JP2024505003A - ヒトの健康を改善するためのプロバイオティクス処置の方法 - Google Patents

Abstract

プレバイオティクス成分とプロバイオティクス成分の両方を含むシンバイオティクス組成物が提供される。プレバイオティクス成分は、少なくとも１つのプニカラギンを含み、プロバイオティクス成分は、合理的に定義され、組み立てられた微生物菌株のコンソーシアムを含む。シンバイオティクス組成物の経口投与のための送達カプセル、および疾患を処置するためにシンバイオティクス組成物を使用する方法もまた提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１５１０３号明細書およびＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０１５１０７号明細書および米国仮特許出願第６３／１４１，８７４号明細書の優先権の利益を主張し、これらは全て２０２１年１月２６日の出願日を有し、全てが参照により本明細書に組み入れられる。

分野
本開示は、一般に、微生物生物製剤、特に、ナイーブな腸内微生物叢および宿主組織の機能を調節することによって臓器系を介して健康を付与するのに効果的である合理的に定義された微生物学的コンソーシアムに関する。

微生物生物製剤は、常在の腸内微生物群および宿主組織に有益な機能を付与する有望な治療法として出現している。現在、食物アレルギー、自閉症、およびがんを含む様々な状態の予防と処置のために、複数の菌株の重複しない微生物コンソーシアムの投与が臨床的に評価されているが、予防的使用のための複雑なコンソーシアムを再現性良く組み立て、送達する能力はまだ確立されていない。

ヒトには、消化管、口腔、皮膚、鼻孔、および泌尿生殖器に数兆個の微生物が定着している。常在微生物の他に、一過性の種は、食物、特に発酵した食物の摂取を通して常に体内に入る。寿命の延長と乳酸産生菌を含むヨーグルトの消費の相関関係が最初に観察されてから、またビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属種が母乳を与えられた乳児の糞便中に検出され、調製乳を与えられ下痢に苦しんでいた乳児では検出されなかったときから１世紀以上が経過した。これらの初期の「健康のための細菌」概念は、プロバイオティクスを「適切な量で投与されたときに宿主に健康上の利益を付与する生きた微生物」として広く採用されてきた。

プロバイオティクスは歴史的にビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属およびラクトバチルス（Lactobacillus）属を包含していた。２５０種以上のラクトバチルス（Lactobacillus）属種が同定され、互いに遺伝的に高度に異なり、代謝的、生態学的、および機能的にも多様であるようであった。これらの観察は、修正されたラクトバチルス（Lactobacillus）（現在、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）群と呼ばれている宿主適応生物を包含する）、パララクトバチルス（Paralactobacillus）、および２３の新規属を含む２５属へのラクトバチルス（Lactobacillus）属の新しい再分類をもたらした。

米国国立衛生研究所ヒト微生物叢プロジェクトは、健康な個体間の微生物の多様性と豊富さにおける大きなバリエーションを示し、普遍的に健康な微生物叢が存在しないことを示している。この種々の健康状態にもかかわらず、健康状態と疾病状態、および特定の微生物種の存在または存在量の間の重要な相関関係が確立されており、これらの群の操作が疾病を予防し、処置し得る可能性が高まっている。この概念は、いわゆる生きた生物学的治療製品（ＬＢＰ）の開発のために、健康な個人から特定の微生物叢メンバーを分離することを促進した。これらは、疾患状態に有益な影響を与えることを目的として、古典的なラクトバチルス（lactobacilli）およびビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）をベースとしたプロバイオティクス製品に加えられた。注目すべきことに、腸内微生物叢介入は、局所環境に健康上の利益をもたらすだけでなく、例えば腸－皮膚、腸－心臓、および腸－脳軸などを介して遠く離れた場所にも影響を与える。

微生物叢の細菌メンバーは、免疫調節、病原体阻害、上皮バリア完全性の改善、および有益な代謝産物の産生または有害な分子の除去の少なくとも４つの別々の経路によって、健康および疾患に影響を及ぼし得る。

免疫調節
腸管粘膜は、免疫調節に関与するいくつかの特殊化した細胞型を含有し、各々が、ＮＯＤ様およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を含む異なるパターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現する。細菌は、主に細胞外皮に局在し、分泌される、広範な微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）を発現する。ＭＡＭＰに曝露されると、ＰＲＲは、核因子－κＢおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達カスケードに連結される関連アダプタータンパク質を活性化することによって応答し、ケモカイン、サイトカインおよび抗菌ペプチドをコードするものを含む応答遺伝子の発現レベルの変化をもたらす。これは重要なことであるが、腸を免疫調節の重要な領域として確立し、したがって、代謝のホメオスタシスを作り出し、回復させることができる細菌株の主要な標的とする。

ラクトバチルス（lactobacilli）の最初の全ゲノム配列が利用できるようになったことは、プロバイオティクスモデル菌株が宿主免疫系とコミュニケーションする分子機構を解明した時代の始まりとなった。これらのモデル菌株では、ＭＡＭＰをコードする遺伝子を欠失させ、微生物－宿主コミュニケーションへの影響を評価した。例えば、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）ＮＣＦＭ、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＷＣＦＳ１、およびラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＧＧの細胞外皮からのリポテイコ酸（ＬＴＡ）の除去および／または修飾は、ＴＬＲ－２シグナル伝達カスケードが変化した菌株をもたらした。得られたサイトカインプロフィールは明らかに菌株特異的であり、潜在的にＬＴＡ鎖長または置換レベルおよび／またはタイプの差異によって引き起こされたが、一貫してより抗炎症性であった（より多くのＩＬ－１０および／またはより少ないＩＬ－１２）。さらに、突然変異体はマウス大腸炎モデルの親菌株と比較して疾患症状を改善した。同様に、ペプチドグリカンは全てのラクトバチルス（lactobacilli）に存在するが、わずかな構造的バリエーションがプロバイオティクスの有効性において中心的な役割を果たす。ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）ＬＳ３３ペプチドグリカンは、ＮＯＤ－２依存性ＩＬ－１０誘導に関与する菌株特異的ムロペプチドを含有し、合成リガンド（Ｍ－ｔｒｉ－Ｌｙｓ）はＮＯＤ２依存性であるが、ＭｙＤ８８非依存性に大腸炎からマウスを保護した。まとめると、いくつかの保存されたＭＡＭＰ－ＰＲＲ相互作用が分子レベルで解明され、免疫系へのそれらの影響は動物モデルにおける疾患症状の軽減に翻訳される。しかしながら、バクテリアポリマーの微妙な構造上の相違は、完全には理解されていない菌株特異的な効果をもたらし、それによって、バイオインフォマティクスに基づく最適なプロバイオティクス機能性の予測を妨げる。

保存されたＭＡＭＰに起因する菌株特異性は、全てが宿主免疫応答に影響を与えることが確立されている外多糖、壁テイコ酸、線毛、およびタンパク質成分などの大きな組のＭＡＭＰがプロバイオティクス菌株に存在しないという事実によってさらに立証されている。

上皮バリアの完全性
密着結合タンパク質によって連結された腸管上皮細胞の単一細胞層が腸バリアを構成している。このバリアは透過性を調節し、このバリアの障害はグラム陰性病原体、リポ多糖、または腸から血流に入る毒性代謝産物をもたらすことができ、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、自己免疫疾患、ならびに糖尿病および肥満を含む代謝障害に関連する炎症カスケードを開始する。密着結合に加えて、パネート細胞は無菌陰窩を維持するためにデフェンシンを産生し、杯細胞はムチンを分泌する。選択された微生物菌株は、密着結合機能を増加させ、デフェンシン産生を増強し、またはアポトーシスを減弱させるシグナル伝達経路を上方制御することによって、上皮バリア機能を改善することが示されている。

代謝物
微生物が宿主の健康に影響を与える別のメカニズムは、微生物が腸内環境で産生する代謝物、または腸内環境から除去する代謝物を介するものである。明白な例は葉酸であり、哺乳動物では合成されず、外因性の供給源から得られなければならない。このビタミンＢは、核酸およびアミノ酸の合成、ＤＮＡメチル化、ならびに制御性Ｔ細胞の生存を含む、ヒト代謝経路に必要なビタミンである。妊娠中の葉酸摂取量の増加は、神経管の先天異常を減少させる可能性がある。ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株は葉酸を産生し、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＳＤ－ＢＡ５－ＩＴを毎日、健康ボランティアに補充することで、糞便中の葉酸が増加し、重大な健康上の利点が得られる。葉酸の他に、チアミンおよびリボフラビンなどの他のビタミンＢはまた、プロバイオティクスビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属種およびラクトバチルス（lactobacilli）によって産生される。

腸－皮膚軸
ヒトの皮膚に存在する微生物は、温度、湿度、およびｐＨを含む様々な環境圧力、ならびに抗菌ペプチドおよび脂質に曝露される。特に、毛包および皮脂腺、エクリン腺、およびアポクリン腺などの皮膚構造は、異なる微生物叢を有する明確なニッチを表す。少なくとも１９の門は健康な皮膚微生物叢の一部であることが公知であり、特にプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、およびコリネバクテリウム（Corynebacterium）などの属が豊富である。腸内微生物叢は、例えば、免疫調節、病原体の阻害、有益な代謝産物の産生、および／または腸上皮バリアに影響を及ぼすなどのいくつかの相互に絡み合ったメカニズムを介して、定量可能な方法で皮膚に遠位的に影響を与えることができる。例えば、健康なマウスの外皮系は、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＡＴＣＣ６４７５の経口補充によって有益に変化し、濾胞形成および皮膚厚の増加、ならびに皮膚の低いｐＨおよび脂肪細胞産生の増加をもたらす。さらに、健康なプロバイオティクス摂取マウスは、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０およびＩＬ－１７の血清レベルをそれぞれ上昇および低下させたが、ＩＬ－１０欠損マウスでは、外皮系は改善されず、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）の免疫に基づく作用機序を示した。ＩＬ－１０誘導性の変化は、典型的には、Ｆｏｘｐ３ Ｔ_ｒｅｇ細胞の誘導を伴い、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）摂取のドナー由来の精製されたＦｏｘｐ３細胞の投与がまた、プロバイオティクス細胞に曝露されなくても、レシピエントマウスにおける外皮系に対するプロバイオティクス誘導性の変化をももたらすという事実と一致する。

腸内微生物叢が皮膚に影響を与え得る別のメカニズムは、それらが産生する代謝産物を介して血流に到達し、遠隔部位に影響を与え得ることである。あるいは、腸内細菌自体が血流に入る可能性があり、特に腸上皮バリアの完全性が障害されている場合にはそうである。例えば、尋常性乾癬患者は、腸異形成に悩まされ、これが血流へのＤＮＡ転座を促進することが示唆されている。観察された腸異形成は、微生物の多様性の増加、ならびにフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Faecalibacterium prausnitzii）の存在量の増加を包含し、健康な腸内微生物叢において優勢であるこの属が、抗炎症ペプチドと同様に有用な短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）酪酸を高レベルで産生する菌株を有することを考えると、常識に反する。アトピー性皮膚炎の研究において、短鎖脂肪酸は黄色ブドウ球菌（S. aureus）などの病原性皮膚微生物の増殖を阻害することも提案されているが、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）およびＣ．アクネス（C. acnes）などの皮膚共生菌はより広いＳＣＦＡシフトに耐性がある。ハプテン感作マウスに酪酸塩を皮下注射または局所塗布すると、接触過敏反応が減少する。さらに、Ｔ_ｒｅｇ特異的因子Ｆｏｘｐ３およびＩＬ－１０はこの処理で上方制御されたようであり、Ｔ_ｒｅｇ細胞が短鎖脂肪酸によって誘導され得ることを示した。ユーバクテリウム（Eubacterium）属、バクテロイデス（Bacteroides）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、プレボテラ（Prevotella）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、およびラクトバチルス（Lactobacillus）属を含む広範囲の細菌株は、相当量の短鎖脂肪酸を産生し、したがって、皮膚の健康について観察された有益な効果は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Faecalibacterium prausnitzii）に限ったものではない。

いくつかのシグナル伝達変換経路の誘発（例えば、ＪＮＫおよびＩＫＫβ／ＮＦ－κβ）は、乾癬の病因の最も重要な炎症性メディエーターである腫瘍壊死因子αなどの炎症性サイトカインおよびケモカインの産生をもたらす。Ｂ．フラギリス（B. fragilis）などの多くの微生物は、多糖ＡおよびＢを産生することによってＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答のバランスを調節することができることが報告されている。微生物叢と乾癬の間の別の提案される連結は、乾癬は自己免疫疾患ではなく、主にＩＬ－２３およびＩＬ－１７によって駆動される、皮膚微生物叢に対する異常な自然免疫応答を反映している可能性があるということである。乾癬のマウスモデルを用いて、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を標的とする抗生物質が、ＩＬ－１７およびＩＬ－２２の産生を阻害することによって乾癬様皮膚炎を向上させることが示されている。ＩＬ－２２産生Ｔ細胞は、皮膚炎症の悪化に重要な役割を果たしているようである。

共生腸内細菌叢は、様々な免疫刺激に応答してＴ細胞分化に影響を与えることにより、皮膚アロスタシスを促進することができる。ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＤＮ－１１４ ００１の経口投与は、皮膚過敏性エフェクター細胞へのＣＤ８＋Ｔ細胞の分化を障害し、曝露時の皮膚へのそれらの動員を減少させることが示されている。

Ｔｈ１７細胞は皮膚と腸の両方に豊富に存在し、両臓器も外部環境と接触している。これらの細胞およびそれらの炎症誘発性サイトカインは、乾癬、ベーチェット病、および接触過敏症を含むいくつかの慢性炎症性皮膚疾患の病因に直接寄与すると考えられている。Ｔｈ１７エフェクター細胞とそれらに対応する制御性Ｔ細胞とのバランスは、腸管微生物叢の影響を大きく受ける。Ｔｈ１７細胞は腸管内腔で排泄されるか、または病原性を制限する免疫抑制特性（ｒＴｈ１７）を有する調節表現型を獲得する可能性がある。

腸内細菌によって合成され、直接的または間接的に皮膚を修飾する可能性のある他の分子が最近検討された。これらには、掻痒を制御するラクトバチルス（Lactobacillus）属種由来のγ－アミノ酪酸およびトリプタミン、ならびにバリア機能を増強するアセチルコリンが含まれる。この目的のために、ニキビ患者は腸上皮バリア完全性が増強されていることが指示されており、これが血中リポ多糖エンドトキシンの存在および高反応性の観察された理由である可能性がある。この仮説と一致して、サブスタンスＰ含有神経のアップレギュレーションとこの神経ペプチドの強力な発現は尋常性ざ瘡と腸管の生殖障害の両方で相互に見られる。サブスタンスＰは、ざ瘡の病因に関与する炎症誘発性メディエーター（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＰＰＡＲ－γ）の増加をもたらす炎症性シグナルを誘発することができる。

高血糖負荷は、インスリン／インスリン様増殖因子（ＩＧＦ－１）シグナル伝達の増加を促進する。これは、細胞栄養状態のセンサーである代謝フォークヘッドボックス転写因子（ＦｏｘＯ１）の細胞質発現の増加を誘導すると考えられる。ＦｏｘＯ１は最終的に、代謝および細胞増殖の調節因子である哺乳動物ラパマイシン標的タンパク質複合体１（ｍＴＯＲＣ１）を誘導し、皮脂腺の過剰増殖、脂肪形成、および先端漏斗角化細胞の過形成を媒介し、それによってニキビ発生に寄与する。腸内微生物叢は、腸管共生細菌とｍＴＯＲ経路のクロストークを介して、ざ瘡の病態生理に影響を及ぼす。腸内微生物叢によって産生される代謝産物は、細胞増殖、脂質代謝、およびｍＴＯＲ経路によって媒介される他の代謝機能を調節することが示されている。ｍＴＯＲ経路は、腸管バリアの調節を介して腸管微生物叢の組成に影響を与える。腸管の生命障害および腸バリアの完全性の障害の場合、この双方向性の関係は代謝性炎症の正のフィードバックサイクルをもたらすことがある。ニキビの病因におけるｍＴＯＲＣ１の重要な役割を考慮すると、この関係は腸内微生物叢がニキビの病態生理に影響を与えるメカニズムとして役立つ。

経口摂取されたプロバイオティクスは、腸－皮膚軸を介して尋常性乾癬、アトピー性皮膚炎、尋常性ざ瘡を含む皮膚疾患を緩和および／または予防するために成功裏に使用されている。

心血管疾患は依然として世界的に主要な死因であり、コレステロール値の上昇および高血圧などの危険因子を伴う。げっ歯類モデルでは、高血圧との腸の連結が示されており、腸上皮バリアおよび炎症状態の透過性増加と、腸の病態生理学的および免疫状態ならびに高血圧と関連する可能性のある腸内微生物のシフトと組み合わせて明らかにされている。また、マウスに高脂肪食を与え、様々な組織における細菌ＤＮＡの存在を顕著に増加させた研究においても、上皮バリア完全性の役割が示唆されている。

アテローム性心血管疾患の個体の腸内微生物叢を健康対照者と比較したところ、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ（Klebsiella）属種、およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）などの潜在的病原体を含む腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の存在量の増加が明らかになった。さらに、以前に炎症性腸疾患と関連した細菌であるルミノコッカス・グナバス（Ruminococcus gnavus）が比較的高レベルで見られた。対照的に、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）およびフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Faecalibacterium prausnitzii）を含む酪酸産生細菌は、罹患集団由来の試料において比較的枯渇した。

アテローム性動脈硬化性心血管疾患患者と他の疾患コホート（２型糖尿病、肝硬変、および肥満）の腸内微生物叢を比較したところ、健康対照群からの一般的な逸脱が明らかになり、発酵性が低く炎症性の高い腸内環境がいくつかの疾患で共通の特徴であることが示唆された。この目的のために、結腸に直接送達されたプロピオン酸塩を受けた過体重の個体は、すでに、エネルギー摂取、脂肪症、および脂質肝臓含量の減少、ならびに腸内分泌Ｌ細胞によって局所的に産生されるペプチドＹＹ（ＰＹＹ）およびグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）の血漿レベルの増加を示すことが示されている。

健康な腸内微生物叢はまた、コレステロールを、吸収されにくいコプロスタノールに脱水素する能力を有する。この変換の酵素活性は、地理的に多様なヒトコホートに広く存在する培養されていない微生物のクレードにおいてｉｓｍＡによってコードされている。コプロスタノール形成微生物を保有する個体は、糞便中コレステロールレベルが低く、血清総コレステロールが低く、その作用は脂質ホメオスタシス遺伝子のバリエーションに起因するものと同等である。これは、微生物叢における１つの特定の機能とヒト健康の間に直接的な連結があることを示唆している。

