CN106460048B - 针对试剂的微生物组应答 - Google Patents

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Abstract

公开了测定健康个体对试剂的耐受的方法。所述方法包括：（a）测定所述健康个体的样品中的微生物组的标记，所述健康个体已经受所述试剂或条件；以及（b）比较所述健康个体的所述微生物组的所述标记与致病性微生物组的至少一种参考标记，其中当所述健康个体的所述微生物组的所述标记在统计上显著类似于所述致病性微生物组的所述参考标记时，表明所述健康个体对所述试剂不耐受。

Description

针对试剂的微生物组应答
发明领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及微生物组，并且更具体地但非专一地，涉及用于通过分析微生物组预测个体对一种或多种试剂的应答的方法和仪器。
人在肠道中携带广泛和多样化的微生物生态系统，其已与我们的物种一起共进化且是人类健康必需的。哺乳动物具有位于肠道中的数百万种微生物基因的‘扩展基因组’：微生物组。这种多基因组共生在宿主中以蛋白质组学和代谢水平表达，并且因此已提出人代表非常复杂的生物学‘超生物’，其中关于宿主代谢调节的部分责任被移交给了微生物共生。肠微生物组的现代解释是基于由高通量基因组筛选技术提供的肠道的非培养的分子观点。肠微生物组还直接牵涉许多各种各样的病理状态如肥胖、循环系统疾病、炎症性肠病（IBD）和孤独症的的发病机制。肠微生物丛也影响药物代谢和毒性、饮食热量的生物利用度、免疫系统的调节和应答、以及手术后恢复。这意味着肠微生物组及其活性的定量分析是产生未来个人化健康护理策略必需的，并且肠微生物组代表了适于开发下一代治疗药物靶的沃土。还意味着可以出于宿主生物的利益而直接调节肠微生物组。
肠微生物丛因此扮演大量重要角色，其限定宿主的生理学，例如免疫系统成熟、对上皮细胞损伤的肠道应答、以及异物和能量代谢。在大多数哺乳动物中，肠微生物组以执行这些任务的四个细菌门为主：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。种系型组成在个体中可以是特异性和稳定的，并且在2年间隔中，个体保留超过60%的肠微生物组种系型。这意味着每个宿主与其肠微生物丛具有独特的生物关系，并且从定义上这影响着个体的患病风险。
背景技术包括Payne等人，obesity reviews（2012）13，799–809；和Cowen等人TheFASEB Journal. 2013；27:224。
另外的背景技术包括美国专利申请号20100172874。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了测定健康个体中对试剂的耐受的方法，其包括：
（a）测定健康个体的样品中的微生物组的标记，所述健康个体已经受试剂或条件；和
（b）比较健康个体的微生物组的标记与致病性微生物组的至少一种参考标记，其中当健康个体的微生物组的标记在统计上显著类似于致病性微生物组的参考标记时，表明所述健康个体对所述试剂不耐受。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了测定试剂对健康个体的微生物组的影响的方法，其包括：
（a）使微生物组暴露于试剂；
（b）比较暴露后的微生物组的标记与致病性微生物组的参考标记，其中当微生物组的标记在统计上显著类似于致病性微生物组的参考标记时，说明所述试剂对所述微生物组具有不利影响。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了测定健康个体中对人造甜味剂的耐受的方法，其包括分析个体的微生物组中属于选自下述目的微生物的量：拟杆菌目（Bacteroidales）、梭菌目（Clostridilales）、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和/或弯曲菌目（Campylobacterales），其中拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物的量超过预定水平表明所述个体对所述人造甜味剂耐受，而RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目和/或弯曲菌目的微生物的量超过预定水平表明所述个体对所述人造甜味剂不耐受。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了测定健康个体中对人造甜味剂的耐受的方法，其包括分析个体的微生物组中如表4中所示的至少一种微生物或微生物类别的量，其中所述至少一种微生物或微生物类别的量超过预定水平表明所述个体对所述人造甜味剂不耐受。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了恢复个体对试剂的耐受的方法，其包括给个体施用有效量的益生菌组合物，所述益生菌组合物包含与非致病性微生物组在统计上显著类似的微生物，从而恢复所述个体对所述试剂的耐受。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了益生菌组合物，其中所述组合物的微生物中的大多数是拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物，所述组合物配制用于直肠或口服施用。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了恢复个体对人造甜味剂的耐受的方法，其包括给个体施用有效量的权利要求42的益生菌组合物，从而恢复所述个体对所述人造甜味剂的耐受。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了恢复个体对人造甜味剂的耐受的方法，其包括给个体施用有效量的抗生素，所述抗生素减少RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目和/或弯曲菌目的微生物的相对丰度，从而恢复所述个体对所述人造甜味剂的耐受。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了恢复个体对人造甜味剂的耐受的方法，其包括给个体施用有效量的抗生素，所述抗生素减少如表4中所示的至少一种微生物的相对量，从而恢复所述个体对所述人造甜味剂的耐受。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了向有此需要的个体提供抗生素或益生菌治疗的方法，其包括：
（a）分析个体的微生物组的昼夜节律；
（b）对个体提供抗生素或益生菌治疗，其中基于所述个体的微生物组的昼夜节律选择所述抗生素或益生菌治疗的施用剂量或时间。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了用于测定个体对试剂是否耐受的试剂盒，其包括：
（i）能够测定至少一种微生物组组分的量的试剂，其中所述至少一种微生物组组分的水平在试剂耐受的微生物组中和在试剂不耐受的微生物组中显著不同；和
（ii）致病性微生物组。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，该方法还包括比较暴露后的微生物组的标记与非致病性微生物组参考标记，其中当微生物组的标记在统计上显著不同于所述非致病性微生物组参考标记时，表明所述试剂对所述微生物组具有不利影响。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述暴露在体内实现。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述暴露在体外实现。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，该方法还包括比较健康个体的微生物组的标记与至少一种非致病性参考标记，其中当健康个体的微生物组的标记在统计上显著不同于所述至少一种非致病性参考标记时，表明所述健康个体对所述试剂不耐受。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述试剂是物质。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述试剂是条件。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述物质是食物添加剂。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述食物添加剂是防腐剂。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述物质是人造甜味剂。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述条件是睡眠模式中的变化。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述条件是暴露于光。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述条件是暴露于烟草烟雾或辐射。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述物质是治疗剂。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述致病性微生物组来源于患有疾病的个体。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述疾病是糖尿病或糖尿病前期。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述致病性微生物组来源于对试剂不耐受的健康个体。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述非致病性微生物组来源于对试剂耐受的健康个体。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述人造甜味剂包含选自糖精、甜菊醇和阿斯巴甜的组分。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述微生物组的标记是微生物组的微生物的存在或水平。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述微生物组的标记是微生物组的微生物基因的存在或水平。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述微生物组的标记是由微生物组的微生物生成的产物。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述产物选自mRNA、多肽、碳水化合物和代谢产物。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述产物包含短链脂肪酸（SCFA）。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，该方法还包括在分析前使个体经受试剂。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，关于致病性微生物组的参考标记的数据存在于第一数据库中，而关于健康个体的微生物组的标记的数据存在于第二数据库中。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述第一数据库包含关于致病性微生物组的多种参考标记的数据。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，微生物组选自肠微生物组、口腔微生物组、支气管微生物组、皮肤微生物组和阴道微生物组。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，该方法还包括在测定前处理样品。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述处理包括生成核酸样品。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，该方法还包括在分析前给个体施用人造甜味剂。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述试剂包括物质。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述试剂包括条件。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述条件包括昼夜节律失调。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述致病性微生物组是经处理的。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述致病性微生物组是未经处理的。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述试剂盒还包括非致病性微生物组。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述至少一种微生物组组分是微生物组的微生物的至少一种基因。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述至少一种微生物组组分是微生物组的至少一种微生物。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，所述试剂盒还包括：
（ii）能够测定第二微生物组组分的量的第二试剂，其中所述第二微生物组组分的水平在试剂耐受的微生物组中和在试剂不耐受的微生物组中显著不同。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了向有此需要的个体提供抗生素或益生菌治疗的方法，其包括：
（a）分析个体的微生物组的昼夜节律；
（b）对个体提供抗生素或益生菌治疗，其中基于所述个体的微生物组的昼夜节律选择所述抗生素或益生菌治疗的施用剂量或时间。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，步骤（a）通过分析所述微生物组的微生物标记来实现。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，步骤（a）通过分析所述微生物组的代谢产物来实现。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，其中在抗生素靶向的细菌处于昼夜节律的谷处时提供抗生素。
根据所述优选实施方案中的另外的特征，在益生菌的细菌处于昼夜节律的峰处时提供益生菌。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了示例性方法和/或材料，但与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试中。在冲突的情况下，以专利说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实例仅是举例说明性的，并且不预期一定是限制性的。
本发明的实施方案的方法和/或仪器的实现可以涉及人工、自动或其组合执行或完成所选任务。此外，根据本发明的方法和/或仪器的实施方案的实际使用仪器和装备，几个所选任务可以使用操作系统通过硬件、软件或固件或其组合来实现。
例如，根据本发明的实施方案用于执行所选任务的硬件可以作为芯片或线路实现。作为软件，根据本发明的实施方案的所选任务可以使用任何合适的操作系统作为通过计算机执行的多个软件指令实现。在本发明的一个示例性实施方案中，根据如本文描述的方法和/或仪器的示例性实施方案的一个或多个任务通过数据处理器，例如用于执行多个指令的计算平台来执行。任选地，数据处理器包括用于贮存指令和/或数据的易失性存储器和/或用于存储指令和/或数据的非易失性存储器，例如磁性硬盘和/或可移动媒体。任选地，同样提供了网络连接。同样任选提供了显示器和/或用户输入装置例如键盘或鼠标。
附图的几个视图的简述
本发明的一些实施方案在本文中参考附图仅作为实例进行描述。现在具体参考详细附图，要强调的是所示的细节作为实例且用于本发明的实施方案的举例说明性讨论的目的。在这点上，与附图结合的描述使得本发明的实施方案可以如何进行实践对于本领域技术人员显而易见。
在附图中：
图1A-K肠道微生物丛产生日间振荡。
（A）示意图显示了经过两个光暗周期的过程，微生物丛的取样时间。
（B）显示了日间振荡的OTU。显示了具有p<1的OTU，并且指出了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个授时因子时间（Zeitgeber time）（ZT）的10只小鼠个体。
（C）经过48小时的过程，粪便微生物丛的分类组成。
（D）具有p < 0.05，JTK_周期的细菌属振荡的直方图表示。
（E、F）微生物丛成员的丰度中的日间振荡的代表性实例；n = 在每个ZT时的10只小鼠。
（G、H）显示了针对对每个基因映射的读数数目标准化的，在鞭毛基因（G）和糖胺聚糖（GAG）降解基因相对于其他基因的基因出现的标准偏差分布。
（I）显示出日间振荡的KEGG途径。仅显示了具有基因覆盖>0.2和p<1的途径。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个ZT时的2只小鼠个体。
（J）功能性KEGG途径的丰度中的反相日间振荡的代表性实例；n = 在每个ZT时的2只小鼠个体。
（K）如通过JTK_周期鉴定的，16个最显著振荡的KEGG途径的直方图表示。
所示结果代表四次实验（1A-F）或两次实验（1G-K）。
图2A-H。与图1A-K有关的组合物和功能中的日间微生物丛振荡。
（A）示意图显示了经过四个光暗周期的过程，每四个小时的微生物丛的取样时间。
（B）显示了日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n= 在每个授时因子时间（ZT）的8只小鼠个体。
（C-D）微生物丛成员的丰度中的日间振荡的代表性实例；n = 在每个ZT时的8只小鼠。
（E-G）功能性KEGG途径的丰度中的日间振荡的代表性实例；n = 在每个ZT时的2只小鼠个体。
（H）涉及鞭毛组装、细菌趋化性（chemotyxis）和III型分泌中的基因的途径描述。颜色指出在不同ZT时的基因的差异丰度。
图3A-H Per1/2缺陷小鼠中的日间微生物丛节律的丧失。
（A）显示了野生型和Per1/2缺陷小鼠中的日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个授时因子时间（ZT）在每个组中的10只小鼠个体。
（B）在Per1/2缺陷小鼠中不存在的，在野生型小鼠中的日间振荡的代表性实例；n= 在每个ZT时的10只小鼠个体。
（C）与Per1/2缺陷小鼠相比较，在野生型小鼠中具有p<0.05，JTK_周期的细菌属振荡的直方图表示；n = 在每个ZT时的10只小鼠。
（D）在来自Per1/2缺陷小鼠的微生物丛中不存在的，来自野生型小鼠的微生物丛中的KEGG途径的日间波动的直方图表示；宏基因组学分析在每个ZT时的总共三只小鼠中执行，并且仅比较具有覆盖>0.2的途径。
（E）显示了与Per1/2缺陷小鼠相比较，在野生型中的日间振荡的KEGG途径。仅显示了具有基因覆盖>0.2和p<1的途径。虚线指出p<0.05，JTK_周期。
（F-H）在野生型和Per1/2缺陷小鼠中属于所示功能途径的基因中的日间变异。宏基因组学分析在每个ZT时的总共三只小鼠中执行。
所示结果代表两次实验。
图4A-L与图3A-H有关的在Per1/2缺陷小鼠中的生态失调。
（A-C）在野生型和Per1/2缺陷小鼠中属于所示功能途径的基因中的日间变异。宏基因组学分析在每个ZT时的总共三只小鼠中执行。
（D，E）来自野生型和Per1/2缺陷小鼠的粪便微生物丛的α（D）和β（E）多样性。样品/基因型来自每天的不同时间；n = 每个组中各90。
（F）来自野生型和Per1/2缺陷小鼠的粪便微生物丛之间的OTU的差异丰度；n = 90个样品。
（G，H）来自野生型和ASC缺陷小鼠的粪便微生物丛的α（D）和β（E）多样性。
（I）显示了ASC缺陷小鼠中的日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个ZT时的8只小鼠个体。
（J）ASC缺陷小鼠的微生物丛中的日间振荡的代表性实例；n = 在每个ZT时的8只小鼠个体。
（K、L）在野生型（K）和Per1/2缺陷小鼠（L）中的日间饲喂模式。小鼠自由进食且经过三个暗光周期。所示实例代表8只小鼠个体。
图5A-L饲喂节律引导日间微生物丛振荡。
（A）示意图显示了定时饲喂方案。
（B）在不同饲喂时间表上，在野生型小鼠中显示了日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个ZT时的10只小鼠个体。
（C-F）在暗阶段饲喂和光阶段饲喂的野生型小鼠之间的细菌振荡中的阶段偏移的代表性实例；n = 在每个ZT时的10只小鼠。
（G）在不同饲喂时间表上，在Per1/2缺陷小鼠中显示了日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个ZT时的10只小鼠个体。
（H-I）在暗阶段饲喂和光阶段饲喂的Per1/2缺陷小鼠之间的细菌振荡中的阶段偏移的代表性实例；n = 在每个ZT时的10只小鼠。
（J）在不同饲喂时间表上，在野生型和Per1/2缺陷小鼠中具有p<0.05，JTK_周期的振荡OTU的定量。
（K）示意图显示了来自Per1/2缺陷小鼠的微生物丛（无节律微生物丛）粪便移植到无菌接受者（获得节律性）内。
（L）在移植到无菌小鼠内之前和之后，来自Per1/2缺陷小鼠的微生物丛中的日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个ZT时在每个组中的10只小鼠个体。
结果代表两次独立实验。
图6A-H。与图5A-L有关的饲喂节律对日间微生物丛振荡的影响。
（A、B）在暗阶段饲喂（A）和光阶段饲喂（B）的小鼠中的饲喂时间。所示图表代表测量的四只小鼠个体。
（C）在暗阶段和光阶段期间，在暗阶段饲喂或光阶段饲喂的小鼠中的Per2的结肠表达显示了通过饲喂节律的肠道钟的重编程；n = 每个组中的10只小鼠。** p < 0.01，***p < 0.001。
（D、E）在仅暗阶段或光阶段期间，在野生小鼠（D）和Per1/2缺陷小鼠（E）中，具有p<0.05，JTK_周期的细菌属振荡的直方图表示；n = 在每个ZT时的10只小鼠。突出显示了在循环OTU中的阶段偏移。
（F-H）在用来自Per1/2缺陷小鼠（F，G）或野生型小鼠（H）的微生物丛移植的无菌小鼠中，经过三个暗光周期过程的身体活动（F、H）和VCO2。移植后一周获得测量。图表代表测量的八只小鼠个体。
图7A-H。时差导致日间微生物丛振荡和生态失调的丧失。
（A）示意图显示了通过8小时的恒定时移的时差诱导。每三天，使小鼠经历8小时的向前或向后时移。对照保持在恒定光暗周期条件下。
（B）在暗阶段、光阶段和组合期间对照和时差小鼠的食物摄入。** p<0.01，n.s.不显著。
（C）与时差小鼠相比较，在对照小鼠中具有p<0.05，JTK_周期的细菌属振荡的热图表示；n=在每个时间点时的5只小鼠。
（D）在对照和时差小鼠中显示了日间振荡的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n=在每个时间点时的5只小鼠个体。
（E）在时差下丧失的野生型小鼠中的细菌振荡的代表性实例；n=在每个时间点时的5只小鼠。
（F）在四周时移后，在对照和时差小鼠中的肠微生物群落的β多样性。样品由一天中的不同时间合并。
（G）在四个月时移后，在对照和时差小鼠中的肠微生物群落的β多样性。
（H）通过时差诱导的微生物组成中的变化的热图表示。
图8A-F与图7A-H有关的在时差期间的昼夜节律失调。
（A、B）在对照和时差小鼠中经过三个暗光周期过程的身体活动。对照小鼠（A）的节律性活动通过时差（B）的诱导转变成随机模式。所示结果代表测量的16只小鼠个体。
（C）经过暗光周期的过程，在对照和时差小鼠的食物摄入中的日间变异。所示结果代表测量的16只小鼠个体。
（D-F）在结肠中的Bmal（D）、Rev-erbα（E）和RORγt（F）的节律性表达模式在时差诱导后改变；n = 在每个ZT时的4-5只小鼠。
图9A-K。时差诱导的生态失调促进代谢紊乱。
（A-E）小鼠经历时移诱导的时差且饲喂高脂肪饮食。一半小鼠用抗生素进行处理；n = 每个组中的10只小鼠。
（A）经过高脂肪饲喂9周的重量增长。** p<0.01，*** p<0.001。
（B）在时差诱导后8周进行口服葡萄糖耐受测试。* p<0.05，** p<0.01。
（C）在时差8周后，连同或不连同Abx处理，对照和时差小鼠的空腹葡萄糖水平。* p<0.05。
