DE2743445A1

DE2743445A1 - Immunchemisches haptenmessverfahren

Info

Publication number: DE2743445A1
Application number: DE19772743445
Authority: DE
Inventors: Takashi Kudo; Ei Mochida; Nobuhisa Ogawa; Hiroyuki Shinkai
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1976-09-29
Filing date: 1977-09-27
Publication date: 1978-03-30
Also published as: NL178280B; US4308026A; DE2743445C2; JPS5734904B2; FR2366569B1; NL178280C; FR2366569A1; GB1586506A; NL7710666A; JPS5341420A

Description

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Beschreibung

In neuerer Zeit ist eine klinische Testmethode oder Diagnose in den Vordergrund getreten, bei welcher der pathologische Zustand oder die pathologische Prognose eines Patienten beurteilt oder die Arzneimitteldosis, die an den Patienten verabreicht werden soll, in der Weise bestimmt wird, daß der Gehalt des Urins oder des Blutes an einer physiologisch aktiven Substanz mit niederem Molekulargewicht gemessen wird, die in seinem Körper als Hapten sowie seiner Metaboliten oder eines an den Patienten verabreichten Arzneimittels sowie seiner Metaboliten vorliegt.

Die bei der Durchführung dieser klinischen Testmethode oder Diagnose zu messenden Haptene sind beispielsweise folgende: Androgene, wie Testosteron, Dehydroepiandrosteron, Androsteron, Glucocorticoide, wie Cortison, Cortisol, Corticosteron, Mineralcorticoide, wie Aldosteron, Progestogene, wie Progesteron, östrogene, wie östriol, östradiol, Thyroidhormome, wie Thyroxin, Trijodthyronin, Prostaglandin, physiologisch aktive Amine, wie L-Dopa, Epinephrin, Norepinephrin, Histamin sowie ihre Metabolite.

Die bei dieser Testmethode oder Diagnose zu messenden Arzneimittel sind folgende: Arzneimittel, deren Dosis mit äußerster Vorsicht ermittelt werden sollte, und deren Wirkungen eine Beziehung zu ihrer Konzentration in dem Blut oder Urin aufweisen, beispielsweise Digitaliszubereitungen, Antibiotika, wie Tetracyclin, psychotrope Mittel, wie Amphetamin, Narkotika, wie Morphin, Blutkoagulationsmittel sowie Antikoagulationsmittel.

Unter dem Begriff "Hapten" ist erfindungsgemäß eine physiologisch aktive Substanz mit niederem Molekulargewicht zu verstehen, die in dem menschlichen Körper vorliegt, sowie ihre Metabolite, oder ein Arzneimittel, das an den menschlichen Körper verabreicht wird, sowie seine Metabolite, wobei eine

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derartige Substanz allein nicht in der Lage ist, einen Antikörper zu erzeugen und dann, wenn sie an eine Substanz gebunden ist, die selbst ein Antigen ist, wie ein Protein, PoIysaccharid oder Glycoprotein, einen Antikörper zu erzeugen vermag (der nachfolgend einfach als Träger bezeichnet wird), wobei der erzeugende Antikörper eine Substanz ist, die sogar in sich selbst eine Reaktivität aufweist.

Gewöhnlich treten die Haptene in Spurenmengen auf, wobei sie als komplexgebundene oder konjugierte Formen in Blut oder Urin mit komplizierter Zusammensetzung vorliegen- Daher ist ein aufwendiges und zeitraubendes Verfahren zu ihrer Ermittlung und Messung erforderlich.

Um diese Haptene zu messen, kann man sich der herkömmlichen Methoden bedienen, beispielsweise eines physikalisch chemischen Verfahrens, eines immunchemischen Verfahrens oder eines konkurrierenden Proteinbindeverfahrens.

Bei der Durchführung des erwähnten physikalisch-chemischen Verfahrens wird der Haptenkomplex oder das Haptenkonjugat in Blut oder Urin mittels einer Säure, eines Alkali oder eines Enzyms hydrolysiert und nach der Reinigung zur Messung einer Chromatographie etc. unterzogen. Die durchzuführende Methode ist jedoch kompliziert und zeitraubend. Während der Hydrolyse verschwindet das Steroid durch Zersetzung im Falle bestimmter Steroide, wobei ferner der Fall eintreten kann, daß der größere Teil des Steroids während der Chromatographie adsorbiert wird. Folglich ist die eluierte Steroidmenge so gering, daß sie nicht mehr meßbar ist.

Das immunchemische Verfahren ist mittlerweile bezüglich der Reaktionsspezifität und der Meßempfindlichkeit dem erwähnten physikalisch-chemischen Verfahren überlegen. Derzeit werden zahlreiche Methoden zur Messung von Haptenspuren im menschlichen Körper durchgeführt, beispielsweise ein Agglutinierungsinhibierungsreaktionsverfahren sowie eine Radioimmunoassay (nachfolgend als RIA abgekürzt). Bei der Durchführung des

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Agglutinierungsinhibierungsreaktionsverfahrens wird ein Haptenträgerkonjugat, welches das gleiche Hapten wie das zu messende Hapten repräsentiert, gebunden an einen Träger (nachfolgend als ANTIGEN bezeichnet) als Antigen verwendet. Ein zu messender Haptenantikörper (nachfolgend als "ANTIKÖRPER" bezeichnet) wird aus einem Antiserum erhalten, das aus Säugetieren gewonnen wird, beispielsweise Meerschweinchen, Kaninchen oder Schafen, die mit ANTIGEN immunisiert worden sind. Unter Einsatz der ANTIKÖRPER sowie ANTIGEN-sensibilisierter Teilchen, die durch Sensibilisierung feiner Teilchen aus Blutzellen oder eines Latex mit hohem Molekulargewicht (nachfolend als "Teilchen" bezeichnet) erhalten worden sind, verläuft die Agglutinierungsreaktion zwischen den zwei Komponenten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens wird die Agglutinierungsreaktion, die durch das Vorliegen des zu messenden Haptens inhibiert wird, zum Zwecke dieser Messung angewendet. Im Gegensatz zu dem erwähnten chemisch-physikalischen Verfahren ist dieses Verfahren ein äußerst einfaches Verfahren, das in der Lage ist, das in Form eines Komplexes oder Konjugates in Blut oder Urin vorliegende Hapten zu messen, ohne daß dabei komplizierte Verfahrensmaßnahmen, wie eine Hydrolyse oder Chromatrographie, erforderlich sind. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens beträgt ungefähr 100 mg/ml, und zwar auich dann, wenn Blutzellen, d. h. ausgezeichnete ANTIGEN-Teilchen, in Frage kommen. Da die meisten Haptene, deren Messung im menschlichen Körper sich lohnt, in einer Menge zwischen 500 pg/ml und 50 ng/ml vorliegen, müssen sie zur Durchführung einer erfolgreichen Messung konzentriert werden.

