PT1003861E - Proteínas de membrana de células de mamíferos;reagentes relacionados - Google Patents

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ΡΕ1003861 1 DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS; REAGENTES RELACIONADOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção é referente a vários reagentes biológicos que são úteis na modulação de uma resposta celular mamífera, por exemplo, na sinalização imune. Mais particularmente, ela está direccionada para as composições e métodos úteis nas interacções imunológicas das células, por exemplo, entre as células B e T, NK, etc.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 componente circulante do sistema circulatório de mamíferos compreende vários tipos de células, incluindo as células sanguíneas vermelhas e brancas das linhagens de células eritróide e mielóide. Ver, por exemplo, Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2d ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of

Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA.; e Paul (ed. 1993) Fundamental Immunoloqy (3d ed.) Raven Press, N.Y. A activação das células T quiescentes é fundamental para a maioria das respostas imunes e permite a 2 ΡΕ1003861 estas células exercer as suas capacidades regulatórias ou efectoras. Ver Paul (ed; 1993 ) Fundamental Immunoloqy 3d ed., Raven Press, N.Y. O aumento da adesão entre as células T e as células apresentadoras de antigénio (APC) ou outras formas de estimulação primária, por exemplo, anticorpos monoclonais imobilizados (mAb), pode potenciar os sinais do receptor da célula T. A activação e expansão das células T depende do compromisso do receptor da célula T (TCR) e dos sinais co-estimuladores fornecidos pelas célula acessórias. Ver, por exemplo, Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5: 361-367; Bierer and Hahn (1993) Semin. Immunol. 5: 249-261; June, et al. (1990) Immunol. Today 11: 211-216; e Jenkins (1994) Immunity 1: 443-446. Uma maior, e bem estudada, interacção co-estimuladora para células T envolve quer CD2 8 ou CTLA-4 em células T quer com B7 ou B7 0 (Jenkins (1994) Immunity 1: 443-446). Estudos recentes em ratos deficientes em CD28 (Shahinian, et al. (1993) Science 261: 609-612; Green, et al. (1994) Immunity 1: 501-508) e em ratos transgénicos que expressam a imunoglobulina CTLA-4 (Ronchese, et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 809-817) revelaram deficiências em algumas respostas de células T embora estes ratos tenham repostas imunes primárias normais e respostas CTL normais para o virus da coriomeningite linfocitária e para o virus da estomatite vesicular. Como resultado, ambos os estudos concluíram que outras moléculas co-estimuladoras devem estar a exercer a função de célula T. No entanto, a identificação destas moléculas que medeiam sinais co-estimuladores distintos tem sido difícil.

Além disso, a sinalização negativa e positiva 3 ΡΕ1003861 similar ocorre com os linfócitos (LIRs); células assassinas naturais (KIRs), e outros tipos de células (ILT, e CD94). Ver, por exemplo, Moretta, et al. (1996) Ann. Rev. Immunol. 14: 619-648; Malissen (1996) Nature 384: 518-519; Scharenberg and Kinet (1996) Cell 87: 961-964; Colonna, et al. (1995) Science 268: 405-408; Wagtmann, et al. (1995) Immunity 2: 439-449; D'Andrea, et al. (1995) J. Immunol. 155: 2306-2310; Samaridis and Colonna (1997) Eur. J. Immunol. 27: 660-665; Aramburu, et al. (1990) J. Immunol. 144: 3238-3247; Aramburu, et al. (1991) J. Immunol. 147: 714-721; e Rubio, et al. (1993) J. Immunol. 151: 1312-1321. A incapacidade de modular os sinais da activação impede o controlo do desenvolvimento inapropriado ou das respostas fisiológicas no sistema imune. A presente invenção fornece pelo menos uma molécula co-estimuladora alternativa, agonistas e antagonistas as quais serão úteis na modulação de inúmeras resposta imunes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na descoberta de genes específicos envolvidos na sinalização celular. Foram identificados vários genes que interagem com formas genéticas cuja função não é conhecida. Estas são a Proteína Acessória DNAX, 12 kD (DAP12); a Proteína Acessória DNAX, 10 kD (DAP10); e outra proteína acessória associada, a MDL-1. 4 ΡΕ1003861

Formas de realização particulares da invenção incluem um polipeptídeo substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12 ou 14. Como descrito aqui a SEQ ID NO: é 2 ou 6, e o polipeptídeo: é uma sequência natural DAP12 maturada da Tabela 1; compreende um motivo ITAM; ou compreende um resíduo carregado num domínio transmembranar; ou a SEQ ID NO: é 8 ou 10, e o polipeptídeo: é uma sequência natural DAP10 maturada da Tabela 2; compreende um motivo ITIM; ou compreende um resíduo carregado num domínio transmembranar. De acordo com a presente invenção a SEQ ID NO: é 12 ou 14, e o polipeptídeo: é uma sequência natural MDL-1 maturada da Tabela 3; ou compreende um motivo ITAM; ou compreende um resíduo carregado num domínio transmembranar; ou a SEQ ID NO: é 8 ou 10, e o polipeptídeo: é uma sequência natural DAP10 maturada da Tabela 2; ou compreende um resíduo carregado num domínio transmembranar. A descoberta inclui um determinado peptídeo que: compreende uma pluralidade de comprimentos; é uma variante alélica natural de DAP12; é uma variante alélica natural de DAP10; é uma variante alélica natural de MDL-1; possui um comprimento de pelo menos 30 aminoácidos; é um polipeptídeo sintético; está acoplado a uma estrutura sólida; está conjugado com outra metade químico; é uma substituição de 5 vezes ou menos da sequência natural; ou é uma variante de delecção ou de inserção a partir de uma sequência natural. Está também descrita uma composição compreendendo: um polipeptídeo estéril de DAP12; o polipeptídeo DAP12 e um veículo, em que o veículo é: um composto aquoso, incluindo a água, 5 ΡΕ1003861 solução salina, e/ou tampão; e/ou formulado para administração oral, rectal, nasal, tópica, ou parenteral; ou um polipeptídeo estéril de DAP10; ou o polipeptideo DAP10 e um veiculo, em que o veiculo é: um composto aquoso, incluindo a água, solução salina, e/ou tampão; e/ou formulado para administração oral, rectal, nasal, tópica, ou parenteral. A presente invenção refere-se a um polipeptídeo MDL-1 estéril. Numa forma de realização a invenção fornece o polipeptídeo MDL-1 e um veículo, em que o veículo é: um composto aquoso, incluindo a água, solução salina, e/ou tampão; e/ou formulado para administração oral, rectal, nasal, tópica, ou parenteral. É fornecida um proteína de fusão, contendo tal polipeptídeo e: uma extremidade de detecção ou purificação, incluindo um peptídeo FLAG, His6, ou imunoglobulina, a β-galactosidase bacteriana, trpE, Proteína A, β-lactamase, alfa amilase, álcool desidrogenase, e factor de conjugação alfa da levedura; ou sequência de outra proteína de membrana.

Os estojos ("kits") são fornecidos contendo tal peptídeo e: um compartimento contendo o polipeptídeo, e/ou instruções para a utilização ou a disposição dos reagentes no Estoj o ("kit") . São também descritos componentes de ligação, compreendendo uma porção de ligação do antigénio ao anticorpo, que se liga especificamente a: um polipeptídeo 6 ΡΕ1003861 natural DAP12, em que o anticorpo: é criado contra um polipeptideo maturado da Tabela 1/ é imunoseleccionado; é um anticorpo policlonal; liga-se a uma DAP12 desnaturada; exibe um kD para o antigénio de pelo menos 30 μΜ; está acoplado a um substrato sólido, incluindo um leito ou uma membrana de plástico; encontra-se numa composição estéril; ou é marcado detectavelmente, incluindo uma marcação radioactiva ou fluorescente; ou um polipeptideo natural DAP10, em que o anticorpo: é criado contra um polipeptideo maturado da Tabela 2; é imunoseleccionado; é um anticorpo policlonal; liga-se a uma DAP10 desnaturada; exibe um kD para o antigénio de pelo menos 30 μΜ; está acoplado a um substrato sólido, incluindo um leito ou uma membrana de plástico; encontra-se numa composição estéril; ou é marcado detectavelmente, incluindo uma marcação radioactiva ou fluorescente. A presente invenção fornece um anticorpo, ou fragmento de ligação dai resultante que se liga especi-ficamente a MDL-1, por exemplo, liga-se a um polipeptideo natural MDL-1, em que o anticorpo: é criado contra um polipeptideo maturado da Tabela 3; é imunoseleccionado; é um anticorpo policlonal; liga-se a uma MDL-1 desnaturada; exibe um kD para o antigénio de pelo menos 30 μΜ; está acoplado a um substrato sólido, incluindo um leito ou uma membrana de plástico; encontra-se numa composição estéril; ou é marcado detectavelmente, incluindo uma marcação radioactiva ou fluorescente. São fornecidos vários estojos ("kits"), por exemplo, compreendendo o composto de ligação, e: um compartimento compreendendo o composto de ligação; e/ou instruções para utilização ou disposição de reagentes 7 ΡΕ1003861 no estojo ("kit")· Formas de realização adicionais uma composição compreendendo: um composto de ligação estéril, ou o composto de ligação e um veiculo, em que o veiculo é: um composto aquoso, incluindo a água, solução salina, e/ou tampão; e/ou formulado para administração oral, rectal, nasal, tópica, ou parenteral.

As formas de realização de ácido nucleico incluem um ácido nucleico isolado ou recombinante que codifica esses polipeptideos, em que o ácido nucleico codifica uma sequência de peptídeo antigénica da Tabela 3. Formas de realização preferíveis incluem o referido ácido nucleico, que codifica uma pluralidade de sequências de peptídeo antigénicas da tabela. Outros ácidos nucleicos incluem um que: é um vector de expressão; compreende adicionalmente uma origem de replicação; é de origem natural; compreende uma marcação detectável; compreende uma sequência de nucleótidos sintética; é menor do que 6 kb, preferencialmente menos do que 3 kb; é de origem mamífera, incluindo um primata ou roedor; ou compreende uma sequência codificante natural de cadeia completa. É também descrita uma sonda de hibridização para um gene que codifica a DAP12, a DAP10, ou a MDL-1; ou um iniciador de PCR, um produto de PCR, ou um iniciador de mutagénese.

Outros ácidos nucleicos aqui descritos hibridizam sob condições de lavagem restringentes de pelo menos 50 °C, menos do que 400 mM de sal, e formamida a 50% para: SEQ ID 8 ΡΕ1003861 NO: 1 ou 5; SEQ ID NO: 7 ou 9; ou SEQ ID NO: 11 ou 13.. A invenção fornece uma célula ou tecido contendo o referido ácido nucleico recombinante, incluindo onde a célula é: uma célula procariótica; uma célula eucariótica; uma célula bacteriana; uma célula de levedura; uma célula de insecto; uma célula mamífera; uma célula de rato; uma célula de primata; ou uma célula humana. Certos estojos ("kits") incluem um contendo o ácido nucleico, e: um compartimento contendo o ácido nucleico; e/ou instruções para a utilização ou a disposição dos reagentes no estojo ("kit"). Os ácidos nucleicos aqui descritos incluem alguns que: exibem identidade sobre uma cadeia de pelo menos cerca de 30 nucleótidos para uma DAP12 de primata; exibem identidade sobre uma cadeia de pelo menos cerca de 30 nucleótidos para uma DAP10 de primata; exibem identidade sobre uma cadeia de pelo menos cerca de 30 nucleótidos para uma MDL-1 de primata; e/ou codifica adicionalmente um receptor KIR, ILT/MIR ou CD94/NKG2C. Formas de realização preferenciais incluem aquelas em que: as condições de lavagem são de 60 °C e/ou sal a 200 mM ; ou a cadeia é de pelo menos 55 nucleótidos.

Estão também descritos métodos de modulação fisiológica ou o desenvolvimento de uma célula ou de células de cultura de tecidos compreendendo o contacto da célula com um agonista ou um antagonista de uma DAP12, DAP10, ou MDL-1. São também descritos métodos de rastreio de um composto que bloqueia a interacção de uma DAP12 ou DAP10 com um receptor KIR, ILT/MIR, ou CD94/NKG2C, 9 ΡΕ1003861 compreendendo o contacto do composto com DAP12 ou DAP10 na presença de um receptor. A invenção fornece também métodos in vitro para a modulação da sinalização imune de uma célula ou de células de culturas de tecido compreendendo o contacto da referida célula com um polipeptídeo substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12 ou com um anticorpo que se liga especificamente ao referido polipeptideo, ou um fragmento de ligação dai resultante. A invenção fornece adicionalmente um polipeptideo substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12 ou um anticorpo que se liga especificamente ao referido polipeptideo, ou um fragmento de ligação dai resultante para utilização na modulação da sinalização imune de uma célula ou células de cultura de tecido. A invenção fornece também a utilização de um polipeptideo substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12 ou um anticorpo que se liga especificamente ao referido polipeptideo, ou um fragmento de ligação dai resultante, ou a manufactura de um fármaco para a modulação da sinalização imune de uma célula ou células de cultura de tecido. A invenção fornece adicionalmente uma formulação 10 ΡΕ1003861 farmacêutica compreendendo (a) um polipeptídeo substancialmente puro ou recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12/ ou (b) um anticorpo que se liga especificamente ao referido polipeptídeo, ou um fragmento de ligação daí resultante, e um veículo farmaceuticamente aceitável daí resultante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS I. Geral A presente aplicação descreve as sequência de aminoácidos e as sequências de DNA de proteínas de mamíferos que exibem propriedades das moléculas acessórias para os antigénios de activação celular. Uma proteína é designada por Proteína de Activação DNAX, 12 kD (DAP12). A sequência de primata descrita aqui foi obtida a partir de sequências identificadas em várias bases de dados. Sequências similares para proteínas noutras espécies mamíferas devem estar também disponíveis, incluindo dos roedores. As descrições em baixo estão direccionadas, para propósitos de exemplo, para o alelo humano de DAP12 natural descrito, mas é igualmente aplicável a variantes alélicas e/ou polimórficas, por exemplo, a partir de outros indivíduos, bem como de variantes processadas, por exemplo, formas naturais.

Uma segunda proteína é designada por proteína de Activação DNAX, 10 kD (DAP10), que exibe muitas caracterís- 11 ΡΕ1003861 ticas estruturais e biológicas similares. Uma terceira proteina associa-se com a DAP12, e possivelmente com a DAP10, e é designada por Lectina-1 associada à DAP12 Mielóide (MDL-1).

Estes genes irão permitir o isolamento de outros genes de primatas ou mamíferos que codificam proteínas com eles relacionadas, expandindo assim a família para além das formas de realização específicas descritas. 0 procedimento é amplamente descrito em baixo. A Proteína de Activação DNAX 12 kD (DAP12) é assim designada devido ás suas características estruturais, e à sua presumível função. Certos receptores da superfície celular não possuem funcionalidade intrínseca, os quais podem interagir hipoteticamente com outra proteína parceira, sugerindo ser uma proteína de 12 kD. O mecanismo da sinalização pode envolver um sinal ITAM. A DAP12 foi identificada a partir de sequências de bases de dados assentes na relação hipotetizada com CD3 (ver Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158: 5083-5086), a presença de uma sequência ITIM (ver Thomas (1995) J. Exp. Med. 181: 1953-1956), certas predições de tamanho (ver Olcese; e Takase, et al. (1997) J. Immunol. 159: 741-747), e outras características. Em particular, o domínio transmembranar foi hipotetizado para conter um resíduo carregado, o qual pode permitir uma ponte salina com os segmentos transmembranares correspondentes dos seus pre- 12 ΡΕ1003861 sumíveis parceiros receptores, KIR (moléculas inibitórias da morte celular), proteina CD94, e possivelmente outras proteínas similares. Ver Daeron, et al. (1995) Immunity 3: 635-646.

De facto, muitas das moléculas receptoras conhecidas KIR, MIR, ILT, e CD94/NKG2 podem actuar realmente com uma proteína acessória que faça parte do complexo receptor funcional. Ver Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158: 5083-5086; e Takase, et al. (1997) J. Immunol. 159: 741-747. Assim, são aqui descritas, formas purificadas dos receptores de sinalização funcionais, por exemplo, a DAP12 e/ou a DAP10 com a outra subunidade. Ver, por exemplo, Daeron, et al. (1995) Immunity 3: 635-646. Assim, uma combinação de DAP12 ou de DAP10 com outro receptor forma uma complexo funcional numa célula a qual é um complexo receptor para um contra-receptor ou liqando para o complexo. A DAP10 foi parcialmente identificada pela sua homologia com a DAP12, e outras características. Em particular, em contraste com a DAP12 que exibe um motivo de activação ITAM, a DAP10 exibe um motivo inibitório ITIM. A MDL-1 foi identificada pela sua associação funcional com a DAP12.

Além disso, a interacção funcional entre, por exemplo, a DAP12 ou a DAP10, e o seu receptor acessório 13 ΡΕ1003861 pode permitir a utilização da combinação estrutural em receptores o que normalmente não se encontra numa forma receptora truncada. Assim, o mecanismo de sinalização através de tais proteínas acessórias tais como a DAP12 e a DAP10 permite conjugações interessantes de outros complexos receptores como o KIR, por exemplo, com os tipos de receptores KIR, MIR, ILT, e CD94 NKG2. As formas truncadas de receptores intactos podem ser construídas as quais interagem com uma DAP12 ou DAP10 para formar um complexo de sinalização funcional.

As formas de primatas e de roedores exibem identidade das sequências significativa quando alinhadas. Ver, por exemplo, as Tabelas 1, 2, e 3. Outros genes exibem identidade muito mais baixa sobre toda a região codificante maturada, embora alguns exibam maior identidade em segmentos particulares. II. DAP e MDL Purificadas A Tabela 1 descreve ambas as sequências de nucleótidos do cDNA e a sequência de aminoácidos correspondente para as formas de realização de DAP12. A sequência de nucleótidos de primata corresponde a SEQ ID NO: 1; a sequência de aminoácidos corresponde à SEQ ID NO: 2. A sequência sinal parece decorrer desde a met(-26) à gln(-l) ou à alai; a proteína maturada deve decorrer desde cerca da alai (ou gln2), o domínio extracelular desde cerca de alai 14 ΡΕ1003861 a prol4; o domínio extracelular contém duas cisteínas em 7 e 9, as quais provavelmente permitem as ligações dissulfureto às proteínas acessórias homotípicas ou heterotípicas adicionais; a região transmembranar decorre desde cerca de glil5 ou vall6 até cerca de gli39; e um motivo ΙΤΔΜ desde a tir65 à leu79 (YxxL-6/8x-YxxL). A EST LVA03A foi identificada e utilizada para extrair outras sequências sobrepostas. Ver também as ESTs Humanas no Genbank que fazem parte da DAP12 humana; algumas mas não todas, incluem os Números de Acesso no Genbank AA481924; H39980; W60940; N41026; R49793; W60864; W92376; H12338; T52100; AA480109; H12392; W74783; e T55959.

Tabela 1: cDNA de DAP12 de primata identificado a partir de biblioteca de cDNA humana. SEQ ID NO: 1 e 2. Ponto de clivagem do sinal efectivo pode ser ligeiramente diferente do indicado, por exemplo, pode estar entre alai e gln2. ATG GGG GGA CTT GAA CCC TGC AGC AGP CTC CTO CTC CTC CGT CTC CTG 43 ífee bly Gly teu Glw Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pso Leu Leu -26 -25 “20 -15 ÇTG GCT GTA ÃGT SGT CTC CGT CCf Gf€ CAG 6CC C&G OCX CÂG AGC GftT 56

Leu Ala Vai Ser Oly Leu Arg Iro Vai Gin Ala Gin Ala Gin Ser Asp -10 -5 1 5

TGC MT TGC TCT kCQ OTG .AGC CCG QTG CTG GCA GGG ATC <3TG ATG

Cys Ser Cys Ser Thr Vai Ser Fr© Sly Vai Leu Ala Gly 11® Vai Ket 10 IS 20 15 ΡΕ1003861 Q&M 192 GftC CTG 0ǧ ACA GTG CTC ATT GCC CTG GCC GTG TAC TTC CTG Qly Asp teu 25 ¥ál Thr Vai teu 30 11· Alá L«u Ala Vôl 35 Tyr The fceu QOC- 240 CSC? CTG CTC CCT CSG GGG CGA GGG GCT gcg GAG GCA GOG ACC CGG Giy Arg 40 í#eti Vai Pre Arg Gly Arg 45 Gly Ala Ala Glu 50 Ala Ala Thr Arg AAA 2BS CÃG CGT ATC ACT GftG ACC GAG TCG CCT TAT CAG GAG CTC CAG GGT Lys BB Gin Arg lie Tte GXu 66 Thx Glu Ser Pro Tyr 65 Gin Glu heu Gin 70 CAÇ 336 AGG TCS GAT CTC TAC ACC GAC CTC ÀAC ACA CAG A0G CCS fAT TAC Gin Arg Ser Asp ¥al ?$ Tyr Ser Asp L&u A.gn S§ Thr Gin Arg Pre Tyjr' 65 Tyr ΆΑΆ TGA, 342

Lys

Sequência contig com regiões flanqueadoras não traduzidas (menos fiáveis; possíveis erros de sequência; SEQ ID NO: 3)

CTTÕCCTGGACSCTGeaCCACATCCCACCOGCCCTTACACTCTGSTGTCCAGCAeCATCCGGCTTC

ATGGG<^GAC?TGAACCCTGCAGCACGeTCCTGCTC£^hC€TCTCCTGCTGGCTGTAAGT?3GT€TC

O^CCTCTCCAQGCCCAGCKC^ÃGAGCGATm^AOTTGCTCmCGGTaRGCCCGGGCGTQei^CA

íX^ATCGT^m^AGACC^^C^^ACAGTGCTCArK^CCK^CCG^mC-rrCCTaSGCCQG

CTGGTCCCTCGÍK^CGAGG^CTGCGGAqGCAgcímCCX^GAAACAGCGTATCÂCTGASACCGAG

TCGCCT^ATC&GdAdeK^AGGGiPCAGÂqGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGàedeCG

TATTACAAA^AGCCCGAA^ATGACACTCAÚaAACATGATAaCTQQATCCÃGCCATmçTfSAAQC

OCAnCCTGCACCTCATl^AàCTCCTACCíJCqAmCAGACCCACAGAG^KSCCA^CCCrGaGAGACC

AGACCGCTCCtCAàTACTCTCCTAAAATAAACATGAAGCM^3AmAAAAAAA^MAAíg^CfeflG

GGGGGGGGCCCGGI^teCCftATTTGGoCCTAAAG

Tabela 1 (continuação): cDNAs de DAP12 de roedor, ver ESTs de rato dos números de Genbank AA24315; W91184; AA098506; AA138406; W88159; e W41142. Uma sequência consensus, com os espaços preenchidos, está perfeitamente dentro do nível dos peritos na técnica. Ver SEQ ID NO: 5 e 6. Ponto de clivagem do sinal pode estar em qualquer das extremidades. 16 ΡΕ1003861 ATS m GfQQ GCT CTS GÃG CCC vec TGG TGC CTf CTG TTC CTF CCT CTC CTC tset ~2β Gly -25 Ma Leu Gin fr© Ser -20 Trp Cys Leu Leu Phe -15 Leu pr© vai LSU CTG M ACT GTG GGA GGA TTA AGT CCC GTA CAG CCC CAG ÃCT GAC ACT TTC hm -10 Thr Vai Gly Gly Leu -5 Ser Fr© Vai Gin Ala 1 Gin Ser Asp Thr 5 Pbe CCA 144 AGA TOC SAC TGT TCT TCC CTG AGC CCT GGT GTA CTG GCT GGG ATT Pro Arg Cys Asç» 10 Cys Ser Ser vai Ser 15 Fr© Gly Vai Leu ALa Gly 20 Xie GTT 19.2 CTG GGT GAC TTG GTG TTG AC? CTG CTG ATT GCC CTG cot gtg TAC Vai Leu Gly Asp 25 Leu V&l Leu TLr Leu 30 Leu Ile Ala Léu 3S Ala Vai Tyr TCT 240 CTG CTG GTC TCC CG& GGT CAA G® ACA GCG GAA GGG ACC Ser Leu 40 Gly Arg Leu Vai Ser 45 Arg Gly Gin Gly Thr 50 Ala Glu Gly Thr CGG 288 AAA CAA CAC ATT GCT GÃG ACT GAG TCG CCT TAT CAG GAG CTT CAG Arg 55 Lys Gin Bis Ile Ala $0 Glu Thr Glu Ser Pro 65 Tyr Gin Glu Léll Gin 70 GGT 336 CAG AGA CCA GAA GTA mc ACT CAC CTC AAC ACA CAG AGG CAA TAT Gly Gin Arg Pr© GXu Vai 75 Tyr Ser Asp Leu Asn 80 Thr Gin Arg Gin 35 Tyr TAC ÂGA TGA 345

Tyr Arg

Alinhamento das sequências da proteína DAP12 de primata e roedor (SEQ ID NO: 2 e 4).

h HGGLSFCSEL LLLPLLLAYS GLRFVGAQA0 S--DCSCSTV SPGVLASIVM m MGALEP3&JCL LFLPVLLTVG GLSPVQAQSD TFPRCDCSSV SPGVLAGIVL h GDLYLTVI»IA LAWFLGRLV PKGKGAAEAA TFJCQRITETK SPWEtOSQE Sft GGLVLTLLIA IAVYSLGRLV SRGQGTAEG" TIOtQEIABTE SPYQELOGQR h m SDWSDUÍTQ RPYYK* PEWSDLKTQ RQYYR* 17 ΡΕ1003861 A Tabela 2 descreve ambas as sequências de nucleótidos do cDNA e a sequência de aminoácidos correspondente de ambos os qenes de DAP10 de humano e de rato. A sequência de nucleótidos para humanos corresponde a SEQ ID NO: 7; a sequência de aminoácidos corresponde à SEQ ID NO: 8. A sequência sinal parece decorrer desde a met(-18) à ala(-l); a proteina maturada deve decorrer desde cerca da qlnl, o dominio extracelular desde cerca de glnl a pro30; o dominio extracelular contém duas cisternas em 21 e 24, as quais provavelmente permitem as ligações dissulfureto às proteinas acessórias homotipicas ou heterotipicas adicionais; a região transmembranar decorre desde cerca de leu31 até val47, com um residuo carregado caracteristico correspondendo à asp39; e um motivo de interesse YxxM desde tir67 a met70, que é similar ao encontrado em CD28, CTLA-4, e CD19. Ver Tabela 2.

Similarmente, para a DAP12 de rato, a sequência sinal parece decorrer desde cerca de met(-18) a ser(-l); a proteina maturada deve decorrer desde cerca da glnl, o domínio extracelular desde cerca de glnl a prolô; o domínio extracelular contém duas cisteínas em 7 e 10, as quais provavelmente permitem as ligações dissulfureto às proteínas acessórias homotipicas ou heterotipicas adicionais; a região transmembranar decorre desde cerca de leul7 até val33, com um resíduo carregado caracteristico 18 ΡΕ1003861 correspondendo à asp25; e um motivo de interesse YxxM desde tir54 a met57, que é similar ao encontrado em CD28 e CTLA-4.

Tabela 2: cDNA de DAP10 de primata identificado a partir de biblioteca de cDNA humana. Ver SEQ ID NO: 7 e 8.

GTÇGACCTGG ACTTCTCTGG ACCACAGTCC TCTQCC&GAC CCCTGCCAGA CCCCAGTCCA 60

CC ATO ATC CAT CTG CGT CAC ATC CTC TTC CTC CTT TTG CTC CCA CTC 107

Het Ile His Leu Gly Uis Ile Leu Kte Leu Leu Leu Leu Pro Vai “18 “15 “10 ~§

GCT GCA GCT CAG ÂCG ACT CCA GGA G&G ASA TCA TCÃ CTC CCT GCC CTT

IBS

Ale Ale Ais. Gin. Thr Thr Pr® Gly Glu Arg Ser Ser Leu Vro Ala Pfce 1 5 10

TAÇ ÇCT GGC ACT TÇA GGC TCT TGT TCC GGA TGT GSOG TCC CTC TCT CTC 203

Tyj? Pra Gly Thr Ser Gly Ser Cys s#p Gly Cys Gly ser Leu Ser Leu 15 20 25

CCC CTC CTC GCA GCC CTC GTS GCT GCT CAT CCC GTG CCA TCC CTC CTC 251

Pr o Leu Leu Ala Gly Leu Vai Ale Ala Asp Ale Vai Ala Ser Leu Leu 30 35 40 45

ATC GTG GGG GCO GTG CTC CTC TCC CCA CCC CCA CCC CGS: ACC CCC CCC

Ils Vai Gly Ala Vai Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala 50 - ^ 55 60 GAA CAT GGC A&A GTC TAC ATC AAC ATC CCA GGC AGG GSC TGACCCTCCT 348

ClP Asp Gly Ly® ¥al Tyr lie Asn Mac Pro Gly Arg Gly S5 70 GCAGCTTGGA CCTTTGACTT CTSACCCTÇT CATCCTCQAT GCTCTCTGCT GCACAGCAAA 408 CCCCCCCCCA ACTTCTGGAT TGTAATAÂAA CATTTGAAAC ACA 451 19 ΡΕ1003861

Tabela 2 (continuação): sequência de cDNAs de DAP10 de roedor a partir de biblioteca de rato. Ver SEQ ID NO: 9 e 10 .

GTOACCATCG GGGTGACATC CGTCCTAGCT SCCTCTCTTC TCCTCTACTG TTCTGAGGAC m TTCCCTatmC CACAGTTTTO CCCACÃT-CÇC TOCAóGTCCC AeCCCJWSC ÃTO QhC ccc 11? fcfet Asp Pro -18 CCA mc TAC cto CTO TTC CTG CTT CTO CTC CCA GTG GCT GCA AGT cm 165 GXy Tyr Leu Leu Phe Léu Látt Lau Leu Pr® Vai Ala Alá Ser ein -15 “10 “5 1 A€à TCG GCA GCT TCC TOC toc GGA TOT GGG ACT CTO TOT CTG CCA CTO 213 Thr SáE Ala Oly Ser Cys Sájr Gly Cys Giy Thr lsu Sás? Leu Pra Láu 5 10 15 cro GCA GGC CTA OTO CCT OCA CAT GGG <STO ATO TOA CTO CTA ATT CTA 261 Leu Ma GlV Leu Vai Alá Ala Asp Ala val mt Ser Láii Léu lis Vãl 20 25 M ees GTO GTO TTT GTA TGT ATO CGC CCA CAC GGC AGG CCT GCC CAA GAA 3 m Gly Vôl Vai Rh® Vai Cys *íet Arg Pro His Giy Arg Fro Alã Qln, Qlu 35 40 45 ÔAT Ó§T mk GTC tac ATC AAC ATO CCT GGC AGA GGC tcaccacggc 35S Asp oiy &rg Vai lie Asn mt Ρϊγο Gíy Arg Gly 50 ss 00

ACCTTCTGAC COGCTOATCC TOOATCCTOT GGGTTTG&SS TOCGTOSG

Alinhamento das sequências da proteina de primata e de roedor (SEQ ID NO: 8 e 10).

hí «XHLC3ÍILFÍ» LLE.PVMAQT TfOmSXJA FTOflTSGSCS ÚSÚSLShWLh m.% mvwmthvb LLLFVAASQT S------—----* —---AGSCS «CGTLSLPLL hí AGLV&ADÃVA SLLXVGAVFL· CÂRPIILSMQ -ϊ»ΚΜΥΪΙ3Μί (Sitó* nu JUSLVAAQAVU SLLXVOWFV C»RPH6RPAQ ED9R«YI»MP SIS* 20 ΡΕ1003861

Tabela 3: Primata, por exemplo, sequência de MDL-1 humana (SEQ ID NO: 11 e 12) . Devido à metionina designada não conter codões de terminação a montante, como esperado, é concebível de que a proteína possua realmente a sequência a montante adicional. Esta metionina alinha-se com a sequência de rato (ver em baixo).

