ES2870658T3 - Respuesta del microbioma a agentes - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de determinación de la tolerancia a una sustancia no calórica en un sujeto sano, que comprende: (a) determinar un distintivo de un microbioma intestinal en una muestra del sujeto sano que ha sido sometido a la sustancia no calórica; (b) comparar dicho distintivo de dicho microbioma intestinal del sujeto sano con al menos un distintivo de referencia de un microbioma intestinal patológico, en donde, cuando dicho distintivo del microbioma intestinal del sujeto sano es similar de manera estadísticamente significativa a dicho distintivo de referencia de dicho microbioma intestinal patológico, es indicativo de que el sujeto sano es intolerante a la sustancia no calórica; y (c) proporcionar una recomendación sobre la cantidad de dicha sustancia no calórica que puede ser tolerada por el sujeto sano.

Description

DESCRIPCIÓN

Respuesta del microbioma a agentes

La presente divulgación, en algunos aspectos de la misma, versa sobre el microbioma y, más en particular, pero no exclusivamente, sobre un procedimiento y un aparato para predecir la respuesta de un sujeto a uno o más agentes mediante el análisis del microbioma.

El ser humano tiene en el intestino un vasto ecosistema microbiano y diversos que ha coevolucionado con nuestra especie y es esencial para la salud humana. Los mamíferos poseen un “genoma extendido” de millones de genes microbianos ubicados en el intestino: el microbioma. Esta simbiosis multigenómica se expresa en los ámbitos proteómico y metabólico en el anfitrión y, por lo tanto, se ha propuesto que los seres humanos representan un “superorganismo” biológico sumamente complejo en el que parte de la responsabilidad de la regulación metabólica del anfitrión recae sobre los simbiontes microbianos. La interpretación moderna del microbioma intestinal se basa en una visión molecular del intestino, independiente de los cultivos, proporcionada por tecnologías de detección genómica de alto rendimiento. El microbioma intestinal también ha sido implicado directamente en la etiopatogenia de varios estados patológicos tan diversos como la obesidad, enfermedades circulatorias, enfermedades inflamatorias del intestino (EII) y el autismo. La microbiota intestinal también influye en el metabolismo y la toxicidad de los fármacos, en la biodisponibilidad calorífica de la dieta, en el acondicionamiento y la respuesta del sistema inmunitario y en la recuperación posquirúrgica. La implicación es que el análisis cuantitativo del microbioma intestinal y de sus actividades es esencial para la generación de futuras estrategias sanitarias personalizadas y que el microbioma intestinal representa un terreno fértil para el desarrollo de la próxima generación de dianas farmacológicas terapéuticas. También implica que el microbioma intestinal puede ser modulado directamente en beneficio del organismo anfitrión.

Por lo tanto, la microbiota intestinal desempeña un gran número de papeles importantes que definen la fisiología del anfitrión, tal como la maduración del sistema inmunitario, la respuesta intestinal a la lesión de las células epiteliales y el metabolismo xenobiótico y energético. En la mayoría de los mamíferos, el microbioma intestinal está dominado por cuatro filos bacterianos que desempeñan estas tareas: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria. La composición de los filotipos puede ser específica y estable en un individuo, y en un intervalo de 2 años un individuo conserva más del 60% de los filotipos del microbioma intestinal. Esto implica que cada anfitrión tiene una relación biológica única con su microbiota intestinal y, por definición, que esto influye en el riesgo de enfermedad de un individuo.

La técnica antecedente incluye Payne y otros, Obesity reviews (2012) 13, 799-809; y Cowen y otros, The FASEB Journal. 2013;27:224.

La solicitud de patente estadounidense n° 20100172874 versa sobre el microbioma intestinal como biomarcador y diana terapéutica para la recolección de energía, la pérdida o la ganancia de peso y/o la obesidad en un sujeto. En particular, proporciona procedimientos de alteración y monitorización de la abundancia relativa de Bacteroides y Firmicutes en el microbioma intestinal de un sujeto.

A. N. PAYNE Y OTROS versa sobre “Gut microbial adaptation to dietary consumption of fructose, artificial sweeteners and sugar alcohols: implications for host-microbe interactions contributing to obesity”, OBESITY REVIEWS, (20120611), vol. 13, n° 9, doi:10.1111/j.1467-789X.2012. 01009.x, ISSN 1467-7881, páginas 799 - 809.

THERESA E COWAN Y OTROS versa sobre “Artificial sweetener consumption differentially affects the gut microbiotahost metabolic interactions — Cowan y otros 27 (1): 224.7 — The Fa SEB Journal”, THE FASEB JOURNAL, (20130401), vol. 27, ISSN 0892-6638, página 224.7.

THOMPSON-CHAGOYAN O C Y OTROS versa sobre “Faecal microbiota and short-chain fatty acid levels in faeces from infants with cow's milk protein allergy”, INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND IMMUNOLOGY, KARGER AG, CH, (20110101), vol. 156, n° 3, ISSN 1018-2438, páginas 325 - 332.

CAO SEVERINE Y OTROS versa sobre “The role of commensal bacteria in the regulation of sensitization to food allergens”, FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, (20140501), vol. 588, n° 22, doi: 10.1016/J.FEBSLET.

2014.04.026, ISSN 0014-5793, páginas 4258-4266.

JOTHAM SUEZ Y OTROS versa sobre “Artificial sweeteners induce glucose intolerance by altering the gut microbiota”, NATURE, (20140917), doi:10.1038/nature13793, ISSN 0028-0836.

SUEZ J Y OTROS versa sobre “Non-caloric artificial sweeteners and the microbiome: Findings and challenges”, GUT MICROBES 20150401 TAYLOR AND FRANCIS INC. USA, (20150401), vol. 6, n° 2, doi: 10.1080/19490976.2015.1017700, ISSN 1949-0976, páginas 149 - 155.

MARIE S. A. PALMNÁS Y OTROS versa sobre “Low-Dose Aspartame Consumption Differentially Affects Gut Microbiota- Host Metabolic Interactions in the Diet-Induced Obese Rat”, PLOS ONE, (20141014), vol. 9, n° 10, doi: 10.1371/journal.pone.0109841, página e109841.

THAISS CHRISTOPH A Y OTROS versa sobre “Transkingdom Control of Microbiota Diurnal Oscillations Promotes Metabolic Homeostasis”, CELL, CELL PRESS, US, (20141016), vol. 159, n° 3, doi: 10.1016/J.CELL.2014.09.048, ISSN 0092-8674, páginas 514 - 529.

THAISS C A Y OTROS versa sobre “A day in the life of the meta-organism: Diurnal rhythms of the intestinal microbiome and its host”, GUT MICROBES 20150422 TAYLOR AND FRANCIS INC. USA, (20150422), vol. 6, n° 2, doi: 10.1080/19490976.2015.1016690, ISSN 1949-0976, páginas 137 - 142.

Sumario de la invención

La presente invención versa sobre un procedimiento de determinación de la tolerancia a una sustancia no calórica en un sujeto sano, que comprende:

(a) determinar un distintivo de un microbioma intestinal en una muestra del sujeto sano que ha sido sometido a la sustancia no calórica;

(b) comparar dicho distintivo de dicho microbioma intestinal del sujeto sano con al menos un distintivo de referencia de un microbioma intestinal patológico, en donde, cuando dicho distintivo del microbioma intestinal del sujeto sano es similar de manera estadísticamente significativa a dicho distintivo de referencia de dicho microbioma intestinal patológico, es indicativo de que el sujeto sano es intolerante a la sustancia no calórica; y

(c) proporcionar una recomendación sobre la cantidad de dicha sustancia no calórica que puede ser tolerada por el sujeto sano.

Preferiblemente, el procedimiento comprende, además, la comparación de dicho distintivo de dicho microbioma intestinal del sujeto sano con al menos un distintivo de referencia no patológico, en donde, cuando dicho distintivo de dicho microbioma intestinal del sujeto sano es diferente de manera estadísticamente significativa de dicho al menos un distintivo de referencia no patológico es indicativo de que el sujeto sano es intolerante a la sustancia no calórica. Preferiblemente, dicho microbioma intestinal patológico deriva de un sujeto sano que es intolerante a la sustancia no calórica.

Preferiblemente, dicho microbioma intestinal no patológico deriva de un sujeto sano que es tolerante a la sustancia no calórica.

Preferiblemente, el sujeto sano ha sido sometido a la sustancia no calórica al menos un mes antes de dicha determinación.

Preferiblemente, el sujeto sano ha sido sometido a la sustancia no calórica al menos una vez al día.

Preferiblemente, el sujeto sano ha sido sometido a la sustancia no calórica durante al menos una semana.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Se describen aquí algunos aspectos de la divulgación, únicamente a título de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se recalca que los detalles mostrados son a título de ejemplo y tienen el propósito de una exposición ilustrativa de aspectos de la divulgación. En este sentido, la descripción, tomada con los dibujos, pone de manifiesto para los expertos en la técnica cómo pueden ponerse en práctica aspectos de la divulgación.

En los dibujos:

Figuras 1A-K. La microbiota intestinal ejerce oscilaciones diurnas.

(A) Esquema que muestra las horas de muestreo de la microbiota en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad. (B) UTO que muestran las oscilaciones diurnas. Se muestran las UTO con p<1 y se indican las amplitudes de las fluctuaciones. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 10 ratones individuales en cada hora Zeitgeber ('temporizador' en alemán, abreviada ZT, por sus siglas en alemán/inglés).

(C) Composición taxonómica de la microbiota fecal en el curso de 48 horas.

(D) Representación de histograma de géneros bacterianos que oscilan con p < 0,05, ciclo JTK.

(E, F) Ejemplos representativos de oscilaciones diurnas en la abundancia de miembros de la microbiota; n = 10 ratones en cada ZT.

(G, H) Histograma que muestra la distribución de la desviación estándar en la presencia de genes flagelares (G) y genes de degradación de glicosaminoglicanos (GAG) frente a otros genes, normalizado al número de lecturas correlacionadas con cada gen.

(I) Vías KEGG que muestran oscilaciones diurnas. Solo se muestran las vías con una cobertura génica >0,2 y p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n= 2 ratones individuales en cada ZT.

(J) Ejemplos representativos de oscilaciones diurnas antifásicas en la abundancia de vías KEGG funcionales; n = 2 ratones individuales en cada ZT.

(K) Representación de histograma de las 16 vías KEGG más significativamente oscilantes, identificadas por el ciclo JTK.

Los resultados mostrados son representativos de cuatro experimentos (1A-F) o de dos experimentos (1G-K).

Figuras 2A-H. Oscilaciones diurnas de la microbiota en composición y función relacionadas con las Figuras 1A-K. (A) Esquema que muestra las horas de muestreo de la microbiota cada cuatro horas en el curso de cuatro ciclos de luz y oscuridad.

(B) UTO que muestran las oscilaciones diurnas. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 8 ratones individuales en cada hora Zeitgeber (ZT).

(C-D) Ejemplos representativos de oscilaciones diurnas en la abundancia de miembros de la microbiota; n = 8 ratones en cada ZT.

(E-G) Ejemplos representativos de oscilaciones diurnas en la abundancia de vías KEGG funcionales; n = 2 ratones individuales en cada ZT.

(H) Representación de la vía de los genes implicados en el ensamblaje flagelar, en la quimiotaxia bacteriana y en la secreción de tipo III. Los colores indican la abundancia diferencial de genes en diferentes ZT.

Figuras 3A-H. Pérdida de ritmos diurnos de la microbiota en ratones deficientes en Per1/2.

(A) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en ratones de la forma natural y deficientes en Per1/2. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 10 ratones individuales en cada grupo en cada hora Zeitgeber (ZT).

(B) Ejemplo representativo de oscilaciones diurnas en ratones de la forma natural, que están ausentes en ratones deficientes en Per1/2; n = 10 ratones en cada ZT.

(C) Representación de histograma de géneros bacterianos que oscilan con p<0,05, ciclo JTK, en ratones de la forma natural en comparación con ratones deficientes en Per1/2; n = 10 ratones en cada ZT.

(D) Representación de histograma de fluctuaciones diurnas de vías KEGG en microbiota de ratones de la forma natural, que están ausentes en microbiota de ratones deficientes en Per1/2; se llevó a cabo un análisis de metagenómica en un total de tres ratones en cada ZT y solo se compararon las vías con una cobertura >0,2.

(E) Vías KEGG que muestran oscilaciones diurnas en ratones de la forma natural en comparación con los deficientes en Per1/2. Solo se muestran las vías con una cobertura génica >0,2 y p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(F-H) Variaciones diurnas en genes pertenecientes a las vías funcionales indicadas en ratones de la forma natural y deficientes en Per1/2. Se llevó a cabo un análisis de metagenómica en un total de tres ratones en cada ZT.

Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos.

Figuras 4A-L. Disbiosis en ratones deficientes en Per1/2, relacionada con las Figuras 3A-H.

(A-C) Variaciones diurnas en genes pertenecientes a las vías funcionales indicadas en ratones de la forma natural y deficientes en Per1/2. Se llevó a cabo un análisis de metagenómica en un total de tres ratones en cada ZT.

(D, E) Alfa-diversidad (D) y beta-diversidad (E) de la microbiota fecal de ratones de la forma natural y deficientes en Per1/2. Las muestras por genotipo son de diferentes momentos del día; n = 90 en cada grupo.

(F) Abundancia diferencial de las UTO entre la microbiota fecal de ratones de la forma natural y deficientes en Per1/2; n = 90 muestras.

(G, H) Alfa-diversidad (G) y beta-diversidad (H) de la microbiota fecal de ratones de la forma natural y deficientes en ASC.

(I) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en ratones deficientes en ASC. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 8 ratones individuales en cada ZT.

(J) Ejemplo representativo de oscilaciones diurnas en la microbiota de ratones deficientes en ASC; n = 8 ratones individuales en cada ZT.

(K, L) Patrón de alimentación diurna en ratones de la forma natural (K) y deficientes en Per1/2 (L). Los ratones fueron alimentados ad libitum y se les hizo un seguimiento durante tres ciclos de luz y oscuridad. Los ejemplos mostrados son representativos de 8 ratones individuales.

Figuras 5A-L. Los ritmos de alimentación dirigen las oscilaciones diurnas de la microbiota.

(A) Esquema que muestra el protocolo temporizado de alimentación.

(B) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en ratones de la forma natural en diferentes horarios de alimentación. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 10 ratones individuales en cada ZT.

(C-F) Ejemplos representativos de cambio de fase en las oscilaciones bacterianas entre ratones de la forma natural alimentados en la fase de oscuridad y alimentados en la fase con luz; n= 10 ratones en cada ZT.

(G) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en ratones deficientes en Per1/2 en diferentes horarios de alimentación. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 10 ratones individuales en cada ZT.

(H-I) Ejemplos representativos de cambio de fase en las oscilaciones bacterianas entre ratones deficientes en Per1/2 alimentados en la fase de oscuridad y alimentados en la fase con luz; n= 10 ratones en cada ZT.

(J) Cuantificación de las UTO oscilantes con p<0,05, ciclo JTK, en ratones de la forma natural y deficientes en Per1/2 en diferentes horarios de alimentación.

(K) Esquema que muestra el trasplante fecal de microbiota de ratones deficientes en Per1/2 (microbiota arrítmica) a receptores libres de gérmenes (ganancia de ritmicidad).

(L) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en microbiota de ratones deficientes en Per1/2 antes y después del trasplante a ratones libres de gérmenes. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 10 ratones individuales en cada ZT en cada grupo. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

Figuras 6A-H. Impacto de los ritmos de alimentación en las oscilaciones diurna de la microbiota, relacionado con las Figuras 5A-L.

(A, B) Horas de alimentación en ratones alimentados en la fase de oscuridad (A) y alimentados en la fase con luz (B). Los gráficos mostrados son representativos de cuatro ratones individuales medidos.

(C) La expresión colónica de Per2 en ratones alimentados en la fase de oscuridad o alimentados en la fase con luz durante la fase de oscuridad y la fase con luz muestra la reprogramación del reloj intestinal por los ritmos de alimentación; n = 10 ratones en cada grupo. ** p < 0,01, *** p < 0,001.

(D, E) Representación de histograma de géneros bacterianos que oscilan con p<0,05, ciclo JTK, en ratones de la forma natural (D) y ratones deficientes en Per1/2 (E) alimentados únicamente durante la fase de oscuridad o la fase con luz; n = 10 ratones en cada ZT. Se destacan los cambios de fase en las UTO cíclicas.

(F-H) Actividad física (F, H) y VCO2 en el curso de tres ciclos de luz y oscuridad en ratones libres de gérmenes trasplantados con microbiota de ratones deficientes en Per1/2 (F, G) o de ratones de la forma natural (H). Las mediciones se realizaron una semana después del trasplante. El gráfico es representativo de ocho ratones individuales medidos.

Figuras 7A-H. El desfase horario lleva a la pérdida de las oscilaciones diurnas de la microbiota y a la disbiosis.

(A) Esquema que muestra la inducción de desfase horario mediante un cambio horario constante de 8 horas. Cada tres días, los ratones eran sometidos a un cambio de adelanto o retraso de 8 horas. Los controles permanecieron en las condiciones de un ciclo constante de luz y oscuridad.

(B) Ingesta de alimentos de ratones de control y con desfase horario durante la fase de oscuridad, la fase con luz y combinadas. ** p<0,01, n.s. no significativa.

(C) Representación de mapa térmico de géneros bacterianos que oscilan con p<0,05, ciclo JTK, en ratones de control en comparación con ratones con desfase horario; n=5 ratones en cada momento.

(D) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en ratones de control y con desfase horario. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n=5 ratones individuales en cada momento.

(E) Ejemplo representativo de oscilaciones bacterianas en ratones de la forma natural que se pierden con el desfase horario; n=5 ratones en cada momento.

(F) Beta-diversidad de comunidades bacterianas intestinales en ratones de control y con desfase horario después de cuatro semanas de cambios horarios. Se agrupan muestras de diferentes horas del día.

(G) Beta-diversidad de comunidades bacterianas intestinales en ratones de control y con desfase horario después de cuatro meses de cambios horarios.

(H) Representación de mapa térmico de cambios en la composición microbiana inducidos por el desfase horario. Figuras 8A-F Desalineación circadiana durante el desfase horario, relacionada con las Figuras 7A-H.

(A, B) Actividad física en el curso de tres ciclos de luz y oscuridad en ratones de control y con desfase horario. La actividad rítmica de un ratón de control (A) se convierte en un patrón aleatorio mediante inducción de desfase horario (B) . Los resultados mostrados son representativos de 16 ratones individuales medidos.

(C) Variaciones diurnas en la ingesta de alimentos de ratones de control y con desfase horario en el curso de un ciclo de luz y oscuridad. Los resultados mostrados son representativos de 16 ratones individuales medidos.

(D-F) Los patrones de expresión rítmico de Bmal (D), Rev-erba (E) y RORYt (F) en el colon se alteran con la inducción del desfase horario; n = 4-5 ratones en cada ZT.

Figuras 9A-K. La disbiosis inducidas por desfase horario promueve trastornos metabólicos.

(A-E) Los ratones fueron sometidos a desfase horario inducido por cambios horarios y fueron alimentados con una dieta rica en grasa. La mitad de los ratones fueron tratados con antibióticos; n = 10 ratones en cada grupo.

(A) Ganancia de peso en 9 semanas de alimentación rica en grasa. ** p<0,01, *** p<0,001.

(B) Prueba de tolerancia a la glucosa oral realizada 8 semanas después del inicio del desfase horario. * p<0,05, ** p<0,01.

(C) Niveles de glucosa en ayunas de ratones de control y con desfase horario, con o sin tratamiento con Abx, después de 8 semanas de desfase horario. * p<0,05.

(D, E) Masa corporal grasa (D) y magra (E) de ratones de control y con desfase horario, con o sin tratamiento con Abx, después de 8 semanas de desfase horario. ** p<0,01.

(F) Peso y contenido de grasa de ratones de control y con desfase horario después de 4 semanas de cambios horarios en el grupo con desfase horario. * p<0,05.

(G-I) La microbiota de ratones de control o con desfase horario se trasplantó a ratones libres de gérmenes (GF, por sus siglas en inglés); n = 4-6 ratones en cada grupo.

(G) Ganancia de peso en 4 semanas. * p<0,05

(H) Prueba de tolerancia a la glucosa oral realizada el día 3 tras la transferencia fecal. * p<0,05

(I) Masa corporal grasa y magra en ratones receptores un mes tras la transferencia fecal. ** p<0,01

(J) Imágenes de RM ponderadas por T2 de ratones de control y con desfase horario después de 8 semanas de desfase horario. Arriba, imágenes coronales; abajo, imágenes axiales.

(K) Imágenes de RM ponderadas por T2 de ratones receptores un mes tras la transferencia fecal. Arriba, imágenes coronales; abajo, imágenes axiales.

Los resultados mostrados son representativos de tres (9A-E) y dos (9G-I) experimentos independientes.

Figuras 10A-L. Efecto de una dieta rica en grasa y del tratamiento antibiótico en el comportamiento diurno y en las oscilaciones de la microbiota, relacionado con las Figuras 9A-K.

(A-D) Actividad física en el curso de 2,5 ciclos de luz y oscuridad en ratones de control (A, B) y con desfase horario (C, D) alimentados con una dieta rica en grasa. Los (B) y los (D) están tratados, además, con antibióticos. Los resultados mostrados son representativos de 32 ratones individuales medidos.

(E, F) Variaciones diurnas en la ingesta de alimentos por parte de ratones de control y con desfase horario en el curso de un ciclo de luz y oscuridad. Todos los ratones estaban alimentados con una dieta rica en grasa. En (F), los ratones estaban tratados con antibióticos.

(G) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en ratones de la forma natural después de una semana con una dieta rica en grasa. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 10 ratones individuales en cada hora Zeitgeber (ZT).

(H, I) Ejemplos representativos de oscilaciones diurnas en la abundancia de miembros de la microbiota en ratones con una dieta rica en grasa; n = 10 ratones en cada ZT.

(J) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en ratones de la forma natural después de una semana de tratamiento con antibióticos. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK; n = 10 ratones individuales en cada hora Zeitgeber (ZT).

(K, L) Ejemplos representativos de oscilaciones diurnas en la abundancia de miembros de la microbiota en ratones tratados con antibióticos; n = 10 ratones en cada ZT.

Figuras 11A-I. La microbiota humana experimenta oscilaciones diurnas en su composición y su función.

(A) Esquema que muestra las horas de muestreo de la microbiota humana de dos sujetos en el curso de múltiples ciclos de luz y oscuridad.

(B, C) UTO que muestran las oscilaciones diurnas en dos sujetos humanos. Solo se muestran las UTO con p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(D) Representación de histograma de géneros bacterianos procedentes de un sujeto humano que oscilan con p < 0,05, ciclo JTK.

(E) Ejemplo representativo de oscilaciones bacterianas diurnas en cinco días consecutivos.

(F) Vías KEGG que muestran oscilaciones diurnas. Solo se muestran las vías con una cobertura génica >0,2 y p<1. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(G, H) Ejemplos de picos de abundancia antifásicos en vías KEGG procedente de la microbiota humana. Se agrupan datos de ZT de cinco días consecutivos.

(I) Representación de histograma de oscilaciones en vías KEGG.

Figuras 12A-D. Oscilaciones diurnas en la composición y la función de la microbiota humana, relacionadas con las Figuras 11A-I.

(A, B) Ejemplos representativos de fluctuaciones diurnas en la abundancia relativa de miembros de la microbiota comensal procedente de un sujeto humano en el curso de cinco días consecutivos.

(C) Oscilaciones en la composición taxonómica de la microbiota fecal humana en el curso de cinco días.

(D) Ejemplos representativos de fluctuaciones diurnas en vías funcionales de la microbiota humana en el curso de cinco días consecutivos.

Figuras 13A-F. El desfase horario en los seres humanos está asociado con la disbiosis, que ocasiona trastornos metabólicos.

(A) Esquema que muestra las horas de muestreo de microbiota de sujetos antes, durante y después del desfase horario inducido por un cambio horario de 8-10 horas.

(B) Composición en el ámbito de filo de microbiota de dos sujetos humanos correspondiente a las horas de muestreo mostradas en (A).

(C) Esquema del trasplante fecal de sujetos humanos antes, durante y después del desfase horario a ratones libres de gérmenes.

(D) Ganancia de peso de los ratones receptores en tres semanas; n = 5 ratones en cada grupo. ** p<0,01

(E) Prueba de tolerancia a la glucosa de ratones receptores realizada el día 3 tras la transferencia fecal; n = 5 ratones en cada grupo. * p<0,05

(F) Imágenes de RM ponderadas por T2 de ratones receptores realizadas tres semanas después de la transferencia fecal. Arriba, imágenes coronales; abajo, imágenes axiales.

Los resultados mostrados son representativos de 2 experimentos independientes (C-F).

Figuras 14A-B. Esquemas de las oscilaciones diurnas en la composición y la función de la microbiota relacionados con las Figuras 13A-F.

(A) Esquema que muestra unidades taxonómicas “distintivas” y vías funcionales con abundancia preferente en ciertas horas durante un ciclo de luz y oscuridad de 24 horas.

(B) Esquema que representa la actividad diurna de la vía de la microbiota en ratones nocturnos de la forma natural, la pérdida de oscilaciones en ratones con alteración horaria y fluctuaciones invertidas en fase en seres humanos. Figuras 15A-E. Esquema experimental. Se trató a ratones macho C57B1/6 de 10 semanas de edad con los siguientes regímenes dietéticos.

(A) Beber edulcorantes artificiales no calóricos (NAS [por sus siglas en inglés]; sacarina, sucralosa y aspartamo) disponibles comercialmente y alimentarse con una dieta de comida normal (NC, por sus siglas en inglés).

(B) Beber sacarina o glucosa disponibles comercialmente como control y alimentarse con una dieta rica en grasa (HFD, por sus siglas en inglés).

(C) Beber sacarina pura o agua y alimentarse con HFD.

(D) Como en III, pero con ratones Swiss-Webster exogámicos. Se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa, análisis del microbioma y suplementación de agua de beber con antibióticos en los momentos indicados.

(E) Esquema de experimentos de trasplante fecal.

Figuras 16A-H. Los edulcorantes artificiales inducen la intolerancia a la glucosa en ratones GF.

(A-B) OGTT [pruebas de tolerancia a la glucosa oral, por sus siglas en inglés] y AUC [área bajo la curva, por sus siglas en inglés] en ratones alimentados con NC que bebían NAS comerciales durante 11 semanas antes (N=20) y después de antibióticos: ciprofloxacina y metronidazol, (“Antibióticos A”, N=10); o vancomicina (“Antibióticos B”, N=5).

(C) OGTT en ratones alimentados con HFD y sacarina (N=10) o glucosa (N=9) comerciales.

(D) OGTT de ratones alimentados con HFD que bebían 0,1 mgrnf1 de sacarina o agua durante 5 semanas (N=20), seguidas por los “Antibióticos A” (N=10).

(E-F) OGTT de ratones GF 6 días tras el trasplante de microbiota de (E) ratones alimentados con sacarina (N=12) y glucosa (N=11) comerciales; o (F) donadores alimentados con sacarina pura (N=16) y agua (N=16). Los símbolos (GTT) o las líneas horizontales (AUC) representan la media; las barras de error, el S.E.M. [error estándar de la media, por sus siglas en inglés]. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, GTT: ANOVA y Bonferroni, AUC: ANOVA y análisis post hoc de Tukey. Cada experimento se repitió dos veces.

(G) Análisis de secuencias de ARNr 16s de: ratones consumidores de sacarina al inicio del estudio (W0 [semana 0, por su inicial en inglés], hexágonos negros) y W11 (triángulos azules); controles de agua (círculos negros para W11 y W0); glucosa (cuadrados negros para W11 y W0); o sacarosa (triángulos negros para W11 y W0). N=5 en cada grupo. (H) PCoA de taxones en receptores GF según la identidad del donador en 1E.

Figuras 17A-F. Los edulcorantes artificiales inducen intolerancia a la glucosa.

(A) AUC de ratones alimentados con HFD y sacarina (N=10) o glucosa (N=9) comerciales.

(B) AUC de ratones alimentados con HFD que bebían 0,1 mgml'1 de sacarina o agua durante 5 semanas (N=20), seguidas por los “Antibióticos A” (N=10).

(C-D) OGTT y AUC de ratones Swiss-Webster exogámicos (N=5) alimentados con HFD que bebían sacarina pura o agua.

(E-F) Se transfirieron muestras fecales desde ratones donadores (N=10) que bebían sacarina, glucosa puras disponibles comercialmente o controles de agua a ratones macho receptores Swiss-Webster de 8 semanas de edad libres de gérmenes. AUC de ratones GF 6 días tras el trasplante de microbiota desde (E) ratones alimentados con sacarina (N=12) y con glucosa (N=11) comerciales; o (F) donadores alimentados con sacarina pura (N=16) y con agua (N=16). Los símbolos (GTT) o las líneas horizontales (AUC) representan la media; las barras de error, el S.E.M. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ANOVA y análisis post hoc de Tukey (GTT) o prueba t de Student de dos lados desapareados (AUC). Cada experimento se repitió dos veces.

Figuras 18A-L. Caracterización metabólica de ratones que consumen formulaciones de NAS comerciales. Se dio a ratones C57B1/6 de 10 semanas de edad (N = 4) edulcorantes artificiales (sacarina, sucralosa y aspartamo) disponibles comercialmente o controles (agua, sacarosa o glucosa, N = 4 en cada grupo) y se los alimentó con dieta de NC. Después de 11 semanas, se caracterizaron los parámetros metabólicos utilizando el sistema de jaulas metabólicas PhenoMaster durante 80 horas. Las fases de luz y oscuridad se indican mediante rectángulos blancos y negros en el eje X, respectivamente, y barras grises para la fase de oscuridad.

(A) Ingesta de líquidos.

(B) AUC de A.

(C) Consumo de comida.

(D) AUC de C.

(E) Ingesta calórica total por la comida y el líquido durante 72 horas (véanse los procedimientos de cálculo).

(F) Tasa de intercambio respiratorio (RER, por sus siglas en inglés).

(G) AUC de F.

(H) Actividad física como distancia.

(I) AUC de H.

(J) Gasto de energía.

(K) Cambio de masa en comparación con el peso original de los ratones durante 15 semanas (N=10).

(L) AUC de K.

La caracterización de las jaulas metabólicas y la monitorización de la ganancia de peso se repitieron dos veces. Figuras 19A-I. Caracterización metabólica de ratones que consumen HFD y sacarina pura o agua. se alimentó con HFD a ratones C57B1/6 de 10 semanas de edad (N=8), con o sin complementar el agua de beber con 0,1mgml'1 de sacarina pura. Después de 5 semanas, se caracterizaron los parámetros metabólicos utilizando el sistema de jaulas metabólicas PhenoMaster durante 70 horas. Las fases de luz y oscuridad se indican mediante rectángulos blancos y negros en el eje X, respectivamente, y barras grises para la fase de oscuridad.

(A) Ingesta de líquidos.

(B) AUC de A.

(C) Consumo de comida.

(D) AUC de C.

(E) Tasa de intercambio respiratorio (RER).

(F) AUC de F.

(G) Actividad física como distancia.

(H) AUC de H.

(I) Gasto de energía.

La caracterización de las jaulas metabólicas se repitió dos veces.

Figuras 20A-C. Los ratones intolerantes a la glucosa que beben NAS presentan niveles y tolerancia normales a la insulina.

(A) Insulina plasmática en ayunas medida después de 11 semanas con NAS comerciales o controles (N=10).

(B) Igual que A, pero medida después de 5 semanas de HFD y sacarina pura o agua (N=20).

(C) Prueba de tolerancia a la insulina efectuada después de 12 semanas de NAS comercial o controles (N=10).

Todas las mediciones se llevaron a cabo en dos cohortes independientes.

Figura 21. Disbiosis en ratones consumidores de sacarina y receptores GF. Mapa térmico que representa las diferencias taxonómicas en el factor multiplicativo de escala logarítmica W11 entre los consumidores de sacarina comercial y agua o de edulcorante calórico (N=5 en cada grupo). Columna de la derecha: diferencias taxonómicas en ratones g F tras el trasplante fecal a partir de ratones consumidores de sacarina comercial (receptores N=15) o de glucosa (N=13). Se indican el número de UTO (GreenGenes) el nivel taxonómico más bajo identificado.

Figuras 22A-G. Caracterización funcional de la microbiota modulada por sacarina.

(A) Alteraciones de especie en ratones que consumían sacarina comercial, agua o glucosa durante 11 semanas (N=4) mostradas por secuenciación aleatoria.

(B) Correlaciones por pares entre cambios en 115 vías KEGG en ratones que recibían diferentes tratamientos.

(C-D) Cambio multiplicativo en la abundancia relativa de genes de las vías de degradación del (C) glicosaminoglicano o de (D) otros glicanos.

(E) Mayor degradación de glicanos atribuida a cinco taxones en el marco de la sacarina comercial.

(F-G) Niveles de acetato y propionato fecales en la W 11 en ratones que bebían sacarina o glucosa comerciales (N=5). Las líneas horizontales representan la media; las barras de error, el S.E.M. **, p<0,01 por prueba t de Student de dos lados.

Se realizaron mediciones de SCFA [ácidos grasos de cadena corta, por sus siglas en inglés] en dos cohortes independientes.

Figuras 23A-D. Análisis funcional de la microbiota modulada por sacarina.

(A-B) Los cambios en la abundancia bacteriana relativa se producen en todo en genoma bacteriano. Se muestran los cambios en la cobertura de secuenciación a lo largo de regiones genómicas de 10.000 pb de (A) Bacteroides vulgatus, (B) Akkermansia muciniphila, con clases ordenadas por la abundancia en la semana 0 de ratones tratados con sacarina.

