BRPI0712084A2 - detecÇço de insuficiÊncia cardÍaca diastàlica por identificaÇço do perfil plasmÁtico de protease e de inibidor de protease - Google Patents

Abstract

DETECÇçO DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA DIASTàLICA POR IDENTIFICAÇçO DO PERFIL PLASMATICO DE PROTEASE E DE INIBIDOR DE PROTEASE São propostos no presente documento métodos de detecção e previsão de insuficiência cardíaca diastólica e de previsão de insuficiência cardíaca congestiva compreendendo a identificação do perfil de protease e de inibidor de protease.

Description

DETECÇÃO DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA DIASTÕLICA POR IDENTIFICAÇÃO DO PERFIL PLASMÃTICO DE PROTEASE E DE

INIBIDOR DE PROTEASE

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS CORRELATOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 60/798.953, depositado em 9 de maio de 2006 e do Pedido Provisório U.S. No. 60/893.781, depositado em 8 de março de 2 007, que são integralmente incorporados ao presente documento a título de referência.

DECLARAÇÃO NO TOCANTE A PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

A presente invenção foi produzida com suporte governamental com o número de contrato VA Merit Review (Spinale 0001) Research Service of the Department of Veterans Affairs, e com os números de contrato POl-HL- 48788, ROl-HL-5 916 5 e M01-RR-01070-251 concedido pelo National Heart, Lung and Blood Institute. 0 governo tem determinados direitos à invenção.

FUNDAMENTOS

Apesar dos avanços significativos em medicamentos para pressão sangüínea alta (hipertensão) e o reconhecimento de que a hipertensão é um fator de risco significativo para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, esta condição continua a ser uma doença cardiovascular importante nos Estados Unidos. Um problema específico para a identificação de pacientes com risco de desenvolver insuficiência cardíaca hipertensiva é a falta de um teste rápido para se identificar os pacientes que têm alterações que ocorrem no músculo cardíaco propriamente dito secundárias à hipertensão. Com uma hipertensão prolongada, a massa muscular e o tamanho do coração aumentam, mas isto pode não ocorrer até mais tarde no processo da doença. Um evento específico e crítico no progresso para a doença cardíaca hipertensiva e a insuficiência cardíaca é o fato de que ocorre um aumento da fibrose no interior do músculo cardíaco propriamente dito.

A base molecular para tal alteração continua desconhecida

SUMÁRIO SUCINTO

De acordo com a finalidade da invenção, conforme incorporada e descrita em linhas gerais no presente documento, a presente invenção se refere a padrões específicos de MMPs/TIMPs que ocorrem nos pacientes que estão desenvolvendo insuficiência cardíaca hipertensiva que foram realmente base para se prever a presença de uma função cardíaca anormal - até agora somente possível de se identificar com testes caros e de difícil aplicação. O padrão específico de MMPs/TIMPs é usado em métodos para a identificação de pacientes com risco de desenvolver insuficiência cardíaca secundária a hipertensão e na iminência de desenvolvê-la.

Vantagens adicionais do método e das composições descritos serão apresentadas em parte na descrição que segue e em parte serão compreendidas a partir da descrição ou podem ser aprendidas colocando em prática o método e as composições descritos. As vantagens do método e das composições descritos serão realizadas e atingidas por meio dos elementos e combinações especialmente apontados nas reivindicações apensas. Deve ficar subentendido que tanto a descrição geral acima como a descrição detalhada que segue são dados a título de exemplo e explicação somente e não são restritivos da invenção conforme reivindicada. DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS

Os desenhos anexos, que são incorporados à presente especificação e constituem uma parte dela, ilustram diversas modalidades do método e das composições descritos e juntamente com a descrição servem para explicar os princípios do método e das composições descritos.

A Figura 1 mostra a detectabilidade de MMP-13 em controles de referência com ou sem hipertensão e em pacientes com LVH com ou sem insuficiência cardíaca crônica. A detectabilidade de MMP-13 foi reduzida significativamente em pacientes com LVH * = ρ < 0,05 em comparação com os controles de Referência sem Hipertensão, # = ρ < 0,05, em comparação com os controles de Referência com Hipertensão, Δ = ρ < 0,05 em comparação com pacientes com LVH sem CHF.

A Figura 2A mostra a relação entre o inibidor tecidual de metaloproteinase 1 de matriz (TIMP-I) e a relação volume/massa do ventrículo esquerdo (LV) . Níveis mais elevados de TIMP-I foram associados com valores mais baixos de relação volume/massa de LV indicando um remodelamento concêntrico mais acentuado, r = -0,56, p< 0,05. A Figura 2B mostra a relação entre o inibidor tecidual de metaloproteinase-1 de matriz (TIMP-I) e onda de preenchimento rápido (E') da imagem por Doppler Tecidual (TDI). Níveis mais elevados de TIMP-I foram associados com valores mais baixos de E' indicando uma taxa de relaxamento diastólico LV mais lenta, r = -0,41, p< 0,05.

A Figura 3 mostra a estrutura e a função de coração normal em comparação com o coração com insuficiência cardíaca diastólica.

A Figura 4 mostra resultados de ecocardiografia e medições de MMP-9, MMP-2, e de TIMP-I plasmáticos para controles com e sem hipertensão (HTN) e pacientes com hipertrofia ventricular com ou sem insuficiência cardíaca congestiva (CGF).

A Figura 5 mostra onda de preenchimento rápido (E' ) de imagem por Doppler Tecidual (TDI) relativa a níveis de TIMP-I.

A Figura 6 mostra níveis plasmáticos de MMP-13 em controles e em pacientes com hipertrofia ventricular esquerda. A Figura 7 mostra a porcentagem de pacientes com ou sem insuficiência cardíaca congestiva e com níveis plasmáticos de TIMP-I acima ou abaixo de 12 0 0 ng/mL que também têm hipertrofia ventricular esquerda.

A Figura 8 mostra curvas de calibração para MMP-9, MMP-13, TNFa e IL- 6 conforme determinadas por análise multiplex.

A Figura 9 mostra o algoritmo para se usar níveis de MMP e TIMP para se determinar o tratamento de pacientes com hipertensão. A Figura 9A mostra esquematicamente para o tratamento de paciente com visita clínica não emergente agendada por hipertensão documentada. A Figura 9B mostra esquematicamente para o tratamento de paciente com visita clínica não emergente com hipertensão de nova ocorrência. A Figura 9C mostra esquematicamente para o tratamento de paciente que apresenta sinais ou sintomas que possam ser causados por HF.

DESCRIÇÃO DETALHADA

0 método e as composições descritos podem ser entendidos com mais facilidade fazendo-se referência ã descrição detalhada abaixo de modalidades específicas e ao Exemplo incluído ali e às Figuras e a sua descrição anterior e seguinte.

São descritos materiais, composições e componentes que podem ser usados para o método e composições descritos, podem ser usados em conjunto com eles, podem ser usados na sua preparação ou são produtos deles. Estes e outros materiais são descritos no presente documento, e deve ficar subentendido que, quando combinações, subconjuntos, interações, grupos etc. destes materiais são descritos que, embora referência específica a cada um destes diversos compostos individuais e a cada uma de suas combinações coletivas e a cada permutação destes compostos possa não ter sido explicitamente descrito, cada um destes compostos, combinações e permutações é especificamente reivindicado e descrito no presente documento. Se um peptídeo, por exemplo, for descrito e discutido e uma série de modificações que possam ser feitas a uma série de moléculas que incluem o peptídeo for discutida, cada uma destas combinações e permutações de peptídeo e as modificações que são possíveis são especificamente reivindicadas, a não ser que seja especificamente indicado em contrário. Portanto, se uma classe de moléculas A, B e C forem descritas assim como uma classe de moléculas D, EeF, e for descrito um exemplo de uma molécula de combinação A-D7 então mesmo que cada uma delas não seja individualmente citada, cada uma delas é reivindicada individual e coletivamente. Assim, neste exemplo, cada uma das combinações Α-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D7 C-E, e C-F é especificamente reivindicada e deve ser considerada como descrita a partir da descrição de A, B e C; D, EeFea combinação do exemplo A-D. De modo análogo, qualquer subconjunto ou combinação destes é também especificamente reivindicada e descrita. Portanto, os subgrupos de Α-E, B-F, e C-E, por exemplo, são reivindicados especificamente e devem ser considerados como descritos a partir da descrição de A, B e C; D, EeF; e a combinação do exemplo A-D. Este conceito se aplica a todos os aspectos do presente pedido, inclui, sem limitação, etapas nos métodos de produção e no uso das composições descritas. Portanto se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser conduzidas, fica subentendido que cada uma destas etapas adicionais pode ser conduzida com qualquer modalidade específica ou combinação de modalidades dos métodos descritos e que cada tal combinação é especificamente reivindicada e deve ser considerada como descrita.

Os versados na técnica observarão, ou serão capazes de determinar usando somente experimentação de rotina, que muitos equivalentes às modalidades específicas do método e das composições descritos no presente documento. tais equivalentes se destinam a ser abrangidos pelas reivindicações abaixo.

Deve ficar subentendido que o método e as composições descritos não são limitados a nenhuma metodologia, protocolos e reagentes específicos descritos, uma vez que estes podem variar. Deve também ficar subentendido que a terminologia usada no presente documento se destina à descrição de modalidades específicas somente e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção que será limitada somente pelas reivindicações apensas.

A não ser que seja expressamente declarado em contrário, não se pretende absolutamente que qualquer método apresentado no presente documento seja considerado como exigindo que as suas etapas sejam conduzidas em uma ordem específica. Conseqüentemente, nos casos em que uma reivindicação de método não citar realmente uma ordem a ser seguida por suas etapas ou se não for especificado em contrário especificamente nas reivindicações ou nas descrições que as etapas devem ser limitadas a uma ordem específica, não se pretende absolutamente que uma ordem seja de nenhum modo subentendida. Isto vale para qualquer possível base não expressa para interpretação, incluindo: assuntos de lógica no tocante ao arranjo das etapas ou do fluxo operacional; significado comum derivado da organização gramatical ou da pontuação; e o número ou tipo de modalidades descritas no relatório. Mais especificamente, as MMPs e as TIMPs cujas quantidades são medidas podem ter essa medidas tomadas em qualquer ordem.

A. Definições

A não ser que seja definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados que são habitualmente compreendidos pelos versados na técnica à qual o método e as composições descritos pertencem. Embora qualquer método e qualquer material análogo ou equivalente aos descritos no presente documento possa ser usado na colocação em prática ou no teste do método e composições da presente invenção, os métodos, dispositivos e materiais especificamente úteis são conforme descrito. As publicações citadas no presente documento e o material para o qual eles são citados são especificamente incorporados ao presente documento a título de referência. Nada no presente documento deve ser considerado como uma admissão de que a presente invenção não tem direito a se antecipar a tal divulgação devido a uma invenção anterior. Nenhuma admissão é feita de que qualquer referência constitui técnica anterior. A discussão de referências declara o que os seus autores declaram e os requerentes se reservam o direito de desafiar a precisão e pertinência dos documentos citados.

Deve se observar que, conforme usado no presente, e nas reivindicações anexas, as formas no singular "um", "uma" e "o" e "a" incluem uma referência no plural, a não ser que o contexto claramente determine em contrário. Portanto, por exemplo, uma referência a "um peptídeo" inclui uma multiplicidade de tais peptídeos, uma referência a "o peptídeo" é uma referência a um ou mais peptídeos e a seus equivalentes conhecidos dos versados na técnica, e assim por diante.

"Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento, circunstância ou material descrito subseqüentemente pode ou não ocorrer ou estar presente e que a descrição inclui casos em que o evento, circunstância ou material ocorre ou está presente e casos em que ele não ocorre ou não se encontra presente.

Os limites podem ser expressos no presente documento como sendo "de aproximadamente" um valor específico, e/ou "a aproximadamente" um outro valor específico. Quando tais limites são expressos, uma outra modalidade inclui de um valor específico e/ou a outro valor específico. De modo análogo, quando valores são expressos como aproximações, com o uso de "aproximadamente" precedendo-o, deve ficar subentendido que o valor específico forma uma outra modalidade. Deve ainda ser subentendido que os pontos extremos de cada um dos limites são significativos tanto em relação ao outro ponto extremo, como independentemente do outro ponto extremo. Deve também ficar subentendido que há uma série de valores divulgados no presente documento, e que cada valor é também divulgado nos termos do presente como sendo de "aproximadamente" aquele valor específico além do valor em si. Se for divulgado o valor "10", por exemplo, então "aproximadamente 10" é também divulgado. Deve também ficar subentendido que quando um valor é divulgado como sendo "inferior a ou igual a o valor", "superior ou igual ao valor" e limites possíveis entre os valores são também divulgados, conforme apropriadamente subentendido pelos versados na técnica. Se o valor "10" for divulgado, por exemplo, então "inferior ou igual a 10" assim como "superior ou igual a 10" são também divulgados. Deve ficar subentendido que em todo o pedido, os dados são fornecidos em uma série de diferentes formatos e que estes dados, representam pontos extremos e pontos de partida, e limites para qualquer combinação dos itens de dados. Se um dado específico "10", por exemplo, e um dado específico 15 forem divulgados, fica subentendido que superior a, superior ou igual a, inferior a, inferior ou igual a, e igual a 10 e 15 são considerados como divulgados assim como entre 10 e 15. Deve também ficar subentendido que cada unidade entre duas unidades específicas é também divulgada. Se 10 e 15 forem divulgados, por exemplo, então 11, 12, 13 e 14 são também divulgados.

Em toda a descrição e reivindicações deste relatório, o termo "compreender" e variações da palavra, tais como "compreendendo" e "compreende", inclui "incluindo sem limitação" e não se destina a excluir, por exemplo, outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.

"Indivíduo" inclui, sem limitação, animais, plantas, bactérias, vírus, parasitas e qualquer outro organismo ou entidade que contenha ácido nucléico. O indivíduo pode ser um vertebrado, mais especificamente um mamífero (um ser humano, cavalo, porco, coelho, cão, ovino, caprino, primata não humano, bovino, gato, cobaia ou roedor, por exemplo) , um peixe, um pássaro ou um réptil ou um anfíbio. O indivíduo pode ser um invertebrado, mais especificamente um artrópode (insetos e crustáceos, por exemplo) . 0 termo não indica uma idade ou sexo específico. Portanto, indivíduos adultos e recém-nascidos, assim como fetos, masculinos ou femininos são destinados a serem abrangidos. Um paciente se refere a um indivíduo portador de uma doença ou distúrbio. O termo "paciente" inclui indivíduos humanos e veterinários.

Conforme definido no presente, "amostra" se refere a qualquer amostra obtida de um organismo. Exemplos de amostras biológicas incluem amostras de fluidos corporais e tecidos. A fonte da amostra pode consistir em meios fisiológicos como sangue, soro, plasma, leite do peito, pus, raspas de tecido, lavagem, urina, tecido tal como nodos Iinfãticos ou semelhantes.

Em todo o pedido, são dadas como referência diversas publicações. As descrições destas publicações integralmente são incorporadas ao presente documento a título de referência a este pedido para descrever de modo mais completo o estado da técnica à qual a invenção pertence. As referências descritas são também individual e especificamente incorporadas ao presente documento a título de referência ao presente documento para o material contido neles que é discutido na sentença em que se apóia na referência,

B. Métodos

1. Insuficiência Cardíaca

A insuficiência congestiva do coração (CHF) também denominada insuficiência cardíaca congestiva (CCF) ou simplesmente insuficiência do coração é uma condição que pode resultar de qualquer distúrbio cardíaco estrutural ou funcional que prejudica a capacidade do coração de se preencher ou de bombear uma quantidade suficiente de sangue em todo o corpo. Assim, o método descrito pode ser usado para o tratamento de qualquer forma de insuficiência cardíaca.

Como nem todos os pacientes têm uma sobrecarga de volume na ocasião da avaliação inicial ou subseqüente, o termo "insuficiência cardíaca" é preferido em vez do termo mais antigo "insuficiência cardíaca congestiva". As causas e os fatores que contribuem para a insuficiência cardíaca congestiva incluem os seguintes (com referência específica aos lados esquerdo (L) ou direito (R)): histórico familiar genético de CHF, doença cardíaca isquêmica infarto do miocárdio (doença arterial coronária), infecção, ingestão de álcool, vermes cardíacos, anemia, tirotoxicose (hipertireoidismo), arritmia, hipertensão (L), coartação da aorta (L) , estenose da aorta/regurgitação (L) , regurgitação mitral (L), estenose pulmonar/hipertensão pulmonar/embolia pulmonar todos levando a doença cárdio-pulmonar (R) e da válvula mitral (L).

Há muitos diferentes modos de se categorizar a insuficiência cardíaca, incluindo: o lado do coração envolvido, (insuficiência cardíaca à esquerda contra insuficiência cardíaca à direita) , se a anomalia é devida à contração ou ao relaxamento do coração (insuficiência cardíaca sistólica ou insuficiência cardíaca diastólica) e se a anomalia é devida a um rendimento cardíaco baixo ou a uma resistência vascular sistêmica baixa (insuficiência congestiva devida a um rendimento baixo ou insuficiência cardíaca por alto rendimento).

A insuficiência congestiva do coração (CHF) é uma constelação de sinais e sintomas (insuficiência respiratória, acúmulo de fluidos devido a um distúrbio subjacente no desempenho cardíaco - principalmente função ventricular esquerda (LV) . As causas de CHF podem ser diversas, mas incidem em 3 categorias principais: após um ataque cardíaco (infarto do miocárdio) com doença cardíaca hipertensiva e com doença muscular intrínseca, geralmente denominada cardiomiopatia. Tem sido difícil se identificar as causas subjacentes de CHF tais como as causadas por doença cardíaca hipertensiva, e este é o centro dos métodos da presente invenção. Mais especificamente, a doença cardíaca hipertensiva produz o aumento do músculo do LV - denominado hipertrofia. A hipertrofia do LV (LVH) essencialmente e em si pode produzir insuficiências no desempenho cardíaco, mas um teste de sangue para se identificar rapidamente e com precisão a LVH não era disponível anteriormente. Este pedido identifica uma abordagem nova e validada para se identificar pacientes com LVH. Se o processo de LVH continuar, ou se não for adequadamente tratado, então os pacientes desenvolverão sinais e sintomas de CHF principalmente devido a insuficiência cardíaca diastólica (DHF). nO entanto tem sido difícil até agora se identificar pacientes que sofrem de CHF que têm primariamente DHF e não tem sido possível se identificar estes pacientes com um teste de sangue simples e rápido. Este pedido identifica uma abordagem nova e validada para a identificação de pacientes que não somente têm a presença de LVH, mas também aqueles que correm o risco de desenvolver DHF e par a identificação daqueles que têm DHF. Portanto, a presente invenção propõe um meio para se detectar a presença de LVH, prever quais os pacientes que correrão um grande risco de desenvolver a DHF, e identificar aqueles pacientes com DHF. Empregando-se uma pequena amostra de fluido corporal, e para o exemplo identificado abaixo, uma amostra de sangue, será possível se conduzir 4 aplicações independentes, mas não necessariamente exclusivas do presente método: teste, previsão/prognóstico, diagnóstico e monitoração do tratamento.

Portanto é divulgado um método de se diagnosticar um indivíduo como tendo hipertrofia ventricular esquerda (LVH, HCM ou HOCM) . É proposto um método de se detectar LVH em um indivíduo que compreende a identificação de um perfil de metaloproteinases de matriz (MMPs) e inibidores teciduais de metaloproteinases de matriz (TIMPs) de um fluido corporal do indivíduo e que é associado com a existência de insuficiência cardíaca diastõlica (DHF). É também proposto um método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo que compreende a identificação de um perfil de metaloproteinases de matriz (MMPs) e inibidores teciduais de metaloproteinases de matriz (TIMPs) de um fluido corporal do indivíduo e que é associado no presente documento com o desenvolvimento provável de insuficiência cardíaca diastólica (DHF).

2. MMPs

As metaloproteinases de matriz (MMPs) são endopeptidases dependentes de zinco; outros membros da família são adamalisinas, serralisinas e astacinas. As MMPs pertencem a uma família maior de proteases conhecidas como a superfamília de metzincinas.

As MMPs compartilham uma estrutura de domínio comum. Os três domínios comuns são o pro-peptídeo, o domínio catalítico e domínio de terminal C semelhante a hemopexina que está ligado ao domínio catalítico por uma região de charneira flexível.

As MMPs são inicialmente sintetizadas como zimogênios inativos com um domínio de pro-peptídeo que deve ser removido antes da enzima se tornar ativa. O domínio de pro-peptídeo é parte do "comutador de cisteína" que contém um resíduo de cisteína conservado que interage com o zinco no sítio ativo e impede a ligação e a clivagem do substrato mantendo a enzima em uma forma inativa. Na maioria das MMPs o resíduo de cisteína se encontra na seqüência conservada PRCGxPD. Algumas MMPs têm um sítio de clivagem de por hormônio convertase (semelhante a furina) como parte deste domínio que, quando clivado, ativa a enzima. MMP-23A e MMP- 23B incluem um segmento de transmembrana neste domínio (PMID 10945999).

As estruturas cristalográficas por raios X de diversos domínios catalíticos de MMP mostraram que este domínio é uma esfera oblata medindo 35 χ 30 χ 30 Â (3,5x3 χ 3 nm) . 0 sítio ativo é uma ranhura de 2 0 Á (2 nm) que se estende através do domínio catalítico. Na parte do domínio catalítico formando o sítio ativo há um íon de Zn2+ cataliticamente importante que é ligado por três resíduos de histidina que se encontram na seqüência conservada HExxHxxGxxH. Portanto, esta seqüência é um motivo de ligação a zinco.

