JP4855513B2 - 哺乳動物細胞膜タンパク質；関連試薬 - Google Patents

哺乳動物細胞膜タンパク質；関連試薬 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、哺乳動物細胞応答（例えば、免疫シグナリング）を調整することに有用な種々の生物学的試薬に関する。より詳細には、本発明は、（例えば、Ｂ細胞とＴ細胞、ＮＫなどとの間の）免疫細胞相互作用に有用な組成物および方法に関する。
（発明の背景）
哺乳動物循環系の循環成分は、赤血球性および骨髄性細胞系統の赤血球および白血球を含む、種々の細胞型を含む。例えば、Ｒａｐａｐｏｒｔ（１９８７）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（第２版）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｊａｎｄｌ（１９８７）Ｂｌｏｏｄ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．；およびＰａｕｌ（編、１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
休止Ｔ細胞の活性化は大抵の免疫応答に重要であり、そしてこれらの細胞が、それらの調節能力またはエフェクター能力を発揮するのを可能にする。Ｐａｕｌ（編；１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。Ｔ細胞と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または一次刺激の他の形態（例えば、固定化モノクローナル抗体（ｍＡｂ））との間の接着の増大は、Ｔ細胞レセプターシグナルを強化し得る。Ｔ細胞活性化およびＴ細胞増大は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）と補助細胞により提供される共刺激シグナルとの結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に依存する。例えば、ＪｅｎｋｉｎｓおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：３６１−３６７；ＢｉｅｒｅｒおよびＨａｈｎ（１９９３）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２４９−２６１；Ｊｕｎｅら（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １１：２１１−２１６；ならびにＪｅｎｋｉｎｓ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４４３−４４６を参照のこと。Ｔ細胞についての主要なおよび十分に研究された共刺激相互作用は、Ｔ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のいずれかと、Ｂ７またはＢ７０のいずれかが関与する（Ｊｅｎｋｉｎｓ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４４３−４４６）。ＣＤ２８欠損マウス（Ｓｈａｈｉｎｉａｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：６０９−６１２；Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：５０１−５０８）およびＣＴＬＡ−４免疫グロブリン発現トランスジェニックマウス（Ｒｏｎｃｈｅｓｅら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：８０９−８１７）に関する最近の研究は、いくつかのＴ細胞応答における欠損を明らかにしたが、これらのマウスは、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスに対して正常な一次免疫応答および正常なＣＴＬ応答を有する。結果として、これらの両方の研究により、他の共刺激分子がＴ細胞機能を支援しているのに違いないと結論付けられる。しかし、別個の共刺激シグナルを媒介するこれらの分子の同定はこれまで困難であった。
さらに、同様のネガティブおよびポジティブなシグナリングが、リンパ球（ＬＩＲ）；ナチュラルキラー細胞（ＫＩＲ）、および他の細胞型（ＩＬＴおよびＣＤ９４）により生じる。例えば、Ｍｏｒｅｔｔａら（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：６１９−６４８；Ｍａｌｉｓｓｅｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：５１８−５１９；ＳｃｈａｒｅｎｂｅｒｇおよびＫｉｎｅｔ（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：９６１−９６４；Ｃｏｌｏｎｎａら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４０５−４０８；Ｗａｇｔｍａｎｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：４３９−４４９；Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２３０６−２３１０；ＳａｍａｒｉｄｉｓおよびＣｏｌｏｎｎａ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：６６０−６６５；Ａｒａｍｂｕｒｕら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３２３８−３２４７；Ａｒａｍｂｕｒｕら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：７１４−７２１；ならびにＲｕｂｉｏら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１３１２−１３２１を参照のこと。
活性化シグナルの調整不能により、免疫系における不適切な発生または生理学的応答の制御が妨げられる。本発明は、少なくとも１つの代替の共刺激分子を提供し、この共刺激分子のアゴニストおよびアンタゴニストは、多量の免疫応答を調節することに有用である。
（発明の要旨）
本発明は、細胞シグナリングに関与する特定の遺伝子の発見に基づく。その機能が理解されていなかった遺伝子形態と相互作用する種々の遺伝子が同定された。これらは、ＤＮＡＸ補助タンパク質、１２ｋＤ（ＤＡＰ１２）；ＤＮＡＸ補助タンパク質、１０ｋＤ（ＤＡＰ１０）；および別の会合補助タンパク質、ＭＤＬ−１である。