(C) Cambio multiplicativo en la abundancia relativa de módulos pertenecientes a sistemas de fosfotransferasa (PTS, por sus siglas en inglés) entre la semana 11 y la semana 0 en ratones que bebían sacarina, glucosa comerciales o agua. Fuente del diagrama de módulos: base de datos KEGG.

(D) Vías KEGG enriquecidas (cambio multiplicativo > 1,38 como tope) en ratones que consumían HFD y sacarina pura en contraposición con agua en comparación con el cambio multiplicativo en la abundancia relativa de las mismas vías en ratones que consumían sacarina comercial (semana 11/semana 0).

Figuras 24A-C. La sacarina modula directamente la microbiota.

(A) Esquema experimental.

(B) Abundancia taxonómica relativa de la microbiota cultivada de forma anaerobia.

(C) AUC de ratones libres de gérmenes 6 días tras el trasplante con cultivos fecales enriquecidos con sacarina o de control (N=10 y N=9, respectivamente). Las líneas horizontales representan la media; las barras de error, el S.E.M. **, p<0,01, prueba t de Student de dos lados desapareados.

El experimento se repitió dos veces.

Figuras 25A-C. La sacarina modula directamente la microbiota.

(A) OGTT de ratones libres de gérmenes 6 días tras el trasplante con cultivos fecales enriquecidos con sacarina o de control (N=10 y N=9, respectivamente). Los representan la media; las barras de error, el S.E.M. **, p<0,01, ***, p<0,001, ANOVa y análisis post hoc de Bonferroni. Los experimentos se repitieron dos veces.

(B) Representación de taxones en ratones libres de gérmenes de A.

(C) Comparación de la abundancia de vías KEGG entre ratones consumidores de sacarina en la W11 (en comparación con la W0, eje x) y ratones GF trasplantados con microbiomas cultivados de forma anaerobia con 5mgml-1 de sacarina (en comparación con PBS, eje y).

Figuras 26A-H. El consumo agudo de sacarina perjudica el control glucémico en los seres humanos, induciendo disbiosis.

(A) HbA1c% de grandes consumidores de NAS (N=40) en contraposición con no consumidores (N=236). **, valor p de suma de intervalos < 0,002.

(B) Área incremental diaria bajo la curva (iAUC, por sus siglas en inglés) de OGTT en 4 respondedores (R) y 3 no respondedores (NR).

(C-D) OGTT de los días 1-4 en contraposición con los días 5-7 en (C) 4 respondedores o (D) 3 no respondedores.

(E) PCoA de secuencias de ARNr 16S de respondedores (N muestras=16) en contraposición con no respondedores (n =9) durante los días 1-4.

(F) Abundancia relativa al nivel de orden de muestras de taxones de los días 1 y 7 de respondedores y no respondedores.

(G-H) OGTT en ratones GF (N=6) 6 días tras el trasplante fecal de muestras del D1 o del D7 del (G) respondedor 1 (R1) o del (H) no respondedor 3 (NR3). Los símbolos representan la media; las barras de error, el S.E.M. *, p<0,05, **, p<0,01, ANOVA y análisis post hoc de Bonferroni.

Figuras 27A-L. El control glucémico afectado asociado con el consumo agudo de sacarina en seres humanos es transferible a ratones GF.

(A) Esquema experimental (N=7).

(B-C) iAUC de los días 1-4 en contraposición con los días 5-7 en (B) 4 respondedores o (C) 3 no respondedores.

(D) Análisis de coordenadas principales (PCoA, por sus siglas en inglés) de distancias UniFrac ponderadas de secuencias de ARNr 16S que demuestra la separación en las coordenadas principales 2 (PC2), 3 (PC3) y 4 (PC4) de microbiota de respondedores (N muestras=12) en contraposición con no respondedores (N=8) durante los días 5-7.

(E) Abundancia relativa al nivel de orden de muestras de taxones de los días 1 y 7 de respondedores y no respondedores.

(F) AUC en ratones GF (N=6) 6 días tras el trasplante fecal procedente de muestras del respondedor 1 (R1) recogidas antes y después de 7 días de consumo de sacarina.

(G-H) OGTT y AUC en ratones GF (N=5) 6 días después de recibir muestras fecales recogidas del respondedor 4 (R4) antes y después de 7 días de consumo de sacarina.

(I) AUC en ratones GF (N=5) 6 días tras el trasplante fecal procedente de muestras del no respondedor 3 (NR3) recogidas antes y después de 7 días de consumo de sacarina.

(J-K) OGTT y AUC en ratones GF (N=5) 6 días después de recibir muestras fecales recogidas procedentes del no respondedor 2 (NR2) antes y después de 7 días de consumo de sacarina.

(L) Cambios multiplicativos en la abundancia relativa de UTO seleccionadas, alterada en receptores GF de microbiomas del d 7 en contraposición con los del D1 procedentes del R1. El color de los puntos corresponde al orden bacteriano del panel 10f. Los símbolos (GTT) o las líneas horizontales (AUC) representan la media; las barras de error, el S.E.M. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ANOVA bidireccional y análisis post hoc de Bonferroni (GTT), prueba t de Student de dos lados desapareados (AUC).

Figuras 28A-I. La adherencia de la microbiota al epitelio colónico experimenta fluctuaciones diurnas.

(A) Esquema que muestra las horas de muestreo para la fijación epitelial de la microbiota, el metaboloma, el metagenoma y el transcriptoma colónico.

(B) Fluctuaciones diurnas en el número de bacterias fijadas al epitelio colónico en dos ciclos de luz y oscuridad, determinado por la qPCR [reacción rápida en cadena de la polimerasa, por sus siglas en inglés] bacteriana de las comunidades adherentes.

(C) Imágenes de SEM [microscopio electrónico de barrido, por sus siglas en inglés] que muestran fluctuaciones diurnas en la colonización epitelial por bacterias. Las imágenes son representativas de 10 vistas por ratón escogidas al azar. (D) Beta-diversidad de las bacterias adherentes a la mucosa en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad.

(E) Composición taxonómica relativa de las bacterias adherentes a la mucosa en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad.

(F) Representación de mapa térmico de las unidades taxonómicas operativas (UTO) adherentes a la mucosa más significativamente oscilantes, p<0,05 and q<0,2, ciclo JTK.

(G) UTO adherentes al epitelio que muestran las oscilaciones diurnas en abundancia relativa. Se representan las amplitudes de fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(H, I) Ejemplos de especies bacterianas que muestran la abundancia relativa fluctuante en las comunidades adherentes a la mucosa.

Los datos son representativos de dos experimentos independientes con N=45 ratones.

Figuras 29A-C. Fluctuaciones diurnas en el número y la composición de comensales asociados a la mucosa.

(A) Número total de bacterias luminales del intestino grueso en el curso de dos días.

(B, C) Cuantificación (B) e imágenes representativas de SEM (C) que muestran las fluctuaciones diurnas en la colonización epitelial por bacterias en el curso de un día. La cuantificación se realización en 10 imágenes por ratón seleccionadas al azar.

Los datos son representativos de dos experimentos independientes con N=45 ratones.

Figuras 30A-I. Fluctuaciones diurnas en el número y la composición de comensales asociados a la mucosa.

(A, B) Ritmicidad diurna de la beta-diversidad de las bacterias adherentes a la mucosa, mostrada por el análisis de coordenadas principales de muestras obtenidas de dos fases consecutivas de luz y oscuridad.

(C) Distancia UniFrac del momento inicial en comparación con todos los demás momentos en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad.

(D) Número total de las diferentes clases bacterianas adherentes a la mucosa en el curso de dos días.

(E) UTO adherentes al epitelio que muestran las oscilaciones diurnas en números totales. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(F-I) Ejemplos de especies bacterianas adherentes a la mucosa que experimentan fluctuaciones rítmicas en números totales en el curso de dos días.

Los datos son representativos de dos experimentos independientes con N=45 ratones.

Figuras 31A-K. El metaboloma intestinal experimenta oscilaciones diurnas.

(A) Metabolitos que muestran oscilaciones diurnas. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(B, D, F, H) Metabolitos de los grupos químicos indicados que muestran oscilaciones diurnas en la materia fecal. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(C, E, G) Ejemplos de ritmicidad en metabolitos intestinales pertenecientes a diferentes grupos químicos.

(I-K) Representaciones de mapa térmico de los genes bacterianos más significativamente oscilantes (I), transcritos colónicos (J) y metabolitos luminales intestinales (K), con p<0,05, q<0,2, ciclo JTK.

Los datos son representativos de 1-2 experimentos independientes con N=18-27 ratones.

Figuras 32A-H. Ritmos diurnos del metaboloma de la microbiota.

(A, C, E) Metabolitos de los grupos químicos indicados que muestran oscilaciones diurnas en la materia fecal. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(B, F, D) Ejemplos de ritmicidad en metabolitos intestinales pertenecientes a diferentes grupos químicos.

(G, H) Ejemplos de ritmicidad en dos genes microbianos, bioD y bioB, que están implicados en la síntesis de biotina. Los datos son representativos de 1-2 experimentos independientes con N=18-27 muestras en cada grupo.

Figuras 33A-L. El tratamiento con antibióticos abroga los ritmos de adherencia microbiana y reprograma las oscilaciones del transcriptoma intestinal.

(A) Esquema que muestra el patrón de alimentación y las horas de muestreo para la fijación epitelial de la microbiota y el transcriptoma colónico en ratones tratados con antibióticos y en controles.

(B) Fluctuaciones diurnas en el número de bacterias fijadas al epitelio colónico en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad en ratones tratados con antibióticos y en controles.

(C) Imágenes representativas de SEM que muestran la colonización epitelial por bacterias en ZT0 en ratones tratados con antibióticos y en controles.

(D) UTO adherentes al epitelio que muestran las oscilaciones diurnas en abundancia relativa en ratones tratados con antibióticos y en controles. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(E) Abundancia relativa en comunidades de Lactobacillus reuteri adherentes al epitelio en ratones tratados con antibióticos y en controles en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad.

(F) Diagrama de Venn de transcritos colónicos oscilantes compartidos y únicos de ratones tratados con antibióticos en comparación con los controles, p<0,05 y q<0,2, ciclo JTK.

(G-I) Representación de mapa térmico de transcritos colónicos cíclicos compartidos entre ratones tratados con antibióticos y controles (G), de transcritos cíclicos únicamente en ratones de control (H), y de transcritos oscilantes únicamente en ratones tratados con antibióticos (I), p<0,05 y q<0,2, ciclo JTK.

(J-L) Análisis KEGG de transcritos colónicos cíclicos compartidos entre ratones tratados con antibióticos y controles (J), de transcritos cíclicos únicamente en ratones de control (K) y de transcritos oscilantes únicamente en ratones tratados con antibióticos (L).

Los datos son representativos de dos experimentos independientes con N=45 muestras en cada grupo.

Figuras 34A-E. El tratamiento con antibióticos abroga los ritmos de adherencia microbiana.

(A, B) Imágenes representativas de SEM (A) y cuantificación (B) de las fluctuaciones diurnas en la colonización epitelial por bacterias en el curso de un día en ratones tratados con antibióticos y de control.

(C) Composición taxonómica relativa de bacterias adherentes a la mucosa en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad después del tratamiento con antibióticos.

(D) Análisis de coordenadas principales de comunidades adherentes a la mucosa en ratones tratados con antibióticos cada 6 horas en el curso de un día.

(E) Distancia UniFrac del momento inicial en comparación con todos los demás momentos en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad en ratones tratados con antibióticos.

Los datos son representativos de dos experimentos independientes con N=36 ratones.

Figuras 35A-I. Se requiere la microbiota para las oscilaciones coordinadas en el transcriptoma intestinal.

(A) Transcritos colónicos que muestran oscilaciones diurnas en ratones tratados con antibióticos y en controles. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(B-D) Ejemplos representativos de transcritos colónicos con ritmicidad compartida entre ratones tratados con antibióticos y controles (B), pérdida de ritmicidad tras el tratamiento con antibióticos (C) y ritmicidad de novo en ratones tratados con antibióticos (D).

(E) Representación esquemática de las actividades metabólicas máximas en el colon de ratones tratados con antibióticos en comparación con los controles. A cada transcrito oscilante se le asignaron ZT de acrofase, y se determinaron perfiles pico mediante análisis KEGG para cada ZT. Obsérvese que las actividades metabólicas máximas difieren entre ambos grupos.

(F) Transcritos colónicos que muestran oscilaciones diurnas en ratones libres de gérmenes y en controles. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(G-I) Representación de mapa térmico de transcritos cíclicos compartidos entre ratones libres de gérmenes y controles (G) , de transcritos cíclicos únicamente en ratones de control (H) y de transcritos oscilantes únicamente en ratones libres de gérmenes (I), p<0,05, ciclo JTK. Los datos son representativos de 1-2 experimentos con N=27-45 ratones en cada grupo.

Figuras 36A-J. Las horas de alimentación controlan las oscilaciones del metagenoma y el transcriptoma colónico.

(A-C) Distribución de la ingesta de alimentos en el curso de tres fases de luz y oscuridad en ratones alimentados ad libitum (A), alimentados únicamente durante la fase de oscuridad (B) o únicamente durante la fase con luz (C).

(D) Ejemplo de genes bacterianos que muestran un cambio de fase tras la alimentación en la fase con luz.

(E, F) Representación de mapa térmico de módulos (E) y vías (F) KEGG metagenómicos oscilantes que muestran un cambio de fase tras la inversión de las horas de alimentación. (F) Representación de mapa térmico de vías (F) KEGG metagenómicas oscilantes que muestran un cambio de fase tras la inversión de las horas de alimentación.

(G) Ejemplo de cambio de fase en un módulo metagenómico relacionada con la degradación del moco bacteriano tras la alimentación de ratones en la fase con luz.

(H) Representación de mapa térmico de módulos y vías KEGG seleccionados implicados en la motilidad bacteriana que muestra un cambio de fase tras la inversión de las horas de alimentación.

(I, J) Ejemplos de inversión de fase de transcritos oscilantes en ratones alimentados en la fase de oscuridad en contraposición con los alimentados en la fase con luz.

Los datos son representativos de 1-2 experimentos independientes con N=18-27 muestras en cada grupo.

Figuras 37A-L. Las horas de alimentación controlan las oscilaciones metagenómicas, la adherencia epitelial y el transcriptoma del anfitrión.

(A) Esquema que muestra un patrón de alimentación y horas de muestreo para el metagenoma de la microbiota, la fijación epitelial y el transcriptoma colónico.

(B) Genes microbianos que muestran oscilaciones diurnas en ratones alimentados ad libitum en contraposición con los alimentados en la fase con luz. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(C) Representación de mapa térmico de genes bacterianos cíclicos que experimentan un cambio de fase tras una alimentación en la fase con luz.

(D) Cambio de fase de las oscilaciones en genes microbianos que alcanzan su punto máximo en abundancia en ZT12 en ratones alimentados ad libitum.

(E, F) Ejemplo de cambio de fase en módulos (E) y vías metagenómicos relacionados con la degradación del moco bacteriano tras la alimentación de ratones en la fase con luz.

(G) Fluctuaciones diurnas en el número de bacterias fijadas al epitelio colónico en ratones con alimentación planificada. (H) Transcritos colónicos que muestran oscilaciones diurnas en ratones alimentados en la fase de oscuridad en contraposición con los alimentados en la fase con luz. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(I) Diagrama de Venn de transcritos colónicos oscilantes compartidos y únicos de ratones alimentados en la fase de oscuridad en comparación con los ratones alimentados en la fase con luz, p<0,05 and q<0,2, ciclo JTK.

(J) Representación de mapa térmico de transcritos cíclicos compartidos entre ratones alimentados en la fase de oscuridad en contraposición con los alimentados en la fase con luz. Obsérvese el cambio de fase entre oscilaciones en ambos grupos.

(K, L) Ejemplos de inversión de fase de transcritos oscilantes en ratones alimentados en la fase de oscuridad en contraposición con los alimentados en la fase con luz.

Los datos son representativos de dos experimentos independientes con N=18-27 muestras en cada grupo.

Figuras 38A-J. Reprogramación combinatoria de oscilaciones del transcriptoma intestinal mediante las horas de alimentación y el microbioma.

(A) Diagrama de Chow-Ruskey que muestra el cuádruple solapamiento de oscilaciones colónicas en ratones alimentados en la fase de oscuridad y los alimentados en la fase con luz, con y sin tratamiento con antibióticos. Los transcritos se contaron como oscilantes para p<0,05, ciclo JTK. Los colores de las áreas indican el grado de solapamiento. Los colores de los límites indican el respectivo grupo experimental. Las áreas de cada dominio son proporcionales al número de transcritos. Debajo se muestra la asignación KEGG de los transcritos oscilantes compartidos por las cuatro condiciones.

(B) Representación de mapa térmico de genes oscilantes (p<0,05, q<0,2, ciclo JTK) que tienen un cambio de fase tras la inversión de las horas de alimentación y pierden las oscilaciones tras un tratamiento con antibióticos.

(C-F) Ifngrl y Cldn2 como ejemplos de transcritos colónicos que son oscilantes en ratones alimentados en la fase de oscuridad y los alimentados en la fase con luz (C, E), pero no en grupos tratados con antibióticos (D, F).

(G-J) Cry1 y Per2 como ejemplos de transcritos colónicos que son cíclicos en ratones alimentados en la fase de oscuridad y los alimentados en la fase con luz, tanto sin (G, I) como con tratamiento con antibióticos (H, J).

Obsérvese que la diferencia de fase entre grupos alimentados en fase de oscuridad y alimentados en fase con luz es menos pronunciada tras el tratamiento con antibióticos. N=27 muestras en cada grupo.

Figuras 39A-G. La inducción de oscilaciones del transcriptoma en ratones deficientes en Per1/2 es impulsada por la ritmicidad de la microbiota.

(A) Esquema que muestra el patrón de alimentación y el muestreo para el metagenoma y el transcriptoma colónico en ratones deficientes en Per1/2 tratados con antibióticos y en controles.

(B) Genes microbianos que muestran oscilaciones diurnas en ratones alimentados ad libitum y los deficientes en Per1/2 alimentados en la fase con luz. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(C) Representación de mapa térmico de oscilaciones de genes microbianos restauradas en ratones deficientes en Per1/2 alimentados en la fase con luz.

(D) Inducción de oscilaciones en genes microbianos que alcanzan su punto máximo en abundancia durante la fase de oscuridad en ratones deficientes en Per1/2 alimentados en la fase con luz.

(E) Ejemplo de ganancia de ritmicidad en un gen microbiano tras la alimentación en la fase con luz de ratones deficientes en Per1/2 en comparación con controles alimentados ad libitum.

(F) Módulos KEGG microbianos que muestran oscilaciones diurnas en ratones alimentados ad libitum y los deficientes en Per1/2 alimentados en la fase con luz. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(G) Representación de mapa térmico de transcritos colónicos en ratones deficientes en Per1/2 que ganan ritmicidad tras la alimentación en la fase con luz, pero no en ratones tratados con antibióticos.

N=18-27 muestras en cada grupo.

Figuras 40A-H. Reprogramación del reloj transcripcional hepático mediante tratamiento con antibióticos.

(A) Diagrama de Venn que representa transcritos hepáticos oscilantes únicos y compartidos entre ratones de control y tratados con antibióticos, con p<0,05 y q<0,2, ciclo JTK.

(B) Representación de mapa térmico de transcritos hepáticos con oscilaciones compartidas entre ratones tratados con antibióticos y controles.

(C, D) Representación de mapa térmico (C) y análisis de vías KEGG (D) de transcritos oscilantes únicamente en ratones de control.

(E, F) Representación de mapa térmico (E) y análisis de vías KEGG (F) de transcritos oscilantes únicamente en ratones tratados con antibióticos.

(G) Representación esquemática de actividades metabólicas máximas en el hígado de ratones tratados con antibióticos y de control. A cada transcrito oscilante se le asignaron ZT de acrofase, y se determinaron perfiles pico mediante análisis KEGG para cada ZT. N=36 muestras en cada grupo.

(H) Esquema que resume la actividad rítmica y la adherencia del bioma a la mucosa. Tras la disrupción del microbioma, se reprograma el transcriptoma del anfitrión, incluyendo la pérdida de las oscilaciones normales y la génesis de novo de las oscilaciones.

Figuras 41A-H. Impacto del tratamiento con antibióticos en las oscilaciones del transcriptoma hepático.

(A) Transcritos hepáticos que muestran oscilaciones diurnas en ratones tratados con antibióticos y en controles. Se representan las amplitudes de la fluctuación. La línea discontinua indica p<0,05, ciclo JTK.

(B) Análisis de vías KEGG de transcritos cíclicos hepáticos compartidos entre ratones tratados con antibióticos y controles.

(C-F) Ejemplos de oscilaciones de transcritos hepáticos compartidas entre ratones tratados con antibióticos y controles.

(G) Ejemplo de oscilaciones de transcritos hepáticos únicas a los ratones de control.

(H) Esquema de un modelo sugerido para la interacción del factor genético y ambiental en la determinación de las oscilaciones del transcriptoma. La red de factores de transcripción que constituyen el reloj molecular integra señales procedentes de la dieta y la microbiota, que determinan la activación rítmica de los genes diana. Esta, a su vez, determina la porción del transcriptoma que experimenta oscilaciones cíclicas.

N=45 muestras en cada grupo.

La Figura 42 es un gráfico de barras que ilustra que la respuesta glucémica promedio en la semana buena es menor que en la semana mala. Nivel iAUCmed promedio de 16 participantes en las semanas buena (verde) y mala (roja) semanas. La iAUCmed es el área incremental bajo la curva (AUC) por encima del nivel medio de glucosa 15 minutos antes de que se consumiera la comida. El nivel iAUCmed de un participante es el iAUCmed promedio de todos sus desayunos, sus comidas y sus cenas. En el eje x, IG significa, por sus siglas en inglés, un participante con glucosa alterada y H, por su inicial en inglés, significa un participante sano. El primer número después del símbolo IG/H entre paréntesis es el nivel promedio de glucosa al despertar de 6 días de experimento y el segundo número entre paréntesis es la HbA1c al comienzo del experimento.

La Figura 43 es un gráfico que ilustra que la respuesta glucémica a las comidas sigue un patrón diurno, teniendo los desayunos la respuesta más baja, seguido por la comida, y la cena, con la más alta. Cada punto representa la iAUCmed promedio de comidas en la semana mala (eje x) en comparación con la semana buena (eje y). La mayoría de puntos está por debajo de la línea x=y, lo que significa que, como promedio, la AUC en la semana mala es mayor que en la semana buena. Se muestran niveles iAUCmed de desayunos (rojos), comidas (verde) y cenas (azul). Los puntos rellenos corresponden a participantes con glucosa alterada y los puntos vacíos corresponden a individuos sanos. La pendiente del ajuste lineal de todos los desayunos en los participantes con glucosa alterada (línea roja) es la máxima en comparación con el del almuerzo (línea verde) seguida por la de la cena (línea azul). Las líneas discontinuas corresponden a participantes sanos y las líneas completas a participantes con glucosa alterada.

Las Figuras 44A-B son gráficos que ilustran que la AUC tras las comidas muestra un patrón diurno después de la normalización por las calorías de las comidas y los niveles de carbohidratos. La Figura 44A muestra una iAUCmed normalizada por el contenido de calorías de la comida y la Figura 44B muestra una iAUCmed normalizada por el contenido de carbohidratos de la comida.

Descripción de aspectos específicos de la divulgación

La presente divulgación, en algunos aspectos de la misma, versa sobre el microbioma y, más en particular, pero no exclusivamente, sobre un procedimiento y un aparato para predecir la response de un sujeto a uno o más agentes mediante el análisis del microbioma.

Antes de explicar en detalle al menos un aspecto de la divulgación, ha de entenderse que la divulgación no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles definidos en la siguiente descripción o ejemplificada por los Ejemplos. La divulgación es capaz de otros aspectos o de ser puesta en práctica o ejecutada de maneras diversas.

El microbioma intestinal está en constante fluctuación, cambiando continuamente su composición microbiana en respuesta a estímulos externos como la ingesta de alimentos, la ingesta de antibióticos y las enfermedades. Por ello, las composiciones filogenéticas de los microbiomas varían de un individuo a otro. Estas diferencias se han asociado con enfermedades como el cáncer de colon y la enfermedad inflamatoria intestinal, la susceptibilidad a la obesidad, la gravedad de los trastornos de espectro autista y diferencias en las respuestas a los tratamientos médicos.

Los presentes inventores han descubierto ahora que el nivel de toxicidad de un agente o una afección para una persona en particular se puede medir analizando su efecto sobre su microbioma. Más específicamente, un agente que es tóxico para un individuo en particular hará que la composición de su microbioma sea más similar a un microbioma patológico (por ejemplo, un microbioma de un sujeto enfermo), mientras que un agente no tóxico no tendrá este efecto. Por lo tanto, su microbioma se puede utilizar como barómetro para medir la toxicidad de los estímulos externos.

Aunque reducen la presente divulgación a la práctica, los presentes inventores han demostrado que el consumo de formulaciones de edulcorantes artificiales comúnmente usadas impulsa el desarrollo de intolerancia a la glucosa en sujetos particulares, mediante la inducción de alteraciones composicionales y funcionales de la microbiota intestinal. Si bien algunos sujetos parecen ser más tolerantes a los efectos de los edulcorantes artificiales, otros son menos tolerantes. Se demostró que la respuesta individual a los edulcorantes artificiales se debe a diferencias en el microbioma de los sujetos evaluados.

Además, los presentes inventores han descubierto que el contenido bacteriano del microbioma intestinal es vulnerable a los estragos de las alteraciones del ritmo circadiano. La alteración del ritmo circadiano provocó que el contenido microbiano del microbioma intestinal fuera más parecido al microbioma de un sujeto obeso o intolerante a la glucosa. Por lo tanto, cuando los microbios con desfase horario se transfirieron de ratones o seres humanos a ratones libres de gérmenes, los roedores se volvieron más susceptibles a la intolerancia a la glucosa y la diabetes.

Aunque reducen aún más la presente divulgación a la práctica, los presentes inventores demostraron que el microbioma intestinal tiene su propio ritmo circadiano innato que tiene un impacto en las oscilaciones diarias locales y sistémicas del transcriptoma del anfitrión. Esta actividad metaorganismal diurna está adaptada a la ingesta de alimentos, cuya sincronización determina la fase de actividad del microbioma y la sincronización con el anfitrión. Los presentes inventores demostraron que la alteración de la microbiota por tratamiento con antibióticos o en ratones libres de gérmenes reprograma el transcriptoma intestinal y hepático del anfitrión, presentando tanto la pérdida masiva como la génesis de novo de oscilaciones, dando lugar a la reorganización temporal de las vías metabólicas.

Por consiguiente, los presentes inventores proponen que se debe tener en cuenta el ritmo circadiano natural del microbioma del anfitrión (es decir, se debe cuidar de no interrumpir el ritmo circadiano del microbioma) al determinar los regímenes de tratamiento con antibióticos o probióticos.

Así, según un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para determinar el efecto de un agente sobre un microbioma de un sujeto que comprende:

(a) exponer el microbioma al agente;

(b) comparar el distintivo del microbioma tras la exposición con el distintivo de referencia de un microbioma patológico, en donde, cuando el distintivo del microbioma es similar de manera estadísticamente significativa al dicho distintivo de referencia del microbioma patológico, es indicativo de que el agente tiene un efecto nocivo sobre el microbioma.

Según se usa en el presente documento, el término “microbioma” se refiere a la totalidad de microbios (bacterias, hongos, protistas), a sus elementos genéticos (genomas) en un entorno definido.

El microbioma puede ser un microbioma intestinal, un microbioma oral, un microbioma bronquial, un microbioma cutáneo o un microbioma vaginal.

Según un aspecto particular, el microbioma es un microbioma intestinal (es decir, un microbioma del intestino).

Los presentes aspectos abarcan el reconocimiento de que se puede depender de los distintivos microbianos como representantes de la composición y/o de la actividad del microbioma. Los distintivos microbianos comprenden puntos de datos que son indicadores de la composición y/o de la actividad del microbioma. Así, según la presente divulgación, los cambios en los microbiomas pueden detectarse y/o analizarse mediante la detección de una o más características de los distintivos microbianos.

En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la cantidad absoluta de uno o más tipos de microbios y/o de productos de los mismos. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con cantidades relativas de cinco, diez, veinte o más tipos de microbios y/o de productos de los mismos.

Ejemplos de productos microbianos incluyen, sin limitación, ARNm, polipéptidos, carbohidratos y metabolitos.

En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de al menos diez tipos de microbios. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de entre 5 y 100 tipos de microbios. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de entre 100 y 1000 o más tipos de microbios. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de sustancialmente todos los tipos de bacterias dentro del microbioma. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de sustancialmente todos los tipos de microbios dentro del microbioma.

En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de metabolitos de al menos diez tipos de microbios. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de metabolitos de entre 5 y 100 tipos de microbios. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de metabolitos de entre 100 y 1000 o más tipos de microbios. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de metabolitos sustancialmente de todos los tipos de bacterias dentro del microbioma. En algunos aspectos, un distintivo microbiano incluye información relacionada con la presencia, el nivel y/o la actividad de metabolitos de sustancialmente todos los tipos de microbios dentro del microbioma.

Según este aspecto de la presente divulgación, el distintivo del microbioma incluye una presencia o un nivel de al menos uno, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1200, al menos 1500 o todas las especies de microbios del microbioma.

En algunos aspectos, un distintivo de microbioma comprende un nivel o un conjunto de niveles de al menos uno, o al menos cinco, o al menos diez o más tipos de microbios (por ejemplo, bacterias) o de componentes o subproductos de los mismos. En algunos aspectos, un distintivo microbiano comprende un nivel o un conjunto de niveles de al menos una o al menos cinco o al menos diez o más secuencias de ADN. En algunos aspectos, un distintivo microbiano comprende un nivel o un conjunto de niveles de diez o más secuencias de genes de ARNr 16S. En algunos aspectos, un distintivo microbiano comprende un nivel o un conjunto de niveles de secuencias de genes de ARNr 18S. En algunos aspectos, un distintivo microbiano comprende un nivel o un conjunto de niveles de al menos cinco o al menos diez o más transcritos de ARN. En algunos aspectos, un distintivo microbiano comprende un nivel o un conjunto de niveles de al menos cinco o al menos diez o más proteínas. En algunos aspectos, un distintivo microbiano comprende un nivel o un conjunto de niveles de al menos uno o al menos cinco o al menos diez o más metabolitos.

Las secuencias de genes de ARNr 16S y 18S codifican componentes de subunidades pequeñas de ribosomas procariotas y eucariotas, respectivamente. Los genes de ARNr son particularmente útiles para distinguir entre tipos de microbios porque, aunque las secuencias de estos genes difieren entre especies microbianas, los genes tienen regiones muy conservadas para la unión de los cebadores. Esta especificidad entre las regiones conservadas de unión de los cebadores permite que los genes de ARNr de muchos tipos diferentes de microbios se amplifiquen con un único conjunto de cebadores y luego se distingan por las secuencias amplificadas.

Según un aspecto, el sujeto bajo análisis es un sujeto sano (es decir, uno al que no se le ha diagnosticado una enfermedad que se sabe que afecta al microbioma). Por tanto, según un aspecto, el sujeto bajo análisis no tiene una enfermedad metabólica (por ejemplo, no es diabético o prediabético, no tiene enfermedad de Crohn) o cáncer. Los sujetos son normalmente mamíferos (por ejemplo, seres humanos).

Según un aspecto, el perfil de microbioma del sujeto bajo análisis está incluido en una base de datos específica del sujeto, y el perfil del microbioma de referencia (microbioma patológico) derivado de un sujeto no sano está incluido en una segunda base de datos. La segunda base de datos puede comprender perfiles de más de un microbioma patológico y puede comprender datos promedio de múltiples microbiomas patológicos.

Tanto la base de datos específica al sujeto como la segunda base de datos pueden estar almacenadas en un formato legible por ordenador en un soporte legible por ordenador, y opcional y preferiblemente, ser objeto de acceso mediante un procesador de datos, tal como un ordenador de uso general o un circuito dedicado.

La base de datos específica al sujeto puede comprender datos adicionales que describen al sujeto. Ejemplos representativos de tipos de datos distintos al perfil o distintivo del microbioma incluyen, entre otros, las respuestas a los alimentos, la química sanguínea del sujeto, la química sanguínea parcial del sujeto, el perfil genético del sujeto, los datos metabolómicos asociados al sujeto, la condición médica del sujeto, los patrones de sueño del sujeto, los hábitos de ingesta de alimentos del sujeto (por ejemplo, si el sujeto usa o no edulcorantes artificiales) y similares. La base de datos específica al sujeto también puede comprender datos relacionados con la frecuencia de ingesta o exposición al agente, la hora de ingesta o exposición al agente, etc. Estos y otros tipos de datos se describen con más detalle a continuación.

Para analizar el microbioma, se toman muestras de un sujeto. Así, por ejemplo, se pueden tomar muestras de heces para analizar el microbioma intestinal, se pueden tomar muestras bronquiales para analizar el microbioma bronquial, etc. Según un aspecto particular, el microbioma de un sujeto se determina a partir de una muestra de heces del sujeto. Se apreciará que se comparan microbiomas de la misma procedencia (es decir, se compara el microbioma intestinal del sujeto con el microbioma intestinal de un segundo sujeto o grupo de sujetos).

Los presentes inventores han demostrado que los cambios en los patrones de alimentación (debidos, por ejemplo, a la desalineación circadiana) afectan a la composición del microbioma. Por tanto, las muestras se toman preferentemente a una hora determinada del día.

Los agentes que se analizan según este aspecto de la presente divulgación pueden ser sustancias o afecciones.

