MX2008014155A - Deteccion de insuficiencia cardiaca diastolica por proteasa y determinacion de perfil plasmatico de inhibidor de proteasa. - Google Patents

Abstract

Se divulgan métodos para detectar y predecir insuficiencia cardiaca diastólica y predecir insuficiencia cardiaca congestiva y determinar el perfil de inhibidor de proteasa.

Description

DETECCIÓN DE INSUFICIENCIA CARDIACA DIASTÓLICA POR PROTEASA Y DETERMINACIÓN DE PERFIL PLASMÁTICO DE INHIBIDOR DE PROTEASA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional norteamericana No. 60/798,953, presentada el 9 de mayo de 2006, y solicitud provisional norteamericana No. 60/893,781, presentada el 8 de marzo de 2007, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. DECLARACIÓN SOBRE INVESTIGACIÓN PATROCINADA POR EL GOBIERNO FEDERAL Esta invención fue efectuada con el apoyo del gobierno federal dentro del marco del contrato No. VA Merit Review (Spinale 0001) Research Service del Department of Veterans Affairs, y bajo los contratos números POl-HL-48788, ROl-HL-59165 y MO1-RR-01070-251 otorgados por el National Heart, and Blood Institute. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A pesar de avances importantes en el desarrollo de fármacos para regular la presión sanguínea elevada (hipertensión) y a pesar del reconocimiento que la hipertensión es un factor de riesgo significativo para el desarrollo de la insuficiencia cardiaca, esta condición sigue siendo una enfermedad cardiovascular principal en los Estados Unidos de América. Un problema particular con la identificación de pacientes en riesgo de desarrollar una insuficiencia cardiaca hipertensiva es la falta de una prueba de detección rápida con el objeto de identificar pacientes que tienen cambios que están ocurriendo en el músculo cardiaco mismo como consecuencia de la hipertensión. Con hipertensión prolongada, la masa muscular y el tamaño del corazón se elevan, pero esto puede no ocurrir sino hasta una fase avanzada del proceso de la enfermedad. Un evento único y critico con relación a la progresión hacia una enfermedad cardiaca hipertensiva y una insuficiencia cardiaca es que ocurre una fibrosis incrementada dentro del músculo cardiaco mismo. La base molecular de este cambio permanece desconocida. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con el propósito de la presente invención, según lo presentado y descrito en términos generales aquí, esta invención se refiere a patrones únicos de MMPs/TIMPs que ocurren en pacientes que están desarrollando una enfermedad cardiaca hipertensiva predictores de la presencia de una función cardiaca anormal - hasta ahora solamente identificable con pruebas costosas y difíciles de aplicar. El patrón único de MMPs/TIMs se utiliza en métodos para la identificación de pacientes en riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca como consecuencia de la hipertensión o bien a punto de desarrollarla. Ventajas adicionales del método divulgado y de las composiciones presentadas se indicarán por un lado en la descripción siguiente y se entenderán por otro lado a partir de la descripción o bien podrán aprenderse mediante la práctica del método divulgado y de las composiciones presentadas. Las ventajas del método divulgado y de las composiciones presentadas se lograrán y alcanzarán a través de los elementos y combinaciones particularmente especificados en las reivindicaciones adjuntas. Se entenderá que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente se ofrecen a titulo de ejemplo y de explicación solamente y no restringen la invención reclamada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos adjuntos que se incorporan en esta especificación y forman parte de ella ilustran varias modalidades del método y composiciones divulgados y conjuntamente con la descripción sirven para explicar los principios del método divulgado y de las composiciones presentadas . La Figura 1 muestra la detectabilidad de MMP-13 en control de referencia con y sin hipertensión y en LVH con y sin insuficiencia cardiaca crónica. La detectabilidad de MMP-13 disminuyó significativamente en pacientes con LVH. * = p < 0.05 vs Control de referencia sin Hipertensión, # = p < 0.05 vs Control de referencia con Hipertensión, ? = p < 0.05 vs LVH sin CHF.

La Figura 2A muestra la relación entre el inhibidor de tejido de metaloproteinasa de matriz- 1 (TIMP-1) y la proporción volumen/masa ventricular izquierda (LV) . Niveles más elevados de TI P-1 fueron asociados con valores menores de la proporción volumen/masa LV lo que indica un remodelado concéntrico más pronunciado, r = -0.56, p<0.05. La Figura 2B muestra la relación entre inhibidor de tejido de metaloproteinasa de matriz- 1 (TIMP-1) y onda de llenado rápido (E' ) de formación de imágenes Doppler de Tejido (TDI) . Niveles más altos de TIMP-1 fueron asociados con valores menores de E' lo que indica una velocidad de relajación diastólica LV más lenta, r = -0.41, p<0.05. La Figura 3 muestra estructura y función de corazón normal en comparación con corazón con insuficiencia cardiaca diastólica. Las Figuras 4A a 4D muestran los resultados de ecocardiografía y mediciones plasmáticas de MMP-9, MMP-2, y TIMP-1 para controles con y sin hipertensión (HTN) y sujetos con hipertrofia ventricular con y sin insuficiencia cardiaca congestiva (CGF) . La Figura 5 muestra onda de llenado rápido (E' ) de formación de imagen Doppler de tejido (TDI) con relación a los niveles de TIMP-1. La Figura 6 muestra niveles plasmáticos de MMP-13 en controles y sujetos con hipertrofia ventricular izquierda.

La Figura 7 muestra un porcentaje de pacientes con o sin insuficiencia cardiaca congestiva y con niveles plasmáticos de TIMP-1 superiores o inferiores a 1200 ng/ml que tienen también hipertrofia ventricular izquierda. La Figura 8 muestra curvas de calibración para MMP-9, MMP-13, TNF-a, e IL-6 de conformidad con lo determinado por análisis multiple . Las Figuras 9A a 9C muestran un algoritmo para utilización de los niveles de MMP y TIMP con el objeto de determinar el tratamiento de pacientes con hipertensión. La Figura 9A muestra de manera esquemática el tratamiento de pacientes con hipertensión documentada programados para visita no emergente a clínica. La Figura 9B muestra de manera esquemática el tratamiento de paciente con visita a clínica no emergente con hipertensión de inicio reciente. La Figura 9C muestra de manera esquemática el tratamiento de pacientes que presentan signos o síntomas que pueden ser causados por HF . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El método divulgado y las composiciones presentadas pueden entenderse más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada de modalidades particulares y el Ejemplo incluido aquí y con relación a las Figuras y su descripción arriba y abajo. Se divulgan materiales, composiciones y componentes que pueden ser utilizados para el método y composiciones divulgados, en combinación con el método y composiciones divulgados, pueden ser utilizados en preparación para el método y composiciones divulgados, o son productos del método y composiciones divulgados. Estos y otros materiales se divulgan aquí y se entenderá que cuando combinaciones, subgrupos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales se divulgan si bien puede no hacerse referencia específicamente a cada elemento individual o combinación colectiva y permuta de sus compuestos, cada una de estas combinaciones y permutaciones se contempla específicamente y se describe aquí. Por ejemplo, sin un péptido es divulgado y comentado y si se comentan varias modificaciones que pueden efectuarse a varias moléculas incluyendo el péptido, todas y cada una de estas combinaciones y permutas de péptido y las modificaciones que son posibles se contemplan específicamente a menos que se indique específicamente lo contrario. Por consiguiente, si una clase de moléculas A, B y C se divulgan así como una clase de moléculas D, E y F y se divulga un ejemplo de una molécula de combinación A-D, entonces aún si no se menciona individualmente cada una de ellas, todas se contemplan individual y colectivamente. Por consiguiente, en este ejemplo, cada una de las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F se contempla específicamente y debe considerase divulgada a partir de la divulgación de A, B, y C; D, E y F; y la combinación de ejemplo A-D. De la misma manera, cualquier subgrupo o combinación de ' estos se contempla y divulga también específicamente. Por consiguiente, por ejemplo, el sub-grupo de A-E, B-F, y C-E se contemplan específicamente y deben considerarse divulgados a partir de la divulgación de A, B y C; D, E y F; y la combinación de ejemplo A-D. Este concepto aplica a todos los aspectos de esta solicitud incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, pasos en métodos para elaborar y utilizar las composiciones divulgadas. Por consiguiente, si existen varios pasos adicionales que pueden ser efectuados se entenderá que cada uno de estos pasos adicionales puede ser efectuado con cualquier modalidad específica o combinación de modalidades de los métodos divulgados, y que cada combinación de este tipo se contempla específicamente y debe considerarse divulgada . Las personas con conocimientos en la materia reconocerán o bien podrán determinar utilizando solamente experimentación de rutina muchos equivalentes a las modalidades específicas del método y composiciones descritos aquí. Tales equivalentes se contemplan dentro del marco de las reivindicaciones siguientes . Se entenderá que el método y composiciones divulgados no se limitan a la metodología particular, protocolos específicos y reactivos particulares descritos puesto que puede variar. Se entenderá también que la terminología utilizada aquí es para propósito de describir modalidades particulares solamente y no se contempla para limitar el alcance de la presente invención que será limitada solamente a través de las reivindicaciones adjuntas. A menos que se indique expresamente lo contrario, no se considera de ninguna manera que algún método establecido aqui requiera que se efectúen los pasos en un orden específico. Por consiguiente, cuando una reclamación de método no indica de hecho un orden a seguir por sus pasos o bien si no se establece específicamente de otra manera en las reivindicaciones o descripciones que los pasos deben ser limitados a un orden específico, no se pretende de ninguna manera inferir que existe un orden. Esto es válido para cualquier base no expresa de interpretación, incluyendo: asuntos de lógica con relación al arreglo de pasos o flujo de operación; significado llano derivado de organización gramática o puntuación; y número o tipo de modalidades descritas en la especificación. Más específicamente, se pueden medir las MMPs y TIMPs cuyas cantidades son medidas en cualquier orden. A. Definiciones A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen los mismos significados que los significados comúnmente entendidos por una persona con conocimientos en la materia a la cual pertenece el método divulgado y las composiciones. Aún cuando métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí pueden ser utilizados en la práctica o prueba del presente método y composiciones, los métodos, dispositivos y materiales particularmente útiles son descritos. Publicaciones citadas aquí y el' material para el cual se citan se incorporan por consiguiente específicamente por referencia. Nada aquí debe considerarse como una admisión que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha divulgación en virtud de invención previa. No se hace ninguna admisión en el sentido que alguna referencia constituye la técnica anterior. La discusión de referencia establece lo que sus autores aseveran y los solicitantes se reservan el derecho a retar la exactitud y el carácter pertinente de los documentos citados. Se deberá observar que como se utiliza aquí y en base a las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencia plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, referencia a "un péptido" incluye varios de sus péptidos, referencia "al péptido" es una referencia a uno o varios péptidos y equivalentes de los mismos conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia, etc. "Opcional" o "opcionalmente" significa que el evento, circunstancia o material descrito subsiguientemente puede o no ocurrir o estar presente y que la descripción incluye casos en los cuales el evento, circunstancia o material ocurre o está presente y casos en los cuales no ocurre ni está presente. Rangos pueden ser expresados aquí desde "aproximadamente" un valor particular, y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando un rango de este tipo es expresado, otra modalidad incluye desde el valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando valores son expresados como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente" se entenderá que el valor particular forma otra modalidad. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los rangos son significativos tanto con relación al otro punto final como independientemente del otro punto final. Se entenderá que existen números valores divulgados aquí y que cada valor está también divulgado aquí como "aproximadamente" este valor particular además del valor mismo. Por ejemplo, si se divulga el valor "10", entonces se divulga también "aproximadamente 10". Se entenderá que cuando un valor es divulgado que es "inferior o igual al" valor, "superior o igual al valor" y rangos posibles entre valores son también divulgados, de conformidad con lo apropiadamente comprendido por la persona con conocimientos en la materia. Por ejemplo, si el valor "10" es divulgado, "inferior o igual a 10" está también divulgado así como "superior o igual a 10". Se entenderá que la solicitud, se proporcionan datos en numerosos formatos diferentes y que estos datos representan puntos finales y puntos iniciales, y rangos para cualquier combinación de puntos de datos. Por ejemplo, si un punto de dato particular "10" y un punto de dato particular 15 son divulgados, se entenderá que mayor que, superior o igual a, menor que, inferior o igual a, e igual a 10 y 15 se consideran divulgados así como entre 10 y 15. Se entenderá también que cada unidad entre dos unidades particulares es también divulgada. Por ejemplo, si se divulgan 10 y 15, entonces se divulgan también 11, 12, 13, y 14. En la descripción y reivindicaciones de esta especificación, la palabra "comprenden" y variaciones de la palabra, como por ejemplo "comprendiendo" y "comprende" significa "incluye pero sin limitarse a" y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, números enteros o pasos. El término "sujeto" incluye, pero sin limitarse a estos ejemplos, animales, plantas, bacterias, virus, parásitos y cualquier otro organismo o entidad que tiene ácido nucleico. El sujeto puede ser un vertebrado, más específicamente un mamífero (por ejemplo, un ser humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, un primate no humano, una vaca, un gato, un conejillo de la India o un roedor), un pez, un ave o un reptil o un anfibio. El sujeto puede ser un invertebrado, más específicamente un artrópodo (por ejemplo, insectos y crustáceos) . El término no se refiere a ninguna edad particular ni a ningún sexo específico. Por consiguiente, sujetos adultos y recién nacidos, así como fetos, ya sea machos o hembras, se contemplan abarcados por el término. Un paciente se refiere a un sujeto que padece de una enfermedad o trastorno. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios. Como se define aquí una "muestra" se refiere a cualquier muestra obtenida de un organismo. Ejemplos de muestras biológicas incluyen fluidos corporales y muestras de tejido. La fuente de la muestra puede ser un medio fisiológico como por ejemplo sangre, suero, plasma, leche materna, pus, exudados de tejido, lavado, orina, tejido, como por ejemplo nodos linfáticos o similares. En esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones. Las divulgaciones de estas publicaciones en su totalidad se incorporan aquí por referencia en esta solicitud con el objeto de describir más completamente el estado de la técnica al a cual pertenece. Las referencias divulgadas se incorporan también individual y específicamente por referencia aquí para el material contenido en ellas que se comenta en la oración en la cual se basa la referencia. B . Métodos 1. Insuficiencia Cardiaca La insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) , se conoce también como falla cardiaca congestiva (CCF) o solamente insuficiencia cardiaca, es una condición que puede resultar de cualquier trastorno cardiaco estructural o funcional que afecte la capacidad del corazón para llenar o bombear una cantidad suficiente de sangre en el cuerpo. Por consiguiente, el método divulgado puede ser utilizado para tratar cualquier forma de insuficiencia cardiaca. Puesto que no todos los pacientes tienen sobrecarga volumétrica al momento de la evaluación inicial o subsiguiente, el término "insuficiencia cardiaca" se prefiere al término más antiguo "insuficiencia cardiaca congestiva". Las causas y los factores que contribuyen a la insuficiencia cardiaca congestiva incluyen los siguientes (con referencia específica a los lados izquierdo (L) o derecho (R) ) : Historia genética familiar de CHF, enfermedad cardiaca isquémica/infarto del miocardio (enfermedad de arteria coronaria) , infección, ingesta de alcohol, gusanos de corazón, anemia, tirotoxicosis (hipertiroidismo) , arritmia, hipertensión (L) , coartación de la aorta (L) , estenosis aórtica/regurgitación (L) , regurgitación mitral (L) , estenosis pulmonar/hipertensión pulmonar/embolia pulmonar, todos llevando a cor pulmonale (R) , y enfermedad de válvula mitral (L) . Existen muchas formas diferentes de clasificar la insuficiencia cardiaca, incluyendo: el lado del corazón involucrado; (insuficiencia cardiaca izquierda versus insuficiencia cardiaca derecha) , ya sea que la anormalidad se deba a contracción o relajación del corazón (insuficiencia cardiaca sistólica vs . insuficiencia cardiaca diastólica) , y si la anormalidad se debe a una salida cardiaca baja o resistencia vascular sistémica baja (insuficiencia cardiaca de salida baja vs. insuficiencia' cardiaca de salida alta) . La insuficiencia cardiaca congestiva (CHF) es una constelación de signos y síntomas (es decir, respiración corta, acumulación de fluido) causados por un padecimiento subyacente en la función ventricular izquierda (LV) notablemente1 con relación al desempeño cardiaco. Las causas de CHF pueden ser diversas, pero caen en tres categorías principales: después de un ataque al corazón (infarto del miocardio) , con enfermedad cardiaca hipertensiva y con enfermedad muscular intrínseca que se conocen genéricamente como cardiomiopatía . Ha sido difícil identificar las causas subyacentes de CHF tales como las que son causadas por enfermedad cardiaca hipertensiva, y es el enfoque de los métodos de la presente invención. Específicamente, la enfermedad cardiaca hipertensiva provoca un crecimiento del músculo LV - que se conoce como hipertrofia. La hipertrofia LV (LVH) puede causar per se defectos en cuanto al desempeño cardiaco, pero una prueba de sangre para identificar rápida y exactamente LVH no ha estado disponible con anterioridad. Esta solicitud identifica un nuevo enfoque validado para identificar pacientes con LVH. Si el proceso de LVH sigue, o bien si no es adecuadamente tratada, entonces el paciente desarrollará signos y síntomas de CHF primariamente por insuficiencia cardiaca diastólica (DHF) . Sin embargo, ha sido difícil hasta ahora identificar pacientes que padecen de CHF que tiene primariamente DHF, y no ha sido posible identificar estos pacientes mediante la utilización de un examen de sangre sencillo y rápido. Esta solicitud identifica un nuevo enfoque validado para identificar pacientes que no solamente tienen presencia de LVH, sino también de pacientes que están en riesgo de desarrollar DHF, y la identificación de los pacientes que tienen DHF. Por consiguiente, esta invención ofrece un medio para detectar la presencia de LVH, predecir los pacientes que se encontrarán en alto riesgo de desarrollar DHF, e identificar los pacientes con DHF. Mediante el uso de una muestra pequeña de fluido corporal y para el ejemplo identificado abajo, una muestra de sangre, será posible efectuar cuatro aplicaciones independientes, pero no necesariamente exclusivas, de este método: detección, predicción/pronóstico, diagnóstico y monitoreo de tratamiento . Por consiguiente, se divulga un método para diagnosticar un sujeto con hipertrofia ventricular izquierda (LVH, HCM o HOCM) . Por ejemplo, se proporciona un método para detectar LVH en un sujeto, que comprende la identificación de un perfil de metaloproteinasas de matriz (MMPs) e inhibidor tisular de metaloproteinasas de matriz (TIMPs) a partir de un fluido corporal de un sujeto asociado con la existencia de insuficiencia cardiaca diastólica (DHF) . Se proporciona también un método para predecir la insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, que comprende la identificación de un perfil de metaloproteinasas de matriz (MMPs) e inhibidores tisulares de metaloproteinasas de matriz (TIMPs) a partir de un fluido corporal del sujeto asociado con la probabilidad de desarrollar una insuficiencia cardiaca diastólica (DHF) . 2. MMPs Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son endopeptidasas dependientes de zinc; otros miembros de familia son adamalisinas, serralisinas y astacinas. Las MMPs pertenecen a una familia más grande de proteasas que se conoce como la superfamilia de metzincina. Las MMPs comparten una estructura de dominio común. Los tres dominios comunes son el pro-péptido, el dominio catalítico y el dominio de terminal C de tipo hemopexina que está unido al dominio catalítico por una región de bisagra flexible. Las MMPs son inicialmente sintetizadas como zimógenos inactivos con un dominio pro-péptido que debe estar removido antes de la activación de la enzima. El dominio de pro- péptido es parte del "interruptor de cisteina" que contiene un residuo de cisteina conservado que interactúa con el zinc en un sitio activo e impide la unión y la disociación del sustrato manteniendo la enzima en una forma inactiva. En mayoría de las MMPs, el residuo de cisteina se encuentra en la secuencia conservada PRCGxPD. Algunos MMPs tienen un sitio de disociación de pro-hormona convertasa (de tipo furina) como parte de su dominio que cuando está disociado activa la enzima. La MMP-23A y la MMP-23B incluyen un segmento de transmembrana en este dominio (PMID 10945999) . Estructuras cristalográficas por rayos X de varios dominios catalíticos de MMP han mostrado que este dominio es una esfera oblata que mide 35 x 30 x 30 Á (3.5 x 3 x 3 nm) . El sitio activo es una ranura de 20 Á (2 nm) que cruza el dominio catalítico. En la parte del dominio catalítico que forma el sitio activo se encuentra un ión Zn2+ importante desde una perspectiva catalítica, que está unido por tres residuos de histidina que se encuentran en la secuencia conservada HExxHxxGxxH. Por consiguiente, esta secuencia es un motivo de unión de zinc. Las gelatinasas, como por ejemplo MMP-2, incorporan módulos de fibronectina tipo II insertados inmediatamente antes en el motivo de unión de zinc en el dominio catalítico (PMID 12486137) . El dominio catalítico está conectado al dominio de extremo C por una bisagra flexible o región de enlazador. Tiene hasta 75 aminoácidos de largo y no tiene estructura determinable. El dominio de extremo C tiene similitudes estructurales con la hemopoxina de proteina de suero. Tiene una estructura de ß-impulsores de cuatro aspas. Estructuras de ß-impulsores proporcionan una gran superficie plana, la cual se considera participa en las interacciones proteina-proteina . Eso determina la especificidad de sustrato y es el sitio para interacción con TIMPs. El dominio de tipo hemopexina está ausente en MMP-7, MMP-23, MMP-26 y la planta y nematodo. MT-MMPs están ancladas en la membrana plasmática, a través de este dominio y algunas tienen dominios citoplásmicos . Las MMPs pueden ser subdivididas en varias formas. El uso de métodos bioinformáticos para comparar las secuencias primarias de las MMPs sugiere los siguientes agrupamientos evolutivos de las MMPs: MMP-19, MMPs 11, 14, 15, 16 y 17; MMP-2 y MMP-9; todas las demás MMPs. El análisis de los dominios catalíticos en aislamiento sugiere que los dominios catalíticos evolutivos adicionalmente una vez que los grupos principales se diferenciaron, como se indica también a través de las especificidades de sustrato de las enzimas. Los agrupamientos más comúnmente utilizados (por investigadores en biología de MMP) se basan parcialmente en evaluación histórica de la especificidad de sustrato de la MMP y parcialmente en la localización celular de la MP. Esos grupos con las colagenasas, las gelatinasas, las estromelisinas, y las MMPs de tipo membrana (MT-MMPs) . Se está volviendo cada vez más claro que estas divisiones son relativamente artificiales, puesto que hay un gran número de MMPs que no caben en ninguno de los grupos tradicionales. Las colagenasas pueden degradar los colágenos fibrilares de triple hélice en fragmentos distintivos 3/4 y 1/4. Estos colágenos son los componentes principales de huesos y cartílagos, y MMPs son las únicas enzimas conocidas de mamíferos que pueden degradarlos. Tradicionalmente, las colagenasas son: MMP-1 (colagenasa intersticial) , MMP-8 (colagenasa de neutrófilo) , MMP-13 (colagenasa 3), MMP-18 • (colagenasa 4, xcol4, colagenasa de xenopus) . No se conocen ortólogos humanos) , MMP-14 (MT1-MMP) del cual se ha mostrado también que disocia el colágeno fibrilar, y de manera más controversial existe evidencia que MMP-2 puede efectuar una colagenolisis . Las estromelisinas despliegan una capacidad amplia para disociar las proteínas de matriz extracelulares pero no pueden disociar los colágenos fibrilares de hélice ' triple . Los tres miembros canónicos de este grupo son: MMP-3 (estromelisina 1) , MMP-10 (estromelisina 2) , y MMP-11 (estromelisina 3) . MMP-11 muestra mayor similitud con MT- MMPs, es activable por convertasa y por consiguiente es habitualmente secretada asociada con MMPs activables por convertasa . Las matrilisinas incluyen MMP-7 (matrilisina, PU P) y M P-26 (matrilisina-2 , endometasa) . Los sustratos principales de gelatinasas son colágeno de tipo IV y gelatina, y estas enzimas se distinguen por la presencia de un dominio adicional .insertado en el dominio catalítico. o Esta región de unión con gelatina está posicionada inmediatamente antes del motivo de unión de zinc, y forma una unidad de pliegue separada que no perturba la estructura del dominio catalítico. Los dos miembros de este subgrupo son: MMP-2 (gelatinasa de 72 kDA, gelatinasa A) y M P-9 (gelatinasa de 92 kDa, gelatinasa B) . Las MMPs secretadas incluyen MMP-11 (estromelisina 3), MMP-21 (X-MMP) y MMP-28 (epilisina) . Las MMPs unidas a membrana incluyen: el conjunto de cisteína de transmembrana de tipo II, MMP-23, las MMPs fijadas a glicosil fosfatidilinositol 17 y 25 (MT4-MMP y MT6-MMP respectivamente), y las MMPs de transmembrana tipo I 14, 15, 16, 24, (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP y MT5-MMP, respectivamente) . Las 6 MT-MMPs tienen un sitio de disociación de furina en el pro-péptido, que es una característica también compartida por MMP-11. Otras MMPs incluyen, MMP-12 (metaloelastasa de macrófago) , MMP-19 (RASI-1, que se conoce habitualmente como estromelisina-4) , enamelisina (MMP-20) y M P-27 (MMP-22, C-MMP) , MP-23A (CA- P) , y MP-23B. 3. TIMPs Las MMPs son inhibidas por inhibidores específicos de tejido endogenoso de metaloproteinasa (TIMPs) , que comprenden una familia de cuatro inhibidores de proteasa: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4. Globalmente, todas las MMPs son inhibidas por TIMPs una vez activadas pero las gelatinasas (MMP-2 y MMP-9) pueden formar complejos con TIMPs cuando las enzimas se encuentran en forma latente. El complejo de MMP-2 latente (pro-MMP-2) con TIMP-2 sirve para facilitar la activación de pro-MMP-2 en la superficie celular por MTl-MMP (MMP-14), una MMP anclada a membrana. 4. Razón MMP/TIMP Una de las características únicas para el perfil de MMP-TIMP en enfermedad cardiaca hipertensiva es la utilización de la TIMP específica cardiaca, TIMP-4 y colocarla en contexto con una MMP que cambia en mayor magnitud en pacientes hipertensos y con infarto del miocardio. Se divulgan también proporciones entre una MMP, como por ejemplo MMP-9 ó MMP-13 y una TIMP, como por ejemplo TIMP-1, TIMP-2 ó TIMP-4. Estas proporciones son utilizadas por vez primera aquí como diferenciales de diagnóstico y para identificar pacientes con estados de enfermedad claramente diferentes.