本発明の特定の実施態様は、配列番号２もしくは６；配列番号８もしくは１０；または配列番号１２もしくは１４に由来する成熟ポリペプチドに対して、少なくとも約１２のアミノ酸の長さにわたって同一性を示す、実質的に純粋なポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含む。好ましくは、配列番号は２もしくは６であり、そしてポリペプチドは、表１の成熟天然配列ＤＡＰ１２であるか；ＩＴＡＭモチーフを含むか；または膜貫通ドメインにおいて荷電残基を含むか；あるいは配列番号は８もしくは１０であり、そしてポリペプチドは、表２の成熟天然配列ＤＡＰ１０であるか；ＩＴＩＭモチーフを含むか；または膜貫通ドメインにおいて荷電残基を含むか；あるいは配列番号は１２もしくは１４であり、そしてポリペプチドは、表３の成熟天然配列ＭＤＬ−１であるか；または膜貫通ドメインにおいて荷電残基を含む。他の好ましい実施態様は、複数の長さを含むか；ＤＡＰ１２の天然対立遺伝子変異体であるか；ＤＡＰ１０の天然対立遺伝子変異体であるか；ＭＤＬ−１の天然対立遺伝子変異体であるか；少なくとも約３０のアミノ酸の長さを有するか；合成ポリペプチドであるか；固体基材に接着されるか；別の化学部分に結合されるか；天然配列からの５倍以下の（５−ｆｏｌｄ ｏｒ ｌｅｓｓ）置換であるか；または天然配列からの欠失もしくは挿入変異体であるようなポリペプチドを含む。他の好ましい実施態様は、滅菌ＤＡＰ１２ポリペプチド；ＤＡＰ１２ポリペプチドおよびキャリアを含む組成物を含み、ここで、このキャリアは、水、生理食塩水、および／もしくは緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または経口、直腸、鼻、局所、もしくは非経口投与のために処方されているか；あるいは滅菌ＤＡＰ１０ポリペプチド；またはＤＡＰ１０ポリペプチドおよびキャリアを含む組成物を含み、ここで、このキャリアは、水、生理食塩水、および／もしくは緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または経口、直腸、鼻、局所、もしくは非経口投与のために処方されているか；あるいは滅菌ＭＤＬ−１ポリペプチド；またはＭＤＬ−１ポリペプチドおよびキャリアを含む組成物を含み、ここで、このキャリアは、水、生理食塩水、および／もしくは緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または経口、直腸、鼻、局所、もしくは非経口投与のために処方されている。
このようなポリペプチド、ならびに検出タグもしくは精製タグ（ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６、もしくは免疫グロブリンペプチドを含む）；細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子；または別の膜タンパク質の配列を含む、融合タンパク質が提供される。
このようなポリペプチド、ならびにそのポリペプチドを含む区画；および／またはキットにおける試薬の使用もしくは処理のための説明書を含む、キットが提供される。
抗体に由来する抗原結合部分を含む結合化合物もまた提供され、その抗体は、天然ＤＡＰ１２ポリペプチドに特異的に結合し、ここでその抗体は、表１の成熟ポリペプチドに対して惹起されたか；免疫選択されているか；ポリクローナル抗体であるか；変性ＤＡＰ１２に結合するか；抗原に対する少なくとも３０μＭのＫｄを示すか；ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基材に接着されているか；滅菌組成物中にあるか；または放射性標識もしくは蛍光標識を含めて、検出可能に標識されているか；あるいは抗体は、天然ＤＡＰ１０ポリペプチドに特異的に結合し、ここでその抗体は、表２の成熟ポリペプチドに対して惹起されたか；免疫選択されているか；ポリクローナル抗体であるか；変性ＤＡＰ１０に結合するか；抗原に対する少なくとも３０μＭのＫｄを示すか；ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基材に接着されているか；滅菌組成物中にあるか；または放射性標識もしくは蛍光標識を含めて、検出可能に標識されているか；あるいは抗体は、天然ＭＤＬ−１ポリペプチドに特異的に結合し、ここでその抗体は、表３の成熟ポリペプチドに対して惹起されたか；免疫選択されているか；ポリクローナル抗体であるか；変性ＭＤＬ−１に結合するか；抗原に対する少なくとも３０μＭのＫｄを示すか；ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基材に接着されているか；滅菌組成物中にあるか；または放射性標識もしくは蛍光標識を含めて、検出可能に標識されている。例えば、結合化合物、ならびに結合化合物を含む区画；および／またはキットにおける試薬の使用もしくは処理のための説明書を含む、種々のキットが提供される。さらなる実施態様は、滅菌結合化合物、または結合化合物およびキャリアを含む組成物を含み、ここでこのキャリアは、水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む水性化合物であり；そして／あるいは経口、直腸、鼻、局所、または非経口投与のために処方されている。
核酸実施態様は、これらのポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え核酸を含み、ここでこの核酸は、その表１、２、または３の抗原ペプチド配列をコードする。好ましい実施態様は、表の複数の抗原ペプチド配列をコードする、このような核酸を含む。他の核酸は、発現ベクターであるか；複製起点をさらに含むか；天然供給源に由来するか；検出可能な標識を含むか；合成ヌクレオチド配列を含むか；６ｋｂ未満、好ましくは３ｋｂ未満であるか；霊長類もしくは齧歯動物を含む哺乳動物に由来するか；天然完全長コード配列を含むか；ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、もしくはＭＤＬ−１をコードする遺伝子のハイブリダイゼーションプローブであるか；またはＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物、もしくは変異誘発プライマーである、核酸を含む。
