CN117042779A - 改善人健康的益生菌治疗方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包含益生元组分和益生菌组分两者的合生素组合物。益生元组分包含至少一种安石榴苷，益生菌组分包含合理定义和组装的微生物株聚生体。还提供了用于口服施用合生素组合物的递送胶囊和使用合生素组合物治疗疾病的方法。

Description

改善人健康的益生菌治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请要求PCT申请PCT/US2021/015103和PCT/US2021/015107以及美国临时专利申请63/141,874的优先权的权益，所有这些申请的申请日均为2021年1月26日，所有这些申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开一般涉及微生物生物制剂，并特别地涉及合理定义的微生物群体(microbial consortia)，该微生物群体通过调节原始肠道微生物群和宿主组织的功能，有效的赋予各器官系统以健康。
背景技术
微生物生物制剂已经作为有前途的疗法出现，以赋予常驻肠道微生物群落和宿主组织有益的功能。目前，正在对施用多株、非冗余微生物群体对于包含食物过敏、自闭症和癌症在内的一系列状况的预防和治疗进行临床评估，但可再生地组装和提供用于防治用途的复杂群体仍处于起步阶段。
人的胃肠道、口腔、皮肤、鼻腔和泌尿生殖道中繁殖了数万亿的微生物。除了常驻微生物外，瞬时物种通过摄取食物，尤其是发酵的那些而不断地进入身体。从首次观察到长寿与食用含有产乳酸菌细菌的酸奶之间的相关性，以及从首次在母乳喂养婴儿的粪便中检测到双歧杆菌属种(Bifidobacterium spp.)而在配方喂养并遭受腹泻的婴儿粪便中检测不到，已经过去了一个多世纪。这些早期的“用于健康的细菌”概念最终广泛适用于益生菌，作为“当以足够的量施用时，给宿主赋予健康益处的活微生物”。
益生菌历来涵盖双歧杆菌(Bifidobacterium)属和乳杆菌(Lactobacillus)属。已鉴定的乳杆菌属种超过250个，其似乎在基因上彼此高度不同，并且在代谢、生态和功能上也多种多样。这些观察结果导致最近将乳杆菌属重新分类为25个属，包含改进的乳杆菌属(其涵盖现称为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)群的适应宿主的生物体)、副乳杆菌属(Paralactobacillus)和23个新属。
美国国立卫生研究院人微生物组项目显示，健康个体之间微生物的多样性和丰度差异很大，表明并不存在普遍的健康微生物组。尽管健康状态多种多样，但健康和疾病状态与特定微生物物种的存在或丰度之间的重要相关性已被证实，提出了操纵这些群落可以预防和治疗疾病的可能性。这一概念促进从健康个体分离特定的微生物群成员，用于所谓的活生物治疗产品(LBP)的开发。这些是对传统的基于乳杆菌和双歧杆菌的益生菌产品的补充，旨在对疾病状态产生有益影响。值得注意的是，肠道微生物群干预不仅能为局部环境带来健康益处，还能通过诸如肠道-皮肤、肠道-心脏和肠道-大脑轴产生远距离影响。
微生物组的细菌成员可以通过至少四种单独的途径对健康和疾病产生影响：免疫调节、病原体抑制、上皮屏障完整性的改善、有益代谢物的产生或有害分子的去除。
免疫调节
肠粘膜含有多种参与免疫调节的特化细胞类型，其每种都表达不同的模式识别受体(PRR)，包含NOD样和Toll样受体(TLR)。细菌表达一系列主要位于细胞包膜并由细胞包膜分泌的微生物相关分子模式(microorganism-associated molecular patterns,MAMP)。在暴露于MAMP时，PRR通过激活相关适配蛋白(adaptor protein)(其与核因子-κB和分裂素激活的蛋白激酶信号传导级联关联)而进行应答，导致应答基因(包含编码趋化因子、细胞因子和抗菌肽的那些)的表达水平改变。这充分说明肠对于免疫调节是关键区域，因此是可以创建和恢复代谢内稳态的细菌株的主要靶标。
第一个乳杆菌的全基因组序列的可用性标志着研究人员揭开益生菌模型株(model strain)与宿主免疫系统沟通的分子机制时代的开始。在这些模型株中，MAMP编码基因被删除，以评估对微生物与宿主交流的影响。例如，从嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)WCFS1和鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)GG的细胞包膜中除去和/或修饰脂多糖酸(LTA)，导致株的TLR-2信号传导级联改变。产生的细胞因子谱是明显地株特异的，可能是由LTA链长度或取代水平和/或类型的差异所造成的，但始终更具抗炎性(更多的IL-10和/或更少的IL-12)。此外，在小鼠结肠炎模型中，与亲本株相比，突变体改善疾病症状。同样，肽聚糖存在于所有乳杆菌中，但微妙的结构变化对益生菌的功效起着关键作用。嗜酸乳杆菌LS33肽聚糖含有株特异性的胞壁肽，其负责NOD-2依赖性的IL-10诱导，并且合成的配体(M-tri-Lys)以NOD2依赖性但MyD88非依赖性的方式保护小鼠免于结肠炎。综上，已在分子水平上揭示了数个保守的MAMP-PRR相互作用，它们对免疫系统的影响转化为动物模型中疾病症状的缓解。然而，细菌的聚合物中细微的结构差别导致株特异性的功效，这一点尚未被完全理解，从而阻碍了基于生物信息学的最佳益生菌功能的预测。
建立以影响宿主免疫应答的大量MAMP诸如胞外多糖、磷壁酸、纤毛和蛋白质组分不存在于所有的益生菌株中，这一事实进一步证实保守MAMP所导致的株特异性。
上皮屏障完整性
肠上皮细胞的单细胞层通过紧密连接蛋白连接在一起构成了肠道屏障。此屏障调节渗透性，并且此屏障的损害可以导致革兰氏阴性病原体、脂多糖或有毒代谢物从肠道进入血流，引发与坏死性小肠结肠炎(NEC)、炎症性肠道疾病(IBD)、自身免疫性疾病以及包含糖尿病和肥胖症在内的新陈代谢病症相关的炎症级联。除了紧密连接外，潘氏细胞产生防御素以维持无菌的隐窝，并且杯状细胞分泌粘蛋白。已经显示，选择的微生物株通过上调增加紧密连接功能、增强防御素产生或减弱细胞凋亡的信号传导途径来改善上皮屏障功能。
代谢物
微生物影响宿主健康所通过的另一机制是通过它们在肠道环境中产生或从中除去的代谢物。一个明确的实例是叶酸，其不由哺乳动物合成且必须从外源获取。这种B族维生素是人代谢途径(包含核酸和氨基酸合成、DNA甲基化和调节性T细胞存活)所需的至关重要的营养物。在怀孕期间增加叶酸的摄取可以减少神经管出生缺陷。双歧杆菌株产生叶酸，每天给健康志愿者补充青春双歧杆菌SD-BA5-IT，增加了排泄物中的叶酸含量，提供了重要的健康益处。除叶酸外，益生菌双歧杆菌属种和乳杆菌还产生其他B族维生素，诸如硫胺素和核黄素。
肠道-皮肤轴
驻在人皮肤上的微生物经受各种环境压力，包含温度、湿度和pH，以及抗菌肽和脂质。值得注意的是，皮肤结构诸如毛囊和皮脂腺、小汗腺和大汗腺代表了生存不同的微生物群的不同生态位。已知至少19个门是健康皮肤微生物群的一部分，特别丰富的属包含丙酸杆菌属(Propionibacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcu)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。肠道微生物群可以经由几种错综复杂的机制，例如免疫调节、抑制病原体、产生有益代谢物和/或影响肠道上皮屏障，以可量化的方式远端地影响皮肤。例如，通过口服补充罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)ATCC 6475，有益地改变了健康小鼠的外皮系统，从而增加毛囊生成和真皮厚度，以及降低皮肤pH和增加皮脂细胞产生。此外，健康益生菌喂养的小鼠分别展现出抗炎和促炎性细胞因子IL-10和IL-17的血清水平升高和降低，而在IL-10缺乏的小鼠中，外皮系统没有改善，证明罗伊氏粘液乳杆菌基于免疫的作用机制。IL-10诱导的变化通常涉及Foxp3 Treg细胞的诱导，这与以下事实一致：即使没有暴露于益生菌细胞，衍生自罗伊氏粘液乳杆菌喂养的供体的纯化Foxp3细胞的施用也导致益生菌诱导的对受者小鼠中外皮系统的改变。
肠道微生物群通过其可以影响皮肤的另一机制是通过它们产生的代谢物，该代谢物可以进入血流并影响远处的部位。或者，肠道细菌本身可以能够进入血流，特别是当肠道上皮屏障完整性受到干扰时。例如，寻常型银屑病患者患有肠道生态失调，并且有迹象表明这会促进DNA易位到血流。观察到的肠道生态失调涵盖增加的微生物多样性，以及更高的普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)丰度，这是违反直觉的(鉴于这种在健康的肠道微生物群中占优势的属具有产生高水平的有益短链脂肪酸(SCFA)丁酸盐以及抗炎肽的株)。在特应性皮炎研究中，也认为短链脂肪酸抑制致病性皮肤微生物(诸如金黄色葡萄球菌)的生长，而侵犯皮肤的皮肤共生体(诸如表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌)耐受更宽的SCFA转变。皮下注射或局部应用丁酸盐降低半抗原致敏小鼠中的接触性超敏反应。此外，在此处理时Treg特异性因子Foxp3和IL-10出现上调，表明短链脂肪酸可以诱导Treg细胞。大量的细菌株(包含来自真杆菌属(Eubacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、普氏菌属(Prevotella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)的株)产生大量的短链脂肪酸，因此观察到的对皮肤健康的有益作用可能不专属于普拉梭菌。
几种信号传导转导途径(诸如JNK和IKKβ/NF-κβ)的触发导致炎性细胞因子和趋化因子(诸如肿瘤坏死因子α，为银屑病发病机理的最重要的炎症介质)的产生。据报道，许多微生物，诸如脆弱类杆菌(B.fragilis)，能够通过产生多糖A和B来调节Th1/Th2免疫应答的平衡。微生物组与银屑病之间的另一被提出的联系是银屑病可以反映对皮肤微生物组的异常先天免疫应答，其主要由IL-23和IL-17驱动，而不是自身免疫性疾病。使用银屑病小鼠模型，已经证明针对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗生素可以通过抑制IL-17和IL-22的产生来改善银屑病样皮炎。产生IL-22的T细胞似乎在皮肤炎症的恶化中起关键作用。
共生的肠道菌群可以通过影响T细胞响应各种免疫刺激的分化来促进皮肤的应变稳态。口服施用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DN-114 001已显示损害CD8+T细胞分化为皮肤超敏性效应细胞，并在暴露时减少其向皮肤的募集。
Th17细胞在皮肤和肠中都很丰富，因为二者都与外部环境接触。这些细胞及其促炎细胞因子被认为直接促成多种慢性炎症性皮肤病(包括银屑病、白塞病(Behcet’sdisease)和接触性超敏反应)的发病机理。Th17效应细胞与其对应的调节性T细胞之间的平衡受到肠微生物组的重大影响。Th17细胞可以在肠腔中被清除，或者它们可以获得具有免疫抑制特征的调节表型(rTh17)，该免疫抑制特征限制致病性。
最近对由肠道细菌合成的可能直接或间接改变皮肤的其他分子进行了综述。这些分子包含来自乳杆菌物种的抑制瘙痒的γ-氨基丁酸和色胺，以及用于增强屏障功能的乙酰胆碱。为此，有迹象表明痤疮患者的肠道上皮屏障完整性增强，这可能是观察到的血液脂多糖内毒素的存在和高反应性的原因。与此假设一致的是，在寻常型痤疮和肠生态失调中均可以共同地看到含有P物质的神经的上调和这种神经肽的强烈表达。P物质可以触发炎性信号，该炎性信号导致参与痤疮的发病机理的促炎介质(IL-1、IL-6、TNF-α、PPAR-γ)增加。
高血糖负荷促进胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF-1)信号传导的增加。认为这诱导代谢叉头盒转录因子(FoxO1)的细胞质表达增加，FoxO1是细胞营养状态的传感器。FoxO1最终触发哺乳动物雷帕霉素靶复合物1(mTORC1)(代谢和细胞增殖的调节器)，以介导皮脂腺过度增殖、脂肪生成和肢端漏斗形角质细胞的增生，从而促进痤疮的发展。肠道微生物群经由肠共生细菌和mTOR途径之间的相互干扰影响痤疮的病理生理学。已经显示肠道微生物群产生的代谢物调节细胞增殖、脂质代谢和由mTOR途径介导的其他代谢功能。mTOR途径可以通过调节肠屏障进而影响肠微生物群的组成。在肠生态失调和肠道屏障完整性破坏的情况下，这种双向关系可以导致代谢性炎症的正反馈循环。鉴于mTORC1在痤疮发病机制中的重要作用，这种关系充当肠道微生物组影响痤疮病理生理学的机制。
口服食用的益生菌已成功用于经由肠道-皮肤轴来缓解和/或预防皮肤疾病，包含寻常型银屑病、特应性皮炎和寻常型痤疮。
心血管疾病仍然是世界范围的主要死亡原因，其风险因素包含胆固醇水平升高和高血压。已在啮齿类动物模型中证实了肠道与高血压的联系，揭示了增加的肠道上皮屏障通透性和炎症状态，以及肠道微生物属的转变可能与肠道的病理生理和免疫状态以及高血压相关。上皮屏障完整性的作用也在一项研究中提出，其中用高脂饮食喂养小鼠，导致各种组织中细菌DNA的存在显著增加。
患有动脉粥样硬化性心血管疾病的个体与健康对照的肠道微生物组的比较揭示肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括潜在的病原体，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯菌属种(Klebsiella spp.)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的丰度增加。此外，发现先前与炎症性肠病相关的细菌活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)处于相对较高的水平。相反，产生丁酸盐的细菌(包含肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)和普拉梭菌)在衍生自患病群体的样品中相对消减。
动脉粥样硬化性心血管疾病患者与其他疾病群体(2型糖尿病、肝硬化和肥胖症)的肠道微生物组的比较揭示了与健康对照组的共同偏差，表明较少发酵和更具炎性的肠道环境是几种疾病的共同特征。为此，已经显示接受在结肠中直接递送的丙酸盐的超重个体表现出减少的能量摄入、肥胖和脂质肝含量，以及增加的由肠内分泌L细胞局部产生的肽YY(PYY)和胰高血糖素样肽1(GLP-1)的血浆水平。
健康的肠道微生物组也具有将胆固醇脱氢为难以被吸收的粪甾醇(coprostanol)的能力。用于这种转化的酶活性由不同地理的人群体中盛行的未培养微生物进化枝中的ismA编码。携带形成粪甾醇的微生物的个体具有较低的排泄物胆固醇水平和较低的血清总胆固醇，具有与脂质内稳态基因中变异导致的那些相当的作用。这表明微生物组中的一种特定功能与人健康之间存在直接联系。
尽管益生菌不含有ismA同系物，但双盲、安慰剂对照、随机研究显示，在12周内，健康、正常至轻度高胆固醇血症的成人补充植物乳杆菌ECGC 13110402后，低密度脂蛋白、甘油三酯、总胆固醇和收缩压血降低，并且高密度脂蛋白升高。初级胆汁酸在肝脏中由胆固醇合成，植物乳杆菌ECGC 13110402产生高水平的胆盐水解酶。确切的机制尚不清楚，但在人和动物模型中，这种酶活性的净效应是降低胆固醇水平，包含低密度脂蛋白。此外，该株在体外表现出降低胆固醇的能力，这暗示了互补的作用机制，例如内化胆固醇的能力。
发明概述