GGCTTAGOGT GGTCGCGGCC SAOQTQGCAA MGGAGCATA TTCTCMXIÁ-G ACGGGGCCÇC SQ

TGCCIGCCAC ACCAAGCATT AG3CCACCAG GMQACCCCC ATCttíCÂAOC MQCCTASCC 120

TtCCAGGGNG AAAGAGGCCT CTGCAGCTCC TTCATC ATG AA€ TC-G CkC ÂTG ATC 174 ÃSÍ5 Txp His SSet IX® 1 § ATC 22a TCT GGG CH* ATT G7G GTA GTG CTT AM GTT GTT GGA ATG ACC TTA 11« Ser Gly Leu 10 11® Vai vai Vai Leu 15 Lya Vai Vai Gly Ket 20 Thr Leu TTT 270 em ctt TAT TTC CCA CAG ATT TTT MC MA AGT MC GAT GGT TTC nm Leu Leu 25 Tyr Phe Pr® Gin 11« Phe 10 Asr Lys Ser A*» 35 A»» Gly Phe ACC 318 acc ACC ACC ACC TÃT CCA ACA GTC TCA CAG ATT TTT GGC AGC AGT Thr Thr 40 Thr Are Ser Tyr Gly 43 Thr Vai Ser Gin lie PA® 50 Gly Ser Ser TCC 36e cca AGT ccc AAÇ GGC TTC ATT ACC ACA ACC ACC TAT CGA ACA CTC Ser 55 Pr® Ser Fr® Asn Gly €0 Ph® lie Thr Thr Arg S«r Tyr 65 Gly Thr Vai 70 TGC 414 ccç AAA GAC TGG GAA ΤΓΤ TAT CAA CCA AGA TGT TTT TTC TTA TCC Cys Pr® Lys Asp Trp 7S Glu Phe Tyr Gin Ala Arg Cya phe m Phe Leu Ser 85 ACT 462 TCT GAA TÇ& TCT TGG AAT GAA ACC ACC CAC TTT TGC MA CGA AAA & Ser Glu Ser 9© Ser Trp Α3Π Gin Ser 95 Arg Asp Fhe Cys Lys 100 Gly Lys 21 ΡΕ1003861 GGA $10 TCC ACÃ TTG GCA ATT GTC AAC ACG CCA GAG AAA CTG TTT CTT CAG Gly Sêif Thr 1.05 LêÚ. Ala n® Vai Asn UO Thr Pro Glu Lys Leu 115 3?he Leu Gin gac 5S8 ATA GAT GCT GAG AAG TAT ΤΤΓ ATT GGC TTA ATT TAC CAT CGT Asp Xle 320 Ui*- Asp Ala Glu Lys 125 Tyr Phe He Gly Leu 130 lia Tyr His Arg G&A sas GAG AAA AGG TGG CGT TGG ATC AAC MC TCT GTG TTC MT GGC AAT Glw im Glu Ay© Affg Trp Argr 140 Trp Ils Asn Aan Ser 145 Vai Fhs Mn Gly Asn 150 ÔTT 654 ACC A&T CAG AAT* CAG AAT TTC AAC TGT GCS ACC ATT GGC fiTA ACA vai Thr Asm Gin Asn 155 Gin. Mn Phe Asn Cys 160 Ala Thr n» Gly Leu 165 Thr AAG 70.2 ACC QAT GCT GCA TCÃ TCT mc ATC AGC TAC asc AGG ATC TGT Lys Thr Pte ASP 17 0 Ala Ala Ser Cys Asp 175 Xle Ser Tyr Arg Arg ISO lie Cys GSSj AAG AAT GÇÇ AAA TGATCACAGT TCCCTCTGAC AAGAACTATA ÇTTGCAACTC 757 61u Lya asm Ala Lya 185

TTTTTG&ATC CATAACAGGT COTACTGGCC AATGATTAGT TTTACTTACC TATCTGTACT «17 ACCÂGTAGCG GTCCTTGCCC AirTTGGGAAÂ CT^AGCTTCT TTCTTCTGCA CTGGGGGACT 87?

GGATGCTAGC CATCTCCAQG AGACAGC^TC AGTTTTACGG AMCMCTCA GTTAGTATAG 53?

AGATGÂGGTC C3CTTCTGTA GT&CCTTCCT TCAAATAAAG AMTCTGGTA CCTGCCOGG n$

Roedor, por exemplo, rato, sequência de cadeia longa de MDL-1 (SEQ ID NO: 13 e 14). Foi identificada uma variante de cadeia curta, que tinha uma delecção dos nucleótidos 221-295. A variante de cadeia curta caracterizada processa também as diferenças na sequência: nucleótidos 29-35 lida como CAGAAGA; 107-109 lida como AGA; 128-129 lida como AT; 820-826 lida como CATAGGT; falta-lhe a 859; e 879-880 lida como CA. A metionina iniciadora possui codões de terminação a montante, sugerindo que se trata da extremidade amina correcta. 22 ΡΕ1003861

ASGAC&TTAC CGAGCAGfôftG CATACATTTC CASASCAAGG AGCCCTOCTC GCTOCACCGA 60

ATATCTOATC AAMÃGACTO CTATCTOTAf GCCAACCCAG ACTTCCCAGA AGAGATCAGA TOCCTO&TCC CCCATCATC ATO MC TOS CÃC ATO ATC ATC TOS 003 CTT ATO 173

Met Asn Trp Mis Met II® 11« Ser Gly Leu 21« t 5 10

OTA STA OTO ATO AAA OTO GTT GGA 220 Vai Vai Vai Xis Lys Vai Vai Gly 15 CCA CAO GTO TTT 000 AAA AS* AAT 268 Pr© Oln Vai Ph® Gly Lys Ser Asn 30 35 TAC OGA ACC ACT AOT OTO CAG AAT 316 Tyr Gly Thr Thr Ser Vai 01» Asa 45 50 OAC GAA AOT ÀCC ATO CCT ACA AOO 354 Asp Glu Ser Thr Met Pr© Thr Arg 60 m AAC TOO 0A7 TTT CAC ÇAA GOA AAA 412 Asn Trp Âsp Pha Bis Qln Gly Lys 80 TOA CCT TGS AAA QAC AGC ATO GAT 460 Ser Pr© Trp Lys Asp Ser Mafc Asp 95 CTO GCA ATO GTC MC ACT CCA GAG 508 Lati Ala II© Vai Asa Thr Pr© olu UO 115 QCT GGT ATO GAG Ml» TAC TOT ATO 556 Ala Gly lie Glu Asa. Tyr Phe lie 135 130 AAA AAG TOS CGC TOS ATC AAC AAC 604 Lys Lys Trp Arg Trp Ile As» Aso 140 14S

ATG ACC TTT TTT CTO CTO YAT TTO

Ket Thr Phe Phs Leu Leu Tyr Fhe 20 .25

GAT ÕGC TTC OTO CCC AOS GAG AGC

Asp Gly Ph® Vai Pro Thr Glu Ser 40

GTC TCA CAG ATC TTT GGG &3A .AAT VAI Ser Gin ll® Fhe Gly Arg Asa 55

AGC TAT GGA ACA GTC TGT CCC AGA

Ser Tyr Gly Thr Vai Cys Pr© Arg 70 75 TOC TTT TTC CTC TCC TOC TOO GAÃ

Cys Phe .Fh« Fhe Ser Fh© Ser Glu gg 90

TAT TOT GCA ACA CAA GGA TCC ACA

Tyr Cys Ala Thr Gin Gly Ser Th*1 1Õ0 10S

AAA. CTO AAG CÃT CTO CAG GAC ATA

Lys Leu Lys Tyr Leu Gl» Asp Ile 130

C5QT TOG GTA CGT CAG CCT GGA GAG

Gly Leu vai Arg Gin Pr© Gly Glu 135

TCT OTO TTC AAT 000' AAT OTO ACC

Ser Vai The Asn. Gly Asa Vai Thr Í50 155 MT CAG GAC CAG MG TTC OAC TOT GTC ACT ATA GGT CTO· ACG AAG ACA 652

Asa Gla Asp Gin As» Fhe Asp Cys Vai Thr lie Gly Leu Thr Lys Thr 160 165 Í7Õ 23 ΡΕ1003861

TÀt GA? G€'T OCA TCA TGT OAÂ GT€ AGC TA? CGC TGG ATC 7GÇ GAA ATG 700

Tyr Asp Ala Ala Ser Cys dia Vsl Ser fyr Ãrg frp Ile Cys Glu Mat 175 180 l&S

AâT GCC AAA TGATCATAGA. TÇTCTAÇAAG âCTGAATOT TACAGAGCTA 749 Aísíí Ala Lys im GCAAA.GGA.GA OTAGTTGTGA CTOMACCAG CGCASGAAAA TAffAGAOCAT? CAAAGACTG? 809

GCCÇATCTXC ATAGGTGGGà GTTCCCmf^ GA&TCC7CAA AGTCAATTXT CTTACTCCAC Sê9

AAACATCTTA CCATAGTAAA ACTCCCT S9€

Alinhamento da cadeia longa de MDL-1 de humano e de MDL-1 de rato. É de particular interesse um domínio intracelular muito curto, correspondendo aos resíduos 1-2; com o domínio transmembranar a decorrer desde cerca de 6 a 27 processando um aminoácido carregado bem perto do resíduo 16. Três sítios de glicosilação N-ligados correspondendo aos resíduos 51, 146, e 153 da cadeia longa de rato; o último deles está conservado na sequência de humano. De notar que a cadeia longa de rato, relativamente à cadeia curta, parece conter um segmento espaçador de cerca de 25 aminoácidos. hjápt-i KmimrisGi,iWvfi^mfa*ri>LFttYFP5iFNKSí5DGFTTfRSYe’T----bsMÈDI,-! ***#♦*"**· * *r # * -fc- * e # ** * (fr # * ^ * # * * % # * ]**-$*

MJ0L” 1 -VS0IFGSSSPSPKGF17TRS^TVCFKIMEF¥QMÍCFFLS7SESSWNES

bjMDL~1 NVSQIFGRííDES-----tMFraSYGTVCPRNtroFHQGK.CFFFSFSBShmDS ****** * ********* * * * *** * ***· * *

hMOL-l ΚΡΡ€ΚσΚ03ίΓ1Αϊν^ΡΕΚΙ-Ρ^ΏΧΤΟΑΕΚΥΡΪβΙ,ΐνΗΡΕ5Κ^«Ιί3Η ísMDL-1 JffiYCATQGSTLAX^rPEKLIíYLQDmGlEKYFIGLVEGPGMSmWXaM jsMDL-1 SVFP3íAm3^^FBCOTIGL1?KTY0AASCEVSYBMXei«SÍAK ********** *** * *******4*****^ .*** *** *** 24 ΡΕ1003861

Como utilizado aqui, o termo "DAP12 humana" deve referir-se, quando utilizado num contexto de proteína, a uma proteína contendo a sequência de aminoácidos de primata apresentada na Tabela 1. Estão também descritas proteínas contendo um fragmento substancial daí resultante, por exemplo, variantes mutantes e polimórficas, juntamente com um polipeptídeo derivado de humano que exibe a mesma função biológica ou interage com os componentes de ligação específicos da DAP12 humana. Estes componentes de ligação ligam-se normalmente a uma DAP12 de humano com afinidade elevada, por exemplo, a pelo menos cerca de 100 nM, normalmente melhor do que cerca de 30 nM, preferencialmente melhor do que cerca de 10 nM, e mais preferencialmente melhor do que cerca de três. São encontradas proteínas homólogas em espécies para além dos humanos, por exemplo, em primatas. Enquanto que a maioria das descrições em baixo é direccionada à DAP12, métodos e características similares podem ser analogamente aplicados aos genes de DAP10 e de MDL-1. Muitas das limitações direccionadas à DAP12 irão corresponder ás condições em referência à DAP10 e à MDL-1, embora as limitações específicas relevantes a um gene, por exemplo, uma limitação do comprimento, não se irá aplicar necessariamente ás outras. O termo "polipeptídeo" quando utilizado aqui inclui um fragmento ou segmento, e engloba uma cadeia de resíduos de aminoácidos de pelo menos cerca de 8 aminoácidos, geralmente de pelo menos 10 aminoácidos, mais 25 ΡΕ1003861 geralmente de pelo menos 12 aminoácidos, frequentemente de pelo menos 14 aminoácidos, mais frequentemente de pelo menos 16 aminoácidos, normalmente de pelo menos cerca de 18 aminoácidos, mais normalmente de pelo menos cerca de 20 aminoácidos, Usualmente de pelo menos cerca de 22 aminoácidos, mais usualmente de pelo menos cerca de 24 aminoácidos, preferencialmente de pelo menos cerca de 26 aminoácidos, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 28 aminoácidos, e, em formas de realização particularmente preferenciais, de pelo menos cerca de 30 ou mais aminoácidos, por exemplo, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 75, 100, 125, etc. Em formas de realização preferenciais, existirá uma pluralidade de diferenças, por exemplo, sem sobreposições, segmentos de comprimentos especifico. Normalmente, as pluralidades serão pelo menos duas, mais normalmente pelo menos três, e preferencialmente 5, 7, ou mesmo mais. Enquanto que o comprimento é fornecido, comprimentos maiores, de vários tamanhos, podem ser apropriados, por exemplo, um do comprimento 7, e dois do comprimento 12. O termo "composição da ligação" refere-se a moléculas que se ligam com especificidade a DAP12, DAP10, ou a MDL-1, por exemplo, numa forma do tipo anticorpo-antigénio. Outras interacções incluem, por exemplo, componente receptor-componente receptor, para formar um complexo receptor. Outros membros do complexo são provavelmente as formas KIR, LIR, MIR, ILT, e CD94 descritas a baixo. Outra interacção de interesse inclui o 26 ΡΕ1003861 tal complexo receptor com o seu contra-receptor, que pode por si só ser uma única proteína ou um complexo. Por exemplo, o receptor para o complexo KIR-DAP12 poderá provavelmente ser um MHC de classe I. Tais interacções podem normalmente ser uma interacção proteína-proteína, quer covalente ou não covalente. A molécula pode ser um polímero ou um reagente químico. Um análogo funcional pode ser uma forma com modificações estruturais, ou pode ser uma molécula inteira não relacionada que possui uma forma molecular que interage com os determinantes de ligação de superfície apropriados. Os análogos podem servir como agonistas ou como antagonistas, ver, por exemplo, Goodman, et al. (eds. 1990) Goodman&Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press. A solubilidade de um polipeptídeo ou fragmento depende do ambiente e do polipeptídeo. Muitos parâmetros afectam a solubilidade do polipeptídeo, incluindo a temperatura, o ambiente electrolítico, o tamanho e as características moleculares do polipeptídeo, e a natureza do solvente. Normalmente, a temperatura à qual o polipeptídeo é utilizado varia de cerca de 4 °C até cerca de 65 °C. Usualmente a temperatura utilizada é maior do que cerca de 18 °C e mais usualmente maior do que cerca de 22 °C. Para fins diagnósticos, a temperatura estará normalmente perto da temperatura ambiente ou mais quente, mas menos do que a temperatura de desnaturação dos componentes no ensaio. Para fins terapêuticos, a temperatura será usualmente a temperatura corporal, 27 ΡΕ1003861 normalmente cerca de 37 °C para os humanos, embora em certas situações a temperatura pode ser aumentada ou diminuída in situ ou in vitro.

Os electrólitos estarão normalmente aproximados das condições fisiológicas in situ, mas podem ser modificados para aumentar ou baixar a força iónica quando vantajoso. Os iões presentes podem ser modificados de acordo com os tampões padrão utilizados em contextos fisiológicos ou analíticos. 0 tamanho e estrutura do polipeptídeo devem normalmente estar num estado substancialmente estável, e normalmente não num estado desnaturado. O polipeptídeo pode estar associado com outros polipeptídeos numa estrutura quaternária, por exemplo, para conferir solubilidade, ou associado com lípidos ou detergentes de forma a aproximar-se das interacções da bicamada lipídica natural. Tais proteínas serão, por exemplo, formas solúveis/curtas das proteínas KIR, MIR, ILT, ou CD94. A disrupção destes complexos irá bloquear normalmente a função sinal. 0 solvente será normalmente um tampão biologicamente compatível, de um tipo utilizado para a preservação das actividades biológicas, e irá aproximar-se normalmente a um solvente fisiológico. Normalmente o solvente apresentará um pH neutro, normalmente entre cerca de 5 e 10, e preferencialmente cerca de 7,5. Em certas ocasiões, será adicionado um detergente, frequentemente um 28 ΡΕ1003861 detergente moderado não desnaturante, por exemplo, CHS (hemisuccinato de colesterilo) ou CHAPS (3— ( [3 — colamidopropil]-dimetilamónio)-1-propano sulfonato), ou numa concentração de detergente suficientemente baixa para não provocar disrupção da estrutura terciária da proteína. A solubilidade é reflectida pela sedimentação medida em unidades Svedberg, a qual é uma medida da velocidade de sedimentação de uma molécula sob condições particulares. A determinação da velocidade de sedimentação era efectuada tradicionalmente numa ultracentrífuga analítica, mas é presentemente efectuada normalmente numa ultracentrífuga padrão. Ver, Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2d ed.), W. H. Freeman; e Cantor e Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, parts 1-3, W. H. Freeman & Co., San Francisco. Como uma determinação natural, uma amostra contendo um polipeptídeo putativamente solúvel é centrifugado numa ultracentrífuga padrão de tamanho grande a cerca de 50 K rpm durante cerca de 10 minutos, e as moléculas solúveis irão permanecer no sobrenadante. Uma partícula ou polipeptídeo solúveis serão normalmente menores do que 30 S, mais frequentemente menores do que cerca de 15 S, usualmente menores do que cerca de 10S, mais usualmente menores do que cerca de 6 S, e, em formas de realização particulares, preferencialmente menores do que cerca de 4S e mais preferencialmente menores do que cerca de 3 S. 29 ΡΕ1003861 III. Variantes Físicas

Estão descritas também proteínas ou peptídeos contendo identidade da sequência de aminoácidos substancial com as sequências de aminoácidos, por exemplo, da DAP12 humana. Fornece, por exemplo, substituições de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, preferencialmente conservativas. Tais variantes podem ser utilizadas para produzir anticorpos específicos, e muitas vezes irão partilhar a maioria ou a totalidade das propriedades biolóqicas. A identidade da sequência de aminoácidos é determinada pela optimização do emparelhamento dos resíduos. Isto altera-se quando se considera as substituições conservativas como emparelhamentos. As substituições conservativas incluem normalmente substituições dentro dos seguintes grupos, glicina, alanina; valina, isoleucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tiro-sina. É suposto que as sequências de aminoácidos similares incluam variações alélicas naturais em cada sequência de proteína respectiva. Proteínas ou peptídeos normalmente homólogos apresentarão uma identidade de 85-100% (se os espaços poderem ser introduzidos) , a 90-100% de identidade (se as substituições conservativas estiverem incluídas) com a sequência de aminoácidos, por exemplo, da DAP12 humana. As medidas de identidade serão de pelo menos cerca de 85%, geralmente de pelo menos cerca de 87%, a maioria das vezes pelo menos cerca de 89%, frequentemente pelo menos cerca de 30 ΡΕ1003861 91%, usualmente pelo menos cerca de 93%, mais usualmente pelo menos cerca de 95%, preferencialmente pelo menos cerca de 97%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 98%, e em formas de realização particularmente preferíveis cerca de 99% ou mais. Ver também Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff, et al. (1983) Chapter One in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practise of Seguence Comparison Addison-Wesley, Reading, MA; e conjuntos de sofware da IntelliGenetics, Mountain View, CA; e o Grupo de Computadores de Genética da University of Wisconsin, Madison, WI. O DNA isolado da DAP e MDL humanas pode ser rapidamente modificado por substituições de nucleótidos, delecções de nucleótidos, inserções de nucleótidos e inversões de cadeias de nucleótidos. Estas modificações irão resultar em novas sequências de DNA que codificam antigénios úteis, os seus derivados, ou proteinas contendo actividade similar ou antagonista. Estas sequências modificadas podem ser utilizadas para produzir antigénios mutantes ou para aumentar a expressão. A expressão aumentada pode envolver a amplificação de genes, aumentar a transcrição, aumentar a tradução, e outros mecanismos. Tais mutantes derivativos de DAP12 incluem mutações pré-determinadas ou de sitio-especificas da respectiva proteína ou dos seus fragmentos. "Mutante de DAP12" engloba um polipeptídeo diferente partilhando características importantes com a DAP12 humana como descrito acima, mas contendo uma sequência de aminoácidos que difere da de 31 ΡΕ1003861 DAP12 encontrada na natureza, quer por delecção, substituição, ou inserção. Particularmente, "mutante de DAP12 de sitio-especifico" está definido como apresentando homologia com um antigénio da Tabela 1, e como partilhando activi-dades biológicas relevantes com esses antigénios. Conceitos similares aplicam-se a diferentes proteínas de DAP12, particularmente àquelas encontradas em vários outros mamíferos. Como mencionado anteriormente, é enfatizado que as descrições se destinam geralmente a englobar proteínas DAP e MDL adicionais, não limitadas somente à forma de realização primata especificamente discutida.

Apesar de os sítios de mutação sítio-específica estarem pré-determinados, não precisam de ser sítio-específicos. A mutagénese de DAP12, DAP10, ou de MDL-1 humana pode ser conduzida efectuando inserções ou delecções de aminoácidos. As substituições, delecções, inserções, ou quaisquer combinações podem ser criadas para chegar a uma construção final. As inserções incluem fusões amino- ou carboxi-terminais. Pode ser conduzida a mutagénese aleatória num codão alvo e os mutantes expressos podem então ser rastreados para a actividade desejada. Os métodos para efectuar mutações de substituição em sítios pré-determinados no DNA contendo uma sequência conhecida são bem conhecidos na técnica, por exemplo, por mutagénese com o iniciador M13. Ver também Sambrook, et al. (1989) e Ausubel, et al. (1987 e Suplementos).

As mutações no DNA não devem colocar normalmente 32 ΡΕ1003861 as sequências codificantes fora das janelas de leitura e preferivelmente não devem criar regiões complementares que se possam hibridizar para produzir estruturas de mRNA secundárias tais como loops ou hairpins.

Estão também descritas proteinas recombinantes, por exemplo, proteinas de fusão heterólogas que utilizam segmentos destas proteinas. Uma proteina de fusão heteróloga é uma fusão de proteinas ou segmentos os quais não se fundem normalmente na natureza da mesma forma. Assim, o produto de fusão de uma imunoglobulina com, por exemplo, um polipeptídeo DAP12, é uma molécula de proteina continua contendo sequências fundidas num peptídeo de ligação típico, produzido normalmente como um produto de tradução simples e exibindo propriedades originárias de cada peptídeo fonte. Aplica-se um conceito similar a sequências de ácido nucleico heterólogas. Fusões particularmente interessantes poderão ser as de DAP12 com o seu receptor associado, como discutido acima. Ambas as formas de realização das proteínas, e dos ácidos nucleicos que codificam ambos os componentes do complexo receptor deverão ser importantes.

Adicionalmente, podem ser efectuadas novas construções combinando domínios funcionais similares de outras proteínas. Por exemplo, parceiros de ligação ou outros segmentos podem ser "trocados" entre diferentes polipeptídeos de fusão ou fragmentos novos. Ver, por 33 ΡΕ1003861 exemplo, Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1330-1336; e 0'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. Assim, novos polipeptídeos quiméricos exibindo novas combinações de especificidades irão resultar da ligação funcional das especificidades dos parceiros de ligação e de outros dominios funcionais. O método do fosforamidito descrito por Beaucage e Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, irá produzir fragmentos de DNA sintéticos adequados. Um fragmento de cadeia dupla irá será obtido frequentemente quer sintetizando a cadeia complementar e emparelhando juntamente a cadeia sob condições apropriadas ou pela adição da cadeia complementar utilizando a DNA polimerase com uma sequência iniciadora apropriada.

Em certas situações, pode ser útil uma DAP12 com múltiplas repetições ITAM, ou uma substituição ITIM. Além disso, as funções do receptor intactas podem ser conseguidas dividindo a cadeia longa do receptor transmembranar em duas subunidades separadas as quais interagem tal como a DAP12 com o seu parceiro. Assim, um receptor de cadeia longa intacto poderá ser substituído com o par de um receptor encurtado com uma DAP12. Podem também ser preparados os construtores de ácido nucleico com a combinação. Da mesma forma com a DAP10, e as repetições de ITIM, ou uma substituição de ITAM. 34 ΡΕ1003861 IV. Variantes Funcionais O bloqueio da resposta fisiológica aos antigénios de DAP12 ou de DAP10 pode resultar da inibição da ligação de um parceiro ao complexo receptor, tal como através da inibição competitiva. Assim, os ensaios in vitro irão utilizar frequentemente proteína isolada, membranas de células que expressam uma DAP12 recombinante, fragmentos solúveis contendo segmentos de parceiros de ligação desses antigénios, ou fragmentos associados a substratos de fase sólida. Estes ensaios irão permitir também a determinação do diagnóstico dos efeitos quer das mutações e modificações do segmento de ligação quer das mutações e modificações do parceiro de ligação.

Esta invenção contempla também a utilização de ensaios de rastreio de fármacos competitivos, por exemplo, onde anticorpos neutralizantes para o antigénio ou para os fragmentos do antigénio competem com um composto teste para se ligarem à proteína. Desta forma, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de um polipeptídeo que partilha um ou mais sítios de ligação do antigénio e podem também ser utilizados para ocuparem sítios de ligação na proteína que poderiam de outra forma ser ocupados por um parceiro de ligação. A invenção contempla também o rastreio para compostos que interrompem as ligações dos resíduos carregados nos segmentos transmembranares entre os parceiros. 35 ΡΕ1003861

Adicionalmente, a neutralização de anticorpos contra a DAP ou a MDL e contra fragmentos solúveis da DAP ou da MDL que contém um sitio de ligação da contraparte de alta afinidade, pode ser utilizada para inibir a função de ligação em tecidos, por exemplo, tecidos com fisiologia anormal. As interacções do domínio intracelular com outros componentes serão também alvo de rastreio para fármacos. "Derivados" dos antigénios de DAP ou de MDL incluem mutantes da sequência de aminoácidos, variantes de glicosilação, e covalentes ou agregados conjugados com outras partes químicas. Derivados covalentes podem ser preparados por ligação de funcionalidades a grupos os quais se encontram nas cadeias de aminoácidos laterais do antigénio de DAP ou de MDL ou no N- ou C-terminal, por meios que são bem conhecidos na técnica. Estes derivados podem incluir, sem limitações, ésteres alifáticos ou amidas da extremidade carboxílica, ou resíduos contendo cadeias laterais carboxílicas, derivados de O-acilo de resíduos contendo grupos hidroxilo, e derivados de N-acilo do aminoácido amino-terminal ou resíduos contendo o grupo amina, por exemplo, lisina ou arginina. Os grupos acilo são seleccionados a partir do grupo de partes alquilo incluindo alquilo normal de C3 a C18, formando assim espécies alcanoil aroil.

Em particular, estão incluídas as alterações da gi icosilação, por exemplo, efectuadas pela modificação dos padrões de glicosilação de um polipeptídeo durante a sua 36 ΡΕ1003861 síntese e processamento, ou em passos de processamento adicionais Embora não existam sítios de N-ligação na proteína, podem existir sítios O-ligação, ou podem ser produzidas variantes com tais sítios. Meios preferenciais particulares para conseguir isto são a exposição do polipeptideo a enzimas de glicosilação derivadas de células que fornecem normalmente tal processo, por exemplo, enzimas de glicosilação humanas. São também contempladas enzimas de desglicosilação. São também englobadas formas de realização da mesma sequência de aminoácidos primária que possuem outras modificações menores, incluindo resíduos de aminoácidos fosforilados, por exemplo, fosfotirosina, fosfoserina, ou fosfotreonina.

Um grupo maior de derivados são covalentes conjugados de, por exemplo, os antigénios de DAP12 ou fragmentos daí resultantes com outras proteínas de polipeptídeos. Estes derivados podem ser sintetizados em culturas recombinantes tal como as fusões de N- ou C-terminais ou pela utilização de agentes conhecidos na técnica pela sua utilidade na ligação cruzada de proteínas através de grupos laterais reactivos. Os sítios de derivatização preferenciais com agentes de ligação cruzada existem em grupos amina livres, em partes de hidratos de carbono, e em resíduos de cisteína. São também descritos polipeptídeos de fusão entre os antigénios de DAP12 e outras proteínas homólogas ou heterólogas. Polipeptídeos homólogos podem apresentar 37 ΡΕ1003861 fusões entre diferentes marcadores de superfície, resultando, por exemplo, numa proteína híbrida que exibe especificidade de ligação a uma ou mais proteínas marcadas. Igualmente, podem ser construídas fusões heterólogas o que poderá exibir uma combinação das propriedades ou actividades das proteínas derivadas. Exemplos típicos são as fusões de um polipeptídeo repórter, por exemplo, a luciferase, com um segmento ou domínio de um antigénio, por exemplo, um segmento de ligação ao parceiro, tal que a presença ou a localização de um parceiro desejável possa ser facilmente determinada. Ver, por exemplo, Dull, et al., Patente dos EUA No 4,859,609, a qual está aqui incorporada por referência. Outros parceiros de fusão de genes incluem a β-galactosidase bacteriana, trpE, Proteína A, β-lactamase, alfa amilase, álcool desidrogenase, e factor alfa de conjugação de leveduras. Ver, por exemplo, Godowski, et al. (1988) Science 241: 812-816. O método do fosforamidito descrito por Beaucage e Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, irá produzir fragmentos de DNA sintéticos adequados. Um fragmento de cadeia dupla irá será obtido frequentemente quer sintetizando a cadeia complementar e emparelhando juntamente a cadeia sob condições apropriadas ou pela adição da cadeia complementar utilizando a DNA polimerase com uma sequência iniciadora apropriada.

Tais polipeptídeos podem também conter resíduos de aminoácidos que tenham sido modificados quimicamente por 38 ΡΕ1003861 fosforilação, sulfonação, biotinilação, ou por adição ou remoção de outras partes, particularmente aqueles que possuam formas moleculares similares aos grupos fosfato. Em algumas formas de realização, as modificações serão reagentes de marcação úteis ou servirão como alvos de purificação, por exemplo, reagentes de afinidade.

As proteínas de fusão serão normalmente produzidas quer por métodos de ácido nucleico recombinante quer por métodos de polipeptídeos sintéticos. As técnicas para a manipulação e expressão do ácido nucleico estão descritas normalmente, por exemplo, em Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.) Vols 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. As técnicas para a síntese de polipeptídeos estão descritas, por exemplo, em Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; e Atherton, et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford.