. Tamizaje Plasmático La ventaja esencial de la presente enseñanza es que en los métodos divulgados aqui proporcionan un proceso más rápido y simplificado para identificar a partir de un tejido o fluido corporal un sujeto que está en riesgo de desarrollar una LVH adversa, asi como para identificar pacientes en los cuales este proceso está ocurriendo a una velocidad acelerada. Por consiguiente, los métodos divulgados aqui pueden comprender la detección de MPs y TIMPs en fluido corporal del sujeto, como por ejemplo sangra, orina, plasma, suero, lágrimas, linfa, bilis, fluido cerebroespinal, fluido intersticial, humor acuoso o vitreo, calostro, esputo, fluido amniótico, saliva, secreciones anales y vaginales, sudor, semen, exudado, transudado y fluido sinovial. El plasma sanguíneo es el componente líquido de la sangre en donde los glóbulos sanguíneos están suspendidos. El plasma es el componente individual más grande de la sangre, y forma aproximadamente el 55% del volumen total de la sangre. El suero se refiere a plasma sanguíneo en donde los factores de coagulación (como por ejemplo fibrina) han sido removidos. El plasma sanguíneo contiene muchas proteínas vitales que incluyen fibrinógeno, globulinas y albúmina sérica humana. A veces el plasma sanguíneo puede contener impurezas virales que deben ser extraídas a través de procesamiento viral. 6. Inmunoensayo Existen numerosos métodos para detectar analitos tales como proteínas, como por ejemplo MMPs y TIMPs, conocidos o recientemente descubiertos en la técnica, que pueden ser utilizados en los métodos divulgados. Por ejemplo, MMPs y TIMPs pueden ser detectadas utilizando métodos estándares de inmunodetección . Los pasos de varios métodos de inmunodetección útiles han sido descritos en la literatura científica como por ejemplo en Maggio et al., Enzyme-Immunoassay, (1978) y Nakamura et al., Enzyme Immunoassays : Heterogeneous and Homogeneous Systems, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry, 27.1-27.20 (1986), que se incorporan aquí por referencia en su totalidad y específicamente con relación a su enseñanza sobre métodos de inmunodetección. Los inmunoensayos, en su sentido más simple y directo, son ensayos de unión que involucran la unión entre anticuerpos y antígeno. Muchos tipos de formatos de inmunoensayos son conocidos y todos son adecuados para detectar los biomarcadores divulgados. Ejemplos de inmunoensayos son ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) , radioinmunoensayos (RIA) , ensayos de precipitación radioinmunes (RIPA) , ensayos de captura de inmunoperla, Western blot, dot blot, ensayo de retardo en gel, citometría de flujo, conjuntos de proteínas, ensayos de perlas multiplexadas, captura magnética, formación de imágenes in vivo, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) , y recuperación/localización de fluorescencia después de fotoblanqueado (FRAP/FLAP) . En general, los inmunoensayos involucran la puesta en contacto de una muestra suspendida que contiene una molécula de interés (como por ejemplo los1 biomarcadores divulgados) con un anticuerpo a la molécula de interés o la puesta en contacto de un anticuerpo con una molécula de interés (como por ejemplo anticuerpos para los biomarcadores divulgados) con una molécula que puede estar unida por el anticuerpo, según el caso, en condiciones efectivas para permitir la formación de inmunocomplej os . La puesta en contacto de una muestra con el anticuerpo para la molécula de interés o con la molécula que puede estar unida por un anticuerpo a la molécula de interés bajo condiciones efectivas y durante un lapso de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes (complejos inmunes primarios) es generalmente una cuestión de simplemente poner en contacto la molécula o anticuerpo y la muestra e incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficientemente largo para que los anticuerpos formen complejos inmunes con cualquier moléculas, es decir se unen con cualquier molécula (por ejemplo, antigenos) presente con la cual el anticuerpo puede unirse. En muchas formas de inmunoensayo, la composición muestra-anticuerpo, como por ejemplo una sección tisular, placa de ELISA, dot blot o Western blot, puede entonces lavarse con el objeto de remover cualquier especie de anticuerpo no específicamente unido, permitiendo solamente que los anticuerpos específicamente unidos dentro de los complejos inmunes primarios se detecten. Los inmunoensayos pueden incluir métodos para detectar o cuantificar la cantidad de una molécula de interés (como por ejemplo los biomarcadores divulgados o sus anticuerpos) en una muestra, dichos métodos involucran generalmente la detección o cuantificación de cualquier complejo inmune formado durante el proceso de unión. En general, la detección de formación de inmunocomplejos es bien conocida en la técnica y puede lograrse a través de la aplicación de numerosos enfoques. Estos métodos son generalmente basados en la detección de una etiqueta o marcador, como por ejemplo etiquetas radioactivas, fluorescentes, biológicas o enzimáticas o cualquier otra etiqueta conocida. Véase, por ejemplo, patentes norteamericanas NOs. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad y específicamente para enseñanza sobre métodos de inmunodeteccion y etiquetas. Como se utiliza aquí, una etiqueta puede incluir un colorante fluorescente, un miembro de un par de unión como por ejemplo biotina/estreptavidina, un metal (por ejemplo, oro) o una etiqueta de epítopo que puede interactúa específicamente con una molécula que puede ser detectada, como por ejemplo medianet la producción de un sustrato de color o fluorescencia. Sustancias adecuadas para proteínas de etiquetado detectable incluyen colorantes fluorescentes (se conocen también como fluorocromos y fluoróforos) y enzimas que reaccionan con los sustratos colorométrico (por ejemplo peroxidasa de rábano agrio) . El uso de colorantes fluorescentes es generalmente preferida en la práctica de la presente invención puesto que ¦ pueden ser detectados en cantidades muy pequeñas. Además, en el caso en el cual antígenos múltiples reaccionen con un solo conjunto, cada antígeno puede ser etiquetado con un compuesto fluorescente distinto para detección simultánea. Puntos marcados en el conjunto son detectados utilizando un fluorímetro, la presencia de una señal indicando un antígeno unido a un anticuerpo específico. Los fluoróforos son compuestos o moléculas que proporcionan luminiscencia. Fluoróforos típicos absorben energía electromagnética a una longitud de onda y emiten energía electromagnética a una segunda longitud de onda. Fluoróforos representativos incluyen, pero son limitarse a estos ejemplos, 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-metilumbelliferona; 5-carboxi-2 , 7-diclorofluoresceína ; 5-Carboxifluoresceína (5-FAM) ; 5-Carboxinafofluoresceína; 5-Carboxitetrametilrodamina (5-TAMRA); 5-hidroxi triptamina (5-HAT); 5-ROX (carboxi-X- rodamina) ; 6-Carboxirodamina 6G; 6-CR 6G; ß-JOE; 7-amino-4-metilcoumarina; 7-aminoactinomicina D (7-AAD) ; 7-hidroxi-4- I metilcoumarina; 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA) ; ABQ; fucsina de ácido; anaranjado de acridina; rojo acridina; amarillo acridina; acriflavina; acriflavina Feulgen SITSA; aequorina ( fotoproteina) ; AFPs - Proteina autofluorescente -(Quantum Biotechnologies ) véase sgGFP, sgBFP; Alexa Fluor 35QTM; Alexa Fluor 430™; Alexa Fluor 488™; Alexa Fluor 532™; Alexa Fluor 546™; Alexa Fluor 568™; Alexa Fluor 594™; Alexa Fluor 633™; Alexa Fluor 647™; Alexa Fluor 660™; Alexa Fluor 680™; Complexon Alizarina; rojo Alizarina; Aloficocianina (APC) ; A C, A CA-S; Aminometilcoumarina (AMCA) ; AMCA-X; aminoactinomicina D; aminocoumarina; azul anilina; esterato de antrocilo; APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; Astrazon Brilliant Red 4G; Astrazon Orange R; Astrazon Red 6B; Astrazon Yellow 7 GLL; Atabrine; ATTO- TAG™ CBQCA; ATTO-TAG™ FQ; Auramina; Aurofosfina G; Aurofosfina; BAO 9 (bisaminofeniloxadiazol ) ; BCECF (pH elevado); BCECF (pH bajo); Sulfato de Berberina; Beta Lactamasa; GFP desplazado azul BFP (Y66H) ; Proteina fluorescente azul; BFP/GFP FRET; Bimano; Bisbenzemida; bisbenzimida (Hoechst) ; bis-BTC; Blancophor FFG; Blancophor SV; B0B0™-1; BOBO™-3; Bodipy492/515 ; Bodipy493/503 ; Bodipy500/510; Bodipy; 505/515; Bodipy 530/550; Bodipy 542/563; Bodipy 558/568; Bodipy 564/570; Bodipy 576/589; Bodipy 581/591; Bodipy 630/650-X; Bodipy 650/665; Bodipy 665/676; Bodipy Fl; Bodipy FL ATP; Bodipy Fl-Ceramida; Bodipy R6G SE; Bodipy TMR; Bodipy TMR-X conjugado; Bodipy TMR-X, SE; Bodipy TR; Bodipy TR ATP; Bodipy TR-X SE; B0-PR0™-1; B0-PR0™-3; Brilliant Sulphoflavin FF; BTC; BTN-5N; Calceina; azul calceina; Crimson calcio -; Verde calcio; Tinte Verde calcio-1 CA2+; verde calcio-2 Ca2+; Verde calcio-5N Ca2+; Verde calcio-C18 Ca2+; anaranjado calcio; blanco Calcofluor; carboxi-X-rodamina (5-ROX) ; Cascade Blue™; Cascade Yellow; Catecolamina; CCF2 (GeneBlazer) ; CFDA; CFP (proteina fluorescente cian) ; CFP/YFP FRET; Chlorophyll; cromomicina A, cromomicina A; CL-NEFR; CMFDA; colenterazina, coelenterazina cp; coelenterazaina f, coelnterazina fcp; coelenterazina h; coelenterazina hcp; coelenterazina ip; coelenterazina n; colelenterazina O; Coumarina faloidina; C-ficocianina ; CPM I metilcoumarina; CTC; CTC formazan; Cy2™; Cy3.1 8; Cy3.5™; Cy3™; Cy5.1 8; Cy5.5™; Cy5™; Cy7™; cian GFP; fluorosensor AMP cíclico (FiCRhR); dabcilo; dansilo; amina dansilo; cadaverina dansilo; cloruro de dansilo; DHPE de dansilo; fluoruro de dansilo; DAPI; dapoxilo; dapoxilo 2; dapoxilo 3'DCFDA; (diacetato de diclorodihidrofluoresceína) ; DDAO; DHR (dihidrodamina 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (no-proporción) ; día (4-Di 16-ASP) ; diacetato de diclorodihidrofluorescenína (DCFH) ; marcador DiD-lipofílico; DiD (DilC18(5)); DIDS; Dihidrhodamina 123 (DHR); Dil (DÍ1C18 (3) ) ; I Dinitrofenol ; DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (DÍ1C18 (7) ) ; DM-NERF (pH alto); DNP; dopamina; DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; eosina; eritrosina; eritrosina ITC; bromuro de etidio; homodimero de etidio-1 (EthD-1) ; eucrisina; EukoLight; cloruro de Europio (111); EYFP; azul rápido; FDA; Feulgen (pararosanilina) ; FIF (fluorescencia inducida por formaldehido) ; FITC; anaranjado Flazo; Fluo-3; Fluo-4; fluoresceina (FITC); diacetato de fluoresceina; fluoro-esmeralda; fluoro-oro (hidroxiestilbamidina); fluor-rubi; FluorX; FM 1-43™; FM 4-46; Fura Red™ (pH alto); Fura Red™/Fluo-3; Fura-2; Fura-2/BCECF; Genacryl Brilliant Red B; Genacryl Brilliant Yellow 10GF; Genacryl Pink 3G; Genacryl Yellow 5GF; GeneBlazer; (CCF2); GFP (S65T) ; rojo desplazado GFP (rsGFP) ; excitación no-UV de tipo GFP silvestre (wtGFP) ; tipo GFP silvestre, excitació UV (wtGFP) ; GFPuv; ácido gloxálico; azul granular; hematoporfirina; Hoeschst 33258; Hochst 33342; Hoechst 34580; HPTS; hidroxicoumarina; hidroxiestilbamidina (FluoroGold) ; hidroxitriptamina; Indo-1, calcio alto; Indo-1 calcio bajo; indodicarbocianina (DiD) ; indotricarbocianina (DiR); Intrawhite Cf; JC-1, JO JO-1; JO-PRO-1; LaserPro; Laurodan; LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA) ; Leucofor PAF; leucofor SF; leucofor WS; lisamina rodamina; lisamina rodamina B; calceina/homodimero de etidio; LOLO-1; LO-PRO-1; Lucifer Yellow; Lyso Tracker Blue; Lyso Tracker Blue-White; Lyso Tracker Green; Lyso Tracker Red; Lyso Tracker Yellow; LysoSensor Blue; LysoSensor Green; LysoSensor Yellow/Blue; Mag Green; Magdala Red (floxin B) ; Mag-Fura Red; Mag-Fura-2; Mag-Fura-5; ag-Indo-1 ; verde magnesio; anaranjado magnesio; malaquina verde; azul marina; I Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF; Maxilon Brillian Flavin 8 GFF; merocianina; metoxicoumarina; Mitotracker Green FM; Mitotracker Orange; Mitotracker Red; mitramicina ; monobromobimano; monobromobimano (mBBr-GSH) ; monoclorobimano; MPS (estilbene pironina verde metilo) ; NBD; NBD amina; Rojo Nilo; nitrobenzoedidol; noradrenalina; Rojo rápido nuclear; Amarillo nuclear i; Nylosan Brillian lavin E8G; Oregon Green™; Oregon Green™ 488; Oregon Green™ 500; Oregon Green™ 514; azul pacifico; aprarosanilina (Feulgen) ; PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-TexasRed (Rojo 613); floxina B (Magdala rojo) ; Phorwite AR; Phorwite BKL; Phorwite Rev; Phorwite RPA; fosfina 3R; PhotoResist; ficoeritrina B [PE]; ficoeritrina R [PE]; PKH26 (Sigma) ; PKH67; PMIA; Pontochrome Blue Black; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-I PRO-3; primulina; Procion Yellow; Propidium Iodid (Pl) ; PyMPO; pireno; pironina; pironina B; Pyrozal Brilliant Flavin 7GF; QSY 7; quinacrina mostaza; resofurina; RH 414; Rhod-2; rodamina; rodamina 110; rodamina 123; rodamina 5 GLD; rodamina 6G; rodamina B; rodamina B 200; rodamina B extra; rodamina BB; rodamina BG; rodamina verde; rodamina falicidina; rodamina; faloidina; rodamina roja; rodamina WT; Rose Bengal; R- ficocianina; R-ficoeritrina (PE) ; rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; Sapphire GFP; SBFI; serotonina; Sevron Brilliant Red 2B; Sevron Brilliant Red 4G; Sevron 1 Brilliant Red B; Sevron Orange; Sevron Yellow L; sgBFP™ (super glow BFP) ; sgGFP™ (super glow GFP) ; SITS (primulina; ácido estilben isotiosulfónico) ; calceina SNAFL; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF calceina; SNARF1; verde sodio; SpectrumAqua ; SpectrumGreen; SpectrumOrange; Spectrum Red; SPQ ( 6-metoxi-N- (3-sulfopropil ) quinolinio) ; estilbeno; sulforodamina B y C; sulforodamina extra; SYTO 11, SYTO 12; SYTO 13, SYTO 14; SYTO 15; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOX azul, SYTOX Verde; SYTOX anaranjado; tetraciclina ; tetrametilrodamina (TRITC) ; Texas Red™; Texas Red-X™ conjugado; tiadiacarbocianina (DÍSC3) ; rojo tiazina R; anaranjado tiazol; tioflavina 5; tioflavina S; tioflavina TON; tiolito; anaranjado tiazol, CBS tinopol (blanco Calcofluor) ; TIER; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; Tricolor (PE-Cy5); TRITC TetrametilrodaminelsoTiocianato; azul verdadero; rojo verdadero; Ultralite; uranina B; Uvitex SFC; wt GFP; WW 781; rodamina X; XRITC; anaranjado xileno; Y66F; Y66H; Y66W; GFP amarillo; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO 3; YOYO-1; YOYO-3; Sybr Greene; anaranjado tiazol (colorante de interquelación) ; nanopartículas de semiconductor, como por ejemplo puntos cuánticos; o fluoróforo enjaulado (que puede ser activado con luz u otra fuente de energía electromagnética) , o una combinación de ellos. El etiquetado puede ser directo o indirecto. En el caso del etiquetado directo, el anticuerpo detector (el anticuerpo para la molécula de interés) o la molécula detectora (la molécula que puede estar unida por un anticuerpo a la molécula de interés) incluye una etiqueta. La detección de la etiqueta indica la presencia del anticuerpo detector o molécula detectora, lo que indica a su vez la presencia de molécula de interés o de un anticuerpo para la molécula de interés, respectivamente. En el caso del etiquetado indirecto, una molécula adicional o porción es llevada en contacto con el inmunocomplejo o generada .en el sitio del inmunocomplejo. Por ejemplo, una molécula generadora de señales o porción generadora de señales como por ejemplo la enzima puede sujetarse o asociarse con el anticuerpo detector o la molécula detectora. La molécula generadora de señales puede generar entonces una señal detectable en el sitio del inmunocomplejo. Por ejemplo, una enzima cuando es suministrada con un sustrato adecuado, puede producir un producto visible o detectable en el sitio del inmunocomplejo. ELISAs utiliza este tipo de etiquetado indirecto.