在本公开的一个方面，治疗人受试者中疾病的方法包括向受试者施用治疗有效量的合生素组合物，合生素组合物包含：益生元组分，其包含至少一种可以由健康人肠道微生物群中存在的微生物株转化为生物活性代谢物的化合物；和益生菌组分，其包含微生物株的聚生体(consortium)，该聚生体(consortium)包含以下项中的至少两种：(i)一种或多种改善消化结果、胃肠道结果或肠屏障功能的微生物株，其选自由短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)SD-BR3-IT、植物乳植杆菌SD-LP1-IT、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SD-BB536-JP、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)SD-M63-JP、鼠李糖乳酪杆菌HRVD113-US、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)HRVD524-US(Bl-04)、短双歧杆菌HRVD521-US、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)HRVD300-US、长双歧杆菌HRVD90b-US、乳双歧杆菌SD150-BE、鼠李糖乳酪杆菌SD-GG-BE、罗伊氏粘液乳杆菌RD830-FR、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)SD-LCR01-IT、发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)SD-LF8-IT、乳双歧杆菌SD-BS5-IT和鼠李糖乳酪杆菌SD-LR6-IT组成的组；(ii)一种或多种改善皮肤病学结果的微生物株，其选自由唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)SD-LS1-IT、长双歧杆菌SD-CECT7347-SP、干酪乳酪杆菌SD-CECT9104-SP和乳双歧杆菌SD-CECT8145-SP组成的组；(iii)一种或多种改善心血管结果的微生物株，其选自由植物乳植杆菌SD-LPLDL-UK和乳双歧杆菌SD-MB2409-IT组成的组；和(iv)一种或多种合成微量营养素的微生物株，其选自由罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)SD-BA5-IT组成的组。
在实施方案中，所述疾病可以选自由肾上腺脑白质营养不良、AGE诱导的基因组损伤、亚历山大病、斑秃、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、心绞痛、关节炎、哮喘、巴洛同心圆性硬化(balo concentric sclerosis)、白塞病、大疱性类天疱疮(bolluspemphigoid)、卡纳万病(Canavan disease)、包括左心室功能不全的心功能不全、中枢神经系统血管炎、腓骨肌萎缩症(Charcott-Marie-Tooth Disease)、儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化不良(childhood ataxia with central nervous system hypomyelination)、慢性特发性周围神经病变(chronic idiopathic peripheral neuropathy)、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、皮肤狼疮、皮炎(接触性、急性和慢性)、糖尿病性视网膜病变、移植物抗宿主病、肉芽肿、丙型肝炎病毒感染、单纯疱疹病毒感染、人免疫缺陷病毒感染、亨廷顿病(Huntington’s disease)、肠易激性病症(irritable bowel disorder)、局部缺血、克拉伯病(Krabbe Disease)、扁平苔藓、黄斑变性、线粒体脑肌病、单肢肌萎缩(monomelicamyotrophy)、多发性硬化、心肌梗塞、神经退行性变伴脑铁沉积(neurodegeneration withbrain iron accumulation)、视神经脊髓炎、神经系统结节病、NF-κB介导的疾病、视神经炎、副肿瘤综合征(pareneoplastic syndrome)、帕金森病(Parkinson’s disease)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、天疱疮、原发性侧索硬化、进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy)、银屑病、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、色素性视网膜病、结节病、席尔德氏病(Schilders Disease)、亚急性坏死性脊髓病、susac综合征、移植排斥、横贯性脊髓炎、肿瘤、溃疡性结肠炎和Zellweger综合征组成的组。
在实施方案中，疾病可以是胃肠病学或感染性疾病。疾病可以但不必须选自由肠易激综合征、COVID-19和便秘组成的组。疾病可以是但不必须是酒精或抗生素诱导的受试者肠道微生物群的生态失调。
在实施方案中，合生素组合物可以作为可摄取制剂施用。可摄取制剂可以但不必须是可吞咽胶囊的形式。胶囊可以但不必须包含约1mg至约400mg、或约25mg至约375mg、或约50mg至约350mg、或约75mg至约325mg、或者约100mg至约300mg、或约125mg至275mg、或约150mg至250mg、或约175mg至约225mg，或约200mg的量的益生元组分。胶囊可以但不必须包含约6.25亿AFU至约3125亿AFU、约62.5亿AFU至约2500亿AFU、约12.5亿AFU到约1250亿AFU、约62.5亿AFU至约625亿AFU、约125亿AFU至约500亿AFU、约187.5亿AFU至约375亿，或约250亿AFU至约312.5亿AFU的量的微生物株的聚生体(consortium)。的合生素组合物的剂量可以但不必须以每天至少一次施用，其中剂量包含两个可吞咽的胶囊。胶囊可以但不必须进一步包含至少一种药学上可接受的媒介物。可吞咽胶囊可以但不必须包含含有益生菌组分的内部胶囊；以及包围和封闭内部胶囊的外部胶囊，其包含益生元组分，其中外部胶囊配置为在人胃和小肠环境中3小时后基本上完全破坏或溶解，其中内部和外部胶囊配置为使得微生物株的聚生体中在人胃和小肠的环境中3小时后保持存活的细胞的比例为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％，并且其中内部胶囊配置为在进入向其施用了可吞咽胶囊的人受试者的结肠中后，释放至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的微生物株的聚生体的存活细胞到结肠中。
在实施方案中，合生素组合物可以但不必须以每天至少一次，持续至少约7天来施用。
在实施方案中，至少一种可被健康人肠道微生物群中存在的微生物株转化为生物活性代谢物的化合物可以包含至少一种安石榴苷，其可衍生自或提取自至少一种石榴。益生元组分可以但不必须进一步包含从至少一种石榴中衍生或提取的至少一种另外的化合物。益生元组分可以但不必须基本上由包含至少一种安石榴苷的多酚石榴衍生物或提取物组成。
在实施方案中，至少一种安石榴苷可以被至少一种已知居住于人胃肠道的细菌株代谢为尿石素。尿石素可以是但不一定是尿石素A。
在实施方案中，至少一种安石榴苷可以被益生菌组分的聚生体的至少一种微生物株代谢为尿石素。尿石素可以是但不一定是尿石素A。
在实施方案中，聚生体可以包含(i)至(iv)的至少三种。聚生体可以但不必须包含(i)至(iv)的所有四种。
在实施方案中，聚生体可以包含(i)的改善消化结果、改善胃肠结果或改善肠道屏障功能的微生物株的至少两种。
在实施方案中，聚生体可以包含(i)的改善消化结果、改善胃肠结果或改善肠道屏障功能的微生物株的所有、(ii)的改善皮肤病学结果的微生物株的所有、(iii)的改善心血管结果的株的所有和(iv)的合成微量营养素的株的所有。聚生体可以但不必须基本上由(i)的改善消化结果、改善胃肠结果或改善肠道屏障功能的微生物株的所有、(ii)的改善皮肤病学结果的微生物株的所有、(iii)的改善心血管结果的株的所有和(iv)的合成微量营养素的株的所有组成。
从本文所包含的公开内容中，本公开的优点将是显而易见的。
如本文所用，“至少一个”、“一个或多个”以及“和/或”是开放式表达，在操作中既是连接的又是分离的。例如，“A、B和C的至少一个”、“A、B或C的至少一个”、“A，B和C的一个或多个”以及“A，B和/或C”的每个表述是指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起，A和C一起，B和C一起，或者A、B和C一起。
应当注意，术语“一”或“一个”实体是指一个或多个该实体。因此，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。还应当注意，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
本文描述的实施方案和配置既不是完整的也不是穷举的。如将理解的，本公开的其他实施方案可以单独或组合地利用一个或多个上文所阐述或下文详细描述的特征。
附图简述
图1A是本公开的递送胶囊的组装视图。
图1B是本公开的递送胶囊的分解视图。
图2是鉴定和验证抑制剂微生物群体或其组分的方法的流程图。
图3A和3B是在两个单独的未处理的秀丽隐杆线虫(C.elegans)重复中gst-4::GFP表达的例示。
图4A和4B是用本公开的合生素组合物处理的两个秀丽隐杆线虫重复中gst-4::GFP表达的例示。
图5是表明用本公开的合生素组合物处理的人上皮细胞中密封蛋白-1表达的蛋白质印迹图像。
图6A和6B说明了分别在液体培养基和固体培养基上测试的本公开的合生素组合物的微生物株的溴甲酚紫测定。
图6C是图6A和6B中所示的微生物株的可见光吸收测量的图。
图7说明了模拟的人肠微生物生态系统。
图8说明了在模拟的人肠微生物生态系统中，本公开的合生素组合物的微生物株的存活细菌计数的数目。
图9说明了在五个模拟的人肠微生物生态系统中48小时内pH的变化。
图10说明了在五个模拟的人肠微生物生态系统中，48小时内丁酸盐浓度的变化。
图11说明了在五个模拟的人肠微生物生态系统中，48小时内丙酸盐浓度的变化。
图12说明了在五个模拟的人肠微生物生态系统中，48小时内乙酸盐浓度的变化。
图13说明了在五个模拟的人肠微生物生态系统中，48小时内总短链脂肪酸浓度的变化。
图14A和14B是本公开的合生素组合物的微生物株在模拟的人肠微生物生态系统中的生存力的图解。
图14C和14D是现有技术益生菌组合物的微生物株在模拟的人肠微生物生态系统中的生存力的图解。
图15是相对于罗伊氏粘液乳杆菌和对照，本公开的合生素组合物的微生物株的组胺代谢的图解。
图16A和16B分别是各自含有本公开的合生素组合物的常规胶囊和液体甘油溶剂溶液在低温、低湿度条件下的活细胞计数和水稳定性的图。
图17A和17B分别是各自含有本公开的合生素组合物的本公开的胶囊和液体甘油溶剂溶液在高温、高湿度条件下的活细胞计数和水稳定性的图。
图18A是在加速降解条件下储存在罐中的含有本公开的合生素组合物的本公开的胶囊的活细胞计数的图。
图18B是在加速降解条件下储存在袋中的含有本公开的合生素组合物的本公开的胶囊的活细胞计数的图。
图19A是在加速降解条件下储存在罐中的含有本公开的合生素组合物的本公开的胶囊的活细胞计数的图。
图19B是在加速降解条件下储存在袋中的含有本公开的合生素组合物的本公开的胶囊的活细胞计数的图。
图20A和20B是在典型的长期储存条件下，分别储存在罐和袋中的含有本公开的合生素组合物的本公开的胶囊的活细胞计数的图。
图21A、21B、21C和21D分别是相对于可商购的益生菌产品和格氏乳杆菌(L.gasseri)和鼠李糖乳酪杆菌对照，本公开的合生素组合物的微生物株1小时后L-乳酸盐、1小时后D-乳酸盐、24小时后L-乳酸盐和24小时后D-乳酸盐的产生的图。
图22A和22B是相对于可商购的益生菌产品和格氏乳杆菌和鼠李糖乳酪杆菌对照，分别在1小时和24小时后，本公开的合生素组合物的微生物株L-乳酸盐和D-乳酸盐的相对产生的图。
图23是说明罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT产生维生素B12(氰钴维生素)的图。
发明详述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物均通过引用以其整体并入。如果本文中的术语有多个定义，除非另有说明，否则以发明概述中提供的定义为准。
“CRISPR”(成簇规则间隔短回文重复)基因座是指编码DNA切割系统组分的某些遗传基因座，例如，细菌和古细菌(archaeal)细胞用于破坏外来DNA。CRISPR基因座可以由CRISPR阵列组成，该阵列包含由短的可变DNA序列(称为间隔区)分隔的短正向重复(CRISPR重复)，其两侧可以是不同的Cas(CRISPR相关)基因。CRISPR-Cas系统是一种在DNA测序时代之前不为科学界所知的途径的实例，现在被认为赋予细菌和古细菌对噬菌体和病毒的获得性免疫。过去十年的深入研究揭示了此系统的生物化学。CRISPR-Cas系统由Cas蛋白和CRISPR阵列组成，Cas蛋白参与外来DNA或RNA的获取、靶向和切割，CRISPR阵列包含两侧为短间隔序列的正向重复，引导Cas蛋白到达其靶标。2类CRISPR-Cas是精简的版本，其中结合至RNA的单个Cas蛋白负责结合并切割靶序列。这些最小系统的可编程性质促进了它们作为多功能技术的使用，这种技术正在使基因组操作领域发生革命性的变化。
如本文所用，“效应器”或“效应蛋白”是一种蛋白，其涵盖包含识别、结合和/或切割或切口多核苷酸靶标的活性。效应器或效应蛋白也可以是核酸内切酶。CRISPR系统的“效应复合物”包含参与crRNA和靶标识别及结合的Cas蛋白。一些组分Cas蛋白可以另外包含参与靶多核苷酸切割的结构域。
术语“Cas蛋白”是指由Cas(CRISPR-相关)基因编码的多肽。Cas蛋白包含由Cas基因座中的基因编码的蛋白，并且包含衔接分子(adaptation molecule)以及干扰分子。细菌适应性免疫复合物的干扰分子包含核酸内切酶。本文所述的Cas核酸内切酶包含一个或多个核酸酶结构域。Cas核酸内切酶包含但不限于：本文公开的新型Cas-α蛋白、Cas9蛋白、Cpf1(Cas12)蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas3、Cas3-HD、Cas5、Cas7、Cas8、Cas10或这些的组合或复合物。Cas蛋白可以是“Cas核酸内切酶”或“Cas效应蛋白”，当其与合适多核苷酸组分复合时，能够识别、结合并任选地切口或切割特定多核苷酸靶序列的全部或部分。
已根据组分的序列和结构分析对CRISPR-Cas系统进行了分类。已经描述了多种CRISPR/Cas系统，包含具有多亚基效应复合物(包含I型、III型和IV型)的1类系统和具有单蛋白效应器(包括II型、V型和VI型)的2类系统。CRISPR-Cas系统至少包含CRISPR RNA(crRNA)分子和至少一种CRISPR相关(Cas)蛋白，以形成crRNA核糖核蛋白(crRNP)效应复合物。CRISPR-Cas基因座包含一系列相同的重复，其中散布有编码crRNA组分的DNA靶向间隔区和编码Cas蛋白组分的cas基因的操纵子样单位。得到的核糖核蛋白复合物以序列特异性方式识别多核苷酸。通过与互补DNA链形成碱基对，同时置换非互补链以形成所谓的R-环，crRNA用作效应器(蛋白质或复合物)与双链DNA序列的序列特异性结合的向导RNA。CRISPR基因座的RNA转录物(前crRNA)在重复序列中被I型和III型系统中的CRISPR相关(Cas)内切核糖核酸酶或被II型系统中的RNA酶III特异性切割。给定CRISPR基因座处的CRISPR相关基因的数量可以因物种而异。
编码具有不同结构域的蛋白质的不同cas基因存在于不同的CRISPR系统中。cas操纵子包含编码一种或多种效应核酸内切酶以及其他Cas蛋白的基因。一些结构域可以用于一个以上的目的，例如Cas9包含用于核酸内切酶功能性以及用于靶切割的结构域等。Cas核酸内切酶由单个CRISPR RNA(crRNA)通过直接的RNA-DNA碱基配对引导，来识别紧邻前间隔区邻近基序(PAM)中的DNA靶位点。I类CRISPR-Cas系统包含I、III和IV型。I类系统的独特特征是存在效应核酸内切酶复合物而不是单一蛋白质。级联复合物包含RNA识别基序(RRM)和核酸结合结构域，该结构域是不同的RAMP(重复相关神秘蛋白)蛋白超家族的核心折叠。
I型CRISPR-Cas系统包含效应蛋白复合物，称为Cascade(用于抗病毒防御的CRISPR相关复合物)，其至少包含Cas5和Cas7。效应复合物与单个CRISPR RNA(crRNA)和Cas3共同发挥功能，以抵御入侵的病毒DNA。I型系统分为7个亚型。
包含多个cas7基因的III型CRISPR-Cas系统靶向ssRNA或ssDNA，并作为RNA酶以及靶RNA激活的DNA核酸酶发挥功能。尽管IV型系统包含典型的I型cas5和cas7结构域以及cas8样结构域，但可能缺乏大多数其他CRISPR-Cas系统所特有的CRISPR阵列。