他の核酸は、少なくとも５０℃、４００ｍＭ塩未満、および５０％ホルムアミドのストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１もしくは５；配列番号７もしくは９；または配列番号１１もしくは１３にハイブリダイズする、核酸を含む。本発明は、このような組換え核酸を含む細胞または組織を提供し、その細胞は原核生物細胞；真核生物細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞；哺乳動物細胞；マウス細胞；霊長類細胞；またはヒト細胞である場合を含む。特定のキットは、核酸、ならびに核酸を含む区画；ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、もしくはＭＤＬ−１ポリペプチドをさらに含む区画、および／またはキットにおける試薬の使用または処理のための説明書を含む、キットを含む。好ましい核酸は、少なくとも約３０のヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたって霊長類ＤＡＰ１２に対して同一性を示し；少なくとも約３０のヌクレオチドのストレッチにわたって霊長類ＤＡＰ１０に対して同一性を示し；少なくとも約３０のヌクレオチドのストレッチにわたって霊長類ＭＤＬ−１に対して同一性を示し；そして／またはＫＩＲ、ＩＬＴ／ＭＩＲ、もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターをさらにコードする、核酸を含む。好ましい実施態様は、洗浄条件が６０℃および／または２００ｍＭ塩であるか、あるいはストレッチが少なくとも５５のヌクレオチドである、実施態様を含む。
本発明はまた、細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調整する方法を提供し、この方法は、細胞を、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、またはＭＤＬ−１のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を含む。ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０とＫＩＲ、ＩＬＴ／ＭＩＲ、またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターとの相互作用をブロックする化合物をスクリーニングする方法もまた提供され、この方法は、このレセプターの存在下で、化合物をＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０に接触させる工程を含む。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 実質的に純粋なまたは組換えポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２もしくは６に由来する成熟ポリペプチドに対して、少なくとも約１２のアミノ酸の長さにわたって同一性を示すか；
（ｂ）成熟配列番号８もしくは１０に対して、少なくとも約１２のアミノ酸の長さにわたって同一性を示すか；または
（ｃ）成熟配列番号１２もしくは１４に対して、少なくとも約１２のアミノ酸の長さにわたって同一性を示す、
ポリペプチド。
・（項目２） 項目１に記載のポリペプチドであって、ここで、
（ａ）上記配列番号は、２もしくは６であり、そして当該ポリペプチドは、
ｉ）表１の成熟天然配列ＤＡＰ１２であるか；
ｉｉ）ＩＴＡＭモチーフを含むか；または
ｉｉｉ）膜貫通ドメインにおいて荷電残基を含むか；
（ｂ）上記配列番号は、８もしくは１０であり、そして当該ポリペプチドは、
ｉ）表２の成熟天然配列ＤＡＰ１０であるか；
ｉｉ）ＩＴＩＭモチーフを含むか；または
ｉｉｉ）膜貫通ドメインにおいて荷電残基を含むか；あるいは
（ｃ）上記配列番号は、１２もしくは１４であり、そして当該ポリペプチドは、
ｉ）表３の成熟天然配列ＭＤＬ−１であるか；または
ｉｉ）膜貫通ドメインにおいて荷電残基を含む、
ポリペプチド。
・（項目３） 項目１に記載のポリペプチドであって、当該ポリペプチドは：
ａ）複数の上記長さを含むか；または
ｂ）ＤＡＰ１２の天然対立遺伝子変異体であるか；
ｃ）ＤＡＰ１０の天然対立遺伝子変異体であるか；
ｄ）ＭＤＬ−１の天然対立遺伝子変異体であるか；
ｅ）少なくとも約３０のアミノ酸の長さを有するか；
ｆ）合成ポリペプチドであるか；
ｇ）固体基材に接着されるか；
ｈ）別の化学部分に結合されるか；
ｉ）天然配列からの５倍以下の置換であるか；または
ｊ）天然配列からの欠失もしくは挿入変異体である、
ポリペプチド。
・（項目４） 以下を含む組成物：
ａ）項目３に記載の滅菌ＤＡＰ１２ポリペプチド；
ｂ）項目３に記載のＤＡＰ１２ポリペプチドおよびキャリア、
であって、ここで当該キャリアは、
ｉ）水、生理食塩水、および／もしくは緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または
ｉｉ）経口、直腸、鼻、局所、または非経口投与のために処方されている、
キャリア；
ｃ）項目３に記載の滅菌ＤＡＰ１０ポリペプチド；あるいは
ｄ）項目３に記載のＤＡＰ１０ポリペプチドおよびキャリア、
であって、ここで当該キャリアは、
ｉ）水、生理食塩水、および／もしくは緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または
ｉｉ）経口、直腸、鼻、局所、または非経口投与のために処方されている、
キャリア；
ｅ）項目３に記載の滅菌ＭＤＬ−１ポリペプチド；あるいは
ｆ）項目３に記載のＭＤＬ−１ポリペプチドおよびキャリア、
であって、ここで当該キャリアは、
ｉ）水、生理食塩水、および／もしくは緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または
ｉｉ）経口、直腸、鼻、局所、または非経口投与のために処方されている、
キャリア。
・（項目５） 項目１に記載の上記ポリペプチド、ならびに以下を含む融合タンパク質：
ａ）ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６、もしくは免疫グロブリンペプチドを含む、検出タグもしくは精製タグ；
ｂ）細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子；または
ｃ）別の膜タンパク質の配列。
・（項目６） 項目１に記載の上記ポリペプチド、ならびに以下を含む、キット：
ａ）当該ポリペプチドを含む区画；および／または
ｂ）当該キットにおける試薬の使用もしくは処理のための説明書。