（D、E）在时差8周后，连同或不连同Abx处理，对照和时差小鼠的脂肪（D）和瘦（E）体重。** p<0.01。
（F）在时差组中在4个月时移后，对照和时差小鼠的重量和脂肪含量。* p<0.05。
（G-I）来自对照或时差小鼠的微生物丛移植到无菌（GF）小鼠内；n = 每个组中的4-6只小鼠。
（G）经过4周的重量增长。* p<0.05。
（H）在粪便转移后第3天时进行口服葡萄糖耐受测试。* p<0.05。
（I）在粪便转移后一个月，接受者小鼠的脂肪和瘦体重。** p<0.01。
（J）在8周时差后，对照和时差小鼠的T2加权MR图像。上，冠状图像；下，轴向图像。
（K）在粪便转移后一个月，接受者小鼠的T2加权MR图像。上，冠状图像；下，轴向图像。
所示结果代表三次（9A-E）和两次（9G-I）独立实验。
图10A-L。与图9A-K有关的高脂肪饮食和抗生素处理对日间行为和微生物丛振荡的影响。
（A-D）在饲喂高脂肪饮食的对照（A、B）和时差小鼠（C、D）中，经过2.5个暗光周期过程的身体活动。（B）和（D）另外用抗生素进行处理。所示结果代表测量的32只小鼠个体。
（E、F）经过暗光周期的过程，在对照和时差小鼠的食物摄入中的日间变异。所有小鼠均饲喂高脂肪饮食。在（F）中，小鼠用抗生素进行处理。
（G）在依靠高脂肪饮食一周后，在野生型小鼠中显示了日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个授时因子时间（ZT）的10只个别小鼠。
（H、I）在依靠高脂肪饮食的小鼠中的微生物丛成员丰度中的日间振荡的代表性实例；n = 在每个ZT时的10只小鼠。
（J）在抗生素处理一周后，在野生型小鼠中显示了日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期；n = 在每个授时因子时间（ZT）的10只小鼠个体。
（K，L）在依靠抗生素的小鼠中的微生物丛成员丰度中的日间振荡的代表性实例；n= 在每个ZT时的10只小鼠。
图11A-I。人微生物丛经历组成和功能的日间振荡。
（A）示意图显示了经过多个光暗周期的过程，来自两个个体的人微生物丛的取样时间。
（B、C）显示了两名人类个体中的日间振荡的OTU。仅显示了具有p<1的OTU。虚线指出p<0.05，JTK_周期。
（D）来自具有p<0.05，JTK_周期的一名人类个体振荡的细菌属的直方图表示。
（E）经过连续五天的日间细菌振荡的代表性实例。
（F）显示出日间振荡的KEGG途径。仅显示了具有基因覆盖>0.2和p<1的途径。虚线指出p<0.05，JTK_周期。
（G、H）在来自人微生物丛的KEGG途径中的反相丰度峰的实例。合并来自连续五天的ZT数据。
（I）KEGG途径中的振荡的直方图表示。
图12A-D。与图11A-I有关的人微生物丛的组成和功能的日间振荡。
（A、B）经过连续五天的过程，来自一名人类个体的共生微生物丛成员的相对丰度中的日间波动的代表性实例。
（C）经过五天过程，人粪便微生物丛的分类组成的振荡。
（D）经过连续五天的过程，来自人微生物丛的功能途径中的日间波动的代表性实例。
图13A-F。人类的时差与驱动代谢紊乱的生态失调相关。
（A）示意图显示了在通过8-10小时时移诱导的时差之前、期间和之后，来自个体的微生物丛取样的时间。
（B）对应于（A）中所示的取样时间，来自两名人类个体的微生物丛的门水平组成。
（C）示意图在时差进入无菌小鼠内之前、期间和之后，来自人类个体的粪便移植。
（D）经过三周的接受者小鼠的重量增长；n = 每个组中的5只小鼠。** p<0.01。
（E）在粪便转移后第3天时进行接受者小鼠的口服葡萄糖耐受测试；n = 每个组中的5只小鼠。* p<0.05。
（F）在粪便转移后三周进行接受者小鼠的T2加权MR图像。上，冠状图像；下，轴向图像。
所示结果代表2次独立实验（C-F）。
图14A-B。示意图与图13A-F有关的微生物丛组成和功能的日间振荡。
（A）示意图显示了在24小时光暗周期期间的某些时间具有优先丰度的“标志”分类单位和功能途径。
（B）示意图描述了在夜行野生型小鼠中的日间微生物丛途径活性，生物钟破坏的小鼠中的振荡丧失和人中的相逆转波动。
图15A-E。实验方案。10周龄C57Bl/6雄性小鼠用下述饮食方案进行处理：（A）饮用商购可得的无热量人造甜味剂（NAS；糖精、三氯蔗糖和阿斯巴甜）且饲喂正常食物（NC）饮食，（B）饮用作为对照的商购可得的糖精或蔗糖且饲喂高脂肪饮食（HFD），（C）饮用纯糖精或水且饲喂HFD，（D）如III中，但使用远交Swiss-Webster小鼠。葡萄糖耐受测试、微生物组分析和用抗生素补充饮用水在所示时间点执行。（E）粪便移植实验的示意图。
图16A-H。人造甜味剂诱导可转移至GF小鼠的葡萄糖耐受不良。（A-B）在抗生素之前（N=20）和之后，饮用商用NAS共11周的NC饲喂小鼠中的OGTT & AUC：环丙沙星和甲硝唑，（‘抗生素A’， N=10）；或万古霉素（‘抗生素B’， N=5）。（C）饲喂HFD和商用糖精（N=10）或葡萄糖（N=9）的小鼠中的OGTT。（D）饮用0.1 mgml-1糖精或水共5周（N=20），随后为‘抗生素A’（N=10）的HFD饲喂小鼠的OGTT。（E-F）在来自（E）商用糖精（N=12）和葡萄糖饲喂小鼠（N=11）的微生物丛移植后6天的GF小鼠的OGTT；或（F）饲喂纯糖精（N=16）和水（N=16）的供体。符号（GTT）或水平线（AUC）-平均值，误差条- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，GTT: ANOVA& Bonferroni，AUC: ANOVA和Tukey事后分析。每一个实验重复两次。（G）来自下述的16srRNA分析：在基线（W0，黑色六角形）和W11（蓝色三角形）时的糖精消耗小鼠；水对照（关于W11 & W0的黑色圆圈）；葡萄糖（关于W11 & W0的黑色方块）；或蔗糖（关于W11 & W0的黑色三角形）。N=每个组中的 5。（H）根据1E中的供体身份在GF接受者中的分类群的PCoA。
图17A-F。人造甜味剂诱导葡萄糖耐受不良。（A）饲喂HFD和商用糖精（N=10）或葡萄糖（N=9）的小鼠的AUC。（B）饮用0.1 mgml-1糖精或水共5周（N=20），随后为‘抗生素A’（N=10）的HFD饲喂小鼠的AUC。（C-D）饮用纯糖精或水的HFD饲喂的远交Swiss-Webster小鼠（N=5）的OGTT & AUC。（E-F）粪便样品从饮用商购可得的纯糖精、葡萄糖或水对照的供体小鼠（N=10）转移到8周龄雄性Swiss-Webster无菌接受者小鼠。来自（E）商用糖精（N=12）和葡萄糖饲喂小鼠（N=11）的微生物丛移植后6天的GF小鼠的AUC；或（F）纯糖精（N=16）和水饲喂（N=16）供体。符号（GTT）或水平线（AUC）- 平均值，误差条- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，ANOVA和Tukey事后分析（AUC）- 平均值，误差条- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，ANOVA和Tukey或不成对两侧斯氏t检验（AUC）。每一个实验重复两次。
图18A-L。食用商用NAS制剂的小鼠的代谢表征。10周龄C57Bl/6小鼠（N=4）给予商购可得的人造甜味剂（糖精、三氯蔗糖和阿斯巴甜）或对照（水、蔗糖或葡萄糖，N=每个组中的4）且饲喂NC饮食。在11周后，使用PhenoMaster代谢笼系统共80小时来表征代谢参数。光和暗阶段分别通过X轴上的白色和黑色三角形指示，并且灰色条用于暗阶段。（A）液体摄入。（B）A的AUC。（C）进食。（D）C的AUC。（E）在72小时期间，来自食物和液体的总热量摄入（关于计算参见方法）。（F）呼吸交换率（RER）。（G）F的AUC。（H）作为距离的身体活动。（I）H的AUC。（J）能量消耗。（K）与在15周期间的原始小鼠重量相比较的质量变化（N=10）。（L）K的AUC。代谢笼表征和重量增长监控重复两次。
图19A-I。食用HFD和纯糖精或水的小鼠的代谢表征。10周龄C57Bl/6小鼠（N=8）饲喂HFD，连同或不连同用0.1mgml-1纯糖精补充饮用水。在5周后，使用PhenoMaster代谢笼系统共70小时来表征代谢参数。光和暗阶段分别通过X轴上的白色和黑色三角形指示，并且灰色条用于暗阶段。（A）液体摄入。（B）A的AUC。（C）进食。（D）C的AUC。（E）呼吸交换率（RER）。（F）F的AUC。（G）作为距离的身体活动。（H）H的AUC。（I）能量消耗。代谢笼表征重复两次。
图20A-C。葡萄糖耐受不良的饮用NAS的小鼠展示正常胰岛素水平和耐受。（A）空腹血浆胰岛素在商用NAS或对照（N=10）11周后进行测量。（B）与A相同，但在HFD和纯糖精或水（N=20）5周后进行测量。（C）胰岛素耐受测试在商用NAS或对照（N=10）12周后执行。所有测量均对两个独立的群组进行。
图21。食用糖精的小鼠和GF接受者中的生态失调。代表在商用糖精和水或热量甜味剂消耗者之间的W11对数标度倍数分类差异的热图（N=每个组中的5）。右列-在来自食用商用糖精（接受者N=15）或食用葡萄糖的小鼠（N=13）的粪便移植后，在GF小鼠中的分类差异。指示了鉴定的OTU数目（GreenGenes）和最低分类水平。
图22A-G。糖精调节的微生物丛的功能表征。（A）通过鸟枪法测序显示的，食用商用糖精、水或葡萄糖共11周的小鼠（N=4）中的物种改变。（B）在所有接受不同处理的小鼠中，在115个KEGG途径中的变化之间的成对关联。（c-d）（C）糖胺聚糖或（D）其他聚糖降解途径基因的相对丰度中的倍数变化。（E）归于商用糖精背景下的五个分类群的更高的聚糖降解。（F-G）在饮用商用糖精或葡萄糖的小鼠（N=5）中，在W11时的粪便乙酸盐和丙酸盐水平。水平线-平均值，误差条- S.E.M. **，通过两侧斯氏t检验p<0.01。SCFA测量对两个独立的群组进行。
图23A-D。糖精调节的微生物丛的功能分析。（A-B）细菌相对丰度中的变化在细菌基因组各处出现。所示的是沿（A）普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）的10,000 bp基因组区域的测序覆盖中的变化。（B）Akkermansia muciniphila，其中框通过糖精处理小鼠的第0周中的丰度排序。（C）在饮用商用糖精、葡萄糖或水的小鼠中，在第11周和第0周之间属于磷酸转移酶系统（PTS）的模块的相对丰度中的倍数变化。模块图解来源：KEGG数据库。（D）与消耗商用糖精的小鼠中的相同途径的相对丰度中的倍数变化（第11周/第0周）相比较，消耗HFD和纯糖精相对于水的小鼠中的富集的KEGG途径（倍数变化> 1.38作为截断值）。
图24A-C。糖精直接调节微生物丛。（a）实验示意图。（b）厌氧培养的微生物丛的相对分类丰度。（c）在用糖精富集或对照粪便培养物移植后6天的无菌小鼠的AUC（分别为N=10& N=9）。水平线-平均值，误差条- S.E.M. **，p<0.01，不成对两侧斯氏t检验。实验重复两次。
图25A-C。糖精直接调节微生物丛。（A）在用糖精富集或对照粪便培养物移植后6天的无菌小鼠的OGTT（分别为N=10 & N=9）。符号- 平均值，误差条- S.E.M. **，p<0.01，***，p<0.001，ANOVA & Bonferroni事后分析。实验重复两次。（B）来自a的无菌小鼠中的分类表示。（c）用由5mgml-1糖精（与PBS相比较，y轴）厌氧培养的微生物组移植的W11食用糖精的小鼠（与W0相比较，x轴）和GF小鼠之间的KEGG途径丰度的比较。
图26A-H。急性糖精消耗通过诱导生态失调损害人体内的升糖控制。（A）高NAS消耗者（N=40）相对于非消耗者（N=236）的HbA1C%。**，秩和p值< 0.002。（B）在4个应答者（R）和3个非应答者（NR）中的OGTT的每日增量曲线下面积（iAUC）。（C-D）在（C）4个应答者或（D）3个非应答者中的第1-4天相对于第5-7天的OGTT。（E）在第1-天期间，来自应答者（N个样品=16）相对于非应答者（N=9）的16S rRNA序列的PCoA。（F）来自应答者和非应答者的第1和7天的分类样品的次序水平相对丰度。（G-H）在（G）应答者1（R1）或（H）非应答者3（NR3）的D1或D7样品的粪便移植后6天，在GF小鼠（N=6）中的OGTT。符号- 平均值，误差条- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，ANOVA & Bonferroni事后分析。
图27A-L。与人中的急性糖精消耗相关的升糖控制受损可转移至GF小鼠。（A）实验方案（N=7）。（b-c）在（B）4个应答者或（C）3个非应答者中的第1-4天相对于第5-7天的iAUC。（D）16S rRNA序列的加权UniFrac距离的主坐标分析证实：在第5-7天期间，在来自应答者（N个样品=12）相对于非应答者（N=8）的微生物丛的主坐标2（PC2）、3（PC3）和4（PC4）上的分离。（E）来自应答者和非应答者的第1-7天的分类样品的次序水平相对丰度。（F）来自在食用糖精7天之前和之后收集的应答者1（R1）样品的粪便移植6天后，在GF小鼠（N=6）中的AUC。（G-H）在接受食用糖精7天之前和之后由应答者4（R4）收集的粪便样品6天后，在GF小鼠（N=5）中的OGTT和AUC。（I）来自在食用糖精7天之前和之后收集的非应答者3（NR3）样品的粪便移植6天后，在GF小鼠（N=5）中的AUC。（J-K）在接受食用糖精7天之前和之后由非应答者2（NR2）收集的粪便样品后6天，在GF小鼠（N=5）中的OGTT和AUC。（L）来自R1的D7相对于D1微生物组的GF接受者中改变的所选OTU的倍数分类丰度变化。点颜色对应于小图10f细菌次序。符号（GTT）或水平线（AUC）- 平均值，误差条- S.E.M. *，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，双因素ANOVA和Bonferroni事后分析（GTT），不成对两侧斯氏t检验（AUC）。
图28A-I。粘附于结肠上皮的微生物丛经历日间波动。
（A）示意图显示了关于微生物丛上皮粘附、代谢组、宏基因组和结肠转录组的取样时间。（B）如通过粘附群落的细菌qPCR测定的，经过两个暗光周期与结肠上皮粘附的细菌数目中的日间波动。（C）SEM图像显示了通过细菌的上皮定植中的日间波动。图像代表10个随机选择的视图/小鼠。（D）经过两个光暗周期的过程，粘膜粘附细菌的β多样性。（E）经过两个光暗周期的过程，粘膜粘附细菌的相对分类组成。（F）最显著振荡的粘膜粘附操作分类单位（OTU）的热图表示，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（G）上皮粘附OTU显示相对丰度中的日间振荡。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（H，I）显示了粘膜粘附群落中的波动相对丰度的细菌物种的实例。
数据代表具有N=45只小鼠的两次独立实验。
图29A-C。与粘膜结合的共生体的数目和组成的日间波动。
（A）经过两天的过程，大肠的腔细菌的总数目。（B，C）显示了经过一天过程，通过细菌的上皮定植中的日间波动的定量（B）和代表性SEM图像（C）。在10个随机选择的图像/小鼠上完成定量。
数据代表具有N=45只小鼠的两次独立实验。
图30A-I。与粘膜结合的共生体的数目和组成的日间波动。
（A、B）如通过得自两个连续暗光阶段的样品的主坐标分析所示，粘膜粘附细菌的β多样性的日间节律性。（C）经过两个光暗周期的过程，与所有其他时间点相比较，初始时间点的UniFrac距离。（D）经过两天的过程，不同粘膜粘附细菌类别的总数目。（E）上皮粘附的OTU显示了总数目中的日间振荡。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（F-I）经过两天的过程，经历总数目中的节律性波动的粘膜粘附的细菌物种的实例。数据代表具有具有N=45只小鼠的两次独立实验。
图31A-K。肠道代谢组经历日间振荡。
（A）显示了日间振荡的代谢产物。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（B、D、F、H）所示化学组的代谢产物显示了粪便物中的日间振荡。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（C、E、G）关于属于不同化学组的肠道代谢产物中的节律性的实例。（I-K）最显著振荡的细菌基因（I）、结肠转录物（J）和肠腔代谢产物（K）的热图表示，其中p<0.05，q<0.2，JTK_周期。数据代表具有N=18-27只小鼠的1-2次独立实验。
图32A-H。微生物丛代谢组的日间节律。
（A、C、E）所示化学组的代谢产物显示了粪便物中的日间振荡。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（B、F、D）关于属于不同化学组的肠道代谢产物中的节律性的实例。（G、H）关于两种微生物基因bioD和bioB（其涉及生物素合成）中的节律性的实例。数据代表在每个组中具有N=18-27个样品的1-2次独立实验。
图33A-L。抗生素处理废除了微生物粘附节律且重新编程肠道转录组振荡。（A）示意图显示了关于抗生素处理的小鼠和对照中的微生物丛上皮粘附和结肠转录组的饲喂模式和取样时间。（B）在抗生素处理的小鼠和对照中，经过两个暗光周期的过程，与结肠上皮粘附的细菌数目中的日间波动。（C）代表性SEM图像显示了在ZT0时在抗生素处理的小鼠和对照中通过细菌的上皮定植。（D）上皮粘附的OTU显示了在抗生素处理的小鼠和对照中，相对丰度中的日间振荡。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（E）经过两个暗光周期的过程，在抗生素处理的小鼠和对照中，罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）的上皮粘附群落中的相对丰度。（F）与对照相比较，抗生素处理的小鼠的共享和独特振荡结肠转录物的维恩图，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（G-I）在抗生素处理的小鼠和对照之间共享的循环结肠转录物（G）、在对照小鼠中独特循环的转录物（H）、以及在抗生素处理的小鼠中独特振荡的转录物（I）的热图表示，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（J-L）在抗生素处理的小鼠和对照之间共享的循环结肠转录物（J）、在对照小鼠中独特循环的转录物（K）、以及在抗生素处理的小鼠中独特振荡的转录物（L）的KEGG分析。数据代表在每个组中具有N=45个样品的两次独立实验。
图34A-E。抗生素处理废除了微生物粘附节律。
（A，B）在抗生素处理的小鼠和对照中，经过一天过程，通过细菌的上皮定植中的日间波动的代表性SEM图像（A）和定量（B）。（C）在抗生素处理后，经过两个光暗周期的过程，粘膜粘附的细菌的相对分类组成。（D）经过一天过程，每6小时在抗生素处理的小鼠中的粘膜粘附群落的主坐标分析。（E）在抗生素处理的小鼠中，经过两个光暗周期的过程，与所有其他时间点相比较，初始时间点的UniFrac距离。数据代表具有N=36只小鼠的两次独立实验。
图35A-I。微生物丛是肠道转录组中的协同振荡所需的。
（A）在抗生素处理的小鼠和对照中显示了日间振荡的结肠转录物。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（B-D）在抗生素处理的小鼠之间具有共享的节律性（B）、在抗生素处理后节律性的丧失（C）和抗生素处理的小鼠中的从头节律性（D）的结肠转录物的代表性实例。
（E）与对照相比较，在抗生素处理的小鼠的结肠中的峰代谢活性的图示。指定每种振荡转录物，并且对于每个ZT通过KEGG分析测定峰相位ZT和峰概况。注意到峰代谢活性在两个组之间不同。（F）在无菌小鼠和对照中显示了日间振荡的结肠转录物。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（G-I）在无菌小鼠和对照之间共享的循环转录物（G）、在对照小鼠中独特循环的转录物（H）、以及在无菌小鼠中独特振荡的转录物（I）的热图表示，p<0.05，JTK_周期。数据代表在每个组中具有N=27-45只小鼠的1-2次独立实验。
图36A-J。饲喂时间控制宏基因组和结肠转录组的振荡。
（A-C）在自由进食（A）、仅在暗阶段期间饲喂（B）或仅在光阶段期间饲喂（C）的小鼠中，经过三个暗光阶段的过程的食物摄入的分布。（D）在光阶段饲喂后显示阶段偏移的细菌基因的实例。（E、F）在饲喂时间逆转后，显示阶段偏移的振荡宏基因组KEGG模块（E）和途径（F）的热图表示。（F）在饲喂时间逆转后，显示阶段偏移的振荡宏基因组KEGG途径的热图表示。（G）在小鼠的光阶段饲喂后，与细菌粘膜降解有关的宏基因组模块中的阶段偏移的实例。（H）在饲喂时间逆转后，显示阶段偏移的涉及细菌运动性的所选KEGG模块和途径的热图表示。（I，J）在暗阶段饲喂相对于光阶段饲喂的小鼠中的振荡转录物的相逆转的实例。数据代表在每个组中具有N=18-27个样品的1-2次独立实验。
图37A-L。饲喂时间控制宏基因组振荡、上皮粘附和宿主转录组。（A）示意图显示了关于微生物丛宏基因组、上皮粘附和结肠转录组的饲喂模式和取样时间。（B）在自由进食相对于光阶段饲喂的小鼠中，显示了日间振荡的微生物基因。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（C）在光阶段饲喂后经历阶段偏移的循环细菌基因的热图表示。（D）在自由进食的小鼠中，在ZT12时在丰度中达到峰值的微生物基因中的振荡的阶段偏移。（E、F）在小鼠的光阶段饲喂后，与细菌粘膜降解相关的宏基因组模块（E）和途径（F）中的阶段偏移的实例。（G）在计划的饲喂时，在小鼠中与结肠上皮粘附的细菌数目中的日间波动。（H）在暗阶段饲喂相对于光阶段饲喂的小鼠中，显示了日间振荡的结肠转录物。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（I）与光阶段饲喂的小鼠相比较，暗阶段饲喂的小鼠的共享和独特的振荡结肠转录物的维恩图，p<0.05和q<0.2，JTK_周期。
（J）在暗阶段饲喂相对于光阶段饲喂的小鼠之间共享的循环转录物的热图表示。注意到两个组中的振荡之间的阶段偏移。
（K、L）在暗阶段饲喂相对于光阶段饲喂的小鼠中的振荡转录物的阶段逆转的实例。数据代表在每个组中具有N=18-27个样品的两次独立实验。
图38A-J。通过饲喂时间和微生物组的肠道转录组振荡的组合重新编程。（A）Chow-Ruskey图解显示了连同和不连同抗生素处理，暗阶段饲喂和光阶段饲喂的小鼠中的结肠振荡的四向重叠。转录物计数为关于p<0.05，JTK_周期的振荡。面积颜色指明重叠程度。边界颜色指明分别的实验组。每个结构域的面积与转录物数目成比例。通过所有四种条件共享的振荡转录物的KEGG指定显示于下文。（B）在抗生素处理后，在饲喂时间逆转后阶段偏移且丧失振荡的振荡基因的热图表示（p<0.05，q<0.2，JTK_周期）。（C-F）Ifngr1和Cldn2作为结肠转录物的实例，所述结肠转录物在暗阶段饲喂和光阶段饲喂的小鼠（C、E）中振荡，但在抗生素处理的组（D、F）中不振荡。（G-J）Cry1和Per2作为结肠转录物的实例，所述结肠转录物在暗阶段饲喂和光阶段饲喂的小鼠中循环，所述两种饲喂均不连同（G、I）和连同抗生素处理（H、J）。注意到暗阶段饲喂和光阶段饲喂的组之间的阶段差异在抗生素处理后更不显著。N=在每个组中的27个样品。
图39A-G。在Per1/2缺陷小鼠中的转录组振荡的诱导通过微生物丛节律性驱动。（A）示意图显示了在抗生素处理的Per1/2缺陷小鼠和对照中关于宏基因组和结肠转录组的饲喂模式和取样。（B）在自由进食和光阶段饲喂的Per1/2缺陷小鼠中，显示了日间振荡的微生物基因。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（C）在光阶段饲喂的Per1/2缺陷小鼠中恢复微生物基因振荡的热图表示。（D）在光阶段饲喂的Per1/2缺陷小鼠中，在暗阶段期间在丰度中达到峰值的微生物基因中的振荡的诱导。（E）与自由进食的对照相比较，在Per1/2缺陷小鼠的光阶段饲喂后，在微生物基因中的节律性获得的实例。（F）在自由进食和光阶段饲喂的Per1/2缺陷小鼠中，显示了日间振荡的微生物KEGG模块。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（G）在Per1/2缺陷小鼠中的结肠转录物的热图表示，所述Per1/2缺陷小鼠在光阶段饲喂后获得节律性，但在抗生素处理的小鼠中则不是。
N=在每个组中的18-27个样品。