プロバイオティクスにはｉｓｍＡ相同体は保有しないが、健康であり、正常から軽度の高コレステロール血症の成人にＬ．プランタルム（L. plantarum）ＥＣＧＣ １３１１０４０２の補充を受けた二重盲検プラセボ対照ランダム化試験では、１２週間以内に低密度リポタンパク質、トリグリセリド、総コレステロール、および収縮期血圧の減少、ならびに高密度リポタンパク質の増加が明らかにされた。一次胆汁酸はコレステロールから肝臓で合成され、Ｌ．プランタルム（L. plantarum）ＥＣＧＣ １３１１０４０２は高レベルの胆汁酸塩ヒドロラーゼを産生する。正確な機序は不明であるが、この酵素活性の正味の効果は、ヒトおよび動物モデルにおける低密度リポタンパク質を含むコレステロールレベルの低下である。さらに、菌株は、インビトロでコレステロールを減少させる能力を示し、例えばコレステロールを内在化する能力のような相補的な作用メカニズムを意味する。

本開示の一態様では、ヒト対象における疾患を処置する方法は、治療有効量のシンバイオティクス組成物を対象に投与するステップを含み、シンバイオティクス組成物は、健康なヒト腸内微生物叢に存在する微生物菌株によって、生物活性代謝産物に変換され得る少なくとも１つの化合物を含むプレバイオティクス成分と、微生物菌株のコンソーシアムを含むプロバイオティクス成分とを含み、コンソーシアムは、（ｉ）ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴ、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰ１－ＩＴ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＢＢ５３６－ＪＰ、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）ＳＤ－Ｍ６３－ＪＰ、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＨＲＶＤ１１３－ＵＳ、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＨＲＶＤ５２４－ＵＳ（Ｂｌ－０４）、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＨＲＶＤ５２１－ＵＳ、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＨＲＶＤ３００－ＵＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＨＲＶＤ９０ｂ－ＵＳ、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ１５０－ＢＥ、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＧＧ－ＢＥ、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＲＤ８３０－ＦＲ、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＳＤ－ＬＣＲ０１－ＩＴ、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Limosilactobacillus fermentum）ＳＤ－ＬＦ８－ＩＴ、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＢＳ５－ＩＴ、およびラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＬＲ６－ＩＴからなる群から選択される１つ以上の消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株；（ｉｉ）リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰ、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＳＤ－ＣＥＣＴ９１０４－ＳＰ、およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＣＥＣＴ８１４５－ＳＰからなる群から選択される１つ以上の皮膚の転帰を改善する微生物菌株；（ｉｉｉ）ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰＬＤＬ－ＵＫおよびビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＭＢ２４０９－ＩＴからなる群から選択される１つ以上の心血管の転帰を改善する微生物菌株；ならびに（ｉｖ）リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴおよびビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＳＤ－ＢＡ５－ＩＴからなる群から選択される１つ以上の微量栄養素合成菌株のうちの少なくとも２つを含む。

実施形態では、疾患は、副腎白質ジストロフィー、ＡＧＥ誘導性ゲノム傷害、アレクサンダー病、円形脱毛症、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、狭心症、関節炎、喘息、口頭同心性硬化症、ベーチェット病、類天疱瘡、カナバン病、左心室機能不全を含む心不全、中枢神経系血管炎、シャルコット・マリー・トゥース病、中枢神経系髄鞘形成不全を伴う小児期運動失調、慢性特発性末梢神経障害、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚狼瘡、皮膚炎（接触、急性および慢性）、糖尿病性網膜症、移植片対宿主病、肉芽腫、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、ハンチントン病、過敏性腸疾患、虚血、クラッベ病、扁平苔癬、黄斑変性症、ミトコンドリア脳筋症、一側性筋萎縮症、多発性硬化症、心筋梗塞、脳鉄蓄積を伴う神経変性、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、ＮＦ－κＢ媒介性疾患、視神経炎、腫瘍随伴症候群、パーキンソン病、ペリゼウス・メルツバッハー病、天疱瘡、原発性側索硬化症、進行性核上麻痺、乾癬、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、色素性網膜症、サルコイドーシス、シルダース病、亜急性壊死性脊髄症、ササック症候群、移植拒絶反応、横断性脊髄炎、腫瘍、潰瘍性大腸炎、およびゼルウィガー症候群からなる群から選択され得る。

実施形態では、疾患は、消化器疾患または感染症であり得る。この疾患は、過敏性腸症候群、ＣＯＶＩＤ－１９、および便秘からなる群から選択することができるが、必ずしもそうである必要はない。疾患は、対象の腸内微生物叢のアルコール性または抗生物質誘導性の生体異常症であり得るが、必ずしもそうである必要はない。

実施形態では、シンバイオティクス組成物は、摂取可能な製剤として投与され得る。摂取可能な製剤は、飲み込み可能なカプセルの形態であり得るが、必ずしもそうである必要はない。カプセルは、プレバイオティクス成分を約１ｍｇ～約４００ｍｇ、約２５ｍｇ～約３７５ｍｇ、または約５０ｍｇ～約３５０ｍｇ、または約７５ｍｇ～約３２５ｍｇ、または約１００ｍｇ～約３００ｍｇ、または約１２５ｍｇ～約２７５ｍｇ、または約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、または約１７５ｍｇ～約２２５ｍｇ、または約２００ｍｇの量で含むことができるが、必ずしもそうである必要はない。カプセルは、約６２５０万ＡＦＵ～約３１２５億ＡＦＵ、約６億２５００万ＡＦＵ～約２５００億ＡＦＵ、約１２億５０００万ＡＦＵ～約１２５０億ＡＦＵ、約６２億５０００万ＡＦＵ～約６２５億ＡＦＵ、約１２５億ＡＦＵ～約５００億ＡＦＵ、約１８７億５０００万ＡＦＵ～約３７５億ＡＦＵ、または約２５０億ＡＦＵ～約３１２億５０００万ＡＦＵの量で微生物菌株のコンソーシアムを含むことができるが、必ずしもそうである必要はない。シンバイオティクス組成物の用量は、少なくとも１日１回投与することができるが、必ずしもそうである必要はなく、用量は２つの飲み込み可能なカプセルを含む。カプセルは、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルをさらに含むことができるが、必ずしもそうである必要はない。飲み込み可能なカプセルは、プロバイオティクス成分を含む内部カプセルと、プレバイオティクス成分を含む内部カプセルを取り囲み、封入する外部カプセルとを含むことができ、必ずしもそうである必要はなく、外部カプセルは、ヒトの胃および小腸の環境において３時間後に実質的に完全に破壊または溶解されるように構成され、内部カプセルおよび外部カプセルは、微生物菌株のコンソーシアムにおけるヒトの胃および小腸の環境中で３時間後に生存し続ける細胞の割合が、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であるように構成され、内部カプセルは、飲み込み可能なカプセルが投与されるヒト対象の結腸に入ると、微生物菌株のコンソーシアムの生存細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が結腸に放出されるように構成される。

実施形態において、シンバイオティクス組成物は、少なくとも約７日間、少なくとも１日１回投与することができるが、必ずしもそうである必要はない。

実施形態では、健康なヒト腸内微生物叢に存在する微生物菌株によって生物活性代謝産物に変換することができる少なくとも１つの化合物は、少なくとも１つのプニカラギンを含むことができ、少なくとも１つのザクロから誘導または抽出することができる。プレバイオティクス成分は、少なくとも１つのザクロから誘導または抽出された少なくとも１つの追加の化合物をさらに含むことができるが、必ずしもそうである必要はない。プレバイオティクス成分は、少なくとも１つのプニカラギンを含むポリフェノール性ザクロ誘導体または抽出物から本質的になることができるが、必ずしもそうである必要はない。

実施形態において、少なくとも１つのプニカラギンは、ヒト消化管に生息することが公知である少なくとも１つの細菌株によってウロリチンに代謝され得る。ウロリチンはウロリチン－Ａであるが、必ずしもそうである必要はない。

実施形態において、少なくとも１つのプニカラギンは、プロバイオティクス成分のコンソーシアムの少なくとも１つの微生物菌株によってウロリチンに代謝され得る。ウロリチンは、ウロリチン－Ａであるが、必ずしもそうである必要はない。

実施形態において、コンソーシアムは、（ｉ）から（ｉｖ）のうちの少なくとも３つを含むことができる。コンソーシアムは、（ｉ）から（ｉｖ）の４つ全てを含むことができるが、必ずしもそうである必要はない。

実施形態では、コンソーシアムは、（ｉ）の消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株のうちの少なくとも２つを含むことができる。

実施形態では、コンソーシアムは、（ｉ）の消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉ）の皮膚の転帰を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉｉ）の心血管の転帰を改善する菌株の全て、および（ｉｖ）の微量栄養素合成菌株の全てを含むことができる。コンソーシアムは、（ｉ）の消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉ）の皮膚の転帰を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉｉ）の心血管の転帰を改善する菌株の全て、および（ｉｖ）の微量栄養素合成菌株の全てから本質的になることができるが、必ずしもそうである必要はない。

本開示の利点は、本明細書に含有される本開示から明らかである。

本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ」、「１つ以上」、および「および／または」は、動作中に結合式と分離式の両方であるオープンエンド式である。例えば、各表現「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの１つ以上」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの１つ以上」、および「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢともに、ＡとＣともに、ＢとＣともに、またはＡとＢとＣともに、を意味する。

用語「１つの（a）」または「１つの（an）」実体は、その実体の１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、用語「１つの（a）」（または１つの（an））、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。また、「含んでいる（comprising）」、「含んでいる（including）」、および「有している」という用語は、互換的に使用することができることに留意されたい。

本明細書に記載される実施形態および構成は、完全なものでも網羅的なものでもない。理解されるように、本開示の他の実施形態は、単独でまたは組み合わせて、上述または下記に詳細に記載される１つ以上の特徴を利用することが可能である。

図１Ａは、本開示の送達カプセルの組立図である。図１Ｂは、本開示の送達カプセルの分解図である。 図２は、阻害剤微生物コンソーシアムまたはその成分を同定および検証するための方法のフローチャートである。 図３Ａおよび図３Ｂは、２つの別々の未処理のＣ．エレガンス（C. elegans）反復におけるｇｓｔ－４：：ＧＦＰ発現の例である。 図４Ａおよび図４Ｂは、本開示のシンバイオティクス組成物を用いて処理されたＣ．エレガンス（C. elegans）の２つの反復におけるｇｓｔ－４：：ＧＦＰ発現の例である。 図５は、本開示のシンバイオティクス組成物を用いて処理されたヒト上皮細胞におけるクラウジン－１発現を示すウエスタンブロットの画像である。 図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ液体培地および固体培地において試験された本開示のシンバイオティクス組成物の微生物菌株のブロモクレゾールパープルアッセイを示す。 図６Ｃは、図６Ａおよび６Ｂに示される微生物菌株の可視光吸光度測定のグラフである。 図７は、シミュレートされたヒト腸管微生物生態系を示す。 図８は、シミュレートされたヒト腸管微生物生態系における本開示のシンバイオティクス組成物の微生物菌株の生菌数の数を示す。 図９は、５つのシミュレートされたヒト腸管微生物生態系における４８時間にわたるｐＨの変化を示す。 図１０は、５つのシミュレートされたヒト腸管微生物生態系における４８時間にわたる酪酸塩濃度の変化を示す。 図１１は、５つのシミュレートされたヒト腸管微生物生態系における４８時間にわたるプロピオン酸塩濃度の変化を示す。 図１２は、５つのシミュレートされたヒト腸管微生物生態系における４８時間にわたる酢酸塩濃度の変化を示す。 図１３は、５つのシミュレートされたヒト腸管微生物生態系における４８時間にわたる全短鎖脂肪酸塩濃度の変化を示す。 図１４Ａは、シミュレートされたヒト腸管微生物生態系における本開示のシンバイオティクス組成物の微生物菌株の生存性の例である。 図１４Ｂは、シミュレートされたヒト腸管微生物生態系における本開示のシンバイオティクス組成物の微生物菌株の生存性の例である。 図１４Ｃは、シミュレートされたヒト腸管微生物生態系における従来技術のプロバイオティクス組成物の微生物菌株の生存性の例である。 図１４Ｄは、シミュレートされたヒト腸管微生物生態系における従来技術のプロバイオティクス組成物の微生物菌株の生存性の例である。 図１５は、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）および対照と比較した、本開示のシンバイオティクス組成物の微生物菌株によるヒスタミン代謝の例である。 図１６Ａは、慣例のカプセルと液体グリセロール溶媒溶液の両方の生菌数のグラフであり、各々は、低温、低湿度条件下で、本開示のシンバイオティクス組成物を含有する。 図１６Ｂは、慣例のカプセルと液体グリセロール溶媒溶液の両方の水の安定性のグラフであり、各々は、低温、低湿度条件下で、本開示のシンバイオティクス組成物を含有する。 図１７Ａは、本開示のカプセルと液体グリセロール溶媒溶液の両方の生菌数のグラフであり、各々は、高温、高湿度条件下で、本開示のシンバイオティクス組成物を含有する。 図１７Ｂは、本開示のカプセルと液体グリセロール溶媒溶液の両方の水の安定性のグラフであり、各々は、高温、高湿度条件下で、本開示のシンバイオティクス組成物を含有する。 図１８Ａは、加速分解条件下で瓶に保存された本開示のシンバイオティクス組成物を含有する本開示のカプセルの生菌数のグラフである。 図１８Ｂは、加速分解条件下でパウチに保存された本開示のシンバイオティクス組成物を含有する本開示のカプセルの生菌数のグラフである。 図１９Ａは、加速分解条件下で瓶に保存された本開示のシンバイオティクス組成物を含有する本開示のカプセルの生菌数のグラフである。 図１９Ｂは、加速分解条件下でパウチに保存された本開示のシンバイオティクス組成物を含有する本開示のカプセルの生菌数のグラフである。 図２０Ａおよび図２０Ｂは、典型的な長期保存条件下で、瓶およびパウチにそれぞれ貯蔵された本開示のシンバイオティクス組成物を含有する本開示のカプセルの生菌数のグラフである。 同上。 図２１Ａ～図２１Ｄは、市販のプロバイオティクス製品およびＬ．ガセリ（L. gasseri）およびＬ．ラムノースス（L. rhamnosus）対照に対して、それぞれ本開示のシンバイオティクス組成物の微生物菌株による、１時間後のＬ－乳酸塩、１時間後のＤ－乳酸塩、２４時間後のＬ－乳酸塩、および２４時間後のＤ－乳酸塩の産生のグラフである。 同上。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、市販のプロバイオティクス製品およびＬ．ガセリ（L. gasseri）およびＬ．ラムノースス（L. rhamnosus）に対して、それぞれ１時間後および２４時間後の本開示のシンバイオティクス組成物の微生物菌株によるＬ－およびＤ－乳酸塩の相対的産生のグラフである。 図２３は、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴによるビタミンＢ_１２（シアノコバラミン）の産生を示すグラフである。

別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において参照される全ての特許、出願、公開された出願、および他の刊行物は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書中の用語に複数の定義がある場合、別段の記載がない限り、本開示の概要に規定される定義が優先する。

「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドローム反復）遺伝子座とは、ＤＮＡ切断システムの成分をコードするある特定の遺伝子座を指し、例えば、細菌および古細菌細胞が外来ＤＮＡを破壊するために使用する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短い可変ＤＮＡ配列（スペーサーと呼ばれる）によって分離された短い直接反復（ＣＲＩＳＰＲ反復）を含むＣＲＩＳＰＲアレイからなることができ、多様なＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子に隣接することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＤＮＡ配列決定の時代以前は科学的に知られていなかった経路の一例であり、現在では、ファージおよびウイルスに対する獲得免疫を有する細菌および古細菌を付与することが理解されている。過去１０年間にわたる集中的な研究により、このシステムの生化学が明らかになった。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、外来ＤＮＡまたはＲＮＡの獲得、標的化および切断に関与するＣａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質をそれらの標的に導く短いスペーサー配列に隣接する直接反復を含むＣＲＩＳＰＲアレイからなる。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、ＲＮＡに結合した単一のＣａｓタンパク質が標的配列への結合および切断に関与する流線形バージョンである。これらの最小限のシステムのプログラム可能な性質は、ゲノム操作の分野に革命をもたらしている汎用的な技術としてのそれらの使用を容易にしている。

本明細書で使用される場合、「エフェクター」または「エフェクタータンパク質」は、ポリヌクレオチド標的を認識し、結合し、および／または切断もしくはニックを入れることを含む活性を包含するタンパク質である。エフェクターまたはエフェクタータンパク質はまたエンドヌクレアーゼであり得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの「エフェクター複合体」には、ｃｒＲＮＡおよび標的の認識と結合に関与するＣａｓタンパク質が含まれる。成分Ｃａｓタンパク質のいくつかは、さらに、標的ポリヌクレオチド切断に関与するドメインを含み得る。

用語「Ｃａｓタンパク質」とは、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。Ｃａｓタンパク質には、ｃａｓ遺伝子座の遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれ、適応分子ならびに干渉分子が含まれる。細菌適応免疫複合体の干渉分子には、エンドヌクレアーゼが含まれる。本明細書に記載されるＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼには、限定されないが、本明細書に開示される新規なＣａｓ－アルファタンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、またはこれらの組合せもしくは複合体が含まれる。Ｃａｓタンパク質は、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」または「Ｃａｓエフェクタータンパク質」であり得、適切なポリヌクレオチド成分との複合体である場合、特定のポリヌクレオチド標的配列の全部または一部を認識し、結合し、および場合によりニックを入れるかもしくは切断することができる。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、成分の配列および構造解析に従って分類されている。マルチサブユニットエフェクター複合体（タイプＩ、タイプＩＩＩ、およびタイプＩＶを含む）を有するクラス１システム、および単一のタンパク質エフェクター（タイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩを含む）を有するクラス２システムを含む複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが報告されている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、最小限、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子および少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、ｃｒＲＮＡリボ核タンパク質（ｃｒＲＮＰ）エフェクター複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、ｃｒＲＮＡ成分をコードするＤＮＡ標的スペーサーおよびＣａｓタンパク質成分をコードするｃａｓ遺伝子のオペロン様ユニットを散在させた一連の同一反復を含む。結果として生じるリボ核タンパク質複合体は、配列特異的にポリヌクレオチドを認識する。ｃｒＲＮＡは、エフェクター（タンパク質または複合体）の二重鎖ＤＮＡ配列への配列特異的結合のためのガイドＲＮＡとして役立ち、相補的ＤＮＡ鎖と塩基対を形成する一方、非相補的鎖を置き換えていわゆるＲループを形成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のＲＮＡ転写産物（プレｃｒＲＮＡ）は、タイプＩおよびタイプＩＩＩシステムではＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドリボヌクレアーゼによって、またはタイプＩＩシステムではＲＮアーゼＩＩＩによって、反復配列において特異的に切断される。所定のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の数は、種間で変化し得る。