・（項目７） 抗体に由来する抗原結合部分を含む結合化合物であって、当該抗体に由来する抗原結合部分は、
ａ）項目２に記載の天然ＤＡＰ１２ポリペプチドに特異的に結合し、ここで当該抗体は、
ｉ）表１の成熟ポリペプチドに対して惹起されたか；
ｉｉ）免疫選択されているか；
ｉｉｉ）ポリクローナル抗体であるか；
ｉｖ）変性ＤＡＰ１２に結合するか；
ｖ）少なくとも３０μＭの、抗原に対するＫｄを示すか；
ｖｉ）ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基材に接着されているか；
ｖｉｉ）滅菌組成物中にあるか；または
ｖｉｉｉ）放射性標識もしくは蛍光標識を含めて、検出可能に標識されている、
抗体であるか；
ｂ）項目２に記載の天然ＤＡＰ１０ポリペプチドに特異的に結合し、ここで当該抗体は、
ｉ）表２の成熟ポリペプチドに対して惹起されたか；
ｉｉ）免疫選択されているか；
ｉｉｉ）ポリクローナル抗体であるか；
ｉｖ）変性ＤＡＰ１０に結合するか；
ｖ）少なくとも３０μＭの、抗原に対するＫｄを示すか；
ｖｉ）ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基材に接着されているか；
ｖｉｉ）滅菌組成物中にあるか；または
ｖｉｉｉ）放射性標識もしくは蛍光標識を含めて、検出可能に標識されている、
抗体であるか；あるいは
ｃ）項目２に記載の天然ＭＤＬ−１ポリペプチドに特異的に結合し、ここで当該抗体は、以下：
ｉ）表３の成熟ポリペプチドに対して惹起されたか；
ｉｉ）免疫選択されているか；
ｉｉｉ）ポリクローナル抗体であるか；
ｉｖ）変性ＭＤＬ−１に結合するか；
ｖ）少なくとも３０μＭの、抗原に対するＫｄを示すか；
ｖｉ）ビーズもしくはプラスチック膜を含む固体基材に接着されているか；
ｖｉｉ）滅菌組成物中にあるか；または
ｖｉｉｉ）放射性標識もしくは蛍光標識を含めて、検出可能に標識されている、
抗体である、
結合化合物。
・（項目８） 項目７に記載の結合化合物、ならびに以下を含むキット：
ａ）当該結合化合物を含む区画；および／または
ｂ）当該キットにおける試薬の使用もしくは処理のための説明書。
・（項目９） 組成物であって、以下：
ａ）項目７に記載の滅菌結合化合物、あるいは
ｂ）項目７に記載の結合化合物およびキャリア、
を含む組成物であって、ここで当該キャリアは、
ｉ）水、生理食塩水、および／もしくは緩衝液を含む水性化合物であり；そして／または
ｉｉ）経口、直腸、鼻、局所、または非経口投与のために処方されている、
キャリアである、
組成物。
・（項目１０） 項目１に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸または組換え核酸であって、ここで当該核酸は、表１、２、または３の抗原ペプチド配列をコードする、核酸。
・（項目１１） 項目１０に記載の核酸であって、当該核酸は、上記表の複数の抗原ペプチド配列をコードする、核酸。
・（項目１２） 項目１０に記載の核酸であって、当該核酸は、以下：
ａ）発現ベクターであるか；
ｂ）複製起点をさらに含むか；
ｃ）天然供給源に由来するか；
ｄ）検出可能な標識を含むか；
ｅ）合成ヌクレオチド配列を含むか；
ｆ）６ｋｂ未満、好ましくは３ｋｂ未満であるか；
ｇ）霊長類もしくは齧歯動物を含む哺乳動物に由来するか；
ｈ）天然完全長コード配列を含むか；
ｉ）ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、もしくはＭＤＬ−１をコードする遺伝子のハイブリダイゼーションプローブであるか；または
ｊ）ＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物、もしくは変異誘発プライマーである、
核酸。
・（項目１３） 少なくとも５０℃、４００ｍＭ塩未満、および５０％ホルムアミドのストリンジェントな洗浄条件下で、以下：
ａ）配列番号１もしくは５；
ｂ）配列番号７もしくは９；または
ｃ）配列番号１１もしくは１３、
にハイブリダイズする、核酸。
・（項目１４） 項目１０に記載の組換え核酸を含む、細胞または組織。
・（項目１５） 項目１４に記載の細胞であって、ここで当該細胞は、以下：
ａ）原核生物細胞；
ｂ）真核生物細胞；
ｃ）細菌細胞；
ｄ）酵母細胞；
ｅ）昆虫細胞；
ｆ）哺乳動物細胞；
ｇ）マウス細胞；
ｈ）霊長類細胞；または
ｉ）ヒト細胞、
である、細胞。
・（項目１６） キットであって、項目１０に記載の核酸、ならびに以下を含むキット：
ａ）当該核酸を含む区画；
ｂ）ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、もしくはＭＤＬ−１ポリペプチドをさらに含む区画；および／または
ｃ）当該キットにおける試薬の使用もしくは処理のための説明書。
・（項目１７） 項目１３に記載の核酸であって、当該核酸は、以下：
ａ）少なくとも約３０のヌクレオチドのストレッチにわたって霊長類ＤＡＰ１２に対して同一性を示し；
ｂ）少なくとも約３０のヌクレオチドのストレッチにわたって霊長類ＤＡＰ１０に対して同一性を示し；
ｃ）少なくとも約３０のヌクレオチドのストレッチにわたって霊長類ＭＤＬ−１に対して同一性を示し；そして／または
ｄ）ＫＩＲ、ＩＬＴ／ＭＩＲ、もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターをさらにコードする、
核酸。
・（項目１８） 項目１７に記載の核酸であって、ここで、以下：
ａ）上記洗浄条件が６０℃および／もしくは２００ｍＭ塩であるか；または
ｂ）上記ストレッチが少なくとも５５個のヌクレオチドである、
核酸。
・（項目１９） 細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調整する方法であって、当該方法は、当該細胞と、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、またはＭＤＬ−１のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる工程を包含する、方法。
・（項目２０） 項目２に記載のＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０と、ＫＩＲ、ＩＬＴ／ＭＩＲ、またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターとの相互作用をブロックする化合物をスクリーニングする方法であって、当該方法は、当該レセプターの存在下で、当該化合物を当該ＤＡＰ１２または当該ＤＡＰ１０に接触させる工程を包含する、方法。
（好ましい実施態様の詳細な説明）
（Ｉ．概略）