Como otro ejemplo de etiquetado indirecto, una molécula adicional (que puede conocerse como un agente de unión) que puede unirse con o bien la molécula de interés o bien con el anticuerpo (anticuerpo primario) a la molécula de interés, por ejemplo un segundo anticuerpo para el anticuerpo primario, puede estar en contacto con el inmunocomplejo. La molécula adicional puede tener una molécula o porción generadora de señal o una etiqueta. La molécula adicional puede ser un anticuerpo que puede conocerse como anticuerpo secundario. La unión de un anticuerpo secundario con el anticuerpo primario puede formar lo que se conoce como un emparedado con el primer anticuerpo (o anticuerpo primario) y la molécula de interés. Los complejos inmunes pueden entrar en contacto con el anticuerpo secundario etiquetado bajo condiciones efectivas y durante un lapso de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes secundarios. Los complejos inmunes secundarios pueden entonces ser generalmente lavados para remover los anticuerpos secundarios etiquetados no específicamente unidos y la etiqueta restante en los complejos inmunes secundarios puede ser entonces detectada. La molécula adicional puede ser también o incluir uno de un par de moléculas o porciones que pueden unirse entre ellas, por ejemplo el par biotina/avadina . De esta manera, el anticuerpo detector o la molécula detectar debe incluir el otro miembro del par.

Otros modos de etiquetado indirecto incluyen la detección de complejos inmunes primarios a través de un enfoque de dos pasos. Por ejemplo, una molécula (que puede conocerse como un primer agente de unión), como por ejemplo un anticuerpo, que tiene afinidad de unión para la molécula de interés o anticuerpo correspondiente puede utilizarse para formar complejos inmunes secundarios de conformidad con lo descrito arriba. Después de lavado, los complejos inmunes secundarios pueden entrar en contacto con otra molécula (que puede conocerse como un segundo agente de unión) que tiene afinidad de unión para el primer agente de unión, otra vez bajo condiciones efectivas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de complejos inmunes (formando por consiguiente complejos inmunes terciarios) . El segundo agente de unión puede estar unido a una etiqueta detectable o a una molécula generadora de señales o porción generadora de señales, permitiendo la detección de los complejos inmunes terciarios formados de esta manera. Este sistema puede proporcionar amplificación de señales. Los inmunoensayos que involucran la detección de una sustancia, como por ejemplo proteina o un anticuerpo para una proteina especifica, incluyen ensayos libres de etiqueta, métodos de separación de proteina (es decir electroforesis) , ensayos de captura de soporte sólido, o bien detección in vivo. Ensayos libres de etiqueta son generalmente medios de diagnóstico para determinar la presencia o ausencia de una proteina especifica, o un anticuerpo para una proteina especifica, en una muestra. Métodos de separación de proteina son adicionalmente útiles para evaluar las propiedades físicas de la proteína, como por ejemplo el tamaño o la carga neta. Ensayos de captura son generalmente más útiles para evaluar cuantitativamente la concentración de una proteína específica, o anticuerpo para una proteína específica, en una muestra. Finalmente, la detección in vivo es útil para evaluar patrones de expresión espaciales del sustrato, es decir, en donde la sustancia puede encontrarse en sujeto, tejido o célula. A condición que las concentraciones sean suficientes, los complejos moleculares ([Ab-Ag]r¡) generados por interacción anticuerpo-antígeno están visibles a simple vista, pero cantidades menores pueden también ser detectadas y medidas debido a su capacidad de dispersar un haz de luz. La formación de complejos indica que ambos reactivos están presentes, y en ensayos de inmunoprecipitación se utiliza una concentración constante de un anticuerpo reactivo para medir el antígeno específico ([Ab-Ag]n), y antígenos de reactivo se utilizan para detectar anticuerpo específico ([Ab-Ag]n). Si la especie de reactivo está previamente recubierta en células (como en el caso de ensayo de hemaglutinación) o partículas muy pequeñas, como en el caso de ensayo de aglutinación en látex) , la formación de "agrupamiento" de las partículas recubiertas es visible en concentración mucho más bajas. Varios ensayos basados en estos principios elementales están en uso común, incluyendo el ensayo de inmunodifusión Ouchterlony, inmunoelectroforesis de cohete, así como ensayos de inmunoturbidométricos y nefelométricos . Las limitaciones principales de tales ensayos son una sensibilidad restringida (límites de detección inferiores) en comparación con ensayos que emplean etiquetas y, en algunos casos, el hecho que concentraciones muy altas de analito pueden inhibir de hecho la formación de complejo, requiriendo de protecciones lo que provoca que los procedimientos sean más complejos. Algunos de estos ensayos de Grupo 1 datan desde el descubrimiento de anticuerpos y ninguno de ellos tiene una "etiqueta" actual (por ejemplo, Ag-enz) . Otros tipos de inmunoensayos que no tiene etiquetas dependen de inmunosensores y varios instrumentos que pueden detectar directamente interacciones anticuerpo-antígeno están ahora disponibles en el comercio. La mayoría de ellos depende de la generación de una onda evanescente en una superficie de sensor con ligando inmovilizado, que permite el monitoreo continuo e la unión con el ligando. Inmunosensores permiten la investigación fácil de interacciones cinéticas y, con la llegada de instrumentos especializados a costos menores, puede encontrar una aplicación amplia en inmunoanálisis en el futuro.

El uso de inmunoensayos para detectar una proteina especifica puede incluir la separación de las proteínas por electroforesis . La electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución en respuesta a un campo eléctrico. Su tasa de migración depende de la fuerza del campo; de la carga neta, tamaño y forma de las moléculas y también de la resistencia iónica, viscosidad y temperatura de medio en el cual las moléculas se están desplazando. Como herramienta analítica, la electroforesis es sencilla, rápida y muy sensible. Se utiliza analíticamente para estudiar las propiedades de una especie cargada individual y como técnica de separación. En general se coloca la muestra en una matriz de soporte como por ejemplo papel, acetato de celulosa, gel de 'almidón, agarosa o bien gel de poliacrilamida . La matriz inhibe el mezclado convectivo causado por el calor y ofrece un registro del experimento electoforético : al final del experimento, la matriz puede ser teñida y utilizada para escaneo, auto-radiografía o almacenamiento. Además, las matrices de soporte más comúnmente utilizadas - agarosa y poliacrilamida ofrecen un medio para separar moléculas por tamaño en la medida en que son geles porosos. Un gel poroso puede actuar como un tamiz retardando o en algunos casos obstruyendo totalmente el movimiento de grandes macromoléculas mientras permite que moléculas más pequeñas migren libremente. Puesto que geles de agarosa diluidos son generalmente más rígidos y fáciles de manejar que poliacrilamida de la misma concentración, se utiliza agarosa para separar macromoléculas de mayor tamaño como por ejemplo ácidos nucleicos, proteínas grandes y complejos de proteína. La poliacrilamida que es fácil de manejar y elaborar en concentraciones más elevadas se utiliza para separar la mayoría de las proteínas y oligonucleótidos pequeños que requieren de un pequeño tamaño de poro de gel para retardo. Las proteínas son compuestos anfotéricos ; su carga neta por consiguiente es determinada por el pH del medio en donde están suspendidas. En una solución con un pH por enzima de su punto isoeléctrico, una proteína tiene una carga negativa neta y migra hacia el ánodo en un campo eléctrico. Debajo de su punto isoeléctrico, la proteína es positivamente cargada y migra hacia el cátodo. La carga neta portada por una proteína es además independiente de su tamaño - es decir, la carga portada por masa unitaria (o longitud, puesto que las proteínas y los ácidos nucleicos son macromoléculas lineales) de molécula difiere de proteína a proteína. Por consiguiente, a un pH dado y bajo condiciones no desnaturalizantes, la separación electroforética de proteínas es determinada tanto por el tamaño como por la carga de las moléculas. El sulfato de dodecilo sódico (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas mediante el hecho de "envolver" la estructura de polipéptido - y SDS se une a proteínas de manera relativamente específica en una proporción en masa de 1.4:1. De esta manera, el SDS confiere una carga negativa al polipéptido en proporción a su longitud. Además, es habitualmente necesario reducir puentes disulfuro en proteínas (desnaturalizar) antes que adopten la configuración helicoidal aleatoria necesaria para separación i por tamaño; esto se efectúa con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT) . En separaciones SDS-PAGE desnaturalizantes, por consiguiente la migración es determinada no por la carga eléctrica intrínseca del polipéptido pero por el peso molecular. La determinación del peso molecular se efectúa mediante SDS-PAGE de proteínas de peso molecular conocido junto con la proteína a caracterizar. Una relación lineal existe entre el logaritmo del peso molecular y un polipéptido desnaturalizado por SDS, o ácido nucleico nativo, y su Rf. Se calcula Rf como la proporción entre la distancia sobre la cual migró la molécula que migró por una frente de colorante de marcador. Una forma sencilla de determinar el peso molecular relativo por electroforesis {Mr) es graficar una curva estándar de distancia migrada vs . loglOMW (peso molecular) para muestras conocidas y leer el logMr de la muestra después de la medición de la distancia migrada en el mismo gel. En electroforesis bidimensional, proteínas son fraccionadas primero con base en una propiedad física, y en un segundo paso con base en otra. Por ejemplo, se puede utilizar el enfoque isoeléctrico para la primera dimensión, lo que se efectúa convenientemente en un gel de tubo, y la electroforesis de SDS en un gel de placa puede utilizarse para la segunda dimensión. Un ejemplo de un procedimiento es el procedimiento de O' Farrell, P.H. High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins, J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad por su enseñanza en materia de métodos de electroforesis bidimensional . Otros ejemplos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los ejemplos encontrados en Anderson, NG, High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins, Proc. Nati. Acad. Sci. 74:5421 (1977), Ornstein, L., Disc Electrophoresis, L. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121:321349 (1964), cada uno de los cuales incorporándose aquí por referencia en su totalidad para enseñanzas sobre los métodos de electroforesis . Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227:680 (1970), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad para las enseñanzas sobre métodos de electroforesis, divulga un sistema discontinuo para resolver proteínas desnaturalizadas con SDS. El ión rector en el sistema de amortiguador de Laemmli es cloruro, y el ión casero es glicina. Por consiguiente, el gel de resolución y el gel de apilamiento se elaboran en amortiguadores Tris-HCl (de concentración diferente y pH diferente), mientras que el amortiguador de tanque es Tris-glicina. Todos los amortiguadores contienen SDS al 0.1%. Un ejemplo de un inmunoensayo que utiliza electroforesis que se contempla en los métodos actuales es el análisis Western blot. El análisis Western blot o el inmunoblot permite la determinación de la masa molecular de una proteina y la medición de cantidades relativas de la proteina presente en diferentes muestras. Métodos de detección incluyen la quimioluminiscencia y la detección cromagénica. Métodos estándares para análisis Western blot pueden encontrarse, por ejemplo en D.M. Bollag et al., Protein Methods (2a Edición 1996) y E. Harlow & D. Lañe, Antibodies, a Laboratory Manual (1988), Patente norteamericana No. 4,452,901, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad para las enseñanzas en materia de métodos Western blot. En general, las proteínas son separadas por electroforesis en gel, habitualmente SDS-PAGE. Las proteínas son transferidas a una hoja de papel secante especial, por ejemplo, nitrocelulosa, aún cuando otros tipos de papel, o membranas pueden utilizarse. Las proteínas conservan el mismo patrón de separación que tenían en el gel. El blot es incubado con una proteína genérica (como por ejemplo proteínas de leche) para unirse con cualquier lugar adhesivo restante en la nitrocelulosa . Se agrega entonces un anticuerpo a la solución que puede unirse a una proteina especifica. La fijación de anticuerpos específicos sobre antígenos inmovilizados específicos puede visualizarse fácilmente mediante técnicas indirectas de inmunoensayo de enzima, utilizando habitualmente un sustrato cromogénico (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano agrio) o sustratos quimioluminiscentes . Otras posibilidades para probar incluyen el uso de etiquetas fluorescentes o radioisótopos (por ejemplo, fluoresceína, 125I) . Sondas para la detección de unión con anticuerpo pueden ser anti-inmunoglobulinas conjugadas, proteína A estafilocócica conjugada (se une con IgG) o bien sondas para anticuerpos primarios biotinilados (por ejemplo, avidina/estreptavidina conjugadas) . El poder de esta técnica se encuentra en la detección simultánea de una proteína específica por medio de su antigenicidad, y su masa molecular. Las proteínas son primero separadas por masa en un SDS-PAGE, después detectadas específicamente en el paso de inmunoensayo. Por consiguiente, estándares de proteína (escalera) pueden ser experimentados simultáneamente con el objeto de aproximar la masa molecular de la proteína de interés en una muestra heterogénea. Ensayo de retardo en gel o el ensayo de retardo de movilidad electroforética (EMSA) puede utilizarse para detectar las interacciones entre proteínas de unión DNA y sus secuencias de reconocimiento de DNA correspondientes, en forma cualitativa así como en forma cuantitativa. Técnicas de ejemplo se describen en Ornstein L., Disc electrophoresis -I: Background and theory, Ann. NY Acad. Sci. 121:31-349 (1964) y Matsudiara, PT and DR Burguess, SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel electrophoresis, AnaL Biochem. 87:386-396 (1987), que se incorporan aquí por referencia en su totalidad para las enseñanzas relacionadas con ensayos de retardo en gel. En un ensayo de retardo en gel general, proteínas purificadas o extracto de células crudas pueden incubarse con una sonda de DNA o RNA etiquetada, por ejemplo radioetiquetado con 32P) , seguido por separación de los complejos de la sonda libre a través de un gel de poliacrilamida de no desnaturalización. Los complejos migran más lentamente a través del gel que la sonda no unida. Según la actividad de la proteína de unión, una sonda etiquetada puede ser ya sea de una sola cadena o bien de cadena doble. Para la detección ,de proteínas de unión de DNA tales como factores de transcripción, proteínas purificadas o bien parcialmente purificadas, o extractos de células nucleares pueden utilizarse. Para la detección de proteínas de unión con RNA, se pueden utilizar o bien proteínas purificadas o parcialmente purificadas, o bien extractos de células citoplásmicas o nucleares. La especificidad de la proteina de unión con DNA o RNA para el sitio de unión putativo se establece mediante experimentos de competencia utilizando fragmentos de DNA o RNA o bien oligonucleótidos que contienen un sitio de unión con la proteina de interés, u otra secuencia no relacionada. Las diferencias en cuanto a naturaleza e intensidad del complejo formado en presencia de un competidor especifico y no especifico permite la identificación de interacciones especificas. Véase Promega, Gel Shift Assay FAQ, disponible en http: //www . promega . com/faq/gelshfaq . html (se visitó por vez última el 25 de marzo de 2005) que se incorpora aquí por referencia en su totalidad para las enseñanzas sobre métodos de retardo en gel. Métodos de retardo en gel pueden incluir la utilización, por ejemplo, de formas coloidales de tinción azul COOMASSIE (Imperial Chemicals Industries, Ltd) para detectar proteínas en geles, como por ejemplo geles electroforesis en poliacrilamida . Tales métodos se describen, por ejemplo en Neuhoff et al., Electrophoresis 6:427-488 (1985), y Neuhoff et al., Electrophoresis 9:255-262 (1988), que se incorporan aquí cada uno por referencia en su totalidad para las enseñanzas sobre los métodos de retardo en gel. Además de los métodos de ensayo de proteina convencionales mencionados arriba, se describe una combinación de composición de limpieza y de tinción de proteina en la patente norteamericana No. 5,424,000, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad para sus enseñazas con relación a métodos de retardo en gel. Las soluciones pueden incluir ácido fosfórico, ácido sulfúrico, y ácido nítrico, así como colorante de violeta de ácido. El Ensayo de Precipitación Radioinmune (RIPA) es un ensayo sensible que utiliza antígenos radioetiquetados para detectar anticuerpos específicos en suero. Los antígenos pueden reaccionar con el suero y después son precipitados utilizando un reactivo especial como por ejemplo perlas de proteína A sefarosa. El inmunoprecipitado radiomarcado unido es entonces comúnmente analizado por electroforesis en gel. El ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) es frecuentemente utilizado como prueba de confirmación para diagnosticar la presencia de anticuerpos para VIH. RIPA se conoce también en la técnica como ensayo de Farr, ensayo de precipitina, ensayo de precipitina radioinmune; y análisis por radioinmunoprecipitación . Mientras los inmunoensayos indicados arriba que utilizan electroforesis para separar y detectar las proteínas específicas de interés permiten la evaluación del tamaño de proteína, no son muy sensibles para evaluar la concentración de proteína. Sin embargo, se contemplan también inmunoensayos en donde la proteína y el anticuerpo específico para la proteina está unido a un soporte sólido (por ejemplo, tubo, pozo, perla, o célula) para capturar el anticuerpo o proteina de interés, respectivamente, de una muestra, en combinación con un método para detectar la proteina o anticuerpo especifico para la proteina en el soporte. Ejemplo de tales inmunoensayos incluyen radioinmunoensayo (RIA) , ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), citometria de flujo, conjunto de proteínas, ensayo de perla multiplexado y captura magnética . El radioinmunoensayo (RIA) es un ensayo cuantitativo clásico para detectar reacciones antígeno-anticuerpo utilizando una sustancia marcada radioactivamente (radioligando) ya sea directa o indirectamente, para medir la unión de la sustancia no etiquetada con un anticuerpo específico o bien con otro sistema de receptor. Se utiliza radioinmunoensayo, por ejemplo, para probar niveles de hormona en la sangre sin necesidad de utilizar un bioensayo. Sustancias no inmunogénicas (por ejemplo haptenos) pueden también ser medidas si están acopladas a proteínas portadoras de mayor tamaño (por ejemplo, gamma-globulina bovina o albúmina sérica humana) capaces de inducir la formación de anticuerpos. RIA incluye el mezclado de un antígeno radioactivo (debido a la facilidad con la cual átomos de yodo pueden ser introducidos en residuos de tirosina en una proteína, los isótopos radioactivos 125I o 131I se utilizan frecuentemente) con anticuerpo para este antigeno. El anticuerpo está generalmente enlazado a un soporte sólido, como por ejemplo un tubo o perlas. Antigeno no etiquetado o "frío" se agrega entonces en cantidades conocidas y se mide la cantidad de antigeno etiquetado desplazado. Inicialmente, el antigeno radioactivo está unido a los anticuerpos. Cuando se agrega un antigeno frió, los dos compiten para sitios de unión con anticuerpos - y en concentraciones más elevadas de antigeno frió, más se une con el anticuerpo, desplazando la variante radioactiva. Los antigenos unidos son separados de los antigenos no unidos en solución y la radioactividad de cada uno se utiliza para graficar una curva de unión. Esta técnica es extremadamente sensible y muy especifica. El ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) , o de manera más genérica EIA (inmunoensayo enzimático) , es un inmunoensayo que puede detectar un anticuerpo especifico para una proteina. En un ensayo de este tipo, una etiqueta detectable unida ya sea a un reactivo de unión con anticuerpo o reactivo de unión con antigeno es una enzima. Cuando está expuesta a su sustrato, esta enzima reacciona de tal manera que se produzca una porción química que puede ser detectada, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Enzimas que pueden ser utilizadas para marcar de manera detectable los reactivos útiles para detección incluye, pero sin limitarse a estos ejemplos, peroxidasa de rábano agrio, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, ß-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, asparaginasa, deshidrogenasa de alcohol de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa . Para descripciones de procedimientos ELISA, véase Voller, A. et al., J. Clin. Phatol, 31:507-520 (1978); Butler, J.E., Meth Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed. ) , Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, 1980; Butler, J.E., En: Structure of Antigens, Vol. 1 (Van Regenmortel, . , CRC Press, Boca Ratón, 1992, páginas 209-259; Butler, J.E., En: van Oss, C.J. et al., (eds) , Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1994, páginas 759-803; Butler, J.E. (ed.), Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, 1991); Crowther, "ELISA" : Theory and Practice", En: Methods in Molecule Biology, Vol. 42, Humana Press; Nueva Jersey, 1995; patente norteamericana No. 4,376,110, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad y específicamente para las enseñanzas relacionadas con métodos ELISA. Variaciones de técnicas ELISA son conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia. En una variación, anticuerpos que pueden unirse a proteínas pueden ser inmovilizados en una superficie seleccionada que presenta afinidad de proteina, como por ejemplo un pozo en una placa de microtitulación de poliestireno . Después, una composición sospechada de contener un antigeno marcador puede agregarse a los pozos. Después de unión y lavado para remover los inmunocomplej os no específicamente unidos, el antígeno unido puede ser detectado. La detección puede lograrse mediante la adición de un segundo anticuerpo especifico para la proteína meta, que está unida a una etiqueta detectable. Este tipo de ELISA es un simple "ELISA de emparedado". La detección puede también lograrse mediante la adición de un segundo anticuerpo, seguido por la adición de un tercer anticuerpo que tiene una afinidad de unión para el segundo anticuerpo, con el tercer anticuerpo unido a una etiqueta detectable. Otra variación es un ELISA de competencia. En ELISAs de competencia, muestras de prueba compiten para unión con cantidades conocidos de antígenos etiquetados o anticuerpos. La cantidad de especie reactiva en la muestra puede determinarse mezclando la muestra con la especie etiquetada conocida antes o durante la incubación con pozos recubiertos. La presencia de especies reactivas en la muestra actúa para reducir la cantidad de especies etiquetadas disponibles para unión en el pozo y reduce por consiguiente la señal final. Independientemente del formato empleado, ELISAs tienen ciertas características en común como por ejemplo recubrimiento, incubación o unión, lavado para remover especies no específicamente unidas, y detección de los inmunocomplej os unidos. El antígeno o los anticuerpos pueden estar unidos a un soporte sólido, como por ejemplo en forma de placa, perlas, varillas, membrana o matriz de columna, y la muestra a analizar puede ser aplicada sobre el antígeno inmovilizado o anticuerpo. En el recubrimiento de una placa ya sea con antígeno o con anticuerpo, se incubará generalmente los pozos de la placa con una solución del antígeno o anticuerpo, ya sea durante la noche o bien durante un lapso especificado de horas. Los pozos de la placa pueden ser entonces lavados para remover el material incompletamente adsorbido. Cualquier superficie disponible restante de los pozos puede entonces ser "recubierta" con proteína no específica que es antigénicamente neutral con relación a los antisueros de prueba, incluyen albúmina sérica bovina (BSA) , caseína y soluciones de polvo de leche. El recubrimiento permite el bloque de. los sitios de adsorción no específicos en la superficie de inmovilización y reduce por consiguiente el fondo causado por la unión no específica de antisueros en la superficie. En ELISAs, un medio de detección secundario o terciario en lugar de un procedimiento directo puede también utilizarse. Por consiguiente, después de la unión de una proteína o anticuerpo sobre el pozo, el recubrimiento con un material no reactivo para reducir el fondo, y el lavado para remover el material no unido, la superficie de inmovilización entra en contacto con la muestra clínica o biológica de control para ser probada en condiciones efectivas para permitir la formación de inmunocomplejos (antígeno/anticuerpo) . La detección del inmunocomplejo requiere entonces de un agente de unión secundario etiquetado o un agente de unión secundario en combinación con un tercer agente de unión etiquetado . La expresión "bajo condiciones efectivas para permitir la formación de inmunocomplejo (antígeno/anticuerpo)" significa que las condiciones incluyen la dilución de los antígenos y anticuerpos con soluciones tales como BSA, gamma globulina bovina (BGG) y una solución salina amortiguada con fosfato (PBS)/Tween con el objeto el reducir la unión no específica y para promover una proporción razonable entre señal y ruido. Las condiciones adecuadas se refieren también al hecho que la incubación se efectúa a una temperatura y durante un lapso de tiempo suficientes para permitir una unión efectiva. Los pasos de incubación pueden típicamente ser desde aproximadamente 1 minuto hasta 12 horas, a temperaturas de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C, o bien pueden presentar una incubación durante la noche a una temperatura de aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 10 °C. Después de todos los pasos de incubación en un ELISA, la superficie en contacto puede ser lavada con el objeto de remover el material que no formó complejos. Un procedimiento de lavado puede incluir lavado con una solución como por ejemplo PBS/Tween o amortiguador de borato. Después de la formación de unos inmunocomplej os específicos entre la prueba de muestra y el material unido original, y lavado subsiguiente, se puede determinar la ocurrencia de cantidades aún diminutas de inmunocomplej os . Para proporcionar un medio de detección, el segundo anticuerpo o el tercer anticuerpo puede tener una etiqueta asociada para permitir la detección, de conformidad con lo descrito arriba. Puede ser una enzima que puede generar revelado de color al ser incubada con un sustrato cromogénico apropiado. Por consiguiente, por ejemplo, se puede poner en contacto e incubar el primer inmunocomplej o o el segundo inmunocomplej o con un anticuerpo etiquetado durante un período de tiempo y bajo condiciones que favorecen el desarrollo de formación adicional de inmunocomplej os (por ejemplo, incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS como por ejemlo PBS-Tween) . Después de incubación con el anticuerpo etiquetado, y subsiguientemente al lavado para remover el material no unido, la cantidad de etiqueta puede ser cuantificada, por ejemplo, por incubación con un sustrato cromogénico como por ejemplo urea o púrpura de bromocresol o bien ácido 2,2'-azido-di- ( 3-etil-benztiazolin-6-sulfonico [ABTS] y H202, en el caso de de peroxidasa como la etiqueta de enzima. La cuantificación puede lograrse entonces midiendo el grado de generación de color, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro de espectro visible. Conjuntos de proteina son sistemas de ensayo de unión con ligando de fase sólida que utilizan proteínas inmovilizadas en superficies que incluyen vidrio, membranas, pozos de microtitulación, placas de espectrómetro de masa, y perlas u otras partículas. Los ensayos son altamente paralelos (multiplexados ) y frecuentemente miniaturizados (microensayos, chips de proteína) . Sus ventajas incluyen el hecho de ser rápidos y automatizables, capaces de alta sensibilidad, económicos en cuanto a reactivos, y ofreciendo una abundancia de datos para un solo experimento. El soporte bioinformático es importante; el manejo de datos requiere de un software sofisticado y análisis por comparación de datos. Sin embargo, el software puede ser adaptado a partir del software utilizado para conjuntos de DNA, así como la mayor parte de los sistemas de detección y hardware. Uno de los formatos principales es el conjunto de captura, en donde reactivos de unión con ligando, que son habitualmente anticuerpos pero pueden ser también alternativamente andamios de proteína, péptidos o haptámeros de ácido nucleico, se utilizan para detectar moléculas meta en mezclas tales como extractos tisulares o plasma. En diagnósticos, ensayos de captura pueden ser utilizados para lleva a cabo múltiples inmunoensayos en paralelo, tanto probando- varios analitos en sueros individuales por ejemplo como probando muchas muestras de suero simultáneamente. En proteómica, los conjuntos de captura son utilizados para cuantificar y comparar los niveles de proteínas en diferentes muestras en estado sano y enfermedad, es decir, se determina el perfil de expresión de proteína. Proteínas diferentes de enlazadores de ligandos específicos se utilizan en el formato de conjunto para tamizajes de interacciones funcionales in vitro como por ejemplo proteína-proteína, proteína-DNA, proteína-fármaco, receptor-ligando, enzima-sustrato, etc. Los reactivos de captura ellos mismos se seleccionan y tamizan contra muchas proteínas, lo que puede efectuarse también en un formato de conjunto de multiplexión contra múltiples proteínas metas. Para la construcción de conjuntos, fuentes de proteínas incluyen sistemas de expresión basadas en células para proteínas recombinantes, purificación a partir de fuentes naturales, producción in vitro por sistemas de traslado libres de células, y métodos sintéticos para péptidos. Muchos de esos métodos pueden ser automatizados para producción de alto rendimiento. Para conjuntos de captura y análisis de función de proteína, es importante que proteínas sean correctamente plegadas y funcionales; esto no es siempre el caso, por ejemplo, cuando proteínas recombinantes son extraídas de bacterias bajo condiciones de desnaturalización. Sin embargo, conjuntos de proteínas desnaturalizadas son útiles en el tamizaje de anticuerpos para reactividad cruzada, identificación de auto-anticuerpos y selección de proteínas de unión con ligando. Conjuntos de proteínas han sido diseñados como una miniaturización de métodos de inmunoensayos familiares tales como ELISA y dot blotting, frecuentemente utilizando lecturas fluorescentes, y facilitados por la robótica y sistemas de detección de alto rendimiento para permitir efectuar ensayos múltiples en paralelo. Soportes físicos comúnmente utilizados incluyen platinas de vidrio, silicio, micropozos, membranas de microcelulosa o PVDF, así como microperlas magnéticas y de otros tipos. Mientras que la microgota de proteínas suministrada en superficies planas son el formato más familiar, arquitecturas alternativas incluyen dispositivos de centrifugación - CD basados en desarrollos en microfluidos (Gyros, Monmouth Junction, NJ) y diseños de chip especializados, como por ejemplo microcanales sometidos a ingeniería en una placa (por ejemplo The Living Chip™, Biotrove, oburn, MA) y postes 3D pequeños en una superficie de silicio (Zyomix, Hayward CA) . Partículas en suspensión pueden también ser utilizadas como base de conjuntos, a condición que estén codificadas para identificación; sistemas que incluyen codificación de color para microperlas (Luminex, Austin, TX; Bio-Rad Laboratories) y nanocristales semiconductores (por ejemplo, QDots™, Quantum Dot, Hayward, CA) , y codificación de barras para perlas (UltraPlex™, SmartBead Technologies Ltd, Babraham, Cambridge, Reino Unido) y microvarillas de metales múltiples (por ejemplo, partículas Nanobarcodes™, Nanoplex Technologies, Mountain View, CA) . Perlas pueden también ensamblarse en conjuntos planos en chips semiconductores (LEAPS Technology, BioArray Solutions, Warren, NJ) . La inmovilización de proteínas incluye tanto el reactivo de acoplamiento como la naturaleza de la superficie sobre la cual se está acoplando. Una buena superficie de soporte de conjunto de proteína es químicamente estable antes y después de los procedimientos de acoplamiento, permite una buena morfología de puntos, presenta una unión no específica mínima, no contribuye a fondo en sistemas de detección, y es compatible con diferentes sistemas de detección. El método de inmovilización utilizado es reproducible , aplicable a proteínas de propiedades diferentes (tamaño, hidrofílica, hidrofóbica) , permite un alto rendimiento y automatización, y es compatible con la retención de actividad de proteína totalmente funcional. La orientación de la proteína unida a superficie es reconocida como un factor importante al presentarla al ligando un sustrato en un estado activo; para capturar conjuntos, los resultados de unión más eficientes se obtienen con reactivos de captura orientados, que requieren generalmente de etiquetado especifico para sitio de la proteina . Se utilizan tanto métodos covalentes como métodos no covalentes de inmovilización de proteina y estos métodos tienen numerosas ventajas e inconvenientes. La adsorción pasiva sobre superficies es un método sencillo pero permite poco control cuantitativo o de orientación; puede o no alterar las propiedades funcionales de la proteina, y la reproducibilidad y eficiencia son variables. Métodos covalentes de acoplamiento ofrecen un enlace estable, puede ser aplicado a una gama de proteínas y tienen una buena reproducibilidad; sin embargo, la orientación puede ser variable, la derivación química puede alterar la función de la proteína y requiere de una superficie interactiva estable. Métodos de captura biológica utilizando una etiqueta en la proteína ofrecen un enlace estable y unen la proteína específicamente y en orientación reproducible, pero el reactivo biológico debe primero ser inmovilizado adecuadamente y el conjunto puede requerir de un manejo especial y tener una estabilidad variable. Varias químicas de inmovilización y etiquetas han sido descritas para la fabricación de conjuntos de proteína. Sustratos para fijación covalente incluyen platinas de vidrio recubiertas con reactivos de silano que contienen amino o aldehido. En el sistema Versalinx™ (Prolinx, Bothell, A) se logra un acoplamiento covalente reversible mediante interacción entre la proteina derivada con ácido fenildiborónico y ácido salicilhidroámico inmovilizado en la superficie de soporte. Esto tiene también una unión de fondo baja y una fluorescencia intrínseca baja y permite que las proteínas inmovilizadas conserven su función. La unión no covalente de proteína no modificada ocurre con estructuras porosas tales como HydroGel™ ( PerkinElmer, Wellesley, MA) , con ase en un gel de poliacrilamida tridimensional; este sustrato es reportado como dando un fondo particularmente bajo en microconjuntos de vidrio, con una alta capacidad de retención de función de proteína. Métodos de acoplamiento biológicos altamente utilizados son a través de interacciones biotina/estreptadivina o hexahistidina/Ni, después de haber modificado apropiadamente la proteína. La biotina puede ser conjugada con una estructura de poli-lisina inmovilizada en una superficie como por ejemplo dióxido de titanio (Zyomyx) o pentóxido de tantalio (Zeptosens, Witterswil, Suiza) . Método de fabricación de conjuntos incluyen impresión por contacto robótico, inyección de tinta, formación de puntos piezoeléctricos y fotolitografía. Numerosos formadores de conjuntos comerciales están disponibles [por ejemplo, Packard Biosciences] así como equipos manuales [V & P Scientific] . Colonias bacterianas pueden ser reticuladas robóticamente en membranas PVDF para inducción de expresión de proteínas in situ. En el límite de tamaño de puntos y densidad se encuentran nanoconjuntos, con puntos en la escala espacial de nanómetro, permitiendo la realización de miles de reacciones en un solo chip de menos de 1 mm cuadrado. BioForce Laboratories han desarrollado nanoconjuntos con 1521 puntos de proteína en 85 mieras cuadradas, lo que es equivalente a 25 millones de puntos por centímetro cuadrado, en el límite de detección óptica; sus métodos de lectura son fluorescencia y microscopía de fuerza atómica (AFM) . Los métodos de etiquetado fluorescente y detección son ampliamente utilizados. Muchos instrumentos utilizados para lectura de microconjunto de DNA son aplicables a conjuntos de proteína. Para despliegue diferencial, conjuntos de captura (por ejemplo, anticuerpos) pueden ser sondeados con proteínas marcadas de manera fluorescente provenientes de dos estados celulares diferentes, en donde listados celulares son directamente conjugados con fluoróforos diferentes (por ejemplo, Cy-3, Cy-5) y mezclados, de tal manera que el color actué como lectura para cambios en cuanto a abundancia meta. La sensibilidad de lectura fluorescente puede ser amplificada de 10 a 100 veces por medio de amplificación de señal de tiramida (TSA) (PerkinElmer Lifesciences ) . Una tecnología de guía de onda plana (Zeptosens) permite la detección ultrasensible de fluorescencia con la ventaja adicional de la no intervención de procedimientos de lavado. Se puede lograr también una alta sensibilidad con perlas y partículas en suspensión, utilizando ficoeritrina como etiqueta (Luminex) o las propiedades de nanocristales semiconductores (Quantum Dot) . Numerosas lecturas alternativas novedosas han sido desarrolladas, especialmente en el ámbito de la biotecnología comercial. Incluyen adaptaciones de resonancia de plasmon superficial (HTS Biosystems, Intrinsic Bioprobes ,' Tempe, AZ) , amplificación de DNA de circulo rodante (Molecular Staging, New Haven CT) , espectrometría de masa (Intrinsic Bioprobes; Ciphergen, Fremont, CA) , dispersión de luz por resonancia (Genicon Sciences, San Diego, CA) y microscopía de fuerza atómica [BioForce Laboratories] . Los conjuntos de captura forman la base de chips de diagnóstico y conjuntos para perfiles de expresión. Emplean reactivos de captura de alta actividad tales como anticuerpos convencionales, dominios individuales, andamios sometidos a ingeniería, péptidos o aptámeros de ácido nucleico, para unir y detectar ligandos meta específicos con alto rendimiento. Conjuntos de anticuerpos tienen las propiedades requeridas de especificidad y fondo aceptable y algunos están disponibles comercialmente (BD Biosciences, San JOse, CA; Clontech, MOuntain View; CA; BioRad; Sigma, St . Louis, MO) . Anticuerpos para conjuntos de captura son elaborados ya sea por inmunización convencional (sueros policlonales e hibridomas) o bien como fragmentos recombinantes, habitualmente expresados en E. coli, después de selección a partir de bibliotecas de despliegues de ribosomas o fagos (Cambridge Antibody Technology, Cambridge, Reino Unido; Biolnvent, Lund, Suecia; Affitech, Walnut Creek, CA; Biosite, San Diego, CA) . Además de los anticuerpos convencionales, fragmentos Fab y scFv, dominios V simples provenientes de camélidos o equivalentes humanos manipulados (Domantis, Waltham, MA) pueden también ser útiles en conjuntos. El término "andamio" se refiere a dominios de enlace de ligando de proteínas que son manipulados en múltiples variantes capaces de unir diversas moléculas meta con propiedades de especificidad y afinidad de tipo anticuerpo. Las variantes pueden ser producidas en formato de biblioteca genética y seleccionadas contra blancos individuales por despliegue de fagos, bacterias o ribosomas. Tales andamios de unión con ligando o estructuras incluyen "Aficuerpos" basados en proteína A de Staph. aureus (Affibody, Bromma, Suecia) , "Trinectinas" basadas en fibronectinas (Phylos, Lexington, MA) y "Anticalinas" basadas en la estructura de la lipocalina (Pieris Proteolab, Freising-Weihenstephan, Alemania) . Pueden utilizarse en conjuntos de captura de manera similar a anticuerpos y pueden tener ventajas de robusteza y facilidad de producción.