異なるドメインを有するタンパク質をコードする異なるｃａｓ遺伝子は、異なるＣＲＩＳＰＲシステムに存在する。ｃａｓオペロンは、１つ以上のエフェクターエンドヌクレアーゼ、ならびに他のＣａｓタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかのドメインは、１を超える目的に役立つことができ、例えば、Ｃａｓ９は、エンドヌクレアーゼ官能性のためのドメイン、ならびに、とりわけ標的切断のためのドメインを含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、プロトスペーサーに隣接するモチーフ（ＰＡＭ）の近傍にあるＤＮＡ標的部位を認識するために、直接的なＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対形成を介して単一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）によって誘導される。クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、タイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含む。クラスＩシステムの特徴は、単一のタンパク質の代わりにエフェクターエンドヌクレアーゼ複合体が存在することである。Ｃａｓｃａｄｅ複合体は、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）と、多様なＲＡＭＰ（Ｒｅｐｅａｔ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）タンパク質スーパーファミリーのコアフォールドである核酸結合ドメインを含む。

タイプＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、最小限、Ｃａｓ５およびＣａｓ７を含むＣａｓｃａｄｅ（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体）と呼ばれるエフェクタータンパク質の複合体を含む。エフェクター複合体は、単一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびＣａｓ３とともに機能し、侵入するウイルスＤＮＡを防御する。Ｉ型システムは７つのサブタイプに分けられる。

タイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、複数のｃａｓ７遺伝子を含み、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡのいずれかを標的とし、ＲＮａｓｅおよび標的ＲＮＡ活性化ＤＮＡヌクレアーゼのいずれかとして機能する。タイプＩＶシステムは、ｃａｓ８様ドメインに加えて典型的なタイプＩ ｃａｓ５およびｃａｓ７ドメインを含むが、他のほとんどのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに特徴的であるＣＲＩＳＰＲアレイを欠いていることがある。

クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、タイプＩＩ、Ｖ、およびＶＩを含む。クラスＩＩシステムの特徴は、エフェクター複合体の代わりに単一のＣａｓエフェクタータンパク質が存在することである。タイプＩＩおよびＶのＣａｓタンパク質は、ＲＮａｓｅ Ｈフォールドを採用するＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインを含む。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を用いてＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的に誘導する。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖に相補的なスペーサー領域と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）と塩基対を形成する領域とを含み、ＲＮＡ二重鎖を形成し、ＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を切断させるように仕向け、平滑末端を残す。スペーサーは、Ｃａｓ１およびＣａｓ２タンパク質が関与する完全には理解されていないプロセスを経て獲得される。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、典型的には、ｃａｓ９遺伝子に加えて、ｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子を含む。タイプＩＩ ＣＲＩＳＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、それぞれのＣＲＩＳＰＲアレイ内の反復に部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡをコードすることができ、Ｃｓｎ１およびＣｓｎ２などの他のタンパク質を含むことができる。ｃａｓ１およびｃａｓ２遺伝子の近傍にｃａｓ９が存在することがタイプＩＩ遺伝子座の特徴である。タイプＶＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９とは異なり、標的切断のために必ずしも追加のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡを必要としない活性ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼであるＣｐｆ１（Ｃａｓ１２）を含む単一のＣａｓエンドヌクレアーゼを含む。タイプＶＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つのＨＥＰＮ（高等真核生物および原核生物のヌクレオチド結合）ドメインを有するが、ＨＮＨまたはＲｕｖＣドメインを有さず、ｔｒａｃｒＲＮＡ活性に依存しないヌクレアーゼをコードするｃａｓ１３遺伝子を含む。ＨＥＰＮドメインの大部分は、金属非依存性エンドＲＮアーゼ活性部位を構成する保存モチーフを含む。この特徴のため、タイプＶＩシステムは、他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに共通であるＤＮＡ標的ではなく、ＲＮＡ標的に作用すると考えられている。

記載要件および実施可能要件を満たすために、以下の参考文献により本明細書に組み込まれるものは、以下の特許公開：Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒによる米国特許出願公開第２０１４／０３４９４０５号明細書；Ｅｌｉｎａｖによる米国特許出願公開第２０１４／０３７７２７８号明細書；Ｄｏｕｄｎａによる米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書；Ｈｏｕらによる米国特許出願公開第２０２００１９０４９４号明細書；およびＺｈａｎｇによる米国特許出願公開第２０２０／０１９９５５５号明細書である。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「約」、「およそ」などは、数値的制限または範囲に関して使用される場合、列挙された制限または範囲が最大１０％変動し得ることを意味する。非限定的な例として、「約７５０」は、わずか６７５、またはせいぜい８２５、またはそれらの間の任意の値を意味し得る。２またはそれ以上の数値的制限または範囲の間の比または関係に関して使用される場合、用語「約」、「およそ」などは、限定または範囲の各々が最大約１０％変動し得ることを意味し、非限定的な例として、２つの量が「およそ等しい」という記述は、２つの量の間の比が０．９：１．１または１．１：０．９程度（またはそれらの間の任意の値）であることを意味し得、４方向の比が「約５：３：１：１」であるという記述は、その比の第１の数が４．５と５．５の間の任意の値であり得、その比の第２の数が２．７と３．３の間の任意の値であり得るなどである。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「動物」とは、限定されないが、ヒトを含む、動物界の任意の生物を指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「疾患」とは、疾患、障害、もしくは状態またはその症状を指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、「ラクトバチルス（lactobacillus）」および「ラクトバチルス（lactobacilli）」という用語は、さらなる詳述を伴わずに使用される場合、ラクトバチルス（Lactobacillus）属を２５の異なる属へと再分類した２０２０年より前にラクトバチルス科（Lactobacillaceae）に分類されていた全ての生物を指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「患者」とは、限定されないが、例としてヒトを含む哺乳動物を指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「薬学的に許容される」とは、動物、より具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦もしくは州政府の規制当局により承認または承認されるか、あるいは米国薬局方または他の一般に認知されている薬局方に列挙されていることを意味する。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「薬学的に許容されるビヒクル」とは、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容されるアジュバント、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される担体、または上記のいずれかの組合せを指し、それとともに本開示によって提供される物質を患者に投与することができ、その薬理学的活性を破壊せず、物質の治療有効量を提供するのに十分な用量で投与された場合に非毒性である。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「医薬製剤」とは、治療活性物質、およびともに患者に投与される少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルを指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「プレバイオティクス」とは、微生物の宿主に健康上の利益を付与する微生物によって選択的に利用される物質を指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「プロバイオティクス」とは、宿主動物に適切な量で投与された場合に、宿主動物に健康上の利益を付与する生きた微生物を指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「シンバイオティクス」は、１種以上の健康促進微生物の増殖の選択的刺激および／または代謝の活性化を介して、生きた微生物栄養補助食品の消化管における生存および移植を改善することによって、宿主に有益に影響するプロバイオティクスおよびプレバイオティクスの組合せまたは混合物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「処置すること」および「処置」とは、疾患もしくは疾患の臨床症状の少なくとも１つを反転、軽減、停止、または向上させ、疾患または疾患の臨床症状の少なくとも１つを獲得するリスクを減少し、疾患の進行または疾患の臨床症状の少なくとも１つを阻害し、あるいは疾患または疾患の臨床症状の少なくとも１つを発症するリスクを減少することを指す。また、「処置すること」または「処置」とは、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、またはその両方で疾患を阻害すること、および患者に識別可能であるかもしくは識別不可能であり得る少なくとも１つの身体的パラメータを阻害することも指す。ある特定の実施形態では、「処置すること」または「処置」とは、患者が疾患の症状をまだ経験していないかまたは提示していないにもかかわらず、疾患に曝露され得るかまたは疾患に素因となり得る患者において、疾患の発症またはその少なくとも１つ以上の症状を遅延させることを指す。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「治療有効量」とは、疾患を処置するために対象に投与された場合、または疾患の臨床症状の少なくとも１つが、疾患またはその症状のこのような処置を実施するのに十分である物質の量を指す。「治療有効量」は、例えば、物質、疾患および／または疾患の症状、疾患および／または疾患または障害の症状の重症度、処置される患者の年齢、体重、および／または健康、ならびに処方医師の判断に依存して変化し得る。任意の所与の例における適切な量は、当業者によって確認され得るか、または日常的な実験によって決定することができる。

本明細書で使用される場合、別段の規定がない限り、用語「治療有効用量」とは、患者における疾患または障害の有効な処置を提供する用量を指す。治療有効用量は、物質ごと、および患者ごとに変化することができ、患者の状態および送達経路などの因子に依存することができる。治療有効用量は、当業者に公知である日常的な薬理学的手順に従って決定することができる。

本開示は、最初に、天然の腸内微生物叢および宿主組織の機能を調節することによって、臓器系を横断して健康をもたらすために、合理的に定義され、組み立てられた微生物コンソーシアムを提供する。より具体的には、本開示は、局所および遠隔部位における宿主の健康状態を維持および改善するために設計された経口予防的なプロバイオティクス菌株混合物を提供する。

実施形態では、本開示は、生きた微生物の１つ以上のコンソーシアムを提供し、ヒトにおいて検証された一連の利点を提供し、一部の実施形態では、保護敵なネスト化カプセルシステムを介して送達することができる。本開示のシンバイオティクス組成物の生産および投与を通しての生存性は、以下に提供される実施例においてさらに詳細に記載されるように、カプセル内およびシミュレートされたヒト腸管環境における活性蛍光ユニット（ＡＦＵ）の包括的評価によって検証されている。このコンソーシアムには、広範な機序および遺伝学的特徴付けに加えて、消化の改善、腸－皮膚軸の調節、低密度リポタンパク質調節、腸の免疫学的反応、上皮バリア制御、および微量栄養素合成などの臨床転帰について、菌株特異的な二重盲検プラセボ対照ヒト試験において臨床的に評価されている菌株が含まれる。

微生物菌株
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術の開発は、原核生物全ゲノム配列決定のための新しく、はるかに安価な方法を導入している。バイオインフォマティクス分析に必要な計算資源の価格の低下と組み合わせて、これは多数の新しい細菌ゲノムの公開をもたらした。ますます多くの「非バイオインフォマティクス」研究室が、自身の原核生物ゲノムの配列決定を行っており、どの配列決定プラットフォームを選択すべきか、どのライブラリーを作製すべきか、どのアセンブリー法をライブラリーに使用すべきかなどの問題に直面している。

各新規細菌配列決定プロジェクトが直面する主要な問題の１つは、ゲノムの使用計画には、各ＤＮＡ分子の単一の高品質な配列（「完全な」状態と定義されるゲノムまたはプラスミド）に閉じ込める必要があるかどうかである。完全なゲノム配列は、全ての塩基対の順序と正確さが検証された最終産物を表す。対照的に、ドラフト配列（高いカバレッジの１つであっても）は、配列決定エラーと可能性のあるミスアセンブリーを含む、未知の順序と配向を有する、様々なサイズのコンティグの集合を表す。例えば、問題のゲノムを他の生物のゲノムと比較して、異なる生理学的特徴または生態学的ニッチの遺伝的基礎を推論する場合、このような比較は、オペロン、ゲノムアイランド、またはプラスミドなどの染色体外エレメントなどの機能関連ゲノム領域の断片化された表現のためにバイアスされ得る。特に、２０１５年１０月現在、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の治癒ゲノムデータベースには４９，２０４のバクテリアゲノムが含まれていたが、「完全ゲノム」と定義されたバクテリアゲノムは１０％に過ぎなかった。残りは「ドラフトゲノム」と定義され、多くのＮ（足場）を有するコンティグの１つから、順序が不明な多数のコンティグまでの幅がある。典型的にはＮＧＳ技術で得られるカバレッジが高いにもかかわらず閉じたゲノムを組み立てることの困難さは、通常、高度に保存されたコア遺伝子（例えば、リボソームおよびｔＲＮＡ遺伝子）と非コア（アクセサリー）遺伝子の両方を含む反復配列によって引き起こされ、しばしばプラスミドおよびトランスポゾンなどの可動性遺伝因子に属する。このような配列はしばしばアセンブリーに「切断点」を生じさせ、多数のコンティグをもたらす。あるいは、組み立てられた場合、このような多コピー遺伝子は、単一の遺伝子配列に折りたたまれ、機能的に重要なであり得る遺伝的微小多様性が欠けていることがある。これらの困難は、アセンブリーのためのオックスフォードナノポア読み取りなどの単一分子の長い読み取り配列決定技術を使用し、続いてＩｌｌｕｍｉｎａ読み取りで研磨することによって、挿入配列および二次代謝産物生合成遺伝子クラスターなどの重要であるが配列決定が困難なゲノム特徴の正確なアノテーションを可能にするのに十分な精度で最も隣接するゲノムを生成することによって、大部分克服することができる。

本開示のシンバイオティクス組成物中の各菌株は、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ読み取りのハイブリッドアセンブリーを用いて閉鎖ゲノムアセンブリーを生成するために配列決定されている。これらのデータは、病原性因子、ゲノム中の抗生物質耐性遺伝子、および各菌株のプラスミド由来配列の検出を可能にし、ゲノムベースの作用メカニズムにより情報を得る組成物のさらなるカスタマイズ、設計、および調整を可能にする。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴは、宿主の排便回数、便の硬さ、および排出の容易さを改善し、腹部膨満、掻痒、灼熱感、または疼痛などの腸管の不快感の症状を緩和し得る。第２の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴは、ＳＣＯＲＡＤおよび皮膚科生活の質（ＤＬＱ）指数によって測定されるアトピー性皮膚炎の臨床パラメータを改善し、微生物転座および／または免疫活性化を減少させ、および／またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ）１７／制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）およびＴｈ１／Ｔｈ２比を改善することができる。第３の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴは、シンバイオティクスの投与を停止した後、宿主の腸内微生物叢中に存続する可能性があり、これは、アトピー性皮膚炎患者の異生物性腸内微生物叢を是正する可能性がある。第４の非限定的な例として、Ｂビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴは、病原性大腸菌（E. coli）Ｏ１５７：Ｈ７を含む複数の大腸菌（E. coli）生物型の増殖を阻害し得る。

本開示の実施形態は、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰ１－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰ１－ＩＴは、宿主の排便回数、便の硬さ、および排出の容易さを改善し、腹部膨満、掻痒、灼熱感、または疼痛などの腸管の不快感の症状を緩和し得る。第２の非限定的な例として、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰ１－ＩＴは、病原性大腸菌（E. coli）Ｏ１５７：Ｈ７を含む複数の大腸菌（E. coli）生物型の増殖を阻害し得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＢＢ５３６－ＪＰを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－Ｂ５３６－ＪＰは、排便回数を増加させ、糞便の視覚特性を改善し、糞便の水分含量を増加させ、糞便アンモニア含量を低下させ、種々の糞便酵素の活性を減少させ、糞便中の微生物叢におけるビフィドバクテリウム（Bifidobacteria）属種の比率を増加させ、ならびに／または糞便中の微生物叢中の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の種および／もしくはクロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）の割合を低下させることができる。第２の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－Ｂ５３６－ＪＰは、宿主における呼吸器疾患の発生を低下させ、および／またはフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）属種の存在量の増加を含む腸内微生物叢の差異を引き起こすことがある。第３の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－Ｂ５３６－ＪＰは、宿主の腸管微生物叢における腸管毒素原性バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）の量を低下させ得る。第４の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－Ｂ５３６－ＪＰは、スギ花粉症アレルギーを有する宿主において、のどの症状および鼻症状、例えば掻痒、鼻漏、および鼻閉を減少させ、アレルギー誘発性のＩＦＮ－γの血中レベルの低下および／または血中好酸球率の増加を抑制し、および／またはＪＣＰ特異的ＩｇＥ抗体のレベルを低下させることができる。

本開示の実施形態は、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴは、シュウ酸塩を分解し、特に、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteria）属種よりもシュウ酸塩をより効果的に分解することができる。第２の非限定的な例として、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴは、リボフラビンおよびビタミンＢ１２を産生し得る。

本開示の実施形態には、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）ＳＤ－Ｍ６３－ＪＰを含むシンバイオティクス組成物が含まれる。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）ＳＤ－Ｍ６３－ＪＰは、ヒト乳糖オリゴ糖３’－シアリルラクトース、６’－シアリルラクトース、２’－フコシルラクトース、および３’－フコシルラクトースを発酵し得る。第２の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）ＳＤ－Ｍ６３－ＪＰは、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に罹患した宿主において、精神的健康状態の改善と相関している、腸内微生物叢におけるファーミキューテス（Firmicutes）属種／バクテロイデス（Bacteroidetes）属種の比を低下させることができる。

本開示の実施形態は、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＨＲＶＤ１１３－ＵＳを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＨＲＶＤ１１３－ＵＳは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＨＲＶＤ５２４－ＵＳ（Ｂｌ－０４）を含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。最初の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＨＲＶＤ５２４－ＵＳ（Ｂｌ－０４）は、上気道疾患エピソードのリスクを減少させ、および／または呼吸器疾患を遅延させ得る。第２の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＨＲＶＤ５２４－ＵＳ（Ｂｌ－０４）は、鼻洗浄におけるライノウイルス力価、鼻分泌物中のウイルス排出の可能性、および／または鼻洗浄におけるライノウイルス感染に対するケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＸＣＬ８）応答を減少させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＨＲＶＤ５２１－ＵＳを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＨＲＶＤ５２１－ＵＳは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＨＲＶＤ３００－ＵＳを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＨＲＶＤ５２１－ＵＳは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＨＲＶＤ９０ｂ－ＵＳを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＨＲＶＤ９０ｂ－ＵＳは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ１５０－ＢＥを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ１５０－ＢＥは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＧＧ－ＢＥを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＧＧ－ＢＥは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のトール様受容体ｍＲＮＡレベルを減少させ、マクロファージにおけるＣＤ１６発現および単球におけるＣＤ１１発現を減少させ、ならびに／またはＩＬ－１２およびＴＮＦ－αの産生の上昇から観察されるように、タイプ１免疫応答分極化を誘導し得る。

本開示の実施形態は、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＲＤ８３０－ＦＲを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＲＤ８３０－ＦＲは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＳＤ－ＢＡ５－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＳＤ－ＢＡ５－ＩＴは、宿主の糞便中の葉酸濃度を増加させ、および／または腸管環境にコロニー形成することがある。第２の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＳＤ－ＢＡ５－ＩＴは、葉酸を産生し得る。