II类CRISPR-Cas系统包含II、V和VI型。II类系统的独特特征是存在单一的Cas效应蛋白而不是效应复合物。II和V型Cas蛋白包含采用RNA酶H折叠的Ruvc核酸内切酶结构域。II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)来引导Cas核酸内切酶到达其DNA靶标。crRNA包含与双链DNA靶标的一条链互补的间隔区和与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)碱基配对形成RNA双链体(duplex)的区域，该RNA双链体指导Cas核酸内切酶切割DNA靶标，留下平末端。间隔区是通过涉及Cas1和Cas2蛋白的尚未完全了解的过程获得的。II型CRISPR/Cas基因座通常包含Cas1和Cas2基因以及Cas9基因。II型CRISR-Cas基因座可以编码tracrRNA，其与各自CRISPR阵列内的重复部分地互补，并且可以包含其他蛋白质诸如Csn1和Csn2。cas1和cas2基因附近存在Cas9是II型基因座的特征。V型CRISPR/Cas系统包含单一的Cas核酸内切酶，其包含Cpf1(Cas12)，这是一种活性RNA引导的核酸内切酶，与Cas9不同，它不一定需要额外的反式激活CRISPR(tracr)RNA用于靶切割。VI型CRISPR-Cas系统包含cas13基因，其编码具有两个HEPN(高等真核生物和原核生物核苷酸结合)结构域但没有HNH或Ruvc结构域的核酸酶，并且不依赖于tracrRNA活性。大多数HEPN结构域包含构成金属非依赖性内切RNA酶活性位点的保守基序。由于这一特征，认为VI型系统作用于RNA靶标而不是其他CRISPR-Cas系统常见的DNA靶标。
为了符合书面描述和实现要求，通过以下引用并入本文的是以下专利公开：Sontheimer的2014/0349405；Elinav的2014/0377278；Doudna的2014/0068797；Hou,et.al.的20200190494；以及Zhang的2020/0199555。
如本文所用，除非另有说明，术语“约”、“大约”等在用于数值限制或范围时意指所叙述的限制或范围可以变化高达10％。作为非限制性实例，“约750”可表示少至675或多至825，或其之间的任何值。当用于两个或多个数字的限制或范围之间的比率或关系时，术语“约”、“大约”等意指每个限制或范围可以变化高达约10％；作为非限制性实例，两个数量“大约相等”的表述可以指两个数量之间的比率少至0.9:1.1或多至1.1:0.9(或其间的任何值)，并且四向比率为“约5:3:1:1”的表述可以表示比率中的第一个数字可以是4.5和5.5之间的任何值，比率中的第二个数字可以是2.7到3.3之间的任何值，依此类推。
如本文所用，除非另有说明，术语“动物”是指动物界的任何生物体，包括但不限于人。
如本文所用，除非另有说明，术语“疾病”是指疾病、症或状况或其症状。
如本文所用，除非另有说明，术语“乳杆菌属(lactobacillus)”和“乳杆菌(lactobacilli)”当使用时没有进一步的详细说明时，是指在2020年将乳杆菌属重新分类为25个不同的属之前被分类为乳杆菌科(Lactobacillaceae)的任何生物体。
如本文所用，除非另有说明，术语“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人。
如本文所用，除非另有说明，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或可批准，或列在美国药典或其他公认的用于动物，且更特别是用于人的药典中。
如本文所用，除非另有说明，术语“药学上可接受的媒介物”是指药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的佐剂、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的载体或上述任何项的组合，其可以与本公开提供的物质一起施用于患者，不破坏其药理学活性，并且当以足以提供物质的治疗有效量的剂量施用时是无毒的。
如本文所用，除非另有说明，术语“药物制剂”是指治疗活性物质和与该物质共同施用于患者的至少一种药学上可接受的媒介物。
如本文所用，除非另有说明，术语“益生元”是指被赋予微生物宿主健康益处的微生物选择性利用的底物。
如本文所用，除非另有说明，术语“益生菌”是指当以足够的量施用于宿主动物时，赋予宿主动物健康益处的活微生物。
如本文所用，除非另有说明，术语“合生素”是指益生菌和益生元的组合或混合物，其通过选择性刺激一种或多种健康促进微生物的生长和/或活化其代谢，来提高胃肠道中活微生物膳食补充剂的存活和植入，从而有益地影响宿主。
如本文所用，术语“治疗”是指逆转、减轻、阻止或改善疾病或疾病的至少一种临床症状、降低患上疾病或疾病的至少一种临床症状的风险、抑制疾病或疾病的至少一种临床症状的进展，或降低发展疾病或疾病的至少一种临床症状的风险。“治疗”还指在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、在生理上(例如，物理参数的稳定)或在两者上抑制疾病，以及抑制对患者可辨别或不可辨别的至少一种物理参数。在某些实施方案中，“治疗”是指延迟患者的疾病或其至少一种或多种症状的发作，该患者可能暴露于或易患上疾病，即使尚未经历或表现出该疾病的症状。
如本文所用，除非另有说明，术语“治疗有效量”是指当施用于受试者用于治疗疾病或疾病的至少一种临床症状时，足以实现疾病或其症状的此类治疗的物质的量。“治疗有效量”可以根据例如物质、疾病和/或疾病的症状、疾病的严重程度和/或疾病或病症的症状、待治疗患者的年龄、重量和/或健康状况以及处方医师的判断而变化。在任何给定的情况下，合适的量可以由本领域技术人员确定，或者能够通过常规实验确定。
如本文所用，除非另有说明，术语“治疗有效剂量”是指在患者中提供疾病或病症的有效治疗的剂量。治疗有效剂量可以因物质以及患者的不同而不同，并且可以取决于诸如患者的状况和递送途径等因素。治疗有效剂量可以根据本领域技术人员已知的常规药理学方法确定。
本公开提供了合理定义和组装的微生物群体(consortia)，以通过首先调节天然肠道微生物群和宿主组织的功能来赋予跨器官系统的健康。更具体地，本公开提供了设计的口腔防治性益生菌株混合物，以维持和改善局部和远距离身体部位的宿主健康状况。
在实施方案中，本公开提供了一种或多种活微生物群体，其具有在人中验证的一系列益处，在一些实施方案中，其可以经由保护性嵌套胶囊系统递送。本公开的合生素组合物在整个生产和施用过程中的生存力已经通过胶囊中和模拟的人肠环境中的活性荧光单位(AFU)的综合评价进行了验证，如下文提供的实施例中所进一步详细描述的。除了广泛的机制和遗传特征，该群体还包含在株特异性、双盲、安慰剂对照人体研究中进行临床评估的株，其临床结果包含改善消化、调节肠道-皮肤轴、低密度脂蛋白调节、肠道免疫应答、上皮屏障调节和微量营养素合成。
微生物株
下一代测序(NGS)技术的发展为原核生物全基因组测序引入了新的、更经济的方法。结合生物信息学分析所需的计算资源的价格下降，这导致了大量新细菌基因组的公布。越来越多的“非生物信息学”实验室正在对他们自己的原核生物基因组进行测序，并面临着诸如选择哪种测序平台、应该生成多少文库、文库应使用哪种组装方法等问题。
每个新的细菌测序项目面临的主要问题之一是，基因组的计划用途是否需要将其封闭成每个DNA分子(基因组或质粒，定义为“完整”状态)的单个高质量序列。完整的基因组序列代表成品，其中每个碱基对的顺序和准确性都得到了验证。相反，框架序列(即使是高覆盖率的序列)代表各种大小的重叠群的集合，具有未知的顺序和方向，包含测序错误和可能的错误组装。例如，如果将所讨论的基因组与其他生物的基因组进行比较以推断不同生理特征或生态位的遗传基础，则由于诸如操纵子、基因组岛或染色体外元件(诸如质粒)的功能相关基因组区域的片段化表示，此类比较可能是有偏差的。值得注意的是，截至2015年10月，美国国家生物技术信息中心(NCBI)的精选基因组数据库包含49,204个细菌基因组，但其中只有10％被定义为“完整基因组”。其余的被定义为“基因组草图(draft genome)”，其范围从具有许多N的一个重叠群(支架)到大量顺序未知的重叠群。尽管通常用NGS技术获得高覆盖率，但组装闭合基因组中的困难通常是由重复序列引起的，重复序列包含高度保守的核心基因(例如，核糖体和tRNA基因)和非核心(附属)基因，非核心基因通常包含在可移动的遗传元件上，例如质粒和转座子。此类序列通常在组装中产生“断点(breakpoint)”，导致多个重叠群。或者，当组装时，此类多拷贝基因可以被收缩成单个基因序列，从而丢失可能在功能上重要的遗传微多样性。通过使用单分子、长读测序技术(诸如牛津纳米孔读段(Oxford Nanopore reads))进行组装，然后用Illumina读段进行抛光，以生成最连续的基因组，其精确度足以准确注释重要但难以测序的基因组特征诸如插入序列和次级代谢物生物合成基因簇)，可以在很大程度上克服这些困难。
使用Illumina和牛津纳米孔读段的杂交组装，对本公开的合生素组合物中的每个株进行测序，以产生闭合基因组组装。这些数据允许检测毒力因子、基因组中的抗生素抗性基因和每个株的质粒衍生序列，并允许进一步定制、设计和定做由基于基因组的作用机制提供信息的组合物。
本公开的实施方案包含含有短双歧杆菌SD-BR3-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，短双歧杆菌SD-BR3-IT可以改善宿主的肠运动频率、粪便稠度和排出的容易度，并且可以减轻肠不适的症状，例如腹胀、瘙痒、烧灼感或疼痛。作为第二非限制性实例，短双歧杆菌SD-BR3-IT可以改善通过SCORAD和皮肤病学生活质量(DLQ)指数测量的特应性皮炎的临床参数，降低微生物迁移和/或免疫活化，和/或改善T辅助细胞(Th)17/调节性T细胞(Treg)与Th1/Th2比率。作为第三非限制性实例，短双歧杆菌SD-BR3-IT可以在停止施用合生素后持续存在于宿主的肠道微生物群中，这可以纠正特应性皮炎患者的生态失调的肠道微生物群。作为第四非限制性实例，短双歧杆菌SD-BR3-IT可以抑制多种大肠杆菌生物型(包括致病性大肠杆菌O157:H7)的生长。
本公开的实施方案包含含有植物乳植杆菌SD-LP1-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，植物乳植杆菌SD-LP1-IT可以改善宿主的肠运动频率、粪便稠度和排出的容易度，并且可以减轻肠不适的症状，例如腹胀、瘙痒、灼烧或疼痛。作为第二非限制性实例，植物乳植杆菌SD-LP1-IT可以抑制多种大肠杆菌生物型(包括致病性大肠杆菌O157:H7)的生长。
本公开的实施方案包含含有长双歧杆菌SD-BB536-JP的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，长双歧杆菌SD-BB536-JP可以增加肠运动频率、改善排泄物的视觉特性、增加排泄物的水分含量、降低排泄物的氨含量、降低各种排泄物酶的活性、增加排泄物的微生物群中双歧杆菌属种的比例，和/或降低排泄物的微生物群中肠杆菌属种和/或的产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的比例。作为第二非限制性实例，长双歧杆菌SD-BB536-JP可以降低宿主中呼吸道疾病的发病率和/或引起肠道微生物群的差异，包含增加粪杆菌属种的丰度。作为第三非限制性实例，长双歧杆菌SD-BB536-JP可以减少宿主肠微生物群中产肠毒素的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的数量。作为第四非限制性实例，长双歧杆菌SD-BB536-JP可以在患有日本柳杉花粉症过敏反应的宿主中减轻咽喉和鼻症状，例如痒、鼻溢和鼻塞，抑制过敏反应诱导的IFN-γ血液水平的降低和/或血液嗜酸性粒细胞比率的增加，和/或降低JCP特异性IgE抗体的水平。
本公开的实施方案包含含有罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT可以降解草酸盐，特别是比双歧杆菌种更有效地降解草酸盐。作为第二非限制性实例，罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT可以产生核黄素和维生素B12。
本公开的实施方案包含含有婴儿双歧杆菌SD-M63-JP的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，婴儿双歧杆菌SD-M63-JP可以发酵人乳寡糖3'-唾液酸苷乳糖、6'-唾液酸苷乳糖、2'-岩藻糖基乳糖和3'-岩藻糖基乳糖。作为第二非限制性实例，婴儿双歧杆菌SD-M63-JP在患有肠易激综合征(IBS)的宿主中可以导致肠道微生物群中厚壁菌属种(Firmicutes spp.)/拟杆菌属种(Bacteroidetes spp.)的比例降低，这与改善心理健康相关。
本发明的实施方案包含含有鼠李糖乳酪杆菌HRVD113-US的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，鼠李糖乳酪杆菌HRVD113-US可增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包含Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本发明的实施方案包含含有乳双歧杆菌HRVD524-US(BL-04)的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，乳双歧杆菌HRVD524-US(BL-04)可以降低上呼吸道疾病发作的风险和/或延迟呼吸道疾病。作为第二非限制性实例，乳双歧杆菌HRVD524-US(BL-04)可以降低鼻灌洗液中的鼻病毒滴度、鼻分泌物中病毒脱落的可能性和/或鼻灌洗液中趋化因子(C-X-C基序)配体8(CXCL8)对鼻病毒感染的应答。
本公开的实施方案包含含有短双歧杆菌HRVD521-US的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，短双歧杆菌HRVD521-US可以增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包括Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本公开的实施方案包含含有干酪乳酪杆菌HRVD300-US的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，短双歧杆菌HRVD521-US可增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包括Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本公开的实施方案包含含有长双歧杆菌HRVD90b-US的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，长双歧杆菌HRVD90b-US可以增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包括Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本公开的实施方案包含含有乳双歧杆菌SD150-BE的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，乳双歧杆菌SD150-BE可以增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包括Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本公开的实施方案包含含有鼠李糖乳酪杆菌SD-GG-BE的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，鼠李糖乳酪杆菌SD-GG-BE可以降低抗原呈递细胞(APC)的Toll样受体mRNA水平，降低巨噬细胞中的CD16表达和单核细胞中的CD11表达，和/或诱导1型免疫应答极化，如从IL-12和TNF-α的产生提高所观察到的。