本発明は、細胞活性化抗原に対して補助分子特性を示す、哺乳動物タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を提供する。１つのタンパク質は、ＤＮＡＸ活性化タンパク質、１２ｋＤ（ＤＡＰ１２）と呼ばれる。本明細書中に記載の霊長類配列は、種々のデータベースから同定された配列から得られた。他の哺乳動物種（齧歯動物を含む）におけるタンパク質についての同様の配列もまた入手可能なはずである。例示の目的のための以下の記載は、記載したヒトＤＡＰ１２天然対立遺伝子に関するが、同様に、例えば、他の個体に由来する対立遺伝子変異体および／または多型変異体、ならびにスプライシング変異体（例えば、天然形態）に適用可能である。
第２のタンパク質は、ＤＮＡＸ活性化タンパク質、１０ｋＤ（ＤＡＰ１０）と呼ばれ、これは、多くの類似した構造および生物学的特徴を示す。第３のタンパク質はＤＡＰ１２と、恐らくＤＡＰ１０と会合し、そして骨髄性ＤＡＰ１２会合レクチン−１（ＭＤＬ−１）と呼ばれる。
これらの遺伝子は、それらに関連するタンパク質をコードする他の霊長類または哺乳動物遺伝子の単離を可能し、記載した特定の実施態様以上にこのファミリーをさらに広げる。手順は、以下におおまかに示される。
ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２ｋＤ（ＤＡＰ１２）は、その構造特徴および推定機能のためにこのように命名された。ある細胞表面レセプターは内在機能を欠き、これは、１２ｋＤタンパク質であると示唆される別のタンパク質パートナーと仮定的に相互作用し得る。シグナリング機構には、ＩＴＡＭシグナルが関与し得る。
ＤＡＰ１２は、ＣＤ３との仮定された関連（Ｏｌｃｅｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５０８３−５０８６を参照のこと）、ＩＴＩＭ配列の存在（Ｔｈｏｍａｓ（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１９５３−１９５６を参照のこと）、特定サイズの予測（Ｏｌｃｅｓｅ；およびＴａｋａｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：７４１−７４７）、ならびに他の特徴に基づいて配列データベースから同定された。特に、膜貫通ドメインは、その推定レセプターパートナーであるＫＩＲ（キラー細胞阻害分子）、ＣＤ９４タンパク質、および恐らく他の同様のタンパク質の対応する膜貫通セグメントとの塩橋を可能にする、荷電残基を含むと仮定された。Ｄａｅｒｏｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６３５−６４６を参照のこと。
実際に、既知のＫＩＲ、ＭＩＲ、ＩＬＴ、およびＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプター分子の多くは、機能的レセプター複合体の一部である補助タンパク質と共に実際に機能し得る。Ｏｌｃｅｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５０８３−５０８６およびＴａｋａｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：７４１−７４７を参照のこと。従って、本発明は、機能的シグナリングレセプター（例えば、ＤＡＰ１２および／またはＤＡＰ１０と他のサブユニット）の精製形態を提供する。例えば、Ｄａｅｒｏｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６３５−６４６を参照のこと。従って、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０と別のレセプターとの組み合せは、カウンター（ｃｏｕｎｔｅｒ）レセプターまたは複合体のリガンドに対するレセプター複合体である、ある細胞上の機能的複合体を形成する。
ＤＡＰ１０は、ＤＡＰ１２に対するその相同性および他の特徴により部分的に同定された。特に、ＩＴＡＭ活性化モチーフを示すＤＡＰ１２とは対照に、ＤＡＰ１０は、ＩＴＩＭ阻害モチーフを示す。ＭＤＬ−１は、ＤＡＰ１２とのその機能的会合により同定された。
さらに、例えば、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０とその補助レセプターとの間の機能的相互作用は、短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）レセプター形態において通常見出されないレセプターにおける構造組み合わせの使用を可能にし得る。従って、ＤＡＰ１２およびＤＡＰ１０のような補助タンパク質によるシグナリング機構は、例えば、ＫＩＲ、ＭＩＲ、ＩＬＴ、およびＣＤ９４ ＮＫＧ２型レセプターを用いた、他のＫＩＲ様レセプター複合体の興味深い操作を可能にする。ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０と相互作用して機能的シグナリング複合体を形成する、インタクトなレセプターの短縮型形態が構築され得る。
霊長類および齧歯動物形態は、整列させられた場合、有意な配列同一性を示す。例えば、表１、２、および３を参照のこと。他の遺伝子は、全成熟コード領域にわたって非常に低い同一性を示すが、いくつかは、特定のセグメントにおいてより高い同一性を示す。
（ＩＩ．精製ＤＡＰおよびＭＤＬ）
表１は、ＤＡＰ１２実施態様についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の両方を開示する。霊長類ヌクレオチド配列は配列番号１に対応し；アミノ酸配列は配列番号２に対応する。シグナル配列は、ｍｅｔ（−２６）からｇｌｎ（−１）またはａｌａ１まであると思われ；成熟タンパク質はおよそａｌａ１（またはｇｌｎ２）から始まり、細胞外ドメインはおよそａｌａ１からｐｒｏ１４まであり；細胞外ドメインは７および９に２つのシステインを含み、このシステインは、さらなる同型または異型補助タンパク質へのジスルフィド結合を可能にするようであり；膜貫通領域はおよそｇｌｙ１５またはｖａｌ１６からおよそｇｌｙ３９まであり；そしてＩＴＡＭモチーフはｔｙｒ６５からｌｅｕ７９まである（ＹｘｘＬ−６／８ｘ−ＹｘｘＬ）。ＬＶＡ０３Ａ ＥＳＴが同定され、そしてこれを使用して他の重複配列を抽出した。ヒトＤＡＰ１２の一部であるＧｅｎｂａｎｋヒトＥＳＴ；全てではないがいくつかの包括的なＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡ４８１９２４；Ｈ３９９８０；Ｗ６０９４０；Ｎ４１０２６；Ｒ４９７９３；Ｗ６０８６４；Ｗ９２３７６；Ｈ１２３３８；Ｔ５２１００；ＡＡ４８０１０９；Ｈ１２３９２；Ｗ７４７８３；およびＴ５５９５９もまた参照のこと。