As gelatinases tais como MMP-2 incorporam módulos de fibronectina do tipo II inseridos imediatamente antes no motivo de ligação a zinco no domínio catalítico (PMID 12486137)

0 domínio catalítico é conectado ao domínio de terminal C por uma dobradiça flexível ou região de linker.

Este consiste em até 75 aminoácidos de comprimento e não tem nenhuma estrutura determinãvel.

O domínio de terminal C tem similaridades estruturais à hemopexina de proteína sérica. Ele tem uma estrutura de uma hélice ρ de quatro lâminas. As estruturas em hélice β proporcionam uma superfície chata grande que se pensa que está envolvida em interações proteína-proteína. Isto determina uma especificidade a substrato e é o sítio para a interação com TIMPs. O domínio semelhante a hemopexina está ausente em MMP=-7, MMP-23, MMP-26 e nas plantas e nos nematóides. As MT-MMPs são ancoradas à membrana plasmática, e através deste domínio e algumas destas têm domínios citoplásmicos.

As MMPs podem ser subdivididas em diferentes modos, o uso de métodos bioinformáticos para se comparar as seqüências primárias das MMPs sugerir os seguintes agrupamentos evolucionários das MMPs: MMP-19; MMPs 11, 14, 15, 16 e 17; MMP-2 e MMP-9; todas as demais MMPs.

A análise dos domínios catalíticos em isolamento sugere que os domínios catalíticos evoluíram ainda mais logo que os grupos principais tinham se diferenciado, conforme é também indicado pelas especificidades a substrato das enzimas. Os agrupamentos mais habitualmente usados (por pesquisadores em biologia de MMP) são baseados parcialmente na avaliação históricas da especificidade a substrato da MMP e parcialmente na localização celular da MMP. Estes grupos são as colagenases, as gelatinases, as estromelisinas e as MMPs do tipo de membrana (MT-MMPs) . Está se tornando cada vez mais claro que estas divisões são um tanto artificiais, uma vez que existe uma série de MMPs que não se encaixam em nenhum dos grupos tradicionais.

As colagenases são capazes de degradar os colágenos fibrilares de tripla hélice em fragmentos distintos de 3/4 e 1/4. Estes colágenos são os componentes principais do osso e da cartilagem, e as MMPs são as únicas enzimas conhecidas de mamíferos capazes de degradá-los Tradicionalmente as colagenases são: MMP-=I (colagenase intersticial), MMP-8 (colagenase de neutrófilos) , MMP-13 (colagenase 3), MMP-18 (colagenase 4, xcol4, colagenase de xenopus. Não é conhecido nenhum ortólogo humano), MMP-14 (MTl-MMP) também mostraram que clivam o colágeno fibrilar, e o mais controverso é que há a evidência de que MMP-2 é capaz de colagenólise.

As estroraelisinas apresentam uma capacidade ampla e clivar proteínas de matriz extracelular, mas são incapazes de clivar os colágenos fibrilares de tripla hélice. Os três membros canônicos deste grupo são: MMP-3 (estromelisina 1) MMP-I (estromelisina 2 e MMP-Il (estromelisina 3) . A MMP-Il mostra mais similaridade às MT-MMPs, é ativável por convertase e secretada, portanto, geralmente associada a MMPs ativáveis por convertase.

As matrilisinas incluem MMP-7 (Matrilisina, PUMP) e MMP-2 6 (matrilisina-2, endometase) .

Os principais substratos de gelatinase são colágeno do tipo IV e gelatina, e estas enzimas são distinguida pela presença de um domínio adicional inserido no domínio catalítico. Esta região de ligação a gelatina é posicionada imediatamente antes do motivo de ligação a zinco, e forma uma unidade de dobramento separada que não perturba a estrutura do domínio catalítico. Os dois membros deste subgrupo são MMP-2 (gelatinase de 72 kDa, gelatinase-A) E MMP-9 (gelatinase de 92 kDa, gelatinase B) .

As MMPs secretadas incluem MMP-Il (estromelisina 3), MMP-21 (X-MMP) e MMP-28 (epilisina).

As MMPs ligadas a membrana incluem: MMP-23 de arranjo de cisteína de transmembrana do tipo II, as MMPs 17 e 25 (MT4-MMP e MT6-MMP, respectivamente) ligadas a glicosil fosfatidilinositol e as MMPs 14, 15, 16, 24 (MTl- MMP, MT2-MMP, MT3-MMP e MT5-MMP, respectivamente) de transmembrana do tipo I.

Todas as 6 MT-MMPs tem um sítio de clivagem de furina no pro-peptídeo, que é uma característica também compartilhada por MMP-Il.

Outras MMPs incluem MMP-12 (metaloelastase de macrófago) , MMP-19 (RASI-1, a que se refere ocasionalmente como estromelisina-4) , enamelisina (MMP-20) e MMP-27 (MMP- 22, C-MMP) , MMP-23A (CA-MMP) e MMP-23B.

3. TIMPs

As MMPs são inibidas por um inibidor tecidual endógeno específico de metaloproteinases (TIMPs) que compreende uma família de quatro inibidores de protease: TIMP-I, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4. Ao todo todas as MMPs são inibidas por TIMPs, uma vez ativadas, mas as gelatinases (MMP-2 e MMP-9) podem formar complexos com TIMPs quando as enzimas se encontram na forma latente. 0 complexo de MMP-2 latente (pro-MMP-2) com TIMP-2 serve para facilitar a ativação de pro-MMP-2 na superfície celular por MTl-MMP (MMP-14), uma MMP ancorada a uma membrana.

4. Relação MMP/TIMP

Uma das características específicas para a determinação do perfil de MMP-TIMP na doença cardíaca hipertensiva consiste na utilização do TIMP específico cardíaco, TIMP-4, e colocar esta em contexto com uma MMP que se altera em uma grandeza maior no infarto do miocãrdio e pacientes hipertensos. Também são divulgados relações de uma MMP, tal como MMP-9 ou MMP-13 para um TIMP, tal como TIMP-I, TIMP-2, ou TIMP-4. Estas relações são usadas para a primeira vez na presente invenção como diferenciais diagnósticos e para a identificação de pacientes com estados mórbidos distintamente diferentes.

5. Teste do plasma Uma vantagem chave das instruções da presente invenção consiste no fato de que os métodos aqui descritos proporcionam um processo mais rápido e simplificado para a identificação, a partir de um tecido ou fluido corporal, do paciente que corre o risco de desenvolver LVH adversa, assim como para a identificação de pacientes nos quais este processo está ocorrendo a um passo acelerado. Portanto, os métodos aqui divulgados podem compreender a detecção de MMPs e de TIMPs no fluido corporal do paciente, tais como sangue, urina, plasma, soro, lágrimas, linfa, bile, fluido cérebro-espinhal, fluido intersticial, humor aquoso ou vítreo, colostro, esputo, fluido amniõtico, saliva, secreções anais e vaginais, transpiração, sêmen, transudado, exsudado e fluido sinovial.

O plasma sangüíneo é o componente líquido do sangue, em que as células sangüíneas se encontram suspensas. O plasma é o maior componente único do sangue, constituindo aproximadamente 55% do volume total do sangue. Soro se refere a plasma sangüíneo em que foram removidos fatores de coagulação (tais como fibrina). O plasma sangüíneo contém muitas proteínas vitais incluindo fibrinogênio, globulinas e albumina sérica humana. Às vezes o plasma sangüíneo pode conter impurezas virais que devem ser extraídas através do processamento viral.

6. Imunoensaio

Há numerosos métodos para a detecção de analitos, tais como proteínas, tais como MMPs e TIMPs, conhecidos ou recém descobertos na técnica, que podem ser usados nos métodos descritos. MMPs e TIMPs, por exemplo, podem ser detectados usando-se métodos de imunodetecção padrão. As etapas de diversos métodos de imunodetecção úteis foram descritas na literatura científica, tais como, por exemplo, Maggio et al. , Enzyme-Immunoassay, (1987) e Nakamura, et al., Enzyme Immunoassays: Heterogeneous e Homogeneous Systems, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry, 27.1-27.20 (1986), cada um dos quais é incorporado integralmente ao presente documento a título de referência e especificamente para as suas instruções no tocante a métodos de imunodetecção. Os imunoensaios, no seu sentido mais simples e direto são ensaios de ligação que envolvem a ligação entre anticorpos e antígeno. Muitos tipos e formatos de imunoensaios são conhecidos e são todos adequados para a detecção dos biomarcadores divulgados. Exemplos de imunoensaios são ensaios imunosorventes ligados a enzima (ELISAs), rádio-imunoensaios (RIA), ensaios de precipitação rádio-imunes (RIPA), ensaios de captura de imunoesferas, transferência Western, transferência de pontos, ensaios de retardamento sobre gel, citometria de fluxo, arranjos de proteínas, arRanjos de microesferas multiplexados, captura magnética, imageamento in vivo, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e recuperação/localização de fluorescência depois de fotodescoramento (FRAP/FLAP).

Em geral, os imunoensaios envolvem a colocação de uma amostra que se suspeita que contenha uma molécula de interesse (tal como os biomarcadores divulgados) em contato com um anticorpo à molécula de interesse ou a colocação de um anticorpo a uma molécula de interesse (tal como anticorpos aos biomarcadores divulgados em contato com uma

3 0 molécula que pode ser ligada pelo anticorpo, conforme o caso, em condições efetivas para permitir a formação de imunocomplexos. A colocação de uma amostra em contato com o anticorpo à molécula de interesse ou com a molécula que pode se ligar a um anticorpo à molécula de interesse em condições efetivas e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos imunes primários) é geralmente uma questão de simplesmente se colocar em contato a molécula ou o anticorpo e a amostra em contato e em se incubar a mistura durante um período de tempo suficiente longo para que os anticorpos formem complexos imunes, isto é se liguem, com quaisquer moléculas (antígenos, por exemplo) presentes, às quais os anticorpos podem se ligar. Em muitas formas de imunoensaio, a composição de amostra-anticorpo, tal como uma seção de tecido, placa ELISA, transferência de pontos ou transferência Western, pode então ser lavada para se remover qualquer espécie de anticorpo que estiver ligada não especificamente, permitindo que somente aqueles anticorpos que estiverem especificamente ligados no interior dos complexos imunes primários sejam detectados.

Os imunoensaios podem incluir métodos para a detecção ou quantificação da quantidade de uma molécula de interesse (tal com os biomarcadores divulgados ou seus anticorpos) em uma amostra, métodos estes que geralmente envolvem a detecção ou quantificação de quaisquer complexos imunes formados durante o processo de ligação. Em geral, a detecção da formação de imunocomplexo é bem conhecida na técnica e pode ser obtida por aplicação de numerosas abordagens. Estes métodos são geralmente baseados na detecção de um rótulo ou marcador, tal como quaisquer identificadores biológicos ou enzimáticos ou qualquer outro rótulo conhecido. Veja, por exemplo, as patentes U.S. Nos. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 e 4.366.241, cada uma das quais é integralmente incorporada ao presente documento a título de referência e especificamente para as instruções referentes a métodos de imunodetecção e rótulos.

Conforme empregado no presente, um rótulo pode incluir um corante fluorescente, um membro de um par de ligação tal como biotina/estreptavidina, um metal (ouro, por exemplo) ou um identificador de epítopo que pode interagir especificamente com uma molécula que pode ser detectada, tal como por produção de um substrato colorido ou fluorescência. As substâncias adequadas para a rotulação detectável de proteínas incluem corantes fluorescentes (também conhecidos no presente documento como fluorcromos e fluoróforos) , e enzimas que reagem com substratos colorimétricos (peroxidase de raiz forte, por exemplo). O uso de corantes fluorescentes é em geral preferido na colocação em prática da invenção, uma vez que eles podem ser detectados com quantidades muito baixas. Além disso, no caso em que se faz reagir uma multiplicidade de antígenos com um arranjo simples, cada antígeno pode ser rotulado com um composto fluorescente distinto para a detecção simultânea. Os pontos rotulados no arranjo são detectados usando-se um fluorímetro, a presença de um sinal indicando um antígeno ligado as um antígeno específico.

Os fluoróforos são compostos ou moléculas que têm luminescência. Tipicamente os fluoróforos absorvem a energia eletromagnética a um comprimento de onda e emitem energias eletromagnética a um segundo comprimento de onda. Os fluoróforos representativos incluem, sem limitação, 1,5 XAEDANS; 1,8-ANS; 4-Metilumbeliferona; 5-carbóxi-2, 7- diclorofluoresceína; 5-Carbóxi-fluoresceIna (5 -FAM); 5- Carbóxi-naf tof luoresceína; 5-Carbõxi-tetrametil-rodamina (5-TAMRA); 5-Hidróxi Triptamina (5-HAT); 5-ROX (carbóxi-X- rodamina); 6 -Carbóxi-rodamina 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-Amino- 4- metilcumarina; 7-Aminoactinomicina D (7-AAD); 7-Hidróxi- 4-1 metilcumarina; 9-Amino-6-cloro-2-metóxi-acridina (ACMA); ABQ; Fucsina Ácida; Laranja Acridina; Vermelho Acridina; Amarelo Acridina; Acriflavina; Acriflavina Feulgen SITSA; Equorina (FotoproteIna); AFPs - Proteína AutoFluorescente - (Quantum Biotechnologies) veja sgGFP, sgBFP; Alexa Fluor 350™; Alexa Fluor 430™; Alexa Fluor 488™; Alexa Fluor 532™; Alexa Fluor 546™; Alexa Fluor 568™; Alexa Fluor 594™; Alexa Fluor 633™; Alexa Fluor 647™; Alexa Fluor 660™; Alexa Fluor 680™; Complexon de Alizarina; Vermelho de Alizarina; Aloficocianina (APC); AMC, AMCA-S; Aminometilcumarina (AMCA) ; AMCA-X;

Aminoactinomicina D; Aminocumarina; Azul de Anilina; Estearato de Antrocila; APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; Vermelho de Astrazon Brilhante 4G; Laranja de Astrazon R; Vermelho de Astrazon 6B; Amarelo de Astrazon 7 GLL; Atabrina; ATTO- TAG™ CBQCA; ATTO-TAG™ FQ; Auramina; Aurofosfina G; Aurofosfina; BAO 9 (Bisaminofeniloxadiazol) ; BCECF (alto pH) ; BCECF (baixo pH); Sulfato de Berberina; Beta Lactamase; GFP deslocado por azul BFP (Y66H) ; Proteína Azul Fluorescente; BFP/GFP FRET; Bimano; Bisbenzemida; Bisbenzimida (Hoechst) ; bis-BTC; Blancophor FFG; Blancophor SV; BOBO™ -1; B0B0™-3; Bodipy 492/515; Bodipy 493/503; Bodipy 500/510; Bodipy; 505/515; Bodipy 530/550; Bodipy 542/563; Bodipy 558/568; Bodipy 564/570; Bodipy 576/589; Bodipy 581/591; Bodipy 630/650-Χ; Bodipy 650/665-Χ; Bodipy 665/676; Bodipy Fl; Bodipy FL ATP; Bodipy Fl-Ceramida; Bodipy R6G SE; Bodipy TMR; conjugado de Bodipy TMR-X; Bodipy TMR-X, SE; Bodipy TR; Bodipy TR ATP; Bodipy TR-X SE; BO-PROtm-I; B0-PR0™-3; Sulfoflavina Brilhante FF; BTC; BTC- 5N; Calceína; Azul Calceína; Escarlate de Cálcio; Verde de Cálcio; Verde de Cálcio - 1 Ca2+ Corante; Verde De Cálcio - 2 Ca2+; Verde De Cálcio -5N Ca2+; Verde De Cálcio -C 18 Ca2+; De Cálcio Laranja; Branco de Calcoflúor; Carbóxi-X-rodamina (5-ROX) ; Cascade Blue™; Amarelo Cascata; Catecolamina; CCF2 (GeneBlazer) ; CFDA; CFP (Proteína Ciano Fluorescente) ; CFP/YFP FRET; Clorofila; Cromomicina A; Cromomicina A; CL- NERF; CMFDA; Coelenterazina; Coelenterazina cp; Coelenterazina f; Coelenterazina fcp; Coelenterazina h; Coelenterazina hep; Coelenterazina ip; Coelenterazina n; Coelenterazina O; Cumarina Faloidina; C-ficocianinas; CPM I Metilcumarina; CTC; CTC Formazan; Cy2™; Cy3.18; Cy3.5™; Cy 3™; Cy 5.18; Cy5.5™; Cy5™; Cy7™; Ciano GFP; Fluorsensor cíclico de AMP (FiCRhR) ; Dabcila; Dansila; Dansil Amina; Dansil Cadaverina; Cloreto de Dansila; DHPE de Dansila; Fluoreto de Dansila; DAPI; Dapoxila; Dapoxila 2; Dapoxila 3'DCFDA; DCFH (Diacetato de Diclorodiidro-fluoresceína) ; DDAO; DHR (Diidro-rodamina 123) ; Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (não relação) ; DiA (4-Di 16-ASP) ; Diacetato de Diclorodiidro-fluoresceína (DCFH); DiD-Rastreador

LipofíIico; DiD (DilC18(5)); DEDS; Diidro-rodamina 123 (DHR) ; DiI (DilC18(3)); I Dinitrofenol; DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (DÍ1C18 (7) ) ; DM-NERF (alto pH) ; DNP; Dopamina; DsRed; DTAF; DY-63O-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; Eosina; Eritrosina; ITC de Eritrosina; Brometo de Etídio; Homodímero de Etidio-I (EthD-I); Eucrisina; EukoLight; cloreto de Európio (III); EYFP; Azul Permanente; FDA; Feulgen (Para-rosanilina) ; FIF (Fluorescência Induzida por Aldeido Fórmico); FITC; Laranja Flazo; Fluo-3; Fluo-4; Fluoresceina (FITC); Diacetato de Fluoresceina; Esmeralda de Flúor; Ouro de Flúor (Hidróxi-estilbamidina) ; Rubi de Flúor; FluorX; FM 1-43™; FM 4-46; Fura Red™ (alto pH) ; Fura Red™/Fluo-3; Fura-2; Fura-2/BCECF; Vermelho Brilhante Genacril B; Amarelo Brilhante de Genaeril 10GF; Rosa de Genaeril 3G; Amarelo de Genaeril 5GF; GeneBlazer; (CCF2); GFP (S65T) ; GFP Vermelho deslocado (rsGFP) ; GFP não de excitação por UV do tipo selvagem (wtGFP) ; GFP do tipo selvagem, excitação por UV (wtGFP) ; GFPuv; Ácido Gloxálico; Azul Granular7- Hematoporf irina; Hoechst 33258; Hoechst 33342; Hoechst 34580; HPTS; Hidroxicumarina; Hidróxi- estilbamidina (Ouro de Flúor); Hidroxitriptamina; Indo-1, de alto teor de cálcio; Indo-1, de baixo teor de cálcio; Indodicarbocianinas (DiD) ; Indotricarbocianinas (DiR) ; Intrawhite Cf; JC-I; JO JO-I; JO-PRO-I; LaserPro; Laurodan; LDS 751 (DNA) ; LDS 751 (RNA) ; Leucóforo PAF; Leucóforo SF; Leucóforo WS; Lissamina Rodamina; Lissamina Rodamina B; homodímero de Caleeina/Etidio; LOLO-I; LO-PRO-I;; Amarelo Lúcifer; Azul Lyso Rastreador; Azul-White Lyso Rastreador; Verde Lyso Rastreador; Vermelho Lyso Rastreador; Amarelo Lyso Rastreador; Azul Lyso Sensor; Verde Lyso Sensor; Amarelo/Azul Lyso Sensor; Verde Mag; Vermelho de Magdala (Floxina B) ; Vermelho Mag-Fura; Mag-Fura-2; Mag-Fura-5; Mag-Indo-1; Verde Magnésio; Laranja Magnésio; Verde Malaquita; Azul Marinho; I Maxilon Brilhante Flavina 10 GFF; Flavina Maxilon Brilhante 8 GFF; Merocianina; Metóxi- cumarina; Verde Mitotracker FM; Laranja Mitotracker; Vermelho Mitotraeker; Mitramieina; Monobromobimano; Monobromobimano (mBBr-GSH) ; Monoclorobimano; MPS (Verde de Metil Pironina Estilbeno) ; NBD; NBD Amina; Vermelho do Nilo; Nitrobenzoxedidol; Noradrenalina; Vermelho Nuclear Permanente; i Amarelo Nuclear; Nylosan

Brilhante lavin E8G; Oregon Green™; Oregon Green™ 488; Oregon Green™ 500; Oregon Green™ 514; Azul Pacífico; Para- rosanilina (Feulgen); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP- Cy5.5; PE-TexasRed (Red 613); Floxina B (Vermelho de Magdala); Phorwite AR; Phorwite BKL; Phorwite Rev; Phorwite RPA; Fosfina 3R; PhotoResist; Ficoeritrina B [PE] ; Ficoeritrina R [PE]; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; Pontocrome Azul Black; POPO-I; POPO-3; PO-PRO-I; PO-I PRO-3; Primulina; Amarelo Procion; Iodeto de Propídio (Pl) ; PyMPO; Pireno; Pironina; Pironina B; Pirozal Brilliant Flavina 7GF; QSY 7; Mostarda de Quinacrina; Reso-rufina; RH 414; Rhod-2; Rodamina; Rodamina 110; Rodamina 123; Rodamina 5 GLD; Rodamina 6G; Rodamina B; Rodamina B 200; Rodamina B extra; Rodamina BB; Rodamina BG; Rodamina Verde; Rodamina Falicidina; Rodamina: Faloidina; Vermelho Rodamina; Rodamina WT; Rose Bengal; R-ficocianinas; R-ficoeritrina (PE); rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; Sapphire GFP; SBFI; Serotonina; Vermelho Brilhante Sevron 2B; Vermelho Brilhante Sevron 4G; Vermelho Brilhante Sevron I B; Laranja Sevron; Amarelo Sevron L; sgBFP™ (superbrilho BFP); sgGFP™ (superbrilho GFP) ; SITS (Primulina; Estilbeno Ácido Isotio- sulfônico) ; calceina SNAFL; SNAFL-1; SNAFL-2; calceína de SNARF; SNARFl; Verde de Sódio; Aqua do Espectro; Verde do Espectro; Laranja do Espectro; Vermelho do Espectro; SPQ (6-metóxi-N-(3-sulfopropil)-quinolínio); estilbeno; Sulfo- rodamina B e C; Sulf o-rodamina Extra; SYTO 11; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; Azul SYT0X; Verde SYTOX; Laranja SYTOX; Tetraciclina; Tetrametilrodamina (TRITC); Texas Red™; conjugado de Texas Red-X™; Tiadicarbocianinas (DÍSC3); Vermelho Tiazina R; Laranja de Tiazol; Tioflavina 5; Tioflavina S; Tioflavina ΤΟΝ; Tiólito; Laranja de Tiozol; Tinopol CBS (Branco Calcoflúor); TIER; TO-PRO-I; TO-PRO-3; T0-PR0-5; TOTO-I; TOTO-3; Tricolor (PE-Cy5); TRITC Isotiocianato de Tetrametil Rodamina; Azul Verdadeiro; Vermelho Verdadeiro; Ultralite; Uranina B; Uvitex SFC; wt GFP; WW 781; X- Rodamina; XRITC; Laranja de Xileno; Y66F; Y66H; Y66W; Amarelo GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3; Verde Sybr; laranja de tiazol (corantes interquelantes) ; nanopartícuias semicondutoras tais como pontos de quantum; ou fluoróforo aprisionado (que pode ser ativado com luz ou com uma outra fonte de energia eletromagnética), ou uma combinação sua.

