录变化。总之，在SOD1-Tg小鼠的NAM治疗之后，213种基因的假发现率(FDR)校正的表达显著改变(图6A)。在AM治疗之后，这些基因中的31种在其表达模式方面也显著相关(图6B)。对表型本体论注释NAM响应基因导致与异常脑形态、生理学和运动有关的4个范畴的显著21%拟合，指示了这些基因也可能是改变疾病的(图6C)。为了确定受AM和NAM影响的转录物的功能性，我们将GO(基因本体论)途径分配给每组基因(图6D-E)。AM和NAM干预之间共享的最显著富集的途径与线粒体的结构和功能、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸+(NAD+)稳态和超氧化物自由基的去除(已知在ALS中被破坏的典型功能)有关。有趣的是，发现AM和NAM治疗之间的28.6%的共享基因受转录因子核呼吸因子-1(NRF-1，图28)调控，所述转录因子已知控制线粒体生物发生、电子转运链活性和氧化性应激37- 41。
人ALS患者中的生态失调和受损的NAM水平
最后，我们检查了在我们的动物饲养所中的SOD1-Tg发现与人ALS的特征之间的初步联系。为此，我们通过以下执行了人观察性研究：收集来自32个ALS患者以及作为对照的27个健康BMI和年龄匹配的家庭成员的大便样品，并且对其肠道微生物组宏基因组学进行测序。如通过鸟枪法宏基因组学测序定量的，ALS患者的微生物组组成与健康对照家庭成员显著不同(对于PC1，图7A：p= 3.3x10-6)。尽管我们在FDR校正后并未观察到特异性细菌物种丰度中的任何显著差异，但可以注意到多重组成趋势(图29A)，潜在地暗示了人ALS微生物组的明显不同的总体聚簇起源于细菌丰度中的众多累积的小变化。在功能上，ALS微生物组显示了在总体细菌基因含量方面的显著差异(图7B，对于PC1：p= 2.88x10-9)，伴随着参与色氨酸和NAM代谢的几种关键基因中FDR校正的(对于这些途径调整的)减少，所述关键基因例如嘌呤核苷磷酸化酶(K03783，punA)、烟酰胺核苷酸酰胺酶(K03742，Amuc_0430)、L-天冬氨酸氧化酶(K00278，Amuc_1079)、NAD+合酶(K01950，Amuc_0620)、2-酮戊二酸脱氢酶(K00164，OGDH)、烟酸核苷酸焦磷酸酶(K00767，Amuc_1263)和烯酰基-CoA水合酶(K01782，fadJ，图7C)。重要的是，这些显著降低的基因中的一些全部映射到嗜粘蛋白艾克曼氏菌基因组，提示了尽管所检查的ALS患者的微生物组中AM的相对丰度与健康对照相似，但不同AM菌株的NAM生物合成能力在ALS中可能差异地受损。
ALS患者的血清的非靶向代谢物组学概况分析揭示了多重显著改变的代谢产物，包括升高的利鲁唑(ALS外源施用的治疗)、肌酸和3-羟基-2-乙基丙酸，以及降低的甲基吲哚3-乙酸和三乙醇胺(图29B)。有趣的是，色氨酸-烟酰胺代谢途径的关键分子在ALS患者的血清中显著变化，在其中有吲哚乙酸、犬尿氨酸、血清素和循环烟酰胺(图7D-E)，提示了在这些人ALS病例的一些中的异常NAM代谢。为了检查这些系统异常是否也可能在CNS中得到反映，我们比较了12个ALS患者的CSF中的NAM水平与17个健康的非家庭对照的NAM水平。ALS患者的平均NAM CSF水平显著低于健康个体，其中一些患者的特征在于显著较低的NAM CSF水平(图7F)。
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尽管本发明已与其具体实施方案结合进行描述，但很明显，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。相应地，预期涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都在本文中整体引入说明书内作为参考，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请具体地且个别地指示引入本文作为参考相同。另外，在本申请中的任何参考文献的引用或鉴定，不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。就使用节段标题而言，它们不应被解释为必然的限制。
另外，本申请的任何优先权文件在此整体引入本文作为参考。

Claims (14)

1.益生菌在制备用于治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物中的用途，其中所述益生菌包含嗜粘蛋白艾克曼氏菌(AM)。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物为经口、直肠、经粘膜、肠胃外或静脉内药物。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述ALS为经典ALS、原发性侧索硬化、进行性延髓麻痹或进行性肌萎缩。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包含生理学上可接受的载体。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包含赋形剂。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为片剂、丸剂或胶囊。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物包含载体和粘合剂。
8.根据权利要求1所述的用途，其中AM为干燥形式。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是液体或凝胶组合物的一部分。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包含促进细菌生长的另外益生菌剂或营养物质。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物配制成剂量，并且该剂量包含至少1x106AM细菌/剂。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物配制成剂量，并且该剂量包含至少1x108AM细菌/剂。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物配制成剂量，并且该剂量包含至少1x1010AM细菌/剂。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为糖衣丸。
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