ES2274574T3 - Proteinas de membrana celular de mamifero; reactivos relacionados. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a la purificación y el aislamiento de varios genes que codifican polipéptidos de superficie celular de mamíferos. La invención se refiere también a ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, y otros reactivos que se utilizan para modular el desarrollo de células, por ejemplo linfoides y mieloides, así como sus procedimientos de utilización.
Description
Proteínas de membrana celular de mamífero;
reactivos relacionados.
La presente invención se refiere a diversos
reactivos biológicos que son útiles para modular una respuesta
celular de mamífero, por ejemplo, señalización inmune. Más
particularmente, se dirige hacia composiciones y métodos útiles en
interacciones de células inmunes, por ejemplo, entre células B y T,
NK, etc.
El componente circulante del sistema
circulatorio de mamíferos comprende diversos tipos de células,
incluyendo hematíes y leucocitos de los linajes celulares eritroide
y mieloide. Véase, por ejemplo, Rapaport (1987) Introduction to
Hematology (2ª ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987)
Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co.,
Boston, MA; y Paul (ed. 1993) Fundamental Immunology (3ª ed.)
Raven Press, N.Y.
La activación de células T en reposo es crítica
para muchas respuestas inmunes y permite a estas células ejercer
sus capacidades reguladora o efectora. Véase Paul (red.; 1993)
Fundamental Immunology 3ª ed., Raven Press, N.Y. Una
adhesión aumentada entre células T y células que presentan antígeno
(APC) u otras formas de estímulos primarios, por ejemplo,
anticuerpos monoclonales inmovilizados (mAB), puede potenciar las
señales del receptor de células T. La activación de células T y la
expansión de células T depende del compromiso del receptor de
células T (TCR) y señales co-estimuladoras
proporcionadas por células accesorias. Véase, por ejemplo, Jenkins
y Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol.
5:361-367; Bierer y Hahn (1993) Semin.
Immunol. 5:249-261; June et al. (1990)
Immunol. Today 11:211-216; y Jenkins (1994)
Immunity 1:443-446. Una interacción
co-estimuladora principal y bien estudiada para
células T implica CD28 o CTLA-4 en células T con B7
o B70 (Jenkins (1994) Immunity 1:443-446).
Estudios recientes en ratones deficientes en CD28 (Shahinian et
al. (1993) Science 261:609-612; Green
et al. (1994) Immunity 1:501-508) y
ratones transgénicos que expresan inmunoglobulina de
CTLA-4 (Ronchese et al. (1994) J. Exp.
Med. 179:809-817) han revelado deficiencias en
algunas respuestas de células T aunque estos ratones tienen
respuestas inmunes primarias normales y respuestas de CTL normales
para virus de coriomeningitis linfocítica y virus de estomatitis
vesicular. Como resultado, estos estudios concluyen que otras
moléculas co-estimuladoras deben soportar la
función de células T. Sin embargo, ha sido difícil la identificación
de estas moléculas que median en señales coestimuladoras
distintas.
Además, tiene lugar una señalización negativa y
positiva similar con linfocitos (LIRs); células destructoras
naturales (KIRs) y otros tipos de células (ILT y CD94). Véase, por
ejemplo, Moretta et al. (1996) Ann. Rev. Immunol.
14:619-648; Malissen (1996) Nature
384:518-519; Scharenberg y Kinet (1996) Cell
87:961-964; Colonna et al. (1995)
Science 268:405-408; Wagtmann et al.
(1995) Immunity 2:439-449; D'Andrea et
al. (1995) J. Immunol. 155:2306-2310;
Samaridis y Colonna (1997) Eur. J. Immunol.
27:660-665; Aramburu et al. (1990) J.
Immunol. 144:3238-3247; Aramburu et al.
(1991) J. Immunol. 147:714-721 y Rubio et
al. (1993) J. Immunol. 151:1312-1321.
La incapacidad para modular señales de
activación impide el control de respuestas de desarrollo o
fisiológicas inapropiadas en el sistema inmune. La presente
invención proporciona al menos una molécula coestimuladora
alternativa, cuyos agonistas y antagonistas serán útiles para
modular una plétora de respuestas inmunes.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de genes particulares implicados en señalización
celular. Se han identificado diversos genes que interactúan con
formas de genes cuya función no se ha comprendido. Éstas son la
Proteína Accesoria de DNAX, 12 kD (DAP12); la Proteína Accesoria
de DNAX, 10 kD (DAP10); y otra proteína accesoria asociada, la
MDL-1.
Realizaciones particulares de la invención
incluyen un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que
comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12 o
14. Como se describe aquí, la SEQ ID NO: es 2 o 6, y el
polipéptido: es una secuencia natural madura DAP12 de la Tabla 1;
comprende un motivo ITAM; o comprende un residuo cargado en un
dominio transmembrana; o la secuencia ID NO: es 8 o 10, y el
polipéptido: es una secuencia natural madura DAP10 de la Tabla 2;
comprende un motivo ITIM; o comprende un residuo cargado en un
dominio transmembrana. Según la presente invención la SEQ ID NO: es
12 o 14, y el polipéptido: es una secuencia natural madura
MDL-1 de la Tabla 3; o comprende un residuo cargado
en un dominio transmembrana. La descripción incluye un polipéptido
tal que: comprende una pluralidad de las longitudes; es una variante
alélica natural de DAP12; es una variante alélica natural de DAP10;
es una variante alélica natural de MDL-1; tiene una
longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; es un
polipéptido sintético; está incorporado a un sustrato sólido; está
conjugado a otro resto químico; es una sustitución de 5 veces o
menos de la secuencia natural; o es una variante de supresión o
inserción de una secuencia natural. También se describe una
composición que comprende: un polipéptido DAP12 estéril; el
polipéptido DAP12 y un vehículo, en el que el vehículo es: un
compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina y/o tampón; y/o
se formula para administración oral, rectal, nasal, tópica o
parenteral; o un polipéptido DAP10 estéril; o el polipéptido DAP10 y
un vehículo, en el que el vehículo es: un compuesto acuoso,
incluyendo agua, solución salina y/o tampón; y/o se formula para
administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. La presente
invención se refiere a un polipéptido MDL-1
estéril. En una realización, la invención proporciona polipéptido
MDL-1 y un vehículo, en el que el vehículo es: un
compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina y/o tampón; y/o
se formula para administración oral, rectal, nasal, tópica o
parenteral.
Se proporciona una proteína de fusión, que
comprende tal polipéptido y: una etiqueta de detección o
purificación, incluyendo una FLAG, His6 o péptido de
inmunoglobulina; \beta-galactosidasa bacteriana,
trpE, Proteína A, \beta-lactamasa, alfa amilasa,
alcohol deshidrogenasa y factor de acoplamiento alfa de levadura; o
secuencia de otra proteína de membrana.
Se proporcionan juegos que comprenden tal
polipéptido y: un compartimento que comprende el polipéptido; y/o
instrucciones de uso o evacuación de reactivos del juego.
Se describen también compuestos de unión, que
comprenden una porción de unión a antígeno de un anticuerpo, que se
une específicamente a: un polipéptido DAP12 natural, en el que el
anticuerpo: se produce contra un polipéptido maduro de la Tabla 1;
se inmunoselecciona; es un anticuerpo policlonal; se une a una DAP12
desnaturalizada; presenta un kd a antígeno de al menos 30 \muM;
se incorpora a un sustrato sólido, incluyendo una perla o membrana
de plástico; está en una composición estéril; o está marcado
detectablemente, incluyendo una marca radioactiva o fluorescente; o
un polipéptido DAP10 natural, en el que el anticuerpo: se produce
contra un polipéptido maduro de la Tabla 2; se inmunoselecciona; es
un anticuerpo policlonal; se une a una DAP10 desnaturalizada;
presenta un kd a antígeno de al menos 30 \muM; se incorpora a un
sustrato sólido, incluyendo una perla o membrana de plástico; está
en una composición estéril; o está marcado detectablemente,
incluyendo una marca radioactiva o fluorescente. La presente
invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión del
mismo, que se une específicamente a MDL-1, por
ejemplo, se une a un polipéptido MDL-1 natural, en
el que el anticuerpo: se produce contra un polipéptido maduro de la
Tabla 3; se inmunoselecciona; es un anticuerpo policlonal; se une a
un MDL-1 desnaturalizado; presenta un kd a antígeno
de al menos 30 \muM; se incorpora a un sustrato sólido,
incluyendo una perla o membrana de plástico; está en una composición
estéril; o está marcado detectablemente, incluyendo una marca
radioactiva o fluorescente. Se proporcionan diversos juegos, que
comprenden por ejemplo el compuesto de unión; y: un compartimento
que comprende el compuesto de unión; y/o instrucciones de uso o
evacuación de reactivos del juego. Las realizaciones adicionales
incluyen una composición que comprende: un compuesto de unión
estéril, o el compuesto de unión y un vehículo, en el que el
vehículo es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina
y/o tampón; y/o se formula para administración oral, rectal, nasal,
tópica o parenteral.
Las realizaciones de ácidos nucleicos incluyen
un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica estos
polipéptidos, en el que el ácido nucleico codifica una secuencia de
péptido antígeno de la Tabla 3. Las realizaciones preferidas
incluyen tal ácido nucleico, que codifica una pluralidad de
secuencias de péptidos antígenos de la tabla. Otros ácidos
nucleicos incluyen uno que: es un vector de expresión; comprende
adicionalmente un origen de replicación; es de origen natural;
comprende una marca detectable; comprende secuencia de nucleótido
sintético; es de menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb; es de
un mamífero, incluyendo un primate o roedor; o comprende una
secuencia de codificación de longitud completa natural. También se
describe una sonda de hibridación para un gen que codifica DAP12,
DAP10 o MDL-1; o es un cebador de PCR, un producto
de PCR o un cebador de mutagénesis.
Otros ácidos nucleicos descritos aquí se
hibridan bajo condiciones de lavado rigurosas de al menos 50ºC,
menos de 400 mM de sal y 50% de formamida a: SEQ ID NO: 1 o 5; SEQ
ID NO: 7 o 9; o SEQ ID NO: 11 o 13. La invención proporciona una
célula o tejido que comprenden tal ácido nucleico recombinante,
incluyendo cuando la célula es: una célula procariota; una célula
eucariota; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula
de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula
de primate; o una célula humana. Ciertos juegos incluyen uno que
comprende el ácido nucleico y: un compartimento que comprende el
ácido nucleico; y/o instrucciones de uso o evacuación de reactivos
del juego. Los ácidos nucleicos descritos aquí incluyen unos que:
presentan identidad sobre una extensión de al menos aproximadamente
30 nucleótidos a un DAP12 de primate; presentan identidad sobre una
extensión de al menos aproximadamente 30 nucleótidos a un DAP10 de
primate; presentan identidad sobre una extensión de al menos
aproximadamente 30 nucleótidos a un MDL-1 de
primate; y/o codifican adicionalmente un receptor KIR, ILT/MIR o
CD94/NKG2C. Las realizaciones preferidas incluyen aquellas en las
que: las condiciones de lavado son a 60ºC y/o sal 200 mM; o la
extensión es al menos 55 nucleótidos.
También se describen métodos para modular la
fisiología o el desarrollo de una célula o células de cultivo de
tejidos que comprenden poner en contacto la célula con un agonista o
antagonista de un DAP12, DAP10 o MDL-1. También se
describen métodos de examen para un compuesto que bloquea la
interacción de una DAP12 o DAP10 con un receptor KIR, ILT/MIR o
CD94/NKG2C, que comprenden poner en contacto el compuesto con la
DAP12 o DAP10 en presencia del receptor.
La invención proporciona también métodos in
vitro para modular la señalización inmune de una célula o
células de cultivo de tejidos que comprenden poner en contacto
dicha célula con un polipéptido sustancialmente puro o recombinante
que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12
o con un anticuerpo que se une específicamente a dicho polipéptido,
o un fragmento de unión del mismo.
La invención proporciona además un polipéptido
sustancialmente puro o recombinante que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12 o un anticuerpo que se une
específicamente a dicho polipéptido, o un frag-
mento de unión del mismo, de uso para modular la señalización inmune de una célula o células de cultivo de tejidos.
mento de unión del mismo, de uso para modular la señalización inmune de una célula o células de cultivo de tejidos.
La invención proporciona también el uso de un
polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende la
secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12 o un anticuerpo
que se une específicamente a dicho polipéptido, o un fragmento de
unión del mismo, para la fabricación de un medicamento para modular
la señalización inmune de una célula o células de cultivo de
tejidos.
La invención proporciona además una formulación
farmacéutica que comprende (a) un polipéptido sustancialmente puro
o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en
SEQ ID NO: 12; o (b) un anticuerpo que se une específicamente a
dicho polipéptido, o un fragmento de unión del mismo, y un vehículo
del mismo aceptable farmacéuticamente.
La presente invención describe las secuencias de
aminoácidos y secuencias de ADN de proteínas de mamíferos que
presentan propiedades de moléculas accesorias para antígenos de
activación celular. Una proteína se denomina Proteína de Activación
DNAX, 12 kD (DAP12). La secuencia de primate descrita aquí se obtuvo
de secuencias identificadas a partir de diversas bases de datos.
También deben estar disponibles secuencias similares para proteínas
de otras especies de mamíferos, incluyendo roedores. Las siguientes
descripciones se dirigen, con fines de ejemplo, al alelo natural de
DAP12 humano descrito, pero son igualmente aplicables a variantes
alélicas y/o polimórficas, por ejemplo, de otros individuos, así
como variantes de empalme, por ejemplo, formas naturales.
Una segunda proteína se denomina Proteína de
Activación DNAX, 10 kD (DAP10), que presenta muchos aspectos
estructurales y biológicos similares. Una tercera proteína se asocia
con la DAP12, y posiblemente con la DAP10, y se denomina
Lectina-1 asociada con DAP12 Mieloide
(MDL-1).
Estos genes permitirán el aislamiento de otros
genes de primate o mamífero que codifiquen proteínas relacionadas
con ellos, que se extiendan además a la familia más allá de las
realizaciones específicas descritas. El procedimiento se expone
extensamente después.
La Proteína de Activación DNAX 12 kD (DAP12) se
denomina así por sus aspectos estructurales, y su función
pretendida. Ciertos receptores de la superficie celular carecen de
funcionalidad intrínseca, que puede interactuar hipotéticamente con
otra proteína compañera, que se sugiere que es una proteína de 12
kD. El mecanismo de la señalización puede implicar una señal de
ITAM.
La DAP12 se identificó a partir de bases de
datos de secuencias en base a una relación supuesta con CD3 (véase
Olcese et al. (1997) J. Immunol.
158:5083-5086), la presencia de una secuencia de
ITIM (véase Thomas (1995) J. Exp. Med.
181:1953-1956), ciertas predicciones de tamaños
(véase Olcese; y Takase et al. (1997) J. Immunol.
159:741-747), y otros aspectos. En particular, se
supone que el dominio transmembrana contiene un residuo de carga,
que permitiría un puente de sal con los segmentos transmembrana
correspondientes de sus compañeros receptores pretendidos, proteína
CD94 de KIR (moléculas inhibidoras de células destructoras) y
posiblemente otras proteínas similares. Véase Daeron et al.
(1995) Immunity 3:635-646.
De hecho, muchas de las moléculas receptoras de
KIR, MIR, ILT y CD94/NKG2 conocidas pueden funcionar realmente con
una proteína accesoria que es parte del complejo receptor funcional.
Véase Olcese et al. (1997) J. Immunol.
158:5083-5086; y Takase et al. (1997) J.
Immunol. 159:741-747. Así, se describen aquí
formas purificadas de los receptores de señalización funcional, por
ejemplo, la DAP12 y/o DAP10 con la otra subunidad, como se describe
aquí. Véase, por ejemplo, Daeron et al. (1995)
Immunity 3:635-646. Así, una combinación de
DAP12 o DAP10 con otro receptor forma un complejo funcional en una
célula que es un complejo receptor para un receptor o ligando
opuesto para el complejo.
La DAP10 se identificó parcialmente por su
homología con la DAP12 y otros aspectos. En particular, en
contraste con la DAP12, que presenta un motivo de activación de
ITAM, la DAP10 presenta un motivo inhibidor de ITIM. La
MDL-1 se identificó por su asociación funcional con
DAP12.
Además, la interacción funcional entre, por
ejemplo, DAP12 o DAP10, y su receptor accesorio puede permitir el
uso de la combinación estructural en receptores que no se encuentran
normalmente en una forma de receptor truncada. Así, el mecanismo de
señalización a través de proteínas accesorias tales como las DAP12 y
DAP10 permite un diseño interesante de otros complejos receptores
tipo KIR, por ejemplo, con los receptores de tipo KIR, MIR, ILT y
CD94 NKG2. Pueden construirse formas truncadas de receptores
intactos que interactúan con una DAP12 o DAP10 para formar un
complejo de señalización funcional.
Las formas de primate y roedor presentan una
identidad de secuencias significativa cuando se alinean. Véanse,
por ejemplo, las Tablas 1, 2 y 3. Otros genes presentan una
identidad mucho más baja sobre la región de codificación madura
completa, aunque algunos presentan una identidad más alta en
segmentos particulares.
La Tabla 1 describe la secuencia de nucleótidos
del cADN y la correspondiente secuencia de aminoácidos para
realizaciones de DAP12. La secuencia de nucleótidos de primate
corresponde a SEQ ID NO: 1; la secuencia de aminoácidos corresponde
a SEQ ID NO: 2. La secuencia de señal parece extenderse de met(-26)
a gln(-1) o ala1; la proteína madura debe extenderse desde
aproximadamente ala1 (o gln2), el dominio extracelular desde
aproximadamente ala1 a prol4; el dominio extracelular contiene dos
cisteínas en 7 y 9, que probablemente permiten enlaces disulfuro a
proteínas accesorias homotípicas y heterotípicas adicionales; la
región transmembrana se extiende desde aproximadamente gly15 o
val16 a aproximadamente gly39; y un motivo ITAM desde tyr65 a leu79
(YxxL-6/8x-YxxL). El LVA03A EST se
identificó y usó para extraer otras secuencias solapantes. Véanse
también ESTs humanos de Genbank que son parte de DAP12 humana;
algunos, aunque no todos, incluidos los números de Admisión Genbank
AA481924;
H39980; W60940; N41026; R49793; W60864; W92376; H12338; T52100; AA480109; H12392; W74783; y T55959.
H39980; W60940; N41026; R49793; W60864; W92376; H12338; T52100; AA480109; H12392; W74783; y T55959.
La Tabla 2 describe la secuencia de nucleótidos
del cADN y la correspondiente secuencia de aminoácidos de cada uno
de los genes de DAP10 humana y de ratón. La secuencia de nucleótidos
para la humana corresponde a SEQ ID NO: 7; la secuencia de
aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 8. La secuencia de señal parece
extenderse desde aproximadamente met(-18) hasta ala(-1); la
proteína madura debe extenderse desde aproximadamente gln1, el
dominio extracelular desde aproximadamente gln1 hasta pro30; el
dominio extracelular contiene dos cisteínas en 21 y 24, que
permiten probablemente enlaces disulfuro a proteínas accesorias
homotípicas o heterotípicas adicionales; la región transmembrana se
extiende desde aproximadamente leu31 hasta val47, con un residuo
cargado característico correspondiente a asp39; y un motivo YxxM
interesante desde tyr67 hasta met70, que es similar al visto en
CD28, CTLA-4 y CD19. Véase Tabla 2.
De modo similar, para la DAP10 de ratón, la
secuencia de señal parece extenderse desde aproximadamente met(-18)
hasta ser(-1); la proteína madura debe extenderse desde
aproximadamente gln1, el dominio extracelular desde aproximadamente
gln1 hasta pro16; el dominio extracelular contiene dos cisteínas en
7 y 10, lo que permite probablemente enlaces disulfuro a proteínas
accesorias homotípicas o heterotípicas adicionales; la región
transmembana se extiende desde aproximadamente leu17 hasta val33; y
un motivo YxxM interesante desde tyr54 hasta met57, que es similar
al visto en CD28 y CTLA-4.
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Secuencia de forma larga de
MDL-1 de roedor, por ejemplo, ratón (SEQ ID NO: 13 y
14). Se ha identificado una variante de forma corta, que tiene una
supresión de nucleótidos 221-295. La variante de
forma corta caracterizada posee también diferencias de secuencia:
los nucleótidos 29-35 se leen CAGAAGA;
107-109 se leen AGA; 128-129 se
leen AT; 820-826 se leen CATAGGT; carece de 859; y
879-880 se leen CA. La metionina de iniciación tiene
codones de terminación aguas arriba, lo que sugiere que es el
término amino correcto.
Alineamiento de forma larga de
MDL-1 humana y MDL-1 de ratón. Son
de particular interés un dominio intracelular muy corto,
correspondiente a los residuos 1-2; con el dominio
transmembrana extendiéndose desde aproximadamente 6 hasta 27
poseyendo un aminoácido cargado en aproximadamente el residuo 16.
Tres lugares de glicosilación N-enlazados putativos
corresponden a los residuos 51, 146 y 153 de la forma larga de
ratón; el último de los que se conservan en la secuencia humana.
Nótese que la forma larga de ratón, con relación a la forma corta,
parece contener un segmento espaciador de aproximadamente 25
aminoácidos.
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\vskip1.000000\baselineskip
Según se usa aquí, la expresión "DAP12
humana" se refiere, cuando se usa en un contexto de proteína, a
una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de primate
mostrada en la Tabla 1. También se describen proteínas que
comprenden un fragmento sustancial de la misma, por ejemplo,
mutantes y variantes polimórficas, junto con un polipéptido
derivado de ser humano que presenta la misma función biológica o
interactúa con componentes de unión específicos de DAP12 humana.
Estos componentes de unión se unen típicamente a una DAP12 humana
con alta afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 100 nM,
usualmente mejor que aproximadamente 30 nM, preferiblemente mejor
que aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente mejor que
aproximadamente 3 nM. Se encuentran proteínas homólogas en especies
distintas de seres humanos, por ejemplo, primates. Aunque mucha de
la descripción posterior se dirige a DAP12, pueden ser aplicables
análogamente métodos y aspectos similares a los genes de DAP10 y
MDL-1. Muchas limitaciones dirigidas a DAP12 se
corresponden en términos con referencia a DAP10 y
MDL-1, aunque limitaciones específicas relevantes
para un gen, por ejemplo, una limitación de longitud, no se
pretenden aplicar necesariamente a los otros.
El término "polipéptido" según se usa aquí
incluye un fragmento o segmento, y abarca una extensión de residuos
de aminoácidos de al menos aproximadamente 8 aminoácidos,
generalmente al menos 10 aminoácidos, más generalmente al menos 12
aminoácidos, a menudo al menos 14 aminoácidos, más a menudo al menos
16 aminoácidos, típicamente al menos aproximadamente 18
aminoácidos, más típicamente al menos aproximadamente 20
aminoácidos, usualmente al menos aproximadamente 22 aminoácidos,
más usualmente al menos aproximadamente 24 aminoácidos,
preferiblemente al menos aproximadamente 26 aminoácidos, más
preferiblemente al menos aproximadamente 28 aminoácidos, y, en
realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente
30 aminoácidos o más, por ejemplo, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 75,
100, 125, etc. En realizaciones preferidas, habrá una pluralidad de
segmentos distintos, por ejemplo, no solapantes, de la longitud
especificada. Típicamente, la pluralidad será al menos dos, más
usualmente al menos tres y preferiblemente 5, 7 o incluso más.
Mientras se proporcionen los mínimos de longitud, pueden ser
apropiadas longitudes más largas, de diversos tamaños, por ejemplo,
una de longitud 7 y dos de longitud 12.
La expresión "composición de unión" se
refiere a moléculas que se unen con especificidad a DAP12, DAP10 o
MDL-1, por ejemplo, de una manera de tipo
anticuerpo-antígeno. Otras interacciones incluyen,
por ejemplo, componente receptor-componente
receptor, para formar un complejo receptor. Otros miembros del
complejo han de ser probablemente las formas KIR, LIR, MIR, ILT y
CD94 descritas antes. Otra interacción interesante incluye tal
complejo receptor con su contrarreceptor, que puede ser él mismo una
proteína simp0le o un complejo. Por ejemplo, el receptor para el
complejo KIR-DAP12 será probablemente MHC Clase I.
Tales interacciones serán típicamente una interacción
proteína-proteína, covalente o no covalente. La
molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. Un análogo
funcional puede ser una forma con modificaciones estructurales, o
puede ser una molécula totalmente no relacionada que tenga una
forma molecular que interactúe con los determinantes de unión
superficiales apropiados. Los análogos pueden servir como agonistas
o antagonistas, véase, por ejemplo, Goodman et al. (reds.
1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of
Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press.
La aolubilidad de un polipéptido o fragmento
depende del ambiente y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a
la solubilidad del polipéptido, incluyendo la temperatura, el
ambiente de electrolito, el tamaño y las características
moleculares del polipéptido y la naturaleza del disolvente.