Moléculas de captura no proteína, notablemente los aptámeros de ácido nucleico de una sola cadena que se unen a ligando de proteína con alta especificidad y afinidad, se utilizan también en conjuntos (Somalogic, Boulder, CO) . Aptámeros son seleccionados a partir de bibliotecas de oligonucleótidos por el procedimiento Selex™ y su interacción con proteína puede ser realzada mediante fijación covalente, a través de la incorporación de desoxiuridina brominada y reticulación activada por UV (fotoaptámeros) . La fotoreticulación con ligando reduce la reactividad cruzada de los aptámeros debido a los requisitos estéricos específicos. Los aptámeros tienen las ventajas de facilitar la producción por síntesis automatizada de oliglonucleótidos y la estabilidad y robusteza de DNA; en conjuntos de fotoaptámeros, tinciones de proteína fluorescente universales puede ser utilizadas para detectar la unión. Analitos de proteína que se unen a conjuntos de anticuerpo pueden ser detectados directamente o a través de un anticuerpo secundario en un ensayo de emparedado. El etiquetado directo es utilizado para comparación de muestras diferentes con colores diferentes. Cuando pares de anticuerpos dirigidos hacia el mismo ligando de proteína están disponibles, inmunoensayos emparedado ofrecen una alta especificidad y sensibilidad y por consiguiente son -el método de elección para proteínas de baja abundancia, por ejemplo citocinas; proporcionan también la posibilidad de detectar modificaciones de proteina. Métodos de detección libres de etiqueta, incluyendo espectrometría de masa, resonancia de plasmón superficial y microscopía de fuerza atómica, evitan la alteración del ligando. Lo que se requiere a partir de cualquier método es sensibilidad y especificidad óptimas, con fondo baja para proporcionar una alta proporción entre señal y ruido. Puesto que las concentraciones de analito abarcan un rango amplio, la sensibilidad debe ser adecuada apropiadamente; dilución en serie de la muestra o bien la utilización de anticuerpos de afinidades diferentes son soluciones para este problema. Proteínas de interés son frecuentemente las proteínas que se encuentran en concentraciones bajas en fluidos corporales y extractos, requiriendo de detección en el rango de pg o menos, tales como citocinas o los productos de expresión baja en células. Una alternativa a un conjunto de moléculas de captura es la utilización de una tecnología de "impresión molecular" en donde péptidos (por ejemplo, las regiones de extremo C de proteínas) se utilizan como templados para generar cavidades especificas para secuencias, estructuralmente complementarias en una matriz polimerizable; las cavidades pueden entonces capturar específicamente proteínas (desnaturalizadas) tienen la secuencia apropiada de aminoácidos primarios ( ProteinPrint™, Aspira Biosystems, Burlingame, CA) .

Otra metodología que puede ser utilizada para diagnóstico y la determinación del perfil de expresión es el conjunto ProteinChip® (Ciphergen, Fremont, CA) , en donde superficies cromatográficas de fase sólida se unen a proteína con características similares de carga o hidrofobicidad a partir de mezclas como por ejemplo extractos plasmáticos o tumorales, y se utiliza la espectrometría de masa SELDI-TOF para detectar las proteínas retenidas. Chips funcionales a gran escala han sido construidos mediante la inmovilización de grandes números de proteínas purificadas y han sido utilizados para ensayar una amplia gama de funciones bioquímicas, como por ejemplo hace interacciones de proteína con otras proteínas, interacciones fármaco-blanco, enzima-sustratos, etc. En general requieren de una biblioteca de expresión, clonada en E. coli, levadura o similar a partir de la cual las proteínas expresadas son entonces purificadas, por ejemplo, a través de un marcador His, e inmovilizadas. La transcripción/traducción de proteína libre celular es una alternativa viable para la síntesis de proteínas que no se expresan bien en sistemas bacterianos o bien en otros sistemas in vivo. Para detectar interacciones proteína/proteína, conjuntos de proteínas pueden ser alternativas in vitro al sistema de dos híbridos de levadura basado en células, y pueden ser útiles cuando este último sistema es deficiente, como por ejemplo en el caso de interacciones que involucran proteínas secretadas o proteínas con puentes disulfuro. Un análisis de alto rendimiento de actividades bioquímicas en conjuntos ha sido descrito para proteína quinazas de levadura y para varias funciones (interacciones proteína-proteína y proteína-lípido) del proteoma de levadura, en donde una gran proporción de la totalidad de los cuadros de lectura abierto de levadura fue expresada e inmovilizada en un microconjunto . Los "chips de proteoma" a gran escala prometen ser muy útiles en la identificación de interacciones funcionales, tamizaje de fármaco, etc. ( Proteometrix, Branford, CT) . Como despliegue bidimensional de elementos individuales, un conjunto de proteínas puede ser utilizado para tamizar bibliotecas de despliegue de fagos o ribosomas con el objeto de seleccionar socios de unión específicos, incluyendo anticuerpos, andamios sintéticos, péptidos y aptámeros . De esta manera, se puede efectuar un tamizaje de "biblioteca contra biblioteca". El tamizaje de candidatos a fármacos en bibliotecas químicas de combinación contra un conjunto de proteínas meta identificadas a partir de proyectos de genoma es otra aplicación del enfoque. Un ensayo de perlas multiplexadas , por ejemplo el ensayo de perlas Citométricas BD™, es una serie de partículas espectralmente discretas que pueden ser utilizadas para capturar y cuantificar analitos solubles. El analito es entonces medido por detección de una emisión basada en fluorescencia y análisis citométrico de flujo. Un ensayo de perlas multiplexadas genera datos que son comparables a los ensayos basados en ELISA, pero en forma "multiplexada" o simultanea. La concentración de valores desconocidos se calcula para el conjunto de perlas citométricas como en el caso de cualquier ensayo de formato de emparedado, es decir, a través del uso de estándares conocidos y graficando los valores desconocidos contra una curva estándar. Además, un ensayo de perlas multiplexadas permite la cuantificación de analitos solubles en muestras nunca previamente consideradas debido a limitaciones de volumen de muestras. Además de los datos cuantitativos, imágenes visuales potentes pueden ser generadas que revelan perfiles o firmas únicas que ofrecen al usuario información adicional inmediatamente. Los perfiles de MP/TIMP divulgadas aquí se basan en mediciones de MMPs o TIMP. Las cantidades pueden ser medidas a través de cualquier medio conocido por proporcionar una indicación aceptable de la magnitud de la presencia de cualquiera de estas en la muestra que se está analizando. Un ejemplo de un medio para medir se proporciona en los Ejemplos. El proceso de medición de una cantidad de un analito (por ejemplo MMP o TIMP) incluye la medición de una cantidad o de una cantidad no detectable del analito. Las técnicas y enfoques para medir MMP y TIMPs que forman la base de esta invención se basaron en inmunoensayos de alta sensibilidad. Varios de estos inmunoensayos fueron desarrollados por este laboratorio (por ejemplo medición de ensayo de TIMP-4). El enfoque de inmunoensayo que fue estandarizado para proporcionar las mediciones mostradas en la Tabla 4 fue efectuado por un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) . Sin embargo, otros métodos más sencillos y rápidos para medir los niveles sanguíneos de MMPs y TIMPs han sido efectuados por este laboratorio e incluyen el uso de un sistema de ensayo multiplexado . En este ejemplo, analitos múltiples en muestras limitadas en cuanto al volumen tales como muestras plasmáticas u otras muestras biológicas, pueden medirse utilizando un inmunoensayo emparedado de multiplexión basada en perla. Esta técnica emergente para análisis de multiplexión se basa en tecnología que combina sensibilidad de ELISA con detección citométrica de flujo, permitiendo la medición específica de hasta 100 analitos diferentes dentro de una sola muestra de menos de 50 µ?. Este enfoque permite la medición de múltiples MMPs y TIMPs en una pequeña muestra de sangre. Este tipo de enfoque es bien adecuado para las aplicaciones de monitoreo para diagnóstico, pronóstico, predicción y terapia que se describen aquí. Específicamente, para medir simultáneamente concentraciones de analito, las microperlas son incubadas con sangre (por ejemplo, muestra de sangre) , y se permite la formación de complejos con los analitos específicos de interés (por ejemplo MMPs) . Anticuerpos de detección (biotinilado) , específicos para un segundo epítopo en cada analito, son entonces agregados a la mezcla y se permite su unión con las microperlas que forman complejos con el analito. La mezcla es entonces incubada con una molécula reportera fluorescente (estreptavidina-ficoeritrina) y toda la muestra es pasada a través de un detector de citometría de flujo de dos láseres. Un láser detecta la fluorescencia precisa de la microperla que define el analito específico que se está examinando y el otro láser detecta la cantidad de fluorescencia de reportero que es directamente proporcional a la cantidad de analito unido. Este proceso ha sido aplicado a numerosas MMPs y otros analitos que tienen la influencia potencial sobre el proceso CHF y se muestran una la Figura 8 y en la Tabla 1. Es solamente un ejemplo de cómo analitos individuales o múltiples pueden ser medidos con una muestra de sangre muy pequeña. Otros ejemplos de mediciones que han sido efectuadas con relación a analitos MMP/TIMP incluyen radioinmunoensayo y ensayos inmur¡pblot. Estos enfoques se basan también en anticuerpos . Tabla 1: Rango de concentraciones de analitos utilizados para Calibración y estadísticas de regresión lineal para curvas estándares calculadas.