A rotulação pode ser direta ou indireta. Na rotulação direta, o anticorpo detector (o anticorpo à molécula de interesse) ou a molécula detectora (a molécula que pode se ligar a um anticorpo à molécula de interesse) incluem um rótulo. A detecção do rótulo indica a presença do anticorpo detector ou da molécula detectora, o que por sua vez indica a presença da molécula de interesse ou de um anticorpo à molécula de interesse, respectivamente. Na rotulação indireta, uma molécula adicional ou fração é colocada em contato com o imunocomplexo, ou gerada no seu sítio. Uma molécula ou fração geradora de sinal tal como uma enzima, por exemplo, pode ser ligada com o anticorpo detector ou molécula detectora ou associada a ele ou ela. A molécula geradora de sinal pode então gerar um sinal detectável no sítio do imunocomplexo. Uma enzima, por exemplo, quando fornecida com substrato adequado, pode produzir um produto visível ou detectável no sítio do imunocomplexo. Os ELISAs usam este tipo de rotulação indireta.

Como um outro exemplo de rotulação indireta, uma molécula adicional (a que pode se referir como um agente de ligação) que pode se ligar ou à molécula de interesse ou ao anticorpo (anticorpo primário) à molécula de interesse, tal como um segundo anticorpo ao anticorpo primário, pode ser colocada em contato com o imunocomplexo. A molécula adicional pode ter um rótulo ou molécula ou fração geradora de sinal. A molécula adicional pode ser um anticorpo, que pode então ser denominado um anticorpo secundário. A ligação de um anticorpo secundário ao anticorpo primário pode formar um conjunto denominado sanduíche com o primeiro anticorpo (ou primário) e a molécula de interesse. Os complexos imunes podem ser colocados em contato com o anticorpo rotulado secundário em condições efetivas e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes secundários. Os complexos imunes secundários podem então ser em geral lavados para se remover quaisquer anticorpos secundários rotulados ligados não especificamente, e o rótulo restante nos complexos imunes secundários pode então ser detectado. A molécula adicional pode também consistir em um de um par de moléculas ou frações que podem se ligar entre si, tal como o par biotina/avadina ou incluí-la.

Outros modos de rotulação indireta incluem a detecção de complexos imunes primários por uma abordagem de duas etapas. Uma molécula (a que se pode referir como um primeiro agente de ligação), por exemplo, tal como um anticorpo, que tem afinidade de ligação para a molécula de interesse ou para o anticorpo correspondente, pode ser usada para formar complexos imunes secundários, conforme foi descrito acima. Depois de serem lavados, os complexos imunes secundários podem ser colocados em contato com uma outra molécula (a que se pode referir como sendo um segundo agente de ligação) que tem uma afinidade de ligação para o primeiro agente de ligação, novamente em condições efetivas e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (formando assim os complexos imunes terciários) . 0 segundo agente de ligação pode ser ligado a um rótulo detectável ou molécula ou fração geradora de sinal, permitindo a detecção dos complexos imunes terciários assim formados. Este sistema pode prover uma amplificação de sinal.

Os imunoensaios que envolvem a detecção de uma substância, tais como uma proteína ou um anticorpo a uma proteína específica, incluem ensaios isentos de rótulos, métodos de separação de proteína (isto é, eletroforese), ensaios de captura sobre suporte sólido, ou detecção in vivo. Os ensaios isentos de rótulo são geralmente meios diagnósticos de determinação da presença ou ausência de uma proteína específica ou de um anticorpo a uma proteína específica em uma amostra. Os métodos de separação de proteína são adicionalmente úteis para a avaliação das propriedades físicas da proteína tais como o seu tamanho ou carga líquida. Os ensaios de captura são geralmente mais úteis para a avaliação quantitativa da concentração de uma proteína específica ou de um anticorpo a uma proteína específica, em uma amostra. Finalmente a detecção in vivo ê útil para a avaliação dos padrões de expressão espaciais da substância, isto é, nos casos em que a substância pode se encontrar em um paciente, tecido ou célula.

Pressupondo-se que as concentrações sejam suficientes, os complexos moleculares ([Ab-Ag]n) gerados pela interação anticorpo-antígeno são visíveis a olho nu, mas quantidades menores podem também ser detectadas e medidas devido a usa capacidade de dispersar um feixe de luz. A formação de complexos indica que os dois reagentes estão presentes e em ensaios de imunoprecipitação uma concentração constante de um anticorpo reagente é usada para medir o ([Ab-Ag]n) do antígeno específico e os antígenos reagentes são usados para a detecção do ( [Ab- Ag]n) do anticorpo específico. Se a espécie de reagente tiver sido previamente aplicada sobre as células (tal como em ensaio de hemaglutinação) ou partículas muito pequenas (tal como no ensaio de aglutinação de látex) , a "aglomeração" das partículas revestidas é visível a concentrações muito mais baixas. Uma variedade de ensaios baseados nestes princípios elementares são habitualmente usados, incluindo o ensaio de imunodifusão de Ouchterlony imunoeletroforese de foguete e ensaios imunoturbidométricos e nefelométricos. As principais limitações de tais ensaios são uma sensibilidade restrita (limites de detecção mais baixos) em comparação com ensaios que empregam rótulos e, em alguns casos, o fato de que concentrações muito elevadas de análito podem realmente inibir a formação de complexos, precisando de proteções que tornem tais procedimentos mais complexos. Alguns destes ensaios do Grupo 1 datam do tempo do descobrimento de anticorpos e nenhum deles tem um "rótulo" real (Agenz, por exemplo). Outros tipos de imunoensaios que são isentos de rótulos dependem de imuno- sensores, e uma variedade de instrumentos que possam detectar diretamente as interações anticorpo-antígeno estão agora disponíveis no comércio. A grande maioria depende na geração de uma onda evanescente na superfície do sensor com ligante imobilizado, o que permite um monitoramento contínuo da ligação ao ligante. Os imuno-sensores permitem a investigação fácil de iterações cinéticas e, com o advento de instrumentos especializados de custo mais baixo, podem no futuro ser amplamente aplicados em imunoanálise.

O uso de imunoensaios para a detecção de uma proteína específica pode envolver a separação das proteínas por eletroforese. A eletroforese é a migração de moléculas carregadas em solução em resposta a um campo elétrico. A sua taxa de migração depende da intensidade do campo; da carga líquida, do tamanho e formato das moléculas e também da resistência iônica, viscosidade e temperatura do meio em que as moléculas estão se deslocando. Como uma ferramenta analítica, a eletroforese é simples, rápida e extremamente sensível. Ela é usada analiticamente para se estudar as propriedades de uma única espécie com carga e como uma técnica de separação.

Em geral a amostra é processada em uma matriz de suporte tal como papel, acetato de celulose, gel de amido, agarose ou gel de poliacrilamida. A matriz inibe a mistura por convecção causada por aquecimento e produz um registro do procedimento eletroforético: no fim do teste, a matriz pode ser tingida e usada para varredura, auto-radiografia ou armazenagem. Além disso, as matrizes de suporte mais habitualmente usadas - agarose e poliacrilamida proporcionam um meio de se separar as moléculas por tamanho, uma vez que elas são géis porosos. Um gel poroso pode atuar como uma peneira por retardamento, ou em alguns por obstrução completa, do movimento das grandes macromoléculas, permitindo a migração livre de moléculas menores. Como os géis de agarose diluídos são geralmente mais rígidos e fáceis de manusear do que a poliacrilamida da mesma concentração, a agarose é usada para a separação de macromoléculas maiores tais como de ácidos nucléicos, de proteínas grandes e de complexos de proteínas. A poliacrilamida, que é fácil de ser manuseada e de se preparar a concentrações mais altas, ê usada para a separação da maioria de proteínas e de pequenos oligonucleotídeos que exigem um tamanho de poro de gel pequeno para o retardamento.

As proteínas são compostos anfóteros; sua carga líquida, portanto, é determinada pelo pH do meio em que se encontram suspensas. Em uma solução com um pH acima do seu ponto isoelétrico, uma proteína tem uma carga negativa líquida e migra na direção do ânodo no campo elétrico. Abaixo do seu ponto isoelétrico, a proteína tem carga positiva e migra para o cátodo. A carga líquida portada por uma proteína é, além disso, independente do seu tamanho - isto e, a carga portada por unidade de massa (ou de comprimento, uma vez que determinadas proteínas e ácidos nucléicos são macromoléculas lineares) de molécula difere de proteína para proteína. A um pH dado, portanto, e em condições não desnaturantes, a separação eletroforética de proteínas é determinada tanto por tamanho como pela carga das moléculas.

O dodecil sulfato de sódio (SDS) é um detergente aniônico que desnatura as proteínas "envolvendo-se ao redor" da espinha dorsal do polipeptídeo - e SDS se liga a proteínas bastante especificamente em uma relação de massas de 1,4:1. SDS confere uma carga negativa ao polipeptídeo em proporção do seu comprimento. Além disso, é geralmente necessário s reduzir as pontes dissulfeto em proteínas (desnaturar) antes que elas adotem a configuração de hélice aleatória necessária para a separação por tamanho; isto se faz com 2-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT) . Em separações SDS-PAGE por desnaturação, portanto, a migração é determinada não por carga elétrica intrínseca do polipeptídeo, mas poro peso molecular.

A determinação do peso molecular é feita por SDS- PAGE de proteínas de peso molecular conhecido juntamente com a proteína a ser caracterizada. Uma relação linear existe entre o logaritmo do peso molecular de um polipeptídeo desnaturado por SDS ou de um ácido nucléico nativo e seu Rf. O Rf é calculado como a relação da distância da qual a molécula tenha migrado para a distância da qual uma frente de corante de marcador tenha migrado. Um modo simples de se determinar o peso molecular relativo por eletroforese (Mr) consiste em se fazer um gráfico de uma curva padrão da distância da qual se migrou pelo IoglO do peso molecular para amostras conhecidas e pela leitura do log de Mr da amostra depois de se medir a distância da qual se tenha migrado no mesmo gel.

Na eletroforese bidimensional, as proteínas são fracionadas primeiro com base em uma propriedade física, e, em uma segunda etapa, com base em uma outra. A focalização isoelétrica, por exemplo, pode ser usada para a primeira dimensão, conduzida, com convenientemente em um gel em tubo, e a eletroforese por SDS em gel em placa pode ser usado para a segunda dimensão. Um exemplo de um procedimento é o de 0'Farrell, P.H., High Resolution Two- dimensional Electrophoresis of Proteins, J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975), integralmente incorporado ao presente documento a título de referência para as suas instruções referentes aos métodos de eletroforese bidimensional. Outros exemplos incluem, sem limitação, os encontrados em Anderson, L e Anderson, NG, High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins, Proc. Natl. Acad. Sei. 74:5421-5425 (1977), Ornstein, L., Disc electrophoresis, L. Ann. N. Y. Acad. Sei. 121:321349 (1964), cada um dos quais é pelo presente integralmente incorporado ao presente documento a título de referência para as instruções referentes a métodos de eletroforese.

Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Τ4, Nature 227:680 (1970), que é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência para as instruções referentes a métodos de eletroforese, descreve um sistema descontínuo para a solução de proteínas desnaturadas com SDS. O íon inicial no sistema de tampão de Laemmli é cloreto, e o íon final é glicina. Conseqüentemente. O gel de resolução e o gel de empilhamento são preparados em tampões Tris-HCl (de diferentes concentrações e pHs) , ao passo que o tampão no tanque é Tris-glicina. Todos so tampões contêm SDS a 0,1%.

Um exemplo de um imunoensaio que usa eletroforese que é contemplado nos métodos atuais é a análise por transferência Western. A transferência Western ou a transferência imune permite a determinação da massa molecular de uma proteína e a medição de quantidades relativas da proteína presente nas amostras diferentes. Os métodos de detecção incluem detecção por quimioluminescência e cromagênica. Os métodos padrão de análise por transferência Western podem ser encontrados em D.M. Bollag et al., Protein Methods (2a. edição 1996) e E. Harlow & D. Lane, Antibodies, a Laboratory Manual (198 8), patente U.S. No. 4.4 52.901, cada um dos quais é pelo presente incorporado ao presente documento a título de referência integralmente para as instruções referentes aos métodos de transferência Western. Geralmente as proteínas são separadas por eletroforese em gel, geralmente por SDS- PAGE. As proteínas são transferidas para uma folha de papel especial de transferência, de nitrocelulose, por exemplo, embora outros tipos de papel ou de membranas possam ser usados. As proteínas conservam o mesmo padrão de separação que elas tinham no gel. A transferência é incubada com uma proteína genérica (tal como proteínas do leite) para se ligar a quaisquer pontos pegajosos restantes na nitrocelulose. Um anticorpo é então acrescentado ã solução que é capaz de se ligar a sua proteína específica.

A fixação de anticorpos específicos a antígenos específicos imobilizados pode ser facilmente visualizada por técnicas indiretas de imunoensaio por enzima, geralmente usando-se um substrato cromogênico (fosfatase alcalina ou peroxidase de raiz forte, por exemplo), ou substratos quimioluminescentes. Outras possibilidades de sondagem incluem o uso de rótulos fluorescentes ou de radioisótopos (fluoresceína, 125I, por exemplo) . As sondas para a detecção da ligação de anticorpo pode consistir em anti-imunoglobulinas conjugadas, Proteína (que se liga a IgG) estafilocócica conjugada, ou sondas a anticorpos primários biotinilados (conjugado de avidina/estraptavidina, por exemplo).

O potencial da técnica está na detecção simultânea de uma proteína específica por meio de sua antigenicidade e sua massa molecular. As proteínas são primeiro separadas por massa no SDS-PAGE, sendo então especificamente detectadas na etapa de imunoensaio. Portanto, podem ser processados padrões (escadas) simultaneamente a fim de se aproximar a massa molecular da proteína de interesse em uma amostra heterogênea.

O ensaio de retardamento sobre gel ou ensaio de retardamento eletroforético (EMSA) pode ser usado para se detectar as interações entre proteínas que se ligam a DNA e as suas seqüências de reconhecimento de DNA cognatas, tanto de modo qualitativo como quantitativo. As técnicas exemplares são descritas em Ornstein L. , Disc electrophoresis - 1: Background e theory, Ann. NY Acad.

Sei. 121:321-349 (1964), e Matsudiara, PT e DR Burgess, SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel

electrophoresis, Anal. Biochem. 87:386-396 (1987), cada um dos quais ê pelo presente integralmente incorporado ao presente documento a título de referência para as instruções referentes a ensaios de retardamento sobre gel.

Em um ensaio geral de retardamento em gel, as proteínas purificadas ou extratos de células brutas podem ser incubadas coma sonda de DNA ou de RNA rotulado (rádio- rotulado com 32P, por exemplo), seguido por separação dos complexos da sonda livre através de um gel' de poliacrilamida não desnaturador. Os complexos migram mais lentamente através do gel do que a sonda sem ligação. Dependendo da atividade da proteína de ligação, uma sonda rotulada pode ou ser de dois filamentos ou de um único filamento. Para a detecção de proteínas que se ligam a DNA tais como fatores de transcrição, proteínas ou purificadas ou parcialmente purificadas, podem ser usados extratos de células nucleares. Para a detecção de proteínas que se ligam a RNA, podem ser usadas ou proteínas purificadas ou parcialmente purificadas, ou extratos celulares nucleares ou citoplasmáticos. A especificidade da proteína de ligação a DNA ou a RNA para o sítio de ligação putativo é estabelecida por experimentos de competição usando-se fragmentos de DNA ou de RNA ou oligonucleotídeos contendo um sítio de ligação para a proteína de interesse ou uma outra seqüência não relacionada. As diferenças em natureza e intensidade do complexo formado na presença de competidor específico e não específico permite a identificação de interações específicas. Consulte Promega, Gel Shift Assay FAQ, disponível de http: / /www. promega . com/f aq/gelshf aq. html (visitado pela última vez em 25 de março de 2 005) , que é incorporado ao presente documento a título de referência integralmente para as instruções referentes a métodos de retardamento sobre gel.

Os métodos de retardamento sobre gel incluem o uso, por exemplo, de formas coloidais de tingimento azul COOMASSIE (Imperial Chemicals Industries, Ltd) para se detectar proteínas em géis tais côo géis para eletroforese de poliacrilamida. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Neuhoff et al, Electrophoresis 6:427-448 (1985), e Neuhoff et al, Electrophoresis 9:255-262 (1988), cada um dos quais é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência para instruções referentes a métodos de retardamento sobre gel. Além dos métodos de ensaio convencionais de proteínas referenciados acima, é descrita uma composição de combinação de limpeza e tingimento de proteína na patente U.S. No. 5.424.000, integralmente incorporada ao presente documento a título de referência para as suas instruções referentes a métodos de retardamento sobre gel. As soluções podem incluir ácidos fosfórico, sulfúrico e nítrico e corante Violeta Ácido.

O Ensaio de Precipitação Radioimune (RIPA) é um ensaio sensível que utiliza antígenos rádio-rotulados para detectar anticorpos específicos no soro. Deixa-se que os antígenos reajam com o soro e se precipitam usando-se um reagente especial tal como, por exemplo, microesferas de sefarose de proteína A. 0 imunoprecipitado rádio-rotulado ligado é então habitualmente analisado por eletroforese sobre gel. 0 ensaio de radio imunoprecipitação (RIPA) é freqüentemente usado com um teste de confirmação para o diagnóstico da presença de anticorpos a HIV. Refere-se a RIPA também na técnica como Ensaio Farr, Ensaio de Precipitina, Ensaio de Precipitina Radioimune; Análise de Precipitação Radioimune; Análise de Precipitação Radioimune e Análise de Precipitação Radioimune.

Embora os imunoensaios acima que utilizam a eletroforese para separar e detectar as proteínas específicas de interesse permitam a avaliação do tamanho da proteína, eles não são muito sensíveis para se avaliar a concentração da proteína. No entanto, também se reivindicam os imunoensaios em que a proteína ou o anticorpo específico à proteína está ligado a um suporte sólido (tubo, poço, microesfera, ou célula, por exemplo) para capturar o anticorpo ou a proteína de interesse, respectivamente, de uma amostra, em combinação com um método de detecção da proteína ou do anticorpo específico à proteína sobre o suporte. Exemplos e tais imunoensaios incluem radioimunoensaio (RIA), ensaio imunossorvente Ligado a Enzima (ELISA), Citometria de fluxo, arranjo de proteína, ensaio de microesferas multiplexado e captura magnética.

O ensaio radioimune (RIA) é um ensaio quantitativo clássico para a detecção de reações antígeno-anticorpo usando-se uma substância rotulada de modo radioativo (radioligante) quer diretamente quer indiretamente, para medir a substância sem rotulação a um anticorpo específico ou um outro sistema receptor. O ensaio radioimune é usado, por exemplo, para testar níveis hormonais no sangue sem que houvesse a necessidade de se usar um bioensaio. AS substâncias não imunogênicas (haptenos, por exemplo) podem também ser medidas se forem acopladas a proteínas veículos maiores (gamaglobulina bovina ou albumina sérica humana, por exemplo) capazes de induzir a formação de anticorpos. RIA envolve a mistura de um antígeno radioativo (devido à facilidade com a qual os átomos de iodo podem ser introduzidos nos resíduos de tirosina em uma proteína, os isótopos radioativos 125I ou 131I são freqüentemente usados) com anticorpo àquele antígeno. O anticorpo é geralmente ligado a um suporte sólido tal como um tubo ou microesferas. Um antígeno sem rotulação ou "frio" é então acrescentado em quantidades conhecidas e mede-se a quantidade de antígeno rotulado deslocado. Inicialmente o antígeno radioativo é ligado a anticorpos. Quando se acrescenta o antígeno frio, so dois competem pelos sítios de ligação a anticorpo - e a concentrações mais altas de antígeno frio, mais se liga ao anticorpo, deslocando a variante radioativa. Os antígenos ligados são separados dos não ligados em solução e a radioatividade de cada um é usada para se desenhar uma curva de ligação. A técnica é extremamente sensível e específica.

O Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima (ELISA) ou mais genericamente denominado EIA (ImunoEnsaio de Enzima), e um imunoensaio que pode detectar um anticorpo específico para uma proteína. Em um tal ensaio, um rótulo detectável ligado ou a um reagente que se liga a anticorpo ou que se liga a antígeno é uma enzima. Quando exposta a seus substrato, esta enzima reage de um modo tal que produz uma fração química que pode ser detectada, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais, por exemplo., Enzimas que podem ser usadas para rotular de modo detectável reagentes úteis para detecção incluem, sem limitação, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, oxidase de glicose, β-galactosidase, ribonuclease, uréase, catalase, malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, asparaginase, desidrogenase alcoólica da levedura, alfa- glicerofosfato desidrogenase, fosfato de triose isomerase, 6-fosfato de glicose desidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase. Para descrições de procedimentos ELISA, veja Voller, A. et ai., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed. ) , Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1980; Butler, J. E., In: Structure of Antigens, Vol. 1 (Van Regenmortel, M., CRC Press, Boca Raton, 1992, pp. 209-259; Butler, J. E., In: van Oss, C. J. et al. , (eds), Immunochemistry, Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1994, pp. 759-803; Butler, J. E. (ed.), Immunochemistry of Solid- Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991) ; Crowther, "ELISA: Theory e Practice," In: Methods in Molecule Biology, Vol. 42, Humana Press; Nova Jersey, 1995; patente U.S. No. 4.376.110, cada um deles integralmente incorporado ao presente documento a título de referência e especificamente para as instruções referentes a métodos de ELISA.

Variações de técnicas de ELISA são conhecidas dos versados na técnica. Em uma variação, os anticorpos que podem se ligar a proteínas podem ser imobilizados sobre uma superfície selecionada que apresenta uma afinidade para a proteína, tal como um por meio uma placa de microtitulação de poliestireno. Em seguida, pode se acrescentar aos poços uma composição de teste de que se suspeita que contenha um antígeno marcador. Depois da ligação e de se ter lavado para remover imunocomplexos ligados de modo não específico, pode se detectar o antígeno ligado. A detecção pode ser obtida pela adição de um segundo anticorpo específico para a proteína alvo, que é ligada a um rótulo detectável. Este tipo de ELISA é um simples "ELISA em sanduíche" . A detecção pode também ser obtida acrescentando-se um segundo anticorpos, acrescentando-se em seguida um terceiro anticorpo que tem afinidade de ligação para o segundo anticorpo, sendo o terceiro anticorpo ligado a um rótulo detectável.

Uma outra variação é um ELISA de competição. Nos ELISAs de competição, as amostras de teste competem para ligação com quantidades conhecidas de antígenos ou anticorpos rotulados. A quantidade de espécies reativas na amostra pode ser determinada misturando-se a amostra com a espécie rotulada conhecida antes ou durante a incubação com poços revestidos. A presença de espécies reativas na amostra atua para reduzir a quantidade de espécie rotulada disponível para ligação ao poço e reduzir assim o sinal final.

Independente do formato empregado, os ELISAs têm determinadas características em comum, tais como revestimento, incubação ou ligação, lavagem para a remoção de espécies ligadas de modo não específico e a detecção dos imunocomplexos ligados. O antígeno ou os anticorpos podem ser ligados a um suporte sólido, tal como na forma de matriz de placa, microesferas, mergulhador, membrana ou coluna, e a amostra a ser analisada é aplicada a um antígeno ou anticorpo imobilizado. Ao se revestir uma placa ou com antígeno ou com anticorpo, geralmente se incubarão os poços da placa com uma solução do antlgeno ou do anticorpo, ou de um dia para o outro ou durante um período especificado de horas. Os poços da placa podem então ser lavados para a remoção de material incompletamente adsorvido. Quaisquer superfícies que permanecem disponíveis nos poços podem então ser "revestidas" com uma proteína não específica que é antigenicamente neutra em relação aos anti-soros de teste. Estas incluem albumina sérica bovina (BSA) , caseína e soluções de pó de leite. O revestimento permite que se bloqueiem os sítios de adsorção não específica sobre a superfície de imobilização e reduz assim o fundo causado por ligação não específica de anti-soros sobre a superfície.

Nos ELISAs, pode também ser usado um meio de detecção secundário ou terciãrio e não um procedimento direto. Portanto, depois da ligação de uma proteína ou de um anticorpo ao poço, do revestimento com um material não reativo para reduzir o fundo e depois de se ter lavado para remover o material que não se ligou, a superfície de imobilização é colocada em contato com a amostra clínica de controle ou biológica a ser testada em condições efetivas para permitir a formação do complexo imune (antígeno/anticorpo). A detecção do complexo imune então necessita de um agente de ligação secundário rotulado ou de um agente de ligação secundário em conjunto com um terceiro agente de ligação rotulado.

"Em condições efetivas para permitir a formação do complexo imune (antígeno/anticorpo)" significa que as condições incluem a diluição dos antígenos e anticorpos com soluções tais como de BSA, gama globulina bovina (BGG) e solução salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween de modo a reduzir a ligação não específica e a promover uma relação razoável de sinal para ruído.

As condições adequadas também significam que a incubação é conduzida a uma temperatura e durante um período de tempo suficiente para permitir uma ligação efetiva. As etapas de incubação podem variar tipicamente de aproximadamente 1 minuto a doze horas, a uma temperatura de aproximadamente 20°C a 30°C, ou pode-se incubar de um dia para o outro a uma temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 10°C.

Depois de todas as etapas de incubação em um ELISA, a superfície que foi colocada em contato pode ser lavada de modo a se remover todo o material não complexado. Um procedimento de lavagem pode incluir a lavagem com uma solução tal como PBS/Tween ou tampão de borato. Depois da formação de complexos imunes específicos entre a amostra de teste e o material originalmente ligado e depois da lavagem subseqüente, pode ser determinada a ocorrência de quantidades mesmo mínimas de complexos imunes.

Para se prover um meio de detecção, o segundo ou o terceiro anticorpo pode ter um rótulo associado para permitir a detecção, conforme descrito acima. Este pode consistir em uma enzima que pode gerar uma revelação de cor depois de incubação com um substrato cromogênico adequado. Portanto, pode-se colocar em contato o primeiro ou o segundo complexo imune com um anticorpo rotulado ou incubá- lo com este anticorpo rotulado, por exemplo, durante um período de tempo e em condições que propiciem o desenvolvimento de uma outra formação de complexo imune (incubação durante 2 horas à temperatura ambiente, por exemplo, em uma solução contendo PBS tal como PBS-Tween) .

Depois da incubação com o anticorpo rotulado e depois da lavagem para se remover o material que não se ligou, pode-se quantificar a quantidade de rótulo, por incubação com um substrato cromogênico tal como uréia e púrpura de bromocresol, por exemplo, ou com ácido 2,2'- azido-di-(3-etil-benzotiazolino-6-sulfônico [ABTS] e H2O2, no caso de peroxidase como a enzima rotuladora. A quantificação pode então ser obtida, medindo-se o grau de geração de cor, usando-se um espectrofotômetro de espectros visíveis, por exemplo.

Os arranjos de proteína são sistemas de ensaio de ligação de ligante a fase sólida usando-se proteínas imobilizadas em superfícies que incluem vidro, membrana, poços de microtitulação, placas de espectrômetro de massa, e microesferas ou outras partículas. Os ensaios são extremamente paralelos (multiplexados) e freqüentemente miniaturizados (microarranjos, chips de proteína) . As suas vantagens incluem a sua rapidez e automatização, capacidade de alta sensibilidade, o fato de economizarem reagentes e produzirem uma abundância de dados para um único experimento. 0 suporte de bio-informática é importante; a manipulação dos dados exige um software sofisticado e uma sofisticada análise de comparação de dados. No entanto, o software pode ser adaptado dos usados para arranjos de DNA, assim como muitos dos elementos sólidos e sistemas de detecção.

Uma dos principais formatos é o arranjo de captura, em que os reagentes de ligação-ligante que são geralmente anticorpos podem também ser armações de ligação de proteínas alternativos, peptídeos ou aptâmeros de ácidos nucléicos, são usados para detectar moléculas alvo me misturas tais como de extratos teciduais ou plasma. Nos diagnósticos, os arranjos de captura podem ser usados para conduzir uma multiplicidade de imunoensaios em paralelo, tanto testando para diversos análitos em soros individuais, por exemplo, e testando muitas amostras séricas simultaneamente. Em proteômica, os arranjos de captura são usados para quantificar e comparar os níveis de proteínas em diferentes amostras na saúde e na doença, isto é, determinação do perfil de expressão de proteínas. A proteínas diferentes dos ligantes específicos são usadas no formato de arranjo para testes de interação funcional in vitro tais como interações proteína-proteína, proteína-DNA, proteína-droga, receptor-ligante, enzima-substrato etc. Os reagentes de captura propriamente ditos são selecionados e testados contra muitas proteínas, o que pode ser feito em um formato de arranjo multiplex contra uma multiplicidade de proteínas alvo.

Para a construção de arranjos, as fontes de proteínas incluem sistemas de expressão à base de células para proteínas recombinantes, a purificação a partir de fontes naturais, a produção in vitro por sistemas de tradução isentos de células e métodos sintéticos para peptídeos. Muitos destes métodos podem ser automatizados para uma produção de alto rendimento. Para arranjos de captura e para a análise da função da proteína, é importante que as proteínas devam ser corretamente dobradas e funcionais; isto não ocorre sempre, quando proteínas recombinantes são extraídas de bactérias em condições de desnaturação, por exemplo. Mesmo assim, arranjos de proteínas desnaturadas são úteis ao se testar anticorpos para reatividade cruzada, para a identificação de auto- anticorpos e para a seleção de proteínas que se ligam a ligante.

Os arranjos de proteínas foram projetados como uma miniaturização de métodos de imunoensaio familiares tais como ELISA e transferência de pontos, freqüentemente utilizando leitura fluorescente e foram facilitados pela robótica e por sistemas de detecção de alto grau de processamento para permitir uma multiplicidade de ensaios conduzidos em paralelo. Suportes físicos habitualmente usados incluem laminas de vidro, silício, micropoços, membranas de nitrocelulose ou de PVDF e microes feras magnéticas e outras.Embora microgotas de proteína aplicadas sobre superfícies planas são o formato mais familiar, arquiteturas alternativas incluem dispositivos de centrifugação de CD com base em desenvolvimentos em microfluídica (Gyros, Monmouth Junction, NJ) e projetos especializados de chips, tais como microcanais construídos em uma placa (The Living Chip™, Biotrove, Woburn, MA, por exemplo) e minúsculos postes de 3D sobre uma superfície de silício (Zyomyx, Hayward CA) . Partículas em suspensão podem ser usadas também como base de arranjos, desde que elas sejam codificadas para identificação; os sistemas incluem codificação de cor para microesferas (Luminex, Austin, TX; Bio-Rad Laboratories) e nanocristais semicondutores (QDots™, Quantum Dot, Hayward, CA, por exemplo), e codificação de barras para microesferas (UltraPlex™, SmartBead Technologies Ltd, Babraham, Cambridge, UK) e micro-hastes multimetãlicas (partículas de Nanobarcodes™, Nanoplex Technologies,- Mountain View, CA, por exemplo) . Micro-esferas podem também ser montadas em arranjos planos sobre chips semicondutores (tecnologia LEAPS, BioArray Solutions, Warren, NJ).

A imobilização de proteínas envolve tanto o reagente de acoplamento como a natureza da superfície a que se acopla. Uma boa superfície de suporte para arranjo de proteína é quimicamente estável antes e depois dos procedimentos de acoplamento, permite uma boa morfologia de pontos, apresenta um mínimo de ligação não específica, não contribui para o fundo em sistemas de detecção, e é compatível com diferentes sistemas de detecção. O método de imobilização usado é reproduzível, aplicável a proteínas de diferentes propriedades (tamanho, hidrófila, hidrófoba), passível de alto rendimento e automação e compatível com retenção de atividade de proteína totalmente funcional. A orientação da proteína ligada à superfície é reconhecida como um fator importante na sua apresentação a ligante ou a substrato em um estado ativo; para arranjos de captura, os resultados de ligação mais eficientes são obtidos com reagentes de captura orientados, o que geralmente exige rotulação específica a sítio da proteína.

Tanto o método por covalência como por não covalência de imobilização de proteína é usado e ambos têm diversos prós e contras. A adsorção passiva a superfícies é metodologicamente simples, mas permite pouco controle quantitativo ou orientacional. Ela pode ou não alterar as propriedades funcionais da proteína e a reproduzibilidade e eficiência são variáveis. Os métodos de acoplamento por covalência proporcionam uma ligação estável, podem ser aplicados a uma série de proteínas e têm uma boa reproduz ibil idade; no entanto, a orientação pode ser variável, a derivação química pode alterar a função da proteína e exige uma superfície interativa estável. Os métodos de captura biológicos que utilizam um identificador na proteína proporcionam uma ligação estável e se ligam à proteína especificamente e com uma orientação reproduzível, mas o reagente biológico deve ser primeiro imobilizado adequadamente e o arranjo pode exigir uma manipulação especial e ter uma estabilidade variável.

Diversas químicas de imobilização e identificadores foram descritos para a fabricação de arranjos de proteína. Os substratos para a fixação por covalência incluem lâminas de vidro revestidas com reagentes de silano contendo amino ou aldeído. No sistema Versalinx™ (Prolinx, Bothell, WA) , um acoplamento por covalência reversível é obtido pela interação entre a proteína derivada com ácido fenildiborônico e ácido salicil-hidroxâmico imobilizada sobre uma superfície de suporte. Isto também tem uma ligação de fundo baixo e baixa fluorescência intrínseca e permite que as proteínas imobilizadas retenham a função. A ligação não por covalência de uma proteína não modificada ocorre no interior de estruturas porosas tais como HydroGel™ (PerkinElmer, Wellesley, MA) com base em um gel tridimensional de poliacrilamida; este substrato é relatado como dando um fundo especialmente baixo sobre microarranjos de vidro, com uma alta capacidade e retenção da função da proteína. Os métodos de acoplamento biológicos amplamente usados são através de interações biotina/estreptavidina ou hexa-histidina/Ni, tendo se modificado a proteína adequadamente, A biotina pode ser conjugada a uma espinha dorsal de poli-lisina imobilizada sobre uma superfície tal como de dióxido de titânio (Zyomix) ou pentóxido de tântalo (Zeptosens, Witterswil, Suíça).

Os métodos de fabricação de arranjos incluem impressão robótica por contato, jato de tinta, disposição de pontos piezelétricos e fotolitografia. Uma série de arranjos comerciais é disponível [Packard Biosciences] assim como equipamento manual [V & P Scientific] . As colônias bacterianas podem ser dispostas em grade roboticamente sobre membranas de PVDF para a indução de expressão de proteína in si tu.

No limite do tamanho e densidade de pontos estão os nanoarranjos, com pontos na escala espacial de nanômetros, permitindo que se conduzam milhares de reações em um único chip que tem menos de 1 mm quadrado de superfície. BioForce Laboratories desenvolveram nanoarranjos com 1521 pontos de proteína em 85 micra quadrados, equivalentes a 25 milhões de pontos por cm quadrado, no limite da detecção ótica; seus métodos de leitura são por fluorescência e microscopia de força atômica (AFM).

Os métodos de rotulação por fluorescência e detecção são amplamente usados. 0 mesmo instrumental usado para leitura de microarranjos de DNA é aplicável a arranjos de proteína. Para a apresentação diferencial, os arranjos de captura (de anticorpos, por exemplo) podem ser sondados com proteínas rotuladas de modo fluorescente a partir de dois estados celulares diferentes em que lisados de células são diretamente conjugados com diferentes fluoróforos (Cy- 3, Cy-5, por exemplo) e misturados, de modo tal que a cor atua como uma leitura para alterações na abundância alvo. A sensibilidade fluorescente da leitura pode ser amplificada 10-100 vezes por amplificação do sinal de tiramida (TSA) (PerkinElmer Lifesciences) . A tecnologia de guia de onda planar (Zeptosens) permite a detecção ultra-sensível de f luorescência, com a vantagem adicional de que não há nenhum procedimento de lavagem intercalado. Uma alta sensibilidade pode também ser obtida com microesferas e partículas em suspensão, usando-se ficoeritrina como rótulo (Luminex) ou as propriedades de nanocristais semicondutores (Quantum Dot). Uma série de leituras alternativas inéditas foi também desenvolvida, especialmente no campo de biotecnologia comercial. Estas incluem adaptações de ressonância superficial de plasmônio (HTS Biosystems, INtrinsic Bioprobes, Tempe, AZ) , amplificação de DNA em círculo que rola (Molecular Stagins, New Haven CT) , espectrometria em massa (Intrinsic Bioprobes; Ciphergen, Fremont, CA) , dispersão de luz de ressonância (Genicon Sciences, San Diego, CA) e microscopia de força atômica [BioForce Laboratories] .

Os arranjos de captura formam a base de chips diagnósticos e arranjos para o levantamento dos perfis de expressão. Eles empregam reagentes de captura de alta afinidade, tais como anticorpos convencionais, domínios singulares, armações de suporte construídas, peptídeos ou aptâmeros de ácidos nucléicos, para se ligar a ligantes alvo específicos e detectá-los, de um modo com alto índice de processamento.

Os arranjos de anticorpo têm as propriedades necessárias de especificidade e fundo aceitável e alguns são disponíveis no comércio (BD Biosciences, San Jose, CA; Clontech, Mountain View, CA; BioRad; Sigma, St. Louis, MO). Os anticorpos para arranjos de captura são preparados ou por imunização convencional (soros policlonais e hibridomas) ou como fragmentos recombinantes, geralmente expressos em E. coli, depois da seleção de bibliotecas de apresentação de fagos ou de ribossomos (Cambridge Antibody Technology, Cambridge, GB; BioInvent, Lund, Sweden; Affitech, Walnut Creek, CA; Biosite, San Diego, CA) . Além dos anticorpos convencionais, podem ser também úteis em arranjos os fragmentos Fab e scFv, domínios V singulares provenientes de camelídeos ou equivalentes humanos construídos (Domantis, Waltham, MA).

O termo "armações de suporte" se refere a domínios de ligação a ligante de proteínas, que são construídos em uma multiplicidade de variantes capazes de se ligar a diversas moléculas alvo com propriedades semelhantes a anticorpo de especificidade e afinidade. Os variantes podem ser produzidos em um formato de biblioteca genética e selecionados contra alvos individuais por apresentação de fagos, bactérias ou ribossomos. Tais armações de suporte ou armações de ligação a ligantes incluem "Afficorpos" baseados na proteína A de Staph. Aureus (Affibody, Bromma, Suécia), "Trinectinas" baseadas em fibronectinas (Phylos, Lexington, MA) e "Anticalinas" baseadas na estrutura de lipocalina (Pieris Proteolab, Freising-Wehenstephan, Alemanha) . Estas armações podem ser usadas nos arranjos de captura de um modo análogo a anticorpos e podem ter vantagens de robustez e facilidade de produção.

As moléculas de captura de não proteínas, principalmente os aptâmeros de ácidos nucléicos de um único filamento e que se ligam a ligantes de proteína com uma alta especificidade e afinidade, são também usados em arranjos (SomaLogic, Boulder, CO) . Aptâmeros são selecionados de bibliotecas de oligonucleotídeos pelo procedimento Selex™ e a sua interação com proteína pode ser intensificada por ligação por covalência, por incorporação de desoxiuridina bromada e por reticulação ativada por UV (fotoaptâmeros). A fotorreticulação a ligante reduz a reatividade cruzada de aptâmeros devido às exigências estéricas específicas. Os aptâmeros têm as vantagens de facilidade de produção por uma síntese automatizada de oligonucleotídeos e a estabilidade e robustez de DNA; nos arranjos de fotoaptâmeros, pode ser usados tingimentos fluorescentes universais de proteínas para detectar a ligação.

A ligação de analitos de proteína a arranjos de anticorpos pode ser detectada diretamente ou por meio de um anticorpo secundário em um arranjo em sanduíche. A rotulação direta é usada para comparação de amostras diferentes com cores diferentes. Nos casos em que pares de anticorpos direcionados ao mesmo ligante de proteína são disponíveis, os imunoensaios em sanduíche proporcionam uma alta especificidade e sensibilidade e são, portanto, o método de escolha para proteínas com baixa abundância tais com citocinas; eles também dão a possibilidade de se detectar modificações de proteínas. Os métodos de detecção isentos de rótulos, incluindo espectrometria de massa, a ressonância de superfície de plasmônio e a microscopia de força atômica, evitam a alteração do ligante. 0 que se exige de qualquer método é uma sensibilidade e especificidade ótimas com um baixo fundo para produzir uma alta relação de sinal para ruído. Como as concentrações de análitos abrangem uma ampla faixa, a sensibilidade tem que ser ajustada apropriadamente; a diluição em série da amostra ou o uso de anticorpos de diferentes afinidades são soluções para este problema. As proteínas de interesse são freqüentemente aquelas em baixa concentração em fluidos corporais e extratos, exigindo uma detecção na faixa de pg ou abaixo dela, tais como citocinas ou produtos com baixa expressão em células.

Uma alternativa a um arranjo de moléculas de captura é um produzido por meio de tecnologia de "impressão molecular" em que peptídeos (das regiões de terminal C de proteínas, por exemplo) são usados como gabaritos para gerar cavidades estruturalmente complementares, específicas a seqüência em uma matriz polimerizável; as cavidades podem então capturar proteínas (desnaturadas) que têm a seqüência de aminoácidos primária apropriada (ProteinPrint™, Aspira, Biosystems, Burlingame, CA).