Está também descrita a utilização de derivados dos antigénios de DAP12 em vez de variações na sequência de aminoácidos ou da glicosilação. Tais derivados podem envolver a associação covalente ou agregada com partes químicas. Estes derivados dividem-se normalmente em três classes: (1) sais, (2) modificações covalentes dos resíduos terminais e da cadeia lateral, e (3) complexos de absorção, por exemplo com membranas celulares. Tais derivados covalentes ou agregados são úteis como imunogenes, como 39 ΡΕ1003861 reagentes em imunoensaios, ou em métodos de purificação tal como para purificação por afinidade de parceiros de ligação. Por exemplo, um antigénio de DAP12 pode ser imobilizado por ligação covalente a um suporte sólido tal como a Sepharose activada com brometo de cianogénio, por métodos que são bem conhecidos na técnica, ou adsorvidos em superfícies de poliolefina, com ou sem cruzamento de glutaraldeído, para utilização no ensaio ou na purificação de anticorpos anti-DAP12 ou dos seus parceiros de ligação. Os antigénios de DAP12 podem também ser marcados com um grupo detectável, por exemplo radioiodada numa tirosina, por exemplo, incorporada na sequência natural, pelo procedimento da cloramina T, ligada covalentemente a um quelato raro, ou conjugada a outra parte fluorescente para a utilização em ensaios de diagnóstico.

Um antigénio de MDL solubilizado desta invenção pode ser utilizado como um imunogene para a produção de anti-soro ou de anticorpos específicos para o antigénio ou de muitos fragmentos daí resultantes. Os antigénios purificados podem ser utilizados para rastrear anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antigénio preparados por imunização com várias formas de preparações impuras contendo a proteína. Em particular, o termo "anticorpos" engloba também fragmentos de ligação ao antigénio de anticorpos naturais. A MDL purificada pode também ser utilizada como um reagente para detectar anticorpos originados em resposta à presença de níveis elevados de MDL ou de fragmentos celulares contendo o 40 ΡΕ1003861 antigénio, podendo ambos ser o diagnóstico de uma condição fisiológica ou de doença anormal ou especifica. Adicionalmente, fragmentos de MDL podem também servir como imunogenes para produzir os anticorpos da presente invenção, como descrito imediatamente abaixo. Por exemplo, esta invenção contempla anticorpos criados contra sequências de aminoácido de, ou codificados por sequências de nucleótidos apresentadas na, por exemplo, Tabela 3, ou fragmentos dai resultantes. Em particular, esta invenção contempla anticorpos que contém afinidade de ligação a ou que são criados contra fragmentos específicos que se prevê estarem localizados fora da bicamada lipídica, quer no dominio extracelular quer no dominio intracelular. Adicionalmente, podem ser produzidos vários construtores a partir da fusão de um segmento associado à membrana à porção extracelular exposta contrária da molécula. Podem ser utilizados outros complexos antigénicos, incluindo complexos da MDL com um parceiro receptor. A presente invenção contempla o isolamento de variantes adicionais estritamente relacionadas. É altamente provável que as variações alélicas existam em diferentes indivíduos exibindo, por exemplo, identidade superior a 90-97% para forma de realização aqui descrita. A invenção fornece também meios para isolar um grupo de antigénios relacionados apresentando tanto distinções como similaridades na estrutura, na expressão, e na função. A elucidação da maioria dos efeitos fisiológicos 41 ΡΕ1003861 dos antigénios será altamente acelerada pelo isolamento e caracterização das contrapartes de espécies distintas dos antigénios. Em particular, a presente invenção fornece sondas úteis para identificar entidades genéticas homólogas adicionais em diferentes espécies.

Os genes isolados irão permitir a transformação de células sem a expressão de DAP ou de MDL, por exemplo, quer de tipos de espécies ou de células, que não têm antigénios correspondentes e exibem actividade de base negativa. Vários tipos de células, por exemplo, Jurkat, YT, ou BAF3, transfectadas com CD94 ou NKAT5 podem exibir sinalização quando transfectadas também com DAP12. A expressão de genes transformados irá permitir o isolamento de linhas celulares antigenicamente puras, com variantes definidas ou de espécie única. Esta abordagem irá permitir maior detecção e discriminação sensitiva dos efeitos fisiológicos da sinalização. Podem ser isolados e utilizados fragmentos subcelulares, por exemplo, citoplastos ou fragmentos de membrana. A dissecação dos elementos estruturais críticos que afectam as várias funções de diferenciação fornecidas pela ligação do receptor é possível utilizando técnicas padrão de biologia molecular moderna, particularmente na comparação de membros da classe relacionada. Ver, por exemplo, a técnica de mutagénese de rastreio homólogo descrita em Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1339- 1336; e abordagens utilizadas em 0' Dowd, et al. (1988) J. 42 ΡΕ1003861

Biol. Chem. 263: 15985-15992; e Lechleiter, et al. (1990) EMBO J. 9: 4381-4390.

Em particular, segmentos de ligação ao parceiro receptor podem ser substituídos entre as espécies variantes para determinar quais das características estruturais são importantes tanto para a afinidade como para a especificidade de ligação. Uma matriz de diferentes, por exemplo, variantes de DAP12, será utilizada para rastrear parceiros que exibem propriedades combinadas de interacção com diferentes espécies variantes.

As funções intracelulares irão provavelmente envolver segmentos do antigénio que estão normalmente acessíveis ao citosol. No entanto, a internalização do antigénio pode ocorrer sob certas circunstâncias, e pode ocorrer a interacção entre os componentes intracelulares e os segmentos "extracelulares" indicados. Os segmentos específicos da interacção da DAP12 com outros componentes intracelulares pode ser identificada por mutagénese ou por meios bioquímicos directos, por exemplo, ligação cruzada, afinidade, ou métodos genéticos. Será também aplicada a análise estrutural através de métodos cristalográficos ou de outros métodos físicos. Investigações futuras do mecanismo de transdução de sinal irá incluir o estudo de componentes associados que podem ser isoláveis por métodos de afinidade.

Serão efectuados estudos futuros da expressão e 43 ΡΕ1003861 controlo de antigénios de DAP12. Os elementos de controlo associados com os antigénios podem exibir desenvolvimento diferencial, tecido específico, ou outros padrões de expressão. São de interesse regiões genéticas a montante ou a jusante, por exemplo, elementos de controlo.

Estudos estruturais dos antigénios de DAP12 irão levar ao desenvolvimento de novas variantes, particularmente análogas exibindo propriedades agonistas ou antagonistas. Isto pode ser combinado com os métodos de rastreio descritos anteriormente para isolar variantes que exibam o espectro de actividades desejado. A expressão em outros tipos de células irá resultar frequentemente em diferenças de glicosilação num antigénio particular. Diversas espécies variantes podem exibir funções distintas baseadas em diferenças estruturais em vez de baseadas na sequência de aminoácidos. Modificações diferenciais podem ser responsáveis pela função diferencial, e a elucidação dos efeitos pode agora ser possível.

Apesar da descrição anterior se ter focado principalmente na DAP12 humana, aqueles peritos na técnica irão imediatamente reconhecer que a descrição engloba outros antigénios de DAP12, por exemplo, primatas e outras variantes de espécies mamíferas. Adicionalmente, o gene DAP10 exibe muitas características similares ao DAP12, e será modificável de forma similar. É evidente que a DAP12, 44 ΡΕ1003861 a DAP10, e a MDL-1 se podem associar umas com as outras, e em certas circunstâncias, podem associar-se todas num complexo multiproteico. V. Anticorpos

Os anticorpos posem ser criados para as diversas variantes alélicas ou de espécies de antigénios de DAP12 ou de MDL e de fragmentos dai resultantes, tanto nas suas formas naturais como nas suas formas recombinantes. Adicionalmente, os anticorpos podem ser criados para a DAP12 tanto nas suas formas activas como nas suas formas inactivas, ou nas suas formas nativas ou desnaturadas. São também contemplados anticorpos anti-idiotípicos.

Podem ser criados anticorpos, incluindo fragmentos de ligação e formas de realização de cadeia simples contra fragmentos pré-determinados de DAP ou de MDL por imunização de animais com conjugados dos fragmentos com proteínas imunogénicas. São preparados anticorpos mono-clonais a partir de células que secretam o anticorpo desejado. Estes anticorpos podem ser rastreados por ligação a DAP ou a MDL normal ou defectiva, ou rastreados para actividade funcional agonística ou antagonística. Estes anticorpos monoclonais ligar-se-ão normalmente com pelo menos um KD melhor do que cerca de 1 mM, mais usualmente melhor do que cerca de 300 μΜ, tipicamente melhor do que cerca de 10 μΜ , mais tipicamente melhor do que cerca de 30 μΜ, preferencialmente melhor do que cerca de 10 μΜ e mais 45 ΡΕ1003861 preferencialmente melhor do que cerca de 3 μΜ, por exemplo, 1 μΜ, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, etc.

Os anticorpos, incluindo os fragmentos de ligação ao antigénio, desta invenção podem possuir diagnóstico significativo ou valor terapêutico. Podem ser potentes antagonistas que se ligam à MDL-1, e/ou inibem a ligação ao parceiro ou inibem a capacidade de ilicitar uma resposta biológica. Podem também ser úteis como anticorpos não neutralizantes e podem ser conjugados com toxinas ou radionuclideos tal que quando o anticorpo se liga ao antigénio, a célula se suicida. Assim, estes anticorpos podem ser conjugados com fármacos ou com outros agentes terapêuticos, quer directa ou indirectamente por meio de um elemento de ligação.

Os anticorpos desta invenção podem também ser utilizados em aplicações de diagnóstico. Como anticorpos de captura ou não neutralizantes, que se podem ligar à MDL sem inibirem a ligação ao parceiro e/ou a sinalização. Como anticorpos neutralizantes, podem ser úteis em ensaios de ligação competitivos. Podem também ser úteis na detecção ou quantificação da MDL ou dos seus parceiros.

Os fragmentos de DAP12 podem juntar-se a outros materiais, polipeptídeos particulares, como polipeptideos fundidos ou associados covalentemente para serem utilizados como imunogenes. Uma DAP12 e os seus fragmentos podem ser 46 ΡΕ1003861 fundidos ou ligados covalentemente a uma diversidade de imunogenes, tais como a hemocianina da lapa californiana, albumina de soro bovino, toxóide do tétano, etc. Ver Microbiology, Hoeber Medicai Division, Harper and Row, 1969/ Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, e Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York para descrições de métodos de preparação de anti-soro policlonal. Um método tipico envolve a hiperimunização de um animal com um antigénio. O sangue do animal é então recolhido logo após as repetidas imunizações e é isolada a gama globulina. Alternativamente, as células podem ser recolhidas para a produção de hibridomas.

Em algumas circunstâncias, é desejável preparar anticorpos monoclonais a partir de diversos hospedeiros mamiferos, tais como ratos, roedores, primatas, humanos, etc. A descrição de técnicas para preparar tais anticorpos monoclonais pode ser encontrada em, por exemplo, Stites, et al. (eds.) Basic and Clinicai Immunology (4th ed.), Lange Medicai Publications, Los Altos, CA, e referências ai citadas; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.) Academic Press, New York; e particularmente em Kohler e Milstein (1975) in Nature 256: 495-497, que debate o método de criação de anticorpos monoclonais. Sumarizando em poucas palavras, este método envolve injectar um animal com um imunogene. O animal é 47 ΡΕ1003861 então sacrificado e são retiradas células do seu baço, que são então fundidas com células de mieloma. O resultado é uma célula híbrida ou "hibridoma" que é capaz de se reproduzir in vitro. A população de hibridomas é então rastreada para isolar clones individuais, cada um dos quais secreta uma única espécie de anticorpo para o imunogene. Desta forma, as espécies de anticorpos individuais obtidas são os produtos de células B únicas imortalizadas e clonadas a partir do animal imune criados em resposta a um sitio especifico reconhecido na substância imunogénica.

Outras técnicas adequadas envolvem a exposição in vitro de linfócitos aos polipeptideos antigénicos ou alternativamente à selecção de bibliotecas de anticorpos em vectores fágicos ou similares. Ver, Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoir in Phage Lambda," Science 246: 1275-1281; e Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546. Os polipeptideos e os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados com ou sem modificação, incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados. Frequentemente, os polipeptideos e os anticorpos irão ser marcados juntando, quer cova-lentemente ou não covalentemente, uma substância que fornece um sinal detectável. Uma larga variedade de técnicas de marcação e conjugação são conhecidas e estão descritas extensivamente tanto na literatura cientifica como nas patentes. Marcações adequadas incluem radionuclideos, enzimas, substratos, co-factores, inibidores, partes fluorescentes, partes quimioluminescentes, partículas magné- 48 ΡΕ1003861 ticas, e outras. Patentes, que explicam a utilização de tais marcações incluem as Patentes dos EUA nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; e 4,366,241, As imunoglobulinas recombinantes podem também ser produzidas, ver Cabilly, Patente dos EUA No. 4,816,567.

Os anticorpos desta invenção podem também ser utilizados para cromatografia de afinidade no isolamento da proteína. As colunas podem ser preparadas onde os anticorpos estão ligados a um suporte sólido, por exemplo, a partículas tais como a agarose, a SEPHADEX, ou outras, onde um lisado celular pode passar através da coluna, a coluna lavada, seguida pelo aumento das concentrações de um desna-turante moderado, pelo que a proteína DAP12 purificada irá ser libertada.

Os anticorpos podem também ser utilizados para rastrear bibliotecas de expressão para produtos de expressão particulares. Normalmente os anticorpos utilizados em tais procedimentos são marcados com uma parte permitindo a fácil detecção da presença de anticorpos por ligação ao anticorpo.

Os anticorpos criados contra um antigénio DAP12, DAP10, ou MDL-1, irão também ser utilizados para criar anticorpos anti-idiotípicos. Isto irá ser utilizado na detecção ou diagnóstico de várias condições imunológicas relacionadas com a expressão dos respectivos antigénios. 49 ΡΕ1003861

Uma proteína DAP12 que se liga especificamente ou que é especificamente imunoreactiva com um anticorpo criado contra um imunogene definido, tal como um imunogene consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 6, é normalmente determinada num imunoensaio. O imunoensaio utiliza normalmente um anti-soro policlonal que foi criado, por exemplo, para uma proteína da SEQ ID NO: 2 ou 6. Este anti-soro é seleccionado por conter baixa reactividade cruzada contra outros membros da família CD3, por exemplo, CD3 ou FcsRy, preferencialmente das mesmas espécies, e qualquer reactividade cruzada é removida por imunoabsorção antes da utilização no imunoensaio.

Com o fim de produzir anti-soro para utilização num imunoensaio, a proteína da SEQ ID NO: 2 ou 6, ou uma combinação daí resultante, é isolada como descrito aqui. Por exemplo, pode ser produzida proteína recombinante numa linha celular mamífera. Um hospedeiro apropriado, por exemplo, uma estirpe inata de rato tal como Balb/c, é imunizado com a proteína seleccionada, utilizando normalmente um adjuvante padrão, tal como o adjuvante de Freund, e um protocolo de imunização padrão de rato (Ver Harlow e Lane, supra). Alternativamente, pode ser utilizado como imunogene um peptídeo sintético derivado das sequências aqui descritas e conjugado a uma proteína transportadora. O soro policlonal é recolhido e titulado contra a proteína imunogénica num imunoensaio, por exemplo, um imunoensaio de fase sólida com o imunogene imobilizado num suporte sólido. O soro policlonal com um título de 104 50 ΡΕ1003861 ou superior é seleccionado e testado pela sua reactividade cruzada contra outros membros da família CD3, CD3 de primata ou de roedor, utilizando um imunoensaio de ligação competitivo tal como o descrito em Harlow e Lane, supra, nas páginas 570-573. Preferencialmente pelo menos dois membros da família CD3 são utilizados nesta determinação em conjunção com qualquer um ou alguns dos DAP12 de primata ou de roedor. Estes membros da família DAP12 podem ser produzidos como proteínas recombinantes utilizando técnicas de biologia molecular padrão e de química proteica como descrito aqui. Podem ser aplicadas técnicas similares à DAP10 ou a MDL-1.

Os imunoensaios no formato de ligação competitiva podem ser utilizados para as determinações de reactividade cruzada. Por exemplo, as proteínas da SEQ ID NO: 2 e/ou 6 podem ser imobilizadas num suporte sólido. As proteínas adicionadas ao ensaio competem com a ligação do anti-soro ao antigénio imobilizado. A capacidade das proteínas acima de competirem com a ligação do anti-soro à proteína imobilizada é comparada à proteína da SEQ ID NO: 2 e/ou 6. A percentagem de reactividade cruzada para as proteínas acima é calculada utilizando cálculos padrão. Estes anti-soros com reactividade cruzada menor do que 10% com cada uma das proteína listadas acima são seleccionados e agrupados. Os anticorpos de reacção cruzada são então removidos dos anti-soros agrupados por imunoabsorção com as proteínas listadas acima. 51 ΡΕ1003861

Os soros imunoabsorvidos e agrupados são então utilizados num imunoensaio de ligação competitivo como descrito acima para comparar uma segunda proteína à proteína imunogénica (por exemplo, a proteína DAP12 da SEQ ID NO: 2 e/ou 6). Com o fim de efectuar esta comparação, as duas proteínas são ensaiadas para uma grande variedade de concentrações e é determinada a quantidade requerida de cada proteína para inibir 50% da ligação do anti-soro à proteína imobilizada. Se a quantidade requerida da segunda proteína for menos do que duas vezes a quantidade que é requerida da proteína ou das proteínas seleccionadas, então diz-se que a segunda proteína se liga especificamente a um anticorpo criado para o imunogene. VI. Ácidos Nucleicos A sonda de DAP ou de MDL humana, ou fragmentos daí resultantes irá ser utilizada para identificar ou isolar ácidos nucleicos que codificam proteínas homólogas de outras espécies ou outras proteínas relacionadas na mesma ou noutras espécies. Pode ser utilizada a hibri-dização ou a tecnologia de PCR.

Está também descrita a utilização de DNA isolado ou de fragmentos para codificar, por exemplo, um poli-peptídeo correspondente à DAP12 biologicamente activo. Adicionalmente, está descrito o DNA isolado ou recombinante que codifica uma proteína ou um polipeptídeos biologicamente activo que é capaz de hibridizar sob condições 52 ΡΕ1003861 apropriadas com as sequências de DNA aqui descritas. A referida proteína ou polipeptídeo biologicamente activo pode ser uma DAP12 intacta, ou um fragmento, e possuir uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico apresentado na Tabela 1. Adicionalmente, esta invenção engloba a utilização de DNA isolado ou recombinante, ou fragmentos daí resultantes, que codificam uma proteína que é homóloga a uma DAP12 ou que foi isolada utilizando cDNA que codifica a DAP12 humana como uma sonda de PCR ou de hibridização. O DNA isolado pode possuir as sequências regulatórias respectivas nas extremidades 5' e 3', por exemplo, promotores, estimuladores, sinais para a adição de poli-A e outros.

Um ácido nucleico "isolado" é um ácido nucleico, por exemplo, um RNA, DNA, ou uma mistura de polímeros, que está substancialmente separado de outros componentes que acompanham naturalmente uma sequência nativa, por exemplo, ribossomas, polimerases, e sequências genómicas flanquea-doras das espécies originárias. A invenção engloba uma sequência de ácido nucleico que foi removida do seu ambiente natural, e inclui isolados de DNA recombinante ou clonado e análogos quimicamente sintetizados ou análogos biologicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Uma molécula substancialmente pura inclui formas isoladas da molécula.

Um ácido nucleico isolado será geralmente uma composição de moléculas homogénea, mas, em algumas formas 53 ΡΕ1003861 de realização, possuirá menor heterogeneidade. Esta heterogeneidade é normalmente encontrada nas extremidades do polimero ou nas porções não criticas para uma função ou actividade biológica desejada. Alternativamente uma composição de sequências purificadas pode ser misturada, por exemplo, numa abordagem de PCR degenerado.

Um ácido nucleico "recombinante" é definido quer pelo seu método de produção quer pela sua estrutura. Com referência ao seu método de produção, por exemplo, um produto efectuado através de um processo, o processo é a utilização de técnicas de ácido nucleico recombinantes, por exemplo, envolvendo a intervenção humana na sequência de nucleótidos. Alternativamente, pode ser um ácido nucleico efectuado pela criação de uma sequência compreendendo a fusão de dois fragmentos que não estão naturalmente contíguos um ao outro, mas obriga a excluir produtos da natureza, por exemplo, mutantes que ocorrem na natureza. Assim, por exemplo, são englobados produtos efectuados através da transformação de células com um vector que não ocorre naturalmente, tal como ácidos nucleicos que compreendem uma sequência derivada utilizando um processo de oligonu-cleótido sintético. Isso é muitas vezes efectuado para substituir um codão por um codão redundante que codifica o mesmo aminoácido ou um conservativo, enquanto que introduz ou remove normalmente, por exemplo, um sitio de restrição ou uma sequência de reconhecimento. Alternativamente, é efectuado para juntar segmentos de ácidos nucleicos de funções desejadas por forma a gerar uma única entidade 54 ΡΕ1003861 genética que contém uma combinação desejada de funções não encontradas sob as formas comummente disponíveis na natureza. Os sitios de restrição de reconhecimento de enzimas são muitas vezes o alvo de tais manipulações artificiais, mas outros alvos de sitio especifico, por exemplo, promotores, sitios de replicação de DNA, sequências de regulação, sequências controlo, ou outras caracteristicas úteis podem ser incorporados para esse fim. Um conceito similar é pretendido para uma fusão ou polipeptideo recombinantes. Estão especificamente incluídos ácidos nucleicos sintéticos que, por redundância do código genético, codificam polipeptídeos similares a fragmentos destes antigénios, e fusões de sequências a partir de várias espécies variantes diferentes.

Um "fragmento" num contexto de ácido nucleico é um segmento contíguo de pelo menos cerca de 17 nucleótidos, geralmente de pelo menos 20 nucleótidos, mais geralmente de pelo menos cerca de 23 nucleótidos, normalmente de pelo menos cerca de 26 nucleótidos, mais normalmente de pelo menos cerca de 29 nucleótidos, muitas vezes de pelo menos cerca de 32 nucleótidos, ainda mais vezes de pelo menos cerca de 35 nucleótidos, tipicamente de pelo menos cerca de 38 nucleótidos, mais tipicamente de pelo menos cerca de 41 nucleótidos, usualmente de pelo menos cerca de 44 nucleótidos, mais usualmente de pelo menos cerca de 47 nucleótidos, preferencialmente de pelo menos cerca de 50 nucleótidos, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 53 nucleótidos, e em formas de realização particularmente 55 ΡΕ1003861 preferíveis terá pelo menos cerca de 56 ou mais nucleótidos, por exemplo, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300, etc.

Um DNA que codifica para, por exemplo, uma proteína DAP12, será particularmente útil para identificar genes, mRNA e cDNA de espécies que codificam para antigénios relacionados ou homólogos, bem como DNAs que codificam para proteínas homólogas de diferentes espécies. Várias proteínas DAP12 devem ser similares na sua sequência e estão aqui descritas. No entanto, mesmo as proteínas que possuem uma relação evolucionária mais distante com a DAP12 podem facilmente ser isoladas utilizando estas sequências se elas exibirem similaridade suficiente. As proteínas primárias de DAP12, DAP10, e de MDL-1 são de particular interesse.

Esta invenção engloba também moléculas e fragmentos de DNA recombinante contendo uma sequência de DNA idêntica ou altamente homóloga aos DNAs isolados de MDL-1 aqui descritos. Em particular, as sequências estarão muitas vezes operacionalmente ligadas a sequências de DNA que controlam a transcrição, a tradução, e a replicação de DNA. Alternativamente, os clones recombinantes derivados a partir das sequências genómicas, por exemplo, contendo intrões, serão úteis para estudos transgénicos, incluindo, por exemplo, células e organismos transgénicos, e para terapia de genes. Ver, por exemplo, Goodnow (1992) "Transgenic Animais" in Roitt (ed.) Encyclopedia of 56 ΡΕ1003861

Immunoloqy Academic Press. San Diego, pp. 1502-1504, Travis (1992) Science 265: 1392-1394/ Kuhn, et al. (1991) Science 254: 707-710; Capacchi (1989) Science 244: 1288; Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford; e Rosenberg (1992) J. Clinicai Oncology 10: 180-199. Associações funcionais de promotores heterólogos com sequências de genes naturais são também fornecidas, tal como vectores que codificam, por exemplo, o MDL-1 com um parceiro receptor.

Sequências de ácidos nucleicos homólogas, quando comparadas, exibem similaridade de sequência significativa. Os padrões para a homologia em ácidos nucleicos são medidos quer por homologia normalmente utilizada na técnica de comparação de sequência ou baseada nas condições de hibridização. As condições de hibridização estão descritas em maior detalhe em baixo.

Para comparação de sequências, uma sequência funciona normalmente como uma sequência de referência, com a qual a sequência teste é comparada. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências teste e de referência são introduzidas num computador, são designadas as coordenadas de subsequência, se necessário, e são designados os parâmetros do programa do algoritmo de sequência. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade das sequências para a(s) sequência(s) teste relativamente à sequência de referência com base nos parâmetros designados do programa. 57 ΡΕ1003861

Pode ser conduzido um alinhamento óptico de sequências para comparação, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de

Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, E TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspecção visual (Ver normalmente Ausubel et al., supra).

Um exemplo de um algoritmo útil é o PILEUP. O PILEUP cria um alinhamento múltiplo de sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas utilizando, alinhamentos entre pares de sequências progressivos para apresentar a relação e a percentagem da identidade das sequências. É também esquematizada uma árvore ou um dendograma apresentando as relações dos agregados utilizadas para criar o alinhamento. O PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng e Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. 0 método utilizado é similar ao método descrito por Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153. O programa pode alinhar até 300 sequências, cada uma delas com um comprimento máximo de 5,000 nucleótidos ou aminoácidos. O procedimento de alinhamento múltiplo começa com o alinhamento entre pares 58 ΡΕ1003861 de sequências das duas sequências mais similares, produzindo um aqreqado de duas sequências alinhadas. Este aqregado é então alinhado à sequência seguinte mais relacionada ou ao agregado de sequências agregadas. Dois agregados de sequências são alinhados por uma extensão simples do alinhamento entre pares de sequências das duas sequências individuais. 0 alinhamento final é alcançado por uma série de alinhamentos entre pares de sequências progressivos. 0 programa decorre designando sequências especificas e as coordenadas dos seus aminoácidos ou nucleótidos para as regiões de comparação de sequências e designando os parâmetros do programa. Por exemplo, uma sequência de referência pode ser comparada a outras sequências teste para determinar a percentagem da relação de identidade da sequência utilizando os seguintes parâmetros: penalidade para o peso de um gap (3,00), penalidade para o comprimento de um gap (0,10),e valor dos gaps terminais.

Outro exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem da identidade da sequência e da similaridade da sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito por Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. O software para efectuar análises de BLAST está disponível publicamente através do National Center of Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiramente a identificação de pares de sequências com elevada pontuação (HSPs) através da identificação de pequenas palavras de comprimento W na 59 ΡΕ1003861 sequência indagada, as quais emparelham ou satisfazem alguns valores positivos limite da pontuação T quando alinhadas com um palavra do mesmo comprimento numa base de dados de sequências. T é referido como a palavra vizinha da pontuação limite (Altschul et al., supra). Estes palavras vizinhas iniciais limite actuam como fonte para iniciar pesquisas para encontrar HSPs maiores que as contenham. As palavras limite são então estendidas em ambas as direcções ao logo de cada sequência tanto quanto a pontuação do alinhamento cumulativo possa ser aumentada. A extensão das palavras limite em cada direcção é detida quando: a pontuação do alinhamento cumulativo diminui devido à quantidade X do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa cai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de residuos de pontuação negativa; ou é alcançada a extremidade de qualquer das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST, W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST utiliza como defeito um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915), os alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, e uma comparação de ambas as cadeias.

Adicionalmente para calcular a percentagem de identidade da sequência, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787). Uma medida da 60 ΡΕ1003861 similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), a qual fornece uma indicação da probabilidade pela qual um emparelhamento entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos venha provavelmente a ocorrer. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma numa comparação de um ácido nucleico teste com o ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente, menor do que cerca de 0,01, e ainda mais preferencialmente menor do que cerca de 0,001.

Uma indicação posterior de que duas sequências de ácido nucleico de polipeptídeos são substancialmente idênticas é a de que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico apresenta reactividade imunolo-gicamente cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Assim, normalmente um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois polipeptídeos diferem apenas nas substituições conservativas. Outra indicação de que as duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é a de que as duas moléculas hibridizam uma com a outra sob condições estringentes, como descrito abaixo.

Identidade substancial no contexto da comparação de sequências de ácidos nucleicos significa que ou os segmentos, ou as suas cadeias complementares, quando 61 ΡΕ1003861 comparados, são idênticos quando alinhados optimamente, com inserções ou delecções de nucleótidos apropriadas, em pelo menos cerca de 50% dos nucleótidos, geralmente pelo menos cerca de 56%, mais geralmente pelo menos cerca de 59%, ordinariamente pelo menos cerca de 62%, mais ordinariamente pelo menos cerca de 65%, muitas vezes pelo menos cerca de 68%, ainda mais vezes pelo menos cerca de 71%, normalmente pelo menos cerca de 74%, mais normalmente pelo menos cerca de 77%, usualmente pelo menos cerca de 80%, mais usualmente pelo menos cerca de 85%, preferencialmente pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 a 98% ou mais, e em formas de realização particulares, tão alto como cerca de 99% ou mais do nucleótidos. Alternativamente, a identidade substancial existe quando os segmentos hibridizam sob condições selectivas de hibridização, a uma cadeia, ou é complementado, utilizando normalmente uma sequência derivada da Tabela 1. Normalmente, a hibridização selectiva ocorre quando existe pelo menos cerca de 55% de homologia sob uma extensão de pelo menos cerca de 14 nucleótidos, preferencialmente cerca de 65%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 75%, e ainda mais preferencialmente cerca de 90%. Ver, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203-213. O comprimento da comparação da homologia, como descrito, pode estar sob extensões maiores, e em certas formas de realização poderá estar sob uma extensão de pelo menos cerca de 17 nucleótidos, usualmente pelo menos cerca de 20 nucleótidos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 nucleótidos, normalmente pelo menos cerca de 28 nucleótidos, mais normalmente pelo menos cerca de 40 62 ΡΕ1003861 nucleótidos, preferencialmente pelo menos cerca de 50 nucleótidos, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 75 a 100 ou mais nucleótidos, por exemplo, 125, 150, 200, 250, 300, etc.