Típicamente, la temperatura a la que se usa el polipéptido varía de
alrededor de 4ºC a aproximadamente 65ºC. Usualmente, la temperatura
en uso es mayor que aproximadamente 18ºC y más habitualmente mayor
que aproximadamente 22ºC. Con fines de diagnóstico, la temperatura
será usualmente alrededor de la temperatura ambiente o más caliente,
pero menos que la temperatura de desaturalización de los
componentes en el ensayo. Con fines terapéuticos, la temperatura
será habitualmente la temperatura del cuerpo, típicamente alrededor
de 37ºC para seres humanos, aunque en ciertas situaciones la
temperatura puede elevarse o disminuirse in situ o in
vitro.
Los electrolitos se aproximaran habitualmente a
las condiciones fisiológicas in situ, pero pueden modificarse
a mayor o menor fuerza iónica cuando sea ventajoso. Los iones
reales pueden modificarse para conformarse a tampones estándares
usados en contextos fisiológicos o analíticos.
El tamaño y estructura del polipéptido deben
estar generalmente en un estado sustancialmente estable, y
habitualmente no en estado desnaturalizado. El polipéptido puede
estar asociado con otros polipéptidos en una estructura
cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o asociado con
lípidos o detergentes de una manera que se aproxime a interacciones
bicapa de lípidos naturales. Tales proteínas serán, por ejemplo,
formas solubles/cortas de las proteínas KIR, MIR, ILT o CD94. La
rotura de esos complejos bloquea típicamente la función de
señal.
El disolvente será usualmente un tampón
compatible biológicamente, de un tipo usado para conservar
actividades biológicas, y se aproximará habitualmente a un
disolvente fisiológico. Usualmente el disolvente tendrá un pH
neutro, típicamente entre aproximadamente 5 y 10 y preferiblemente
aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se añadirá un
detergente, típicamente uno no desnaturalizante suave, por ejemplo,
CHS (hemisuccinato de colesterilo) o CHAPS (sulfonato de
3-([3-colamidopropil)]dimetilamonio)-1-propano),
o en una concentración de detergente suficientemente baja para no
romper la estructura terciaria de la proteína.
La solubilidad se refleja por sedimentación
medida en unidades Svedberg, que son una medida de la velocidad de
sedimentación de una molécula en condiciones particulares. La
determinación de la velocidad de sedimentación se realizó
clásicamente en una ultracentrífuga analítica, pero se realiza ahora
típicamente en una ultracetrífuga estándar. Véase Freifelder (1982)
Physical Biochemistry (2ª ed.), W.H. Freeman; y Cantor y
Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, partes
1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco. Como una
determinación cruda, una muestra que contiene un polipéptido
putativamente soluble se hace girar en una ultracentrífuga de tamaño
completo estándar a aproximadamente 50k rpm durante aproximadamente
10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el
sobrenadante. Una partícula o polipéptido soluble tendrá típicamente
menos de aproximadamente 30S, más típicamente menos de
aproximadamente 15 S, habitualmente menos de aproximadamente 10S,
más habitualmente menos de aproximadamente 6S y, en realizaciones
particulares, preferiblemente menos de aproximadamente 4S, y más
preferiblemente menos de aproximadamente 3S.
También se describen proteínas o péptidos que
tienen identidad de secuencias de aminoácidos sustancial con las
secuencias de aminoácidos, por ejemplo, de la DAP12 humana.
Proporciona sustituciones de por ejemplo, 1 vez, 2 veces, 3 veces,
5 veces, preferiblemente conservadoras. Tales variantes pueden ser
útiles para producir anticuerpos específicos, y participarán a
menudo de muchas o todas las propiedades biológicas.
La identidad de secuencia de aminoácidos se
determina optimizando parejas de residuos. Esto cambia cuando se
consideran como parejas sustituciones conservadoras. Las
sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones
dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina,
isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina,
glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina,
tirosina. Se pretende que secuencias de aminoácidos similares
incluyan variaciones alélicas naturales en cada secuencia de
proteína respectiva. Proteínas o péptidos homólogos típicos tienen
del 85-100% de identidad (si pueden introducirse
huecos) al 90-100% de identidad (si se incluyen
sustituciones conservadoras) con la misma secuencia de aminoácidos,
por ejemplo, de la DAP12 humana. Las medidas de identidad serán al
menos aproximadamente 85%, generalmente al menos aproximadamente
87%, a menudo al menos aproximadamente 89%, típicamente al menos
aproximadamente 91%, usualmente al menos aproximadamente 93%, más
usualmente al menos aproximadamente 95%, preferiblemente al menos
aproximadamente 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente
98%, y en realizaciones particularmente preferidas al menos
aproximadamente 99% o más. Véase también Needleham et al.
(1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff
et al. (1983) Capítulo Uno en Time Warps, String Edits,
and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence
Comparison Addison-Wesley, Reading, MA; y
paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y el
Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin, Madison,
WT.
El ADN de DAP y MDL humano aislado puede
modificarse fácilmente por sustituciones de nucleótidos, supresiones
de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de
extensiones de nucleótidos. Estas modificaciones producirán nuevas
secuencias de ADN que codifiquen antígenos útiles, sus derivados o
proteínas que tengan actividad similar o antagonista. Estas
secuencias modificadas pueden usarse para producir antígenos
mutantes o aumentar expresión. La expresión aumentada puede
implicar multiplicación de genes, transcripción aumentada,
traducción aumentada y otros mecanismos. Tales derivados de DAP12
mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas para el
lugar de la proteína respectiva o sus fragmentos. "DAP12
mutante" abarca un polipéptido que participa por lo demás de
aspectos importantes de la DAP12 humana como se ha indicado antes,
pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de
DAP12 como se encuentra en la naturaleza, por vía de supresión,
sustitución o inserción. En particular, "DAP12 mutante específica
para el lugar" se define como que tiene homología con un
antígeno de la Tabla 1, y como que participa en actividades
biológicas relevantes con esos antígenos. Se aplican conceptos
similares a diferentes proteínas DAP12, particularmente las
encontradas en otros mamíferos diversos. Como se ha indicado antes,
se subraya que se entiende generalmente que las descripciones
abarcan proteínas DAP y MDL adicionales, no limitadas únicamente a
la realización de primate discutida específicamente.
Aunque se predeterminan lugares de mutación
específica para el lugar, los mutantes no necesitan ser específicos
para el lugar. La mutagénesis de DAP12, DAP10 o
MDL-1 humanas puede realizarse haciendo inserciones
o supresiones de aminoácidos. Pueden generarse sustituciones,
supresiones, inserciones o cualesquiera combinaciones para llegar a
una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o
carboxi-terminales. Puede realizarse mutagénesis
aleatoria en un codón objetivo y puede examinarse la actividad
deseada en los mutantes expresados. Son muy conocidos en la técnica
métodos para hacer mutaciones de sustitución en lugares
predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida, por
ejemplo, por mutagénesis de cebador M13. Véase también Sambrook
et al. (1989) y Ausubel et al. (1987 y
Suplementos).
Las mutaciones en el ADN no deben colocar
normalmente secuencias de codificación fuera de los marcos de
lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que
podrían hibridarse para producir estructura de mARN secundaria tal
como lazos u horquillas.
Se describen también proteínas recombinantes,
por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas usando segmentos de
estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de
proteínas o segmentos que no se encuentras normalmente fusionados
de la misma manera naturalmente. Así, el producto de fusión de una
inmunoglobulina con, por ejemplo, un polipéptido de DAP12, es una
molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un
enlace péptido típico, hecho típicamente como un producto de
traducción simple y que presenta propiedades derivadas de cada
péptido de origen. Un concepto similar se aplica a secuencias de
ácidos nucleicos heterólogas. Serán fusiones particularmente
interesantes la DAP12 con su compañero receptor, como se ha
discutido antes. Serán valiosas ambas realizaciones de proteínas y
ácidos nucleicos que codifican ambos componentes del complejo
receptor.
Además, pueden hacerse nuevas construcciones de
combinar dominios funcionales similares de otras proteínas. Por
ejemplo, pueden "intercambiarse" segmentos de unión a compañero
u otros entre nuevos polipéptidos o fragmentos de fusión
diferentes. Véase, por ejemplo, Cunningham et al. (1989)
Science 243:1330-1336; y O'Dowd et al.
(1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. Así,
nuevos polipéptidos quiméricos que presenten nuevas combinaciones
de especificidades resultarán del enlace funcional de
especificidades de unión a compañero y otros dominios
funcionales.
funcionales.
El método de fosforamidita descrito por Beaucage
y Carruthers (1981) Tetra Letts.
22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético
adecuados. Se obtendrá a menudo un fragmento de doble cadena
sintetizando la cadena complementaria y reasociando la cadena
juntamente en condiciones apropiadas o añadiendo la cadena
complementaria usando polimerasa de ADN con una secuencia de
cebador apropiada.
En ciertas situaciones, puede ser útil una DAP12
con repeticiones ITAM múltiples o una sustitución ITIM. Además,
pueden conseguirse funciones del receptor intactas dividiendo la
forma larga del receptor transmembrana en dos subunidades separadas
que interactúan que interactúan como la DAP12 con su compañero. Así,
podría sustituirse un receptor de forma larga intacta con el par de
un receptor acortado con una DAP12. Pueden prepararse también
construcciones de ácidos nucleicos con la combinación. De igual modo
con DAP10, y repeticiones ITIM, o una sustitución ITAM.
El bloqueo de la respuesta fisiológica a
antígenos DAP12 o DAP10 puede producir la inhibición de unión de un
compañero al complejo receptor de DAP, probablemente a través de
inhibición competitiva. Así, los ensayos in vitro usarán a
menudo proteína aislada, membranas de células que expresan una DAP12
recombinante, fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión
a compañero de estos antígenos o fragmentos incorporados a sustratos
en fase sólida. Estos ensayos permitirán también la determinación
de diagnóstico de los efectos de mutaciones y modificaciones de
segmentos de unión o mutaciones y modificaciones de compañeros de
unión.
Esta invención considera también el uso de
ensayos de examen de fármacos competitivos, por ejemplo, en los que
anticuerpos neutralizantes para el antígeno o fragmentos de antígeno
compiten con un compuesto de ensayo por unirse a la proteína. De
esta manera, pueden usarse los anticuerpos para detectar la
presencia de un polipéptido que comparte uno o más lugares de unión
del antígeno y puede usarse también para ocupar lugares de unión en
la proteína que podrían ser ocupados de otro modo por un compañero
de unión. La invención considera también examinar compuestos que
interrumpen el puenteo de los residuos cargados en los segmentos
transmembrana entre compañeros.
Adicionalmente, pueden usarse anticuerpos
neutralizantes contra las DAP o MDL y fragmentos solubles de las
DAP o MDL que contienen un lugar de unión de la contrapartida de
alta afinidad, para inhibir la función de unión en tejidos, por
ejemplo, tejidos que experimentan fisiología anormal. Las
interacciones de dominios intracelulares con otros componentes
también serán objetivos para examen de fármacos.
Los "derivados" de los antígenos de DAP o
MDL incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos, variantes de
glicosilación y conjugados covalentes o agregados con otros restos
químicos. Pueden prepararse derivados covalentes por enlaces de
funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas
secundarias de aminoácidos de antígenos DAP o MDL o en los términos
N- o C-, por medios que son muy conocidos en la técnica. Estos
derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas
alifáticos del término carboxilo, o de residuos que contienen
cadenas secundarias de carboxilo, derivados de
O-acilo de residuos que contienen grupos hidroxilo y
derivados de N-acilo del aminoácido amino terminal
o residuos que contienen grupo amino, por ejemplo, lisina o
arginina. Se seleccionan grupos acilo del grupo de restos alquilo
incluyendo alquilo C3 a C18 normal, formando por ello especies
alcanoil aroilo.
En particular, se incluyen alteraciones de
glicosilación, por ejemplo, hechas modificando los modelos de
glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y elaboración,
o en etapas de elaboración adicionales. Aunque no haya lugares
N-enlazados naturales en la proteína, puede haber
lugares O-enlazados o pueden producirse variantes
con tales lugares. Son medios particularmente preferidos para
conseguir esto exponer el polipéptido a enzimas glicosilantes
derivadas de células que proporcionan normalmente tal elaboración,
por ejemplo, enzimas de glicosilación humanas. También se
consideran enzimas de desglicosilación. También se abarcan versiones
de la misma secuencia de aminoácidos principal que tienen otras
pequeñas modificaciones, incluyendo residuos de aminoácidos
fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o
fosfotreonina.
Un grupo principal de derivados son conjugados
covalentes de, por ejemplo, los antígenos DAP12 o fragmentos de los
mismos con otras proteínas de polipéptidos. Estos derivados pueden
sintetizarse en cultivo recombinante tales como fusiones N- o
C-terminales o mediante el uso de agentes conocidos
en la técnica por su utilidad en proteínas de reticulación a través
de grupos secundarios reactivos. Los lugares de derivación
preferidos con agentes de reticulación son en los grupos amino
libres, restos de hidratos de carbono y residuos de cisteína.
También se describen polipéptidos de fusión
entre los antígenos DAP12 y otras proteínas homólogas o heterólogas.
Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre marcadores
superficiales diferentes, produciendo, por ejemplo, una proteína
híbrida que presenta especificidad de unión de una o más proteínas
de marcadores. De igual modo, pueden construirse fusiones
heterólogas que presentarían una combinación de propiedades o
actividades de las proteínas derivadas. Son ejemplos típicos
fusiones de un polipéptido informador, por ejemplo, luciferasa, con
un segmento o dominio de un antígeno, por ejemplo, un segmento de
unión a compañero, de manera que puede determinarse fácilmente la
presencia o localización de un compañero deseado. Véase, por
ejemplo, Dull et al., Patente de los EE.UU. Nº 4.859.609,
que se incorpora aquí por ello como referencia. Otros compañeros de
fusión génicos incluyen \beta-galactosidasa
bacteriana, trpE, Proteína A, \beta-lactamasa,
alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa y factor de acoplamiento alfa
de levadura. Véase, por ejemplo, Godowski et al. (1988)
Science 241:812-816.
El método de fosforamidita descrito por Beaucage
y Carruthers (1981) Tetra. Letts.
22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético
adecuados. Se obtendrá a menudo un fragmento de doble cadena
sintetizando la cadena complementaria y reasociando la cadena
juntamente en condiciones apropiadas o añadiendo la cadena
complementaria usando polimerasa de ADN con una secuencia de
cebador apropiada.
Tales polipéptidos pueden tener también residuos
de aminoácidos que se hayan modificado químicamente por
fosforilación, sulfonación, biotinación o adición o separación de
otros restos, particularmente aquellos que tienen formas
moleculares similares a grupos fosfato. En algunas realizaciones,
las modificaciones serán reactivos de marcado útiles, o servirán
como objetivos de purificación, por ejemplo, reactivos de
afinidad.
Se harán típicamente proteínas de fusión por
métodos de ácidos nucleicos recombinantes o por métodos de
polipéptidos sintéticos. Se describen en general técnicas para
manipulación y expresión de ácidos nucleicos, por ejemplo, en
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2ª ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor
Laboratory. Se describen técnicas para síntesis de polipéptidos,
por ejemplo, en Merrifield (1963) J. Amer. Cem. Soc.
85:2149-2156; Merrifield (1986) Science
232:341-347; y Atherton et al. (1989)
Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL
Press, Oxford.
También se describe el uso de derivados de los
antígenos DAP12 distintos de variaciones de la secuencia de
aminoácidos o glicosilación. Tales derivados pueden implicar
asociación covalente o agregativa con restos químicos. Estos
derivados están generalmente en tres clases: (1) sales, (2)
modificaciones covalentes de cadenas secundarias y residuos
terminales y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas
celulares. Tales derivados covalentes o agregativos son útiles como
inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en métodos de
purificación tales como para purificación por afinidad de compañeros
de unión. Por ejemplo, puede inmovilizarse un antígeno DAP12 por
enlace covalente a un soporte sólido tal como Sepharose activada con
bromuro de cianógeno, por métodos que son muy conocidos en la
técnica, o adsorberse en superficies de poliolefina, con o sin
reticulación con glutaraldehído, para uso en el ensayo o
purificación de anticuerpos anti-DAP12 o sus
compañeros de unión. Los antígenos DAP12 pueden marcarse también
con un grupo detectable, por ejemplo, radioyodado en una tirosina,
por ejemplo, incorporado a la secuencia natural, por el
procedimiento de cloramina T, unido covalentemente a quelatos de
tierras raras o conjugado a otro resto fluorescente para uso en
ensayos de diagnóstico.
Un antígeno solubilizado de esta invención puede
usarse como inmunógeno para la producción de antisueros o
anticuerpos específicos para el antígeno o muchos fragmentos del
mismo. Los antígenos purificados pueden usarse para examinar
anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno preparados
por inmunización con diversas formas de preparaciones impuras que
contienen la proteína. En particular, el término "anticuerpos"
abarca también fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos
naturales. La MDL purificada puede usarse también como reactivo
para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de
niveles elevados de MDL o fragmentos de células que contienen el
antígeno, ambos de los cuales pueden ser diagnóstico de un estado
anormal o fisiológico específico o enfermedad. Adicionalmente,
fragmentos de MDL pueden servir también como inmunógenos para
producir los anticuerpos de la presente invención, como se describe
inmediatamente después. Por ejemplo, esta invención considera
anticuerpos producidos contra secuencias de aminoácidos de, o
codificados por, secuencias de nucleótidos mostradas en, por
ejemplo, la Tabla 3, o fragmentos de ellos. En particular, esta
invención considera anticuerpos que tienen afinidad de unión a, o
producidos contra, fragmentos específicos de los que se predice
estar fuera de la bicapa de lípido, en dominios extracelulares o
intracelulares. Adicionalmente, pueden producirse diversas
construcciones de la fusión de un segmento de asociación a membrana
a la porción expuesta extracelular por lo demás de la molécula.
Pueden usarse otros complejos antígenos, incluyendo complejos de la
MDL con un compañero receptor.
La presente invención considera el aislamiento
de variantes estrechamente relacionadas adicionales. Es altamente
probable que existan variaciones alélicas en diferentes individuos
que presenten, por ejemplo, una identidad mejor que el
90-97% a la realización descrita aquí.
La invención proporciona también medios para
aislar un grupo de antígenos relacionados que presentan carácter
distinto y similitudes de estructura, expresión y función. La
aclaración de muchos de los efectos fisiológicos de los antígenos
se acelerará en gran medida por el aislamiento y caracterización de
contrapartidas de los antígenos de especies distintas. En
particular, la presente invención proporciona sondas útiles para
identificar entidades genéticas homólogas adicionales en diferentes
especies.
Los genes aislados permitirán la transformación
de células que carecen de expresión de DAP o MDL, por ejemplo,
tipos de especies o células que carecen de antígenos
correspondientes y presentan actividad de fondo negativa. Diversos
tipos de células, por ejemplo, Jurkat, YT o BAF3, transfectadas con
CD94 o NKAT5 pueden presentar señalización cuando se transfectan
también con DAP12. La expresión de genes transformados permitirá el
aislamiento de linajes celulares puros antigénicamente, con
variantes de especies definidas o simples. Este método permitirá
una detección más sensible y discriminación de los efectos
fisiológicos de la señalización. Pueden aislarse y usarse
fragmentos subcelulares, por ejemplo, citoplastos o fragmentos de
membrana.
Es posible la disección de los elementos
estructurales críticos que efectúan las diversas funciones de
diferenciación proporcionadas por la unión de receptor usando
técnicas estándares de biología molecular moderna, particularmente
comparando miembros de la clase relacionada. Véase, por ejemplo, la
técnica de mutagénesis por homólogo-exploración
descrita en Cunningham et al. (1989) Science
243:1339-1336; y los métodos utilizados en O'Dowd
et al. (1988) J. Biol. Chem.
263:15985-15992; y Lechleiter et al. (1990)
EMBO J. 9:4381-4390.
En particular, pueden sustituirse segmentos de
unión a compañero receptor entre variantes de especies para
determinar qué aspectos estructurales son importantes en afinidad y
especificidad de unión. Se usará una disposición de diferentes
variantes, por ejemplo de DAP12, para examinar compañeros que
presenten propiedades combinadas de interacción con diferentes
variantes de especies.
Las funciones intracelulares implicarían
probablemente segmentos del antígeno que son accesibles normalmente
al citosol. Sin embargo, puede tener lugar en ciertas circunstancias
internalización de antígeno, y puede tener lugar interacción entre
componentes intracelulares y los segmentos "extracelulares"
designados. Los segmentos específicos de interacción de DAP12 con
otros componentes intracelulares puede identificarse por mutagénesis
o medios bioquímicos directos, por ejemplo, reticulación, afinidad
o métodos genéticos. También será aplicable análisis estructural
por métodos cristalográficos u otros físicos. La investigación
adicional del mecanismo de transducción de señal incluirá el
estudio de componentes asociados que pueden ser aislables por
métodos de afinidad.
Se seguirá con estudio adicional de la expresión
y control de antígenos DAP12. Los elementos de control asociados
con los antígenos pueden presentar modelos de expresión de
desarrollo diferencial, específicos para tejidos u otros. Son de
interés regiones genéticas aguas arriba o aguas abajo, por ejemplo,
elementos de control.
Los estudios estructurales de los antígenos
DAP12 conducirán al diseño de nuevas variantes, particularmente
análogos que presenten propiedades agonistas o antagonistas. Esto
puede combinarse con métodos de examen descritos previamente para
aislar variantes que presenten espectros de actividades
deseados.
La expresión en otros tipos de células producirá
a menudo diferencias de glicosilación en un antígeno particular.
Diversas variantes de especies pueden presentar distintas funciones
en base a diferencias estructurales distintas de la secuencia de
aminoácidos. Modificaciones diferenciales pueden ser responsables de
función diferencial, y se hace posible ahora la aclaración de los
efectos.
Aunque la descripción anterior se ha enfocado
principalmente en la DAP12 humana, los expertos en la técnica
reconocerán inmediatamente que la descripción abarca otros antígenos
DAP12, por ejemplo, variantes de primate y otras especies de
mamíferos. Además, el gen de DAP10 presenta muchos aspectos
similares a DAP12, y será modificable de manera similar. Hay
evidencia de que la DAP12, la DAP10 y la MDL-1
pueden asociarse con otra, y pueden asociarse todas en un complejo
multiproteínas en ciertas circunstancias.
Pueden producirse anticuerpos para las diversas
variantes alélicas o de especies de antígenos DAP o MDL y
fragmentos de ellos, en sus formas de origen natural y en sus formas
recombinantes. Adicionalmente, pueden producirse anticuerpos para
DAP12 en sus formas activas o en sus formas inactivas, o formas
nativas o desnaturalizadas. También se consideran anticuerpos
anti-idiotípicos.
Pueden producirse anticuerpos, incluyendo
fragmentos de unión y versiones de cadena sencilla, contra
fragmentos predeterminados de DAP o MDL, por inmunización de
animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunógenas.
Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que
segregan el anticuerpo deseado. Se puede examinar en estos
anticuerpos la unión a DAP o MDL normal o defectuosa, o examinar la
actividad funcional agonista o antagonista. Estos anticuerpos
monoclonales se unen habitualmente con al menos una K_{D} mejor
que aproximadamente 1 mM, más usualmente mejor que aproximadamente
300 \muM, típicamente mejor que aproximadamente 10 \muM, más
típicamente mejor que aproximadamente 30 \muM, preferiblemente
mejor que aproximadamente 10 \muM, y más preferiblemente mejor
que aproximadamente 3 \muM, por ejemplo, 1 \muM, 300 nM, 100 nM,
30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, etc.
Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión
a antígeno, de esta invención pueden tener un valor de diagnóstico
o terapéutico significativo. Pueden ser antagonistas eficaces que se
unen a MDL-1, y/o inhiben la unión de compañero o
inhiben la capacidad para obtener una respuesta biológica. También
pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y pueden
acoplarse a toxinas o radionúclidos de manera que, cuando el
anticuerpo se une al antígeno, la propia célula es destruida.
Además, estos anticuerpos pueden conjugarse a fármacos u otros
agentes terapéuticos, directa o indirectamente por medio de un
enlazador.
Los anticuerpos de esta invención pueden ser
útiles también en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de
captura o no neutralizantes, pueden unirse a la MDL sin inhibir la
unión de compañero y/o la señalización. Como anticuerpos
neutralizantes, pueden ser útiles en ensayos de unión competitivos.
También serán útiles para detectar o cuantificar MDL o sus
compañeros.
Pueden unirse fragmentos de DAP12 a otros
materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos
fusionados o unidos covalentemente a usar como inmunógenos. Una
DAP12 y sus fragmentos pueden fusionarse o enlazarse covalentemente
a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina de lapa ojo de
cerradura, albúmina de suero de bovino, toxoide de tétano, etc.
Véase Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper y Row,
1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological
Reactions, Dover Publications, Nueva York y Williams et
al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry,
Vol. 1, Academic Press, Nueva York, para tener descripciones de
métodos de preparación de antisueros policlonales. Un método típico
implica hiperinmunización de un animal con un antígeno. La sangre
del animal se recoge entonces poco después de las inmunizaciones
repetidas y se aísla la gamma globulina. Alternativamente, pueden
recogerse células para producir hibridomas.