Bei der Durchführung des konkurrierenden Proteinbindeverfahrens wird anstelle des bei der RIA eingesetzten Antikörpers ein Haptenrezeptor oder ein bindendes Protein, das im menschlichen Körper vorliegt, eingesetzt. Mit einem gemessenen Wert, welcher in einer Beziehung zu der biologischen Akti- ' vität gesetzt wird, die Hapten zeigt, läßt sich dieses Ver-

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fahren durchführen, es weist jedoch insofern Nachteile auf, als nur von wenigen Haptenen, wie östrogen, Corticosteroid oder dem Thyroidhormon, ihre Rezeptoren bekannt sind. Es ist ein kompliziertes Verfahren zur Extraktion und Reinigung dieses Rezeptoren erforderlich, wobei diese Rezeptoren nach der Extraktion nicht lange beständig sind.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines neuen immunchemischen Verfahrens zur Messung von Hapten. Durch die Erfindung sollen ferner Reagentien für eine Haptenmessung auf der Grundlage dieses neuen Verfahrens geschaffen werden. Erfindungsgemäß wird eine Agglutinierungsinhibierungsreaktion unter Einsatz von Antihaptenantikörper-sensibilisierten Teilchen sowie eines Haptenträgerkonjugats durchgeführt.

Das erfindungsgemäße immunchemische Verfahren zur Messung von Hapten unterscheidet sich von dem herkömmlichen Verfahren unter Anwendung der Agglutinierungsinhibierungsreaktion und hebt sich insofern von dem bekannten Verfahren ab, als eine außergewöhnlich gute Wirkung erzielt wird, wie sie bei der Durchführung der herkömmlichen Methode nicht erreicht werden kann.

Bei der Durchführung einer herkömmlichen immunchemischen Meßmethode unter Verwendung eines ANTIGENS und eines ANTIKÖRPERS werden ANTIGEN-sensibilisierte Teilchen sowie ANTIKÖRPER verwendet, um das Hapten zu messen, wobei die Wirkung des zu messenden Haptens ausgenützt wird, die Agglutinierung der ANTIGEN-sensibilisierten Teilchen infolge der ANTIKÖRPER zu inhibieren. Erfindungsgemäß werden bei Verwendung von ANTIKÖRPER-sensibilisierten Teilchen sowie eines ANTIGENS, das nicht auf die Teilchen sensibilisiert ist oder eines ANTIGENS, das auf die Teilchen sensibilisiert ist, Haßten durch Anwendung der Agglutinierungsreaktion der. infolge des ANTIGENS ANTIKÖRPER-sensibilisierten Teilchen sowie der Agglutinierungsinhibierungsreaktion des zu messen-

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den Haptens gemessen.

Zur Durchführung der Erfindung wird gewöhnlich ein bestimmtes Volumen der Körperflüssigkeit oder des Exkrets, welche bzw. welches das zu messende Hapten enthält, entnommen und direkt als Testlösung eingesetzt oder entsprechend auf verschiedene Konzentrationsgrade verdünnt, worauf man die Reaktion zwischen einem gegebenen Volumen der Testlösung und einem gegebenen Volumen der ANTIKÖRPER-sensibilisierten Teilchen ablaufen läßt. Dann wird ein gegebenes Volumen ANTIGEN dieser Reaktionsmischung zugesetzt. Nach einer bestimmten Reaktionszeitspanne wird das Agglutinierungsmuster oder das Agglutinierungsinhibierungsmuster ermittelt. Aus dem Verdünnungsfaktor der Testlösung und der Meßempfindlichkeit dieses Verfahrens wird der Haptengehalt in der Testlösung bestimmt.

Erfindungsgemäß werden ANTIKÖRPER wie folgt verwendet: Ein Träger wird an Hapten nach einer bekannten Methode gebunden. Ein Antiserum wird aus einem Tier erhalten, das nach einer Routinemethode mit dem Haptenträgerkonjugat (ANTIGEN) als Antigen immunisiert worden ist. Ein Haptenantikörper allein (ANTIKÖRPER) wird in der Weise gewonnen, daß durch Absorption die anderen Antikörper als die Haptenantikörper entfernt werden, d. h. die Antikörper zu dem Träger und/oder der konjugierten Stelle zwischen dem Träger und dem Hapten. Als Träger kann man beliebige Materialien verwenden. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die Träger eine hohe Antigenwirkung aufweisen. Erwähnt seien beispielsweise Rinderserumalbumin (abgekürzt als BSA), menschliches Serumalbumin (HSA), Rinder- ^-globulin (BGG), Tetanustoxoid, Glutaminsäure/Lyson/Tyrosin-Copolymere oder pneumkokkale Polysaccharide.

Als zu sensibilisierende Teilchen sind ANTIKÖRPER und ANTIGEN, feinteilige Träger, wie sie normalerweise zur Durchführung von immunchemischen Agglutinierungsreaktionen oder Aggluti-

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nierungsinhibierungsreaktionen eingesetzt werden, wie Blutzellen, hochmolekularer Latex, Kaolinit, Bentonit oder Aktivkohle verfügbar. Zur Sensibilisierung dieser Teilchen werden die ANTIKÖRPER oder die ANTIGENE in Form einer 0,001 bis 1,0 %igen Lösung der ANTIKÖRPER oder des ANTIGENS sowie eine 2 bis 20 %ige Suspension der zu sensibilisierenden Teilchen in gleichen Mengen vermischt und zu einer Umsetzung während einer Zeitspanne von 30 bis 90 Minuten bei 25 bis 56⁰C gebracht.