Condições estringentes, no que se refere à identidade no contexto de hibridização, serão condições combinadas de estringência de sal, temperatura, solventes orgânicos, e outros parâmetros normalmente controlados em reacções de hibridização. Condições estringentes de temperatura incluem usualmente temperaturas em excesso de cerca de 30 °C, mais usualmente em excesso de cerca de 37 °C, tipicamente em excesso de cerca de 45 °C, mais tipicamente em excesso de cerca de 55 °C, preferencialmente em excesso de cerca de 65 °C, e mais preferencialmente em excesso de cerca de 70 °C. As condições de estringência de sal serão ordinariamente menores do que cerca de 500 mM, usualmente menores do que cerca de 350 mM, mais usualmente menores do que cerca de 200 mM, normalmente menores do que cerca de 150 mM, preferencialmente menores do que cerca de 100 mM, e mais preferencialmente menores do que cerca de 50 mM. No entanto, a combinação de parâmetros é muito mais importante do que a medida de qualquer parâmetro isolado. Ver, por exemplo, Wetmur e Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370. A hibridização sob condições de estringência deve fornecer um fundo de pelo menos 2 vezes sob o fundo, preferencialmente de pelo menos 3-5 ou mais. A DAP ou a MDL de outros indivíduos humanos podem 63 ΡΕ1003861 ser clonadas e isoladas por hibridização ou por PCR. Alternativamente, a preparação de uma preparação de anticorpo que exiba menor especificidade alélica pode ser útil em abordagens na clonagem de expressão. As variantes alélicas podem ser caracterizadas utilizando, por exemplo, uma combinação de análise de sequências e de PCR redundante, por exemplo, utilizando iniciadores definidos, fornecendo assim informação sobre a variação alélica numa população humana. VII. Produzir DAP ou MDL; Miméticas 0 DNA que codifica um antigénio de DAP ou de MDL ou fragmentos dai derivados pode ser obtido por síntese química, pelo rastreio de bibliotecas de DNA, ou pelo rastreio de bibliotecas genómicas preparadas a partir de uma grande variedade de linhas celulares ou amostras de tecido. moléculas podem ser purificadas

Este DNA pode ser expresso numa grande variedade de células hospedeiras para a síntese de um antigénio de cadeia completa ou fragmentos que podem por sua vez, por exemplo ser utilizados para criar anticorpos monoclonais ou policlonais; para estudos de ligação; para construção e expressão de moléculas modificadas; e para estudos de estrutura/função. Cada antigénio ou os seus fragmentos podem ser expressos em células hospedeiras que são transformadas ou transfectadas com vectores de expressão apropriados. Estas 64 ΡΕ1003861 substancialmente para ficarem livres de proteínas ou de contaminantes celulares, por exemplo, os derivados do hospedeiro recombinante, e por isso são particularmente úteis em composições farmacêuticas quando combinadas com um veiculo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. 0 antigénio, ou porções dai resultantes podem ser expressos como fusões com outras proteínas.

Os vectores de expressão são normalmente construtores de DNA ou de RNA auto-replicantes contendo os gene do antigénio desejado ou os seus fragmentos, usualmente ligado operacionalmente a elementos de controlo genético adequados que são reconhecidos numa célula hospedeira adequada. Estes elementos controlo são capazes de efectuar a expressão num hospedeiro adequado. O tipo específico de elementos de controlo necessários para efectuar a expressão irá depender da célula hospedeira eventualmente utilizada. Geralmente, os elementos de controlo genético podem incluir um sistema promotor procariótico ou um sistema de controlo de expressão do promotor eucariótico, e inclui normalmente um promotor transcripcional, um operador opcional para controlar o início da transcrição, estimuladores da transcrição para elevar o nível de expressão do mRNA, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossoma adequado, e sequências que terminam a transcrição e a tradução. Os vectores de expressão usualmente contêm também uma origem de replicação que permite ao vector replicar-se independentemente da célula hospedeira. 65 ΡΕ1003861

Os vectores contêm DNA que codifica, por exemplo, um antigénio de DAP12 humano, ou um fragmento dai resultante que codifica um polipeptideo biologicamente activo. 0 DNA pode encontrar-se sob controlo de um promotor virai e pode codificar um marcador de selecção. Está também descrita a utilização de tais vectores de expressão que são capazes de expressar cDNA eucariótico codificado para um antigénio de DAP12 primata num hospedeiro procariótico ou eucariótico, onde o vector é compatível com o hospedeiro e onde o cDNA eucariótico que codifica para o antigénio é inserido no vector tal que o crescimento do hospedeiro contendo o vector expressa o cDNA em questão. Usualmente, os vectores de expressão são desenvolvidos para a replicação estável nas suas células hospedeiras ou para amplificação para aumentar grandemente o número total de cópias por célula do gene desejável. Nem sempre é necessário requerer que um vector de expressão que se replique numa célula hospedeira, por exemplo, é possivel efectuar a expressão transiente do antigénio ou dos seus fragmentos em vários hospedeiros utilizando vectores que não contenham uma origem de replicação que seja reconhecida pela célula hospedeira. É também possivel utilizar vectores que causem a integração do gene da DAP12 humana ou dos seus fragmentos no DNA do hospedeiro por recombinação.

Vectores, quando utilizado aqui, compreende plasmideos, virus, bacteriófagos, fragmentos de DNA integráveis, e outros veiculos que possibilitam a integração de fragmentos de DNA no genoma do hospedeiro. Os 66 ΡΕ1003861 vectores de expressão são vectores especializados que contém elementos de controlo genético que efectuam a expressão de genes ligados operacionalmente. Os plasmideos são a forma de vector mais comummente utilizada mas todas as outras formas de vectores que desempenham uma função equivalente e que são, ou se tornam, conhecidos na técnica são adequados para serem utilizados aqui. Ver, por exemplo, Pouwels, et al. (1985 e Suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y., e Rodriguez, et al. (1988) (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersword, Boston, MA.

As células transformadas são células, preferencialmente mamíferas, que foram transformadas ou transfec-tadas com vectores de DAP12 humanas construídos utilizando técnicas de DNA recombinante. As células hospedeiras transformadas expressam usualmente o antigénio ou os seus fragmentos, mas para fins de clonagem, amplificação, e manipulação do seu DNA, não necessitam de expressar a proteina. Esta invenção contempla também o cultivo de células transformadas num meio de nutrientes, permitindo assim que a proteina se acumule em cultura. A proteina pode ser recuperada, quer da cultura ou quer do meio de cultura.

Para fins desta invenção, as sequências de DNA estão operacionalmente ligadas quando estão funcionalmente relacionadas umas com as outras. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou um lider secretório está operacionalmente ligado a um polipeptideo se expressar como uma pré- 67 ΡΕ1003861 proteína ou participar no direccionamento do polipeptídeo para a membrana celular ou na secreção do polipeptídeo. Um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se esta controlar a transcrição do polipeptídeo; um sítio de ligação de ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se esta estiver posicionada para permitir a tradução. Usualmente, operacionalmente ligado significa que está contíguo e em fase de leitura, no entanto, certos elementos genéticos tais como genes repressores não estão ligados contiguamente mas mantêm-se ligados ás sequências operadoras que por seu turno controlam a expressão.

As células hospedeiras adequadas incluem, por exemplo, procariotas, eucariotas inferiores, e eucariotas superiores. Os procariotas incluem tanto organismos gram positivos como gram negativos, por exemplo, E. coli e B. subtilis. Os eucariotas inferiores incluem as leveduras, por exemplo, S. cerevisiae e Pichia, e espécies do género Dictyostelium. Os eucariotas superiores incluem linhas celulares de culturas de tecido estabelecida a partir de células animais, tanto de origem não mamífera, por exemplo, células de insectos e de aves, como de origem mamífera, por exemplo, de humanos, primatas, e roedores.

Os sistemas de vectores hospedeiros procarióticos incluem uma grande variedade de vectores de muitas espécies diferentes. Quando utilizado aqui, a E. coli e os seus vectores serão utilizados genericamente para incluir 68 ΡΕ1003861 vectores equivalentes utilizados em outros procariotas. Um vector representativo para amplificação de DNA é o pBR322 ou muitos dos seus derivados. Os vectores que podem ser utilizados para expressar, por exemplo, os antigénios da DAP12 humana ou os seus fragmentos incluem, mas não estão limitados a, vectores tais como os que contêm o promotor lac (série pUC); o promotor trp (pBR322-trp); promotor lpp (a série pIN); promotores lambda-pP ou pR (pOTS); ou promotores híbridos tais como ptac (pDR540). Ver Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, e lpp- derived Promoters" em Rodriguez e Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersword, Boston, Chapter 10, pp. 205-236.

Os eucariotas inferiores, por exemplo, leveduras e Dictyostelium, podem ser transformados com, por exemplo, a sequência do antigénio da DAP12 humana contendo os vectores. Para os fins desta invenção, o hospedeiro eucariótico inferior mais comum é a levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae. Será também utilizada para representar genericamente eucariotas inferiores apesar de um número de outras estirpes e espécies estarem também disponíveis. Os vectores de levedura consistem normalmente de uma origem de replicação (com excepção dos do tipo integrativo) , num gene de selecção, num promotor, em DNA que codifica a proteína desejada ou os seus fragmentos, e sequências para a terminação da tradução, poliadenilação, e terminação da transcrição. Vectores de expressão adequados para levedura incluem promotores constitutivos tais como a 69 ΡΕ1003861 cinase do 3-fosfoglicerato e várias outros promotores de genes de enzimas glicoliticas ou promotores induziveis tais como o promotor da álcool desidrogenase 2 ou o promotor metalotionina. Vectores adequados incluem derivados dos seguintes tipos: auto-replicantes de baixo número de cópias (tal como os da série YRp), auto-replicantes de elevado número de cópias (tal como os da série YEp); tipos integrantes (tal como os da série YIp), ou minicromossomas (tal como os da série YCp).

Células de cultura de tecidos de eucariotas superiores são as células hospedeiras preferidas para a expressão da proteina do antigénio de DAP ou MDL humana funcionalmente activa. Em principio, muitas linhas celulares de cultura de tecidos de eucariotas superiores são utilizáveis, por exemplo, sistemas de expressão do baculovirus de insecto, quer de fonte invertebrada ou vertebrada. No entanto, as células mamiferas são preferíveis, neste processamento, tanto co-traducionalmente como pós-traducionalmente. A transformação ou transfecção e propagação de tais células tornou-se num procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares úteis incluem células HeLa, linhas celulares de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares de rim de rato bebé (BRK) , linhas celulares de insecto, linhas celulares de aves e linhas celulares de macaco (COS). Os vectores de expressão para tais linhas celulares incluem usualmente uma origem de replicação, um promotor, um sítio de iniciação da tradução, sítios de processamento de RNA (se for utilizado DNA 70 ΡΕ1003861 genómico), um sítio de poliadenilação, e um sítio de terminação da transcrição. Estes vectores contêm também usualmente um gene de selecção ou gene de amplificação. Os vectores de expressão adequados podem ser plasmídeos, vírus, ou retrovírus que transportam promotores derivados, por exemplo, de tais fontes bem como de adenovírus, SV40, parvovírus, vírus vaccinia, ou citomegalovírus. Exemplos representativos de vectores de expressão adequados incluem o pCDNAl; pCD, ver Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136-1142; pMClneo Poly-A, ver Thomas, et al. (1987) Cell 51: 503-512; e um vector de baculovírus tal como o pAC 373 ou pAC 610.

Será muitas vezes desejável expressar um poli-peptídeos do antigénio de DAP ou de MDL humana num sistema que fornece um padrão de glicosilação específico ou definido. Neste caso, o padrão usual será aquele que é fornecido naturalmente pelo sistema de expressão. No entanto, o padrão será modificado pela exposição do polipeptídeo, por exemplo, uma forma não glicosilada, para proteínas de glicosilação apropriadas introduzidas num sistema de expressão heterólogo. Por exemplo, o gene do antigénio de DAP12 pode ser co-transformado com um ou mais genes que codificam enzimas de mamíferos ou outras enzimas de glicosilação. Utilizando esta abordagem, certos padrões de glicosilação de mamíferos serão alcançáveis ou aproximados em procariotas ou em outras células.

Os antigénios de DAP podem também ser produzidos 71 ΡΕ1003861 numa forma a qual está ligada ao fosfatidil-inositol (PI), mas que pode ser removido das membranas por tratamento com uma enzima de clivagem do fosfatidil-inositol, por exemplo, fosfatidil-inositol fosfolipase C. Isto liberta o antigénio de uma forma biologicamente activa, e permite a purificação por procedimentos padrão da química proteica. Ver, por exemplo, Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988: 427-454; Tse, et al. (1985) Science 230: 1003-1008; e Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114: 1275-1283. Alternativamente, os segmentos purificados podem ser manipulados na sequência, por exemplo, no N-terminal ou no C-terminal, para assistir na purificação ou detecção do produto proteína. Os meios para remover tais segmentos podem também ser manipulados, por exemplo, sítios de clivagem de protease.

Agora que todas as sequências são conhecidas, os antigénios de DAP12 ou de MDL de primata, fragmentos ou derivados daí resultantes podem ser preparados por processos convencionais para sintetizar peptídeos. Estes incluem processos tais como os descritos em Stewart e Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical CO. Rockford, IL; Bodanszky e Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; e Bodanszky (1984) The Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York. Por exemplo, pode ser utilizado um processo de azida, um processo de cloreto de ácido, e um processo de anidrido de ácido, um processo de anidrido misto, um processo de éster activo (por exemplo, éster de 72 ΡΕ1003861 p-nitrofenilo, éster de N-hidroxisuccinimida, ou éster de cianometilo), um processo de carbodimidazole, um processo de oxidação-redução, ou um processo de diciclo-hexilcar-bodiimida (DCCD)/aditivo. As sínteses de fase sólida e de fase líquida são ambas aplicáveis ao processo correntes.

Os antigénios de DAP ou de MDL humanas, fragmentos e derivativos adequadamente preparados de acordo com os processos acima normalmente empregues na síntese de peptídeos, geralmente quer por um processo chamado passo a passo ("stepwise") que compreende a condensação de um aminoácido ao aminoácido terminal, um por um em sequência, ou acoplando fragmentos do polipeptídeo ao aminoácido terminal. Os grupos amino que não foram utilizados na reacção de acoplamento devem ser protegidos para prevenir a acoplação numa localização incorrecta.

Se for adoptada uma síntese de fase sólida, o aminoácido C-terminal é ligado a um veículo ou suporte insolúvel através do seu grupo carboxílico. Veículo insolúvel não +e particularmente limitado desde que possua uma capacidade de ligação a um grupo carboxílico reactivo. Exemplo de tais veículos insolúveis incluem resinas halometílicas, tais como a resina clorometílica ou a resina bromometílica, resinas hidroximetílicas, resinas fenólicas, resinas tert-alquiloxicarbonil-hidrolisadas, e outras.

Um aminoácido com o grupo amina protegido é ligado em sequência através da condensação do seu grupo 73 ΡΕ1003861 carboxílico activado e do grupo aminoreactivo do peptídeo ou cadeia anteriormente formado, para sintetizar o peptideo passo a passo. Após a sintese de toda a sequência, o peptideo é separado do veículo insolúvel para produzir o peptideo. Esta abordagem de fase sólida é geralmente descrita por Merryfield, et al. (1963) em J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156. O antigénio preparado e fragmentos daí derivados podem ser isolados e purificados a partir da mistura de reacção através de métodos de separação de peptídeos, por exemplo, por extracção, precipitação, electroforese e várias formas de cromatografia, e outros. Os antigénios da DAP12 humana desta invenção podem ser obtidos em vários graus de pureza dependendo do uso desejado. A purificação pode ser conseguida pela utilização das técnicas da purificação de proteínas aqui descritas ou pela utilização dos anticorpos aqui descritos, por exemplo, em cromatografia de afinidade imunoabsorvente. Esta cromatografia de afinidade imunoabsorvente é efectuada, por exemplo, ligando primeiramente os anticorpos a um suporte sólido e então pondo em contacto os anticorpos ligados com lisados de células solubilizadas, lisados de outras células que expressam, por exemplo, os antigénios de DAP12, ou lisados ou sobrenadantes de células que produzem os antigénios de DAP12 como resultado das técnicas de DNA, ver em baixo. 74 ΡΕ1003861 VIII. Utilizações A presente invenção fornece reagentes que serão úteis em aplicações de diagnóstico como descrito neste trabalho, por exemplo, na descrição geral para anormalidades desenvolvidas ou fisiológicas, ou em baixo na descrição de estojos ("kits") de diagnóstico.

Muitos dos receptores importantes na activação de leucócitos (incluindo o receptor de antigénio de células T, e imunoglobulina e receptores Fc) sem propriedades de sinalização intrínsecas, mas transmitem os seus sinais acoplando-se não covalentemente com outras proteínas de membrana que contêm motivos de activação baseados no imunoreceptor da tirosina (ITAM, YxxL- espaçador de 6 a 8 aminoácidos - YxxL) nos seus domínios citoplasmáticos. Por exemplo, o receptor de antigénio de células T está associados com as proteínas CD3 gama, delta, epsilon, e zeta que contêm sequências ITAM. Similarmente, a superfície da imunoglobulina em células B está associada com CD79A e CD79B que contêm ITAM e são requeridas para a transdução de sinal. Os receptores Fc para IgG (CD16) em células NK associadas com CD3 zeta ou com a subunidade gama do receptor Fc de IgE (contendo ambas ITAM) e o receptor de elevada afinidade de IgE em mastócitos associado com a subunidade gama do receptor Fc de IgE. Por isso, proteínas associadas contendo ITAM representam uma estratégia geral na construção da activação dos receptores nos leucócitos. 75 ΡΕ1003861

Recentemente, foram identificadas numerosas novas famílias de receptores de leucócitos que são estruturalmente diversas. Certas isoformas da família de receptores KIR, ILT/MIR, Ly4 9, e CD94/NKG2 foram implicadas na sinalização positiva; no entanto, estas moléculas (por exemplo KIR-NKAT5, KIR-C139, ILT1, gp91/PIR, e CD94) não têm sequências nos seus domínios citoplasmáticos o que seria consistente com a capacidade de sinalização positiva.

Dado que os receptores de antigénio de células T, os receptores de imunoglobulinas, e os receptores Fc, apresentam todos a função de sinalização por associação com outra pequena subunidade contendo ITAM, é provável que estes outros receptores de leucócitos possam utilizar uma estratégia similar.

Por isso, bases de dados de sequências disponíveis foram pesquisadas com sequências de proteína da cadeia gama, delta, epsilon, e zeta, e gama do receptor Fc de IgE da CD3 humana e de rato. Uma EST designado LVA03A foi identificado por codificar uma proteína de membrana putativa de ~12 kd com um resíduo acídico (D) no segmento transmembranar e uma sequência ITAM perfeita no domínio citoplasmático. Os resíduos de cisteína no domínio extracelular mais pequeno sugerem que a molécula pode ser expressa como um dímero dissulfureto ligado. Estudos de distribuição indicam que o gene é transcrito em macrófagos, células dendríticas, algumas células T, e células NK. Esta proteína foi designada por Proteína de Activação DNAX 12 76 ΡΕ1003861 (DAP12). Foi também identificado um gene análogo, designado DAP10, que processa os motivos ITIM.

Os receptores contendo ITAM foram todos importantes na indução da função leucocitária (por exemplo, receptor de antigénios das células T, receptor da imunoglobulina, receptor Fc) . Por isso, é provável que a DAP12 possua um papel importante na transdução de sinal em leucócitos. Os agonistas e antagonistas da DAP12 devem fornecer utilidade tanto potenciando como inibindo respostas imunes (isto é, proliferação, produção de citoquinas, indução de apoptose, ou activando a citotoxicidade mediada pela célula), respectivamente.

Os receptores contendo o motivo YxxM foram identificados como sendo importantes em certa moléculas de sinalização, por exemplo, CD98, CTLA-4, e CD19. Por isso, é provável que a DAP10 desempenhe um papel importante na transdução de sinal. Os agonistas e os antagonistas de DAP10 devem fornecer utilidade tanto potenciando como inibindo respostas imunes (isto é, proliferação, produção de citoquinas, indução de apoptose, ou activando a citotoxicidade mediada pela célula), respectivamente. É antecipado que a DAP12 pode associar-se não covalentemente com diversos receptores de membrana diferentes, por exemplo, mas não necessariamente limitadas a receptores de antigénio de células T, aos receptores de antigénio de pré-células T, aos receptores de imuno- 77 ΡΕ1003861 globulina, receptores de Fc, aos receptores da família KIR, aos receptores da família ILT/MIR, aos receptores da família LAIR, aos receptores da família gp91/PIR, os receptores da família Ly49 (especificamente Ly49D e Ly49H), e aos receptores da família CD94/NKG2. Entre estes encontra-se o da MDL-1. Por isso, os reagentes que afectam a interacção da DAP12 com os referidos receptores podem tanto aumentar quer suprimir a função destas moléculas para intervenção terapêutica (isto é, aumentar a imunidade para a vacinação ou para doenças de imunodeficiência ou para suprimir respostas imunes no caso de doenças auto-imunes ou de transplantação) . As combinações da DAP com qualquer um destes receptores serão úteis, por exemplo, para o rastreio de fármacos que interrompem a interacção e a subsequente sinalização, tal como os anticorpos para as formas dos complexos estruturais resultantes da sua interacção. A DAP12 pode desempenhar um papel na sinalização da integrina como Beta2. É claro que a integrina Beta2 pode transmitir um sinal dependente da cinase P Tir envolvendo Syk. Nas Syk knockouts a Beta2 não sinaliza. A via envolve provavelmente também FcyR (em Monócitos, Macrófagos e células B) como um regulador negativo. No entanto, não existe a possibilidade de a Syk se associar com as integrinas de Beta2 devido a estas não possuírem sequências contendo ITAM nos seus domínios citoplasmáticos. Além disso, não existe evidência de que as proteínas conhecidas contendo ITAM se possam associar com Beta2. Assim, a DAP12 será uma candidata ou protótipo principal para se associar com Beta2. 78 ΡΕ1003861

Esta invenção fornece reagentes com valor terapêutico significativo. A DAP12 ou DAP10 humana (que ocorre naturalmente na natureza ou recombinante) , os fragmentos dai resultantes e os seus anticorpos, juntamente com compostos identificados como possuindo afinidade de ligação à DAP de primata, devem ser úteis no tratamento de condições associadas com a resposta à célula B anormal, incluindo a proliferação anormal, por exemplo, condições cancerigenas, ou condições degenerativas. A proliferação, a regeneração, a degeneração, e atrofia anormais podem ser moduladas por tratamento terapêutico apropriado utilizando as condições aqui fornecidas. Por exemplo, uma doença ou desordem associada com a expressão anormal ou a activação anormal de DAP12 deve ser um alvo provável para um agonista ou um antagonista do antigénio. A DAP12 desempenha provavelmente um papel na activação ou regulação das células imunes, que afectam as respostas imunológicas, por exemplo, doenças auto-imunes ou respostas alérgica.

Adicionalmente, a interacção do parceiro de ligação DAP:DAP pode estar envolvida em interacções de células T, NK, DC, ou de monócitos que permitem a activação, proliferação, e/ou diferenciação das células interactuantes. Se assim for, o tratamento pode resultar da interferência com a transdução do sinal do parceiro de ligação DAP:DAP potenciando ou inibindo particularmente as respostas imunes tais como a proliferação, a produção de citoquinas, a apoptose induzida, ou a activação da 79 ΡΕ1003861 citotoxicidade mediada pela célula. O bloqueio do sinal pode ser efectuado, por exemplo, por DAP solúvel ou anticorpos de DAP, ou fármacos que disrompem a interacção funcional da DAP com o seu parceiro complexo receptor.

Outras condições anormais de desenvolvimento são conhecidas em cada um dos tipos de célula que demonstram possuir mRNA de DAP12 ou de DAP10 por análise de Northern blot, por exemplo, linfócitos, NK, monócitos, e células dendriticas. Ver Berkow (ed.) The Merck Manual of Diaqnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N. J.; e Thorn, et al. Harrison's Principies of Internai Medicine, McGraw-Hill, N. Y. Por exemplo, pode ser atingida a imunossupressão terapêutica bloqueando a interacção do linfócito T e do linfócito B através desta molécula. Irá representar uma terapia importante para controlar as doenças auto-imunes e a rejeição do enxerto durante a transplantação. O bloqueio pode ser efectuado com composições que bloqueiam as ligações, por exemplo, anticorpos neutralizantes. A DAP recombinante ou anticorpos de DAP podem ser purificados e seguidamente administrados a um paciente. Estes reagentes podem ser combinados para a utilização terapêutica com componentes activos adicionais, por exemplo, em veículos ou diluentes convencionais farmaceutica-mente aceitáveis, por exemplo, adjuvantes imunogénicos juntamente com estabilizadores e excipientes fisiologi-camente inócuos. Estas combinações, e composições fornecidas, podem ser filtradas esterilmente e colocadas em 80 ΡΕ1003861 formas de dosagem quer por liofilização em frascos de dosagem ou por armazenamento em preparações aquosas estabilizadas. Esta invenção contempla também utilizações de anticorpos ou de fragmentos de ligação dai resultantes que não são complementos de ligação. O rastreio de fármacos utilizando DAP ou fragmentos dai resultantes pode ser efectuado para identificar compostos que contêm afinidade de ligação a uma DAP, incluindo o isolamento de componentes associados. Os ensaios biológicos subsequentes podem então ser utilizados para determinar se o composto possui actividade estimuladora intrínseca e é por isso um agente bloqueador ou se é um antagonista e por isso bloqueia a sinalização. Igualmente, um composto contendo actividade estimuladora intrínseca pode activar o antigénio e é assim um agonista e por isso estimula a actividade de uma DAP. Está também descrita a utilização terapêutica de anticorpos para DAP como antagonistas. Esta abordagem pode ser particularmente útil com outras espécies variantes de DAP ou de MDL.

As quantidades de reagentes necessárias para a terapia efectiva irão depender de muitos factores diferentes, incluindo os meios de administração, o sítio alvo, o estado fisiológico do paciente e os outros medicamentos administrados. Assim, as dosagens de tratamento devem ser tituladas para optimizar a segurança e a eficácia. Normalmente, as dosagens utilizadas in vitro podem fornecer orientações úteis nas quantidades utilizadas na adminis- 81 ΡΕ1003861 tração in situ destes reagentes. Os testes em animais de doses efectivas para tratamento de doenças particulares irão fornecer indicação preditiva adicional para a dosagem em humanos. Estão descritas várias considerações, por exemplo, em Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8 th Ed., Pergamon Press; e Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Os métodos para a administração estão ai descritos e em baixo, por exemplo, para administração oral, intravenosa, intrape-ritoneal, ou intramuscular, difusão transdérmica e outras. Veiculos farmaceuticamente aceitáveis deverão incluir água, solução salina, tampões, e outros componentes descritos, por exemplo, em Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Espera-se que o intervalo de dosagem seja normalmente em quantidades menores do que concentrações de 1 mM, tipicamente concentrações menores do que cerca de 10 μΜ, usualmente menores do que cerca de 100 nM, preferencialmente menores do que cerca de 10 pM (picomolar), e mais preferencialmente menores do que cerca de 1 fM (fento-molar), com um veiculo apropriado. Formulações de libertação lenta, ou um aparelho de libertação lenta serão muitas vezes utilizados para administração continua. A DAP ou a MDL humanos, fragmentos dai resultantes, e anticorpos para estas, ou para os seus fragmentos, antagonistas, e agonistas podem ser administrados directamente no hospedeiro para ser tratado ou, dependendo do tamanho dos compostos, pode ser desejável conjugá-los a 82 ΡΕ1003861 veículos de proteínas tais como a ovalbumina ou a albumina sérica antes da sua administração. As formulações terapêuticas podem ser administradas em diversas formulações convencionais de dosagem. Enquanto for possível administrar somente o componente activo, é preferível apresentá-lo como uma formulação farmacêutica. As formulações compreendem normalmente pelo menos um componente activo, como definido acima, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis daí resultantes. Cada veículo deve ser aceitável tanto farmaceuticamente como fisiologicamente no sentido de ser compatível como os outros componentes e não ser prejudicial para o paciente. As formulações incluem aquelas adequadas para a administração tópica, oral, rectal, nasal, ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). As formulações podem ser convenientemente apresentadas sob a forma de unidades de dosagem, em formas estéreis, ou podem ser preparadas por muitos métodos bem conhecidos na área da farmacologia. Ver, por exemplo, Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8 th Ed., Pergamon Press; e Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. A terapia desta invenção pode ser combinada ou utilizada em associação com outros agentes.

Tanto a forma que ocorre naturalmente na natureza como a forma recombinante dos antigénios de DAP ou de MDL são particularmente úteis em estojos ("kits") e métodos de ensaio que são capazes de rastrear compostos para a 83 ΡΕ1003861 actividade de ligação ás proteínas. Diversos métodos de automatização de ensaios foram desenvolvidos nos últimos anos para permitir o rastreio de dezenas de milhares de compostos num curto período. Ver, por exemplo, Fodor, et al. (1991) Science 251: 767-773, que descreve formas para testar a afinidade de ligação de uma pluralidade de polímeros definidos sintetizados num substrato sólido. O desenvolvimento de ensaios adequados pode ser largamente facilitada pela disponibilidade de grandes quantidades de DAP ou de MDL solúvel, purificada como fornecidas aqui.

Por exemplo, os antagonistas podem ser encontrados normalmente assim que uma DAP ou uma MDL estejam estruturalmente definidas. O teste a antagonistas potenciais é agora possível devido ao desenvolvimento de métodos de ensaio altamente automatizados utilizando uma DAP ou MDL purificadas. Em particular, novos agonistas e antagonistas serão descobertos utilizando técnicas de rastreio tornadas possíveis aqui. São de particular importância compostos que possuem uma afinidade de ligação combinada para múltiplas proteínas de DAP12, de DAP10, ou de MDL-1, por exemplo, compostos que podem servir como antagonistas para variantes alélicas de DAP ou de MDL.

Além disso, desde que a sinalização através do parceiro de ligação DAP:DAP possa funcionar em combinação com outros sinais, a combinação de terapia com tais vias pode também ser considerada. Assim, o antagonismo de vias múltiplas de sinalização, ou estimulação com vias múltiplas 84 ΡΕ1003861 pode ser útil. Além disso, com a associação da DAP12 à MDL-1, e possivelmente também à DAP10, várias combinações dos genes descritos podem ser importantes.

Esta invenção é particularmente útil para ras-trear compostos utilizando os antigénios recombinantes em qualquer uma de várias técnicas de rastreio de fármacos. As vantagens da utilização de uma proteína recombinante no rastreio de compostos específicos incluem: (a) fonte renovável da DAP12 melhorada a partir de uma fonte específica; (b) número potencialmente maior de moléculas de antigénio por célula originando um sinal melhor à taxa de ruído nos ensaios; e (c) especificidade de espécies variantes (teoricamente originando maior especificidade biológica e de doença).

Um método de rastreio de fármacos utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas que são esta-velmente transformadas com moléculas de DNA recombinante que expressa a DAP e/ou a MDL. Podem ser isoladas células que expressam uma DAP isoladas das outras, ou em combinação com o seu parceiro complexo receptor. Tais células, quer na forma viável quer na forma fixada, podem ser utilizadas para ensaios de ligação padrão ao antigénio/parceiro. Ver também, Parce, et al. (1989) Science 246: 243-247; e Owicki, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4007-4011, que descreve métodos sensíveis para detectar respostas celulares. Os ensaios competitivos são particularmente úteis, onde as células (fonte de DAP) são 85 ΡΕ1003861 postas em contacto e incubadas com um composto marcado contendo afinidade de ligação conhecida ao antigénio, e um composto teste cuja afinidade de ligação à DAP está a ser medida. 0 composto ligado e os compostos livres são então separados para aceder ao grau de ligação. A quantidade do composto teste ligado é inversamente proporcional à quantidade medida do composto de ligação marcado. Podem ser utilizadas muitas técnicas para separar o composto ligado do livre para aceder ao grau de ligação. Este passo de separação pode envolver normalmente um procedimento tal como a adesão de filtros seguido por lavagem, adesão a plástico seguido de lavagem, ou centrifugação das membranas celulares. As células viáveis podem também ser utilizadas para rastrear os efeitos dos fármacos nas funções mediadas pela DAP, por exemplo, niveis da segunda mensagem, isto é, Ca++; proliferação celular; alterações do grupo de inositol-fosfato, e outros. Alguns métodos de detecção permitem a eliminação de um passo de separação, por exemplo, um sistema de detecção de proximidade sensitiva. A coloração sensitiva de cálcio pode ser útil para detectar niveis de Ca++, com um fluorimetro ou um aparelho distribuição de fluorescência celular.

Outro método utiliza membranas de células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas transformadas como fonte de DAP ou de MDL humanas. Estas células são estavelmente transformadas com vectores de DNA dirigindo a expressão do antigénio de DAP ou da MDL humana. Essencialmente, as membranas serão preparadas a partir das 86 ΡΕ1003861 células e utilizadas num ensaio de ligação do complexo receptor tal como no ensaio competitivo descrito abaixo.