本公开的实施方案包含含有罗伊氏粘液乳杆菌RD830-FR的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，罗伊氏粘液乳杆菌RD830-FR可以增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包括Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本公开的实施方案包含含有青春双歧杆菌SD-BA5-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，青春双歧杆菌SD-BA5-IT可以增加宿主排泄物中的叶酸浓度和/或在肠环境中定殖。作为第二非限制性实例，青春双歧杆菌SD-BA5-IT可以产生叶酸。
本公开的实施方案包含含有卷曲乳杆菌SD-LCR01-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，卷曲乳杆菌SD-LCR01-IT可以增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包括Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本公开的实施方案包含含有唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT可以改善通过SCORAD和皮肤病学生活质量(DLQ)指数测量的特应性皮炎的临床参数，降低微生物迁移和/或免疫活化，和/或改善辅助T细胞(Th)17/调节性T细胞(Treg)和Th1/Th2的比率。作为第二非限制性实例，唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT可以减少宿主排泄物中的葡萄球菌计数。作为第三非限制性实例，唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT可以改善通过痒指数所测量的特应性皮炎的临床参数，其可以在停止施用合生素后持续。作为第四非限制性实例，唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT可以降低葡萄球菌载量和/或减少Th2细胞因子的产生，并维持Th1细胞因子的稳定产生。作为第五非限制性实例，唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT可以减少促炎细胞因子，增加抗炎细胞因子，抑制活性氧种类产生，恢复细胞膜完整性，和/或抑制致病性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。
本公开的实施方案包含含有发酵酸杆菌SD-LF8-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，发酵粘液乳杆菌SD-LF8-IT可以增加人肠上皮细胞中肠道屏障完整性标志物(包括Nrf2和上皮紧密连接蛋白)的表达和/或SCFA的产生。
本公开的实施方案包含含有长双歧杆菌SD-CECT7347-SP的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为第一非限制性实例，长双歧杆菌SD-CECT7347-SP可以降低SCORAD指数和局部类固醇治疗的使用以治疗慢性皮肤病学疾病的加剧。作为第二非限制性实例，长双歧杆菌SD-CECT7347-SP可以减少涉及Caco-2细胞中的细胞骨架瓦解、炎症和凋亡的细胞蛋白质的表达改变。作为第三非限制性实例，长双歧杆菌SD-CECT7347-SP可以在乳糜泻宿主的外周血单个核细胞(PBMC)中抑制促炎细胞因子模式并增加IL-10的产生。作为第四非限制性实例，长双歧杆菌SD-CECT7347-SP可以影响单核细胞衍生的树突状细胞的表型和功能成熟。作为第五非限制性实例，长双歧杆菌SD-CECT7347-SP可以减少毒性氨基酸序列的细胞表现并减少NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达。
本公开的实施方案包含含有干酪乳酪杆菌SD-CECT9104-SP的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，干酪乳酪杆菌SD-CECT9104-SP可以降低SCORAD指数和局部类固醇治疗的使用以治疗慢性皮肤病学疾病的加剧。
本公开的实施方案包含含有乳双歧杆菌SD-CECT8145-SP的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，乳双歧杆菌SD-CECT8145-SP可以降低SCORAD指数和局部类固醇治疗的使用以治疗慢性皮肤病学疾病的加剧。
本公开的实施方案包含含有植物乳植杆菌SD-LPLDL-UK的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，植物乳植杆菌SD-LPLDL-UK可以降低宿主的LDL-C、总胆固醇和/或收缩血压和/或增加宿主的HDL-C。
本公开的实施方案包含含有乳双歧杆菌SD-MB2409-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，乳双歧杆菌SD-MB2409-IT可以降低总胆固醇和LDL-C和/或吸收胆固醇及针对甘胆酸和牛磺脱氧胆酸的胆盐水解酶。
本公开的实施方案包含含有乳双歧杆菌SD-BS5-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，乳双歧杆菌SD-BS5-IT可以促进肠糖分解代谢和/或减少阿霉素诱导的氧化应激。
本公开的实施方案包含含有鼠李糖乳酪杆菌SD-LR6-IT的合生素组合物。该细菌株可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，鼠李糖乳酪杆菌SD-LR6-IT可以抑制多种大肠杆菌生物型(包含致病性大肠杆菌O157:H7)的生长。
本公开的方面允许合理和系统地筛选和选择用于合生素组合物中的感兴趣的细菌株。特别地，如贯穿本公开所述的，在优选实施方案中，感兴趣的细菌株可以针对各种功能属性进行筛选，功能属性包括但绝不限于Nrf2转录因子的上调、肠道中短链脂肪酸(SCFA)产生的增加和/或肠道中上皮屏障功能的改善。作为这种筛选的结果，每个具有一种或多种这些期望的功能属性并且共同具有大多数或所有期望的属性的个体株或株的组合，可以包含在合生素组合物中以提供对宿主健康的协同作用。作为非限制性实例，在一些实施方案中，Nrf2的上调、SCFA产生的增加和上皮屏障功能的改善可以在宿主的肠道环境中相互加强，并且可以因此导致比这些功能结果的任何一种或两种更大的全面宿主健康的改善；因此，可以针对这些属性筛选株，并作为此筛选的结果合理地选择包含在本公开的合生素组合物中的株。
益生元
常规益生元膳食补充剂中使用的大多数益生元是某些可微生物发酵的膳食纤维，即被肠道微生物利用来支持生长并通过多步骤发酵过程促进有益化合物的微生物产生的多聚和寡聚碳水化合物。此类纤维的常见实例包含低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)和菊粉。然而，为了提供显著的健康益处，这些细菌可发酵的纤维基质通常需要的量大于可在单个胶囊或其他剂型中提供的量，因此最好从食物来源(例如坚果、水果和蔬菜)获得。因此，优选在益生元膳食补充剂中提供替代类型的益生元。
本公开的实施方案包含含有多酚的合生素组合物，多酚可以被微生物群生物转化为一种或多种代谢物。多酚是以羟基化的苯基部分为特征的一大类异质化合物，主要存在于包含水果、蔬菜和谷物的植物中，或植物来源的饮料中，如茶、咖啡和酒。多酚由于其潜在的健康益处，特别是关于预防癌症和心血管疾病，最近已成为许多研究的焦点。这些植物衍生的分子不是通过发酵处理，而是通过肠道微生物生物转化为可以适用于人体的特定代谢物。科学证据表明，多酚可以调节人宿主中肠道微生物群的组成，改善慢性疾病的各种生化标志物和风险因素。
更特定地，本公开的实施方案包含含有安石榴苷的合生素组合物，在一些实施方案中，安石榴苷可以衍生自或提取自石榴。安石榴苷是有效的多酚，存在于石榴的果实和果皮中，使果实呈现深紫红色。在人体中，安石榴苷充当强大的抗氧化剂并且可以被某些肠道细菌代谢为一类被称为尿石素的二苯并吡喃-6-酮，包括但不限于尿石素-A。尿石素-A可以对宿主的健康具有几种有益作用的任何一种或多种。作为非限制性实例，尿石蛋白-A驱动线粒体自噬过程，即有缺陷的线粒体的再循环，并且从而可以对宿主的代谢健康具有深远的积极影响。
虽然本文公开内容的实施方案通常针对包含安石榴苷作为益生元组分的主要成分的合生素组合物，但应明确理解，除了安石榴苷之外或代替安石榴苷，可以提供能够通过健康人肠道微生物群中存在的微生物株转化为生物活性代谢物的任何化合物。作为第一非限制性实例，益生元组分可以包含一种或多种芥子油苷，其可以被肠道微生物群代谢为异硫氰酸酯，异硫氰酸酯转而又显示出具有抗癌特性和对人健康的其他有益作用。作为第二非限制性实例，益生元组分可以包含一种或多种儿茶素，其可以被结肠中的微生物代谢为γ-戊内酯和马尿酸，γ-戊内酯和马尿酸转而又在人肝脏中生物转化为对人健康有用的代谢物。作为第三非限制性实例，益生元组分可以包含一种或多种多酚，已知许多多酚被肠道微生物群代谢为有益于人健康的化合物。这些和其他实施方案在本公开的范围内。在一些实施方案中，化合物可以是从宿主的角度来看在生物学上“惰性”的化合物(即，仅能被肠道微生物群中的一种或多种株代谢，而不能被宿主代谢)，而在其他实施方案中，化合物可以被宿主和肠道微生物群代谢。
递送胶囊
许多可吞咽胶囊形式的常规膳食益生菌组合物存在组合物对人宿主的靶向性差的问题。特别地，已经证实在这些常规胶囊组合物中难以提供能够确保大部分活微生物通过上消化道的严酷条件而存活，然后将活微生物释放到其最有益的下消化道的胶囊。在许多情况下，常规胶囊在上消化道中降解到这样的程度，即大部分活微生物在到达下消化道之前被破坏。
现在参照图1A和1B，本公开的实施方案包含用于递送益生菌组合物的改进的胶囊。如图1A中的组装视图和图1B中的分解视图所示，递送胶囊100包含内部胶囊110，该内部胶囊110封闭在外部胶囊120内、嵌入在外部胶囊120内和/或被外部胶囊120包围。尽管内部胶囊110和外部胶囊120的组成和结构可以变化，但在许多实施方案中，内部胶囊110将含有或封闭合生素组合物的大部分或全部益生菌组分，而外部胶囊120含有或封闭大部分或全部的合生素组合物的益生元组分。此递送胶囊100允许通过胃肠道的改善的稳定性和生存力，导致益生菌生物体通过胃、空肠、十二指肠和回肠，直到到达结肠具有100％或接近100％的存活，如在下面的实施例中所更详细描述的。显然，与传统的延迟释放或基于肠溶衣的耐酸递送系统相比，本公开的递送胶囊100允许在小肠上部精确释放，从而增加生物体和宿主细胞之间的接合。不希望受任何特定理论的束缚，在内部胶囊110被降解或消化以导致合生素组合物的益生菌组分释放之前，可以将外部胶囊120降解或消化，从而导致合生素组合物的益生元组分的释放。本公开的递送胶囊100的重要优势在于，其允许益生元组分和益生菌组分中的任一种或两者的改进的释放特性，特别是益生菌组分通过上消化系统的改善的存活，直至在结肠中释放，而无需单独的液体介质或溶剂。
图1A和1B所示的胶囊100的“胶囊中的胶囊”构造的一个优势在于，内部胶囊110和外部胶囊120都可以由常规赋形剂、压片成分(tableting ingredient)、控释组分材料等构成。内部胶囊110和外部胶囊120可以由相同的材料或不同的材料制成。作为非限制性实例，在许多实施方案中，内部胶囊110和外部胶囊120均可由羟丙甲纤维素构成；内部胶囊110可由与外部胶囊120相同等级或不同等级的羟丙甲纤维素构成。
药物制剂
本公开提供的药物制剂可以一起包含治疗有效量的合生素组合物和适当量的一种或多种药学上可接受的媒介物，以提供用于适当施用于对患者的制剂。合适的药物媒介物在本领域中有描述。
在某些实施方案中，可以将合生素组合物掺入口服施用的药物制剂中。此类药物制剂的口服施用可以导致合生素组合物贯穿整个肠的释放和/或吸收。此类口服制剂可以以制药领域已知的方式制备，并包含合生素组合物和至少一种药学上可接受的媒介物。口服药物制剂可以包含治疗有效量的合生素组合物和适当量的药学上可接受的媒介物，以提供施用于患者的适当形式。
可以将合生素组合物掺入药物制剂中，以通过任何其他合适的全身施用途径(包含肌内、静脉内和口服)进行施用。
包含合生素组合物的药物制剂可以通过常规的混合、溶解、造粒、糖衣丸制造、磨细、乳化、囊封、包埋(entrapping)或冻干方法制造。可以使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂以常规方式配制药物制剂，载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂有利于将合生素组合物和一种或多种药学上可接受的媒介物加工成可在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。本公开提供的药物制剂可以采用适合施用于患者的持续释放制剂的形式。
本公开提供的药物制剂可以以单位剂型配制。单位剂型是指物理上离散的单位，其适合作为经历治疗的患者的单一剂量，每个单位含有预定数量的合生素组合物，该预定数量经计算可产生预期的治疗效果。单位剂型可以是单日剂量，每天施用2次，或多个日剂量之一，例如每天3次或更多次。当使用多个日剂量时，单位剂型对于每个剂量可以相同或不同。一种或多种剂型可以包含在单个时间点或时间间隔期间施用于患者的剂量。
在某些实施方案中，本公开提供的口服剂型可以是控释剂型。受控递送技术可以改善胃肠道的一个或多个特定区域中活性成分的吸收。可以将受控的活性成分递送系统设计成以此种方式递送活性成分，即只要该系统在胃肠道中以特定的释放曲线持续递送活性成分，就维持活性成分的水平在治疗有效窗口内并且维持有效和安全的血液水平一段时间。与用立即释放剂型观察到的波动相比，受控的活性成分递送可以在一段时间内产生基本恒定的活性成分血液水平。对于某些应用，在贯穿整个疗法进程中维持恒定的血液和组织浓度是最理想的治疗模式。活性成分的立即释放可以导致血液水平达到峰，该峰高于引发期望应答需要的水平，这可能浪费活性成分并可以导致或加剧毒副作用。受控的活性成分递送可以产生最佳疗法，并且不仅可以减少给药频率，而且还可以降低副作用的严重程度。控制释放剂型的实例包含溶解控制系统(dissolution controlled systems)、扩散控制系统、离子交换树脂、渗透控制系统、易侵蚀基质系统、pH非依赖性制剂和胃滞留系统等。
本公开提供的特定药物制剂的合适口服剂型至少部分地可以取决于活性成分的胃肠吸收特性和/或活性成分在胃肠道中的稳定性、活性成分的药代动力学和预期的治疗概况(therapeutic profile)。对于特定的成分或成分的组合，可以选择合适的控制释放口服剂型。例如，胃滞留口服剂型可以适合于主要从上胃肠道吸收的活性成分，而持续释放口服剂型可以适合于主要从下胃肠道吸收的活性成分。某些活性成分主要从小肠吸收。通常，活性成分在约3至5小时内穿过小肠的长度。对于不容易被小肠吸收或不容易溶解的活性成分，小肠中活性剂吸收的窗口可能太短而不能提供期望的治疗效果。
在某些实施方案中，本公开提供的药物制剂可以用适于在口服施用时提供合生素组合物的持续释放的剂型来实施。持续释放口服剂型可以用于在延长的时间段内释放活性成分，并且当期望将活性成分递送至下胃肠道(包含结肠)时是有用的。持续释放口服剂型包含在生物流体诸如血浆、血液、脑脊液中或在组织或器官中在延长的时间段内维持活性成分的治疗浓度的任何口服剂型。持续释放口服剂型包含扩散控制系统如贮液器装置和基质装置、溶解控制系统、渗透系统和侵蚀控制系统。持续释放口服剂型及其制备方法是本领域公知的。
在某些实施方案中，本公开提供的药物组合物可以包含用于施用合生素组合物的任何有肠溶包衣的持续释放口服剂型。在一个实施方案中，有肠溶包衣的口服剂型以每天三次的给药频率施用于患者。在另一个实施方案中，有肠溶包衣的口服剂型以每天两次的给药频率施用于患者。在又另一个实施方案中，有肠溶包衣的口服剂型以每天一次的给药频率施用于患者。
在某些实施方案中，本公开提供的药物制剂可以包含用于施用合生素组合物的任何非肠溶包衣的持续释放口服剂型。在一个实施方案中，非肠溶包衣的口服剂型以每天三次的给药频率施用于患者。在另一个实施方案中，非肠溶包衣的口服剂型以每天两次的给药频率施用于患者。在又另一个实施方案中，非肠溶包衣的口服剂型以每天一次的给药频率施用于患者。