本開示の実施形態は、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＳＤ－ＬＣＲ０１－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＳＤ－ＬＣＲ０１－ＩＴは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴは、ＳＣＯＲＡＤおよび皮膚科学的生活の質（ＤＬＱ）指標によって測定されるアトピー性皮膚炎の臨床パラメータを改善し、微生物転座および／または免疫活性化を減少させ、および／またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ）１７／制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）およびＴｈ１／Ｔｈ２比を改善することができる。第２の非限定的な例として、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴは、宿主の糞便中のブドウ球菌数を減少させ得る。第３の非限定的な例として、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴは、シンバイオティクス投与の停止後も存続し得る、掻痒指数によって測定されるアトピー性皮膚炎の臨床パラメータを改善し得る。第４の非限定的な例として、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴは、ブドウ球菌負荷を低下させ、および／またはＴｈ２サイトカインの産生を減少させ、Ｔｈ１サイトカインの安定した産生を維持させ得る。第５の非限定的な例として、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴは、炎症誘発性サイトカインを減少させ、抗炎症性サイトカインを増加させ、活性酸素種産生を阻害し、細胞膜の完全性を回復させ、および／または病原性大腸菌（E. coli）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を阻害し得る。

本開示の実施形態は、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Limosilactobacillus fermentum）ＳＤ－ＬＦ８－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Limosilactobacillus fermentum）ＳＤ－ＬＦ８－ＩＴは、ヒト腸管上皮細胞における腸バリア完全性のマーカー（Ｎｒｆ２および上皮密着結合タンパク質を含む）の発現および／またはＳＣＦＡの産生を増加させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のいずれか１つ以上を有することがある。第１の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰは、ＳＣＯＲＡＤ指数を減少させ、慢性皮膚疾患の再燃を処置するための局所ステロイド処置の使用を減少させ得る。第２の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰは、Ｃａｃｏ－２細胞における細胞骨格の破壊、炎症、およびアポトーシスに関与する細胞タンパク質の変化した発現を減少させ得る。第３の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰは、セリアック病を有する宿主において、炎症誘発性サイトカインパターンを抑制し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ－１０産生を増加させ得る。第４の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰは、単球由来樹状細胞の表現型および機能的成熟に影響し得る。第５の非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰは、毒性アミノ酸配列の細胞出現を減少させ、ＮＦ－κＢ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１βの発現を減少させることができる。

本開示の実施形態には、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＳＤ－ＣＥＣＴ９１０４－ＳＰを含むシンバイオティクス組成物が含まれ、この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のいずれか１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＳＤ－ＣＥＣＴ９１０４－ＳＰは、ＳＣＯＲＡＤ指数を減少させ、慢性皮膚疾患の再燃を処置するための局所ステロイド処置の使用を減少させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＣＥＣＴ８１４５－ＳＰを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のいずれか１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＣＥＣＴ８１４５－ＳＰは、ＳＣＯＲＡＤ指数を減少させ、慢性皮膚疾患の再燃を処置するための局所ステロイド処置の使用を減少させ得る。

本開示の実施形態には、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰＬＤＬ－ＵＫを含むシンバイオティクス組成物が含まれる。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰＬＤＬ－ＵＫは、宿主のＬＤＬ－Ｃ、総コレステロール、および／または収縮期血圧を減少させ、および／または宿主のＨＤＬ－Ｃを増加させ得る。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＭＢ２４０９－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康に対するいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＭＢ２４０９－ＩＴは、グリコール酸およびタウロデオキシコール酸に対して、総コレステロールおよびＬＤＬ－Ｃを減少させ、ならびに／またはコレステロールおよび胆汁酸塩ヒドロラーゼを同化させることができる。

本開示の実施形態は、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＢＳ５－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＢＳ５－ＩＴは、腸管糖分解代謝を促進し、および／またはドキソルビシン誘導性酸化ストレスを減少し得る。

本開示の実施形態は、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＬＲ６－ＩＴを含むシンバイオティクス組成物を含む。この細菌株は、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有することがある。非限定的な例として、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＬＲ６－ＩＴは、病原性大腸菌（E. coli）Ｏ１５７：Ｈ７を含む複数の大腸菌（E. coli）生物型の増殖を阻害し得る。

本開示の態様は、シンバイオティクス組成物において使用するための、目的の細菌株の合理的であり、系統的なスクリーニングおよび選択を可能にする。特に、本開示全体を通して記載されるように、目的の細菌株は、様々な機能的特性、例えば、限定されないが、Ｎｒｆ２転写因子の上方制御、腸における短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）産生の増加、および／または腸における上皮バリア機能の改善についてスクリーニングすることができ、好ましい実施形態ではスクリーニングされる。このスクリーニングの結果として、個々の菌株または菌株の組合せは、各々がこれらの所望の機能的特性の１つ以上を有し、全体として所望の特性の大部分または全てを有する株は、シンバイオティクス組成物に含め、宿主の健康における相乗効果を提供することができる。非限定的な例として、Ｎｒｆ２の上方制御、ＳＣＦＡ産生の増加、および上皮バリア機能の改善は、一部の実施形態では、宿主の腸内環境において互いに補強し合うことができ、したがって、これらの機能的結果のいずれか１つまたは２つよりも、宿主全体の健康のより大きな改善をもたらし得る；したがって、菌株をこれらの特性についてスクリーニングし、このスクリーニングの結果として本開示のシンバイオティクス組成物に含めるように合理的に選択することができる。

プレバイオティクス
従来のプレバイオティクス栄養補助食品に使用されるプレバイオティクスの大部分は、ある特定の微生物発酵性食物繊維、すなわち、多段階発酵プロセスを介して成長を支持し、有益な化合物の微生物生産を促進するために腸内微生物によって利用されるポリマー性およびオリゴマー性炭水化物である。このような繊維の一般的な例としては、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、およびイヌリンが挙げられる。しかしながら、実質的な健康上の利益をもたらすためには、これらの細菌発酵性繊維基質は、典型的には、単一のカプセルまたは他の投与形態で提供され得る量よりも多く必要とされ、その代わりに、食物源、例えば、ナッツ、果物および野菜から最も良く得られる。したがって、プレバイオティクスの栄養補助食品中に別のタイプのプレバイオティクスを提供することが好ましい。

本開示の実施形態は、微生物叢によって１種以上の代謝産物に生物変換され得るポリフェノールを含むシンバイオティクス組成物を含む。ポリフェノールは、ヒドロキシル化フェニル部分によって特徴付けられる大きな不均一な化合物群であり、果物、野菜、およびシリアルを含む植物、または茶、コーヒー、およびワインなどの植物由来の飲料中に大部分見出される。ポリフェノールは、特にがんおよび心血管疾患の予防に関して、健康に有益である可能性があるため、最近、多くの研究の焦点となっている。これらの植物由来の分子は発酵によって処理されるのではなく、腸内微生物によって生体内で有用であり得る特異的代謝物に生物変換される。科学的証拠は、ポリフェノールがヒト宿主における腸内微生物叢の組成を調節し、慢性疾患の種々の生化学的マーカーおよび危険因子を改善できることを示唆する。

より具体的には、本開示の実施形態は、一部の実施形態では、ザクロから誘導または抽出され得る、プニカラギンを含むシンバイオティクス組成物を含む。プニカラギンは、ザクロの果実および皮に見られる強力なポリフェノールであり、果実の深いバーガン色を提供する。人体では、プニカラギンは強力な抗酸化剤として作用し、ある特定の腸内細菌によって、ウロリチンとして公知であるジベンゾピラン－６－オン類（ウロリチン－Ａを含むが、必ずしもこれらに限定されない）に代謝され得る。ウロリチン－Ａは、宿主の健康におけるいくつかの有益な効果のうちの１つ以上を有する可能性がある。非限定的な例として、ウロリチン－Ａは、ミトファジーのプロセス、即ち、欠陥ミトコンドリアのリサイクルを駆動し、したがって、宿主の代謝的健康に重大なプラスの効果を有することができる。

本明細書に開示される本開示の実施形態は、一般に、プレバイオティクス成分の主成分としてのプニカルギンを含むシンバイオティクス組成物に向けられているが、健康なヒト腸内微生物叢中に存在する微生物菌株によって、生理活性代謝物に変換され得る任意の化合物が、プニカラギンに加えてまたはその代わりに提供され得ることは、明示的に理解されるべきである。第１の非限定的な例として、プレバイオティクス成分は、腸内微生物叢によってイソチオシアネートに代謝され得る１種以上のグルコシノレートを含み得、次に、ヒトの健康において抗がん特性および他の有益な役割を有することが示されている。第２の非限定的な例として、プレバイオティクス成分は、結腸内の微生物によってγ－バレロラクトンおよび馬尿酸に代謝され得る１種以上のカテキンを含み得、次に、ヒトの肝臓においてヒトの健康に有用な代謝産物に生物変換され得る。第３の非限定的な例として、プレバイオティクス成分は、１種以上のポリフェノールを含み得、その多くは、腸内微生物叢によって代謝され、ヒトの健康に有益な化合物になることが公知である。これらおよび他の実施形態は、本開示の範囲内である。一部の実施形態では、化合物は、そうでなければ、宿主の観点から、生物学的に「不活性」（すなわち、宿主によってではなく、腸内微生物叢中の１種以上の菌株によってのみ代謝され得る）である化合物であり得、他の実施形態では、化合物は、宿主と腸内微生物叢の両方によって代謝され得る。

送達カプセル
飲み込み可能なカプセルの形態の多数の従来の食物プロバイオティクス組成物は、ヒト宿主に対する組成物の標的化が不十分であるという問題を抱えている。特に、これらの従来のカプセル組成物において、上部消化管の過酷な条件を通して生きた微生物の大部分の生存を確実にし、次に生きた微生物を最も有益な下部消化管に放出することができるカプセルを提供することは困難であることが証明されている。多くの場合、生きた微生物の大部分が下部消化管に到達する前に破壊されるそのような程度に、従来のカプセルは上部消化管で分解される。

ここで、図１Ａおよび１Ｂを参照すると、本開示の実施形態は、プロバイオティクス組成物の送達のための改善されたカプセルを含む。図１Ａの組立図および図１Ｂの分解図に示されるように、送達カプセル１００は、外部カプセル１２０内に封入され、外部カプセル１２０内に埋め込まれ、および／または外部カプセル１２０に取り囲まれた内部カプセル１１０を含む。内部カプセル１１０および外部カプセル１２０の組成および構造は変化し得るが、多くの実施形態では、内部カプセル１１０は、シンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分の大部分もしくは全部を含有するかまたは封入し、一方、外部カプセル１２０は、シンバイオティクス組成物のプレバイオティクス成分の大部分もしくは全部を含有するかまたは封入する。この送達カプセル１００は、消化管を通しての安定性および生存性の改善を可能にし、以下の実施例においてより詳細に記載するように、胃、空腸、十二指腸、および回腸を通して、結腸に到着するまで、プロバイオティクス微生物の１００％またはほぼ１００％の生存をもたらす。特に、本開示の送達カプセル１００は、上部小腸において正確な放出を可能にし、それによって、従来の遅延放出または腸溶被覆ベースの酸耐性送達システムとは対照的に、微生物と宿主細胞の間の係合を増加させる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、外部カプセル１２０は、分解または消化され得、それによって、シンバイオティクス組成物のプレバイオティクス成分の放出をもたらし得、その後、内部カプセル１１０は、分解または消化されて、シンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分の放出をもたらす。本開示の送達カプセル１００の重要な利点は、別個の液体媒体または溶媒を必要とせずに、プレバイオティクス成分およびプロバイオティクス成分のいずれかまたは両方の放出特性の改善を可能にし、特に、結腸内で放出されるまで上部消化システムを介してプロバイオティクス成分の生存を改善することである。

図１Ａおよび１Ｂに示されたカプセル１００の「カプセル・イン・カプセル」構造の１つの利点は、内部カプセル１１０と外部カプセル１２０の両方が、従来の賦形剤、錠剤成分、制御送達成分材料などから構成され得ることである。内部カプセル１１０および外部カプセル１２０は、同じ材料または異なる材料で作製され得る。非限定的な例として、多数の実施形態では、内部カプセル１１０と外部カプセル１２０の両方は、ヒプロメロースから構成することができ、内部カプセル１１０は、外部カプセル１２０と同じグレードまたは異なるグレードのヒプロメロースから構成することができる。

医薬製剤
本開示によって提供される医薬製剤は、患者に適切に投与するための製剤を提供するように、治療有効量のシンバイオティクス組成物を、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルとともに含むことができる。適切な薬学的なビヒクルが当該技術分野において報告されている。

ある特定の実施形態では、シンバイオティクス組成物は、経口投与される医薬製剤に組み込むことができる。このような医薬製剤の経口投与は、腸全体にわたってシンバイオティクス組成物の放出および／または取り込みをもたらすことができる。このような経口製剤は、医薬分野において公知である方法で調製することができ、シンバイオティクス組成物および少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルを含む。経口医薬製剤は、患者に投与するための適切な形態を提供するように、治療有効量のシンバイオティクス組成物および適切な量の薬学的に許容されるビヒクルを含み得る。

シンバイオティクス組成物は、筋肉内、静脈内および経口を含む任意の他の適切な全身投与経路によって投与される医薬製剤に組み込むことができる。

シンバイオティクス組成物を含む医薬製剤は、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、レビゲーション、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬製剤は、１種以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤を用いて、通常の方法で製剤化することができ、シンバイオティクス組成物および１種以上の薬学的に許容されるビヒクルの、薬学的に使用し得る製剤への加工を容易にする。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。本開示によって提供される医薬製剤は、患者への投与に適した持続放出製剤の形態をとることができる。

本開示によって提供される医薬製剤は、単位投与形態で製剤化することができる。単位投与形態とは、処置を受ける患者のための単位用量として適切な物理的に離散した単位を指し、各単位は意図した治療効果をもたらすように計算された所定量のシンバイオティクス組成物を含有する。単位投与形態は、１日１回の用量、１日２回の用量、または１日複数回の用量、例えば１日３回またはそれ以上の用量であり得る。１日複数回の用量を用いる場合、単位投与形態は、各用量に対して同じであるかまたは異なるものであり得る。１つ以上の投薬形態は、１つの用量を含み得、１つの時点でまたは時間間隔の間に患者に投与され得る。

ある特定の実施形態では、本開示によって提供される経口投与形態は、制御放出投与形態であり得る。制御送達技術は、消化管の特定の領域または複数の領域における活性成分の吸収を改善することができる。制御された活性成分送達システムは、活性成分のレベルが治療有効なウィンドウ内に維持され、有効であり、安全な血液レベルが、システムが消化管内で特定の放出プロファイルを有する活性成分を送達し続ける限り、一定期間維持されるように、活性成分を送達するように設計することができる。制御された活性成分送達は、即放性剤形で観察される変動と比較して、活性成分の実質的に一定の血中レベルを一定時間にわたって生じさせることができる。いくつかの用途では、治療経過を通して一定の血中および組織濃度を維持することが最も望ましい処置モードである。活性成分の即時放出は、所望の応答を引き出すのに必要なレベルを超える血中レベルをピークにすることがあり、これは活性成分を浪費し、毒性副作用を引き起こすかまたは悪化させることがある。制御された活性成分送達は、最適な治療をもたらすことができ、投薬の頻度を減らすことができるだけでなく、副作用の重症度も減らすことができる。制御放出投与形態の例としては、溶解制御システム、拡散制御システム、イオン交換樹脂、浸透圧制御システム、侵食性マトリックスシステム、ｐＨ非依存性製剤、胃貯留システムなどが挙げられる。

本開示によって提供される特定の医薬製剤のための適切な経口投与形態は、少なくとも部分的には、活性成分の消化管吸収特性および／または消化管における活性成分の安定性、活性成分の薬物動態および意図される治療プロファイルに依存し得る。適切な制御放出経口投与形態は、特定の成分または成分の組合せに対して選択することができる。例えば、胃貯留経口投与形態は、主として上部消化管から吸収される活性成分に適しており、持続放出経口投与形態は、主として下部消化管から吸収される活性成分に適していることがある。ある特定活性成分は、主に小腸から吸収される。一般に、活性成分は約３～５時間で小腸の全長を通過する。小腸によって容易に吸収されないか、または容易に溶解しない活性成分については、小腸における活性剤吸収のウィンドウは、所望の治療効果を提供するには短すぎることがある。

ある特定の実施形態では、本開示によって提供される医薬製剤は、経口投与時にシンバイオティクス組成物の持続放出を提供するように適合された投与形態で行うことができる。持続放出経口投与形態は、長期間にわたって活性成分を放出するために使用することができ、活性成分が結腸を含む下部消化管に送達されることが望ましい場合に有用である。持続放出経口投与形態は、血漿、血液、脳脊髄液などの生物学的流体中、または組織もしくは臓器中の活性成分の治療濃度を長期間維持する任意の経口投与形態を含む。持続放出経口投与形態には、リザーバーデバイスおよびマトリックスデバイスなどの拡散制御システム、溶解制御システム、浸透システム、および浸食制御システムが含まれる。持続放出経口投与形態およびそれを調製する方法は、当該技術分野において周知である。

ある特定の実施形態では、本開示によって提供される医薬組成物は、シンバイオティクス組成物を投与するための任意の腸溶性持続放出経口投与形態を含み得る。一実施形態では、腸溶被覆経口投与形態は、１日３回の投与頻度で患者に投与される。別の実施形態では、腸溶被覆経口投与形態は、１日２回の投与頻度で患者に投与される。さらに別の実施形態では、腸溶被覆経口投与形態は、１日１回の投与頻度で患者に投与される。

ある特定の実施形態では、本開示によって提供される医薬製剤は、シンバイオティクス組成物を投与するための任意の非腸溶性持続放出経口投与形態を含み得る。一実施形態では、非腸溶被覆経口投与形態は、１日３回の投与頻度で患者に投与される。別の実施形態では、非腸溶被覆経口投与形態は、１日２回の投与頻度で患者に投与される。さらに別の実施形態では、非腸溶被覆経口投与形態は、１日１回の投与頻度で患者に投与される。

ある特定の実施形態では、本開示によって提供される医薬製剤は、シンバイオティクス組成物を投与するための任意のカプセル経口投与形態を含み得る。一実施形態では、カプセル経口投与形態は、１日３回の投与頻度で患者に投与される。別の実施形態では、カプセル経口投与形態は、１日２回の投与頻度で患者に投与される。さらに別の実施形態では、カプセル経口投与形態は、１日１回の投与頻度で患者に投与される。

ある特定の実施形態では、本開示によって提供される医薬製剤は、上記のインビトロ放出プロファイルを達成する任意の適切な投与形態を含み得る。このような投与形態は、持続放出腸溶被覆経口投与形態、および持続放出腸溶被覆または非腸溶被覆経口投与形態を含む、任意の全身投与形態であり得る。適切な投与形態の例を本明細書に記載する。製剤分野の当業者は、実施例に記載される投与形態を出発点として与えられたいずれかの数の許容可能な投与形態を開発することができる。