（表１）ヒトｃＤＮＡライブラリーから同定された霊長類ＤＡＰ１２ ｃＤＮＡ。配列番号１および２。実際のシグナル切断点は、同定されたシグナル切断点（例えば、ａｌａ１とｇｌｎ２の間であり得る）とはわずかに異なり得る。
Figure 0004855513
（表１）（続き）隣接する非翻訳領域を有するコンティグ配列（あまり確実ではない；ありうる配列誤差；配列番号３）
Figure 0004855513
（表１）（続き）：げっ歯類ＤＡＰ１２ ｃＤＮＡ、マウスＥＳＴ Ｇｅｎｂａｎｋ番号第ＡＡ２４３１５号；同第Ｗ９１１８４号；同第ＡＡ０９８５０６号；ＡＡ１３８４０６号；同第Ｗ８８１５９号；および同第Ｗ４１１４２号を参照のこと。ホールを満たしているコンセンサス配列は、当業者のレベル内で充分である。配列番号５および６を参照のこと。シグナル切断点は、いずれかの側に対してであり得る。
Figure 0004855513
（表１）（続き）霊長類およびげっ歯類ＤＡＰ１２タンパク質配列（配列番号２および４）のアラインメント
Figure 0004855513
表２は、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と、ヒトおよびマウスＤＡＰ１０遺伝子の各々の対応するアミノ酸配列の両方を開示している。ヒトのヌクレオチド配列は、配列番号７に対応する；このアミノ酸配列は、配列番号８に対応する。シグナル配列は、およそｍｅｔ（−１８）からａｌａ（−１）に向う（ｒｕｎ）ようである；成熟タンパク質は、およそｇｌｎ１から向かうはずである；細胞外ドメインは、およそｇｌｎ１からｐｒｏ３０へ向うはずである；細胞外ドメインは、２１および２４に２つのシステイン（これらは、さらなる同型アクセサリータンパク質または異型アクセサリータンパク質へのジスルフィド結合が可能なようである）を含む；膜貫通領域は、ａｓｐ３９に対応する特徴的な荷電残基と共に、およそｌｅｕ３１からｖａｌ１４７へ向う；そして目的のＹｘｘＭモチーフは、ｔｙｒ６７からｍｅｔ７０（これは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ１９に見られるモチーフと同じである）に向う。表２を参照のこと。
同様に、マウスＤＡＰ１０については、シグナル配列は、およそｍｅｔ（−１８）からｓｅｒ（−１）へ向うはずである；成熟タンパク質は、およそｇｌｎ１から向うはずであり、細胞外ドメインは、およそｇｌｎ１からｐｒｏ１６へ向うはずである；細胞外ドメインは７および１０に２つのシステイン（これらは、さらなる同型アクセサリータンパク質または異型アクセサリータンパク質へのジスルフィド結合が可能なようである）を含む；膜貫通領域は、ａｓｐ２５に対応する特徴的な荷電残基とともに、およそｌｅｕ１７からｖａｌ３３へ向かう；そして目的のＹｘｘＭモチーフは、ｔｙｒ５４からｍｅｔ５７（これは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に見られるモチーフと同じである）に向う。
（表２）ヒトｃＤＮＡライブラリーから同定された霊長類ＤＡＰ１０ ｃＤＮＡ。配列番号７および８を参照のこと。
Figure 0004855513
（表２）（続き）マウスライブラリーからのげっ歯類ＤＡＰ１０ ｃＤＮＡ配列。配列番号９および１０を参照のこと。
Figure 0004855513
（表２）（続き）霊長類およびげっ歯類のタンパク質配列（配列番号８および１０）のアライメント。
Figure 0004855513
（表３）霊長類（例えば、ヒト）ＭＤＬ−１配列（配列番号１１および１２）。設計されたメチオニンは、上流末端コドンを有さないので、予測されるように、このタンパク質は実際に、さらなる上流配列を有すことが考え得る。このメチオニンは、マウス配列と共に配置する（以下を参照のこと）。
Figure 0004855513
Figure 0004855513
（表３）（続き）げっ歯類（例えば、マウス）ＭＤＬ−１長形態配列（配列番号１３および１４）。短形態改変体が同定され、これはヌクレオチド２２１−２９５の欠失を有した。特徴付けられた短形態改変体はまた、配列差異を有する：ヌクレオチド２９〜３５はＣＡＧＡＡＧＡを読む；１０７〜１０９はＡＧＡを読む；１２８〜１２９はＡＴを読む；８２０〜８２６は、ＣＡＴＡＧＧＴを読む；欠失８５９；および８７９〜８８０は、ＣＡを読む。開始メチオニンは、正確なアミノ末端であることを示唆する、上流末端コドンを有する。
Figure 0004855513
Figure 0004855513
（表３）（続き）ヒトＭＤＬ−１およびマウスＭＤＬ−１長形態のアラインメント。特に目的のものは、残基１〜２に対応する、非常に短い細胞内ドメインである；およそ残基１６に荷電されたアミノ酸を有する、約６〜２７へ向う膜貫通ドメインと共に。３つの推定のＮ結合型グリコシル化部位は、マウス長形態の残基５１、１４６、および１５３に対応する；この後者は、ヒト配列中に保存される。短形態に関連するマウス長形態が、およそ２５アミノ酸のスペーサーセグメントを含むようであることに注意のこと。
Figure 0004855513
本明細書中に使用されるように、用語「ヒトＤＡＰ１２」とは、タンパク質状況で使用される場合、表１に示される霊長類アミノ酸配列を有するタンパク質をいうべきである。本発明はまた、ヒトＤＡＰ１２特異的結合成分と同じ生物学的機能を示すかまたは相互作用する、ヒト誘導化ポリペプチドとともに、タンパク質の実質的なフラグメント（例えば、変異体および多型改変体）を含むタンパク質を包含する。これらの結合成分は、代表的には、高い親和性（例えば、少なくとも約１００ｎＭ、通常は、約３０ｎＭを超えて良好である、好ましくは約１０ｎＭを超える、そしてより好ましくは、約３ｎＭを超える）でヒトＤＡＰ１２に結合する。同種タンパク質は、ヒト以外の種（例えば、霊長類）で見出される。以下のほとんどの説明はＤＡＰ１２に関するが、同じ方法および特徴が、ＤＡＰ１０およびＭＤＬ−１遺伝子に同様に適用可能であり得る。ＤＡＰ１２に関する多くの限定は、ＤＡＰ１０およびＭＤＬ−１に関する参考文献における用語と一致するが、１つの遺伝子に関連する特定の限定（例えば、長さの限界）は、他のものに適用することを必然的に意図しない。