En algunos casos, es deseable preparar
anticuerpos monoclonales de diversos hospedantes mamíferos, tales
como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Puede
encontrarse una descripción de técnicas para preparar tales
anticuerpos monoclonales en, por ejemplo, Stites et al.
(reds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.), Lange
Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias ciatadas allí;
Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH
Press: Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York; y particularmente
en Kohler y Milstein (1975) en Nature
256:495-497, que discute un método para generar
anticuerpos monoclonales. Resumido brevemente, este método implica
inyectar a un animal con un inmunógeno. El animal se sacrifica
después y se toman células de su bazo, que se fusionan después con
células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o
"hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. Se
examina después la población de hibridomas para aislar clones
individuales, cada uno de los cuales segrega al inmunógeno una
especie de anticuerpo simple. De esta manera, la especie de
anticuerpo individual obtenida es los productos de células B
simples inmortalizadas y clonadas del animal inmune generado como
respuesta a un lugar específico reconocido en la sustancia
inmunógena.
Otras técnicas adecuadas implican exposición
in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o
alternativamente a selección de genotecas de anticuerpos en fago o
vectores similares. Véase Huse et al. (1989) "Generation
of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in
Phage Lambda", Science 246:1275-1281; y
Ward et al. (1989) Nature 341:544-546.
Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden
usarse con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o
humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos estarán
marcados uniendo, covalentemente o no covalentemente, una sustancia
que proporcione una señal detectable. Se conoce una amplia variedad
de marcas y técnicas de conjugación y se informa de ellas
extensamente en la bibliografía científica y de patentes. Las marcas
adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores,
inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes,
partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso
de tales marcas incluyen las Patentes de los EE.UU. Nº 3.817.837,
3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 y 4.366.241.
También pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, véase
Cabilly, Patente de los EE.UU. Nº 4.816.567.
Los anticuerpos de esta invención pueden usarse
también para cromatografía de afinidad aislando la proteína. Pueden
prepararse columnas en las que los anticuerpos están enlazados a un
soporte sólido, por ejemplo, partículas, tales como agarosa,
SEPHADEX o similares, en las que un lisado de células puede hacerse
pasar a través de la columna, lavarse la columna, seguido por
concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, por lo que
se liberará la proteína DAP12 purificada.
Los anticuerpos pueden usarse también para
examinar genotecas de expresión para productos de expresión
particulares. Habitualmente, los anticuerpos usados en tal
procedimiento estarán marcados con un resto que permita una
detección fácil de la presencia de antígeno por unión a
anticuerpo.
Los anticuerpos producidos contra un antígeno
DAP12, DAP10 o MDL-1 se usarán también para producir
anticuerpos anti-idiotípicos. Éstos serán útiles
para detectar o diagnosticar diversas condiciones inmunológicas
relacionadas con la expresión de los antígenos respectivos.
Una proteína DAP12 que se une específicamente a,
o que es inmunorreactiva específicamente con, un anticuerpo
generado contra un inmunógeno definido, tal como un inmunógeno
consistente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 6, se
determina típicamente en un inmunoensayo. El inmunoensayo usa
típicamente un antisuero policlonal que se produjo, por ejemplo,
para una proteína de SEQ ID NO: 2 o 6. Este antisuero se selecciona
para tener baja reactividad cruzada contra otros miembros de la
familia de CD3, por ejemplo, CD3 o Fc\varepsilonR\gamma,
preferiblemente de la misma especie, y se elimina toda reactividad
cruzada tal por inmunoabsorción antes de usar en el
inmunoensayo.
Con el fin de producir antisueros de uso en un
inmunoensayo, se aísla como se describe aquí la proteína de SEQ ID
NO. 2 o 6, o una combinación de ellas. Por ejemplo, puede producirse
proteína recombinante en un linaje celular de mamífero. Un
hospedante apropiado, por ejemplo, una cepa endógama de ratones
tales como Balb/c, se inmuniza con la proteína seleccionada,
típicamente usando un coadyuvante estándar, tal como coadyuvante de
Freund, y un método de inmunización de ratones estándar (véase
Harlow y Lane, supra). Alternativamente, puede usarse como
inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias descritas
aquí y conjugado a una proteína vehículo. Se recogen sueros
policlonales y se titulan contra la proteína inmunógeno en un
inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el
inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido. Se seleccionan
antisueros policlonales con un título de 10^{4} o superior y se
ensaya su reactividad cruzada contra otros miembros de la familia
de CD3, por ejemplo, CD3 de primate o roedor, usando un inmunoensayo
de unión competitiva tal como el descrito en Harlow y Lane,
supra, en las páginas 570-573. Se usan
preferiblemente en esta determinación al menos dos miembros de la
familia de CD3, conjuntamente con alguna o algunas de las DAP12 de
primate o roedor. Estos miembros de la familia de DAP12 pueden
producirse como proteínas recombinantes y aislarse usando técnicas
de biología molecular y química de proteínas estándares como se
describe aquí. Pueden aplicarse técnicas similares a la DAP10 o
MDL-1.
Pueden usarse inmunoensayos en el formato de
unión competitiva para las determinaciones de reactividad cruzada.
Por ejemplo, las proteínas de SEQ ID NO: 2 y/o 6 pueden
inmovilizarse en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al
ensayo compiten con la unión de los antisueros al antígeno
inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para
competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada
se compara con la proteína de SEQ ID NO: 2 y/o 6. Se calcula el
porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores
usando cálculos estándares. Se seleccionan y agrupan los antisueros
con menos del 10% de reactividad cruzada con cada una de las
proteínas listadas antes. Se separan después los anticuerpos que
reaccionan cruzadamente de los antisueros agrupados por
inmunoabsorción con las proteínas listadas antes.
Los antisueros inmunoabsorbidos y agrupadfos se
usan después en un inmunoensayo de unión competitiva como se ha
descrito antes para comparar una segunda proteína con la proteína
del inmunógeno (por ejemplo, la proteína de tipo DAP12 de SEQ ID
NO: 2 y/o 6). Con el fin de hacer esta comparación, se ensaya cada
una de las dos proteínas en un amplio intervalo de concentraciones
y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir
el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si
la cantidad de la segunda proteína requerida es menos que dos veces
la cantidad de proteína de la proteína o proteínas seleccionadas
que se requiere, se dice que la segunda proteína se une
específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda de DAP o MDL humanas, o fragmentos de
ella, se usarán para identificar o aislar ácidos nucleicos que
codifican proteínas homólogas de otras especies, u otras proteínas
relacionadas de la misma u otras especies. Pueden usarse
hibridación o tecnología de PCR.
También se describe el uso de ADN aislado o
fragmentos para codificar, por ejemplo, un polipéptido de DAP12
correspondiente activo biológicamente. Además, se describe ADN
aislado o recombinante que codifica una proteína o un polipéptido
activos biológicamente que sea capaz de hibridarse en condiciones
apropiadas con las secuencias de ADN descritas aquí. Dicha proteína
o polipéptido activos biológicamente pueden ser una DAP12 intacta, o
fragmento, y tener una secuencia de aminoácidos codificada por un
ácido nucleico mostrado en la Tabla 1. Además, esta invención cubre
el uso de ADN aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, que
codifica una proteína que es homóloga a una DAP12 o que se ha
aislado usando cADN que codifica DAP12 humana como una sonda de PCR
o hibridación. El ADN aislado puede tener las secuencias reguladoras
respectivas en los extremos 5' y 3', por ejemplo, promotores,
aumentadores, señales de poli-A adición y otros.
Un ácido nucleico "aislado" es un ácido
nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mezclado, que está
separado sustancialmente de otros componentes que acompañan
naturalmente a una secuencia nativa, por ejemplo, ribosomas,
polimerasas y secuencias genómicas flanqueantes de las especies de
las que se originan. La invención abarca una secuencia de ácido
nucleico que se ha separado de su ambiente de origen natural, e
incluye aislados de ADN recombinante o clonado y análogos
sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente
por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye
formas aisladas de la molécula.
Un ácido nucleico aislado será generalmente una
composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones,
contendrá una pequeña heterogeneidad. Esta heterogeneidad se
encuentra típicamente en los extremos del polímero o en porciones
no críticas para una función o actividad biológica deseada.
Alternativamente, puede mezclarse una mezcla de secuencias
purificadas, por ejemplo, en un método de PCR degenerado.
Un ácido nucleico "recombinante" se define
por su método de producción o por su estructura. En referencia a su
método de producción, por ejemplo, un producto fabricado por un
procedimiento, el procedimiento es el uso de técnicas de ácidos
nucleicos recombinantes, por ejemplo, que implican intervención
humana en la secuencia de nucleótidos. Alternativamente, puede ser
un ácido nucleico fabricado generando una secuencia que comprende
fusión de dos fragmentos que no son contiguos entre sí naturalmente,
pero se entiende que excluye productos naturales, por ejemplo,
mutantes de origen natural. Así, por ejemplo, se abarcan productos
fabricados transformando células con tal vector que no tiene lugar
naturalmente, como lo son ácidos nucleicos que comprenden una
secuencia derivada usando un procedimiento de oligonucleótidos
sintéticos. Se hace tal a menudo para sustituir un codón con un
codón redundante que codifica el mismo aminoácido o uno conservador,
mientras se introduce o separa típicamente, por ejemplo, un lugar
de restricción o de reconocimiento de secuencia. Alternativamente,
se realiza unir entre sí segmentos de ácidos nucleicos de funciones
deseadas para generar una entidad genética simple que comprende una
combinación deseada de funciones no encontradas en las formas
naturales disponibles comúnmente. Los lugares de reconocimiento de
enzimas de restricción son a menudo el objetivo de tales
manipulaciones artificiales, pero pueden incorporarse por diseño
otros objetivos específicos de lugares, por ejemplo, promotores,
lugares de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias
de control u otros aspectos útiles. Se pretende un concepto similar
para un polipéptido recombinante, por ejemplo, de fusión. Están
incluidos específicamente ácidos nucleicos sintéticos que, por
redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a
fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de diversas
variantes de especies diferentes.
Un "fragmento" en un contexto de ácidos
nucleicos es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17
nucleótidos, generalmente al menos 20 nucleótidos, más generalmente
al menos aproximadamente 23 nucleótidos, ordinariamente al menos
aproximadamente 26 nucleótidos, más ordinariamente al menos
aproximadamente 29 nucleótidos, a menudo al menos aproximadamente
32 nucleótidos, más a menudo al menos aproximadamente 35
nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 38 nucleótidos,
más típicamente al menos aproximadamente 41 nucleótidos, usualmente
al menos aproximadamente 44 nucleótidos, más usualmente al menos
aproximadamente 47 nucleótidos, preferiblemente al menos
aproximadamente 50 nucleótidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente 53 nucleótidos, y en realizaciones particularmente
preferidas será al menos aproximadamente 56 o más nucleótidos, por
ejemplo, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300, etc.
Un ADN que codifica, por ejemplo, una proteína
DAP12, será particularmente útil para identificar especies de
genes, mARN y cADN que codifican antígenos relacionados u homólogos,
así como ADNs que codifican proteínas homólogas de diferentes
especies. Diversas proteínas DAP12 deben ser de secuencia similar y
se describen aquí. Sin embargo, incluso proteínas que tienen una
relación de evolución más distante con la DAP12 pueden aislarse
fácilmente usando estas secuencias si presentan suficiente
similitud. Son de particular interés proteínas DAP12, DAP10 y
MDL-1 de primate.
Esta invención abarca además moléculas de ADN
recombinante y fragmentos que tienen una secuencia de ADN idéntica
o altamente homóloga a los ADNs de MDL-1 aislados
indicados aquí. En particular, las secuencias estarán a modo
enlazadas operativamente a segmentos de ADN que controlan la
transcripción, traducción y replicación de ADN. Alternativamente,
serán útiles para estudios transgénicos clones recombinantes
derivados de las secuencias genómicas, por ejemplo, que contienen
intrones, incluyendo, por ejemplo, células y organismos
transgénicos, y para terapia génica. Véase, por ejemplo, Goodnow
(1992) "Transgenic Animals" en Roitt (red.) Encyclopedia of
Immunology Academic Press, San Diego, págs.
1502-1504, Travis (1992) Science
256:1392-1394; Kuhn et al. (1991)
Science 254:707-710; Capecchi (1989)
Science 244:1288; Robertson (1987) (red.) Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press,
Oxford; y Rosenberg (1992) J.Clinical Oncology
10:180-199. Se proporciona también una asociación
operativa de promotores heterólogos con secuencias génicas
naturales, como son los vectores que codifican, por ejemplo, la
MDL-1 con un compañero receptor.
Las secuencias de ácidos nucleicos homólogas,
cuando se comparan, presentan una similitud de secuencias
significativa. Los patrones para homología en ácidos nucleicos son
medidas para homología usadas generalmente en la técnica por
comparación de secuencias o se basan en condiciones de hibridación.
Las condiciones de hibridación se describen después con mayor
detalle.
Para comparación de secuencias, típicamente una
secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se
comparan secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de
comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia
se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de
subsecuencias, si es necesario, y se designan parámetros del
programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de
secuencias calcula después el porcentaje de identidad de secuencias
para la(s) secuencia(s) de ensayo con relación a la
secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa
designados.
Puede realizarse alineamiento óptico de
secuencias para comparación, por ejemplo, por el algoritmo de
homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math.
2:482, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y
Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, para la búsqueda por el
método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad,
Sci. USA 85:2444, por realizaciones de tratamiento por ordenador
de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science
Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase en general Ausubel
et al., supra).
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP.
PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un
grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares
progresivos para mostrar la relación y el porcentaje de identidad
de secuencias. También representa un árbol o dendograma que muestra
las relaciones de agrupación usadas para crear el alineamiento.
PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo
de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol.
35:351-360. El método usado es similar al método
descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS
5:151-153. El programa puede alinear hasta 300
secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o
aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con
el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares,
produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo se
alinea después con la siguiente secuencia o grupo de secuencias
alineadas más relacionadas. Se alinean dos grupos de secuencias
mediante una extensión simple del alineamiento por pares de dos
secuencias individuales. El alineamiento final se consigue por una
serie de alineamientos por pares progresivos. Se hace funcionar el
programa designando secuencias específicas y sus coordenadas de
aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de
secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo,
puede compararse una secuencia de referencia con otras secuencias
de ensayo para determinar la relación del porcentaje de identidad
de secuencias usando los siguientes parámetros: peso de separación
por defecto (3,00), peso de longitud de separación por defecto
(0,10) y separaciones de extremos pesadas.
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para
determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud
de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Atschul
et al. (1990) J. Mol. Biol.
215:403-410.El software para realizar análisis
BLAST está disponible públicamente a través del National Center for
Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este
algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta
puntuación (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la
secuencia interrogante, que igualan o satisfacen alguna puntuación
T de umbral evaluado positivo cuando se alinean con una palabra de
la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se hace
referencia a T como el umbral de puntuación de palabra de
alrededores (Altschul et al., supra). Estos impactos de
palabras de alrededores iniciales actúan como semillas para
búsquedas de iniciación para encontrar HSPs más largos que las
contienen. Los impactos de palabras se extienden después en ambas
direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda aumentarse
la puntuación de alineamiento acumulativa. La extensión de los
impactos de palabras en cada dirección se interrumpe cuando: la
puntuación de alineamiento acumulativo disminuye en la cantidad X de
su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa pasa a cero o
inferior, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de
residuos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de
cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST
determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El
programa BLAST usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11,
los alineamientos (B) de matriz de puntuación BLOSUM62 (véase
Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
89:10915) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación
de ambas cadenas.
Además de calcular el porcentaje de identidad de
secuencia, el algoritmo BLAST realiza también un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad.Sci. USA
90:5873-5787). Una medida de similitud proporcionada
por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña
(P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por
la que tendría lugar por casualidad una igualación entre dos
secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido
nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la
probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido
nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de
aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente
0,01, y aún más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.
Una indicación adicional de que dos secuencias
de ácidos nucleicos de polipéptidos son sustancialmente idénticas
es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene
reactividad cruzada inmunológicamente con el polipéptido codificado
por el segundo ácido nucleico, como se describe después. Así, un
polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo
polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en
sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias
de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos
moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se
describe después.
Identidad sustancial en el contexto de
comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que los
segmentos, o sus cadenas complementarias, cuando se comparan, son
idénticos cuando se alinean óptimamente, con inserciones o
supresiones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente
el 50% de los nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente el
56%, más generalmente al menos aproximadamente el 59%,
ordinariamente al menos aproximadamente el 62%, más ordinariamente
al menos aproximadamente el 65%, a menudo al menos aproximadamente
el 68%, más a menudo al menos aproximadamente el 71%, típicamente al
menos aproximadamente el 74%, más típicamente al menos
aproximadamente el 77%, usualmente al menos aproximadamente el 80%,
más usualmente al menos aproximadamente el 85%, preferiblemente al
menos aproximadamente el 90%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95 a 98% o más, y, en realizaciones
particulares, tan alto como aproximadamente el 99% o más de los
nucleótidos. Alternativamente, existe identidad sustancial cuando
los segmentos se hibridan, en condiciones de hibridación
selectivas, a una cena, o su complemento, usando típicamente una
secuencia derivada de la Tabla 1. Típicamente, tiene lugar
hibridación selectiva cuando hay al menos aproximadamente 55% de
homología sobre una extensión de al menos aproximadamente 14
nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 65%, más
preferiblemente al menos aproximadamente 75% y aún más
preferiblemente al menos aproximadamente 90%. Véase Kanehisa (1984)
Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de
comparación de homología, como se ha descrito, puede ser sobre
extensiones más largas, y en ciertas realizaciones será sobre una
extensión de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente al
menos aproximadamente 20 nucleótidos, más usualmente al menos
aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos
aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos
aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente al menos
aproximadamente 50 nucleótidos y más preferiblemente al menos
aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos, por ejemplo, 125, 150,
200, 250, 300, etc.
Condiciones rigurosas, con referencia a
identidad en el contexto de hibridación, serán condiciones rigurosas
combinadas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y otros
parámetros controlados típicamente en reacciones de hibridación.
Las condiciones de temperatura rigurosas incluirán usualmente
temperaturas superiores a aproximadamente 30ºC, más usualmente
superiores a aproximadamente 37ºC, típicamente superiores a
aproximadamente 45ºC, más típicamente superiores a aproximadamente
55ºC, preferiblemente superiores a aproximadamente 65ºC y más
preferiblemente superiores a aproximadamente 70ºC. Las condiciones
rigurosas de sal serán ordinariamente menos de aproximadamente 500
mM, usualmente menos de aproximadamente 350 mM, más usualmente
menos de aproximadamente 200 mM, típicamente menos de
aproximadamente 150 mM, preferiblemente menos de aproximadamente 100
mM y más preferiblemente menos de aproximadamente 50 mM. Sin
embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la
medida de cualquier parámetro simple. Véase, por ejemplo, Wetmur y
Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. La
hibridación en condiciones rigurosas debe dar un fondo de al menos
2 veces sobre el fondo, preferiblemente al menos 3-5
o más.
Pueden clonarse y aislarse DAP o MDL de otros
sujetos humanos por hibridación o PCR. Alternativamente, puede ser
útil la preparación de una preparación de anticuerpo que presente
menos especificidad alélica en métodos de clonación expresión. Las
variantes alélicas pueden caracterizarse usando, por ejemplo, una
combinación de PCR redundante y análisis de secuencias, por
ejemplo, usando cebadores definidos, proporcionando por ello
información sobre variación alélica en una población humana.
Puede obtenerse ADN que codifica el antígeno DAP
O MDL o fragmentos del mismo por síntesis química, examinando
genotecas de cADN o examinando genotecas genómicas preparadas a
partir de una amplia variedad de linajes celulares o muestras de
tejidos.
Este ADN puede expresarse en una amplia variedad
de células hospedantes para la síntesis de un antígeno de longitud
completa o fragmentos que pueden a su vez, por ejemplo, usarse para
generar anticuerpos policlonales o monoclonales, para estudios de
unión; para construcción y expresión de moléculas modificadas; y
para estudios de estructura/función. Cada antígeno o sus fragmentos
pueden expresarse en células hospedantes que se transforman o
transfectan con vectores de expresión apropiados .Estas moléculas
pueden purificarse sustancialmente para estar exentas de proteína o
contaminantes celulares, por ejemplo, los derivados del hospedante
recombinante, y son por tanto particularmente útiles en
composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o
diluyente aceptable farmacéuticamente. El antígeno, o porciones del
mismo, pueden expresarse como fusiones con otras proteínas.
Los vectores de expresión son típicamente
construcciones de ADN o ARN auto-replicantes que
contienen el gen de antígeno deseado o sus fragmentos,
habitualmente enlazado operativamente a elementos de control
genético adecuados que son reconocidos en una célula hospedante
adecuada. Estos elementos de control son capaces de efectuar la
expresión dentro de un hospedante adecuado. El tipo específico de
elementos de control necesarios para efectuar la expresión
dependerá de la célula hospedante eventual usada. Generalmente, los
elementos de control genético pueden incluir un sistema de promotor
procariota o un sistema de control de expresión de promotor
eucariota, e incluyen típicamente un promotor de transcripción , un
operador opcional para controlar el comienzo de la transcripción,
mejoradores de la transcripción para elevar el nivel de expresión de
mARN, una secuencia que codifica un lugar de unión de ribosoma
adecuado y secuencias que terminan la transcripción y la
traducción. Los vectores de expresión contendrán también
usualmente un origen de replicación que permita replicarse al vector independientemente de la célula hospedante.
usualmente un origen de replicación que permita replicarse al vector independientemente de la célula hospedante.
Los vectores contienen ADN que codifica, por
ejemplo, un antígeno DAP12 humano, o un fragmento del mismo que
codifica un polipéptido activo biológicamente. El ADN puede estar
bajo el control de un promotor vírico y puede codificar un marcador
de selección. También se describe el uso de vectores de expresión
tales que son capaces de expresar cADN eucariota que codifica un
antígeno DAP12 de primate en un hospedante procariota o eucariota,
en el que el vector es compatible con el hospedante y en el que el
cADN eucariota que codifica el antígeno está insertado en el vector
de tal modo que el crecimiento del hospedante que contiene el vector
expresa el cADN en cuestión. Habitualmente, se diseñan vectores de
expresión para replicación estable en sus células hospedantes o
para multiplicación con el fin de aumentar en gran medida el número
total de copias del gen deseable por célula. No siempre es
necesario requerir que un vector de expresión se replique en una
célula hospedante, por ejemplo, es posible efectuar expresión
transitoria del antígeno o sus fragmentos en diversos hospedantes
usando vectores que no contienen un origen de replicación que sea
reconocido por la célula hospedante. También es posible usar
vectores que ocasionan la integración del gen de DAP12 humana o sus
fragmentos en el ADN del hospedante por recombinación.
Los vectores, según se usa aquí, comprenden
plásmidos, virus, bacteriófago, fragmentos de ADN integrables y
otros vehículos que permitan la integración de fragmentos de ADN en
el genoma del hospedante. Los vectores de expresión son vectores
especializados que contienen elementos de control genético que
efectúan la expresión de genes enlazador operativamente. Plásmidos
son la forma más usada comúnmente de vector, pero son adecuados
para su uso aquí todas las otras formas de vectores que sirven para
una función equivalente y que sean, o resulten, conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Pouwels et al. (1985 y
Suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier,
N.Y., y Rodriguez et al. (1988) (reds.) Vectors: A Survey
of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth,
Boston, MA.
Las células transformadas son células,
preferiblemente de mamífero, que se han transformado o transfectado
con vectores de DAP12 humana construidos usando técnicas de ADN
recombinante. Las células hospedantes transformadas expresan
usualmente el antígeno o sus fragmentos, pero con fines de
clonación, multiplicación y manipulación de su ADN, no necesitan
expresar la proteína. Esta invención considera adicionalmente
cultivar células transformadas en un medio nutriente, permitiendo
así a la proteína acumularse en el cultivo. La proteína puede
recuperarse, del cultivo o del medio de cultivo.
Para los fines de esta invención, las secuencias
de ADN están enlazadas operativamente cuando están relacionadas
funcionalmente entre sí. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o
líder secretora está enlazado operativamente a un polipéptido si se
expresa como una preproteína o participa en dirigir el polipéptido a
la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor
está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si
controla la transcripción del polipéptido; un lugar de unión a
ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia de
codificación si está situado para permitir la traducción.
Habitualmente, enlazado operativamente significa contiguo y en
marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales
como genes represores no están enlazados contiguamente pero se unen
todavía a secuencias operadoras que a su vez controlan la
expresión.
Las células hospedantes adecuadas incluyen, por
ejemplo, procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores.
Las procariotas incluyen organismos gram negativos y gram
positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Las
eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S.
cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium.
Las eucariotas superiores incluyen linajes celulares de cultivo de
tejidos establecidos de células de animales, de origen no de
mamífero, por ejemplo, células de insectos, y aves, y de origen de
mamífero, por ejemplo, ser humano, primates y roedores.