シンバイオティクス組成物の適切な用量は、いくつかの十分に確立されたプロトコールのいずれか１つに従って決定することができる。例えば、マウス、ラット、イヌ、および／またはサルを用いた研究などの動物試験を用いて、医薬化合物の適切な用量を決定することができる。動物試験の結果は、例えばヒトなど他の動物種において使用するための用量を決定するために外挿することができる。

用途
本明細書に開示される方法および製剤は、シンバイオティクス組成物が提供することが公知であるか、または後に治療上の利益を提供することが見出される疾患、障害、状態および症状に苦しむ患者を処置するために使用することができる。本明細書に開示される製剤は、副腎白質ジストロフィー、ＡＧＥ誘導性ゲノム傷害、アレクサンダー病、円形脱毛症、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、狭心症、関節炎、喘息、口頭同心性硬化症、ベーチェット病、類天疱瘡、カナバン病、左心室機能不全を含む心不全、中枢神経系血管炎、シャルコット・マリー・トゥース病、中枢神経系髄鞘形成不全を伴う小児期運動失調、慢性特発性末梢神経障害、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚狼瘡、皮膚炎（接触、急性および慢性）、糖尿病性網膜症、移植片対宿主病、肉芽腫、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、ハンチントン病、過敏性腸疾患、虚血、クラッベ病、扁平苔癬、黄斑変性症、ミトコンドリア脳筋症、一側性筋萎縮症、多発性硬化症、心筋梗塞、脳鉄蓄積を伴う神経変性、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、ＮＦ－κＢ媒介性疾患、視神経炎、腫瘍随伴症候群、パーキンソン病、ペリゼウス・メルツバッハー病、天疱瘡、原発性側索硬化症、進行性核上麻痺、乾癬、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、色素性網膜症、サルコイドーシス、シルダース病、亜急性壊死性脊髄症、ササック症候群、移植拒絶反応、横断性脊髄炎、腫瘍、潰瘍性大腸炎、またはゼルウィガー症候群から選択される疾患を処置するために使用することができる。

本開示によって提供される患者において疾患を処置する方法は、このような処置を必要とする患者に、本開示のシンバイオティクス組成物の治療有効量を投与するステップを含む。これらの方法および医薬製剤は、患者への投与後に、治療量もしくは予防量のプレバイオティクス化合物および／またはプロバイオティクス菌株を提供する。シンバイオティクス組成物は、特定の疾患の処置に適した量で、投与スケジュールを用いて投与することができる。

シンバイオティクス組成物のプレバイオティクス成分の化合物の日用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、およびある特定の実施形態では、約５ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。ある特定の実施形態では、プレバイオティクス成分の化合物は、経時的に約１ｍｇ～約５ｇ／日、約１０ｍｇ～約４ｇ／日、ある特定の実施形態では約２０ｍｇ～約２ｇ／日、ある特定の実施形態では約１００ｍｇ～約１ｇ／日、ある特定の実施形態では約１５０ｍｇ～約６５０ｍｇ／日、ある特定の実施形態では約２５０ｍｇ～約５５０ｍｇ／日、ある特定の実施形態では約３５０ｍｇ～約４５０ｍｇ／日、およびある特定の実施形態では約４００ｍｇ／日の用量で投与され得る。

ある特定の実施形態では、プロバイオティクス成分の微生物菌株は、経時的に約１億２５００万ＡＦＵ～約６２５０億ＡＦＵ／日、特定の実施形態では約１２億５０００万ＡＦＵ～約５０００億ＡＦＵ／日、ある特定の実施形態では約２５億ＡＦＵ～約２５００億ＡＦＵ／日、ある特定の実施形態では約１２５億ＡＦＵ～約１２５０億ＡＦＵ／日、ある特定の実施形態では約２５０億ＡＦＵ～約１０００億ＡＦＵ／日、ある特定の実施形態では約３７５億ＡＦＵ～約７５０億ＡＦＵ／日、およびある特定の実施形態では約５００億ＡＦＵ～約６２５億ＡＦＵ／日の用量で投与され得る。

一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２５億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約５０億ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２５億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約５０億ＡＦＵ／用量のラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰ１－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約６０億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約１２０億ＡＦＵ／用量のラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＬＲ６－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２５億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約５０億ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＳＤ－ＢＡ５－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約１０億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約２０億ＡＦＵ／用量のリギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２４億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約４８億ＡＦＵ／用量のリモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約４億２，５００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約８億５，０００万ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＢＳ５－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約５億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約１０億ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＭＢ２４０９－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約４億２，５００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約８億５，０００万ＡＦＵ／用量のラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＳＤ－ＬＣＲ０１－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約８５００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約１億７０００万ＡＦＵ／用量のリモシラクトバチルス・ファーメンタム（Limosilactobacillus fermentum）ＳＤ－ＬＦ８－ＩＴを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約４２．５億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約８５億ＡＦＵ／用量のラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＨＲＶＤ１１３－ＵＳを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約１０億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約２０億ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＨＲＶＤ５２４－ＵＳ（Ｂｌ－０４）を含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約３億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約６億ＡＦＵ／用量のラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＨＲＶＤ３００－ＵＳを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約３億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約６億ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＨＲＶＤ５２１－ＵＳを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約１億２，０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約２億４，０００万ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＨＲＶＤ９０ｂ－ＵＳを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約３０億ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約６０億ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－Ｂ５３６－ＪＰを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２億５，０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約５億ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）ＳＤ－Ｍ６３－ＪＰを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約６０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約１２０００万ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ１５０－ＢＥのカプセルを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または約４０００万ＡＦＵ／用量のラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＧＧ－ＢＥを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約４０００万ＡＦＵ／用量のリモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＲＤ８３０－ＦＲを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２億１０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約４億２０００万ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＣＥＣＴ８１４５－ＳＰを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２億１０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約４億２０００万ＡＦＵ／用量のビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約１億８０００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約３億６０００万ＡＦＵ／用量のラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＳＤ－ＣＥＣＴ９１０４－ＳＰを含み得る。一部の実施形態では、プロバイオティクス成分は、少なくとも約２４億６５００万ＡＦＵ／カプセル、および／または少なくとも約４９億３０００万ＡＦＵ／用量のラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰＬＤＬ－ＵＫを含み得る。これらの実施形態では、プロバイオティクス成分に存在する任意の１つ以上の菌株のＡＦＵ絶対数は、任意の２つ以上の選択された微生物菌株間のＡＦＵ比が上記とほぼ同じままである限り（例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴとラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＬＲ６－ＩＴの間のＡＦＵ比が約２５億：６億、または約５０億：１２０億のままである限り）、変動し得る。

シンバイオティクス組成物の適切な用量は、例えば、処置される患者の体重および／または状態、処置される疾患の重症度、副作用の発生率および／または重症度、投与方法、および処方医師の判断を含む、いくつかの因子に基づいて決定され得る。適切な用量範囲は、当業者に公知である方法によって決定することができる。

シンバイオティクス組成物は、ヒトに使用する前に、所望の治療活性または予防活性についてインビトロおよびインビボでアッセイすることができる。例えば、適切な動物モデルを用いたインビボアッセイはまた、シンバイオティクス組成物の投与が治療有効であるかどうかを決定することができる。

ある特定の実施形態では、治療有効量のシンバイオティクス組成物は、副作用を含む実質的な毒性を引き起こすことなく、治療上の利益を提供し得る。シンバイオティクス組成物および／またはその代謝物の毒性は、標準的な医薬手順を用いて決定することができ、当業者によって確認することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数である。シンバイオティクス組成物の用量は、毒性をほとんど示さないかまたは全く示さない、例えばプレバイオティクス成分の治療有効な循環血漿および／または血中濃度を確立および維持することができる範囲内であり得る。

シンバイオティクス組成物投与は、副腎白質ジストロフィー、ＡＧＥ誘導性ゲノム傷害、アレクサンダー病、円形脱毛症、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、狭心症、関節炎、喘息、口頭同心性硬化症、ベーチェット病、類天疱瘡、カナバン病、左心室機能不全を含む心不全、中枢神経系血管炎、シャルコット・マリー・トゥース病、中枢神経系髄鞘形成不全を伴う小児期運動失調、慢性特発性末梢神経障害、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚狼瘡、皮膚炎（接触、急性および慢性）、糖尿病性網膜症、移植片対宿主病、肉芽腫、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、ハンチントン病、過敏性腸疾患、虚血、クラッベ病、扁平苔癬、黄斑変性症、ミトコンドリア脳筋症、一側性筋萎縮症、多発性硬化症、心筋梗塞、脳鉄蓄積を伴う神経変性、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、ＮＦ－κＢ媒介性疾患、視神経炎、腫瘍随伴症候群、パーキンソン病、ペリゼウス・メルツバッハー病、天疱瘡、原発性側索硬化症、進行性核上麻痺、乾癬、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、色素性網膜症、サルコイドーシス、シルダース病、亜急性壊死性脊髄症、ササック症候群、移植拒絶反応、横断性脊髄炎、腫瘍、潰瘍性大腸炎、またはゼルウィガー症候群から選択される疾患を処置するために使用され得る。処置される前述の疾患のいずれかの根底にある病因は、多数の起源を有する場合がある。さらに、ある特定の実施形態では、治療有効量のシンバイオティクス組成物を、前述の疾患および障害に対する予防手段として、ヒトなどの患者に投与することができる。したがって、治療有効量のシンバイオティクス組成物は、副腎白質ジストロフィー、ＡＧＥ誘導性ゲノム傷害、アレクサンダー病、円形脱毛症、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、狭心症、関節炎、喘息、口頭同心性硬化症、ベーチェット病、類天疱瘡、カナバン病、左心室機能不全を含む心不全、中枢神経系血管炎、シャルコット・マリー・トゥース病、中枢神経系髄鞘形成不全を伴う小児期運動失調、慢性特発性末梢神経障害、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚狼瘡、皮膚炎（接触、急性および慢性）、糖尿病性網膜症、移植片対宿主病、肉芽腫、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、ハンチントン病、過敏性腸疾患、虚血、クラッベ病、扁平苔癬、黄斑変性症、ミトコンドリア脳筋症、一側性筋萎縮症、多発性硬化症、心筋梗塞、脳鉄蓄積を伴う神経変性、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、ＮＦ－κＢ媒介性疾患、視神経炎、腫瘍随伴症候群、パーキンソン病、ペリゼウス・メルツバッハー病、天疱瘡、原発性側索硬化症、進行性核上麻痺、乾癬、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、色素性網膜症、サルコイドーシス、シルダース病、亜急性壊死性脊髄症、ササック症候群、移植拒絶反応、横断性脊髄炎、腫瘍、潰瘍性大腸炎、またはゼルウィガー症候群の素因および／または病歴を有する患者に対して予防手段として投与することができる。

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、広域スペクトル抗生物質療法後の腸内微生物叢のメタゲノムおよびメタボロミクス再構成に有効であり得る。このような方法および組成物に関するさらなる開示は、Clinicaltrials.gov Study NCT04171466, 「Metagenomic and Metabolomic Reconstitution of Gut Microbiota After Broad Spectrum Antibiotic Therapy」に見出され得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、広域スペクトル抗生物質治療後に上皮バリア完全性および腸内微生物叢機能を回復するのに有効であり得る。このような方法および組成物に関するさらなる開示は、Clinicaltrials.gov Study NCT04171466, 「Metagenomic and Metabolomic Reconstitution of Gut Microbiota After Broad Spectrum Antibiotic Therapy」に見出され得、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、過敏性腸症候群の対象における腸内微生物叢のメタゲノム安定性および代謝産物を改善するのに有効であり得る。

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、軽度から中等度のＣＯＶＩＤ－１９を有する成人の腸および気道の微生物叢を改善、修復、または機能を回復するのに有効であり得る。

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、過敏性腸症候群の対象において、リファキシミン処置後に腸バリアの完全性および腸内微生物叢組成物を保持するのに有効であり得る。

一部の実施形態では、本開示の方法および組成物は、便秘を向上させ、予防し、または処置するのに有効であり得る。

本開示は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに記載される。実施例は、本開示の種々の態様を例示する。本開示の範囲から逸脱することなく、材料および方法の両方に対する多くの変更を実施することができることは、当業者には明らかである。

[実施例１]
全ゲノムショットガン配列決定
メタゲノムＤＮＡを、Ｍａｇ Ａｔｔｒａｃｔ Ｐｏｗｅｒ Ｓｏｉｌキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ２７０００－４－ＥＰ）を用いて、本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分から抽出した。配列ライブラリーは、Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｆｌｅｘプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて調製された。配列決定は、ＨｉＳｅｑ３０００（２×１５０ｂｐ）上で行い、品質フィルタリングの前にＲ１とＲ２読み取りの両方に対して２２．２７Ｇｂを生成した。配列は、デフォルト設定で、最小配列長が７５ｂｐであるＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを使用してフィルタリングされた。分類学的組成はＭｅｔａＰｈｌＡｎ２を用いて決定された。

プロバイオティクス混合物からの対末端配列読み取りを、ｋｍａを用いて、ＲｅｓＦｉｎｄｅｒ（２０１９年４月２６日リリース）およびＮＣＢＩ抗菌薬耐性データベース（２０１９年４月２９日リリース）の２つの公的に利用可能なＡＭＲデータベースの最新バージョンにマッピングする読取レベル分析を行った。ｋｍａアルゴリズムは、生の（すなわち、組み立てられていない）配列読み取りをマッピングし、冗長データベース内のヒットを同定するように設計された、迅速で正確なｋｍｅｒベースのアライナーである。ｋｍａアライナーは、クエリーに焦点を当てるのではなく、データベースに焦点を当て、同定、カバレッジ、組み立てられていない読み取りのプールで特定された全てのヒットによって表されるカバレッジの深さに関する証拠を提示することを除いて、従来のＢＬＡＳＴレポートによく似た出力を生成する。

合計２２．２７Ｇｂの生の配列データを生成した。品質フィルタリング後、１６．０４Ｇｂのデータを分類学的およびＡＭＲプロファイリングに利用した。分類学的プロファイリングは、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）、リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）、およびビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）を含む１２の細菌種を同定し、群において同定された配列リードの大部分を占めた。

[実施例２]
Ｎｒｆ２転写因子に対するスクリーニング
カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）は、その全ゲノム配列を決定した最初の多細胞生物であり、短い２～３週間の寿命、透明な細胞壁、および遺伝的容易性の組合せにより、エネルギー代謝、免疫、および老化の研究に使用される極めて汎用性の高いモデル系となった。Ｃ．エレガンス（C. elegans）蠕虫は野生では多様な微生物叢を示すが、実験室では一般的に１種の微生物を用いて増殖する。これにより、研究者は明確な腸内微生物叢を容易に作成し、維持することができる。腸は生物の主要な臓器の１つであり、体質量の約３分の１を占める。透明な細胞壁および好気性内腔もまた、蛍光タンパク質およびマーカーの簡単な可視化を可能にする。蠕虫は、蠕虫の年齢に伴って腸内細菌量を調節するために使われる自然免疫系を有する。宿主－微生物叢相互作用を調べるために便利であり、ロバストなツールの必要性が明らかになってきたことから、宿主－微生物叢相互作用と合成生物学の両方のための生きた動物モデルとしてＣ．エレガンス（C. elegans）を使用することへの関心が高まっている。例としては、宿主－微生物－薬物相互作用の複雑性を解明するためのハイスループットスクリーニング、細菌産生代謝産物が蠕虫の遺伝子発現とその寿命にどのように影響するかの理解、および微生物叢による腸のコロニー形成における確率論的役割が挙げられる。

活性酸素種によって引き起こされる細胞損傷は、加齢関連疾患の主要な寄与因子であると考えられている。ヒトは、環境ストレス因子に応答するロバストな応答経路を発達させ、生体異物に応答して一連の解毒酵素を産生する。消化管は、皮膚と並んで、外部ストレス因子との高い接触表面であり、その結果、宿主の免疫応答を調節する。近年、微生物がこのシステムに関与し、局在性および全身性の転写経路に影響を及ぼすための使用が探索されている。細胞サーベイランス活性化解毒および免疫応答に関与するシグナル伝達機構および遺伝因子を同定することにより、その調節のための新規プロバイオティクスを同定し、有害な転帰を予防または処置することができる。

本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分に存在する微生物菌株を、最初に、単一ヒットとして、および哺乳動物Ｎｒｆ２転写因子の機能的オルソログであるＳｋｎ－１として知られる経路を介して、宿主解毒応答の上方制御を同定するための新規なＣ．エレガンス（C. elegans）に基づくモデルにおけるコンソーシアムにおいて評価した。Ｎｒｆ２は抗酸化物質および細胞保護遺伝子の発現を誘導するため、生物学的に関連する経路であり、抗炎症発現プロファイルをまとめて誘発し、インフラマソーム応答を調節する。

次に図２を参照すると、デトックスおよび免疫応答の減弱および／または関連症状の処置のための阻害剤微生物コンソーシアムまたはその成分を同定および検証するための方法２００が示されている。方法２００の第１のステップ２１０において、約１，４００個の固有微生物および１０００万個を超える遺伝子活性に関する情報を含むマイクロバイオームライブラリーをスクリーニングして、関心のある微生物を同定する。方法２００の第２のステップ２２０において、対象となる微生物を、例えば、糖尿病、アポトーシス、がんなどのための５０以上の調製済みＣ．エレガンス（C. elegans）モデルのいずれかに導入する。方法２００の第３のステップ２３０において、Ｃ．エレガンス（C. elegans）モデルから個々の微生物菌株を単離し、特徴付けを行い、方法２００の第４のステップ２４０において、遺伝子スクリーニングによって治療上目的の菌株を同定する。次に、治療上目的これらの菌株を、増殖ステップ２５０ａの一方または両方に供し、完全に特徴付けられた微生物菌株を、任意の適切な方法によって増殖させ、および／または、微生物代謝産物、すなわち潜在的な活性な治療成分を同定し、合成する代謝産物同定ステップ２５０ｂである。ステップ２５０ａの微生物菌株および／またはステップ２５０ｂで合成された微生物代謝産物は、次に、ステップ２６０の動物モデルおよび／または患者組織において試験されて、微生物菌株（プロバイオティクスとして）、微生物代謝産物（プレバイオティクスまたはポストバイオティクスとして）、またはその両方（シンバイオティクス組成物として）の治療効果を評価することができる。次に、動物および／または患者組織試験ステップ２６０の結果を用いて、製剤化ステップ２７０における精密なプレバイオティクス、プロバイオティクス、ポストバイオティクス、および／またはシンバイオティクス組成物に使用する菌株および／または化合物を合理的に選択することができる。