Las sustancias que pueden analizarse son normalmente sustancias no calóricas (es decir, que tienen menos de 3 calorías por 100 g).

Sustancias no calóricas ejemplares incluyen los aditivos alimentarios.

El aditivo alimentario se puede clasificar según la Unión Europea con un número E. Así, por ejemplo, una sustancia que tiene un número E entre 100-199 es un color, una sustancia que tiene un número E entre 200-299 es un conservante, una sustancia que tiene un número E entre 300-399 es un antioxidante, una sustancia que tiene un número E entre 400-499 es un espesante, un estabilizador o un emulsionante, una sustancia que tiene un número E entre 500-599 es un regulador de la acidez o un agente antiaglomerante, una sustancia que tiene un número E entre 600-199 es un potenciador del sabor, una sustancia que tiene un número E entre 700-799 es un antibiótico, una sustancia que tiene un número E entre 900-999 es un agente de glaseado o un edulcorante. Productos químicos adicionales tienen números E entre 1000-1599.

Los aditivos alimentarios se pueden clasificar en los siguientes grupos: ácidos, reguladores de la acidez, agentes antiaglutinantes, agentes antiespumantes, antioxidantes, agentes de carga, colorantes, emulsionantes, aromas, potenciadores del sabor, agentes de glaseado, humectantes, conservantes, estabilizantes, edulcorantes artificiales y espesantes.

Según un aspecto particular, la sustancia es cafeína.

Según otro aspecto, la sustancia es un edulcorante artificial.

Ejemplos de edulcorantes artificiales incluyen, sin limitación, aspartamo, acesulfamo, esteviol, sacarina, ciclamato, eritritol, isomaltitol, maltitol, lactitol, manitol, neohesperidina dihidrocalcona, neotame, sorbitol, xilitol y sucralosa.

Según otro aspecto, la sustancia es un agente terapéutico. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen, sin limitación, compuestos inorgánicos u orgánicos; moléculas pequeñas (es decir, de menos de 1000 dáltones) o moléculas grandes (es decir, de más de 1000 dáltones); biomoléculas (por ejemplo, moléculas proteínicas, que incluyen, entre otros, péptidos, polipéptidos, proteínas modificadas postraduccionalmente, anticuerpos, etc.) o una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN bicatenario, ARN monocatenario o moléculas de ácido nucleico de triple hélice) o productos químicos. Los agentes terapéuticos pueden ser productos naturales derivados de cualquier organismo conocido (incluidos, entre otros, animales, plantas, bacterias, hongos, protistas o virus) o de una biblioteca de moléculas sintéticas. Los agentes terapéuticos pueden ser compuestos tanto monoméricos como poliméricos.

Según un aspecto particular, la sustancia es un metabolito.

Según se usa en el presente documento, un “metabolito” es un producto intermedio o producto del metabolismo. El término metabolito está generalmente restringido a moléculas pequeñas y no incluye compuestos poliméricos como ADN o proteínas. Un metabolito puede servir de sustrato para una enzima de una vía metabólica, un compuesto intermedio de tal vía o el producto obtenido por la vía metabólica.

En aspectos preferidos, los metabolitos incluyen, sin limitación, azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos, hormonas, vitaminas, oligopéptidos (de menos de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud), así como fragmentos iónicos de los mismos. Las células también se pueden lisar para medir los productos celulares presentes dentro de la célula. En particular, dichos metabolitos tienen menos de aproximadamente 3000 dáltones de peso molecular, y más particularmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 3000 dáltones.

El metabolito de este aspecto de la presente divulgación puede ser un metabolito primario (es decir, esencial para el microbio para su crecimiento) o un metabolito secundario (uno que no desempeña un papel en el crecimiento, el desarrollo o la reproducción, y se forma durante el final de la fase estacionaria de crecimiento o cerca de la misma.

Ejemplos representativos de vías metabólicas en las que están implicados los metabolitos de la presente divulgación incluyen, sin limitación, ciclo del ácido cítrico, cadena respiratoria, fotosíntesis, fotorrespiración, glicólisis, gluconeogénesis, vía de la hexosa monofosfato, vía oxidativa de la pentosa fosfato, producción y p-oxidación de ácidos grasos, ciclo de la urea, vías de biosíntesis de aminoácidos, vías de degradación de proteínas como la degradación proteasomal, vías de degradación de aminoácidos, biosíntesis o degradación de: lípidos, policétidos (incluidos, por ejemplo, flavonoides e isoflavonoides), isoprenoides (incluidos, por ejemplo, terpenos, esteroles, esteroides, carotenoides, xantófilas), carbohidratos, fenilpropanoides y derivados, alcaloides, bencenoides, indoles, compuestos de indol y azufre, porfirinas, antocianinas, hormonas, vitaminas, cofactores como grupos protésicos o portadores de electrones, lignina, glucosinolatos, purinas, pirimidinas, nucleósidos, nucleótidos y moléculas relacionadas como ARNt, microARN (miARN) o ARNm.

Según un aspecto particular, el agente terapéutico no es un alimento o un aditivo alimentario.

Según otro aspecto, el agente terapéutico no es para tratar la obesidad o una enfermedad relacionada con la intolerancia a la glucosa (por ejemplo, diabetes).

Según otro aspecto adicional, la sustancia no es un agente terapéutico.

Las sustancias pueden estar aisladas o estar incorporadas en un vehículo, tal como un alimento o una bebida.

Según un aspecto, el vehículo es un vehículo no calórico, tal como un alimento o una bebida no calóricos. Así, por ejemplo, la sustancia puede ser una bebida dietética o café sin leche.

Preferiblemente, el microbioma se expone a una cantidad similar de agente al que se somete de forma rutinaria al sujeto examinado.

Como se ha mencionado, el agente que se evalúa también puede ser una afección.

Afecciones ejemplares contempladas por la presente divulgación incluyen, sin limitación, patrones de sueño alterados, exposición al humo del tabaco, exposición a radiaciones, exposición a la luz y patrones de ingesta de alimentos.

La primera etapa según este aspecto de la presente divulgación implica exponer el microbioma al agente. Se apreciará que, cuando el agente es una sustancia, esta etapa puede efectuarse in vivo o ex vivo. Cuando el agente es una afección, esta etapa se efectúa normalmente in vivo. La exposición puede ser una exposición directa (por ejemplo, una puesta en contacto) o puede efectuase a través del sujeto (por ejemplo, el sujeto es sometido a diferentes patrones de sueño).

La puesta en contacto puede realizarse una sola vez, o puede efectuarse en gran número de ocasiones en el curso de un periodo de tiempo particular.

Se apreciará que el distintivo puede determinarse en un microbioma de un sujeto que se sabe que ha estado sometido al agente o a la afección. Esta información puede obtenerse directamente del sujeto analizado (por ejemplo, usando un cuestionario). Preferiblemente, el sujeto ha estado sometido al agente durante un periodo de tiempo (por ejemplo, una semana, un mes o más tiempo). Según un aspecto particular, el sujeto ha estado sometido al agente al menos una vez al día, al menos dos veces al día, al menos tres veces al día o más. Preferiblemente, el sujeto estuvo sometido al agente al menos 1 mes antes del análisis, al menos una semana antes del análisis y, opcionalmente, al menos un día antes del análisis.

Tras la puesta en contacto, el distintivo del microbioma del sujeto evaluado se compara con un distintivo de referencia de un microbioma patológico.

Como se usa en el presente documento, la frase “microbioma patológico” se refiere a un microbioma derivado de un sujeto que se sabe que tiene una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad metabólica tal como diabetes o prediabetes, cáncer) o que ya ha sido preclasificado como portador de un microbioma que es intolerante al agente.

Cuantificación de niveles microbianos; En procedimientos según la presente divulgación, se obtiene y/o se determina un distintivo microbiano cuantificando los niveles microbianos. A continuación se describen en el presente documento procedimientos de cuantificación de los niveles de microbios de tipos diversos.

En algunos aspectos, determinar un nivel o un conjunto de niveles de uno o más tipos de microbios o de componentes o productos de los mismos comprende determinar un nivel o un conjunto de niveles de una o más secuencias de ADN. En algunos aspectos, una o más secuencias de ADN comprenden cualquier secuencia de ADN que pueda usarse para diferenciar entre diferentes tipos microbianos. En ciertos aspectos, una o más secuencias de ADN comprenden secuencias de genes del ARNr 16S. En ciertos aspectos, una o más secuencias de ADN comprenden secuencias de genes del ARNr 18S. En algunos aspectos, se amplifican 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 1.000, 5.000 o más secuencias.

En algunos aspectos, se analiza directamente una muestra de microbiota (por ejemplo, una muestra fecal) para determinar un nivel o un conjunto de niveles de una o más secuencias de ADN. En algunos aspectos, el ADN se aísla de una muestra de microbiota y el ADN aislado se analiza para determinar un nivel o un conjunto de niveles de una o más secuencias de ADN. Los procedimientos de aislamiento de ADN microbiano son bien conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen, sin limitación, la extracción con fenol-cloroformo y una amplia variedad de equipos disponibles comercialmente, incluyendo el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, California).

En algunos aspectos, se determina un nivel o un conjunto de niveles de una o más secuencias de ADN amplificando secuencias de ADN usando PCR [reacción en cadena de la polimerasa, por sus siglas en inglés] (por ejemplo, PCR estándar, PCR semicuantitativa o cuantitativa). En algunos aspectos, se determina un nivel o un conjunto de niveles de una o más secuencias de ADN amplificando secuencias de ADN usando PCR cuantitativa. Estos y otros procedimientos básicos de amplificación de ADN son bien conocidos por los profesionales en la técnica y están descritos en Ausubel y otros (Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (ed.).

1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nueva York).

En algunos aspectos, se amplifican secuencias de ADN usando cebadores específicos para una o más secuencias que diferencian tipos microbianos individuales de otros tipos microbianos diferentes. En algunos aspectos, se amplifican secuencias de genes del ARNr 16S o fragmentos del mismo usando cebadores específicos para secuencias de genes del ARNr 16S. En algunos aspectos, se amplifican secuencias de ADN 18S usando cebadores específicos para secuencias de ADN 18S.

En algunos aspectos, se determina un nivel o un conjunto de niveles de una o más secuencias de genes del ARNr 16S usando tecnología PhyloChip. El uso de PhyloChips es muy conocido en la técnica y está descrito en Hazen y otros (“Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria”. Science, 330, 204-208, 2010). Sucintamente, se amplifican y marcan secuencias de genes del ARNr 16S a partir de ADN extraído de una muestra de microbiota. A continuación, el ADN amplificado se hibrida formando una matriz que contiene sondas para genes del ARNr 16S microbiano. Acto seguido, se cuantifica el nivel de unión a cada sonda proporcionando un nivel de muestra del tipo microbiano correspondiente a la secuencia de genes del ARNr 16S hibridada. En algunos aspectos, el análisis de PhyloChip lo lleva a cabo una empresa comercial. Ejemplos incluyen, sin limitación, Second Genome Inc. (San Francisco, California).

En algunos aspectos, determinar un nivel o un conjunto de niveles de uno o más tipos de microbios o de componentes o productos de los mismos comprende determinar un nivel o un conjunto de niveles de una o más moléculas (por ejemplo, transcritos) de ARN microbiano. En la técnica son muy conocidos los procedimientos de cuantificación de los niveles de transcritos de ARN e incluyen, sin limitación, el análisis Northern, la PCR semicuantitativa con transcriptasa inversa, la PCR cuantitativa con transcriptasa inversa y el análisis de micromatrices.

En algunos aspectos, determinar un nivel o un conjunto de niveles de uno o más tipos de microbios o de componentes o productos de los mismos comprende determinar un nivel o un conjunto de niveles de uno o más polipéptidos microbianos. En la técnica son muy conocidos los procedimientos de cuantificación de los niveles de polipéptidos e incluyen, sin limitación, el análisis Western y la espectrometría de masas. Ausubel y otros describen estos y todos los demás procedimientos básicos de detección de polipéptidos.

En algunos aspectos, determinar un nivel o un conjunto de niveles de uno o más tipos de microbios o de componentes o productos de los mismos comprende determinar un nivel o un conjunto de niveles de uno o más metabolitos microbianos. En algunos aspectos, los niveles de metabolitos se determinan mediante espectrometría de masas. En algunos aspectos, los niveles de metabolitos se determinan mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear. En algunos aspectos, los niveles de metabolitos se determinan mediante el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés). En algunos aspectos, los niveles de metabolitos se determinan por colorimetría. En algunos aspectos, los niveles de metabolitos se determinan por espectrofotometría.

En la técnica se conocen procedimientos de análisis de SCFA. Más abajo, en la sección de Ejemplos del presente documento, se describe un procedimiento ejemplar.

Se apreciará que se selecciona el distintivo de referencia del microbioma patológico para que se corresponda con el distintivo del microbioma del sujeto. Por ejemplo, si el distintivo del microbioma del sujeto comprende cantidades de metabolitos microbianos, entonces el distintivo de referencia del microbioma patológico también comprende cantidades de metabolitos microbianos. Si el distintivo del microbioma del sujeto comprende datos de expresión para un grupo de genes involucrados en la síntesis de glicosaminoglicano, entonces el distintivo de referencia del microbioma patológico también comprende datos de expresión para un grupo de genes involucrados en la síntesis de glicosaminoglicano.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando comprenden al menos un 50% de los mismos microbios, al menos un 60% de los mismos microbios, al menos un 70% de los mismos microbios, al menos un 80% de los mismos microbios, al menos un 90% de los mismos microbios, al menos un 91% de los mismos microbios, al menos un 92% de los mismos microbios, al menos un 93% de los mismos microbios, al menos un 94% de los mismos microbios, al menos un 95% de los mismos microbios, al menos un 96% de los mismos microbios, al menos un 97% de los mismos microbios, al menos un 98% de los mismos microbios, al menos un 99% de los mismos microbios o el 100% de los mismos microbios.

Además, o de forma alternativa, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando la cantidad (por ejemplo, la incidencia) en el microbioma de al menos un microbio de interés es idéntica. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 10% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 20% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 30% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 40% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 50% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 60% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 70% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 80% de sus microbios. Según otro aspecto, los microbiomas pueden tener un distintivo similar de manera estadísticamente significativa cuando es idéntica una proporción relativa en el microbioma de al menos un 90% de sus microbios. Por tanto, el porcentaje fraccionario de los microbios (por ejemplo, cantidad relativa, proporción, distribución, frecuencia, porcentaje, etc.) del total puede ser estadísticamente similar.

Según otro aspecto, para clasificar a un microbio como perteneciente a un género, familia, orden, clase o filo particular, debe comprender al menos un 90% de homología de secuencia, al menos un 91% de homología de secuencia, al menos un 92% de homología de secuencia, al menos un 93% de secuencia homología, al menos un 94% de homología de secuencia, al menos un 95% de homología de secuencia, al menos un 96% de homología de secuencia, al menos un 97% de homología de secuencia, al menos un 98% de homología de secuencia, al menos un 99% de homología de secuencia con un microbio de referencia que se sabe que pertenece al género en particular. Según un aspecto particular, la homología de secuencia es al menos del 95%.

Según otro aspecto, para clasificar a un microbio como perteneciente a una especie particular, debe comprender al menos un 90% de homología de secuencia, al menos un 91% de homología de secuencia, al menos un 92% de homología de secuencia, al menos un 93% de homología de secuencia, al menos un 94% de homología de secuencia, al menos un 95% de homología de secuencia, al menos un 96% de homología de secuencia, al menos un 97% de homología de secuencia, al menos un 98% de homología de secuencia, al menos un 99% de homología de secuencia con un microbio de referencia que se sabe que pertenece a la especie particular. Según un aspecto particular, la homología de secuencia es al menos del 97%.

Para determinar si un ácido nucleico o proteína es sustancialmente homólogo o comparte un cierto porcentaje de identidad de secuencia con una secuencia de la divulgación, la similitud de secuencia puede definirse mediante algoritmos convencionales, que normalmente permiten la introducción de un pequeño número de discontinuidades para lograr el mejor ajuste. En particular, la “ identidad porcentual” de dos polipéptidos o dos secuencias de ácido nucleico se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1993). Dicho algoritmo está incorporado en los programas BLASTN y BLAs Tx de Altschul y otros (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Las búsquedas BLAST de nucleótidos se pueden realizar con el programa BLASTN para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la divulgación. Igualmente, se pueden realizar búsquedas BLAST de proteínas con el programa BLASTX para obtener secuencias de aminoácidos que sean homólogas a un polipéptido de la divulgación. Para obtener alineaciones con discontinuidades con fines de comparación, se utiliza el llamado Gapped BLAST, descrito en Altschul y otros (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov para obtener más detalles.

Según otro aspecto adicional, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el número relativo de genes pertenecientes a una vía particular es similar. Tales vías se describen posteriormente en el presente documento.

Según otro aspecto adicional, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el número relativo de un producto generado por los microbios es similar. Tales productos se describen posteriormente en el presente documento.

Además de comparar el distintivo del microbioma del sujeto analizado con el microbioma patológico de referencia, el distintivo del microbioma del sujeto puede compararse también (o alternativamente) con un microbioma no patológico de referencia.

Por tanto, según otro aspecto, el procedimiento comprende, además, la comparación del distintivo del microbioma, tras la exposición, con un distintivo de referencia de un microbioma no patológico, en donde, cuando el distintivo del microbioma es diferente de manera estadísticamente significativa del distintivo de referencia de un microbioma no patológico, es indicativo de que el agente tiene un efecto nocivo sobre el microbioma. Además, cuando el distintivo del microbioma es similar de manera estadísticamente significativa al distintivo de referencia de un microbioma no patológico, es indicativo de que el agente tiene un efecto no perjudicial sobre el microbioma.

Los microbiomas no patológicos normalmente derivan de sujetos sanos (es decir, que no tienen ninguna enfermedad, especialmente enfermedades metabólicas). Además, los microbiomas no patológicos normalmente derivan de sujetos sanos que no ingieren de forma crónica agentes que se sabe que afectan adversamente al microbioma. Así, por ejemplo, el microbioma no patológico deriva normalmente de un sujeto sano que no ingiere de forma crónica edulcorantes artificiales.

Pueden añadirse etapas adicionales a cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento que se usen para evaluar el efecto de un agente sobre el microbioma, incluyendo, por ejemplo, la administración del agente al sujeto antes del análisis del distintivo del microbioma y/o la preparación de la muestra para el análisis (por ejemplo, eliminar la materia fecal, crear un extracto proteico, preparar una muestra de ácido nucleico, etc.).

Cualquiera de los procedimientos analíticos descritos en el presente documento puede ser implementado de muchas formas. Por ejemplo, puede ser incorporado en un medio tangible como un ordenador para realizar las operaciones del procedimiento. Puede implementarse en un soporte legible por ordenador que comprenda instrucciones legibles por ordenador para llevar a cabo las operaciones del procedimiento. También se puede incorporar en un dispositivo electrónico que tenga prestaciones de ordenador digital dispuestas para ejecutar el programa informático en el medio tangible o ejecutar la instrucción en un soporte legible por ordenador.

Los programas informáticos que implementan el procedimiento analítico de los presentes aspectos se pueden distribuir comúnmente a los usuarios en un soporte de distribución tal como, sin limitación, CD-ROM o soportes de memoria flash. Desde el soporte de distribución, los programas informáticos se pueden copiar a un disco duro o a un soporte de almacenamiento intermedio similar. En algunos aspectos de la presente divulgación, los programas informáticos que implementan el procedimiento de los presentes aspectos se pueden distribuir a los usuarios permitiendo que el usuario descargue los programas de una ubicación remota, a través de una red de comunicaciones; por ejemplo, Internet. Los programas informáticos se pueden ejecutar cargando las instrucciones informáticas ya sea desde su soporte de distribución o su soporte de almacenamiento intermedio en la memoria de ejecución del ordenador, configurando el ordenador para que actúe de acuerdo con el procedimiento de esta divulgación. Todas estas operaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica de los sistemas informáticos.

Mediante la realización de los procedimientos descritos en el presente documento, es posible determinar la tolerancia de un sujeto al agente. Entonces se hace posible proporcionar recomendaciones en cuanto a la cantidad de una sustancia que puede ser tolerada (por ejemplo, ingerida), o a la cantidad o el nivel de una afección que puede tolerar un sujeto.

A continuación se muestran dos ejemplos que se demostró que tenían efecto sobre el microbioma.

Edulcorantes artificiales: Los presentes inventores han demostrado que el consumo de formulaciones de edulcorantes artificiales de uso común impulsa el desarrollo de intolerancia a la glucosa en sujetos particulares, a través de la inducción de alteraciones composicionales y funcionales de la microbiota intestinal. Si bien algunos sujetos parecen ser más tolerantes a los efectos de los edulcorantes artificiales, otros son menos tolerantes. Se demostró que la respuesta individual a los edulcorantes artificiales se debe a diferencias en el microbioma de los sujetos evaluados.

La frase “tolerancia a edulcorantes artificiales”, según se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de ingerir (ya sea comiendo o bebiendo) la máxima ingesta diaria admisible (IDA) de edulcorante artificial (por ejemplo, sacarina comercial 5mgkg-1) de la FDA [Administración de Alimentos y Medicamentos, por sus siglas en inglés] sin mostrar un parámetro clínico que esté asociado con un metabolismo alterado de la glucosa. Así, por ejemplo, se puede considerar que una persona no supera una prueba de tolerancia a la glucosa si, 2 horas después de la ingestión de 75 gramos de glucosa, su nivel de glucosa en sangre es inferior a 140 mg/dl y todos los valores entre 0 y 2 horas son inferiores a 200 mg/dl. Además, se puede considerar que una persona es tolerante a un edulcorante artificial si sus niveles de glucosa en ayunas se encuentran en el intervalo normal.

Normalmente, los sujetos analizados para determinar su tolerancia a los edulcorantes artificiales no son diabéticos ni prediabéticos. Preferiblemente no padecen ningún trastorno metabólico.

Distintivos de microbioma particularmente relevantes cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales incluyen un nivel de microbios pertenecientes a los órdenes Bacteroidales, Clostridilales, Bactobacillales, YS2, RF32, Erysipelotrichales, Burkholderiales, Lactobacillales, Anaeroplasmatales, Enterobacteriales y/o Campylobacterales.

Según un aspecto particular, el distintivo del microbioma comprende un nivel de microbios pertenecientes a los órdenes Bacteroidales, Clostridilales, Bactobacillales, YS2, RF32, Erysipelotrichales, Burkholderiales y/o Campylobacterales, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Según otro aspecto, el distintivo del microbioma comprende un nivel de microbios pertenecientes a los filos Bacteroidetes, Firmicutes y/o Tenericutes, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales. Según otro aspecto, el distintivo del microbioma comprende un nivel de microbios pertenecientes a las clases Bacteroidia, Bacilli, Clostridia, Mollicutes y/o Gammaproteobacteria, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Según otro aspecto, el distintivo del microbioma comprende un nivel de microbios pertenecientes a los órdenes Bacteroidales, Lactobacillales, Clostridiales, Anaeroplasmatales y/o Enterobacteriales, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Según otro aspecto, el distintivo del microbioma comprende un nivel de microbios pertenecientes a las familias Bacteroidaceae, Lactobacillaceae, Porphyromonadaceae, Anaeroplasmataceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Ruminococcaceae, Streptococcaceae, Dehalobacteriaceae, Enterobacteriaceae y/o S24-7, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Según otro aspecto, el distintivo del microbioma comprende un nivel de microbios pertenecientes a los géneros Bacteroides, Lactobacillus, Parabacteroides, Anaeroplasma, Candidatus arthromitus, Odoribacter, Lactococcus y/o Dehalobacterium, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Según otro aspecto adicional, el distintivo del microbioma comprende un nivel de microbios de al menos una de las especies definidas más abajo en la Tabla 4 del presente documento, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, el distintivo del microbioma puede referirse al nivel de genes particulares expresados en los microbios del microbioma.

Más específicamente, el distintivo del microbioma puede comprender niveles de genes pertenecientes a la vía de degradación de los glicanos (por ejemplo, la vía del glicosaminoglicano), cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Según otro aspecto adicional, el distintivo del microbioma puede comprender niveles de genes microbianos que incluyen, por ejemplo, genes implicados en el metabolismo del almidón y la sacarosa, genes implicados en el metabolismo de la fructosa y la manosa, genes implicados en la biosíntesis de folatos, genes implicados en la biosíntesis de glicerolípidos, genes implicados en la biosíntesis de ácidos grasos, genes implicados en las vías de transporte de glucosa, genes implicados en el metabolismo del ascorbato y el aldarato, genes implicados en la biosíntesis de los lipopolisacáridos y/o genes implicados en la quimiotaxia bacteriana, cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, el distintivo del microbioma puede referirse al nivel de un producto o subproducto generado por microbios del microbioma; por ejemplo, un metabolito.

Un metabolito ejemplar que puede analizarse en la muestra son ácidos grasos de cadena corta (SCFA), cuando se evalúa la tolerancia a edulcorantes artificiales.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a los órdenes Bacteroidales, Clostridilales, Bactobacillales, YS2, RF32, Erysipelotrichales, Burkholderiales, Lactobacillales, Anaeroplasmatales, Enterobacteriales y/o Campylobacterales es estadísticamente similar.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a los órdenes Bacteroidales, Clostridilales, Bactobacillales, YS2, RF32, Erysipelotrichales, Burkholderiales y/o Campylobacterales es estadísticamente similar.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a los filos Bacteroidetes, Firmicutes y/o Tenericutes es estadísticamente similar.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a las clases Bacteroidia, Bacilli, Clostridia, Mollicutes y/o Gammaproteobacteria es estadísticamente similar.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a los órdenes Bacteroidales, Lactobacillales, Clostridiales, Anaeroplasmatales y/o Enterobacteriales es estadísticamente similar.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a las familias Bacteroidaceae, Lactobacillaceae, Porphyromonadaceae, Anaeroplasmataceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Ruminococcaceae, Streptococcaceae, Dehalobacteriaceae, Enterobacteriaceae y/o S24-7 es estadísticamente similar.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a los géneros Bacteroides, Lactobacillus, Parabacteroides, Anaeroplasma, Candidatus Arthromitus, Odoribacter, Lactococcus y/o Dehalobacterium es estadísticamente similar.

Según un aspecto de la presente divulgación, dos distintivos de microbioma pueden clasificarse como similares si el nivel relativo de microbios pertenecientes a las especies definidas más abajo en la Tabla 4 del presente documento es estadísticamente similar.

Según otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de determinación de la tolerancia a un edulcorante artificial en un sujeto que comprende analizar la cantidad de microbios pertenecientes a un orden seleccionado del grupo formado por el orden Bacteroidales, el orden Clostridilales, el orden Bactobacillales, el orden YS2, el orden RF32, el orden Erysipelotrichales, el orden Burkholderiales y/o el orden Campylobacterales en un microbioma del sujeto, en donde una cantidad de microbios de los órdenes Bacteroidales, Clostridilales, Bactobacillales y/o YS2 por encima de un nivel predeterminado es indicativa de que un sujeto es tolerante al edulcorante artificial y una cantidad de microbios de los órdenes RF32, Erysipelotrichales, Burkholderiales y/o Campylobacterales por encima de un nivel predeterminado es indicativa de que un sujeto es intolerante al edulcorante artificial.

La determinación de la cantidad de microbios pertenecientes a un orden particular se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Según este aspecto, se analiza la cantidad relativa de microbios pertenecientes a al menos uno de los órdenes, a dos de los órdenes, a tres de los órdenes, a cuatro de los órdenes, a cinco de los órdenes, a seis de los órdenes, a siete de los órdenes, a ocho de los órdenes, a nueve de los órdenes, a diez de los órdenes, a once de los órdenes o a todos los órdenes mencionados anteriormente.

Preferiblemente, el aumento en el nivel es de al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o mayor.

Según otro aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de determinación de la tolerancia a un edulcorante artificial en un sujeto que comprende el análisis de la cantidad de al menos un microbio o clase de microbios definido en la Tabla 4 en un microbioma del sujeto, en donde la cantidad de al menos uno de los microbios o de la clase de microbios por encima de un nivel predeterminado es indicativa de que un sujeto es intolerante al edulcorante artificial.

Según este aspecto de la presente divulgación, se analiza al menos uno de los microbios descritos en la Tabla 4, se analiza al menos un 5% de los microbios descritos en la Tabla 4, se analiza al menos un 10% de los microbios descritos en la Tabla 4, se analiza al menos un 20% de los microbios descritos en la Tabla 4, se analiza al menos un 30% de los microbios descritos en la Tabla 4, se analiza al menos un 40% de los microbios descritos en la Tabla 4, se analiza al menos un 50% de los microbios descritos en la Tabla 4.

Preferiblemente, el aumento en el nivel es de al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces o mayor.

Pueden añadirse etapas adicionales a cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, que se usan para evaluar la tolerancia de un sujeto a un edulcorante artificial, incluyendo, por ejemplo, administrar al sujeto el edulcorante artificial antes del análisis del distintivo del microbioma y preparar la muestra para el análisis (por ejemplo, eliminar la materia fecal, crear un extracto proteico, preparar una muestra de ácido nucleico, etc.).

Ritmo circadiano alterado

Los presentes inventores han demostrado que los sujetos con desalineación circadiana (por ejemplo, los que padecen desfase horario) tienen microbiomas que son similares de forma estadísticamente significativa a microbiomas patológicos y sugieren que la comunidad microbiana resultante puede contribuir a desequilibrios metabólicos.

Por tanto, los presentes inventores proponen es determinar si un sujeto es tolerante a que se altere su ritmo circadiano (por ejemplo, cambio de zonas horarias, realización de turnos nocturnos, etc.) analizando su microbioma. Si su microbioma es similar de manera estadísticamente significativa a un microbioma patológico, entonces es indicativo de que es intolerante a estas afecciones.

La presente divulgación contempla equipos para analizar el microbioma de una persona para determinar su tolerancia a diferentes agentes o afecciones.

Así, según otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un equipo para determinar si un sujeto es tolerante a un agente que comprende:

(i) un agente que es capaz de determinar una cantidad de al menos un componente del microbioma, siendo el nivel del al menos un componente del microbioma significativamente diferente en un microbioma tolerante al agente y en un microbioma intolerante al agente; y

(ii) un microbioma patológico.

En un aspecto, el equipo comprende un agente que es capaz de determinar una cantidad de al menos un componente del microbioma, siendo el nivel del al menos un componente del microbioma significativamente diferente en un sujeto tolerante a edulcorantes artificiales y en un sujeto intolerante a edulcorantes artificiales.

El componente (por ejemplo, una biomolécula) del microbioma puede enriquecerse, reducirse, regularse al alza, regularse a la baja, degradarse o estabilizarse en el microbioma tolerante al agente en comparación con el microbioma intolerante al agente.

Como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, el componente (por ejemplo, una biomolécula) del microbioma puede ser un ácido nucleico, un ácido oligonucleico, un aminoácido, un péptido, un polipéptido, una proteína, un lípido, un carbohidrato, un metabolito o un fragmento de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden incluir ARN, ADN y derivados naturales o creados sintéticamente. El componente relacionado con el microbioma puede estar presente, producido o modificado por un microorganismo dentro del intestino.

La biomolécula puede permitir el análisis de una especie o una clase de microbios particulares.

En el caso de un microbio, el agente puede ser un cebador o un conjunto de cebadores para amplificar ARNr 16S o ARNr 18S. En la sección de Ejemplos a continuación se proporciona un ejemplo de tal conjunto de cebadores. El equipo de este aspecto puede comprender reactivos adicionales requeridos para reacciones de secuenciación posteriores.

En el caso de un gen (ADN) o ARN, el agente puede ser un oligonucleótido que se hibrida específicamente con el ADN o el ARN de interés.

El oligonucleótido puede estar en forma de un cebador de amplificación. En este caso, el equipo puede comprender componentes adicionales para realizar una reacción de amplificación, tales como enzimas, sales y tampones. Normalmente, el equipo comprende oligonucleótidos para amplificar al menos dos genes que se sabe que se expresan diferencialmente en microbiomas tolerantes/intolerantes a edulcorantes artificiales. Según un aspecto particular, los dos genes forman parte de una vía que se sabe que está implicada en la tolerancia a los edulcorantes artificiales, tales como la vía de degradación de los glicanos (por ejemplo, la vía del glicosaminoglicano).

Además, o alternativamente, los cebadores pueden amplificar genes implicados en al menos un proceso o una vía que se sabe que están regulados al alza o a la baja en un microbioma tolerante al agente en comparación con el microbioma intolerante al agente. Así, en el caso de los edulcorantes artificiales, el cebador puede amplificar genes en uno o más de los siguientes procesos o de las siguientes vías: metabolismo del almidón y la sacarosa, metabolismo de la fructosa y la manosa, biosíntesis de folatos, biosíntesis de glicerolípidos, biosíntesis de ácidos grasos, vías de transporte de la glucosa, metabolismo del ascorbato y el aldarato, biosíntesis de lipopolisacáridos y/o quimiotaxia bacteriana.

Alternativamente, el oligonucleótido puede unirse a una superficie (es decir, una matriz) sólida. Se conocen en la técnica varios sustratos adecuados para la construcción de matrices, y un experto en la técnica apreciará que pueden estar disponibles otros sustratos a medida que avance la técnica. El sustrato puede ser un material que puede modificarse para que contenga sitios individuales diferenciados apropiados para la unión o la asociación del oligonucleótido y es susceptible de al menos un procedimiento de detección. Ejemplos no limitantes de materiales de sustrato incluyen vidrio, vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TeflonJ, etc.), nailon o nitrocelulosa, polisacáridos, nailon, resinas, sílice o materiales a base de sílice, incluyendo silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos y plásticos. En un aspecto ejemplar, los sustratos pueden permitir la detección óptica sin fluorescencia apreciable.