Das zur Erzielung eines ANTIKÖRPERS eingesetzte ANTIGEN sowie das ANTIGEN, das eine Agglutinierungsreaktion verursacht, können voneinander in dem Trägerteil und/oder in der konjugierten Stelle zwischen dem Träger und dem Hapten verschieden sein. Das Hapten in dem ANTIGEN zur Gewinnung eines ANTIKÖRPERS sowie das Hapten in dem ANTIGEN zu Bewirkung einer Agglutinierungsreaktion sind nicht in notwendiger Weise auf das gleiche zu messende Hapten beschränkt, vorausgesetzt, daß die Spezifität der Messung beibehalten wird. Es kann sich um verschiedene Substanzen handeln, die eine immunchemische Querreaktion zeigen.

Die erfindungsgemäß zu messenden Haptene sind beispielsweise die vorstehend erwähnten Haptene: Androgene, östrogene, Progestogene, Corticoadrenalhormone, Thyroidhormone, physiologische aktive Amine, wie Epinephrin, Histamin oder Serotonin sowie ihre Metabolite, Arzneimittel, wie Morphin, luteinisierende Hormone freisetzende Hormone, Diphenylhydantoin sowie ihre Metabolite.

Im Vergleich zu der herkömmlichen Methode bietet die Erfindung eine außergewöhnlich hohe Messungsempfindlichkeit. Diese hohe Empfindlichkeit geht, wie man annimmt, obwohl ihr Mechanismus noch nicht restlos aufgeklärt ist, auf die Tatsache zurück, daß der ANTIKÖRPER, mit dem das Teilchen sensibilisiert worden ist, als multivalente Bindung

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Dies läßt sich aufgrund der Tatsache erklären, daß die Messungsempfindlichkeit noch weiter erhöht werden kann, wenn ANTIKÖRPER-sensibilisierte Teilchen sowie ANTIGEN-sensibilisierte Teilchen zusammen eingesetzt werden. Erfindungsgemäß ist die Beurteilung einfach, da die Auster der Agglutinierung sowie der Agglutinierungsinhibierung deutlich verschieden sind, was ebenfalls auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß der ANTIKÖRPER als multivalente Bindung wirkt.

Erfindungsgemäß sind nur kleine Mengen an ANTIKÖRPER und ANTIGEN erforderlich. Diese Substanzen lassen sich daher ökonomisch einsetzen. Beispielsweise kann der Verbrauch an einem bestimmten ANTIGEN, und zwar Östriolglucuronid-BSA, das schwierig herzustellen und daher teuer ist, auf ungefähr 1/100 bis 1/1000 der Menge herabgesetzt werden, die zur Durchführung der herkömmlichen Methode erforderlich ist.

Im Gegensatz zu der herkömmlichen Methode ermöglicht die Erfindung die Verwendung von ANTIKÖRPERN mit niedrigem Titer. Im allgemeinen sind die ANTIKÖRPER schwierig herzustellen, insbesondere ANTIKÖRPER mit einem hohen Titer. Werden ANTIKÖRPER mit einem niedrigen Titer verwendet, dann kann auf Kosten einer verursachtem nichtspezifischen Agglutinierungsreaktion die Messung selbst nicht durchgeführt werden. Auch dann, wenn sie durchgeführt werden kann, ist die Messungsempfindlichkeit niedrig. Erfindungsgemäß wird sogar bei Verwendung von ANTIKÖRPERN mit niedrigem Titer die Messungsempfindlichkeit nicht geringer. Darüber hinaus können, da die ANTIKÖRPER wirtschaftlich eingesetzt werden können, bei der Herstellung guter ANTIKÖRPER die ANTIKÖRPER während einer langen Zeitspanne (die gleichen ANTIKÖRPER werden zur Herstellung einer großen Anzahl von Kits verwendet) lange eingesetzt werden, so daß ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in reproduzierbarer Weise mit guter Qualität hergestellt werden kann.

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Erfindungsgemäß kann in Abhängigkeit von der Art und der Menge des zu messenden Haptens sowie in Abhängigkeit von dem Messungszweck die Empfindlichkeit willkürlich durch Steuerung der Menge an ANTIKÖRPER für die Sensibilisierung der Teilchen und/oder des entsprechenden ANTIGENS oder durch Auswahl der Kombination aus der ANTIKÖRPER-Charge und der ANTIGEN-Charge oder durch Zugabe einer Substanz, wie HSA, BSA, RSA (Kaninchenserumalbumin) oder eines grenzflächenaktiven Mittels oder durch eine Kombination einiger dieser Stufen eingestellt werden.

Die Menge an ANTIGEN, ANTIKÖRPER sowie die Empfindlichkeit der herkömmlichen Methode zur Messung von Urinöstrogen wurden mit den entsprechenden erfindungsgemäßen Parametern verglichen. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle I hervor.

In der Tabelle I bedeutet "ANTIKÖRPER" einen Antiöstriolantikörper, der durch Tiere erzeugt wird, die mit östriol-16,17-dihenisuccinat-BSA immunisiert worden sind. Unter "ANTIGEN" ist östron-17-(o-carboxymethyl)oxim-BSA oder östriol-16,17-dihemisuccinat zu verstehen. Als mit dem ANTIKÖRPER oder dem ANTIGEN zu sensibilisierende Teilchen wurden Blutzellen von Schafen sowie Polystyrollatex verwendet.

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- 12 Tabelle I

ANTIGEN-Menge ANTIKÖRPER- Empfind- Zeit zur

Methode Teilchen ^g/Test) Menge ^g/Test) lichkeit Messung

(μg/Inl)

Blutzellen 3 χ 10~⁴ erfin- von Schafen dungsgemäß Polystyrol- _₂

latex

3 χ 10

Blutzellen

herkömm- von Schafen 4 χ 10 lieh

Polystyrollatex 3

30

2 x 10 ³ 2h 1 χ 10

-2

1 χ 10

0~

5 min

2h

5 χ 10~ 5 min

Wie aus der Tabelle I hervorgeht, ist die erfindungsgemäße Methode 50 mal empfindlicher bei der östrogenmessung als die herkömmliche Methode, wobei die ANTIGEN-Menge auf 1/100 bis 1/1300 und die ANTIKÖRPER-Menge auf 1/10 der Menge, die bei der Durchführung der herkömmlichen Methode eingesetzt wird, herabgesetzt werden kann.