本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分中に存在する微生物菌株を、Ｃ．エレガンス（C. elegans）に対して単離して、細胞保護応答についてスクリーニングした。環境ストレスによって引き起こされる損傷を防ぐために、生物は防御反応をもたらす防御機構を発達させてきた。酸化ストレスは、活性酸素種（ＲＯＳ）生成の増加により細胞内で発生し、タンパク質および脂質損傷の増加および細胞機能の低下と関連している。消化管の苦痛に加えて、ＲＯＳ値の上昇は加齢、神経変性、糖尿病と関連している。Ｎｒｆ２は酸化還元感受性転写因子であり、細胞ストレスに対する適応応答および内因性および環境ストレス因子に対する保護を媒介する。

Ｎｒｆ２は、ＲＯＳおよびＲＯＳ誘導細胞変化を解毒するシステムを助けるグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含むいくつかの解毒酵素の発現を調節する。ＳＫＮ－１は哺乳動物Ｎｒｆ転写因子のＣ．エレガンス（C. elegans）の機能的オルソログであり、ＳＫＮ－１の活性化はグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のホモログであるＧＳＴ－４の発現を誘導する。ＳＫＮ－１の活性化は、ＧＦＰタンパク質（ｇｓｔ－４：：ＧＦＰ）にフックされたｇｓｔ－４遺伝子の発現を評価することによってアッセイされた。ＳＫＮ－１が活性化されると、ｇｓｔ－４：：ＧＦＰの発現が増加する。正常または未処置動物では、弱いｇｓｔ－４：：ＧＦＰ発現が体壁筋および皮膚組織で観察される。

次に図３Ａ～４Ｂを参照すると、本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分の微生物コンソーシアムの組み合わせ処理の結果が示されている。図３Ａおよび３Ｂに示されるように（２つの別々の未処理Ｃ．エレガンス（C. elegans）反復を表す）、弱いｇｓｔ－４：：ＧＦＰが観察された。図４Ａおよび４Ｂに示されるように（本開示の微生物コンソーシアムで処理された２つの別々のＣ．エレガンス（C. elegans）反復を表す）、ｇｓｔ－４：：ＧＦＰは、明らかに大幅に強化され、増大される。したがって、特定の理論に拘束されることを望まないが、本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分の微生物コンソーシアムの投与は、細胞ストレスに対する宿主の適応応答の媒介を改善し、および／またはＮｒｆ２を上方制御することによって宿主を内因性および環境ストレス因子から保護し、それにより、胃腸障害、加齢、神経変性、および糖尿病のいずれか１つ以上を向上させ、予防し、または処置するのに有効であり得ると考えられる。

[実施例３]
密着結合タンパク質におけるＮｒｆ２情報制御の効果
Ｎｒｆ２は、適切な上皮バリア機能を維持するために必要な遺伝子の発現に重要である。腸上皮細胞におけるＮｒｆ２経路の上方制御は、ＲＯＳレベルを減少させ、腸細胞生存を促進し、密着結合の完全性を増加させることが示されている。密着結合タンパク質は、クラウジン、オクルージン、接合接着分子、および足場タンパク質小帯閉塞によって表される。これらの密着結合タンパク質のうち、クラウジンは密着結合の主要な構成要素であり、上皮細胞のバリアと極性に関与している。逆流性食道炎、炎症性腸疾患、機能性消化管障害、がんなどの消化管疾患は、これらの分子によって調節され、その機能が破壊されると、慢性炎症状態および慢性疾患または進行性疾患に至る。

本開示のシンバイオティクス組成物が密着結合タンパク質に影響を与えるメカニズムをさらに探索するために、５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃にて増殖させた結腸癌細胞株ＨＴ－２９／Ｂ６を用いて実験を行った。元々ＨＴ－２９細胞からサブクローニングしたＨＴ－２９／Ｂ６細胞を２％安定化Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中で培養し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを補充した。これらの細胞の６分離株が得られ、そのうち５株は本開示に従ってシンバイオティクス組成物で処理され、１株は対照として未処理のままであった。

クラウジン－１に対する抗体は、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から入手した。ウエスタンブロット分析のために、細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ＰｏｌｙＳｃｒｅｅｎ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に半乾燥トランスファーにより移した。膜をＴＳＴ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）中、室温で１時間ブロックした。ＴＳＴ中の濃度１μｇ／ｍｌの第１抗体とのインキュベーションを、室温で１時間行った。ＴＳＴで３回洗浄した後、ＴＳＴで１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体で３０分間膜をインキュベートし、その後洗浄した。ケミルミネセンス検出は、Ｂｉｏｍａｘ ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）をＬｕｍｉＬｉｇｈｔウエスタンブロッティング基質処理膜に曝露することによって行われた。タンパク質断片の分子量は、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定された。

次に図５を参照すると、ウエスタンブロットの結果が示され、図５において、「１」と標識された分離株は対照（未処理）分離株であり、「２」から「６」と標識された分離株はシンバイオティクス組成物で処理される。図５に示されるように、未処理細胞と比較して、Ｎｒｆ２を上方制御する本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分の微生物菌株で腸上皮細胞を処理した後、クロージン－１の発現の増加が観察される。この結論は、下記の表１に示される密着結合タンパク質の発現増加のデンシトメトリー値によってさらに補強される。

したがって、いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本開示のシンバイオティクス組成物の投与は、Ｎｒｆ２を上方制御することによって上皮関門機能を改善することができ、それによって、１種以上の消化管疾患を向上させ、予防し、または処置するのに効果的であり得ると考えられる。

[実施例４]
有機酸産生
有機酸産生は、微生物が腸内微生物叢の代謝産物を調節し、宿主細胞と結合する重要な特徴である。有機酸、特に短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、カルボン酸部分と小さな炭化水素鎖から化学的に構成される細菌発酵産物である。ＳＣＦＡの中では、酢酸、プロピオン酸、酪酸が最も研究されており、それぞれ２個、３個、４個の炭素原子を化学構造にもっている。これらの代謝産物は腸管で高濃度に見出され、そこで腸上皮細胞（ＩＥＣ）に取り込まれ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の酸化的生産のための基質として使用される。さらに、これらの分子は、ＩＥＣの様々な態様、および白血球の発生、生存、および機能を調節することによって、微生物叢と免疫系との間のリンクとして作用する。さらに、ＳＣＦＡは、上皮バリアの完全性を保護し、Ｂ細胞ＩｇＡ産生を促進し、Ｔ細胞分化を調節することにより、腸の恒常性を維持することが示されている。

９６個の平底孔（３００μＬ）を有するポリプロピレンマイクロプレート上で試験を行い、吸光度をＢｉｏｔｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマルチモードのマイクロプレートリーダーで測定した。使用した試薬は、Ａｃｒｏｓ－Ｏｒｇａｎｉｃｓの酪酸エチル（９９．０％）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈの酢酸エチル（９９．５％）、プロピオン酸メチル（９９．５％）、およびアセトン（９９．５％）およびＶｅｔｅｃの無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム（９９．０％）であった。対照は、Ｎｅｏｎ由来の酪酸（９９．５％）および酢酸（９９．８％）およびＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ由来のプロピオン酸（９９．０％）であった。ブロモチモールブルーインジケーターは、Ｓｙｎｔｈから入手し、ＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）ＰＤＢ（ポテトデキストロースブロス）培地はＡｃｕｍｅｄから入手した。

本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分中に存在する微生物菌株を、唯一の炭素源としてラクツロースおよび酸性条件下で黄色になる酸インジケーターとしてブロモクレゾールパープル（０．５％）を有する消化管修飾培地を用いて、有機酸の生産のためにスクリーニングした。ラクツロースを利用して有機酸／短鎖脂肪酸を生成し、次に培地を酸性化する分離株は「ヒット」と考えられ、液体培地で試験される菌株もあれば、固体培地基質で試験される菌株もある。

有機酸産生を測定するための培地は、表２に従った組成を有した。

有機酸の生成は、微生物菌株の添加後のブロモクレゾールパープルから黄色への色変化を観察することによってモニタリングした。図６Ａおよび６Ｂは、それぞれ液体培地および固体培地上で試験された試料の代表的なアッセイの結果を示す。図７に示される可視光吸光度測定値は、対照に対する各試料中で産生された有機酸の量の定量的測定値を提供する。

図６Ａ、６Ｂ、および７に示される結果が示すように、本開示のシンバイオティクス組成物の投与は、消化管における有機酸の産生を増加させ得る。したがって、いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、このような投与は、上皮バリアの完全性を保護し、Ｂ細胞ＩｇＡ産生を促進し、および／またはＴ細胞分化を調節し得、それにより、腸の恒常性の維持を助けるのに効果的であり得ると考えられる。

[実施例５]
消化管生存率
本開示によるシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分の微生物コンソーシアムの生存を確認するために、シンバイオティクス組成物を含む図１Ａに記載のヒプロメロース送達カプセル１００を、図７に示されるヒト腸内微生物生態系（ＳＨＩＭＥ）７００のシミュレーターを用いて試験した。特に、ＳＨＩＭＥ７００は、胃管７１０、小腸管７２０、上行結腸管７３０、横行結腸管７４０、および下行結腸管７５０を含む。胃管７１０は、ポンプを介して微生物コンソーシアム７０１および胃酸７０２、ならびに窒素ガスの供給を受け取り、混合する。胃管７１０からの出力は、小腸管７２０に送り出され、そこでポンプを介して受け取られた膵液７１１と混合される。小腸血管７２０からの出力は、ヒト上行結腸を模擬するためにｐＨ制御されている上行結腸血管７３０に送り出される。上行結腸血管７３０からの出力は、ヒト横行結腸をシミュレートするためにｐＨ制御される横行結腸血管７４０にポンピングされる。横行結腸血管７４０からの出力は、下行結腸血管７５０に送り出され、これは、ヒト下行結腸をシミュレートするためにｐＨ制御される。下行結腸容器７５０からの出力は、最終的に排出タンク７５１にポンプで送られる。したがって、ＳＨＩＭＥ７００は、ヒト消化管を代表する生理学的条件および生物学的条件（例えば、食物取り込み、蠕動、消化酵素、膵臓および胆汁酸、滞留時間など）を再現する。

試験期間を通して、様々な時点での生／死フローサイトメトリーを用いて、微生物の生存度を評価した。さらに、カプセルの目視スコアリングにより、崩壊挙動およびプロバイオティクスの標的送達の可能性を観察することができた。各サンプリング時点において、カプセルの目視検査を行い、上部ＧＩＴの異なる領域を通過する際のカプセルの溶解挙動を検討した。各サンプリング時点で、カプセルは１（完全にインタクトのカプセル）、２（カプセルが損傷したが、カプセル内にほとんど全ての製品が依然として存在している）、３（カプセルが損傷し、全ての製品が放出される）、または４（カプセルが破壊される）の数字スコアを受けた。サイトメトリーおよび目視検査は、カプセルのＳＨＩＭＥへの導入前、胃血管７１０への滞留の終わり（導入後約１時間）、小腸血管７２０への滞留のおよそ中間点（導入後約２時間）、および小腸血管７２０への滞留の終わり（導入後約３時間）の４つの時点で行われた。

次に図８を参照すると、ＳＨＩＭＥ７００を用いた送達カプセル１００の試験の結果が示され、バーは、適切なリアクターにおける生菌数のベース－１０対数を表し、バーの上の数字は、カプセルの目視検査によって得られた定性的な１～４スコアを示す。「製品」、「ＳＴｅｎｄ」、「ＳＩｍｉｄ」および「ＳＩｅｎｄ」は、それぞれ、第１、第２、第３および第４の時点、すなわち、ｔ＝０、１時間、２時間および３時間を表す。

図８に示されように、ヒトの胃および小腸の状態に３時間曝露した後、カプセル１００は、４（カプセル破壊）の定性的目視スコアによって示されるように、完全に溶解および／または破壊されたが、生きたプロバイオティクスの最大放出を送達し、顕著には、微生物の開始用量の１００％（ｌｏｇ－１０．５７生菌数の開始用量と比較してｌｏｇ－１０．６０生菌数）は、この３時間後も残存した。これらの結果は、本開示の送達カプセルが、小腸の末端までの本開示のシンバイオティクス組成物の完全なプロバイオティクス成分の生存性を確実にし、したがって、結腸内にインタクトの微生物の完全な全量を放出するのに有効であることを示す。

[実施例６]
腸内毒素症に対する保護効果
この実施例は、移植されたヒト微生物叢におけるベースラインへの復帰ならびに全体的な微生物発酵および代謝活性を評価することによって、２つの一般的な環境誘導ストレス因子である抗生物質およびアルコールによって引き起こされる微生物性腸内毒素症に対する本開示のシンバイオティクス組成物の保護効果における洞察を提供する。

アルコール摂取または抗生物質の使用などの食習慣が、ヒト腸内微生物叢の組成物と代謝活性の調節に何らかの役割を果たしているという証拠が増えている。米国では、医療提供者が毎年２億７，０００万件を超える抗生物質の処方を提供している。抗生物質は、医学および生命を脅かす細菌感染の処置方法を変えてきたが、広域スペクトル抗生物質はまた、組成と機能の両方を変化させることによって、常在の腸内微生物群の破壊を誘導する。微生物群動態のこの破壊は分類学的レベルで実証されているが、微生物代謝産物および宿主細胞に対する機能的破壊の程度は、ヒトでは未だ明らかにされていない。

身体的、体液性および免疫学的成分を含む、腸管バリアにおける複数層の防御はまた、アルコールによって影響され得る。動物およびヒトを対象とした研究では、アルコール摂取は「リーキーガット」、細菌および微生物化合物の腸基底膜を越えた門脈および体循環への移行を引き起こすことが示されている。さらに、アルコール摂取は、アルコール摂取のマウスモデルと同様に、ヒトの小腸における腸内細菌性毒素症および細菌の過剰増殖をもたらす。

結腸環境を模倣するＳＨＩＭＥリアクターは、粘液環境を模擬するために、微生物およびムチン被覆担体の栄養源とともに、健康ドナー由来の糞便微生物叢で接種された。全試験条件を三重反復で評価した。

２種類の異なる抗菌薬：抗生物質（５０μｇ／ｍｌメトロニダゾール＋３０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン）またはアルコール（０．３ｍＬグレイグースウォッカ／ｍｌ結腸懸濁液、または１２％のアルコール濃度に対応する３０％（ｖ／ｖ））のうちの１つを添加することによって、腸内毒素症を誘導した。これらの用量は、上部ＧＩＴに沿った９０％の吸収を仮定することによって、経口抗菌薬投入量の１０％と推定され、予備研究で発酵槽内の微生物叢の実質的な腸内毒素症を誘導することが実証された。

本開示によるシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分の完全な２カプセル用量（５３０億ＡＦＵ）を、抗菌剤誘発性腸内異常微生物群を含むリアクターに添加した。「健康」対照をシミュレートするために、発酵槽に、抗生物質またはアルコールを添加せずに、健康なドナー由来の糞便微生物叢を接種した。

微生物の代謝および活性は、ベースラインならびに６、２４、および４８時間のインキュベーション後に各発酵槽で評価された。評価されたパラメータは、（１）ｐＨ（酸性化の程度は細菌の発酵代謝の強度の尺度である）で測定した場合の全体的な発酵活性の変化、および（２）ＳＣＦＡ微生物代謝産物、すなわち酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩の濃度の変化（ＳＣＦＡ産生のパターンは微生物の炭水化物およびタンパク質代謝の評価に使用することができる）であった。

図９は、健康な対照発酵槽（「対照」）、抗生物質誘発性腸内異常対照発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿対照」）、抗生物質誘発性腸内異常処置発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿処置」）、アルコール誘発性腸内異常対照発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿対照」）、およびアルコール誘発性腸内異常処置発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿処置」）における４８時間にわたるｐＨの変化を示す。健康対照微生物叢は発酵槽のｐＨを強く低下させ、微生物の高い発酵代謝活性を示した。腸内毒素症対照インキュベーション（シンバイオティクスなし）では、微生物の発酵代謝の低下を反映して、健康対照のインキュベーションよりも顕著なｐＨ低下が少なかった。微生物不均衡群への本開示のシンバイオティクス組成物の添加は、それぞれの対照インキュベーションよりも強いｐＨ低下をもたらし、これらの微生物群における発酵プロセスに対するシンバイオティクス組成物の刺激効果を示唆した。観察されたｐＨ低下は、健康な対照インキュベーションよりもさらに強かった。これらの結果は、シンバイオティクス組成物が誘導型腸内毒素症の２つの異なるモデルにおいて発酵プロセスに積極的に寄与し、このようにＳＣＦＡおよび／または乳酸塩の産生を刺激したことを示す。

総ＳＣＦＡレベルは、試験成分の全体的な発酵を反映している。腸内異常対照インキュベーションは、健康対照インキュベーションよりも総ＳＣＦＡ濃度が有意に低かった。シンバイオティクス処置は、両方の腸内異常群において総ＳＣＦＡ産生を刺激した。これは、インキュベーション終了時までに、健康対照と比較して、シンバイオティクス処置された腸内異常発酵槽中の類似したまたはより高いＳＣＦＡ濃度をもたらした。

図１０は、健康な対照発酵槽（「対照」）、抗生物質誘発性腸内異常対照発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿対照」）、抗生物質誘発性腸内異常処置発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿処置」）、アルコール誘発性腸内異常対照発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿対照」）、およびアルコール誘発性腸内異常処置発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿処置」）における４８時間にわたる酪酸塩濃度の変化を示す。酪酸塩は、クロストリジウム（Clostridium）属のメンバーによって産生され、様々なヒトの健康上の利益を有する。腸内異常対照インキュベーションは、健康対照インキュベーションよりも有意に高い酪酸塩濃度を生じさせた。これは、主に６時間～２４時間の酪酸塩のより高い産生に起因し、主に酢酸塩およびプロピオン酸塩の産生菌からなる管腔微生物叢が腸内異常物質によって高度に影響され、それによって腸内異常物質が消失したときに酪酸塩産生菌の優先的な伸長をもたらしたという事実によって説明される可能性が高い。シンバイオティクス処置は、両方の腸内異常群において、主に過去２４時間の間に酪酸塩産生を増加させた。このように、インキュベーションの終了までに、シンバイオティクス処置された群は、健康対照群と未処置の腸内異常インキュベーションの両方よりも有意に高い酪酸塩濃度をもたらした。

図１１は、健康な対照発酵槽（「対照」）、抗生物質誘発性腸内異常対照発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿対照」）、抗生物質誘発性腸内異常処置発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿処置」）、アルコール誘発性腸内異常対照発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿対照」）、およびアルコール誘発性腸内異常処置発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿処置」）における４８時間にわたるプロピオン酸塩濃度の変化を示す。プロピオン酸塩は広範囲の腸内微生物によって産生され、バクテロイデス（Bacteroides）属種およびアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を含む最も豊富な産生菌がある。腸内異常対照のインキュベーションは、健康対照より有意に低いプロピオン酸塩濃度をもたらした。シンバイオティクス処置は、両方の腸内異常群において、最初の２４時間でプロピオン酸塩産生をさらに減少させ、最後の２４時間で増加した。このように、インキュベーションの終了までに、処理された群は、健康対照および腸内異常対照よりも低いプロピオン酸塩濃度をもたらした。これは、酢酸塩と酪酸塩の高度に特異的な刺激によって説明し得ると考えられる。