Los sistemas hospedante
procariota-vector incluyen una amplia variedad de
vectores para muchas especies diferentes. Según se usa aquí, E.
coli y sus vectores se usarán genéricamente incluyendo vectores
equivalentes usados en otros procariotas. Un vector representativo
para multiplicar ADN es pBR322 o muchos de sus derivados. Los
vectores que pueden usarse para expresar, por ejemplo, los antígenos
DAP12 humanos o sus fragmentos incluyen, aunque sin limitarse a
ellos, vectores tales como los que contienen el promotor lac (serie
pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp
(la serie pIN); promotores lambda-pP o pR (pOTS); o
promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius et
al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-,
and Ipp-derived promoters", en Rodriguez y
Denhardt (reds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors
and Their Uses, Buttersworth, Boston, Capítulo 10, págs.
205-236.
Los eucariotas inferiores, por ejemplo,
levaduras y Dictyostelium, pueden transformarse con, por ejemplo,
una secuencia de antígeno DAP12 humano que contiene vectores. Para
los fines de esta invención, el hospedante eucariota inferior más
común es la levadura de panadero, Saccharomyces cerevisiae.
Se usará para representar genéricamente eucariotas inferiores,
aunque también está disponible un cierto número de otras cepas y
especies. Los vectores de levadura consisten típicamente en un
origen de replicación (salvo del tipo integrante), un gen de
selección, un promotor, ADN que codifica la proteína deseada o sus
fragmentos y secuencias para terminación de traducción,
poliadenilación y terminación de transcripción. Los vectores de
expresión adecuados para levadura incluyen promotores constitutivos
tales como 3-fosfoglicerato quinasa y otros
promotores de genes de enzimas glicolíticas diversos o promotores
inducibles tales como el promotor de alcohol deshidrogenasa 2 o el
promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen
derivados de los siguientes tipos: número de copias bajo
autorreplicantes (tal como la serie YRp), número de copias alto
autorreplicantes (tal como la serie YEp); tipos integrantes (tales
como la serie YIp) o mini-cromosomas (tales como la
serie YCp).
Las células de cultivo de tejidos eucariotas
superiores son las células hospedantes preferidas para la expresión
de la proteína de antígeno DAP o MDL humano activo funcionalmente.
En principio, son practicables muchos linajes celulares de cultivo
de tejidos eucariotas superiores, por ejemplo, sistemas de expresión
de baculovirus de insectos, tanto de un origen de invertebrado como
de vertebrado. Sin embargo, se prefieren células de mamífero, por
la elaboración, en cotraducción y post-traducción.
La transformación o transfección y la propagación de tales células
se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de
linajes celulares útiles incluyen células HeLa, linajes celulares
de ovario de hámster chino (CHO), linajes celulares de riñón de rata
joven (BRK), linajes celulares de insectos, linajes celulares de
aves y linajes celulares de mono (COS). Los vectores de expresión
para tales linajes celulares incluyen habitualmente un origen de
replicación, un promotor, un lugar de iniciación de traducción,
lugares de empalme de ARN (si se usa ADN genómico), un lugar de
poliadenilación y un lugar de terminación de transcripción. Estos
vectores contienen también usualmente un gen de selección o un gen
de multiplicación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser
plásmidos, virus o retrovirus que llevan promotores derivados, por
ejemplo, de fuentes tales como de adenovirus, SV40, parvovirus,
virus de la viruela o citomegalovirus. Los ejemplos representativos
de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase
Okayama et al. (1985) Mol. Cell Biol.
5:1136-1142; pMC1neo Poly-A, véase
Thomas et al. (1987) Cell 51:503-512;
y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610.
Se deseará a menudo expresar un polipéptido de
antígeno DAP o MDL humano en un sistema que proporcione un modelo
de glicosilación específico o definido. En este caso, el modelo
usual será el proporcionado naturalmente por el sistema de
expresión. Sin embargo, el modelo será modificable exponiendo el
polipéptido, por ejemplo, una forma no glicosilada, a proteínas de
glicosilación apropiadas introducidas en un sistema de expresión
heterólogo. Por ejemplo, el gen de antígeno DAP12 puede
co-transformarse con uno o más genes que codifican
enzimas de glicosilación de mamíferos u otras. Usando este método,
serán alcanzables o aproximados ciertos modelos de glicosilación de
mamíferos en células procariotas u otras.
Los antígenos DAP podrían producirse también en
una forma que está enlazada a fosfatidil inositol (PI), pero pueden
separarse de membranas por tratamiento con una enzima de división de
fosfatidil inositol, por ejemplo, fosfatidil inositol
fosfolipasa-C. Esto libera el antígeno en una forma
activa biológicamente, y permite purificación por procedimientos
estándares de química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989)
Biochim. Biophys. Acta 988:427-454, Tse
et al. (1985) Science 230:1003-1008; y
Brunner et al. (1991) J. Cell Biol.
114:1275-1283. Alternativamente, pueden diseñarse
en la secuencia segmentos de purificación, por ejemplo, en el
término N o el término C, para ayudar en la purificación o
detección del producto proteínico. Pueden diseñarse también medios
para separar tales segmentos, por ejemplo, lugares de división por
proteasa.
Ahora que se conocen las secuencias completas,
pueden prepararse los antígenos DAP o MDL de primate, fragmentos o
derivados de ellos por procedimientos convencionales para sintetizar
péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como se describen en
Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce
Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The
Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag,
Nueva York; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide
Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York. Por
ejemplo, pueden usarse un procedimiento con azida, un procedimiento
con cloruro de ácido, un procedimiento con anhídrido de ácido, un
procedimiento con anhídrido mezclado, un procedimiento con éster
activo (por ejemplo, éster de p-nitrofenilo, éster
de N-hidroxisuccinimida o éster de cianometilo), un
procedimiento con carbodiimidazol, un procedimiento
oxidante-reductor o un procedimiento con
diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Las síntesis en fase sólida
y en fase solución son ambas aplicables a los procedimientos
anteriores.
Los antígenos DAP o MDL humanos, fragmentos o
derivados se preparan convenientemente según los procedimientos
anteriores como se emplean típicamente en síntesis de péptidos,
generalmente bien por un procedimiento denominado por etapas que
comprende condensar un aminoácido al aminoácido terminal, en
secuencia uno por uno, o bien mediante acoplamiento de fragmentos
de péptidos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se usan
en la reacción de acoplamiento deben protegerse para impedir el
acoplamiento en una posición incorrecta.
Si se adopta una síntesis en fase sólida, el
aminoácido C-terminal se une a un vehículo o soporte
insoluble a través de su grupo carboxilo. El vehículo insoluble no
está limitado particularmente en tanto en cuanto tenga una
capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de
tales vehículos insolubles incluyen resinas de halometilo, tales
como resina de clorometilo o resina de bromometilo, resinas de
hidroximetilo, resinas fenólicas, resinas de
ter-alquiloxicarbonil-hidrazidadas y
similares.
Un aminoácido protegido en el grupo amino se une
en secuencia a través de la condensación de su grupo carboxilo
activado y el grupo amino reactivo del péptido o cadena formados
previamente, para sintetizar el péptido paso a paso. Después de
sintetizar la secuencia completa, el péptido se separa del vehículo
insoluble para producir el péptido. Este método en fase sólida se
describe en general por Merrifield et al. (1963) en J. Am.
Chem. Soc. 85:2149-2156.
El antígeno preparado y fragmentos del mismo
pueden aislarse y purificarse de la mezcla de reacción mediante
separación de péptido, por ejemplo, por extracción, precipitación,
electroforesis y diversas formas de cromatografía, y similares. Los
antígenos DAP12 humanos de esta invención pueden obtenerse con
diversos grados de pureza dependiendo del uso deseado. La
purificación puede conseguirse mediante el uso de las técnicas de
purificación de proteínas descritas aquí o mediante el uso de los
anticuerpos descritos aquí, por ejemplo, en cromatografía de
afinidad de inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad de
inmunoabsorbente se realiza, por ejemplo, enlazando primero los
anticuerpos a un soporte sólido y poniendo después en contacto los
anticuerpos enlazados con lisados solubilizados de células, lisados
de otras células que expresan, por ejemplo, los antígenos DAP12 o
lisados o sobrenadantes de células que producen los antígenos DAP12
como resultado de técnicas de ADN, véase después.
La presente invención proporciona reactivos que
encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico como se describe
aquí en otros lugares, por ejemplo, en la descripción general de
anormalidades de desarrollo o fisiológicas, o después en la
descripción de juegos para diagnosis.
Muchos de los receptores importantes en la
activación de leucocitos (incluyendo el receptor de antígeno de
células T y los receptores de inmunoglobulina y Fc) carecen de
propiedades de señalización intrínsecas, pero transmiten sus
señales por acoplamiento no covalente con otras proteínas de
membrana que contienen motivos de activación basados en tirosina de
inmunoreceptores (ITAM, YxxL- espaciador de 6 a 8 aminoácidos -YxxL)
en sus dominios citoplásmicos. Por ejemplo, el receptor de antígeno
de células T está asociado con las proteínas CD3 gamma, delta,
epsilon y zeta que contienen secuencias de ITAM. De modo similar, la
inmunoglobulina superficial en células B está asociada con CD79A y
CD79B que contienen ITAM y se requieren para transducción de señal.
Los receptores de Fc para IgG (CD16) en células NK se asocian con
CD3 zeta o la subunidad de receptor-gamma de Fc de
IgE (que contienen ambos ITAM) y el receptor de IgE de alta afinidad
en mastocitos asociados con la subunidad de
receptor-gamma de Fc de IgE. Por tanto, las
proteínas asociadas que contienen ITAM representan una estrategia
general en el montaje de receptores activadores en leucocitos.
Recientemente, se han identificado varias
familias nuevas de receptores de leucocitos que son diversas
estructuralmente. Ciertas isoformas de la familia de receptores
KIR, ILT/MIR, Ly49 y CD94/NGK2 se han implicado en señalización
positiva; sin embargo, estas moléculas (por ejemplo,
KIR-NKAT5, KIR-c139, ILT1, gp91/PIR
y CD94) carecen de secuencias en sus domonios citoplásmicos que
serían consecuentes con capacidad de señalización positiva.
Dado que los receptores de antígenos de células
T, los receptores de inmunoglobulina y los receptores de Fc
consiguen todos función de señalización por asociación con otra
pequeña subunidad que contiene ITAM, es probable que estos otros
receptores de leucocitos pudieran usar una estrategia similar.
Por tanto, se buscaron bases de datos de
secuencias disponibles con secuencias de proteínas de CD3 gamma,
delta, epsilon y zeta humana y de ratón, y cadena de receptor gamma
de Fc de IgE. Se identificó una EST denominada LVA03A que codifica
una proteína de membrana putativa de \sim12 kd con un residuo
ácido (D) en el segmento transmembrana y una secuencia de ITAM
perfecta en el dominio citoplásmico. Los residuos de cisteína en el
dominio extracelular corto sugieren que la molécula podría
expresarse como un dímero unido por disulfuro. Los estudios de
distribución indican que el gen se transcribe en macrófagos,
células dendríticas, algunas células T y células NK. Esta proteína
se ha denominado Proteína de Activación DNAX 12 (DAP12). Se
identificó también un gen análogo, denominado DAP10, que posee
motivos ITIM.
Todos los receptores que contienen ITAM han sido
importantes para inducir la función de leucocitos (por ejemplo,
receptor de antígeno de células T, receptor de inmunoglobulina,
receptor de Fc). Por tanto, es probable que DAP12 tenga un papel
importante en transducción de señal en leucocitos. Se
proporcionarían agonistas y antagonistas de DAP12 útiles para
potenciar o inhibir respuestas inmunes (es decir, proliferación,
producción de citoquinas, inducción de apoptosis o provocación de
citotoxicidad mediada por células), respectivamente.
Se han identificado receptores que contienen el
motivo YxxM como importantes en ciertas moléculas de señalización,
por ejemplo, CD28, CTLA-4 y CD19. Por tanto, es
probable que DAP10 tenga un papel importante en transducción de
señal. Se proporcionarían agonistas y antagonistas de DAP10 útiles
para potenciar o inhibir respuestas inmunes (es decir,
proliferación, producción de citoquinas, inducción de apoptosis o
provocación de citotoxicidad mediada por células),
respectivamente.
Se prevé que DAP12 pueda asociarse no
covalentemente con varios receptores de membrana diferentes, por
ejemplo, pero no limitado necesariamente a receptor de antígeno de
células T, el receptor de antígeno de células pre-T,
el receptor de inmunoglobulina, receptores de Fc, la familia KIR de
receptores, la familia ILT/MIR de receptores, la familia LAIR de
receptores, la familia gp91/PIR de receptores, la familia Ly49 de
receptores (específicamente Ly49D y Ly49H) y la familia CD94/NKG2
de receptores. Entre éstos está el MDL-1. Por tanto,
reactivos para afectar la interacción de DAP12 con dichos
receptores pueden aumentar o suprimir la función de estas moléculas
para intervención terapéutica (es decir, aumentar la inmunidad para
vacunación o enfermedades de inmunodeficiencia o suprimir
respuestas inmunes en el caso de enfermedades autoinmunes o
trasplante). Las combinaciones de DAP con uno cualquiera de estos
receptores serán útiles, por ejemplo, para examen de fármacos para
interruptores de la interacción y señalización subsiguiente, así
como anticuerpos para los complejos estructurales procedentes de su
interacción.
La DAP12 puede jugar un papel en la señalización
de integrina tipo Beta2. Es claro que integrina Beta2 puede
transmitir una señal dependiente de P Tyr quinasa que implica Syk.
En eliminaciones de Syk, Beta2 no señala. La trayectoria implica
también probablemente Fc\gammaR (en Monocitos/Macrófagos y células
B) como regulador negativo. Sin embargo, no hay forma conocida de
que Syk se asocie con integrinas Beta2 porque no tienen secuencias
que contengan ITAM en sus dominios citoplásmicos. Además, no hay
evidencia de que las proteínas conocidas que contienen ITAM puedan
asociarse con Beta2. Así, DAP12 sería un candidato o prototipo
principal de uno que se asociara con Beta2.
Esta invención proporciona también reactivos con
un valor terapéutico significativo. Las DAP12 o DAP10 humanas (de
origen natural o recombinantes), fragmentos de ellas y anticuerpos
para ellas, junto con compuestos identificados por tener afinidad
de unión a DAP de primate, deben ser útiles en el tratamiento de
estados asociados con respuestas anormales de células B, incluyendo
proliferación anormal, por ejemplo, estados cancerosos o estados
degenerativos. La proliferación, regeneración, degeneración y
atrofia anormales pueden modularse mediante tratamiento terapéutico
apropiado usando las composiciones proporcionadas aquí. Por ejemplo,
una enfermedad o trastorno asociados con expresión anormal o
provocación anormal de DAP12 deben ser un objetivo probable para un
agonista o antagonista del antígeno. La DAP12 juega probablemente un
papel en la activación o regulación de células inmunes, que afectan
a respuestas inmunológicas, por ejemplo, trastornos autoinmunes o
respuestas alérgicas.
Además, la interacción de compañeros de unión
DAP:DAP puede estar implicada en interacciones de células T, NK, DC
o monocitos que permiten la activación, proliferación y/o
diferenciación de células que interactúan. Si es así, el
tratamiento puede resultar de la interferencia con la transducción
de señal de compañeros de unión DAP:DAP, particularmente
potenciación o inhibición de respuestas inmunes tales como
proliferación, producción de citoquinas, inducción de apoptosis o
provocación de la citotoxicidad mediada por células. El bloqueo de
la señal puede efectuarse, por ejemplo, mediante una DAP soluble o
anticuerpos para DAP, o fármacos que rompen la interacción
funcional de la DAP con su compañero de complejo receptor.
Se conocen otras condiciones de desarrollo
anormales en cada uno de los tipos de células de los que se muestra
que poseen mARN de DAP12 o DAP10 por análisis de manchas de
Northern, por ejemplo, linfocitos, NK, monocitos y células
dendríticas. Véase Berkow (red.) The Merck Manual of Diagnosis
and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; y Thorn et
al. Harrison's Principles of Internal Medicine,
McGraw-Hill, N.Y. Por ejemplo, puede conseguirse
inmunosupresión terapéutica bloqueando la interacción de linfocitos
T y linfocitos B a través de su molécula. Ello representará una
terapia importante para controlar enfermedades autoinmunes y rechazo
de injertos durante el trasplante. El bloqueo puede efectuarse con
composiciones de unión bloqueantes, por ejemplo, anticuerpos
neutralizantes.
Pueden purificarse DAP o anticuerpos de DAP
recombinantes y administrarse después a un paciente. Estos reactivos
pueden combinarse para uso terapéutico con ingredientes activos
adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes aceptables
farmacéuticamente convencionales, por ejemplo, coadyuvantes
inmunógenos, junto con estabilizantes y excipientes inocuos
fisiológicamente. Estas combinaciones, y las composiciones
proporcionadas, pueden filtrarse estérilmente y ponerse en formas
de dosificación como mediante liofilización en viales de
dosificación o almacenarse en preparaciones acuosas estabilizadas.
Esta invención considera también el uso de anticuerpos o fragmentos
de unión de ellos que no son unión de complemento.
Puede realizarse examen de fármacos usando DAP o
fragmentos de ella para identificar compuestos que tienen afinidad
de unión a una DAP, incluyendo aislamiento de componentes asociados.
Pueden utilizarse después ensayos biológicos subsiguientes para
determinar si el compuesto tiene actividad estimuladora intrínseca y
es por tanto un bloqueador o antagonista porque bloquea
señalización. De modo similar, un compuesto que tiene actividad
estimuladora intrínseca puede activar el antígeno y es así un
agonista porque estimula la actividad de una DAP. También se
describe el uso terapéutico de anticuerpos para DAP como
antagonistas. Este método sería particularmente útil con otras DAP
o variantes de especies de MDL.
Las cantidades de reactivos necesarias para una
terapia eficaz dependerá de muchos factores diferentes, incluyendo
medios de administración, lugar del objetivo, estado fisiológico del
paciente y otros medicamentos administrados. Así, deben titularse
dosificaciones de tratamiento para optimizar la seguridad y la
eficacia. Típicamente, las dosificaciones usadas in vitro
pueden proporcionar una guía útil de las cantidades útiles para
administración in situ de estos reactivos. El ensayo en
animales de dosis eficaces para el tratamiento de trastornos
particulares proporcionará una indicación predictiva adicional de
la dosificación en seres humanos. Se describen diversas
consideraciones, por ejemplo, en Gilman et al. (reds. 1990)
Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of
Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press; y Remington's
Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co.,
Easton, Penn. Se comentan en ellas y después métodos de
administración, por ejemplo, para administración oral, intravenosa,
intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otras. Los
vehículos aceptables farmacéuticamente incluirán agua, solución
salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el
Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Se
esperaría ordinariamente que los intervalos de dosificación
estuvieran en cantidades inferiores a concentraciones de 1 mM,
típicamente menos de concentraciones de aproximadamente 10 \muM,
usualmente menos de aproximadamente 100 nM, preferiblemente menos de
aproximadamente 10 pM (picomolar), y más preferiblemente menos de
aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un vehículo apropiado. Se
utilizarán a menudo para administración continua formulaciones de
liberación lenta o un aparato de liberación lenta.
Pueden administrarse DAP o MDL humanas,
fragmentos de ellas y anticuerpos para ellas o sus fragmentos,
antagonistas y agonistas, directamente al hospedante a tratar o,
dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable
conjugarlos a proteínas vehículo tales como ovalbúmina o albúmina de
suero antes de su administración. Pueden administrarse
formulaciones terapéuticas en muchas formulaciones de dosificación
convencionales. Aunque es posible administrar el ingrediente activo
solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica.
Las formulaciones comprenden típicamente al menos un ingrediente
activo, como se ha definido antes, junto con uno o más vehículos
aceptables de él. Cada vehículo debe ser farmacéutica y
fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los
otros ingredientes y no perjudicial para el paciente. Las
formulaciones incluyen las adecuadas para administración tópica,
oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea,
intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden
presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, en
formas estériles, o pueden prepararse por muchos métodos muy
conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman
et al. (reds. 1990) Goodman and Gilman's: The
Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press;
y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack
Publishing Co., Easton, Penn. La terapia de esta invención puede
combinarse con, o usarse en asociación con, otros agentes.
Las formas de origen natural y recombinante de
los antígenos DAP o MDL son particularmente útiles en juegos y
métodos de ensayo que son capaces de examinar la actividad de unión
de compuestos a las proteínas. Se han desarrollado varios métodos
para automatizar ensayos en años recientes para permitir el examen
de decenas de miles de compuestos en un período corto. Véase, por
ejemplo, Fodor et al. (1991) Science
251:767-773, que describe medios para ensayar
afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos
sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos
adecuados puede facilitarse en gran medida por la disponibilidad de
grandes cantidades de DAP o MDL solubles, purificadas, como se
proporcionan aquí.
Por ejemplo, pueden encontrarse normalmente
antagonistas una vez que se ha definido estructuralmente una MAP o
MDL. Es posible ahora el ensayo de antagonistas potenciales sobre el
desarrollo de métodos de ensayo altamente automatizados usando una
MAP o MDL purificada. En particular, se descubrirán nuevos agonistas
y antagonistas usando técnicas de examen que se han hecho posibles
aquí. Son de particular importancia compuestos en los que se
encuentra que tienen una afinidad de unión combinada a proteínas
DAP12, DAP10 o MDL-1 múltiples, por ejemplo,
compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes
alélicas de DAP o MDL.
Además, puesto que la señalización a través del
compañero de unión de DAP:DAP puede funcionar en combinación con
otras señales, se considerará también terapia de combinación con
tales trayectorias. Así, pueden ser útiles el antagonismo de
trayectorias de señales múltiples, o la estimulación con
trayectorias múltiples. Además, con la asociación de la DAP12 con
MDL-1, y posiblemente también con DAP10, pueden ser
importantes combinaciones diversas de los genes descritos.
Esta invención es particularmente útil para
examinar compuestos usando los antígenos recombinantes en cualquiera
de una variedad de técnicas de examen de fármacos. Las ventajas de
usar una proteína recombinante en el examen de compuestos
específicos incluyen: (a) fuente renovable mejorada de la DAP12 de
una fuente específica; (b) número potencialmente mayor de moléculas
de antígeno por célula dando en los ensayos mejor relación de señal
a ruido; y (c) especificidad de variantes de especies (dando
teóricamente mayor especificidad biológica y de enfermedad).
Un método de examen de fármacos utiliza células
hospedantes eucariotas o procariotas que se transforman establemente
con moléculas de ADN recombinante que expresan las DAP y/o MDL.
Pueden aislarse células que expresan una DAP en aislamiento de
otras, o en combinación con su compañero del complejo receptor.
Tales células, en forma viable o fija, pueden usarse para ensayos
de unión de antígeno/compañero estándares. Véase también Parce et
al. (1989) Science 246:243-247; y Owicki
et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
87:4007-4011, que describen métodos sensibles para
detectar respuestas celulares. Son particularmente útiles ensayos
competitivos, en los que las células (fuente de DAP) se ponen en
contacto y se incuban con un compuesto marcado que tiene afinidad
de unión conocida al antígeno, y un compuesto de ensayo cuya
afinidad de unión a la DAP está siendo medida. El compuesto unido y
el compuesto libre se separan después para valorar el grado de
unión. La cantidad de compuesto de ensayo unido es inversamente
proporcional a la cantidad de unión de compuesto marcado medida.
Pueden usarse muchas técnicas para separar compuesto unido de libre
para valorar el grado de unión. Esta etapa de separación podría
implicar típicamente un procedimiento tal como adhesión a filtros
seguida por lavado, adhesión a plástico seguida por lavado, o
centrifugación de las membranas celulares. Podrían usarse también
células viables para examinar los efectos de fármacos en funciones
mediadas por DAP, por ejemplo, niveles de segundo mensajero, es
decir, Ca^{++}; proliferación celular; cambios de agrupación de
fosfato de inositol; y otros. Algunos métodos de detección permiten
la eliminación de una etapa de separación, por ejemplo, un sistema
de detección sensible a la proximidad. Los colorantes sensibles a
calcio serán útiles para detectar niveles de Ca^{++}, con un
fluorímetro o un aparato de clasificación de células de
fluorescencia.
fluorescencia.
Otro método utiliza membranas de células
hospedantes eucariotas o procariotas transformadas como fuente de
las DAP o MDL humanas. Estas células se transforman establemente con
vectores de ADN que dirigen la expresión de antígeno DAP o MDL
humano. Esencialmente, las membranas se prepararían a partir de las
células y se usarían en un ensayo de unión de complejo receptor tal
como el ensayo competitivo indicado antes.
Otro método todavía es usar DAP purificada
solubilizada, impurificada o solubilizada, de células hospedantes
eucariotas o procariotas transformadas. Esto permite un ensayo de
unión "molecular" con las ventajas de especificidad aumentada,
la capacidad de automatizar y alta capacidad de ensayo de
fármacos.
Otra técnica para examen de fármacos implica un
método que proporciona un examen de alta capacidad para compuestos
que tienen afinidad de unión adecuada a DAP o MDL humanas y se
describe con detalle en Geysen, Solicitud de Patente Europea
84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. Primero, se
sintetizan grandes números de diferentes compuestos de ensayo
péotidos pequeños sobre un sustrato sólido, por ejemplo, espigas de
plástico o alguna otra superficie apropiada, véase Fodor et
al. (1991). Se hacen reaccionar después todas las espigas con
DAP purificada, solubilizada, impurificada o solubilizada, y se
lavan. La siguiente etapa implica detectar DAP unida.