Ainda outra abordagem é a que utiliza DAP solubilizada, não purificada, ou solubilizada, purificada a partir de células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas transformadas. Isto permite a um ensaio de ligação "molecular" com as vantagens de especificidade aumentada, a capacidade de se automatizar, e testar toda um elevado número de fármacos.

Outra técnica para rastreio de fármacos envolve uma abordagem que fornece um rastreio total elevado para compostos contendo afinidade de ligação adequada a DAP ou a MDL humanas e é descrita em detalhe em Geysen, Patente de Aplicação Europeia 84/03564, publicada em 13 de Setembro de 1984. Primeiro, um grande número de compostos teste de pequenos peptideos diferentes são sintetizados num substrato sólido, por exemplo, alfinetes de plástico ou algumas outras superfícies apropriadas, ver Fodor, et al. (1991). Depois todos os alfinetes são postos a reagir com DAP solubilizada, não purificada, ou solubilizada, purificada, e lavados. O próximo passo envolve a detecção da DAP ligada. O desenvolvimento de fármacos em quantidades racionais pode também basear-se em estudos estruturais das formas moleculares da DAP ou de MDL e de outros efectores. Os efectores podem ser outras proteínas que medeiam outras 87 ΡΕ1003861 funções em resposta ao complexo receptor de ligação, ou outras proteínas que normalmente interagem com o antigénio. Um dos meios para determinar quais os sítios que interagem com outras proteínas específicas é uma determinação da estrutura física, por exemplo, cristalografia por raio-X ou técnicas de NMR a 2 dimensões. Isto fornecerá uma orientação de como os resíduos de aminoácido formam regiões de contacto molecular. Para uma descrição detalhada da determinação estrutural da proteína, ver, por exemplo, Bundell e Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York. A D AP ou a MDL purificadas podem ser cobertas directamente em placas para utilização em técnicas de rastreio de fármacos anteriormente mencionadas. No entanto, anticorpos não neutralizantes para estes antigénios podem ser utilizados como anticorpos de captura para imobilizar a respectiva DAP ou MDL na fase sólida. IX. Estojos ("Kits")

Esta invenção contempla também a utilização de proteínas de MDL, fragmentos daí resultantes, peptídeos, e os seus produtos de fusão numa variedade de estojos ("kits") e métodos de diagnóstico para detectar a presença de MDL, ao de um parceiro de ligação. Normalmente o estojo ("kit") possuirá um compartimento contendo um segmento de gene ou um peptídeo de MDL definido ou um reagente que reconhece um ou outro. ΡΕ1003861

Um estojo ("kit") para determinar a afinidade de ligação de um composto teste para, por exemplo, uma DAP12, compreenderá normalmente um composto teste; um composto marcado, por exemplo, um parceiro de ligação ao complexo receptor ou um anticorpo contendo afinidade de ligação conhecida para a DAP12; uma fonte de DAP12 (que ocorre naturalmente na natureza ou recombinante); e meios para separar compostos marcados ligados dos livres, tais como uma fase sólida para imobilizar a DAP12. Assim que os compostos são rastreados, aqueles que contêm afinidade de ligação adequada à DAP12 podem ser avaliados em ensaios biológicos adequados, como é bem conhecido na técnica, para determinar se actuam como agonistas ou antagonistas. A disponibilidade de polipeptídeos DAP12 recombinantes fornece também padrões bem definidos para calibrar tais ensaios.

Um estojo ("kit") preferencial para determinar a concentração de, por exemplo, uma DAP12, numa amostra deverá conter normalmente um composto marcado, por exemplo, anticorpo, contendo afinidade de ligação conhecida para a DAP12, uma fonte de DAP12 (que ocorre naturalmente na natureza ou recombinante) e meios para separar compostos marcados ligados dos livres, por exemplo, uma fase sólida para imobilizar a DAP12. Serão normalmente fornecidos compartimentos contendo reagentes, e instruções.

Um método para a determinação a concentração de 89 ΡΕ1003861 DAP12 numa amostra deverá compreender normalmente os passo de: (1) preparação das membranas a partir de uma amostra que contém uma fonte de DAP12; (2) lavagem das membranas e a sua suspensão num tampão; (3) solubilização da DAP12 incubando as membranas num meio de cultura ao qual foi adicionado um detergente adequado; (4) ajustar a concentração de detergente da DAP12 solubilizada, (5) por em contacto e incubar a referida diluição com anticorpos radiomarcados para formar complexos; (6) recolha dos complexos por filtração através de filtros tratados com polietileneimina; e (7) medição da radioactividade dos complexos recuperados.

Anticorpos, incluindo fragmentos de ligação ao antigénio, específicos para a DAP humana ou fragmentos de DAP são úteis em aplicações de diagnóstico, por exemplo, para detectar a presença de níveis elevados de DAP e/ou dos seus fragmentos. Tais ensaios de diagnóstico podem empregar lisados, células vivas, células fixadas, imunofluores-cência, culturas de células, fluídos corporais, e podem envolver ainda a detecção de antigénios relacionados com a DAP em soros, ou outros. Os ensaios de diagnóstico podem ser homogéneos (sem um passo de separação entre o reagente livre e o complexo antigénio-parceiro) ou heterogéneos (com um passo de separação). Existem vários ensaios comercializados, tal como o radioimunoensaio (RIA), o ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA), o imunoensaio enzimático (EIA), a técnica de imunoensaio enzimático de multiplicação (EMIT), o imunoensaio fluorescente de subs- 90 ΡΕ1003861 trato marcado (SLFIA), e outros. Por exemplo, anticorpos não marcados podem ser empregues por utilizarem um segundo anticorpo que é marcado e que reconhece o anticorpo para uma DAP ou para um fragmento particular daí resultante. Estes ensaios foram também extensivamente discutidos na literatura. Ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.

Anticorpos anti-idiotípicos podem apresentar uma utilização similar para diagnosticar a presença de anticorpos contra uma DAP humana, tal como pode ser o diagnóstico de vários estados anormais. Por exemplo, a sobreprodução de DAP pode resultar na produção de várias reacções imunológicas que podem ser o diagnóstico de estados fisiológicos anormais, particularmente em condições proliferativas de células tais como o cancro ou a diferenciação anormal.

Frequentemente, os reagentes para ensaios de diagnóstico são fornecidos em estojos ("kits") para optimizar a sensibilidade do ensaio. Para a presente invenção, dependendo da natureza do ensaio, é fornecido o protocolo, o marcador, o anticorpo quer marcado ou não marcado, ou a DAP ou a MDL marcadas. Isto está usualmente em conjunção com outros aditivos tais como tampões, estabilizadores, materiais necessários para a produção de sinal tais como substratos para enzimas, e outros. Preferencialmente, o estojo ("kit") deverá conter instruções para utilização e disposição apropriadas dos 91 ΡΕ1003861 conteúdos após a utilização. Normalmente o estojo ("kit") contém compartimentos para cada reagente útil. Desejavelmente, os reagentes são fornecidos como pó seco liofi-lizado, onde os reagentes podem ser constituídos num meio aquoso fornecendo concentrações apropriadas de reagentes para efectuar o ensaio.

Nenhum dos constituintes do rastreio de fármacos e dos ensaios de diagnóstico acima mencionados deve ser utilizado sem modificação ou pode ser modificado numa diversidade de formas. Por exemplo, a marcação pode ser conseguida por junção covalente ou não covalente a uma parte que fornece directa ou indirectamente um sinal detectável. Em qualquer um destes ensaios, o composto teste, DAP, MDL ou anticorpos daí resultantes podem ser marcados quer directamente ou indirectamente. As possibilidades para a marcação directa incluem grupos marcadores: radiomarcadores tais como 125I, enzimas (Pat. EUA No. 3,645,090) tais como peroxidase e fosfatase alcalina, e marcadores fluorescentes (Pat. EUA No. 3,940,475) capazes de monitorizar a alteração na intensidade da fluorescência, alteração no comprimento de onda, ou polarização fluorescente. Ambas as patentes estão aqui incorporadas como referência. As possibilidades para marcação indirecta incluem a biotinilação de um componente seguido por ligação a avidina acoplada a um dos grupos marcadores acima.

Existem também numerosos métodos para separar o 92 ΡΕ1003861 composto de ligação livre do ligado, ou alternativamente o composto teste de ligação livre do ligado. A DAP ou a MDL podem ser imobilizadas em várias matrizes seguido de lavagem. Matrizes adequadas incluem plástico tais como uma placa de ELISA, filtros, e leitos. Métodos para imobilizar a DAP ou a MDL a uma matriz incluem, sem limitações, adesão directa ao plástico, a utilização de um anticorpo de captura, acoplagem quimica, e avidina-biotina. O último passo nesta abordagem envolve a precipitação do complexo composto de ligação/antigénio por qualquer um de diversos métodos incluindo aqueles que utilizam, por exemplo, um solvente orgânico tal como o polietilenoglicol ou um sal tal como o sulfato de amónio. Outras técnicas de separação adequadas incluem sem limitações, o método de partícula megnetizável do anticorpo com a fluoresceína descrito em Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461, e a separação dupla da partícula magnética do anticorpo como descrito na Patente dos EUA No. 4,659,678.

Os métodos para ligar proteínas ou os seus fragmentos ás várias marcações têm sido extensivamente descritos na literatura. Muitas das técnicas envolvem a utilização de grupos carboxílicos activados quer através da utilização de carbodiimida quer de ésteres activos para formar ligações peptídicas, a formação de tioéteres por reacção de um grupo mercapto com um halogéneo activado tal como o cloroacetilo, ou uma olefina activada tal como a maleimida, para ligação, ou outras. As proteínas de fusão são também úteis nestas aplicações. 93 ΡΕ1003861

Outro aspecto diagnóstico aqui descrito envolve a utilização de sequência de polinucleótidos ou de oligonucleótidos retiradas da sequência de uma DAP ou de uma MDL. Estas sequências podem ser utilizadas como sondas para detectar níveis do antigénio em amostras de pacientes suspeitos de sofrerem de uma condição anormal, por exemplo, cancro ou problemas de desenvolvimento. A preparação de ambas as sequências de nucleótidos de RNA e de DNA, a marcação das sequências, e o tamanho preferido das sequências têm recebido ampla descrição e discussão na literatura. Normalmente uma sonda de oligonucleótidos deve possuir pelo menos cerca de 14 nucleótidos, usualmente pelo menos cerca de 18 nucleótidos, e as sondas de polinucleótidos devem possuir bastantes kilobases. Devem ser empregues várias marcações, mais comummente radionuclídeos, particularmente 32P. No entanto, outras técnicas podem também ser empregues, tal como as que utilizam nucleótidos modificados pela biotina para introdução num polinu-cleótido. A biotina serve então como o sítio para a ligação à avidina ou a anticorpos, o que pode ser marcado com uma grande variedade de marcadores, tais como radionuclídeos, fluorescências, enzimas, ou outros. Alternativamente, podem ser empregues os anticorpos que podem reconhecer duplas hélices específicas, incluindo as duplas hélices do DNA, as duplas hélices do RNA, as duplas hélices híbridas do DNA-RNA, ou as duplas hélices do DNA-proteína. Os anticorpos por seu turno podem ser marcados e o ensaio efectuado onde a dupla hélice se liga a uma superfície, tal que após a 94 ΡΕ1003861 formação da dupla hélice na superfície, a presença do anticorpo ligado à dupla hélice pode ser detectada. A utilização de sondas para o novo RNA antisentido pode ser efectuado por qualquer técnica convencional tal como a hibridização de aminoácidos, rastreio mais e menos, sondagem recombinacional, tradução híbrida libertada (HRT), e tradução híbrida presa (HART). Isto inclui também técnicas de amplificação tais como a reacção de polimerização em cadeia (PCR).

Estão também contemplados estojos ("kits") de diagnóstico que testam também a presença qualitativa ou quantitativa de outros marcadores. Os diagnósticos ou prognósticos podem depender da combinação de múltiplas indicações utilizadas como marcadores, assim, os estojos ("kits") podem ser testados para combinações de marcadores. Ver, por exemplo, Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97. X. Parceiro complexo receptor A descrição das proteína de DAP e de MDL fornecem aqui meios para identificar parceiros complexo receptor. Tal parceiro complexo receptor deve ligar-se especificamente à DAP12, DAP10, e/ou MDL-1 com afinidade razoavelmente elevada. Vários construtores tornaram-se disponíveis o que permite a marcação quer da DAP ou da MDL para detectar o seu parceiro. Por exemplo, a DAP12 marcada directamente fundida com os seus marcadores de marcação 95 ΡΕ1003861 secundária, por exemplo, FLAG ou outros epitopos marcadores, fusões do domínio Ig, etc., irá permitir a detecção de parceiros de ligação. Isto pode ser histológico como um método de afinidade para purificação, marcação, ou selecção bioquímica numa abordagem de clonagem de expressão. Um sistema de selecção de duplo-híbrido pode também ser aplicado efectuando construções apropriadas com as sequências de DAP12 disponíveis. Ver, por exemplo, Fields e Song (1989) Nature 340: 245-246. O âmbito geral desta invenção é melhor entendido com referência aos seguintes exemplos, que não pretendem ser uma limitação da invenção a formas de realização específicas.

EXEMPLOS I. Métodos Gerais

Alguns dos métodos padrão estão descritos ou referenciados, por exemplo, em Maniatis, et al. (1982)

Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Bioloqy, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; ou Ausubel, et al. (1987 e Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Os métodos de purificação de proteínas incluem tais métodos como a precipitação com 96 ΡΕ1003861 sulfato de amónio, cromatografia de coluna, electroforese, centrifugação, cristalização, e outros. Ver, por exemplo, Ausubel, et al. (1987 e Suplementos Periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" em Methods in Enzymology, vol. 182, e outros volumes nestas séries; e literatura do fabricante na utilização de produtos de purificação de proteínas, por exemplo, Pharmacia, Piscataway, N. J., ou Bio-Rad, Richmond, CA. A combinação com técnicas recombinantes permite a fusão a segmentos apropriados, por exemplo, a uma sequência FLAG ou equivalente que pode ser fundida via uma sequência de protease removível. Ver, por exemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" em Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12: 87-98, Plenum Press, N. Y.; e Crowe, et al. (1992) OIAexpress: The High Levei Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. São descritas técnicas imunológicas padrão, por exemplo, em Hertzenberg, et al. (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; e Methods in Enzymology volumes. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, e 163. Os ensaios para actividades biológicas de células neurais estão descritos, por exemplo, em Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; e Neuromethods Humana Press, 97 ΡΕ1003861

Totowa, NJ. A metodologia de sistemas de desenvolvimento está descrita, por exemplo, em Meisami (ed.) Handbook of

Human Growth and Developmental Biology CRC Press; e Chrispeels (ed.) Molecular Technigues and Approaches in Developmental Biology Interscience.

As análises por FACS estão descritas em Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Praticai Flow Cytometry Liss, New York, NY; e Robinson, et al. (1993) and Handbook of

Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY. É efectuada a análise de sequência em computadores, por exemplo, utilizando programas de software disponíveis, incluindo aqueles a partir de fontes de GCG (U. Wisconsin) e do GenBank. As bases de dados de sequência públicas são também utilizadas, por exemplo, do GenBank e outras.

II. Amplificação do fragmento de DAP humana por PCR São desenvolvidos dois iniciadores de acordo com as sequências fornecidas. Para aumentar as possibilidades de obter produtos de PCR, são utilizadas, células de THP-1 humanas, células T Thl, monócitos activados com LPS, IFN-γ e IL-10, ou células NK. Um produto é purificado, subclonado num vector pCR (Invitrogen, San Diego CA), e então sequenciado. Ver Tabelas 1, 2, e 3. 98 ΡΕ1003861 III. Distribuição de tecido da DAP e da MDL humanas

Pode ser utilizada a análise de hibridização ou a análise de PCR. Os dados preliminares por hibridizaçao sugerem a expressão em macrófagos, células dendriticas, algumas células T, e células NK. A análise pode ser por técnicas de Northern, Southern, ou cDNA Northern. 0 Western blotting pode ser efectuado utilizando anticorpos ou soros apropriados. As sequências genómicas podem também ser determinadas por técnicas padrão. A análise por Southern blot de DNA genómico humano revelou um padrão de digestão da enzima de restrição consistente com a organização genómica de um único gene de DAP12. A análise por Northern blot indicou a presença abundante de transcriptos de DAP12 de ~0,7 kb nos leucócitos do sangue periférico e no baço humano, mas não no timo, na próstata, nos testículos, ovários, no intestino delgado ou no cólon. Os transcriptos de DAP12 foram detectado em RNA isolado a partir de duas linhas celulares NK humanas NKL e NK92, mas não na linha celular T de leucemia Jurkat ou na linha celular linfoblastoide B transformada com JY EBV. A análise por Southern blot de um largo painel de bibliotecas de cDNA revelou expressão predominante de DAP12 em células mononucleares do sangue periférico humano em repouso, em células dendriticas (a partir das quais a DAP12 foi clonada), em monócitos do sangue periférico, e em linhas celulares e clones de NK. 99 ΡΕ1003861

Os dados de distribuição inicial da DAP10 indicam que é altamente expressa em células T, células NK, monócitos, e células dendriticas. Não parece ser altamente expressa em células B transformadas com EBV. A MDL-1 parece restrita na expressão em monócitos, macrófagos, e células dendriticas como analisado através da análise por Southern blot de um largo painel de bibliotecas de cDNA e por RT-PCR. Os transcriptos de MDL-1 não foram detectados em células T (células pré-T, células T em repouso, clones e linhas celulares T Thl e Th2), células B, células NK, granulócitos, linhas celulares mast, e linhas celulares endoteliais. Um painel de bibliotecas de tecido fetal humano revela hibridização com a biblioteca de baço fetal mas com nenhuma outra biblioteca, sugerindo que o transcripto de MDL-1 não é expresso em tipos de células de origem não hematopoiética. IV. Isolamento de um cDNA de DAP e de MDL de roedor

As sequências das Tabelas 1, 2, e 3 permitem o desenvolvimento de uma sonda ou de um iniciador que irá permitir o isolamento das contrapartes de rato. Com as sequências de primata e de roedor, contrapartes de outras espécies podem ser identificadas utilizando sequências conservadas, quer de ácidos nucleicos ou de epitopos. 100 ΡΕ1003861 V. Sequenciação de um clone isolado São utilizados métodos padrão para sequenciar um clone isolado como descrito acima. Os construtores apropriados para a expressão são preparados, por exemplo, numa coli, baculovirus, ou num tipo de célula mamífera. Tipos de células preferidos incluem Jurkat, YT, ou Baf3. Ver catalogo ATCC. VI. Expressão da proteína DAP ou MDL humana A proteína DAP12-FLAG solúvel é expressa transientemente em células COS-7. Uma forma recombinante de DAP12 apresentando o peptídeo FLAG no terminal amino ou carboxílico (Hoppe, et al. (1988) Biotechnology 6: 1205- 1210) é introduzida num vector de expressão pME18S e subsequentemente transfectada em células COS-7 por elec-troporação. As células electroporadas são crescidas em meio DMEM suplementado quer com Nutridoma HU a 1% (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) ou apenas com meio DMEM. São utilizados métodos similares para a DAP10 ou para a MDL-1. VII. Purificação da proteína DAP FLAG solúvel O sobrenadante contendo DAP12 FLAG solúvel é passado através de uma coluna de 20 ml com iões Cu++ ligados a uma matriz de Sepharose de Fluxo Rápido Quelante (Pharmacia, Upsalla, Sweden). Após a lavagem com o tampão de ligação (estojo ("kit") de tampão de ligação à His, 101 ΡΕ1003861

Novagen, Madison, WI), as proteínas retidas pelos iões metálicos são eluídas com um gradiente de imidazole. O conteúdo da DAP12 FLAG humana nas fracções eluídas é determinado, por exemplo, por dot blot utilizando o anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, New Haven, CT) ou por coloração com azul de Coomassie e com prata de SDS-PAGE de redução. A proteína DAP12 FLAG contendo fracções é então agrupada e dialisada contra PBS.

VIII. Expressão estável da membrana de DAP ou de MDL

Uma forma de membrana nativa é subclonada num vector de expressão, por exemplo, pMAMneo (Clontech, Paio Alto, Califórnia), que contém o estimulador RSV-LTR ligado ao promotor MMTV-LTR induzível por dexametasona. Esta construção é então transfectada em células NIH-3T3 por electroporação. As células NIH-3T3 transfectadas são inoculadas em Geneticina selectiva a 0,5 mg/ml (G418; Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany) DMEM suplementado com soro fetal de bovino a 10%. A caracterização bioquímica da membrana da proteína DAP12 em células NIH-3T3 estavelmente transfectadas pode ser efectuada com marcação metabólica. As células são cultivadas, por exemplo, em meio DMEM suplementado com o soro fetal de bovino a 10% e com dexametasona uma concentração final de 1 μΜ (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France). As células são então incubadas com 35S-Met e com 35S-Cis para marcar as proteínas 102 ΡΕ1003861 celulares. A análise das proteínas sob condições de redução em SDS-PAGE deverá apresentar uma proteina de 12 kDa, mas não no lisado ou nas células NIH-3T3 não transfectadas. São conhecidas algumas outras caracteristicas estruturais, por exemplo, sitios de glicosilação, etc.

IX. Preparação de anticorpos específicos para DAP

Ratos Balb/c consanguíneos são imunizados intra-peritonealmente com formas recombinantes da proteina de primata. Os animais são estimulados a pontos de tempo apropriados com a proteina, com ou sem o adjuvante adicional, para a subsequente produção de anticorpos. O soro é colectado, ou os hibridomas produzidos com os baços recolhidos.

Alternativamente, os ratos Balb/c são imunizados com células transformadas com o gene ou com os fragmentos dai resultantes, quer das células endógenas ou exógenas, quer com as membranas isoladas enriquecidas para a expressão do antigénio. O soro é colectado no tempo apropriado, normalmente após numerosas administrações adicionais. Várias técnicas de terapia de genes podem ser utilizadas, por exemplo, na produção de proteínas in situ, para a obtenção de respostas imunes. 0 anticorpos monoclonais podem ser produzidos. Por exemplo, os esplenócitos são fundidos com um parceiro 103 ΡΕ1003861 de fusão apropriado e os hibridomas são seleccionados em meio de crescimento através de procedimentos padrão. Os sobrenadantes dos hibridomas são rastreados quanto à presença de anticorpos que se ligam à DAP12 humana, por exemplo, através de ELISA ou de outro ensaio. Podem também ser seleccionados ou preparados os anticorpos que reconhecem especificamente a DAP12 humana mas não espécies variantes.

Noutro método, peptídeos sintéticos ou proteinas purificadas são apresentados a um sistema imune para criar anticorpos monoclonais ou policlonais. Ver, por exemplo,

Coligan (1991) Current_Protocols_in_Immunology

Wiley/Greene; e Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Em situações apropriadas, o reagente de ligação é quer marcado como descrito acima, por exemplo, fluorescentemente ou de outra forma, quer imobilizado a um substrato para métodos de partição múltipla ("panning"). Os ácidos nucleicos podem também ser introduzidos em células num animal para produzir o antigénio, que serve para elicitar uma resposta imune. Ver, por exemplo, Wang, et al. (1993) Proc. Natl. Acad.

Sei. 90: 4156-4160/ Barry, et al. (1994) BioTechniques 16: 616-619; e Xiang, et al. (1995) Immunity 2: 129-135.

Os anticorpos têm sido produzidos, e utilizados, como descrito abaixo para ambas as proteinas DAP. 104 ΡΕ1003861 X. Mapeamento da DAP humana

São preparados cromossomas segmentados. A hibridização in sito é efectuada em preparações de cromossomas obtidas a partir de culturas de 72 h de linfócitos humanos estimulados com fitohemaglutinina. Foi adicionada 5-bromodeoxiuridina nas últimas sete horas de cultura (60 pg/ml de meio), para assegurar uma bandagem cromossomal de boa qualidade pós-hibridização.

Um fragmento de PCR, amplificado com a ajuda de iniciadores, é clonado num vector apropriado. O vector é marcado por tradução por cortes ("nick-translation") com 3H. A sonda radiomarcada foi hibridizada aos segmentos em metafase a uma concentração final de 200 ng/ml de solução de hibridização como descrito em Mattei, et al. (1985) Hum.

Genet. 69: 327-331.

Após cobertura com emulsão de rasto nuclear (KODAK NTB2) , os diapositivos são expostos. Para evitar qualquer deslizamento dos grãos de prata durante o procedimento de bandagem, os cromossomas segmentados são primeiramente corados com solução de Giemsa tamponada e é fotografada a metafase. A bandagem R é então efectuada pelo método de fotólise de fluorocromo Giemsa (FPG) e são novamente fotografadas as metafases antes da análise. A organização genómica da DAP12 humana consiste em 5 exões que medem ~4 kb no cromossoma 19ql3.1. Os genes 105 ΡΕ1003861 humanos KIR (Baker, et al. (1995) Chromosome Research 3: 511) e o LAIR relacionado (Meyaard, et al. (1997) Immunity 7: 283-290), e os genes ILT/MIR (Wagtmann, et al. (1997) Current Biology 7: 615-618) estão todos proximamente localizados no cromossoma 19ql3.4.

XI. Biologia da DAP e da MDL A DAP é um homodimero com ligações dissulfureto, contendo um motivo de activação de imunoreceptor baseado na tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático, que é predominantemente expressa em células NK, monócitos, e em células dendríticas. Esta molécula associa-se não covalentemente com glicoproteínas de membrana da familia de receptores inibitórios das células assassinas (KIR) que não possuem motivos de inibição de imunoreceptores baseados na tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático. Os complexos KIR2DS2-DAP12 de ligação cruzada expressos em transfec-tantes resultam na activação celular, como demonstrado pela fosforilação da tirosina de proteínas celulares e estimulação ("up-regulation") dos primeiros antigénio de activação. Os peptídeos DAP12 fosforilados ligam as cinases ZAP-70 e a tirosina da proteína Syk, sugerindo uma via de activação similar à dos receptores dos antigénios das células T e B.

As células NK expressam os receptores de membrana da imunoglobulina e das super-famílias de lectina de tipo C que reconhecem o MHC de classe I e inibem a citotoxicidade 106 ΡΕ1003861 mediada pelas células NK. Lanier (1997) Immunity 6: 371-378. Estes receptores inibitórios (incluindo a KIR humana, a CD94/NKG2A humana, e a Ly49 de roedor) possuem ITIM nos seus domínios citoplasmáticos que fornece o domínio SH2 contendo as fosfatases da tirosina 1 e 2 (SHP), resultando numa inactivação da função das células NK. Burshtyn, et al. (1996) Immunity 4: 77-85; Olcese, et al. (1996) J. Immunol. 156: 4531-4534; e Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609. Certas isoformas dos receptores de KIR, Ly49 e de CD94/NKG2 não possuem sequências ITIM e foi proposto que estes receptores "não inibitórios" possam activar, em vez de inibir, a função da célula NK. Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609; Biassoni, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 645-650; e Mason, et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 2119-2128. Quando a molécula KIR2DS2 não inibitória foi expressa por transfecção em leucemia basofílica RBL-2H3 não foi observada activação celular quando se ligaram os receptores, sugerindo que estes receptores NK "não inibitórios" podem não possuir propriedades de sinalização intrínsecas. Bléry, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 8989-8996.

Recentemente, Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158: 5083-5086, revelou que uma fosfoproteína desconhecida de ~12 kD, expressa como um dímero de ligações dissulfureto, foi co-imunoprecipitada com uma glicoproteína KIR2DS2 não inibitória a partir de lisados de células NK. Os receptores Ig da superfície da célula, receptores de antigénio de célula T (TcR), e certos receptores Fc (FcR) 107 ΡΕ1003861 associam-se não covalentemente com pequenas proteínas transmembranares (por exemplo, subunidades de CD3ô, γ, ε, ζ, CD79a, β, FctRI-y) contendo sequências ITAM (D/ExxYxxL/I - x6-8- YxxL/I; Reth (1989) Nature 338: 383-384) que são necessárias para a transdução de sinal por estes complexos receptores. Chan, et al. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12: 555-592. Por isso, parece provável que estes receptores de célula NK não inibitórios possam requerer uma proteína associada com propriedades similares para mediar a transdução de sina positiva.

Uma base de dados de sequências expressas marcadas (EST) foi rastreada a partir de uma vasto painel de bibliotecas de cDNA com um programa de algoritmo TBLASTN para moléculas que possuem homologia com as sequências das proteínas humanas CD35, γ, ε, ζ, e Fc8RI-y. Uma EST de uma biblioteca de células dendríticas CD1+ humana foi seleccionada para estudo mais aprofundado baseado na identificação de uma ITAM nesta molécula. A sequenciação de 604 pb de cDNA revelou uma janela de leitura aberta de 339 nucleótidos, que codificam uma proteína de membrana de tipo I putativa de 113 aminoácidos (ver SEQ ID No: 1 e 2) . A proteína, designada DAP12, é composta por uma sequência líder de 27 aa, um domínio extracelular de 14 aa, um segmento transmembranar de 24 aa, e uma região citoplas-mática de 48 aa. Apesar de a DAP12 possuir menos do que 25% de homologia com as proteínas humanas CD3ô, γ, ε, ζ, e FctRI-y, o domínio citoplasmático contém o peptídeo ESPYQELQGQRSDVYSDL (ver SEQ ID NO: 2), que corresponde 108 ΡΕ1003861 precisamente à sequência consensus do protótipo ITAM. Os sitios potenciais para a fosforilação pela proteina cinase C (resíduos 79-81 e 107-109) e a caseína cinase II (resíduos 85-88) estão também presentes na região cito-plasmática de DAP12. A região transmembranar contém um aminoácido carregado (D) , também conservado no domínio transmembranar das subunidades CD3. Um murino homologo potencial de DAP12 é -70% homologo com a proteína DAP12 humana e possui um resíduo D conservado na região transmembranar, resíduos C conservados no domínio extracelular, e um ITAM na região citoplasmática.

Uma característica distinta dos receptores não inibitórios KIR (Biassoni, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 645-650), Ly49D e Ly 49 H (Mason, et al. (1996) J. Exp.

Med. 184: 2119-2128), CD94 (Chang, et al. (1995) Eur. J.

Immunol. 25: 2433-2437), NKG2C e NKG2E (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 1017-1020), e ILT1 (Samaridis e

Colonna (1997) Eur. J. Immunol. 27: 660-665) é a presença de um aminoácido básico (K ou R) no domínio transmembranar. Dado o precedente para interacções entre proteínas de complexos receptores de múltiplas subunidades via aminoácidos de carga oposta nos domínios transmembranares, por exemplo, o complexo CD3/TcR (Chan, et al. (1994) Ann.