在某些实施方案中，本公开提供的药物制剂可以包含用于施用合生素组合物的任何胶囊口服剂型。在一个实施方案中，胶囊口服剂型以每天三次的给药频率施用于患者。在另一个实施方案中，胶囊口服剂型以每天两次的给药频率施用于患者。在又另一个实施方案中，胶囊口服剂型以每天一次的给药频率施用于患者。
在某些实施方案中，本公开提供的药物制剂可以包含实现上述体外释放概况的任何合适的剂型。此类剂型可以是任何全身剂型，包含持续释放的有肠溶包衣的口服剂型以及持续释放的有肠溶包衣或非肠溶包衣的口服剂型。本文描述了合适剂型的实例。以实例中描述的剂型为起点，制剂领域的技术人员可以开发任何数量的可接受剂型。
合生素组合物的合适剂量可以根据几种得到确认的方案的任何一种来确定。例如，可以使用动物研究例如使用小鼠、大鼠、狗和/或猴的研究来确定药物化合物的适当剂量。可以将动物研究的结果进行外推以确定用于其他物种(例如人)的剂量。
用途
本文公开的方法和制剂可以用于治疗患有已知或后来发现合生素组合物提供对其提供治疗益处的疾病、病症、状况和症状的患者。本文公开的制剂可以用于治疗选自以下的疾病：肾上腺脑白质营养不良、AGE诱导的基因组损伤、亚历山大病、斑秃、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、心绞痛、关节炎、哮喘、巴洛同心圆性硬化(balo concentricsclerosis)、白塞病、大疱性类天疱疮(bollus pemphigoid)、卡纳万病(Canavandisease)、包括左心室功能不全的心功能不全、中枢神经系统血管炎、腓骨肌萎缩症(Charcott-Marie-Tooth Disease)、儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化不良(childhoodataxia with central nervous system hypomyelination)、慢性特发性周围神经病变(chronic idiopathic peripheral neuropathy)、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、皮肤狼疮、皮炎(接触性、急性和慢性)、糖尿病性视网膜病变、移植物抗宿主病、肉芽肿、丙型肝炎病毒感染、单纯疱疹病毒感染、人免疫缺陷病毒感染、亨廷顿病(Huntington’s disease)、肠易激性病症(irritable bowel disorder)、局部缺血、克拉伯病(Krabbe Disease)、扁平苔藓(lichen planus)、黄斑变性、线粒体脑肌病、单肢肌萎缩(monomelic amyotrophy)、多发性硬化、心肌梗塞、神经退行性变伴脑铁沉积(neurodegeneration with brain ironaccumulation)、视神经脊髓炎、神经系统结节病、NF-κB介导的疾病、视神经炎、副肿瘤综合征(pareneoplastic syndrome)、帕金森病(Parkinson’s disease)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、天疱疮、原发性侧索硬化、进行性核上麻痹(progressivesupranuclear palsy)、银屑病、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、色素性视网膜病、结节病、席尔德氏病(Schilders Disease)、亚急性坏死性脊髓病、susac综合征、移植排斥、横贯性脊髓炎、肿瘤、溃疡性结肠炎和Zellweger综合征。
本公开提供的治疗患者中疾病的方法包括向需要此类治疗的患者施用治疗有效量的本公开的合生素组合物。这些方法和药物制剂在施用于患者后提供治疗或防治量的益生元化合物和/或益生菌株。合生素组合物可以以适于治疗特定疾病的量和给药方案施用。
合生素组合物的益生元组分的化合物的日剂量可以为约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至50mg/kg，和在某些实施方案中约5mg/kg至约25mg/kg。在某些实施方案中，益生元组分的化合物可以以如下剂量施用：逐渐地为每天约1mg至约5g、每天约10mg至约4g，在某些实施方案中每天约20mg至约2g，在某些实施方案中每天约100mg至约1g，在某些实施方案中每天约150mg至约650mg，在某些实施方案中每天约250mg至约550mg，在某些实施方案中每天约350mg至约450mg，和在某些实施方案中每天约400mg。
在某些实施方案中，益生菌组分的微生物株可以以如下剂量随时间施用：每天约1.25亿AFU至约6250亿AFU，在某些实施方案中每天约12.5亿AFU至约5000亿AFU，在某些实施方案中每天约25亿AFU至2500亿AFU，在某些实施方案中每天约125亿AFU至约1250亿AFU，在某些实施方案中每天约250亿AFU至约1000亿AFU，在某些实施方案中每天约375亿AFU至约750亿AFU，和在某些实施方式中每天约500亿AFU至约625亿AFU。
在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约25亿AFU，和/或每剂量至少约50亿AFU的短双歧杆菌SD-BR3-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约25亿AFU，和/或每剂量至少约50亿AFU的植物乳植杆菌SD-LP1-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约60亿AFU，和/或每剂量至少约120亿AFU的鼠李糖乳酪杆菌SD-LR6-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约25亿AFU，和/或每剂量至少约50亿AFU的青春双歧杆菌SD-BA5-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约10亿AFU，和/或每剂量至少约20亿AFU的唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约24亿AFU，和/或每剂量至少约48亿AFU的罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约42500万AFU，和/或每剂量至少约85000万AFU的乳双歧杆菌SD-BS5-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约50000万AFU，和/或每剂量至少约10亿AFU的乳双歧杆菌SD-MB2409-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约42500万AFU，和/或每剂量至少约85000万AFU的卷曲乳杆菌SD-LCR01-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约8500万AFU，和/或每剂量至少约17000万AFU的发酵粘液乳杆菌SD-LF8-IT。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约42.5亿AFU，和/或每剂量至少约85亿AFU的鼠李糖乳酪杆菌HRVD113-US。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约10亿AFU，和/或每剂量至少约20亿AFU的乳双歧杆菌HRVD524-US(BL-04)。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约3亿AFU，和/或每剂量至少约6亿AFU的干酪乳酪杆菌HRVD300-US。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约3亿AFU，和/或每剂量至少约6亿AFU的短双歧杆菌HRVD521-US。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约1.2亿AFU，和/或每剂量至少约2.4亿AFU的长双歧杆菌HRVD90b-US。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约30亿AFU，和/或每剂量至少约60亿AFU的长双歧杆菌SD-BB536-JP。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约2.5亿AFU，和/或每剂量至少约5亿AFU的婴儿双歧杆菌SD-M63-JP。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约6000万AFU，和/或每剂量至少约1.2亿AFU的乳双歧杆菌SD150-BE。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约2000万AFU，和/或每剂量至少约4000万AFU的鼠李糖乳酪杆菌SD-GG-BE。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约2000万AFU，和/或每剂量至少约4000万AFU的罗伊氏粘液乳杆菌RD830-FR。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约2.1亿AFU，和/或每剂量至少约4.2亿AFU的乳双歧杆菌SD-CECT8145-SP。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约2.1亿AFU，和/或每剂量至少约4.2亿AFU的长双歧杆菌SD-CECT7347-SP。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约1.8亿AFU，和/或每剂量至少约3.6亿AFU的干酪乳酪杆菌SD-CECT9104-SP。在一些实施方案中，益生菌组分可以包含每胶囊至少约24.65亿AFU，和/或每剂量至少约49.3亿AFU的植物乳植杆菌SD-LPLDL-UK。在这些实施方案中，益生菌组分中存在的任何一种或多种株的绝对AFU计数可以变化，只要任何两种或更多种所选微生物株之间的AFU比率保持与上述相同(例如，只要短双歧杆菌SD-BR3-IT和鼠李糖乳酪杆菌SD-LR6-IT之间的AFU比率保持约25亿:60亿，或约50亿:120亿。
合生素组合物的合适剂量可以基于几个因素(包含诸如所治疗患者的体重和/或状况、所治疗疾病的严重程度、副作用的发生率和/或严重程度、施用方式和处方医生的判断)来确定。合适的剂量范围可以通过本领域技术人员已知的方法确定。
在用于人之前，可以在体外和体内测定合生素组合物的期望治疗或防治活性。例如使用合适的动物模型的体内测定，也可用于确定合生素组合物的施用是否治疗有效。
在某些实施方案中，治疗有效剂量的合生素组合物可以提供治疗益处，而不会引起显著的毒性(包含有害的副作用)。合生素组合物和/或其代谢物的毒性可以使用标准药学方法测定，并且可以由本领域技术人员确定。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。合生素组合物的剂量可以在能够建立和维持益生元成分(表现很少或没有毒性)的治疗有效的循环血浆和/或血液浓度的范围内。
施用合生素组合物可以用于治疗选自以下的疾病：肾上腺脑白质营养不良、AGE诱导的基因组损伤、亚历山大病、斑秃、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、心绞痛、关节炎、哮喘、巴洛同心圆性硬化(balo concentric sclerosis)、白塞病、大疱性类天疱疮(bollus pemphigoid)、卡纳万病(Canavan disease)、包括左心室功能不全的心功能不全、中枢神经系统血管炎、腓骨肌萎缩症(Charcott-Marie-Tooth Disease)、儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化不良(childhood ataxia with central nervous systemhypomyelination)、慢性特发性周围神经病变(chronic idiopathic peripheralneuropathy)、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、皮肤狼疮、皮炎(接触性、急性和慢性)、糖尿病性视网膜病变、移植物抗宿主病、肉芽肿、丙型肝炎病毒感染、单纯疱疹病毒感染、人免疫缺陷病毒感染、亨廷顿病(Huntington’s disease)、肠易激性病症(irritable boweldisorder)、局部缺血、克拉伯病(Krabbe Disease)、扁平苔藓(lichen planus)、黄斑变性、线粒体脑肌病、单肢肌萎缩(monomelic amyotrophy)、多发性硬化、心肌梗塞、神经退行性变伴脑铁沉积(neurodegeneration with brain iron accumulation)、视神经脊髓炎、神经系统结节病、NF-κB介导的疾病、视神经炎、副肿瘤综合征(pareneoplastic syndrome)、帕金森病(Parkinson’s disease)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、天疱疮、原发性侧索硬化、进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy)、银屑病、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、色素性视网膜病、结节病、席尔德氏病(Schilders Disease)、亚急性坏死性脊髓病、susac综合征、移植排斥、横贯性脊髓炎、肿瘤、溃疡性结肠炎和Zellweger综合征。所治疗的任何上述疾病的根本病因可能有多种来源。此外，在某些实施方案中，可以向患者(诸如人)施用治疗有效量的合生素组合物作为针对前述疾病和病症的预防措施。因此，对具有以下的倾向和/或病史的患者可以施用治疗有效量的合生素组合物作为预防措施：肾上腺脑白质营养不良、AGE诱导的基因组损伤、亚历山大病、斑秃、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、心绞痛、关节炎、哮喘、巴洛同心圆性硬化(balo concentricsclerosis)、白塞病、大疱性类天疱疮(bollus pemphigoid)、卡纳万病(Canavandisease)、包括左心室功能不全的心功能不全、中枢神经系统血管炎、腓骨肌萎缩症(Charcott-Marie-Tooth Disease)、儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化不良(childhoodataxia with central nervous system hypomyelination)、慢性特发性周围神经病变(chronic idiopathic peripheral neuropathy)、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、皮肤狼疮、皮炎(接触性、急性和慢性)、糖尿病性视网膜病变、移植物抗宿主病、肉芽肿、丙型肝炎病毒感染、单纯疱疹病毒感染、人免疫缺陷病毒感染、亨廷顿病(Huntington’s disease)、肠易激性病症(irritable bowel disorder)、局部缺血、克拉伯病(Krabbe Disease)、扁平苔藓(lichen planus)、黄斑变性、线粒体脑肌病、单肢肌萎缩(monomelic amyotrophy)、多发性硬化、心肌梗塞、神经退行性变伴脑铁沉积(neurodegeneration with brain ironaccumulation)、视神经脊髓炎、神经系统结节病、NF-κB介导的疾病、视神经炎、副肿瘤综合征(pareneoplastic syndrome)、帕金森病(Parkinson’s disease)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、天疱疮、原发性侧索硬化、进行性核上麻痹(progressivesupranuclear palsy)、银屑病、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、色素性视网膜病、结节病、席尔德氏病(Schilders Disease)、亚急性坏死性脊髓病、susac综合征、移植排斥、横贯性脊髓炎、肿瘤、溃疡性结肠炎和Zellweger综合征。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物可以在广谱抗生素疗法后有效地用于肠微生物群的元基因组和代谢组重构。可以在Clinicaltrials.gov Study NCT04171466,“广谱抗生素疗法后肠道微生物群的元基因组和代谢组重构(Metagenomic andMetabolomic Reconstitution of Gut Microbiota After Broad Spectrum AntibioticTherapy)”中可以找到关于此类方法和组合物的其他公开内容，其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物可以在广谱抗生素疗法后有效地恢复上皮屏障完整性和肠道微生物群功能。可以在Clinicaltrials.gov Study NCT04171466,“广谱抗生素疗法后肠道微生物群的元基因组和代谢组重构(Metagenomic andMetabolomic Reconstitution of Gut Microbiota After Broad Spectrum AntibioticTherapy)”中可以找到关于此类方法和组合物的其他公开内容，其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物可以有效改善患有肠易激综合征的受试者中元基因组稳定性和肠道微生物群的代谢产量。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物可以有效改善、修复或恢复患有轻度至中度COVID-19的成人的肠道和气道微生物群的功能。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物可以在利福昔明(rifaximin)治疗患有肠易激综合征的受试者后有效保持肠道屏障完整性和肠道微生物群组成。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物可以有效改善、预防或治疗便秘。