Werden Blutzellen von Schafen als Teilchen für die ANTIGENE oder die ANTIKÖRPER verwendet, dann kann die Messung empfindlicher sein, dauert jedoch länger. Wird jedoch Polystyrollatex verwendet, dann nimmt die Empfindlichkeit auf 1/5 ab, die erforderliche Zeit kann jedoch auf 1/20 verkürzt werden. Daher können geeignete Teilchen, die den Meßzweck erfüllen, ausgewählt werden.

Als nächstes wurde der Unterschied der Agglutinierungs- und Agglutinierungsinhibierungsmuster im Fall des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie des herkömmlichen Verfahrens verglichen. Verschiedene Konzentrationen an östriol-16Q(-glucuronid in Glycin/Puffer-Salzlösung gemäß Tabelle II wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und der herkömmlichen Methode unter Verwendung von Polystyrollatex als Teilchen für ANTIKÖRPER oder ANTIGEN gemessen.

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Bei diesem Vergleich wurde die Empfindlichkeit in beiden Fällen auf 10 Mg/ml eingestellt, so daß nur der Unterschied der Agglutinierungs- und Agglutinierungsinhibierungsmuster untersucht werden konnte, und zwar frei von dem Einfluß der Empfindlichkeit.

Die Agglutinierung und die Agglutinierungsinhibierung wurden nach folgenden Kriterien durch Beobachtung mit dem bloßen Auge beurteilt:

- : ' Agglutinierung vollständig inhibiert.

+ : Nicht unterscheidbar als Agglutinierung oder als Agglutinierungsinhibierung;

+ : Unterscheidbar als Agglutinierung durch Untersuchung ++ : Deutliche Agglutinierung.

Tabelle II

Menge an östriol-

glucuronid (Mg/ml) 0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0

erfindungsgemäßes

Verfahren ++++++++++ +

herkörmliches Verfahren +++++ + + + +

Wie aus der Tabelle II hervorgeht, erfordert bei der Durchführung der herkömmlichen Methode eine Änderung der Agglutinierungsmuster von (++) zu (-) einen Konzentrationsunterschied von 17,5 μg/ml, d. h. von 2,5 μg/ml auf 20 μg/ml, während im Falle des erfindungsgemäßen Verfahrens sich das Muster von (++) nach (-) mit einem Konzentrationsunterschied von 5 μg/ml verändert, d. h. von 10 μg/ml auf 15 μ9/πι1. Im Falle von engen Bereichen von (+) und (+), bei denen eine Beurteilung schwierig ist, ob das Muster eine Agglutinierung oder Agglutinierungsinhibierung ist, begünstigt das erfindungsgemäße Verfahrung die

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Beurteilung und ist daher praktisch von erheblichem Vorteil. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Messung von östrogen im Urin einer normalen Fra i.

A) Synthese von östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA

600 mg östriol 16,17-dihemisuccinat werden in 12 ml Dioxan aufgelöst. Die Lösung von 600 mg östriol-16,17-dihemisuccinat in 12 ml Dioxan wird mit 0,3 ml Tri-n-butylamin versetzt. Nachdem die Mischung auf ungefähr 11⁰C abgekühlt ist, werden 0,17 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt, worauf gründlich gerührt wird. In der Zwischenzeit werden 40 ml Dioxan der BSA-Lösung zugesetzt, die aus 1,7 g BSA in 40 ml destilliertem Wasser besteht. Der pH wird auf 12 unter Verwendung von 1n Natriumhydroxid eingestellt. Dann wird die Mischung auf 11⁰C abgekühlt. Die zuerst genannte Lösung wird mit dieser letzteren Lösung vermischt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 4 Stunden gerührt wird. Dann werden die Substanzen mit niederem Molekulargewicht, wie nichtumgesetztes östriol-16,17-dihemisuccinat und Tri-n-butylamin, durch Gelfiltration (Sephadex G-25, Warenzeichen der Pharmacia Co. in Schweden) abgetrennt, östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, das 0,1 % Natriumazid enthält, und gefriergetrocknet.

B) Synthese von östron-17-(O-carboxymethyl)oxim-BSA

östron-17-(O-carboxymethyl)oxim-BSA wird unter Verwendung von östron-17-(O-carboxymethyl)oxim und BSA nach der unter A) beschriebenen Methode erhalten.

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C) Herstellung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper.

2 mg östriol-16,17-dihemisuac^|inat-BSA in 1 ml einer Salzlösung werden mit 1 ml eines vollständigen Freund'sehen Adjuvanses enulgiert und subkutan in Kaninchen injiziert. Die Injektion wird fünfmal alle 2 Wochen wiederholt. Nachdem eine Zunahme des Antikörpertiters feststeht wird das Kaninchen zur Gewinnung von Antiserum ausbluten gelassen. Nach der Absorption durch BSA wird dieses Antiserum mittels eines Aussalzverfahrens unter Verwendung von wasserfreiem Natriumsulfat zur Gewinnung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper gereinigt.

D) Herstellung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Blutzellen.

Mit Formalin fixierte Blutzellen von Schafen werden mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) bei einem pH von 7,4 gewaschen. Dann erfolgt eine Suspendierung in PBS in einer 4 %igen Konzentration und ein Vermischen mit einem gleichen Volumen von 0,1 % Gerbsäure in PBS. Anschließend wir*d eine Reaktion bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten durchgeführt. Anschließend an diese Reaktion werden die Blutzellen durch Zentrifugieren abgetrennt, mit PBS gewaschen und erneut in einer 4 %igen Konzentration suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit einem gleichen Volumen von 0,02 % der Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörperlösung, erhalten gemäß C), in PBS vermischt. Nach einer Umsetzung bei 56°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten erfolgt ein Waschen mit PBS und eine Suspendierung in einer Konzentration von 2 %. Es wird eine Suspension von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Blutzellen erhalten. Dann werden 0,1 ml der Suspension in eine Ampulle eingefüllt und gefriergetrocknet.