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、フラグメントまたはセグメントを含み、そして少なくとも約８アミノ酸のアミノ酸、一般的には少なくとも１０アミノ酸、より一般的には少なくとも１２アミノ酸、頻繁には少なくとも１４アミノ酸、より頻繁には少なくとも１６アミノ酸、代表的には少なくとも約１８アミノ酸、より代表的には少なくとも約２０アミノ酸、通常少なくとも約２２アミノ酸、より通常には少なくとも約２４アミノ酸、好ましくは少なくとも約２６アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２８アミノ酸、および特に好ましい実施態様では少なくとも約３０以上のアミノ酸、例えば、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、７５、１００、１２５などのアミノ酸残基のストレッチを包含する。好ましい実施態様において、特定の長さの複数の異なる（例えば、重複しない）セグメントが存在する。代表的には、複数は、少なくとも２、より通常には少なくとも３、および好ましくは５、７、またはそれ以上である。最小の長さが提供されるが、種々のサイズのより長い長さ、例えば、１つの長さ７、および２つの長さ１２が、適切であり得る。
用語「結合組成物」とは、例えば、抗体−抗原型様式において、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、またはＭＤＬ−１に特異的に結合する分子をいう。他の相互作用には、例えば、レセプター複合体を形成する、レセプター成分−レセプター成分が含まれる。複合体の他のメンバーは、上記に記載される、ＫＩＲ、ＬＴＲ、ＭＩＲ、ＩＬＴ、およびＣＤ９４形態であるようである。別の目的の相互作用には、これのカウンター−レセプター（これ自身は、単一のタンパク質または複合体であり得る）とのこのようなレセプター複合体が含まれる。例えば、ＫＩＲ−ＤＡＰ１２複合体のためのレセプターは、おそらくＭＨＣクラスＩである。このような相互作用は、代表的には共有または非共有のいずれかである、タンパク質−タンパク質相互作用である。分子は、ポリマーまたは化学試薬であり得る。機能的アナログは、構造的改変を有する形態であり得るか、または適切な表面結合決定基と相互作用する分子形状を有する完全に関連のない分子であり得る。アナログは、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら（編） （１９９０） Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
ポリペプチドまたはフラグメントの溶解度は、環境およびポリペプチドに依存する。多くのパラメータは、ポリペプチド溶解度に影響を及ぼし、これには、温度、電解質環境、ポリペプチドのサイズおよび分子特徴、ならびに溶媒の性質を含む。代表的には、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約６５℃の範囲にある。通常、使用時の温度は、約１８℃を超え、およびより通常には約２２℃を超える。診断目的については、温度は、通常、ほぼ室温またはより温かであるが、アッセイにおける成分の変性温度未満である。治療目的については、温度は、通常では体温、代表的にはヒトについては約３７℃であるが、ある状況下では、温度は、インサイチュまたはインビトロで上昇または低下し得る。
電解質は、通常、およそインサイチュ生理学的状態であるが、有利になる、より高いイオン強度またはより低いイオン強度へと改変され得る。実際のイオンは、生理学的状況または分析的状況において使用される標準緩衝液に一致するように改変され得る。
ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的には、実質的に安定な状態にあるべきであり、そして通常、変性状態にはない。ポリペプチドは、例えば、溶解度を与えるために、４次構造で他のポリペプチドと会合し得るか、あるいは天然の脂質二重層相互作用に近い様式で脂質または界面活性剤と会合し得る。このようなタンパク質は、例えば、ＫＩＲ、ＭＩＲ、ＩＬＴ、またはＣＤ９４タンパク質の可溶性／短い形態である。これらの複合体の破壊は、代表的には、シグナル機能をブロックする。
溶媒は、通常、生物学的活性の保存に使用されるタイプの、生物学的適合可能な緩衝液であり、そして通常、生理学的溶媒に近い。通常、溶媒は、中性ｐＨ、代表的には約５〜１０の間、および好ましくは約７．５を有する。場合によっては、界面活性剤が添加され、代表的には穏和な非変性界面活性剤、例えば、ＣＨＳ（コレステリルヘミスクシネート）またはＣＨＡＰＳ（３−（［３−コラミドプロピル］ジメチル−アンモニオ）−１−プロパンスルホン酸）、またはタンパク質の３次構造を破壊しないような十分に低い界面活性剤濃度である。
溶解度は、スウェードベリー単位で測定される沈降によって反映され、この単位は特定の条件下の分子の沈降速度の尺度である。沈降速度の決定を、分析用超遠心分離機で古典的に行ったが、代表的には、現在は標準的超遠心分離機で行われる。Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ（１９８２）Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；およびＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ（１９８０）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１〜３部、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏを参照のこと。粗決定として、推定的可溶なポリペプチドを含むサンプルが、標準的フルサイズの超遠心分離機で約５０Ｋ ｒｐｍにて約１０分間回転され、そして可溶性分子は上清に残る。可溶性粒子またはポリペプチドは、代表的には、約３０Ｓ未満、より代表的には約１５Ｓ未満、通常は約１０Ｓ未満、より通常には約６Ｓ未満、ならびに特定の実施態様では好ましくは約４Ｓ未満、およびより好ましくは約３Ｓ未満である。
（ＩＩＩ．物理的改変体）
本発明はまた、例えば、ヒトＤＡＰ１２のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはペプチドを包含する。これは、例えば１倍、２倍、３倍、５倍の置換体、好ましくは保存体を提供する。このような改変体は、特異的抗体を産生するために有用であり得、そしてしばしば多くのまたは全ての生物学的特性を共有する。