图40A-H。通过抗生素处理对肝脏转录钟重新编程。（A）描述了在对照和抗生素处理的小鼠之间的独特和共享的振荡肝脏转录物的维恩图，其中p<0.05和q<0.2，JTK_周期。（B）在抗生素处理的小鼠和对照之间具有共享振荡的肝脏转录物的热图表示。（C、D）在对照小鼠中独特振荡的转录物的热图表示（C）和KEGG途径分析（D）。（E、F）在抗生素处理的小鼠中独特振荡的转录物的热图表示（E）和KEGG途径分析（F）。（G）在抗生素处理和对照小鼠的肝中的峰代谢活性的图示。指定每种振荡转录物，并且对于每个ZT通过KEGG分析测定峰相位ZT和峰概况。N=在每个组中的36个样品。（H）示意图概括了微生物组的节律性活动和粘膜粘附。在微生物组破坏后，宿主转录组被重新编程，包括正常振荡的丧失和振荡的从头发生。
图41A-H。抗生素处理对肝脏转录组振荡的影响。
（A）在抗生素处理的小鼠和对照中，显示出日间振荡的肝脏转录物。描述了波动幅度。虚线指出p<0.05，JTK_周期。（B）在抗生素处理的小鼠和对照之间共享的肝脏循环转录物的KEGG途径分析。（C-F）在抗生素处理的小鼠和对照之间共享的肝脏转录物振荡的实例。（G）对于对照小鼠独特的肝脏转录物振荡的实例。（H）关于测定转录组振荡中的遗传和环境因子的相互作用的提示模型的示意图。构成分子钟的转录因子的网络整合来自饮食和微生物丛的信号，其确定靶基因的节律性活化。这继而确定经历循环振荡的转录组的部分。N=每个组中的45个样品。
图42是举例说明良好周中的平均升糖反应低于糟糕周的条形图。良好（绿色）和糟糕（红色）周中的16名参与者的平均iAUCmed水平。iAUCmed是在膳食消耗前15分钟超过中值葡萄糖水平的增量曲线下面积（AUC）。参与者的iAUCmed水平是所有其早餐、午餐和晚餐iAUCmed的平均值。在x轴中，IG表示葡萄糖受损的参与者，并且H表示健康参与者。圆括号中的符号IG/H后的第一个数目是实验6天的平均唤醒葡萄糖水平，并且圆括号中的第二个数目是在实验开始时的HbA1C。
图43是举例说明对膳食的升糖反应遵循日间模式的图表，其中早餐具有最低应答，随后为午餐，而晚餐具有最高应答。每个点代表与良好周（y轴）相比较，在糟糕周（x轴）中的膳食的平均iAUCmed。大多数点低于x=y线，意指平均起来糟糕周中的AUC与良好周相比较更高。所示的是早餐（红色）、午餐（绿色）和晚餐（蓝色）的iAUCmed水平。实心点对应于葡萄糖受损的参与者，并且空心点对应于健康个体。葡萄糖受损的参与者中的所有早餐的线性拟合的斜率（红线）与午餐（绿线）相比较最高，随后为晚餐（绿线）。虚线对应于健康参与者，并且完整线对应于葡萄糖受损的参与者。
图44A-B是举例说明在通过膳食热量和碳水化合物水平标准化后，膳食后的AUC显示日间模式的图表。图44A显示了通过膳食热量含量标准化的iAUCmed，并且图44B显示了通过膳食碳水化合物含量标准化的iAUCmed。
发明具体实施方案的描述
本发明在其一些实施方案中涉及微生物组，并且更具体地但非专一地，涉及用于通过分析微生物组预测个体对一种或多种试剂的应答的方法和仪器。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用中不一定限制于下述说明书中阐述或通过实施例例示的细节。本发明能够具有其他实施方案或者以各种方式实践或进行。
肠微生物组处于持续变化中，响应于外部刺激例如食物摄入、抗生素摄入和疾病而不断改变其微生物组成。因此，微生物组的系统发育组成在个体间变化。此类差异已与疾病例如结肠癌和炎性肠病、易患肥胖、自闭症谱系障碍的严重程度以及对医学治疗的应答差异相关。
本发明人目前已发现试剂或条件对特定个人的毒性水平可以通过分析其对他的微生物组的影响进行测量。更具体而言，对特定个体有毒的试剂将驱使他的微生物组的组成更类似于致病性微生物组（例如来自患病个体的微生物组），而无毒试剂将不具有这种效应。因此，他的微生物组可以用作衡量外部刺激的毒性的晴雨表。
当实践本发明时，本发明人已证实食用常用的人造甜味剂制剂通过诱导肠道微生物组的组成和功能的改变，推动特定个体中的葡萄糖耐受不良的发展。虽然一些个体似乎对人造甜味剂的效应更耐受，但其他的则更不耐受。对人造甜味剂的个体应答被证明是由于测试个体的微生物组的差异。
另外，本发明人已发现肠微生物组的细菌含量易受昼夜节律改变破坏的影响。昼夜节律的破坏促使肠微生物组的微生物含量更类似于肥胖或葡萄糖耐受不良的个体的微生物组。因此，当时差微生物从小鼠或人转移到无菌小鼠内时，啮齿类动物变得对葡萄糖耐受不良和糖尿病更敏感。
当进一步实践本发明时，本发明人证明肠微生物组具有其自身固有的昼夜节律，其影响宿主的每日局部和全身转录组振荡。这种日间宏生物（metaorganism）活性适合食物摄入，其时间安排决定了微生物组活性的阶段和与宿主的同步。本发明人证明：通过抗生素处理破坏微生物丛或在无菌小鼠中重新编程肠道和肝脏宿主转录组以同时表征振荡的大量丧失和从头发生，导致代谢途径的时间再组构。
相应地，本发明人提出当确定抗生素或益生菌治疗方案时，应考虑到宿主的微生物组的天然昼夜节律（即应小心以便不破坏微生物组的昼夜节律）。
因此，根据本发明的一个方面，提供了测定试剂对个体的微生物组的影响的方法，其包括：
（a）使微生物组暴露于试剂；
（b）比较暴露后的微生物组的标记与致病性微生物组的参考标记，其中当微生物组的标记在统计上显著类似于致病性微生物组的参考标记时，表明所述试剂对所述微生物组具有不利影响。
如本文使用的，术语“微生物组”指在限定环境中微生物（细菌、真菌、原生生物）、其遗传元件（基因组）的总体。
微生物组可以是肠微生物组、口腔微生物组、支气管微生物组、皮肤微生物组或阴道微生物组。
根据一个特定实施方案，所述微生物组是肠微生物组（即肠道微生物组）。
本发明涵盖了这样的认知：可以依赖微生物标记作为关于微生物组组成和/或活性的代表。微生物标记包含作为微生物组组成和/或活性的指示剂的数据点。因此，根据本发明，微生物组中的变化可以通过检测微生物标记的一个或多个特征进行检测和/或分析。
在一些实施方案中，微生物标记包括与一个或多个类型的微生物和/或其产物的绝对量有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包括与五个、十个、二十个或更多个类型的微生物或其产物的相对量有关的信息。
微生物产物的实例包括但不限于mRNA、多肽、碳水化合物和代谢产物。
在一些实施方案中，微生物标记包含与至少十个类型的微生物的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与5至100个类型的微生物的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与100至1000个或更多个类型的微生物的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与微生物组内基本上所有类型的细菌的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与微生物组内基本上所有类型的微生物的存在、水平和/或活性有关的信息。
在一些实施方案中，微生物标记包含与至少十个类型的微生物的代谢产物的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与5至100个类型的微生物的代谢产物的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与100至1000个或更多个类型的微生物的代谢产物的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与微生物组内基本上所有类型的细菌的代谢产物的存在、水平和/或活性有关的信息。在一些实施方案中，微生物标记包含与微生物组内基本上所有类型的微生物的代谢产物的存在、水平和/或活性有关的信息。
根据本发明的这个方面，微生物组标记包括微生物组中至少一种、至少10种、至少20种、至少50种、至少100种、至少200种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种、至少800种、至少900种、至少1000种、至少1200种、至少1500种或所有种类的微生物的存在或水平。
在一些实施方案中，微生物组标记包含至少一个、或至少五个、或至少十个或更多个类型的微生物（例如细菌）或者其组分或副产物的水平或水平组。在一些实施方案中，微生物标记包含至少一种或至少五种或至少十种或更多种DNA序列的水平或水平组。在一些实施方案中，微生物标记包含十种或更多种16S rRNA基因序列的水平或水平组。在一些实施方案中，微生物标记包含18S rRNA基因序列的水平或水平组。在一些实施方案中，微生物标记包含至少五种或至少十种或更多种RNA转录物的水平或水平组。在一些实施方案中，微生物标记包含至少五种或至少十种或更多种蛋白质的水平或水平组。在一些实施方案中，微生物标记包含至少一种或至少五种或至少十种或更多种代谢产物的水平或水平组。
16S和18S rRNA基因序列分别编码原核生物和真核生物核糖体的小亚基组分。rRNA基因对于区分微生物类型特别有用，因为尽管这些基因的序列在微生物物种之间不同，但这些基因具有高度保守的引物结合区域。保守的引物结合区之间的这种特异性允许许多不同类型的微生物的rRNA基因用单一引物组扩增，并随后通过扩增序列区分。
根据一个实施方案，处于分析下的个体是健康个体（即未诊断有已知影响微生物组的疾病的个体）。因此，根据一个实施方案，处于分析下的个体未患有代谢疾病（例如并非糖尿病或糖尿病前期、未患有克罗恩氏病）或癌症。个体通常是哺乳动物（例如人）。
根据一个实施方案，处于分析下的个体的微生物组概况被包括在个体特异性数据库中，并且来源于非健康个体的参考微生物组（致病性微生物组）的概况被包括在第二数据库中。所述第二数据库可包含不止一种致病性微生物组的概况，并且可以包含来自多个致病性微生物组的平均数据。
个体特异性数据库和第二数据库两者均可以计算机可读形式存储于计算机可读媒体上，并且任选且优选由数据处理器例如通用计算机或专用电路访问。
个体特异性数据库可以包含描述个体的另外数据。除微生物组概况或标记外的数据类型的代表性实例包括但不限于对食物的应答、个体的血液化学、个体的部分血液化学、个体的遗传学概况、与个体相关的代谢组学数据、个体的身体状况、个体的睡眠模式、个体的食物摄入习惯（例如个体是否使用人造甜味剂）等等。个体特异性数据库还可以包含关于对试剂的摄入或暴露频率、对试剂的摄入或暴露时间等等的数据。这些及其他类型的数据在下文更详细地描述。
为了分析微生物组，从个体中获取样品。因此，例如可以获取大便样品以分析肠微生物组，可以获取支气管样品以分析支气管微生物组等。根据一个特定实施方案，个体的微生物组由所述个体的大便样品进行测定。应当理解，对相同来源的微生物组进行了比较（即个体的肠微生物组与第二个体或个体组的肠微生物组比较）。
本发明人已证明进食模式（例如由于昼夜节律失调）中的变化影响微生物组的组成。因此，优选地，在每天的固定时间获取样品。
根据本发明的这个方面进行分析的试剂可以是物质或条件。
可能分析的物质通常是无热量物质（即具有小于3卡路里/100 g）。
示例性无热量物质包括食物添加剂。
食物添加剂可以根据欧盟用E编号进行分类。因此，例如E编号在100-199之间的物质是色素，E编号在200-299之间的物质是防腐剂，E编号在300-399之间的物质是抗氧化剂，E编号在400-499之间的物质是增稠剂、稳定剂或乳化剂，E编号在500-599之间的物质是酸性调节剂或抗结块剂，E编号在600-699之间的物质是风味增强剂，E编号在700-799之间的物质是抗生素，E编号在900-999之间的物质是上光剂或甜味剂。另外的化学制品的E编号在1000-1599之间。
食物添加剂可以分类成下列组：酸、酸度调节剂、抗结块剂、消泡剂、抗氧化剂、填充剂、着色剂、乳化剂、香料、风味增强剂、上光剂、保湿剂、防腐剂、稳定剂、人造甜味剂和增稠剂。
根据一个特定实施方案，所述物质是咖啡因。
根据另一个实施方案，所述物质是人造甜味剂。
人造甜味剂的实例包括但不限于阿斯巴甜、安赛蜜、甜菊醇、糖精、甜蜜素、赤藓醇、益寿糖、麦芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜、山梨糖醇、木糖醇和三氯蔗糖。
根据另一个实施方案，所述物质是治疗剂。治疗剂的实例包括但不限于无机或有机化合物；小分子（即小于1000道尔顿）或大分子（即超过1000道尔顿）；生物分子（例如蛋白性分子，包括但不限于：肽、多肽、翻译后修饰的蛋白质、抗体等）或核酸分子（例如双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA或三螺旋核酸分子）或化学制品。治疗剂可以是来源于任何已知生物（包括但不限于动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒）的天然产物或来源于合成分子的文库。治疗剂可以是单体以及聚合化合物。
根据一个特定实施方案，所述物质是代谢产物。
如本文使用的，“代谢产物”是代谢的中间产物或产物。术语代谢产物一般局限于小分子，并且不包括聚合化合物例如DNA或蛋白质。代谢产物可以充当代谢途径的酶的底物、此类途径的中间产物或通过该代谢途径获得的产物。
在优选实施方案中，代谢产物包括但不限于糖、有机酸、氨基酸、脂肪酸、激素、维生素、寡肽（长度小于约100个氨基酸）以及其离子片段。细胞还可以进行裂解，以便测量细胞内存在的细胞产物。特别地，所述代谢产物分子量小于约3000道尔顿，并且更特别地约50至约3000道尔顿。
本发明的这个方面的代谢产物可以是主要代谢产物（即微生物生长必需的）或次要代谢产物（在生长、发育或繁殖中不起作用，并且在生长结束后或接近生长静止期所形成的代谢产物）。
本发明的代谢产物所涉及的代谢途径的代表实例包括但不限于柠檬酸循环、呼吸链、光合作用、光呼吸作用、糖酵解、糖异生、磷酸己糖途径、氧化磷酸戊糖途径、脂肪酸的生产和氧化、尿素循环、氨基酸生物合成途径、蛋白质降解途径如蛋白酶体降解、氨基酸降解途径、下列物质的生物合成或降解：脂质、聚酮（包括例如类黄酮和异黄酮）、类异戊二烯（包括例如萜烯、甾醇、类固醇、类胡萝卜素、叶黄素）、碳水化合物、类苯基丙烷和衍生物、生物碱、苯环型化合物、吲哚、吲哚-硫化合物、卟啉、花青素、激素、维生素、辅因子如辅基或电子载体、木质素、硫代葡糖苷、嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸和相关分子如tRNA、微小RNA（miRNA）或mRNA。
根据一个特定实施方案，所述治疗剂不是食物或食物添加剂。
根据另一个实施方案，所述治疗剂并非用于治疗肥胖或与葡萄糖耐受不良相关的疾病（例如糖尿病）。
根据另外一个实施方案，所述物质不是治疗剂。
所述物质可以是分离的或可以掺入载体例如食物或饮料中。
根据一个实施方案，所述载体是无热量载体例如无热量食物或饮料。因此，例如，所述物质可以是减肥饮料或不加奶的咖啡。
优选地，微生物组暴露于相似量的试剂，所述试剂量是处于检查下的个体常规经受的。
如所述的，测试的试剂还可以是条件。
本发明设想的示例性条件包括但不限于睡眠模式改变、暴露于烟草烟雾、暴露于辐射、曝露于光和食物摄入模式。
根据本发明的这个方面的第一步涉及使微生物组暴露于试剂。应当理解，当试剂是物质时，这个步骤可以在体内或体外实现。当试剂是条件时，这个步骤通常在体内实现。暴露可以是直接暴露（例如接触）或可以经由个体（例如个体暴露于不同的睡眠模式）来实现。
接触可以一次进行，或可以在特定时间段的过程中在多个时机实现。
应当理解，标记可以在个体的微生物组中进行测定，所述个体已知或已经经受试剂或条件。这个信息可以直接得自处于分析下的个体（例如使用问卷）。优选地，个体已经受试剂一段时间（例如一周、一个月或更久）。根据一个特定实施方案，个体已经受试剂一天至少一次、一天至少两次、一天至少三次或更多次。优选地，在分析之前至少1个月，在分析前至少一周且任选在分析前至少一天，个体已经受试剂。
在接触之后，将测试个体的微生物组的标记与致病性微生物组的参考标记相比较。
如本文使用的，短语“致病性微生物组”指来源于个体的微生物组，所述个体已知患有疾病（例如代谢疾病例如糖尿病或糖尿病前期、癌症）或已经预分类为具有对试剂不耐受的微生物组。
定量微生物的水平：在依照本发明的方法中，通过定量微生物的水平获得并且/或者测定微生物标记。定量各种类型的微生物的水平的方法在本文下文描述。
在一些实施方案中，测定一个或多个类型的微生物或者其组分或产物的水平或水平组包括测定一种或多种DNA序列的水平或水平组。在一些实施方案中，一种或多种DNA序列包括可以用于区分不同微生物类型的任何DNA序列。在某些实施方案中，一种或多种DNA序列包括16S rRNA基因序列。在某些实施方案中，一种或多种DNA序列包括18S rRNA基因序列。在一些实施方案中，扩增了1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、1,000、5,000种或更多种序列。
在一些实施方案中，直接测定微生物丛样品（例如粪便样品）的一种或多种DNA序列的水平或水平组。在一些实施方案中，从微生物丛样品中分离DNA，并且测定分离的DNA的一种或多种DNA序列的水平或水平组。分离微生物DNA的方法是本领域众所周知的。实例包括但不限于苯酚-氯仿提取，以及广泛多样的商购可得的试剂盒，包括QIAamp DNA StoolMini Kit（Qiagen，Valencia，Calif.）。
在一些实施方案中，一种或多种DNA序列的水平或水平组通过使用PCR（例如标准PCR、半定量或定量PCR）扩增DNA序列进行测定。在一些实施方案中，一种或多种DNA序列的水平或水平组通过使用定量PCR扩增DNA序列进行测定。这些及其他基本DNA扩增程序是本领域从业者众所周知的，并且在Ausebel等人（Ausubel F M，Brent R，Kingston R E，MooreD D，Seidman J G，Smith J A，Struhl K（编辑）. 1998. Current Protocols inMolecular Biology. Wiley: New York）中描述。
在一些实施方案中，DNA序列使用特异于一种或多种序列的引物进行扩增，所述一种或多种序列将个别微生物类型与其他不同的微生物类型区分开。在一些实施方案中，16SrRNA基因序列或其片段使用特异于16S rRNA基因序列的引物进行扩增。在一些实施方案中，18S DNA序列使用特异于18S DNA序列的引物进行扩增。
在一些实施方案中，一种或多种16S rRNA基因序列的水平或水平组使用phylochip技术进行测定。phylochip的使用是本领域众所周知的，并且在Hazen等人（"Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria." Science，330，204-208，2010）中描述，所述参考文献全文通过引用并入。简言之，扩增16S rRNA基因序列且由从微生物丛样品中提取的DNA进行标记。扩增的DNA随后与含有针对微生物16S rRNA基因的探针的阵列杂交。随后定量与每种探针的结合水平，提供对应于探测到的16S rRNA基因序列的微生物类型的样品水平。在一些实施方案中，phylochip分析通过商用供应商来进行。实例包括但不限于Second Genome Inc.（San Francisco，Calif.）。
在一些实施方案中，测定一个或多个类型的微生物或者其组分或产物的水平或水平组包括测定一种或多种微生物RNA分子（例如转录物）的水平或水平组。定量RNA转录物的水平的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于RNA分析、半定量逆转录酶PCR、定量逆转录酶PCR和微阵列分析。
在一些实施方案中，测定一个或多个类型的微生物或者其组分或产物的水平或水平组包括测定一种或多种微生物多肽的水平或水平组。定量多肽水平的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于蛋白质分析和质谱法。这些及其他基本多肽检测程序在Ausebel等人中描述。
在一些实施方案中，测定一个或多个类型的微生物或者其组分或产物的水平或水平组包括测定一种或多种微生物代谢产物的水平或水平组。在一些实施方案中，代谢产物的水平通过质谱法进行测定。在一些实施方案中，代谢产物水平通过核磁共振波谱法进行测定。在一些实施方案中，代谢产物水平通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测定。在一些实施方案中，代谢产物水平通过比色法进行测定。在一些实施方案中，代谢产物水平通过分光光度法进行测定。
分析SCFA的方法是本领域已知的。示例性方法在本文下文实施例部分进行描述。
应当理解，选择致病性微生物组参考标记以便与个体的微生物组标记对应。例如，如果个体的微生物组标记包含微生物代谢产物的量，则致病性微生物组参考标记也包含所述微生物代谢产物的量。如果个体的微生物组标记包含涉及糖胺聚糖合成的一组基因的表达数据，则致病性微生物组参考标记也包含涉及糖胺聚糖合成的该组基因的表达数据。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，当两种微生物组标记包含的微生物至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同时，它们可以是统计上显著相似的标记。
另外或可替代地，当微生物组中至少一种目标微生物的数量（例如出现）相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少10%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少20%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。
根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少30%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少40%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少50%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。
根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少60%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少70%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少80%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。
根据另一个实施方案，当微生物组中其微生物的至少90%的相对比率相同时，微生物组可以具有统计上显著相似的标记。因此，总体微生物的分数百分比（例如相对量、比率、分布、频率、百分比等）可以是统计上类似的。
根据另一个实施方案，为了将微生物划归特定的属、科、目、纲或门，其必须与已知属于特定属的参考微生物具有至少90%序列同源性、至少91%序列同源性、至少92%序列同源性、至少93%序列同源性、至少94%序列同源性、至少95%序列同源性、至少96%序列同源性、至少97%序列同源性、至少98%序列同源性、至少99%序列同源性。根据一个特定实施方案，序列同源性是至少95%。
根据另一个实施方案，为了将微生物划归特定的种，其必须与已知属于特定种的参考微生物具有至少90%序列同源性、至少91%序列同源性、至少92%序列同源性、至少93%序列同源性、至少94%序列同源性、至少95%序列同源性、至少96%序列同源性、至少97%序列同源性、至少98%序列同源性、至少99%序列同源性。根据一个特定实施方案，序列同源性是至少97%。
在测定核酸或蛋白质是否与本发明的序列基本上同源或共享一定百分比的序列同一性中，序列相似性可以通过常规算法进行限定，所述常规算法通常允许引入少量空位，以便实现最佳拟合。特别地，两个多肽或两个核酸序列的“同一性百分比”使用Karlin和Altschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268，1993）的算法进行测定。将此类算法结合到Altschul等人（J. Mol. Biol. 215:403-410，1990）的BLASTN和BLASTX程序内。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序执行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同等地，BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序执行，以获得与本发明的多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，1997）中所述的使用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各自程序（例如BLASTX和BLASTN）的缺省参数。关于更多细节参考wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov。