Un sustrato puede ser planario, un sustrato puede ser un pocillo —es decir, una placa de 364 pocillos— o, alternativamente, un sustrato puede ser una perla. Además, el sustrato puede ser la superficie interior de un tubo para el análisis de muestras de flujo pasante para minimizar el volumen de la muestra.

De modo similar, el sustrato puede ser flexible, tal como una espuma flexible, incluyendo espumas de celdas cerradas hechas de plásticos particulares.

El oligonucleótido o los oligonucleótidos pueden unirse al sustrato en una amplia variedad de maneras, como apreciarán los expertos en la técnica. El oligonucleótido puede bien ser sintetizado primero, con la subsiguiente unión al sustrato, o bien puede ser sintetizado directamente sobre el sustrato. El sustrato y el oligonucleótido pueden modificarse con grupos químicos funcionales para la subsiguiente unión de los dos. Por ejemplo, el sustrato puede modificarse con un grupo químico funcional que incluye, sin limitación, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo o grupos tiol. Usando estos grupos funcionales, el oligonucleótido puede unirse usando grupos funcionales en el usando conectores ya sea directa o indirectamente.

El oligonucleótido también puede unirse al sustrato de forma no covalente. Por ejemplo, puede prepararse un oligonucleótido biotinilado, que puede unirse a superficies recubiertas covalentemente con estreptavidina, dando lugar a la unión. Alternativamente, un oligonucleótido u oligonucleótidos pueden sintetizarse sobre la superficie usando técnicas tales como fotopolimerización y fotolitografía. En la técnica son muy conocidos procedimientos adicionales de unión de oligonucleótidos a matrices y procedimientos de síntesis de oligonucleótidos sobre sustratos; es decir, la tecnología VLSIPS de Affymetrix (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n° 6.566.495, y Rockett y Dix, “DNA arrays: technology, options and toxicological applications”, Xenobiotica 30(2):155-177).

En un aspecto, el oligonucleótido o los oligonucleótidos unidos al sustrato se sitúan en una dirección espacialmente definida de la matriz. Las matrices pueden comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente varios cientos de miles de direcciones o más. En un aspecto, la matriz puede estar compuesta por menos de 10.000 direcciones. En otro aspecto alternativo, la matriz puede estar compuesta por al menos 10.000 direcciones. En otro aspecto alternativo adicional, la matriz puede estar compuesta por menos de 5.000 direcciones. En otro aspecto alternativo adicional, la matriz puede estar compuesta por al menos 5.000 direcciones. En un aspecto adicional, la matriz puede estar compuesta por menos de 500 direcciones. En otro aspecto adicional, la matriz puede estar compuesta por al menos 500 direcciones.

Un oligonucleótido puede estar representado más de una vez en una matriz dada. En otras palabras, más de una dirección de una matriz puede estar compuesta por el mismo oligonucleótido. En algunos aspectos, dos, tres o más de tres direcciones de la matriz pueden estar compuestas por el mismo oligonucleótido. En ciertos aspectos, la matriz puede comprender oligonucleótidos de control y/o direcciones de control. Los controles pueden ser controles internos, controles positivos, controles negativos o controles de segundo plano.

La matriz puede estar compuesta por oligonucleótidos que se hibridan con ADN o ARN que son indicativos de un microbioma tolerante o no tolerante a los edulcorantes artificiales.

En un aspecto, la matriz puede comprender un agente que puede cuantificar o cualificar la presencia de una biomolécula enriquecida en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con el microbioma anfitrión intolerante al agente. En otro aspecto, la matriz puede comprender un agente que puede cuantificar o cualificar la presencia de una biomolécula reducida en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con el microbioma anfitrión intolerante al agente. En otro aspecto adicional, la matriz puede comprender un agente que puede cuantificar o cualificar la presencia de una biomolécula regulada al alza en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con el microbioma anfitrión intolerante al agente. En otro aspecto adicional, la matriz puede comprender un agente que puede cuantificar o cualificar la presencia de una biomolécula regulada a la baja en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con el microbioma anfitrión intolerante al agente. En otro aspecto adicional, la matriz puede comprender un agente que puede cuantificar o cualificar la presencia de una biomolécula degradada en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con el microbioma anfitrión intolerante al agente. En un aspecto alternativo, la matriz puede comprender un agente que puede cuantificar o cualificar la presencia de una biomolécula estabilizada en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con el microbioma anfitrión intolerante al agente.

Por ejemplo, cuando el agente es un edulcorante artificial, la matriz puede comprender oligonucleótidos que se hibridan con secuencias de ADN/ARN que codifican polipéptidos implicados en la vía de degradación de los glicanos (por ejemplo, la vía del glicosaminoglicano).

Además, o alternativamente, cuando el agente es un edulcorante artificial, la matriz puede comprender oligonucleótidos que se hibridan con secuencias de ADN/ARN que codifican polipéptidos implicados en al menos uno o más de los siguientes procesos o vías: metabolismo del almidón y la sacarosa, metabolismo de la fructosa y la manosa, biosíntesis de folatos, biosíntesis de glicerolípidos, biosíntesis de ácidos grasos, vías de transporte de la glucosa, metabolismo del ascorbato y el aldarato, biosíntesis de lipopolisacáridos y/o quimiotaxia bacteriana.

Preferiblemente, están representados en la matriz al menos 2, 5, 10, 15, 20 genes de una vía particular.

En un aspecto, la matriz comprende oligonucleótidos que se hibridan con al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395 o 400 oligonucleótidos indicativos o modulados en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con un microbioma anfitrión intolerante al agente. En otro aspecto, la matriz comprende oligonucleótidos que identifican específicamente al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800 o al menos 900 biomoléculas indicativas o moduladas en el microbioma anfitrión tolerante al agente en comparación con un microbioma anfitrión intolerante al agente.

Los equipos descritos en el presente documento también pueden comprender muestras de control. Según un aspecto, el equipo comprende un control positivo; por ejemplo, un microbioma patológico.

Además, o alternativamente, el equipo comprende un control negativo; por ejemplo, un microbioma no patológico.

El microbioma patológico y el no patológico pueden estar procesados. Así, los microbiomas de control pueden estar representados como polinucleótidos o proteínas aislados.

Alternativamente, el microbioma de control puede estar representado por microbios.

Las muestras de control pueden estar en cualquier forma adecuada; por ejemplo, en forma seca en polvo. Además, las muestras de control pueden haber sufrido procesamiento para aumentar su supervivencia. Por ejemplo, el microorganismo puede estar recubierto o encapsulado en un polisacárido, grasa, almidón, proteína o en una matriz de azúcar. Pueden usarse técnicas estándar de encapsulación conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse las técnicas expuestas en la patente estadounidense n° 6.190.591.

Según otro aspecto adicional de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento de restauración de la tolerancia de un sujeto a un agente que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición probiótica que comprende microbios similares de forma estadísticamente significativa al microbioma no patológico, restaurando con ello la tolerancia del sujeto al agente.

Por ejemplo, la presente divulgación contempla composiciones microbianas (por ejemplo, composiciones probióticas), siendo la mayoría de los microbios de la composición microbios del orden Bacteroidales, del orden Clostridilales, del orden Bactobacillales y/o del orden YS2 para aumentar la tolerancia a los edulcorantes artificiales.

La presente divulgación contempla, además, composiciones microbianas (por ejemplo, composiciones probióticas o antibióticas) para aumentar la tolerancia a la desalineación circadiana.

Por ejemplo, los presentes inventores han demostrado que las muestras de microbiota obtenidas durante el desfase horario mostraban una representación relativa mayor de Firmicutes, lo que se revertía al recuperarse del desfase horario. Así, los agentes que pueden reducir el nivel de Firmicutes en el microbioma pueden ser eficaces para restaurar la tolerancia de un sujeto a la desalineación circadiana.

Según se usa en el presente documento, el término “probiótico” se refiere a cualquier tipo microbiano que esté asociado con beneficios para la salud en un organismo anfitrión y/o con una reducción del riesgo y/o de los síntomas de una enfermedad, un trastorno, una afección o un episodio en un organismo anfitrión. En algunos aspectos, los probióticos se formulan en un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico. En algunos aspectos, los probióticos son tipos de bacterias.

Las composiciones microbianas de este aspecto de la presente divulgación pueden ser similares de forma estadísticamente significativa a un microbioma de un sujeto que se ha descubierto que es tolerante del agente.

Las composiciones microbianas se pueden tomar de una muestra de microbiota del microbioma.

Una muestra de microbiota comprende una muestra de microbios de un microbioma y/o componentes o productos de los mismos.

En algunos aspectos, se recoge una muestra de microbiota por cualquier medio que permita la recuperación de los microbios de un microbioma y sin alterar las cantidades relativas de microbios o componentes o productos de los mismos. El procedimiento particular de recuperación debería estar adaptado a la procedencia del microbioma.

Alternativamente, la composición microbiana puede crearse artificialmente añadiendo cantidades conocidas de diferentes microbios.

Se apreciará que la composición microbiana que se deriva de la muestra de microbiota de un sujeto puede ser manipulada antes de administrarla al aumentar la cantidad de una cepa particular o al reducir la cantidad de una cepa particular. Alternativamente, las composiciones microbianas se tratan de tal manera que no alteren el equilibrio relativo entre las especies microbianas y los taxones comprendidos en las mismas. En algunos aspectos, la composición microbiana es expandida ex vivo usando procedimientos de cultivo conocidos antes de su administración. En otros aspectos, la composición microbiana no es expandida ex vivo antes de su administración.

Según un aspecto, la composición microbiana no deriva de materia fecal.

Según otro aspecto adicional, la composición microbiana carece (o comprende únicamente cantidades traza) de materia fecal (por ejemplo, fibra).

El microorganismo probiótico puede estar en cualquier forma adecuada; por ejemplo, en forma seca en polvo. Además, el microorganismo probiótico puede haber sufrido procesamiento para aumentar su supervivencia. Por ejemplo, el microorganismo puede estar recubierto o encapsulado en un polisacárido, grasa, almidón, proteína o en una matriz de azúcar. Pueden usarse técnicas estándar de encapsulación conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse las técnicas expuestas en la patente estadounidense n° 6.190.591.

Según un aspecto particular, el microorganismo probiótico se formula en un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico.

En algunos aspectos, un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico es o comprende un producto lácteo. En algunos aspectos, un producto lácteo es o comprende un producto de yogur. En algunos aspectos, un producto lácteo es o comprende un producto de leche. En algunos aspectos, un producto lácteo es o comprende un producto de queso. En algunos aspectos, un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico es o comprende un zumo u otro producto derivado de fruta. En algunos aspectos, un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico es o comprende un producto derivado de verduras. En algunos aspectos, un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico es o comprende un producto de granos, incluyendo, sin limitación cereal, galletas saladas, pan y/o avena. En algunos aspectos, un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico es o comprende un producto de arroz. En algunos aspectos, un producto alimenticio, un alimento funcional o un nutracéutico es o comprende un producto cárnico.

Antes de la administración, el sujeto puede ser tratado de antemano con un agente que reduce el número de microbios naturales en el microbioma (por ejemplo, mediante tratamiento con antibióticos). Según un aspecto particular, el tratamiento elimina significativamente la microflora intestinal natural en al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o incluso el 90%.

En algunos aspectos, la administración comprende cualquier medio de administración de una cantidad efectiva (por ejemplo, terapéuticamente efectiva) o, en todo caso, deseable de una composición a un individuo. En algunos aspectos, la administración de una composición comprende la administración por cualquier vía, incluyendo, por ejemplo, vías de administración parenterales y no parenterales. Las vías parenterales incluyen, por ejemplo, vías de inyección intraarterial, intracerebroventricular, intracraneal, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intraportal, intraespinal, intratecal, intravenosa, subcutánea u otras. Las vías no parenterales incluyen, por ejemplo, la bucal, nasal, ocular, oral, pulmonar, rectal, transdérmica o vaginal. La administración también puede ser por perfusión continua, administración local, liberación sostenida desde implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa.

En algunos aspectos, una composición se administra en una cantidad y/o según una pauta posológica que se correlacione con un resultado deseado particular (por ejemplo, con un cambio particular en la composición y/o el distintivo del microbioma que se correlacione con un resultado de interés). En algunos aspectos, el resultado deseado es una tolerancia potenciada a los edulcorantes artificiales, como se ha descrito anteriormente. En algunos aspectos, el resultado deseado es la tolerancia al desfase horario o al trabajo en turnos nocturnos.

Las dosis o cantidades particulares que han de administrarse según la presente divulgación pueden variar dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza y/o del grado del resultado deseado, de los detalles de la vía y/o las horas de administración, y/o de una o más características (por ejemplo, peso, edad, antecedentes personales, característica genética, parámetro de estilo de vida, gravedad de la diabetes y/o nivel de riesgo de diabetes, etc., o combinaciones de los mismos). Las personas con un dominio normal de la técnica pueden determinar tales dosis o cantidades. En algunos aspectos, se determina una dosis o cantidad adecuada según técnicas clínicas estándar. Alternativamente o además, en algunos aspectos, se determina una dosis o cantidad apropiada a través del uso de uno o más ensayos in vitro o in vivo para contribuir a identificar intervalos o cantidades deseables u óptimos de la dosificación que ha de administrarse.

En algunos aspectos particulares, las dosis o cantidades apropiadas que han de ser administrarse pueden extrapolarse de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo en modelos in vitro o animales. La dosis o cantidad efectiva que ha de administrarse para un individuo particular pueden variarse (por ejemplo, incrementarse o disminuirse) en el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. En algunos aspectos, cuando se administran bacterias, una dosificación apropiada comprende al menos aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más células bacterianas. En algunos aspectos, la presente divulgación abarca el reconocimiento de que se puede lograr un mayor beneficio proporcionando números de células bacterianas superiores a aproximadamente 1000 o más (por ejemplo, a aproximadamente 1500, 2000, 2500, 3000, 35000, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 40.000, 50.000, 75.000, 100.000, 200.000, 300.000, 400.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1*106, 2*10®, 3*10®, 4*10®, 5*10®, 6*10®, 7*10® 8*10®, 9*10®, 1*107, 1*108, 1*109, 1*1010, 1X1011, 1*1012, 1*1013 o más bacterias.

Además de tratar a un sujeto con composiciones probióticas, la presente divulgación también contempla tratar a sujetos con composiciones antimicrobianas cuya presencia es sabido que causa intolerancia a un agente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “agente antibiótico” se refiere a un grupo de sustancias químicas, aisladas de fuentes naturales o derivadas de agentes antibióticos aislados de fuentes naturales, que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias y otros microorganismos o de destruirlos, usadas principalmente en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Ejemplos de agentes antibióticos incluyen, sin limitación, Amikacina; Amoxicilina; Ampicilina; Azitromicina; Azlocilina; Aztreonam; Carbenicilina; Cefaclor; Cefepime; Cefetamet; Cefinetazol; Cefixima; Cefonicida; Cefoperazona; Cefotaxima; Cefotetan; Cefoxitina; Cefpodoxima; Cefprozil; Cefsulodina; Ceftazidima; Ceftizoxima; Ceftriaxona; Cefuroxima; Cefalexina; Cefalotina; Cetromicina; Cloranfenicol; Cinoxacina; Ciprofloxacina; Claritromicina; Clindamicina; Cloxacilina; Co-amoxiclavuanato; Dalbavancina; Daptomicina; Dicloxacilina; Doxiciclina; Enoxacina; Estolato de eritromicina; Etil succinato de eritromicina; Glucoheptonato de eritromicina; Lactobionato de eritromicina; Estearato de eritromicina; Eritromicina; Fidaxomicina; Fleroxacina; Gentamicina; Imipenem; Kanamicina; Lomefloxacina; Loracarbef; Meticilina; Metronidazol; Mezlocilina; Minociclina; Mupirocina; Nafcilina; Ácido nalidíxico; Netilmicina; Nitrofurantoína; Norfloxacina; Ofloxacina; Oxacilina; Penicilina G; Piperacilina; Retapamulina; Rifaxamina, Rifampicina; Roxitromicina; Estreptomicina; Sulfametoxazol; Teicoplanina; Tetraciclina; Ticarcilina; Tigeciclina; Tobramicina; Trimetoprima; Vancomicina; combinaciones de Piperacilina y Tazobactam; y sus diversos ácidos, bases, sales y otros derivados. Los agentes antibióticos antibacterianos incluyen, sin limitación, aminoglucósidos, carbacefem, carbapenem, cefalosporinas, cefamicinas, fluoroquinolonas, glicopéptidos, lincosamidas, macrólidos, monobactamas, penicilinas, quinolonas, sulfonamidas y tetraciclinas.

Los agentes antibacterianos también incluyen péptidos antibacterianos. Ejemplos incluyen, sin limitación, abaecina; andropina; apidaecinas; bombinina; brevininas; buforina II; CAP18; cecropinas; ceratotoxina; defensinas; dermaseptina; dermcidina; drosomicina; esculentinas; indolicidina; LL37; magainina; H5 máximo; melitina; moricina; profenina; protegrina y/o taquiplesinas.

Según un aspecto particular, el antibiótico es un antibiótico no absorbible.

Así, por ejemplo, la presente divulgación contempla el tratamiento de un sujeto con un antibiótico que reduce los microbios de los órdenes RF32, Erysipelotrichales, Burkholderiales y/o Campylobacterales para potenciar la tolerancia del sujeto a un edulcorante artificial. Preferiblemente, el antibiótico no tiene eficacia (o tiene una eficacia menor) contra los microbios que son de los órdenes Bacteroidales, Clostridilales, Bactobacillales y/o YS2.

Los presentes inventores han descubierto que los patrones oscilantes del microbioma tienen un impacto en las oscilaciones diarias locales y sistemas del transcriptoma del anfitrión. Los presentes inventores demostrar que la alteración de la microbiota por el tratamiento con antibióticos o en ratones libres de gérmenes reprogramaba el transcriptoma intestinal y hepático del anfitrión de forma que presentaba tanto una pérdida masiva como una génesis de oscilaciones nuevas, lo que dio lugar a la reorganización temporal de las vías metabólicas. En consecuencia, los presentes inventores proponen que el análisis del ritmo del microbioma en el curso de un día puede arrojar información importante en cuanto a la dosis o el régimen de administración de un antibiótico o un probiótico. Así, por ejemplo, si el análisis del ritmo del microbioma muestra que un microbio en particular está en un pico en las horas de la mañana y en un valle en las horas del anochecer, entonces se puede recomendar que se administre un agente probiótico que comprenda este microbio por la mañana y no por la noche para no alterar el ritmo circadiano natural del microbioma. Si el análisis del ritmo del microbioma muestra que un microbio en particular está en un pico en las horas de la mañana y en un valle en las horas del anochecer, entonces se puede recomendar que se administre un agente antibiótico que regule negativamente este microbio por la noche y no por la mañana para no alterar el ritmo circadiano natural del microbioma.

El análisis del microbioma se puede llevar a cabo analizando el nivel de los propios microbios o de los productos (por ejemplo, metabolitos) de los mismos. El análisis del microbioma se describe adicionalmente más arriba en el presente documento.

Para analizar el ritmo del microbioma, deberían medirse en el curso de un periodo de 24 horas al menos dos muestras, al menos 3 muestras, al menos 4 muestras, al menos 5 muestras, al menos 6 muestras o más del microbioma.

Ha de entenderse que, aunque los anteriores tipos de información adicional se describieron por separado, los presentes aspectos contemplan cualquier combinación de dos o más tipos de información para las bases de datos.

Según se usa en el presente documento “aproximadamente” se refiere a ± 10%.

La palabra “ejemplar” se usa en el presente documento con el sentido de “servir de ejemplo, caso o ilustración”. No de interpretarse necesariamente que cualquier aspecto descrito como “ejemplar” sea preferido o ventajoso con respecto a otros aspectos ni/o que excluya la incorporación de características de otros aspectos.

La palabra “opcionalmente” se usa en el presente documento con el sentido de “se proporciona en algunos aspectos y no se proporciona en otros aspectos”. Cualquier aspecto particular de la divulgación puede incluir múltiples características “opcionales”, a no ser que tales características causen un conflicto.

Los términos “comprende”, “comprendiendo”, “incluye”, “incluyendo”, “teniendo” y sus conjugados significan “incluir sin limitación”.

La expresión “constituido por” significa “que incluye y está limitado a”.

La expresión “constituido esencialmente por” significa que la composición, el procedimiento o la estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el procedimiento o la estructura reivindicados.

Según se usa aquí, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen referencias plurales, a no ser que el contexto dicte claramente algo distinto. Por ejemplo, la expresión “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir múltiples compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

En toda esta solicitud, pueden presentarse diversos aspectos de esta divulgación en un formato de intervalo. Debería entenderse que la descripción en el formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse que sea una limitación inflexible en el alcance de la divulgación. En consecuencia, se debería considerar que la descripción de un intervalo divulga específicamente todos los subintervalos posibles, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debería considerar que la descripción de un intervalo como de 1 a 6 divulga específicamente subintervalos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo; por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica con independencia de la anchura del intervalo.

Siempre que en el presente documento se indica un intervalo numérico, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. En el presente documento, las frases “oscilando/que oscila entre” un primer número indicativo y un segundo número indicativo y “oscilando/que oscila de” un primer número indicativo se usan de forma intercambiable y se pretende que incluyan los números indicados primero y segundo y todos los números fraccionarios y enteros entre los mismos.

Diversos aspectos de la presente divulgación delineados en lo que antecede y reivindicados en la sección de reivindicaciones más abajo encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que, junto con las descripciones anteriores, ilustran algunos aspectos de la divulgación de forma no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente divulgación incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook y otros, (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” tomos I-III, Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y otros, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y otros, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren y otros (ed.) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, tomos 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías se definen en las patentes estadounidenses nos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, tomos I-III, Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” de Freshney, Wiley-Liss, Nueva York (1994), tercera edición; “Current Protocols in Immunology”, tomos I-III, Coligan J. E., ed. (1994); Stites y otros (ed.), “Basic and Clinical Immunology” (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, Connecticut (1994); Mishell y Shiigi (ed.), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica; véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., y Higgins S. J., ed. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture”, Freshney, R. I., ed. (1986); “ Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning”, Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology”, vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, California (1990); Marshak y otros, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Se proporcionan a lo largo de este documento otras referencias generales. Se cree que los procedimientos del mismo son muy conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.

Ejemplo 1

El control trans-reino de las oscilaciones diurnas de la microbiota promueve la homeostasis metabólica

Materiales y procedimientos

Ratones: Se adquirieron ratones C57B1/6 de Harlan y se dejó que se aclimataran a las instalaciones locales para animales durante dos semanas antes de usarlos para la experimentación. A no ser que se especifique algo distinto, los ratones se mantuvieron bajo estrictos ciclos de luz y oscuridad, encendiéndose las luces a las 6 de la mañana y apagándose a las 6 de la tarde. En todos los experimentos, se usaron animales de la misma edad y el mismo sexo. Los ratones tenían entre 8 y 9 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Para los experimentos que incluían una dieta rica en grasas, solo se utilizaron ratones machos. Para todos los demás experimentos, se utilizaron ratones machos y hembras. Se recogieron muestras de heces frescas y estudiadas individualmente para cada ratón. Los gránulos frescos se recogieron en tubos, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido tras la recogida y se almacenaron a -80 ° C hasta el aislamiento del ADN.

A no ser que se indique algo distinto, se usaron 10 ratones por grupo experimental para la recogida de materia fecal de cada ratón individual. Para la inducción del desfase horario, se pasó a los ratones entre condiciones de luz controlada (luces encendidas a las 6 de la mañana y apagadas a las 6 de la tarde) y una diferencia horaria de 8 horas (luces encendidas en las 10 de la noche y apagadas a las 10 de la mañana) cada tres días. Los experimentos que se llevaron a cabo en ratones con desfase horario se realizaron cuando estos ratones se encontraban en el mismo ciclo de luz y oscuridad que los ratones de control, y las horas Zeitgeber (ZT) estaban sincronizadas (es decir, la ZT0 de los ratones con desfase horario correspondía a la ZT0 de los ratones de control, ya que todos los ratones estuvieron expuestos a las mismas condiciones de luz y oscuridad al inicio de la recogida de muestras).

En los experimentos de restricción de alimentos, los ratones se alojaron en condiciones estándar de luz y oscuridad (de 6 de la mañana a 6 de la tarde), pero tuvieron acceso a los alimentos solo durante la fase de luz u oscuridad, respectivamente, durante dos semanas. Para el tratamiento con antibióticos, se administró a los ratones una combinación de vancomicina (1 g/l), ampicilina (1 g/l), kanamicina (1 g/l) y metronidazol (1 g/l) en el agua de beber (Rakoff-Nahoum y otros, 2004). Todos los antibióticos se obtuvieron de Sigma Aldrich. Se administraron antibióticos durante toda la duración de los experimentos, es decir, desde el inicio de la inducción del desfase horario hasta el punto final del experimento. Para experimentos con ratones gnotobióticos, se alojaron ratones Swiss Webster libres de gérmenes en aisladores estériles. Para los experimentos de trasplante fecal, se resuspendieron 100 mg de heces en 1 ml de PBS, se homogeneizaron y se filtraron a través de un colador de 70 mm. A los ratones receptores se les administró por sonda 200 pl del filtrado. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el IACUC local.

Muestras humanas: La recogida de heces de seres humanos se llevó a cabo usando hisopos estériles de algodón y se las almacenó a temperatura ambiente hasta su llegada al laboratorio, donde se realizó la extracción de ADN. La recogida de heces humanas fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Sourasky de Tel Aviv. En experimentos que implicaban la recogida de heces humanas en múltiples momentos del día, los sujetos comieron cuatro comidas por día y se recogieron muestras fecales después de la ingesta de alimentos.

Análisis taxonómicos de la microbiota: Se procesaron muestras fecales congeladas para el aislamiento del ADN usando un equipo MoBio PowerSoil según las instrucciones del fabricante. Se usó 1ng del ADN fecal purificado para la amplificación por PCR y la secuenciación del gen del ARNr 16S bacteriano. Los amplicones que abarcan la región variable 2 (V2) del gen del ARNr 16S se generaron usando los siguientes cebadores con códigos de barras: : dir 5'-NNNNNNNNAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 1), inv 5-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 2), representando N una base de código de barras. Posteriormente, las reacciones se combinaron en una proporción equimolar, se purificaron (equipo de limpieza de PCR, Promega) y se usaron para la secuenciación de Illumina MiSeq. Se empleó una secuenciación de extremos emparejados de 500 pb. Luego, las lecturas se procesaron usando el flujo funcional de análisis QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology, www.qiime.org), descrito en Caporaso y otros, 2010; Elinav y otros, 2011. Sucintamente, se utilizaron como entradas ficheros de calidad fasta y un fichero de correlaciones que indica la secuencia de código de barras correspondiente a cada muestra, las lecturas se dividieron por muestras de acuerdo con el código de barras, la clasificación taxonómica se realizó utilizando el clasificador RDP, se construyó un árbol taxonómico de novo de las secuencias en función de la similitud de secuencias y se creó una tabla UTO. Después de la eliminación de la quimera, el número promedio de lecturas por muestra fecal fue de 34.847. Las secuencias que comparten una identidad de secuencia de nucleótidos del 97% en la región V2 se agruparon en unidades taxonómicas operativas (UTO con ID del 97%) usando uclust; las secuencias quiméricas se eliminaron usando ChimeraSlayer.

Correlación de secuencias metagenómicas. Las lecturas de secuenciación de Illumina se correlacionaron con un catálogo de genes microbianos intestinales [20203603] usando un correlacionador GEM [23103880] con los siguientes parámetros: -m 0,08 -s 0 -q desfase-33 -umbral-de-calidad-gem 26.

Asignación funcional. A las lecturas correlacionadas con el catálogo de genes microbianos intestinales se les asignó un número de identificación KEGG [10592173, 24214961] según la correlación de gen a categoría que acompañaba a cada una de estas bases de datos. Posteriormente, los genes se correlacionaron con módulos y vías KEGG. Para el análisis de vías KEGG solo se incluyeron las vías cuya cobertura génica estaba por encima de 0,2. Acto seguido, las vías KEGG fueron sometidas a oscilaciones diarias por el ciclo JTK.

Evaluación de tolerancia a la glucosa: Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 horas y, posteriormente se les administraron 200pl de una solución de glucosa de 0,2g/ml (JT Baker) mediante sonda oral. La glucosa en sangre se determinó 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutes después de la prueba de provocación con glucosa (medidor de glucosa en sangre Contour™, Bayer, Suiza).

Formación de imágenes por resonancia magnética: Los ratones fueron anestesiados con isofluorano (5% para la inducción, 1-2% para el mantenimiento) mezclado con oxígeno (1 litro/min) y administrado a través de una mascarilla nasal. Una vez anestesiados, los animales se colocaron en un soporte para la cabeza para asegurar un posicionamiento reproducible dentro del imán. La frecuencia respiratoria se controló y mantuvo durante todo el periodo experimental en torno a 60-80 respiraciones por minuto. Los experimentos de resonancia magnética se realizaron en el sistema 9.4 Tesla BioSpec Magnet 94/20 USR (Bruker, Alemania) equipado con un sistema de bobinas de gradiente capaz de producir gradientes de impulsos de hasta 4-10'3 tesla/cm en cada una de las tres direcciones. Todas las imágenes de RM se habían obtenido con una bobina resonadora en cuadratura (Bruker). El protocolo de resonancia magnética incluyó dos conjuntos de imágenes de resonancia magnética ponderadas por T2 de múltiples cortes coronales y axiales. Las imágenes ponderadas por T2 se obtuvieron utilizando la secuencia RARE de múltiples cortes (TR = 2500 ms, TE = 35 ms, factor RARE = 8), y el tamaño de la matriz fue de 256 x 256, cuatro promedios, correspondientes a un tiempo de adquisición de imágenes de 2 minutos 40 segundos por conjunto. El primer conjunto se utilizó para obtener 21 cortes axiales con un grosor de corte de 1,00 mm (sin discontinuidad). El campo de visión se seleccionó con 4,2 x 4,2 cm2 El segundo conjunto se utilizó para obtener 17 cortes coronales con un grosor de corte de 1,00 mm (sin discontinuidad). El campo de visión se seleccionó con 7,0 x 5,0 cm2.

La grasa total y la magra de los ratones se midieron mediante EchoMRI-100™ (Echo Medical Systems, Houston, Texas).

Estudios metabólicos: La ingesta de alimentos y la actividad locomotriz se midieron utilizando el sistema PhenoMaster (TSESystems, Bad Homburg, Alemania), que consiste en una combinación de sensores de alimentación sensibles para la medición automatizada y un sistema de monitorización de actividad basado en rayos fotoeléctricos que detecta y registra los movimientos ambulatorios, incluidos la erección sobre las patas de atrás y la escalada, en cada jaula. Todos los parámetros se midieron de forma continua y simultánea. Los ratones se entrenaron en alojamientos individuales en jaulas idénticas antes de la obtención de datos.

Análisis de expresión génica: Los tejidos se preservaron en una solución RNAlater (Ambion) y posteriormente se homogeneizaron en reactivo Trizol (Invitrogen). Las células clasificadas por FACS se resuspendieron en reactivo Trizol. El ARN se purificó según las instrucciones del fabricante. Se usó un microgramo de ARN total para generar ADNc (equipo HighCapacity cDNA Reverse Transcription; Applied Biosystems). Se efectuó una PCR de tiempo real usando conjuntos de cebadores/sondas específicos de genes (Applied Biosystems) y el equipo Kapa Probe Fast qPCR (Kapa Biosystems) en un instrumento Viia7 (Applied Biosystems). Las condiciones de la PCR fueron 95°C durante 20 s, seguidos por 40 ciclos de 95°C durante 3 s y 60°C durante 30 s. Los datos se analizaron usando el procedimiento deltaCt con hprtl que sirve de gen de mantenimiento de referencia.

Análisis estadístico: Los datos se expresan como media ± S.E.M. Para el análisis de las oscilaciones rítmicas y sus amplitudes, se usó la prueba no paramétrica del ciclo JTK (Hughes y otros, 2010), que incorpora una ventana de 18­ 24 horas para la determinación de la periodicidad circadiana. Se consideraron significativos los valores P < 0,05. Se usó el procedimiento de Benjamini-Hochberg para controlar la tasa de falsos descubrimientos. Los resultados del ciclo JTK se proporcionan en tablas suplementarias. Las diferencias en los datos metabólicos se analizaron mediante ANOVA, y se efectuó un análisis post hoc para una comparación de múltiples grupos. Se realizó una comparación por pares entre los datos de transcritos del anfitrión usando la prueba t de Student. Se efectuaron el ANOVA y la prueba t usando el soporte lógico GraphPad Prism.