Un diseño de fármaco racional puede basarse
también en estudios estructurales de las formas moleculares de la
DAP o MDL y otros efectores. Los efectores pueden ser otras
proteínas que median en otras funciones en respuesta a unión de
complejo receptor, u otras proteínas que interactúan normalmente con
el antígeno. Un medio para determinar qué lugares interactúan con
otras proteínas específicas es una determinación de estructura
física, por ejemplo, cristalografía de rayos x o técnicas de NMR
bidimensional. Éstas proporcionarán una guía sobre qué residuos de
aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una
descripción detallada de determinación estructural de proteínas,
véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein
Crystallography, Academic Press, New York.
Pueden revestirse directamente sobre placas DAP
o MDL purificadas para su uso en las técnicas de examen de fármacos
antedichas. Sin embargo, pueden usarse anticuerpos no neutralizantes
para estos antígenos como anticuerpos de captura para inmovilizar
las DAP o MDL respectivas en la fase sólida.
Esta invención considera también el uso de
proteínas MDL, fragmentos de ellas, péptidos y sus productos de
fusión en una variedad de juegos de diagnóstico y métodos para
detectar la presencia de MDL o un compañero de unión. Típicamente,
el juego tendrá un compartimento que contenga un péptido de MDL
definido o segmento de gen o un reactivo que reconozca a uno o al
otro.
Un juego para determinar la afinidad de unión de
un compuesto de ensayo a, por ejemplo, una DAP12, comprendería
típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por
ejemplo, un compañero de unión de complejo receptor o anticuerpo
que tenga afinidad de unión conocida para la DAP12; una fuente de
DAP12 (de origen natural o recombinante); y un medio para separar
compuesto marcado unido de libre, tal como una fase sólida para
inmovilizar la DAP12. Una vez examinados los compuestos, los que
tengan afinidad de unión adecuada a la DAP12 pueden evaluarse en
ensayos biológicos adecuados, como son bien conocidos en la técnica,
para determinar si actúan como agonistas o antagonistas. La
disponibilidad de polipéptidos de DAP12 recombinantes proporciona
también estándares bien definidos para calibrar tales ensayos.
Un juego preferido para determinar la
concentración de, por ejemplo, una DAP12, en una muestra
comprendería típicamente un compuesto marcado, por ejemplo,
anticuerpo, que tenga afinidad de unión conocida para la DAP12, una
fuente de DAP12 (de origen natural o recombinante) y un medio para
separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una fase
sólida para inmovilizar la DAP12. Se proporcionarán
normalmente compartimentos que contengan reactivos, e
instrucciones.
Un método para determinar la concentración de
DAP12 en una muestra comprendería típicamente las etapas de: (1)
preparar membranas de una muestra constituida por una fuente de
DAP12; (2) lavar las membranas y suspenderlas en un tampón; (3)
solubilizar la DAP12 incubando las membranas en un medio de cultivo
al que se ha añadido un detergente adecuado; (4) ajustar la
concentración de detergente de la DAP12 solubilizada; (5) poner en
contacto e incubar dicha dilución con anticuerpo radiomarcado para
formar complejos; (6) recuperar los complejos tal como mediante
filtración a través de filtros tratados con polietilenimina; y (7)
medir la radioactividad de los complejos recuperados.
Son útiles en aplicaciones de diagnóstico
anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión a antígeno, específicos
para DAP humana o fragmentos de DAP, por ejemplo, para detectar la
presencia de niveles elevados de DAP y/o sus fragmentos. Tales
ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas,
células fijas, inmunofluorescencia, cultivos de células, fluidos
corporales, y además pueden implicar la detección de antígenos
relacionados con la DAP en suero, o similares. Los ensayos de
diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación
entre reactivo libre y un complejo
antígeno-compañero) o heterogéneos (con una etapa de
separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como
radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima
(ELISA), inmunoensayo de enzima (EIA), técnica de inmunoensayo
multiplicado por enzima (EMIT), inmunoensayo fluorescente marcado
en sustrato (SLFIA) y similares. Por ejemplo, pueden emplearse
anticuerpos no marcados usando un segundo anticuerpo que está
marcado y que reconoce el anticuerpo a una DAP o a un fragmento
particular de ella. Estos ensayos también se han discutido
extensamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane
(1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.
Pueden tener un uso similar anticuerpos
anti-idiotípicos para diagnosticar la presencia de
anticuerpos contra una DAP humana, ya que tal puede ser diagnóstico
de diversos estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de
DAP puede dar como resultado la producción de diversas reacciones
inmunológicas que pueden ser diagnóstico de estados fisiológicos
anormales, particularmente en estados celulares proliferativos tales
como cáncer o diferenciación anormal.
Frecuentemente, los reactivos para ensayos de
diagnóstico se suministran en juegos, para optimizar la sensibilidad
del ensayo. Para la invención sujeto, dependiendo de la naturaleza
del ensayo, del método y de la marca, se proporciona anticuerpo
marcado o no marcado, o DAP o MDL marcadas. Esto es habitualmente en
conjunción con otros aditivos, tales como tampones, estabilizantes,
materiales necesarios para producción de señal tales como sustratos
para enzimas, y similares. Preferiblemente, el juego contendrá
también instrucciones para un uso apropiado y evacuación del
contenido después de usar. Típicamente, el juego tiene
compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los
reactivos se proporcionan como un polvo liofilizado seco, en el que
pueden reconstituirse los reactivos en un medio acuoso
proporcionando concentraciones apropiadas de reactivos para
realizar el ensayo.
Cualquiera de los constituyentes antedichos de
los ensayos de examen de fármacos y de diagnóstico puede usarse sin
modificación o puede modificarse de una variedad de formas. Por
ejemplo, el marcado puede conseguirse uniendo covalentemente o no
covalentemente un resto que proporciona directa o indirectamente una
señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, el compuesto de
ensayo, DAP, MDL o anticuerpos para ellos pueden marcarse directa o
indirectamente. Las posibilidades para marcado directo incluyen
grupos de marca: radiomarcas tales como ^{125}I, enzimas (Patente
de los EE.UU. Nº 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa
alcalina, y marcas fluorescentes (Patente de los EE.UU. Nº
3.940.475) capaces de comprobar el cambio de la intensidad de
fluorescencia, el desplazamiento de longitud de onda o la
polarización de fluorescencia. Ambas patentes se incorporan aquí
como referencia. Las posibilidades para el marcado indirecto
incluyen biotinación de un constituyente seguida por unión a
avidina acoplada a uno de los grupos de marca anteriores.
Hay también numerosos métodos para separar el
compuesto de unión unido del libre, o alternativamente el compuesto
de ensayo unido del libre. Las DAP o MDL pueden inmovilizarse en
diversas matrices, seguido por lavado. Las matrices adecuadas
incluyen plástico, tal como una placa ELISA, filtros y perlas. Los
métodos para inmovilizar las DAP o MDL en una matriz incluyen, sin
limitación, adhesión directa a plástico, uso de un anticuerpo de
captura, acoplamiento químico y biotina-avidina. La
última etapa en este método implica la precipitación de complejo de
antígeno/compuesto de unión por cualquiera entre varios métodos,
incluyendo los que utilizan, por ejemplo, un disolvente orgánico
tal como polietilenglicol o una sal tal como sulfato amónico. Otras
técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el
método de partículas magnetizables de anticuerpo fluoresceína
descrito en Rattel et al. (1984) Clin. Chem.
30:1457-1461, y la doble separación de partículas
magnéticas de anticuerpo como se describe en la Patente de los
EE.UU. Nº 4.659.678.
Los métodos para enlazar proteínas o sus
fragmentos a las diversas marcas se han indicado extensamente en la
bibliografía. Muchas de las técnicas implican la utilización de
grupos carboxilo activados mediante el uso de carbodiimida o
ésteres activos para formar enlaces péptido, la formación de
tioéteres por reacción de un grupo mercapto con un halógeno
activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como
maleimida, para enlace, o similares. También encuentran uso en
estas aplicaciones proteínas de fusión.
Otro aspecto de diagnóstico descrito aquí
implica el uso de polinucleótido o secuencias de oligonucleótidos
tomadas de la secuencia de una DAP o MDL. Estas secuencias pueden
usarse como sondas para detectar niveles del antígeno en muestras
de pacientes de los que se sospecha que tienen un estado anormal,
por ejemplo, cáncer o un problema de desarrollo. La preparación de
ambas secuencias de nucleótidos de ARN y ADN, el marcado de las
secuencias y el tamaño preferido de las secuencias han recibido una
amplia descripción y discusión en la bibliografía. Normalmente, una
sonda de oligonucleótido debe tener al menos aproximadamente 14
nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos y
las sondas de polinucleótido pueden ser de hasta varias kilobases.
Pueden emplearse diversas marcas, más comúnmente radionúclidos,
particularmente ^{32}P. Sin embargo, pueden emplearse también
otras técnicas, tales como usar nucleótidos modificados con biotina
para introducir en un polinucleótido. La biotina sirve después como
lugar para unión a avidina o anticuerpos, que pueden marcarse con
una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos, productos
fluorescentes, enzimas o similares. Alternativamente, pueden
emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos,
incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex híbridos de
ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína.
Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y realizarse el ensayo en
el que el dúplex se une a una superficie de modo que por formación
de dúplex en la superficie, puede detectarse la presencia de
anticuerpo unido al dúplex. El uso de sondas para el nuevo ARN
anti-sentido puede realizarse en cualquier técnica
convencional tal como hibridación de ácido nucleico, examen más y
menos, sondeo recombinacional, traducción liberada de híbrido (HRT)
y traducción detenida de híbrido (HART). Esto incluye también
técnicas de multiplicación tales como reacción en cadena de
polimerasa (PCR).
También se consideran juegos de diagnóstico que
también ensayan la presencia cualitativa o cuantitativa de otros
marcadores. La diagnosis o prognosis puede depender de la
combinación de indicaciones múltiples usadas como marcadores. Así,
pueden ensayar juegos combinaciones de marcadores. Véase, por
ejemplo, Viallet et al. (1989) Progress in Growth Factor
Res. 1:89-97.
La descripción de las proteínas DAP y MDL aquí
proporciona medios para identificar compañeros del complejo
receptor. Tal compañero del complejo receptor debe unirse
específicamente a la DAP12, DAP10 y/o MDL-1 con una
afinidad razonablemente alta. Se han hecho disponibles diversas
construcciones que permiten el marcado de la DAP o MDL para
detectar su compañero. Por ejemplo, marcado directamente de DAP12,
fusionando sobre ella marcadores para marcado secundario, por
ejemplo, FLAG u otras etiquetas epítopes, fusiones de dominios de
Ig, etc., permitirán la detección de compañeros de unión. Éste puede
ser histológico, como un método de afinidad para purificación
bioquímica, o marcado o selección en un método de clonación de
expresión. Puede aplicarse también un sistema de selección de dos
híbridos haciendo construcciones apropiadas con las secuencias de
DAP12 disponibles. Véase, por ejemplo, Fields y Song (1989)
Nature 340:245-246.
El amplio alcance de esta invención se entiende
mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden
limitar la invención a realizaciones específicas.
Algunos de los métodos estándares se describen o
se hace referencia a ellos, por ejemplo, en Maniatis et al.
(1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et
al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (2ª
ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et
al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn,
NY; o Ausubel et al. (1987 y Suplementos) Current
Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York. Los
métodos para purificación de proteínas incluyen métodos tales como
precipitación con sulfato amónico, cromatografía de columna,
electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, por
ejemplo, Ausubel et al. (1987 y suplementos periódicos);
Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods
in Enzymology, vol. 182 y otros volúmenes en esta serie; y
bibliografía del fabricante sobre el uso de productos de
purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J.,
o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con
técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos apropiados, por
ejemplo, a una secuencia FLAG o una equivalente que puede
fusionarse mediante una secuencia separable por proteasa. Véase,
por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie
12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of
Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow
(red.) Genetic Engineering, Principle and Methods
12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe et al.
(1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein
Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA:
Se describen técnicas inmunológicas estándares,
por ejemplo, en Hertzenberg et al. (reds. 1996) Weir's
Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4,
Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in
Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology
volúmenes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 y
163. Se describen ensayos para actividades biológicas de células
neurales, por ejemplo, en Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience
Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences
Academic Press; y Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. Se
describe metodología de sistemas de desarrollo, por ejemplo, en
Meisami (red.) Handbook of Human Growth and Developmental
Biology CRC Press; y Chrispeels (red.) Molecular Techniques
and Approaches in Developmental Biology Interscience.
Se describen análisis FACS en Melamed et
al. (1990) Flow Cytometry and Sorting
Wiley-Liss, Inc. Nueva York, NY; Shapiro (1988)
Practical Flow Cytometry Liss, Nueva York, NY; y Robinson
et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods
Wiley-Liss, Nueva York, NY.
Se realiza análisis de secuencias por ordenador,
por ejemplo, usando programas de software disponibles, incluyendo
los de las fuentes GCG (U. Wisconsin) y GenBank. Se usaron también
basas de datos de secuencias públicas, por ejemplo, de GenBank y
otros.
Se diseñan dos cebadores según las secuencias
proporcionadas. Para aumentar las posibilidades de obtener productos
de PCR, se usan células humanas THP-1 humanas, Th1
T, monocitos activados con LPS, IFN-\gamma e
IL-10, o NK. Se purifica un producto, se subclona
en vector pCR® (Invitrogen, San Diego, CA) y se determina después
la secuencia. Véanse Tablas 1, 2 y 3.
Pueden usarse análisis de hibridación o análisis
de PCR. Los datos preliminares por hibridación sugieren expresión
en macrófagos, células dendríticas, algunas células T y células NK.
El análisis puede ser por técnicas de Northern, Southern o cADN
Northern. Puede realizarse manchas de Western usando anticuerpos o
suero apropiados. Pueden determinarse también secuencias genómicas
por técnicas estándares.
El análisis de manchas de Southern de ADN
genómico humano reveló un modelo de digestión con enzima de
restricción consecuente con la organización genómica de un gen de
DAP12 simple. El análisis de manchas de Northern indicó la
presencia abundante de transcriptos de DAP12 de \sim0,7 kb en
leucocitos de sangre periférica y bazo humano, pero no en timo,
próstata, testículos, ovarios, intestino delgado o colon. Los
transcriptos de DAP12 se detectaron en ARN aislado de dos linajes
celulares NK humanos, NKL y NK92, pero no en el linaje celular de
leucemia Jurkat T o el linaje celular de linfoblastoides B
transformados con JY EBV. El análisis de manchas de Southern de un
gran panel de genotecas de cADN reveló expresión predominante de
DAP12 en células mononucleares de sangre periférica humana en
reposo, células dendríticas (de las que se clonó DAP12), monocitos
de sangre periférica y linajes celulares NK y clones.
Los datos de distribución inicial sobre DAP10
indican que se expresa elevadamente en células T, células NK,
monocitos y células dendríticas. No parece ser expresada
elevadamente en células B transformadas con EBV.
La MDL-1 parece restringida en
expresión a monocitos, macrófagos y células dendríticas, analizado
por análisis de manchas de Southern, de un gran panel de genotecas
de cADN y por RT-PCR. No se detectaron transcriptos
de MDL-1 en células T (pre-células
T, células T en reposo, linajes celulares T Th1 y Th2 y clones),
células B, células NK, granulocitos, linajes de células cebada y
linajes celulares endoteliales. Un panel de genotecas de tejidos
fetales humanos mostró hibridación con la genoteca de bazo fetal
pero no con otra genoteca, sugiriendo que el transcripto de
MDL-1 no se expresa en tipos de células de origen no
hematopoyético.
Las secuencias de las Tablas 1, 2 y 3 permiten
el diseño de una sonda o cebador que permita el aislamiento de
contrapartidas de ratón. Con las secuencias de primate y roedor,
pueden identificarse contrapartidas de otras especies usando
secuencias conservadas, ácido nucleico o epítopes.
Se usan métodos estándares para determinar la
secuencia de un clon aislado como se ha descrito antes. Se preparan
las construcciones apropiadas para expresión, por ejemplo, en un
tipo celular de coli, baculovirus o mamífero. Los tipos de células
preferidos incluyen Jurkat, YT o Baf3. Véase catálogo ATCC.
Se expresa transitoriamente proteína
DAP12-FLAG soluble en células COS-7.
Una forma recombinante de DAP12 que presenta el péptido FLAG en el
término amino o carboxi (Hoppe et al. (1988)
Biotechnology 6:1205-1210) se introduce en
el vector de expresión pME18S y se transfecta a continuación en
células COS-7 por electroporación. Las células
electroporadas se desarrollan en medio DMEM suplementado con 1% de
Nutridoma HU (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) o con medio
DMEM solo. Se usan métodos similares para la DAP10 o
MDL-1.
Se hace pasar sobrenadante que contiene DAP12
FLAG soluble sobre una columna de 20 ml de iones Cu^{++}
incorporados a una matriz Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia,
Upsalla, Suecia). Después de lavar con tampón de unión (juego de
tampón His-Bind, Novagen, Madison, WI), las
proteínas retenidas por los iones de metal se eluyen con un
gradiente de imidazol. Se determina el contenido de DAP12 FLAG
humana en las fracciones eluidas, por ejemplo, por mancha puntual
usando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2
(Eastman Kodak, New Haven, CT) o por azul de Coomassie y coloración
con plata de SDS-PAGE reductora. Se agrupan después
las fracciones que contienen proteína DAP12 FLAG y se dializan
frente a PBS.
Una forma de membrana nativa se subclona en un
vector de expresión, por ejemplo, pMAMneo (Clontech, Palo Alto,
California), que contiene el aumentador RSV-LTR
enlazado al promotor MMTV-LTR inducible con
dexametasona. Esta construcción se transfecta después en células
NIH-3T3 por electroporación. Las células
NIH-3T3 transfectadas se siembran en DMEM selectivo
con 0,5 mg/ml de geneticina (G418;
Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania)
suplementado con 10% de suero de becerro fetal.
La caracterización bioquímica de proteína DAP12
de membrana en células NIH-3T3 transfectadas
estables puede realizarse con marcado metabólico. Se cultivan
células, por ejemplo, en medio DMEM suplementado con 10% de suero
de becerro fetal y dexametasona final 1 \muM (Sigma, Saint Quentin
Fallavier, Francia). Se incuban después las células con
^{35}S-Met y ^{35}S-Cys para
marcar proteínas celulares. El análisis de las proteínas en
condiciones reductoras en SDS-PAGE debe mostrar una
proteína de 12 kDa, pero no en el lisado de células
NIH-3T3 no transfectadas. Se conocen ciertos otros
aspectos estructurales, por ejemplo, lugares de glicosilación,
etc.
Se inmunizan intraperitonealmente ratones Balb/c
endógamos con formas recombinantes de la proteína de primate. Los
animales se reforzaron en puntos de tiempo apropiados con proteína,
con o sin un coadyuvante adicional, para estimular adicionalmente
la producción de anticuerpo. Se recoge suero o hibridomas producidos
con bazos cosechados.
Alternativamente, se inmunizan ratones Balb/c
con células transformadas con el gen o fragmentos del mismo,
células endógenas o exógenas o con membranas aisladas enriquecidas
para expresión del antígeno. Se recoge suero en el momento
apropiado, típicamente después de numerosas administraciones
adicionales. Pueden ser útiles diversas técnicas de terapia de
genes, por ejemplo, para producir proteína in situ, para
generar una respuesta inmune.
Pueden fabricarse anticuerpos monoclnales. Por
ejemplo, se fusionan esplenocitos con un compañero de fusión
apropiado y se seleccionan hibridomas en medio de crecimiento por
procedimientos estándares. Se examina en sobrenadantes de
hibridomas la presencia de anticuerpos que se unen a la DAP12
humana, por ejemplo, por ELISA u otro ensayo. Pueden seleccionarse
o prepararse también anticuerpos que reconocen específicamente DAP12
humana pero no variantes de especies.
En otro método, se presentan péptidos sintéticos
o proteína purificada a un sistema inmune para generar anticuerpos
monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991)
Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y
Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring
Harbor Press. En situaciones apropiadas, el reactivo de unión está
marcado como se ha descrito antes, por ejemplo, fluorescencia o de
otro modo, o inmovilizado en un sustrato para métodos de
tratamiento en bandeja. También pueden introducirse ácidos nucleicos
en células de un animal para producir el antígeno, que sirve para
obtener una respuesta inmune. Véase, por ejemplo, Wang et
al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci.
90:4156-4160; Barry et al. (1994)
BioTchniques 16:616-619; y Xiang et
al. (1995) Immunity 2:129-135.
Se han fabricado y usado anticuerpos, como se
describe después, para ambas proteínas DAP.
Se preparan extensiones de cromosomas. Se
realiza hibridación in situ en preparaciones de cromosomas
obtenidas de linfocitos humanos estimulados con fitohemaglutinina
cultivados durante 72 h. Se añadió
5-bromodesoxiuridina durante las siete horas
finales de cultivo (60 \mug/ml de medio), para asegurar una
formación de bandas cromosómicas posthibridación de buena
calidad.
Un fragmento de PCR, multiplicado con la ayuda
de cebadores, se clona en un vector apropiado. El vector se marca
por traducción de corte con ^{3}H. La sonda radiomarcada se
hibrida a extensiones de metafase con una concentración final de
200 ng/ml de solución de hibridación como se describe en Mattei
et al. (1985) Hum. Genet.
69:327-331.
Después de revestir con emulsión de traza
nuclear (KODAK NTB_{2}), se exponen platinas. Para evitar todo
deslizamiento de granos de plata durante el procedimiento de
formación de bandas, se colorean primero las extensiones de
cromosomas con solución Giemsa tamponada y se fotografía la
metafase. Se realiza después la formación de bandas R por el método
de fluorocromo-fotolisis-Giemsa
(FPG) y se refotografían las metafases antes del análisis.
La organización genómica de DAP12 humana
consiste en 5 exones que se extienden \sim4 kb en el cromosoma
19q13.1. Los genes de KIR humanos (Baker et al. (1995)
Chromosome Research 3:511) y los LAIR relacionados (Meyaard
et al. (1997) Immunity 7:283-290, y
los genes de ILT/MIR (Wagtmann et al. (1997) Current
Biology 7:615-618) están todos situados cerca
en el cromosoma 19q13.4
La DAP12 es un homodímero unido por disulfuro,
que contiene un motivo de activación basado en tirosina
inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico, que se expresa
principalmente en células NK, monocitos y células dendríticas. Esta
molécula se asocia no covalentemente con glicoproteínas de membrana
de la familia del receptor inhibidor de células destructoras (KIR)
que carece de motivos inhibidores basados en tirosina
inmunorreceptores (ITIM) en su dominio citoplásmico. Los complejos
KIR2DS2-DAP12 de reticulación expresados en
transfectantes producen activación celular, como se demuestra por
fosforilación con tirosina de proteínas celulares y sobrerregulación
de antígenos de activación temprana. Los péptidos de DAP12
fosforilados se unen a ZAP-70 y tirosina quinasas
de proteína Syk, sugiriendo una trayectoria de activación similar a
los receptores de antígenos de células T y B.
Las células NK expresan receptores de membrana
de las superfamilias de inmunoglobulina y lectina tipo C que
reconocen MHC clase I e inhiben citotoxicidad mediada por células
NK. Estos receptores inhibidores (incluyendo KIR humano, CD94/NKG2A
humano y Ly49 de ratón) poseen ITIM en sus dominios citoplásmicos
que reclutan dominio SH2 que contienen tirosina fosfatasas de
proteína (SHP) 1 o 2, produciendo inactivación de función de
células NK. Burshtyn et al. (1996) Immunity
4:77-85; Olcese et al. (1996) J.
Immunol. 156:4531-4534; y Houchins et
al. (1997) J. Immunol. 158:3603-3609.
Ciertas isoformas de los receptores KIR, Ly49 y CD94/NKG2 carecen de
secuencias ITIM y se ha propuesto que estos receptores "no
inhibidores" pueden activar, en lugar de inhibir, la función de
células NK. Houchins et al. (1997) J. Immunol.
158:3603-3609; Biassoni et al. (1996) J.
Exp. Med. 183:645-650 y Mason et al.
(1996) J. Exp. Med. 184:2119-2128. Cuando la
molécula KIR2DS2 no inhibidora se expresó por transfección en la
leucemia basófila RBL-2H3, no se observó activación
celular cuando se ligaron los receptores, sugiriendo que estos
receptores de NK "no inhibidores" pueden carecer de propiedades
de señalización intrínsecas. Bléry et al. (1997) J. Biol.
Chem. 272:8989-8996.
\newpage
Recientemente, Olcese et al. (1997) J.
Immunol. 158:5083-5086, informaron de que una
fosfoproteína desconocida de \sim12 kD, expresada como un dímero
unido por disulfuro, se co-inmunoprecipitaba con una
glicoproteína KIR2DS2 no inhibidora de lisados de células NK.