Uma outra metodologia que pode ser usada diagnosticamente e no levantamento de perfis é o arranjo ProteinChip® (Ciphergen, Fremont, CA) em que as superfícies cromatográficas de fase sólida se ligam a proteínas com características análogas de carga ou de hidrofobicidade a partir de misturas tais como plasma ou extratos de tumores e se usa a espectrometria de massa SELDI-TOF para a detecção das proteínas retidas.

Os chips funcionais em grande escala foram construídos imobilizando-se grandes números de proteínas purificadas e foram usados para se testar uma ampla faixa de funções bioquímicas, tais com interações de proteínas com outras proteínas, interações de droga-alvo, enzima- substratos etc. Geralmente eles exigem uma biblioteca de expressão, clonada em E. coli, levedura ou análogo a partir da qual as proteína expressas são então purificadas por meio do seu identificador His, e imobilizadas. A transcrição/tradução da proteína isenta de células é uma alternativa viável para a síntese de proteínas que não se expressam bem em sistemas bacterianos ou em outros sistemas in vivo.

Para a detecção de interações proteína-proteína, os arranjos de proteínas podem ser alternativas in vitro para o sistema de dois híbridos de levedura à base de células e podem ser úteis nos casos em que este último é deficiente, tal como em interações que envolvem proteínas secretadas ou proteínas com pontes dissulfeto. Uma análise de atividade bioquímica em arranjos de alto volume de processamento já foi descrita para proteína quinases da levedura e para diversas funções (interações proteína-proteína e proteína- lipídio) do proteoma da levedura em que uma grande proporção de todas as matrizes de leitura abertas de levedura foi expressa e imobilizada em um microarranjo. Os "chips de proteomas" em grande escala prometem ser muito úteis na identificação de interações funcionais, teste de drogas etc. (Proteometrix, Branford, CT).

Como uma apresentação bidimensional de elementos individuais um arranjo de proteínas pode ser usado para se testar bibliotecas de apresentação de fagos ou ribossomos, a fim de se selecionar parceiros de ligação específicos, incluindo anticorpos, armações de suporte sintéticas, peptídeos e aptâmeros. Deste modo pode ser conduzido o teste de "biblioteca contra biblioteca". O teste de candidatos a drogas nas bibliotecas químicas combinatõrias contra um arranjo de proteínas alvo identificados dos projetas de genoma é uma outra aplicação da abordagem.

Um ensaio multiplexado de microesferas, tal como, por exemplo, o BD™ Cytometric Bead Array é uma série de partículas espectralmente descontínuas que pode ser usada para capturar e quantificar análitos solúveis, o análito é então medido por detecção de uma emissão à base de fluorescência e análise citométrica de fluxo, o ensaio multiplexado de microesf eras gera dados que são comparáveis a ensaios à base de ELISA, mas de um modo "multiplexado" ou simultâneo. A concentração de incógnitas é calculada para o arranjo citométrico de microesferas como com qualquer ensaio de formato em sanduíche, isto é, pelo uso de padrões conhecidos e lançando-se em gráfico as incógnitas contra uma curva padrão. Além disso, o ensaio multiplexado de microesferas permite a quantificação de análitos solúveis em amostras que nunca foi considerado antes devido a limitações de volume de amostras. Além dos dados quantitativos, podem ser geradas imagens visuais possantes revelando perfis ou assinaturas singulares que fornecem ao usuário informações adicionais com um simples lance de olhos.

Os perfis de MMP/TIMP divulgados no presente documento são baseados em medições de MMPs ou TIMPs individuais. As quantidades destas podem ser medidas por qualquer meio conhecido que possa proporcionar uma indicação aceitável da quantidade de qualquer uma destas que esteja presente na amostra que estiver sendo analisada.

Um exemplo de um meio de medição é dado nos Exemplos. 0 processo de medição de uma quantidade de um análito (MMP ou TIMP, por exemplo) inclui a medição de nenhuma quantidade ou uma quantidade não detectável do análito.

As técnicas e abordagens para a medição de MMP e TIMPs que formam a base da presente invenção são baseadas em imunoensaios de alta sensibilidade. Diversos destes imunoensaios foram desenvolvidos por este laboratório (isto é, medições de ensaio de TIMP-4) . A abordagem de imunoensaio que foi padronizada para fornecer as medições mostradas na Tabela 4 foi conduzida por um imunoensaio ligado a enzima (ELISA). No entanto, outros métodos mais sensíveis e rápidos para a medição de níveis de sangue de MMPs e TIMPs foram conduzidos por este laboratório e estes incluem o uso de um sistema multiplex de ensaio. Neste exemplo, uma multiplicidade de análitos em amostras de volume limitado tais como de plasma ou de outras amostras biológicas, pode ser medida usando-se um imunoensaio multiplex em sanduíche à base de microesf eras. Este técnica emergente para uma análise multiplex é construída sobre tecnologia que combina a sensibilidade de ELISA com a detecção citométrica de fluxo, permitindo a medição específica de até 100 diferentes análitos dentro de uma única amostra de menos de 5 0 pL. Esta abordagem permite a medição de uma multiplicidade de MMPs e TIMPs em uma pequena amostra de sangue. Este tipo de abordagem e adequado para aplicações diagnosticas, prognostica de previsão e de monitoração terapêutica que são descritas no presente documento. Mais especificamente, para se medir simultaneamente as concentrações de análitos, incubam-se as microesferas juntamente com a amostra (isto é, a amostra de sangue) e permite-se que se formem complexos com os análitos específicos de interesse (isto é, com MMPs) . Os anticorpos de detecção (biotinilados) específicos para um segundo epítopo em cada análito são então acrescentados à mistura e deixa-se que se liguem às microesferas complexadas com o análito. A mistura é então incubada com uma molécula repórter fluorescente (estreptavidina- ficoeritrina) e faz-se passar a amostra integral através de um detector citométrico de fluxo de dois lasers. Um laser detecta a fluorescência precisa da microesfera que define o análito específico que estiver sendo examinado e o outro laser detecta a quantidade de fluorescência repórter que é diretamente proporcional à quantidade de análito ligado.

Este processo foi então aplicado a uma série de MMPs e outros análitos que tem um potencial para o processo CHF e estes são apresentados na figura 8 e na Tabela 1. Este é um exemplo somente do modo como análitos individuais ou múltiplos podem ser medidos com uma amostra de sangue muito pequena. Outros exemplos de medições que foram conduzidas no tocante a análitos MMP/TIMP incluem radioimunoensaio e ensaio de imuno-transferência. Estas abordagens são também à base de anticorpos

Tabela 1: Limites e concentração de analitos usados para a calibração e estatísticas de regressão linear para as curvas padrão calculadas

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7. Anticorpos

Os anticorpos específicos para MMPs e para TIMPs são conhecidos e disponíveis no comércio. Exemplos de anticorpos são dados na Tabela 2

Tabela 2: Anticorpos a MMP/TIMP <table>table see original document page 61</column></row><table> <table>table see original document page 62</column></row><table> <table>table see original document page 63</column></row><table>

O termo "anticorpos" é usado no presente documento em um sentido amplo e inclui tanto anticorpo policlonais como monoclonais. Além das moléculas de imunoglobulina intactas, também são incluídos no termo "anticorpos" fragmentos ou polímeros dessas moléculas de imunoglobulina, e versões humanas ou humanizadas de moléculas de imunoglobulina ou seus fragmentos, desde que eles sejam escolhidos para a sua capacidade de interagir com MMPs ou com TIMPs. Os anticorpos podem ser testados para a sua atividade desejada usando-se os ensaios in vitro descritos no presente documento, ou por métodos análogos, depois dos quais as suas atividades terapêuticas e/ou profiláticas in vivo são testadas de acordo com métodos de testes clínicos conhecidos.

O termo "anticorpo monoclonal", conforme empregado no presente, se refere a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, isto, os anticorpos individuais dentro da população são idênticos exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente e que podem estar presentes em um pequeno subconjunto das moléculas do anticorpo. Os anticorpos monoclonais neste documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica às seqüências correspondentes ou homólogas às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou que pertencem a uma classe ou subclasse específica do anticorpo, sendo as demais da(s) cadeia(s) idênticas ou homólogas às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de qualquer outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles apresentem a atividade antagonistica desejada (Veja patente U.S. No. 4.816.567 e Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)).

Os anticorpos monoclonais descritos podem ser produzidos usando-se qualquer procedimento que produz anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais descritos podem ser preparados, por exemplo, usando-se métodos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975). Em um método de hibridoma, um camundongo ou um outro animal hospedeiro adequado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para se obter linfócitos que produzem ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante.

Os anticorpos monoclonais podem também ser preparados por métodos de DNA recombinante, tais como os descritos na patente U.S. No. 4.816.567 (Cabilly et al.). 0 DNA que codifica anticorpos monoclonais divulgados pode ser facilmente isolada e seqüenciado usando-se procedimentos convencionais (usando-se sondas de oligonucleotideos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeia pesadas e leves de anticorpos murinos, por exemplo) . As bibliotecas de anticorpos ou de fragmentos ativos de anticorpos podem também ser geradas e testadas usando-se técnicas de apresentação de fagos, conforme já descrito na patente U.S. No. 5.8 04.44 0 concedida a Burton e tel. E na patente U.S. No. 6.0 96.441 concedida a Barbas et al., por exemplo.

Os métodos in vitro são também adequados para a preparação de anticorpos monovalente. A digestão de anticorpos para produzir seus fragmentos, especialmente fragmentos Fab, pode ser efetuada usando-se técnicas de rotina conhecidas na técnica. A digestão pode ser conduzida usando-se papaina, por exemplo. Exemplos de digestão por papaína são descritos em WO 94/29348 publicada em 22 de dezembro de 1994 e patente U.S. No. 4.342.566. A digestão de anticorpos por paina tipicamente produz dois fragmentos idênticos de ligação a antígeno, denominados fragmentos Fab, cada com um único sítio de ligação a antígeno, e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina resulta em um fragmento que tem dois sítios de combinação com antígeno e ainda é capaz de reticular um antígeno.

Os fragmentos, quer ligados a outras seqüências quer não, podem também incluir inserções, deleções, substituições ou outras modificações selecionadas de regiões específicas ou resíduos específicos de aminoácidos, desde que a atividade do anticorpo ou do fragmento de anticorpo não seja significativamente alterada ou prejudicada em comparação com o anticorpo não modificado ou com o fragmento de anticorpo não modificado. Estas modificações podem proporcionar alguma propriedade adicional, tal como a de remoção/adição de aminoácidos capazes de ligação por dissulfeto, aumento da sua bio- longevidade ou alteração de suas características secretoras etc. Qualquer que seja o caso, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo deve possuir uma propriedade bioativa, tal como uma ligação específica ao seu antígeno cognato. As regiões ativas ou funcionais do anticorpo ou do fragmento de anticorpo podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguida por expressão e teste do polipeptídeo expresso. Tais métodos são facilmente aparentes a um versado na técnica e pode incluir mutagênese específica a sítio do ácido nucléico que codifica o anticorpo ou o fragmento de anticorpo ((Zoller, MJ. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992).

Conforme empregado no presente, o termo "anticorpo" ou "anticorpos" pode também se referir a um anticorpo humano e/ou a um anticorpo humanizado. Muitos anticorpos não humanos (os derivados de camundongos, ratos ou coelhos, por exemplo) são naturalmente antigênicos em seres humanos e por este motivo podem dar origem a respostas imunes indesejáveis quando administrados a seres humanos. Portanto, o uso de anticorpos humanos ou humanizados nos métodos serve para reduzir a possibilidade de que um anticorpo administrado a um ser humano produzirá uma resposta imune indesejável.

8. Valores de Referência

São propostos perfis de MMPs e/ou de TIMPs que são indicadores da existência de DHF ou que são previsores do desenvolvimento de DHF em um indivíduo. Os perfis que são indicadores da existência de DHF ou eu prevêem o desenvolvimento de DHF em um indivíduo podem ser relativas a um valor normal. Um valor normal para um análito dado (MMP ou TIMP) pode ser um valor de referência para um indivíduo com a idade correspondente que é confirmado como não tenho nenhuma evidência de uma doença cardiovascular significativa. Portanto, o valor normal pode ser um valor baseado em população derivado de um número significativo de indivíduos sadios. Estes valores de referência normais podem ser obtidos de estudos baseados em população. Há estudos baseados em grandes populações que têm níveis relativos de TIMP-I identificados (Framingham Heart Study, Circulation 2004: 109: 2850-2856) em um grupo de referência a aproximadamente 800 ng/mL o que é coerente com os valores de controle de referência descritos no presente documento.

Alternativamente, o valor normal pode ser um valor que é considerado normal para um indivíduo dado. As medições básicas dos análitos relevantes, por exemplo, podem ser efetuadas para um indivíduo sadio, e usadas para comparação com medições adquiridas mais tarde daquele indivíduo para identificar uma doença corrente ou o progresso na direção de uma doença cardíaca hipertensiva.

Uma observação descontínua, para MMP-13, por exemplo, é para aquele caso em que uma variável contínua, tal como uma concentração plasmática de um análito dado, é convertida em uma variável divergente. Neste caso específico um valor ± seria atribuído a MMP-13, sendo o valor acima de 10 ng/mL considerado detectável ou valor positivo e um valor inferior a 10 ng/mL seria considerado um valor negativo.

É proposto, por exemplo, um método de se diagnosticar a ausência de LVH associada com doença hipertensiva cardíaca em um paciente que compreende a medição de níveis de MMP e/ou de TIMP em um tecido ou fluido corporal de um indivíduo e a comparação dos níveis a valores de referência. Assim, valores normais para MMP-2, MMP- 9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2 e/ou TIMP-I indicam a ausência de hipertrofia ventricular esquerda associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos os níveis plasmáticos de MMP-2 dentro de limites normais são uma indicação da ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva. Em alguns aspectos, os níveis plasmáticos de MMP-9 dentro de limites normais indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva, Em alguns aspectos, os níveis plasmáticos de MMP-13 dentro de limites normais indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-I dentro de limites normais indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva. Em alguns aspectos níveis plasmáticos de TIMP-2 dentro de limites normais indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva. Em alguns aspectos os níveis plasmáticos de TIMP-4 dentro de limites normais indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-2 acima de aproximadamente 1000 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 1000, 1100, 12 00, 13 00, 1400, e 15 00 ng/ml, indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-9 abaixo de aproximadamente 2 0 ng/ml, incluindo abaixo de aproximadamente 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, oul ng/ml, indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos detectáveis de MMP-13 acima de aproximadamente 5 ng/ml, incluindo abaixo de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ng/ml, indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-I abaixo de aproximadamente 1000 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, ou 10 ng/ml, indicam a ausência de LVK associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-2 inferiores a aproximadamente 50 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 35, 30, 25, 20, 15, ou 10 ng/ml, indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-4 inferiores a aproximadamente 2 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,5, ou 0.1 ng/ml, indicam a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

O método pode ainda compreender a medição de níveis plasmáticos de dois ou mais MMPs e/ou TIMPs. O método pode compreender, por exemplo, a medição de duas, três, quatro, cinco, seis, sete, ou oito de MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-I, TIMP-2, e TIMP-4. Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2 e MMP-9, ou de MMP-2 e MMP- 7, MMP-2 e MMP-13, MMP-2 e MMP-8, MMP-2 e TIMP-I, MMP-2 e TIMP-2, MMP-2 e TIMP-4, MMP-9 e MMP-7, MMP-9 e MMP-13, MMP- 9 e MMP-8, MMP-9 e TIMP-1, MMP-9 e TIMP-2, MMP-9 e TIMP-4, MMP-7 e MMP-13, MMP-7 e MMP-8, MMP-7 e TIMP-1, MMP-7 e TIMP-2, MMP-7 e TIMP-4, MMP-13 e MMP-8, MMP-13 e TIMP-1, MMP-13 e TIMP-13, MMP-13 e TIMP-4, MMP-8 e TIMP-1, MMP-8 e TIMP-2, MMP-8 e TIMP-4, TIMP-I e TIMP-2, TIMP-I e TIMP-4, TIMP-2 e ΤΙΜΡ-4. Portanto, ο método pode compreender a medição de MMP-2, MMP-13 e TIMP-I; MMP-2, MMP-13 e TIMP-2; MMP-2, MMP-13 e TIMP-4; MMP-13, TIMP-I, e TIMP-2; MMP-13, TIMP-I, e TIMP-4; MMP-13, TIMP-2, e TIMP-4 . Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2, MMP-13, TIMP-I, e TIMP-2; MMP-2, MMP-13, TIMP-1, e TIMP-4; MMP-2, MMP-13, TIMP-2, e TIMP-4; MMP-13, TIMP-I, TIMP-2, e TIMP-4; MMP-2, TIMP-I, TIMP-2, e TIMP-4. Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2, MMP-13, TIMP-I, TIMP-2, e TIMP-4. Outras combinações destes análitos são reivindicadas e divulgadas no presente documento.

O método pode ainda compreender o cálculo da relação de um ou mais das MMPs ou dos TIMPs para outras MMPs ou outros TIMPs. 0 método pode compreender, por exemplo, o cálculo da relação de MMP-9 para TIMP-I, TIMP-2 ou TIMP-4.

Em alguns aspectos, por exemplo, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 acima de aproximadamente 7 χ IO3, incluindo acima de aproximadamente 7 χ 103, 8 χ 103, 9 χ 103, 10 χ 103, 11 χ 103, 12 χ 103, 13 χ 103, ou 14 χ 103, indica a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 acima de aproximadamente 10 χ 104, incluindo acima de aproximadamente 10 χ 104, 20 χ 104, χ 104, ou 40 χ 104, indica a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-4 acima de aproximadamente 1, incluindo acima de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9, indica a ausência de LVH associada com doença cardíaca hipertensiva.

Os valores normais de referência e os medidos ao se testar em pacientes hipertensos são mostrados na Tabela 3. Neste caso, os valores de MMP-2 podem ser reduzidos em pacientes hipertensos com LVH sem nenhuma alteração em valores de MMP-7. No entanto, uma observação descontínua para MMP-13 ocorrerá, uma vez que ela não será detectada em pacientes hipertensos com LVH. Portanto, o ponto limite abaixo de 10 ng/mL deveria ser considerado um critério diagnóstico para hipertensão e insuficiência cardíaca. Os níveis de TIMP-I e TIMP-4 serão 50% mais elevado em pacientes hipertensos com LVH em comparação com valores de controle de referência. A relação de MMP-9/TIMP-4 será reduzida de mais de 50% em pacientes hipertensos com LVH quando comparados com valores normais de referência. Tabela 3: Dados de MMP e de TIMP; Valores normais de referência e Valores de Doença Cardíaca Hipertensiva; Pontos Limites de Porcentagem de Diagnóstico

<table>table see original document page 71</column></row><table> <table>table see original document page 72</column></row><table>

NC = nenhuma alteração de Normal *p < 0,05 em relação ao Normal 9. Teste Rápido para LVH

É proposto um resultado rápido de sim/não que pode ser obtido testando-se niveis para um MMP específico, MMP- 13. Um ponto determinado, que pode ser ajustado com base em estatísticas populacionais assim como ser ajustado para a idade, deveria ser usado com a leitura efetiva. Como um exemplo, um nível de MMP-13 abaixo de um limiar de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ng/mL, justificaria uma bateria de exames mais intensivos do plasma e estudos adicionais de imageamento cardiovascular. Em outras palavras este teste rápido poderia ser aplicado a uma grande população, o que então daria a identificação daqueles indivíduos que exigiriam um teste mais cuidadoso e acompanhamento. Atualmente não existem testes rápidos disponíveis para a identificação de pacientes com LVH.

É proposto um método de se prever uma insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, que compreende a medição da quantidade de MMP-13 em um fluido corporal proveniente do indivíduo, uma quantidade inferior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ng/mL ou indetectável indicando a presença de LVH e sendo uma previsão de DHF. Quando combinada com medições anormais de outros análitos relevantes descritos no presente documento, esta medição pode detectar DHF.

A determinação do perfil plasmático pode ser efetuada em um consulta de atendimento primário ou de teste médico. Esta medição de teste pode ser conduzida para um ou mais de MMPs e/ou TIMPs. Se a uma ou mais medições incidirem fora dos valores de referência, podem ser conduzidas medições adicionais. MMP-13, por exemplo, pode ser usada para um teste inicial tal, que se MMP-13 for não detectável, então um segundo ensaio pode ser conduzido na amostra de plasma. De modo análogo pode se empregar MMP-9 e TIMP-1, TIMP-2 e/ou TIMP-4 para um teste inicial, de modo que, se a relação de MMP-9 para TIMP-1, TIMP-2 ou TIMP-4 for inferior aos limites normais usando um limiar estabelecido, então um segundo ensaio pode ser conduzido com a amostra de plasma. O segundo teste pode ser para o perfil integral apresentado na Tabela 3 ou um subconjunto seu. Se este perfil satisfizer os critérios para a doença cardíaca hipertensiva, então o paciente pode ser avaliado por testes mais agressivos que poderiam incluir ecocardiograf ia, cateterização, imageamento nuclear conforme for adequado. O paciente pode também ser avaliado para um tratamento médico mais agressivo

10. Diagnóstico

É também proposto um método diagnóstico que pode ser usado, por exemplo, com um paciente que apresenta sinais e sintomas de CHF, mas quando a causa subjacente desta apresentação é difícil de determinar. Isto ocorre com bastante freqüência; quando um paciente tem CHF, e existe ou LVH ou DHF, e contribui para a exacerbação do processo de CHF, não pode ser facilmente determinado. O uso de um simples e rápido teste de sangue de triagem para "excluir" ou "incluir" a presença de LVH e DHF, conforme descrito neste pedido, proporcionaria esta abordagem diagnostica necessária. Mais especificamente, uma amostra de sangue seria medida para MMP-13, MMP-9, MMP-2, TIMP-I e/ou TIMP-4. Os valores obtidos seriam comparados aos valores normais de referência descritos no presente documento. Se os valores diferirem dos limites normais pelos limiares identificados no presente documento, então um paciente pode ser identificado como tendo DHF.