図１２は、健康な対照発酵槽（「対照」）、抗生物質誘発性腸内異常対照発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿対照」）、抗生物質誘発性腸内異常処置発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿処置」）、アルコール誘発性腸内異常対照発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿対照」）、およびアルコール誘発性腸内異常処置発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿処置」）における４８時間にわたる酢酸塩濃度の変化を示す。酢酸塩はプレバイオティクス繊維の発酵で産生される一次代謝産物である。腸内異常対照群は、健康対照群よりも有意に低い酢酸塩濃度を産生した。シンバイオティクス処置は、両方の腸内異常群において酢酸塩産生を刺激した。研究終了時、シンバイオティクス処理された腸内異常インキュベーション中の酢酸塩レベルは処理前よりも有意に高かったが、健康対照よりも依然として低かった。

図１３は、健康な対照発酵槽（「対照」）、抗生物質誘発性腸内異常対照発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿対照」）、抗生物質誘発性腸内異常処置発酵槽（「ＡＢ ｄｙｓ＿処置」）、アルコール誘発性腸内異常対照発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿対照」）、およびアルコール誘発性腸内異常処置発酵槽（「Ｖｏｄｋａ ｄｙｓ＿処置」）における４８時間にわたる総ＳＣＦＡ濃度の変化を示す。この実施例の結果は、本開示のシンバイオティクス組成物とドナー微生物叢とのインキュベーションが、抗生物質誘発性とアルコール誘導性の腸内毒素症の両方において、最も興味深いことに酪酸塩である短鎖脂肪酸産生を刺激したことを示す。シンバイオティクス処置の酪酸生成効果は非常に強く、腸内異常群の酪酸塩生成は健康対照群のそれを大きく上回った。

[実施例７]
消化管生存率の比較
実施例５の操作を、本開示によるシンバイオティクス組成物カプセルと下記表３に列挙する１７個の市販の慣用的プロバイオティクス製品の両方を用いて繰り返した。

胃インキュベーションの開始時に、製品１０および１２を除き、リアクターあたり１カプセルを投与した。製品１０および１２を除く全ての製品のカプセルをカプセルシンカーに取り付けた。Ｙａｋｕｌｔ製品（製品１０）を調べるために、濃縮された胃懸濁液に胃相開始時に１用量（６５ｍＬ）投与し、他のインキュベーションと同じ開始体積を得た。Ｄｕｏｌａｃ（製品１２）を、胃インキュベーションの開始時に１用量（２．５ｇ）を添加することによって調べた。生物学的多様性を説明するために、全ての実験を生物学的に三重反復で行った。

本開示によるヒプロメロースシンバイオティクス組成物カプセル１００は、カプセル含有量の少なくとも一部（定性的スコア２）を放出し、その結果、胃相の終わりに平均２．８×１０^９の生菌が得られた。次に、カプセル１００は、小腸血管７２０内で１．５時間インキュベートした後、完全放出（定性的スコア４）を達成した。図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、放出された細菌細胞の生存率は、ほぼ１００％に近づき、そのままであった。小腸インキュベーションの延長は生存率に影響を及ぼさず、小腸相の終わりに、投与されたプロバイオティクスの完全生存によって示された。全体として、これらの結果は、個々の細胞が、単離において、全ての反復において胃腸通過中に遭遇する胃酸、プロテアーゼ、リパーゼ、および胆汁酸塩への曝露中に、コンソーシアム内での同時インキュベーションで生存することができ、その結果、絶食条件下で上部消化管を通過した後に、平均４．０×１０^１０の生存可能な細菌細胞が結腸に送達されることを示す。

対照的に、従来のプロバイオティクス製品は、表４に示されるように、本開示によるシンバイオティクス組成物カプセル１００と比較して、小腸の終わりに生存可能な細菌細胞の送達が有意に減少したことを示した。ＹａｋｕｌｔおよびＤｕｏｌａｃなどの「裸の」製品（すなわち、カプセルに含まれない製品）は、結果として生存率が最も低かった（それぞれ０．７％および０．３％）。Ｓｗｉｓｓｅ Ｄａｉｌｙ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃはまた、腸管内腔におけるカプセル内容物の迅速な放出のため、０．８％の低い生存率をもたらした。最良性能の従来のプロバイオティクス製品－Ｍｅｔａｇｅｎｉｃｓ Ｕｌｔｒａ Ｆｌｏｒａ、Ｊａｒｒｏｗ、およびＢｌａｃｋｍｏｒｅ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ－は、本開示によるシンバイオティクス組成物カプセル１００のおよそ１００％と比較して、結腸に生存可能な細菌細胞の約３４％～５７％しか送達されなかった。

Ａｌｉｇｎ（登録商標）プロバイオティクスカプセルから得られた結果は、他の多くの従来のプロバイオティクス製品について観察された欠点の例である。胃相を通して、Ａｌｉｇｎ（登録商標）プロバイオティクスカプセルは、カプセル化された細菌のかなりの部分を放出した。したがって、小腸血管７２０内で１．５時間インキュベートした後、カプセルの完全な溶解（定性的スコア４）が得られた。図１４Ｃおよび１４Ｄに示されるように、合計ｌｏｇ－８．８７の生存細菌が上部ＧＩＴを通過した後に検出され、本開示の組成物と比較して、１．５時間の小腸インキュベーション後におよそｌｏｇ－０．８５の減少が示された。特定の理論に拘束されることを望まないが、この減少は、微生物菌株が小腸インキュベーションの開始時に低環境ｐＨおよび／または高濃度の微生物毒性胆汁酸塩に遭遇した早期胃放出に起因する可能性が高い。長期の小腸インキュベーションは、さらに生存率に影響を及ぼさなかった。全体として、生存細菌のわずか１６％が小腸相の終わりに送達され、これは平均ｌｏｇ－８．９４の生存細菌細胞に対応する。したがって、本開示のシンバイオティクス組成物およびヒプロメロース送達カプセル１００は、従来のＡｌｉｇｎ（登録商標）プロバイオティクス製品と比較して、小腸の終わり（すなわち、結腸への侵入時）に生存可能な細菌細胞の送達を有意に改善した。

[実施例８]
ヒスタミン代謝
ヒスタミンは、筋収縮から免疫調節までの様々な過程を調節するため、ヒトの健康において重要な生体アミンである。しかしながら、過剰なヒスタミンはヒスタミン不耐症を引き起こし、健康および全身の健康状態に悪影響を及ぼす。ヒスタミン不耐性は、典型的には、遺伝的ジアミンオキシダーゼ欠損に起因するが、微生物の関与を支持する証拠が増えており、発酵食品またはプロバイオティクスの形態の生きた微生物の摂取に関して緊急の懸念が生じている。この実施例は、これらの化合物のインビトロ産生を試験した。本開示のシンバイオティクス組成物のプロバイオティクス成分に存在する微生物菌株、ならびに種々の対照菌株を、好気性と嫌気性環境の両方で増殖させ、その後、ヒスタミンおよび両方の乳酸塩アイソフォームの存在について分析した。

本開示による個々のヒプロメロース送達カプセルを開き、４５ｍＬのＤｅ Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）液体ブロス培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する５０ｍＬのコニカルチューブに内容物を無菌的に添加した。本開示のシンバイオティクス組成物の各菌株は、この培地中で増殖することは公知である。全ての菌株を一緒に試験する理由は、ヒトが摂取した場合に何が起こるかをシミュレートすることであった。チューブを３０秒間ボルテックスし、カプセルの内容物を溶解し、培地全体に均等に分散されることを確実にした。次に、試料を、好気性または嫌気性環境中で、一定の条件下、３７℃で９６時間インキュベートして、種々のレベルの酸素下でのヒスタミン産生を評価した。

陽性対照として使用したラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ＡＴＣＣ ２３２７２を、凍結保存液からＭＲＳ寒天上に画線培養し、３７℃で一晩嫌気的にインキュベートした。単一のコロニーを選択し、嫌気性条件下でＭＲＳブロスに、１２時間、３７℃で接種した。その後、一晩培養物を、新鮮なＭＲＳブロス培地中に継代培養した（１：２２５希釈）。次に、培養物を嫌気的条件下で３７℃にて９６時間インキュベートした後、ヒスタミン分析を行った。

競合的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、各試料中のヒスタミン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を定量した。各試料からの１ｍＬのアリコートを１０００ｇで２０分間、４℃にて遠心分離した。その後、上清を用いて製造業者の指示に従ってヒスタミンを定量した（ヒスタミンＥＬＩＳＡキット；Ｅ－ＥＬ－００３２；Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ）。

試験した培養物の上清中の総タンパク質含量を、製造業者の指示に従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。簡単に説明すると、２５μＬの各試料（以前の乳酸塩定量ステップで抽出したのと同じ上清から分注したもの）を２００μＬの作用試薬に添加し、完全に混合し、次に、暗所、３７℃で３０分間、静置条件下でインキュベートした。その後、ＢｉｏＴｅｋ ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＨＴマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＳＰＸ）を用いて、５６２ｎｍでの光学密度を測定することにより、総タンパク質の比色検出および定量を決定した。

本開示のシンバイオティクス組成物の菌株の嫌気的条件下での増殖は、平均８５．９９±１．２３ｎｇ／ｍＬのヒスタミン（ＳＤ８５．７６±１．４２ｎｇ／ｍＬ）をもたらした。また、未接種ビヒクル（ＭＲＳ培地のみ）を分析し、図１５において「ＭＲＳ」と表示されたバーで示されるように、８６．４４±０．９２ｎｇ／ｍＬのヒスタミンを含有することがわかった。好気的に増殖させた培養物（図１５において「種（好気性）」と表示されたバー）または嫌気的に増殖させた培養物（図１５において「種（嫌気性）」と表示されたバー）では、ビヒクル対照と比較して、ヒスタミン産生において検出可能な差は観察されなかった（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。ヒスタミンを産生することが以前に示された菌株であるＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＡＴＣＣ ２３２７２は、図１５に示されるように、その培養上清中のヒスタミン含有量がビヒクル対照と比較して有意に高いことを示した（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。

[実施例９]
棚の安定性および水分活性の比較
本開示のプロバイオティクス成分は、ヒプロメロース送達カプセル１００と液体グリセロール溶媒の両方に組み込まれた。これらの送達ビヒクルの各々の試料は、２５±２℃、５０±５％相対湿度条件、および３５±２℃、７５±５％相対湿度条件の２つの異なる温度および湿度条件で１０日間保持された。各試料中の生細胞数を０、１、３、５、７および１０日で決定し、組成物の水分活性を０、５および１０日で決定した。低温／低室後条件下の生細胞数および水分活性をそれぞれ図１６Ａおよび図１６Ｂに示し、高温／高湿度条件下の生細胞数および水分活性をそれぞれ図１７Ａおよび図１７Ｂに示す。

図１６Ａおよび図１７Ａに示されるように、本開示の送達カプセル１００は、少なくとも約１０日の期間にわたって、通常の貯蔵条件下で生存可能な元の細胞の実質的な画分を維持するために、液体グリセロール溶媒よりも優れている。この特徴は、効力を確保し、表示要件を遵守するために極めて重要である。同様に、図１６Ｂおよび１７Ｂが示されるように、本開示の送達カプセル１００は、少なくとも約１０日間にわたって、液体グリセロール溶媒よりも低い水分活性を維持する。水分活性の低下は、多くの理由で、特に環境からの外因性微生物によるプロバイオティクス組成物の汚染を緩和するために望ましい。

[実施例１０]
加速安定性試験
本開示の合成組成物を含むハイプロメロース送達カプセル１００は、プロバイオティクス貯蔵瓶とプロバイオティクス貯蔵ポーチの両方にパッケージされた。瓶を４９±２℃および５０±５％相対湿度で１０日間維持し、ポーチを３８±２℃および５０±５％相対湿度で１０日間維持した。１用量（２カプセル）中の生細胞数を０、１、２、３、５、７、および１０日目に測定した；カプセルは、シンバイオティクス組成物の１用量（プロバイオティクス成分の５３６億ＡＦＵ）を送達するように適合された。瓶カプセルおよびポーチカプセルからの生細胞の数は、それぞれ図１８Ａおよび１８Ｂに示される（５３６億ＡＦＵの細胞数標的は破線で示される）。

図１８Ａおよび１８Ｂに示されるように、本開示の送達カプセル１００は、瓶またはポーチに貯蔵されているかどうかにかかわらず、少なくとも約１０日間の加速分解条件下で生存可能な元の細胞の十分な画分を維持するのに有効である。この特徴は、効力を確保し、表示要件を遵守するために極めて重要である。

この手順を繰り返し、瓶とポーチの両方を１００°Ｆに保持した；用量あたりの生細胞数は、瓶カプセルについては１、３および１０日目で、ポーチカプセルについては１、３、４および６日目で測定した。結果は、それぞれ図１９Ａおよび１９Ｂに示され、ここでも、生存可能な細胞の適切なカウントの維持が成功したことを示す。

[実施例１１]
リアルタイム安定性試験
実施例１０の手順を繰り返したが、長期彫像条件をより密接に模擬するために、瓶およびポーチを高温ではなく、通常の室温および湿度に維持した。投与あたりの生細胞数（２カプセル）を０、３、６、８、および１２カ月後に測定した；瓶およびポーチについての結果は、それぞれ図２０Ａおよび２０Ｂに示される（ここでも標的細胞数は破線で示される）。これらの結果は、ここでも、本開示の送達カプセル１００は、瓶またはポーチに貯蔵されているかどうかにかかわらず、少なくとも約６カ月の期間にわたり、および瓶では少なくとも約８カ月の期間にわたり、典型的な分解条件下で生存可能な元の細胞の十分な画分を維持するのに有効であることを示す。

[実施例１２]
乳酸塩代謝
ヒトでは、乳酸塩は嫌気性代謝の一般的な副産物であり、Ｌ－乳酸塩とＤ－乳酸塩の２つのアイソフォームとして存在する。血中のＤ－乳酸塩の力価が高いと、Ｄ－乳酸アシドーシスを引き起こすことがあり、Ｄ－乳酸アシドーシスは、不明瞭な発語、運動失調、ときには中枢神経系に影響を与えることによって昏睡を引き起こす状態である。ヒト細胞によるＤ－乳酸塩の産生は無視できる程度であるが、腸内の一部の細菌は発酵過程を介して生物学的に適切な濃度でこのアイソフォームを生じさせることができる。乳酸塩産生菌は一方または両方のアイソフォームを産生し、それぞれホモ発酵性またはヘテロ発酵性とみなされる。したがって、各アイソフォームを産生する細菌の比は、生体内のＤ－／Ｌ－乳酸塩の絶対濃度および相対濃度に影響を与える。

本開示による個々のヒプロメロース送達カプセルを開き、４５ｍＬのＭＲＳ液体ブロス培地を含有する５０ｍＬのコニカルチューブに内容物を無菌的に添加した。チューブを３０秒間ボルテックスし、カプセルの内容物を均質化し、培地全体に均一に分布させた。次に、試料を、３７℃で２４時間、静止条件下で嫌気的にインキュベートした。その後、細菌細胞を５，０００ｇで１０分間遠心分離し、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１Ｌの水に溶解した８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４、および１０．２４ｇのＫＨ_２ＰＯ_４；ｐＨ７．３５）で２回洗浄した。洗浄後、代謝活性を促進する４５ｍＬのＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液を含有する５０ｍＬのコニカルチューブに細胞を移し、３７℃で好気的または嫌気的にインキュベートした。１時間後および２４時間後のＬ－およびＤ－乳酸塩の産生を測定した。

市販の９菌株のプロバイオティクス製品、Ｒｅｎｅｗ Ｌｉｆｅ Ｆｌｏｒａは、乳酸塩の産生を強調するための複数の菌株対照として使用し、先行するパラグラフに記載したように調製し、インキュベートした。２つの単一菌株対照、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＧＧおよびラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）ＡＴＣＣ ３３３２３を、凍結保存液からＭＲＳ寒天上に画線培養し、静止条件下で３７℃にて一晩嫌気的にインキュベートした。単一のコロニーを選択し、ＭＲＳ液体培地中で３７℃にて１２時間接種した。その後、新鮮なＭＲＳブロスに一晩培養（１：２２５希釈）し、嫌気的に２４時間、３７℃で培養した。細菌細胞を５，０００ｇで１０分間遠心分離し、１×ＰＢＳで２回、Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液で１回洗浄した。洗浄後、細胞を４５ｍＬのＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液を含有する５０ｍＬのコニカルチューブに移し、嫌気的または好気的条件下、３７℃でインキュベートした。Ｌ－およびＤ－乳酸塩の産生を、１時間および２４時間のインキュベーション後に測定した。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の存在下での乳酸塩からピルビン酸への変換に基づく標準酵素アッセイを用いて、試料中のＤ－／Ｌ－乳酸塩の濃度を定量した。所定のインキュベーション時間における細胞培養物を、室温で１０分間、５，０００ｇで遠心分離した。その後、２０ｍＬの上清アリコートを回収し、２５０ｍＬの緩衝液（０．４Ｍグリシン、０．５Ｍヒドラジン、２５ｍＬのＮＡＤ（１７ｍｇ／ｍＬ）、および２．５ｍＬのＤ－ＬＤＨまたはＬ－ＬＤＨのいずれか）を含有する各ウェルを用いて平底９６ウェルアッセイプレートに移した。培養上清を添加した後、プレートを１時間、２５℃でインキュベートした。ＢｉｏＴｅｋ ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＨＴマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＳＰＸ）を用いて３４０ｎｍ（ＯＤ３４０）で光学濃度を測定した。値は、試料中の総タンパク質に標準化した。上清中の総タンパク質含有量を実施例８に記載したように決定した。図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、および２１Ｄは、それぞれ１時間後のＬ－乳酸塩産生、１時間後のＤ－乳酸塩産生、２４時間後のＬ－乳酸塩産生、２４時間後のＤ－乳酸塩産生を示し、図２２Ａおよび２２Ｂは、それぞれ１時間後および２４時間後のＬ－乳酸塩形態産とＤ－乳酸塩形態の比を示す。（これらの図において、「ｎｓ」は統計学的に有意でない差を表し、「^＊」はｐ＜０．０５レベルで有意である差を表し、「^＊＊＊＊」はｐ＜０．０００１レベルで有意である差を表す）。