Receptores Ig de la superficie celular, receptores antígenos de
células T (TcR) y ciertos receptores de Fc (FcR) se asocian no
covalentemente con pequeñas proteínas transmembrana (por ejemplo,
subunidades CD3\delta, \gamma, \varepsilon, \zeta,
CD79\alpha, \beta, Fc\varepsilonRI-\gamma)
que contienen secuencias ITAM (D/ExxYxxL/I-
x_{6-8}- YxxL/I; Reth (1989) Nature
338:383-384) que se requieren para transducción de
señal por estos complejos receptores. Chan et al. (1994)
Ann. Rev. Immunol. 12:555-592. Por tanto,
parece probable que estos receptores de células NK no inhibidores
podrían requerir una proteína asociada con propiedades similares
para mediar en una transducción de señal positiva.
Se investigó una base de datos de secuencias de
etiqueta expresadas (EST) de un gran panel de genotecas de cADN con
un programa de algoritmo TBLASTN para moléculas que tienen homología
con las secuencias de proteínas CD3\delta, \gamma,
\varepsilon, \zeta y Fc\varepsilonRI-\gamma
humanas. Se seleccionó una EST de una genoteca de células
dendríticas CD1+ humanas para estudio adicional en base a la
identificación de una ITAM en esta molécula. La determinación de
secuencia del cADN de 604 pb reveló un marco de lectura abierto de
339 nucleótidos, que codifica una proteína de membrana de tipo I
putativa de 113 aminoácidos (véanse SEQ ID NO: 1 y 2). La proteína,
denominada DAP12, está compuesto de un líder 27 aa, dominio
extracelular 14 aa, segmento transmembrana 24 aa y región
citoplásmica 48 aa. Aunque la DAP12 tiene menos del 25% de homología
con las proteínas CD3\delta, \gamma, \varepsilon, \zeta y
Fc\varepsilonRI-\gamma humanas, el dominio
citoplásmico contiene el péptido,
E SP Y QELQGQRSDV Y SDL
(véase SEQ ID NO: 2), que corresponde precisamente con la secuencia
de consenso de ITAM prototipo. También están presentes en la región
citoplásmica de DAP12 lugares potenciales para fosforilación por
proteína quinasa C (residuos 79-81 y
107-109) y caseína quinasa II (residuos
85-88). La región transmembrana contiene un
aminoácido cargado (D), conservado también en el dominio
transmembrana de las subunidades CD3. Un homólogo de ratón
potencial de DAP12 es \sim70% homólogo con la proteína DAP12
humana y tiene un residuo D conservado en la región transmembrana,
residuos C conservados en el dominio extracelular y un ITAM en la
región citoplásmica.
Un aspecto que llama la atención de los
receptores no inhibidores KIR (Biassoni et al. (1996) J.
Exp. Med. 183:645-650), Ly49D y Ly49H (Mason
et al. (1996) J. Exp. Med.
184:2119-2128), CD94 (Chang et al. (1995)
Eur. J. Immunol. 25:2433-2437), NKG2C y
NKG2E (Houchins et al. (1991) J. Exp. Med.
173:1017-1020) e ILT1 (Samaridis y Colonna (1997)
Eur. J. Immunol. 27:660-665) es la presencia
de un aminoácido básico (K o R) en el dominio transmembrana. Dado
el precedente para interacciones entre proteínas de complejos
receptores multi-subunidades mediante aminoácidos
cargados opuestamente en los dominios transmembrana, por ejemplo, el
complejo CD3/TcR (Chan et al. (1994) Ann. Rev.
Immunol. 12:555-592), se examinó si DAP12 se
asocia con la glicoproteína KIR2DS2 no inhibidora que contiene una
K en la región transmembrana (Colonna y Samaridis (1995)
Science 268:405-408). El linaje celular
Ba/F3 pre-B de ratón se transfectó con un cADN que
codifica KIR2DS2 solo o junto con un cADN de DAP12 que contiene una
etiqueta de epítope FLAG en el término N para permitir la detección
con un mAb anti-FLAG. Se seleccionaron
transfectantes por citometría de flujo para expresión en la
superficie celular basado en coloración positiva con mAb
anti-MIR DX27 o mAb anti-FLAG M2.
Los transfectantes KIR2DS2 Ba/F3 y KIR2DS2 +
DAP12-FLAG Ba/F3 se marcaron en superficie con
^{125}I, se lisaron en 1% de digitonina para preservar
asociaciones no covalentes de complejos de proteína de membrana y se
inmunoprecipitaron con mAb anti-KIR o mAb
anti-FLAG. El residuo de tirosina en el epítope FLAG
proporcionó un lugar para radioyodación, permitiendo la
visualización de la proteína DAP12. El mAb anti-KIR
inmunoprecipitó una especie marcada con ^{125}I de
\sim50-60 kD de las células KIR2DS2 Ba/F3 y los
transfectantes KIR2DS2 + DAP12-FLAG Ba/F3,
consecuente con el peso molecular predicho de la glicoproteína
KIR2DS2. Una proteína marcada con ^{125}I adicional de \sim12 kD
se co-inmunoprecipitó con mAb
anti-KIR del transfectante KIR2DS2 +
DAP12-FLAG, pero no del transfectante que expresa
sólo KIR2DS2. Recíprocamente, una glicoproteína marcada con
^{125}I que migra idéntica a KIR2DS2 se
co-inmunoprecipitó con mAb anti-FLAG
de las células KIR2DS2 + DAP12-FLAG Ba/F3, pero no
del transfectante KIR2DS2 único. La comparación de
inmunoprecipitados analizados por SDS-PAGE usando
condiciones reductoras o no reductoras indican que DAP12 se expresa
en la superficie celular como un dímero unido por disulfuro. Debe
señalarse que se fue incapaz de detectar expresión en la superficie
celular de DAP12 en la superficie de células Ba/F3 transfectadas
con el cADN de DAP12-FLAG solo, sin KIR2DS2. Sin
embargo, se detectaron proteínas DAP12-FLAG en el
citoplasma, sugiriendo que DAP12 puede requerir asociación con sus
subunidades compañeras para un transporte eficaz a la superficie
celular, similar a la situación con las proteínas CD3 (Clevers et
al. (1989) Ann. Rev. Immunol.
6:629-662). Adicionalmente, los resultados
preliminares indicaron que la DAP12 no se asocia con las isoformas
KIR inhibidoras que carecen de un residuo cargado en su dominio
transmembrana.
Un péptido correspondiente al dominio
citoplásmico de DAP12 (ITETESPY*QELQGQRSDVY*SDLNTQRP; véase SEQ ID
NO: 2) se sintetizó como una proteína no fosforilada o que contiene
fosfatos en ambos residuos Y. Se incubaron lisados de células
Jurkat T o clon A6 de células NK con los péptidos biotinados y se
precipitaron complejos usando avidina-agarosa. El
análisis de manchas de Western demostró que un péptido de DAP12
fosforilado en ambos residuos Y, pero no el péptido no fosforilado,
formaba complejos con la ZAP-70 quinasa. El péptido
de DAP12 fosforilado con tirosina, pero no el péptido de DAP12 no
fosforilado, formaba también un complejo con la proteína Syk
tirosina quinasa en lisados de células NK. La unión de estas
quinasas a DAP12 fosforilada recuerda destacadamente las
interacciones que se han demostrado entre las subunidades de CD3 que
contienen ITAM fosforiladas y Syk de ZAP-70
quinasas durante señalización de TcR. Iwashima et al. (1994)
Science 263:1136-1139; y Chan et al.
(1994) J. Immunol. 152:4758-4766.
La ligación del complejo CD3/TcR en células T o
el complejo receptor de Ig en células B produjo activación celular.
Por tanto, se emprendieron estudios para examinar la consecuencia
funcional de reticulación del complejo
KIR2DS2-DAP12. Se incubaron con mAb
anti-KIR DX27 o mAb anti-FLAG,
seguido por una Ig anti-ratón de cabra,
transfectantes de Ba/F3 que expresan KIR2DS2 solo o el complejo
KIR2DS2-DAP12-FLAG, para
proporcionar reticulación. El examen de las proteínas celulares
totales en células Ba/F3 que expresan el complejo
KIR2DS2-DAP12-FLAG que se
estimularon con mAb anti-KIR o
anti-FLAG revelaron fosforilación con tirosina de
varios sustratos celulares. La inmunoprecipìtación con mAb
anti-FLAG y el análisis de manchas de Western con
mAb anti-fosfotirosina demostraron que la
reticulación de los transfectantes de
KIR2DS2-DAP12-FLAG con mAb
anti-KIR indujo fosforilación con tirosina de la
proteína DAP12 y produjo la asociación de DAP12 fosforilada con la
proteína Syk tirosina quinasa. Como contraste, las células Ba/F3
que expresan sólo KIR2DS2 no se activaron por reticulación con mAb
anti-KIR. De modo similar, se observó
sobrerregulación de la expresión de CD69 en células de leucemia
Jurkat T transfectadas con KIR2DS2 y DAP12, pero no KIR2DS2 solo,
cuando se reticulan estos receptores con mAb
anti-KIR. Estos resultados indican que DAP12 es
necesaria y responsable de transducción de señal de KIR2DS2 en estas
células hospedantes y están demostrando, según observaciones
anteriores, que las moléculas KIR2DS2 son funcionales en células
NK, pero no en transfectantes que expresan sólo KIR2DS2. Bléry et
al. (1997) J. Biol. Chem.
272:8989-8996.
Estos estudios sugieren que la DAP12 puede
asociarse con las isoformas no inhibidoras de las moléculas KIR en
células NK y permite activación celular mediante estos receptores,
similar a la función de las subunidades CD3 en el complejo TcR y
las subunidades CD79 en el complejo receptor de células B. La
expresión de DAP12 en monocitos y células dendríticas predice una
asociación con otros receptores similar al KIR no inhibidor
presente en estos tipos de células. Son candidatos probables la
familia ILT/MIR identificada recientemente de moléculas expresadas
por monocitos humanos (Wagtmann et al. (1997) Current
Biology 7:615-618; y Samaridis y Colonna (1997)
Eur. J. Immunol. 27:660-665) y las moléculas
PIR-A en mieloide y células B de roedor (Hayami
et al. (1997) J. Biol. Chem.
272:7320-7327; y Kubagawa et al. (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5261-5266).
Además, las propiedades físicas de DAP12 son similares a una nueva
fosfoproteína dímera de 12 kD identificada en el complejo receptor
de células pre-T en timocitos de ratón. Takase et
al. (1997) J. Immunol. 159:741-747. Así,
la DAP12 puede funcionar en activación celular mediada por una serie
diversa de receptores en distintos linajes celulares.
Se hicieron investigaciones TBLASTN de las bases
de datos de la secuencia DNAX usando las secuencias de proteínas
CD3\delta, \gamma, \varepsilon, \zeta y
Fc\varepsilonRI-\gamma humanas. El inserto de
cADN en el plásmido LL603, identificado en una genoteca de células
dendríticas CD1+ humanas, se aisló y sometió a determinación de
secuencia automatizada (ABI).
Se compraron a Clontech (Palo Alto, CA) ARN de
tejidos humanos y ADN genómico humano. Se realizaron análisis de
manchas de Northern y Southern como se ha descrito. Chang et
al. (1995) Eur. J. Immunol.
25:2433-2437.
Un cADN que contenía el segmento líder CD8,
seguido por el epítope de péptido FLAG, y unido a los segmentos
extracelular, transmembrana y citoplásmico de DAP12 se subclonó en
el vector retrovírico pMX-puro (Onihsi et
al. (1996) Exp. Hematology 24:324-329;
proporcionado generosamente por el Dr. T. Kitamura, DNAX),
empaquetado usando el linaje celular Phoenix (proporcionado
amablemente por el Dr. G. Nolan, Stanford), y se usó el virus para
infectar el linaje celular pre-B de ratón Ba/F3
(Onihsi et al. (1996) Exp. Hematology
24:324-329). El cADN de NKAT5 (Colonna y Samaridis
(1995) Science 268:405-408) que codifica
KIR2DS2 (proporcionado amablemente por el Dr. M. Colonna, Basel) se
subclonó en el vector retrovírico pMX-neo. Se
infectaron células Ba/F3, se seleccionaron fármacos y se aislaron
transfectantes usando citometría de flujo. Onihsi et al.
(1996) Exp. Hematology 24:324-329. Se
subclonó cADN de DAP12 en el vector pEF-BOS para
expresión transitoria en células Jurkat usando electroporación para
introducir el plásmido. Wu et al. (1995) Mol. Cell.
Biol. 15:4337-4346.
Se marcaron células con ^{125}I y se
solubilizaron en tampón de lisis (pH 7,8, 1% de digitonina (Sigma),
0,12% de Triton-X100, NaCl 150 mM, trietanolamina 20
mM, 0,01% de NaN_{3} e inhibidores de proteasa). Lanier et
al. (1989) Nature 342:803-805. Se
incubaron lisados de células en hielo durante 2 h con Pansorbin
(Calbiochem) revestido con Ig anti-ratón de conejo
(Sigma) y mAb anti-KIR2D de ratón DX27, mAb
anti-FLAG M2 (Kodak) o IgG testigo y se lavó
después en solución salina tamponada con Tris (TBS, Tris 50 mM,
NaCl 150 mM, pH 8,0) que contenía CHAPS 5 mM (Sigma) e inhibidores
de proteasa. Lanier et al. (1989) Nature
342:803-805. Se sintetizaron péptidos biotinados
correspondientes a residuos ITETESPY*QELQGQRSDVY*SDLNTQRP en el
dominio citoplásmico de DAP12 (véase SEQ ID NO: 2), no fosforilados
o que contenían fosfato en ambos residuos Y (proporcionados
generosamente por el Dr. C. Turck, UCSF). Los péptidos no
fosforilado testigo y CD\cdot\zeta Y-fosforilado
(Iwashima et al. (1994) Science
263:1136-1139) fueron un regalo del Dr. A. Weiss
(UCSF). Se incubaron péptidos biotinados con lisados de células
Jurkat o clon de NK A6, se precipitaron con
avidina-agarosa y se lavaron en solución salina
tamponada con Tris (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8) que contenía
1% de NP-40 e inhibidores de proteasa (Iwashima
et al. (1994) Science 263:1136-1139).
Se analizaron inmunoprecipitados por manchas de Western (Phillips
et al. (1996) Immunity 5:163-172)
usando mAb anti-ZAP-70 o antisuero
específico anti-Syk de conejo (Iwashima et
al. (1994) Science 263:1136-1139;
proporcionado amablemente por Art Weiss, UCSF).
Se incubaron células Ba/F3 que expresan KIR2DS2
solo, DAP12 (etiquetado con epítope FLAG) solo o el complejo
KIR2DS2-DAP12 con los mAbs indicados a 4ºC, se
lavaron y se reticularon después con Ig anti-ratón
de cabra F(ab')_{2} durante 3 min a 37ºC. Se lisaron
células en TBS que contenía 1% de NP-40 e
inhibidores de proteasa. Los lisados de células totales o
inmunoprecipitados de DAP2-FLAG con mAb
anti-FLAG M2 se analizaron por manchas de Western
usando mAb anti-fosfotirosina conjugado con HRP 4G10
(UBI). Células Jurkat transfectadas establemente con el cADN de
NKAT5 (Colonna y Samaridis (1995) Science
268:405-408) usando un vector retrovírico (Onihsi
et al. (1996) Exp. Hematology
24:324-329) se transfectaron transitoriamente por
electroporación con cADN de DAP12 humano en el vector
pEF-BOS o transfectado simuladamente con un vector
testigo. Wu et al. (1995) Mol. Cell. Biol.
15:4337-4346. Después de 24 horas, se incubaron los
transfectantes en placas de microtitulación
pre-revestidas (5 \mug/ml) con Ig testigo o mAb
anti-KIR DX27. Después de 12 h de incubación, se
cosecharon transfectantes y se colorearon después con
anti-CD69 conjugado con FITC o mAb testigo y se
analizaron por citometría de flujo. Lanier y Recktenewald (1991)
Methods: A Companion to Methods in Enzymology
2:192-199.
Aunque los receptores de células NK inhibidores
para MHC Clase I expresan Motivos Inhibidores basados en Tirosina
Inmunorreceptores (ITIM) que reclutan tirosina fosfatasas
intracelulares e impiden la función efectora de células NK, los
receptores de células NK activadores carecen de secuencias
intrínsecas requeridas para estimulación celular. El CD94/NKG2C, un
receptor de células NK activador de la superfamilia de lectina tipo
C que se une a HLA-E, se asocia no covalentemente
con DAP12, un receptor de membrana que contiene un Motivo Activador
basado en Tirosina Inmunorreceptor (ITAM). La expresión eficaz de
CD94/NKG2C en la superficie celular requiere la presencia de DAP12
y son necesarios residuos cargados en los dominios transmembrana de
DAP12 y NKG2C para esta interacción. Estos resultados proporcionan
una base molecular para el conjunto de receptores de células NK
para MHC clase I implicados en activación e inhibición celular.
Las células NK son linfocitos que participan en
respuestas inmunes innatas contra ciertas bacterias, parásitos y
virus (analizado en Scott y Trinchieri (1995) Current Opinion
Immunol. 7:34-40; Trinchieri (1989) Adv.
Immunol. 47:187-376). No está claro cómo las
células NK reconocen organismos patógenos; sin embargo, un aspecto
de este proceso puede implicar la detección y eliminación de
células hospedantes que han perdido o sub-regulado
la expresión de MHC clase I como consecuencia de una infección. Las
células NK expresan receptores para MHC clase I que pueden activar
o inhibir la citotoxicidad mediada por células y la producción de
citoquina (analizado en Lanier, (1998) Cell
92:705-707; Lanier, (1998) Ann. Rev. Immunol.
16:359-393). Se han identificado varios tipos de
receptores de células NK para MHC clase I (Lanier, (1998)
Cell 92:705-707). En seres humanos, los
Receptores Inhibidores de Células Destructoras (KIR) comprenden una
pequeña familia de moléculas codificadas por genes de la
superfamilia de Ig (Colonna y Samaridis (1995) Science
268:405-408; D'Andrea et al. (1995) J.
Immunol. 155:2306-2310; Wagtmann et al.
(1995) Immunity 2:439-449). Dentro de la
familia KIR, ciertas isoformas poseen dos dominios de Ig (KIR2D) o
tres dominios de Ig (KIR3D) en la región extracelular que están
implicados en el reconocimiento de ligandos HLA-C o
HLA-B polimóficos, respectivamente (Dohring y
Colonna (1996) Eur. J. Immunol. 26:365-369;
Fan et al. (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
93:7178-7183; Litwin et al. (1994) J.
Exp. Med. 180:537-543; Rajagopalan y Long (1997)
J. Exp. Med. 185:1523-1528; Rojo et
al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:568-571;
y Wagtmann et al. (1995) Immunity
3:801-809). También existe heterogeneidad en los
dominios transmembrana y citoplásmico de diferentes moléculas de
KIR. Por unión de ligando, KIR que tienen ITIM en su dominio
citoplásmico (denominados KIR2DL y KIR3DL) reclutan
SHP-1 e impiden la función efectora de células NK
(Burshtyn et al. (1996) Immunity
4:77-85; Campbell et al. (1996) J. Exp.
Med. 184:93-100; Fry et al. (1996) J.
Exp. Med. 184:295-300; y Olcese et al.
(1996) J. Immunol. 156:4531-4534). Como
contraste, las isoformas de KIR que carecen de ITIM y que tienen un
aminoácido K básico en la transmembrana (KIR2DS y KIR3DS) han sido
implicadas en la activación de células NK (Biassoni et al.
(1996) J. Exp. Med. 183:645-650; Olcese et
al. (1997) J. Immunol. 158:5083-5086).
Las KIR2DS están asociadas no covalentemente con la molécula
adaptadora que lleva ITAM, DAP12, que se expresa en la superficie
de células NK como un homodímero unido por disulfuro (Campbell et
al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:599-609;
Lanier (1998) Cell 92:705-707; Olcese et
al. (1997) J. Immunol. 158:5083-5086. Por
reticulación de KIR2DS, los residuos de tirosina en el ITAM de
DAP12 resultan fosforilados y reclutan ZAP-70 o Syk,
produciendo activación celular (Lanier (1998) Cell
92:705-707). La DAP12 humana está presente en el
cromosoma humano 19q13.1 cerca de la familia del gen de KIR (Baker
et al. (1995) Chromosome Research 3:511), demostrando
un enlace genético entre KIR y
DAP12.
DAP12.
Otro tipo de receptor de células NK, CD94/NKG2,
es un heterodímero compuesto por una glicoproteína CD94 invariante
que se une por disulfuro a una glicoproteína NKG2A o NKG2C (Brooks
et al. (1997) J. Exp. Med.
185:795-800; Carretero et al. (1997) Eur.
J. Immunol. 27:563-575; Lazetic et al.
(1996) J. Immunol. 157:4741-4745). CD94
(Chang et al. (1995) Eur. J. Immunol.
25:2433-2437) y cuatro genes de NKG2 (NKG2A, NKG2C,
NKG2E y NKG2D/F; Houchins et al. (1991) J. Immunol.
158:3603-3609; y Plougastel y Trowsdale (1997)
Eur. J. Immunol. 27:2835-2839) son todos
miembros de la superfamilia de lectina tipo C y están estrechamente
enlazados en el cromosoma humano 12p12-p13 en el
"complejo NK" (Renedo et al (1997) Immunogenetics
46:307-311). Los homólogos de roedor de los genes
CD94 y NKG2 están situados en el "complejo NK" en cromosomas de
ratón y rata sinténicos con el cromosoma humano 12 (Berg et
al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:444-450;
Dissen et al. (1997) Eur. J. Immunol.
27:2080-2086; y Vance et al. (1997) Eur.
J. Immunol. 27:3236-3241).
Anticuerpos contra CD94 pueden activar o inhibir
la citotoxicidad mediada por células NK contra objetivos que llevan
receptor de Fc y diferentes clones de células NK aislados de un
individuo simple demuestran comportamiento heterogéneo en estos
ensayos funcionales (Brumbaugh et al. (1996) J.
Immunol. 157:2804-2812;
Pérez-Villar et al. (1996) J.
Immunol. 157:5367-5374; y
Pérez-Villar et al. (1995) J. Immunol.
154:5779-5788). Este fenómeno se explicó por el
hallazgo de que CD94 forma heterodímeros enlazados por disulfuro con
NKG2A o NKG2C (Brooks et al. (1997) J. Exp. Med.
185:795-800; Cantoni et al. (1998) Eur. J.
Immunol. 28:327-338; Carretero et al.
(1997); y Lazetic et al. (1996) J. Immunol.
157:4741-4745). NKG2A contiene una secuencia de ITIM
en el dominio citoplásmico que, por ligación de receptor, resulta
fosforilado con tirosina y recluta SHP-1 o
SHP-2, que a su vez inhiben la función efectora de
NK (Houchins et al. (1997) J. Immunol.
158:3603-3609; y Le Drean et al. (1998)
Eur. J. Immunol. 28:264-276). Como contraste,
NKG2C carece de un ITIM y la ligación de receptor produce
activación de células NK (Cantoni et al. (1998) Eur. J.
Immunol. 28:327-338; y Houchins et al.
(1997) J. Immunol. 158:3603-3609). Es
necesario CD94 para transportar NKG2A y NKG2C a la superficie
celular (Lazetic et al. (1996) J. Immunol.
157:4741-4745). Dentro de la población de células NK
en un individuo, se expresan receptores CD94/NKG2A y CD94/NKG2C en
subpoblaciones que se solapan y algunas células NK pueden expresar
proteínas CD94 que no están asociadas con NKG2A o NKG2C (Cantoni
et al. (1998) Eur. J. Immunol.
28:327-338). Así, CD94 y las proteínas NKG2 pueden
formar un repertorio receptor diverso en un individuo. Los
receptores CD94/NKG2A y CD94/NKG2C reconocen HLA-E
(Borrego et al. (1998) J.Exp. Med.
187:813-818; Braud et al. (1998) J.
Immunol. 159:5192-5196), una molécula de MHC
clase I no clásica que tiene la propiedad única de unir péptidos de
9 aminoácidos derivados de los segmentos líderes de otras proteínas
de HLA clase I clásicas (Braud et al. (1997) Eur. J.
Immunol. 27:1164-1169). Mientras que el ITIM en
NKG2A explica la función inhibidora del receptor CD94/NKG2A, ni
CD94 ni NKG2C poseen secuencias en sus dominios citoplásmicos que
proporcionen capacidad de señalización intrínseca. Sin embargo, la
existencia de un aminoácido básico en la transmembrana de NKG2C
sugirió posibles interacciones con el receptor de DAP12.