Resultados

Para determinar los cambios longitudinales de la composición de microbiota en el curso de un día, se realizó un análisis taxonómico de la microbiota fecal de los ratones cada 6 horas para dos ciclos de luz y oscuridad (Figura 1A). Todos los ratones fueron alimentados ad libitum, alojados en estrictas condiciones de luz y oscuridad de 24 horas, manteniéndose las luces encendidas durante 12 horas. Las muestras se tomaron en los momentos de cambio de condiciones de luz (horas Zeitgeber (ZT) 12 y 0, es decir, “anochecer” y “amanecer”, respectivamente) y en el punto medio de las fases de oscuridad y luz (ZT 18 y 6, respectivamente). Se usó el algoritmo no paramétrico de uso común ciclo JTK para detectar elementos rítmicos en el conjunto de datos taxonómicos (Hughes y otros, 2010). Llamativamente, se detectaron fluctuaciones diurnas significativas (p <0,05) en la abundancia de más del 15% de todas las unidades taxonómicas operativas (UTO) bacterianas (Figura 1B). Los grupos de bacterias fluctuantes presentaban horas distintivas de acrofase y batifase con un periodo de 24 horas. Los géneros bacterianos que oscilaban rítmicamente en un ciclo de 24 horas pertenecían a abundantes órdenes taxonómicos; concretamente, Clostridiales, Lactobacillales y Bacteroidales, de modo que las UTO oscilantes rítmicamente representaban alrededor del 60% de la composición de la microbiota y daban lugar a configuraciones taxonómicas específicas a la hora del día (Figuras 1C y 1D). Se encontraron fluctuaciones circadianas muy robustas, por ejemplo, en Lactobacillus reuteri y Dehalobacterium spp. (Figuras 1E y 1F). La ritmicidad fue reproducible independientemente de las condiciones de alojamiento o de los efectos de la jaula (datos no mostrados). Estos resultados se confirmaron con una resolución de muestreo más fina durante un periodo de muestreo más largo, con muestras de heces recogidas cada 4 horas durante 4 días consecutivos (Figuras 2A-D).

Los presentes inventores analizaron a continuación si estas oscilaciones diurnas en la composición de la microbiota tienen consecuencias para las capacidades funcionales de la comunidad microbiana intestinal en el curso de un día. Se realizó la secuenciación metagenómica aleatoria de muestras fecales recogidas cada 6 horas en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad y las lecturas metagenómicas se correlacionaron con un catálogo de genes microbianos intestinales (Qin y otros, 2010). Si bien la mayoría de genes mostraron un nivel estable en el curso de un día, ciertos grupos de genes (como los genes involucrados en el ensamblaje flagelar y la degradación de glicosaminoglicanos, Figuras 1G y 1H) presentaron una variación más fuerte en abundancia. Para probar si tales fluctuaciones en genes pertenecientes a entidades funcionales siguen ritmos diurnos, los genes se agruparon en vías KEGG (Kanehisa y Goto, 2000; Kanehisa y otros, 2014) y se empleó el algoritmo ciclo JTK para detectar las oscilaciones que se producen con un ritmo de 24 horas. Curiosamente, el 23% de todas las vías con cobertura génica superior a 0,2 presentaban ritmicidad diurna (Figura 11). Entre estas se encuentran las vías involucradas en la homeostasis de los ácidos nucleicos, incluido el metabolismo de los nucleótidos (Figura 2E), el metabolismo de los aminoácidos (Figura 2F) y la degradación del moco (Figura 2G).

Estos resultados sugieren la existencia de perfiles de funcionalidad de la microbiota específicos a la hora del día. Curiosamente, parecía que distintos grupos funcionales presentaban fluctuaciones antifásicas coordinadas (Figura 1J). Por ejemplo, las funciones involucradas en el metabolismo energético, la reparación del ADN y el crecimiento celular se realizaron favorablemente durante la fase de oscuridad (Figura 1K), mientras que la fase con luz presentó una mayor abundancia de vías de “mantenimiento” implicadas en la desintoxicación, la motilidad y la detección ambiental. Por ejemplo, los genes que realizan funciones en el ensamblaje flagelar, la quimiotaxia bacteriana y la secreción de tipo III fueron más abundantes durante la fase con luz (Figura 2H).

Juntos, estos resultados revelan fluctuaciones en la composición y la función de la microbiota en una escala de horas, que siguen una ritmicidad de 24 horas, y que dan como resultado oscilaciones robustas y configuraciones específicas a la hora del día.

Se requiere un reloj circadiano funcional del anfitrión para las oscilaciones diurnas de la microbiota

Es importante destacar que la ritmicidad diurna intestinal observada de la microbiota estuvo presente a pesar de la falta de exposición microbiana directa a alteraciones ambientales de luz y oscuridad. Los presentes inventores buscaron así determinar cómo se generan estas fluctuaciones rítmicas en la composición de la microbiota en un periodo de 24 horas. El reloj biológico del anfitrión está sincronizado con las variaciones ambientales diurnas y nocturnas por los componentes moleculares del reloj circadiano. Para probar si el reloj circadiano del anfitrión es necesario para la ritmicidad diurna en la composición de la microbiota, se utilizaron ratones Per1/2-/-, que son deficientes en un reloj funcional del anfitrión (Adamovich y otros, 2014). Se realizó una comparación taxonómica entre la microbiota de ratones de la forma natural y Per1/2-/- en cada fase del ciclo de luz y oscuridad durante 48 horas, y luego se utilizó el algoritmo ciclo JTK para identificar los elementos rítmicos. En particular, los ratones Per1/2-/-demostraron una pérdida casi completa de las fluctuaciones rítmicas en la abundancia de bacterias comensales (Figura 3A), como lo ejemplifican las Bacteroidales (Figura 3B). El patrón rítmico observado en ratones de la forma natural fue reemplazado por una fluctuación aleatoria de abundancia en ratones con reloj deficiente con una reducción en el número de unidades taxonómicas bacterianas oscilantes (Figura 3C).

Para determinar si la pérdida de oscilaciones composicionales tiene alguna consecuencia para el perfil metagenómico diurno, se realizó secuenciación aleatoria de microbiota de ratones Per1/2r1- y se compararon los resultados con ratones de la forma natural en cada fase del día. Los patrones diurnos en las vías metagenómicas observados en ratones de la forma natural eran inexistentes en ratones deficientes en Per1/2 (Figuras 3D y 3E), y en su lugar fueron reemplazados por niveles principalmente invariantes de actividad de la vía a lo largo del ciclo de luz y oscuridad. Por tanto, la actividad preferente de determinadas funcionalidades durante la fase con luz o de oscuridad se perdió en ratones Per1/2-/-. Por ejemplo, las vías involucradas en el metabolismo de las vitaminas (Figura 3F), en el metabolismo de los nucleótidos (Figura 3G), en los sistemas bicomponentes y de secreción (Figura 3H), en la reparación del ADN (Figura 4A), en la síntesis de la pared celular (Figura 4b ) y en la motilidad. (Figura 4C) perdieron su ritmicidad diurna en ratones Per1/2-/-. En conjunto, estos datos indican que se requiere un reloj circadiano funcional del anfitrión para la generación de fluctuaciones diurnas en la composición y la función de la microbiota intestinal.

Es importante destacar que los presentes inventores también notaron disbiosis en ratones deficientes en Per1/2, como se evidencia en la menor alfadiversidad (Figura 4D) y porque presentaban una composición de la comunidad intestinal distinta en comparación con los controles (Figura 4E). Algunas de las mayores diferencias en la composición de la microbiota entre ratones de la forma natural y los deficientes en Per1/2 se encontraron en géneros bacterianos que experimentan fluctuaciones diurnas en ratones de la forma natural (Figuras 4F). Para descartar la posibilidad de que la disbiosis y la pérdida de oscilaciones diurnas de la microbiota estén intrínsecamente interconectadas, se analizaron otros ratones disbióticos modificados genéticamente para detectar la existencia de oscilaciones diurnas de la microbiota. Se seleccionaron ratones deficientes en la ASC adaptadora de los inflamasomas, un modelo que se ha descrito recientemente que presenta una disbiosis funcionalmente importante y bien definida (Elinav y otros, 2011; Henao-Mejía y otros, 2012). De hecho, las comunidades fecales de ratones de la forma natural y ratones ASC-1- diferían en alfa y beta-diversidad (Figuras 4G y 4H). No obstante, las UTO bacterianas de los ratones ASC-1- mostraron oscilaciones de composición significativas, identificadas por el ciclo JTK (Figuras 4I y 4J). Por lo tanto, se puede concluir que las oscilaciones diurnas de la microbiota están presente en diferentes configuraciones de microbiota, y que la disbiosis composicional y la pérdida de la ritmicidad diurna pueden producirse de manera independiente entre sí.

Las oscilaciones diurnas de la microbiota son controladas por la hora de alimentación

Los presentes inventores se propusieron a continuación determinar el mecanismo por el cual el reloj circadiano del anfitrión participa en la generación de oscilaciones composicionales microbianas en el intestino. El reloj circadiano del anfitrión controla la ritmicidad de muchas funciones fisiológicas, incluido el consumo de alimentos (Turek y otros, 2005). Por el contrario, las horas de alimentación son fundamentales para armonizar y sincronizar los relojes periféricos (Asher y otros, 2010; Hoogerwerf y otros, 2007; Stokkan y otros, 2001). Los roedores son animales nocturnos que comen preferentemente durante la fase de oscuridad (Figura 4K). En cambio, los ratones Per1/2-/-presentan un ritmo de alimentación diurno muy atenuado y consumen alimentos de forma continua a lo largo del día (Figura 4L). Por lo tanto, es plausible que la ritmicidad de la microbiota en un anfitrión normal de la forma natural sea impulsada por sus hábitos alimentarios diurnos, mientras que la disminución de la ritmicidad de la microbiota en ratones Per1/2-/- sea secundaria a su momento de consumo de alimentos profundamente alterado. Para ello, se realizó un experimento de alimentación temporizada en el que se dio acceso al alimento a ratones de la forma natural solo durante la fase con luz o solo durante la fase de oscuridad (Figuras 5A, 6A y 6B). En consonancia con la capacidad de la alimentación programada para armonizar los relojes periféricos, esta inversión de los hábitos alimentarios invirtió el patrón de expresión de los genes del reloj intestinal (Figura 6C). Después de dos semanas de alimentación programada continua, se recogieron muestras fecales de microbiota cada 6 horas durante dos ciclos consecutivos de luz y oscuridad. Usando el algoritmo ciclo JTK, se encontró que las oscilaciones de la microbiota en el grupo alimentado en la fase de oscuridad eran similares a las de los ratones alimentados ad libitum, reflejando los hábitos alimentarios normales principalmente nocturnos de los roedores (Figuras 5B-5F, 6D). En cambio, las UTO cíclicas a menudo presentaban fases distintas entre los grupos alimentados en la fase de oscuridad y los alimentados en la fase con luz (Figuras 5C-5F y 6D). La mayoría de las UTO cíclicas parecían exhibir un cambio de fase de aproximadamente 12 horas tras la modificación de las horas de alimentación, lo que sugiere un control directo de los ritmos de la microbiota mediante las horas de alimentación. Este cambio de fase se observó, por ejemplo, en el caso de Bacteroides acidifaciens (Figura 5C), Lactobacillus reuteri (Figura 5D) y Peptococcaceae (Figura 5E). Los presentes inventores también observaron casos de ritmicidad mejorada o de novo en los grupos alimentados con luz, ejemplificados por Candidatus arthromitus (Figura 5F). Estos resultados sugieren que las horas de alimentación influyen en las fluctuaciones diarias en la composición de la microbiota y que las oscilaciones en abundancia de bacterias comensales pueden controlarse mediante la alimentación programada.

En consecuencia, si las horas de alimentación controlan directamente las fluctuaciones diurnas en la composición de la microbiota, entonces la alimentación cronometrada debería rescatar la pérdida de tales fluctuaciones en ratones deficientes en el reloj circadiano. Por lo tanto, los presentes inventores realizaron un experimento similar de restricción de alimentos en ratones Per1/2-'- y se analizaron muestras de microbiota cada 6 horas durante dos ciclos de luz y oscuridad después de dos semanas de alimentación programada. De hecho, tanto los ratones Per1/2r1- alimentados en la fase con luz como los alimentados en la fase de oscuridad, pero no alimentados ad libitum presentaban UTO bacterianas significativamente oscilantes, lo que demuestra una generación de ritmicidad de novo en una composición comunitaria anteriormente arrítmica (Figuras 5G y 6E).

De forma similar a los ratones de la forma natural sometidos a alimentación programada, la fase de oscilaciones de la microbiota siguió a la hora de alimentación en ratones Per1/2r1-, y las UTO oscilantes mostraron cambios de fase entre ratones alimentados en la fase de oscuridad y los alimentados en la fase con luz (Figura 6E). Por ejemplo, las oscilaciones en Lactobacillus reuteri (Figura 5H) y Bacteroides (Figura 5I) observadas en ratones P e r1 /2 alimentados en la fase de oscuridad siguieron los patrones observados en ratones de la forma natural alimentados ad libitum o alimentados en la fase de oscuridad, mientras que el grupo alimentado en la fase con luz exhibió ciclos opuestos. Estos resultados demuestran que la alimentación rítmica puede reconstituir las oscilaciones UTO en ratones Per1/2r1-(Figura 5J).

Para corroborar aún más la centralidad de la ritmicidad de alimentación del anfitrión en el control de las oscilaciones de la microbiota, se trasplantó la microbiota de ratones Per1/2r1- (que carecían de fluctuaciones diurnas) a ratones libres de gérmenes alojados en condiciones normales de luz y oscuridad (Figura 5K). Tras el trasplante fecal, los ratones libres de gérmenes colonizados exhibieron actividad nocturna y patrones metabólicos regulares (Figuras 6F y 6G). Esto también se observó cuando se realizaron trasplantes de control con microbiota de ratones de la forma natural (Figura 6H). En particular, una semana después del trasplante en el anfitrión libre de gérmenes, la microbiota fecal de ratones Per1/2-'- presentaba una ritmicidad diurna normalizada (Figuras 5L). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que la ritmicidad de la ingesta de alimentos dicta las oscilaciones diarias en la composición de la microbiota, y que la ritmicidad de la microbiota es un proceso flexible que se puede perder o recuperar en respuesta a cambios en los comportamientos alimentarios. Por lo tanto, las horas de alimentación acoplan los patrones circadianos de comportamiento del anfitrión con fluctuaciones diurnas en la composición y la función de la microbiota.

La alteración ambiental de los patrones normales de sueño induce la pérdida de la ritmicidad diurna de la microbiota y la disbiosis

Los presentes inventores se propusieron a continuación evaluar la relevancia fisiológica de la ritmicidad diurna de la microbiota. En los seres humanos, las alteraciones del reloj circadiano a menudo ocurren en el entorno del trabajo por turnos y del desfase horario crónico, donde las condiciones de luz externa cambian con frecuencia y afectan a la capacidad del reloj molecular para adaptarse a un ritmo estable. Esta situación se imitó en ratones mediante el uso de un modelo de desfase horario en el que los ratones se expusieron a un turno de 8 horas cada tres días (Figura 7A). Este modelo simula la situación de desfase horario inducida por vuelos frecuentes entre países con una diferencia horaria de 8 horas e igualmente imita un escenario de cambio regular entre el trabajo por turnos de día y de noche (Huang y otros, 2011; Yamaguchi y otros, 2013). Después de cuatro semanas de inducción del desfase horario, los ratones volvieron a las condiciones del ciclo de luz inicial y fueron analizados un día después del último cambio horario. La inducción de desfase horario dio lugar a la pérdida de la actividad física rítmica del anfitrión (Figuras 8A y 8B). Al igual que en los seres humanos, desfase horario también condujo a un patrón irregular de los ritmos de ingesta de alimentos, lo que dio lugar a una pérdida de las variaciones día-noche en el consumo de alimentos (Figuras 7B y 8C). Sin embargo, la cantidad diaria total de ingesta de alimentos no se vio afectada entre los ratones de control y los que tenían desfase horario (Figura 7B). La inducción de desfase horario con éxito también fue confirmada por un cambio en las oscilaciones del transcrito del reloj periférico (Figuras 8D-8F).

Dado el hallazgo de que la ingesta rítmica de alimentos induce fluctuaciones diurnas en la microbiota, los presentes inventores examinaron si estas alteraciones del comportamiento rítmico por desfase horario también afectarían a las oscilaciones diurnas en la composición de la microbiota. Para ello, se realizó un análisis taxonómico de la composición de la microbiota cada 6 horas en ratones con desfase horario y se evaluó la ritmicidad mediante ciclo JTK. De manera análoga a los ratones deficientes en el reloj circadiano, los ratones con desfase horario presentaban una abrogación de los ritmos bacterianos con un número reducido de unidades taxonómicas bacterianas oscilantes (Figuras 7C-E). En conjunto, de forma similar a la alteración genética del reloj circadiano, la anulación de los patrones oscilatorios diarios inducida por el entorno se asocia con la pérdida de la ritmicidad diurna en la composición de la microbiota.

Dado que se observó disbiosis en ratones genéticamente deficientes en el reloj, se analizó la composición de la comunidad de ratones con desfase horario después de 4 semanas de cambios horarios. De hecho, la composición de la microbiota difirió levemente entre el control y los ratones con desfase horario (Figura 7F). Cuando se hizo un seguimiento de los ratones durante un periodo de 16 semanas de desplazamiento horario continuo, se intensificó la disbiosis (Figura 7G) y se vieron afectadas las unidades taxonómicas que se encontraron oscilantes en ratones de la forma natural (Figura 7H). En conjunto, estos datos sugieren que la alteración genética o ambiental crónica del ciclo de luz y oscuridad de los mamíferos se manifiesta como alteraciones significativas en los ritmos de alimentación y como el no mantenimiento de la composición y la ritmicidad de la microbiota.

La disbiosis asociada con la alteración del reloj ambiental impulsa la enfermedad metabólica

El desfase horario crónico y el trabajo por turnos son patrones de comportamiento que se han generalizado en los seres humanos solo recientemente, tras la revolución industrial. Estos patrones de comportamiento recientemente introducidos se asocian con un mayor riesgo de obesidad, diabetes y enfermedades cardiovasculares, estados patológicos todos que han surgido en paralelo en las poblaciones humanas modernas (Archer y otros, 2014; Buxton y otros, 2012; Fonken y otros, 2010; Scheer y otros, 2009; Suwazono y otros, 2008). Dado que se encontró que la pérdida de las oscilaciones de la microbiota y la disbiosis estaban asociadas con la desfase horario en ratones, los presentes inventores se propusieron evaluar si la microbiota involucrada en los desequilibrios metabólicos está asociada con ritmos circadianos alterados. Primero establecieron que desfase horario se asocia con manifestaciones del síndrome metabólico. Los ratones con desfase horario y los de control fueron alimentados con una dieta rica en grasas, que contenía un 60% de la energía calórica procedente de las grasas, imitando así los hábitos alimentarios humanos que predisponen al síndrome metabólico. De hecho, solo 6 semanas después de la instauración de una dieta rica en grasas, los ratones con desfase horario mostraron una potenciación en el aumento de peso y una intolerancia exacerbada a la glucosa en comparación con los ratones mantenidos en una ritmicidad circadiana normal (Figuras 9A-9C).

Dado que la ingesta total de alimentos no fue diferente entre los ratones de la forma natural y los que tenían desfase horario (Figura 7B), se planteó la hipótesis de que las alteraciones en la composición de la microbiota puedan contribuir a este fenotipo metabólico. De hecho, el tratamiento con antibióticos de amplio espectro (vancomicina, ampicilina, kanamicina y metronidazol en el agua de beber (Fagarasan y otros, 2002; Rakoff-Nahoum y otros, 2004)) durante la inducción del desfase horario abrogó la obesidad y la intolerancia a la glucosa en ratones con desfase horario (Figuras 9A-9C). La obesidad en ratones con desfase horario se asoció con una mayor masa grasa, la cual fue rescatada por tratamiento con antibióticos (Figuras 9D y 9E). La formación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) reveló que esta acumulación de masa grasa dio lugar a un aumento de la deposición de grasa subcutánea y visceral en ratones que fueron sometidos a un desfase horario crónico (Figura 9J).

Es de destacar que la tolerancia a la glucosa por sí misma subyace a la variación circadiana (Kaasik y otros, 2013; So y otros, 2009). No obstante, las diferencias diurnas en la intolerancia a la glucosa entre los grupos con desfase horario y de control persistieron independientemente del momento diario de la medición (datos no mostrados). La alteración de los patrones de comportamiento nocturno y alimentación en ratones con desfase horario no se vio afectada por la dieta rica en grasas o el tratamiento con antibióticos (Figuras 10A-10F). Aunque la alimentación rica en grasa sí redujo en cierta medida la cantidad de UTO oscilantes (Figuras 10G-I), las oscilaciones de la microbiota persistieron después de una semana de tratamiento con antibióticos (Figuras 10J-K).

Para resaltar aún más que el efecto adverso inducido por desfase horario sobre la homeostasis del peso era independiente de la composición dietética, los ratones con desfase horario mantenidos con una dieta de comida regular durante cuatro meses presentaron un mayor peso corporal y una mayor masa de grasa corporal en que sus controles sin desfase horario (Figura 9F).

Para corroborar aún más el papel de la microbiota alterada en los desequilibrios metabólicos observados en ratones con desfase horario, se realizó la transferencia fecal de configuraciones de control o de microbiota con desfase horario a ratones Swiss Webster libres de gérmenes. Los receptores de la microbiota con desfase horario presentaron una ganancia de peso y una intolerancia a la glucosa mayores que los receptores de la microbiota de control (Figuras 9G y 9H).

Además, de forma similar a sus respectivos donadores, los receptores de microbiota de ratones con desfase horario presentaron un aumento significativo en la adiposidad corporal (Figura 9I). La resonancia magnética mostró un aumento de la grasa corporal en ratones libres de gérmenes que habían recibido microbiota de donadores con desfase horario (Figura 9K). En conjunto, estos resultados demuestran que los trastornos metabólicos asociados a desfase horario son transmisibles por la microbiota.

La microbiota humana presenta oscilaciones diurnas y disbiosis asociada con el desfase con consecuencias metabólicas

Por último, los presentes inventores examinaron si los hallazgos en modelos animales pueden aplicarse a seres humanos. En primer lugar, determinaron las variaciones de la comunidad de microbiota en muestras fecales humanas de dos sujetos recogidas en múltiples momentos durante el día durante varios días consecutivos (Figura 11A). Utilizando la secuenciación 16S, se encontraron fluctuaciones diurnas en la abundancia de hasta el 10% de todas las UTO bacterianas (Figuras 11B y 11C).

De manera similar a lo que se encontró en ratones, las UTO oscilantes presentan distintas acrofases y batifases en el curso de un día (Figura 11D). Se encontraron oscilaciones robustas, por ejemplo, en Paraacteroides (Figura 11E), Lachnospira (Figura 12A) y Bulleida (Figura 12B). La ritmicidad diurna en la abundancia de UTO dio lugar a configuraciones de la comunidad de microbiota específicas al día con un patrón repetitivo durante el periodo de tiempo observado (Figura 12C). El análisis metagenómico de muestras humanas se realizó en múltiples momentos de un día. Se encontró que alrededor del 20% de todas las vías con una cobertura génica superior a 0,2 exhibieron un patrón de abundancia diurna (Figuras 11F), como ejemplifican los genes que pertenecen a las vías de degradación de dioxinas (Figura 12D). De forma análoga a los hallazgos en ratones, distintas entidades funcionales presentaban abundancia preferencial en diferentes momentos del día. Por ejemplo, el metabolismo energético y la producción de proteínas se realizaron preferentemente durante la fase con luz, mientras que las vías de desintoxicación estuvieron principalmente activas durante la noche (Figuras 11G y 11H). Las fases máximas de la actividad de la vía ocurrieron en momentos opuestos del día en comparación con la microbiota del ratón (Figura 111), como se cabría esperar del comportamiento diurno en contraposición del nocturno del anfitrión. En conjunto, estos datos sugieren que, al igual que en los ratones, los componentes de la microbiota intestinal humana pueden sufrir variaciones diurnas en su composición y función.

Además, los datos en ratones sugieren que la interrupción del reloj circadiano por ciclos aberrantes de actividad del sueño conduce a una composición de microbiota aberrante. El modelo de desfase horario que se aplicó en ratones corresponde al desfase horario inducido por volar entre países con una diferencia horaria de 8 horas. Por lo tanto, los presentes inventores recogieron muestras fecales de dos donadores humanos sanos que se sometieron a un cambio horario de 8-10 horas inducido por un vuelo (volando desde las zonas horarias del centro o el oeste de los Estados Unidos a Israel) y realizaron un análisis taxonómico un día antes de la inducción de desfase horario inducido por el viaje, durante el desfase horario (un día después del aterrizaje), y después de la recuperación del desfase horario (dos semanas después del aterrizaje) (Figura 13A). De hecho, las comunidades de microbiota mostraron un cambio en la composición inducido por el cambio horario, detectado 24 horas desde el comienzo del desfase horario (Figura 13B y Tablas A y B). Las muestras de microbiota obtenidas durante el desfase horario mostraron una mayor representación relativa de Firmicutes, lo que revirtió al recuperarse del desfase horario.

Curiosamente, el Firmicutes se ha asociado con una mayor propensión a la obesidad y la enfermedad metabólica en múltiples estudios en seres humanos (Ley y otros, 2006; Ridaura y otros, 2013). Para analizar si los cambios en la microbiota en individuos con desfase horario se asociaban con una mayor susceptibilidad a enfermedades metabólicas, se realizaron experimentos de transferencia fecal a ratones libres de gérmenes de muestras humanas obtenidas de sujetos individuales antes del desfase horario, 24 horas desde el comienzo del desfase horario y después de la recuperación del desfase horario (Figura 13C).

Los ratones libres de gérmenes colonizados con microbiota de individuos con desfase horario mostraron una potenciación del aumento de peso y presentaron niveles más altos de glucosa en sangre después de la prueba de glucosa oral que las muestras tomadas antes del cambio horario (Figuras 13D y 13E). Este efecto metabólico se anuló después de la recuperación del desfase horario (Figuras 13D y 13E).

Además, los receptores de microbiota libres de gérmenes del estado de desfase horario acumularon más grasa corporal que los ratones que recibieron microbiota de los mismos sujetos antes o después del desfase horario (Figura 13F). Aunque preliminares, estos datos en conjunto sugieren que algunos representantes comensales de la microbiota humana pueden sufrir oscilaciones diurnas, que la desalineación circadiana en seres humanos se asocia con la disbiosis y que la comunidad microbiana puede contribuir a desequilibrios metabólicos.

Tabla A

Tabla B

______________________________________________________

Exposición

En este ejemplo, los presentes inventores describen que la microbiota intestinal de los mamíferos presenta oscilaciones diurnas que se rigen por la ritmicidad del consumo de alimentos. Si las horas de alimentación rítmica se distorsionan, como en el caso de la deficiencia del reloj genético o el desfase horario inducido por el cambio horario, las oscilaciones de la microbiota se deterioran (Figura 14). La desalineación circadiana crónica en ratones y el desfase horario inducido por el cambio horario en seres humanos da lugar a la disbiosis y a consecuencias metabólicas transmisibles que incluyen obesidad e intolerancia a la glucosa. Estas observaciones proporcionan el primer ejemplo de cómo una comunidad simbiótica puede sincronizar sus actividades fisiológicas interdependientes con el reloj geofísico, y cómo esto promueve la homeostasis del metaorganismo.

Estudios anteriores que analizaron las fluctuaciones temporales en la microbiota han considerado marcos temporales más largos y encontraron una estabilidad notable de composiciones microbianas individuales a lo largo del tiempo (Faith y otros, 2013; Lozupone y otros, 2012). Aquí, los presentes inventores realizaron el estudio longitudinal de la microbiota con una resolución temporal más fina y encontraron una fluctuación de la escala horaria con un ritmo diurno. En particular, el análisis aquí se centra en las variaciones diurnas en la composición de la comunidad microbiana y las vías metagenómicas. Dado que también se ha descrito que los componentes moleculares de los relojes circadianos bacterianos funcionan en los ámbitos transcripcional y postranscripcional (Lenz y Sogaard-Andersen, 2011), es posible que algunos miembros de la microbiota comensal alberguen otro nivel de control de actividad dependiente de la hora, que, además de los patrones en abundancia relativa, podría regular la actividad bacteriana de manera rítmica.

Estos resultados tienen varias implicaciones. En primer lugar, sugieren que los desequilibrios metabólicos asociados con alteraciones crónicas de los ritmos circadianos del anfitrión, como los que se encuentran en los trabajadores por turnos y durante el desfase horario, tienen un componente transmisible que depende de la composición de la microbiota y de su efecto sobre el metabolismo del anfitrión. Las morbilidades altamente multifactoriales asociadas con las alteraciones de los ritmos circadianos del anfitrión son enfermedades emergentes del estilo de vida moderno, y la etiología subyacente es poco conocida. El presente estudio identifica alteraciones en las comunidades microbianas intestinales como una fuerza impulsora adicional de tales manifestaciones de enfermedad e implica que la terapia probiótica o antimicrobiana dirigida puede evaluarse como un posible nuevo planteamiento preventivo o terapéutico en poblaciones susceptibles. Además, los resultados arrojan un nuevo discernimiento sobre estudios anteriores en ratones con deficiencias en el reloj circadiano (Karatsoreos y otros, 2011; Rudic y otros, 2004; Turek y otros, 2005), ya que algunos de los fenotipos descubiertos podrían no estar mediados únicamente por la deficiencia genética, sino que además pueden verse influidos por cambios en las características de la microbiota, y consecuencias metabólicas e inflamatorias posteriores. Los resultados aquí presentados pueden impulsar estudios futuros para determinar el impacto de la desalineación circadiana sobre los factores que configuran la microbiota, incluidas las vías inmunes y metabólicas del anfitrión, los patrones de alimentación, los niveles de hormonas del estrés y las deposiciones.

En segundo lugar, el presente estudio revela que, además de que el tipo de dieta es un modulador de la composición de la microbiota, el momento de la ingesta de alimentos desempeña un papel crítico en la configuración de la ecología microbiana intestinal. Se encontró que, cuando la ingesta de alimentos es rítmica, hasta un 15% de las unidades taxonómicas bacterianas comensales (y un porcentaje mucho mayor de abundancia) fluctúan en el curso de un día. En los tejidos periféricos del anfitrión, como el hígado, una proporción similar de todos los transcritos oscila de manera rítmica (Akhtar y otros, 2002; McCarthy y otros, 2007; Panda y otros, 2002; Storch y otros, 2002; Vollmers y otros, 2009). De manera análoga a los relojes periféricos, los ritmos de la microbiota se ven influidos por el reloj del anfitrión y realizan funciones críticas en la adaptación de los procesos metabólicos a las fluctuaciones diurnas del entorno. De hecho, un trabajo reciente ha demostrado que las señales de la microbiota desempeñan un papel importante en la generación de ritmos circadianos en las células epiteliales intestinales (Mukherji y otros, 2013). Juntos, este trabajo reciente y el presente estudio sugieren un nuevo paradigma emergente mediante el cual se produce un bucle de retroalimentación entre oscilaciones diurnas del anfitrión y la microbiota con mutua regulación cruzada de funciones interdependientes.

La presente observación de que la ritmicidad de los alimentos dirige las oscilaciones de la microbiota también podría ser notable en otro aspecto. Es un concepto bien establecido que, además de estar sincronizados con el oscilador central sensible a la luz, los relojes periféricos están armonizados por los ritmos de alimentación. En función del papel bien documentado de la microbiota como modulador de la expresión de genes del anfitrión, estos resultados plantean la posibilidad de que la microbiota pueda estar involucrada en este proceso de armonización de alimentos y podría sugerir una explicación mecanicista adicional para observaciones anteriores de los efectos metabólicos beneficiosos asociados con la alimentación programada (Adamovich y otros, 2014; Damiola y otros, 2000; Vollmers y otros, 2009). En tal escenario, la ingesta rítmica de alimentos puede gobernar las oscilaciones de la microbiota, lo que a su vez provoca la inducción rítmica de la expresión génica del anfitrión. El impacto de la microbiota y sus oscilaciones en el comportamiento circadiano del anfitrión y la expresión génica presenta, por tanto, un campo apasionante de investigación futura.

Además, las fluctuaciones diurnas en la ecología microbiana intestinal aquí descubiertas deben tenerse en cuenta al interpretar estudios centrados en la composición de la microbiota humana y animal. Por ejemplo, en función de los resultados presentes, podría ser aconsejable que los sujetos humanos involucrados en estudios de microbiota proporcionen sus muestras a una hora estandarizada del día para excluir el efecto de las variaciones diurnas en la interpretación de la dieta o las modalidades de tratamiento. El presente estudio revela que la disbiosis tiene una dimensión temporal y que las comparaciones de microbiota estática podrían no ser completamente concluyentes, a no ser que se tomen muestras de manera controlada con respecto a esta importante variable adicional. Las oscilaciones rítmicas a corto plazo en la microbiota, como las descritas en este estudio, pueden exagerarse o alterarse en diversas condiciones de enfermedad, y será interesante determinar el impacto de dicha “disbiosis temporal” en enfermedades mediadas por microbiota con diferentes manifestaciones o grados variables de gravedad en diferentes fases del día.

Por último, la red de ritmos diurnos codependientes que el anfitrión y su microbiota autóctona han desarrollado podría conferir varias ventajas biológicas al metaorganismo. Una composición de microbiota dinámica puede ser capaz de hacer frente a los desafíos impuestos por fluctuaciones diurnas en el entorno de mejor forma que una composición temporalmente estática. Como se ha demostrado en este estudio, la ingesta de alimentos por parte del anfitrión sufre fluctuaciones circadianas, que evocan cambios temporales en las especies bacterianas involucradas en el metabolismo de los nutrientes. Por lo tanto, las oscilaciones en los componentes de la microbiota podrían anticipar estas variaciones temporales en la disponibilidad de nutrientes. El análisis metagenómico sugiere que ciertas categorías de funciones bacterianas presentan predilecciones temporales del curso de un día (Figura 14). Se descubrió que las vías implicadas en el crecimiento y el metabolismo energético (como la reparación de ácidos nucleicos, el metabolismo de nucleótidos, el metabolismo de carbohidrato y aminoácidos) son antifásicas para las vías de motilidad y desintoxicación (incluidos el ensamblaje flagelar, la quimiotaxia y la degradación de xenobióticos). Dado que el análisis taxonómico indica que las oscilaciones de la microbiota siguen la ingesta rítmica de alimentos, tales fluctuaciones metagenómicas podrían ser el resultado de la ocupación rítmica del nicho por parte de especialistas que son sensibles a las fases de ingesta/inanición de alimentos. Además, la microbiota proporciona resistencia a la colonización contra elementos microbianos extraños, incluidos los patógenos entéricos (Stecher y Hardt, 2011) que son potencialmente introducidos por el consumo de alimentos durante las horas de vigilia. Por ello, la introducción de elementos microbianos extraños en la microbiota intestinal subyace a las fluctuaciones diarias, generando la necesidad de una ritmicidad diurna de ocupación de nichos por parte de la microbiota comensal. Desentrañar los papeles y los reguladores de las oscilaciones diurnas de la microbiota puede agregar una faceta importante a nuestra búsqueda de elucidación molecular de los principios de la coexistencia simbiótica del anfitrión con su medio microbiano en la salud y la enfermedad, y, en consecuencia, puede explotarse terapéuticamente la modulación de la ritmicidad de la microbiota.