Rev. Immunol. 12: 555-592), foi examinado se a DAP12 se associa com a glicoproteína KIR2DS2 não inibitória contendo um K na região transmembranar (Colonna e Samaridis (1995) Science 268: 405-408). A linha celular de murino pré-B

Ba/F3 foi transfectada com um cDNA que codifica a KIR2DS2 109 ΡΕ1003861 quer só ou juntamente com um cDNA de DAP12 contendo um epitopo FLAG marcado na N-terminal para permitir a detecção com um mAb anti-FLAG. Os transfectantes foram seleccionados por citometria de fluxo para a expressão na superfície celular com base na coloração positiva com o mAb DX27 anti-RIR ou o mAb M2 anti-FLAG. Os transfectantes KIR2DS2 Ba/F3 e KIR2DS2 + DAP12-FLAG Ba/F3 foram marcados à superfície com 125I, lisados em digitonina a 1% para preservar as associações não covalentes dos complexos da proteína de membrana, e imunoprecipitados com o mAb anti-KIR ou o mAb anti-FLAG. 0 resíduo de tirosina no epitopo FLAG fornece um sitio para a radioiodação, permitindo a visualização da proteína DAP12. O mAb anti-KIR imunoprecipitado e espécies marcadas com 1251 de ~50-60 kD a partir quer das células KIR2DS2 Ba/F3 quer dos transfectantes KIR2DS2 + DAP12-FLAG Ba/F3, consistentes com o peso molecular predito da glicoproteína KIR2DS2. Uma proteína marcada com 125I adicional de ~12 kD foi co-imunoprecipitada com o mAb anti-KIR a partir do transfectante KIR2DS2 + DAP12-FLAG, mas não a partir do transfectante que expressa apenas KIR2DS2. •η o c

Reciprocamente, a glrcoproterna marcada com I que mrgra de forma idêntica a KIR2DS2 foi co-imunoprecipitada com o mAb anti-FLAG a partir das células KIR2DS2 + DAP12-FLAG Ba/F3, mas não a partir do único transfectante KIR2DS2. A comparação de imunoprecipitados analisados por SDS-PAGE utilizando condições quer redutoras quer não redutoras indicou que a DAP12 é expressa na superfície da célula como um dímero de ligações dissulfureto. Deve ser digno de nota de que fomos incapazes de detectar expressão de DAP12 na 110 ΡΕ1003861 superfície celular na superfície de células Ba/F3 transfectadas somente com o cDNA de DAP12-FLAG, sem KIR2DS2. No entanto, as proteínas de DAP12-FLAG foram detectadas no citoplasma, sugerindo que a DAP12 pode requerer associação com as suas subunidades parceiras para transporte eficiente para a superfície celular, similar à situação com as proteínas CD3 (Clevers, et al. (1988) Ann. Rev. Immunol. 6: 629-662). Adicionalmente, resultados preliminares indicam que a DAP12 não se associa com as isoformas de KIR inibitórias que não possuem um resíduo carregado no seu domínio transmembranar.

Um peptídeo correspondendo ao domínio citopla-smático de DAP12 (ITETESPY*QELQGQRSDVY*SDLNTQRP; ver SEQ ID NO: 2) foi sintetizado quer como uma proteína não fos-forilada quer como uma contendo fosfatos em ambos os resíduos Y. Os lisados de clones A6 de células T Jurkat ou de células NK foram incubados com os peptídeos biotinilados e os foram precipitados os complexos utilizando avidina-agarose. A análise por Western blot demonstrou que um peptídeo de DAP12 fosforilado em ambos os resíduos Y, mas não o peptídeo não fosforilado, forma complexos com a cinase ZAP-70. A tirosina do peptídeo de DAP12 fosforilado, mas não do peptídeo de DAP12 não fosforilado, forma também um complexo com a tirosina da proteína cinase Syk nos lisados das células NK. A ligação destas cinases à DAP12 fosforilada é demarcadamente reminescente das interacções que foram demonstradas entre as subunidades de CD3 fosforilada contendo ITAM e as cinases Syk ou ZAP-70 111 ΡΕ1003861 durante a sinalização de TcR. Iwashima, et ai. (1994) Science 263: 1136-1139; e Chan, et al. (1994) J. Immunol. 152: 4758-4766. A ligação do complexo CD3/TcR em células T ou o complexo receptor Ig em células B resultar na activação celular. Assim, foram efectuados estudos para examinar a consequência funcional da ligação cruzada do complexo KIR2DS2-DAP12. Os transfectantes Ba/F3 que expressam apenas o complexo KIR2DS2 ou o complexo KIR2DS2-DAP12-FLAG foram incubados com o mAb DX27 anti-KIR ou com o mAb anti-FLAG seguido por uma Ig de cabra anti-rato para promover a ligação cruzada. O exame de todas as proteínas celulares em células Ba/F3 que expressam o complexo KIR2DS2-DAP12-FLAG que foram estimuladas com o mAb anti-KIR ou anti-FLAG revelaram a fosforilação da tirosina de vários substratos celulares. A imunoprecipitação com o mAb anti-FLAG e a análise por Western blot com o mAb anti-fosfotirosina demonstrou que a ligação cruzada dos transfectantes KIR2DS2-DAP12-FLAG com o mAb anti-KIR induz a fosforilação da tirosina da proteína DAP12 e resulta na associação de DAP12 fosforilada com a tirosina da proteína cinase Syk. Em contraste, as células Ba/F3 que expressam apenas KIR2DS2 não foram activadas por ligação cruzada com o mAb anti-KIR. Similarmente, a estimulação ("up-regulation") da expressão de CD7 9 foi observada em células T de leucemia Jurkat transfectadas tanto com KIR2DS2 e DAP12, mas não apenas com KIR2DS2, quando estes receptores apresentam ligação cruzada com o mAb anti-KIR. Estes resultados indicam que a DAP12 é 112 ΡΕ1003861 necessária e responsável pela transdução de sinal de KIR2DS2 nestas células hospedeiras e estão de acordo com observações anteriores demonstrando que as moléculas de KIR2DS2 são funcionais em células NK, mas não em transfectantes que expressam apenas KIR2DS2. Bléry, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 8989-8996.

Estes estudos sugerem que a DAP12 pode associar-se com as isoformas não inibitórias das moléculas KIR em células NK e permite a activação celular via estes receptores, similar à função das subunidades CD3 no complexo TcR e das subunidades CD79 no complexo receptor de células B. A expressão de DAP12 em monócitos e em células dendriticas prevê a associação com outros receptores similares ao do KIR não inibitório presente nestes tipos de células. Prováveis candidatos são as recentemente identificadas familia de moléculas ILT/MIR expressas por monócitos humanos (Wagtmann, et al. (1997) Current Biology 7: 615-618/ e Samaridis e Colonna (1997) Eur. J. Immunol. 27: 660-665) e as moléculas PIR-A em células mielóides e em células B de roedores (Hayami, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 7320-7327; e Kubagawa, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 5261-5266). Adicionalmente, as propriedades físicas da DAP12 são similares ás de uma nova fosfoproteína dimérica de 12 kD identificada no complexo receptor de célula pré-T em timócitos de murino. Takase, et al. (1997) J. Immunol. 159: 741-747. Assim, a DAP12 pode funcionar na activação celular mediada por uma série diversa de receptores nas linhagens celulares distintas. 113 ΡΕ1003861

Clonagem e análise da sequência A pesquisa com TBLASTN na base de dados de sequências DNAX foi efectuada utilizando as sequências das proteínas CD3ô, γ, ε, ζ e FcsRI-γ. O inserto de cDNA no plasmídeo LL603, identificado numa biblioteca de células dendríticas humanas CD1+, foi isolado e sujeito a sequenciação automatizada (ABI).

DNA e RNA O RNA de tecidos humanos e o DNA genómico humano foram adquiridos na Clontech (Paio Alto, CA) . As análises por Northern e Southern blot foram efectuadas como descrito. Chang, et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 2433-2437 .

Transfecção

Um cDNA contendo o segmento líder de CD8, seguido pelo epitopo do peptídeo FLAG, e adicionado aos segmentos extracelular, transmembranar e citoplasmático de DAP12 foi subclonado no vector retroviral pMX-puro (Onihsi, et al. (1996) Exp. Hematology 24: 324-329; geralmente fornecido pelo Dr. T. Kitamura, DNAX), inserido utilizando a linha celular Phoenix (gentilmente fornecida pelo Dr. G. Nolan, Stanford), e o vírus foi utilizado para infectar a linha de células pré-B de rato Ba/F3 (Onihsi, et al. (1996) Exp. 114 ΡΕ1003861

Hematoloqy 24: 324-329). 0 cDNA de NKAT5 (Colonna e Samaridis (1995) Science 268: 405-408) que codifica a KIR2DS2 (gentilmente fornecida pelo Dr. M. Colonna, Basel) foi subclonado no vector retroviral pMX-neo. As células Ba/F3 foram infectadas, seleccionadas com fármacos, e foram isolados os transfectantes utilizando citometria de fluxo. Onihsi et al. (1996) Exp. Hematoloqy 24. 324-329. 0 cDNA de DAP12 foi subclonado no vector pEF-BOS para a expressão transiente de células Jurkat utilizando electroporação para a introdução do plasmideo. Wu, et al. (1995) Mol. Cell Biol. 15: 4337-4346.

Imunoprecipitação.

As células foram marcadas com 125I e solubilizadas em tampão de lise (pH 7,8, digitonina a 1% (Sigma), Triton-X100 a 0,12%, NaCl a 150 mM, trietanolamina a 20 mM, NaN3 a 0,01%, e inibidores de protease). Lanier, et al. (1989) Nature 342: 803-805. Os lisados celulares foram incubados em gelo durante 2 hr com Pansorbina (Calbiochem) cobertos com Ig de coelho anti-rato (Sigma) e o mAb DX27 anti-KIR2D de rato, o mAb M2 anti-FLAG (Kodak), ou com IgG de controlo e depois lavados em solução salina tamponado com Tris (TBS), Tris a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 8,0) contendo CHAPS a 5 mM (Sigma) e inibidores de protease. Lanier, et al. (1989) Nature 342: 803-805. Os peptídeos biotinilados correspondendo aos residuos ITETESPY*QELQGQRSDVY*SDLNTQRP no dominio citoplasmático de DAP12 (ver SEQ ID NO: 2) foram sintetizados, tanto os não fosforilados como os que contêm 115 ΡΕ1003861 fosfato em ambos os resíduos Y (generosamente fornecidos pelo Dr. C. Turck, UCSF). Os peptídeos de 0ϋ3ζ controlo não fosforilados e Y-fosforilados (Iwashima, et al. (1994) Science 263: 1136-1139) foram uma oferta do Dr. A. Weiss (UCFF). Os peptídeos biotinilados foram incubados com os lisados das células Jurkat ou NK dos clones A6, precipitados com avidina-agarose, e lavados em solução salina tamponada com Tris (Tris 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,8) contendo NP-40 a 1% e inibidores de protease (Iwashima, et al. (1994) Science 263: 1136-1139). Os imunoprecipitados foram analisados por Western blot (Philips, et al. (1996) Immunity 5: 163:172) utilizando o mAb anti-ZAP-70 ou anti-soro específico de coelho anti-Syk (Iwashima, et al. (1994) Science 263: 1136-1139; gentilmente fornecido por Art Weiss, UCFF).

Activação Celular

As células Ba/F3 que expressam quer apenas o KIR2DS2, quer apenas a DAP12 (marcado com epitopo FLAG), ou quer com o complexo KIR2DS2-DAP12 foram incubadas com os mAbs indicados a 4 °C, lavadas, e depois efectuada a ligação cruzada com Ig de cabra anti-rato F(ab')2 durante 3 min a 37 °C. As células foram lisadas em TBS contendo NP-40 a 1% e inibidores de protease. A totalidade dos lisados celulares ou dos imunoprecipitados de DAP12-FLAG com o mAb M2 anti-FLAG foi analisada por Western blot utilizando o mAb 4G10 anti-fosfotirosina conjugado com HRP (UBI). As células Jurkat foram estavelmente transfectadas com o cDNA 116 ΡΕ1003861 de NKAT5 (Colonna e Samaridis (1995) Science 268: 405-408) utilizando um vector retroviral (Onihsi, et al. (1996) Exp. Hematology 24: 324-329) foram transfectadas transientemente por electroporação com cDNA de DAP12 humano no vector pEF-BOS ou falsamente transfectadas com um vector controlo. Wu, et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:4337-434 6. Após 24 horas, os transfectantes foram incubados em placas de microtitulo pré-cobertas (5yg/ml) com Ig de controlo ou com o mAb DX27 anti-KIR. Após 12 hr de incubação, os transfectantes foram recolhidos e seguidamente corados com FITC conjugado com anti-CD69 ou com o mAb controlo e analisados por citometria de fluxo. Lanier e Recktenwald (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 192-199.

XII. DAP12 Associada com Receptores de Activação da Célula NK CD94/NKG2C

Enquanto que os receptores inibitórios das células NK para o MHC de classe I expressam os motivo inibitórios de imunoreceptor baseado na tirosina (ITIM) que recrutam fosfatases da tirosina intracelular e previnem a função efectora da célula NK, os receptores de activação da célula NK não possuem sequências intrínsecas requeridas para a estimulação celular. A CD94/NKG2C, e o receptor de activação da célula NK da super-família de lectina tipo C que se liqam a HLA-E, associa-se não covalentemente com a DAP12, um receptor de membrana contendo um motivo de activação de imunoreceptor baseado na tirosina (ITAM). A expressão eficiente de CD94/NKG2C na superfície da célula 117 ΡΕ1003861 requer a presença de DAP12 e de resíduos carregados nos domínios transmembranares de DAP12 e a NKG2C é necessária para esta interacção. Estes resultados fornecem uma base molecular para o estabelecimento da ligação dos receptores da célula NK para o MHC de classe I envolvido na activação e inibição celular.

As células NK são linfócitos que participam em respostas imunes inatas contra certas bactérias, parasitas, e virus (revisto em Scott e Trinchieri (1995) Current Opinion Immunol. 7: 34-40; Trinchieri (1989) Adv. Immunol. 47: 187-376). Não é claro como é que as células NK reconhecem os patogenes; no entanto, um aspecto deste processo pode envolver a detecção e a eliminação de células hospedeiras que tenham perdido ou suprimido a expressão do MHC de classe I como uma consequência da infecção. As células NK expressam receptores para o MHC de classe I que podem quer activar ou inibir a citotoxicidade mediada pela célula e a produção de citoquinas (revisto em Lanier, (1998) Cell 92: 705-707; Lanier (1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 359-393). Foram identificados diversos tipos de receptores da célula NK para o MHC de classe I (Lanier, (1998) Cell 92: 705-707). Em humanos, os receptores inibitórios da célula assassina (KIR) compreendem uma pequena familia de moléculas codificada por genes da super-família Ig (Colonna e Samaridis (1995) Science 268: 405-408; D'Andrea, et al. (1995) J. Immunol. 155: 2306-2310; Wagtmann, et al. (1995) Immunity 2: 439-449) . Dentro da familia KIR, certas isoformas possuem dois domínios Ig 118 ΡΕ1003861 (KIR2D) ou três domínios Ig (KIR3D) na região extracelular que está envolvida no reconhecimento dos ligandos polimórficos HLA-C ou HLA-B, respectivamente (Dohring e Colonna (1996) Eur. J. Immunol. 26: 365-369; Fan, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7178-7183; Litwin, et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 537-543; Rajagopalan e Long (1997) J. Exp. Med. 185: 1523-1528; Rojo, et al. (1997)

Eur. J. Immunol. 27: 568-571; e Wagtmann, et al. (1995)

Immunity 3: 801-809). A heterogeneidade existe também nos

domínios transmembranar e citoplasmático de diferentes moléculas KIR. Após a ligação ao ligando, a KIR contendo ITIM no seu domínio citoplasmático (designado KIR2DL e KIR3DL) recruta SHP-1 e previne a função efectora da célula NK (Burshtyn, et al. (1996) Immunity 4: 77-85; Campbell, et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 93-100; Fry, et al. (1996) CL

Exp. Med. 184: 295-300; e Olcese, et al. (1996) J. Immunol. 156: 4531-4534). Em contraste, as isoformas de KIR sem ITIM e contendo um aminoácido básico K no domínio transmembranar (KIR2DS e KIR3DS) foram implicada na activação da célula NK (Biassoni, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 645-650; Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158: 5083-5086). As KIR2DS estão associadas não covalentemente com uma molécula adaptadora contendo ITAM, a DAP12, que é expressa na superfície de células NK como um homodímero com ligações dissulfureto (Campbell, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 599-609;

Lanier (1998) Cell 92: 705-707; Olcese, et al. (1997) J^_ Immunol. 158: 5083-5086). Após a ligação cruzada de KIR2DS, os resíduos de tirosina no ITAM de DAP12 tornam-se fosforilados e recrutam ZAP-70 ou Syk, resultando na 119 ΡΕ1003861 activaçao celular (Lanier (1998) Cell 92: 705-707) . A DAP12 humana está presente no cromossoma humano 19ql3.1 perto da família de genes KIR (Baker, et al. (1995) Chromosome Research 3: 511), demonstrando uma ligação genética entre KIR e DAP12.

Outro tipo de receptor de célula NK CD94/NKG2, é um heterodímero composto de uma glicoproteína invariante CD94 que apresenta ligações dissulfureto quer com uma glicoproteína NKG2A ou com uma NKG2C (Brooks, et al. (1997) J. Exp. Med. 185: 795-800; Carretero, et al. (1997) Eur. J.

Immunol. 27: 563-575; Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745) . A CD94 (Chang, et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 2433-2437) e quatro genes de NKG2 (NKG2A, NKG2C, NKG2E, e NKG2D/F; Houchins, et al. (1991) J.

Immunol. 158: 3603-3609; e Plougastel e Trowsdale (1997) Eur. J. Immunol. 27: 2835-2839) são todos membros da super-família de lectina tipo C e estão proximamente ligados no cromossoma 12pl2-pl3 no "complexo NK" (Renedo, et al. (1997) Immunogenetics 46: 307-311). O genes de roedor homólogos aos genes humanos CD94 e NKG2 estão localizados no "complexo NK" nos cromossomas de rato e de ratazana sinténico com o cromossoma humano 12 (Berg, et al. (1998)

Eur. J. Immunol. 28: 444-450); Dissen, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 2080-2086; e Vance, et al. (1997) Eur. J.

Immunol. 27: 3236-3241).

Os anticorpos contra a CD94 podem quer activar ou inibir a citotoxicidade mediada pela célula NK contra o 120 ΡΕ1003861 receptor Fc que alberga alvos e diferentes clones da célula NK isolados a partir de um único individuo que demonstra comportamento heterogéneo nestes ensaios funcionais (Brumbaugh, et al. (1996) J. Immunol. 157: 2804-2812; Perez-Villar, et al. (1996) J. Immunol. 157: 5367-5374; e Pérez-Villar et al. (1995) J. Immunol. 154: 5779-5788). Este fenómeno foi explicado pela descoberta de que a CD94 forma heterodimeros com ligações dissulfureto quer com NKG2A ou com NKG2C (Brooks, et al. (1997) J. Exp. Med. 185: 795-800; Cantoni, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 327-338; Carretero, et al. (1997); e Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745). A NKG2A contém uma sequência ITIM no dominio citoplasmático que após a ligação ao receptor torna a tirosina fosforilada e recruta SHP-1 ou SHP-2 que por seu turno inibem a função efectora de NK (Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609; e Le Drean, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 264-276). Em contraste, a NKG2C não tem um ITIM e a ligação ao receptor resulta na activação da célula NK (Cantoni, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 327-338; e Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609) . A CD94 é necessária para transportar tanto a NKG2A como a NKG2C para a superfície celular (Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745). Dentro da população de célula NK de um indivíduo, são expressos os receptores CD94/NKG2A e CD94/NKG2C em subpopulações sobrepostas e algumas célula NK podem expressar proteínas de CD94 que não estão associadas nem com a NKG2A nem com a NKG2C (Cantoni, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 327-338). Assim, a CD94 e as proteínas NKG2 podem formar um repertório diverso de 121 ΡΕ1003861 receptores num indivíduo. Os receptores CD94/NKG2A e CD94/NKG2C reconhecem HLA-E (Borrego, et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 813-818/ Braud, et al. (1998) J. Immunol. 159: 5192-5196), Uma molécula de MHC não clássica de classe I que tem a propriedade única de ligar peptídeos de 9 aminoácidos derivados dos segmentos líder de outras proteínas de HLA clássicas de classe I (Braud, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 1164-1169) . Enquanto que o ITIM em NKG2A explica a função inibitória do receptor de CD94/NKG2A, nem a CD94 nem a NKG2C possuem sequências nos seus domínios citoplasmáticos que forneçam capacidade de sinalização intrínseca. No entanto, a existência de um aminoácido básico no domínio transmembranar de NKG2C sugere possíveis interacções com o receptor de DAP12.

Associação de DAP12 com receptores de CD94/NKG2C

Para determinar se a DAP12 pode estar associada com o complexo receptor de activação CD94/NKG2C, uma linha celular de célula pré-B de rato, Ba/F3, foi co-infectada com o retrovírus ecotrópico que codifica a CD94, a NKG2C, e a DAP12 humanas (contendo um epitopo FLAG no N-terminal para permitir a detecção na superfície da célula). Consistente com resultados anteriores (Lanier (1998) Cell 92: 705-707), a transfecção de apenas DAP12-FLAG em células Ba/F3 não permite a expressão na superfície da célula deste receptor, apesar de as proteínas DAP12-FLAG serem detectadas no citoplasma destes transfectantes como 122 ΡΕ1003861 determinado por coloração citoplasmática e análise por Western blot. Similarmente, não foi detectada expressão na superficie celular de apenas NKG2C em células Ba/F3 ou em transfectantes DAP12-FLAG + Ba/F3 co-infectados com NKG2C fria. Em contraste, apenas a CD94 foi expressa na superficie celular de células de Ba/F3. No entanto, a CD94 não é competente para transportar DAP12-FLAG para a superficie celular em células Ba/F3 co-infectadas tanto com CD94 como com DAP12-FLAG, apesar de a DAP12-FLAG ser detectada no citoplasma destes transfectantes por Western blot e por imunofluorescência citoplasmática. Adicionalmente, quando as células de CD94 + Ba/F3 foram infectadas com um retrovírus que codifica NKG2C, não foram detectados os heterodimeros de CD94/NKG2C na superficie da célula, utilizando um anti-soro que detecta o complexo CD94/NKG2C (Braud, et al. (1998) J. Immunol. 159: 5192-5196; Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745) (apesar de ser possível obter baixos níveis de expressão superficial de heterodimeros de CD94/NKG2C utilizando vectores epissomais contendo promotores fortes em sistemas de transfecção de elevada eficiência tais como as células 293T; Braud, et al. (1998) J. Immunol. 159: 5192-5196; Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745). Quando as células Ba/F3 são infectadas com retrovírus que codifica a CD94, NKG2C, e DAP12-FLAG humanas, é detectada a expressão dos receptores DAP12-FLAG e CD94/NKG2C na superfície da célula dos transfectantes CD94/NKG2C/DAP12. 123 ΡΕ1003861

Colectivamente, estas experiências suportam a existência de um complexo receptor de múltiplas subunidades composto por CD94, NKG2C, e DAP12.

Os transfectantes de Ba/F3 que expressam CD94, NKG2C, e DAP12-FLAG foram marcados com 125I, solubilizados no detergente digitonina para preservar os complexos receptores de membrana não covalentes (Lanier, et al. (1989) Nature 342: 803-805), e imunoprecipitados com anticorpos contra a CD94 ou a FLAG humanas. A imunoprecipitação com anti-CD94 dos transfectantes Ba/F3 CD 9 4/NKG2 C/DAP12-FLAG revelou proteínas marcadas com 125I com a mobilidade prevista de NKG2C e DAP12-FLAG. Foi anteriormente reportado que a CD94 humana não é eficientemente marcada com 125I (Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745; Philips, et al. (1996) Immunity 5: 163:172), assim a subunidade radiomarcada com ~40 kD imunoprecipitada com o mAb anti-CD94 representa uma glicoproteina NKG2C que apresenta ligações dissulfureto a CD94 (Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745). Quando analisada utilizando condições não redutoras, a DAP12-FLAG migra predominantemente como um homodimero com ligações dissulfureto e a mobilidade de NKG2C é consistente com a existência de um heterodimero de CD94/NKG2C. Por isso, parece que o complexo receptor mínimo de CD94/NKG2C-DAP12 pode ser um tetrâmero constituído por um homodimero de DAP12 de ligações dissulfureto associado não covalentemente com um heterodimero de CD94/NKG2C de ligações dissulfureto. 124 ΡΕ1003861 XII. A DAP12 é requerida para a expressão de CD94/NKG2C na superfície celular utilizando resíduos carregados nos domínios transmembranares de DAP12 e de NKG2C. O papel dos aminoácidos carregados nos domínios transmembranares dos receptores de KIR, NKG2, e de DAP12 na ligação dos complexos de múltiplas subunidades.

As proteínas NKG2A e NKG2C demonstram identidade de aminoácidos de 75% (Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609) e ambos os receptores de CD94/NKG2A e CD94/NKG2C se ligam a um ligando comum, HLA-E (Braud, et al. (1998) J. Immunol. 159: 5192-5196). Uma diferença conspícua entre NKG2A e NKG2C é a presença de um resíduo básico na domínio transmembranar de NKG2C que está ausente na NKG2A e na CD94. Em contraste com NKG2C, a infecção de célula CD94 + Ba/F3 com um retrovírus que codifica a NKG2A humana permite a expressão de um complexo CD94/NKG2A na superfície da célula na ausência de DAP12. A presença de um complexo de CD94/NKG2A em células Ba/F3 não permite a expressão de DAP12-FLAG na superfície da célula, apesar de serem detectadas proteínas DAP12-FLAG no citoplasma destes transfectantes por imunofluorescência e por análise de Western blot.

Devido a outros receptores de membrana de múltiplas subunidades terem sido apresentados por se associarem via pontes de sais formadas através de 125 ΡΕ1003861 aminoácidos acídicos e básicos nos seus domínios transmembranares (por exemplo, CD3/TcR) (Bonifacino, et al. (1991) EMBO J. 10: 2783-2793; Cosson, et al. (1991) Nature 351: 414-416; Morley, et al. (1988) J. Exp. Med. 168: 1971-1978), o requerimento do resíduo D na DAP12 foi examinado por associação com CD94/NKG2C. O resíduo D em DAP12-FLAG foi convertido em A por mutagénese sítio dirigida e este receptor mutante foi transfectado em células Ba/F3. Ao contrário da DAP12-FLAG de estirpe selvagem, o receptor mutante DAP12-FLAG D-A transmembranar foi expresso na superfície da célula na ausência de outras subunidades, indicando que o resíduo D no domínio transmembranar serve como um sinal de retenção para a DAP12, similarmente à função dos resíduos carregados no domínio transmembranar das proteínas CD3 (Bonifacino, et al. (1990) Cell 63: 503-513; Bonifacino, et al. (1991) EMBO J. 10: 2783-2793; Cosson, et al. (1991) Nature 351: 414-416). Como notado anteriormente, as células Ba/F3 transfectadas com CD94 e NKG2C não expressam eficazmente um heterodímero de CD94/NKG2C na superfície da célula na ausência de DAP12. A infecção destes transfectantes CD94/NKG2C + Ba/F3 com o receptor mutante DAP12-FLAG D-A transmembranar não permite a expressão eficaz de CD94/NKG2C na superfície da célula, como indicado pela reactividade marginal destas células com um anti-soro específico anti-CD94/NKG2 (apesar de as proteínas NKG2C serem detectadas no citoplasma do transfectante por análise por Western blot). A comparação dos domínios transmembranares de NKG2A e NKG2C indica a presença de um resíduo K em NKG2C, 126 ΡΕ1003861 sugerindo que este resíduo pode ser responsável pela interacção com o resíduo D em DAP12. Por isso, o K em NKG2C foi convertido em L por mutagénese sítio dirigida e o mutante NKG2C K-L transmembranar foi transfectado em células Ba/F3 que expressam DAP12 e CD94. As células Ba/F3 co-transfectadas com CD94 e o mutante NKG2C K-L transmembranar expresso não permite a expressão na superfície de DAP12-FLAG, apesar da DAP12 ser detectada no citoplasma por análise de Western blot. Foram detectado níveis muito baixos de um receptor mutante NKG2C CD94/K-L transmembranar na superfície destes transfectantes

utilizando um anti-soro anti-CD94/NKG2C. Apesar do resíduo K no domínio transmembranar de NKG2C poder servir como um sinal de retenção, deve ser digno de nota que a NKG2C expressa também o motivo DxxxLL que está também presente em CD3y e tem sido implicado na degradação, transporte e localização de proteínas CD3 (Dietrich, et al. (1994) EMBO J. 13: 2156-2166/ Dietrich, et al. (1997) J. Cell Biol. 138: 271-281/ Dietrich, et al. (1996) J. Cell Biol. 132: 299-310/ Letourneur e Klausner (1992) Cell 69: 1143-1157) e na ligação da Proteína Adaptadora 1 (AP-1) e na Proteína

Adaptador 2 (AP-2/ Dietrich, et al. (1997) J. Cell Biol. 138: 271-281). XIV. Tradução de sinal via complexos CD94/NKG2C/DAP12 e KIR2DS2/DAP12 A ligação de KIR2DS2 em transfectantes que expressam complexos KIR2DS2/DAP12 resultam na fosforilação 127 ΡΕ1003861 da tirosina de DAP12 e de outros substratos celulares e a associação de DAP12 fosforilada com Syk (Lanier (1998) Cell 92: 705-707) . A ligação quer de CD94 ou de DAP12-FLAG em transfectante Ba/F3 que expressam complexos CD94/NKG2C/DAP12 causa a fosforilação da tirosina de numerosas proteínas celulares, incluindo a DAP12 e a Syk. Estes resultados indicam que a ligação cruzada de CD94/NKG2C induz a activação celular, presumivelmente via DAP12. Ainda não está definido se a ligação de CD94/NKG2C na ausência de DAP12 ou em transfectantes que expressam o mutante DAP12-FLAG D-A transmembranar possui consequências funcionais devido à CD94/NKG2C não ser eficientemente expressa na ausência de DAP12 de estirpe selvagem.