Para determinar si DAP12 podía asociarse con el
complejo receptor CD94/NKG2C activador, un linaje celular
pre-B de ratón, Ba/F3, se co-infectó
con retrovirus ecotrópicos que codifican CD94, NKG2C y DAP12 humanos
(que contienen un epítope FLAG en el término N para permitir
detección en la superficie celular). En consecuencia con resultados
anteriores (Lanier (1998) Cell 92:705-707),
la transfección de FLAG-DAP12 solo en células Ba/F3
no permite expresión en la superficie celular de este receptor,
aunque se detectaron proteínas FLAG-DAP12 en el
citoplasma de estos transfectantes determinado por coloración
citoplásmica y análisis de manchas de Western. De modo similar, la
expresión en la superficie celular de NKG2C solo en células Ba/F3 o
en transfectantes FLAG-DAP12+ Ba/F3
co-infectados con NKG2C no podía detectarse. Como
contraste, CD94 solo se expresaba en la superficie celular de
células Ba/F3. Sin embargo, CD94 no es competente para transportar
FLAG-DAP12 a la superficie celular en células Ba/F3
co-infectadas con CD94 y FLAG-DAP12,
aunque se detectó FLAG-DAP12 en el citoplasma de
estos transfectantes por manchas de Western e inmunofluorescencia
citoplásmica. Además, cuando se infectaron células CD94+ Ba/F3 con
un retrovirus que codifica NKG2C, no se detectaron heterodímeros
CD94/NKG2C en la superficie celular, usando un antisuero que
detecta el complejo CD94/NKG2C (Braud et al. (1998) J.
Immunol. 159:5192-5196; Lazetic et al.
(1996) J. Immunol. 157:4741-4745) (aunque es
posible obtener bajos niveles de expresión superficial de
heterodímeros CD94/NKG2C usando vectores episómicos que contienen
promotores fuertes en sistemas de transfección altamente eficaces
tales como células 293T; Braud et al. (1998) J.
Immunol. 159:5192-5196; Lazetic et al.
(1996) J. Immunol. 157:4741-4745). Cuando se
infectaron células Ba/F3 con retrovirus que codifican CD94, NKG2C y
FLAG-DAP12 humanos, se detectó la expresión de
FLAG-DAP12 y un receptor CD94/NKG2C en la superficie
celular de los transfectantes CD94/NKG2C/DAP12. Colectivamente,
estos experimentos soportan la existencia de un complejo receptor
multi-subunidades compuesto por CD94, NKG2C y
DAP12.
Se marcaron con ^{125}I transfectantes de
Ba/F3 que expresan CD94, NKG2C y FLAG-DAP12, se
solubilizaron en detergente de digitonina para conservar complejos
receptores de membrana no covalentes (Lanier et al. (1989)
Nature 342:803-805) y se inmunoprecipitaron
con anticuerpos contra CD94 o FLAG humanos. La inmunoprecipitación
con anti-CD94 de los transfectantes de Ba/F3
CD94/NKG2C/FLAG-DAP12 reveló proteínas marcadas con
^{125}I consecuentes con la movilidad predicha de NKG2C y
FLAG-DAP12. Se ha informado previamente de que CD94
humano no se marca eficazmente con ^{125}I (Lazetic et al.
(1996) J. Immunol. 157:4741-4745; Phillips
et al. (1996) Immunity 5:163-172), de
modo que la subunidad radiomarcada de \sim40 kD inmunoprecipitada
con mAb anti-CD94 representa una glicoproteína de
NKG2C que está unida por disulfuro a CD94 (Lazetic et al.
(1996) J. Immunol. 157:4741-4745). Cuando se
analizó usando condiciones no reductoras, FLAG-DAP12
migró principalmente como un homodímero unido por disulfuro y la
movilidad de NKG2C era consecuente con la existencia de un
heterodímero de CD94/NKG2C. Por tanto, parece que el complejo
receptor CD94/NKG2C-DAP12 mínimo puede ser un
tetrámero constituido por un homodímero de DAP12 enlazado por
disulfuro asociado no covalentemente con un heterodímero de
CD94/NKG2C enlazado por disulfuro.
El papel de aminoácidos cargados en la
transmembrana de receptores KIR, NKG2 y DAP12 en el conjunto de los
complejos multi-subunidades.
Las proteínas de NKG2A y NKG2C demuestran un 75%
de identidad de aminoácidos (Houchins et al. (1991) J.
Immunol. 158:3603-3609) y ambos receptores
CD94/NKG2A y CD94/NKG2C se unen a un ligando común,
HLA-E (Braud et al. (1998) J.
Immunol. 159:5192-5196). Una diferencia visible
entre NKG2A y NKG2C es la presencia de un residuo básico en la
transmembrana de NKG2C que está ausente en NKG2A y CD94. Como
contraste con NKG2C, la infección de células CD94+ Ba/F3 con un
retrovirus que codifica NKG2A humano permite la expresión de un
complejo CD94/NKG2A en la superficie celular en ausencia de DAP12.
La presencia de un complejo CD94/NKG2A en células Ba/F3 no permite
la expresión de FLAG-DAP12 en la superficie celular,
aunque se detectaron proteínas de FLAG-DAP12 en el
citoplasma de estos transfectantes por inmunofluorescencia y
análisis de manchas de Western.
Puesto que se ha mostrado que otros receptores
de membrana multi-subunidades se asocian mediante
puentes de sal formados por aminoácidos ácidos y básicos en sus
transmembranas (por ejemplo, CD3/TcR (Bonifacino et al.
(1991) EMBO J. 10:2783-2793; Cosson et
al. (1991) Nature 351:414-416; Morley
et al. (1988) J. Exp. Med.
168:1971-1978), se examinó el requisito del residuo
D en DAP12 para asociación con CD94/NKG2C. El residuo D en
FLAG-DAP12 se convirtió en A por mutagénesis
dirigida por el lugar y este receptor mutante se transfectó en
células Ba/F3. A diferencia del FLAG-DAP12 de tipo
natural, el receptor mutante FLAG-DAP12
transmembrana D-A se expresó en la superficie
celular en ausencia de otras subunidades, indicando que el residuo D
en la transmembrana sirve como señal de retención para DAP12,
similar a la función de residuos cargados en la transmembrana de las
proteínas CD3 (Bonifacino et al. (1991) EMBO J.
10:2783-2793; Cosson et al. (1991)
Nature 351:414-416). Como se ha indicado
previamente, las células Ba/F3 transfectadas con CD94 y NKG2C no
expresan eficazmente un heterodímero CD94/NKG2C en la superficie
celular en ausencia de DAP12. La infección de estos transfectantes
CD94/NKG2C+ Ba/F3 con el receptor mutante
FLAG-DAP12 transmembrana D-A no
permitía la expresión eficaz de CD94/NKG2C en la superficie
celular, como se indica por la reactividad marginal de estas células
con un antisuero específico anti-CD94/NKG2 (aunque
se detectaron proteínas NKG2C en el citoplasma del transfectante por
análisis de manchas de Western).
La comparación de los dominios transmembrana de
NKG2A y NKG2C indica la presencia de un residuo K en NKG2C,
sugiriendo que este residuo puede ser responsable de interacción con
el residuo D en DAP12. Por tanto, el K en NKG2C se convirtió en L
por mutagénesis dirigida por el lugar y el mutante NKG2C
transmembrana K-L se transfectó en células Ba/F3
que expresan DAP12 y CD94. Se co-transfectaron
células Ba/F3 con CD94 y el mutante NKG2C transmembrana
K-L expresado no permitió expresión superficial de
FLAG-DAP12, aunque se detectó DAP12 en el
citoplasma por análisis de manchas de Western. Se detectaron muy
bajos niveles de receptor mutante NKG2C transmembrana
CD94/K-L en la superficie de estos transfectantes
usando un antisuero anti-CD94/MKG2C. Aunque el
residuo K en la transmembrana de NKG2C podría servir como señal de
retención, debe indicarse que NKG2C expresa también el motivo
DxxxLL, que también está presente en CD3\gamma y se ha implicado
en la degradación, transporte y localización de proteínas CD3
(Dietrich et al. (1994) EMBO J.
13:2156-2166; Dietrich et al. (1997) J.
Cell Biol. 138:271-281; Dietrich et al.
(1996) J. Cell Biol. 132:299-310; Letourneur
y Klausner (1992) Cell 69:1143-1157) y en la
unión de Proteína Adaptadora-1
(AP-1) y Proteína Adaptadora-2
(AP-2; Dietrich et al. (1997) J. Cell
Biol. 138:271-281).
La ligación de KIR2DS2 en transfectantes que
expresan complejos KIR2DS2/DAP12 produce la fosforilación con
tirosina de DAP12 y otros sustratos celulares y la asociación de
DAP12 fosforilada con Syk (Lanier (1998) Cell
92:705-707). La ligación de CD94 o
FLAG-DAP12 en transfectantes de Ba/F3 que expresan
complejos CD94/NKG2C/DAP12 causó fosforilación con tirosina de
numerosas proteínas celulares, incluyendo DAP12 y Syk. Estos
resultados indican que la reticulación de CD94/NKG2C induce
activación celular, presumiblemente mediante DAP12. No se trató si
la ligación de CD94/NKG2C en ausencia de DAP12 o en transfectantes
que expresan el mutante FLAG-DAP12 transmembrana
D-A tiene consecuencias funcionales porque
CD94/NKG2C no se expresaba eficazmente en ausencia de DAP12 de tipo
natural.
A diferencia de CD94/NKG2C, las moléculas de
KIR2DS2 se expresan en la superficie celular en ausencia de DAP12,
aunque son incapaces de inducir activación celular (Bléry et
al. (1997) J.Biol. Chem. 272:8989-8996;
Lanier et al. (1998) Nature
391:703-707). Se infectaron células KIR2DS2+ Ba/F3
con retrovirus que codifican FLAG-DAP12 de tipo
natural o el receptor mutante FLAG-DAP12
transmembrana D-A. KIR2DS2 y la proteína DAP12
mutante se expresaron en la superficie celular. Sin embargo, la
proteína mutante FLAG-DAP12 transmembrana
D-A no se co-inmunoprecipitó con
KIR2DS2 partir de transfectantes marcados con ^{125}I. Además, la
ligación con mAb anti-KIR no consiguió activar
estas células, mientras que la reticulación directa del receptor
mutante FLAG-DAP12 transmembrana
D-A con mAb anti-FLAG indujo
fosforilación con tirosina de proteínas celulares. Como NKG2A y
NKG2C, la proteína de KIR2DS2 tiene una contrapartida, KIR2DL2, que
carece de un aminoácido cargado en la transmembrana y contiene un
ITIM en su dominio citoplásmico. Se ha indicado previamente que
KIR2DL2 es incapaz de asociarse con DAP12 (Lanier et al.
(1998) Nature 391:703-707). Colectivamente,
estos hallazgos indican que la asociación de DAP12 con KIR2DS2 o
complejos CD94/NKG2C resulta probablemente de interacciones que
implican los dominios transmembrana de estas proteínas.
No se ha determinado la estequiometría de DAP12
y KIR2DS2 o CD94/NKG2C en estos complejos. Un homodímero enlazado
por disulfuro de DAP12 posee dos residuos D (es decir, uno en cada
proteína DAP12) que podrían interactuar con los residuos K
presentes en las transmembranas de KIR2DS2 o NKG2C. Puesto que CD94
carece de residuos cargados en la transmembrana, DAP12 puede ser
capaz de funcionar como un adaptador permitiendo la asociación de
dos monómeros KIR2DS2 o dos heterodímeros CD94/NKG2C con un
homodímero DAP12 simple.
Los receptores CD94/NKG2C se han implicado
previamente en activación de células NK (Cantoni et al.
(1998) Eur. J. Immunol. 28:327-338; Houchins
et al. (1997) J. Immunol.
158:3603-3609). Se seleccionaron un clon de células
NK y un linaje celular de NK policlonal en base a su capacidad para
mediar en la citotoxicidad redirigida contra célula objetivo P815
que lleva receptor de Fc en presencia de mAb
anti-CD94, sugiriendo la presencia de un complejo
receptor asociado con CD94 activador, probablemente CD94/NKG2C
(Cantoni et al. (1998) Eur. J. Immunol.
28:327-338). El clon de células NK y el linaje
celular de NK policlonal se marcaron con ^{125}I, se lisaron en
detergente de digitonina para conservar complejos receptores
multi-subunidades y se
co-inmunoprecipitaron proteínas asociadas con DAP12
usando un antisuero anti-DAP12. Las proteínas
asociadas con DAP12 se eluyeron con un tampón de pH 11,5 para
disociar los complejos y se re-inmunoprecipitaron
después las proteínas eluídas con un mAb testigo o mAb
anti-CD94. Para el linaje celular de NK policlonal,
mAb anti-CD94 reaccionó específicamente con una
^{125}I proteína eluída del inmunoprecipitado
anti-DAP12 inicial. Por análisis de
SDS-PAGE, esta molécula migró a \sim70 kD en
condiciones no reductoras y \sim40 kD en condiciones reductoras.
Se obtuvieron resultados equivalentes usando el clon de células NK.
Puesto que la propia CD94 no se marca con ^{125}I (Lazetic et
al. (1996) J. Immunol. 157:4741-4745;
Phillips et al. (1996) Immunity
5:163-172), parece probable que la proteína marcada
con ^{125}I asociada con CD94 represente NKG2C, aunque no están
disponibles para confirmar esto reactivos serológicos específicos
para NKG2C. No obstante, estos hallazgos demuestran la existencia de
un complejo receptor CD94/DAP12 en la superficie celular de células
NK humanas.
La familia de genes KIR codifica receptores que
se han implicado en activación o inhibición celular (Biassoni et
al. (1996) J. Exp. Med. 183:645-650;
Olcese et al. (1997) J. Immunol.
158:5083-5086). Los receptores inhibidores
contienen secuencias ITIM en sus dominios citoplásmicos y carecen de
residuos cargados en los segmentos transmembrana, mientras que los
receptores activadores carecen de ITIM, tienen a menudo regiones
citoplásmicas más cortas y poseen un aminoácido cargado en la
transmembrana. Esta estrategia general también es evidente en las
familias de genes de NKG2 (Houchins et al. (1991) J.
Immunol. 158:3603-3609), Ly49 (Smith et
al. (1994) J. Immunol. 153:1068-1079),
PIR (Hayami et al. (1997) J. Biol. Chem.
272:7320-7327; Kubagawa et al. (1997)
Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:5261-5266) e
ILT (LIR) (Borges et al. (1997) J. Immunol.
159:5192-5196; Samaridis y Colonna (1997) Eur.
J. Immunol. 27:660-665), que incluyen todas
receptores potencialmente inhibidores y activadores.
Se ha mostrado aquí que DAP12 se asocia con las
isoformas activadoras de los receptores KIR y CD94/NKG2. Los
receptores CD94/NKG2A inhibidor y CD94/NKG2C activador se unen ambos
al mismo ligando, HLA-E (Braud et al. (1998)
J. Immunol. 159:5192-5196). ¿Cuál es la razón
biológica de receptores inhibidor y activador pareados que
reconocen MHC clase I?. El complejo receptor CD94/NKG2C/DAP12
activador puede funcionar para estimular tirosina quinasas que
fosforilan las secuencias ITIM en el receptor NKG2A inhibidor,
produciendo el reclutamiento de SHP-1 o
SHP-2 (Le Drean et al. (1998) Eur. J.
Immunol. 28:264-276). Sin embargo, esto parece
improbable porque NKG2A y NKG2C se expresan diferencialmente dentro
de la población de células NK total y sólo un subgrupo de células
NK expresa ambos receptores (Cantoni et al. (1998) Eur. J.
Immunol. 28:327-338; y Houchins et al.
(1997) J. Immunol. 158:3603-3609). La
existencia de células NK que expresan CD94/NKG2C, en ausencia del
receptor CD94/NKG2A inhibidor, proporciona el potencial para
activar estas células encontrándose con HLA-E.
HLA-E se expresa extensamente en tejidos normales
(Geraghty et al. (1992) Proc. Ntl. Acad. Sci. USA
89:2669-2673; Lee et al. (1998) Proc.
Ntl. Acad. Sci. USA 95:5199-5204; Ulbrecht et
al. (1992) J. Immunol. 149:2945-2953);
por tanto, la activación de células NK mediante CD94/NKG2C/DAP12
podría producir autoinmunidad. No obstante, estudios recientes
sugieren que todos los clones de células NK parecen expresar al
menos un receptor inhibidor (un KIR o CD94/NKG2A) contra un
autoligando de MHC clase I, impidiendo así la destrucción de tejidos
autólogos normales (Uhrberg et al. (1997) Immunity
7:753-763; Valiante et al. (1997)
Immunity 7:739-751). Clones de células NK
que expresan receptores CD94/NKG2C/DAP12 activadores y un KIR
inhibidor contra un autoligando de clase I podrían reconocer y
eliminar potencialmente células hospedantes que han perdido
expresión del ligando de clase I de KIR, pero conservan la
expresión de HLA-E. Este modelo requiere ensayo
experimental, pero proporcionaría defensa contra organismos
patógenos que codifican péptidos líderes competentes para unirse a
HLA-E, pero subregulan la expresión de moléculas de
MHC clase I convencionales como consecuencia de la
infección.
infección.
Los cADN usados fueron CD94 (Chang et
al., 1995), NKG2A y NKG2C (Houchins et al. (1991) J.
Immunol. 158:3603-3609), KIR2DS2 (NKAT5,
(Colonna y Samaridis (1995)) y FLAG-DAP12 (Lanier
et al. (1998) Nature 391:703-707)
humanos. El cADN de mutante FLAG-DAP12
transmembrana D-A con un residuo A (codón GCC)
sustituido por el residuo D (codón GAC) y el cADN de mutante NKG2C
transmembrana K-L con un residuo L (TTA) sustituido
por K (codón AAA) se generaron por mutagénesis PCR usando técnicas
convencionales. Un cADN de NKG2C que contiene un epítope FLAG en el
términ COOH inmediatamente antes del codón de detención de NKG2C se
generó por PCR. Se determinó la secuencia de los cADN y se
subclonaron en los vectores retrovíricos pMX-neo o
pMX-puro (Onihsi et al. (1996) Exp.
Hematology 24:324-329). Se transfectó ADN
plásmido en células de empaquetadura de retrovirus ecotrópico
\Phi-NX-E (un regalo generoso de
G. Nolan (Stanford University)) usando lipofectamina
(Gibco-BRL) (Onihsi et al., 1996). Se
recogieron sobrenadantes víricos dos días después y se usaron para
infectar células Ba/F3 pre-B de ratón (Onihsi et
al., 1996). Dos días post-infección se cambiaron
las células a medio de selección y se clasificaron por citometría
de flujo células Ba/F3 que expresan establemente receptores de
células NK humanas para expresión de alto nivel homogéneo.
Los mAbs usados fueron anti-CD94
(DX22; Phillips et al. (1996) Immunity
5:163-172) o mAb HP-3D9
(Lopez-Botet (1995), págs.
1437-1439, en Schlossman et al. (reds.)
Leucocyte Typing V. Oxford Universuty Press, Oxford; mAb
anti-KIR2D (DX27; Phillips et al. (1996)
Immunity 5:163-172),
anti-NKR-P1A (DX1; Lanier et
al. (1994) J. Immunol. 153:2417-2428),
anti-FLAG (mAb M2, Kodak),
anti-NKG2A/C (mAb 8E4; Houchins et al. (1997)
J. Immunol. 158:3603-3609) y mAb IgG1 de
ratón testigo (Becton Dickinson, San Jose, CA). Se preparó antisuero
de conejo específico para los heterodímeros CD94/NKG2A y CD94/NKG2C
como se ha descrito (Lazetic et al. (1996) J. Immunol.
157:4741-4745). Se compraron a CalTag (So. San
Francisco, CA) segundos anticuerpos Ig anti-conejo
de cabra conjugada con FITC e Ig anti-ratón
conjugada con FITC. Se realizaron inmunofluorescencia y citometría
de flujo como se ha descrito (Lanier y Recktenwald (1991)
Methods: A companion to Methods in Enzymology
2:192-199).
Se marcaron con ^{125}I células Ba/F3
transfectadas y se solubilizaron en tampón de lisis de digitonina
(pH 7,8, 1% de digitonina, 0,12% de Triton-X100,
NaCl 150 mM, trietanolamina 20 mM, 0,01% de NaN_{3} e inhibidores
de proteasa; Lanier et al. (1989) Nature
342:803-805). Se incubaron lisados de células en
hielo durante 2 horas con Pansorbin (Calbiochem) revestido con Ig
anti-ratón/rata de conejo (Sigma) y
anti-CD94 (mAb DX22), anti-FLAG
(mAb M2) o IgG testigo y se lavaron después. Los inmunoprecipitados
se resuspendieron en tampón de muestras de SDS-PAGE
en presencia o ausencia de 2-mercaptoetanol al 10%,
se hicieron pasar sobre geles de 18% de Tris/glicina (Novex) y se
visualizaron usando un PhosphorImager (Molecular Dynamics).
Un clon de células NK humanas y un linaje
celular de NK humano policlonal (células NK de sangre periférica
CD3-, CD56+) cultivadas como se ha descrito (Yssel et al.
(1984) J. Exp. Med. 160: 239-254) se
marcaron con ^{125}I y se solubilizaron en tampón de lisis de
digitonina. Los lisados de células con ^{125}I se
pre-aclararon durante la noche con Pansorbin
revestido con Ig de conejo y se incubaron después en hielo durante 2
horas con Pansorbin revestido con un antisuero
anti-DAP12 de conejo purificado por afinidad
(generado por métodos estándares contra una proteína de fusión GST
que contiene el dominio citoplasmico completo de DAP12 humana). Las
proteínas asociadas con DAP12 se eluyeron en 25 \mul de
dietilamina 50 mM (pH 11,5) y se transfirieron a 0,5 ml de tampón
de lisis de NP-40 al 1% (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH
8,0 que contiene inhibidores de proteasa) con 10 mg/ml de proteína
vehículo BSA. Las proteínas eluídas asociadas a DAP12 se
re-inmunoprecipitaron con perlas de Sepharose
acopladas a mAb anti-CD94 (HP-3D9 y
DX22) o perlas de Sepharose acopladas a mAb
anti-NKR-P1A (DX1) (usadas como
testigo negativo). Se lavaron los inmunoprecipitados en tampòn de
lisis de NP-40 al 1%, se resuspendieron en tampón
de muestras de SDS-PAGE en presencia o ausencia de
2-mercaptoetanol al 10%, se hicieron pasar sobre
geles de 18% de Tris/glicina y se visualizaron usando un
PhosphorImager.
El análisis de manchas de Western usando
anti-FLAG (mAb M2) o anti-NKG2A/C
(mAb 8E4; Houchins et al. (1997) J. Immunol.
158:3603-3609) se realizó como se ha descrito en
Phillips et al. (1996) Immunity
5:163-172. El mAb 8E4 detecta NKG2A y NKG2C por
análisis de manchas de Western, pero no inmunoprecipita o se une a
estos antígenos en ensayos de inmunofluorescencia.
Se suspendieron células BaF3 transfectadas en
PBS fría con 0,5% de BSA a razón de 5 x 10^{7} células/ml que
contenía 20 \mug/ml de mAb que reconoce CD94,
FLAG-DAP12 o KIR2DS2. Las células se incubaron en
hielo durante 30 minutos, se lavaron, se resuspendieron en 10
\mug/ml de IgG anti-ratón de cabra
F(ab')_{2} (Jackson Immunoresearch) y se incubaron durante
tres minutos a 37ºC. Las células se globulizaron, se resuspendieron
a razón de 10^{8}/ml en tampón de lisis enfriado con hielo (1% de
NP-40, Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM que contenía
los inhibidores de proteasa y fosfatos aprotinina, leupeptina,
PMSF, EDTA, NaVO_{4} y NaF) como se ha descrito (Lanier et
al. (1998) Nature 391:703-707). Se
inmunoprecipitaron Syk y FLAG-DAP12 con antisuero
anti-Syk de conejo (proporcionado generosamente por
Joe Bolen, DNAX) o anti-FLAG (mAb M2). Los lisados
de células (2-3 x 10^{6} equivalentes de células)
y los inmunoprecipitados se hicieron pasar sobre geles de
Tris/glicina, se mancharon con ellos membranas Immobilon
(Millipore), se bloquearon, se sondaron con mAb
anti-fosfotirosina conjugado a peroxidasa de rábano
picante 4G10 (Upstate Biotechnology), se lavaron y se revelaron con
un sustrato quimioluminiscente
(Pierce).
(Pierce).
Varios miembros de la familia de receptores Ly49
inhiben la lisis mediada por células NK de objetivos que expresan
moléculas MHC clase I apropiadas. Ly49D y Ly49H, dos moléculas Ly49
que carecen de Motivos Inhibidores basados en Tirosina
Inmunorreceptores (ITIM) en sus dominios citoplásmicos, se asocian
con DAP12 de ratón, una molécula que posee un Motivo de Activación
basado en Tirosina Inmunorreceptor (ITAM). La
co-transfección de Ly49D o Ly49H con DAP12 induce
expresión superficial de Ly49 y DAP12. El complejo Ly49/DAP12 se
co-inmunoprecipitó de las células transfectadas,
demostrando una asociación física de DAP12 con Ly49D o Ly49H en la
membrana de plasma. La estimulación de transfectantes con
anticuerpos que reconocen Ly49D o Ly49H produce activación celular,
como se valora por inducción de fosforilación con tirosina de
sustratos celulares múltiples.