É proposto, por exemplo, um método de diagnóstico de LVH em um indivíduo que compreende a medição dos níveis de MMP e/ou de TIMP em um tecido ou em um fluido corporal do indivíduo e a comparação dos níveis a valores de referência.

Em alguns aspectos, os níveis plasmáticos de MMP-2 inferiores ao valor normal são uma indicação de doença cardíaca hipertensiva. Uma quantidade de MMP-2 de pelo menos aproximadamente 20% abaixo do valor médio normal pode ser uma indicação de doença cardíaca hipertensiva. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-2 abaixo de aproximadamente 1000 ng/ml, incluindo abaixo de aproximadamente 1000, 990, 980, 970, 960, 950, 940, 930, 920, 920, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250, ou 100 ng/ml, são uma indicação de doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, MMP-9 níveis plasmáticos de acima do valor normal é uma indicação de doença cardíaca hipertensiva.

Uma quantidade de MMP-9 pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de doença cardíaca hipertensiva. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-9 acima de aproximadamente 20 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 15, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 ng/ml, é uma indicação de doença cardíaca hipertensiva.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos indetectáveis de MMP-13 são uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-13 abaixo de aproximadamente 10 ng/ml, incluindo abaixo de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, oul ng/ml, são uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-I acima do valor normal é uma indicação de doença cardíaca hipertensiva. Uma quantidade de TIMP-I pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-I acima de aproximadamente 1000 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, ou 1500 ng/ml, são uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-2 acima do valor normal são uma indicação de LVH. Uma quantidade de TEMP-2 pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-2 acima de aproximadamente 5 0 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 ng/ml, são uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-4 acima do valor normal são uma indicação de LVH. Uma quantidade de TIMP-4 pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-4 acima de aproximadamente 2 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ng/ml, são uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-7 dentro de limites normais são uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-8 dentro de limites normais são uma indicação de LVH.

O método pode ainda compreender a medição dos níveis plasmáticos de dois ou mais MMPs e/ou TIMPs. O método pode compreender, por exemplo, a medição de duas, três, quatro, cinco, seis, sete, ou oito de MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP- 13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2, e TIMP-4. Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2 e MMP-9; MMP-2 e MMP-13; MMP-13 e TIMP-1; MMP-13 e TIMP-2; MMP-13 e TIMP- 4; MMP-2, MMP-13 e TIMP-I; MMP-2, MMP-13 e TIMP-2; MMP-2, MMP-13 e TIMP-4; ou MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, e TIMP- 4. Outras combinações destes análitos são reivindicadas e divulgadas no presente documento.

Quando combinado com um nível reduzido de MMP-13, por exemplo, um nível aumentado de TIMP-I (TIMP-1 > 1200 ng/mL, por exemplo) pode detectar DHF. Como um outro exemplo, quando combinada com um nível reduzido de MMP-13 e um nível aumentado de TIMP-1, uma quantidade de TIMP-4 acima de 3 ng/mL indica LVH e faz uma previsão de DHF.

Portanto, um método de detecção de LVH e de previsão de insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, dos perfis de MMP-13, TIMP-1, e TIMP-4. Os perfis em que a quantidade de MMP-13 for indetectável, a quantidade de TIMP-I for aproximadamente 50% acima do valor normal (ou acima de 12 00 ng/mL) e a quantidade de TIMP-4 for pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal (ou acima de 3 ng/mL) , são uma previsão de DHF.

0 método pode ainda compreender o cálculo da relação de uma ou mais de MMPs ou TIMPs para outros MMPs ou TIMPs. 0 método pode compreender, por exemplo, o cálculo da relação de MMP-9 para TIMP-1, TIMP-2 ou TIMP-4 .

Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 abaixo do valor normal é uma indicação de LVH. Uma relação de MMP-9/TIMP-1 pelo menos 50% abaixo do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, por exemplo, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 abaixo de aproximadamente 7 x 10"3, incluindo abaixo de aproximadamente 7 x 10"3 6 x 10"3 5 x 10"3 4 x 10"3 5 x 10"3 6 x 10"3 1 x 10"3 é uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 abaixo do valor normal é uma indicação de LVH. Uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP- 9/TIMP-2 pelo menos aproximadamente 50% abaixo do valor médio normal, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 abaixo de aproximadamente 100 χ 103, incluindo abaixo de aproximadamente 100 χ 103 7 90 χ 103, 80 χ 103, 70 χ 103, 60 X 103, 50 χ 103, 40 χ 103, 30 χ 103, 20 χ 103, ou 10 χ 103, é uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-4 abaixo do valor normal é uma indicação de LVH. Uma relação de MMP-9/TIMP-4 pelo menos aproximadamente 50% abaixo do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-4 abaixo de aproximadamente 3, incluindo abaixo de aproximadamente 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,05, ou 0,01, é uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 abaixo de aproximadamente 5 χ 103i uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 abaixo de aproximadamente 100 χ IO3 e uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-4 abaixo de aproximadamente 1 é uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-2 abaixo de aproximadamente 1000 ng/ml, níveis plasmáticos de MMP-13 abaixo de aproximadamente 5 ng/ml, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 abaixo de aproximadamente 5 χ IO3, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 de abaixo de aproximadamente 100 χ IO3 e uma relação entre níveis plasmáticos de MMP- 9/TIMP-4 abaixo de aproximadamente 1 é uma indicação de LVH.

11. Prognóstico

Também é proposto um método de prognóstico de insuficiência cardíaca diastõlica que pode ser usado, por exemplo, com um indivíduo que foi escolhido no teste e em seguida através de um perfil plasmático subseqüente foi confirmado que tem LVH grave e corre o risco de desenvolver DHF. Neste caso, o nível de MMP-13 será quantificado assim como os níveis de TIMP. Um nível de MMP-13 baixo/indetectável (0-5 ng/mL) acoplado com altos níveis de TIMP (tal como TIMP-I > 1200 ng/mL, TIMP-2>700 ng/mL, e/ou TIMP-4 > 3 ng/mL) em comparação com indivíduos normais de referência acoplados com níveis de TIMP provavelmente fornecerá uma visão crítica do grau de fibrose miocardiana e de disfunção diastólica. Isto contém um valor de prognóstico no tocante ao progresso de sintomas e hospitalização. Mais especificamente, estes pacientes podem ser mais agressivamente tratados com medicação anti- hipertensiva e terem estudos de imageamento cardiovascular mais regulares.

É proposto, por exemplo, um método de se identificar um indivíduo que apresenta um risco maior de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica (DHF), que compreende a medição de MMP e/ou níveis de TIMP em um tecido ou fluido corporal do indivíduo e comparação dos níveis a valores de referência.

E alguns aspectos, os níveis plasmáticos de MMP-2 abaixo do valor normal são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Uma quantidade de MMP-2 pelo menos aproximadamente 20% abaixo do valor médio normal, por exemplo, pode ser uma indicação de um risco aumentado para desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-2 abaixo de aproximadamente 500 ng/mL, incluindo abaixo de aproximadamente 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250, ou 100 ng/ml, são uma indicação de um aumento do risco de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos indetectáveis de MMP-13 são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-13 abaixo de aproximadamente 10 ng/ml, incluindo abaixo de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, oul ng/ml, são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-I acima do valor normal são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Uma quantidade de TIMP-I pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-I acima de aproximadamente 1000 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ou 2000 ng/ml, são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-2 acima do valor normal são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Uma quantidade de TIMP-2 pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-2 acima de aproximadamente 5 0 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 ng/ml, são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-4 acima do valor normal são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Uma quantidade de TIMP-4 pelo menos aproximadamente 5 0% acima do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de TIMP-4 acima de aproximadamente 2 ng/ml, incluindo acima de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 ng/ml, são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-9 dentro de limites normais são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-7 dentro de limites normais são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-8 dentro de limites normais são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica.

O método pode ainda compreender a medição de níveis plasmáticos de duas ou mais MMPs e/ou TIMPs. O método pode, por exemplo, compreender a medição de duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito de MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-I, TIMP-2, e TIMP-4. Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2 e MMP-9, MMP-2 e MMP-7, MMP- 2 e MMP-13, MMP-2 e MMP-8, MMP-2 e TIMP-1, MMP-2 e TIMP-2, MMP-2 e TIMP-4, MMP-9 e MMP-7, MMP-9 e MMP- 13, MMP-9 e MMP-8, MMP-9 e TIMP-1, MMP-9 e TIMP-2, MMP-9 e TIMP-4, MMP- 7 e MMP-13, MMP-7 e MMP-8, MMP-7 e TIMP-1, MMP-7 e TIMP-2, MMP-7 e TIMP-4, MMP-13 e MMP-8, MMP-13 e TIMP-1, MMP-13 e TIMP-13, MMP-13 e TIMP-4, MMP-8 e TIMP-1, MMP-8 e TIMP-2, MMP-8 e TIMP-4, TIMP-1 e TIMP-2, TIMP-1 e TIMP-4, TIMP-2 e TIMP-4. Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2, MMP-13 e TIMP-1; MMP-2, MMP-13 e TIMP-2; MMP-2, MMP- 13 e TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, e TIMP-2; MMP-13, TIMP-1, e TIMP-4; MMP-13, TIMP-2, e TIMP-4. Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2, MMP-13, TIMP-1, e TIMP-2; MMP-2, MMP-13, TIMP-1, e TIMP-4; MMP-2, MMP-13, TIMP-2, e TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, e TIMP-4; MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, e TIMP-4. Portanto, o método pode compreender a medição de MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, e TIMP-4. Outras combinações destes análitos são reivindicadas e descritas no presente documento.

É proposto um método, por exemplo, de se detectar insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, e que compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 e MMP-9. É também proposto um método de se prever insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, que compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 e MMP-9. Nestes métodos, os perfis podem mostrar uma quantidade de MMP-13 que é indetectável (ou inferior a 10 ng/mL) , uma quantidade de TIMP-I que está aproximadamente 50% acima do valor normal ou acima de 1200 ng/mL, uma quantidade de TIMP-4 que é pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal ou acima de 3 ng/mL e uma quantidade de MMP-9 que é pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal pode detectar LVH e DHF.

É também proposto um método de detecção de insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, que compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 e MMP-2. É também proposto um método de se prever insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, que compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de MMP-13, TIMP-I, TIMP-4 e MMP-2. Nestes métodos, os perfis podem mostrar uma quantidade de MMP-13 que é indetectável (ou abaixo de 10 ng/mL) , uma quantidade de TIMP-I que está aproximadamente 50% acima do valor normal (ou acima de 1200 ng/mL) , uma quantidade de TIMP-4 que está pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal (ou acima de 3 ng/mL) e a quantidade de MMP-2 está pelo menos aproximadamente 20% abaixo do valor normal (ou abaixo de 120 0 ng/mL).

O método pode ainda compreender o cálculo da relação de uma ou mais de MMPs ou TIMPs para outras MMPs ou TIMPs. O método pode compreender, por exemplo, o cálculo da relação de MMP-9 to TIMP-1, TIMP-2 ou TIMP-4.

Em alguns aspectos, uma relação entre os níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 abaixo do valor normal é uma indicação de LVH. Uma relação de MMP-9/TIMP-1 pelo menos aproximadamente 50% abaixo do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica. Em alguns aspectos, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP- 9/TIMP-l abaixo de aproximadamente 7 χ 10"3, incluindo abaixo de aproximadamente 7 χ IO3, 6 χ 10"3, 5 χ 10"3, 4 χ 10"3, 5 χ 10"3, 6 χ 10"3, 1 χ 10"3, 9 χ 10"2, 8 χ 10"2, 7 χ 10"2, 6 χ 10"2, 5 χ 10"2, 4 χ 10"2, 3 χ 10"2, 2 χ 10"2, ou 1 χ 10"2, por exemplo, são uma indicação de um risco aumentado de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica.

Em alguns aspectos, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 abaixo do valor normal é uma indicação de LVH. Uma relação de MMP-9/TIMP-2 pelo menos aproximadamente 50% abaixo do valor normal médio, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 abaixo de aproximadamente 100 χ 10"3, incluindo abaixo de aproximadamente 100 χ 10"3, 90 χ 10"3, 80 χ 10"3, 70 χ 10"3, 60 χ 10"3, 50 χ 10"3, 40 χ 10"3, 30 χ 10"3, 20 χ 10"3, 10 χ 10"3, 9 χ 10"3, 8 χ 10"3, 7 χ 10"3, 6 χ 10"3, 5 χ 10"3, 4 χ 10"3, 3 χ 10"3, 2 χ 10"3, ou 1 χ 10"3, é uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-4 abaixo do valor normal médio é uma indicação de LVH. Uma relação de MMP-9/TIMP-4 pelo menos aproximadamente 10 0% abaixo do valor médio normal, por exemplo, pode ser uma indicação de LVH. Em alguns aspectos, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP- 9/TIMP-4 abaixo de aproximadamente 1, incluindo abaixo de aproximadamente 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,25, 0,2, 0,15, 0,10, 0,05, ou 0,01, é uma indicação de LVH.

Portanto, é proposto um método de detecção ou previsão de insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, que compreende a detecção de uma redução na relação de MMP-9 para TIMP-4 em um fluido corporal proveniente do indivíduo em comparação com a relação normal. O método envolve a medição de uma redução na relação de pelo menos aproximadamente 50% em comparação com a relação normal.

Em alguns aspectos, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 abaixo de aproximadamente 5 χ 10^3, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 abaixo de aproximadamente 100 χ 10^3 e uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-4 abaixo de aproximadamente 1 é uma indicação de LVH.

Em alguns aspectos, níveis plasmáticos de MMP-2 abaixo de aproximadamente 1000 ng/ml, níveis plasmáticos de MMP-13 abaixo de aproximadamente 5 ng/ml, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 abaixo de aproximadamente 5 χ 10^3, uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 abaixo de aproximadamente 100 χ 10^3 e uma relação entre níveis plasmáticos de MMP-9/TIMP-4 abaixo de aproximadamente 1 é uma indicação de LVH. 12. Guiando Intervenções Terapêuticas

No tocante ao tratamento níveis baixos de MMP-13 e altos de TIMP poderiam ser monitorados como um indicador de eficácia farmacológica. Há diversas situações clínicas relevantes para as quais isto seria extremamente aplicável. Embora um paciente hipertenso possa ter uma pressão sangüínea dentro de "limites normais", por exemplo, MMP-13 permanece suprimido e os níveis de TIMP estão aumentando. A supratitulação de determinados medicamentos anti- hipertensivos poderia então ser utilizada para "normalizar" estes marcadores biológicos de fibrose miocardiana e insuficiência cardíaca diastólica. A finalidade desta abordagem seria de se medir em série os valores sangüíneos das MMPs e TIMPs apresentadas na Tabela 3 e para aumentar a medicação a fim de levar estes perfis para incidir na faixa normal de referência.

Nos pacientes hipertensos que foram identificados como tendo uma massa cardíaca aumentada (tamanho) devido a uma pressão sangüínea alta, os perfis de MMP/TIMP podem ser utilizados para acompanhar a adequacidade do tratamento. Os perfis específicos identificados descritos o presente documento seriam monitorados e a eficácia de tratamento determinada à medida que estes perfis de MMP/TIMP se dirigissem para os limites normais.

Os perfis de MMP/TIMP são baseados em medições de MMPs ou TIMPs individuais. A quantidades destes podem ser medidas por qualquer meio conhecido para produzir uma indicação aceitável de quantos de qualquer um destes estão presentes na amostra que estiver sendo analisada. Um exemplo de um meio de medição é dado nos Exemplos. O processo de medição de uma quantidade de um analito (MMP ou TIMP, por exemplo) inclui uma medição de nenhuma quantidade ou de uma quantidade indetectável do análito. As técnicas e abordagens para a medição de MMPs e TIMPs que formam a base deste método são baseadas em imunoensaios de alta sensibilidade. Diversos destes imunoensaios foram desenvolvidos por este laboratório (isto é, as medições de ensaio de TIMP-4).

A abordagem de imunoensaio que foi padronizada para fornecer as medições mostradas na Tabela 1 foi conduzida por um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) . No entanto outros métodos mais sensíveis e rápidos para a medição de níveis sangüíneos de MMPs e TIMPs foram conduzidos por este laboratório e estes incluem o uso de um sistema multiplex de ensaios. Neste exemplo, uma multiplicidade de análitos em amostras de volume limitado, tais como de plasma ou de um outra amostra biológica, pode ser medida usando-se um imunoensaio multiplex em sanduíche à base de microesferas. A técnica emergente para a análise multiplex é construída sobre uma tecnologia que combina a sensibilidade de ELISA com detecção citométrica de fluxo, permitindo a medição específica de até 100 diferentes análitos dentro de uma única amostra de menos de 50 pL. Esta abordagem permitirá a medição de uma multiplicidade de MMPs e TIMPs em uma pequena amostra de sangue. Este tipo de abordagem pode ser usado para aplicações de diagnóstico, prognóstico, previsão e monitoração terapêutica que são descritas no presente documento. Mais especificamente, para se medir as concentrações de análitos simultaneamente, as microesferas são incubadas juntamente com uma amostra (isto é, uma amostra de sangue) e deixa-se que ela forme complexos com os análitos específicos de interesse (isto é, com as MMPs). Os anticorpos de detecção (biotinilados) específicos para um segundo epítopo em cada análito são então acrescentados à mistura e deixa-se que se liguem às microesferas complexadas com o análito. A mistura é então incubada com uma molécula repórter fluorescente (estreptavidina- ficoeritrina) e faz-se passar a amostra integral através de um detector citométrico de fluxo de dois lasers. Um laser detecta a fluorescência precisa da microesfera que define o análito específico que estiver sendo examinado e o outro laser detecta a quantidade de fluorescência repórter que é diretamente proporcional à quantidade do análito ligado. Este processo foi aplicado a uma série de MMPs e a outros análitos que tem um potencial para o processo de CHF e estes são apresentados na Figura 16 e na Tabela 1. Este é somente um exemplo do modo como análitos individuais, ou uma multiplicidade deles, podem ser medidos com uma amostra muito pequena de sangue. Outros exemplos de medições que foram conduzidas por este laboratório com referência a análitos de MMP/TIMP incluem rádio-imunoensaios e ensaios de imunotransferência. Estas abordagens são também à base de anticorpos. 13. Combinação

Os métodos divulgados no presente documento podem ainda compreender a detecção de outros marcadores de insuficiência cardíaca. Os métodos divulgados no presente documento, por exemplo, podem ainda compreender a medição de níveis de NT-proBNP em um tecido ou em um fluido corporal do indivíduo e a comparação dos níveis a valores de referência. Os métodos descritos no presente documento podem ainda compreender a medição de níveis de Troponina-I em um tecido ou em um fluido corporal do indivíduo e a comparação destes níveis a valores de referência. 14. Ocasião das Medições

Conforme será descrito abaixo e explicado em exemplos subseqüentes para se testar e se monitorar terapeuticamente a ocasião das medições seria específico ao contexto. Para se testar, isso pode ser a qualquer momento em que um indivíduo se apresentar para um exame médico. Exemplos destes momentos incluiria o exame anual, feiras de saúde e o teste por meio de instalações residenciais. Assim, o método de diagnóstico divulgado pode ser usado para se diagnosticar um indivíduo que apresentar sinais e sintomas de CHF, mas quando a causa subjacente para esta apresentação for difícil de ser determinada.

Há pelo menos três pontos no tempo iniciais para se levantar o perfil de MMP/TIMP para os métodos divulgados no presente documento. As medições iniciais podem ser feitas em um paciente que se apresentar para uma visita clínica de rotina com um histórico de hipertensão estabelecida. As medições iniciais podem ser feitas a uma feita de saúde que precipitaria uma visita clínica. As medições iniciais podem ser feitas em um paciente que apresentar sintomas devidos a uma insuficiência cardíaca hipertensiva. O esquema da abordagem de coleta de amostras e de diagnóstico para cada uma destas circunstâncias é mostrado nas Figuras 9A-C para cada um destes casos.

Portanto, o método divulgado de prognóstico pode ser usado para se identificar se um indivíduo que apresenta pressão sangüínea alta (hipertensão) tem LVH ou está correndo o risco de desenvolver DHF. O método divulgado de prognóstico pode também ser usado para identificar se um indivíduo que apresenta sinais e sintomas de CHF tem LVH e corre o risco de desenvolver insuficiência cardíaca diastólica (DHF). O método pode ser usado, por exemplo, com um paciente que se apresenta ao clínico com queixas consistentes com CHF. O clínico pode então aplicar os testes de sangue para determinar se está presente um perfil de MMP/TIMP coerente com LVH e DHF. Isto guiaria o clínico a outros testes de diagnóstico e a planos de tratamento.

Um outro exemplo de momentos de tomada de amostra de sangue seria quando um paciente já foi identificado como tendo LVH estabelecida, podendo então a monitoração em série de perfis de MMP/TIMP ser usada como ferramenta de previsão para o progresso de DHF. Estes testes poderiam ser aplicados somente uma vez como uma ferramenta de teste ou aplicados uma multiplicidade de vezes e em seqüência em qualquer indivíduo dado.