通过参考以下非限制性实施例进一步描述本公开。实施例说明了本公开的各个方面。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以对材料和方法进行许多修改。
实施例1
全基因组鸟枪法测序
使用Mag Attract Power Soil试剂盒(Qiagen，目录号27000-4-EP)从本公开的合生素组合物的益生菌组分中提取元基因组DNA。使用Nextera DNA Flex方案(Illumina)制备序列文库。在Hiseq3000(2x150bP)上进行测序，在质量过滤之前针对R1和R2读段产生22.27Gb。在默认设置下，使用Trimmomatic过滤序列，具有75bp的最小序列长度。使用MetaPhlAn2确定分类组成。
进行读段水平分析，其中使用kma将益生菌混合物的配对末端序列读段定位到两个公众可用的AMR数据库的最新版本：ResFinder(2019年4月26日发布)和NCBI抗菌素耐药性(NCBI Antimicrobial Resistance)数据库(2019年4月29日发布)。kma算法是一种快速且准确的基于kmer的对齐器，设计用于定位原始(即未组装)序列读段并鉴定冗余数据库中的命中。kma对齐器产生的输出非常类似于传统的BLAST报告，除了它们是数据库聚焦的而不是查询聚焦的，并提供与身份、覆盖范围和覆盖范围的深度相关的证据，这些证据由未组装的读段池中鉴定的所有打击表示。
产生总共22.27Gb的原始序列数据。质量过滤后，利用16.04Gb的数据进行分类和AMR分析。分类学分析鉴定了12个细菌种，其中长双歧杆菌、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、鼠李糖乳酪杆菌、植物乳植杆菌、唾液联合乳杆菌和短双歧杆菌占群落(community)中鉴定的序列读段的大部分。
实施例2
针对Nrf2转录因子的筛选
无脊椎动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是第一个进行全基因组测序的多细胞生物，并且2至3周的短寿命、透明的细胞壁和遗传可处理性的组合使其成为用于研究能量代谢、免疫和衰老的极其多功能的模型系统。尽管秀丽隐杆线虫蠕虫在野外表现出多样化的微生物群，但它通常在实验室中以一个物种生长。这使得研究者轻松地创建和维持确定的肠微生物群。肠是生物体的主要器官之一并且约占其体质量的三分之一。透明的细胞壁和有氧腔(aerobic lumen)也使得实现荧光蛋白和标志物的简单可视化。蠕虫具有先天免疫系统，用于随着蠕虫老化调节肠细菌载量。对研究宿主-微生物群相互作用的便利和稳健的工具的新需求，导致人们对使用秀丽隐杆线虫作为宿主-微生物群相互作用和合成生物学的活体动物模型越来越感兴趣。实例包含高通量筛选，以阐明潜在的宿主-微生物-药物相互作用的复杂性，了解细菌产生的代谢物如何影响蠕虫基因表达及其寿命，以及微生物群定植肠道中的随机性的作用。
认为由活性氧种类引起的细胞损伤是年龄相关疾病的主要原因。人已经发展出一种强大的应答途径来对环境应激源作出应答，并产生一系列解毒酶作为对异生物质(xenobiotics)的应答。胃肠道和皮肤一起是与外部应激源高度接触的表面，并且因此调节宿主的免疫应答。最近，已经探索了使用微生物来参与此系统并影响局部和系统的转录途径。鉴定参与细胞监视激活(surveillance-activated)的解毒和免疫应答的信号传导机制和遗传因子，可以鉴定用于其调节的新型益生菌，并预防或治疗不良后果。
存在于本公开的合生素组合物的益生菌组分中的微生物株首先作为单一打击并在新型基于秀丽隐杆线虫的模型中的群体(consortia)中进行评估，以鉴定经由称为Skn-1(哺乳动物Nrf2转录因子的功能性直向同源物)的途径的宿主解毒应答的上调。Nrf2是一种生物学相关途径，因为它诱导抗氧化剂和细胞保护基因的表达，这些基因共同激发抗炎表达谱并调节炎性体应答。
现在参考图2，示出了用于鉴定和验证用于减弱解毒及免疫应答和/或治疗相关症状的抑制剂微生物群体或其组分的方法200。在方法200的第一步骤210中，筛选微生物组文库以鉴定感兴趣的微生物，该微生物组文库包含与约1,400种独特微生物和超过1000万种基因活性有关的信息。在方法200的第二步骤220中，将感兴趣的微生物引入超过50个现成的秀丽隐杆线虫模型(例如用于糖尿病、细胞凋亡、癌症等)的任何一个。在方法200的第三步骤230中，将个体微生物株从秀丽隐杆线虫模型分离并进行表征，并且在方法200的第四步骤240中，通过遗传筛选鉴定有治疗意义的株。然后使这些有治疗意义的株经受生长步骤250a(其中通过任何合适的方法使完全表征的微生物株生长)和/或代谢物鉴定步骤250b(其中鉴定并合成微生物代谢物，即潜在的活性治疗成分)的任一个或两个。然后可以在步骤260中在动物模型和/或患者组织中测试步骤250a中的微生物株和/或步骤250b中合成的微生物代谢物，以评估微生物株(作为益生菌)、微生物代谢物(作为益生元或后生元)或两者(作为合生素组合物)的治疗效果。然后，动物和/或患者组织测试步骤260的结果可以用于合理地选择株和/或化合物，用于配制步骤270中的精确益生元、益生菌、后生元和/或合生素组合物。
对于细胞保护应答，针对秀丽隐杆线虫将本公开的合生素组合物的益生菌组分中存在的微生物株进行了孤立筛选。为了预防由环境胁迫造成的损害，生物体发展了防御机制，最终导致保护应答。由于活性氧(ROS)的产生增加而在细胞中生成氧化应激，并且氧化应激与蛋白质和脂质损伤增加以及细胞功能降低有关。除了胃肠道不适(gastrointestinal distress)，ROS水平升高还与衰老、神经退行性变和糖尿病有关。Nrf2是氧化还原敏感的转录因子，其介导对细胞应激的适应性反应和针对内源性和环境应激源的保护。
Nrf2调节许多解毒酶(包含谷胱甘肽S转移酶(GST))的表达，解毒酶帮助系统对ROS和ROS诱导的细胞变化进行解毒。SKN-1是哺乳动物Nrf转录因子的秀丽隐杆线虫功能性直向同源物，并且SKN-1的激活诱导GST-4的表达，GST-4是谷胱甘肽S转移酶(GST)的同系物。通过评估与GFP蛋白挂钩的gst-4基因(gst-4::GFP)的表达来测定SKN-1的激活。无论何时将SKN-1激活，gst-4::GFP表达增加。在正常或未经治疗的动物中，在体壁肌肉和皮肤组织中观察到弱的gst-4::GFP表达。
现在参考图3A至4B，示出了本公开的合生素组合物的益生菌组分的微生物群体的组合处理的结果。如图3A和3B所示(代表两个单独的未处理的秀丽隐杆线虫重复)，观察到弱的gst-4::GFP。如图4A和4B所示(代表用本公开的微生物组合处理的两个单独的秀丽隐杆线虫重复)，gst-4::GFP明显极大地增强和增加。因此，不希望受任何特定理论的束缚，据信施用本公开的合生素组合物的益生菌组分的微生物群体可以通过上调Nrf2来改善宿主对细胞应激的适应性反应的介导和/或保护宿主免于内源性和环境应激源，从而可以有效改善、预防或治疗胃肠道不适(gastrointestinal distress)、衰老、神经退行性变和糖尿病的任何一种或多种。
实施例3
Nrf2上调对紧密连接蛋白的影响
Nrf2对于维持正常上皮屏障功能所需基因的表达很重要。已显示肠上皮细胞中Nrf2途径的上调可降低ROS水平，增强肠上皮细胞的存活，并增加紧密连接的完整性。紧密连接蛋白由密封蛋白(claudin)、闭合蛋白(occludin)、连接粘附分子(junctionaladhesion molecule)和支架蛋白闭锁小带(scaffold protein zonula occluden)所代表。在这些紧密连接蛋白中，密封蛋白是紧密连接的主要组分，负责上皮细胞的屏障和极性。这些分子可以调节胃肠道疾病，包括反流性食道炎、炎症性肠病、功能性胃肠道病症和癌症，并且其功能的破坏导致慢性炎症状况以及慢性或进行性疾病。
为了进一步探究本公开的合生素组合物影响紧密连接蛋白的机制，用在37℃、5％CO2气氛中生长的结肠癌细胞系HT-29/B6进行实验。使最初从HT-29细胞亚克隆的HT-29/B6细胞在含有2％稳定的L-谷氨酰胺并补充有10％(v/v)FCS的RPMI 1640培养基(Biochrom)中培养。获得这些细胞的六个隔离群，其中五个用根据本公开的合生素组合物处理，留下一个未处理作为对照。
针对密封蛋白-1的抗体从Zymed Laboratories Inc获得。对于蛋白质印迹(western blot)分析，将细胞裂解物通过SDS-PAGE分开，并通过半干转移来转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(PolyScreen,Perkin Elmer Life Sciences)上。在室温(RT)将膜在TST缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5,150mM NaCl,0.1％(v/v)Tween 20)中封闭1小时。在RT与浓度为1μg/ml的一抗在TST中温育1小时。用TST清洗三次后，将膜与辣根过氧化物酶缀合的二抗温育30分钟并随后清洗，该二抗在TST中以1:10,000稀释。通过将Biomax MR胶片(Kodak,Rochester,NY)暴露于LumiLight蛋白质印迹基质处理的膜来进行化学发光检测。使用BenchMarkTM预染蛋白条带(Invitrogen Life Technologies,Karlsruhe,Germany)测定蛋白质片段的分子质量。
现在参考图5，示出了蛋白质印迹结果；在图5中，标记为“1”的隔离群是对照(未处理的)隔离群，而标记为“2”至“6”的隔离群是用合生素组合物处理的隔离群。如图5所示，与未处理的细胞相比，在用上调Nrf2的本公开的合生素组合物的益生菌组分的微生物株处理肠上皮细胞后，观察到密封蛋白-1的表达增加。紧密连接蛋白表达增加的光密度值进一步加强了此结论，如下表1所示。
表1
因此，不希望受任何特定理论的束缚，据信施用本公开的合生素组合物可以通过上调Nrf2来改善上皮屏障功能，并且从而可以有效改善、预防或治疗任何一种或多种胃肠的疾病。
实施例4
有机酸产生
有机酸产生是微生物通过其调节肠道微生物群的代谢输出并与宿主细胞互动的重要特征。有机酸，特别是短链脂肪酸(SCFA)，是细菌发酵产物，在化学上由羧酸部分和小的烃链组成。在SCFA中，乙酸、丙酸和丁酸是研究最多的，在它们的化学结构中分别存在两个、三个和四个碳原子。这些代谢物在肠道中以高浓度存在，它们在此处被肠上皮细胞(IEC)吸收并用作氧化产生三磷酸腺苷(ATP)的底物。此外，这些分子通过调节IEC的不同方面和白细胞的发育、存活和功能，充当微生物群和免疫系统之间的纽带。此外，已显示SCFA通过保护上皮屏障完整性、促进B细胞IgA产生和调节T细胞分化来维持肠内稳态。
在具有96个平底孔(300μL)的聚丙烯微孔板上进行测试，并在来自Biotek,Synergy HT Multi-Mode的微孔板读取器中测定吸光度。使用的试剂是来自Acros-Organics的丁酸乙酯(99.0％)；来自Sigma-Aldrich的乙酸乙酯(99.5％)、丙酸甲酯(99.5％)和丙酮(99.5％)以及来自Vetec的无水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(99.0％)。对照是来自Neon的丁酸(99.5％)和乙酸(99.8％)以及来自Mallinckrodt的丙酸(99.0％)。溴百里酚蓝指示剂从Synth获得，并且PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)和PDB(马铃薯右旋糖肉汤)培养基从Acumed获得。
使用具有乳果糖作为唯一碳源和溴甲酚紫(0.5％)作为在酸性条件下变黄的酸性指示剂的肠道改良培养基，筛选存在于本公开的合生素组合物的益生菌组分中的微生物株用于产生有机酸。利用乳果糖产生有机酸/短链脂肪酸并反过来酸化培养基的隔离群被认为是“打击”。将一些株在液体培养基中测试，而其他株在固体培养基底物上测试。
用于测量有机酸产量的培养基具有根据表2的组成。
表2
通过观察加入微生物株后溴甲酚紫至黄色的颜色变化来监测有机酸的产生。图6A和6B分别显示了在液体培养基和固体培养基上测试的样品的代表性测定的结果。如图7所例示，可见光吸收读数提供了每个样品中产生的有机酸相对于对照的量的定量测量。
如图6A、6B和7所示的结果，施用本发明的合生素组合物可以增加胃肠道中有机酸的产生。因此，不希望受任何特定理论的束缚，据信此类施用可以保护上皮屏障完整性，促进B细胞IgA产生，和/或调节T细胞分化，并且从而可以有效地帮助维持肠内环境稳定。
实施例5
胃肠道存活能力
为了证实根据本公开的合生素组合物的益生菌组分的微生物群体的存活，使用如图7所例示的人肠微生物生态系统(SHIME)模拟器700测试根据图1A的包含合生素组合物的羟丙甲纤维素递送胶囊100。特别地，SHIME 700包含胃容器710、小肠容器720、升结肠容器730、横结肠容器740和降结肠容器750。胃容器710通过泵以及氮气的供应来接收并混合微生物群体701与胃酸702。将来自胃容器710的输出物泵送到小肠容器720，在此处其与通过泵接收的胰液711混合。将来自小肠容器720的输出物泵送到升结肠容器730，该升结肠容器730是pH受控的以模拟人升结肠。将来自升结肠容器730的输出物泵送至横结肠容器740，该横结肠容器740是pH受控的以模拟人横结肠。将来自横结肠容器740的输出物泵送至降结肠容器750，该降结肠容器750是pH受控的以模拟人降结肠。将来自降结肠容器750的输出物最终泵送至流出物罐751。因此，SHIME 700再现了代表人胃肠道的生理条件和生物条件(例如食物摄取、蠕动、消化酶、胰酸和胆汁酸、停留时间等)。
在整个测试过程中的各个时间点，使用活/死流式细胞术评估微生物的生存力。此外，胶囊的视觉评分允许观察它们的崩解行为和益生菌的可能的靶向递送：在每个取样点，进行胶囊的目视检查以研究它们在通过上GIT的不同区域期间的溶解行为，并且在每个取样点，胶囊得到1(胶囊完全完整)、2(胶囊损坏但几乎所有产品仍在胶囊中)、3(胶囊损坏并且所有产品释放)或4(胶囊破坏)的计分。在4个时间点进行细胞计数和目视检查：在将胶囊引入SHIME之前、在胃容器710中驻留结束时(引入后约1小时)、在小肠容器720中驻留的大约中点(引入后约2小时)，和在小肠容器720中驻留结束时(引入后大约3小时)。