根据仍另一个实施方案，如果属于特定途径的基因的相对数目相似，则两种微生物组标记可以归为相似的。此类途径在本文下文描述。
根据仍另一个实施方案，如果由微生物生成的产物的相对量相似，则两种微生物组标记可以归为相似的。此类产物在本文下文描述。
正如比较处于分析下的个体的微生物组标记与致病性参考微生物组，个体的微生物组标记还（或可替代地）可以与非致病性参考微生物组相比较。
因此，根据另一个实施方案，该方法还包括比较暴露后的微生物组的标记与非致病性微生物组参考标记，其中当微生物组的标记在统计上显著不同于非致病性微生物组参考标记时，表明所述试剂对所述微生物组具有不利影响。另外，当微生物组的标记在统计上显著类似于非致病性微生物组参考标记时，表明所述试剂对所述微生物组不具有不利影响。
非致病性微生物组通常来源于健康个体（即，不患有任何疾病，尤其是代谢疾病）。另外，非致病性微生物组通常来源于未长期摄入试剂的健康个体，所述试剂已知会不利地影响微生物组。因此，例如，非致病性微生物组通常来源于未长期摄入人造甜味剂的健康个体。
可以在本文描述的方法的任一种中加入另外的步骤，所述方法用于评价试剂对微生物组的作用，包括在分析微生物组标记和/或制备用于分析的样品（例如粪便物的取出、制造蛋白质提取物、制备核酸样品等）之前，给个体施用试剂。
本文描述的分析方法中的任一种均可以许多形式体现。例如，它可以在有形介质例如用于执行方法操作的计算机上体现。它可以在计算机可读介质上体现，包括用于进行方法操作的计算机可读说明书。它还可以在电子装置中体现，所述电子装置具有数字计算机能力以安排运行在有形介质上的计算机程序或执行在计算机可读介质上的指令。
实现本文实施方案的分析方法的计算机程序通常可以在分发介质例如但不限于CD-ROM或闪存介质上分发给用户。计算机程序可以从分发介质拷贝到硬盘或相似的中间存储介质。在本发明的一些实施方案中，通过允许用户经由通信网络例如因特网远程下载程序，将实现本文实施方案的方法的计算机程序分发给用户。可以通过从其分发介质或其中间存储介质下载计算机指令到计算机的执行存储器内，配置计算机以依照本发明的方法工作，来运行计算机程序。所有这些操作均为计算机系统领域技术人员众所周知的。
通过进行本文描述的方法，能够测定个体对试剂的耐受。随后能够提供关于可以耐受（例如摄入）的物质的量，或可以由个体耐受的条件的量或水平的建议。
下文是经证明对微生物组有影响的试剂的两个实例。
人造甜味剂：本发明人已证实食用常用的人造甜味剂制剂通过诱导肠道微生物组的组成和功能的改变，推动特定个体中的葡萄糖耐受不良的发展。虽然一些个体似乎对人造甜味剂的效应更耐受，但其他的则更不耐受。对人造甜味剂的个体应答被证明是由于测试个体的微生物组的差异。
如本文使用的，短语“对人造甜味剂的耐受”指摄入（进食或饮用）FDA的每日最大容许摄入量（ADI）的人造甜味剂（例如商用糖精5mgkg-1）而不表现出与扰乱的葡萄糖代谢相关的临床参数的能力。因此，例如，如果一个人通过了葡萄糖耐量测试，则他可被视为对人造甜味剂耐受。例如，如果摄入75克葡萄糖后2小时，其血糖水平低于140 mg/dl，并且在0至2小时之间的所有值均小于200 mg/dl，则其可被视为未通过葡萄糖耐量测试。另外，如果一个人的空腹葡萄糖水平在正常范围内，则其可被视为对人造甜味剂耐受。
通常，就其对人造甜味剂的耐受进行测试的个体并非糖尿病患者或糖尿病前期患者。优选地，他们不患有代谢病症。
当测试对人造甜味剂的耐受时，特别有关的微生物组标记包括：属于拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目、乳杆菌目、厌氧原体目（Anaeroplasmatales）、肠杆菌目（Enterobacteriales）和/或弯曲菌目的微生物的水平。
根据一个特定实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记包含属于拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目和/或弯曲菌目的微生物的水平。
根据另一个实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记包含属于拟杆菌门、厚壁菌门和/或软壁菌门（Tenericutes）的微生物的水平。
根据另一个实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记包含属于拟杆菌纲（Bacteroidia）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、梭菌纲（Clostridia）、柔膜菌纲（Mollicutes）和/或γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）的微生物的水平。
根据另一个实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记包含属于拟杆菌目、乳杆菌目、梭菌目、厌氧原体目和/或肠杆菌目的微生物的水平。
根据另一个实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记包含属于拟杆菌科（Bacteroidaceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）、厌氧原体科（Anaeroplasmataceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、臭味菌科（Odoribacteraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）、Dehalobacteriaceae、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和/或S24-7科的微生物的水平。
根据另一个实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记包含属于拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）、紫单胞菌属（Parabacteroides）、厌氧原体属（Anaeroplasma）、分节丝状菌（Candidatus Arthromitus）、臭味菌属（Odoribacter）、乳球菌属（Lactococcus）和/或Dehalobacterium属的微生物的水平。
根据又另一个实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记包含本文下文表4中所示的物种中的至少一种的微生物的水平。
如本文上文所提及的，微生物组标记可以指在微生物组的微生物中表达的特定基因的水平。
更具体而言，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记可以包含属于聚糖降解途径（例如糖胺聚糖途径）的基因的水平。
根据另外一个实施方案，当测试对人造甜味剂的耐受时，微生物组标记可以包含微生物基因的水平，包括例如涉及淀粉和蔗糖代谢的基因、涉及果糖和甘露糖代谢的基因、涉及叶酸生物合成的基因、涉及甘油脂生物合成的基因、涉及脂肪酸生物合成的基因、涉及葡萄糖转运途径的基因、涉及抗坏血酸和醛糖二酸盐（aldarate）代谢的基因、涉及脂多糖生物合成的基因和/或涉及细菌趋化性的基因。
如本文上文所提及的，微生物组标记可以指由微生物组的微生物生成的产物或副产物-例如代谢产物的水平。
当测试对人造甜味剂的耐受时，可以在样品中进行分析的示例性代谢产物是短链脂肪酸（SCFA）。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目、乳杆菌目、厌氧原体目、肠杆菌目和/或弯曲菌目的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目和/或弯曲菌目的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于拟杆菌门、厚壁菌门和/或软壁菌门的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于拟杆菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲、柔膜菌纲和/或γ变形菌纲的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于拟杆菌目、乳杆菌目、梭菌目、厌氧原体目和/或肠杆菌目的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于拟杆菌科、乳杆菌科、紫单胞菌科、厌氧原体科、梭菌科、臭味菌科、瘤胃菌科、链球菌科、Dehalobacteriaceae科、肠杆菌科和/或S24-7科的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于拟杆菌属、乳杆菌属、紫单胞菌属、厌氧原体属、分节丝状菌、臭味菌属、乳球菌属和/或Dehalobacterium属的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，如果属于本文下文表4中所示的物种的微生物的相对水平是统计上相似的，则两种微生物组标记可以归为相似的。
根据本发明的另一个方面，提供了测定个体对人造甜味剂的耐受的方法，其包括分析个体的微生物组中属于选自下述目的微生物的量：拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目、YS2目、RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目和/或弯曲菌目，其中拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物的量超过预定水平表明个体对人造甜味剂耐受，而RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目和/或弯曲菌目的微生物的量超过预定水平表明个体对人造甜味剂不耐受。
测定属于特定目的微生物的量已在本文上文进行描述。
根据这个方面，分析属于至少一个目、两个目、三个目、四个目、五个目、六个目、七个目、八个目、九个目、十个目、十一个目或上文提及的全部的目的微生物的相对量。
优选地，水平增加至少1.5倍、2倍、5倍或更大。
根据本发明的另外一个方面，提供了测定个体对人造甜味剂的耐受的方法，其包括分析个体的微生物组中如表4中所示的至少一种微生物或微生物类别的量，其中所述至少一种微生物或微生物类别的量超过预定水平表明个体对人造甜味剂不耐受。
根据本发明的这个方面，分析了表4中所述的微生物中的至少一种，分析了表4中所述的微生物中的至少5%，分析了表4中所述的微生物中的至少10%，分析了表4中所述的微生物中的至少20%，分析了表4中所述的微生物中的至少30%，分析了表4中所述的微生物中的至少40%，分析了表4中所述的微生物中的至少50%。
优选地，水平增加至少1.5倍、2倍、5倍或更大。
可以在本文描述的方法的任一种中加入另外的步骤，所述方法用于评价个体对人造甜味剂的耐受，包括在分析微生物组标记和制备用于分析的样品（例如粪便物的取出、制造蛋白质提取物、制备核酸样品等）之前，给个体施用人造甜味剂。
改变的昼夜节律
本发明人已证明具有昼夜节律失调的个体（例如具有时差的那些）具有统计上显著类似于致病性微生物组的微生物组，并且认为所得到的微生物群落可以促成代谢失衡。
因此，本发明人提出通过分析个体的微生物组，测定个体对其昼夜节律改变（例如改变时区、上夜班等）是否耐受。如果其微生物组在统计上显著类似于致病性微生物组，则表明其对这些条件不耐受。
本发明设想了用于分析个人的微生物组以便测定其对不同试剂或条件的耐受的试剂盒。
因此，根据本发明的另一个方面，提供了用于测定个体对试剂是否耐受的试剂盒，其包含：
（i）能够测定至少一种微生物组组分的量的试剂，其中所述至少一种微生物组组分的水平在试剂耐受的微生物组中和在试剂不耐受的微生物组中显著不同；和
（ii）致病性微生物组。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括能够测定至少一种微生物组组分的量的试剂，其中所述至少一种微生物组组分的水平在人造甜味剂耐受的个体中和在人造甜味剂不耐受的个体中显著不同。
与试剂不耐受的微生物组相比较，微生物组组分（例如生物分子）在试剂耐受的微生物组中可以是富集、耗尽、上调、下调、降解或稳定的。
如本文上文所提及的，微生物组组分（例如生物分子）可以是核酸、寡聚核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢产物或其片段。核酸可以包括RNA、DNA、以及天然存在或合成制备的衍生物。微生物组相关组分可以存在于肠内的微生物中，通过肠内的微生物产生或通过肠内的微生物修饰。
生物分子可以允许分析特定物种或类别的微生物。
在微生物的情况下，试剂可以是用于扩增16S rRNA或18S rRNA的引物或引物组。此类引物组的实例在本文下文实施例部分中提供。本实施方案的试剂盒可以包括后续测序反应所需的另外试剂。
在基因（DNA）或RNA的情况下，试剂可以是与目标DNA或RNA特异性杂交的寡核苷酸。
寡核苷酸可以是扩增引物的形式。在这种情况下，试剂盒可以包括执行扩增反应的另外组分，例如酶、盐和缓冲液。通常，试剂盒可以包括用于扩增至少两个基因的寡核苷酸，所述至少两个基因已知在人造甜味剂耐受/不耐受微生物组中差异表达。根据一个特定实施方案，所述两个基因是已知涉及人造甜味剂耐受的途径，例如聚糖降解途径（例如糖胺聚糖途径）的一部分。
另外或可替代地，引物可以扩增涉及至少一种过程或途径的基因，与试剂不耐受的微生物组相比较，所述至少一种过程或途径已知在试剂耐受的微生物组中是上调或下调的。因此，在人造甜味剂的情况下，引物可以扩增在下述过程或途径中的一种或多种中的基因：淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、叶酸生物合成、甘油脂-生物合成、脂肪酸生物合成、葡萄糖转运途径、抗坏血酸和醛糖二酸盐代谢、脂多糖生物合成和/或细菌趋化性。
可替代地，寡核苷酸可以附着至固体表面（即阵列）。适合于构建阵列的几种基底是本领域已知的，并且本领域技术人员应当理解，随着技术进步可以使用其他基底。基底可以是这样的材料，其可以进行修饰以含有适于寡核苷酸附着或结合的不连续的单独位点，且适应至少一种检测方法。基底材料的非限制性实例包括玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料（包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、TeflonJ等）、尼龙或硝酸纤维素、多糖、尼龙、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料（包括硅和改性的硅）、碳、金属、无机玻璃和塑料。在一个示例性实施方案中，基底可以允许光学检测而无需明显的荧光发射。
基底可以是平面的，基底可以是孔，即364孔板，或可替代地，基底可以是微珠。另外，基底可以是用于流通样品分析的管的内表面，以使样品体积降到最低。类似地，基底可以是柔性的，例如柔性泡沫，包括由特殊塑料制成的闭孔泡沫。
一种或多种寡核苷酸可以以广泛多样的方式附着至基底，如本领域技术人员应当理解，的。寡核苷酸可以首先合成，随后附着至基底，或可以在基底上直接合成。基底和寡核苷酸可以衍生带有化学官能团用于两者的后续附着。例如，基底可以衍生带有化学官能团，所述化学官能团包括但不限于氨基、羧基、氧代基团或硫醇基团。使用这些官能团，寡核苷酸可以使用接头直接地或间接地使用寡核苷酸上的官能团进行附着。
寡核苷酸还可以非共价地附着至基底。例如，可以制备生物素化的寡核苷酸，其可以结合至由链霉亲和素共价包被的表面，导致附着。可替代地，一种或多种寡核苷酸可以使用技术例如光聚合和光刻法在表面上合成。将寡核苷酸附着至阵列的另外方法和在基底上合成寡核苷酸的方法是本领域众所周知的，即来自Affymetrix的VLSIPS技术（例如参见美国专利号6,566,495，以及Rockett和Dix，"DNA arrays: technology，options andtoxicological applications," Xenobiotica 30（2）:155-177，所有这些参考文献均在此通过引用全文并入）。
在一个实施方案中，附着至基底的一种或多种寡核苷酸定位于空间限定的阵列地址。阵列可以包含约1至约几十万个地址或更多。在一个实施方案中，阵列可以包含小于10,000个地址。在另一个可替代实施方案中，阵列可以包含至少10,000个地址。在又另一个可替代实施方案中，阵列可以包含小于5,000个地址。在仍另一个可替代实施方案中，阵列可以包含至少5,000个地址。在另外的实施方案中，阵列可以包含小于500个地址。在又另外的实施方案中，阵列可以包含至少500个地址。
寡核苷酸可以在给定阵列上呈现不止一次。换言之，阵列的不止一个地址可以由相同寡核苷酸构成。在一些实施方案中，阵列的两个、三个或超过三个地址可以由相同寡核苷酸构成。在某些实施方案中，阵列可以包含对照寡核苷酸和/或对照地址。对照可以是内部对照、阳性对照、阴性对照或背景对照。
阵列可以由与DNA或RNA杂交的寡核苷酸构成，所述DNA或RNA指示人造甜味剂耐受或不耐受的微生物组。
在一个实施方案中，阵列可以包含这样的试剂，所述试剂可以与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，对在试剂耐受的宿主微生物组中富集的生物分子的存在进行定量或定性。在另一个实施方案中，阵列可以包含这样的试剂，所述试剂可以与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，对在试剂耐受的宿主微生物组中耗尽的生物分子的存在进行定量或定性。在另外一个实施方案中，阵列可以包含这样的试剂，所述试剂可以与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，对在试剂耐受的宿主微生物组中上调的生物分子的存在进行定量或定性。在另外一个实施方案中，阵列可以包含这样的试剂，所述试剂可以与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，对在试剂耐受的宿主微生物组中下调的生物分子的存在进行定量或定性。在另外一个实施方案中，阵列可以包含这样的试剂，所述试剂可以与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，对在试剂耐受的宿主微生物组中降解的生物分子的存在进行定量或定性。在一个可替代实施方案中，阵列可以包含这样的试剂，所述试剂可以与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，对在试剂耐受的宿主微生物组中稳定的生物分子的存在进行定量或定性。
例如，当试剂是人造甜味剂时，阵列可以包含与DNA/RNA序列杂交的寡核苷酸，所述DNA/RNA序列编码涉及聚糖降解途径（例如糖胺聚糖途径）的多肽。
另外或可替代地，当试剂是人造甜味剂时，阵列可以包含与DNA/RNA序列杂交的寡核苷酸，所述DNA/RNA序列编码涉及下述过程或途径中的至少一种或多种的多肽：淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、叶酸生物合成、甘油脂-生物合成、脂肪酸生物合成、葡萄糖转运途径、抗坏血酸和醛糖二酸盐代谢、脂多糖生物合成和/或细菌趋化性。
优选地，特定途径中的至少2、5、10、15、20个基因在阵列上呈现。
在一个实施方案中，阵列包含与至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395或400种寡核苷酸杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸指示试剂耐受的宿主微生物组，或与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，其在试剂耐受的宿主微生物组中是受调制的。在另一个实施方案中，阵列包含专门鉴定至少 200种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种、至少800种或至少900种生物分子的寡核苷酸，所述生物分子指示试剂耐受的宿主微生物组，或与试剂不耐受的宿主微生物组相比较，其在试剂耐受的宿主微生物组中是受调制的。
本文描述的试剂盒还可以包括对照样品。根据一个实施方案，试剂盒包括阳性对照例如致病性微生物组。另外或可替代地，试剂盒包括阴性对照例如非致病性微生物组。
致病性和/或非致病性微生物组可以是经处理的。因此，对照微生物组可以作为经分离的多核苷酸或蛋白质呈现。可替代地，对照微生物组可以由微生物呈现。
对照样品可以是任何合适的形式，例如粉末干燥形式。另外，对照样品可以已经历处理，以增加其存活。例如，微生物可以包被或封装在多糖、脂肪、淀粉、蛋白质或糖基质中。可以使用本领域已知的标准封装技术。例如，可以使用美国专利号6,190,591中讨论的技术，所述专利在此通过引用全文并入。
根据本发明的另外一个方面，提供了恢复个体对试剂的耐受的方法，其包括给个体施用有效量的益生菌组合物，所述益生菌组合物包含与非致病性微生物组在统计上显著类似的微生物，从而恢复个体对试剂的耐受。
例如，本发明设想了用于增加对人造甜味剂的耐受的微生物组合物（例如益生菌组合物），其中组合物的微生物中的大多数是拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物。
本发明还设想了用于增加对昼夜节律失调的耐受的微生物组合物（例如益生菌或抗生素组合物）。例如，本发明人已证明在时差期间获得的微生物丛样品具有更高的相对量的厚壁菌门，其在时差恢复后逆转。因此，可以减少微生物组中的厚壁菌门水平的试剂在恢复个体对昼夜节律失调的耐受方面可能是有效的。
如本文使用的，术语“益生菌”指任何微生物类型，其与宿主生物中的健康益处和/或宿主生物中的疾病、病症、状况或事件的危险和/或症状减少相关。在一些实施方案中，益生菌被配制在食物产品、功能食物或营养品中。在一些实施方案中，益生菌是多种类型的细菌。
本发明的这个方面的微生物组合物可以在统计上显著类似于已发现是试剂耐受的个体的微生物组。
微生物组合物可以取自微生物组的微生物丛样品。
微生物丛样品包含来自微生物组的微生物和或其组分或产物的样品。
在一些实施方案中，通过任何手段收集微生物丛样品，所述手段允许回收微生物且不破坏微生物组的微生物或者其组分或产物的相对量。特定回收方法应适合微生物组来源。
可替代地，微生物组合物可以通过加入已知量的不同微生物而人工制备。
应当理解，来源于个体的微生物丛样品的微生物组合物可以在施用前通过增加特定菌株的量或耗尽特定菌株的量进行操纵。可替代地，微生物组合物以这样的方式进行处理，以便不改变微生物物种和其中包含的分类群之间的相对平衡。在一些实施方案中，微生物组合物在施用前使用已知培养方法进行体外扩增。在其他实施方案中，微生物组合物在施用前不进行体外扩增。
根据一个实施方案，微生物组合物不来源于粪便材料。
根据仍另一个实施方案，微生物组合物不含（或仅包含痕量）粪便材料（例如纤维）。
益生菌微生物可以是任何合适的形式，例如粉末干燥形式。另外，益生菌微生物可以已经历处理，以增加其存活。例如，微生物可以包被或封装在多糖、脂肪、淀粉、蛋白质或糖基质中。可以使用本领域已知的标准封装技术。例如，可以使用美国专利号6,190,591中讨论的技术，所述专利在此通过引用全文并入。
根据一个特定实施方案，益生菌微生物组合物被配制在食物产品、功能食物或营养品中。
在一些实施方案中，食物产品、功能食物或营养品是或包含乳制品。在一些实施方案中，乳制品是或包含酸奶制品。在一些实施方案中，乳制品是或包含奶制品。
在一些实施方案中，乳制品是或包含奶酪制品。在一些实施方案中，食物产品、功能食物或营养品是或包含果汁或来源于水果的其他产品。在一些实施方案中，食物产品、功能食物或营养品是或包含来源于蔬菜的产品。在一些实施方案中，食物产品、功能食物或营养品是或包含谷类产品，包括但不限于谷物、饼干、面包和/或燕麦片。在一些实施方案中，食物产品、功能食物或营养品是或包含稻产品。在一些实施方案中，食物产品、功能食物或营养品是或包含肉制品。
在施用前，个体可以用试剂进行预治疗，所述试剂减少微生物组中天然存在的微生物数目（例如通过抗生素治疗）。根据一个特定实施方案，治疗显著消除了至少20%、30%40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%的天然存在的肠微生物丛。
在一些实施方案中，施用包括给个体施用有效量（例如治疗有效量）或其它所需的量的组合物的任何手段。在一些实施方案中，施用组合物包括通过任何途径的施用，包括例如肠胃外和非肠胃外施用途径。肠胃外途径包括例如动脉内、脑室内、颅内、肌内、腹膜内、胸膜内、门静脉内、脊柱内、鞘内、静脉内、皮下、或其他注射途径。非肠胃外途径包括例如颊、鼻、眼、口服、肺、直肠、经皮或阴道。施用还可以是通过连续输注、局部施用、植入物（凝胶、膜等等）的持续释放和/或静脉内注射。