C. Kits.

São divulgados no presente documento kits que são projetados para reagentes que podem ser usados na colocação em prática dos métodos descritos no presente documento. Os kits podem incluir qualquer reagente ou combinação de reagentes discutidos no presente ou que ficaria subentendido que seriam necessários ou benéficos na colocação me prática dos métodos divulgados. É divulgado, por exemplo, um kit para se avaliar o risco de um indivíduo de desenvolver DHF, incluindo neste caso os componentes os componentes descritos na seção anterior. Os componentes de um kit de MMP/TIMP, por exemplo, incluiriam os reagentes necessários para se complexar o MMP e/ou TIMP relevante de interesse (Veja a Tabela 3 para a lista de MMPs e TIMPs relevantes) com um reagente de detecção no exemplo de uma abordagem de imunoensaio, um anticorpo rotulado de modo fluorescente contra uma MMP específica ou um TIMP específico seria incubado com a amostra de sangue e depois de uma etapa de lavagem e de eliminação da ligação não específica, a quantidade do anticorpo ligado à MMP ou ao TIMP de interesse seria computada por medição do grau relativo de fluorescência. Este kit pode consistir em um kit muito simples que poderia ser usado para um teste de triagem, ou um sistema mais complexo em que uma multiplicidade de MMPs/TIMPs é medida a partir de uma única amostra. A essência de uma abordagem graduada para a medição de uma MMP ou TIMP de interesse para se medir uma multiplicidade de MMPs/TIMPs simultaneamente foi descrito em uma seção anterior. Para o ensaio de teste de triagem (isto é, de MMP-13) , a pequena amostra de sangue seria processada em plasma (centrifugação) e o plasma seria misturado com o anticorpo direcionado a MMP-13. A mistura seria novamente centrifugada e o anticorpo especificamente ligado a MMP-13 seria lido por um sistema fluorimétrico. Este equipamento e este sistema de medições poderiam ser facilmente configurados em um sistema em uma pequena valise ou de mesa. O monitor do sistema indicaria então se MMP-13 se encontra abaixo ou acima de uma medição de limiar específica (conforme já definido em uma seção anterior).

D. Exemplos

1. Exemplo 1: Metaloproteinases de

Matriz/Inibidores Teciduais de Metaloprotinases: Relação entre Alterações em Determinantes Proteolíticos da Composição da Matriz e Manifestações Estruturais, Funcionais e Clínicas da Doença Cardíaca Hipertensiva

Sumário de Métodos e Resultados: MMP-2, MMP-9, MMP- 13 e TIMP-I, TIMP-2 plasmáticas e a ecocardiografia Doppler foram obtidos em 103 indivíduos divididos em 4 grupos: a) indivíduos de referência (CTL) sem nenhuma evidência de doença cardiovascular, b) hipertensão (HTN) , pressão sangüínea controlada e nenhuma hipertrofia do LV, c) hipertensão, pressão sangüínea controlada com hipertrofia do LV (HTN Sc LVH) , mas sem CHF, d) hipertensão, pressão sangüínea controlada, LVH e CHF (HTN & LVH & CHF) . Em comparação com CTL, os pacientes com HTN não apresentaram nenhuma alteração significativa em nenhuma das MMPs ou TIMPs. Os pacientes com HTN & LVH tiverem uma redução em MMP-2 e MMP-13 e um aumento de MMP-9. Somente pacientes com HTN & LVH & CHF tiveram um aumento em TIMP-I. TIMP-I > 12 00 ng/mL foi uma previsão de CHF.

Conclusão: Os pacientes com hipertensão, mas com uma estrutura e função normais de LV tinham perfis normais de MMP/TIMP. As alterações em perfis de MMP que propiciam uma redução da degradação de ECM foram associadas com hipertrofia de LV e com a disfunção diastólica. Um aumento de TIMP-I previu a presença de CHF. Estes dados indicam que alterações no equilíbrio MMP/TIMP representam um papel importante nas manifestações estruturais, funcionais e clínicas da doença cardíaca hipertensiva.

Métodos

Indivíduos: Dois grupos de indivíduos foram recrutados para este estudo: controles de referência e pacientes com LVH. Os controles de referência foram identificados de feiras de saúde patrocinadas localmente e de voluntários do corpo de funcionários da Universidade de Medicina de Carolina do Sul. Dos controles de referência triados, 35% foram aceitos, 50% satisfizeram um dos critérios de exclusão relacionados abaixo e 15% recusaram participar. Os pacientes com LVH foram identificados a partir de estudos ecocardiográficos. Dos pacientes triados por ecocardiogramas, 10% foram incluídos, 75% satisfizeram um dos critérios de exclusão relacionados abaixo e 15% recusaram participar. Houve alguns critérios de exclusão comuns aos dois grupos:

1) histórico de infarto do miocárdio, 2) anomalia de movimento de parede regional, 3) cirurgia de revascularização coronária, 4) amiloidose, sarcoidose, HIV, cardiomiopatia obstrutiva hipertrõfica, doença cardíaca valvular, 5) fração de ejeção < 50%, 6) malignidade, 7) disfunção renal ou hepática significativa, 8) doença reumatológica, 9) pressão sangüínea > 140/90 mmHg.

Cento e três indivíduos foram incluídos neste estudo: 53 indivíduos de controle de referência e 50 indivíduos com uma evidência de LVH [espessura de parede LV de > 1,2 cm e/ou índice de massa de LV ≥ 125 g/m2 (Tabela 4]. Os indivíduos de controle de referência foram subdivididos em dois grupos com base na presença ou na ausência de hipertensão; 3 9 indivíduos de controle (a que se refere como "Controle de referência sem hipertensão) não têm nenhum histórico de hipertensão, nenhuma evidência de doença cardiovascular (CV), nenhum sintoma ou evidência física de doença cardiovascular, nenhuma medicação cardiovascular e todas as medições ecocardiográficas se encontram dentro de limites normais (Tabela 5) ; e 14 pacientes (a que se refere como "Controle de referência com hipertensão") tiveram um histórico de hipertensão arterial, pressão sangüínea controlada (farmacologicamente tratados para satisfazer os critérios de JNC 7 isto é, < 14 9/90 mmHg) nenhuma hipertrofia ventricular esquerda (Chobanian AV, et al. 2003) e todas as medições ecocardiográf icas se encontrando dentro dos limites normais (Tabela 5) .

Tabela 4: Dado Demográfico, Estrutura/Função Ventricular Esquerda e Dados de MMP/TIMP

<table>table see original document page 94</column></row><table> <table>table see original document page 95</column></row><table>

Abreviaturas: Os dados consistem em média ± erro padrão médio, LV = Ventricular Esquerdo, LVH - pacientes com hipertrofia ventricular esquerda hipertensiva, Controle de Referência = pacientes sem nenhuma evidência de doença cardiovascular, IVRT = tempo de relaxamento isovolúmico, PCWP = pressão de cunha capilar pulmonar, MMP = matriz metaloproteinase de matriz, TIMP = inibidor tecidual de MMP, * = ρ < 0,05 em comparação com o controle de referência

Tabela 5: Controles de Referência com e sem Hipertensão, LVH com e sem CHF

<table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table>

Abreviaturas: Os dados são média ± erro médio padrão, LV = Ventricular Esquerdo, PCWP = pressão de cunha capilar pulmonar, EDV = volume diastólico final, Ea -elastância efetiva arterial, MMP = metaloproteinase de matriz, TIMP = inibidor tecidual de MMP, LVH = Hipertrofia Ventricular Esquerda, CHF = Insuficiência Cardíaca Crônica, Diferenças significativa entre todos so 4 grupos foram analisadas usando-se testes de comparação múltipla ANOVA e de Tukey, * = ρ < 0,05 em relação ao controle de referência sem Hipertensão, # = ρ < 0,05 em comparação com o controle de referência com hipertensão, Δ = ρ < 0,05 em comparação com LVH sem CHF.

Os pacientes com LVH foram subdivididos em dois grupos com base na presença ou na ausência de CHF. Referiu- se a 23 pacientes com hipertensão, pressão sangüínea controlada, com LVH, mas sem CHF como sendo "LVH sem CHF" (Tabela 5) . 0 segundo subgrupo consistia em 26 pacientes com hipertensão, pressão sangüínea controlada, LVH e CHF e se referiu a eles como "LVH com CHF" . Todos estes pacientes tinham evidência de chf definida de acordo com os critérios de Framingham (Levy D., et al. 1996), evidência de relaxamento anormal (E' reduzido), aumento de rigidez (PCWP aumentado e uma relação PCWP/EDV aumentada) , uma distância de caminhada de 6 minutos nitidamente reduzida (979 ± 86 pés (298,40 ± 26,21 metros) no grupo de LVH com CHF em comparação com 1839 ± 60 pés (560,53 ± 18,29 metros), ρ < 0,05 no grupo de LVH sem CHF), EP > 50% e, portanto, tinham insuficiência cardíaca diastólica.

As medicações usadas para o tratamento da hipertensão foram escolhidas e monitoradas pelo clínico principal do paciente e não pelos investigadores. Elas incluíam diuréticos, antagonistas de renina-angiotensina- aldosterona (inibidores de enzima conversora de angiotensina, bloqueadores de receptor de angiotensina II e bloqueadores de aldosterona), vasodilatadores diretos (nitratos, hidralazina) , bloqueadores alfa adrenérgicos, bloqueadores do sistema nervoso central, aspirina, bloqueadores de receptores beta adrenérgicos e bloqueadores de canais de cálcio. A duração média do tratamento anti- hipertensivo foi de 6,4 + 1,5 anos.

Métodos Ecocardiográficos. Os ecocardiogramas foram conduzidos usando-se um sistema Sonos 5500 com um transdutor S-4 MHz. As medições foram efetuadas usando-se os critérios da American Society of Echocardiography (Sahn DJ, et al., 1978; Schiller NB, et al. 1989). Os volumes de LV e esquerdo atrial foram calculados usando-se o método de discos (Schiller NB, et al. 19) . A massa de LV foi calculada usando-se a fórmula de Reichek e Devereux (Devereux RB, et al. 1986). Foram conduzidas a medição Doppler de velocidade de onda E e A do influxo mitral, a relação E/A, o tempo de desaceleração da onda E, e o tempo de relaxamento (IVRT). Foi efetuada a medição Doppler tecidual (ânulo mitral lateral) da velocidade de onda E' e A'. A pressão de cunha capilar pulmonar (PCWP) foi calculada usando-se a fórmula: 2 + 1/3 E/E' (Nagueh SF, et al. 1998). A elastância arterial efetiva (Ea) foi calculada usando-se a fórmula: pressão sistólica final/volume de passo.

Medições de MMP/TIMP Plasmáticos: Gelatinases (MMP- 2 e MMP-9) , colagenase (MMP-13); e inibidores teciduais de MMPs (TIMP-1 e TIMP-2) foram examinadas usando-se kits de ensaio imunossorvente ligado a enzima de dois sítios (ELISA) (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, GB) . Plasma e padrões de MMP respectivos foram acrescentados a poços pré-revestidos contendo o anticorpo a MMP ou a TIMP de interesse e lavados. A reação resultante foi lida a um comprimento de onda de 450 nm (Labsystems Multiskan MCC/340, Helsinki, Finlândia) . Como MMP-13 foi encontrado a níveis muito baixos no plasma, os resultados de MMP-13 foram divididos em detectáveis e não detectáveis.

Análise Estatística: MMP e TIMPs forma medidos a cada 2 horas durante um período de 6 horas para se calcular um coeficiente de variância para medições de MMP/TIMP entre indivíduos e intra-indivíduos em um subgrupo de indivíduos de controle de referência (n = 20) usando-se um ANOVA de efeitos aleatórios de uma via. Em seguida o coeficiente foi calculado como a raiz quadrada do quadrado do erro médio intra-pessoal multiplicado por 100. 0 coeficiente de variação intra-paciente para MMP-2 = 11,2 ± 1,1%, para TIMP-I = 8,5 ± 2,2% e para TIMP-2 = 14,3 ± 1,7%. Um coeficiente intra-ensaio de variação quantificando a variação na técnica de ensaio propriamente dita foi inferior a 6% para todos os MMPs e TIMPs.

Inicialmente as comparações entre os controles de referência contra indivíduos com LVH foram feitas usando-se um teste Student t de 2 casas decimais. Subseqüentemente, as comparações entre todos os 4 grupos (controle de referência com hipertensão contra controle sem hipertensão contra LVH com CHF contra LVH sem CHF) foram analisados usando-se testes de ANOVA e de Tukey de comparações múltiplas. Um valor ρ < 0,05 foi considerado significativo. Foi usada uma regressão linear simples para se examinar a relação entre os níveis de MMP e de TIMP e medições de estrutura e função de LV. Foram usadas curvas de chi quadrado de Mantel Hanzel e operacionais receptoras para se avaliar a associação entre os níveis de MMP-13 e TIMP-I e a presença de LVH e de CHF. Os efeitos potenciais dos medicamentos sobre a estrutura, função ou dados de plasma foram examinados primeiro por uma análise de regressão univariada e em seguida por uma multivariada. A medição da estrutura, função, MMP ou TIMP foi a variável dependente com a medicação lançada como uma variável falsa. Uma droga única foi examinada e em seguida foram examinadas drogas em combinação.

O protocolo de pesquisa usado neste estudo foi revisado e aprovado pelo painel de revisão institucional da Medicai University of South Carolina. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes. Os autores tiveram total acesso aos dados e respondem por sua integridade. Todos os autores leram e acordaram o manuscrito conforme redigido

Resultados

Controle de referência, comparado com LVH

Dados de Função/Estrutura: Os indivíduos de controle de referência tinham uma distribuição de idade e gênero análoga à dos indivíduos com LVH (Tabelas 3 e 4) . Em comparação com o controle de referência, LVH tinham uma pressão sangüínea sistólica mais elevada, uma remodelação concêntrica significativa, conforme evidenciado por um índice de massa de LV acima de 60%, nenhuma diferença no volume diastólico final e uma relação de volume diastólico final de LV para massa 4 0% mais baixo. Em comparação com o controle de referência, LVH tinha anomalias significativas nos índices de relaxamento diastólico de LV e rigidez diastólica de LV; IVRT aumentado, tempo de desaceleração de onda e aumentado, E' reduzido, aumento da pressão de cunha capilar pulmonar e uma relação aumentada de PCWP para volume diastólico final de LV (0,16 ± 0,01 mmHg/mL em LVH) em comparação com o controle de referência (0,09 ± 0,01 mmHg/mL, ρ < 0,05), sugerindo que houve um aumento na rigidez operacional diastólica final instantânea de LV.

Perfis plasmáticos de MMP e TIMP: Em comparação com O controle de referência, MMP-2 estava diminuída, e MMP-9 estava aumentada em LVH. Foram constatadas diferenças significativas em detectabilidade de MMP-13 (Figura 1).

Quarenta e sete por cento dos indivíduos de controle de referência tinham um nível detectável de MMP-13, ao passo que MMP-13 era detectável em somente 15% dos indivíduos com LVH (x2 = 17,89, p < 0,001, relação provável = 0,24). TIMP- 1 plasmático tinha aumentado significativamente em LVH em comparação com o controle de referência. TIMP-2 e as relações MMP-9/TIMP-1 e MMP-2/TIMP-2 não apresentaram diferenças entre o controle de referência e LVH.

Controles de referência sem hipertensão comparados com controles de referência com hipertensão

Dados de Estrutura/Função: Os indivíduos de controle de referência sem hipertensão serviram como grupo de controle de referência com a idade e gênero correspondentes para comparação com o controle de referência com hipertensão, o grupo com LVH sem CHF e o grupo com LVH com CHF. Não houve nenhuma diferença significativa em qualquer parâmetro demográfico ou qualquer medição ecocardiográfica da estrutura ou função do LV entre so controles de referência sem hipertensão quando comparados com controle de referência com hipertensão (Tabelas 3 e 4) . 0 volume máximo atrial esquerdo (LAMV) e a fração de esvaziamento atrial esquerda (LAEF) eram análogas nos controles de referência sem hipertensão (LAMV =40+2 mL, LAEF = 4 2 ± 3%) quando comparados com os controles de referência com hipertensão (LAMV = 42 ± 4 mL, LAEF = 43 ± 2%) .

Perfis plasmáticos de MMP e TIMP: Não houve nenhuma diferença significativa em nenhum nível plasmático de MMP ou TIMP entre os indivíduos de controle de referência sem hipertensão e os do controle de referência com hipertensão.

LVH sem CHF comparados com LVH com CHF

Dados de Estrutura/Função: Não houve nenhuma diferença significativa em pressão sangüínea sistólica, volume de LV, ou massa de LV entre os indivíduos com LVH sem CHF e os com LVH com CHF (Tabela 5) . No entanto a função diastólica estava significativamente mais comprometida em indivíduos com LVH com CHF em comparação com os com LVH e sem CHF. Os índices de relaxamento diastólico eram mais lentos, a rigidez diastólica era maior e as pressões de enchimento eram superiores em indivíduos com LVH com CHF quando comparados com os com LVH sem CHF. Mais especificamente nos pacientes com LVH sem CHF, E' de Doppler tecidual foi reduzido (8,4 ± 0,4 cm/seg com intervalos de confiabilidade (CI) de 95% de 7,4, 9,3) em comparação com os controles de referência sem hipertensão (10 ± 0,4 cm/seg, CI de 95% = 9,3, 11) e controles de referência com hipertensão (9,8 ± 0,5 cm/seg, CI de 95% = 8,1, 11) . E' caiu ainda mais no grupo com LVH com CHF (7,2 ± 0,5 cm/seg, CI de 95% = 6,2, 8,3). Nos pacientes com LVH sem CHF, PCWP estava inalterado (13 ± 2 mmHg, CI de 95% = 10,5, 15,2) em comparação com controles de referência sem hipertensão (10 ± 1 mmHg, CI de 95% = 9,3, 10,6) e controles de referência com hipertensão (11 + 1 mmHg, CI de 95% - 9,1, 12,2), mas aumentado em pacientes com LVH com CHF (17 ± 2 mmHg, CI de 95% = 15,2, 17,7). A relação de PCWP pelo volume diastólico final de LV não tinha se alterado em pacientes com LVH sem CHF, mas tinha significativamente aumentado em pacientes com LVH com CHF. A elastância arterial efetiva tinha aumentado em pacientes com LVH sem CHF e tinha diminuído em pacientes com LVH com CHF. LAMV tinha aumentado em pacientes com LVH sem CHF (LAMV - 53 ± 4 mL, ρ < 0,05, em comparação com o controle de referência) e tinha aumentado ainda mais nos pacientes com LVH com CHF (LAMV = 70 ± 5 mL, ρ < 0,05 em comparação com pacientes com LVH sem CHF) . LAEF permaneceu inalterado nos pacientes com LVH com CHF (LAEF = 42 + 3%, ρ < 0,05 em comparação com os controles de referência) , mas tinha aumentado em pacientes com LVH com CHF (LAEF - 48 ± 2% em comparação com pacientes com LVH sem CHF) .

Perfis plasmáticos de MMP e TIMP: Não houve nenhuma diferença significativa em MMP-2, MMP-9, MMP-13, TIMP-2 ou nas relações MMP/TIMP em pacientes com LVH sem CHF em comparação com pacientes com LVH com CHF (Figura 1) . nO entanto TIMP-I tinha aumentado significativamente em pacientes com LVH com CHF (13 64 ± 8 6 ng/mL, CI de 95% = 1185, 1543) em comparação com pacientes com LVH sem CHF (1092 ± 77 ng/mL, CI de 95% = 933, 1252). Na verdade TIMP-I tinha se elevado somente nos indivíduos com CHF. TIMP-I permaneceu inalterado nos pacientes com LVH sem CHF em comparação com os controles de referência sem hipertensão (1000 ± 42 ng/mL, CI de 95% = 915, 1085) e os controles de referência com hipertensão (988 ± 76 ng/mL, CI de 95% = 824,1152).

Relação entre os perfis plasmáticos de MMP e de TIMP e a estrutura e função de LV: Houve uma relação significativa entre TIMP-I e a extensão de remodelação de LV. À medida que TIMP-I aumentava, aumentava a massa de LV (r - 0,30, ρ - 0,005) e diminuía a relação volume/massa (r -0,56, ρ = 0,001. Figura 2A) , Houve uma relação significativa entre TIMP-I e a extensão da disfunção diastólica. À medida que TIMP-I aumentava a relação E/A mitral diminuía (r = -0,22, ρ < 0,027), E' caía (r = -0,62, ρ = 0,001, Figura 2B) , e aumentava o PCWP (r = 0,28, ρ = 0,013). Finalmente existe uma relação significativa entre a extensão de CHF e os níveis de TIMP-1. 0 valor médio de TIMP-I era superior em pacientes com LVH com CHF que eram da classe III de NYHA do que nos da classe II. Ter-se um nível de TIMP-I de >1200 ng/mL era uma previsão de se ter LVH com CHF (x2 = 4,6, ρ = 0,03, especificidade = 88% e valor de previsão positiva = 94%, relação de probabilidade = 3,54, intervalos de confiabilidade de 95% = 1,08, 11,50). A área sob a curva operadora de receptor (ROC) era de 0,71.

Não havia nenhuma relação entre o uso de uma medicação específica e diferenças na estrutura de LV ou perfis plasmáticos de MMP/TIMP entre grupos. Mais especificamente não havia nenhuma diferença em qualquer nível de MMP ou de TIMP entre pacientes agrupados por qualquer medicação ou combinação de medicações. Mesmo assim, reconhece-se que este estudo não foi potencializado suficientemente para enfrentar de modo completo o efeito das drogas sobre a estrutura, função de LV ou os perfis plasmáticos de MMP/TIMP. Portanto estes dados e análise devem ser interpretados com uma cautela adequada.