现在参考图8，显示使用SHIME 700的递送胶囊100的测试结果；条形代表适当反应器中存活细菌计数的以10为底的对数，而条形上方的数字表示通过目视检查胶囊获得的定性1-4得分。“产品”、“STend”、“SImid”和“SIend”分别代表第一、第二、第三和第四时间点，即t＝0、1小时、2小时和3小时。
如图8所例示，在暴露于人胃和小肠的条件3小时后，胶囊100完全溶解和/或破坏，如定性目视检查得分4(胶囊被破坏)所示，但明显地递送了最大的活益生菌的释放——值得注意的是，在这三小时的时间段后保留了100％的微生物起始剂量(log-10.60存活细菌计数，与log-10.57存活细菌计数的起始剂量相比)。这些结果表明，本公开的递送胶囊有效地确保本公开的合生素组合物的全部益生菌组分穿透到小肠末端的生存力，并因此将全部微生物完整的释放到结肠中。
实施例6
针对生态失调的保护作用
此实施例通过评估移植的人微生物群中的恢复到基线以及总体微生物发酵和代谢活性，提供了对本公开的合生素组合物针对由两种常见的环境诱导的应激源(抗生素和酒精)引起的微生物生态失调的保护作用的深入了解。
越来越多的证据表明，饮食习惯(例如饮酒或使用抗生素)在调节人肠道微生物群的组成和代谢活动中发挥作用。在美国，医疗保健提供者每年开出超过2.7亿张抗生素处方。尽管抗生素已经改变了治疗危及生命的细菌感染的药物和方法，但广谱抗生素也通过改变组成和功能来诱导常驻肠道微生物群落的破坏。这种微生物群落动态的破坏已经在分类学水平上得到了证明，但在人中，对微生物代谢输出和宿主细胞的功能破坏程度仍未得到充分研究。
肠屏障中的多层防御(包含物理、体液和免疫组分)也可以受酒精影响。动物和人研究显示饮酒导致“漏的肠道”，即细菌和微生物化合物穿过肠基底膜迁移至门静脉和系统循环。此外，在饮酒的人以及小鼠模型中，饮酒导致肠细菌生态失调和小肠中细菌过度生长。
模仿结肠环境的SHIME反应器接种有来自健康供体的排泄物微生物群，以及微生物的营养源和粘蛋白包被的载体，以模拟粘液环境。所有测试条件均以一式三份进行评估。
通过添加两种不同抗微生物剂之一来诱导生态失调：抗生素(50μg/ml甲硝唑+30μg/ml环丙沙星)或酒精(0.3ml灰雁伏特加/ml结肠悬浮液，或30％(v/v)，对应于12％酒精浓度)。这些剂量估计为口服抗微生物剂输入的10％(通过假设90％吸收沿着上GIT进行)，并在初步研究中证明诱导发酵罐内微生物群的大量生态失调。
将一个完整的两个胶囊剂量(530亿AFU)的根据本公开的合生素组合物的益生菌组分添加到含有抗微生物剂诱导的生态失调微生物群落的反应器中。为了模拟“健康”对照，发酵罐接种有来自健康供体的排泄物微生物群，不添加抗生素或酒精。
在基线和温育6、24和48小时后，评估每个发酵罐中的微生物代谢和活性。评估的参数是(1)通过pH测量的总发酵活性的变化(酸化程度是细菌发酵代谢强度的量度)和(2)SCFA微生物代谢物(即乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)浓度的变化(SCFA产生的模式可用于评估微生物碳水化合物和蛋白质代谢)。
图9说明了在健康对照发酵罐(“对照”)、抗生素诱导的生态失调对照发酵罐(“ABdys_对照”)、抗生素诱导的生态失调处理发酵罐(“AB dys_处理”)、酒精诱导的生态失调对照发酵罐(“伏特加dys_对照”)和酒精诱导的生态失调处理发酵罐(“伏特加dys_处理”)中48小时内pH的变化。健康对照微生物群强烈地降低发酵罐的pH，表明微生物的高发酵代谢活性。生态失调对照温育(无合生素)导致比健康对照温育明显更少的pH降低，表明减少的微生物发酵代谢。将本公开的合生素组合物添加到微生物不平衡的群落导致比各自的对照温育更强的pH降低，表明合生素组合物对这些微生物群落中的发酵过程的刺激作用。观察到的pH降低甚至比健康对照温育更强。这些结果表明，在，合生素组合物积极促进两种不同的诱导生态失调的模型中的发酵过程，并因此刺激SCFA和/或乳酸盐的产生。
总SCFA水平反映测试成分的整体发酵。生态失调对照温育导致比健康对照温育显著更低的总SCFA浓度。合生素处理刺激两个生态失调群落中的总SCFA产生。这导致到温育结束时，相比于健康对照，合生素处理的生态失调发酵罐中的SCFA浓度相似或更高。
图10说明了在健康对照发酵罐(“对照”)、抗生素诱导的生态失调对照发酵罐(“ABdys_对照”)、抗生素诱导的生态失调处理发酵罐(“AB dys_处理”)、酒精诱导的生态失调对照发酵罐(“伏特加dys_对照”)和酒精诱导的生态失调处理发酵罐(“伏特加dys_处理”)中48小时内丁酸盐浓度的变化。丁酸盐是由梭状芽孢杆菌(Clostridium)属的成员产生的并且具有一系列的人健康益处。生态失调对照温育产生比健康对照温育显著更高的丁酸盐浓度。这主要是由于在6小时和24小时之间丁酸盐的较高产生所导致，并且似乎由以下事实解释：主要由乙酸盐和丙酸盐产生者组成的管腔微生物群受到生态失调剂的高度影响，从而导致当生态失调剂消失时丁酸盐产生者的优先生长。合生素处理主要在最后24小时期间增加两个生态失调群落的丁酸盐产生。因此，到温育结束时，合生素处理的群落导致比健康对照和未处理的生态失调温育两者都显著更高的丁酸盐浓度。
图11说明了在健康对照发酵罐(“对照”)、抗生素诱导的生态失调对照发酵罐(“ABdys_对照”)、抗生素诱导的生态失调处理发酵罐(“AB dys_处理”)、酒精诱导的生态失调对照发酵罐(“伏特加dys_对照”)和酒精诱导的生态失调处理发酵罐(“伏特加dys_处理”)中48小时内丙酸盐浓度的变化。丙酸盐由多种肠道微生物产生，最丰富的产生者包含拟杆菌属(Bacteroides)种和嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)。生态失调对照温育导致显著低于健康对照的丙酸盐浓度。合生素处理在前24小时内进一步降低丙酸盐产生，在最后24小时内增加两个生态失调群落中的丙酸盐产生。因此，到温育结束时，处理的群落导致比健康对照和生态失调对照更低的丙酸盐浓度。这似乎可以用乙酸和丁酸的高度特异性刺激来解释。
图12说明了在健康对照发酵罐(“对照”)、抗生素诱导的生态失调对照发酵罐(“ABdys_对照”)、抗生素诱导的生态失调处理发酵罐(“AB dys_处理”)、酒精诱导的生态失调对照发酵罐(“伏特加dys_对照”)和酒精诱导的生态失调处理发酵罐(“伏特加dys_处理”)中48小时内乙酸盐浓度的变化。乙酸盐是益生元纤维发酵过程中产生的主要代谢物。生态失调对照群落产生显著低于健康对照的乙酸盐浓度。合生素处理刺激两种生态失调群落中的乙酸产生。到研究结束时，合生素治疗的生态失调温育中乙酸盐水平显著高于治疗前，但仍低于健康对照。
图13说明了在健康对照发酵罐(“对照”)、抗生素诱导的生态失调对照发酵罐(“ABdys_对照”)、抗生素诱导的生态失调处理发酵罐(“AB dys_处理”)、酒精诱导的生态失调对照发酵罐(“伏特加dys_对照”)和酒精诱导的生态失调处理发酵罐(“伏特加dys_处理”)中48小时内总SCFA浓度的变化。此实施例的结果表明，在抗生素诱导和酒精诱导的生态失调后，本公开的合生素组合物与供体微生物群的温育刺激短链脂肪酸产生，最有趣的是丁酸盐产生。合生素处理的产丁酸效应如此强烈，以至于生态失调群落的丁酸盐产生大大超过健康对照群落的那些。
实施例7
比较性胃肠道存活能力
使用根据本公开的合生素组合物胶囊和17种市售的常规益生菌产品(列于下表3中)重复实施例5的规程。
表3
在胃温育的开始，除产品10和12外，每个反应器施用一个胶囊。除产品10和12外的所有产品的胶囊都安装在胶囊沉降器中。为了研究Yakult产品(产品10)，在胃期的开始将一个剂量(65mL)施用于浓缩的胃悬浮液，以获得与其他温育相同的起始体积。通过在胃温育的开始添加一个剂量(2.5g)来研究Duolac产品(产品12)。考虑到生物变异性，所有实验均以生物学一式三份进行。
根据本公开的羟丙甲纤维素合生素组合物胶囊100释放至少一部分的胶囊内容物(定性得分为2)，在胃期结束时产生平均2.8·109个存活细菌。然后，在小肠容器720中温育1.5小时后，胶囊100达到完全释放(定性得分为4)。如图14A和14B所例示，释放的细菌细胞的生存力接近并保持100％左右。在小肠阶段结束时，施用的益生菌的完全存活表明延长的小肠温育不会影响生存力。总之，这些结果表明，在所有重复中，个体细胞能够孤立地在聚生体中的共温育和在暴露于胃酸、蛋白酶、脂肪酶和胃肠转运期间遇到的胆盐的期间存活，导致在禁食条件下通过上胃肠道后，将平均4.0·1010个存活细菌细胞递送到结肠。
相反，如表4所示，与根据本公开的合生素组合物胶囊100相比，常规益生菌产品在小肠末端表现出显著减少的存活细菌细胞递送。“裸”产品(即不包含在胶囊内的产品)，如Yakult和Duolac导致最低的存活(分别为0.7％和0.3％)。由于胶囊内容物在肠腔中的快速释放，Swisse Daily Digestive Probiotic也导致0.8％的低存活。与约100％的根据本公开的合生素组合物胶囊100相比，表现最好的常规益生菌产品——MetagenicsUltraFlora、Jarrow和Blackmore益生菌——仅将约34％至57％的存活细菌细胞递送至结肠。
表4
从益生菌胶囊获得的结果说明观察的许多其他常规益生菌产品的缺点。在整个胃期，/>益生菌胶囊释放了相当一部分的密封的细菌。因此，在小肠容器720中温育1.5小时后，获得了胶囊的完全溶解(定性得分为4)。如图14C和14D所示，在通过上GIT后，检测到总数为log-8.87的存活细菌，表明与本公开的组合物相比，在小肠温育1.5小时后的约log-0.85的减少。不希望受任何特定理论的束缚，这种减少可能是由于早期胃释放，其中微生物株在小肠温育的开始遇到低环境pH和/或高浓度的微生物毒性胆盐。延长小肠温育不会进一步影响生存力。总体而言，在小肠阶段结束时仅递送16％的存活细菌，这对应于平均log-8.94个存活细菌细胞。因此，相比于常规/>益生菌产品，本公开的合生素组合物和羟丙甲纤维素递送胶囊100在小肠末端(即进入结肠时)提供显著改善的存活细菌细胞的递送。
实施例8
组胺代谢
组胺是人健康中的重要生物胺，因为它调节从肌肉收缩到免疫调节的各种过程。然而，过量的组胺可能造成组胺不耐受，这会对健康和整体福祉产生负面影响。虽然组胺不耐受通常归因于遗传性二胺氧化酶缺乏，但随着对食用酵食品条目或益生菌形式的活微生物的关注日益增加，越来越多的证据支持微生物参与。此实施例测试了这些化合物的体外产生。本公开的合生素组合物的益生菌组分中存在的微生物株以及各种对照株在有氧和无氧环境两者中生长，并且随后分析组胺和两种乳酸盐同等型的存在。
打开根据本公开的单个羟丙甲纤维素递送胶囊，并将内容物无菌地添加到含有45mL De Man、Rogosa和Sharpe(MRS)液体肉汤培养基(Sigma Aldrich)的50ml锥形管。已知本公开的合生素组合物的每个株在此培养基中生长。一起测试所有株的原因是为了模拟人食用后将会发生什么。将管涡旋30秒以确保胶囊的内容物溶解并均匀分散在整个培养基。然后将样品在有氧或无氧环境中在固定条件下37℃温育96小时，以评估在不同氧水平下组胺的产生。
将用作阳性对照的罗伊氏粘液乳杆菌ATCC 23272从冷冻原液中划线铺板到MRS琼脂上，并在37℃无氧地温育过夜。选择单个菌落并在无氧条件下在37℃在MRS肉汤中接种12小时。随后，将过夜培养物传代培养(1:225稀释)到新鲜的MRS肉汤培养基。然后在组胺分析之前，将培养物在37℃在无氧条件下温育96小时。
使用竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量每个样品中组胺的浓度(ng/mL)。将来自每个样品的1mL的等分试样在4℃以1000g离心20分钟。随后，按照制造商的说明(组胺ELISA试剂盒；E-EL-0032；Elabscience)，使用上清液来定量组胺。
使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)，按照制造商的说明来测定测试培养物上清液中的总蛋白质含量。简言之，将25μL的每种样品(从在先前乳酸盐定量步骤期间提取的相同上清液等分)添加到200μL的工作试剂中，完全地混合，然后在37℃于黑暗中在固定条件下温育30分钟。随后，通过使用BioTek PowerWave HT微孔板读取器(BioSPX)测量562nm处的光密度来测定总蛋白质的比色检测和定量。
本公开的合生素组合物的株在无氧条件下的生长产生了85.99±1.23ng/mL的组胺平均数(SD 85.76±1.42ng/mL)。还分析了未接种的媒介物(单独MRS培养基)，并发现含有86.44±0.92ng/mL的组胺，如图15中标记为“MRS”的条所示。相比于媒介物对照(ANOVA，P<0.05)，有氧地(图15中标记为“种子(有氧)”的条)或无氧地(图15标记为“种子(无氧)”的条)培养生长没有观察到组胺产生的可检测差异。如图15所示，与媒介物对照(ANOVA，p<0.05)相比，先前显示产生组胺的罗伊氏粘液乳杆菌ATCC 23272在其培养物上清液中显示出显著更高的组胺含量。
实施例9
比较性保存(Shelf)稳定性和水分活性
将本公开的益生菌组分并入羟丙甲纤维素递送胶囊100和液体甘油溶剂两者。每种的这些递送媒介物的样品在两种不同的温度和湿度条件保持10天：25±2℃、50％±5％相对湿度条件和35±2℃、75％±5％相对湿度条件。在0、1、3、5、7和10天测定每个样品中的活细胞数量，并在0、5和10天测定组合物的水分活性。低温/低湿度条件下的活细胞数量和水分活性分别如图16A和16B所示，高温/高湿度条件下的活细胞数量和水分活性分别如图17A和17B所示。
如图16A和17A所示，本公开的递送胶囊100优于液体甘油溶剂，其在至少约10天的期间内，在正常储存条件下维持相当大部分的原始细胞存活。此特征对于确保效力和符合标签要求至关重要。同样，如图16B和17B所示，本公开的递送胶囊100在至少约10天的期间内保持比液体甘油溶剂更低的水分活性。出于许多原因，特别是为了减轻益生菌组合物被来自环境的外来微生物污染，希望降低水分活性。
实施例10
加速稳定性测试
将包含本公开的合生素组合物的羟丙甲纤维素递送胶囊100包装在益生菌储存罐和益生菌储存袋两者中。将罐在49±2℃和50％±5％相对湿度保持10天，将袋在38±2℃和50％±5％相对湿度保持10天。在0、1、2、3、5、7和10天测量一个剂量(两个胶囊)中的活细胞数量；胶囊适于递送一个剂量(536亿AFU的益生菌组分)的合生素组合物。在图18A和18B中分别示出来自罐胶囊和袋胶囊的活细胞的数量(536亿AFU的细胞计数目标以虚线示出)。
如图18A和18B所示，本公开的递送胶囊100至少约10天的期间内在加速降解条件下有效维持足够部分的原始细胞存活，无论储存在罐中还是袋中。此特征对于确保效力和符合标签要求至关重要。
重复此规程，将罐和袋两者都保持在100°F；对于罐胶囊，在1、3和10天测量每剂量的活细胞数量，对于袋胶囊，在1、3、4和6天测量每剂量的活细胞数量。结果分别示于图19A和19B中，再次表明成功维持了适当的存活细胞计数。
实施例11
实时稳定性测试
除了将罐和袋保持在正常的室温和湿度而不是升高的温度以更接近地模拟长期储存条件外，重复实施例10的规程。在0、3、6、8和12个月测量每剂量(两个胶囊)的活细胞数量；罐和袋的结果分别在图20A和20B中给出(靶细胞计数再次用虚线表示)。这些结果再次说明，无论储存在罐中还是袋中，在典型的降解条件下，在至少约六个月的期间内，以及在罐中在至少约八个月的期间内，本公开的递送胶囊100都能有效地维持足够部分的原始细胞存活。
实施例12
乳酸盐代谢
在人中，乳酸盐是无氧代谢的常见副产物，以L-乳酸盐和D-乳酸盐两种同等型的形式存在。血液中高滴度的D-乳酸盐可以造成D-乳酸中毒，这是一种通过影响中枢神经系统而诱发口齿不清、共济失调和间或昏迷的状况。尽管人细胞产生的D-乳酸盐可以忽略不计，但肠道中一些细菌能够经由发酵过程以生物学相关的浓度产生此同等型。产生乳酸盐的细菌产生两种同等型的一种或两种，并分别被视为同型发酵或异型发酵。因此，产生每种同等型的细菌的比例将影响体内D-/L-乳酸盐的绝对和相对浓度。