Las células NK expresan receptores para MHC
clase I que, por reconocimiento de ligandos de clase I polimórficos
apropiados entregan una señal inhibidora, produciendo la inhibición
de la lisis objetivo. El Ly94A de ratón, el receptor inhibidor
prototípico para H-2 (Karlhofer et al. (1992)
Nature 358:66) es una proteína de membrana integral de tipo
II homodímera de la familia de lectina tipo C expresada en células
destructoras naturales y una pequeña población de células T. La
familia Ly49 incluye 9 genes, Ly49A a I (Smith et al. (1994)
J. Immunol. 153:1068; Brennan et al. (1994) J.
Exp. Med. 180:2287; Takei et al. (1997) Immunol.
Rev. 155:67). Siete de las moléculas Ly49 (Ryan y Seaman (1997)
Immunol. Rev. 155:79) poseen un ITIM (V/IxYxxL/V) (Thomas
(1995) J. Exp. Med. 181:1953; Lanier (1997) Immunity
6:371) en sus dominios citoplásmicos. El ITIM fosforilado en Ly49A
y Ly49G2 se une a las tirosina fosfatasas citoplásmicas
SHP-1 y SHP-2 (Olcese et al.
(1996) J. Immunol. 156:4531; Nakamura et al. (1997)
J. Exp. Med. 185:673; y Mason et al. (1997) J.
Immunol. 159:4187). El compromiso de Ly49A por su ligando
H-2D^{d} interrumpe acontecimientos de activación
temprana inducidos por interacción de células NK con células
objetivo (Nakamura et al. (1997) J. Exp. Med.
185:673). Ly49D y Ly49H carecen de ITIM y poseen un residuo de
arginina cargado positivamente dentro de sus dominios transmembrana.
El Ly49D es incapaz de entregar una señal inhibidora y puede
activar de hecho células NK (Mason et al. (1996) J. Exp.
Med. 184:2119).
Las células NK humanas expresan un grupo de
moléculas análogas funcionalmente, los receptores inhibidores de
células destructoras (KIR), que pertenecen a la superfamilia de
inmunoglobulinas (Lanier (1997) Immunity 6:371). El KIR,
como Ly49, puede dividirse en dos subfamilias basadas en la
presencia o ausencia de ITIM en sus dominios citoplásmicos. KIR2DL
o KIR3DL poseen ITIM e inhiben la lisis de objetivos que expresan
sus ligandos de MHC clase I. Isoformas de KIR que carecen de ITIM
(KIR2DS) poseen un residuo cargado positivamente en sus dominios
transmembrana y entregan una señal activadora (Moretta et al.
(1995) J. Exp. Med. 182:875; Biassoni et al. (1996)
J. Exp. Med. 183:645). La DAP12, que se asocia no
covalentemente con KIR2DS2 (Lanier et al. (1998)
Nature 391:703-707) posee un ITAM en su cola
citoplásmica y un residuo de ácido aspártico cargado negativamente
en su dominio transmembrana. La ligación del complejo KIR2DS2/DAP12
produce activación celular. Se examinó la asociación de DAP12 de
ratón con Ly49D y Ly49H y la capacidad de estos complejos para
activar aguas abajo trayectorias de señalización.
Están presentes transcriptos de Ly49D y Ly49H en
células NK activadas con IL-2 (20). Se expresa Ly49D
en \sim50% de células NK (Mason et al. (1996) J. Exp.
Med. 184:2119), y está asociada con una tirosina fosfoproteína
de 16 kD (Mason et al. (1998) J. Immunol.
160:4148-4152). Las células NK de ratón, como las
células NK humanas, transcriben mARN para DAP12, una molécula que
se asocia con el KIR2DS activador y media en activación celular
(Lanier et al. (1998) Nature 391:703). Para examinar
si Ly49D o Ly49H se asociaban con DAP12, se transfectaron
establemente células Ba/F3 con una DAP12 de ratón etiquetada con
epítope (DAP12-FLAG). Las células
Ba/F3-DAP12-FLAG no expresan DAP12
en la superficie celular. Se infectaron después Ba/F3 o los
transfectantes de Ba/F3-DAP12 con retrovirus que
codifican Ly49D, un Ly49H etiquetado con epítope myc
(Ly49H-myc) o como un Ly49A testigo. Ni Ly49D ni
Ly49H-myc se expresaron en niveles apreciables en la
superficie celular cuando se transfectaron en células Ba/F3. Como
contraste, la transfección de células
Ba/F3-DAP12-FLAG con Ly49D o
Ly49H-myc produjo expresión superficial de alto
nivel de Ly49 y DAP12-FLAG, sugiriendo que Ly49D y
Ly49H se asocian con DAP12.
Se examinó si los residuos cargados en las
transmembranas de Ly49 y DAP12 son importantes para su asociación.
Ly49A comparte un 86% de identidad de aminoácidos con Ly49D en su
dominio extracelular, pero carece de la arginina en su segmento
transmembrana. Como contraste con Ly49D o Ly49H, cuando Ly49A se
transfectó establemente en células Ba/F3 o
Ba/F3-DAP12-FLAG, se expresó en la
superficie celular solo o en presencia de DAP12-FLAG
y dejó de inducir expresión superficial de
DAP12-FLAG. Las interacciones entre Ly49D o
Ly49H-myc y DAP12 no están restringidas a la
especie porque ambas moléculas Ly49 se expresaron en la superficie
de transfectantes Ba/F3-DAP12-FLAG
humano. Sin embargo, ni Ly49D ni Ly49H se expresaron en la
superficie de células Ba/F3 transfectadas establemente con una
molécula de DAP12 humana mutante en la que el ácido aspártico
cargado negativamente en la transmembrana se mutó a leucina. Por
tanto, Ly49D y Ly49H deben asociarse con DAP12 para alcanzar
eficazmente la superficie celular y su interacción es mediada
probablemente por los residuos cargados opuestamente en las
transmembranas de DAP12 y Ly49.
Para confirmar que Ly49D y Ly49H se asocian no
covalentemente con DAP12 en la superficie celular, se yodaron
superficialmente transfectantes Ly49D/DAP12-FLAG o
Ly49H-myc/DAP12-FLAG Ba/F3, se
lisaron con digitonina y se analizaron los inmunoprecipitados por
SDS-PAGE. La inmunoprecipitación de lisados de
Ba/F3-Ly49D/DAP12-FLAG con
anti-Ly49D mostró dos especies yodadas con tamaños
consecuentes con su identidad como Ly49D y
DAP12-FLAG. Se observó un modelo idéntico con
anti-FLAG, confirmando que las dos especies son
Ly49D y DAP12-FLAG. La inmunoprecipitación de
lisados de
Ba/F3-Ly49H-myc/DAP12-FLAG
con anti-myc o anti-FLAG mostró un
modelo similar. Estos resultados demuestran una interacción física
de Ly49D o Ly49H con DAP12 en la membrana del plasma.
Puesto que DAP12 posee un ITAM y el compromiso
de Ly49D activa células NK (Mason et al. (1996) J. Exp.
Med. 184:2119), se preguntaba si los complejos Ly49/DAP12
transmiten una señal de activación. La reticulación de
transfectantes Ly49D/DAP12-FLAG y
Ly49H-myc/DAP12-FLAG con
anti-Ly49 o anti-FLAG producía
fosforilación con tirosina de muchas proteínas celulares,
incluyendo DAP12-FLAG y Syk en ambos linajes
celulares. Estos datos proporcionan evidencia de que Ly49D/DAP12 y
Ly49H/DAP12 forman complejos funcionales en la superficie celular
que pueden iniciar por ligación activación celular.
¿Cuáles son los ligandos fisiológicos para estos
receptores activadores?. Ly49D comparte el 86% de identidad de
aminoácidos en su dominio extracelular con Ly49A (Smith et
al. (1994) J. Immunol. 153:1068), un receptor inhibidor
que se une a H-2D^{d} y H-2D^{k}
(Brennan et al. (1996) J. Exp. Med. 183:1553; Kane
(1994) J. Exp. Med. 179:1011; Daniels et al. (1994)
J. Exp. Med. 180:687). Ly49H comparte el 90% de identidad de
aminoácidos en su dominio extracelular con otro receptor inhibidor
Ly49C (Brennan et al. (1994) J. Exp. Med. 180:2287),
que interactúa con varias moléculas de clase I, incluyendo
H-2K^{b} (Brennan et al. (1996) J. Exp.
Med. 183:1553). Así, estas formas activadoras de Ly49 pueden
interactuar con moléculas MHC clase I. La evidencia de
alorreconocimiento positivo por células NK in vivo e in
vitro existe en la rata (analizado en Rolstad et al.
(1997) Immunol. Rev. 155:91). De modo similar, las células NK
de ratón reconocen células de médula ósea alogénicas que expresan
ciertas moléculas de clase I de manera positiva y median en su
rechazo in vivo (Ohlen et al. (1989) Science
246:666; George et al. (1997) Immunol. Rev. 155:29).
Se ha mostrado que Ly49D y Ly49H de ratón se asocian con DAP12 y
forman receptores activadores, proporcionando una posible
explicación de alorreconocimiento positivo por células NK.
¿Cómo puede conciliarse la existencia de
receptores de NK activadores e inhibidores que reconocen ligandos
de clase I?. Se prevén tres modelos. En el primer modelo, el
compromiso de los receptores activadores funcionaría durante el
desarrollo para promover la maduración de células NK inmaduras. Sin
embargo, no hay evidencia hasta ahora de la aparición de receptores
activadores antes que receptores inhibidores durante el desarrollo.
Un segundo modelo propone que una célula NK posee receptores
activadores e inhibidores para el mismo ligando de clase I.
Ocupándose de la clase I, el receptor activador reclutaría una
proteína tirosina quinasa que fosforila el ITIM del receptor
inhibidor, produciendo inactivación de células NK. Aunque muchos
clones de células NK humanas poseen al menos un receptor activador
y uno inhibidor, no poseen necesariamente un par capaz de reconocer
el mismo ligando. Finalmente, un tercer modelo predice que las
células NK expresan receptor inhibidor y activador para diferentes
alelos de clase I. En este modelo, domina el compromiso del receptor
inhibidor si se comprometen ligandos para ambos receptores. Si el
ligando para el receptor inhibidor está subregulado o perdido, el
receptor activador podría provocar la lisis de la célula
"anormal" si está presente su ligando. Este modelo tiene la
ventaja de que podrían expresarse receptores inhibidores y
activadores múltiples por la misma célula, una predicción más en
línea con los hallazgos en clones de NK. Incluso, en el caso de
pérdida de todas las moléculas MHC clase I por una célula objetivo,
otros mecanismos activadores tendrían que iniciar la lisis por la
célula NK.
DAP12 permanece localizada intracelularmente
cuando se expresa en células en ausencia de compañeros de
asociación. Esta observación se explotó con el propósito de clonar
nuevas proteínas que se asocian a DAP12, por ejemplo, a genes de
clones de expresión necesarios en el procedimiento de localización
celular para la membrana. Se transfectaron con la DAP12 células
que carecían de las proteínas asociadas, y la proteína permaneció
localizada intracelularmente. Estas células podrían usarse para
expresar proteínas accesorias necesarias para el clon para
localización superficial de DAP12. La estrategia se ha calificado
"trampa de DAP".
Con este fin, una forma etiquetada con FLAG de
DAP12 de ratón se expresó en células 293T usando un vector de
expresión, por ejemplo, pREP10. En presencia de higromicina, se
seleccionó un linaje celular estable que expresa DAP12, DT381. Para
reducir el fondo de expresión espontánea de DAP12 en la superficie
celular, se seleccionaron negativamente células DT381 por
citometría de flujo usando el mAb anti-Flag M2
(Kodak). Para clonar nuevas proteínas que se asocian a DAP12, un
linaje celular de macrófago J774 derivado de genoteca de expresión
de pJEF14 se transfectó en células DT381. Cuarenta y ocho horas
después de la transfección, se seleccionaron las células por
expresión en la superficie celular de DAP12 mediante citometría de
flujo. Esto se realizó mediante coloración de dos colores: se
visualizó DAP12 usando el mAb anti-FLAG M2, seguido
por un mAb anti-IgG1 de ratón conjugado a biotina
(02232D Pharmingen), seguido por una tercera etapa de incubación con
estreptavidina-PE. Los receptores de Fc en células
DT381 transfectadas se visualizaron usando el mAb
anti-CD16/32 conjugado a FITC directamente 2.4G2
(01244D Pharmingen). Sólo se clasificaron las células positivas en
PE simples. La coloración con el mAb anti-CD16/32
fue necesaria para evitar la clonación de receptores de Fc que están
presentes abundantemente en células J774.
Se rescataron los plásmidos de las células
clasificadas y se retransformó el ADN en bacterias DH10B. Se
obtuvieron subgenotecas y se sometieron a una nueva ronda de
clonación de expresión. Después de tres rondas de selección, se
desarrollaron 500 colonias bacterianas simples de la tercera
subgenoteca en un formato de placa de 96 pocillos para construir
una matriz tridimensional consistente en 5 x 12 x 8 colonias. El ADN
obtenido de agrupaciones de cada coordenada X, Y y Z de esta matriz
se transfectó de nuevo en células DT381 y se examinó en los
transfectantes la expresión superficial de DAP12.
Esto produjo la identificación de dos clones
idénticos, que codifican ambos una proteína transmembrana de tipo
II de 165 aminoácidos de la superfamilia de lectina tipo C. Este
gen/proteína se denominó Lectina-1 que se asocia a
DAP12 Myloid (MDL-1). Esta realización de
MDL-1 del ratón tiene una región intracelular de 2
residuos, una región transmembrana de 23 residuos y una región
extracelular de 140 residuos que contiene el dominio de lectina
tipo C. El segmento transmembrana posee un aminoácido cargado, y la
región extracelular tiene tres lugares de
N-glicosilación putativos. La búsqueda BLAST reveló
un EST de ratón de longitud completa altamente homólogo, AA186015,
que era idéntico a los dos clones mencionados antes, con la
excepción de que este clon tiene una extensión extra de 75
nucleótidos produciendo una extensión adicional de 25 residuos
extracelularmente exactamente fuera de la región transmembrana.
Así, existen dos realizaciones, una forma corta y una forma larga.
El resto de las secuencias es idéntico.
La búsqueda dentro de una base de datos de
secuencias DNAX reveló un EST humano homólogo,
97-1128A12, que codifica un homólogo humano de
MDL-1. La MDL-1 de ratón parece ser
codificada por un gen simple, en contraste con muchas proteínas
superficiales relacionadas, que pueden tener lugar en familias de
genes. La expresión de MDL-1 de ratón está
restringida a monocitos, macrófagos y células dendríticas.
Puesto que el gen de MDL-1
parece ser crucial en la localización de la DAP12 en la membrana y
posee interesantes aspectos estructurales, es probable que la
MDL-1 se asocie con la DAP12 en un complejo de
membrana. Así, la rotura del complejo puede conducir a un bloqueo
de función interesante de la DAP12-complejo
receptor. Esto sugiere métodos obvios para examen de fármacos de
moléculas pequeñas para compuestos que interferirían con la
asociación. Alternativamente, fragmentos transmembrana pueden
bloquear asociación funcional. Serían útiles en contextos de
diagnóstico o terapéuticos anticuerpos para las regiones
extracelulares, de proteínas solas, o la combinación de componentes
en los complejos funcionales.
La DAP10 también parece asociarse con una
proteína accesoria. En particular, la inmunoprecipitación de DAP10
en condiciones suavemente desnaturalizantes produce
co-inmunoprecipitación de una banda de proteína de
aproximadamente 40-41 kD. El tratamiento con
neuraminidasa, o el tratamiento con O-glicanasa,
producen una disminución del peso molecular hasta aproximadamente
38-39 kD. El tratamiento con
N-glicanasa causa una disminución de peso molecular
hasta aproximadamente 28-30 kD. Esto sugiere que la
proteína es de aproximadamente 26-30 kD sin
glicosilación. Pueden aplicarse métodos estándares o de
microdeterminación de secuencia a proteína aislada por
inmunoprecipitación. Con la secuencia, pueden aplicarse para aislar
el gen cebadores de PCR redundantes u otras técnicas.
Alternativamente, la secuencia puede permitir la identificación del
gen por igualaciones en bases de datos de secuencias.
Además, la DAP10 también está sujeta a la
estrategia trampa de DAP. Pueden aplicarse técnicas de clonación de
expresión, como con la DAP12, para clonar el gen de una genoteca de
cADN. La información de distribución permitirá la selección de los
linajes celulares apropiados y las genotecas de cADN para ellos.
| SEQ ID NO: 1 es una secuencia de cADN de DAP12 de primate. |
| SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos de DAP12 de primate. |
| SEQ ID NO: 3 es una secuencia de cADN contig de DAP12 de primate. |
| SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos de consenso de ITAM. |
| SEQ ID NO: 5 es una secuencia de cADN de DAP12 de roedor. |
| SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos de DAP12 de roedor. |
| SEQ ID NO: 7 es una secuencia de cADN de DAP10 de primate. |
| SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos de DAP10 de primate. |
| SEQ ID NO: 9 es una secuencia de cADN de DAP10 de roedor. |
| SEQ ID NO: 10 es una secuencia de aminoácidos de DAP10 de roedor. |
| SEQ ID NO: 11 es una secuencia de de cADN de MDL-1 de primate. |
| SEQ ID NO: 12 es una secuencia de aminoácidos de MDL-1 de primate. |
| SEQ ID NO: 13 es una secuencia de cADN de MDL-1 de roedor. |
| SEQ ID NO: 14 es una secuencia de aminoácidos de MDL-1 de roedor. |
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Schering Corporation
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas de membrana celular de mamífero; reactivos relacionados
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Schering Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2000 Galloping Hill Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Kenilworth
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 07033-0530
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Power Mcintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 7.5.3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: MS Word 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 31 de Julio de 1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/089.168
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 DE JUNIO DE 1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/069.692
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 DE DICIEMBRE DE 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/990.820
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 DE DICIEMBRE DE 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/063.717
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 DE OCTUBRE DE 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/904.905
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 DE AGOSTO DE 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Thampoe, Inmac J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.322
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: DX0763X
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (908)298-5061
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (908)298-5388
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 342 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..339
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 79..339
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 628 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg
Ser Asp Val Tyr Ser}
\sac{Asp Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 345 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..342
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 79..342
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 114 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 451 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 63..338
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 117..338
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 92 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 403 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 109..345
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 163..345
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 79 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 996 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 157..717
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 187 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 896 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 140..709
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_aspecto
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 221
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "la variante de forma corta carece de los nucleótidos 221-295"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_aspecto
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 29
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "la diferencia de variante de forma corta en los nucleótidos 29-35 se lee CAGAAGA; 107-109 se lee AGA; 128-129 se lee AT; 820-826 se lee CATAGGT; carece de 859; y 879-880 se lee CA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 190 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (35)
1. Un polipéptido sustancialmente puro o
recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en
SEQ ID NO: 12.
2. Una composición que comprende un polipéptido
de la reivindicación 1ª y un vehículo que comprende agua, solución
salina y/o tampón.
3. La composición de la reivindicación 2ª, que
comprende además un tampón.
4. La composición de la reivindicación 2ª o la
reivindicación 3ª, que se formula para administración oral, rectal,
nasal, tópica o parenteral.
5. El polipéptido de la reivindicación 1ª, que
comprende además una etiqueta de detección o purificación.
6. El polipéptido de la reivindicación 5ª, en el
que la etiqueta de detección o purificación se selecciona del grupo
constituido por FLAG, His6, péptido de inmunoglobulina,
\beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A,
\beta-lactamasa, alfa amilasa, alcohol
deshidrogenasa y factor de acoplamiento alfa de levadura.
7. Un juego que comprende:
- a)
- un compartimento que contiene dicho polipéptido de alguna de las reivindicaciones 1ª, 5ª o 6ª; y/o
- b)
- instrucciones de uso o evacuación de reactivos de dicho juego.
8. Un anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido de la reivindicación 1ª, o un fragmento de unión del
mismo.
9. El anticuerpo de la reivindicación 8ª, que es
un anticuerpo monoclonal.
10. El anticuerpo de la reivindicación 8ª, que
es un anticuerpo policlonal.
11. El anticuerpo o fragmento de unión de alguna
de las reivindicaciones 8ª a 10ª, que presenta un kd para la
secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12 de al menos 30
\muM.
12. El anticuerpo o fragmento de unión de alguna
de las reivindicaciones 8ª a 11ª, en el que dicho anticuerpo o
fragmento de unión está incorporado a un sustrato sólido.
13. El anticuerpo o fragmento de unión de la
reivindicación 12ª, en el que dicho sustrato sólido es una perla o
una membrana de plástico.
14. El anticuerpo o fragmento de unión de alguna
de las reivindicaciones 8ª a 13ª, que comprende además una marca
detectable.
15. El anticuerpo o fragmento de unión de la
reivindicación 14ª, en el que dicha marca detectable es una marca
radioactiva o fluorescente.
16. Una composición que comprende un anticuerpo
o fragmento de unión de alguna de las reivindicaciones 8ª a
15ª.
17. Un juego que comprende:
- a)
- un compartimento que contiene un anticuerpo o fragmento de unión de alguna de las reivindicaciones 8ª a 15ª; y/o
- b)
- instrucciones de uso o evacuación de reactivos de dicho juego.
18. Un ácido nucleico aislado o recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12.
19. El ácido nucleico de la reivindicación 18ª,
que comprende además una marca detectable.
20. Un vector de expresión que comprende el
ácido nucleico de la reivindicación 18ª o la reivindicación 19ª.
21. El vector de expresión de la reivindicación
20ª, que comprende además un origen de replicación.
\newpage
22. Una célula o tejido que comprende un ácido
nucleico de alguna de las reivindicaciones 18ª a 21ª, en el que
dicha célula o tejido no es un producto natural.
23. La célula de la reivindicación 22ª, en la
que dicha célula es:
- a)
- una célula procariota;
- b)
- una célula eucariota;
- c)
- una célula bacteriana;
- d)
- una célula de levadura;
- e)
- una célula de insecto;
- f)
- una célula de mamífero;
- g)
- una célula de ratón;
- h)
- una célula de primate; o
- i)
- una célula de ser humano.
24. Un juego que comprende:
- a)
- un compartimento que contiene un ácido nucleico de alguna de las reivindicaciones 18ª a 21ª; y/o
- b)
- instrucciones de uso o evacuación de reactivos de dicho juego.
25. Un método in vitro para modular la
señalización inmune de una célula o células de cultivo de tejidos
que comprende poner en contacto dicha célula con el polipéptido de
la reivindicación 1ª.
26. Un método in vitro para modular la
señalización inmune de una célula o células de cultivo de tejidos
que comprende poner en contacto dicha célula con un anticuerpo o
fragmento de unión de la reivindicación 8ª.
27. El polipéptido de la reivindicación 1ª, de
uso para modular la señalización inmune de una célula o células de
cultivo de tejidos.
28. El anticuerpo o fragmento de unión de la
reivindicación 8ª, de uso para modular la señalización inmune de
una célula o células de cultivo de tejidos.
29. El uso de un polipéptido de la
reivindicación 1ª, para la fabricación de un medicamento para
modular la señalización inmune de una célula o células de cultivo
de tejidos.
30. El uso de un anticuerpo o fragmento de unión
de la reivindicación 8ª, para la fabricación de un medicamento para
modular la señalización inmune de una célula o células de cultivo de
tejidos.
31. Una formulación farmacéutica que
comprende:
- (a) el polipéptido de la reivindicación 1ª; o
- (b) el anticuerpo o fragmento de unión de alguna de las reivindicaciones 8ª a 15ª;
y un vehículo aceptable
farmacéuticamente del
mismo.
32. Un polipéptido sustancialmente puro o
recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en
SEQ ID NO: 14.
33. Un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido de la reivindicación 32ª, o un fragmento de unión
del mismo.
34. Un ácido nucleico aislado o recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:
14.
35. El ácido nucleico de la reivindicación 34ª,
que comprende la secuencia de nucleótidos indicada en los
nucleótidos 140 a 709 de SEQ ID NO: 13.
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| AU2002220591A1 (en) * | 2000-09-20 | 2002-04-02 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (I.N.S.E.R.M) | Means for the identification of compounds capable of inhibiting karap-transduced signals |
| CA2431177C (en) | 2000-12-08 | 2015-04-14 | Baylor College Of Medicine | Trem-1 splice variant for use in modifying immune responses |
| US20060099144A1 (en) * | 2004-11-08 | 2006-05-11 | Schering Corporation | Tumor association of MDL-1 and methods |
| AR059193A1 (es) * | 2006-01-31 | 2008-03-12 | Bayer Schering Pharma Ag | Modulacion de la actividad de mdl-1 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3940475A (en) | 1970-06-11 | 1976-02-24 | Biological Developments, Inc. | Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten |
| NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| US3939350A (en) | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4277437A (en) | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
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| AU5296796A (en) * | 1995-02-28 | 1996-09-18 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Function | Peptidyl compounds comprising an itim motif which regulate hematopoietic function and their use |
| AU7739696A (en) * | 1995-11-30 | 1997-06-19 | Schering Corporation | Dnam, an nk antigen and adhesion molecule of the immunoglobulin superfamily |
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| WO1999002546A1 (en) * | 1997-07-08 | 1999-01-21 | Human Genome Sciences, Inc. | 123 human secreted proteins |
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