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E) Messung von Urinöstrogen

Der Urin einer normalen Frau wird in jeder Periode ihres Menstruationszyklus gesammelt. Die Probe wird auf das 5-, 10-, 20-, 40- und 80-fache in Salzlösung verdünnt. 0,1 ral der Verdünnungen werden in Ampullen mit runden Böden eingefüllt. Die gemäß D) hergestellten Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten Blutzellen werden mit 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die ganzen Mengen dieser Suspension werden in die vorstehend erwähnten Ampullen mit Rundboden eingefüllt und gut vermischt. Es werden 0,1 ml der 5 ng/ml-Lösung des östron-(O-carboxymethyl)oxim-BSA, erhalten gemäß B), der gleichen Ampulle zugesetzt. Die Ampullen werden dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehengelassen. Man stellt eine Ringsedimentation der Blutzellen am Boden der Ampullen fest. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor.

In dem vorliegenden Beispiel ist die Empfindlichkeit auf 2 ng/ml eingestellt. Die Gehalte an Harnöstrogen in jeder Periode gehen aus der Spalte C) der Tabelle III hervor.

Tabelle III

•_Aj (B) Verdünnung, x-fach (C) Gehalte an Urin-

Menstruationszyklus ' östrogen (ng/tal)

x5 x10 x20 x40 x80

5. Tag Vorovula- ++ - - - 10

9. Tag tix^nsphase ₊₊ _ _ _ _ ₁₀

13. Tag Ovulation ++ ++ ++ ++ - 80

17. Tag Lutealphase ++ ++ - - - 20

23. Tag ++++-- - 20

- : Deutliche Agglutinierung (Hinweis, daß der Gehalt an Urin-

östrogen unterhalb der Empfindlichkeit liegt). ++: Agglutinierung vollständig inhibiert (Hinweis, daß die Menge an Urinöstrogen oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

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Beispiel 2

Messung des ürinöstrogens von schwangeren Frauen

A) Herstellung von Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisiertem Polystyrollatex.

Gemäß Beispiel 1 C) hergestellter intiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörper wird in glycingepufferter Salzlösung (GBS) auf einen pH von 8,2 zur Einstellung einer Konzentration von 0,08 % aufgelöst. 5 ml der erhaltenen Lösung werden mit 5 ml einer 10 %igen Polystyrollatexsuspension vermischt, worauf die Mischung bei 45°C während einer Zeitspanne von 1 Stunde bebrütet wird. Anschließend wird der Polystyrollatex durch Zentrifugieren abgetrennt und in 50 ml GBS, enthaltend 0,1 % BSA, suspendiert. Dabei erhält man Antiöstriol-1 6,17-dihemisuccinatantikörper-sensibilisierten PoIystyrollatex.

B) Messung des Ürinöstrogens

Drei Urinproben von schwangeren Frauen werden auf das 25-, 50-, 100- bzw. 200-fache verdünnt. Jeder verdünnte Urin wird auf ein Diapositivglas aufgetropft (jeder Tropfen entspricht einer Menge von 0,025 ml), wobei eine Titrationspipette verwendet wird. Ferner wird ein Tropfen GBS und ein Tropfen des Antiöstriol-16,17-dihemisuccinatantikörpersensibilisierten Polystyrollatex, erhalten gemäß A), auf dieses Diapositivglas unter Verwendung von Titrationspipetten aufgetropft. Diese drei Bestandteile werden auf dem Diapositivglas gut vermischt. Ein Tropfen einer 2 μg/ml-Lösung von östriol-16,17-dihemisuccinat-BSA, erhalten gemäß Beispiel 1 A), wird zugesetzt. Nach 3 Minuten dauerndem Vermischen wird das Agglutinationsmuster des Latex unter Beleuchtung mit dem bloßen Auge ermittelt.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle IV hervor. In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 200 ng/ml eingestellt.

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Die Gehalte an Harnöstrogen in jeder von schwangeren Frauen gewonnenen Probe gehen aus der Spalte (C) der Tabelle IV hervor. Die Beurteilung ist die gleiche wie im Falle der Tabelle III.

	(B)	Tabelle	IV	(C) Gehalte an Harnöstrogen, μg/ml
(A) Anzahl der	x25	Verdünnung,	x-fach	5 5 10
Urinproben	++ ++ ++	x50 x1	00 x200
1 2 3		++	_
Beispiel 3

Messung des Urinpregnandiols von schwangeren Frauen. A) Synthese von Pregnandiol-3-glucuronid-BSA

Pregnandiol-3-glucuronid wird unter Verwendung von Pregnandiol-3-glucuronid und BSA nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten.

B) Herstellung eines Antipregnandiol-3-glucuronidantikörpers

Antiserum wird aus einem Kaninchen erhalten, das mit dem gemäß A) nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise erhaltenen Pregnandiol-3-glucuronid-BSA immunisiert worden ist.

C) Herstellung des Antipregnandiol-3-glucuronidantikörpersensibilisierten carboxylierten Polystyrollatex.

Ein Antipregnandiol-3-glucuronidantikörper-sensibilisierter

carboxylierter Polystyrollatex wird nach der in Beispiel 2 A) beschriebenen Methode hergestellt.

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D) Messung des Urinpregnandiols

Unter Verwendung von drei verdünnten Urinproben von schwangeren Frauen, hergestellt gemäß Beispiel 2 B), sowie des gemäß A) und C) erhaltenen Pregnandiol-3-glucuronid-BSA sowie Antipregnandiol-3-glucuronidantikörper-sensibilisierten carboxylierten Polystyrollatex wird der Gehalt an Urinpregnandiol nach der in Beispiel 2 B) beschriebenen Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V zusammengefaßt.

In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 200 ng/ral eingestellt. Die Gehalte an Urinpregnandiol der schwangeren Frauen gehen aus Spalte (C) der Tabelle V hervor.

	(B)	Tabelle	V	(C) Gelaalte an Urin pregnandiol, pg/ml
(A) Anzahl der Urin proben	x25	Verdünnung	, x-fach	5 10 20
1 2 3	Z	x50 x100	x200
	Z «	-

Beurteilung:

- : Deutliche Agglutinierung (Hinweis, daß der Gehalt an Urinpregnandiol unterhalb der Empfindlichkeit liegt)

++ : Agglutinierung vollständig inhibiert (Hinweis, daß der Gehalt an Urinpregnandiol oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 4

Messung von Cortisol in Serum

A) Synthese von Cortisol-21-hemisuccinat-BSA

Unter Verwendung von Cortisol-21-hemisuccinat und BSA wird

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Cortisol-21-hemisuccinat-BSA nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten.