Analito Rango (pg/ml) R2 Valor P MMP-1 14.1-3433.33 0.96 0.0004 MP-2 75.5-18333.33 0.99 0.0001 MMP-3 13.0-3166.67 0.97 0.0002 MMP-7 96.0-23333.33 0.98 0.0001 P-8 83.7-20333.33 0.96 0.0004 MMP-9 54.9-13333.33 0.98 0.0001 MMP-12 12.8-31000.00 0.97 0.0003 MMP-13 72.7-17666.70 0.98 0.0001 TNF-alfa 1.95-2000.0 0.95 0.0002 IL-1 beta 1.95-2000.0 0.94 0.0002 IL-2 1.95-2000.0 0.98 0.0001 IL-6 1.95-2000.0 0.98 0.0001 IL-8 1.95-2000.0 0.91 0.0007 IL-10 1.95-2000.0 0.97 0.0001 G-CSF 1.95-2000.0 0.99 0.0001 INF-gamma 1.95-2000.0 0.99 0.0001 MCP-1 1.95-2000.0 0.96 0.0001 MIP-beta 1.95-2000.0 0.91 0.0008 7. Anticuerpos Anticuerpos específicos para MMPs y TIMPs son conocidos y comercialmente disponibles . Ejemplos de anticuerpos se proporcionan en la Tabla 2. Tabla 2: Anticuerpos específicos para MMP/TIMP Analito Catálogo # Vendedor IM52 Oncogene PC311 Oncogene MMP-1 IM35L Oncogene AB806 Chemicon AB19015 Chemicon PC342 Oncogene I 33L Oncogene MMP-2 MAB3308 Chemicon AB19015 Chemicon MAB13405 Chemicon AB809 Chemicon PC310 Oncogene AB810 Chemicon MMP-3 AB811 Chemicon I 36L Oncogene PC492 Oncogene MP-7 AB8118 Chemicon AB8117 Chemicon 3528-100 Bio Visión MMP-8 PC493 Oncogene IM38L Oncogene AB19047 Chemicon IM09 Oncogene MMP-9 PC309 Oncogene AB804 Chemicon MMP-11 PC467 Oncogene MMP-11 PC467 Oncogene AB19051 Chemicon MMP-12 RPI-MMP-12 TriplePointBiologics PC494 Oncogene AB8114 Chemicon PC542 Oncogene MMP-13 3533-100 BioVision AB19055 Chemicon AB815 Chemicon AB8102 Chemicon RDI-MMP14 Res. Diagnostics, Inc.

MMP-14 MAB3317 Chemicon AB8221 Chemicon AB8103 Chemicon AB850 Chemicon MMP-15 MAB3320 Chemicon AB855 Chemicon OPA1-08512 ABR AB8122 Chemicon TIMP-1 AB770 Chemicon AB8116. Chemicon PC500 Oncogene AB801 Chemicon RP2T2 Triple Point Biologics TIMP-2 IM11L Oncogene CL1T2 Cedar Lañe MAB3310 Chemicon AB8107 Chemicon CL2T3 Cedar Lañe TI P-3 IM43L Oncogene H-TIMP-3 Triple Point Biologics AB816 Chemicon TIMP-4 MAB974 R&D Systems Abl9087 Chemicon El término "anticuerpos" se utiliza aquí en un sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales . Además de moléculas de inmunoglobulina intactas, dentro del marco del término "anticuerpos" se incluyen también fragmentos o polímeros de estas moléculas de inmunoglobulina, y versiones humanas o humanizadas de moléculas de inmunoglobulina o fragmentos de ellas, en la medida en que se seleccionan por su capacidad de interactuar con MMPs o TIMPs. Los anticuerpos pueden ser probados para determinar su actividad deseada utilizando los ensayos in vitro descritos aquí, o bien por métodos análogos, después de lo cual sus actividades terapéuticas y/o profilácticas in vivo son probadas según métodos de prueba clínicos conocidos. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales dentro de la población son idénticos excepto con relación a posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en un pequeño sub-grupo de las moléculas de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales aquí incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en donde una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica homologa a secuencias correspondientes al anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o sub-clase particular de anticuerpos mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o sub-clase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, en la medida en que presentan la actividad antagonista deseada (véase, patente norteamericana No, 4,816,567 y orrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos monoclonales divulgados pueden ser elaborados utilizando cualquier procedimiento que produce anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales divulgados pueden prepararse utilizando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiad es típicamente inmunizado con un agente de inmunización con el objeto de provocar que los linfocitos produzcan o puedan producir anticuerpos que se unen específicamente al agente de inmunización. Los anticuerpos monoclonales pueden también ser elaborados por métodos DNA recombinantes , tales como los métodos descritos en la patente norteamericana No. 4,816,567 (Cabilly et al.). DNA que codifica los anticuerpos monoclonales divulgados puede ser fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino) . Bibliotecas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos activos pueden también ser generados y tamizados utilizando técnicas de despliegue de fago, por ejemplo de conformidad con lo descrito en la patente norteamericana No. 5,804,440 de Burton et al. y en la patente norteamericana No. 6,096,441 de Barbas et al. Métodos in vitro son también adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede lograrse empleando técnicas de rutina conocidas en la técnica. Por ejemplo, la digestión puede efectuarse utilizando papaina. Ejemplos de difusión con papaina se describen en el documento O 94/29348 publicado el 22 de diciembre de 1994 y en la patente norteamericana No. 4,342,566. La digestión con papaina de anticuerpos produce típicamente dos fragmentos de unión con antígeno idénticos que se conocen como fragmentos Fab, cada uno de los cuales tiene un sitio de unión con antígeno único y un fragmento Fe residual. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento que tiene dos sitios de combinación de antígenos y sigue siendo capaz de reticulación de antígeno. Los fragmentos, ya sea fijados sobre o de otras secuencia o no, pueden también incluir inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o residuos específicos de aminoácidos, a condición que la actividad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo no sea significativamente alterada o afectada en comparación con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo no modificado. Estas modificaciones pueden proporcionar ciertas propiedades adicionales, como por ejemplo remover/agregar aminoácidos capaces de enlace disulfuro, incrementar su biolongevidad, alterar sus características secretorias, etc. De cualquier manera, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, como por ejemplo unión específica con su antígeno correspondiente. Regiones funcionales o activas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueden ser identificadas por mutagénesis de una región especifica de la proteina, seguido por expresión y prueba del polipéptido expresado. Tales métodos son fácilmente aparentes a una persona con conocimientos en la materia y pueden incluir mutagénesis especifica para sitio del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. (Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992) . Como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" o bien el término "anticuerpos" puede también referirse a un anticuerpo humano y/o a un anticuerpo humanizado. Muchos anticuerpos no humanos (por ejemplo, los anticuerpos derivados de ratones, ratas o conejos) son naturalmente antigénicos en seres humanos y por consiguiente pueden provocar respuesta inmunes indeseables cuando se administran a seres humanos. Por consiguiente, el uso de anticuerpos humanos o humanizados en los métodos sirve para reducir la probabilidad que un anticuerpo administrado a un ser humano cause una respuesta inmune indeseable. 8. Valores de Referencia Se proporcionan perfiles de MMPs y/o TIMPs que son indicadores de la existencia de DHF o que predicen el desarrollo de DHF en un sujeto. Los perfiles indicadores de la existencia de DHF o que predicen el desarrollo de DHF en un sujeto pueden ser relativos a un valor normal. Un valor normal para un analito dado (MMP o TI P) puede ser un valor de referencia para un sujeto de edad correspondiente que es confirmado como no teniendo evidencia de enfermedad cardiovascular significativa. Por consiguiente, el valor normal puede ser un valor basado en población derivado de un número significativo de individuos sanos. Estos valores normales de referencia pueden ser obtenidos a partir de estudios basados en población. Existen grandes estudios basados en población como por ejemplo que han identificado niveles relativos de TIMP-1 (Framingham Heart Study, Circulation 2004; 109:2850-2856) en un grupo de referencia a aproximadamente 800 ng/mL lo que es consistente con los valores de control de referencia divulgados aqui. Alternativamente, el valor normal puede ser un valor considerado normal para un sujeto dado. Por ejemplo, mediciones de linea basal de los analitos relevantes pueden efectuarse para un individuo sano y utilizarse para comparación contra mediciones adquiridas posteriormente a partir de un individuo para identificar una enfermedad actual o la progresión hacia una enfermedad cardiaca hipertensiva. Una observación discreta, por ejemplo para M P-13, es cuando una variable continua como por ejemplo una concentración plasmática de un analito dado es convertida en una variable dicotómica. En este caso particular, un valor +/- seria asignado a MMP-13 cuando un valor superior a 10 ng/mL se consideraría un valor detectable o positivo y un valor inferior a 10 ng/mL sería un valor negativo. Por ejemplo, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva en un sujeto, que comprende la medición de los niveles de MMP y/o TIMP en un tejido o fluido corporal del sujeto y comparar tales niveles con valores de referencia. Por consiguiente, valores normales para MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2 y/o TIMP-4 son una indicación de la ausencia de hipertrofia ventricular izquierda asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-2 dentro de un rango normal son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-9 dentro del rango normal son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-13 dentro de un rango normal son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-1 dentro de un rango normal son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-2 dentro de un rango normal son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva . En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-4 dentro de un rango normal son una indicación de ausencia de LVH asociado con enfermedad cardiaca hipertensiva. , En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-2 superiores a aproximadamente 1000 ng/ml incluyendo superior a aproximadamente 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 y 1500 ng/ml, son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-9 inferiores a aproximadamente 20 ng/ml, incluyendo inferiores a aproximadamente 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 ng/ml, son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva . En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-13 detectables superiores a aproximadamente 5 ng/ml, incluyendo inferiores a aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 ng/ml, son una indicación de ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-1 inferiores a aproximadamente 1000 ng/ml, incluyendo mayores que aproximadamente 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20 ó 10 ng/ml, son una indicación de la ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva . En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-2 inferiores a aproximadamente 50 ng/ml, incluyendo superiores a aproximadamente 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ó 10 ng/ml, son una indicación de la ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva . En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-4 inferiores a 2 ng/ml, incluyendo superiores a aproximadamente 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.5 ó 0.1 ng/ml, son una indicación de la ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva. El método puede comprender además la medición de niveles plasmáticos de dos o más MMPs y/o TIMPs. Por ejemplo, el método puede comprender la medición de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho de MMP-2, MMP-9, M P-7, MMP-13, M P-8, TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-4. Por consiguiente, el método puede comprender la medición de MMP-2 y MMP-9 o MMP-2 y MMP-7, MMP-2 y MMP-13, MMP-2 y MMP-8, MMP-2 y TIMP-1, MMP-2 y TIMP-2, MMP-2 y TIMP-4, MMP-9 Y MMP-7, MMP-9 y MMP-13, MMP-9 y MMP-8, MMP-9 y TIMP-1, MMP-9 y TIMP-2, MMP-9 y TIMP-4, MMP-7 y MMP-13, MMP-7 y MMP-8, MMP-7 y TIMP-1, MMP-7 y TIMP-2, MMP-7 y TIMP-4, MMP-13 y MMP-8, MMP-13 y TIMP-1, MMP-13 y TIMP-13, MMP-13 y TIMP-4, MMP-8 y TIMP-1, MMP-8 y TIMP-2, MMP-8 y TIMP-4, MMP-1 y TIMP-2, TIMP-1 y TIMP-4, TIMP-2 y TIMP-4. Por consiguiente, el método puede comprender la medición de M P-2, M P-13 y TIMP-1; MMP-2, MMP-13 y TIMP-2; MMP-2, MMP-13 y TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, y TIMP-2; MMP-13, TIMP-1, y TIMP-4; MMP-13, TIMP-2, y TIMP-4. Por consiguiente, el método puede comprender la medición de MMP-2, MMP-13, TIMP-1, y TIMP-2; MMP-2, MMP-13, TIMP-1, y TIMP-4; MMP-2, MMP-13, TIMP-2, y TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4; MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4. Por consiguiente, el método puede comprender la medición de MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4. Otras combinaciones de estos analitos se contemplan y divulgan dentro del marco del presente. El método puede comprender además el cálculo de la proporción de una o varias de las MMPs o TIMPs con relación a otras MMPs o TIMPs. Por ejemplo, el método puede comprender el cálculo de la proporción entre MMP-9 y TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-4. Por ejemplo, en algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-1 superiores a aproximadamente 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 10 x 103, 11 x 103, 12 x 103, 13 x 103 ó 14 x 103, es una indicación de la ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva . En algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-2 superiores a aproximadamente 10 x 104, incluyendo superiores a aproximadamente 10 x 104, 2 x 104, 30 x 104 ó 40 x 104, en una indicación de la ausencia de LVH asociada con la enfermedad cardiaca hipertensiva.