在一些实施方案中，组合物以与特定所需结果关联的量和/或根据与特定所需结果关联的剂量方案施用（例如与目标结果关联的微生物组组合物和/或标记中的特定变化）。在一些实施方案中，所需结果是对人造甜味剂的耐受增强，如上所述。在一些实施方案中，所需结果是对时差或夜班工作耐受。
依照本发明待施用的特定剂量或量可以改变，例如取决于所需结果的性质和/或程度、或特定施用途径和/或时机、和/或一种或多种特征（例如体重、年龄、个人病史、遗传特征、生活方式参数、糖尿病的严重性和/或糖尿病的风险水平等或其组合）。此类剂量或量可以由本领域普通技术人员确定。在一些实施方案中，适当剂量或量依照标准临床技术进行确定。可替代地或另外，在一些实施方案中，适当剂量或量通过使用一种或多种体外或体内测定法进行确定，以帮助鉴定待施用的所需或最佳剂量范围或量。
在一些特定实施方案中，待施用的适当剂量或量可以由来源于体外或动物模型测试系统的剂量应答曲线外推。对于特定个体待施用的有效剂量或量可以取决于该个体的需要随着时间推移而改变（例如增加或减少），。在一些实施方案中，当施用细菌时，适当剂量包含至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个细菌细胞。在一些实施方案中，本发明涵盖下述认识：更大的益处可以通过提供大于约1000个或更多个（例如约1500、2000、2500、3000、35000、4000、4500、5000、5500、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1x106、2x106、3 x106、4 x106、5 x106、6x106、7 x106、8 x106、9 x106、1 x107、1 x108、1 x109、1 x1010、1 x1011、1 x1012、1 x1013或更多个细菌）细菌细胞数目来实现。
正如用益生菌组合物治疗个体，本发明还设想了用抗微生物组合物治疗个体，所述抗微生物组合物的存在已知会引起对试剂的不耐受。
如本文使用的，术语“抗生素试剂”指从天然来源中分离或来源于从天然来源分离的抗生素试剂的一组化学物质，具有抑制细菌及其他微生物生长或破坏细菌及其他微生物的能力，主要用于治疗传染病。抗生素试剂的实例包括但不限于：阿米卡星；阿莫西林；氨苄青霉素；阿奇霉素；阿洛西林；氨曲南；氨曲南；羧苄青霉素；头孢克洛；头孢吡肟；头孢他美；头孢美唑（Cefinetazole）；头孢克肟；头孢尼西；头孢哌酮；头孢噻肟；头孢替坦；头孢西丁；头孢泊肟；头孢丙烯；头孢磺啶；头孢他啶；头孢唑肟；头孢曲松；头孢呋辛；头孢氨苄；头孢噻吩；喹红霉素；氯霉素；西诺沙星；环丙沙星；克拉霉素；克林霉素；氯唑西林；辅阿莫氟酸盐（Co-amoxiclavuanate）；达巴凡星；达托霉素；双氯西林；多西环素；依诺沙星；依托红霉素；琥乙红霉素；葡庚糖酸红霉素；乳糖酸红霉素；硬脂酸红霉素；红霉素；非达霉素；氟罗沙星；庆大霉素；亚胺培南；卡那霉素；洛美沙星；劳拉卡帕；甲氧西林；甲硝唑；美洛西林；米诺环素；莫匹罗星；奈夫西林；萘啶酸；奈替米星；呋喃妥因；诺氟沙星；氧氟沙星；苯唑西林；青霉素G；哌拉西林；瑞他莫林；利福昔明（Rifaxamin），利福平；罗红霉素；链霉素；磺胺甲噁唑；替考拉宁；四环素；替卡西林；替加环素；妥布霉素；甲氧苄啶；万古霉素；哌拉西林和他唑巴坦的组合；以及它们的各种盐、酸、碱和其他衍生物。抗菌抗生素试剂包括但不限于氨基糖苷、碳头孢烯、碳青霉烯、头孢菌素、头霉素、氟喹诺酮、糖肽、林可酰胺、大环内酯、单环内酰胺、青霉素、喹诺酮、磺胺和四环素。
抗菌剂还包括抗菌肽。实例包括但不限于abaecin；果蝇抗菌肽（andropin）；蜜蜂抗菌肽（apidaecins）；铃蟾抗菌肽；brevinins；buforin II；CAP18；天蚕素；ceratotoxin；防御素；皮抑菌肽；皮离蛋白（dermcidin）；果蝇霉素（drosomycin）；esculentins；indolicidin；LL37；蛙皮素；最大H5；蜂毒素；moricin；prophenin；抗菌肽Protegrin；和或tachyplesins。
根据一个特定实施方案，抗生素是无法吸收的抗生素。
因此，例如，本发明设想了用抗生素治疗个体，所述抗生素减少RF32目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目和/或弯曲菌目的微生物，以便增强个体对人造甜味剂的耐受。优选地，抗生素对拟杆菌目、梭菌目、Bactobacillales目和/或YS2目的微生物不具有功效（或具有更少的功效）。
本发明人已发现微生物组的振荡模式影响宿主的每日局部和全身转录组振荡。本发明人证明：通过抗生素处理破坏微生物丛或在无菌小鼠中重新编程肠道和肝脏宿主转录组以同时表征振荡的大量丧失和从头发生，导致代谢途径的时间再组构。相应地，本发明人提出：对一天中微生物组节律的分析可以透露关于抗生素或益生菌试剂的施用剂量或方案的重要信息。因此，例如，如果微生物组的节律分析显示特定微生物在早晨时间处于峰，并且在晚上时间处于谷，则可以推荐在早晨而不是晚上施用包含这种微生物的益生菌试剂，以便不改变微生物组的天然昼夜节律。如果微生物组的节律分析显示特定微生物在早晨时间处于峰，并且在晚上时间处于谷，则推荐在晚上而不是早晨施用下调这种微生物的抗生素试剂，以便不改变微生物组的天然昼夜节律。
微生物组的分析可以通过分析微生物自身或其产物（例如代谢产物）的水平来进行。微生物组的分析在本文上文进一步描述。
为了分析微生物组的节律，在24小时期间应测量至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或更多个微生物组样品。
应理解，虽然单独描述了上述类型的另外信息，但本文实施方案设想了数据库的两种或更多种类型的信息的任何组合。
如本文使用的，术语“约”指± 10%。
单词“示例性的”在本文中用于意指“充当实例、实例或举例说明”。描述为“示例性的”任何实施方案不一定要解释为优选或优于其他实施方案和/或排除结合其他实施方案的特征。
单词“任选地”在本文中用于意指“在一些实施方案中提供而在其他实施方案中不提供”。本发明的任何特定实施方案可以包括多个“任选”特点，除非此类特点冲突。
术语“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”及其缀合物意指“包括但不限于”。
术语“由……组成”意指“包括且限于”。
术语“主要由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在另外的成分、步骤和/或部分不会在材料上改变请求保护的组合物、方法或结构的基础和新型特征时。
如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
本申请自始至终，本发明的各个实施方案可以以范围形式呈现。应当理解以范围形式的描述仅为了方便和简洁起见，并且不应解释为对本发明的范围的硬性限制。相应地，范围的描述应视为已具体公开在该范围内的所有可能的子范围以及个别数值。例如，范围的描述例如1至6应视为已具体公开在该范围内的子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的个别数目，例如1、2、3、4、5和6。这与范围的宽度无关应用。
每当本文指出数目范围时，它意欲包括在所述范围内的任何引用数目（分数或整数）。短语“范围在第一指出数目和第二指出数目……之间/在第一指出数目和第二指出数目……之间的范围”和“范围从第一指出数目到第二指出数目/从第一指出数目到第二指出数目的范围”在本文中可互换使用，并且意欲包括第一和第二指出数目，以及两者之间的所有分数和整数数目。
应当理解，为了明确起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独或以任何合适的子组合或如本发明的任何其他所述实施方案中合适的提供。在各个实施方案的上下文中描述的某些特征不视为这些实施方案的基本特征，除非实施方案没有那些要素则不起作用。
如在上文描绘和如下文权利要求部分中请求保护的本发明的各个实施方案和方面可在下述实施例中找到实验支持。
应当理解，为了明确起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独或以任何合适的子组合或如本发明的任何其他所述实施方案中合适的提供。在各个实施方案的上下文中描述的某些特征不视为这些实施方案的基本特征，除非实施方案没有那些要素则不起作用。
如在上文描绘和如下文权利要求部分中请求保护的本发明的各个实施方案和方面可在下述实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下述实施例，所述实施例连同上文说明书一起以非限制性方式举例说明本发明的一些实施方案。
一般地，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中充分说明。参见例如"Molecular Cloning: Alaboratory Manual" Sambrook等人，（1989）；"Current Protocols in MolecularBiology"第I-III卷Ausubel，R. M.编辑（1994）；Ausubel等人，"Current Protocols inMolecular Biology"，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland（1989）；Perbal，"APractical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley & Sons，New York（1988）；Watson等人，"Recombinant DNA"，Scientific American Books，New York；Birren等人（编辑）"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York（1998）；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，第I-III卷Cellis，J. E.编辑（1994）；"Culture of Animal Cells - A Manual of BasicTechnique" by Freshney，Wiley-Liss，N. Y.（1994），Third Edition；"CurrentProtocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.编辑（1994）；Stites等人（编辑），"Basic and Clinical Immunology"（第8版），Appleton & Lange，Norwalk，CT（1994）；Mishell和Shiigi（编辑），"Selected Methods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman和Co.，New York（1980）；可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait，M. J.编辑（1984）；“Nucleic AcidHybridization" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑（1985）；"Transcription andTranslation" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑（1984）；"Animal Cell Culture"Freshney，R. I.编辑（1986）；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,（1986）；"APractical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.,（1984）和"Methods inEnzymology"第1-317卷，Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods AndApplications"，Academic Press，San Diego，CA（1990）；Marshak等人，"Strategies forProtein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHLPress（1996）；所有这些参考文献均通过引用并入，如同它在本文中完全阐述。其他一般参考贯穿本文件提供。其中的程序被认为是本领域众所周知的，并且为了读者的方便而提供。其中含有的所有信息通过引用并入本文。
实施例1
微生物丛日间振荡的跨界控制促进代谢稳态
材料与方法
小鼠– C57Bl/6小鼠购自Harlan，并且在用于实验之前，允许适应当地动物设施两周。除非另有说明，否则小鼠保持在严格的光暗周期下，其中光在6am时打开，并且在6pm时关闭。在所有实验中，使用年龄和性别匹配的小鼠。小鼠在实验开始时为8-9周龄。对于涉及高脂肪饮食的实验，仅使用雄性小鼠。对于所有其他实验，同时使用雄性和雌性小鼠。大便样品新鲜且在小鼠个体的基础上进行收集。新鲜团块收集在管中，在收集后在液氮中立即冷冻，并且贮存于-80℃下直至分离DNA时。除非另有说明，否则10只小鼠/实验组用于从每只小鼠个体收集粪便材料。对于时差的诱导，小鼠每三天在控制光条件（光在6am时打开且在6pm时关闭）和8小时时间差异（光在10pm时打开且在10am时关闭）之间转变。当这些小鼠处于与对照小鼠相同的光暗周期时，完成对时差小鼠进行的实验，并且使授时因子时间（ZT）同步（即时差小鼠的ZT0对应于对照小鼠的ZT0，就如同所有小鼠在样品收集开始时均暴露于相同的光暗条件下）。在食物限制实验中，小鼠在标准光暗条件（6am至6pm）下饲养，但分别仅在光或暗阶段期间获得食物，持续两周。对于抗生素处理，在小鼠的饮用水中给予万古霉素（1 g/l）、氨苄青霉素（1 g/l）、卡那霉素（1 g/l）和甲硝唑（1 g/l）的组合（Rakoff-Nahoum等人，2004）。所有抗生素均得自Sigma Aldrich。在实验的整个持续时间，即在时差诱导开始时起始直至实验终点，给予抗生素。对于涉及限菌小鼠的实验，在无菌隔离器中饲养无菌Swiss Webster小鼠。对于粪便移植实验，将100mg大便重悬浮于1ml PBS中，匀浆化且通过70µm滤过器过滤。接受者小鼠用200µl滤液进行管饲。所有实验程序均由当地IACUC批准。
人样品 - 来自人的大便收集使用无菌棉签进行，并且贮存于室温下直至到达实验室时，DNA提取在所述实验室中进行。人大便的收集由Tel Aviv Sourasky MedicalCenter Institutional Review Board批准。在涉及一天多次收集人大便的实验中，个体每天吃四餐，并且在食物摄入后收集粪便样品。
分类学微生物丛分析 - 根据制造商的说明书，使用MoBio PowerSoil试剂盒，将冷冻的粪便样品加工用于DNA提取。1ng纯化的粪便DNA用于细菌16S rRNA基因的PCR扩增和测序。涵盖16S rRNA基因的可变区2（V2）的扩增子通过使用下述带条形码引物来生成：Fwd5’-NNNNNNNNAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO: 1），Rev 5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 2），其中N代表条形码基础。反应随后以等摩尔比合并，纯化（PCR清洁试剂盒，Promega）且用于Illumina MiSeq测序。采用500 bp配对末端测序。随后如所述的（Caporaso等人，2010；Elinav等人，2011），使用QIIME（Quantitative Insights IntoMicrobial Ecology，wwwdotqiimedotorg）分析流水线来处理读数。简言之，指示对应于每种样品的条形码序列的fasta质量文件和映射文件用作输入，读数通过样品根据条形码进行拆分，使用RDP分类器执行分类学分类，基于序列相似性构建序列的从头分类树，并且制备OTU表。在去除嵌合体后，平均读数数目/粪便样品是34,847。在V2区中共享97%核苷酸序列同一性的序列使用uclust框并成操作分类单位（97% ID OTU），并且使用ChimeraSlayer去除嵌合序列。
宏基因组序列映射。Illumina测序读数使用GEM映射器[23103880]对肠微生物基因目录[20203603]进行映射，使用下述参数：
-m 0.08 –s 0 –q offset-33 –gem-quality-threshold 26
功能指定。根据伴随这些数据库各自的基因对种类的映射，为映射到肠微生物基因目录的读数指定KEGG [10592173，24214961]标识号。随后将基因映射到KEGG模块和途径。对于KEGG途径分析，仅包括其基因覆盖超过0.2的途径。KEGG途径随后通过日间振荡的JTK_周期进行测试。
葡萄糖耐量测试 - 小鼠禁食6小时，并且随后通过口服管饲法给予200µl 0.2g/ml葡萄糖溶液（JT Baker）。在葡萄糖攻击后0、15、30、60、90和120分钟时测定血糖（ContourTM血糖仪，Bayer，瑞士）。
磁共振成像 - 小鼠用与氧（1升/分钟）混合的异氟烷（5%用于诱导，1-2%用于维持）进行麻醉，并且通过鼻罩递送。一旦麻醉，即将动物置于头部固定器中，以确保在磁体内的可重复定位。监测呼吸率并且在实验期间自始至终保持在60–80次呼吸/分钟左右。MRI实验在9.4 Tesla BioSpec Magnet 94/20 USR系统（Bruker，德国）上进行，所述系统配备在三个方向各自上能够产生最高达40高斯/cm的脉冲梯度的梯度线圈系统。所有MR图像均已用正交谐振器线圈（Bruker）获得。MRI方案包括两组冠状和轴向多层面T2加权MR图像。使用多层面RARE序列获得T2加权图像（TR = 2500 ms，TE = 35 ms，RARE因子 = 8），并且矩阵大小为256 x 256，四个平均值，对应于2分40秒/组的图像采集时间。第一组用于获得具有1.00mm层面厚度的21个轴向层面（无间隙）。视野选择为4.2 x 4.2 cm2。第二组用于采集1.00mm层面厚度的17个冠状层面（无间隙）。视野选择为7.0 x 5.0 cm2。
小鼠的总脂肪量和瘦体重通过EchoMRI-100TM（Echo Medical Systems，Houston，TX）进行测量。
代谢研究 - 使用PhenoMaster系统（TSE-Systems，Bad Homburg，德国）测量食物摄入和自发活动，所述PhenoMaster系统由用于自动化测量的灵敏饲喂传感器的组合组成，并且基于光子束的活动监视系统检测且记录动态运动，包括在每个笼中的后腿站立和攀爬。所有参数均连续且同时进行测量。小鼠在数据采集之前在相同笼中单独饲养训练。
基因表达分析 - 组织保存在RNAlater溶液（Ambion）中且随后在Trizol试剂（Invitrogen）中匀浆化。将通过FACS分选的细胞重悬浮于Trizol试剂中。根据制造商的说明书来纯化RNA。一微克总RNA用于生成cDNA（HighCapacity cDNA Reverse Transcription试剂盒；Applied Biosystems）。使用基因特异性引物/探针组（Applied Biosystems）和Kapa Probe Fast qPCR试剂盒（Kapa Biosystems），在Viia7仪器（Applied Biosystems）上进行实时PCR。PCR条件是95℃20秒，随后为95℃3秒和60℃30秒的40个循环。使用deltaCt方法分析数据，其中hprt1充当参考管家基因。
统计分析 - 数据以平均值± SEM表示。对于节律振荡及其幅度的分析，使用非参数测试JTK_周期（Hughes等人，2010），结合18-24小时的窗口用于测定昼夜节律周期性。P值< 0.05被视为显著的。Benjamini-Hochberg程序用于控制错误发现率。JTK_周期结果在补充表中提供。代谢数据中的差异通过ANOVA进行分析，并且进行用于多组比较的事后分析。使用斯氏t检验进行宿主转录物数据之间的配对比较。ANOVA和t检验使用GraphPad Prism软件进行。
结果
为了测定经过一天的过程微生物丛组成的纵向变化，对于两个光暗周期，每6小时对小鼠的粪便微生物丛的进行分类学分析（图1A）。所有小鼠自由进食，饲养在严格的24小时暗光条件下，其中光保持打开共12小时。在改变光条件的时间点（授时因子时间（ZT）12和0，即分别为“黄昏”和“黎明”）以及在暗和光阶段的中点（分别为ZT 18和6）时获取样品。常用的非参数算法JTK_周期用于检测分类数据集中的节律元素（Hughes等人，2010）。引人注目的是，检测到在所有细菌操作分类单位（OTU）的超过15%的丰度中的显著（p<0.05）日间波动（图1B）。波动细菌组的特征在于具有24小时时期的独特峰相位和底值期时间。在24小时周期中节律振荡的细菌属属于丰富的分类学目，即梭菌目、乳杆菌目和拟杆菌目，使得节律振荡的OTU占微生物丛组成的约60%，并且导致日特异性分类学配置的时间（图1C和1D）。例如，在罗伊乳杆菌和Dehalobacterium属物种中发现高度稳健的昼夜节律波动（图1E和1F）。节律性的重现与饲养条件或笼效应无关（数据未示出）。这些结果证实：取样时期越长，取样分辨率越精细，其中连续4天每4小时收集一次粪便样品（图2A-D）。
本发明人接下来分析微生物丛组成中的这些日间振荡是否在一天中对肠道微生物群落的功能有影响。经过两个光暗周期的过程，对每6小时收集的粪便样品的进行鸟枪法宏基因组测序，并且将宏基因组读数映射到肠微生物基因目录（Qin等人，2010）。虽然大多数基因显示在一天的过程中具有稳定的水平，但某些组的基因（例如涉及鞭毛装配和糖胺聚糖降解的基因，图1G和1H）表现出更强的丰度变化。为了测试此类基因波动是否属于日间节律后的功能实体，基因分组成KEGG途径（Kanehisa和Goto，2000；Kanehisa等人，2014），并将JTK_周期算法用于检测伴随24小时节律发生的振荡。有趣的是，具有基因覆盖超过0.2的所有途径中的23%表现出日间节律性（图1I）。在这些中有涉及核酸稳态的途径，包括核苷酸代谢（图2E）、氨基酸代谢（图2F）和粘液降解（图2G）。这些结果表明微生物丛功能的日时间特异性概况的存在。有趣的是，看起来不同的官能团显示出协调的反相波动（图1J）。例如，涉及能量代谢、DNA修复和细胞生长的功能有利地在暗阶段期间执行（图1K），而光阶段的特征在于更高丰度的涉及解毒、运动性和环境感知的“维持”途径。例如，执行鞭毛装配、细菌趋化性和III型分泌中的功能的基因在光阶段时期最丰富（图2H）。
总之，这些结果揭示在小时规模上的微生物丛组成和功能的波动，其遵循24小时节律性，并且导致稳健振荡和日特异性配置的时间。
宿主的功能昼夜节律钟是日间微生物丛振荡所需的
重要的是，尽管缺乏对环境光暗改变的直接微生物暴露，依然存在所观察到的肠微生物丛日间节律性。本发明人因此寻求测定微生物丛组成中的这些节律波动如何在24小时时期生成。宿主的生物钟通过昼夜节律钟的分子组分与环境日夜变化同步。为了测试宿主的昼夜节律钟是否是微生物丛组成中的日间节律性所需的，使用Per1/2 -/-小鼠，其在功能宿主钟上有缺陷（Adamovich等人，2014）。经过48小时，在暗光周期的每个阶段时，进行野生型和Per1/2 -/-小鼠的微生物丛之间的分类学比较，并随后将JTK_周期算法用于鉴定节律要素。值得注意的是，Per1/2 -/-小鼠证实共生细菌丰度中的节律波动几乎完全丧失（图3A），如由拟杆菌目例示的（图3B）。在野生型小鼠中观察到的节律模式被替换为钟缺陷小鼠中的随机丰度波动，伴随振荡细菌分类单位数目的减少（图3C）。
为了测定组成振荡的丧失是否对日间宏基因组概况有影响，对Per1/2 -/-小鼠的微生物丛的进行鸟枪法测序，并且将结果在一天的每个阶段时与野生型小鼠相比较。在野生型小鼠中观察到的宏基因组途径中的日间模式在Per1/2缺陷小鼠中不存在（图3D和3E），而是被替换为途径活性水平在光暗周期自始至终大多不变。在光或暗阶段期间的某些功能的优先活性因此在Per1/2 -/-小鼠中丧失。例如，涉及维生素代谢（图3F）、核苷酸代谢（图3G）、双组分以及分泌系统（图3H）、DNA修复（图4A）、细胞壁合成（图4B）和运动性（图4C）的途径在Per1/2 -/-小鼠中丧失其日间节律性。总之，这些数据表明宿主的功能昼夜节律钟是生成肠道微生物丛的组成和功能的日间波动所需的。