Ao contrário da CD94/NKG2C, as moléculas de KIR2DS2 são expressas na superfície da célula na ausência de DAP12, apesar de serem incapazes de induzir a activação celular (Bléry, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 8989-8996; Lanier, et al. (1998) Nature 391: 703-707). As células de KIR2DS2 + Ba/F3 foram transfectadas com um retrovírus que codifica quer a DAP12-FLAG de estirpe selvagem quer o receptor mutante DAP12-FLAG D-A transmembranar. Tanto a KIR2DS2 e a proteína DAP12 mutante foram expressas na superfície da célula. No entanto, a proteína mutante DAP12-FLAG D-A não foi co-imunoprecipitada com KIR2DS2 de transf ectantes marcado com 125I. Adicionalmente, a ligação com o mAb anti-KIR falha na activação destas células, enquanto que a ligação cruzada do receptor mutante DAP12-FLAG D-A transmembranar com o mAb 128 ΡΕ1003861 anti-FLAG induz de facto a fosforilação da tirosina de proteínas celulares. Tal como a NKG2A e a NKG2C, a proteína KIR2DS2 possui uma contraparte, KIR2DL2, à qual lhe falta um aminoácido carregado no domínio transmembranar e contém um ITIM no seu domínio citoplasmático. Foi anteriormente reportado que a KIR2DL2 é incapaz de se associar com DAP12 (Lanier, et al. (1998) Nature 391: 703-707). Colectiva-mente, estas descobertas indicam que a associação de DAP12 com qualquer um dos complexos KIR2DS2 ou CD94/NKG2C resulta provavelmente de interacções que envolvem os domínios transmembranares dessas proteínas. A estequiometria de DAP12 de KIR2DS2 ou de CD94/NKG2C nestes complexos não foi determinada. Um homodímero de DAP12 de ligações dissulfureto processa dois resíduos D (isto é, um em cada proteína DAP12) que podem interagir com os resíduos K presentes nos domínios transmembranares de KIR2DS2 ou NKG2C. Devido à CD94 não possuir resíduos carregados no domínio transmembranar, a DAP12 pode ser capaz de funcionar como um adaptador permitindo a associação de dois monómeros KIR2DS2 ou de dois heterodímeros CD94/NKG2C com um homodímero de DAP12. XV. Associação de DAP12 e CD94 em célula NK humanas

Os receptores CD94/NKG2C têm sido anteriormente implicados na activação de células NK (Cantoni, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 327-338; Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609). Um clone de célula NK e 129 ΡΕ1003861 uma linha celular NK policlonal foram seleccionados com base na sua capacidade para mediar a citotoxicidade redireccionada contra a célula alvo P815 que alberga o receptor Fc na presença do mAb anti-CD94, sugerindo a presença de um complexo receptor de activação associado à CD94, provavelmente o CD94/NKG2C (Cantoni, et al. (1998)

Eur. J. Immunol. 28: 327-338) . O clone da célula NK e a linha celular NK policlonal foram marcados com 125I lisados em detergente digitonina para preservar complexos recepto-res de múltiplas subunidades, e as proteínas associadas à DAP12 foram co-imunoprecipitadas utilizando um anti-soro anti-DAP12. As proteínas associadas à DAP12 foram eluídas com um tampão de pH 11,5 para dissociar os complexos e então as proteínas eluídas foram re-imunoprecipitadas com um mAb de controlo ou com um mAb anti-CD94 para a linha celular de NK policlonal, o mAb anti-CD94 reagiu especif icamente com uma proteína 125I eluída a partir do imunoprecipitado anti-DAP12 inicial. Na análise por SDS-PAGE, esta molécula migrou a ~70 kD em condições não redutoras e ~40 kD em condições redutoras. Foram obtidos resultado equivalente utilizando o clone de célula NK. Devido à CD94 por si só não apresentar marcação com 125I (Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745;

Philips, et al. (1996) Immunity 5: 163:172), parece provável que a proteína marcada com 125I associada à CD94 represente a NKG2C, apesar dos reagentes serológicos específicos de NKG2C não estarem disponíveis para o confirmar. Todavia, esta descoberta demonstra a existência de um complexo receptor CD94/DAP12 na superfície celular das células NK humanas. 130 ΡΕ1003861

Receptores de Activação e Inibitórios Juntos

Os genes da família KIR codificam receptores que têm sido implicados quer na activação quer na inibição celular (Biassoni, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 645-650/ Olcese, et al. (1997) J. Immunol. 158: 5083-5086). Os receptores inibitórios contêm sequências ITIM nos seus domínios citoplasmáticos e não possuem resíduos carregados nos segmentos transmembranares, enquanto que os receptores de activação não possuem ITIM, mas possuem muitas vezes regiões citoplasmáticas, e possuem um aminoácido carregado no domínio transmembranar. Esta estratégia geral é também

evidente nas famílias de genes NKG2 (Houchins, et al. (1991) J. Immunol. 158: 3603-3609), Ly49 (Smith, et al. (1994) J. Immunol. 153: 1068-1079), PIR (Hayami, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 7320-7327; Kubagawa, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 5261-5266) e ILT (LIR) (Borges, et al. (1997) J. Immunol. 159: 5192-5196; Samaridis e Colonna (1997) Eur. J. Immunol. 27: 660-665), que incluem todas potenciais receptores de activação e inibitórios.

Foi aqui demonstrado, que a DAP12 se associa com as isoformas de activação em ambos os receptores KIR e CD94/NKG2. O receptores inibitórios CD94/NKG2A e de activação CD94/NKG2C ligam-se ambos ao mesmo ligando, HLA-E (Braud, et al. (1998) J. Immunol. 159: 5192-5196). Qual é a fundamentação biológica para juntar receptores inibitórios 131 ΡΕ1003861 e de activação que reconhecem o MHC da classe I? O complexo receptor de activação CD94/NKG2C/DAP12 pode funcionar para estimular tirosina cinases que fosforilam as sequências ITIM do receptor inibitório NKG2A, resultando no recrutamento de SHP-1 ou SHP-2 (Le Drean, et al. (1998)

Eur. J. Immunol. 28: 264-276). No entanto, parece pouco provável visto que a NKG2A e a NKG2C são expressas diferencialmente dentro da população total de célula NK e apenas um subconjunto de células NK expressam ambos os receptores (Cantoni, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28: 327-338/ Houchins, et al. (1991) J. Immunol. 158: 3603- 3609). A existência de células NK que expressam CD94/NKG2C, na ausência do receptor inibitório CD94/NKG2A, fornece o potencial para a activação destas células quando se defrontam com a HLA-E. A HLA-E é largamente expressa em tecidos normais (Geraghty, et al. (1992) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 89: 2669-2673/ Lee, et al. (1998) Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 95: 5199-5204/ Ulbrecht, et al. (1992) J.

Immunol. 149: 2945-2953)/ por isso, a activação de células NK via CD94/NKG2C/DAP12 pode resultar em autoimunidade. No entanto, estudos recentes sugerem que todos os clones de células NK parecem expressar pelo menos um receptor inibitório (quer um KIR ou um CD94/NKG2A) contra um ligando do próprio MHC de classe I, prevenindo assim a destruição de tecidos autólogos normais (Uhrberg, et al. (1997) Immunity 7: 753-763/ Valiante, et al. (1997) Immunity 7: 739-751). Os clones de célula NK que expressam receptores de activação CD94/NKG2C/DAP12 e uma KIR inibitória contra um ligando próprio de classe I podem potencialmente 132 ΡΕ1003861 reconhecer e eliminar células hospedeiras que perderam a expressão do ligando KIR de classe I, mas que retiveram a expressão de HLA-E. Este modelo requer testes de experimentação, mas pode fornecer defesas contra patogenes que codificam peptideos lider competentes para ligar HLA-E, mas suprimem a expressão de moléculas convencionais de MHC de classe I como uma consequência da infecção.

Transfectantes O cDNA utilizado foi o da CD94 (Chang, et al. 1995), da NKG2A e da NKG2C (Houchins, et al. (1991) lL· Immunol. 158: 3603-3609), da KIR2DS2 (NKAT5, (Colonna e Samaridis, 1995)) e da DAP12-FLAG (Lanier, et al. (1998) Nature 391: 703-707) humanas. O mutante de cDNA DAP12-FLAG D-A transmembranar com um residuo A (codão GCC) substituído pelo residuo D (codão GAC) e o mutante de cDNA NKG2C K-L transmembranar com um residuo L (TTA) substituído por K (codão AAA) foram criados através de mutagénese por PCR utilizando técnicas convencionais. Foi criado por PCR um cDNA de NKG2C contendo um epitopo FLAG na extremidade COOH imediatamente antes do codão de terminação de NKG2C. O cDNA foi sequenciado e subclonado nos vectores retrovirais pMX-neo ou pMX-puro (Onihsi, et al. (1996) Exp. Hematology 24: 324-329) . O DNA plasmidico foi transfectado em células de empacotamento do retrovirus ecotrópico φ-ΝΧ-Ε (uma oferta generosa de G. Nolan (Stanford University)) utilizando lipofectamina (Gibco-BRL) (Onihsi, et al. 1996). Os sobrenadantes virais foram recolhidos dois dias depois e 133 ΡΕ1003861 utilizados para infectar células pré-B Ba/F3 de rato (Onihsi, et al. 1996). Dois dias após a infecção as células foram transferidas para meio de selecção e as células Ba/F3 que expressam estavelmente os receptores da célula NK humana foram seleccionadas por citometria de fluxo para expressão homogénea de nivel elevado.

Anticorpos e Citometria de Fluxo

Os mAbs utilizados eram anti-CD94 (DX22; Philips, et al. (1996) Immunity 5: 163:172) ou mAb HP-3D9 (Lopez-Botet (1995), pp. 1437-1439, em Schlossman, et al. (eds.) Leucocyte Typing V. Oxford University Press, Oxford) mAb anti-KIR2D (DX27, Philips, et al. (1996) Immunity 5: 163:172), anti-NKR-PlA (DX1; Lanier (1994) J. Immunol. 153: 2417-2428), anti-FLAG (mAb M2, Kodak), anti-NKG2A/C (mAb 8E4; Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609) e mAb IgGI de rato controlo (Becton Dickinson, San José, CA). O anti-soro especifico de coelho para os heterodimeros de CD94/NKG2A e de CD94/NKG2C foi preparado como descrito (Lazetic, et al. (1996) J. Immunol. 157: 4741-4745). Os segundo anticorpos da Ig de cabra anti-coelho conjugada com FITC e da Ig anti-rato conjugada com FITC foram adquiridos à CalTag (So. San Francisco, CA). A imunofluorescência e a citometria de fluxo foram efectuadas como descrito (Lanier e Recktenwald (1991) Methods: A Companion to Methods in

Enzymology 2: 192-199). 134 ΡΕ1003861

Bioquímica

As células Ba/F3 transfectada foram marcadas com 125I e solubilizadas em tampão de lise com digitonina (pH 7,8, digitonina a 1%, Triton-X100 a 0,12%, NaCl a 150 mM, trietanolamina a 20 mM, NaN3 a 0,01%, e inibidores de protease; Lanier, et al. (1989) Nature 342: 803-805. Os lisados celulares foram incubados em gelo durante 2 hr com Pansorbina (Calbiochem) cobertos com Ig de coelho anti-rato/ratazana (Sigma) e anti-CD94 (mAb DX22), anti-FLAG (mAb M2) ou IgG de controlo e depois lavados. Os imunoprecipitados foram ressuspensos em tampão de amostra SDS-PAGE na presença ou ausência de 2-mercaptoetanol a 10%, corridos em géis de Tris/glicina a 18% (Novex) e visualizados utilizando um Phosphorlmager (Molecular Dynamics).

Um clone de célula NK humana e uma linha policlonal de células NK humanas (CD3-, CD56+, de células NK de sangue periférico) cultivadas como descrito (Yssel, et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 239-254) foram marcadas com 125I e solubilizadas em tampão de lise com digitonina. Os lisados das células 125I foram pré-limpas durante a noite com Pansorbina cobertas com Ig de coelho e depois incubadas em gelo durante 2 hr com Pansorbina cobertas com um anti-soro de afinidade anti-DAP12 de coelho purificado (geralmente por métodos padrão contra uma proteína de fusão GST contendo todo o domínio citoplasmático de DAP12 humana). As proteínas associadas a DAP12 foram eluídas em 25 μΐ de dietilamina a 50 mM (pH 11,5) e transferidas o.,5 135 ΡΕ1003861 ml de tampão de lise NP-40 a 1% (Tris a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 8,0 contendo inibidores de protease) com uma proteína transportadora BSA a 10 mg/ml. As proteínas eluídas associadas a DAP12 foram re-imunoprecipitadas com mAb anti-CD94 (HP-3D9 e Dx22) acoplado em leitos de Sepharose ou com o mAb anti-NKR-PlA (DX1) acoplado em leitos de Sepharose (utilizado como um controlo negativo). Os imunoprecipitados foram lavados em tampão de lise NP-40 a 1%, ressuspensos em tampão de amostra de SDS-PAGE na presença ou ausência de 2-mercaptoetanol a 10%, corridos em géis de Tris/glicina a 18% e visualizados utilizando um Phosphorlmager. A análise por Western blot utilizando anti-FLAG (mAb M2) ou anti-NKG2A/C (mAb 8E4; Houchins, et al. (1997) J. Immunol. 158: 3603-3609) foi efectuada como descrito em Philips, et al. (1996) Immunity 5: 163:172. O mAb 8E4 detecta tanto a NKG2A como a NKG2C por análise de Western blot, mas não se imunoprecipita ou liga a estes antigénios em ensaios de imunofluorescência.

Estimulação celular

As células Ba/F3 transfectadas foram suspensas em PBS gelado com BSA a 0,5% em 5 x 107 células/ml contendo mAb a 20 yg/ml que reconhece a CD94, DAP12-FLAG, ou KIR2DS2. As células foram incubadas em gelo durante 30 minutos, lavadas, ressuspensas em IgG de cabra anti-rato F(ab')2 a 10 yg/ml (Jackson Immunoresearch), e incubadas 136 ΡΕ1003861 durante três minutos a 37 °C. As células foram centrifugadas em pellet, foram ressuspensas com tampão de lise gelado a 108/ml (NP-40 a 1%, Tris a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM contendo inibidores de protease e de fosfatos, aprotinina, leupeptina, PMSF, EDTA, NaVCy, e NaF) como descrito (Lanier, et ai. (1998) Nature 391: 703-707). As Syk e a DAP12-FLAG foram imunoprecipitadas com anti-soro anti-Syk de coelho (generosamente fornecido por Joe Bolen, DNAX) ou com anti-FLAG (mAb M2) . Os lisados das células (equivalentes a 2-3 x 106 células) e os imunoprecipitados foram postos a correr em géis de Tris/glicina, transferidos para membranas Immobilon (Millipore), bloqueados, sondados com o mAb 4G10 anti-fosfotirosina conjugado com a peroxidase de rábano (Upstate Biotechnology) , lavados e desenvolvidos com um substrato quimioluminescente (Pierce).

XVI. DAP12 de Murino Associada com Ly49D ou Ly49H

Diversos membros da família de receptores Ly49 inibem a lise mediada pela célula NK de alvos que expressam moléculas de MHC de classe I apropriadas. A Ly49D e a Ly49H, duas moléculas Ly49 que não possuem motivos de inibição de imunoreceptores baseados na tirosina (ITIM) nos seus domínios citoplasmáticos, associam-se com a DAP12 de rato, uma molécula que possui um motivo de inibição de imunoreceptores baseado na tirosina (ITIM). A co-trans-fecção quer de Ly49D ou Ly49H com a DAP12 induz a expressão à superfície de ambas Ly49 e de DAP12. O complexo Ly49/DAP12 foi co-imunoprecipitado a partir das células 137 ΡΕ1003861 transfectadas, demonstrando uma associação física de DAP12 com Ly49D ou com Ly49H na membrana plasmática. A estimulação de transfectantes com anticorpos que reconhecem quer a Ly49D quer a Ly49H resulta na activação celular como estimado pela indução da fosforilação da tirosina dos múltiplos substratos celulares.

As células NK expressam receptores para o MHC de classe I que após o reconhecimento de ligando polimórficos de classe I apropriados emitem um sinal inibitório, resultando na inibição da lise alvo. A Ly49A de rato, o receptor inibitório prototípico para H-2 (Karlhofer, et al. (1992) Nature 358: 66), é uma proteína de membrana integral homodimérica de tipo II da família de lectina tipo C expressa em células assassinas naturais e numa pequena população de células T. A família Ly49 inclui 9 genes, de Ly49A até I (Smith, et al. (1994) J. Immunol. 153: 1068;

Brennan, et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 2287; Takei, et al. (1997) Immunol. Rev. 155: 67). Sete das moléculas Ly49 (Ryan e Seaman (1997) Immunol. Rev. 155: 79) possuem um ITIM (V/IxYxxL/V) (Thomas (1995) J. Exp. Med. 181: 1953;

Lanier (1997) Immunity 6: 371) nos seus domínios citoplasmático. O ITIM fosforilado em Ly49A e em Ly49G2 liga-se às fosfatases da tirosina citoplasmáticas SHP-1 e SHP-2 (Olcese, et al. (1996) J. Immunol. 156: 4531;

Nakamura, et al. (1997) J. Exp. Med. 185: 673; Mason, et

al. (1997) J. Immunol. 159: 4187). A ligação de Ly49A através dos seus ligandos H-2Dd interrompe os primeiros eventos de activação induzidos pela interacção de células 138 ΡΕ1003861 NK com células alvo (Nakamura, et al. (1997) J. Exp. Med. 185: 673) . A Ly49D e a Ly49H não possuem ITIM mas possuem um resíduo de arginina carregado positivamente nos seus domínios transmembranares. A Ly49D é incapaz de emitir um sinal inibitório e pode de facto activar células NK (Mason, et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 2119).

As células NK humanas expressam um conjunto de moléculas funcionalmente análogo, os receptores inibitórios da célula assassina (KIR) , que pertencem à super-família das imunoglobulinas (Lanier (1997) Immunity 6: 371). A KIR, tal como a Ly49, pode ser dividida em duas sub-famílias baseadas na presença ou ausência de ITIM nos seus domínios citoplasmáticos. A KIR2DL ou a KIR3DL possuem ITIM e inibem a lise de alvos que expressam os seus ligandos MHC de classe I. As isoformas de KIR sem ITIM (KIR2DS) possuem um resíduo carregado positivamente nos seus domínios transmembranares e emitem um sinal de activação (Moretta, et al. (1995) J. Exp. Med. 182: 875; Biassoni, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 645) . A DAP12 que se associa não covalentemente com a KIR2DS2 (Lanier, et al. (1998) Nature 391: 703-707), possui um ITAM na extremidade citoplasmática e um resíduo de ácido aspártico negativamente carregado mo seu domínio transmembranar. A ligação do complexo KIR2DS2/DAP12 resulta na activação celular. A associação de DAP12 com a Ly4 9D e a Ly4 9H de rato, e a capacidade deste complexos para activarem vias de sinalização a jusante, foram examinadas. 139 ΡΕ1003861

Os transcriptos de Ly49D e de Ly49H estão presentes nas células NK activadas por IL-2 (20). A Ly49D é expressa em - '50% das células NK (Mason, et al. (1996) J.L Exp. Med. 184 : 2119), e está associada com uma fosfoproteína tirosina de 16 kD (Mason, et al. (1998) J.

Immunol. 160: 4148-4152). As células NK de murino, tal como as células NK de humanos, transcrevem mRNA para a DAP12, uma molécula que se associa com a KIR2DS activadora e medeia a activação celular (Lanier, et al. (1998) Nature 391: 703). Para examinar se a Ly49D ou a Ly49H se associam com a DAP12, células Ba/F3 foram estavelmente transfectadas com uma DAP12 de rato marcada com epitopo (DAP12-FLAG). As células Ba/F3-DAP12-FLAG não expressam a DAP12 na superfície celular. A Ba/F3 ou os transfectantes Ba/F3-DAP12 foram então infectados com retrovirus que codifica quer uma Ly4 9D, quer uma Ly4 9H marcada com o epitopo myc (Ly49H-myc), ou uma Ly49 como controlo. Nem a Ly49D nem a Ly49H-myc foram expressas em niveis apreciáveis na superfície da célula quando transfectadas em células Ba/F3. em contraste, a transfecção de células Ba/F3-DAP12-FLAG quer com a Ly49D quer com a Ly49H-myc resulta na expressão superficial de nível elevado em ambas as Ly49 e na DAP12-FLAG, sugerindo que a Ly49D e a Ly49H se associam com a DAP12.

Foi examinado se os resíduos carregados nos domínios transmembranares de Ly49 e DAP12 são importantes para a sua associação. A Ly49A partilha 86% de identidade de aminoácidos com a Ly49D no seu domínio extracelular, mas 140 ΡΕ1003861 falta-lhe a arginina no seu segmento transmembranar. Em contraste com a Ly4 9D ou com a Ly4 9H, quando a Ly4 9A foi transfectada estavelmente em células Ba/F3 ou Ba/F3-DAP12-FLAG, foi expressa na superfície celular sozinha ou na presença da DAP12-FLAG e não induziu a expressão superficial de DAP12-FLAG. As interacções entre Ly49D ou Ly49H-myc e DAP12 não são restritas da espécie porque ambas as moléculas de Ly49 são expressas na superfície de transfectantes Ba/F3 DAP12-FLAG humanos. No entanto, nem a Ly49D nem a Ly49H foram expressas na superfície de células Ba/F3 estavelmente transfectadas com uma molécula mutante de DAP12 humana, na qual o ácido aspártico negativamente carregado no dominio transmembranar foi mutado para leucina. Por isso, ambas as Ly49D e Ly49H devem associar-se com a DAP12 para alcançarem efectivamente a superfície da célula e a sua interacção é provavelmente mediada pelos residuos contrariamente carregados nos domínios transmembranares de DAP12 e de Ly49.

Para confirmar se a Ly49D e a Ly49H se associam não covalentemente com a DAP12 na superfície celular, os transfectantes de Ba/F3 Ly49D/DAP12-FLAG ou Ly49H-myc/DAP12-FLAG foram iodados à superfície, lisados com digitonina, e os imunoprecipitados foram analisados por SDS-PAGE. A imunoprecipitação de lisados de Ba/F3-Ly49D/DAP12-FLAG com anti-Ly49D apresentou duas espécies iodadas com tamanhos consistentes com a sua identidade como Ly49D e DAP12-FLAG. Foi observado um padrão idêntico com anti-FLAG, confirmando que as duas espécies são a Ly49D e a 141 ΡΕ1003861 DAP12-FLAG. A imunoprecipitação de lisados Ba/F3-Ly49H-myc/DAP12-FLAG com anti-myc ou com anti-FLAG apresentou um padrão similar. Estes resultados demonstram uma interacção fisica de Ly4 9D ou de Ly4 9H com a DAP12 na membrana plasmática. XVII. Os Complexos Ly49D/DAP12 Transmitem Sinais de

Activação Intracelular

Visto que a DAP12 possui um ITAM e a ligação de Ly49D activa as células NK (Mason, et al. (1996) J. Exp.

Med. 184: 2119) é questionado se os complexos Ly49/DAP12 transmitem um sinal de activação. A ligação cruzada dos transfectantes Ly49D/DAP12-FLAG e Ly49H-myc/DAP12-FLAG com Ly49 ou anti-FLAG resulta na fosforilação da tirosina de muitas proteínas celulares incluindo a DAP12-FLAG e a Syk em ambas as linhas celulares. Estes dados fornecem a evidência de que a Ly49D/DAP12 e a Ly49H/DAP12 formam complexos funcionais à superfície da célula que após a ligação podem iniciar a activação celular.

Quais são os ligandos fisiológicos para estes receptores de activação? A Ly49D partilha 86% de identidade de aminoácidos no seu domínio extracelular com a Ly49A (Smith, et al. (1994) J. Immunol. 153: 1068), um receptor inibitório que liga H-2Dd e H-2Dk (Brennan, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 1553; Kane (1984) J. Exp. Med. 179: 1011;

Daniels, et al. (1994) J. Exp. Med. 180 : 687). A Ly49H 142 ΡΕ1003861 partilha 90% de identidade de aminoácidos no seu domínio extracelular com outro receptor inibitório Ly49C (Brennan, et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 2287) que interage com várias moléculas de classe I incluindo a H-2KB (Brennan, et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 1553). Assim, estas formas activadoras de Ly49 podem interagir com moléculas de MHC de classe I. Existem evidências nos ratos para o aloreconhecimento por células NK tanto in vivo como in vi tro (revisto em Rolstad, et al. (1994) Immunol. Rev. 155: 91). Similarmente, células NK de rato reconhecem células da medula óssea alogénica que expressam certas moléculas de classe I de uma forma positiva e medeiam a sua rejeição in vivo (Ohlen, et al. (1989) Science 246: 666/ George, et al. (1997) Immunol. Rev. 155: 29). Tem sido demonstrado que a Ly4 9D e Ly4 9H de rato se associam com a DAP12 e formam receptores de activação, fornecendo uma possível explicação para o aloreconhecimento positivo por células NK.

Como pode a existência de ambos os receptores de activação e inibitórios de NK que reconhecem os ligando de classe I ser conciliada? São idealizar três modelos. No primeiro modelo, a ligação de receptores de activação pode funcionar durante o desenvolvimento para promover a maturação de células NK imaturas. No entanto, até agora não existe evidência para o aparecimento de receptores de activação antes dos receptores inibitórios durante o desenvolvimento. Um segundo modelo propõe que uma célula NK processe os receptores de activação e inibitórios para o 143 ΡΕ1003861 mesmo ligando de classe I. Após a ligação da classe I, o receptor de activação, deve recrutar uma proteina tirosina cinase que fosforila o ITIM do receptor inibitório, resultando na inactivação da célula NK. Enquanto que a maioria dos clones de células NK humanos possuem pelo menos um receptor de activação e um receptor inibitório estes não possuem necessariamente um par capaz de reconhecer o mesmo ligando. Finalmente, um terceiro modelo prediz que as células NK expressam um receptor de activação e inibitório para diferentes alelos de classe I. Neste modelo, a ligação do receptor inibitório domina se os ligandos para ambos os receptores estiverem ligados. Se o ligando para o receptor inibitório for suprimido ou perdido, o receptor de activação pode activar a lise da célula "anormal" se o ligando estiver presente. Este modelo possui a vantagem de múltiplos receptores de activação e inibitórios poderem ser expressos na mesma célula, uma predição mais em linha com as descobertas nos clones de NK. Assim, no caso de perda de todas as moléculas de MHC de classe I por uma célula alvo, outros mecanismos de activação terão de iniciar a lise pela célula NK. XVIII. Isolamento de Proteínas Associadas A DAP12 permanece localizada intracelularmente quando expressa em células na ausência de parceiros de associação. Esta observação foi explorada com o propósito de clonar novas proteínas de associação à DAP12, por 144 ΡΕ1003861 exemplo, para a expressão de genes clonados necessários no processo de localização celular da membrana. Células sem as proteinas associadas foram transfectadas com a DAP12, e a proteína permaneceu localizada intracelularmente. Estas células podem ser utilizadas para a expressão de clones de proteínas acessórias necessárias para a localização da DAP12 na superfície. A estratégia tem sido designada "DAP-trap".

Para este fim, uma forma de FLAG marcada de DAP12 de rato foi expressa em células 293T utilizando um vector de expressão, por exemplo, pREPlO. Na presença de higromicina, foi seleccionada uma linha celular que expressa DAP12 estável, DT381. Para reduzir as interferências da expressão espontânea de DAP12 na superfície da célula, as células DT381 foram negativamente seleccionadas por citometria de fluxo utilizando o mAb anti-FLAG M2 (Kodak). Para clonar novas proteínas de associação à DAP12, foi transfectada uma linha celular de macrófago J774 derivada de uma biblioteca de expressão pJEF14 em células DT381. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram seleccionadas para a expressão de DAP12 na superfície celular por citometria de fluxo. Isto foi efectuado por coloração com duas cores: a DAP12 foi visualizada utilizando o mAb anti-FLAG M2, seguido de um mAb IgGl anti-rato conjugado com biotina (#02232D Pharmingen), seguido de um terceiro passo de incubação com estreptoavidina-PE. Os receptores Fc das 145 ΡΕ1003861 células DT381 transfectadas foram visualizados utilizando o mAb 2,4G2 anti-CD16/32 conjugado directamente com FITC (#01244D Pharmingen).Foram seleccionadas apenas células positivas PE isoladas. A coloração com o mAb anti-CD16/32 foi necessário para evitar a clonagem de receptores Fc que estão abundam«temente presentes nas células J774.

Os plasmideos das células seleccionadas foram recuperados e o DNA foi re-transformado em bactérias DH10B. Foram obtidas sub-bibliotecas e foram sujeitas a um novo ciclo de clonagem de expressão. Após três ciclos de selecção, foram crescidas 500 colónias bacterianas isoladas da terceira sub-biblioteca num formato de placa de 96 poços para construir uma matriz tridimensional que consiste em 5 x 12 x 8 colónias. O DNA obtido a partir dos conjuntos de cada coordenada X, Y, e Z desta matriz foi novamente transfectado em células DT381 e os transfectantes foram rastreados para a expressão superficial de DAP12.

Isto resulta na identificação de dois clones idênticos, codificando ambos uma proteina transmembranar de tipo II de 165 aminoácidos da super-familia de lectina tipo C. Este gene/proteina foi designado por Lectina-1 associada à DAP12 Mielóide (MDL-1). Esta forma de realização de MDL-1 de rato possui uma região intracelular de 2 residuos, uma região transmembranar de 23 residuos, e uma região extracelular de 140 residuos contendo o dominio da lectina tipo C. 0 segmento transmembranar possui um aminoácido 146 ΡΕ1003861 carregado, e a região extracelular possui três sitios putativos de N-glicosilação. A pesquisa por BLAST revelou uma EST de rato de cadeia completa altamente homóloga, AA186015, que era idêntica aos dois clones acima mencionados, com a excepção de que este clone possuía uma cadeia extra de 75 nucleótidos que resulta numa cadeia adicional de 25 resíduos extracelulares imediatamente a seguir à região transmembranar. Assim, existem duas formas de realização, uma forma curta e uma forma longa. As restantes sequências são idênticas. A pesquisa numa base de dados de sequências DNAX revelou uma EST humano homóloga, #97-1128A12, que codifica uma MDL-1 humana homóloga. A MDL-1 de rato parece ser codificada por um único gene, em constaste com muitas proteínas de superfície relacionadas, que podem ocorrer em famílias de genes. A expressão de MDL-1 de rato é restrita a monócitos, macrófagos e a células dendríticas.

Devido ao gene de MDL-1 parecer ser crucial na localização da DAP12 na membrana, e processar caracterís-ticas estruturais interessantes, é provável que a MDL-1 se associe com a DAP12 num complexo de membrana. Assim, a disrupção do complexo pode levar ao bloqueio interessante da função do complexo receptor de DAP12. Isto sugere abordagens óbvias ao rastreio de pequenas moléculas farmacológicas para compostos que irão interferir com a associação. Alternativamente, os fragmentos transmembrana-res podem bloquear a associação funcional. Os anticorpos 147 ΡΕ1003861 das regiões extracelulares, quer apenas com proteínas, ou quer com a combinação de componentes nos complexos funcionais, poderá ser útil em contextos de diagnóstico ou terapêuticos. A DAP10 parece associar-se também com uma proteína acessória. Em particular, a imunoprecipitação de DAP10 sob condições de desnaturação moderadas resulta na co-imunoprecipitação de uma banda de proteína de cerca de 40-41 kD. O tratamento através da neuraminidase ou tratamento por O-glicanase, resulta num decréscimo de peso molecular de cerca de 38-39 kD. O tratamento com N-glicanase causa um decréscimo no peso molecular de cerca de 28-30 kD. Isto sugere que a proteína tem cerca de 26-30 kD sem a glicosilação. Métodos padrão ou de microsequenciação podem ser aplicados à proteína isolada por imunoprecipitação. Com a sequência, podem ser aplicados iniciadores de PCR redundantes, ou outras técnicas para isolar o gene. Alternativamente, a sequência pode permitir a identificação do gene por emparelhamento com sequências em bases de dados.