B) Synthese von östradiol-ITß-hemisuccinat-BSA

östradiol-17ß-hemisuccinat-BSA wird unter Verwendung von östradiol-ITß-hemisuccinat und BSA nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten.

C) Herstellung von Anticortisolantikörper

Antiserum wird aus einem Kaninchen erhalten, das mit dem gemäß A) nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise erhaltenen Cortisol-21-hemisuccinat-BSA immunisiert worden ist. Dieses Antiserum wird von dem östradiol-ITß-hemisuccinat-BSA, erhalten gemäß B), absorbiert und dann durch Aussalzen unter Verwendung von wasserfreiem Natriumsulfat gereinigt. Dabei erhalt man Anticortisolantikörper.

D) Herstellung von Anticortisolantikörper-sensibilisierten Blutzellen.

Der gemäß C) erhaltene Anticortisolantikörper wird der in Beispiel 1 D) beschriebenen Methode unterzogen. Dabei erhält man Anticortisolantikörper-sensibilisierte Blutzellen.

E) Messung von Cortisol im Serum

Fünf Serumproben gesunder Männer werden auf 70⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten erhitzt und dann auf das 20-, 30-, 40-, 60- bzw. 80-fache in Salzlösung verdünnt. 0,1 ml des verdünnten Urins werden einer mit einem Rundboden versehenen Ampulle zugesetzt. Die gemäß D) hergestellten Anticortisolantikörper-sensibilisierten Blutzellen werden in 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die gesamten Mengen dieser Suspension werden zu der vorstehend erwähnten Ampulle mit rundem Boden zugesetzt und gründlich vermischt. Dann werden

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0,1 ml einer 10 ng/ml-Lösung des gemäß A) erhaltenen Cortisol-21-hemisuccinat-BSA in die gleiche Ampulle eingefüllt. Die Ampullen werden dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehengelassen. Man stellt eine Ringsedimentation von Blutzellen am Boden der Ampullen fest. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VI hervor.

In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 3 ng/ml eingestellt. Die Mengen an Cortisol in jedem Serum gehen aus Spalte (C) der Tabelle VI hervor.

	(B)	Tabelle VI	_	(C) Gehalte an Cor tisol im Serum, ng/ml
(A) Anzahl der Serum proben	x20	Verdünnung, x-fach	++ 4+·	90
1	++	x30 x40 x60 x80	++ - - -	60
2	++	++ - - -		60
3	++	_ _ _	120
4	++	90
5	++

Bewertung:

- : Deutliche Agglutinierung (Hinweis, daß der Gehalt an Cortisol in dem Serum unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

++ : Agglutinierung vollständig inhibiert (Hinweis, daß der Gehalt an Cortisol in dem Serum oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 5

Messung von Serotonin

A) Synthese von Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA

50 mg DL-p-Aminophenylalanin werden in 5 ml destilliertem Wasser aufgelöst, worauf 50 mg BSA und 50 mg 1-Äthyl-3-(3-

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dimethylaminopropyD-carbodiimid der Lösung zugesetzt werden. Nach dem Rühren läßt man die Mischung über Nacht stehen. Der Reaktant wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf einen pH von 1,5 eingestellt. Anschließend werden 100 mg Natriumnitrit in 1 ml destilliertem Wasser sowie 50 mg Ammoniumsulfamat in destilliertem Wasser zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird auf einen pH von 8,0 eingestellt. Nach der Zugabe von 10 ml einer 0,1m Boratpufferlösung, die 100 mg Creatininsulfat von Serotonin enthält, zu der Reaktionsmischung wird diese über Nacht an einem kalten dunklen Platz gerührt. Man erhält Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA durch Dialyse gegen destilliertes Wasser.

B) Herstellung von Antiserotoninantikörper

250 μg Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA in 0,5 ml Salzlösung wird mit einem gleichen Volumen eines vollständigen Freund'sehen Adjuvanses emulgiert. Unter Anwendung der in Beispiel 1 C) beschriebenen Methode wird das Antiserum erhalten. DiesesAntiserum wird durch DL-p-Aminophenylalanin-BSA absorbiert, d. h. es handelt sich um ein Zwischenprodukt bei der Synthese von Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA gemäß A), und durch Aussalzen unter Verwendung von wasserfreiem Natriumsulfat zur Gewinnung von Antiserotoninantikörper gereinigt.

C) Herstellung von Antiserotoninantikörper-sensibilisierten Blutzellen.

Unter Verwendung des gemäß C) erhaltenen Antiserotoninantikörpers werden Antiserotoninantikörper-sensibilisierte Blutzellen nach der in Beispiel 1 D) beschriebenen Weise hergestellt.

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D) Messung von Serotonin

Serononin (Produkt der Wako-junyaku K.K.) wird in einer Salzlösung sowie in Urin ohne Serotonin in verschiedenen Konzentrationen, wie sie in der Tabelle VII zusammengefaßt sind, aufgelöst. 0,1 ml einer jeden Lösung wird in eine mit einem runden Boden versehene Ampulle eingefüllt. Die gemäß C) hergestellten Antiserotoninantikörper-sensibilisierten Blutzellen werden mit 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die Gesamtmengen dieser Suspension werden der vorstehend erwähnten Ampulle mit rundem Boden zugesetzt und gut vermischt. Dann wird 0,1 ml einer 50 ng/ml-Lösung von Serotonin-p-aminophenylalanin-BSA, erhalten gemäß A), der gleichen Ampulle zugesetzt. Die Ampullen läßt man dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehen. Man stellt eine Ringsedimentation von Blutzellen am Boden der Ampullen fest. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.

Die Empfindlichkeit beträgt in diesem Beispiel 50 ng/ml und bleibt unbeeinflußt durch den Uringehalt stabil.