重要的是，本发明人还注意到Per1/2缺陷小鼠中的生态失调，证据是更低的α多样性（图4D），并且当与对照相比较时，其具有独特的肠道群落组成（图4E）。在细菌属中发现了野生型和Per1/2缺陷小鼠之间的微生物丛组成的一些最大差异，所述细菌属在野生型小鼠中经历日间波动（图4F）。为了排除生态失调与日间微生物丛振荡的丧失固有地互联的可能性，分析了其他遗传修饰的生态失调的小鼠的日间微生物丛振荡的存在。选择炎性体衔接子ASC缺陷的小鼠，在近期已描述了该模型以表征功能上重要并已明确定义的生态失调（Elinav等人，2011；Henao-Mejia等人，2012）。确实，野生型和ASC -/- 小鼠的粪便群落通过α和β多样性区分（图4G和4H）。然而，正如通过JTK_周期鉴定的：来自ASC -/- 小鼠的细菌OTU展示出显著的组成振荡（图4I和4J）。因此，可以得出结论微生物丛日间振荡以不同的微生物丛配置存在，并且组成生态失调和日间节律性的丧失可以彼此独立地发生。
微生物丛日间振荡由饲喂时间控制
本发明人接下来着手确定宿主的昼夜节律钟所涉及的机制，该机制生成肠道中的微生物组成振荡。宿主昼夜节律钟控制许多生理功能包括进食（Turek等人，2005）的节律性。相反，饲喂时间在引导和同步外围钟中是关键的（Asher等人，2010；Hoogerwerf等人，2007；Stokkan等人，2001）。啮齿类动物是优先在暗阶段期间进食的夜行动物（图4K）。相比之下，Per1/2 -/-小鼠的特征在于极大减弱的日间饲喂节律，并且全天连续进食（图4L）。因此似乎合理的是正常野生型宿主中的微生物丛节律性通过其日间进食习惯驱动，而Per1/2 -/- 小鼠中减弱的微生物丛节律性是继发于其完全改变的进食时间。为此，进行定时饲喂实验，其中野生型小鼠仅在光阶段期间或仅在暗阶段期间获得食物（图5A、6A和6B）。与预定的饲喂引导外周钟的能力一致，进食习惯的这种逆转颠倒了肠道钟基因的表达模式（图6C）。在两周的连续计划饲喂后，两个连续的光暗周期，每6小时收集一次粪便微生物丛样品。使用JTK_周期算法，发现暗阶段饲喂组中的微生物丛振荡类似于自由进食的小鼠，反映出啮齿类动物的正常的主要夜间食性，图5B-5F、6D）。相比之下，循环OTU通常在暗阶段饲喂组和光阶段饲喂组之间表现出不同阶段（图5C-5F和6D）。大多数循环OTU看起来在改变饲喂时间后表现出约12小时的阶段偏移，表明微生物丛节律由饲喂时间直接控制。此类阶段偏移例如在Bacteroides acidifaciens（图5C）、罗伊乳杆菌（图5D）和消化球菌科（Peptococcaceae）（图5E）的情况下观察到。本发明人还在光阶段饲喂组中观察到了从头或增强的节律性的情况，如通过分节丝状菌（图5F）例示的。这些结果表明，饲喂时间影响微生物丛组成的日间波动，并且共生细菌的丰度的振荡可以由计划饲喂控制。
因而，如果饲喂时间直接控制微生物丛组成的日间波动，则定时饲喂应当拯救昼夜节律钟缺陷的小鼠中的此类波动的丧失。本发明人因此对Per1/2 -/-小鼠进行了相似的食物限制实验，并且在两周的计划饲喂后，在两个光暗周期，每6小时分析一次微生物丛样品。确实，光阶段饲喂和暗阶段饲喂的Per1/2 -/-小鼠均具有显著振荡的细菌OUT，而自由进食的Per1/2 -/-小鼠则没有，表现出之前的无节律性群落组成中的从头节律性生成（图5G和6E）。
类似于经历定时饲喂的野生型小鼠，在Per1/2 -/-小鼠中微生物丛振荡阶段在饲喂时间之后，并且振荡OTU显示出暗阶段饲喂小鼠和光阶段饲喂小鼠之间的阶段偏移（图6E）。例如，在暗阶段饲喂的Per1/2 -/-小鼠中观察到的罗伊乳杆菌（图5H）和拟杆菌属（图5I）的振荡遵循在自由进食或暗阶段饲喂的野生型小鼠中观察到的模式，而光阶段饲喂组显示出相反循环。这些结果证实节律饲喂可以重构Per1/2 -/-小鼠中的OTU振荡（图5J）。
为了进一步确证宿主饲喂节律性在控制微生物丛振荡中的中心性，将来自Per1/ 2 -/-小鼠的微生物丛（缺乏日间波动）移植到无菌小鼠内，所述无菌小鼠在正常光暗条件下饲养（图5K）。在粪便移植后，定植的无菌小鼠表现出规则的夜行活动和代谢模式（图6F和6G）。当用来自野生型小鼠的微生物丛进行对照移植时，也观察到这点（图6H）。值得注意的是，在移植到无菌宿主内一周后，来自Per1/2 -/-小鼠的粪便微生物丛表现出标准化的日间节律性（图5L）。综上，这些结果显示食物摄入的节律性支配微生物丛组成中的每日振荡，并且微生物丛节律性是可以响应于改变的饲喂行为而丧失或再获得的灵活过程。由此，饲喂时间将宿主行为的昼夜节律模式与微生物丛组成和功能的日间波动相关联。
正常睡眠模式的环境破坏诱导微生物丛日间节律性的丧失和生态失调
本发明人接下来寻求测试微生物丛日间节律性的生理学相关性。在人中，昼夜节律钟的扰乱通常发生在轮班工作和长期时差的背景下，其中外部光条件频繁改变并削弱分子钟调整至稳定节律的能力。通过使用其中小鼠每三天暴露于8小时时移的时差模型，在小鼠中模拟这种情况（图7A）。这种模型模拟通过在具有8小时时间差异的国家之间频繁飞行诱导的时差情况，并且同样地模仿在日夜轮班工作之间的定期转换的情况（Huang等人，2011；Yamaguchi等人，2013）。在四周的时差诱导后，小鼠返回起始光周期条件，并且在最后一次时移一天后进行分析。时差的诱导导致宿主节律性身体活动的丧失（图8A和8B）。类似于人，时差还导致不规则模式的食物摄入节律，导致进食的日夜变化的丧失（图7B和8C）。然而，食物摄入的日总量在对照和时差小鼠间未受影响（图7B）。时差的成功诱导还通过外周钟转录物振荡的偏移得到确认（图8D-8F）。
考虑到节律性食物摄入诱导微生物丛的日间波动的发现，本发明人检查了由时差带来的对节律性行为这些破坏是否还损害微生物丛组成的日间振荡。为此，在时差小鼠中每6小时进行一次微生物丛组成的分类学分析，并且通过JTK_周期测试节律性。类似于昼夜节律钟缺陷的小鼠，时差小鼠表现出细菌节律的废除，伴随振荡细菌分类单位的数目减少（图7C-E）。总之，类似于昼夜节律钟的基因破坏，环境诱导的每日振荡模式的废除与微生物丛组成的日间节律性的丧失相关。
因为在基因上钟缺陷的小鼠中观察到生态失调，所以在时移4周后分析了“时差”小鼠的群落组成。实际上，微生物丛组成在对照和时差小鼠之间略微不同（图7F）。当小鼠经过为期16周的连续时移后，生态失调得到增强（图7G），并且那些在野生型小鼠中振荡的分类单位受到影响（图7H），总而言之，这些数据表明哺乳动物暗光周期的慢性环境或基因破坏表现为饲喂节律的显著改变，以及无法维持微生物丛的节律性和组成。
与环境钟破坏相关的生态失调驱动代谢疾病
长期时差和轮班工作是在工业革命后仅最近才在人类中变得普遍的行为模式。这些新近引入的行为模式与肥胖、糖尿病和心血管疾病（在现代人群中平行出现的所有疾病状态）的风险增加相关（Archer等人，2014；Buxton等人，2012；Fonken等人，2010；Scheer等人，2009；Suwazono等人，2008）。因为发现微生物丛振荡的丧失和生态失调与小鼠中的时差相关，所以本发明人着手测试涉及代谢失衡的微生物丛是否与改变的昼夜节律相关。他们首先确定了时差与代谢综合征的表现相关。给时差小鼠和对照小鼠饲喂高脂肪饮食，其中60%的热量能量来自脂肪，从而模仿易患代谢综合征的人类饮食习惯。确实，早在高脂肪饮食实行6周后，与维持在正常昼夜节律节律性上的小鼠相比较，时移小鼠就显示出增强的重量增加和恶化的葡萄糖耐受不良（图9A-9C）。
因为总体食物摄入在野生型和时差小鼠之间并无不同（图7B），所以猜测微生物丛组成中的改变可以促成这种代谢表型。确实，在时差诱导期间用广谱抗生素处理（饮用水中的万古霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和甲硝唑（Fagarasan等人，2002；Rakoff-Nahoum等人，2004））消除了时差小鼠中的肥胖和葡萄糖耐受不良（图9A-9C）。时移小鼠中的肥胖与更高的脂肪量相关，所述更高的脂肪量通过抗生素处理挽救（图9D和9E）。磁共振成像（MRI）揭示脂肪量的这种累积导致经历慢性时移的小鼠中增加的皮下和内脏脂肪沉积（图9J）。
值得注意的是，葡萄糖耐受自身即是昼夜节律变化的基础（Kaasik等人，2013；So等人，2009）。然而，时差组和对照组之间的葡萄糖耐受不良的日间差异的持续存在与测量的每日时间无关（数据未示出）。时差小鼠的夜晚行为和饲喂模式的破坏不受高脂肪饮食或抗生素处理影响（图10A-10F）。虽然高脂肪饲喂在一定程度上的确减少振荡OTU的量（图10G-I），但微生物丛振荡在抗生素处理一周后持续存在（图10J-K）。
为了进一步突出显示时差诱导对重量稳态的不良作用不依赖于饮食组成，与其非时差对照相比较，维持了四个月常规食物饮食的时差小鼠表现出更高的体重和增加的体脂量（图9F）。
为了进一步确证在时差小鼠中观察到的改变的微生物丛在代谢失衡中的作用，将具有对照或“时差”微生物丛配置的粪便转移到无菌Swiss Webster小鼠内。与对照微生物丛接受者相比较，时移微生物丛的接受者显示出增强的重量增加和葡萄糖耐受不良（图9G和9H）。
此外，类似于其相应的供体，时移小鼠的微生物丛的接受者的特征在于身体肥胖的显著增加（图9I）。MRI扫描显示接受来自时差供体的微生物丛的无菌小鼠的体脂增加（图9K）。综上，这些结果证实时差相关的代谢紊乱可通过微生物丛传递。
人微生物丛显示出具有代谢后果的日间振荡和时移相关的生态失调
最后，本发明人检查了在动物模型中的发现是否可以应用于人。他们首先测定连续几天在一天中的多个时间点从两名个体收集的人粪便样品中的微生物丛群落变化（图11A）。使用16S测序，发现占所有细菌OTU中最高达10%的丰度的日间波动（图11B和11C）。
类似于在小鼠中的发现，振荡OTU在一天中具有不同的峰相位和底值期（图11D）。例如，在紫单胞菌属（图11E）、毛螺菌属（Lachnospira）（图12A）和Bulleida属（图12B）中发现稳健振荡。OTU丰度的日间节律性导致日特异性微生物丛群落配置的时间，伴随在观察到的时间段上的重复模式（图12C）。在一天的多个时间进行了人样品的宏基因组分析。发现具有基因覆盖高于0.2的所有途径中的约20%显示出日间丰度模式（图11F），如通过属于二噁英降解途径的基因例示的（图12D）。类似于小鼠中的发现，不同的功能实体在一天的不同时间具有优先丰度。例如，能量代谢和蛋白质生产在光阶段期间优先进行，而解毒途径在晚上最活跃（图11G和图11H）。与小鼠微生物丛相比较，途径活性的峰时期在一天的相反时间发生（图11I），正如由宿主的日间相对于夜晚行为所预期的。总之，正如在小鼠中，这些数据表明，人肠道微生物丛的组分可以经历组成和功能的日间变化。
此外，小鼠的数据表明由异常的睡眠活动周期造成的昼夜节律钟的破坏导致异常的微生物丛组成。应用在小鼠中的时移模型对应于通过在具有8小时时间差异的国家之间飞行诱导的时差。本发明人因此收集来自两名健康人供体的粪便样品，所述健康人供体经历此类飞行诱导的8-10小时时移（从美国中部或西部时区飞往以色列），并且在旅行诱导的时差诱导前一天、在时差期间（着陆后一天）、以及从时差恢复后（着陆后两周）进行分类学分析（图13A）。确实，微生物丛群落显示出时移诱导的组成变化，其在进入时差24小时内被检测到（图13B以及表A和B）。在时差期间获得的微生物丛样品具有更高的相对量的厚壁菌门，其在时差恢复后逆转。
有趣的是，厚壁菌门已与多项人研究中更高的肥胖和代谢疾病倾向相关（Ley等人，2006；Ridaura等人，2013）。为了分析时差个体中的微生物丛变化是否与对代谢疾病的敏感性增加相关，进行了在时差前、时差24小时内和时差恢复后从单独个体获得的人样品进入无菌小鼠内的粪便转移实验（图13C）。
由来自时差个体的微生物丛定植的无菌小鼠展示出增强的重量增加，并且与在时移前获取的样品相比较，在口服葡萄糖攻击后表现出更高的血糖水平（图13D和13E）。这种代谢效应在时差恢复后消除（图13D和13E）。
此外，来自时差状态的微生物丛的无菌接受者比接受来自在时差之前或之后的相同个体的微生物丛的小鼠累积了更多的体脂（图13F）。总之，尽管是初步性的，但这些数据表明人微生物丛的一些共生代表可以经历日间振荡，人中的昼夜节律失调与生态失调相关，并且所得到的微生物群落可以促成代谢失衡。
表A
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表B
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讨论
在本实施例中，本发明人描述了哺乳动物肠微生物丛展示日间振荡，其受进食节律性的支配。如果节律饲喂时间扭曲，正如在遗传钟缺陷或时移诱导的时差的情况下，则微生物丛振荡受损（图14）。小鼠中的长期昼夜节律失调和人中时移诱导的时差导致生态失调和可传递的代谢后果，包括肥胖和葡萄糖耐受不良。这些观察提供了共生群落如何可以使其相互依赖的生理活动与地球物理时钟同步并且这如何促进宏生物的稳态的首个实例。
先前研究在关注微生物丛的时间波动时已考虑到了更长的时帧，并且发现了个体微生物组成随时间推移的显著稳定性（Faith等人，2013；Lozupone等人，2012）。此处，本发明人进行了具有更细微的时间分辨率的纵向微生物丛研究，并且发现具有日间节律的小时规模的波动。值得注意的是，此分析集中于微生物群落组成和宏基因组途径的日间波动。因为细菌昼夜节律钟的分子组分还已被描述为作用于转录和转录后水平（Lenz和Sogaard-Andersen，2011），所以共生微生物丛的一些成员可能拥有又另一个水平的时间依赖性活性控制，除相对丰度中的模式之外，其还可能以节律方式调节细菌活性。
这些结果具有若干意义。首先，它们表明与宿主昼夜节律的长期扰乱相关的代谢失衡，例如在轮班工人和在时差期间发现的那种，具有取决于微生物丛的组成及其对宿主代谢的作用的可传播组分。与宿主昼夜节律的破坏相关的高度多因子发病率是新出现的现代生活方式的疾病，并且基础的病因学知之甚少。本研究将肠道微生物群落的改变鉴定为此类疾病表现的另外驱动力，且认为靶向益生菌或抗微生物疗法可以作为潜在的新预防或治疗方法在易感群体中进行测试。另外，结果获得关于具有昼夜节律钟缺陷的小鼠的较早期研究的新认识（Karatsoreos等人，2011；Rudic等人，2004；Turek等人，2005），因为发现的表型中的一些可能不仅由基因缺陷介导，另外还可以受微生物丛的特征以及下游代谢和炎性后果变化的影响。此处提供的结果因此可以促进未来的研究，以测定昼夜节律失调对微生物丛成形因素的影响，包括宿主的免疫和代谢途径、进食模式、应激激素水平和肠运动。
其次，本研究揭示除了将饮食类型作为微生物丛组成的调节因子之外，食物摄入的时机也在肠道微生物丛生态学成形中起关键作用。当食物摄入是节律性的时，发现最高达15%的共生细菌分类单位（和高得多百分比的丰度）在一天中波动。在宿主外周组织例如肝中，所有转录物中的相似比例以节律方式振荡（Akhtar等人，2002；McCarthy等人，2007；Panda等人，2002；Storch等人，2002；Vollmers等人，2009）。类似于外周钟，微生物丛节律受宿主钟影响，并且在调整代谢过程以适应环境的日间波动中发挥关键作用。确实，近期工作已显示来自微生物丛的信号在肠道上皮细胞的昼夜节律生成中起重要作用（Mukherji等人，2013）。综上，这项近期工作和本研究提出了新出现的新范例，其中在宿主的日间振荡和微生物丛之间存在反馈回路，其具有对相互依存的功能的互相交叉调节。
本文观察到的食物节律性指导微生物丛振荡的在另一方面也可以是值得注意的。作为成熟的概念，外周钟除与光敏中心振荡器同步之外，其还通过饲喂节律引导。基于微生物丛作为宿主基因表达的调节因子的作用已被充分证明，这些结果提出了这样的可能性：微生物丛可能涉及此食物引导过程，并且可能对较早期观察到的与定时饲喂相关的有益代谢效应提出另外的机制解释（Adamovich等人，2014；Damiola等人，2000；Vollmers等人，2009）。在此类情况下，节律性食物摄入可能支配微生物丛振荡，其继而引起对宿主基因表达的节律诱导。因此，微生物丛及其振荡对宿主昼夜节律行为和基因表达的影响展现出令人兴奋的未来研究领域。
另外，在理解聚焦于人和动物微生物丛组成的研究时，应考虑到此处发现的肠道微生物生态学的日间波动。例如，基于本结果，涉及微生物丛研究的人类个体在每天的标准化时间提供其样品可以是可取的，以便排除日间变化对饮食或处理模态的解释的影响。本研究揭示生态失调具有时间维度，并且静态微生物丛比较可能无法完全定论，除非针对此重要的附加变量以控制方式获取样品。微生物丛的短期节律振荡，例如本研究中所述的那种，可以在各种疾病条件下被扩大或破坏，而测定此类“时间生态失调”对微生物丛介导的疾病的影响将是有意思的，所述疾病在每天的不同时期具有不同表现或不同程度的严重性。
最后，由宿主及其固有的微生物丛进化出的共同依赖性日间节律的网络可能赋予宏生物若干生物学优点。动态微生物丛组成可能能够比时间静态组成更好地应对由环境的日间波动强加的挑战。如本研究中证实的，宿主的食物摄入经历昼夜节律波动，其诱发涉及营养物质代谢的细菌物种中的时间变化。因此，微生物丛组分的振荡可以预料营养物质可用性的这些时间变化。宏基因组分析表明某些种类的细菌功能在一天中具有时间偏好（图14）。据发现，涉及生长和能量代谢的途径（例如核酸修复、核苷酸代谢、碳水化合物和氨基酸代谢）与运动性和解毒途径（包括鞭毛装配、趋化性和异生物质降解）是反相的。由于分类学分析表明微生物丛振荡是在节律食物摄入之后，所以此类宏基因组波动可能是专门响应于食物摄入/饥饿阶段的途径占据节律小生境的结果。此外，微生物丛提供了针对外来微生物元素包括肠病原体的定植抗性（Stecher和Hardt，2011），所述定植抗性可能通过在清醒期间进食而引入。由此，将外来微生物元素引入肠道微生物丛构成了每日波动的基础，产生对由共生微生物丛占据小生境的日间节律性的需要。弄清日间微生物丛振荡的作用和调节因子可以对我们寻找健康和疾病中宿主与其微生物环境的共生共存原理的分子解释添加重要的方面，并且因而可以在治疗上利用对微生物丛节律性的调节。
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实施例2
人造甜味剂通过改变微生物丛诱导葡萄糖耐受不良
材料与方法
小鼠– 将C57Bl/6 WT成年雄性小鼠随机分配（并非不知情）至处理组，并且在饮用水中给予商用人造甜味剂（基于糖精、三氯蔗糖或阿斯巴甜）或纯糖精（Sigma Aldrich），并且饲喂高脂肪（HFD D12492， 60% Kcal来自脂肪，Research Diets）或标准多糖正常食物（NC）饮食（Harlan-Teklad）。比较组始终饲喂来自相同批次的饮食。对于抗生素处理，在小鼠的饮用水中给予环丙沙星（0.2gl-1）和甲硝唑（1gl-1）或万古霉素（0.5gl-1）的组合。所有抗生素均得自Sigma Aldrich。成年雄性远交Swiss-Webster小鼠（无菌实验中广泛使用的小鼠品系）充当粪便移植物的接受者，并且饲养在无菌隔离器（Park Biosciences）中。对于粪便抑制实验，在厌氧条件下，将200mg大便（来自小鼠团块或人拭子）重悬浮于5ml PBS中，涡旋3分钟，且允许通过重力沉降2分钟，接受者小鼠用200µl滤液进行管饲，并且在整个实验中维持标准NC饮食和水。
人造和热量甜味剂-将下述商购可得的NAS溶解于小鼠饮用水中，以获得10%溶液：Sucrazit（5%糖精、95%葡萄糖）、Sucralite（5%三氯蔗糖）、Sweet’n Low Gold（4%阿斯巴甜）。10%葡萄糖（J.T. Baker）和10%蔗糖（Sigma Aldrich）溶液用作对照。所施用的溶解于水中的10%商用NAS的剂量大大低于其报告的毒性剂量（对于糖精、三氯蔗糖和阿斯巴甜分别为6.3gkg-1 51、16gkg-1 52和4gkg-1 53）。对于用纯糖精（Sigma Aldrich）进行的实验，根据下述计算，使用1 mgml-1溶液以便满足FDA限定的糖精在人中的ADI（5 mgkg-1）：
Figure 291697DEST_PATH_IMAGE032
。
葡萄糖和胰岛素耐量测试-小鼠在光阶段期间禁食6小时，自由饮水。在饮用方案非水的所有小鼠组中，该方案在禁食期间和葡萄糖或胰岛素耐量测试期间取代水。在用40mg葡萄糖（J.T. Baker）口服饲喂或用0.1Ukg-1胰岛素（Biological Industries）腹膜内注射前一刻以及15、30、60、90和120分钟后，将来自尾静脉的血液用血糖计（Bayer）测量血糖水平。使用ELISA（Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit，Crystal Chem），在GTT起始前一刻收集的血清中测量血浆空腹胰岛素水平。
代谢研究- 使用PhenoMaster系统（TSE-Systems，Bad Homburg，德国）测量食物和饮料摄入以及能量消耗，所述PhenoMaster系统由用于自动化测量的灵敏饲喂传感器的组合和基于光子束检测并记录动态运动（包括在每个笼中的后腿站立和攀爬）的活动监测系统组成。所有参数均连续且同时进行测量。小鼠在数据采集之前在相同笼中单独饲养训练。为了计算总热量摄入，使用下述值：食物3kcalg-1、蔗糖0.3938kcalml-1、葡萄糖 0.4kcalml-1、糖精 0.38kcalml-1、三氯蔗糖 0.392kcalml-1和阿斯巴甜 0.38kcalml-1。
体外厌氧培养- 将来自未经实验的成年WT C57Bl/6雄性小鼠的合并粪便物在厌氧室（Coy Laboratory Products，75% N2、20% CO2、5% H2）中重悬浮于5 ml PBS中，涡旋3分钟，且允许通过重力沉降2分钟。将500 ml上清液加入含有Chopped Meat CarbohydrateBroth，PR II（BD）和500 ml 5mgml-1糖精溶液或等体积PBS的管中。每3天，将500 ml培养物稀释至含有糖精或PBS的新鲜培养基中。在9天后，将培养物用于无菌小鼠的接种。
分类学微生物丛分析 - 根据制造商的说明书，使用MoBio PowerSoil试剂盒，处理冷冻的粪便样品用于提取DNA。将1ng纯化的粪便DNA用于细菌16S rRNA基因的PCR扩增和测序。涵盖16S rRNA基因的可变区2（V2）的~365bp扩增子通过使用下述带条形码引物来生成：Fwd 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO: 3），Rev 5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 4）。随后将反应以等摩尔比合并，纯化（PCR清洁试剂盒，Promega），并且用于Illumina MiSeq测序至至少18000个读数/样品的深度（平均读数/样品139148±5264（SEM））。随后如所述的使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）分析流水线（版本1.8）来处理读数。使用UCLUST算法和greengenes数据库将配对末端连接的序列分组成操作分类单位（OTU）。将在353bp的中值序列长度上具有97%或更大的基于距离的相似性的序列指定至相同OTU。将样品根据处理进行分组。在每个分类水平（门-属+ OTU水平）上分别进行分析。对于每个分类群，在不同组之间进行G测试。将P值针对多重假设检验进行FDR校正。
鸟枪法焦磷酸测序和测序映射- 如先前所述57进行，伴随下述修饰：1ug DNA使用Covaris 5200系统（Covaris,Inc.，Woburn，MA，USA）进行剪切，随后为末端修复、与衔接子连接，8循环PCR扩增（Kappa HiFi）和使用Illumina HiSeq测序至11773345个读数/样品的最低限度深度（平均读数/样品 20296086±637379（SEM），读数长度51 bp）。将Illumina序列读数对人类微生物组项目（Human Microbiome Project）[www.hmpdacc.org/HMREFG/32]的人微生物组参考基因组数据库进行映射，并且使用GEM映射器58与下述参数对肠微生物丛基因目录33进行映射：
-m 3 –s 0 –q offset-33 –gem-quality-threshold 26
微生物物种丰度被测量为对数据库中的单个物种映射的读数分数。由Pathoscope59修改的EM算法用于测定对超过一个物种映射的读数的正确指定。我们仅考虑对于其至少10%的基因组在至少一种生长条件（糖精、水或葡萄糖）下被覆盖（每个覆盖框长10,000-bp）的物种。根据可由目录获得的映射，对肠微生物基因目录映射的读数指定KEGG34,35 ID。基因随后对KEGG途径映射，并且仅包括其基因覆盖超过0.2的途径。为了计算不同细菌对聚糖降解途径的过度呈现的贡献，，对肠微生物基因目录中属于聚糖降解途径的基因映射的读数被提取且再映射HMP参考基因组数据库，寻找具有最高贡献的病菌。
短链脂肪酸定量- 为了测定游离脂肪酸的水平，如先前所述60执行分析型HPLC（Agilent 1260）。简言之，以各种浓度（0.01-0.2 M）制备乙酸盐、丁酸盐和丙酸盐（全部来自Sigma-Aldrich）的标准溶液。这些溶液使用HPLC进行分析，相继使用QTOF-Mass Spec，采用含0.1%甲酸的从0%到60% CH3CN的不连续梯度的溶剂溶液，以获得每种脂肪酸的校正曲线。以类似方式分析用0.1%甲酸溶解的粪便医学样品，以测量全部三种游离脂肪酸的总浓度。
分析人中的NAS消耗和临床参数之间的关系：
将试验报告给临床试验，标识符NCT01892956。该研究并没有必要或涉及随机化。对于临床营养研究中的每名个体，在签署知情同意书后，收集的参数包括BMI、身体周度、空腹血糖水平、一般性问卷、全血细胞计数和一般的化学参数，经过验证的长期食物频率问卷44,61,62。