En ciertos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos de MMP-9/TI P-4 mayores que aproximadamente 1, incluyendo mayores que aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, es una indicación de la ausencia de LVH asociada con enfermedad cardiaca hipertensiva . Los valores normales de referencia y los medidos en el tamizaje en pacientos hipertensos se muestran en la Tabla 3. En este caso, los valores de MMP-2 pueden ser reducidos en pacientes hipertensos con LVH sin cambio en valores de MMP-7. Sin embargo, una observación discreta para MMP-13 ocurrirá en donde esto no se detectará en pacientes hipertensos con LVH. Por consiguiente, un punto de corte inferior a 10 ng/mL se considerarla un criterio de diagnóstico para hipertensión e insuficiencia cardiaca. Niveles de TIMP-1 y TIMP-4 serán 50% mayores en pacientes hipertensos con LVH en comparación con los valores de control de referencia. La proporción MMP-9/TI P-4 será reducida en más del 50% en pacientes hipertensos con LVH en comparación con valores normales de referencia . Tabla 3: Datos MP y TIMP; Valores Normales de Referencia y Enfermedad Cardiaca Hipertensiva; Puntos de Corte Porcentuales para Diagnóstico Normal Hipertensión e % de Cambio Insuficiencia 1387±39 1205+44* T 20% o más MMP-2 (ng/mL) 2.5+0.2 Similar a normal NC MMP-7 (ng/mL) Detectable No Valor M P-13 (ng/mL) Detectable (<10) discreto 13±3 26. ±3* A 50% o más MMP-9 (ng/mL) 997±36 1291+70* A 50% o más TIMP-1 (ng/mL) 44±4 58±7 NC TIMP-2 (ng/mL) 1.9±0.1 3.8±0.1 A 50% o más TIMP-4 (ng/mL) 14+3 15±5 NC MP-9/TIMP-1 (xl0~3) 388+88 350+250 NC MP-9/TIMP-2 (xl0~3) 7.8±1.6 2.52±0.4* A 50% o más MMP-9/TIMP-4 NC = sin cambio en comparación con valor normal *p <0.05 vs . Normal 9. Tamizaje Rápido para LVH Se proporciona un resultado si/no rápido que puede ser obtenido mediante la prueba de los niveles para una P particular, MMP-13. Un punto establecido, que puede ser ajustado con base en estadísticas de población así como ajustado por edad, se utilizará como la lectura efectiva. A título de ejemplo, un nivel de MMP-13 inferior a un ajuste umbral de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ng/mL puede justificar una cartera de tamizaje plasmático más intenso así como estudios adicionales de formación de imágenes cardiovasculares. En otras palabras, esta prueba de detección rápida puede aplicarse a cualquier población importante, que identificaría entonces los sujetos que justificarían una prueba y seguimiento más cuidadosos. Hoy en día no se cuenta con pruebas de tamizaje rápido para identificar pacientes con LVH. Se proporciona un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, que comprende la medición de la cantidad de MMP-13 en un fluido corporal del sujeto, una cantidad inferior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ng/mL o indetectable indicando la presencia de LVH y siendo un factor de predicción de VHF. En combinación con mediciones anormales de otros analitos relevantes divulgados aquí, esta medición puede detectar DHF. Se puede efectuar una determinación de perfil de plasma en una entrevista de tamizaje médico o atención primaria. Esta medición de tamizaje puede efectuarse para una o varias de las MMPs y/o TIMPs. Si una o varias mediciones caen fuera de los valores de referencia, se pueden efectuar mediciones adicionales. Por ejemplo, se puede utilizar MMP-13 para un tamizaje inicial de tal manera que si MMP-13 no es detectable, entonces se puede efectuar un segundo ensayo en la muestra de plasma. De la misma manera, se puede utilizar MMP-9 y TIMP-1, TIMP-2 y/o TIMP-4 para un tamizaje inicial de tal manera que si la proporción entre MMP-9 y TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-4 es inferior a limites normales utilizando un umbral establecido, entonces se puede efectuar un segundo ensayo en la muestra de plasma. Esta segunda prueba puede ser para el perfil completo mostrado en la Tabla 3 o bien un sub-grupo del mismo. Si este perfil cumple con los criterios de enfermedad cardiaca hipertensiva, entonces el paciente puede ser evaluado a través de pruebas más agresivas que pueden incluir ecocardiografia, cateterización, formación de imágenes nucleares según lo apropiado. El paciente puede también ser evaluado para manejo médico más agresivo. 10. Diagnóstico Se proporciona también un método de diagnóstico que puede ser utilizado, por ejemplo, con un sujeto que presenta signos y síntomas de CHF, pero la causa subyacente de esta presentación es difícil de determinar. Esto ocurre con bastante frecuencia; cuando un paciente tiene CHF pero no se puede determinar fácilmente si existe LVH y DHF o no, y si contribuye a la exacerbación del proceso de CHF. El uso de un examen de sangre sencillo y rápido para "confirmar" o "descartar" la presencia de LVH y DHF, de conformidad con lo descrito en esta solicitud, ofrecería este enfoque de diagnóstico requerido. Específicamente, una muestra de sangre sería medida en cuanto a MMP-13, MMP-9, P-2, TI P-1 y/o TIMP-4. Los valores obtenidos serían comparados con los valores de referencia normales divulgados aquí. Si los valores difieren de los límites normales por los umbrales identificados aquí, entonces un paciente puede ser identificado como teniendo DHF. Por ejemplo, se proporciona un método para diagnosticar LVH en un sujeto que comprende la medición de los niveles de MMP y/o TIMP en un tejido o fluido corporal del sujeto y comparar estos niveles con valores de referencia. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-2 inferiores al valor normal son una indicación de enfermedad cardiaca hipertensiva . Por ejemplo, una cantidad de MMP-2 por lo menos aproximadamente 20% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-2 inferiores a aproximadamente 1000 ng/ml, incluyendo inferiores a aproximadamente 1000, 990, 980, 970, 960, 950, 940, 930. 920, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250 ó 100 ng/ml son una indicación de enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-9 superiores al valor normal son una indicación de enfermedad cardiaca hipertensiva. Por ejemplo, una cantidad de MMP-9 por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor medio normal puede ser una indicación de enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-9 superiores a aproximadamente 20 ng/ml incluyendo superiores a aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,. 90, 95 ó 100 ng/ml son una indicación de enfermedad cardiaca hipertensiva. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-13 no detectables son una indicación de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-13 inferiores a aproximadamente 10 ng/ml, incluyendo inferior a aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 ng/ml son una indicacións de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-1 superiores al valor normal son una indicación de enfermedad cardiaca hipertensiva. Por ejemplo, una cantidad de TIMP-1 por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. En algunos aspectos, valores plasmáticos de TIMP-1 superiores a aproximadamente 1000 ng/ml, incluyendo superiores a 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400 ó 1500 ng/ml son una indicación de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-2 superiores al valor normal son una indicación de LVH. Por ejemplo, una cantidad de TIMP-2 por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-2 superiores a aproximadamente 50 ng/ml, incluyendo superiores a aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 ng/ml, son una indicación de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-4 superiores al valor normal son una indicación de LVH. Por ejemplo, una cantidad de TIMP-4 por lo menos aproximadamente 50% superior al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-4 superiores a aproximadamente 2 ng/ml, incluyendo superiores a aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 ng/ml, son una indicación de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-7 dentro de un rango normal son una indicación de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-8 dentro de un rango normal son una indicación de LVH. El método puede comprender además la medición de niveles plasmáticos de dos o más MMPs y/o TIMPs. Por ejemplo, el método puede comprender la medición de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho de MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4. Por consiguiente, el método puede comprender la medición de MMP-2 Y MMP-9; MMP-2 Y MMP-13; MMP-13 y TIMP-1; MMP-13 y TIMP-2; MMP-13 y TIMP-4; MMP-2, MMP-13 y TIMP-1; MMP-2, MMP-13 y TIMP-2; MMP-2, MMP-13 y TIMP-4; o MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-4. Otras combinaciones de estos analitos se contemplan y se divulgan dentro del marco del presente. Por ejemplo, cuando se combina con un nivel reducido de MMP-13, TIMP-1 incrementada (por ejemplo, TIMP-1 > 1200 ng/mL) puede detectar DHF. Como ejemplo adicional, cuando se combina con un nivel reducido de MMP-13 y un nivel incrementado de TIMP-1, una cantidad de TIMP-4 superior a 3 ng/mL indica LVH y predice DHF. Por consiguiente, un método para detectar LVH y predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, comprende la medición en un fluido corporal del sujeto de los perfiles de P-13, TI P-1, y TIMP-4. Los perfiles en los cuales la cantidad de MMP-13 no es detectable, la cantidad de TIMP-1 es aproximadamente 50% superior al valor normal (o mayor que 1200 ng/mL) y la cantidad de TIMP-4 es por lo menos aproximadamente 50% mayor que el valor normal (o superior q 3 ng/mL) son predictivos de DHF. El método puede comprender además el cálculo de la proporción entre uno o varios de las MMPs o TIMPs y otras MMPs o TIMPs. Por ejemplo, el método puede comprender el cálculo de la proporción entre MMP-9 y TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-4. En algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos de MMP-9/TIMP-1 inferior al valor normal es una indicación de LVH. Por ejemplo, una proporción MMP-9/TIMP-1 por lo menos aproximadamente 50% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. Por ejemplo, en algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-1 inferior a aproximadamente 7 x 103, incluyendo menos que aproximadamente 7 x 103, 6 x 103, 5 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 1 x 103, es una indicación de LVH. En algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos de MMP-9/TIMP-2 inferior al valor normal , es una indicación de LVH. Por ejemplo, una proporción M P-9/TI P-2 por o menos aproximadamente 50% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. En algunos aspectos\ una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-2 inferior a aproximadamente 100 x 103, incluyendo inferior a aproximadamente 100 x 103, 90 x 103, 80 x 103,. 70 x 103, 60 x 103, 50 x 103, 40 x 103, 30 x 103, 20 x 103, o 10 x 103, es una indicación de LVH. En algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TI P-4 inferiores al valor normal es una indicación de LVH. Por ejemplo, una proporción MMP-9/TIMP-4 por lo menos aproximadamente 50% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. En algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-4 inferiores a aproximadamente 3, incluyendo inferiores a aproximadamente 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, o 0.01, es una indicación de LVH. En ciertos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-1 inferior a aproximadamente 5 x 103, una proporción de niveles plasmáticos MP-9/TIMP-2 inferior a aproximadamente 100 x 103 y una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-4 inferior a aproximadamente 1 es una indicación LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-2 inferiores a aproximadamente 1000 ng/ml, niveles plasmáticos de MMP-13 inferiores a aproximadamente 5 ng/ml, una proporción de niveles plasmáticos MP-9/TIMP-1 inferior a aproximadamente 5 x 103, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-2 inferior a aproximadamente 100 x 103 y una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-4 inferior a aproximadamente 1 es una indicación de LVH. 11. Pronóstico Se proporciona también un método para pronosticar una enfermedad cardiaca diastólica, que puede emplearse por ejemplo con un sujeto que ha sido seleccionado en tamizaje y después, a través de un perfil plasmático adicional, confirmado como teniendo LVH severa y en riesgo de desarrollar DHF. En este caso, el nivel de MMP-13 será cuantificado asi como niveles de TI P. Un nivel bajo/indetectable de MMP-13 (0-5 ng/mL) conjuntamente con niveles elevados de TIMP (como por ejemplo TIMP-1>1200 ng/mL, TIMP-2>700 mg/mL, y/o TIMP-4>3 ng/mL) en comparación con sujetos normales de referencia relacionados a niveles de TIMP proporcionará una comprensión critica del grado de fibrosis del miocardio y disfunción diastólica. Esto tiene valor de pronóstico en cuanto a la progresión de los síntomas y hospitalización. Específicamente, esos pacientes pueden ser tratados más agresivamente con medicaciones hipertensivas, y tienen estudios de formación de imágenes cardiovasculares más · regulares . Por ejemplo, se proporciona un método para identificar un sujeto en riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica (DHF), que comprende la medición de los niveles de P y/o TI P en un tejido o fluido corporal del sujeto y comparar estos niveles con valores de referencia. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de M P-2 inferiores al valor normal son una indicación de un riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. Por ejemplo, una cantidad de MMP-2 por lo menos aproximadamente 20% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de un riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-2 inferiores a aproximadamente 500 ng/ml, incluyendo inferiores a aproximadamente 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 250, ó 100 ng/ml, son una indicación de un riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica . En algunos aspectos, niveles plasmáticos indetectables de MMP-13 son una indicación de un riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-13 inferiores a aproximadamente 10 ng/ml, incluyendo inferiores a aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 ng/ml, son una indicación de riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-1 superiores al valor normal son indicadores de riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. Por ejemplo, una cantidad de TI P-1 por lo menos aproximadamente 50% superior al valor medio normal puede ser una indicación de un riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TI P-1 superiores a aproximadamente 1000 ng/ml, incluyendo superiores a aproximadamente 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, o 2000 ng/ml, son una indicación de riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-2 superiores al valor normal son una indicación de riesgo incrementado para desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. Por ejemplo, una cantidad de TIMP-2 por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor medio normal puede ser una indicación de riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-2 superiores a aproximadamente 50 ng/ml, incluyendo superiores a aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 ng/ml, son una indicación de riesgo incrementado para desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-4 superiores al valor normal son una indicación de riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. Por ejemplo, una cantidad de TIMP-4 por lo menos aproximadamente 50% mayor que el valor medio normal puede ser una indicación de riesgo incrementado para desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de TIMP-4 mayores que aproximadamente 2 ng/ml, incluyendo mayores qué aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 ng/ml, son una indicación de riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica . En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-9 dentro del rango normal son una indicación de riesgo incrementado para desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En ciertos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-7 dentro de rango normal son una indicación de riesgo incrementado para desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-8 dentro del rango normal son una indicación de riesgo incrementado para desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. El método puede comprender además la medición de niveles plasmáticos de dos o más MMPs y /o TIMPs. Por ejmplo, el método puede comprender la medición de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho de MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-13, MMP-8, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4. Por consiguiente el método puede comprender la medición de MMP-2 y MMP-9, MMP-2 y MMP-7, MMP-2 y MMP-13, MMP-2 y MMP-8, MMP-2 y TIMP-1, MMP- y TIMP-2, MMP-2 y TIMP-4, MMP-9 y MMP-7, MMP-9 y MMP-13, MMP-9 y MMP-8, MMP-9 y TIMP-1, MMP-9 y TIMP-2, MMP-9 y TIMP-4, MMP-7 y MMP-13, MMP-7 y MMP-8, MMP-7 y TIMP-1, MMP-7 y TIMP-2, MMP-7 y TIMP-4, MMP-13 y MMP-8, MMP-13 y TIMP-1, MMP-13 y TIMP-2, MMP-13 y TIMP-4, MMP-8 y TIMP-1, MMP-8 y TIMP-2, MMP-8 y TIMP-4, TIMP-1 y TIMP-2, TIMP-1 y TIMP-4, TIMP-2 y TIMP-4. Por consiguiente, el método puede comprender la medición de MMP-2, MMP-13 y TIMP-1; MMP-2, MMP-13 y TIMP-2; MMP-2, MMP-13 y TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, y TIMP-2; MMP-13, TIMP-1, y TIMP-4; MMP-13, TIMP-2, y TIMP-4. Asi, el método puede comprender la medición de MMP-2, MMP-13, TIMP-1, y TIMP-2; MMP-2, MMP-13, TIMP-1, y TIMP-4; MMP-2, MMP-13, TIMP-2, y TIMP-4; MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4; MMP-2, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4. Por consiguiente, el método puede comprender la medición de MMP-2, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4. Otras combinaciones de estos analitos se contemplan y divulgan aquí. Por ejemplo, se proporcionan un método para detectar insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición en un fluido corporal del sujeto de una cantidad de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 y MMP-9. Se proporciona también un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición en un fluido corporal del sujeto de una cantidad de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 y MMP-9. En estos métodos, los perfiles pueden mostrar una cantidad de MMP-13 que es indetectable (o inferior a 10 ng/mL) , una cantidad de TIMP-1 que es aproximadamente 50% mayor al valor normal o superior a 1200 ng/mL, una cantidad de TIMP-4 que es por lo menos aproximadamente 50% mayor que el valor normal o superior a 3 ng/mL y una cantidad de MMP-9 que es por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal y pueden detectar LVH y DHF. Se proporciona también un método para detectar insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición en un fluido corporal del sujeto de una cantidad de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 y MMP-2. Se proporciona también un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición en un fluido corporal del sujeto de una cantidad de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 y MMP-2 En estos métodos los perfiles pueden mostrar una cantidad de MMP-13 que es indetectable (o inferior a 10 ng/mL) , una cantidad de TIMP-1 que es aproximadamente 50% mayor al valor normal (o superior a 1200 ng/mL) , una cantidad de TIMP-4 que es por lo menos aproximadamente 50% mayor que un valor normal (o superior a o superior a 3 ng/mL) y la cantidad de MMP-2 es por lo menos aproximadamente 20% inferior al valor normal (o inferior a 1200 ng/mL) . El método puede comprender además el cálculo de la proporción entre una o varias de las MMPs o TI Ps y otras MMPs o T^MPs. Por ejemplo, el método puede comprender el cálculo de la proporción entre MMP-9 y TIMP-l, TIMP-2 o TIMP-4. En ciertos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-1 inferior al valor normal es una indicación de LVH. Por ejemplo, una proporción de MMP-9/TIMP-1 por lo menos aproximadamente 50% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de riesgo incrementado de desarrollar enfermedad cardiaca diastólica. Por ejemplo, en ciertos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-1 inferior a aproximadamente 7 x 103, incluyen de inferior a aproximadamente 7 x 103, 6 x 103, 5 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 1 x 103, 9 x 102, 8 x 102, 7 x 102, 6 x 102, 5 x 102, 4 x 103, 3 x 102, 2 x 102, o 1 x 102, es una indicación de riesgo incrementado de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica. En ciertos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-2 inferior al valor normal es una indicación de LVH. Por ejemplo, una proporción MMP-9/TIMP-2 por lo menos aproximadamente 50% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. En ciertos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-2 inferior a aproximadamente 100 x 103, incluyendo inferior a aproximadamente 100 x 103, 90 x 103, 80 x 103, 70 x 103, 60 x 103, 50 x 103, 40 x 103, 30 x 103, 20 x 103, 10 x 103, 9 x 103, 8 x 103, 7 x 6 x 103, 5 x 103, 4 x 103, 3 x 103, 2 x 103, o 1 x 103, es una indicación de LVH. En ciertos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-4 inferior al valor normal es una indicación de LVH. Por ejemplo, una proporción M P-9/TIMP-4 por lo menos aproximadamente 100% inferior al valor medio normal puede ser una indicación de LVH. En algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-4 inferior a aproximadamente 1 incluyendo inferior a aproximadamente 1, 0.09, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.15, 0.10, 0.05, o 0.01, es una indicación de LVH. Por consiguiente, se proporciona un método para detectar o predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la detección de una reducción de la proporción entre M P-9 y TI P-4 en un fluido corporal de un sujeto en comparación con la proporción normal. El método incluye la medición de una reducción de la proporción de por lo menos aproximadamente 50% en comparación con la proporción normal . En algunos aspectos, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-1 inferior a aproximadamente 5 x 103, una proporción a niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-2 inferior a aproximadamente 100 x 103, y una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-4 inferior a aproximadamente 1 es una indicación de LVH. En algunos aspectos, niveles plasmáticos de MMP-2 inferiores a aproximadamente 1000 ng/ml, niveles plasmáticos de MMP-13 inferiores a aproximadamente 5 ng/ml, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-1 inferior a aproximadamente 5 x 103, una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TIMP-2 inferior a aproximadamente 100 x 103 y una proporción de niveles plasmáticos MMP-9/TI P-4 inferior a aproximadamente 1 es una indicación de LVH. 12. Guia para intervenciones terapéuticas Con relación al tratamiento, niveles bajos de MMP-13 y niveles altos de TIMP podían ser monitoreados como indicador de eficacia farmacológica. Existen varios escenarios clínicos relevantes para los cuales esto podría ser altamente aplicable. Por ejemplo, mientras que un paciente hipertenso puede tener una presión sanguínea dentro de "límites normales", MMP-13 permanece suprimida y los niveles de TIMP son incrementados. La titulación ascendente de ciertas medicaciones contra hipertensión podría entonces utilizarse para "normalizar" estos marcadores biológicos de fibrosis del miocardio e insuficiencia cardiaca diastólica. El objetivo de este enfoque sería medir en serie valores sanguíneos de las MMPs y TIMPs que se muestran en la Tabla 3, e incrementar la medicación con el objeto.de llevar estos perfiles dentro del rango de referencia normal. En pacientes hipertensos que han sido identificados por tener una masa cardiaca (tamaño) incrementada debido a presión sanguínea elevada, perfiles de MMP/TIMP pueden ser utilizados para dar seguimiento al carácter adecuado del tratamiento. Los perfiles específicos identificados divulgados aquí podrían ser monitoreados y se podría determinar la eficacia del tratamiento conforme estos perfiles de MMP/TIMP se desplazan hacia el rango normal. Los perfiles de MMP/TIMP se basan en mediciones de MMPs o TIMPs individuales. Estás cantidades pueden medirse a través de cualquier medio conocido por proporcionar una indicación aceptable de la magnitud de la presencia de estás en la muestra analizada. Un ejemplo de un medio para medir se ofrece en los Ejemplos. El proceso de medición de una cantidad de un analito (por ejemplo, MMP o TIMP) incluye la medición de la ausencia de cantidad o de una cantidad indetectable del analito. Las técnicas y enfoques para medir MMP y TIMPs que formaron la base de este método se basaron en inmunoensayos de alta sensibilidad. Varios de estos inmunoensayos fueron desarrollados por este laboratorio (por ejemplo, mediciones de ensayo TIMP-4). El enfoque de inmunoensayo que fue estandarizado para proporcionar las mediciones mostradas en la Tabla 1 fue efectuado por un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) . Sin embargo, otros métodos más sensibles y rápidos para medir los niveles sanguíneos de MMPs y TIMPs han sido efectuados por este laboratorio e incluyen el uso de un sistema de ensayo multiplex. En este ejemplo, múltiples analitos en muestras de volumen limitado, como por ejemplo plasma u otras muestras biológicas, pueden medirse utilizando un inmunoensayo de emparedado multiplex basado en perlas. Está técnica emergente para análisis multiplex se basa en tecnología que combina la sensibilidad de ELISA con detección citométrica de flujo permitiendo la medición especifica de hasta 100 analitos diferentes dentro de una sola muestra de menos de 50 µ?. Este enfoque permitirá la medición de múltiples MMPs y TIMPs en una muestra de sangre pequeña. Este tipo de enfoque puede ser utilizado para las aplicaciones de diagnóstico, pronostico, predicción y monitoreo terapéutico que se describen aquí. Específicamente, para medir simultáneamente concentraciones de analitos, las microperlas son incubadas con muestra (por ejemplo, muestra de sangre) y se permite la formación de complejos con los analitos de interés específicos (por ejemplo MMPs) . Anticuerpos de detección (biotinilados) específicos para un segundo epítopo en cada analito, y se agregan entonces a la mezcla y se permite su unión a las microperlas que forman complejos con el analito. La mezcla es entonces incubada con una molécula reportera fluorescente (estreptavidina-ficoeritrina) y toda la muestra es pasada a través de un detector citométrico de flujo de dos láseres. Un láser detecta la fluorescencia precisa de la microperla que define el analito específico que se está examinando, y el otro láser detecta la cantidad de fluorescencia de reportero que es directamente proporcionada a la cantidad de analito unido. Este proceso ha sido aplicado a numerosas MMPs y otros analitos que tienen una influencia potencial sobre el proceso de CHF y se muestran en la Figura 16 y Tablal. Esto es solamente un ejemplo de cómo analitos simples o múltiples pueden medirse con una cantidad muy pequeña de muestra de sangre. Otros ejemplos de mediciones que han sido efectuadas por este laboratorio con relación a analitos MMP/TIMP incluyen radioinmunoensayo y ensayos inmunoblot. Estos enfoques se basan también en anticuerpos. 13. Combinación Los métodos divulgados aqui pueden comprender además la detección de otros marcadores de insuficiencia cardiaca. Por ejemplo, los métodos divulgados aqui pueden comprender además la medición de niveles de NT-proBNP en un tejido o fluido corporal del sujeto y la comparación de estos niveles con valores de referencia. Los métodos divulgados aqui pueden comprender además la medición de niveles de Troponina-I en un tejido o fluido corporal del sujeto y la comparación de estos niveles con valores de referencia. 14. Tiempo de las mediciones Como se describirá abajo y se presentará en ejemplos adicionales para tamizaje y monitoreo terapéutico, el tiempo de las mediciones será especifico para el contexto. En el caso del tamizaje, esto puede efectuarse en cualquier momento que un sujeto este sometido a un examen medico. Ejemplos pueden incluir exámenes físicos anuales, ferias de la salud y tamizaje a través de instalaciones residenciales. Por consiguiente, el método de diagnóstico divulgado puede ser utilizado para diagnosticar un sujeto que presenta signos y síntomas de CHF, pero cuya causa subyacente es difícil de determinar . Existen por o menos tres puntos de tiempo iniciales para determinar el perfil de MMP/TIMP para los métodos divulgados aquí. Mediciones iniciales pueden tomarse en un paciente que se presenta a una visita de rutina en una clínica con historia de hipertensión establecida. Mediciones iniciales pueden tomarse en una feria de la salud que llevaría a una visita a una clínica. Mediciones iniciales pueden tomarse en un paciente que se presenta con síntomas debidos a insuficiencia cardiaca hipertensiva . En las Figuras 9a-C se muestra el esquema de muestreo y enfoque de diagnóstico para cada uno de estos escenarios, para cada de uno de estos casos. Por consiguiente, el método de pronóstico divulgado puede ser utilizado para identificar si un sujeto que presenta presión sanguínea elevada (hipertensión) tiene LVH o está en riesgo de desarrollar DHF. El método divulgado de pronóstico puede también ser utilizado para identificar si un sujeto que presenta signos y síntomas de CHF tiene LVH y está en riesgo de desarrollar insuficiencia cardiaca diastólica (DHF) . Por ejemplo, el método puede ser utilizado con un paciente que se presenta al médico con quejas consistentes con CHF. El médico puede entonces aplicar los exámenes sanguíneos con el objeto de determinar si un perfil de MMP/TIMP consistente con LVH y DHF está presente. Esto guiaría al médico en exámenes de diagnósticos adicionales y planes de tratamiento. Otro ejemplo del tiempo de muestreo de sangre sería cuando un paciente ha sido identificado como teniendo LVH establecida, y después el monitoreo en serie de perfiles de MMP/TIMP podría emplearse como herramientas de predicción de la progresión de DHF. Estas pruebas podían ser aplicadas solamente una vez como herramienta de tamizaje, o bien se pueden aplicar múltiples veces y secuencialmente en cualquier sujeto dado. C . Kits Se divulgan aquí kits que son elaborados para reactivos que pueden utilizarse en la práctica de los métodos divulgados aquí. Los kits pueden incluir cualquier reactivo o combinación de reactivos conectados aquí o que pueden entenderse como requeridos por benéficos en la práctica de los métodos divulgados. Por ejemplo, se divulga un kit para evaluar el riesgo de un sujeto de desarrollar DHF, cuyos componentes incluyen componentes descritos en la sección previa. Por ejemplo, el componente de kit MP/TIMP podría incluir los reactivos necesarios para formar complejos con la MMP y/o TIMP de interés relevante (véase Tabla 3 para lista de Ps y TIMPs relevantes) con un reactivo de detección. En el ejemplo de un enfoque de inmunoensayo, un anticuerpo etiquetado de manera fluorescente contra una MMP o TIMP específica podría incubarse con la muestra de sangre y después de un lavado y de un paso de depuración de enlace no específico, se podría calcular la cantidad de anticuerpo unido a la MMP o TIMP de interés mediante la medición del grado relativo de fluorescencia. Esto puede ser un kit muy sencillo que podría utilizarse para tamizaje, o un sistema más complejo en donde múltiples MMPs/TIMPs son medidas a partir de una muestra única. Una justificación de un enfoque graduado de medición de una MMP o TIMP de interés para medir múltiples MMP/TIMPs simultáneamente ha sido descrita en una sección previa. Para un ensayo de tamizaje (por ejemplo MMP-13), la muestra de sangre pequeña podría ser procesada en plasma (centrifugación) y el plasma podría ser mezclado con anticuerpo enfocado por MMP-13. La mezcla podría ser centrifugada otra vez y el anticuerpo específicamente unido a MMP-13 podría ser leído por un sistema de fluorimetría . Este equipo y sistema de medición podrían diseñarse fácilmente para caber en un pequeño maletín o en un sistema de escritorio. La lectura del sistema indicarían entonces si MMP-13 se encuentra por debajo o por enzima de una medición umbral especifica (de conformidad con lo definido en la sección previa) . D. Ejemplos 1. Ejemplo 1 : Metaloproteinasas de Matriz/Inhibidores Tisulares de Metaloproteinasa : Relación entre el Cambio en Determinantes Proteoliticos de Composición de Matriz y Manifestaciones Estructurales, Funcionales y Clínica de Enfermedad Cardiaca Hipertensiva Resumen de Métodos y Resultados: Se obtuvieron MMP-2,-9,-13 y TIMP-1,-2 plasmáticas y ecocardiografia Doppler en 103 sujetos divididos en 4 grupos: a) sujetos de referencia (CTL) sin evidencia de enfermedad cardiovascular, b) hipertensión (HTN) , presión sanguínea controlada, y ausencia de hipertrofia LV, c) hipertensión, presión sanguínea controlada, con hipertrofia LV (HTN&LVH) , pero sin CHF, d) hipertensión, presión sanguínea controlada, LVH, y CHF (HTN&LVH&CHF) . En comparación con CTL, pacientes con HTN no presentaban cambios significativos en ninguna de P o TIMP. Pacientes con HTN&LVH presentaban niveles reducidos de MMP-2 y MMP-13 y niveles incrementados de MMP-9. Solamente pacienets con HTN&LVH&CHF presentaban niveles incrementados de TIMP-1. TI P-1 >1200 ng/ml fue un predictor de CHF. Conclusión: Pacientes con hipertensión pero estructura y función LV normales tenían perfiles MMP/TIMP normales.