Tabelle VII

(A) Serotonxnverdünnungs- (B) Serotoninkonzentration,pg/ml

mittel

0 0,025 0,05 0,10 0,20

Salzlösung - ■ - ++ 4+ ++

Urin ohne Serotonin --++++ ++

Beurteilung:

- : Deutliche Agglutinierung (Hinweis, daß der Gehalt an

Serotonin unterhalb der Empfindlichkeit liegt). ++ : Agglutinierung vollständig inhibiert (Hinweis, daß der Gehalt an Serotonin oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

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Beispiel 6

Messung von luteinisierendem Hormon-freisetzendem Hormon.

A) Synthese von luteinisierendem Hormon-freisetzendem Hormon-RSA.

Eine Lösung von 40 mg eines luteinisierenden Hormon-freisetzenden Hormons (LH-RH) in 1 ml einer Salzlösung wird mit 1 ml einer 5 %igen RSA-Lösung vermischt. 1 ml einer 50 %igen Pyridinlösung von 200 mg 1-Cyclohexy 1-3-/2-ItIOrPhO-liny1-(4)-äthy17-carbodiimidmethoxy-p-toluolsulfonat wird dieser Mischung zugesetzt, worauf 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt wird. LH-RH-RSA wird durch Entsalzen mit Gelfiltration (Sephadex G-25) und dann durch Dialyse gegen PBS erhalten.

B) Herstellung von Anti-LH-RH-Antikörper

20 mg LH-RH werden in 1 ml einer Salzlösung aufgelöst. 4 ml einer 50 %igen Polyvinylpyrrolidons in der Salzlösung wird der Lösung zugesetzt, worauf 2 Stunden lang gerührt wird. Nach dem Rühren wird die Mischung mit 5 ml eines vollständigen Freund'sehen Adjuvanses emulgiert. Nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Arbeitsweise erhält man Anti-LH-RH-Antikörper .

C) Herstellung von Anti-LH-RH-Antikörper-sensibilisierten Blutzellen.

Unter Einsatz des gemäß B) erhaltenen Anti-LH-RH-Antikörpers werden Anti-LH-RH-Antikörper-sensibilisierte Blutzellen nach dem in Beispiel 1 D) beschriebenen Verfahren hergestellt.

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D) Messung von LH-RH im Blut.

Die Konzentration von LH-RH im Blut eines Patienten mit einem schlecht funktionierenden Hypothalamo-hypophysialsystem, der intravenös mit 100 μg LH-RH gespritzt worden ist, wird gemessen. Dieses Serum wird vor der Injektion gesammelt und 2, 5, 10/30 und 60 Minuten nach der Injektion auf das 20-, 30-, 40-, 50- bzw. 100-fache verdünnt. 0,1 ml einer jeden verdünnten Lösung werden in eine mit einem runden Boden versehene Ampulle eingefüllt. Die Anti-LH-RH-Antikörper-sensibilisierten Blutzellen, die gemäß C) hergestellt worden sind, werden mit 0,3 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die gesamten Mengen dieser Suspension werden in die vorstehend erwähnte Ampulle mit rundem Boden eingefüllt und gut vermischt. Dann werden 0,1 ml einer 5 ng/ml-PBS-Lösung von LH-RH-RSA, erhalten gemäß A) in die gleiche Ampulle eingefüllt. Die Ampullen werden dann während einer Zeitspanne von 2 Stunden ohne Rühren stehengelassen. Am Boden der Ampullen wird ein Ring aus sedimentierten Blutzellen festgestellt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle VIII hervor. In diesem Beispiel ist die Empfindlichkeit auf 1 ng/ml eingestellt, der LH-RH-Gehalt in jedem Serum geht aus der Spalte (C) der Tabelle VIII hervor.

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Tabelle VIII

(A) Untersuchtes Serum (B) Verdünnung, x-fach (C) Gehalte an LH-

x20 x30 x40 x50 x100 ¹^ ^{m Serum}'

ng/ml

Vor der Injektion von IH-RH - - - - - weniger als 20 2 Minuten nach der Injektion ++ ++ -H- - 40 5 Minuten -H- - 20

10 Minuten - - - - weniger als 20

30 Minuten - - - - - weniger als 20

60 Minuten - - weniger als 20

Beurteilung:

- : Deutliche Agglutinierung (Hinweis, daß der Gehalt an IH-RH unterhalb

der Empfindlichkeit liegt).
-H- : Agglutinierung vollständig inhibiert (Hinweis, daß der Gehalt an IH-RH oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

Beispiel 7

Messung von Diphenylhydantoin

A) Synthese von 5- (p-CarboxymethoxyphenyD-5-phenylhydantoin

400 mg 5-(p-Hydroxyphenyl)-5-phenylhydantoin in 4 ml absolutem Äthanol werden mit 140 mg Chloressigsäure in 3,5 ml 1n Kaliumhydroxid/Äthanol-Lösung vermischt, worauf die Mischung 22 Stunden lang am Rückfluß gehalten wird. Nach dem Abkühlen wird die Mischung mit 0,33 ml 5n Chlorwasserstoff säure angesäuert, worauf zur Entfernung von Äthanol destilliert wird. Dann werden 20 ml destilliertes Wasser zugesetzt, und der pH wird auf 1,0 bis 2,0 mit 5n Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die erhaltene Lösung wird 4 mal mit 5 ml Äthylacetat extrahiert und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dann wird sie in 2 ml Chloroform/Methanol (2:1, Volumen/Volumen) aufgelöst. Die Lösung wird durch eine 2,0 χ 40 cm Kieselgelsäule fraktioniert. Die zweite Fraktion· wird gesammelt.

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5-(p-Carboxymethoxyphenyl)-5-phenylhydantoin (CMPPH) wird durch Eindampfen der gesammelten zweiten Fraktion erhalten und auf Calciumchlorid unter Vakuum getrocknet.

B) Synthese von CMPPH-BGG

CMPPH-BGG wird unter Verwendung von CMPPH und BGG nach der in Beispiel 1 A) beschriebenen Weise erhalten. Dabei wird BGG für die Synthese dreimal soviel verbraucht wie BSA gemäß 1 A) .

C) Herstellung von Anti-CMPPH-Antikörper.

Unter Verwendung von CMPPH-BGG, erhalten gemäß B), wird Anti-CMPPH-Antikörper nach der in Beispiel 1 C) beschriebenen Weise erhalten.

D) Herstellung von Anti-CMPPH-Antikörper-sensibilisierten Blutzellen.