长期NAS消耗由对关于人造甜味剂的明确问题的答案直接进行定量，参与者在其食物频率问卷中填写所述答案。随后使用斯皮尔曼关联（Spearman correlation）检查NAS消耗和上述参数各自之间的关系，并且针对多重假设检验进行FDR校正。
统计学- 使用下述统计分析：在GTT中，分别地，双因素ANOVA和Bonferroni事后分析用于不同时间点中的组间比较，并且单因素ANOVA和Tukey事后分析或不成对两侧斯氏t检验用于多个或两个组的AUC之间的比较。采用用于相等方差的Bartlett’s或F-检验，并且在比较组的方差之间未观察到显著差异。对于分类数据的比较，使用G检验并且P值对于多重假设检验进行FDR校正。在宏基因组学以及来自人的临床和分类数据中，皮尔森和斯皮尔曼用于关联检验，并且惠特尼U用于比较组间的临床参数。p<0.05在所有分析中视为显著的（*指示p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001）。在所有有关实验对象组中，符号或水平线代表平均值和误差条S.E.M。对于小鼠实验，群组大小匹配所述实验的通常实践。对于人实验，选择样品大小以验证统计分析。不从分析中排除小鼠或数据点。在人研究中，包括注册的所有年龄大于18岁的人。排除标准包括妊娠。
结果
长期食用无热量人造甜味剂加剧葡萄糖耐受不良
为了测定NAS对葡萄糖稳态的作用，我们将糖精、三氯蔗糖或阿斯巴甜的商用制剂加入消瘦的10周龄C57Bl/6小鼠的饮用水中（图15A）。因为所有三种商用NAS均含有~5%甜味剂和~95%葡萄糖，所以我们使用仅饮用水或者补充有葡萄糖或蔗糖的水的小鼠作为对照。值得注意的是，在第11周时，消耗水、葡萄糖和蔗糖的三个小鼠组表现出可比较的葡萄糖耐量曲线，而所有三个NAS消耗小鼠组发生明显的葡萄糖耐受不良（p<0.001，图16A-B）。
因为糖精具有最大效应，所以我们进一步研究其作为原型人造甜味剂的作用。为了确证在肥胖背景下的发现，我们给C57Bl/6小鼠饲喂高脂肪饮食（HFD，60% Kcal来自脂肪），而将食用商用糖精或纯葡萄糖的作为对照（图15B）。如在消瘦状态中，与对照小鼠组相比较，饲喂HFD和商用糖精的小鼠发生葡萄糖耐受不良（p<0.03，图16C和17A）。为了检查纯糖精对葡萄糖耐受不良的影响，我们跟踪10周龄C57Bl/6小鼠的群组，所述小鼠饲喂HFD且通过向其饮用水中加入0.1mgml-1纯糖精提供营养（图15C）。这个剂量对应于在人中的FDA每日容许摄入量（ADI）（5mgkg-1，调整至小鼠重量，参见方法）。与商用糖精一样，这个更低的纯糖精剂量与早在HFD起始后5周开始的葡萄糖耐量受损相关（p<0.0002，图16D和17B）。类似地，与对照相比较，用或不用0.1mgml-1纯糖精提供营养的HFD饲喂的远交Swiss Webster小鼠（图15D）在5周糖精暴露后表现出显著的葡萄糖耐受不良（p<0.03，图17C-D）。
在代谢笼中NC-或HFD-饲喂的小鼠的代谢概况分析包括液体和进食、氧消耗、步行距离和能量消耗，显示了在NAS和对照饮用小鼠之间的相似测量结果（图18和19）。在正常食物（NC）和HFD背景下，空腹血清胰岛素水平和胰岛素耐量在食用NAS或热量甜味剂的所有小鼠组中也是相似的（图20）。综上，这些结果表明在消瘦和肥胖两种状态下，NAS在一系列制剂、剂量、小鼠品系和平行人条件的饮食中均促进代谢紊乱。
NAS诱导的葡萄糖耐受不良由肠微生物丛介导
因为饮食调节肠微生物丛15，并且微生物丛改变对宿主生理学和代谢具有极大影响，所以本发明人测试了微生物丛是否可以调节观察到的NAS效应。为此，他们用含环丙沙星（0.2gl-1）和甲硝唑（1gl-1）的革兰氏阴性靶向的广谱抗生素方案（指定为‘抗生素A’）处理在消瘦和HFD状态下食用商用或纯NAS的小鼠组（图15A、C），同时将小鼠维持在其饮食和甜味剂补充方案上。值得注意的是，在抗生素处理4周后，饮用NAS的小鼠和对照之间的葡萄糖耐受不良中的差异在消瘦（图16A-B）和肥胖（图16D和图17B）两种状态下均被消除。用革兰氏阳性靶向抗生素万古霉素（‘抗生素B’，0.5gl-1，图15A-B）观察到类似效应。这些结果提示NAS诱导的葡萄糖耐受不良由对共生微生物丛的改变介导，其中包含来自多样细菌分类群的贡献。
为了测试微生物丛作用是否是原因性的，通过将来自饮用商用糖精或葡萄糖（对照）的NC饮食的小鼠的微生物丛配置转移到食用NC的无菌小鼠内，进行粪便移植实验（图15E）。值得注意的是，在转移后6天的测定中，与对照（葡萄糖）微生物丛接受者相比较，商用糖精相关微生物丛的接受者显示出葡萄糖耐量受损（p<0.03，图16E和17E）。转移饮用水或纯糖精的HFD消耗小鼠的微生物丛组合物再现了葡萄糖耐受不良表型（p<0.004，图16F和17F）。总之，这些结果确定通过NAS消耗诱导的代谢紊乱由肠道微生物丛介导。
NAS消耗介导对微生物丛的不同的组成和功能改变
本发明人接下来通过测序其16S rRNA基因检查各个小鼠组的粪便微生物丛组成。饮用糖精的小鼠具有不同的微生物丛组成，其与其起始微生物丛配置和在第11周时的所有对照组分开聚簇（图16G）。同样地，来自食用糖精的供体小鼠的大便的GF接受者的微生物丛与饮用葡萄糖的供体大便的GF接受者分开聚簇（图16H）。与所有对照组相比较，食用糖精小鼠的微生物丛展示相当大的生态失调，其中>40个操作分类单位（OTU）的丰度显著改变（对于每个OTU，FDR校正的p值< 0.05，图21）。许多相对丰度增加的分类群属于拟杆菌属和梭菌目，而梭菌目的其他成员连同罗伊乳杆菌构成了呈现不足的分类群中的大多数，并且反映在来自食用糖精的供体大便的GF接受者中（图21，右列）。同样地，在食用纯糖精和HFD的小鼠中观察到生态失调。总之，这些结果证实在各种制剂、剂量和饮食中的糖精消耗诱导具有总体相似的配置的生态失调。
为了研究NAS消耗的功能后果，与消耗葡萄糖或水的对照小鼠相比较，在商用糖精消耗之前和11周之后进行粪便样品的鸟枪法宏基因组测序。为了比较相对物种丰度，测序读数对人微生物组参考基因组数据库进行映射16。与16S rRNA分析一致，糖精处理诱导微生物相对物种丰度中的最大变化（图22A，本文下文的表1；F检验p值<10-10）。这些变化不太可能是水平基因转移或弱覆盖的基因组的人为现象，因为在整个细菌基因组长度的大部分中观察到相对丰度的变化，如通过一种过度呈现的物种（脆弱拟杆菌，图23A）和一种呈现不足的物种（A. muciniphila，图23B）例示的。
表1
Figure 445598DEST_PATH_IMAGE033
Figure 265787DEST_PATH_IMAGE034
Figure 618271DEST_PATH_IMAGE035
本发明人接下来将宏基因组读数对肠微生物基因目录进行映射，将读数映射平均地划分至不止一种基因，并且随后将基因分组至KEGG途径中。检查具有基因覆盖超过0.2的途径（115个途径），途径丰度的变化在食用商用糖精和食用葡萄糖的小鼠之间呈负相关（R=-0.45，p<10-6，图22B）。因为商用糖精由95%葡萄糖组成，所以这些结果表明糖精极大地影响微生物丛功能。值得注意的是，在食用糖精小鼠中过度表现的途径包括聚糖降解途径的剧烈增加（图22C-D），在该途径中聚糖发酵以形成各种化合物包括短链脂肪酸（SCFA）17。这些途径显著增强能量收获并且其富集先前已与小鼠11和人18中的肥胖相关联，其中SCFA可能充当宿主中的从头葡萄糖和脂肪合成的前体和/或信号转导分子19。为了鉴定作为基础的细菌，本发明人通过其起源细菌注释对聚糖降解途径映射的每一个读数。这些途径中的许多增加可归于源自5个革兰氏阴性和阳性物种的读数，其中两个属于拟杆菌属（图22E），与16S rRNA分析中观察到的食用糖精小鼠中的这个属的丰度急剧增加一致（图21）。因而，与对照失用葡萄糖小鼠相比较，在大便中测量的SCFA丙酸盐和乙酸盐的水平在食用商用糖精小鼠中明显更高（图22F-G），反映出通过具有和不具有NAS暴露的长期葡萄糖消耗介导的差异效应。丁酸盐水平在组间是相似的（数据未示出）。
除聚糖降解之外，并且与用T2DM对人的先前研究一致13,20，其他途径在食用糖精小鼠的微生物组中富集，包括淀粉和蔗糖代谢，果糖和甘露糖代谢，以及叶酸、甘油酯和脂肪酸生物合成（本文下文表2），而葡萄糖转运途径在食用糖精小鼠中表现不足（图23C）。消耗HFD和纯糖精的小鼠的特征在于多重富集途径（图23D），包括抗坏血酸和醛糖二酸盐代谢（先前报告为在瘦素受体缺陷的糖尿病小鼠中富集21）、脂多糖生物合成（与代谢内毒素血症有关22）和细菌趋化性（先前报告为在肥胖小鼠中富集11）。
表2
Figure 560819DEST_PATH_IMAGE036
Figure 998753DEST_PATH_IMAGE037
Figure 419370DEST_PATH_IMAGE038
Figure 829623DEST_PATH_IMAGE039
总之，糖精消耗导致微生物丛中的不同饮食依赖性功能改变，包括由若干增加的分类群促成的聚糖降解中的NC相关扩张，最终导致升高的大便SCFA水平，这是微生物能量收获增加的特征11。
葡萄糖耐受不良直接由糖精诱导的肠微生物丛调节介导
为了测定糖精是否直接影响肠微生物丛，在糖精（5mgml-1）或对照生长培养基的存在下，本发明人在严格厌氧条件下（75% N2、20% CO2、5% H2）培养来自未经实验的小鼠的粪便物。通过管饲将来自温育第9天的培养物施用给无菌小鼠（图24A）。含糖精的体外大便培养物诱导拟杆菌门的增加和厚壁菌门中的减少（拟杆菌门89%相对于70%，厚壁菌门6%相对于22%，图24B）。与接受对照培养物的无菌小鼠相比较，将这种体外糖精处理的微生物丛配置转移到无菌小鼠内导致显著更高的葡萄糖耐受不良（p<0.002）（图25A和24C。类似于补充有糖精的厌氧培养的组成，这种培养配置的无菌接受者的特征在于拟杆菌属成员的过度表现，以及几个梭菌目的表现不足（图25B和表3）。
表3
Figure 677493DEST_PATH_IMAGE040
Figure 602724DEST_PATH_IMAGE041
鸟枪法宏基因组测序分析揭示体外糖精处理诱导与食用商用糖精的小鼠中发现的那些相似的功能改变（图21C，p<10-4），其中聚糖降解途径在两个背景下均为高度富集的。在两个背景下均高度富集的其他途径包括涉及鞘脂代谢的先前显示为在非肥胖糖尿病小鼠的微生物组中过度表现的那些23，以及常见的表现不足的途径包括葡萄糖转运（图25C和图23C，右列）。
综上，这些结果证实糖精直接调节微生物组的组成和功能且诱导生态失调，导致哺乳动物宿主中的下游葡萄糖耐受不良表型。
在人中的NAS消耗与葡萄糖耐量受损相关
为了研究NAS在人中的效应，比较在进行中的临床营养研究中从381个非糖尿病个体（44%男性和56%女性；年龄43.3±13.2）收集的数据中的长期NAS消耗（基于经过验证的食物频率问卷，参见方法）和各种临床参数之间的关系。发现在NAS消耗和几种代谢综合征相关临床参数之间的显著正相关（本文下文表4），包括增加的重量和腰臀比（向心性肥胖的量度）；更高的空腹血糖、糖基化血红蛋白（HbA1C%）和葡萄糖耐量测试（GTT，葡萄糖耐量受损的量度）和升高的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT，其是肝脏损伤的量度，所述肝脏损伤在这个背景下可能是继发于非酒精性脂肪肝病）。此外，当比较高NAS消费者（40名个体）与非NAS消费者（236名个体，图26A，秩和p<0.002）的亚组时，指示经过前3个月的葡萄糖浓度的糖基化血红蛋白（HbA1C%）的水平显著增加。当针对BMI水平进行校正时，这种增加保持显著（秩和p<0.015）。在这个群组中，表征172名随机选择的个体中的16S rRNA。值得注意的是，发现在多重分类学实体和NAS消耗之间的统计上显著的正相关，包括肠杆菌科（皮尔森r=0.36，FDR校正的p<10-6）、δ变形球菌纲（皮尔森r=0.33，FDR校正的p<10-5）和放线菌门（皮尔森r=0.27，FDR校正的p<0.0003，表5）。重要的是，未检测到OTU丰度和BMI之间的统计上显著的关联，说明上述关联不是由于NAS消费者的不同BMI所造成的。
表4
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表5
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最后，作为对人NAS消耗和血糖控制之间的关系是否有因果关系的初始评价，对通常不食用NAS或含NAS食物的七名健康志愿者（5名男性和2名女性，年龄28-36）随访一周。在这周期间，参与者在第2-7天时食用FDA的每日最大容许摄入量（ADI）的商用糖精（5mgkg-1）作为等价于120mg的3个分份日剂量，并且通过连续血糖测量和每日GTT进行监测（图27A）。值得注意的是，即使在这个短期7天暴露期中，在食用NAS后5-7天，大多数个体（7个中的4个）也发生显著更弱的升糖反应（下文称为‘NAS应答者’），与其在第1-4天时的个体升糖反应相比较（图26B-C和27B，p<0.001）。3名NAS无应答者无一表现出改善的葡萄糖耐受（图26B、D和27C）。
如通过16S rRNA分析评价的，在食用NAS之前和之后（分别为图26E和27D），NAS应答者的微生物组配置与无应答者均不同地聚簇。此外，来自无应答者的微生物组的特征在于在研究周期间组成很少变化，而在NAS应答者中观察到巨大的组成变化（图26F和27E）。为了研究这种NAS诱导的生态失调是否是产生葡萄糖耐受不良的原因，将来自NAS暴露之前（第1天，D1）或之后（第7天，D7）的大便从两个NAS应答者和两个NAS无应答者转移到饲喂NC的无菌小鼠的组内。实际上，与注明使用由相同的NAS应答个体转移的D1大便的应答相比较，来自NAS应答者的NAS暴露后（D7）大便的转移在接受者GF小鼠中诱导显著的葡萄糖耐受不良（图26G和27F，P<0.004和27G-H，P<0.02）。相比之下，从两个NAS无应答者转移到GF小鼠内的D7大便诱导正常葡萄糖耐受，这与用来自相同‘无应答’个体的D1大便转移的小鼠无法区别（图26H和图27I-K）。用‘应答者’微生物组移植的GF小鼠再现了部分供体糖精诱导的生态失调，包括拟杆菌属脆弱拟杆菌（拟杆菌目）和魏斯氏菌属食物魏斯氏菌（乳杆菌目）相对增加20倍，以及分节丝状菌（梭菌目）增加~10倍（图27I）。
结论
概括起来，我们的结果表明在小鼠和人两者中的NAS消耗均增强葡萄糖耐受不良的风险，并且这些不利的代谢效应由微生物丛的组成和功能的调节介导。值得注意的是，在食用NAS后改变的细菌分类群中的几个先前与人中的T2DM相关13,20，包括拟杆菌属的过度表现和梭菌目的表现不足。革兰氏阳性和阴性分类群两者均促成NAS诱导的表型（图16A-B），并且富含聚糖降解途径（图21），先前与增强的能量收获联系（图22C-D）11,24。这表明精细的种间微生物协作可以在功能上协调肠生态系统，且促成在趋异的环境条件（例如正常食物相对于高脂肪饮食条件）下重要的群落活性。另外，我们证明食用糖精小鼠的宏基因组富含先前显示在小鼠和人中与糖尿病23或肥胖11相关的多重另外途径，包括鞘脂代谢和脂多糖生物合成25。
来自短期和长期人类NAS消费者群组的结果（图26、图27和表4-5）表明人类个体表现出对NAS的个人化应答，这可能起源于其微生物丛组成和功能中的差异。我们的研究中注意到的变化可以进一步在食用不同人饮食的小鼠中得到证明26。人造甜味剂被广泛引入我们的饮食内，目的在于减少热量摄入且使血糖水平标准化，而不牺牲人的‘甜食喜好’。连同在人营养中出现的其他主要转变，NAS消耗的增加与肥胖和糖尿病流行的急剧增加一致。我们的发现表明NAS可能已直接促成增强它们自身所旨在对抗的那些流行病。此外，我们的结果指出需要开发针对个体定制的新营养策略，同时综合肠微生物丛的组成和功能的个人化差异。
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实施例3
肠微生物丛生物地理学和功能的日间波动全面编程宿主昼夜节律转录组
材料与方法
小鼠：C57Bl/6小鼠购自Harlan，并且在用于实验之前，允许适应当地动物设施2周。小鼠保持在严格的光暗周期下，其中光在6am时打开，并且在6pm时关闭。在所有实验中，使用年龄和性别匹配的小鼠。小鼠在实验开始时为8-9周龄。一般地，同时使用雄性和雌性小鼠。大便样品、粪便内容物和组织样品新鲜且在小鼠个体的基础上进行收集。新鲜样品收集在管中，在收集后在液氮中立即冷冻，并且贮存于-80℃下直至分离RNA或DNA时。在食物定时实验中，小鼠在标准光暗条件（6am至6pm）下饲养，但分别仅在光或暗阶段期间获得食物，持续2周。对于抗生素处理，在小鼠的饮用水中给予万古霉素（0.5 g/l）、氨苄青霉素（1g/l）、卡那霉素（1 g/l）和甲硝唑（1 g/l）的组合。所有抗生素均得自Sigma Aldrich。抗生素连续给予共一周。对于涉及限菌小鼠的实验，将无菌Swiss Webster小鼠饲养在无菌隔离器中。所有实验程序均由当地IACUC批准。
RNA-seq：将组织保存在RNAlater溶液（Ambion）中，且随后在Trizol试剂（Invitrogen）中匀浆化。RNA根据制造商的说明书进行纯化。将400 ng总RNA用于文库制备。mRNA用12 μl Dynabeads寡核苷酸（dT）（Life technologies）进行捕获，并且根据制造商的指导进行洗涤。纯化的信使RNA在70℃下用10 μl 10 mM Tris-Cl pH 7.5进行洗脱。cDNA由每种样品的1μl mRNA生成。每种样品的cDNA数量通过肌动蛋白B基因的qPCR进行评估，并且随后获取每种样品的等价量的mRNA用于RNAseq文库构建。文库构建在96孔板形式中执行。首先，为了打开二级RNA结构且允许RT引物的退火，样品在72℃下温育3分钟，并且立即转移至4℃。随后，RT反应混合物（10 mM DTT、4 mM dNTP、在50 mM Tris-HCl（pH 8.3）中的2.5U/μl Superscript III RT酶、75 mM KCl、3 mM MgCl2）加入96孔板的每个孔内，并且将反应混合。96孔板随后向下旋转且移动到循环仪（Eppendorf）内用于下述温育：在42℃下2分钟、在50℃下50分钟、在85℃下5分钟。将索引样品与等价量的cDNA合并，并且用1.4x体积的SPRI珠纯化产物。文库完成且通过12循环PCR反应进行扩增，使用0.5 μM P5_Rd1和P7_Rd2引物和PCR预混合物（Kapa Biosystems）。正向引物含有Illumina P5-Read1序列，并且反向引物含有P7-Read2序列。扩增的合并文库用0.7x体积的SPRI微珠进行纯化，以去除引物剩余物。文库浓度用Qubit荧光计（Life Technologies）进行测量，并且平均分子大小用2200TapeStation仪器（Agilent）进行测定。文库使用Illumina HiSeq 1500进行测序。读数如先前所述（Lavin等人，2014）进行分析，并且针对总读数数目进行标准化用于在所有样品间的相等覆盖。仅考虑分析具有超过10个读数/样品的基因。
细菌DNA的定量：通过充分冲洗肠道管腔以去除非粘附共生细菌收获管腔和粘膜粘附群落。使用MoBio PowerSoil试剂盒从管腔和粘膜部分中提取DNA。使用来自大肠杆菌（E.coli）K12的已知DNA浓度的标准曲线计算DNA浓度。使用SYBR快速混合物（KapaBiosystems），使用鉴定V6 16S基因的不同区域的引物进行16S qPCR。随后将样品中的细菌的绝对数目约计为细菌的样品/DNA分子量中的DNA量。
扫描电子显微镜检查：用含有在0.1 M二甲胂酸钠中的2%戊二醛和3% PFA的固定剂灌注小鼠。结肠样品充分洗涤掉粪便物且固定1-2小时。样品在二甲胂酸钠缓冲液中清洗三次，并且在1%四氧化锇中后固定1小时，在1%乙酸双氧铀中染色再一小时，随后清洗，脱水且使用临界点干燥进行干燥。样品随后进行金包被且在ULTRA 55 FEG（ZEISS）中察看。对于图像定量，计数在10个随机选择的视野/样品上的细菌数目且求平均值。
代谢组学：代谢组学分析通过Metabolon，Inc（Morrisville，NC）进行。样品通过超高性能液相层析-串联质谱法（UPLC-MS/MS）和气相层析-质谱法（GC-MS）进行分析。平台的LC/MS部分基于Waters ACQUITY超高效液相层析（UPLC）和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精准质谱仪，其与加热电喷雾电离（HESI-II）源和在35,000质量分辨率下操作的Orbitrap质量分析器接口。使样品提取物干燥，随后在酸性或碱性LC-相容溶剂中重构，所述溶剂各自含有固定浓度的8个或更多个注射标准，以确保注射和层析一致性。使用单独的专用柱（Waters UPLC BEH C18-2.1x100 mm，1.7 µm），在两次独立注射中，使用酸性阳离子最佳化条件分析一个等分试样，并且使用碱性阴离子最佳化条件分析另一等分试样。使用水和含有0.1%甲酸的甲醇，从C18柱中梯度洗脱在酸性条件下重构的提取物。使用甲醇和水，然而，连同6.5mM碳酸氢铵，从C18中类似地洗脱碱性提取物。使用由水和乙腈与10mM甲酸铵组成的梯度，在从HILIC柱（Waters UPLC BEH Amide 2.1x150 mm，1.7 µm）中洗脱后，第三等分试样经由负电离进行分析。MS分析使用动态洗脱在MS和数据依赖性MS2扫描之间交替，并且扫描范围为80-1000 m/z。在干燥氮下使用双三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺衍生之前，将用于GC-MS分析的样品在真空下干燥至少18小时。将衍生的样品在5%二苯基/ 95%二甲基聚硅氧烷熔融石英柱（20 m x 0.18 mm ID；0.18 um薄膜厚度）上分离，使用氦作为载气和在17.5分钟时期内从60°到340℃的温度速变。样品在Thermo-Finnigan Trace DSQ快速扫描单四极杆质谱仪上进行分析，使用电子碰撞电离（EI）且在单位重量分辨力下操作。扫描范围为50–750 m/z。将原始数据提取，鉴定峰且进行QC加工。化合物通过与纯化标准的文库条目或重现性未知适体比较进行鉴定。此外，生物化学鉴定基于三个标准：在所提出的鉴定的窄RI窗内的保留指数，与文库准确质量匹配至+/- 0.005 amu，以及在实验数据和真实标准之间的MS/MS正向和反向得分。MS/MS得分基于实验谱中存在的离子与文库谱中存在的离子的比较。使用曲线下面积鉴定峰。对于跨越多天的研究，进行数据标准化步骤以校正由仪器日间调谐差异所造成的变化。对于分析，依据原始面积计数对值进行标准化，并且其后重新标定以将中值设为等于1。
分类学微生物丛分析：通过将结肠连续洗涤除掉其管腔内容物，随后将粘膜层在液氮中速冻，来获得粘附细菌群落。根据制造商的说明书，使用MoBio PowerSoil试剂盒，处理冷冻样品用于提取DNA。将1ng纯化的粪便DNA用于细菌16S rRNA基因的PCR扩增和测序。涵盖16S rRNA基因的可变区1/2（V1/2）的扩增子通过使用下述带条形码引物来生成：Fwd5’-NNNNNNNNAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO: 1），Rev 5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’（SEQ ID NO: 2），其中N代表条形码基础。随后将反应以等摩尔比合并，纯化（PCR清洁试剂盒，Promega）且用于Illumina MiSeq测序。采用500 bp配对末端测序。内部脚本用于装配配对末端对数。在所有实验中实现90%的装配率。随后使用QIIME（Quantitative InsightsInto Microbial Ecology，www.qiime.org）分析流水线来处理读数（Caporaso等人，2010）。简言之，将指示对应于每种样品的条形码序列的fasta质量文件和映射文件用作输入，读数通过样品根据条形码进行拆分，使用RDP分类器执行分类学分类，并且制备OTU表。我们采用使用Greengenes数据库的开放参考OTU映射。在359bp总配对末端装配的读数长度上不允许非匹配核苷酸。进行稀疏化以排除具有不足够的读数/样品计数的样品。在V2区中共享97%核苷酸序列同一性的序列框并成操作分类单位（97% ID OTU）。对于β多样性，根据基于1,000个读数/样品的前两个主要坐标来标绘未加权unifrac测量结果。
宏基因组序列映射：Illumina测序读数使用GEM映射器（Marco-Sola等人，2012）对肠微生物基因目录（Human Microbiome Jumpstart Reference Strains等人，2010）进行映射，使用下述参数：-m 0.08 -s 0 -q offset-33 -gem-quality-threshold 26。