Referencias para el Ejemplo 1

Adamovich, Y., Rousso-Noori, L., Zwighaft, Z., Neufeld-Cohen, A., Golik, M., Kraut-Cohen, J., Wang, M., Han, X. y Asher, G. (2014). Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell metabolism 19, 319-330.

Akhtar, R.A., Reddy, A.B., Maywood, E.S., Clayton, J.D., King, V.M., Smith, A.G., Gant, T.W., Hastings, M.H. y Kyriacou, C.P. (2002). Circadian cycling of the mouse liver transcriptome, as revealed by cDNA microarray, is driven by the suprachiasmatic nucleus. Current biology : CB 12, 540-550.

Archer, S.N., Laing, E.E., Moller-Levet, C.S., van der Veen, D.R., Bucca, G., Lazar, A.S., Santhi, N., Slak, A., Kabiljo, R., von Schantz, M., y otros (2014). From the Cover: Mistimed sleep disrupts circadian regulation of the human transcriptome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, E682-691.

Asher, G., Reinke, H., Altmeyer, M., Gutierrez-Arcelus, M., Hottiger, M.O. y Schibler, U. (2010). Poly(ADP-ribose) polymerase 1 participates in the phase entrainment of circadian clocks to feeding. Cell 142, 943-953.

Bass, J. (2012). Circadian topology of metabolism. Nature 491, 348-356.

Buxton, O.M., Cain, S.W., O'Connor, S.P., Porter, J.H., Duffy, J.F., Wang, W., Czeisler, C.A. y Shea, S.A. (2012). Adverse metabolic consequences in humans of prolonged sleep restriction combined with circadian disruption. Science translational medicine 4, 129ra143.

Caporaso, J.G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F.D., Costello, E.K., Fierer, N., Pena, A.G., Goodrich, J.K., Gordon, J.I., y otros (2010). QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods 7, 335-336.

Clemente, J.C., Ursell, L.K., Parfrey, L.W. y Knight, R. (2012). The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. Cell 148, 1258-1270.

Damiola, F., Le Minh, N., Preitner, N., Kornmann, B., Fleury-Olela, F. y Schibler, U. (2000). Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes & development 14, 2950-2961.

Dibner, C., Schibler, U. y Albrecht, U. (2010). The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annual review of physiology 72, 517-549.

Edgar, R.S., Green, E.W., Zhao, Y., van Ooijen, G., Olmedo, M., Qin, X., Xu, Y., Pan, M., Valekunja, U.K., Feeney, K.A., y otros (2012). Peroxiredoxins are conserved markers of circadian rhythms. Nature 485, 459-464.

Elinav, E., Strowig, T., Kau, A.L., Henao-Mejia, J., Thaiss, C.A., Booth, C.J., Peaper, D.R., Bertin, J., Eisenbarth, S.C., Gordon, J.I., y otros (2011). NLRP6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell 145, 745-757.

Fagarasan, S., Muramatsu, M., Suzuki, K., Nagaoka, H., Hiai, H. y Honjo, T. (2002). Critical roles of activationinduced cytidine deaminase in the homeostasis of gut flora. Science 298, 1424-1427.

Faith, J.J., Guruge, J.L., Charbonneau, M., Subramanian, S., Seedorf, H., Goodman, A.L., Clemente, J.C., Knight, R., Heath, A.C., Leibel, R.L., y otros (2013). The long-term stability of the human gut microbiota. Science 341, 1237439. Fonken, L.K., Workman, J.L., Walton, J.C., Weil, Z.M., Morris, J.S., Haim, A. y Nelson, R.J. (2010). Light at night increases body mass by shifting the time of food intake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 18664-18669.

Gerhart-Hines, Z., Feng, D., Emmett, M.J., Everett, L.J., Loro, E., Briggs, E.R., Bugge, A., Hou, C., Ferrara, C., Seale, P., y otros (2013). The nuclear receptor Rev-erba Controls circadian thermogenic plasticity. Nature 503, 410-413. Gordon, J.I. (2012). Honor thy gut symbionts redux. Science 336, 1251-1253.

Henao-Mejía, J., Elinav, E., Jin, C., Hao, L., Mehal, W.Z., Strowig, T., Thaiss, C.A., Kau, A.L., Eisenbarth, S.C., Jurczak, M.J., y otros (2012). Inflammasome- mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity. Nature 482, 179-185.

Hogenesch, J.B. y Ueda, H.R. (2011). Understanding systems-level properties: timely stories from the study of clocks. Nature reviews Genetics 12, 407-416.

Hoogerwerf, W.A., Hellmich, H.L., Cornelissen, G., Halberg, F., Shahinian, V.B., Bostwick, J., Savidge, T.C. y Cassone, V.M. (2007). Clock gene expression in the murine gastrointestinal tract: endogenous rhythmicity and effects of a feeding regimen. Gastroenterology 133, 1250-1260.

Hooper, L.V., Littman, D.R. y Macpherson, A.J. (2012). Interactions between the microbiota and the immune system. Science 336, 1268-1273.

Hsiao, E.Y., McBride, S.W., Hsien, S., Sharon, G., Hyde, E.R., McCue, T., Codelli, J.A., Chow, J., Reisman, S.E., Petrosino, J.F., y otros (2013). Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 155, 1451-1463.

Huang, W., Ramsey, K.M., Marcheva, B. y Bass, J. (2011). Circadian rhythms, sleep, and metabolism. The Journal of clinical investigation 121, 2133-2141.

Hughes, M.E., Hogenesch, J.B. y Kornacker, K. (2010). JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of biological rhythms 25, 372-380.

Human Microbiome Project, C. (2012). Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486, 207-214.

Johnson, C.H., Egli, M. y Stewart, P.L. (2008). Structural insights into a circadian oscillator. Science 322, 697-701.

Johnson, C.H., Stewart, P.L. y Egli, M. (2011). The cyanobacterial circadian system: from biophysics to bioevolution. Annual review of biophysics 40, 143-167.

Kaasik, K., Kivimae, S., Allen, J.J., Chalkley, R.J., Huang, Y., Baer, K., Kissel, H., Burlingame, A.L., Shokat, K.M., Ptacek, L.J., y otros (2013). Glucose sensor O-GlcNAcylation coordinates with phosphorylation to regulate circadian clock. Cell metabolism 17, 291-302.

Kanehisa, M. y Goto, S. (2000). KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research 28, 27-30. Kanehisa, M., Goto, S., Sato, Y., Kawashima, M., Furumichi, M. y Tanabe, M. (2014). Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG. Nucleic acids research 42, D199-D205.

Karatsoreos, I.N., Bhagat, S., Bloss, E.B., Morrison, J.H. y McEwen, B.S. (2011). Disruption of circadian clocks has ramifications for metabolism, brain, and behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 1657-1662.

Keller, M., Mazuch, J., Abraham, U., Eom, G.D., Herzog, E.D., Volk, H.D., Kramer, A. y Maier, B. (2009). A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 21407-21412.

Lenz, P. y Sogaard-Andersen, L. (2011). Temporal and spatial oscillations in bacteria. Nature reviews Microbiology 9, 565-577.

Ley, R.E., Turnbaugh, P.J., Klein, S. y Gordon, J.I. (2006). Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 444, 1022-1023.

Lozupone, C.A., Stombaugh, J.I., Gordon, J.I., Jansson, J.K. y Knight, R. (2012). Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota. Nature 489, 220-230.

McCarthy, J.J., Andrews, J.L., McDearmon, E.L., Campbell, K.S., Barber, B.K., Miller, B.H., Walker, J.R., Hogenesch, J.B., Takahashi, J.S. y Esser, K.A. (2007). Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiological genomics 31, 86-95.

Mohawk, J.A., Green, C.B. y Takahashi, J.S. (2012). Central and peripheral circadian clocks in mammals. Annual review of neuroscience 35, 445-462.

Mukherji, A., Kobiita, A., Ye, T. y Chambon, P. (2013). Homeostasis in intestinal epithelium is orchestrated by the circadian clock and microbiota cues transduced by TLRs. Cell 153, 812-827.

Nguyen, K.D., Fentress, S.J., Qiu, Y., Yun, K., Cox, J.S. y Chawla, A. (2013). Circadian gene Bmall regulates diurnal oscillations of Ly6C(hi) inflammatory monocytes. Science 341, 1483-1488.

Panda, S., Antoch, M.P., Miller, B.H., Su, A.I., Schook, A.B., Straume, M., Schultz, P.G., Kay, S.A., Takahashi, J.S. y Hogenesch, J.B. (2002). Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell 109, 307­ 320.

Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K.S., Manichanh, C., Nielsen, T., Pons, N., Levenez, F. y Yamada, T. (2010). A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 464, 59-65. Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S. y Medzhitov, R. (2004). Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 118, 229-241.

Ridaura, V.K., Faith, J.J., Rey, F.E., Cheng, J., Duncan, A.E., Kau, A.L., Griffin, N.W., Lombard, V., Henrissat, B., Bain, J.R., y otros (2013). Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 341, 1241214.

Rudic, R.D., McNamara, P., Curtis, A.M., Boston, R.C., Panda, S., Hogenesch, J.B. y Fitzgerald, G.A. (2004). BMAL1 and CLOCK, two essential components of the circadian clock, are involved in glucose homeostasis. PLoS biology 2, e377.

Rust, M.J., Markson, J.S., Lane, W.S., Fisher, D.S. y O'Shea, E.K. (2007). Ordered phosphorylation governs oscillation of a three-protein circadian clock. Science 318, 809-812.

Scheer, F.A., Hilton, M.F., Mantzoros, C.S. y Shea, S.A. (2009). Adverse metabolic and cardiovascular consequences of circadian misalignment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 4453-4458.

Silver, A.C., Arjona, A., Walker, W.E. y Fikrig, E. (2012). The circadian clock controls toll-like receptor 9-mediated innate and adaptive immunity. Immunity 36, 251-261.

So, A.Y., Bemal, T.U., Pillsbury, M.L., Yamamoto, K.R. y Feldman, B.J. (2009). Glucocorticoid regulation of the circadian clock modulates glucose homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 17582-17587.

Sommer, F. y Backhed, F. (2013). The gut microbiota-masters of host development and physiology. Nature reviews Microbiology 11, 227-238.

Stecher, B. y Hardt, W.D. (2011). Mechanisms controlling pathogen colonization of the gut. Current opinion in microbiology 14, 82-91.

Stokkan, K.A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y. y Menaker, M. (2001). Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science 291, 490-493.

Storch, K.F., Lipan, O., Leykin, I., Viswanathan, N., Davis, F.C., Wong, W.H. y Weitz, C.J. (2002). Extensive and divergent circadian gene expression in liver and heart. Nature 417, 78-83.

Suwazono, Y., Dochi, M., Sakata, K., Okubo, Y., Oishi, M., Tanaka, K., Kobayashi, E., Kido, T. y Nogawa, K. (2008). A longitudinal study on the effect of shift work on weight gain in male Japanese workers. Obesity 16, 1887-1893. Turek, F.W., Joshu, C., Kohsaka, A., Lin, E., Ivanova, G., McDearmon, E., Laposky, A., Losee-Olson, S., Easton, A., Jensen, D.R., y otros (2005). Obesity and metabolic syndrome in circadian Clock mutant mice. Science 308, 1043­ 1045.

Vollmers, C., Gill, S., DiTacchio, L., Pulivarthy, S.R., Le, H.D. y Panda, S. (2009). Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 21453-21458.

Yamaguchi, Y., Suzuki, T., Mizoro, Y., Kori, H., Okada, K., Chen, Y., Fustin, J.M., Yamazaki, F., Mizuguchi, N., Zhang, J., y otros (2013). Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science 342, 85-90.

Yu, X., Rollins, D., Ruhn, K.A., Stubblefield, J.J., Green, C.B., Kashiwada, M., Rothman, P.B., Takahashi, J.S. y Hooper, L.V. (2013). TH17 cell differentiation is regulated by the circadian clock. Science 342, 727-730.

Ejemplo 2

Los edulcorantes artificiales inducen intolerancia a la glucosa al alterar la microbiota

Materiales y procedimientos

Ratones: Se asignaron aleatoriamente (sin enmascaramiento) ratones macho adultos C57B1/6 WT a grupos de tratamiento y se les administraron edulcorantes artificiales comerciales (a base de sacarina, sucralosa o aspartamo) o sacarina pura (Sigma Aldrich) en el agua de beber y se los alimentó con una dieta rica en grasa (HFD D12492, 60% Kcal de grasa, Research Diets) o de comida normal (NC) con polisacáridos estándar (Harlan-Teklad). Los grupos comparados siempre fueron alimentados con el mismo lote de dieta. Para el tratamiento con antibióticos, se administró a los ratones una combinación de ciprofloxacina (0,2gl-1) y metronidazol (1gl-1) o vancomicina (0,5gl-1) en el agua de beber. Todos los antibióticos se obtuvieron de Sigma Aldrich. Los ratones macho adultos Swiss-Webster exogámicos (una cepa de ratón usada de forma generalizada en experimentos libres de gérmenes) sirvieron como receptores para trasplantes fecales y se alojaron en aisladores estériles (Park Biosciences). Para los experimentos de trasplante fecal, se resuspendieron 200 mg de heces (de gránulos de ratón o muestras humanas) en 5 ml de PBS en condiciones anaeróbicas, se centrifugaron durante 3 minutos y se dejaron sedimentar por gravedad durante 2 minutos. Los ratones receptores se alimentaron por sonda con 200 pl del sobrenadante y se mantuvieron con dieta de NC estándar y agua durante todo el experimento.

Edulcorantes artificiales y calóricos; Se disolvieron los siguientes NAS disponibles comercialmente en el agua de beber para los ratones para obtener una solución al 10%: Sucrazit (5% de sacarina, 95% de glucosa), Sucralite (5% de sucralosa), Sweet'n Low Gold (4% de aspartamo). Para los controles se usaron soluciones de glucosa al 10% (J.T. Baker) y sacarosa al 10% (Sigma Aldrich). Las dosis administradas de NAS comercial al 10% disuelto en agua estuvieron muy por debajo de la dosis tóxica documentada (6,3gkg-151, 16gkg-152 y 4gkg-153, para la sacarina, la sucralosa y el aspartamo, respectivamente). Para los experimentos realizados con sacarina pura (Sigma Aldrich) se usó una solución de 0,1 mgml-1 para satisfacer la IDA definida por la FDA para sacarina en seres humanos (5 mgkg-1), de acuerdo con el siguiente cálculo:

ID A 5mgkg 1 x peso medio por ratón 0,03kg „ , , , , -----------S-2----- - ------:—:-------------:------ ------2. = 0,075mgml 1 ^ 0,lm gm l

Ingesta líquida diaria promedio 2m l

Pruebas de tolerancia a la glucosa y la insulina: Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 horas durante la fase con luz, con libre acceso al agua. En todos los grupos de ratones en los que el régimen de bebida no era agua, se sustituyó por agua durante el periodo del ayuno y la prueba de tolerancia a la glucosa o la insulina. Se utilizó sangre de la vena de la cola para medir los niveles de glucosa usando un glucómetro (Bayer) inmediatamente antes y 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la alimentación oral con 40 mg de glucosa (J.T. Baker) o inyección intraperitoneal con 0,1Ukg-1 de insulina (Biological Industries). Los niveles plasmáticos de insulina en ayunas se midieron en sueros recogidos inmediatamente antes del inicio de la GTT (prueba de tolerancia a la glucosa, por sus siglas en inglés) usando ELISA (Ultra-Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit, Crystal Chem).

Estudios metabólicos: La ingesta de alimentos y bebida y el gasto energético se midieron usando el sistema PhenoMaster (TSESystems, Bad Homburg, Alemania), que consiste en una combinación de sensores de alimentación sensibles para la medición automatizada y un sistema de monitorización de actividad basado en rayos fotoeléctricos que detecta y registra los movimientos ambulatorios, incluidos la erección sobre las patas de atrás y la escalada, en cada jaula. Todos los parámetros se midieron de forma continua y simultánea. Los ratones se entrenaron en alojamientos individuales en jaulas idénticas antes de la obtención de datos. Para calcular el aporte calórico total se usaron los siguientes valores: Comida 3kcalg-1, sacarosa 0,3938kcalmL1, glucosa 0,4kcalml-1, sacarina 0,38kcalmM, sucralosa 0,392kcalml-1 y aspartamo 0,38kcalmM.

Cultivo anaeróbico in vitro: Se resuspendió materia fecal combinada de ratones macho WT C57B1/6 adultos no modificados en 5 ml de PBS en una cámara anaeróbica (Coy Laboratory Products, 75% N2, 20% CO2, 5% H2), se centrifugó durante 3 minutos y se dejó que sedimentara por gravedad durante 2 minutos. Se añadieron 500 ml del sobrenadante a un tubo que contenía caldo de carbohidratos de carne picada, PR II (BD) y 500 ml de una solución de sacarina de 5mgml-1 o un volumen igual de PBS. Cada 3 días, se diluyeron 500 ml de cultivo en medio fresco que contenía sacarina o PBS. Después de 9 días, se utilizaron cultivos para la inoculación de ratones libres de gérmenes.

Análisis taxonómicos de la microbiota; Se procesaron muestras fecales congeladas para el aislamiento del ADN usando un equipo MoBio PowerSoil según las instrucciones del fabricante. Se usó 1ng del ADN fecal purificado para la amplificación por PCR y la secuenciación del gen del ARNr 16S bacteriano. Los amplicones que abarcan la región variable 2 (V2) del gen del ARNr 16S se generaron usando los siguientes cebadores con códigos de barras: : dir 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 3), inv 5-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 4). Posteriormente, las reacciones se combinaron en una proporción equimolar, se purificaron (equipo de limpieza de PCR, Promega) y se usaron para la secuenciación de Illumina MiSeq hasta una profundidad de al menos 18000 lecturas por muestra (lecturas medias por muestra: 139148±5264 (S.E.M.)). Luego, las lecturas se procesaron usando el flujo funcional de análisis QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology, www.qiime.org) descrita, versión 1.8. Las secuencias unidas de extremos emparejados se agruparon en unidades taxonómicas operativas (UTO) usando el algoritmo UCLUST y la base de datos GreenGenes. Se asignaron a la misma UTO secuencias con una similitud basada en una distancia del 97% o más sobre la longitud media de la secuencia de 353 pb. Las muestras se agruparon según el tratamiento. Se realizó el análisis en cada nivel taxonómico (filo-género nivel UTO) por separado. Para cada taxón, se realizó la prueba G entre los diferentes grupos. Los valores de p se corrigieron con la FDR (tasa de falsos descubrimientos, por sus siglas en inglés) para pruebas de hipótesis múltiples.

Pirosecuenciación aleatoria y correlación de secuencias: Se llevó a cabo según se ha descrito anteriormente57, con las siguientes modificaciones: el saliente del ADN se cortó usando el sistema Covaris 5200 (Covaris, Inc., Woburn, Massachusetts, EE. UU.), seguido por la reparación de extremos, ligadura a adaptadores, una amplificación por PCR de 8 ciclos (Kappa HiFi) y secuenciada utilizando un Illumina HiSeq a un profundidad mínima de 11773345 lecturas por muestra (lecturas medias por muestra 20296086±637379 (S.E.M.), longitud de lectura 51 pb). Las lecturas de la secuencia de Illumina se correlacionaron con la base de datos del genoma de referencia del microbioma humano del Proyecto de Microbioma Humano [www.hmpdacc.org/HMREFG/32], y en un catálogo de genes microbianos intestinales33 usando un correlacionador GEM58 con los siguientes parámetros: -m 3 -s 0 -q desfase-33-umbral-decalidad-gem 26.

La abundancia de especies microbianas se midió como la fracción de lecturas que se correlacionaban con una única especie en la base de datos. Se empleó un algoritmo EM adaptado de Pathoscope59 para determinar la asignación correcta de lecturas que se correlacionaron con más de una especie. Se consideraron solo las especies para las que se cubrió al menos el 10% del genoma (cada clase de cobertura tenía una longitud de 10.000 pb) en al menos una de las condiciones de crecimiento (sacarina, agua o glucosa). A las lecturas correlacionadas con el catálogo de genes microbianos intestinales se les asignó un ID KEGG3435 según la correlación disponible con el catálogo. Posteriormente, los genes se correlacionaron con vías KEGG y solo se incluyeron las vías cuya cobertura génica estaba por encima de 0,2. Para calcular la contribución de diferentes bacterias a la sobrerrepresentación de las vías de degradación de glicanos, se extrajeron lecturas que se correlacionaron con genes en el catálogo de genes microbianos intestinales que pertenecen a vías de degradación de glicanos y se volvieron a correlacionar con la base de datos del genoma de referencia de HMP, buscando gérmenes que tuvieran la mayor contribución.

Cuantificación de ácidos grasos de cadena corta: para determinar el nivel de ácidos grasos libres, se realizó HPLC analítica (Agilent 1260) como se ha descrito anteriormente60. Sucintamente, se prepararon soluciones estándar de acetato, butirato y propionato (todos de Sigma-Aldrich) a varias concentraciones (0,01-0,2 M). Estas soluciones se analizaron mediante HPLC, sucesivamente con QTOF-Mass Spec con un gradiente escalonado de solución de disolvente del 0% al 60% de CH3CN con ácido fórmico al 0,1% para obtener la curva de calibración para cada ácido graso. Las muestras de medios fecales se disolvieron con ácido fórmico al 0,1% analizadas de manera similar para medir la concentración total de los tres ácidos grasos libres.

Análisis de la relación entre el consumo de NAS y parámetros clínicos en seres humanos

El ensayo se circunscribió a ensayos clínicos, identificador NCT01892956. El estudio no necesitó ni implicó aleatorización. Para cada individuo en el estudio nutricional clínico, después de firmar un consentimiento informado, los parámetros recogidos incluyen IMC (índice de masa corporal), circunferencias corporales, niveles de glucosa en ayunas, cuestionario general, hemogramas completos y parámetros de química general, un cuestionario validado de frecuencia alimentaria a largo plazo44,61,62.

El consumo de NAS a largo plazo se cuantificó directamente a partir de las respuestas a una pregunta explícita sobre edulcorantes artificiales que los participantes completaron en su cuestionario de frecuencia alimentaria. A continuación, se utilizó la correlación de Spearman para examinar la relación entre el consumo de NAS y cada uno de los parámetros anteriores, y se corrigió con la FDR para las pruebas de hipótesis múltiples realizadas.

Estadística; Se usaron los siguientes análisis estadísticos: en GTT, se usaron un ANOVA bidireccional y un análisis post hoc de Bonferroni para comparar entre grupos en diferentes momentos, y se usaron ANOVA unidireccional y análisis post hoc de Tukey o la prueba t de Student de dos lados desapareados para comparar entre AUC de grupos múltiples o dos grupos, respectivamente. Se emplearon las pruebas de Bartlett o F para una varianza igual y no se observaron diferencias significativas entre las varianzas de los grupos comparados. Para la comparación de los datos taxonómicos, se usó una prueba G y los valores P se corrigieron con FDR para pruebas de hipótesis múltiples. En metagenómica y datos clínicos y taxonómicos de seres humanos, se usaron Pearson y Spearman para las pruebas de correlación, y se usó la prueba U de Mann-Whitney para comparar los parámetros clínicos entre grupos. Se consideró que p <0,05 era significativo en todos los análisis (* denota p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001). En todos los paneles relevantes, los símbolos o líneas horizontales representan la media, y las barras de error el S.E.M. Para los experimentos con ratones, los tamaños de las cohortes coinciden con la práctica común de los experimentos descritos. Para los experimentos humanos, se eligió el tamaño de la muestra para validar los análisis estadísticos. No se excluyeron de los análisis ratones ni puntos de datos. En los estudios humanos, se incluyeron todos los seres humanos mayores de 18 años que se inscribieron. Los criterios de exclusión incluyeron embarazo.

Resultados

El consumo crónico de edulcorantes artificiales no calóricos exacerba la intolerancia a la glucosa

Para determinar los efectos de NAS sobre la homeostasis de la glucosa, los inventores agregaron formulaciones comerciales de sacarina, sucralosa o aspartamo al agua de beber de ratones C57B1/6 flacos de 10 semanas de edad (Figura 15A). Dado que los tres NAS comerciales comprenden ~ 5% de edulcorante y ~ 95% de glucosa, los inventores usaron como controles ratones que bebían solo agua o agua complementada con glucosa o sacarosa. En particular, en la semana 11, los tres grupos de ratones que consumían agua, glucosa y sacarosa presentaron curvas de tolerancia a la glucosa comparables, mientras que los tres grupos de ratones que consumían NAS desarrollaron una marcada intolerancia a la glucosa (p <0,001, Figuras 16A-B).

Ya que la sacarina ejercía el efecto más pronunciado, los inventores estudiaron más a fondo su función como edulcorante artificial prototípico. Para corroborar los hallazgos en la configuración de obesidad, suministraron a ratones C57B1/6 una dieta rica en grasas (HFD, 60% Kcal procedentes de la grasa) mientras consumían sacarina comercial o glucosa pura como control (Figura 15B). Como en el estado magro, los ratones alimentados con HFD y sacarina comercial desarrollaron intolerancia a la glucosa, a diferencia del grupo de ratones de control (p <0,03, Figuras 16C y 17A). Para examinar los efectos de sacarina pura sobre la intolerancia a la glucosa, los inventores hicieron un seguimiento a una cohorte de ratones C57B1/6 de 10 semanas de edad alimentados con HFD y alimentados con 0,1mgml-1 de sacarina pura añadida a su agua potable (Figura 15C). Esta dosis corresponde a la ingesta diaria admisible (IDA) de la FDA en seres humanos (5mgkg-1, ajustada al peso del ratón, ver procedimientos). Al igual que con la sacarina comercial, esta dosis más baja de sacarina pura se asoció con un deterioro de la tolerancia a la glucosa (p <0,0002, Figuras 16D y 17B) a partir de las 5 semanas posteriores al inicio de la HFD. De manera similar, los ratones Swiss Webster exógenos alimentados con HFD alimentados con o sin 0,1mgml-1 de sacarina pura (Figura 15D) mostraron intolerancia a la glucosa significativa después de 5 semanas de exposición a la sacarina en comparación con los controles (p <0,03, Figuras 17C-D).

El perfil metabólico de ratones alimentados con NC o con HFD en jaulas metabólicas, incluyendo el consumo de líquidos y comida, el consumo de oxígeno, la distancia recorrida y el gasto energético, mostró medidas similares entre ratones bebedores de NAS y control (Figuras 18 y 19). Los niveles de insulina sérica en ayunas y la tolerancia a la insulina también fueron similares en todos los grupos de ratones que consumieron NAS o edulcorantes calóricos, tanto en la configuración de comida normal (NC) como en la de HFD (Figura 20). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el NAS promueve trastornos metabólicos en diversas formulaciones, dosis, cepas de ratón y dietas análogas a las condiciones humanas, tanto en el estado magro como en el obeso.

La intolerancia a la glucosa inducida por NAS es mediada por la microbiota intestinal

Dado que la dieta modula la microbiota intestinal15 y que las alteraciones de la microbiota ejercen profundos efectos sobre la fisiología y el metabolismo del anfitrión, los presentes inventores evaluaron si la microbiota puede regular los efectos del NAS observados. Con este fin, trataron grupos de ratones que consumían NAS comercial o puro en los estados magro y HFD (Figuras 15A, C) con un régimen de antibióticos de amplio espectro dirigidos a bacterias gramnegativas (denominados “Antibióticos A”) de ciprofloxacina (0,2gl-1) y metronidazol (1 gl-1), mientras mantenían a los ratones en su dieta y regímenes de suplementación con edulcorantes. En particular, después de 4 semanas de tratamiento con antibióticos, se abolieron las diferencias en la intolerancia a la glucosa entre ratones que bebían NAS y controles, tanto en el estado magro (Figuras 16A-B) como en el obeso (Figura 16D y Figura 17B). Se observaron efectos similares con el antibiótico vancomicina dirigido a bacterias grampositivas (“Antibióticos B”, 0,5gl-1, Figuras 15A-B). Estos resultados sugieren que la intolerancia a la glucosa inducida por el NAS está mediada por alteraciones de la microbiota comensal, con aportaciones de diversos taxones bacterianos.

Para comprobar si el papel de la microbiota es causal, se realizaron experimentos de trasplante fecal, transfiriendo la configuración de la microbiota de ratones con dieta NC que bebían sacarina comercial o glucosa (control) a ratones libres de gérmenes consumidores de NC (Figura 15E). En particular, los receptores de la microbiota relacionada con la sacarina comercial exhibieron tolerancia a la glucosa alterada en comparación con los receptores de la microbiota de control (glucosa), determinada 6 días después de la transferencia (p <0,03, Figuras 16E y 17E). La transferencia de la composición de la microbiota de ratones consumidores de HFD que bebían agua o sacarina pura duplicó el fenotipo de intolerancia a la glucosa (p <0,004, Figuras 16F y 17F). En conjunto, estos resultados establecen que los trastornos metabólicos inducidos por el consumo de NAS están mediados por la microbiota intestinal.

El consumo de NAS media alteraciones composicionales y funcionales diferenciadas en la microbiota

Los presentes inventores examinaron a continuación la composición de la microbiota fecal de los diversos grupos de ratones mediante la secuenciación de su gen ARNr 16S. Los ratones que bebían sacarina tenían una composición de microbiota distinta que se agrupaba por separado de sus configuraciones de microbioma inicial y de todos los grupos de control en la semana 11 (Figura 16G). Asimismo, la microbiota de los receptores GF de las heces de los ratones donantes consumidores de sacarina se agruparon por separado de la de los receptores GF de las heces de los donadores que bebían glucosa (Figura 16H). En comparación con todos los grupos de control, la microbiota de los ratones consumidores de sacarina mostró una disbiosis considerable, con >40 unidades taxonómicas operativas (UTO) significativamente alteradas en abundancia (valor de p corregido con FDR <0,05 para cada UTO, Figura 21). Muchos de los taxones que aumentaron en abundancia relativa pertenecían al género Bacteroides y al orden Clostridiales, comprendiendo otros miembros del orden Clostridiales la mayoría de los taxones infrarrepresentados, junto con Lactobacillus reuteri, y se reflejan en receptores GF de heces de donadores que consumían sacarina (Figura 21, columna derecha). Asimismo, se observó disbiosis en ratones que consumían sacarina pura y HFD. Juntos, estos resultados demuestran que el consumo de sacarina en diversas formulaciones, dosis y dietas induce disbiosis con configuraciones generales similares.

Para estudiar las consecuencias funcionales del consumo de NAS, se realizó una secuenciación metagenómica aleatoria de muestras fecales de antes y después de 11 semanas de consumo de sacarina comercial, en comparación con ratones de control que consumían glucosa o agua. Para comparar la abundancia relativa de las especies, las lecturas de secuenciación se correlacionaron con la base de datos del genoma de referencia del microbioma humano16. Según el análisis de ARNr 16s, el tratamiento con sacarina indujo los mayores cambios en la abundancia relativa de especies microbianas (Figura 22A, Tabla 1, a continuación; valor de p de la prueba F <10-10). Es poco probable que estos cambios sean una aberración de la transferencia horizontal de genes o de genomas mal cubiertos, ya que se observaron cambios en la abundancia relativa en gran parte de la longitud de los genomas bacterianos, como ejemplifica uno sobrerrepresentado (B. vulgatus, Figura 23A) y una especie infrarrepresentada (A. muciniphila, Figura 23B).

Tabla 1

A continuación, los presentes inventores correlacionaron las lecturas metagenómicas con un catálogo de genes microbianos intestinales, dividiendo uniformemente las lecturas correlacionadas con más de un gen y agrupando luego los genes en rutas KEGG. Al examinar las vías con cobertura génica por encima de 0,2 (115 vías), los cambios en la abundancia de la vía se correlacionaron inversamente entre los ratones consumidores de sacarina comercial y de glucosa (R = -0,45, p <10-6, Figura 22B). Dado que la sacarina comercial consiste en un 95% de glucosa, estos resultados sugieren que la sacarina afecta en gran medida a la función de la microbiota. En particular, las vías sobrerrepresentadas en ratones consumidores de sacarina incluyen un fuerte aumento en las vías de degradación de glicanos (Figuras 22C-D), en las que los glicanos se fermentan para formar diversos compuestos, incluidos los ácidos grasos de cadena corta (SCFA)17 Estas vías marcan una mayor cosecha de energía y su enriquecimiento se asoció previamente con la obesidad en ratones11 y seres humanos18, sirviendo los SCFA posiblemente como precursores y/o moléculas de señalización para la síntesis de novo de glucosa y lípidos por parte del anfitrión19. Para identificar las bacterias subyacentes, los presentes inventores anotaron cada lectura que se correlacionó con las vías de degradación de glicanos por parte de sus bacterias originarias. Gran parte del aumento de estas vías es atribuible a lecturas provenientes de 5 especies gramnegativas y positivas, de las cuales dos pertenecen al género Bacteroides (Figura 22E), en consonancia con el fuerte aumento en la abundancia de este género en ratones consumidores de sacarina observado en el análisis de ARNr 16s (Figura 21). En consecuencia, los niveles de propionato y acetato de SCFA medidos en las heces fueron manifiestamente más altos en ratones consumidores de sacarina comercial que en ratones consumidores de glucosa control (Figuras 22F-G), lo que refleja los efectos diferenciales mediados por el consumo crónico de glucosa con y sin exposición a NAS. Los niveles de butirato fueron similares entre los grupos (datos no mostrados).