Anti-CMPPH-Antikörper-sensibilisierte Blutzellen werden nach der in Beispiel 1 D) beschriebenen Methode hergestellt.

E) Herstellung von CMPPH-BGG-sensibilisierten Blutzellen.

Unter Verwendung von CMPPH-BGG anstelle von Anti-CMPPH-Antikörper werden CMPPH-BGG-sensibilisierte Blutzellen nach dem in Beispiel 1 D) beschriebenen Verfahren erhalten.

F) Messung von Diphenylhydantoin in Blut.

Die Gehalte von Diphenylhydantoin in dem Serum eines Patienten, an den Diphenylhydantoin verabreicht worden ist, werden gemessen. Zur Messung wird dieses Serum auf das 10-, 20-, 40-, 60- und 80-fache verdünnt. 0,1 ml der jeweils verdünnten Lösungen werden in eine Ampulle mit Rundkolben eingefüllt. Die Anti-CMPPH-Antikörper-sensibilisierten Blut-

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zellen, hergestellt gemäß D), werden mit 0,2 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die gesamten Mengen dieser Suspension werden der vorstehend erwähnten Ampulle mit rundem Boden zugesetzt und gut vermischt. Dann werden die gemäß E) hergestellten CMPPH-BGG-sensibilisierten Blutzellen mit 0,2 ml PBS pro Ampulle suspendiert. Die Gesamtmengen dieser Suspension werden ebenfalls der mit rundem Boden versehenen Ampulle zugesetzt und gut vermischt. Die Ampullen werden dann 2 Stunden lang ohne Rühren stehengelassen. Eine Ringsedimentation von Blutzellen wird am Boden der Ampullen beobachtet. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle IX hervor.

In diesem Beispiel wird die Empfindlichkeit auf 1 μg/ml eingestellt. Die Gehalte an Dipheny!hydantoin in jedem Serum gehen aus Spalte (C) der Tabelle IX hervor.

Tabelle IX

(A) Anzahl^derSerum- (B) Verdünnung, x-fach _(c) _QAäLta ^ _Diphe_

^F XIO x20 x40 x60 _x80 "Y¹*^^ im Serum,

μ9/ΐη1

1 + weniger als

3 + + ___ 10-20

4 - - - - weniger als

5 +++++++_ 40-60

Beurteilung:

-, + : Deutliche Agglutinierung oder undeutliche Agglutinierung (Hinweis, daß der Gehalt an Diphenylhydantoin im Serum unterhalb der Empfindlichkeit liegt).

+, ++: Agglutinierung vollständig inhibiert (Hinweis, daß der Gehalt an Diphenylhydantoin oberhalb der Empfindlichkeit liegt).

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Claims

MÜLLER-BORE · DEUFEL · SCHÖN !IERTEL

PATENTANWÄLTE Z743AA5

DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALT VON 1927 - 1975) DR. PAUL DEUFEL. DIPL-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS.

M 2518

MOCHIDA SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, 7-banchi, 1-chome, Yotsuya, Shinjuku^ku, Tokyo, Japan

Immunchemisches Haptenmeßverfahren.

Patentansprüche

Immunchemisches Haptenmeßverfahren, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Antikörper-sensibilisierten Teilchens, das durch Sensibilisierung des Antikörpers zu dem zu messenden Hapten (nachstehend als "ANTIKÖRPER" bezeichnet") zu feinen Teilchen und Haptenträgerkonjugat (nachfolgend als "ANTIGEN" bezeichnet) hergestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das ANTIGEN zu feinen Teilchen sensibilisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ·

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S JlCXCflEN SS ■ SIEBERTSTB. 4 · POSTFACH 880720 ■ KABEL: MUXBOPAT · TEL. (080) 474009-TELSX 3-24289

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das Hapten des ANTIGENS mit ANTIKÖRPER reagieren kann.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die feinen Teilchen aus Blutzellen, einem hochmolekularen Latex, Kaolinit, Bentonit oder Aktivkohle bestehen.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der ANTIKÖRPER nur aus Haptenantikörper besteht, der durch Absorption und Entfernung von Antikörper mit Ausnahme von Haptenantikörper aus Antiserum erzeugt wird, das durch Immunisieren eines Tieren mit ANTIGEN erhalten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Rinderserumalbumin, Menschenserumalbumin, Rinder- /'-globulin, Tetanustoxoid, ein Glutaminsäure/ Lyson/Tyrosin-Copolymeres oder ein pneumokokkales PoIysaccharid verwendet wird.
7. Reagens zur Durchführung einer immunchemischen Messung, gekennzeichnet durch Antikörper-sensibilisierte Teilchen, die durch Sensibilisierung von ANTIKÖRPER zu feinen Teilchen und ANTIGEN hergestellt werden.
8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ANTI GEN zu feinen Teilchen sensibilisiert ist.
9. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das ANTIGEN-Hapten ein Hapten ist, das mit ANTIKÖRPERN zu rea gieren vermag.
10. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die feinen Teilchen aus Blutzellen, Latex mit hohem Molekular gewicht, Kaolinit, Bentonit oder Aktivkohle bestehen.
11. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der ANTIKÖRPER nur aus Haptenantikörper besteht, der durch

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Absorption und Entfernung von Antikörper, mit Ausnahme
von Haptenantikörper, aus Antiserum erzeugt wird, das
durch Immunisieren eines Tiers mit ANTIGEN erhalten wird.
12. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger aus Rinderserumalbumin, Menschenserumalbumin,
Rinder-T-globulin, Tetanustoxoid, einem Glutaminsäure/ Lysin/Tyrosin-Copolymeren oder aus einem pneumokokkalen Polysaccharid bestehen.
13. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die ANTIKÖRPER-sensibilisierten Teilchen gefriergetrocknet
sind.
14. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das ANTIGEN gefriergetrocknet ist.
15. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messenden Haptene aus folgenden Haptenen bestehen:
Androgenen, östrogenen, Progestogenen, Adrenocortikoidhormonen, Thyroidhormonen, physiologisch aktiven Aminen, wie Epinephrin, Histamin oder Serotonin, sowie Arzneimittel, wie Morhpin, luteinisierende Hormone freisetzende
Hormone, Diphenylhydantoxn sowie ihre Metaboliten.

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