功能指定。根据伴随基因目录的基因对种类映射，为对肠微生物基因目录映射的读数指定KEGG（Kanehisa和Goto，2000）标识号。基因随后对KEGG模块和途径进行映射。仅考虑具有超过10个指定读数的基因。对于KEGG途径分析，仅包括其基因覆盖超过0.2的途径。随后通过日间振荡的JTK_周期测试KEGG途径。
统计分析 - 数据以平均值± SEM表示。对于节律振荡及其幅度的分析，使用非参数测试JTK_周期（Hughes等人，2010），允许24小时用于测定昼夜节律周期性。对于节律代谢产物、宏基因组含量和转录物的检测，p<0.05并且q<0.2被视为显著的。使用Vennerable包在R中生成Chow-Ruskey图解。关于KEGG途径富集分析的超几何测试使用DAVID（Huang da等人，2009）完成。
结果
微生物丛生物地理学定位的日间节律
肠道微生物丛经历组成和基因含量的节律振荡，但这些功能微生物振荡通过其影响宿主的机制仍然是难以捉摸的。因为最强地影响宿主的共生细菌被认为定位在紧密接近于肠道微生物表面，所以本发明人寻求研究微生物组日间节律性的生物地理学方面。他们因此分析了在两天的过程中，在上皮粘附共生细菌的丰度波动（图28A），并且用常用的非参数算法JTK_周期（JTK_）分析节律性（Hughes等人，2010）。所有小鼠均自由进食且饲养在严格的24小时光暗条件下，其中光保持打开12小时（授时因子时间（ZT）0-12）。在每个时间点，充分清洁近侧结肠以除掉管腔内容物，并且仅分离粘膜粘附细菌，随后经由qPCR的DNA定量。定植上皮小生境的细菌数目经历显著的日间变化，其中共生上皮层粘附在暗阶段中是最高的（图28B，p=3x10-7，JTK_周期），而细菌的管腔数目保持恒定（图29A）。扫描电子显微镜检查（SEM）成像证实了与肠道上皮紧密相关的共生体的量的每日波动（图28C、29B和29C）。SEM图像提示粘附细菌的分类学组成在每天的不同时间是不均匀的（图28C）。他们因此对在每天的不同时间收获的上皮相关群落进行16S rDNA测序。确实，粘附细菌的组成经历显著的日间波动，使得上皮相关共生体的β多样性在连续光暗周期过程中节律性改变（图28D、28E和30A-C；关于UniFrac距离的振荡p=4x10-13）。因此，与在两者之间的任何其他时间点相比较，在任何时间点定位至肠道粘膜的群落组成更类似于24小时后呈现的那种。某些共生体对于上皮附近的定位在一天中具有不同的优先时间（图28F），包括瘤胃球菌属、 Mucispirillum属和乳杆菌属（分别为p<10-6和p<10-5，图28G）。因此，在相对丰度（图28G-28I）和绝对丰度（图30D-I）中，宿主粘膜均暴露于细菌的日间波动数目和物种。值得注意的是，某些细菌物种的峰和谷丰度相差超过100倍，如通过Mucispirillum schaedleri例示的（图30F），其为已知定植在小鼠粘膜层的共生体。总之，这些结果证实肠微生物丛经历生物地理学分布的振荡，导致对于每天的不同时间粘膜相关共生体特征的周期概况。
肠道代谢组的日间节律
为了测定日间节律性是否在宿主-微生物组相互作用内发生，其中强烈和密切的通讯主要通过代谢产物的交换和感知发生，在两个光暗周期的过程中，每6小时通过野生型小鼠的代谢产物概况分析来测定肠道代谢组的时间动态（图28A）。使用JTK_周期，当使用p<0.05和q<0.2作为阈值时，发现所有检测到的代谢产物中的18%经历24小时节律中的波动（图31A）。振荡代谢产物属于多样化学组，包括碳水化合物（图31B和31C）、维生素（图31D和31E）、氨基酸（图31F和31G）、脂质（图31H）、核苷酸（图32A和32B）、肽（图32C和32D）、以及异生物质（图32E-32F）。高度稳健的日间波动例如在碳水化合物木糖、葡萄糖和乳酸盐（p<0.007，图31B和31C）、微生物丛依赖性必需维生素生物素（p<10-5，图31E）、以及氨基酸脯氨酸和天冬酰胺（p<0.0004，图31F和31G）中发现。这些结果表明宿主-微生物丛相互作用具有由下述组成的多面性节律性：组成（Thaiss等人，2014b）、宏基因组（图32I）和生物地理学（图28A-I）微生物组节律性，如通过周期性RNA-seq定量的宿主转录组节律性（图31J）和代谢组学节律性（图31K），其整合宿主、其微生物组和饮食输入的日间模式。在一些情况下，可以在这个多层节律环境的不同组分之间发现直接联系。例如，编码生物素生物合成中的最后两个酶促步骤的微生物基因（bioD和bioB）的节律丰度伴随着生物素的阶段节律管腔丰度（图32G和32H）。
微生物丛编程结肠转录组振荡。
为了全面测定微生物丛作用于宿主的振荡过程的调节作用，给小鼠施用广谱抗生素，测定微生物丛耗尽对宏生物日间波动的影响（图33A）。预期地，抗生素处理急剧减少了上皮粘附细菌的数目且消除了剩余群落中的任何节律性，如通过定量PCR和SEM测定的（图33B、33C、34A和34B）。因此，上皮相关共生体的节律分类学组成通过抗生素处理被消除（图3D和34C-34E）。例如，罗伊乳杆菌在饮用抗生素的小鼠中丧失其特征性相对丰度峰和谷阶段（图34E）。为了测定微生物耗尽和振荡丧失对宿主的作用，在两个光暗周期的过程中，每6小时进行一次来自对照和抗生素处理小鼠的结肠组织的比较RNA测序，使用在每个组中的每个ZT时的5只小鼠（图33A）。使用JTK_周期评估转录物概况中的节律性，其中阈值为p<0.05和q<0.2。两个组的特征均在于可比较数目的振荡宿主转录物（图35A），表明总体肠道转录昼夜节律性不依赖于肠道微生物丛的存在。然而，与对照相比较，振荡基因程序的鉴定在抗生素处理的小鼠中显著不同（图33F）。总的来说，在定植小鼠中振荡的总共3133种基因中的2102种在抗生素处理的小鼠中丧失其节律性。相比之下，1194种基因具有抗生素处理小鼠的从头振荡，而仅1031种节律转录物在两个组之间共享（图33F-3I）。在共享转录物中有涉及核心昼夜节律钟和肠道管家功能的基因，表明宿主外周钟机制的功能并非真正依赖于完整微生物丛的存在（图33J、35B）。在不存在微生物丛的情况下丧失其振荡的转录物主要属于核苷酸代谢和细胞周期途径，以及微生物丛代谢产物下游活化的宿主代谢途径，例如代谢短链脂肪酸的途径和粘液产生途径（图33K）。微生物组依赖性宿主振荡转录物还包括涉及免疫受体信号转导的基因（图33K和35C），这与肠道上皮细胞中关于节律TLR信号转导的微生物控制的较早期报告一致（Mukherji等人，2013）。然而，最值得注意的是在微生物丛耗尽后获得节律性的功能性，其包括主要代谢途径如TCA循环和氧化磷酸化（图33L），如通过细胞色素c氧化酶复合物的成员例示的（图35D）。因此，结肠代谢活性的总体时间坐标在微生物丛耗尽和对照小鼠之间不同，其中节律功能在每天的不同时间达到峰值（图35E）。为了排除抗生素处理自身的潜在混淆效应，这些结果在无菌条件下饲养的无菌小鼠中得到证实。实际上，类似于抗生素处理的小鼠，无菌小鼠表现出其周期转录组的大量改变，而循环元件的总数目与对照可比较（图35F-35I）。因此，KEGG功能性丧失且获得节律性，类似于抗生素处理的小鼠（数据未示出）。综上，这些数据表明微生物丛重新编程节律宿主转录组，以改变代谢和免疫程序的时间顺序，所述程序中的许多与其自身共生小生境功能直接有关。
协同的宏生物振荡由饲喂时间驱动
为了测定节律食物摄入是否控制共生体的节律性活动，进行了定时饲喂实验。在这些实验中，小鼠（其在暗阶段期间优先消耗食物，图36A）仅在暗阶段期间或仅在光阶段期间随意进行饲喂（图37A、36B和36C）。对不同预定饲喂组的小鼠，进行鸟枪法宏基因组测序、生物地理学评价和宿主转录组定量（图37A）。虽然总体微生物组节律性不受改变的饲喂时间影响（图37B），但逆转的饲喂时间造成了基因丰度振荡的阶段偏移（图37C和37D），如通过细菌半乳糖胺硫酸酯酶例示的（图36D）。因此，节律宏基因组模块和途径遵循食物摄入时间，且表现出自由进食和光阶段饲喂的小鼠之间的反相峰相位和底值期（图36E和36F）。由饲喂时机紧密控制的功能元素包括细菌粘液降解（图37E、37F和36G）和运动性（图36H），潜在解释了饲喂时间如何确定微生物丛易位和粘液代谢的节律，且从而调节上皮生物地理学粘附的日间波动。实际上，逆转的饲喂时间还颠倒节律性上皮粘附的模式（图37G），如通过经过一天过程的附着共生体的qPCR所测量的。
节律饲喂还重新编程结肠转录组，如先前在肝脏注意到的（Vollmers等人，2009），同时保持振荡元素的恒定总数目（图37H和37I）。与微生物组中的阶段偏移同步，结肠的节律转录组还遵循饲喂时间（图37J-37L、36I和36J）。总之，这些结果提示节律营养物质可用性指导微生物丛活性和生物地理学定位中的功能日间振荡，类似于其与宿主微生物丛互利共生有关的多重宿主途径的节律性活动的控制。
饲喂时间、微生物丛和宿主遗传学共同协调循环转录组
考虑到微生物丛和饲喂时间两者均能够编程结肠转录组振荡，本发明人接下来解决对宿主昼夜节律功能的两类环境影响之间的相互作用。为了测定饲喂节律性破坏诱导和微生物组耗尽诱导的宿主转录组重编程之间的相似性和相互依赖性，进行连同和不连同另外的抗生素处理，在定时饲喂的小鼠之间独特和共享的振荡转录组的四重比较（图37A）。一般地，振荡转录物的数目跨越所有条件均为稳定的（数据未示出）。为了鉴定每个组中共享和独特的循环元素，使用4阶Chow-Ruskey比较（图38A），其揭示几个特点。首先，定时饲喂和微生物丛耗尽两者均产生独特和共享的宿主转录物的独立模式（图38A）。300种转录物仅是微生物丛依赖性的，因为其循环与饲喂条件无关（具有在颠倒饲喂时间之间的阶段偏移），但在抗生素处理后丧失振荡（图38B）。这些基因包括免疫途径的成员，例如干扰素-γ受体（图38C和38D），以及涉及屏障功能的基因，例如封闭蛋白-2（图38E和38F）。其次，转录物中仅少数涵盖所有条件振荡。事实上，根据JTK_周期算法显示显著振荡的仅44种转录物在所有条件之间是共享的（图38A）。这些转录物的KEGG途径分析揭示这个组富含核心分子钟的成员（图38A和38G-38J），指出分子钟自身维持稳健的振荡，与饲喂和微生物组可用性条件无关，而下游靶中的大多数仅在适当的饲喂和定植条件下振荡。第三，在光阶段饲喂、抗生素处理的小鼠中独特循环的基因数目比所有其他组低约50%，指出微生物丛在响应饲喂时间逆转的循环转录组的重编程中具有作用。支持这一概念，在所有四个组中振荡的典型钟成员在暗阶段和光阶段饲喂小鼠之间阶段偏移，但当小鼠也用抗生素进行处理时，这种阶段偏移丧失。例如，当两个组中的微生物丛被抗生素处理破坏时，暗阶段和光阶段饲喂组之间的Cry1振荡中的阶段偏移在很大程度上减弱（图38G和38H）。针对其他钟基因观察到了相同现象（图38I和38J）。这些结果揭示微生物丛活性对肠中的节律转录维持具有出乎意料的大影响，包括循环元素的鉴定和阶段分布两者。
本结果指出微生物丛的存在对于结肠转录组振荡的维持是关键的。为了理解微生物丛在驱动宿主昼夜节律活性的必要性是仅起源于其存在还是起源于其日间波动活性，本发明人利用下述发现：不存在功能宿主昼夜节律钟的情况下，组成微生物振荡停止存在，但可以通过节律饲喂恢复（Thaiss等人，2014b）。他们因此对Per1/2缺陷小鼠进行了计划饲喂实验，所述Per1/2缺陷小鼠缺乏分子钟的必需组分（图39A），并且测试了在随意和定时饲喂的条件下，这些小鼠的宏基因组和结肠转录组振荡。虽然自由进食的Per1/2 -/- 小鼠缺乏在其宏基因组中的振荡活性，但微生物组的日间节律通过定时饲喂诱导（图39B-39D），如通过细菌氢化酶hyoA例示的（图39E）。相应地，在预定饲喂后，在Per1/2缺陷小鼠中，微生物组的功能模块获得24小时节律中的时间组构（图39F）。与在肝样品中的先前发现一致（Vollmers等人，2009），定时饲喂还恢复Per1/2 -/- 小鼠中的几百种结肠转录物中的振荡（图39G）。然而，值得注意的是，这些转录物的日间活性的再获得依赖于完整微生物丛，因为定时饲喂的Per1/2 -/- 小鼠的抗生素处理废除了这些宿主振荡的恢复（图39G）。其饲喂诱导的节律性诱导依赖于微生物丛的转录物包括涉及粘膜免疫应答的多重基因，包括细胞因子的IL-1家族及其信号转导途径的成员（Il33、Il1r1、Myd88、Socs1）。这些数据表明微生物丛振荡是维持大量结肠基因的转录物振荡所必需的。
微生物丛编程肝脏钟
最后，我们试图确定通过日间波动肠微生物组介导的对肠道振荡转录组程序的作用是否可以系统性传递。此类远程微生物组诱导对宿主昼夜节律性的调节作用具有潜在的病理生理学关联性。我们选择集中于微生物组日间活性对肝昼夜节律性的影响，因为对肝脏生理学和肝疾病的微生物组影响已在多项近期研究中得到证明，而关于此类远程效应中的许多机制仍是难以捉摸的（Henao-Mejia等人，2012；Qin等人，2014）。为了评价肝脏转录组重编程是否受微生物丛破坏影响，用广谱抗生素处理小鼠一周，未经实验或抗生素处理的小鼠的肝脏节律转录使用JTK_周期进行概况分析，使用p<0.05和q<0.2作为阈值（图33A）。类似于结肠，抗生素介导的微生物丛破坏重编程肝脏转录物振荡，而节律元素的总数目仍与对照具有可比性（图40A和41A）。正如在肠中，典型钟组分维持其节律（图40B和41B-D），并且同样地，肝脏管家功能、代谢功能和解毒功能在抗生素暴露后持续循环（图41B、41E和41F）。总共1796种转录物中的629种丧失振荡概况（图40C），包括涉及氧化磷酸化及其他分解代谢途径的基因（图40D）。例如，在抗生素处理一周后，编码磷酸葡萄糖异构酶-1的基因丧失可检测的节律性（图41G）。相比之下，1825种转录物发生从头节律性（图40E），其中许多涉及脂肪酸、核酸和氨基酸代谢（图40F）。由于在循环转录组中的这些大量改变，肝脏代谢活性的正常时间顺序被部分扰乱且被从头振荡程序所替换，其中峰活性与非抗生素处理条件下相比处于显著不同的时间下（图40G）。例如，涉及氨基酸代谢、胰岛素信号转导和PPAR信号转导的途径具有阶段偏移的活性峰（图40G）。因此，出乎意料的是，在局部肠道环境和全身两者中，均发现微生物丛对于维持代谢活性的稳态每日继续是关键的。
在这个实例中，日间节律性被鉴定为宿主微生物丛共生的调节中的必需组分。微生物丛振荡活性的两种新元素已得到鉴定，其提供了关于其功能重要性的机理解释：生物地理学定位中的振荡和代谢产物分泌模式。节律协调的功能例如细菌运动性和粘膜降解建立确定微生物丛成员的粘膜粘附的时间模式，诱导其中宿主在每天的不同时间定期暴露于不同的细菌数目、物种、功能和产物的稳态状态。在应答中，宿主施加与相应的微生物活性同步的节律代谢和免疫程序（图40H）。一旦稳态定植被取消，如在抗生素处理的情况下，微生物节律性就在其所有层包括组成和粘膜粘附中丧失，其导致相应的宿主节律性的解偶联。令人惊讶的是，这种微生物丛宿主昼夜节律解偶联的整合部分涉及肠道和肝中的宿主转录振荡的大量从头发生，潜在满足了由节律性食物摄入施加的需要，其通常通过日间微生物丛活性缓冲（图40H）。共生微生物配偶体或其正常循环行为的丧失即使在远离微生物定植部位的位置处也会扰乱哺乳动物宿主的瞬时转录组协调。
这些发现具有许多重要的意义。首先，代谢产物的交换越来越多地识别为微生物丛和宿主之间的主要通讯手段，从而产生代谢和免疫串扰和相互依赖性的全宏生物网络。这通过代谢产物诱导的宿主生理学调节和通过先天性免疫系统受体的微生物存在的分子识别例证。所有此类功能关键地依赖于微生物丛的生物地理学定位，并且因此构成肠道生态系统中的微生物丛分层基础的调节机制可能是理解宿主内的微生物定植如何建立且维持的关键。本发现证实每天的时间剧烈影响所有三种参数：每天的给定时间的特征在于代谢组、微生物组成和粘膜粘附的独特概况，导致时间特异性宿主转录程序突出显示在不同日间时期时的不同免疫和代谢功能。源自微生物的分子还可以成形系统昼夜节律代谢组学模式，其近期已发现具有节律行为，通过日间促成必须微生物生产或调节的化合物如必需氨基酸和维生素。
因而，本结果表明在目前视为静态的稳态中的宿主微生物组相互作用，事实上可以视为不断改变的，仍紧密偶联且高度调节‘波动稳态’的状态。此外，可以说明这些日间波动和组成微生物特性在测定针对微生物丛稳态丧失（例如在暴露于抗生素期间）的宿主应答中也是重要的。因此，本结果表明，在解释微生物丛调节饮食的下游效应和医学干预时，需要考虑微生物丛功能的动力学。
其次，在相应的宿主和微生物代谢活性之间协调的日间节律性的鉴定为我们对宿主微生物共同进化的理解添加了出乎意料的方面。宿主转录物振荡的微生物诱导可能以至少两种方式对于宏生物生态系统在功能上是有利的。一方面，通过使其代谢活性与微生物组的日间波动同步，宿主可以优化必需的源自微生物丛的化合物例如营养物质和维生素的摄取和处理。另一方面，协调的宏生物代谢和免疫活性可以理想地适合于满足通过营养物质、无毒异生物质和病原体的引入对生态系统施加的波动。此外，沿结肠粘膜在定植条件中的小时规模变化产生关于共生体的动态小生境，并且可以通过在稳定定植状态周围的短期振荡支持长期群落稳定性。像这样，在这项研究中鉴定的协调的宏生物活性可以提供关于通过微生物丛的活性小生境构建的实例，其在24小时中周期性出现。
此外，本研究提供了关于下述概念的支持：外周钟中的转录组振荡的昼夜节律程序依赖于环境信号，并且提供了关于这些信号整合的新角度。先前研究已指出食物摄入的时机和饮食类型决定外周转录组的昼夜节律编程。目前已发现通过诱导且压制转录组循环，微生物丛在转录组振荡的协调中起同样重要的作用，共同地且不依赖于饲喂时间（图38A）。此外，定时饲喂已显示恢复缺乏功能分子钟的小鼠中的转录组振荡。已确定微生物丛促成这种效应，并且这种饲喂依赖性振荡的再获得至少部分依赖于微生物组振荡。因此，本文有关宿主转录物振荡的微生物编程的发现可能将许多迄今为止描述的通过食物重编程的外周转录组的实例联系起来，提供了这样的整合的理解：对宏生物的日间活性的饮食影响可以通过微生物丛组成和功能的调节间接发挥。值得注意的是，据发现，仅少量宿主转录物不依赖于饮食和微生物影响而振荡（图5A），其中大多数属于昼夜节律钟的核心成员。因此，本发现提出了这样的模型：在该模型中，分子钟经历自持续节律性，而转录组的大部分中的节律性的下游诱导可以依赖于环境信号的适当整合（图41H）。
最后，本研究提供了抗生素使用对哺乳动物生理学的多面性作用的新认识。大量抗生素暴露对微生物组的频繁破坏已变成现代人类医学实践和工业化食物制备两者的标志。除充分说明的对微生物组多样性和对致病性感染的敏感性的直接不利影响之外，此类暴露也与各种不利的代谢紊乱相关（Ayres等人，2012；Cox等人，2014；Ng等人，2013；Zeissig和Blumberg，2014），然而，对于这些间接系统抗生素效应仍知之甚少。发现抗生素介导的多个水平的微生物丛日间节律性的破坏与一天中结肠和肝脏宿主代谢活性两者的正常时间顺序的扰乱相关，生成与稳态每日活性概况相比较的时间去同步化。此发现表明抗生素对宿主生理学的作用远远超过对微生物组直接发挥的那些（例如药物抗性和机会致病菌感染的出现），以及直接的抗生素介导的不利效应。相反，抗生素诱导的生态失调使微生物和宿主协调的节律性解偶联，导致宿主转录活性的大量丧失和获得。在肠和肝两者中注意到的途径活性的这种失调可以导致功能改变，其范围从受损和不当的肝脏解毒、分解代谢和合成功能到改变的免疫，可能导致长期后果例如儿童期抗生素治疗和易肥胖之间的关联（Cox等人，2014）。
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实施例4
食物摄入的定时对微生物组的影响
材料与方法
16名升糖反应受损和健康参与者参与了为期三周的饮食干预实验。第一周是概况分析周，由其计算两种个人化测试饮食：（1）一整周的预测具有“良好”（低）的餐后血糖应答的个人化饮食；和（2）一整周的预测具有“糟糕”（高）的餐后血糖应答的个人化饮食。本发明人评估与“糟糕”周给予的个人化饮食相比较，“良好”周的个人化饮食是否的确引发更低的血糖反应。
在实验之前，饮食学家计划如下共6天的个人定制的饮食：每个参与者决定他或她一天内吃多少餐和多少热量。6天内的所有餐均为不同的，并且在每一天，消耗相同餐数和热量，其中在两餐之间具有至少3小时的间隙。餐的内容物通过参与者决定，以匹配其味道和日常饮食。例如，参与者可以选择如下一天吃5餐的热量：300卡路里早晨、200卡路里早午餐、500卡路里午餐、200卡路里零食和800卡路里晚餐。参与者决定关于每餐类别的6个不同选项（实例中的5种餐食类别：早晨、早午餐、午餐、零食和晚餐），伴随饮食学家的帮助，以确保所有早餐均是等热量的，具有10%的最大限度偏差。
实验由从参与者获取血样和人体测量开始，将参与者与连续葡萄糖监测仪连接且开始6天饮食，同时在研究时间期间记录所有进餐。在实验第7天时，参与者执行标准（50g）口服葡萄糖耐量测试，这之后他通常在那天全天正常吃饭。被称为“混合周”的第一周使参与者暴露于各种食物，其后确定哪些餐是相对“良好”和“糟糕”的，即哪些餐分别导致低和高葡萄糖应答。使用连续血糖监测仪（Medtronic iPro2）监测葡萄糖血液水平，具有高的5分钟时间分辨率。对于每餐测量血糖上升和血糖增量曲线下面积（AUC）。选择从低到高反应的餐食，其中选择每一餐种类中最佳和最糟的两餐，且标记为良好餐和糟糕餐。
在选择良好和糟糕餐后，参与者继续另外两周实验，其为测试周。“良好周”仅包含良好餐，并且“糟糕周”仅包含预测为引发“糟糕”（高）的血糖反应的餐。一周包含6天饮食和如上所述的一天50克葡萄糖耐量测试。周的次序随机选择，并且参与者和饮食学家均不知晓周的次序。在三周后，比较周之间的葡萄糖水平。
迄今为止，16名个体完成了实验，其中10名具有升糖反应受损，而6名是健康的。
结果
将“良好”和“糟糕”餐正确分类：发现在两个测试周测试的绝大多数的餐显示与预测一致的血糖反应（低/高）。
与“糟糕”周相比较，在“良好”周中观察到餐后平均AUC的显著改善。这个结果对于健康和葡萄糖耐量受损的个体两者均成立，其中在后面一组中，“良好”和“糟糕”周之间的差异更大（图42）。
结果还表明在餐后的血糖反应显示出日间模式（图43）。当通过类别中的所有餐的平均AUC应答进行线性拟合时，可以看出早餐AUC趋势相对低，随后为午餐，并且晚餐具有AUC的最高趋势。这个趋势在通过一餐中的碳水化合物或热量标准化后保持（图44A-B）。
尽管本发明已与其具体实施方案结合描述，但显而易见的是许多替代方案、修饰和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。相应地，预期包含落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修饰和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入本文说明书内，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请特别且个别指出通过引用并入本文相同。另外，在本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。就使用部分标题的程度而言，它们不应解释为必要的限制。
序列表
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 单链DNA寡核苷酸
<400> 4
tgctgcctcc cgtaggagt 19

Claims (14)

1.一种测定健康个体中对无热量物质的耐受的方法，其中所述无热量物质选自食物添加剂、食物防腐剂、人造甜味剂和治疗剂，其包括：
（a）测定所述健康个体的样品中的肠道微生物组的标记，所述健康个体已经接受所述无热量物质；
（b）比较所述健康个体的所述肠道微生物组的所述标记与致病性肠道微生物组的至少一种参考标记，其中当所述健康个体的所述肠道微生物组的所述标记在统计上显著类似于所述致病性肠道微生物组的所述参考标记时，表明所述健康个体对所述无热量物质不耐受；以及
（c）提供关于所述健康个体可以耐受的所述无热量物质的量的建议，其中所述方法不是用于诊断疾病。
2.权利要求1的方法，其还包括比较所述健康个体的所述微生物组的所述肠道标记与至少一种非致病性参考标记，其中当所述健康个体的所述肠道微生物组的所述标记在统计上显著不同于所述至少一种非致病性参考标记时，表明所述健康个体对所述无热量物质不耐受。
3.权利要求1的方法，其中所述致病性肠道微生物组来源于对所述无热量物质不耐受的健康个体。
4.权利要求2的方法，其中所述非致病性微生物组来源于对所述无热量物质耐受的健康个体。
5.权利要求1的方法，其中所述人造甜味剂包含选自糖精、甜菊醇和阿斯巴甜的组分。
6.权利要求1的方法，其中微生物组的所述标记是所述微生物组的微生物的存在或水平。
7.权利要求1的方法，其中微生物组的所述标记是所述微生物组的微生物基因的存在或水平。
8.权利要求1的方法，其中微生物组的所述标记是由所述微生物组的微生物生成的产物。
9.权利要求8的方法，其中所述产物选自mRNA、多肽、碳水化合物和代谢产物。
10.权利要求8的方法，其中所述产物包括短链脂肪酸（SCFA）。
11.权利要求1的方法，其中关于致病性微生物组的所述参考标记的数据存在于第一数据库中，而关于所述健康个体的微生物组的所述标记的数据存在于第二数据库中。
12.权利要求11的方法，其中所述第一数据库包含关于致病性微生物组的多种参考标记的数据。
13.权利要求1的方法，其还包括在测定前处理所述样品。
14.权利要求13的方法，其中所述处理包括生成核酸样品。
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