Cambios en perfiles de MMP que favorecen una degradación reducida de ECN fueron asociados con hipertrofia LV y disfunción diastólica. TIMP-1 incrementada predijo la presencia de CHF. Estos datos indican que cambios en el equilibrio MMP/TIMP desempeñan una función importante en las manifestaciones estructurales, funcionales y clínicas de enfermedad cardiaca hipertensiva . Métodos Sujetos: Dos grupos de sujetos fueron reclutados en este estudio: controles de referencia y pacientes LVH. Controles de referencia fueron identificados a partir de ferias de la salud patrocinadas a nivel local y voluntarios del personal del Medical University of South Carolina. Entre los controles de referencia tamizados, 35% fueron reclutados, 50% presentaban uno de los criterios de exclusión listados abajo y 15% rechazaron participar. Pacientes con LVH fueron identificados a partir de estudios ecocardiográficos . Entre los ecocardiogramas de pacientes tamizados, 10% fueron reclutados, 75% presentaron uno de los criterios de exclusión listados abajo y 15% rechazaron participar. Se observaron algunos criterios de exclusión comunes a ambos grupos: 1) Historia de infarto del miocardio, 2) anormalidad en el movimiento de pared regional, 3) cirugía de revascularización coronaria, 4) amiloidosis, sarocoidosis, VIH, cardiomiopatía obstructora hipertrófica, enfermedad cardiaca valvular, 5) fracción de eyección <50%, 6) malignidad, 7) disfunción renal o hepática significativa, 8) enfermedad reumatológica, 9) presión sanguinea >140/90 mmHg. Ciento tres sujetos fueron reclutados en este estudio: 53 sujetos de control de referencia y 50 sujetos con evidencia de LVH (espesor de pared de LV de >1.2 cm y/o índice de masa LV = 125 g/m2 (Tabla 4) . Los sujetos de control de referencia fueron subdivididos en dos grupos con base en la presencia o ausencia de hipertensión; 39 sujetos de control (conocidos como "Control de referencia sin hipertensión") , no tenían historia de hipertensión, no tenían evidencia de enfermedad cardiovascular (CV) , ni síntomas ni evidencia física de enfermedad cardiovascular, ni medicación cardiovascular, y todas las mediciones ecocardiográficas estaban dentro del rango normal (Tabla 5) ; y 14 pacientes (se conocen como "Control de referencia con hipertensión") tenían una historia de hipertensión arterial, presión sanguínea controlada (tratada farmacológicamente para cumplir con los criterios JNC 7, es decir, <140/90 mmHg), ausencia de hipertrofia ventricular izquierda (Chobanian AV, et al. 2003) y, todas las mediciones ecocardiográficas estaban dentro del rango normal (Tabla 5) . Tabla 4: Características Demográficas, Estructura/Función Ventricular Izquierda y Datos MMP/TIMP Control de Referencia Número 53 50 Género (hombre/mujer) 20/33 24/26 Edad (años) 59±1 60±2 Presión sanguínea sistólica (mmHg) 127+2 137+3* Presión sanguínea diastolica 75±1 76±2 (mmHg) Volumen diastólico final (ml/m2) 51±2 . 52±2 Fracción de eyección (%) 66±1 72+2* Masa LV (g/m2) 99±3 162+6* Proporción volumen/masa (ml/mg) 0.54+0. 02 0.32±0. 01* Proporción EA/mitral 0.95+0. 04 0.91+0. 05 IVRT (mseg) 83+2 91±3* Tiempo de desaceleración de onda E 208±8 234±10* (mseg) E' Doppler tisular (cm/seg) 10.1+0. 4 7.410.4 * PCWP (mmHg) 10±1 16±1* MMP-2 (ng/mL) 1387139 1205±44 MMP-9 (ng/mL) 13±3 26±3* TIMP-1 (ng/mL) 997±36 1291170 * TIMP-2 (ng/mL) 44±4 58±7 Abreviaturas: Los datos son medias + SEM, LV = Ventricular izquierda, LVH = paciente con hipertrofia ventricular izquierda hipertensiva, Control de referencia = sujetos sin evidencia de enfermedad cardiovascular, IVRT = tiempo de relajación isovolumétrica, PCWP = presión de cuña capilar pulmonar, MMP = metaloproteinasa de matriz, TIMP = inhibidor tisular de MMP, * = p<0.05 en comparación con control de referencia . Tabla 5: Controles de Referencia con y sin Hipertensión, LVH con y sin CHF Control de Control de LVH sin CHF LVH con CHF referencia referencia sin con hipertensión hipertensión Número 39 14 23 26 Presión sanguínea sistólica (mmHg) 126±3 131+4 138+3* 133+4 Presión sanguínea diastólica (mmHg) 74+2 77+2 8212* 72+2? Volumen diastólico final 97±3 9415 98+6 10415 (mi) Fracción de eyección (%) 65±1 66+1 70+2* 7312* Masa LV (g/m2) 94±5 101+3 16017*# 164+7*# Proporción E/A Mitral 0.98±0.5 0.85+0.05 0.801.09* 0.9710.07? E' Doppler tisular (cm/seg) 10.0±0.4 9.810.5 8.410.4# 7.210.5*#? PCWP (mmHg) 10+1 11+1 13+2 17±2*#? PCWP/EDV (mmHg/ml) 0.09±0.01 0.11+0.01 0.1210.01 0.1710.01*#? Ea (mmHg/ml) 1.50±0.05 1.6110.09 1.6710.10* 1.4510.11? MMP-2 (ng/ml) 1383144 1399+84 1119148*# 1286+73 MMP-9 (ng/ml) 13±4 1415 2713*# 24+*# TIMP-1 (ng/ml) 1000142 988+76 1092177 1364186*#? TIMP-2 (ng/ml) 42±4 48±7 58111 59±9 Abreviaturas: Datos son media + SEM, LV = Ventricular izquierda, PCWP = presión de cuña capilar pulmonar, EDV = volumen diastólico final, Ea = elastasa arterial efectiva, MP = metaloproteinasa de matriz, TIMP = inhibidor tisular de MMP, LVH = hipertrofia ventricular izquierda, CHF = insuficiencia cardiaca crónica. Diferencias significativas entre estos 4 grupos fueron analizadas utilizando ANOVA y prueba de comparación múltiples de Tukey, * = p<0.05 vs Control de referencia sin hipertensión, # = p<0.05 vs Control de referencia con hipertensión, ? = p<0.05 vs LVH sin CHF. Pacientes con LVH fueron subdivididos en dos grupos con base en presencia o ausencia de CHF. 23 pacientes con hipertensión, presión sanguínea controlada, con LVY, pero sin CHF fueron conocidos como "LVH sin CHF" (Tabla 5) . El segundo sub-grupo consistió de 26 pacientes con hipertensión, presión sanguínea controlada, LVH, y CHF, y se conoció como "LVH con CHF". Todos estos pacientes presentaban evidencia de CHF definida de conformidad con los criterios de Framingham (Levy D, et al. 1996), evidencia de relajación anormal (E' reducido) , rigidez incrementada (PCWP incrementada y proporción PCWP/EDV incrementada) , una distancia de caminata de 6 minutos notablemente reducida (298 + 26 metros [979 ± 86 pies] en el grupo de LVH con CHF en comparación con 561 ± 18 metros [1839 ± 60 pies], p<0.05 en el grupo LVH sin CHF) , EF =50%, y por consiguiente, tenían insuficiencia cardiaca diastólica . Las medicaciones utilizadas para tratar la hipertensión fueron seleccionadas y monitoreadas por el médico primario del paciente y no por los investigadores. Incluyeron diuréticos, antagonistas de renina-angiotensina-aldosterona (inhibidores de enzima convertidora de angiotensina, bloqueadores de receptor de angiotensina II, y bloqueadores de aldosterona) , vasodiladores directos (nitratos, hidralazina) , bloqueadores alfa adrenérgicos , bloqueadores del sistema nervioso central, aspirina, bloqueadores de receptores beta adrenérgicos, y bloqueadores de canales del calcio. La duración media del tratamiento antihipertensivo fue de 6.4 ± 1.5 años. Métodos Ecocardiográfieos: Se efectuaron ecocardiogramas utilizando un sistema Sonos 5500 con un transductor S-4 MHz. Mediciones fueron efectuadas utilizando los criterios de la American Society de Echocardiography (Sahn DJ, et al. 1978: Schiller NB, et al. 1989). Se calcularon volúmenes LV y atriales izquierdos utilizando el método de discos (Schiller NB, et al. 19). Se calculó la masa LV utilizando la fórmula de Reichek y Devereux (Devereux RB, et al. 1986). Mediciones Doppler de velocidad de onda de influjo vitral E y A, la proporción E / A, el tiempo de desaceleración de onda E, y el tiempo de relajación isovolúmico (IVRT) se realizaron. Se efectuaron medición Doppler tisular (anillo vitral lateral) de velocidad de onda E' y A' mitral. Se calculó la presión de cuña capilar pulmonar (PCWP) utilizando la fórmula: 2 + 1/3 E/E' (Naguesh SF, et al. 1998) . Se calculó la elastancia arterial efectiva (Ea) empleando la fórmula: presión sistólica final/volumen de latido. Mediciones Plasmáticas MMP/TIMP: Se examinaron gelatinasas (MMP-2 y MMP-9) , colagenasa (MMP-13) ; e inhibidores tisulares de Ps (TIMP-1 y TIMP-2) utilizando kits de ensayo inmunosorbente enlazado a enzima de dos sitios (ELISA) (Amersham Pharmacia Biotech, Buckimghamshire (Reino Unido) . Se agregaron plasma y los estándares de MMP respectivos acuosos pre-cubiertos que contenían el anticuerpo para MMP o TIMP de interés y se lavaron. La reacción resultante fue leída a una longitud de onda de 450 nm (Labsystems Multiskan MCC/340, Helsinki, Finlandia) . Puesto que se encontró MMP-13 en niveles muy bajos en el plasma, los resultados de MMP-13 fueron divididos en detectables y no detectables. Análisis Estadístico: Se midieron MMP y TIMPs cada 2 horas durante un período de 6 horas con el objeto de calcular un coeficiente de variación para mediciones de MMP/TIMP entre sujetos y dentro de sujetos individuales en un subgrupo de sujetos de control de referencia (n = 20) utilizando un efecto aleatorio de un sentido ANOVA. Después el coeficiente fue calculado como la raíz cuadrada del error cuadrático medio de la persona multiplicada por 100. El coeficiente de variación intrapaciente para MMP-2 = 11.2 ± 1.1%, TIMP-1 = 8.5 ± 2.2% y TIMP-2 = 14.3 ± 1.7%. Un coeficiente de variación intra-ensayo que cuantifica la variación en la técnica de ensayo misma fue inferior a 6% para la totalidad de MMP y TIMPs. Inicialmente, se efectuaron comparaciones entre controles de referencia vs sujetos con LVH utilizando una prueba t de Student de 2 colas. Subsiguientemente, comparación entre todos los 4 grupos (control de referencia con versus sin hipotensión versus LVH con versus sin CHF) fueron analizadas utilizando ANOVA y pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. Un valor p de <0.05 fue considerado significativo. Se utilizó una regresión lineal simple para examinar la relación entre los niveles de MMP y TIMP y mediciones de estructura y función de LV. Se utilizaron curvas de operador-receptor y chi cuadrado de Mantel Hanzel para evaluar la asociación entre los niveles de MMP-13 y TIMP-1 y la presencia de LVH y CHF. Los efectos potenciales de las medicaciones sobre los datos de estructura, función o plasmáticos fueron examinados primero por un análisis de regresión de una variable y después por medio de un análisis de regresión de variables múltiples. La medición de la estructura, función, MMP o TIMP fue la variable dependente con la medicación ingresada como variable ficticia. Se examinó un solo fármaco, y después se examinaron fármacos en combinación. El protocolo de investigación utilizando en este estudio fue revisado y aprobado por el consejo de revisión institucional en la Medical University of South Carolina. Consentimiento informado escrito fue obtenido de todos los participantes. Los autores tuvieron acceso completo a los datos y asumieron la responsabilidad de su integridad. Todos los autores hablan leído y estaban de acuerdo con el manuscrito redactado. Resultados Control de referencia versus LVH Datos de Estructura/Función: Los sujetos de control de referencia tenían una edad similar y una distribución similar entre géneros en comparación con los sujetos con LVH (Tablas 3 y 4) . En comparación con el control de referencia, LVH presentaba una presión sanguínea sistólica más elevada, un remodelado concéntrico significativo de conformidad con lo evidenciado por un índice de masa LV 60% más elevado, sin diferencia en cuanto a volumen diastólico final, y una proporción entre volumen diastólico final LV versus masa 40% inferior. En comparación con un control de referencia, LVH presentó anormalidades significativas en índices de relajación diastólica LV y rigidez diastólica LV: IVRT incrementado, tiempo de desaceleración de onda E incrementado, E' reducido, presión de cuña capilar pulmonar incrementada, y PCWP incrementada versus proporción de volumen diastólico final LV (0.16 ± 0.01 mmHg/mL en LVH) en comparación con control de referencia (0.09 ± 0.01 mmHg/mL, p<0.05), lo que sugiere que hubo un incremento de la rigidez de operación diastólica final instantánea LV. Perfiles plasmáticos de M P y TIMP: En comparación con control de referencia, MMP-2 fue reducida y M P-9 fue incrementada en LVH. Diferencias significativas fueron encontradas en detectabilidad de MMP-13 (Figura 1) . Cuarenta y siete por ciento de los sujetos de control de referencia presentaban un nivel detectable de MMP-13, mientras que MMP-13 fue detectable en solamente el 15% de lo sujetos con LVH (?2 = 17.89, p<0.001, razón de posibilidades = 0.24). El nivel plasmático de TIMP-1 fue significativamente incrementado en LVH en comparación con control de referencia. La TIMP-2 y las proporciones MMP-9/TIMP-1 y MMP-2/TIMP-2 no fueron diferentes entre control de referencia y LVH. Control de referencia sin hipertensión versus control de referencia con hipertensión Datos de Estructura/Función: Sujetos de control de referencia sin hipertensión sirvieron como el grupo de control de referencia con correspondencia de edad y género para comparación con los grupos de control de referencia con hipertensión, LVH sin CHF y LVH con CHF. No se observaron diferencias significativas en ningún parámetro demográfico o ninguna medición ecocardiográfica de estructura o función LV entre controles de referencia sin hipertensión versus control de referencia con hipertensión (Tablas 3 y 4). El volumen máximo atrial izquierdo (LA V) y la fracción de vaciado (LAEF) fueron similares en control de referencia sin hipertensión (LAMV = 40 + 2 mi, LAEF = 42 ± 3%) en comparación con control de referencia con hipertensión (LAMV = 42 ± 4 mi, LAEF = 43 ± 2%) . Perfiles plasmáticos de MMP y TIMP: No se observaron diferencias significativas en los niveles plasmáticos de MMP o TIMP entre sujetos de control de referencia sin hipertensión versus control de referencia con hipertensión. LVH sin CHF versus LVH con CHF Datos de Estructura / Función: No se observaron diferencias significativas en presión sanguínea sistólica, volumen LV, o masa entre LVH sin CHF y sujetos con LVH con CHF (Tabla 5) . Sin embargo, la función diastólica fue significativamente más afectada en LVH con CHF en comparación con LVH sin CHF. índices de relajación diastólica fuero más lentos, la rigidez diastólica fue mayor y presiones de llenada fueron más elevadas en LVH con CHF en comparación con LVH sin CHF. En particular, en pacientes con LVH sin CHF. En particular, en pacientes con LVH sin CHF, Doppler E' tisular fue reducido (8.4 ± 0.4 cm/seg con intervalos de confianza de 95% (CI) de 7.4, 9.3) en comparación con control de referencia sin hipertensión (10 ± 0.4 cm/seg, intervalo de confianza de 95% = 9.3, 11) y control de referencia con hipertensión (9.8 ± 0.5 cm/seg, intervalo de confianza del 95% = 8.1, 11). E' cayó adicionalmente en LVH con CHF (7.2 ± 0.5 cm/seg, intervalo de confianza de 95% = 6.2, 8.3) . En pacientes con LVH sin CHF, PCWP permaneció sin cambio (13 ± 2 mmHg, intervalo de confianza de 95% = 10.5, 15.2) en comparación con control de referencia sin hipertensión (10 ± 1 mmHg, intervalo de confianza de 95% = 9.3, 10.6) y control de referencia con hipertensión (11 ± 1 mmHg, intervalo de confianza de 95% = 9.1, 12.2) pero se incrementó en LVH con CHF (17 ± 2 mmHg, intervalo de confianza de 95% = 15.2, 17.7). La proporción de PCWP versus volumen diastólico final LV no presentó cambio en pacientes con LVH sin CHF pero se elevó significativamente en pacientes con LVH con CHF. La elastancia arterial efectiva fue incrementada en LVH sin CHF y fue reducida en LVH con CHF. LA V fue incrementado en LVH sin CHF (LAMV = 53 ± 4 mi, p<0.05 en comparación con control de referencia) y se incrementó adicionalmente en LVH con CHF (LAMV = 70 + 5 mi, p<0.05 en comparación con LVH sin CHF). LAEF permaneció sin cambio en LVH con CHF (LAEF = 42 ± 3%, p<0.05 en comparación con control de referencia) pero fue incrementada en LVH con CHF (LAEF = 48 ± 2% en comparación con LVH sin CHF) . Perfiles plasmáticos de MMP y TIMP; No hubo diferencias significativas en MMP-2, -9, -13, TI P-2 o proporciones MMP/TIMP en LVH sin CHF en comparación con LVH con CHF (Figura 1). Sin embargo, TIMP-1 fue significativamente incrementada en LVH con CHF (1364 ± 86 ng/ml, intervalo de confianza de 95% = 1185, 1543) en comparación con LVH sin CHF (1092 ± 77 ng/ml, intervalo de confianza de 95% = 933, 1252) . De hecho, TIMP-1 fue elevada solamente en sujetos con CHF. TIMP-1 permaneció sin cambio en pacientes con LVH sin CHF en comparación con control de referencia sin hipertensión (1000 ± 42 ng/ml, intervalo de confianza de 95% = 915, 1085) y control de referencia con hipertensión (988 ± 76 ng/ml, intervalo de confianza de 95% = 824, 1152) . Relación entre perfiles plasmáticos de MMP y TIMP y estructura y función LV: Se observó una relación significativa entre TIMP-1 y la magnitud del remodelado LV. Conforme se incrementó TIMP-1, se incrementó la masa LV (r = 0.30, p = 0.005) y la proporción volumen/masa se redujo (r = -0.56, p = 0.001, Figura 2A) . Hubo una relación significativa entre TIMP-1 y la magnitud de la disolución diastólica. Conforme se incrementó TIMP-1, la proporción mitral E/A disminuyó (r = -0.22, p<0.027), E' cayó (r - -0.62, p = 0.001, Figura 2B) , y se incrementó la PCWP (r = 0.28, p = 0.013). Finalmente hubo una relación significativa entre la magnitud de CHF y los niveles de TIMP-1. El valor medio de TIMP-1 fue más elevado en sujetos con LVH con CHF que pertenecían a la clase II de NYHA versus clase II. El hecho de tener un nivel de TIMP-1 de >1200 ng/ml fue predictivo de tener LVH con CHF (?2 = 4.6, p = 0.03, especificidad = 88% y valor predictivo positivo = 94%, razón de posibilidades = 3.54, intervalos de confianza de 95% = 1.08, 11.50). El área bajo la curva de operador-receptor (ROC) fue de 0.71. No hubo relación entre el uso de medicación específica y diferencias en estructura LV, función o perfiles plasmáticos de MMP/TIMP entre grupos. Específicamente, no se observaron diferencias en ningún nivel de MMP o TIMP entre pacientes agrupados por ninguna medicación o combinación de medicaciones. Sin embargo, se reconoce que este estudio no fue suficientemente poderoso para analizar completamente los efectos de fármacos sobre estructura LV, función o perfiles plasmáticos de MMP/TIMP. Por consiguiente, estos datos y análisis deben ser interpretados con la cautela apropiada. Discusión Se encontraron 3 hallazgos únicos en este estudio: 1) pacientes con hipertensión pero con estructura y función LV normales presentaban un perfil MMP/TIMP normal, 2) cambios en perfiles de MMP/TIMP que favorecen una degradación reducida de ECM (MMP-2, -13 reducidas, TIMP-1 incrementada) fueron asociados con hipertrofia LV y disfunción diastólica, y 3) TIMP-1 incrementada fue predictor de presencia de CHF.