打开根据本公开的各种羟丙甲纤维素递送胶囊，并将内容物无菌地添加到含有45mL MRS液体肉汤培养基的50mL锥形管中。将管涡旋30秒以均质化胶囊的内容物并确保在整个培养基的均匀分布。然后将样品在37℃在固定条件下无氧温育24小时。随后，将细菌细胞以5,000g离心10分钟并用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS；8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶解于1L水中；pH 7.35)清洗两次。清洗后，将细胞转移到含有45mL的Krebs-Ringer缓冲液(其促进代谢活性)的50mL锥形管，并在37℃进行有氧或无氧温育。在温育1小时和24小时后测量L-D-乳酸盐的产生。
使用市售的9个株的益生菌产品Renew Life Flora作为多株对照，以突出乳酸盐的产生；如先前段落中所描述的进行制备和培养。将两个单一株对照，鼠李糖乳酪杆菌GG和格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)ATCC 33323，从冷冻原液划线涂布到MRS琼脂上，并在固定条件下在37℃无氧温育过夜。选择单个克隆并在37℃在MRS液体培养基中接种12小时。随后，将过夜培养物接种(1:225稀释)到新鲜的MRS肉汤，并在37℃无氧温育24小时。将细菌细胞以5,000g离心10分钟，并用1X PBS清洗两次以及用Krebs-Ringer缓冲液清洗一次。清洗后，将细胞转移到含有45mL Krebs-Ringer缓冲液的50mL锥形管中，并在37℃在无氧或有氧条件下温育。在温育1小时和24小时后测量L-和D-乳酸盐的产生。
基于在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和乳酸盐脱氢酶(LDH)存在下乳酸盐转化为丙酮酸的标准酶测定用于定量样品中D-/L-乳酸盐的浓度。将指定温育时间的细胞培养物在室温下5,000g离心10分钟。随后，收集20mL的上清液等分试样并转移到平底96孔测定板，每个孔含有250mL缓冲溶液(0.4M甘氨酸、0.5M肼、25mL NAD(17mg/mL)和2.5mL的D-LDH或L-LDH)。加入培养物上清液后，将板在25℃温育1小时。温育后，使用BioTek PowerWave HT微孔板读取器(BioSPX)在340nm(OD340)处测量光密度。将值标准化为样品中的总蛋白。按实施例8中所描述的测定上清液中的总蛋白质含量。图21A、21B、21C和21D分别显示了1小时后L-乳酸盐、1小时后D-乳酸盐、24小时后L-乳酸盐和24小时后D-乳酸盐的产生，并且图22A和22B分别显示了1小时和24小时后L-乳酸盐和D-乳酸盐形式的比例。(在这些图中，“ns”表示统计学上不显著的差异，“*”表示在p<0.05水平上显著的差异，以及“***”表示在p<0.0001水平上显著的差异。)
温育1小时后，所有样品都显示产生比D-乳酸盐更多的L-乳酸盐的趋势。如图21A和21B所示，来自根据本公开的合生素培养物的上清液含有最大量的L-和D-乳酸盐两种同等型，平均数为0.59±0.01mM(SD 0.38±0.01mM)(图21A、21B)，以及Renew益生菌产品产生0.25±0.01mM的L-乳酸盐和0.10±0.01mM的D-乳酸盐(图19)。然而，两种产品的总乳酸盐的L:D比例相似。24小时后，除一个样品外的所有样品都有利于D-乳酸盐的产生而不是L同等型。同样，如图22B中所示，本公开的合生素组合物和Renew益生菌产品两者的总L:D比例相似。这表明本公开的合生素组合物中存在的益生元不影响乳酸盐代谢。先前已显示主要产生L-乳酸盐的鼠李糖乳酪杆菌GG，在两个时间点都持续产生更大量的L-乳酸盐，具有相似的L:D比率。
实施例13
维生素B12产生
在人饮食中，维生素B12的主要来源包含肝脏、牛肉、羊肉、鸡蛋和乳制品。维生素B12由肠道细菌合成并被人宿主吸收。维生素B12缺乏与神经管缺陷、心血管疾病、认知能力下降、抑郁症、骨质疏松症以及与糖尿病和衰老相关的病症恶化有关，由于饮食摄入不足和营养不良，维生素B12缺乏在世界各地普遍存在。已知罗伊氏粘液乳杆菌益生菌细菌产生维生素B12。
通过Illumina和纳米孔测序的组合，将基因组测序并组装成一个环形重叠群。根据制造商的方案(Oxford Nanopore Technologies)，使用具有SQK-LSK109试剂盒的9.4.1流动池，并具有以下改进：通过DNA混合物在20℃15分钟和65℃15分钟的温育来进行切口和突出端(DNA末端制备)的去除以产生平端DNA。使用Guppy v3.6在高精度模式下进行碱基调用。对于Illumina测序，使用DNA Nextera试剂盒在具有X2X75 PE中间输出的NextSeq550上运行。使用Flye汇编器(版本2.8.1-B1676)将长读读数据组装成连续的DNA序列(重叠群)。Medaka(版本1.0.3)用使用长读序列的组装序列进行错误校正。此外，使用Pilon(版本1.23)对重叠群进行进一步的错误校正。使用Pyani软件包(版本0.2.10)，使用平均核苷酸同一性(ANI)分析确认物种同一性。使用Prodigal(版本2.6.3)预测组装的重叠群的开放阅读框(ORF)。研究罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT和罗伊氏粘液乳杆菌SD-RD830-FR基因组中的维生素B12产生所必需的cbi、cob和hem基因簇的同系物的存在。
使用罗伊氏粘液乳杆菌DSM 20016(GenBank:CP000705.1)和罗伊氏粘液乳杆菌CRL 1098(GenBank:LYWI00000000.1)基因组进行比较。通过Roary pipeline进行株和泛基因组(pangenome)构建之间的系统发生的关系。通过使用Prokka(版本1.14.6)进行罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT、罗伊氏粘液乳杆菌SD-RD830-FR、罗伊氏粘液乳杆菌CRL 1098和罗伊氏粘液乳杆菌DSM 20016株的基因组注释。GFF3格式的注释程序集用于通过具有Roarypipeline的默认参数的Roary计算泛基因组构建。
使用高效液相色谱(HPLC)来评价本公开的益生菌组分中存在的罗伊氏粘液乳杆菌株的维生素B12的产生。以化学上界定的、不含维生素B12的测定培养基中对每个株进行四次连续的传代培养，允许株完全活化并在不含维生素B12的培养基中调节生长。分析的株以相同的百分比并在相同的培养条件下接种。随后，将培养液离心并在磷酸盐缓冲液中清洗，然后在氰化钾(形成氰钴维生素所需的氰基部分的供体)存在下在提取缓冲液中再悬浮。在冰浴中超声处理悬浮液以裂解细胞并释放维生素B12。为了评价裂解事件的效率，采用了Bradford测定，并且Bradford测定还用于获得各种株之间的比较参数。然后进行样品的热处理以允许的最终形成，然后离心。随后，使用Ascentis C-18柱(250x4.6mm，4μm)和360nm波长处的Uv-vis检测器将20μL的上清液注入HPLC。应用每分钟1.0ml洗脱体积，95:5的H2O-乙腈梯度。通过使用50至1000ng/mL范围内的不同浓度的氰钴维生素标准品产生校准曲线。
使从罗伊氏粘液乳杆菌株SD-LRE2-IT和SD-RD830-FR(两者均可以存在于根据本公开内容的合生素组合物中)分离的DNA经受组合的Illumina和纳米孔测序。两个序列数据集可以分别组装成一个2.3(GC％38.8，具有2424个编码序列区(CDS))和2.1Mbp(GC％38.9，具有2088个CDS)的环形重叠群，表明在这些株中不存在质粒。使用公众可获得的模式株罗伊氏粘液乳杆菌DSM 20016(2.0Mbp)的基因组序列的平均核苷酸分析(ANI)揭露株SD-LRE2-IT和SD-RD830-FR的98.8％和98.4％的同一性，证实了物种同一性。
基于罗伊氏粘液乳杆菌模式株、可以存在于根据本公开的组合物中的两种株(SD-LRE2-IT和SD-RD830-FR)以及维生素B12产生者罗伊氏粘液乳杆菌CRL1098构建了系统发生树。这揭露相比于模式株，株SD-RD830-FR和SD-LRE2-IT在分类学上与罗伊氏粘液乳杆菌CRL 1098更相关。罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT的基因组含有在相同的组织中从头合成维生素B12所需的全套基因，该组织较早在株CRL 1098中建立，即顺序为cobTSU、hemLBCA、sirC、cobQ、cbiOQNMLK、cysG/hemD、cbiJHGFTEDC、cobD1、cbiA和cobD2。相比之下，株SD-RD830-FR和DSM 20016似乎缺乏来自该簇的几乎所有基因。
为了证实基于生物信息学的罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT株的维生素B12产生能力的预测，采用HPLC方法。现在参考图23，对于罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT，维生素B12的氰钴维生素变体的色谱峰在13至14分钟的保留时间(这是基于采用纯化的氰钴维生素的校准曲线的预期保留时间)表现出清晰地且特异性地可检测。这些结果表明罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT能够产生生物学相关水平的维生素B12。
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Claims (26)

1.治疗人受试者中的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的合生素组合物，所述合生素组合物包含：
益生元组分，其包含至少一种可以由健康人肠道微生物群中存在的微生物株转化为生物活性代谢物的化合物；和
益生菌组分，其包含微生物株的聚生体，所述聚生体包含以下项的至少两种：
(i)一种或多种改善消化结果、胃肠道结果或肠道屏障功能的微生物株，其选自由短双歧杆菌SD-BR3-IT、植物乳植杆菌SD-LP1-IT、长双歧杆菌SD-BB536-JP、婴儿双歧杆菌SD-M63-JP、鼠李糖乳酪杆菌HRVD113-US、乳双歧杆菌HRVD524-US(Bl-04)、短双歧杆菌HRVD521-US、干酪乳酪杆菌HRVD300-US、长双歧杆菌HRVD90b-US、乳双歧杆菌SD150-BE、鼠李糖乳酪杆菌SD-GG-BE、罗伊氏粘液乳杆菌RD830-FR、卷曲乳杆菌SD-LCR01-IT、发酵粘液乳杆菌SD-LF8-IT、乳双歧杆菌SD-BS5-IT和鼠李糖乳酪杆菌SD-LR6-IT组成的组；
(ii)一种或多种改善皮肤病学结果的微生物株，其选自由唾液联合乳杆菌SD-LS1-IT、长双歧杆菌SD-CECT7347-SP、干酪乳酪杆菌SD-CECT9104-SP和乳双歧杆菌SD-CECT8145-SP组成的组；
(iii)一种或多种改善心血管结果的微生物株，其选自由植物乳植杆菌SD-LPLDL-UK和乳双歧杆菌SD-MB2409-IT组成的组；和
(iv)一种或多种合成微量营养素的微生物株，其选自由罗伊氏粘液乳杆菌SD-LRE2-IT和青春双歧杆菌SD-BA5-IT组成的组。
2.权利要求1的方法，其中所述疾病选自下组：肾上腺脑白质营养不良、AGE诱导的基因组损伤、亚历山大病、斑秃、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、心绞痛、关节炎、哮喘、巴洛同心圆性硬化、白塞病、大疱性类天疱疮、卡纳万病、包括左心室功能不全的心功能不全、中枢神经系统血管炎、腓骨肌萎缩症、儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化不良、慢性特发性周围神经病变、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、皮肤狼疮、皮炎(接触性、急性和慢性)、糖尿病性视网膜病变、移植物抗宿主病、肉芽肿、丙型肝炎病毒感染、单纯疱疹病毒感染、人免疫缺陷病毒感染、亨廷顿病、肠易激性病症、局部缺血、克拉伯病、扁平苔藓、黄斑变性、线粒体脑肌病、单肢肌萎缩、多发性硬化、心肌梗塞、神经退行性变伴脑铁沉积、视神经脊髓炎、神经系统结节病、NF-κB介导的疾病、视神经炎、副肿瘤综合征、帕金森病、佩梅病、天疱疮、原发性侧索硬化、进行性核上麻痹、银屑病、坏疽性脓皮病、再灌注损伤、色素性视网膜病、结节病、席尔德氏病、亚急性坏死性脊髓病、susac综合征、移植排斥、横贯性脊髓炎、肿瘤、溃疡性结肠炎和Zellweger综合征。
3.权利要求1的方法，其中所述疾病是胃肠病学或感染性疾病。
4.权利要求3的方法，其中所述疾病选自由肠易激综合征、COVID-19和便秘组成的组。
5.权利要求3的方法，其中所述疾病是酒精或抗生素诱导的受试者肠道微生物群的失调。
6.权利要求1所述的方法，其中所述合生素组合物作为可摄取制剂施用。
7.权利要求6的方法，其中所述可摄取制剂是可吞咽胶囊的形式。
8.权利要求7的方法，其中所述胶囊包含约1mg至约400mg，或约25mg至约375mg，或约50mg至约350mg，或约75mg至约325mg，或约100mg至约300mg，或约125mg至约275mg，或约150mg至约250mg，或约175mg至约225mg，或约200mg的量的所述益生元组分。
9.权利要求7的方法，其中所述胶囊包含约6250万AFU至约3125亿AFU、约6.25亿AFU至约2500亿AFU、约12.5亿AFU到约1250亿AFU、约62.5亿AFU至约625亿AFU、约125亿AFU至约500亿AFU、约187.5亿AFU至375亿，或约250亿AFU至约312.5亿AFU的量的所述微生物株的聚生体。
10.权利要求7的方法，其中每天施用至少一次所述合生素组合物的剂量，其中剂量包含两个可吞咽胶囊。
11.权利要求7的方法，其中所述胶囊进一步包含至少一种药学上可接受的媒介物。
12.权利要求7的方法，其中所述可吞咽胶囊包含：
内部胶囊，其含有所述益生菌组分；和
包围并封闭所述内部胶囊的外部胶囊，其包含所述益生元组分，
其中所述外部胶囊配置为在人胃和小肠的环境中3小时后基本上完全毁坏或溶解，
其中所述内部和外部胶囊配置为使得所述微生物株的聚生体中在人胃和小肠的环境中3小时后保持存活的细胞的比例为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％，并且
其中所述内部胶囊配置为在进入向其施用了所述可吞咽胶囊的人受试者的结肠中后，释放至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的所述微生物株的聚生体的存活细胞到结肠中
13.权利要求1所述的方法，其中所述合生素组合物每天施用至少一次，至少约7天。
14.权利要求1的方法，其中所述至少一种可以被健康人肠道微生物群中存在的微生物株转化为生物活性代谢物的化合物包括至少一种安石榴苷。
15.权利要求14的方法，其中所述至少一种安石榴苷衍生自或提取自至少一种石榴。
16.权利要求15的方法，其中所述益生元组分进一步包含从至少一种石榴衍生或提取的至少一种另外的化合物。
17.权利要求15的方法，其中所述益生元组分基本上由包含至少一种安石榴苷的多酚石榴衍生物或提取物组成。
18.权利要求14的方法，其中所述至少一种安石榴苷能够被至少一种已知居住于人胃肠道的细菌株代谢为尿石素。
19.权利要求18的方法，其中所述尿石素为尿石素-A。
20.权利要求14的方法，其中所述至少一种安石榴苷能够被所述益生菌组分的聚生体的至少一种微生物株代谢为尿石素。
21.权利要求20的方法，其中所述尿石素为尿石素-A。
22.权利要求1的方法，其中所述聚生体包含(i)至(iv)的至少三种。
23.权利要求22的方法，其中所述聚生体包含(i)至(iv)的所有四种。
24.权利要求1的方法，其中所述聚生体包含(i)的所述改善消化结果、胃肠结果或肠道屏障功能的微生物株的至少两种。
25.权利要求1的方法，其中所述聚生体包含(i)的所述改善消化结果、胃肠结果或肠道屏障功能的微生物株的所有、(ii)的所述改善皮肤病学结果的微生物株的所有、(iii)的所述改善心血管结果的株的所有和(iv)的所述合成微量营养素的株的所有。
26.权利要求25的方法，其中所述聚生体基本上由(i)的所述改善消化结果、胃肠结果或肠道屏障功能的微生物株的所有、(ii)的所述改善皮肤病学结果的微生物株的所有、(iii)的所述改善心血管结果的株的所有和(iv)的所述合成微量营养素的株的所有组成。
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