Además de la degradación de glicanos, y en línea con estudios previos en seres humanos con T2DM1320, se enriquecieron otras vías en microbiomas de ratones consumidores de sacarina, incluido el metabolismo de almidón y sacarosa, el metabolismo de fructosa y manosa y biosíntesis de folatos, glicerolípidos y ácidos grasos (Tabla 2, a continuación), mientras que las vías de transporte de glucosa estaban infrarrepresentadas en ratones consumidores de sacarina (Figura 23C). Los ratones que consumían HFD y sacarina pura presentaban múltiples vías enriquecidas (Figura 23D), incluyendo el metabolismo del ascorbato y el aldarato (previamente documentado como enriquecido en ratones diabéticos con deficiencia del receptor de leptina21), biosíntesis de lipopolisacáridos (ligada a endotoxemia metabólica22) y quimiotaxia bacteriana (documentada previamente como enriquecida en ratones obesos11).

Tabla 2

En conjunto, el consumo de sacarina da lugar a claras alteraciones funcionales en la microbiota dependientes de la dieta, incluyendo la expansión relacionada con la NC en la degradación de glicanos aportadas por varios de los taxones aumentados, dando lugar en último término a niveles elevados de SCFA en las heces, característicos de una mayor cosecha de energía microbiana11.

La intolerancia a la glucosa está directamente mediada por la modulación de la microbiota intestinal inducida por la sacarina

Para determinar si la sacarina afecta directamente a la microbiota intestinal, los presentes inventores cultivaron materia fecal de ratones no modificados bajo estrictas condiciones anaeróbicas (75% N2, 20% CO2, 5% H2) en presencia de sacarina (5mgml-1) o medios de crecimiento de control. Los cultivos a partir del día 9 de incubación se administraron mediante sonda a ratones libres de gérmenes (Figura 24A). El cultivo de heces in vitro con sacarina indujo un aumento del filo Bacteroidetes y una reducción del Firmicutes (Bacteroidetes 89% frente a 70%, Firmicutes 6% frente a 22%, Figura 24B). La transferencia de esta configuración de microbiota tratada con sacarina in vitro a ratones libres de gérmenes resultó en una intolerancia a la glucosa significativamente mayor (p <0,002) en comparación con los ratones libres de gérmenes que recibieron el cultivo de control (Figuras 25A y 24C). De forma similar a la composición del cultivo anaeróbico suplementado con sacarina, los receptores libres de gérmenes de esta configuración cultivada presentaban sobrerrepresentación de miembros del género Bacteroides y una infrarrepresentación de varios Clostridiales (Figura 25b y Tabla 3).

Tabla 3

El análisis de secuenciación metagenómica aleatoria reveló que el tratamiento con sacarina in vitro indujo alteraciones funcionales similares a las encontradas en ratones que consumían sacarina comercial (Figura 21C, p <10-4), estando las vías de degradación de glicanos altamente enriquecidas en ambos entornos. Otras vías muy enriquecidas en ambos entornos incluyeron las implicadas en el metabolismo de los esfingolípidos, que previamente se demostró que estaban sobrerrepresentadas en microbiomas de ratones diabéticos no obesos23, y las vías comunes infrarrepresentadas incluyeron el transporte de glucosa (Figura 25C y Figura 23C, columna derecha).

Colectivamente, estos resultados demuestran que la sacarina modula directamente la composición y la función del microbioma e induce disbiosis, lo que explica el fenotipo de intolerancia a la glucosa aguas abajo en el anfitrión mamífero.

El consumo de NAS en los seres humanos está asociado con la intolerancia a la glucosa

Para estudiar el efecto del NAS en seres humanos, se compararon la relación entre el consumo de NAS a largo plazo (basado en un cuestionario validado de frecuencia alimentaria; véanse procedimientos) y varios parámetros clínicos en datos recogidos de 381 individuos no diabéticos (44% hombres y 56% mujeres; edad 43,3±13,2) en un estudio clínico nutricional en curso. Se encontraron correlaciones positivas significativas entre el consumo de NAS y varios parámetros clínicos relacionados con el síndrome metabólico (Tabla 4, a continuación), incluido el aumento de peso y de la relación cintura-cadera (medidas de obesidad central); glucosa en sangre en ayunas más alta, hemoglobina glicosilada (HbA1 c%) y prueba de tolerancia a la glucosa (GTT, medidas de tolerancia alterada a la glucosa) y alanina aminotransferasa sérica elevada (ALT, medida de daño hepático que probablemente sea secundario, en este contexto, a enfermedad del hígado graso no alcohólico). Además, los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c%), indicativos de la concentración de glucosa durante los 3 meses anteriores, aumentaron significativamente cuando se comparó un subgrupo de grandes consumidores de NAS (40 individuos) con los no consumidores de NAS (236 individuos, Figura 26A, suma de intervalos p <0,002). Este aumento siguió siendo significativo cuando se corrigió a los niveles de IMC (suma de intervalos p <0,015). En esta cohorte, se caracterizó el ARNr 16S en 172 individuos seleccionados al azar. En particular, se encontraron correlaciones positivas estadísticamente significativas entre múltiples entidades taxonómicas y el consumo de NAS, incluida la familia Enterobacteriaceae (Pearson r = 0,36, corregido con FDR p<10-6), la clase Deltaproteobacteria (Pearson r = 0,33, corregido con FDR p<10-5) y el filo Actinobacteria (Pearson r = 0,27, corregido con FDR p<0,0003, Tabla 5). Es importante destacar que no se detectaron correlaciones estadísticamente significativas entre las abundancias de UTO y el IMC, lo que sugiere que las correlaciones anteriores no se deben a los distintos IMC de los consumidores de NAS.

Tabla 4

Tabla 5

Por último, como evaluación inicial de si la relación entre el consumo humano de NAS y el control de la glucosa en sangre es causal, se hizo un seguimiento durante una semana a siete voluntarios sanos (5 hombres y 2 mujeres, de 28 a 36 años de edad) que normalmente no consumían NAS ni alimentos que contuvieran NAS. Durante esta semana, los participantes consumieron en los días 2-7 la máxima ingesta diaria admisible (IDA) de la FDA de sacarina comercial (5mgkg-1) en 3 dosis diarias divididas equivalentes a 120 mg, y fueron monitorizados mediante mediciones continuas de glucosa y GTT diaria (Figura 27A). En particular, incluso en este periodo de exposición a corto plazo de 7 días, la mayoría de las personas (4 de 7) desarrollaron respuestas glucémicas significativamente más deficientes 5-7 días después del consumo de NAS (denominados en lo sucesivo “respondedores a NAS”), en comparación con su respuesta glucémica individual en los días 1-4 (Figuras 26B-C y 27B, p <0,001). Ninguno de los 3 no respondedores a NAS presentó mejoría en la tolerancia a la glucosa (Figuras 26B, D y 27C).

Las configuraciones del microbioma de los respondedores a NAS, según lo evaluado por análisis de ARNr 16s, se agruparon de manera diferente de las de los no respondedores tanto antes como después del consumo de NAS (Figuras 26E y 27D, respectivamente). Además, los microbiomas de los no respondedores presentaron pequeños cambios en la composición durante la semana de estudio, mientras que se observaron cambios de composición pronunciados en los respondedores a NAS (Figuras 26F y 27E). Para estudiar si esta disbiosis inducida por NAS tiene un papel causal en la generación de intolerancia a la glucosa, las heces de antes (día 1, D1) o después (día 7, D7) de la exposición a NAS se transfirieron de dos respondedores a NAS y dos no respondedores a NAS a grupos de ratones libres de gérmenes alimentados con NC. De hecho, la transferencia de heces posteriores a la exposición a NAS (D7) de los respondedores a NAS indujo una intolerancia a la glucosa significativa en los ratones receptores GF, en comparación con la respuesta observada con las heces D1 transferidas de los mismos individuos que respondieron al NAS (Figuras 26G y 27F, P<0,004 y 27G-H, P<0,02). En cambio, las heces D7 transferidas a ratones GF de los dos no respondedores a NAS indujeron una tolerancia normal a la glucosa, que era indistinguible de la de los ratones a los que se transfirieron heces D1 de los mismos individuos “no respondedores” (Figura 26H y Figuras 27I-K). Los ratones GF trasplantados con microbioma de “respondedores” duplicaron parte de la disbiosis inducida por sacarina del donador, incluido un aumento relativo de 20 veces de Bacteroides fragilis (orden Bacteroidales) y Weissella cibaria (Lactobacillales), y una disminución de ~10 veces en Candidatus arthromitus (Clostridiales) (Figura 27I).

Conclusión

En resumen, los resultados de los inventores sugieren que el consumo de NAS tanto en ratones como en seres humanos aumenta el riesgo de intolerancia a la glucosa y que estos efectos metabólicos adversos están mediados por la modulación de la composición y la función de la microbiota. En particular, varios de los taxones bacterianos que cambiaron después del consumo de NAS se asociaron previamente con T2DM en seres humanos1320, incluida la sobrerrepresentación de Bacteroides y la infrarrepresentación de Clostridiales. Tanto los taxones grampositivos como los gramnegativos contribuyeron al fenotipo inducido por NAS (Figuras 16A-B) y se enriquecieron para las vías de degradación de glicanos (Figura 21), previamente vinculadas a una mayor cosecha de energía (Figuras 22C-D)1124. Esto sugiere que la elaborada cooperación microbiana entre especies puede orquestar funcionalmente el ecosistema intestinal y contribuir a las actividades vitales de la comunidad en condiciones ambientales divergentes (por ejemplo, comida normal frente a condiciones dietéticas altas en grasas). Además, los inventores muestran que los metagenomas de los ratones consumidores de sacarina están enriquecidos con múltiples vías adicionales que previamente se ha demostrado que se asocian con diabetes mellitus23 u obesidad11 en ratones y seres humanos, incluidos el metabolismo de esfingolípidos y la biosíntesis de lipopolisacáridos25.

Los resultados de cohortes de consumidores de NAS humanos a corto y largo plazo obtenidos por los inventores (Figura 26, Figura 27 y Tablas 4-5) sugieren que los individuos humanos presentan una respuesta personalizada al NAS, posiblemente derivada de diferencias en la composición y la función de su microbiota. Los cambios observados en los estudios de los inventores se pueden corroborar aún más en ratones que consumen diferentes dietas humanas26. Los edulcorantes artificiales se introdujeron ampliamente en las dietas aplicadas por los inventores con la intención de reducir la ingesta calórica y normalizar los niveles de glucosa en sangre sin comprometer la afición humana por lo dulce. Junto con otros cambios importantes que se produjeron en la nutrición humana, este aumento en el consumo de NAS coincide con el aumento espectacular de las epidemias de obesidad y diabetes. Los hallazgos de los inventores sugieren que el NAS puede haber contribuido directamente a potenciar precisamente la epidemia que ellos mismos debían combatir. Además, los resultados de los inventores apuntan a la necesidad de desarrollar nuevas estrategias nutricionales adaptadas al individuo integrando diferencias personalizadas en la composición y la función de la microbiota intestinal.

Referencias para el Ejemplo 2

1 Gardner, C. y otros: Nonnutritive Sweeteners: Current Use and Health Perspectives A Scientific Statement from the American Heart Association and the American Diabetes Association. Diabetes care 35, 1798-1808 (2012).

2 Fitch, C. y Keim, K. S. Position of the academy of nutrition and dietetics: use of nutritive and non-nutritive sweeteners. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics 112, 739-758 (2012).

3 Tordoff, M. G. y Alleva, A. M. Effect of drinking soda sweetened with aspartame or high-fructose corn syrup on food intake and body weight. The American journal of clinical nutrition 51, 963-969 (1990).

4 Horwitz, D. L., McLane, M. y Kobe, P. Response to single dose of aspartame or saccharin by NIDDM patients. Diabetes Care 11,230-234 (1988).

5 Nettleton, J. A. y otros: Diet soda intake and risk of incident metabolic syndrome and type 2 diabetes in the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA). Diabetes Care 32, 688-694 (2009).

6 Roberts, A., Renwick, A. G., Sims, J. y Snodin, D. J. Sucralose metabolism and pharmacokinetics in man. Food and chemical toxicology: an international journal published for the British Industrial Biological Research Association 38 Suppl 2, S31-41 (2000).

7 Byard, J. L. y Goldberg, L. The metabolism of saccharin in laboratory animals. Food and cosmetics toxicology 11, 391-402 (1973).

8 Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W. y Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. Cell 148, 1258-1270, doi: 10.1016/j.cell.2012.01.035 (2012).

9 Claesson, M. J. y otros: Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly. Nature 488, 178­ 184, doi:10.1038/nature11319 (2012).

10 Muegge, B. D. y otros: Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science 332, 970-974 (2011).

11 Turnbaugh, P. J. y otros: An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature 444, 1027-1131 (2006).

12 Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S. y Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature 444, 1022-1023 (2006).

13 Qin, J. y otros: A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature 490, 55-60 (2012).

14 Henao-Mejia, J. y otros: Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity. Nature 482, 179-185 (2012).

15 David, L. A. y otros: Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature (2013).

16 Peterson, J. y otros: The NIH human microbiome project. Genome research 19, 2317-2323 (2009).

17 Koropatkin, N. M., Cameron, E. A. y Martens, E. C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nature reviews. Microbiology 10, 323-335, doi:10.1038/nrmicro2746 (2012).

18 Schwiertz, A. y otros: Microbiota and SCFA in lean and overweight healthy subjects. Obesity (Silver Spring) 18, 190-195, doi: 10.1038/oby.2009.167 (2010).

19 Bergman, E. N. Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract in various species. Physiological reviews 70, 567-590 (1990).

20 Karlsson, F. H. y otros: Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control. Nature 498, 99-103 (2013).

21 Connor, S. C., Hansen, M. K., Corner, A., Smith, R. F. y Ryan, T. E. Integration of metabolomics and transcriptomics data to aid biomarker discovery in type 2 diabetes. Molecular bioSystems 6, 909-921, doi:10.1039/b914182k (2010).

22 Cani, P. D. y otros: Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat dietinduced obesity and diabetes in mice. Diabetes 57, 1470-1481, doi:10.2337/db07-1403 (2008).

23 Markle, J. G. y otros: Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science 339, 1084-1088, doi:10.1126/science.1233521 (2013).

24 Sonnenburg, J. L. y otros: Glycan foraging in vivo by an intestine-adapted bacterial symbiont. Science 307, 1955­ 1959 (2005).

25 Cani, P. D. y otros: Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance. Diabetes 56, 1761-1772, doi:10.2337/db06-1491 (2007).

26 Smith, M. I. y otros: Gut microbiomes of Malawian twin pairs discordant for kwashiorkor. Science 339, 548-554, doi:10.1126/science.1229000 (2013).

Ejemplo 3

Las fluctuaciones diurnas en la biogeografía y la función de la microbiota intestinal programan globalmente el transcriptoma circadiano del anfitrión

Materiales y procedimientos

Ratones: Se adquirieron ratones C57B1/6 de Harlan y se dejó que se aclimataran a las instalaciones locales para animales durante dos semanas antes de usarlos para la experimentación. Los ratones se mantuvieron bajo estrictos ciclos de luz y oscuridad, encendiéndose las luces a las 6 de la mañana y apagándose a las 6 de la tarde. En todos los experimentos, se usaron animales de la misma edad y el mismo sexo. Los ratones tenían entre 8 y 9 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Generalmente, se usaron ratones tanto machos como hembras. Se recogieron muestras de heces, contenido fecal y muestras tisulares frescos y de forma individual para cada ratón. Las muestras frescas se recogieron en tubos, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido tras la recogida y se almacenaron a -80 ° C hasta el aislamiento del ARN o el ADN. En los experimentos de temporización de la alimentación, los ratones se alojaron en condiciones estándar de luz y oscuridad (6 de la mañana a 6 de la tarde), pero tuvieron acceso a los alimentos solo durante la fase con luz o de oscuridad, respectivamente, durante 2 semanas. Para el tratamiento con antibióticos, se administró a los ratones una combinación de vancomicina (0,5 g/l), ampicilina (1 g/l), kanamicina (1 g/l) y metronidazol (1 g/l) en el agua de bebida. Todos los antibióticos se obtuvieron de Sigma Aldrich. Se administraron antibióticos de forma continua durante una semana. Para experimentos con ratones gnotobióticos, se alojaron ratones Swiss Webster libres de gérmenes en aisladores estériles. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el IACUC local.

RNA-Seq: Los tejidos se preservaron en una solución RNAlater (Ambion) y posteriormente se homogeneizaron en reactivo Trizol (Invitrogen). El ARN se purificó según las instrucciones del fabricante. Se usaron 400 ng de ARN total para la preparación de la biblioteca. Se capturó ARNm con12 pl de Dynabeads oligo(dT) (Life technologies), y se lavó según las directrices del fabricante. El ARN mensajero purificado se eluyó a 70°C con 10 pl de 10 mM Tris-Cl pH 7,5. Se generó ADNc a partir de 1ml del ARNm de cada muestra. La cantidad de ADNc en cada muestra fue evaluada mediante qPCR para el gen actina B, y, a continuación, se tomaron cantidades equivalentes de ARNm de cada muestra para la construcción de la biblioteca RNA-Seq. La construcción de la biblioteca se llevó a cabo en un formato de placa de 96 pocillos. En primer lugar, para abrir las estructuras secundarias del ARN y permitir la hibridación del cebador RT, las muestras se incubaron a 72°C durante 3 minutos y transferidas inmediatamente a 4°C. A continuación, se añadió la mezcla de reacción de RT (10 mM DTT, 4 mM dNTP, 2,5 U/pl enzima Superscript III RT en Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCb) a cada pocilio de la placa de 96 pocilios y la reacción se mezcló. Se bajó la velociad de la placa de 96 pocillos hasta detenerse y se movió a un ciclador (Eppendorf) para la siguiente incubación: 2 minutos a 42°C, 50 minutos a 50°C, 5 minutos a 85°C. Las muestras indexadas con una cantidad equivalente de ADNc se combinaron y el producto se purificó con 1,4* volúmenes de perlas SPRI. La biblioteca se completó y amplificó mediante una reacción de PCR de 12 ciclos con cebadores 0,5 mM de P5_Rd1 y P7_Rd2 y una mezcla preparada para PCR (Kapa Biosystems). El cebador directo contiene las secuencias Illumina P5-Read1 y el cebador inverso contiene las secuencias P7-Read2. La biblioteca combinada amplificada se purificó con 0,7* volúmenes de perlas SPRI para eliminar los restos del cebador. La concentración de la biblioteca se midió con un fluorómetro Qubit (Life Technologies) y el tamaño medio de la molécula se determinó con un instrumento 2200 TapeStation (Agilent). Las bibliotecas se secuenciaron utilizando un Illumina HiSeq 1500. Las lecturas se analizaron como se ha descrito anteriormente (Lavin y otros, 2014) y se normalizaron al número de lecturas totales para una cobertura igual en todas las muestras. Solo se consideraron para el análisis los genes con más de 10 lecturas por muestra.

Cuantificación del ADN bacteriano: Se recolectaron comunidades adherentes a la luz y a las mucosas mediante un amplio lavado de la luz intestinal para eliminar bacterias comensales no adherentes. Se extrajo ADN de las fracciones luminal y de la mucosa usando el equipo MoBio PowerSoil. La concentración de ADN se calculó usando una curva estándar de concentraciones conocidas de ADN de E. coli K12. Se realizó una qPCR 16S usando cebadores que identificaban diferentes regiones del gen V6 16S usando la mezcla rápida SYBR (Kapa Biosystems). A continuación, se calculó de forma aproximada el número absoluto de bacterias en las muestras como cantidad de ADN en una muestra/masa de la molécula de ADN de las bacterias.

Microscopía electrónica de barrido: Los ratones se perfundieron con un fijador que contenía glutaraldehído al 2% y PFA al 3% en cacodilato de sodio 0,1 M. Las muestras de colon se lavaron exhaustivamente de la materia fecal y se fijaron durante 1-2 horas. Las muestras se enjuagaron tres veces en tampón de cacodilato de sodio y se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% durante 1 hora, se tiñeron en acetato de uranilo al 1% durante una hora más, luego se enjuagaron, deshidrataron y secaron usando secado de punto crítico. A continuación, las muestras se recubrieron de oro y se visualizaron en un ULTRA 55 FEG (ZEISS). Para la cuantificación de imágenes, se contó y promedió el número de bacterias en 10 campos seleccionados al azar por muestra.

Metabolómica: El análisis de metabolómica fue realizado por Metabolon, Inc (Morrisville, Carolina del Norte). Las muestras se analizaron mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectroscopia de masas en tándem (UPLC-MS/MS) y cromatografía de gases-espectroscopia de masas (GC-MS). La parte de LC/MS de la plataforma se basó en una cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) Waters ACQUITY y un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q-Exactive de alta resolución/precisión interconectados con una fuente de ionización por electropulverización calentada (HESI-II) y un analizador de masas Orbitrap operado a una resolución de 35.000 masas. El extracto de la muestra se secó y luego se reconstituyó en disolventes ácidos o básicos compatibles con LC, cada uno de los cuales contenía 8 o más patrones de inyección a concentraciones fijas para asegurar la inyección y la coherencia cromatográfica. Se analizó una alícuota usando condiciones ácidas optimizadas de iones positivos y la otra usando condiciones optimizadas de iones negativos básicos en dos inyecciones independientes usando columnas dedicadas separadas (Waters UPLC BEH C18-2,1*100 mm, 1,7 pm). Los extractos reconstituidos en condiciones ácidas se eluyeron en gradiente de una columna C18 usando agua y metanol que contenía ácido fórmico al 0,1%. Los extractos básicos se eluyeron de forma similar de C18 usando metanol y agua, aunque con bicarbonato de amonio 6,5 mM. La tercera alícuota se analizó mediante ionización negativa después de la elución de una columna HILIC (Waters UPLC BEH Amide 2,1*150 mm, 1,7 pm) usando un gradiente que constaba de agua y acetonitrilo con formiato de amonio 10 mM. El análisis de MS alternó entre MS y barridos de MS2 dependientes de los datos usando exclusión dinámica, y el intervalo de escaneo fue de 80-1000 m/z. Las muestras destinadas al análisis por GC-MS se secaron al vacío durante un mínimo de 18 horas antes de modificarse en nitrógeno seco con bistrimetilsililtrifluoroacetamida. Las muestras modificadas se separaron en una columna de sílice fundida de 5% difenil / 95% dimetilpolisiloxano (20 m * 0,18 mm DI; 0,18 pm de espesor de película) con helio como gas portador y una pendiente de temperatura de 60° a 340°C en un periodo de 17,5 minutos. Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas de un solo tetrapolo de barrido rápido Thermo-Finnigan Trace DSQ usando ionización por impacto de electrones (EI, por sus siglas en inglés) y se operaron con un poder de resolución de masa unitaria. El intervalo de barrido fue de 50 a 750 m/z. Se extrajeron los datos en bruto, se identificaron sus picos y se los procesó mediante QC. Los compuestos se identificaron por comparación con las entradas de la biblioteca de estándares purificados o entidades desconocidas recurrentes. Además, las identificaciones bioquímicas se basaron en tres criterios: índice de retención dentro de una ventana de RI estrecha de la identificación propuesta, coincidencia precisa de masa con la biblioteca /- 0,005 uma y las puntuaciones directa e inversa de MS/MS entre los datos experimentales y los estándares auténticos. Las puntuaciones de MS/MS se basan en una comparación de los iones presentes en el espectro experimental con los iones presentes en el espectro de la biblioteca. Los picos se cuantificaron usando el área bajo la curva. Para los estudios que abarcan varios días, se realizó una etapa de normalización de datos para corregir la variación resultante de las diferencias de ajuste entre días del instrumento. Para el análisis, los valores se normalizaron en términos de recuentos de área sin procesar y luego se volvieron a cambiar de escala para establecer la mediana en 1.

Análisis taxonómico de la microbiota: Se obtuvieron comunidades bacterianas adherentes eliminando el contenido luminal de los cólones mediante lavado en serie, seguido por la congelación instantánea de la capa mucosa en nitrógeno líquido. Las muestras congeladas se procesaron para el aislamiento del ADN usando un equipo MoBio PowerSoil según las instrucciones del fabricante. Se usó 1ng del ADN fecal purificado para la amplificación por PCR y la secuenciación del gen del ARNr 16S bacteriano. Los amplicones que abarcan la región variable 1/2 (V1/2) del gen del ARNr 16S se generaron usando los siguientes cebadores con códigos de barras: : dir 5'-NNNNNNNNAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 1), inv 5-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 2), representando N una base de código de barras. Posteriormente, las reacciones se combinaron en una proporción equimolar, se purificaron (equipo de limpieza de PCR, Promega) y se usaron para la secuenciación de Illumina MiSeq. Se empleó una secuenciación de extremos emparejados de 500 pb. Se usó una secuencia interna de ejecución para ensamblar las lecturas de los extremos emparejados. En todos los experimentos se lograron tasas de ensamblaje del 90%. Luego, las lecturas se procesaron usando el flujo funcional de análisis QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology, www.qiime.org) (Caporaso y otros, 2010). Sucintamente, se utilizaron como entradas ficheros de calidad fasta y un fichero de correlaciones que indica la secuencia de código de barras correspondiente a cada muestra, las lecturas se dividieron por muestras de acuerdo con el código de barras, la clasificación taxonómica se realizó utilizando el clasificador RDP y se creó una tabla UTO. Los inventores emplearon una correlación UTO de referencia abierta usando la base de datos GreenGenes. No se permitieron nucleótidos no coincidentes en la longitud total de lectura ensamblada de extremos emparejados de 359 pb. Se realizó una rarefacción para excluir las muestras con lecturas insuficientes por recuento de muestras. Las secuencias que comparten un 97% de identidad de secuencia de nucleótidos en la región V2 se agruparon en unidades taxonómicas operativas (UTO con ID del 97%). Para la betadiversidad, se representaron visualmente mediciones unifrac no ponderadas de acuerdo con las dos primeras coordenadas principales basadas en 1.000 lecturas por muestra.

Correlación de secuencias metagenómicas. Las lecturas de secuenciación de Illumina se correlacionaron con un catálogo de genes microbianos intestinales (Human Microbiome Jumpstart Reference Strains y otros, 2010) usando un correlacionador GEM (Marco-Sola y otros, 2012) con los siguientes parámetros: -m 0,08 -s 0 -q desfase-33 -umbralde-calidad-gem 26.

Asignación funcional: A las lecturas correlacionadas con el catálogo de genes microbianos intestinales se les asignó un número de identificación KEGG (Kanehisa y Goto, 2000) según la correlación de gen a categoría que acompañaba al catálogo de genes. Posteriormente, los genes se correlacionaron con módulos y vías KEGG. Solo se consideraron los genes con más de 10 lecturas asignadas. Para el análisis de vías KEGG solo se incluyeron las vías cuya cobertura génica estaba por encima de 0,2. Acto seguido, las vías KEGG fueron sometidas a oscilaciones diarias por el ciclo JTK.

Análisis estadístico: Los datos se expresan como media ± S.E.M. Para el análisis de las oscilaciones rítmicas y sus amplitudes, se utilizó la prueba no paramétrica ciclo JTK en R (Hughes y otros, 2010), permitiendo 24 horas para la determinación de la periodicidad circadiana. Para la detección de metabolitos, contenido metagenómico y transcritos rítmicos, se consideraron significativos p <0,05 y q<0,2. Se generaron diagramas de Chow-Ruskey en R usando el paquete Vennerable. Las pruebas hipergeométricas para el análisis de enriquecimiento de vías KEGG se realizaron usando DAVID (Huang da y otros, 2009).

Resultados

Ritmos diurnos de la localización biogeográfica de la microbiota

La microbiota intestinal experimenta oscilaciones rítmicas en la composición y el contenido de genes, pero los mecanismos por los cuales estas oscilaciones microbianas funcionales tienen un impacto en el anfitrión siguen siendo difíciles de captar. Dado que se cree que las bacterias comensales que afectan con más fuerza al anfitrión están ubicadas muy cerca de la superficie de la mucosa intestinal, los presentes inventores buscaron estudiar los aspectos biogeográficos de la ritmicidad diurna del microbioma. Por lo tanto, analizaron las fluctuaciones en la abundancia de bacterias comensales adherentes al epitelio en el curso de dos días (Figura 28A) y analizaron la ritmicidad con el algoritmo no paramétrico ciclo JTK (Hughes y otros, 2010), de uso común. Todos los ratones fueron alimentados ad libitum y alojados bajo estrictas condiciones de luz y oscuridad de 24 horas, manteniéndose las luces encendidas durante 12 horas (horas Zeitgeber (ZT) 0-12). En cada momento, se eliminó exhaustivamente el contenido luminal de los cólones proximales y solo se aislaron las bacterias adherentes a la mucosa, seguido de la cuantificación del ADN mediante qPCR. El número de bacterias que colonizan el nicho epitelial sufrió marcados cambios diurnos, siendo mayor la adherencia a la capa epitelial comensal en la fase de oscuridad (Figura 28B, p=3*10'7, ciclo JTK), mientras que el número luminal de bacterias se mantuvo constante (Figura 29A ). Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) confirmaron fluctuaciones diarias en la cantidad de comensales en estrecha asociación con el epitelio intestinal (Figuras 28C, 29B y 29C). Las imágenes SEM sugirieron que la composición taxonómica de las bacterias adherentes no era uniforme en diferentes momentos del día (Figura 28C). Por lo tanto, los inventores realizaron la secuenciación del ADNr 16S de las comunidades asociadas al epitelio recolectadas en diferentes momentos del día. De hecho, la composición de las bacterias adherentes experimentó marcadas fluctuaciones diurnas, de modo que la beta-diversidad de los comensales asociados al epitelio cambió rítmicamente en el curso de ciclos consecutivos de luz y oscuridad (Figuras 28D, 28E, y 30A-C; p=4*10'13 para oscilaciones de distancias UniFrac). Así, la composición de la comunidad localizada en la mucosa intestinal en cualquier momento fue más similar a la presente 24 horas después que a la de cualquier otro momento intermedio. Ciertos comensales presentaban diferentes momentos preferentes del día para la localización en la proximidad epitelial (Figura 28F), incluyendo Ruminococcus, Mucispirillum y Lactobacillus (p<10-6 y p<10-5, respectivamente, Figura 28G). Por lo tanto, la mucosa del anfitrión estuvo expuesta a cantidades y especies de bacterias fluctuantes diurnas, tanto en abundancia relativa (Figuras 28G-28I) como absoluta (Figuras 30D-I). Es de destacar que las abundancias máxima y mínima de ciertas especies bacterianas diferían en más de 100 veces, como ejemplifica el Mucispirillum schaedleri (Figura 30F), un comensal conocido por colonizar la capa de moco en ratones. Juntos, estos resultados demuestran que la microbiota intestinal sufre oscilaciones en la distribución biogeográfica, lo que da como resultado perfiles periódicos de comensales asociados a la mucosa característicos de diferentes horas del día.

Ritmos diurnos del metaboloma intestinal

Para determinar si la ritmicidad diurna ocurre dentro de la superficie de contacto anfitrión-microbioma, produciéndose la comunicación intensa e íntima principalmente a través del intercambio y detección de metabolitos, la dinámica temporal del metaboloma intestinal se determinó mediante el perfil de metabolitos en ratones de la forma natural cada 6 horas en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad (Figura 28A). Usando el ciclo JTK, se encontró que el 18% de todos los metabolitos detectados experimentan fluctuaciones en un ritmo de 24 horas cuando se usan p<0,05 y q<0,2 como umbral (Figura 31A). Los metabolitos oscilantes pertenecían a diversos grupos químicos, incluyendo carbohidratos (Figuras 31B y 31C), vitaminas (Figuras 31D y 31E), aminoácidos (Figuras 31F y 31G), lípidos (Figura 31H), nucleótidos (Figuras 32a y 32B), péptidos (Figuras 32C y 32D) y xenobióticos (Figuras 32E-32F). Se encontraron fluctuaciones diurnas muy robustas, por ejemplo, en los carbohidratos xilosa, glucosa y lactato (p<0,007, Figuras 31B y 31C), la vitamina esencial biotina dependiente de la microbiota (p<10-5, Figura 31E), y en los aminoácidos prolina y asparagina (p <0,0004, Figuras 31F y 31G). Estos resultados indican que la superficie de contacto anfitrión-microbiota se caracteriza por una ritmicidad multifacética compuesta de ritmicidades de microbioma compositivo (Thaiss y otros, 2014b), metagenómico (Figura 32I) y biogeográfico (Figuras 28A-I), y ritmicidad transcriptómica del anfitrión cuantificada por RNA-Seq periódica (Figura 31J), y ritmicidad metabolómica (Figura 31K), integrando los patrones diurnos del anfitrión, su microbioma y el aporte dietético. En algunos casos, se podría reconocer un vínculo directo entre los diferentes componentes de este entorno rítmico de múltiples capas. Por ejemplo, la abundancia rítmica de los genes microbianos que codifican las dos etapas enzimáticas finales en la biosíntesis de biotina, bioD y bioB, acompañó a la abundancia luminal rítmica fásica de la biotina (Figuras 32G y 32H).