Mientras pleotrópicos en sus sustratos y acciones, cambios en MMPs y TIMPs del miocardio tienen efectos predecibles sobre ECM (Spinale, FG. 2002; Chapman RE, et al. 2004). Por ejemplo, MMP-2 (una gelatinasa) degrada proteínas de membrana de base, péptidos de colágeno fibrilar, y fibras de colágeno recientemente sintetizadas. En el estudio actual, MMP-2 fue significativamente reducida en pacientes con LVH hipertensiva . MMP-9 (una gelatinasa) tiene los mismos sustratos de proteínas estructurales que MMP-2, pero tiene un nivel de actividad muy inferior. Sin embargo, MMP-9 tiene efectos significativos sobre proteínas/péptidos biológicamente activos importantes tales como TGF-D, y otras proteínas y vías "pro-fibróticas" . La activación de vías pro-fibróticas por MMP-9 incrementada podía esperarse que incrementará la acumulación de ECM. Por consiguiente, niveles reducidos de MMP-2 y niveles incrementados de MMP-9 encontrados en pacientes con LVH en el estudio actual pueden ser un factor que contribuya a los cambios estructurales y funcionales observados en enfermedad cardiaca hipertensiva. MMP-13 es una colagenasa que se encuentra en niveles muy bajos en el plasma y es difícil de cuantificar con exactitud aún con un ensayo de alta sensibilidad. Por consiguiente, en el estudio actual, en lugar de reportar MMP-13 como un valor cuantitativo, los resultados fueron dicotomizados . MMP-13 detectable en el plasma de pacientes con LVH fue muy reducida y fue reducida adicionalmente en pacientes con LVH y CHF. La reducción en esta enzima colagenolitica debería provocar una producción de colágena fibrilar reducida, degradación reducida y acumulación incrementada de ECM. La actividad MMP es regulada en varios niveles que no solamente incluyen regulación transcripcional, sino que incluyen también modificación post-traslacional como por ejemplo unión de TIMP. Las TIMPs se unen a MMPs activas en una proporción 1:1, inhiben la actividad enzimática de MMP y por consiguiente forman un punto de control importante con relación a la actividad proteolítica ECM meta (Spinale, FG. 2002; Chapmman RE, et al., 2004; Brew K, et al. 2000). El estudio actual mostró que niveles plasmáticos de TIMP-1 se incrementaban en pacientes con LVH y CHF. Como resultado, el equilibrio entre MMPs y TIMPs fue alterado a favor de una actividad proteolítica ECM reducida lo que facilitaría por consiguiente la acumulación de ECM. Existen cuatro TIMPs conocidas, y la regulación transcripcional de estas moléculas no es homogénea (Brew K, et al. 2000). Niveles discordantes de TIMPs han sido observados tanto en modelos de animales de insuficiencia cardiaca como en el caso de pacientes con enfermedad cardiomiopática (Wilson EM, et al. 2002; Stroud RE. 2005). En el estudio actual, un incremento robusto en TIMP-1 fue observado en pacientes con LVH con CHF. En contraste, solamente un pequeño incremento en TI P-2 fue observado en pacientes con LVH ya sea con o sin CHF. Estas observaciones recalcan probablemente las funciones diferentes y las vías regulatorias diferentes para TIMPs en el proceso de remodelado LV. Un hallazgo único del presente estudio fue que un tipo especifico de TI P, TIMP-1, estaba fuertemente asociado con el desarrollo de CHF. En pacientes con LVH y CHF, no resulta claro si los niveles incrementados de TIMP-1 contribuyeron al desarrollo de CHF o eran el resultado de su desarrollo. Lo que resulta claro, sin embargo, es que TIMP-1 incrementada estuvo presente de manera única en pacientes con LVH y CHF y valores plasmáticos de TIMP-1 >1200 ng/ml fue un predictor de presencia de CHF. Por consiguiente, este analito plasmático debe considerarse en el desarrollo de criterios de diagnóstico para insuficiencia cardiaca con una fracción de eyección normal (insuficiencia cardiaca diastólica) y para diseñar estrategias de manejo terapéutico novedosas para la insuficiencia cardiaca diastólica. Sin embargo, se reconoce que el valor de partición de TIMP-1 = 1200 ng/ml fue elegido en forma "post-hoc" en lugar de seleccionarse de manera prospectiva. Por consiguiente, la validez de su valor predictivo debe interpretarse con cautela apropiada y debe confirmares en estudios adicionales que utilizan un diseño de estudio en serie prospectivo grande. Los cambios en MMP/TIMPs que ocurren en pacientes con enfermedad cardiaca hipertensiva pueden afectar la regulación del crecimiento tanto en compartimientos extracelulares como en compartimientos de cardiomiocitos que resultan conjuntamente en hipertrofia LV concéntrica y contenido incrementado de colágeno. La homeostasis de colágeno es determinada por el equilibrio entre síntesis, modificación post-traslacional y degradación. En enfermedad cardiaca hipertensiva, Diez et al y otros han mostrado que un contenido incrementado de colágeno estaba asociado con marcadores plasmáticos incrementados de síntesis de colágeno, degradación reducido de colágeno y producción reducida de colágeno (Diez J, et al. 2002; López B, et al. 2001a; López B, et al. 2001b) . Cambios en los perfiles de MP/TIMP encontrados en el estudio actual divulgan mecanismos potenciales a través de los cuales se pueden efectuar cambios de síntesis, degradación y producción. Mientras existen muchos determinantes del remodelado estructural LV, la presión sanguínea es uno de los más importantes. Sin embargo, datos provenientes del estudio actual indican que aún después de un control adecuado de la presión sanguínea, cambios en curso en MMPs y TIMPs predicen, probablemente predeterminan y están ciertamente asociados con un remodelado concéntrico persistente, LVH e insuficiencia cardiaca diastólica. La regresión de LVH requiere de un remodelado apropiado del ECM incluyendo degradación y producción de componentes de ECM (particularmente las proteínas de membrana de base) y alteraciones de las interacciones cardiomiocito-matriz . El estudio actual mostró que pacientes con LVH hipertensiva tenían anormalidades persistentes en perfiles específicos de M P (MMP-2 reducida) y TIMP (TIMP-1 incrementada) que era de esperarse que favoreciera unas conexiones membrana de base de cardiomiocito-matriz continuas y no la producción de ECM necesaria para permitir una regresión de masa LV. Parece probable por consiguiente que los cambios en curso en MMPs y TIMPs observados en el estudio actual contribuyen a los cambios fenotípicos y estructurales presentes en enfermedad cardiaca hipertensiva. El estudio actual utilizó niveles plasmáticos de MMPs y TIMPs como marcadores sustituidos para reflejar cambios en niveles miocardiales de estas enzimas y péptidos. La activación de MMP y la unión de TIMP es un proceso compartimentalizado que ocurre dentro del intersticio miocardial (Spinale, FG. 2002; Chapman RE, et al. 2004) . Por consiguiente, los niveles plasmáticos no reflejan necesariamente la actividad proteolítica ECM neta que ocurre dentro del miocardio. Diferencias en niveles plasmáticos de MMP y TIMP observados entre control de referencia y pacientes con enfermedad cardiaca hipertensiva en el estudio actual reflejan probablemente diferencias a nivel miocardial (Joffs C, et al. 2001 ; Yarbrough WM, et al. 2003 ; Lindsey ML, et al. 2003 ) . Es posible que el miocardio no sea la única fuente de MMPs y TIMPs en pacientes con LVH. Por consiguiente, mediciones de niveles plasmáticos de MMP y TIMP representan la suma de MMPs y TIMP liberadas de fuentes tanto cardiacas como no cardiacas. Sin embargo, los criterios de exclusión específicos utilizados en el presente estudio ayudaron a eliminar cambios significativos en las fuentes principales no cardiacas de MMPs y TIMPs. Sin embargo, se debe reconocer que pacientes con hipertensión y LVH, con o sin enfermedad cardiaca crónica pueden tener cambios en otros tejidos no cardiacos, tales como los ríñones y la basculatura, que pueden contribuir a la liberación de MMP y TIMP en el plasma. Los hallazgos del estudio actual demuestran diferencias en niveles plasmáticos de MMP y TIMP entre control de referencia y pacientes con LVH. o Conclusión: Un patrón específico de cambios en el sistema proteolítico de ECM fue asociado con manifestación estructural, funcional y/o clínica de enfermedad cardiaca hipertensiva . Sujetos con una presión sanguínea adecuadamente controlada sin cambios estructurales ni funcionales en el ventrículo izquierdo no presentaron cambios en la firma MMP/TIMP. Sin embargo, pacientes con LVH, a pesar de un control adecuado de la presión sanguínea, presentaron niveles reducidos de MMP-2 y -13 .Se encontraron incrementos en TIMP- 1 en pacientes con LVH y CHF. En particular, la transición entre LVH hipertensivo y el desarrollo de CHF es anunciada por cambios en MPs y TI Ps tales como un incremento en TIMP-1 > 1200 ng/ml o ausencia de MMP-13. Sin embargo, el estudio actual presentó un tamaño de muestra limitado, utilizó un diseño cruzado, y no efectuó estudios en serie a lo largo del tiempo. Estas limitaciones hacen que nuestras observaciones deban ser probadas adicionalmente y confirmadas utilizando un diseño de estudio en serie, prospectivo, grande. Sin embargo, los datos provenientes del estudio actual indican que los cambios estocásticos observados en MMP/TIMPs desempeñan una función importante en las manifestaciones de enfermedad cardiaca hipertensiva . La comprensión de está patofisiologia dependiente de ECM ofrece un diagnóstico y tratamiento mejorados de pacientes con enfermedad cardiaca hipertensiva.

Perspectiva clínica: La hipertensión arterial crónica es una causa común de hipertrofia concéntrica LV, velocidad de relajación reducida, y rigidez incrementada. Los cambios estructurales y funcionales provocados por la hipertensión resultan de cambios tanto de los constituyentes principales del miocardio, el cardiomiocito como particularmente de la matriz extracelular (ECM) . Estos cambios estructurales y funcionales LV crean el sustrato necesario para el desarrollo de insuficiencia cardiaca diastólica (DHF) . Sin embargo, se desconoce lo que controla estos cambios en la ECM, si el control de la presión sanguínea solo puede evitar o revertir estos cambios, y si el conocimiento de los mecanismos de control de ECM pudieran ayudar a diagnosticar o tratar la enfermedad cardiaca hipertensiva . El estudio actual mostró que cambios en el patrón de proteínas/péptidos proteolíticos de ECM específicos (MMPs Y TIMPs) eran asociados con cada manifestación estructural, funcional, y clínica de enfermedad cardiaca hipertensiva. Sujetos con una presión sanguínea adecuadamente controlada sin cambios estructurales o funcionales LV no presentaron cambios en la firma MMP/TIMP. Por consiguiente, el tratamiento de la hipertensión puede prevenir cambios en ECM y en el sistema proteolítico de ECM. Sin embargo, pacientes con LVH residual o resistente, a pesar de un control adecuado de la presión sanguínea, tenían MMPs anormales. El desarrollo de DHF fue anunciado por un incremento en TIMP-1 > 1200 ng/ml. Estos datos sugieren que la regresión de LVH y la prevención de DHF dependen más que solamente de cambios en la presión sanguínea, y pueden requerir de enfocar y normalizar cambios en MMP/TIMPs. La comprensión de está patofisiología dependiente de ECM ofrece un diagnóstico y tratamiento mejorados de pacientes con enfermedad cardiaca hipertensiva. 2. Ejemplo 2: Metaloproteinasas de matriz/inhibidores tisulares de Metaloproteinasas : Relación entre Cambios en Determinantes Proteoliticos de Composición de Matriz y Manifestaciones Estructurales , Funcionales , y Clínicas de Enfermedad Cardiaca Hipertensiva Métodos Reclutamiento en el Estudio: LA Tabla 6 muestra el reclutamiento en el estudio. Los criterios de exclusión fueron una historia de infarto del miocardio, cardiomeopatia, anormalidades de movimiento de pared o valvular, arritmia, enfermedad cardiaca infiltrante, EF<50%, hipertensión no controlada (SBP>140 o DBP>90) , o enfermedad sistémica que afecta los perfiles plasmáticos de MMP/TIMP. Los criterios de inclusión para controles y controles con HTN fueron hombres y mujeres de una edad comprendida entre 18 y 90 años sin evidencia de enfermedad cardiovascular estructural. Los criterios de inclusión para LVH y LVH con CHF fueron hombres y mujeres de una edad comprendida entre 18 y 90 años con hipertrofia LV establecida por ecocardiografia (espesor de pared >1.2 cm o índice de masa LV >125 g/m2) . Tabla 6: Reclutamiento para el Estudio Control LVH -HTN +HTN -CHF +CHF Número 39 14 23 26 Edad 59±2 60±2 56+2 64±2 SBP (mmHg) 126±3 131±4 138±3 133±4 DBP (mmHg) 74±2 77±2 82±2 72±2 Mediciones de Ecocardiografía : se utilizó ecocardiografía bidimensional estándar. Cálculos de Ecocardiografia : se calculó el volumen LV a través del método de discos. Se calculo la masa LV a través del método Penn. Se calculó PCWP como 2 + 1.3 x (E/Ea) . Mediciones plasmáticas de MMP/TIMP: se obtuvieron mediciones plasmáticas mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) (Ammersham Pharmacia Biotech) para las gelatinasas P-2 y MMP-9, la colagenasa MMP-13, y las TIMPS TIMP-1 y TIMP-2. Resultados Las Figuras 7-11 muestran los resultados del estudio. Conclusiones Pacientes con HTN pero con estructura y función LV normales tenían un perfil de MMP/TIMP normal. Cambios en perfiles MMP/TIMP que favorecen una degradación reducida de ECM fueron asociados con hipertrofia LV y disfunción diastólica. TIMP-1 incrementada predijo la presencia de CHF. Cambios en el sistema proteolítico de matriz extracelular del miocardio son medibles utilizando ensayos plasmáticos de MMPs y TIMPs seleccionadas. Cada manifestación de enfermedad cardiaca hipertensiva está asociada con un patrón especifico de cambios en el sistema proteolítico de ECM. Pacientes hipertensos con remodelado estructural, disfunción diastólica y/o CHF clínica se caracterizan por una reducción de MMPs y un incremento de TIMPs. 3. Ejemplo 4: Criterios para la diferenciación, predicción y diagnóstico de insuficiencia cardiaca en pacientes con hipertensión En la Tabla 7 se proporciona un grupo claro de valores normales para sujetos humanos dentro del rango de edad y entre los géneros. No se ha compilado con anterioridad lista de valores de referencia normales para MMPs/TIMPs que son tan incluyentes como está y además proporciona rangos de referencia normales puesto que sujetos con correspondencia de edad, libres de enfermedad cardiovascular fueron incluidos. Además, razones estequimetricas novedosas para perfiles de MMP/TIMP se proporcionan que resultan ser importantes como información de diagnóstico y pronostico como se muestra con detalles en Tablas subsecuentes. Estos datos fueron recopilados y analizados en más de 100 sujetos. Tabla 7: Rango de Referencia Humanos* Normales MMP/TIMP Niveles Plasmáticos (ng/mL) MMP-2 1000-1500 MMP-9 0-20 MMP-7 0-5 MMP-13 0-10 MMP-8 0-3 TIMP-1 800-1000 TIMP-2 25-50 TIMP-4 0-2 Razones MMP-9/TIMP MMP-9/TIMP-1 7-15 MMP-9/TIMP-2 100-500 MMP-9/TIMP-4 1-10 *Adultos Normales Edades: de 25 a 70 años La Tabla 8 presenta los valores de MMP y TIMP en términos absolutos, las razones MMP/TIMP en términos absolutos, y los cambios porcentuales a partir de valores de referencia normales basados en los términos absolutos, en pacientes con opresión sanguínea bien manejada, pero con un diagnóstico de hipertensión. Estos valores fueron recopilados de conformidad con lo descrito en el cuerpo de la solicitud original. Se demuestra un perfil plasmático único que no podía ser predicho a partir de reportes anteriores en estudios con animales ni a partir de los estudios clínicos limitados publicados previamente. Este perfil único incluye una caída de MMP-2, la ausencia de cambio en MP-9, la ausencia de detección de MMP-13 (debajo de la sensibilidad de cualquier sistema de ensayo utilizado actualmente) , y niveles fuertemente incrementados de TIMP-1. Además, un incremento del marcador específico cardiovascular para TIMP-4 pudo demostrarse. Estos cambios en perfiles de MMP y Timps son únicos para pacientes con hipertensión y demuestran cambios tempranos que ocurren dentro del tejido cardiaco de estos pacientes. Este perfil único y específico puede ser utilizado para guiar la terapia con el objeto de reducir esos cambios en perfiles de MMP y TIMP a partir de sujetos normales. Además, estos perfiles plasmáticos pueden ser utilizados para un tamizaje generalizado para poblaciones de pacientes en riesgo y para identificar pacientes que están en riesgo de eventos adversos $futuros . Tabla 8: Diagnóstico para Enfermedad Cardiaca Hipertensiva MMP/TIMP Niveles Plasmáticos (ng/mL) * M P-2 <1000 MMP-9 25-50 MMP-7 0-5 MMP-13 0-5 MMP-8 ' 0-3 TIMP-1 <1000 TIMP-2 >50 TIMP-4 >2 Razones Plasmáticas MMP/TIMP MMP-9/TIMP-1 <5 MMP-9/TIMP-2 <100 MMP-9/TIMP-4 <3 ^Pacientes diagnosticados con presión sanguínea elevada y bajo manejo médico apropiado La Tabla 9 demuestra perfiles plásmaticos para MMPs y TIMPs que provienen de pacientes con insuficiencia cardiaca secundaria a enfermedad de cardiaca hipertesiva. Estos datos fueron compilados a partir de estudios proporcionados en la solicitud inicial. Este estudio pasado demostró que la diferenciación entre la presencia y ausencia de insuficiencia cardiaca en pacientes hipertensos podría obtenerse a través de la perdida de una señal para MMP-13, y el fuerte incremento en TIMP-1. De hecho, curvas operador-receptor (ROC) para predicción y diagnóstico de insuficiencia cardiaca fueron previamente proporcionadas. En contraste notable con pacientes con insuficiencia cardiaca secundaria a un infarto al miocardio (ataque cardiaco) , los niveles de MMP-9 son normales o inferiores a la normal. La diferenciación entre estos dos estados de enfermedad es posible y se ofrece en una tabla en proceso de elaboración. Además, mediante la utilización de un marcador especifico cardiovascular, TIMP-4, se podría demostrar que este fue incrementado en pacientes con enfermedad cardiaca hipertensiva y que esto proporciono especificidad cardiovascular al perfil plasmático nunca demostrado antes. Estos datos ofrecen el primer perfil diferencial para identificar a través de marcadores plasmáticos, a pacientes que adolecen de insuficiencia cardiaca por enfermedad cardiaca hipertensiva. Es un asunto importante puesto que las modalidades de tratamiento difieren en la causa subyacente de la insuficiencia cardiaca. La forma como estos nuevos datos podrían ser utilizados para guiar la terapia y toma de decisión clínica se ofreció en la solicitud inicial . Tabla 9: Pacientes Hipertensos en Riesgo de Insuficiencia Cardiaca* MMP/TIMP Niveles Plasmáticos (ng/mL) MMP-2 <500 MMP-9 0-20 MMP-7 0-5 MMP-13 ND (no detectable) MMP-8 0-3 TIMP-1 >1500 TIMP-2 >100 TIMP-4 >6 Razones Plasmáticas MMP/TIMP MMP-9/TIMP-1 <2 MMP-9/TIMP-2 <50 MMP-9/TIMP-4 <0.25 Pacientes diagnosticados con presión sanguínea elevada bajo manejo medico apropiado La firma plasmática única que fue desarrollada en esta solicitud y presentada en el material de apoyo ofrece por vez primera la capacidad de diferenciar las causas subyacentes para un paciente que presenta insuficiencia cardiaca. Específicamente, como se muestra en la Tabla 10, surge un perfil plasmático único y muy diferente para un paciente en riesgo de desarrollar o que presenta insuficiencia cardiaca secundaria a un infarto del miocardio o en pacientes con insuficiencia cardiaca secundaria a hipertensión. Estos datos fueron compilados a partir de nuestros estudios terminados que forman la base de esta solicitud. Por consiguiente, se pueden efectuar diagnósticos diferenciados con base en estos perfiles y, lo que es más importante, se pueden tomar decisiones clínicas más específicas y se pueden considerar estrategias terapéuticas más específicas. Ejemplos de aplicaciones clínicas para este perfil y cómo pueden ser utilizados en toma de decisión clínica se ofrecen en la solicitud inicial. Tabla 10: Diagnóstico Diferencial de Insuficiencia Cardiaca Sistólica (Post-MI) o Diastólica (Enfermedad Cardiaca Hipertensiva) * Perfiles Plasmáticos MMP/TIMP HF Sistólica HF Diástolica MMP i MMP † M P MMP MP-13 1 o ND MMP-8 † TIMP-1 † T † TIMP-2 † † † TIMP-4 j. T T Razones Plasmáticas MMP/TIMP MMP-9/TIMP-1 1 MMP-9/TIMP-2 MMP-9/TIMP-4 l E. Referencias Bigg HF, Morrison CJ, Butler GS, Bogoyevitch MA, Wang Z, Soloway PD, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-4 inhibits but does not support the activation of gelatinase A via efficient inhibition of membrane type 1 -matrix metalloproteinase . Cáncer Res 2001; 61 ( 9) : 3610-8. Bradham WS, Gunasinghe H, Holder JR, ultani MM, Killip D, Anderson M, et al. Reléase of matrix metalloproteinases following alcohol septal ablation in hypertrophic obstructive cardiomyopathy . JACC 2002; 40 (12) :2165-73. Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. 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Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición de la cantidad de MMP-13 en un fluido corporal proveniente de un sujeto, una cantidad inferior a 10 ng/mL indicando la presencia de insuficiencia cardiaca diastólica o prediciendo una insuficiencia cardiaca.
2. 2. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la detección en un fluido corporal proveniente de un sujeto, de una cantidad TIMP-1 superior al valor normal.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde la cantidad de MMP-2 es por lo menos aproximadamente 20% mayor que el valor normal.
4. 4. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la detección en un fluido corporal del sujeto de una cantidad de TIMP-4 superior al valor normal.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde la cantidad^ de TIMP-4 es por lo menos aproximadamente 50% mayor que el valor normal.
6. 6. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición en un fluido corporal del sujeto de una cantidad de MMP-13, TIMP-1, y TIMP-4.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde la cantidad de MMP-13 es indetectable, la cantidad de TI P-1 es por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal y la cantidad de TIMP-4 es por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal.
8. 8. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición en un fluido corporal del sujeto de una cantidad de MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, y TIMP-4.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde la cantidad de MMP-13 es indetectable, la cantidad de TIMP-1 es por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal, la cantidad de TIMP-2 es de por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal, y la cantidad de TIMP-4 es por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal.
10. 10. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la medición en un fluido corporal del sujeto, de una cantidad de MMP-13, TIMP-1, TIMP-4 y MMP-2.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde la cantidad de MMP-13 es indetectable, la cantidad de TIMP-1 es por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal, la cantidad de TIMP-4 es por lo menos aproximadamente 50% mayor al valor normal, y la cantidad de MMP-2 es por lo menos aproximadamente 20% menor que el valor normal.
12. 12. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la detección de una reducción de la proporción entre MMP-9 y TIMP-1 en un fluido corporal del sujeto, en comparación con la proporción normal.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la reducción de la proporción es de por lo menos aproximadamente 50% en comparación con la proporción normal.
14. 14. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la detección de una reducción de la proporción entre MMP-9 y TIMP-2 en un fluido corporal proveniente del sujeto, en comparación con la proporción normal.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la reducción de la proporción es de por lo menos aproximadamente 50% en comparación con la proporción normal.
16. 16. Un método para predecir insuficiencia cardiaca diastólica en un sujeto, dicho método comprende la detección de una reducción de la proporción entre MMP-9 y TIMP-4 en un fluido corporal proveniente del sujeto, en comparación con la proporción normal.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la reducción de la proporción es de por lo menos aproximadamente 50% en comparación con la proporción normal.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde el fluido corporal es sangre.
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en donde el fluido corporal es plasma.