１時間のインキュベーション後、全試料はＤ－乳酸塩よりもＬ－乳酸塩を産生する傾向を示した。図２１Ａおよび図２１Ｂに示されるように、本開示によるシンバイオティクス培養物からの上清は、平均０．５９±０．０１ｍＭ（ＳＤ０．３８±０．０１ｍＭ）のＬ－とＤ－乳酸塩アイソフォームの両方の最大量を含有し（図２１Ａ、２１Ｂ）、Ｒｅｎｅｗプロバイオティクス製品は、０．２５±０．０１ｍＭのＬ－乳酸塩および０．１０±０．０１ｍＭのＤ－乳酸塩を産生した（図１９）。しかしながら、総乳酸塩のＬ：Ｄ比は両製品で同様であった。２４時間後、１検体を除いて全ての試料が、ＬアイソフォームよりもＤ－乳酸塩産生が良好であった。ここでも、図２２Ｂに示されるように、本開示のシンバイオティクス組成物およびＲｅｎｅｗプロバイオティクス製品の両方の総Ｌ：Ｄ比は類似していた。これは、本開示のシンバイオティクス組成物中に存在するプレバイオティクスが乳酸塩代謝に影響を及ぼさないことを示す。Ｌ．ラムノースス（L. rhamnosus）ＧＧは、以前は主にＬ－乳酸塩を産生することが示されていたが、いずれの時点でもＬ：Ｄ比は類似しており、一貫してＬ－乳酸塩の産生量が多かった。

[実施例１３]
ビタミンＢ _１２ 産生
ヒトの食事では、ビタミンＢ_１２の主な供給源は肝臓、牛肉、子羊、卵、および乳牛である。ビタミンＢ_１２は腸内細菌によって合成され、ヒト宿主によって吸収される。ビタミンＢ_１２欠乏症は、神経管欠損、心血管疾患、認知機能低下、抑うつ、骨粗鬆症、糖尿病および加齢に伴う疾患の悪化と関連しており、食事摂取の不足や栄養不良のために世界中に広がっている。リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）プロバイオティクス細菌は、ビタミンＢ_１２を産生することが知られている。

ゲノムを配列決定し、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＮａｎｏｐｏｒｅ配列決定の組合せにより１つの環状コンティグに組み立てられた。ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９キットを備えた９．４．１フローセルを製造業者のプロトコール（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って使用し、以下を修飾した：平滑末端ＤＮＡを作製するためのニックおよびオーバーハング（ＤＮＡ末端準備）の除去は、ＤＮＡ混合物を２０℃で１５分間および６５℃で１５分間インキュベートすることによって行われた。高精度モードでＧｕｐｐｙ ｖ３．６を用いてベース呼び出しを行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定のために、ＤＮＡ Ｎｅｘｔｅｒａキットを用いて、Ｘ２Ｘ７５ ＰＥ中間出力を用いて、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０上で行った。長時間読み取られたデータは、Ｆｌｙｅアセンブラー（バージョン２．８．１－ｂ１６７６）を用いて、連続したＤＮＡ配列（連続体）に組み立てられた。Ｍｅｄａｋａ（バージョン１．０．３）は、長い読み取り配列を使用して組み立てられた配列でエラー修正された。さらに、Ｐｉｌｏｎ（バージョン１．２３）を用いてコンティグをさらにエラー訂正した。種の同一性は、Ｐｙａｎｉソフトウェアパッケージ（バージョン０．２．１０）を用いた平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）分析を用いて確認した。組み立てられたコンティグのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＰｒｏｄｉｇａｌ（バージョン２．６．３）を用いて予測した。Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴおよびＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＲＤ８３０－ＦＲのゲノムは、ビタミンＢ_１２産生に不可欠なｃｂｉ、ｃｏｂおよびｈｅｍ遺伝子クラスターの相同体の存在について調べられた。

Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ ２００１６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０００７０５．１）およびＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＣＲＬ １０９８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＹＷＩ０００００００．１）ゲノムを比較のために使用した。菌株と汎ゲノム構築の系統発生的関係は、Ｒｏａｒｙパイプラインによって行われた。Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴ、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＲＤ８３０－ＦＲ、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＣＲＬ １０９８およびＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ ２００１６菌株のゲノム注釈は、プロッカ（バージョン１．１４．６）を用いて行われた。ＧＦＦ３フォーマットの注釈付きアセンブリーを用いて、Ｒｏａｒｙパイプラインのデフォルトパラメータを伴うＲｏａｒｙによる汎ゲノム構築物を計算した。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、本開示のプロバイオティクス成分中に存在するＬ．ロイテリ（L. reuteri）菌株によるビタミンＢ１２の産生を評価した。各菌株について４回の連続継代培養を、化学的に定義されたビタミンＢ_１２不含アッセイ培地中で行い、菌株の完全な活性化およびビタミンＢ_１２を含まない培地中での増殖のコンディショニングを可能にした。分析した菌株は、同じパーセンテージであり、同じ培養条件下で接種された。その後、培養液を遠心分離し、リン酸緩衝液中で洗浄し、続いて、シアノコバラミンの形成に必要なシアノ部分のドナーであるシアン化カリウムの存在下、抽出緩衝液中で再懸濁した。懸濁液を氷浴中で超音波処理して細胞を溶解し、ビタミンＢ_１２を放出させた。溶菌事象の効率を評価するために、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用し、種々の菌株間の比較パラメータを得るためにも使用した。次に、試料の熱処理を行い、シアノコバラミンの最終的な形成を可能にし、続いて遠心分離を行った。続いて、２０μＬの上清を、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｃ－１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、４μｍ）および３６０ｎｍ波長のＵｖ－Ｖｉｓ検出器を用いてＨＰＬＣに注入した。１．０ｍｌ／分の溶出体積を９５：５のＨ２Ｏ－アセトニトリル勾配で適用した。５０～１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度でシアノコバラミン標準を用いて検量線を作製した。

Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）菌株ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴおよびＳＤ－ＲＤ８３０－ＦＲから単離されたＤＮＡ（いずれも本開示によるシンバイオティクス組成物中に存在し得る）は、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＮａｎｏｐｏｒｅの組み合わせ配列決定に供された。両方の配列データセットを、それぞれ２．３（２４２４コード配列領域（ＣＤＳ）を有するＧＣ％３８．８）および２．１Ｍｂｐ（２０８８ＣＤＳを有するＧＣ％３８．９）の１つの環状コンティグに組み立てることができ、これらの菌株にはプラスミドが存在しないことを示した。基準菌株Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＤＳＭ ２００１６（２．０Ｍｂｐ）の公的に入手可能なゲノム配列を用いた平均ヌクレオチド分析（ＡＮＩ）は、菌株ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴおよびＳＤ－ＲＤ８３０－ＦＲについて９８．８％および９８．４％の相同性を示し、種の同一性を確認した。

Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）型菌株、本開示による組成物中に存在し得る２つの菌株（ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴおよびＳＤ－ＲＤ８３０－ＦＲ）、およびビタミンＢ_１２産生菌株Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＣＲＬ １０９８に基づいて系統樹を構築した。これは、菌株ＳＤ－ＲＤ８３０－ＦＲおよびＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴが基準菌株よりもＬ．ロイテリ（L. reuteri）ＣＲＬ１０９８に分類学的に近縁であることを明らかにした。Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴのゲノムは、デノボビタミンＢ_１２合成に必要な遺伝子の完全なセットを、ＣＲＬ １０９８菌株で以前に確立されたのと同じ組織、すなわち、ｃｏｂＴＳＵ、ｈｅｍＬＢＣＡ、ｓｉｒＣ、ｃｏｂＱ、ｃｂｉＯＱＮＭＬＫ、ｃｙｓＧ／ｈｅｍＤ、ｃｂｉＪＨＧＦＴＥＤＣ、ｃｏｂＤ１、ｃｂｉＡおよびｃｏｂＤ２の順で有する。対照的に、菌株ＳＤ－ＲＤ８３０－ＦＲおよびＤＳＭ ２００１６は、このクラスター由来のほぼ全ての遺伝子を欠いているようである。

Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴ菌株のビタミンＢ_１２産生能力のバイオインフォマティクスに基づく予測を確認するために、ＨＰＬＣ法を採用した。ここで図２３を参照すると、ビタミンＢ_１２のシアノコバラミンバリアントのクロマトグラフィーピークは、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴについて、１３～１４分の保持時間で明確であり、特異的に検出可能であるように見えた。これは、精製シアノコバラミンを採用した検量線に基づく予想される保持時間である。これらの結果は、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴが生物学的に適切なレベルのビタミンＢ_１２を産生することができることを示す。

本明細書に例示的に開示された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素が存在しない場合に、適切に行うことができる。しかしながら、本開示の多くの変更、バリエーション、修飾、他の用途、および適用が可能であり、また、本開示の精神および範囲から逸脱しない変更、バリエーション、修飾、他の用途、および適用は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される本開示の対象とみなされることは、当業者には明らかである。

本開示の前述の検討は、説明および記載の目的のために提示されている。上記は、本開示を本明細書に開示された形態または複数の形態に限定することを意図したものではない。本開示の前述の詳細な説明において、例えば、本開示の様々な特徴は、本開示を簡素化する目的で、１つ以上の実施形態において一緒にグループ化される。本開示の実施形態の特徴は、上記で検討したもの以外の代替実施形態において組み合わせることができる。この開示方法は、請求された開示が各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、発明の態様は、単一の前述の開示された実施形態の全ての特徴よりも少ない特徴にある。したがって、以下の特許請求の範囲は、本開示のこの詳細な説明に本明細書により組み込まれ、各請求項は、本開示の別個の好ましい実施形態としてそれ自体で有効である。

さらに、本開示の記載は、１つ以上の実施形態ならびにある特定の変形および修飾の記載を含んでいるが、他の変形、組合せおよび修飾は、本開示を理解した後、例えば、当業者の技術および知識の範囲内にあるように、本開示の範囲内にある。特許請求されたものに対する代替的、交換可能な、および／もしくは同等の構造、機能、範囲、またはステップを含む、許可される範囲で代替実施形態を含む権利を取得することを意図し、このような代替的、交換可能な、および／もしく同等の構造、機能、範囲、またはステップが本明細書に開示されているか否かを問わず、いずれもの特許可能な主題を公的に提供することを意図していない。

Claims (26)

1. ヒト対象における疾患を処置するための方法であって、前記方法は、治療有効量のシンバイオティクス組成物を対象に投与するステップを含み、
   前記シンバイオティクス組成物は、
   健康なヒト腸内微生物叢に存在する微生物菌株によって、生物活性代謝産物に変換され得る少なくとも１つの化合物を含むプレバイオティクス成分と、
   微生物菌株のコンソーシアムを含むプロバイオティクス成分とを含み、
   前記コンソーシアムは、
   （ｉ）ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＳＤ－ＢＲ３－ＩＴ、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰ１－ＩＴ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＢＢ５３６－ＪＰ、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）ＳＤ－Ｍ６３－ＪＰ、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＨＲＶＤ１１３－ＵＳ、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＨＲＶＤ５２４－ＵＳ（Ｂｌ－０４）、ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Bifidobacterium breve）ＨＲＶＤ５２１－ＵＳ、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＨＲＶＤ３００－ＵＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＨＲＶＤ９０ｂ－ＵＳ、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ１５０－ＢＥ、ラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＧＧ－ＢＥ、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＲＤ８３０－ＦＲ、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）ＳＤ－ＬＣＲ０１－ＩＴ、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Limosilactobacillus fermentum）ＳＤ－ＬＦ８－ＩＴ、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＢＳ５－ＩＴ、およびラクトバチルス・ラムノースス（Lacticaseibacillus rhamnosus）ＳＤ－ＬＲ６－ＩＴからなる群から選択される１つ以上の消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株；
   （ｉｉ）リギラクトバチルス・サリバリウス（Ligilactobacillus salivarius）ＳＤ－ＬＳ１－ＩＴ、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＳＤ－ＣＥＣＴ７３４７－ＳＰ、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Lacticaseibacillus casei）ＳＤ－ＣＥＣＴ９１０４－ＳＰ、およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＣＥＣＴ８１４５－ＳＰからなる群から選択される１つ以上の皮膚の転帰を改善する微生物菌株；
   （ｉｉｉ）ラクチプランチバチルス・プランタルム（Lactiplantibacillus plantarum）ＳＤ－ＬＰＬＤＬ－ＵＫおよびビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）ＳＤ－ＭＢ２４０９－ＩＴからなる群から選択される１つ以上の心血管の転帰を改善する微生物菌株；ならびに
   （ｉｖ）リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）ＳＤ－ＬＲＥ２－ＩＴおよびビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）ＳＤ－ＢＡ５－ＩＴからなる群から選択される１つ以上の微量栄養素合成菌株
   のうちの少なくとも２つを含む、方法。
2. 前記疾患が、副腎白質ジストロフィー、ＡＧＥ誘導性ゲノム傷害、アレクサンダー病、円形脱毛症、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、狭心症、関節炎、喘息、口頭同心性硬化症、ベーチェット病、類天疱瘡、カナバン病、左心室機能不全を含む心不全、中枢神経系血管炎、シャルコット・マリー・トゥース病、中枢神経系髄鞘形成不全を伴う小児期運動失調、慢性特発性末梢神経障害、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚狼瘡、皮膚炎（接触、急性および慢性）、糖尿病性網膜症、移植片対宿主病、肉芽腫、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、ハンチントン病、過敏性腸疾患、虚血、クラッベ病、扁平苔癬、黄斑変性症、ミトコンドリア脳筋症、一側性筋萎縮症、多発性硬化症、心筋梗塞、脳鉄蓄積を伴う神経変性、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、ＮＦ－κＢ媒介性疾患、視神経炎、腫瘍随伴症候群、パーキンソン病、ペリゼウス・メルツバッハー病、天疱瘡、原発性側索硬化症、進行性核上麻痺、乾癬、壊疽性膿皮症、再灌流傷害、色素性網膜症、サルコイドーシス、シルダース病、亜急性壊死性脊髄症、ササック症候群、移植拒絶反応、横断性脊髄炎、腫瘍、潰瘍性大腸炎、およびゼルウィガー症候群からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記疾患が、消化器疾患または感染症である、請求項１に記載の方法。
4. 前記疾患が、過敏性腸症候群、ＣＯＶＩＤ－１９、および便秘からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記疾患が、前記対象の腸内微生物叢のアルコール性または抗生物質誘導性の腸内毒素症である、請求項３に記載の方法。
6. 前記シンバイオティクス組成物が、摂取可能な製剤として投与される、請求項１に記載の方法。
7. 前記摂取可能な製剤が、飲み込み可能なカプセルの形態である、請求項６に記載の方法。
8. 前記カプセルが、前記プレバイオティクス成分を約１ｍｇ～約４００ｍｇ、約２５ｍｇ～約３７５ｍｇ、または約５０ｍｇ～約３５０ｍｇ、または約７５ｍｇ～約３２５ｍｇ、または約１００ｍｇ～約３００ｍｇ、または約１２５ｍｇ～約２７５ｍｇ、または約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、または約１７５ｍｇ～約２２５ｍｇ、または約２００ｍｇの量で含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記カプセルが、約６２５０万ＡＦＵ～約３１２５億ＡＦＵ、約６億２５００万ＡＦＵ～約２５００億ＡＦＵ、約１２億５０００万ＡＦＵ～約１２５０億ＡＦＵ、約６２億５０００万ＡＦＵ～約６２５億ＡＦＵ、約１２５億ＡＦＵ～約５００億ＡＦＵ、約１８７億５０００万ＡＦＵ～約３７５億ＡＦＵ、または約２５０億ＡＦＵ～約３１２億５０００万ＡＦＵの量で微生物菌株の前記コンソーシアムを含む、請求項７に記載の方法。
10. 前記シンバイオティクス組成物の用量が、少なくとも１日１回投与され、用量が２つの飲み込み可能なカプセルを含む、請求項７に記載の方法。
11. 前記カプセルは、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む、請求項７に記載の方法。
12. 前記飲み込み可能なカプセルは、
    前記プロバイオティクス成分を含む内部カプセルと、
    前記プレバイオティクス成分を含む前記内部カプセルを取り囲み、封入する外部カプセルとを含み、
    外部カプセルは、ヒトの胃および小腸の環境において３時間後に実質的に完全に破壊または溶解されるように構成され、
    前記内部カプセルおよび外部カプセルは、微生物菌株の前記コンソーシアムにおけるヒトの胃および小腸の環境中で３時間後に生存し続ける細胞の割合が、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であるように構成され、
    前記内部カプセルは、前記飲み込み可能なカプセルが投与されるヒト対象の結腸に入ると、微生物菌株の前記コンソーシアムの生存細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が結腸に放出されるように構成される、請求項７に記載の方法。
13. 前記シンバイオティクス組成物が、少なくとも約７日間、少なくとも１日１回投与される、請求項１に記載の方法。
14. 健康なヒト腸内微生物叢に存在する微生物菌株によって生物活性代謝産物に変換することができる前記少なくとも１つの化合物が、少なくとも１つのプニカラギンを含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つのプニカラギンが、少なくとも１つのザクロから誘導または抽出される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記プレバイオティクス成分が、少なくとも１つのザクロから誘導または抽出された少なくとも１つの追加の化合物をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記プレバイオティクス成分が、前記少なくとも１つのプニカラギンを含むポリフェノール性ザクロ誘導体または抽出物から本質的になる、請求項１５に記載の方法。
18. 前記少なくとも１つのプニカラギンは、ヒト消化管に生息することが公知である少なくとも１つの細菌株によってウロリチンに代謝される、請求項１４に記載の方法。
19. 前記ウロリチンがウロリチン－Ａである、請求項１８記載の方法。
20. 前記少なくとも１つのプニカラギンが、前記プロバイオティクス成分の前記コンソーシアムの少なくとも１つの微生物菌株によってウロリチンに代謝され得る、請求項１４に記載の方法。
21. 前記ウロリチンがウロリチン－Ａである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記コンソーシアムが、（ｉ）から（ｉｖ）のうちの少なくとも３つを含む、請求項１に記載の方法。
23. 前記コンソーシアムが、（ｉ）から（ｉｖ）の４つ全てを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記コンソーシアムが、（ｉ）の前記消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株のうちの少なくとも２つを含む、請求項１に記載の方法。
25. 前記コンソーシアムが、（ｉ）の前記消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉ）の前記皮膚の転帰を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉｉ）の前記心血管の転帰を改善する菌株の全て、および（ｉｖ）の前記微量栄養素合成菌株の全てを含む、請求項１に記載の方法。
26. 前記コンソーシアムが、（ｉ）の前記消化器系の転帰、消化管の転帰、または腸バリア機能を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉ）の前記皮膚の転帰を改善する微生物菌株の全て、（ｉｉｉ）の前記心血管の転帰を改善する菌株の全て、および（ｉｖ）の前記微量栄養素合成菌株の全てから本質的になる、請求項２５に記載の方法。