Discussão

Houve 3 constatações singulares neste estudo: 1) pacientes com hipertensão, mas com uma estrutura e função normais de LV tinham um perfil de MMP/TIMP normal, 2) alterações nos perfis de MMP e TIMP que beneficiam a degradação reduzida de ECM (redução de MMP-2, MMP-13, aumento de TIMP-1) estavam associados com hipertrofia de LV e com disfunção diastólica e 3) o aumento de TIMP-I era uma previsão da presença de CHF.

Embora sejam pleotrópicas nos seus substratos e ações, alterações em MMPs e TIMPs miocardiais têm efeitos previsíveis sobre ECM (Spinale, FG, 2002; Chapman RE et al., 2004). MMP-2 (uma gelatinase), por exemplo, degrada proteínas de membrana de base, peptídeos de colágeno fibrilar, e fibras de colágeno recém sintetizadas. No estudo da presente invenção MMP-2 estava significativamente reduzida em pacientes com LVH hipertensiva. MMP-9 (uma gelatinase) tem os mesmos substratos estruturais de proteína como MMP-2, mas tem um nível de atividade muito mais baixo. No entanto, MMP-9 tem efeitos significativos sobre proteínas/peptídeos biologicamente ativos importantes tais como TGF-α, e outras proteínas e trajetos "pro- fibrõticos" . Seria de se esperar que a ativação de trajetos pro-fibróticos por uma MMP-9 aumentada aumentaria o acúmulo de ECM. Portanto, níveis reduzidos de MMP-2 e aumentados de MMP-9 encontrados em pacientes com LVH no presente estudo podem ser um fator que contribui para as alterações estruturais e funcionais observadas na doença cardíaca hipertensiva.

MMP-13 é uma colagenase que se encontra a níveis muito baixos no plasma e é difícil de ser quantificada com precisão mesmo com um ensaio extremamente sensível.

Portanto, no presente estudo, em vez de se relatar MMP-13 como um valor quantitativo, so resultados foram dicotomizados. A MMP-13 detectável no plasma de pacientes com LVH estava muito reduzida e estava ainda mais reduzida em pacientes com LVH e CHF. Seria de se esperar que a redução nesta enzima colagenolítica causaria uma conversão de colágeno fibrilar reduzida, uma degradação reduzida e um acúmulo maior de ECM.

A atividade de MMP é regulada a diversos níveis que não somente inclui a regulação transcricional, mas também inclui modificação pós-traducional tal como a ligação a TIMP. Os TIMPs se ligam a MMPs ativas numa relação de 1:1, inibem a atividade enzimática de MMP e por este motivo formam um ponto de controle importante no tocante à atividade proteolítica líquida de ECM (Spinale, FG, 2002; Chapman RE et al. , 2004; Brew K, et al. , 2000). O presente estudo mostrou que níveis plasmáticos de TIMP-I aumentavam em pacientes com LVH e CHF. Por este motivo, o equilíbrio entre MMPs e TIMPs estava alterado a favor de uma atividade proteolítica de ECM, o que facilitaria, portanto, o acúmulo de ECM. Há quatro TIMPs conhecidos e a regulação transcricional destas moléculas não é homogênea (Brew K, et al. , 2000). Níveis discordantes de TIMPs forma observados tanto em modelos animais de insuficiência cardíaca e em pacientes com doença cardiomiopática (Wilson EM et al.,2002; Stroud RE, 2005). No presente estudo um aumento robusto em TIMP-1 foi observado em pacientes com LVH com CHF. Por outro lado somente um pequeno aumento em TIMP-2 foi observado em pacientes com LVH com ou sem CHF. Estas observações provavelmente reduzem a importância das diferentes funções e trajetos reguladores para TIMPs no processo de remodelação de LV. Uma descoberta singular do presente estudo foi que um tipo específico de TIMP, o TIMP- 1, estava intensamente associado com o desenvolvimento de CHF. Em pacientes com LVH e CHF, não é claro se os níveis aumentados de TIMP-1 contribuíram para o desenvolvimento de CHF ou se foi o resultado do seu desenvolvimento. 0 que é evidente, no entanto, é que níveis aumentados de TIMP-1 estavam especificamente presentes em pacientes com LVH e CHF e os valores plasmáticos de TIMP-1 > 1200 ng/mL eram uma previsão da presença de CHF. Portanto, este análito plasmático deveria ser considerado no desenvolvimento de critérios diagnósticos para insuficiência cardíaca com uma fração de ejeção normal (insuficiência cardíaca diastólica) e para se projetar estratégias de manejo terapêutico inédito para insuficiência cardíaca diastólica. NO entanto, reconhece-se que o valor divisório de TIMP-1 = 1200 ng/mL foi escolhido de um modo "post-hoc" e não de um modo prospectivo. Portanto, a validade do seu valor de previsão deve ser interpretada com uma cautela adequada e ser confirmado em estudos adicionais que usem um projeto de estudo prospectivo amplo em série.

As alterações em MMPs/TIMPs que ocorrem em pacientes com doença cardíaca hipertensiva pode efetuar uma regulagem de crescimento tanto nos compartimento extracelulares como nos de cardiomiócitos, o que em conjunto resulta na hipertrofia de LV concêntrica e em um aumento de teor de colágeno. A homeostase do colágeno é determinada pelo equilíbrio entre a síntese, modificação pós-traducional e degradação. Na doença cardíaca hipertensiva, Diez et al, e outros mostraram que um teor aumentado de colágeno estava associado com um aumento de marcadores plasmáticos da síntese de colágeno, com uma degradação diminuída de colágeno e uma conversão diminuída de colágeno (Diez J, et al. , 2002; Lopez B, et al. 2001a; Lopez B, et al. 2001b). As alterações nos perfis de MMPs/TIMPs encontradas no presente estudo descrevem mecanismos potenciais pelos quais podem ocorrer alterações em síntese, degradação e conversão.

Embora haja muitos determinantes da remodelação estrutural de LV1 a pressão sangüínea é um dos mais importantes. NO entanto, os dados obtidos com o presente estudo indicam que mesmo depois da pressão sangüínea ter sido adequadamente controlada, a continuação de alterações em MMPs e TIMPs são uma previsão, e provavelmente determinam e são definitivamente associadas com uma remodelação concêntrica persistente, com LVH e com insuficiência cardíaca diastólica. A regressão de LVH exige uma remodelação adequada da ECM incluindo a degradação e conversão de componentes de ECM (especialmente as proteínas de membrana basal) e alterações das interações de cardiomiócitos-matriz. O presente estudo mostrou que os pacientes com LVH hipertensiva tinham anomalias persistentes em perfis específicos de MMP (níveis diminuídos de MMP-2) e TIMP (níveis aumentados de TIMP-1) que se esperaria que propiciassem conexões contínuas de cardiomiócitos-matriz de membrana basal e não a conversão de ecm necessária para acomodar a regressão de massa de LV. Parece provável, portanto, que a continuação das alterações em MMPs e TIMPs observadas no presente estudo contribuem para as alterações fenotípicas e estruturais presentes na doença cardíaca hipertensiva.

O presente estudo utilizou níveis plasmáticos de MMPs e TIMPs como marcadores substitutos para refletir as alterações em níveis miocardiais destas enzimas e peptídeos. A ativação de MMP e a ligação de TIMPs é um processo compartimentalizado que ocorre no interior do interstício miocardial (Spinale, FG. 2002; Chapman RE et al. 2004) . Portanto, os níveis plasmáticos não refletem necessariamente a atividade proteolítica líquida de ECM que ocorre no interior do miocárdio. As diferenças em níveis plasmáticos de MMP e TIMP observados entre os controles de referência e os pacientes com doença cardíaca hipertensiva no presente estudo provavelmente refletem diferenças a nível miocardial (Joffs C1 et al. 2001; Yarbrough WM, et al. 2003; Lindsey ML, et al. 2003) . É possível que o miocárdio não é a única fone de MMPs e TIMPs em pacientes com LVH. Portanto, as medições de níveis plasmáticos de MMP e TIMP representam a soma de MMPs e TIMPs liberados tanto de fontes cardíacas como de fontes não cardíacas. No entanto, os critérios específicos de exclusão utilizados no presente estudo ajudaram a eliminar alterações significativas nas principais fontes não cardíacas de MMPs e TIMPs. Mesmo assim, deve se reconhecer que pacientes com hipertensão e LVH, com ou sem insuficiência cardíaca crônica, podem ter alterações em outros tecidos não cardíacos, tais como nos rins e na massa vascular, que podem contribuir para a liberação de MMPs e TIMPs no plasma. As constatações do presente estudo demonstram diferenças nos níveis plasmáticos de MMP e de TIMP entre os controles de referência e os pacientes com LVH.

Conclusão: Um padrão específico de alterações no sistema proteolítico de ECM foi associado com cada manifestação estrutural, funcional e/ou clínica de doença cardíaca hipertensiva. Os pacientes com uma pressão sangüínea adequadamente controlada e sem nenhuma alteração estrutural ou funcional no ventrículo esquerdo não tiveram nenhuma alteração na assinatura de MMP/TIMP. No entanto, os pacientes com LVH, apesar do controle adequado da pressão sangüínea tiveram níveis diminuídos de MMP-2 e MMP-13. Aumentos em TIMP-I foram encontrados em pacientes com LVH e CHF. Mais especificamente a transição entre LVH hipertensiva e o desenvolvimento de CHF é anunciada por alterações em MMPs e TIMPs tais como um aumento em TIMP-I > 1200 ng/mL ou a ausência de MMP-13. NO entanto, o presente estudo tem um tamanho limitado de amostra, usou um projeto em seção transversal e não conduziu estudos em série durante um período de tempo. Estas limitações exigem que nossas observações sejam ainda mais testadas e confirmadas usando um projeto de estudo amplo prospectivo em série. Mesmo assim, os dados do presente estudo indicam que as alterações estocásticas observadas em MMPs/TIMPs representam um papel importante nas manifestações de doença cardíaca hipertensiva. A compreensão desta patofisiologia dependente de ECM proporciona um melhor diagnóstico e um melhor tratamento de pacientes com doença cardíaca hipertensiva.

Perspectiva Clinica: A Hipertensão arterial crônica é uma causa comum da hipertrofia concêntrica de LV, uma taxa de relaxamento diminuída e uma rigidez aumentada. As alterações estruturais e funcionais produzidas pela hipertensão resultam de alterações tanto aos dois principais constituintes do miocárdio, o cardiomiócito e especialmente a matriz extracelular (ECM). Estas alterações estruturais e funcionais de LV criam o substrato necessário para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca diastólica (DHF) . No entanto, não se sabe o que controla estas alterações na E CM, se o controle da pressão sangüínea somente pode prevenir ou reverter estas alterações e se o conhecimento dos mecanismos do controle de ECM auxiliaria no diagnóstico ou no tratamento de doença cardíaca hipertensiva. 0 presente estudo mostrou que alterações no padrão de proteínas/peptídeos proteolíticos de ECM específicos (MMPs e TIMPs) estavam associadas com cada manifestação estrutural, funcional e clínica de doença cardíaca hipertensiva. Os indivíduos com uma pressão sangüínea adequadamente controlada sem nenhuma alteração estrutural ou funcional de LV não tem nenhuma alteração na assinatura de MMP/TIMP. Portanto, o tratamento de hipertensão pode prevenir alterações na ECM e no sistema proteolítico de ECM. No entanto, os pacientes com LVH residual ou resistente, apesar do controle adequado da pressão sangüínea, tinham níveis anormais de MMPs. O desenvolvimento de DHF foi anunciado por um aumento em TIMP-1 > 1200 ng/mL. Estes dados sugerem que a regressão de LVH e a prevenção de DHF dependem não somente de alterações em pressão sangüíneas, e pode ser necessário se direcionar o tratamento para a normalização de alterações em MMP/TIMPs. A compreensão desta patofisiologia dependente de ECM proporciona ume melhor diagnóstico e um melhor tratamento e pacientes com doença cardíaca hipertensiva.

2. Exemplo 2: Metaloproteinases de Matriz/Inibidores Teciduais de Metaloproteinases: Relação entre Alterações nos Determinantes Proteolíticos da composição da matriz e Manifestações Estruturais, Funcionais e Clínicas de Doença Cardíaca Hipertensiva.

Métodos

Inclusão no Estudo: A Tabela 6 mostra a inclusão no estudo. Os critérios de exclusão eram um histórico de infarto do miocárdio, cardiomiopatia, anomalias valvulares ou de movimento da parede, arritmia, doença cardíaca infiltrante, EF < 50%, hipertensão não controlada (SBP > 140 ou DBP > 90) ou doença sistêmica que afeta perfis plasmáticos de MMP/TIMP. Os critérios de inclusão para controles e controles com HTN eram mulheres e homens com idade de 18-90 anos sem nenhuma evidência de doença cardiovascular estrutural. Os critérios de inclusão para LVH e LVH com CHF eram homens e mulheres com idade de 18-90 anos com uma hipertrofia de LV estabelecida por ecocardiografia (espessura de parede de > 1,2 cm ou índice de massa de LV > 125 g/m2) .

Tabela 6: Inclusão no Estudo

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Medições de ecocardiografia: foi usado padrão para ecocardiografia dimensional

Cálculos de ecocardiografia: O volume de LV foi calculado pelo mt de discos. A massa de LV foi calculadas pelo Método Penn. PCWP foi calculado como sendo 2 + 1,3 χ (E/Ea).

Medições plasmáticas de MMP/TIMP: As medições plasmáticas forma obtidas por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) (Ammersham Pharmacia Biotech) para as gelatinases MMP-2 e MMP-9, a colagenase MMP-13 e os TIMPs TIMP-I e TIMP-2.

Resultados

As Figuras 7-11 mostram os resultados do estudo. Conclusões

Pacientes com HTN mas com uma estrutura e função de LV normais têm um perfil normal de MMP/TIMP. Alterações em perfis de MMP/TIMP que propiciam uma diminuição da degradação da ECM foram associados com hipertrofia de LV e com disfunção diastólica. Um aumento em TIMP-I era uma previsão da presença de CHF. Alterações no sistema proteolítico da matriz extracelular miocardial são mensuráveis usando-se ensaios plasmáticos de MMPs e TIMPs selecionados. Cada manifestação de doença cardíaca hipertensiva é associada com um padrão específico de alterações no sistema proteolítico de ECM. Pacientes hipertensos com uma remodelação estrutural, disfunção diastólica e/ou CHF clínica são caracterizados por uma redução nos níveis de MMPs e com um aumento nos níveis de TIMPs.

3. Exemplo 4: Critérios para se diferenciar, prever e diagnosticar insuficiência cardíaca em pacientes com hipertensão

É apresentado na Tabela 7 um conjunto claro de valores normais para indivíduos humanos dentro de faixa etária e cobrindo os dois gêneros. Não foi anteriormente compilada uma lista de valores de referência normais para MMPs/TIMPs que fosse tão inclusiva como esta e além disso que proporcionasse faixas de referência normais, uma vez que foram incluídos indivíduos com idades correspondentes, isentos de doença cardiovascular. Além disso, são dadas relações estequiométricas inéditas para os perfis de MMP/TIMP que mostrarão conter informações diagnosticas e prognósticas importantes, conforme será dado em detalhes nas tabelas subseqüentes. Estes dados foram coletados e analisados a partir de mais de 100 indivíduos

Tabela 7: Limites Normais Humanos de Referência*

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*Adultos Normais com idade de 25-70 anos

A Tabela 8 apresenta os valores de MMP e de TIMP em termos absolutos, as relações MMP/TIMP em termos absolutos e as alterações percentuais a partir dos valores de referência normais baseados nos termo s absolutos, em pacientes com pressão sangüínea bem controlada, mas que têm um diagnóstico de hipertensão. Estes valores foram coletados conforme descrito no corpo do pedido original. É apresentado um perfil plasmático singular que não seria previsto de relatórios anteriores em estudos animais ou nos estudos clínicos limitados anteriormente publicado. Este perfil singular inclui uma queda em MMP-2, nenhuma alteração em MMP-9, MMP-13 não detectável (abaixo de sensibilidade de qualquer sistema de ensaio atualmente usado) e níveis muito aumentados de TIMP-1. Além disso pode ser demonstrado um aumento no marcador cardiovascular específico para TIMP-4. Estas alterações em perfis de MMP e TIMP são específicas a pacientes com hipertensão e demonstram alterações precoces ocorrendo no interior do tecido cardíaco destes pacientes. Este perfil singular e específico pode ser usado para guiar a terapia para se minimizar estas alterações em perfis de MMP e TIMP de pacientes normais. Além disso estes perfis plasmáticos podem ser usados para uma triagem generalizada para populações de pacientes de risco e para identificar pacientes que correm o risco de eventos adversos futuros.

Tabela 8: Diagnóstico para Doença Cardíaca Hipertensiva

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♦pacientes diagnosticados com alta pressão

sangüínea e sob controle médico adequado

A Tabela 9 demonstra perfis plasmáticos para MMPs e TIMPs que aparecem em pacientes com insuficiência cardíaca secundária a doença cardíaca hipertensiva. Estes dados oram compilados de estudos providos no pedido inicial. Este estudo passado demonstrou que a diferenciação entre a presença e a ausência de insuficiência cardíaca em pacientes hipertensivos poderia ser obtida pela perda de um sinal para MMP-13 e pelo aumento consistente em TIMP-I. Na verdade curvas operadoras de receptor (ROC) para a previsão e diagnóstico para insuficiência cardíaca já foram dados anteriormente. Em contraste acentuado com pacientes com insuficiência cardíaca secundária a um infarto do miocárdio (ataque cardíaco), os níveis de MMP-9 são normais ou abaixo do normal. A diferenciação entre estes dois estados mórbidos é possível e dada em uma tabela subseqüente. Além disso, utilizando-se um marcador cardiovascular específico, TIMP-4, pode ser demonstrado que este tinha o nível aumentado em pacientes com doença cardíaca hipertensiva e que isto fornecia uma especificidade cardiovascular ao perfil plasmático nunca demonstrada anteriormente. Estes dados fornecem o primeiro perfil diferencial para a identificação através dos marcadores plasmãticos, pacientes que sofrem de uma insuficiência cardíaca devida a doença cardíaca hipertensiva. Esta é uma questão importante uma vez que as modalidades de tratamento diferem com base na causa subjacente da insuficiência cardíaca. O modo com estes novos dados poderiam ser usados para conduzir a terapia e a tomada de decisão clínica foi fornecida no pedido inicial.

Tabela 9: Pacientes Hipertensivos com Risco Aumentado para Insuficiência Cardíaca*

<table>table see original document page 117</column></row><table>

*Paciente diagnosticado com pressão sangüínea alta e sob controle médico adequado

A assinatura plasmática singular que foi desenvolvida nesta aplicação e apresentada no material de suporte fornece pela primeira vez a capacidade de se diferenciar as causas subjacentes para um paciente que apresenta insuficiência cardíaca. Mais especificamente, conforme mostrado na tabela 10, emerge um perfil plasmático específico e muito diferente de um paciente com risco para desenvolver, ou apresentar, uma insuficiência cardíaca secundária a um infarto do miocárdio ou o de pacientes com insuficiência cardíaca secundária a hipertensão. Estes dados foram compilados de nossos estudos completados que formaram a base para o presente pedido. Portanto, podem ser levantados diagnósticos diferenciais com base nestes perfis e o que é mais importante podem ser tomadas decisões clínicas mais específicas e consideradas estratégias terapêuticas mais específicas. Exemplos de aplicações clínicas para este perfil e o modo como estas seriam utilizadas na tomada de decisões clínicas foram dados no pedido inicial.

Tabela 10: Diagnóstico Diferencial de Insuficiência Cardíaca Sistólica (pós-MI) ou Diastólica (Doença Cardíaca Hipertensiva)*

<table>table see original document page 118</column></row><table> <table>table see original document page 119</column></row><table>Ε. Referências

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Claims (19)

1. Método de se prever uma insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a medição da quantidade de MMP-13 em um fluido corporal do indivíduo, uma quantidade inferior a 10 ng/mL indicando a presença de insuficiência cardíaca diastólica ou sendo uma previsão de insuficiência cardíaca.

2. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de TIMP-I que é superior ao valor normal.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade de MMP-2 é de pelo menos aproximadamente 20% acima do valor normal.

4. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção, em fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de TIMP-4 que é superior ao valor normal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a quantidade de TIMP-4 é de pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal.

6. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em ura indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de MMP-13, TIMP-I e TIMP-4.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade de MMP-13 é indetectável, sendo a quantidade de TIMP-I pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal e a quantidade de TIMP-4 sendo pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal.

8. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, e TIMP-4.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade de MMP-13 é indetectável, a quantidade de TIMP-1 ê de pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal, a quantidade de TIMP-2 é de pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal, e a quantidade de TIMP-4 é de pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal.

10. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a medição, em um fluido corporal proveniente do indivíduo, de uma quantidade de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 e MMP-2.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade de MMP-13 é indetectável, a quantidade de TIMP-1 é de pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal, a quantidade de TIMP-4 é de pelo menos aproximadamente 50% acima do valor normal e a quantidade de MMP-2 é de pelo menos aproximadamente 20% abaixo do valor normal.

12. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de uma redução na relação de MMP-9 para TIMP-I em um fluido corporal proveniente do indivíduo em comparação com a relação normal.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a redução na relação é de pelo menos aproximadamente 50% em comparação com a relação normal.

14. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de uma redução na relação de MMP-9 para TIMP-2 em um fluido corporal proveniente do indivíduo em comparação com a relação normal.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a redução na relação é de pelo menos aproximadamente 50% em comparação com a relação normal.

16. Método de se prever a insuficiência cardíaca diastólica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de uma redução na relação de MMP-9 para TIMP-4 em um fluido corporal proveniente do indivíduo em comparação com a relação normal.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a redução na relação é de pelo menos aproximadamente 50% em comparação com a relação normal.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é sangue.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal é plasma.