Além disso, a DAP10 é também sujeita à estratégia de DAP-trap, podem ser aplicadas as técnicas de clonagem de expressão, tal como com a DAP12, para clonar o gene a partir de uma biblioteca de cDNA. A distribuição da informação irá permitir a selecção das linhas celulares e bibliotecas de cDNA apropriadas para tal. 148 ΡΕ1003861

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO 1 é uma sequência de cDNA da DAP12 de primata SEQ ID NO 2 é uma sequência de aminoácidos da DAP12 de primata. SEQ ID NO 3 é uma sequência contig de cDNA da DAP12 de primata. SEQ ID NO 4 é uma sequência de aminoácidos consensus de ITAM. SEQ ID NO 5 é uma sequência de cDNA da DAP12 de roedor. SEQ ID NO 6 é uma sequência de aminoácidos da DAP12 de roedor. SEQ ID NO 7 é uma sequência de cDNA da DAP10 de primata SEQ ID NO 8 é uma sequência de aminoácidos da DAP10 de primata. SEQ ID NO 9 é uma sequência de cDNA da DAP10 de roedor. SEQ ID NO 10 é uma sequência de aminoácidos da DAP10 de roedor. SEQ ID NO 11 é uma sequência de cDNA da MDL-1 de primata. SEQ ID NO 12 é uma sequência de aminoácidos da MDL-1 de primata SEQ ID NO 13 é uma sequência de cDNA da MDL-1 de roedor SEQ ID NO 14 é uma sequência de aminoácidos da MDL-1 de roedor. (D INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Schering Corporation (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Proteínas da Membrana Das Células Mamíferas; Reagentes Relacionados (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 14 (iv) MORADA: (A) ENDEREÇO: Schering Corporation (B) RUA: 2000 Galloping Hill Road (C) CIDADE: Kenilworth (D) ESTADO: New Jersey

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 07033-0530 (v) SUPORTE INFORMÁTICO: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: Power Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 7,5,3 (D) SOFTWARE: MS Word 6,0 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATADE PEDIDO: 31-JUL-1998 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 60/089,168 (B) DATADE PEDIDO: 12-JUN-1998 (vii) DADOS DE PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 60/069,692 (B) DATADE PEDIDO: 16-DEZ-1997 (vii) DADOS DE PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/990,820 (B) DATADE PEDIDO: 15-DEZ-1997 149 ΡΕ1003861 (vii) DADOS DE PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 60/063,717 (B) DATADE PEDIDO: 29-OUT-1997 (vii) DADOS DE PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/904,905 (B) DATADE PEDIDO: Ol-AGO-1997 (viii) ADVOGADO/AGENTE INFORMAÇÃO: (A) NOME: Thampoe, Immac J. (B) NÚMERO DE REGISTO: 36,322

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ETIQUETA: DX0763X (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (908)298-5061 (B) TELEFAX: (908)298-5388 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 342 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..339 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 79..339 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 1:

ATG ©3G GOA CTT GAA CCC TGC AGC AGG CTC CTG CTC CTQ CCT CTC CTG 4Ê Mét Gly Gly Leu Glu Pra Cys Ser Arg· Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu -ae »as -2Θ -is

CFG OCT GTA AGT OGT CTC CGT CCT CTC CÃG GCC CAG GCC CAG AGC GAT 96

Leu Ala Vai Ser Qly hm Ar® Pro vai Gin Ala Gin Ala Gin ser Asp “10 1. 3

TGC AOT TOC TCT ÂCG OTO AGC €06 GGC GTG CTG GCA GGO ATC GTG ATO 144

Cys Ser Cys Ser Thr Vai Ser Fr o Gly Vai Leu Ala Gly Ile V&i ttet 10 IS 2Ô GGà «AC CTO ÓTG CTS AÇA STG CTC ATT GCC CTG GCC OTO TAC TTC CTG 1:92

Giy Asp Leu Vai Leu Thr Vai Leu Ile Ma Leu Ala Vai Tyr Phe Leu 150 ΡΕ1003861 35 30 35 CSC MQ CGG CTG GTC CCT cm ggg GGA OQG GCT GCG GAG GCA GCG ACC CCG Gly Arg 40 Leu Vai Ιϊΰ .Arg Gly 45 Arg Oiy Alá Ala Glu. Alá Ala Thr 50 Arg AAA 288 CAG CGT ATC ÂCT GAG ACC QAG TCG CCT TAT CAG GAG CTC CAG GGT Lys 55 Gin Ats XX® Thr Glu 80 Thr GlU Ser Pro Tyr 65 Gin Glu Leu Gin Gly 70 CAG 336 ASG TCG GAT GTC TAC AGC GAC CTC AAC AGA CAG AGG COG TAT mc Gin Arg Ser ASp Vai 75 Tyr Ser ASp Leu Asn 80 Thr Gin Arg Pro Tyr m ααα TGa

Ml

Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 113 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 2:

fóet Gly Gly Leu £31«. Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu ~2S ~2B -20 -IS

Leu Ala Vai Ser Gly Leu Arg Pre Vai Gin Ala Gin Ala Olu Ser Asp

-10 -5 X S

CyS Ser Cys Ser Thr Vai Ser Pro Gly Vai Leu Ala Gly 11« Vai Msfc io is " m

Gly Asp Leu Vai Leu Thr Vai Leu II® Alá Leu Ala Vai Tyr Phs Leu 25 30 35

Gly Arg Leu Vai Pró Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr ATS 40· 45 50

Lys Gin Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Glu Glu Leu Gla Gly 55 00 15 70

Gin Arg Ser Asp Vai Tyr Ser Asp Leu Asa Thr Gin Arg Pro Tyr Tyr 75 80 85

Lys 151 ΡΕ1003861 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 668 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 3:

CGCTGCGCCA C&TCCC&CtS GCCCTTAOAC 'KSTCGTGTOC ACSCAGCATCC 60

OGCTTCATGO GGGGACTTGA ACCCTGCÃGC AGGCTCCTOC TCCTGCCTCT CCTGCTGGCT 120

GT AAGTOSTC TCCOTCCTOT CCAGGOCCAG OCCCmkGCG ATPGCAGTfG CTCTÂCGGTG

ISO AGCCCGGGCG TOCTGGCA6G GAfCGTGATG GGASACCTGG TGCTG&C&GT GCTCATFGCC 240

CTOGCCGTGT ACTTCCTGGG CCGGCTGOTC CCTCGOGGGC GAGGGGCTGC GGAGGCASCG 300

àCCCSSAAAC ÃGCGTATCÃC TGÃGÃCCGÃG TCOCCTTATC AGSÃGCTCCA GGGTCAGAGG

TCGGATXJTGT AC&GCGACep CAbChCÂCAG AGGCCGTATT ACAAATGÃGC CCGAATCATG 420

ACAGTCAGCA ACATGATÃ.CC TGGATCCAGC CATTCCTGAA GCCCÂISOCTG ChCCTC&ttC 480 CAACTCCTAC CGCGATÃCÃG ACCCACAGAG T-GCCATCCCr GAGAGACCAG ACCGCTCCCC 540

AAmetCfCC TAAÃATAÃÃC ATCAAGCACA ÂA&AAAAAAA AAAAAAftAAÇ TCI4SGQQS3G 600 ©GCCCGGTTA NCCAATTTGG &CCTÍUUUG 628 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: não relevante (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptideo 152 ΡΕ1003861 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 4:

Gle Ser Pro Tyx GXn Glu Leu Gin Gly Gin Argr Ser Asp Vai Tyr Sãr 1 s 10 15

Asp Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 345 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..342 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 79..342 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 5:

ATS 03G SCT CTG SM CCC TÇÇ TGG TGC CTT CTG TTC CTT CGT GTC CTC

4S

Het Gly Ala Leu Glu Pro Ser Trp Cys Leu Leu Lee Pro vai Leu -25 -2S “20 “15

CtG &CT GTG GGA GSA 7TA AGT CCC GTA Ç&0 GCC C&G hm QAC ACT TTC 9ê

Leu Ihx vai Gly Gly Leu Ser fsô vai Gin Ala Qln Ser Aap Thr Phe “5 1 ^

CCA AQA TGC GAÇ TGT TCT TCC GTG AfiC CCT GG? OTA CTG GCT GGG ATT 144 |?ro Ar3 Çys Asp Cys Ser Ser Vai Ser Pro Gly Vai. Leu Ala Gly 11® 10 15 2® GTT CTG GGT QAC TTS GTG TTG AÇT ÇTG CTS MT GCG CTG GCT GTG TAC 1Í2

Val Leu Gly Asp Leu Vai Leu Thr Leu Leu II® Ala Leu Ala Vai Tyr

25 10 3S

TCT CTS SGC CSC CTG GTC TCC OSA GST CAA GGC ACA GCG GAA GCG ACC 240

Ser Leu Gly A*» Leu Vai Ser Ar» Gly Gl« Gly «Wf Ala Glu Gly. Th* 40 45 so 153 ΡΕ1003861 CGG MA CM CAC 288 &rg Lys Gin Bis S5

GGT CAG AÍ3A CCA 338

Gly Gin Arg Pro

ATT GCT G&G ÂCT

Jle Ala Glu Tfor so

GAA STA TAC AGT

Glu V&1 Tyr s-er 75

GAG TCG CGT TÂT

Gin Ser Fro Tyr 85

GAC CTC AAC ACA

As» Lgu Asn TBr 80

CAG CAG €TT CAG

Gin Gin L«u Gin 70

CAG AÚÚ CAA TÁT

Gin. Arg Gin Tyr 85

TAC AGA TGA 345 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 114 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 6: fciefc Gly Ala Leu Glu Tro Ser Trp Cys Leu· Leu Phe Leu Pre Vai Leu ~2$ -25 “20 “15

Leu ttr Vai Gly Gly Leu Ser Pro Vai Gin Ala Gin Ser Asp Thr Fhe “10 “5 15

Pre> Arg ÇyS Asp Cys Ser Ser Vãl Ser Pro Gly Vai Leu Ala Gly 11« 10 15 20

Vai Leu Gly Asp Leu Vai Leu Thr Leu Leu Xis Ala Leu Ala Vai Tyr 25 30 35

Ser Leu Gly Arg Leu Vai Ser Arg Gly Gin Gly Thr Ala Glu Gly Thr 40 45 50

Arg Lys Gin His XXe Ala Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gin Glu Leu Gin 55 80 05 70

Gly Gin Arg Fro Glu Vai Tyr Ser Asp Leu AàA Thr Gin Arg Gin Tyr 75 80 85

Tyr Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 451 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 154 ΡΕ1003861

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 63..338 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 117..338 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 7: ©TCGACCTGG AGTTCTCTQG ACCÂCAGTCC TCTGCCAGAC CCCTGCCAGA CGCCAGTCCA 6ô CC ATG ATC CAT CK GST CAC ATC CTC TTC CTG CTT TTG CTC CCA GTG 107

Het IX® His Leu Gly Hls lie Leu Phe Leu Leu Leu Leu Prc Vai 18 “15 -10 -5 ÓCT <3CA '1: se OCT CAG AÇG ACT CCA mA GAG AGA TCÃ TCA CTC CCT GCC Ala Ala .Ala Gla Thr 1 Thr Pro Gly Glu Arg 5 Ser Ser Leu 10 Pr© Ala Phe TAC 203 OCr GGC ACT TC,A GGC TCf TGT TCC GGA TGT GGG TCC CTC TCT CTG Tyr Pro 15 Gly Thr Ser Gly Ser Cyst 20 Ser Gly cys Gly 25 Ser Leu Ser Leu CCG 251 CTC CTG· GCA GGC CTC GTG GCT QCT GAT GCG GTG GC& TCG CTG CTC Pro 30 Leu Leu Ala Gly Leu 35 v&l Ala Asp Ala 40 Vai Ala Ser Leu Leu 45 ATC 299 GTG GGG QQQ GTG TTC CTG TGC G€A CGC CCA CGC CGC AGC ccc GCC lis Vai Gly Ala vai 50 Phe Leu Cys Ala Arg SS Pro Arg Arg ser Pró ®0 Ala CAA 348 SAT GGC AAA GTC TAC ATC MÇ ATG CCA GGC AGG GSC TGACCCTCCT GX» Asp Gly Lys Vai Tyx 11a Asa Mefc Pr© Gly Arg Gly SS 70 GCAGCTTGGA CCTTTGACTT CTOACCCTCT CATCCTGGAT GGTGTGTGGT GCACAGGAAA 408 CCCCGCCCCA ACTTTTCGAT OTMIMM CATTTGAAAC ACA 451 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 155 ΡΕ1003861 (A) COMPRIMENTO: 92 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.

Met lis Kie Leu Gly His Xle teu Leu Lau Leu .Leu Pr© Vai &L& “18 -15 -10 “5

Ala Ma 61» Thr Thx Fro Gly 61 u Arg Ser Ser Leu Pr© Ala fhm Tyr 1 S 10

Fr© Gly *hx Ser Gly Ser Çye Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pr© IS 20 25 30

Leu Leu Ala Gly Lsu vai Ala Ma hsp Ala Vai Ala Ser Leu Leu Xle 35 40 45

Vai Gly Ala Vai Phe Leu Cys Ala Arg Pr© Arg Arg Ser Pr© Ala Olu 50 55 SÕ

Asp Gly lya vai Tyr Xle As» Mas Pr© Gly Arçf Gly 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 403 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 109..345 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 163..345 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 9:

OTCACCÀTCG SGGT^C&TC Ç6XCCTÀGCT ©CCTCTCTTC TOCTCTACTO TOCTOAOGAC eo

TTCCCTGSAC CACÃSrmsS GCCÂGMGCC TTC&GGrCCC Ã6CCCAGC ATG 6AC CCC 117

Met .Asp Fr© -18 CCA 66C WC CTC CTG TTC CLG CTF CTG CTC CCA GTG GCT OCA AGT CAG 165 156 ΡΕ1003861

Pr© Qly Tyr Leu -IS Leu Phe -10 Leu hmi Leu Leu Pr© «5 Val Ala Ala Ser Gin 1 ACA TCG GCA GGT 213 tcc TGC TCC cjGã TGT GGG ACT CTG TCT CTG CCA CTC Thr Ser Ale Gly 5 Ser Cys Ser Gly Cys Gly Thr 1Q Leu Ser Leu 15 Pr© Leu CTG GCA GGC CTA 261 GTG GCT GCA GAT GCG GTC ATG TCA. CTG CTA ATT GTA Leu Ala ôly Leu 20 Vai Ala Ala Asp 25 Ala Vai Met Ser Leu 30 Leu Ile val GGG GTG OTG TTT 303 GTA TGT ATG CGC CCA CftC GGC AGG CCT wUv# CAÂ QAA Gly Vai Vai Phe 3S Vai Gys Mefc Arg 40 Pr© Bis Gly Arg 45 Pr© Ala eia Glu GM> GG? AG& GTC 355 Asp Gly Arg Vai 50 TAC Tyr ATC 11© 55 AAC Asm ATG Met CCT Pro QGC ÂGA siy €Q GGC Gly TtSAC C AOGOC ÂCCTTCTGAC CCGCTCATCC TGGATCCTGT GQGTTTGGGQ TGCGTGGG 403 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 79 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 10:

Met Asp Pr© Pr a Gly Vyx Leu Leu Pbe Leu Leu Leu Leu Pfo Vai Ala “1® -IS -10 ~5

Ala Ser Gin Thr Ser Ala Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly ãr tom Ser 13 i&

Leu Pr© Leu Leu Ala Qly Leu Vai Ala Ala Asp Ala Vai Kfcte B-ttt Leu 15 20 25 30

Leu 11« Vai Qly vai Val Phe Vai Cys Mefe Arg Pr© Bis Qly Arg Pr© 35 40 4§

Ala Gin Glu Asp Gly Arg Vai Tyr 11© Asm Wat Pro Gly Arg Gly 50 55 ¢0 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 996 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 157 ΡΕ1003861 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 157..117 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 11: GGCTTAGCGT GGTCGCCGCC GAGGTCGCAA MÕ3AGCATA TTCTCAGMG AÇGQS3CÇÇÇ £0

TOCCTOCCAC ACCMGCATT AGGCCACCAG GMGACCCCC ATCTGCAAGC MGCCTAGCC 120 TTCCAGGGAG ÍMGAGGCCX CTCCAGC;TCC TTCATC ATO .MC TGG CAC ATO ATO 174 M®t Asn Trp His Met Ile X 5

ATC TCT G©S CTT ATT OXO GTA GTC €TT MA GTT GT? GGA ATO ACC TTA 232

Ile ser Gly Leu Ile V«1 Vai V&l Leu Lya Vai Vai Gly Sít Thr Leu 10 15 20 TTT CTA CTT TAT TTC CCA CAG ATT TXT AAC AM AGT AAC CAT GGT TTC 270

Phe Leu Leu Tyr Phe Pr* Gin Ile Phe Asa Lys Ser Asn Asp Gly Phe 2:5 30 35 AGC ACC ACC AGS AGC TAT GGA ACA GTC TCA CAG ATT TTT GGC ACC AGT 318

Thr Thr Thr Arg Ser Tyr Gly Chr Vai Ser Gin Ile Fh.e Gly Ser Ser 40 45 50 TO€ CCA AGT CCC AAC GGC TTC ATT ACC ACA AGG AGC TAT GGA ACA GTC 366

Ser Pro Ser Pro Asa Gly Phe lie Thx Thr Ara Ser Tyr Gly Thr Vai 55 €0 65 70 TOC CCC AM GAC TGG GAA TXT TAT CM ÚCh AGA TCT TTT TTC TTA TCC 414

Cys Pr® Lys Asp Trp Glu Phe Tyr Gin Ala Arg Cys Phe Pha L«u Ser 7S 80 85 ACT TCT GM TCA TCT TCG MT 8AA AGC AGG GAC TTT TCC AM GGA AM 463

Thr Ser Glu Ser Ser Trp Asn Glu Ser Arg Asp Ptwe Cys Lys Gly Lys 90 55 100 GGA TCC ACA TTC GCA ATT GTC AAC ACG CCA GAG ÂAA CTC TTT CTT CAG 510

Gly Ser Thr Leu Ala Xle Vai Asa Thr Pro Glu Lys Leu Phe Leu Gin 105 UQ 115 158 ΡΕ1003861 6AC 538 ATA ACT GAT GCT GAG A&G TAT TTT ATT GGC TTA ATT TAC CAT CGT ASp IJb 120 Thir Asp Ala aiu Lys 125 Tyr Pite Xle Gly Leu 130 lie Tyr Mis Arg OAA 608 GAG AAA AGG TGG CGT TGG ATC AAC AAC TCT GTG TTC AM* mc AAT Gltt 135 Clu Lys Arg Tsp Arg Trp 140 lie Asm Asn Ser 143 Vai The Asa Gly Aa« 150 GTT S54 ACC AAT CAG AAT C&G AM* TTC AAC TGT ©CG ACC ATT GGC CTA ACA Vai Thr AStt Gin AS» 155 61a Asn The Asn Cys i m Ala Tfez Xle Gly Leu 165 Thr AAG 702 A.CC TTT GAT OCT GCA TOA TGT QbQ ATC AGC TAC €GC AGG ATC TGT Lys: Thr The Asp 170 Ala Ser Cys 175 11® ser Tyr Arg Ar® ISO 11® cys GAG MG AAT GCC AAA TOATCACAST 'TCCCTGTGAC AAGAACTATA CTTGeAACTC 7S7

Glu Lys Asr* Ala Lys 183 tttttsãmg cataacaggt cgtactggoc aatgattact tttacttacc tatctgtact 817 AOCftOTAGCG GTCCTTGCCC ATTTOGGAAA CTGAlGCTTCT TTCTTCTGCA CTGG666ACT 877

G6ATCCTAGC CATCTCCAGG AG&CA66ATC AGTTTTACGG MÁCAACTCA GTTAGTATAG 93?

ÃGAT0AGG7C CGCTTCTGTA GTACCTTCCT TCAAATÂAAG MATTTGGTA CCTGCCCOG 996 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 187 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 12:

Htet Asa Trp Kis Htefc xle Ils Sei Gly Leu lie Vai Vai Vai Leu Lys 1 S 10 1§

Vai Vai Gly Met Thr Leu Fhe Leu Leu Tyr Th® Pro Gin lie Phe Asts 20 25 30

Ser

Lys Sar &sn Asp Gly The Thr TTir Vhr Àrg Ser Tyr Gly Thr Vai 35 40 45 159 ΡΕ1003861

Gin Ile Phe Gly Ser Ser Ser Pro Ser Pro Asn Gly Hse Π« Thr Thr so S5 m

Ar3 Ser Tyr Gly Thr Vai Cys Pro Lys âsp Típ Gly. Pns Tyr Gi» Ale S5 ?G 75 ' ®õ

Argf Cys P&e Ph© Leu Ser ISsr Ser Glu Ser Ser Trp &s« Glu Ser Arg S5 £6 55

Asp Pha -Cys Lys Gly Ly» Gly Ser Thr Leu Ala Ile Vai As» Thr Pr© 100 105 110

Glu Lys Leu Phe Lee Gin Asp Ile Thr Asp Ala Glu Lys Tyr Fhe Ile 115 120 125

Gly Leu Ile Tyr Bis Arg Glu Glu Lys Arg Trp Arg Trp Ile Asa Asa 130 135 140

Ser Vai Phe Asn Gly Asa Vai Thr Asn Gin Asn Gin Aso. The Asn Cys 145 ISO 153 ISO

Ala Thr Ile Gly Leu Thr Lys Thr Phe Asp Ala Ala Ser Cy# Asp Ile 165 170 175

Ser Tyr Axg Ar® li© Cys Glu Lys Asa Ala Lys ISO 135 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 896 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 140..709 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 221 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota = "pequena forma variante sem os nucleótidos 221-295" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 29 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota = "pequena forma variante com diferença nos nucleótidos 29-35 lida como CAGAAGA; 107-109 lida como AGA; 128-129 lida como AT; 820-826 lida como CATAGGT; sem o 859; e 879-880 lida como CA" 160 ΡΕ1003861 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 13:

ATOACATTAC CGATOATOAG CATACATTTC CAQAGCAATO ÀGCCCTGCTC GCTTOACCGA 6G AT&TÇTTATC AAAAAGACTC CTATCTOTAT TOGAACCCAG ACTTCCCAGA AGAGATCAGA 120 TCCCTGATCC CCCATCATC ATO AAC TOG ÇAÇ ATO ATC ATO TCG GGG CTT ATO 172

Hat A8D ΊΧρ Kis Met Ile Ile Ser Gly Mtt Xlã 1 5 10 GTA GTA GTG ATO AAA GTT GTT TOA ATO ACC TTT TTT CTO CVG TAT TTC 220

Vai Vai Vai XX© Lys Vai Vai Gly M&t Thr PLs Phe Leu Leu Tyx Phe IS 20 25 CCA CAO GTT TTT TOC AAA AGT AAT GAT TOC TTC TOC CCC ATO GAG AGC 26β

Pxo Gin Vai Phe Gly Lys Ser Asa Asp Gly Phe Vai Fro Thr Glu Ser 30 35 40

TAC TOA ACC ÀCT AGI* GTO CAG AAT GTO TOA CAG ATO TXT GGG AGA AÂT 316

Tyx Gly Thr Thr ser vai Gin Asn Vai Ser Gin He Fhe Gly Are Asa 45 50 55

GAC GAA ACT ACC ATO CCT ACA AfâG AGC TAT TOA ACA GTO TGT CCC AGA 364

Asp Glu Ser Thr M&t Fro Thr Arg Ser Tyr Gly Thr Vai Cys Pro Arg 60 65 70 75 AAC TOG GAT TTT CAC CAA TOA ÂÂA TOC TTT TTC TTC TCC TTC TOC GÃA 412

Asn Trp Asp Fhs Mis Gin Gly Lys Cys Phe Pb© Fhs Ser Phe Ser Giu 00 85 00 TC A COT TOS AAA GAC AGC ATO GAT TAT TGT TOA ACA CAA. TOA TOC ACA 460

Ser Pro Trp Lys Asp Ser Met Asp Tyr cys Ala Thr Gin Gly Ser Thr 95 100 105

CTG GCA ATT STC AAC ACT CCA ®&G AAA CTO AAC TAT CTT CAS GAC ATA 508

Leu Al a Ila v'al Asn Thr Pr o Glu Lys Leu Lys Tyr Leu Gin Asp Xl e 110 U5 120 CCT CGT ATT GAG AAT TAC TXT ATT GGT TTC GTA CGT ÇAG CCT TOA QhS S56

Ala Gly Ils Glu Asn Tyr Phe Xis Gly Leu Vai Arg Gin Pro Gly Glu 125 130 135 AAA AAG TOG COO TGG ATC AAC AAC TCT GTO TTC AAT TOC AAT GTT ACC 604

Ly© Lys Trp Arg Trp XI a Asa Asa Ser Vai Pfce Asa Gly Asa Vai Thr 140 145 ISO 155 161 ΡΕ1003861 AAT CAG GAC CAG AAC TTC GAC TGT GTC ACT ATA GGT CTG ACG AAQ ACA 652 Asn Gin Asp Gin Asa Phe Asp Cys Vai Thr 11« Giy Leu Thr Lys Thr 160 165 170 TAT GAT GC? GCA TCA TGT GAA GTC AGC TAT CGC TGG ATC TGC GAA ATG 700 Tyr ASp Ala Ala Ser Cys Glu Vai Ser Tyr Arg Trp Ile Cys Glu Met 175 180 1S5 ΑΆΤ GC€ Ά&Α tgatgataga tctctacaag agtgaatttt tacagagcta 749 Asn Ala Lys 190 GCAAAGGAGA TTAGTTGTGÂ CTGAAACCAG CCCAGGAAAA TATAGAGCAT CBWAGACTGT 809 GCCCATCTTC ATAGGTGGGA GTTCCCTATT GAATCCTCAA AGTCMTTTT GTTACTCCAC S69

AAÃCÁTCTTA CCATAGTAAA ACTCCCT 896 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N.° 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 190 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.° 14:

Mtet Asn Trp His Mefc 11« lie Ser C.Iy Leu lie vai Vai Vai 11« hys l 5 10 is Vál vai Gly Met Thr Phe Phe Leu Leu Tyr Phe Pro Gin Vai Phe Gly 20 25 30

Lys Ser Aen Asp Gly Phe Vai Pro Thr Giu Se* Tyr Gly Thr Thr Ser 35 40 45

Vai Gin Asm Vai Ser Gin Ile phe Gly Arg: Asn Asp Gin Ser Thr Met 50 55 60

Pro Thr Arg Ser Tyr Gly Thr Vai Cys Pro Arg Asn Trp Asp Phe His 65 70 75 80

Gin Gly Lys cys Phe Phe Phe Ser Phe ser Qlu Ser Fro Trp hys Asp 85 90 35

Ser Mefc Asp Tyr Cys Ala Thr Gia Gly Ser Thr Leu Ala lie Vai Asn 100 105 110

Thr Pro Giu Lys Leu Lys Tyr Leu ©In Asp Xle Ala Giy Ile Glu Asn 162 ΡΕ1003861 U$

12 S 135

XI® Ctly L®ii Vai Arg 01«. Ρτo Çly úla 13 S tys Ly« 140

Trp Arg' *Txp II* Asn. Asn Ser Vai Phe As» <31y Asn Vai. Thr Asn Gin Asp Gin Asn 145 150 155 .160

Vfae Asp Gyst Vai Thr 11® Gly M *Thr JUys Thr 1¾¾ -Asp Ala Ala- Ser MS 170 175

Cys Glu Val S&r Tyr Arg Tsp lie Cys Sla Mas Asn Ala hys 180 105 1S&

Lisboa, 18 de Dezembro de 2006

Claims (35)

1. ΡΕ1003861 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipeptídeo substancialmente puro ou recombinante contendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12.
2. 2. Uma composição compreendendo o polipeptídeo da reivindicação 1 e um veículo contendo água, solução salina e/ou tampão.
3. 3. A composição da reivindicação 2, contendo adicionalmente um tampão.
4. 4. A composição da reivindicação 2 ou da reivindicação 3, que é formulada para administração oral, rectal, nasal, tópica, ou parentérica.
5. 5. 0 polipeptídeo da reivindicação 1, contendo adicionalmente uma marcação para detecção ou purificação.
6. 6. O polipeptídeo da reivindicação 5, em que a marcação para detecção ou purificação é seleccionada a partir do grupo constituído por FLAG, His6, peptídeo da imunoglobulina, β-galactosidase bacteriana, trpE, Proteína A, β-lactamase, alfa amilase, álcool desidrogenase, e factor alfa de conjugação de leveduras.
7. 7. Um estojo ("kit") compreendendo: 2 ΡΕ1003861 a) um compartimento contendo o referido polipeptídeo de qualquer uma das reivindicação 1, 5 ou 6; e/ou b) instruções para utilização ou disposição de reagentes no referido estojo ("kit").
8. 8. Um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo da reivindicação 1, ou a um fragmento de ligação daí resultante.
9. 9. 0 anticorpo da reivindicação 8, que é um anticorpo monoclonal.
10. 10. O anticorpo da reivindicação 8, que é um anticorpo policlonal.
11. 11. O anticorpo ou o fragmento de ligação de qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, que exibe um kD para a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12 de pelo menos 30 μΜ.
12. 12. O anticorpo ou o fragmento de ligação de qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, em que o referido anticorpo ou o fragmento de ligação está acoplado a um substrato sólido.
13. 13. O anticorpo ou o fragmento de ligação da reivindicação 12, em que o referido substrato sólido é um leito ou uma membrana plástica. 3 ΡΕ1003861
14. 14. O anticorpo ou o fragmento de ligação de qualquer uma das reivindicações de 8 a 13, compreendendo adicionalmente uma marcação detectável.
15. 15. O anticorpo ou o fragmento de ligação da reivindicação 14, em que a referida marcação detectável é uma marcação radioactiva ou fluorescente.
16. 16. Uma composição compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação de qualquer uma das reivindicações de 8 a 15.
17. 17. Um estojo ("kit") compreendendo: a) um compartimento contendo um anticorpo ou um fra gmento de ligação de qualquer uma das reivindicação de 8 a 15; e/ou b) instruções para utilização ou disposição de reagentes no referido estojo ("kit").
18. 18. Um ácido nucleico isolado ou recombinante compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 12.
19. 19. 0 ácido nucleico da reivindicação 18, compreendendo adicionalmente uma marcação detectável.
20. 20. Um vector de expressão compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 18 ou da reivindicação 19. 4 ΡΕ1003861
21. 21. O vector de expressão da reivindicação 20, compreendendo adicionalmente uma origem de replicação.
22. 22. Uma célula ou tecido compreendendo um ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações de 18 a 21, em que a referida célula ou tecido não é um produto da natureza.
23. 23. A célula da reivindicação 22, em que a referida célula é: a) uma célula procariótica; b) uma célula eucariótica; c) uma célula bacteriana; d) uma célula de levedura; e) uma célula de insecto; f) uma célula mamifera; g) uma célula de rato; h) uma célula de primata; ou i) uma célula humana.
24. 24. Um estojo ("kit") compreendendo: a) um compartimento contendo um ácido nucleico de qualquer uma das reivindicação de 18 a 21; e/ou b) instruções para utilização ou disposição de reagentes no referido estojo ("kit"). 5 ΡΕ1003861
25. 25. Um método in vitro para modular a sinalização imune de uma célula ou de células de cultura de tecido compreendendo o contacto da referida célula com o polipeptideo da reivindicação 1.
26. 26. Um método in vitro para modular a sinalização imune de uma célula ou de células de cultura de tecido compreendendo o contacto da referida célula com o anticorpo ou o fragmento de ligação da reivindicação 8.
27. 27. 0 polipeptideo da reivindicação 1 para utilização na modulação da sinalização imune de uma célula ou de células de cultura de tecido.
28. 28. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação da reivindicação 8 para utilização na modulação da sinalização imune de uma célula ou de células de cultura de tecido.
29. 29. A utilização de um polipeptideo da reivindicação 1 para a produção de um medicamento para modular a sinalização imune de uma célula ou de células de cultura de tecido.
30. 30. A utilização de um anticorpo ou fragmento de ligação da reivindicação 8 para a produção de um medicamento para modular a sinalização imune de uma célula ou de células de cultura de tecido.
31. 31. Uma formulação farmacêutica compreendendo: 6 ΡΕ1003861 (a) o polipeptídeo da reivindicação 1; ou (b) o anticorpo ou o fragmento de ligação de qualquer uma das reivindicações de 8 a 15; e um veiculo farmaceuticamente aceitável dai resultante.
32. 32. Um polipeptídeo substancialmente puro ou recombinante contendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 14.
33. 33. Um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo da reivindicação 32, ou a um fragmento de ligação daí resultante.
34. 34. Um ácido nucleico isolado ou recombinante compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 14.
35. 35. O ácido nucleico da reivindicação 34, compreendendo a sequência de nucleótidos descrita nos nucleótidos 140 a 709 da SEQ ID NO: 13. Lisboa, 18 de Dezembro de 2006