La microbiota programa las oscilaciones del transcriptoma colónico

Para determinar globalmente los papeles regulatorios que desempeña la microbiota sobre los procesos oscilatorios del anfitrión, se administraron a los ratones antibióticos de amplio espectro y se determinó el impacto del agotamiento de la microbiota en las oscilaciones diurnas del metaorganismo (Figura 33A). Como cabía esperar, el tratamiento con antibióticos redujo drásticamente el número de bacterias epiteliales adherentes y eliminó cualquier ritmicidad en la comunidad restante, según lo determinado por PCR cuantitativa y SEM (Figuras 33B, 33C, 34A y 34B). Como resultado, la composición taxonómica rítmica de los comensales asociados al epitelio fue abrogada por el tratamiento con antibióticos (Figuras 3D y 34C-34E). Por ejemplo, el Lactobacillus reuteri perdió su característica de fases pico y valle de abundancia relativa en ratones que bebían antibióticos (Figura 34E). Para determinar los efectos del agotamiento microbiano y la pérdida de oscilaciones en el anfitrión, se realizó una secuenciación comparativa de ARN de tejido colónico de ratones de control y tratados con antibióticos cada 6 horas en el curso de dos ciclos de luz y oscuridad, usando 5 ratones en cada ZT en cada grupo (Figura 33A). La ritmicidad en los perfiles de transcritos se evaluó mediante ciclo JTK con un umbral de p<0,05 y q<0,2. Ambos grupos presentaban números comparables de transcritos oscilantes de anfitriones (Figura 35a ), lo que indica que la ritmicidad circadiana transcripcional intestinal global era independiente de la presencia de microbiota intestinal. No obstante, la identidad del programa de genes oscilantes fue marcadamente diferente en los ratones tratados con antibióticos en comparación con los controles (Figura 33F). En conjunto, 2102 de un total de 3133 genes que oscilaban en ratones colonizados perdieron su ritmicidad en los ratones tratados con antibióticos. En cambio, 1194 genes presentaron oscilaciones de novo en ratones tratados con antibióticos, mientras que solo 1031 transcritos rítmicos fueron compartidos entre ambos grupos (Figuras 33F-3I). Entre los transcritos compartidos se encontraban genes implicados en el reloj circadiano central y las funciones de limpieza intestinal, lo que sugiere que la función de la maquinaria del reloj periférico del anfitrión no dependía intrínsecamente de la presencia de una microbiota intacta (Figuras 33J, 35B). Los transcritos que perdieron sus oscilaciones en ausencia de la microbiota pertenecían principalmente al metabolismo de los nucleótidos y a las vías del ciclo celular, así como a las vías metabólicas del anfitrión activadas aguas abajo de los metabolitos de la microbiota, como las vías que metabolizan los ácidos grasos de cadena corta y las vías de producción de moco (Figura 33K). Los transcritos oscilatorios del anfitrión dependientes del microbioma también incluían genes implicados en la señalización del receptor inmunitario (Figuras 33K y 35C), en línea con un informe anterior sobre el control microbiano de la señalización rítmica de los TLR (receptores de tipo Toll, por sus siglas en inglés) en células epiteliales intestinales (Mukherji y otros, 2013). Sin embargo, las más notables fueron las funcionalidades que ganaron ritmicidad tras el agotamiento de la microbiota, que incluían vías metabólicas importantes como el ciclo TCA y la fosforilación oxidativa (Figura 33L), como ejemplifican los miembros del complejo citocromo c oxidasa (Figura 35D). Como resultado, la coordinación temporal global de la actividad metabólica colónica difirió entre los ratones de control y los ratones con microbiota empobrecida, alcanzando las funciones rítmicas su punto máximo en diferentes momentos del día (Figura 35E). Para descartar posibles efectos de confusión del tratamiento con antibióticos per se, estos resultados se confirmaron en ratones libres de gérmenes que se encuentran alojados en condiciones estériles. De hecho, al igual que los ratones tratados con antibióticos, los ratones libres de gérmenes presentaban alteraciones masivas en su transcriptoma cíclico, mientras que el número total de elementos cíclicos era comparable a los controles (Figuras 35F-35I). Como resultado, las funcionalidades de KEGG perdieron y ganaron ritmicidad, de forma similar a los ratones tratados con antibióticos (datos no mostrados). Juntos, estos datos indican que la microbiota reprograma el transcriptoma rítmico del anfitrión para alterar la secuencia temporal de los programas metabólicos e inmunológicos, muchos de los cuales son directamente relevantes para su propia función de nicho simbiótico.

Las oscilaciones coordinadas del metaorganismo son impulsadas por las horas de alimentación

Para determinar si la ingesta rítmica de alimentos controla la actividad rítmica de los comensales, se realizaron experimentos de alimentación temporizados. En estos, los ratones (que preferentemente consumen alimentos durante la fase de oscuridad, Figura 36A), fueron alimentados ad libitum, solo durante la fase de oscuridad, o solo durante la fase con luz (Figuras 37A, 36B y 36C). La secuenciación metagenómica aleatoria, la evaluación biogeográfica y la cuantificación del transcriptoma del anfitrión se realizaron en ratones de diferentes grupos de alimentación programada (Figura 37A). Si bien la ritmicidad general del microbioma no se vio afectada por las horas de alimentación alteradas (Figura 37B), las horas de alimentación invertidas cambiaron de fase las oscilaciones en la abundancia de genes (Figuras 37C y 37D), como demuestra la galactosamino sulfatasa bacteriana (Figura 36D). Como consecuencia, los módulos y las vías metagenómicos rítmicos siguieron las horas de ingesta de alimentos y presentaron acro y batifase de fase inversa entre ratones alimentados ad libitum y alimentados en la fase con luz (Figuras 36E y 36F). Los elementos funcionales estrictamente controlados por la hora de alimentación incluyeron la degradación del moco bacteriano (Figuras 37E, 37F y 36G) y la motilidad (Figura 36H), lo que potencialmente explica cómo las horas de alimentación determinan el ritmo de translocación de la microbiota y el metabolismo del moco y, por lo tanto, regulan las fluctuaciones diurnas en la fijación biogeográfica epitelial. De hecho, las horas de alimentación invertidas también invirtieron el patrón de adherencia epitelial rítmica (Figura 37G), medido por la qPCR de los comensales adheridos en el curso de un día.

La alimentación rítmica también reprogramó el transcriptoma colónico, como se ha señalado previamente para el hígado (Vollmers y otros, 2009), manteniendo un número total constante de elementos oscilantes (Figuras 37H y 37I). En sincronización con los cambios de fase en el microbioma, el transcriptoma rítmico del colon también siguió las horas de alimentación (Figuras 37J-37L, 36I y 36J). En conjunto, estos resultados sugieren que la disponibilidad rítmica de nutrientes dirige oscilaciones diurnas funcionales en la actividad de la microbiota y la localización biogeográfica, simultánea a su control de la actividad rítmica de múltiples vías del anfitrión relacionadas con el mutualismo anfitriónmicrobiota.

Las horas de alimentación, la microbiota y la genética del anfitrión coordinan conjuntamente el transcriptoma cíclico

Dado el hallazgo de que tanto la microbiota como las horas de alimentación son capaces de programar las oscilaciones del transcriptoma colónico, los presentes inventores abordaron a continuación la interacción entre ambos tipos de influencias ambientales sobre la función circadiana del anfitrión. Para determinar el parecido y la interdependencia entre la reprogramación del transcriptoma del anfitrión inducida por alteración de la ritmicidad de la alimentación y la inducida por el agotamiento del microbioma, se realizó una comparación cuádruple de transcritos oscilantes únicos y compartidos entre ratones en alimentación programada, con y sin tratamiento adicional con antibióticos (Figura 37A). Generalmente, el número de transcritos oscilantes fue estable en todas las condiciones (datos no mostrados). Para identificar elementos cíclicos compartidos y únicos en cada grupo, se utilizó una comparación de Chow-Ruskey de 4 órdenes (Figura 38A), que reveló varias características. En primer lugar, tanto la alimentación programada como el agotamiento de la microbiota crearon patrones independientes de transcritos de anfitriones únicos y compartidos (Figura 38A). Trescientos transcritos eran solo dependientes de la microbiota, ya que experimentaban un ciclo independientemente de la condición de alimentación (con un cambio de fase entre horas de alimentación inversas) pero perdían oscilaciones con el tratamiento con antibióticos (Figura 38B). Estos genes incluían miembros de vías inmunes, como el receptor de interferón-Y (Figuras 38C y 38D), así como genes implicados en la función de barrera, como la claudina-2 (Figuras 38E y 38F). En segundo lugar, solo una minoría de transcritos oscilaba en todas las condiciones. De hecho, solo 44 transcritos que mostraron oscilaciones significativas según el algoritmo ciclo JTK fueron compartidos entre todas las condiciones (Figura 38A). El análisis de las vías KEGG de estos transcritos reveló que este grupo se enriqueció para los miembros del reloj molecular central (Figuras 38A y 38G-38J), lo que indica que el reloj molecular en sí mismo mantiene oscilaciones robustas independientemente de las condiciones de alimentación y de la disponibilidad del microbioma, mientras que la mayoría de las dianas aguas abajo solo oscilan en las condiciones de alimentación y colonización adecuadas. En tercer lugar, el número de genes que experimentan un ciclo de forma única en ratones tratados con antibióticos alimentados con luz fue aproximadamente un 50% menor que el de todos los demás grupos, lo que indica que la microbiota tiene un papel en la reprogramación del transcriptoma cíclico en respuesta a la inversión de las horas de alimentación. En apoyo de esta noción, los miembros del reloj canónico que oscilaban en los cuatro grupos se desplazaron de fase entre ratones alimentados con fase de oscuridad y fase con luz, pero este cambio de fase se perdió cuando los ratones también fueron tratados con antibióticos. Por ejemplo, el cambio de fase en las oscilaciones de Cry1 entre los grupos alimentados en la fase de oscuridad y la fase con luz se atenuó en gran medida cuando la microbiota en ambos grupos fue trastocada por el tratamiento con antibióticos (Figuras 38G y 38H). Se observó el mismo fenómeno con otros genes reloj (Figuras 38I y 38J). Estos resultados revelan un impacto inesperadamente grande de la actividad de la microbiota en el mantenimiento de la transcripción rítmica en el intestino, que incluye tanto la identificación como la distribución de fases de los elementos cíclicos.

Los presentes resultados indican que la presencia de la microbiota es crítica para el mantenimiento de las oscilaciones del transcriptoma colónico. Para comprender si la necesidad de que la microbiota impulse la actividad circadiana del anfitrión se debe únicamente a su presencia o a su actividad fluctuante diurna, los presentes inventores aprovecharon el hallazgo de que las oscilaciones microbianas composicionales dejan de estar presentes en ausencia de un reloj circadiano funcional del anfitrión, pero se pueden restaurar mediante la alimentación rítmica (Thaiss y otros, 2014b). Por lo tanto, realizaron un experimento de alimentación programada en ratones deficientes en Per1/2, que carecen de componentes esenciales del reloj molecular (Figura 39A), y evaluaron las oscilaciones metagenómicas y del transcriptoma colónico en estos ratones en condiciones adlibitum y de alimentación programada. Aunque los ratones Perl/2 '1' alimentados ad libitum carecían de actividad oscilatoria en su metagenoma, los ritmos diurnos del microbioma fueron inducidos por alimentación programada (Figuras 39B-39D), como demuestra la hidrogenasa bacteriana hyoA (Figura 39E). En consecuencia, los módulos funcionales del microbioma ganaron organización temporal en un ritmo de 24 horas en ratones deficientes en Per1/2 con la alimentación programada (Figura 39F). En línea con hallazgos anteriores en muestras hepáticas (Vollmers y otros, 2009), la alimentación temporizada también restauró oscilaciones en varios cientos de transcritos colónicos en ratones Per1/2r/~ (Figura 39G). Sorprendentemente, sin embargo, la recuperación de la actividad diurna en estos transcritos dependía de una microbiota intacta, ya que el tratamiento con antibióticos de ratones Per1/2-'- alimentados de forma temporizada derogó la restauración de estas oscilaciones del anfitrión (Figura 39G). Los transcritos cuya inducción de la ritmicidad inducida por la alimentación dependía de la microbiota incluían múltiples genes involucrados en la respuesta inmunitaria de la mucosa, incluidos miembros de la familia de citocinas IL-1 y su vía de señalización (Il33, Il1r1, Myd88, Socs1). Estos datos indican que las oscilaciones de la microbiota son necesarias para el mantenimiento de las oscilaciones del transcrito en un gran número de genes colónicos.

La microbiota programa el reloj hepático

Por último, los inventores se propusieron determinar si los efectos mediados por el microbioma intestinal oscilante diurno sobre el programa del transcriptoma oscilante intestinal podrían transmitirse sistémicamente. Tan distantes efectos reguladores inducidos por el microbioma sobre la ritmicidad circadiana del anfitrión serían de posible relevancia fisiopatológica. Los inventores decidieron centrarse en los efectos de la actividad diurna del microbioma sobre la ritmicidad circadiana del hígado, ya que los impactos del microbioma en la fisiología y la enfermedad hepáticas se han documentado en múltiples estudios recientes, mientras que muchos de los mecanismos de tales efectos distales siguen siendo difíciles de captar (Henao-Mejía y otros, 2012; Qin y otros, 2014). Para evaluar si la reprogramación del transcriptoma hepático se ve afectada por la alteración de la microbiota, los ratones se trataron durante una semana con tratamiento con antibióticos de amplio espectro, se perfiló la transcripción rítmica hepática de ratones no modificados y tratados con antibióticos o con el ciclo JTK, con p<0,05 y q<0,2 como umbral (Figura 33A). Al igual que en el colon, la alteración de la microbiota mediada por antibióticos reprogramó las oscilaciones del transcriptoma hepático, mientras que el número total de elementos rítmicos permaneció comparable al de los controles (Figuras 40A y 41A). Al igual que en el intestino, los componentes del reloj canónico mantuvieron sus ritmos (Figuras 40B y 41B-D), y las funciones de limpieza, metabolismo y desintoxicación hepáticas continuaron experimentando un ciclo con la exposición a antibióticos (Figuras 41B, 41E y 41F). Seiscientos veintinueve de un total de 1796 transcritos perdieron los perfiles oscilatorios (Figura 40C), incluidos los genes implicados en la fosforilación oxidativa y otras vías catabólicas (Figura 40D). Por ejemplo, el gen que codifica la glucosa fosfato isomerasa-1 perdió una ritmicidad detectable después de una semana de tratamiento con antibióticos (Figura 41G). En cambio, 1825 transcritos desarrollaron ritmicidad de novo (Figura 40E), muchos de los cuales están involucrados en el metabolismo de ácidos grasos, ácidos nucleicos y aminoácidos (Figura 40F). Como resultado de estas alteraciones masivas en el transcriptoma cíclico, la secuencia temporal normal de la actividad metabólica hepática fue parcialmente abolida y reemplazada por programas oscilatorios de novo con actividades máximas en momentos del día marcadamente diferentes que en afecciones no tratadas con antibióticos (Figura 40G). Por ejemplo, las vías involucradas en el metabolismo de los aminoácidos, la señalización de la insulina y la señalización del PPAR presentaban picos de actividad con desplazamiento de fase (Figura 40G). Así, inesperadamente, se encontró que la microbiota era vital para mantener la sucesión homeostática diaria de actividad metabólica, tanto en el entorno intestinal local como sistémicamente.

En este ejemplo, la ritmicidad diurna se identifica como un componente esencial en la regulación de la simbiosis anfitrión-microbiota. Se han identificado dos nuevos elementos de la actividad oscilatoria de la microbiota que proporcionan una explicación mecanicista de su importancia funcional: las oscilaciones en la localización biogeográfica y los patrones de secreción de los metabolitos. Las funciones rítmicamente coordinadas, como la motilidad bacteriana y la degradación del moco, establecen un patrón temporal de adherencia mucosa de miembros definidos de la microbiota, induciendo un estado homeostático en el que el anfitrión es expuesto periódicamente a diferentes cantidades, especies, funciones y productos bacterianos en diferentes momentos del día. En respuesta, el anfitrión ejerce un programa inmunológico y metabólico rítmico en sincronía con la correspondiente actividad microbiana (Figura 40H). Una vez abrogada la colonización homeostática, como en el caso del tratamiento con antibióticos, se pierde la ritmicidad microbiana en todas sus capas, incluida la composición y la adherencia mucosa, lo que provoca el desacoplamiento de la correspondiente ritmicidad del anfitrión. Sorprendentemente, una parte integral de este desacoplamiento circadiano microbiota-anfitrión implica una génesis masiva de novo de oscilaciones transcripcionales del anfitrión tanto en el intestino como en el hígado, potencialmente para satisfacer las necesidades impuestas por la ingesta rítmica de alimentos que normalmente se amortigua por la actividad diurna de la microbiota (Figura 40H) . La pérdida del socio microbiano simbiótico o de su comportamiento cíclico normal perturba la orquestación del transcriptoma temporal del anfitrión mamífero, incluso en lugares alejados del sitio de colonización microbiana.

Estos hallazgos tienen numerosas implicaciones importantes. En primer lugar, el intercambio de metabolitos se reconoce cada vez más como un medio importante de comunicación entre la microbiota y el anfitrión, creando con ello una red de metaorganismos de interdependencia e interferencia metabólica e inmunológica. Esto se ejemplifica por la regulación inducida por metabolitos de la fisiología del anfitrión y el reconocimiento molecular de la presencia microbiana por los receptores del sistema inmunológico innato. Todas las funciones de ese tipo dependen fundamentalmente de la localización biogeográfica de la microbiota y, por lo tanto, los mecanismos reguladores que subyacen a la estratificación de la microbiota en el ecosistema intestinal pueden ser la clave para comprender cómo se establece y mantiene la colonización microbiana dentro del anfitrión. Los presentes hallazgos demuestran que la hora del día influye drásticamente en los tres parámetros: una hora determinada del día presenta perfiles únicos de metaboloma, composición microbiana y adherencia de la mucosa, lo que da como resultado un programa transcripcional del anfitrión específico a la hora que resalta distintas funciones inmunitarias y metabólicas en diferentes periodos diurnos. Las moléculas derivadas de microbios también pueden dar forma a patrones metabolómicos circadianos sistémicos, que se ha descubierto recientemente que albergan un comportamiento rítmico, al contribuir diurnamente con compuestos modulados o producidos por microbios esenciales, como los aminoácidos esenciales y las vitaminas.

En consecuencia, los presentes resultados sugieren que las interacciones anfitrión-microbioma en el estado estacionario, actualmente consideradas estáticas, pueden de hecho ser vistas como un estado de “homeostasis fluctuante” en constante alteración pero estrechamente acoplado y muy regulado. Además, se puede sugerir que estas propiedades microbianas funcionales y composicionales diurnas también son importantes para determinar la respuesta del anfitrión a la pérdida de la homeostasis de la microbiota (como durante la exposición a antibióticos). Por lo tanto, los resultados actuales sugieren que la cinética de la función de la microbiota debe tenerse en cuenta al interpretar los efectos posteriores de las intervenciones dietéticas y médicas que modulan la microbiota.

En segundo lugar, la identificación de la ritmicidad diurna coordinada entre la correspondiente actividad metabólica microbiana y del anfitrión añade una faceta inesperada a nuestra comprensión de la coevolución del anfitrión y microbiana. La inducción microbiana de las oscilaciones del transcrito del anfitrión podría ser funcionalmente beneficiosa para el ecosistema del metaorganismo en al menos dos formas. Por un lado, al sincronizar su actividad metabólica con las fluctuaciones diurnas del microbioma, el anfitrión puede optimizar la absorción y el procesamiento de compuestos esenciales derivados de la microbiota, como nutrientes y vitaminas. Por otro lado, la actividad metabólica e inmunitaria coordinada del metaorganismo puede ser ideal para hacer frente a las fluctuaciones impuestas al ecosistema por la introducción de nutrientes, xenobióticos nocivos y patógenos. Además, los cambios a escala horaria en las condiciones de colonización a lo largo de la mucosa colónica crean un nicho dinámico para los comensales y podrían apoyar la estabilidad de la comunidad a largo plazo mediante oscilaciones a corto plazo alrededor de un estado de colonización estable. Por ello, la actividad concertada del metaorganismo identificada en este estudio puede proporcionar un ejemplo de construcción activa de nichos por parte de la microbiota, que se produce periódicamente en el curso de 24 horas.

Además, , este estudio da apoyo a la noción de que el programa circadiano de oscilaciones del transcriptoma en los relojes periféricos no es independiente de las señales ambientales y proporciona una nueva perspectiva sobre la integración de estas señales. Estudios anteriores han indicado que tanto el momento de la ingesta de alimentos como el tipo de dieta determinan la programación circadiana del transcriptoma periférico. Ahora se ha descubierto que la microbiota desempeña un papel igualmente importante en la orquestación de las oscilaciones del transcriptoma, al inducir y suprimir el ciclo de los transcritos, tanto de manera conjunta como independiente de las horas de alimentación (Figura 38A). Además, se ha demostrado que la alimentación programada restaura las oscilaciones del transcriptoma en ratones que carecen de un reloj molecular funcional. Se ha determinado que la microbiota contribuye a este efecto, y que esta recuperación de oscilaciones dependiente de la alimentación depende, al menos en parte, de las oscilaciones del microbioma. Por lo tanto, el presente descubrimiento de la programación microbiana de las oscilaciones del transcrito del anfitrión puede potencialmente vincular muchos de los casos descritos hasta ahora de reprogramación del transcriptoma periférico por los alimentos, proporcionando una imagen integrada por la cual el impacto dietético sobre la actividad diurna del metaorganismo puede ejercerse indirectamente mediante la modulación de la composición y la función de la microbiota. Cabe destacar que se encontró que solo un pequeño número de transcritos del anfitrión oscila independientemente de la influencia dietética y microbiana (Figura 5A), la mayoría de los cuales pertenecen a los miembros centrales del reloj circadiano. Así, los presentes hallazgos sugieren un modelo por el cual el reloj molecular experimenta una ritmicidad autosostenida, mientras que la inducción de ritmicidad aguas abajo en grandes porciones del transcriptoma puede depender de la integración adecuada de señales ambientales (Figura 41H).

Por último, el presente estudio proporciona una nueva comprensión de los efectos multifacéticos del uso de antibióticos en la fisiología de los mamíferos. La alteración frecuente del microbioma por exposición masiva a antibióticos se ha convertido en un rasgo distintivo tanto de la práctica médica humana moderna como de la preparación industrializada de alimentos. Además del efecto nocivo directo bien explicado sobre la diversidad de microbiomas y la susceptibilidad a infecciones patógenas, dicha exposición también se asocia con diversos trastornos metabólicos adversos (Ayres y otros, 2012; Cox y otros, 2014; Ng y otros, 2013; Zeissig y Blumberg, 2014); sin embargo, estos efectos antibióticos sistémicos indirectos siguen siendo poco conocidos. Se encuentra que la alteración mediada por antibióticos de múltiples niveles de ritmicidad diurna de la microbiota se asocia con la anulación de la secuencia temporal normal de la actividad metabólica del anfitrión tanto colónica como hepática en el curso de un día, generando una desincronización temporal en comparación con el perfil de actividad diaria homeostática. Este hallazgo implica que los efectos de los antibióticos sobre la fisiología del anfitrión superan con creces los que se ejercen directamente sobre el microbioma (como la aparición de infecciones oportunistas y resistentes a los fármacos), así como los efectos adversos directos mediados por antibióticos. Más bien, la disbiosis inducida por antibióticos desacopla la ritmicidad coordinada microbiana y del anfitrión, lo que da lugar a una pérdida y una ganancia masiva de la actividad transcripcional del anfitrión. Esta desalineación de la actividad de las vías, que se observa tanto en el intestino como en el hígado, puede dar lugar a funciones alteradas que van desde la desintoxicación hepática alterada o inoportuna, el catabolismo y la función sintética, hasta la inmunidad alterada, lo que podría llevar a consecuencias a largo plazo, como la asociación entre un tratamiento con antibióticos en la infancia y la susceptibilidad a la obesidad (Cox y otros, 2014).

Referencias

Arpaia, N., Campbell, C., Fan, X., Dikiy, S., van der Veeken, J., deRoos, P., Liu, H., Cross, J.R., Pfeffer, K., Coffer, P.J., y otros (2013). Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature 504, 451-455.

Asher, G., y Sassone-Corsi, P. (2015). Time for Food: The Intimate Interplay between Nutrition, Metabolism, and the Circadian Clock. Cell 161, 84-92.

Ayres, J.S., Trinidad, N.J., y Vance, R.E. (2012). Lethal inflammasome activation by a multidrug-resistant pathobiont upon antibiotic disruption of the microbiota. Nature medicine 18, 799-806.

Bass, J. (2012). Circadian topology of metabolism. Nature 491, 348-356.

Cox, L.M., Yamanishi, S., Sohn, J., Alekseyenko, A.V., Leung, J.M., Cho, I., Kim, S.G., Li, H., Gao, Z., Mahana, D., y otros (2014). Altering the intestinal microbiota during a critical developmental window has lasting metabolic consequences. Cell 158, 705-721.

Damiola, F., Le Minh, N., Preitner, N., Kornmann, B., Fleury-Olela, F., y Schibler, U. (2000). Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes & development 14, 2950-2961.

De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Goncalves, D., Vinera, J., Zitoun, C., Duchampt, A., Backhed, F., y Mithieux, G. (2014). Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell 156, 84-96. Dibner, C., Schibler, U., y Albrecht, U. (2010). The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annual review of physiology 72, 517-549.

Eckel-Mahan, K.L., Patel, V.R., de Mateo, S., Orozco-Solis, R., Ceglia, N.J., Sahar, S., Dilag-Penilla, S.A., Dyar, K.A., Baldi, P., y Sassone-Corsi, P. (2013). Reprogramming of the circadian clock by nutritional challenge. Cell 155, 1464­ 1478.

Eckel-Mahan, K.L., Patel, V.R., Mohney, R.P., Vignola, K.S., Baldi, P., y Sassone-Corsi, P. (2012). Coordination of the transcriptome and metabolome by the circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 5541-5546.

Fung, T.C., Artis, D., y Sonnenberg, G.F. (2014). Anatomical localization of commensal bacteria in immune cell homeostasis and disease. Immunological reviews 260, 35-49.

Henao-Mejia, J., Elinav, E., Jin, C., Hao, L., Mehal, W.Z., Strowig, T., Thaiss, C.A., Kau, A.L., Eisenbarth, S.C., Jurczak, M.J., y otros (2012). Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity. Nature 482, 179­ 185.

Hsiao, E.Y., McBride, S.W., Hsien, S., Sharon, G., Hyde, E.R., McCue, T., Codelli, J.A., Chow, J., Reisman, S.E., Petrosino, J.F., y otros (2013). Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 155, 1451-1463.

Huang da, W., Sherman, B.T., y Lempicki, R.A. (2009). Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature protocols 4, 44-57.

Hughes, M.E., Hogenesch, J.B., y Kornacker, K. (2010). JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of biological rhythms 25, 372-380.

Lavin, Y., Winter, D., Blecher-Gonen, R., David, E., Keren-Shaul, H., Merad, M., Jung, S., y Amit, I. (2014). Tissueresident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell 159, 1312-1326. López, C.A., Kingsbury, D.D., Velazquez, E.M., y Baumler, A.J. (2014). Collateral damage: microbiota-derived metabolites and immune function in the antibiotic era. Cell host & microbe 16, 156-163.

Minami, Y., Kasukawa, T., Kakazu, Y., ligo, M., Sugimoto, M., Ikeda, S., Yasui, A., van der Horst, G.T., Soga, T., y Ueda, H.R. (2009). Measurement of internal body time by blood metabolomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 9890-9895.

Mukherji, A., Kobiita, A., Ye, T., y Chambon, P. (2013). Homeostasis in intestinal epithelium is orchestrated by the circadian clock and microbiota cues transduced by TLRs. Cell 153, 812-827.

Ng, K.M., Ferreyra, J.A., Higginbottom, S.K., Lynch, J.B., Kashyap, P.C., Gopinath, S., Naidu, N., Choudhury, B., Weimer, B.C., Monack, D.M., y otros (2013). Microbiota-liberated host sugars facilitate post-antibiotic expansion of enteric pathogens. Nature 502, 96-99.

Qin, N., Yang, F., Li, A., Prifti, E., Chen, Y., Shao, L., Guo, J., Le Chatelier, E., Yao, J., Wu, L., y otros (2014). Alterations of the human gut microbiome in liver cirrhosis. Nature 513, 59-64.

Robertson, B.R., O'Rourke, J.L., Neilan, B.A., Vandamme, P., On, S.L., Fox, J.G., y Lee, A. (2005). Mucispirillum schaedleri gen. nov., sp. nov., a spiral-shaped bacterium colonizing the mucus layer of the gastrointestinal tract of laboratory rodents. International journal of systematic and evolutionary microbiology 55, 1199-1204.

Shapiro, H., Thaiss, C.A., Levy, M., y Elinav, E. (2014). The cross talk between microbiota and the immune system: metabolites take center stage. Current opinion in immunology 30, 54-62.

Sharon, G., Garg, N., Debelius, J., Knight, R., Dorrestein, P.C., y Mazmanian, S.K. (2014). Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Cell metabolism 20, 719-730.

Smith, P.M., Howitt, M.R., Panikov, N., Michaud, M., Gallini, C.A., Bohlooly, Y.M., Glickman, J.N., y Garrett, W.S. (2013). The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis. Science 341, 569­ 573.

Thaiss, C.A., y Elinav, E. (2014). Exploring new horizons in microbiome research. Cell host & microbe 15, 662-667. Thaiss, C.A., Levy, M., Suez, J., y Elinav, E. (2014a). The interplay between the innate immune system and the microbiota. Current opinion in immunology 26, 41-48.

Thaiss, C.A., Zeevi, D., Levy, M., Zilberman-Schapira, G., Suez, J., Tengeler, A.C., Abramson, L., Katz, M.N., Korem, T., Zmora, N., y otros (2014b). Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis. Cell 159, 514-529.

Voigt, R.M., Forsyth, C.B., Green, S.J., Mutlu, E., Engen, P., Vitaterna, M.H., Turek, F.W., y Keshavarzian, A. (2014). Circadian disorganization alters intestinal microbiota. PloS one 9, e97500.

Vollmers, C., Gill, S., DiTacchio, L., Pulivarthy, S.R., Le, H.D., y Panda, S. (2009). Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 21453-21458.

Zarrinpar, A., Chaix, A., Yooseph, S., y Panda, S. (2014). Diet and feeding pattern affect the diurnal dynamics of the gut microbiome. Cell metabolism 20, 1006-1017.

Zeissig, S., y Blumberg, R.S. (2014). Life at the beginning: perturbation of the microbiota by antibiotics in early life and its role in health and disease. Nature immunology 15, 307-310.

Ejemplo 4

Efecto del momento de la ingesta de alimentos sobre el microbioma

Materiales y procedimientos

Dieciséis participantes con respuesta glucémica alterada y sanos formaron parte de un experimento de tres semanas de intervención dietética. La primera semana fue una semana de elaboración de perfiles, a partir de la cual se calcularon dos dietas de prueba personalizadas: (1) una semana completa de una dieta personalizada que se predijo que tendría respuestas de glucosa en sangre postprandial “buenas” (bajas); y (2) una semana completa de una dieta personalizada que se predijo que tendría respuestas de glucosa en sangre postprandial “malas” (altas). Los presentes inventores evaluaron si efectivamente la dieta personalizada de la semana "buena" provocaba respuestas de glucosa en sangre más bajas que la dieta personalizada que se daba en la semana “mala”.

Antes del experimento, un dietista planificó una dieta personalizada durante 6 días de la siguiente manera: cada participante decidió cuántas comidas y calorías ingiere al día. Todas las comidas en los 6 días fueron diferentes y en todos los días se consumió el mismo número de comidas y calorías con un intervalo de al menos 3 horas entre comidas. El contenido de las comidas fue decidido por el participante para que coincida con su gusto y dieta habitual.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de determinación de la tolerancia a una sustancia no calórica en un sujeto sano, que comprende: (a) determinar un distintivo de un microbioma intestinal en una muestra del sujeto sano que ha sido sometido a la sustancia no calórica;

(b) comparar dicho distintivo de dicho microbioma intestinal del sujeto sano con al menos un distintivo de referencia de un microbioma intestinal patológico, en donde, cuando dicho distintivo del microbioma intestinal del sujeto sano es similar de manera estadísticamente significativa a dicho distintivo de referencia de dicho microbioma intestinal patológico, es indicativo de que el sujeto sano es intolerante a la sustancia no calórica; y

(c) proporcionar una recomendación sobre la cantidad de dicha sustancia no calórica que puede ser tolerada por el sujeto sano.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 que, además, comprende la comparación de dicho distintivo de dicho microbioma intestinal del sujeto sano con al menos un distintivo de referencia no patológico, en donde, cuando dicho distintivo de dicho microbioma intestinal del sujeto sano es diferente de manera estadísticamente significativa de dicho al menos un distintivo de referencia no patológico es indicativo de que el sujeto sano es intolerante a la sustancia no calórica.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en donde dicho microbioma intestinal patológico deriva de un sujeto sano que es intolerante a la sustancia no calórica.

4. El procedimiento de la reivindicación 3 en donde dicho microbioma intestinal no patológico deriva de un sujeto sano que es tolerante a la sustancia no calórica.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en donde el sujeto sano ha sido sometido a la sustancia no calórica al menos un mes antes de dicha determinación.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 en donde el sujeto sano ha sido sometido a la sustancia no calórica al menos una vez al día.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 en donde el sujeto sano ha sido sometido a la sustancia no calórica durante al menos una semana.