アミノ酸配列同一性は、残基適合を最適にすることによって決定される。これは、保存的置換を適合とみなす場合に変化する。保存的置換には、代表的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。類似のアミノ酸配列には、各それぞれのタンパク質配列における天然の対立遺伝子改変体が含まれることが意図される。代表的な同種タンパク質またはペプチドは、例えば、ヒトＤＡＰ１２のアミノ酸配列と、８５〜１００％同一性（ギャップが導入され得る場合）から９０〜１００％同一性（保存的置換が含まれる場合）までを有する。同一性の尺度は、少なくとも約８５％、一般的には少なくとも約８７％、しばしば少なくとも約８９％、代表的には少なくとも約９１％、通常には少なくとも約９３％、より通常には少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９７％、およびより好ましくは少なくとも約９８％、そして特に好ましい実施態様では少なくとも約９９％以上である。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３；Ｓａｎｋｏｆｆら（１９８３）Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ， Ｓｔｒｉｎｇ Ｅｄｉｔｓ， ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎの第１章、 Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ， Ｒｅａｄｉｎｇ， ＭＡ；ならびにＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ；およびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩからのソフトウエアパッケージもまた参照のこと。
単離されたヒトＤＡＰ、およびＭＤＬ ＤＮＡは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの逆転によって、容易に改変され得る。これらの改変は、有用な抗原、これらの誘導体、または類似するかもしくはアンタゴニスト活性を有するタンパク質をコードする新規ＤＮＡ配列を生じる。これらの改変された配列は、変異体抗原を産生するために、または発現を増強するために、使用され得る。増強された発現は、遺伝子増幅、増加した転写、増加した翻訳、および他のメカニズムを包含し得る。このような変異体ＤＡＰ１２誘導体には、それぞれのタンパク質またはそのフラグメントの所定のまたは部位特異的変異が含まれる。「変異体ＤＡＰ１２」は、上記のヒトＤＡＰ１２の重要な特性を共有するが、欠失、置換、または挿入によるいずれかで、天然に見られるＤＡＰ１２とは異なるアミノ酸配列を有する、その他のポリペプチドを包含する。特に、「部位特異的変異体ＤＡＰ１２」は、表１の抗原との相同性を有し、そしてこれらの抗原と関連する生物学的活性を共有するとして定義される。同様の概念が、特に、種々の他の動物で見られる、異なるＤＡＰ１２タンパク質に適用する。上記のように、説明は、さらなるＤＡＰタンパク質およびＭＤＬタンパク質を含むことを一般に意味するが、具体的に議論された霊長類実施態様へもっぱら限定されないことが強調される。
部位特異的変異部位は予め定められているが、変異体は部位特異的である必要はない。ヒトＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、またはＭＤＬ−１変異誘発は、アミノ酸挿入または欠失の作製によって行われ得る。置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせは、最終構築物で到達するために生成され得る。挿入は、アミノ末端融合またはカルボキシ末端融合を包含する。ランダム変異誘発は、標的コドンで行われ得、そして発現された変異体は、次いで所望の活性についてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するＤＮＡにおいて所定の部位に置換変異を作成する方法は、例えば、当該分野で周知であるＭ１３プライマー変異誘発による。Ｓａｍｂｒｏｏｋら （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら （１９８７年および補遺）もまた参照のこと。
ＤＮＡの変異は、正常には、リーディングフレームの外のコード配列に配置すべきではなく、そして好ましくは、ループまたはヘアピンのような二次ｍＲＮＡ構造を産生するためにハイブリダイズし得る相補領域を生成しない。
本発明はまた、これらのタンパク質からのセグメントを使用して、組換えタンパク質、例えば、異種融合タンパク質を提供する。異種融合タンパク質は、天然では同じ方法で通常は融合しないタンパク質またはセグメントの融合物である。従って、例えば、ＤＡＰ１２ポリペプチドとの免疫グロブリンの融合産物は、代表的なペプチド結合で融合され、代表的には単一の翻訳産物として作成され、そして各ソースペプチドに由来する特性を示す配列を有する、連続するタンパク質分子である。同様の概念は、異種核酸配列に適用する。特に目的の融合物は、上記で議論されるような、そのレセプターパートナーを有するＤＡＰ１２である。両方のタンパク質の実施態様および、両方のレセプター複合体成分をコードする核酸は、価値がある。
さらに、新しい構築物は、他のタンパク質からの類似の機能的ドメインを組み合わせることから作製され得る。例えば、パートナー結合セグメントまたは他のセグメントは、異なる新しい融合ポリペプチドまたはフラグメント間で、「交換」され得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６；およびＯ’Ｄｏｗｄら （１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５９８５−１５９９２を参照のこと。従って、特異性の新しい組み合わせを示す新しいキメラポリペプチドは、パートナー結合特異性および他の機能性ドメインの機能的連結から生じる。
ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２によって記載されるホスホロアミデート法は、適切な合成ＤＮＡフラグメントを産生する。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングすることによって、または適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってしばしば得られる。
特定の状況において、複数のＩＴＡＭ反復またはＩＴＩＭ置換を有するＤＡＰ１２は、有用であり得る。さらに、インタクトなレセプター機能は、膜貫通レセプターの長形態を２つの分離するサブユニット（これらは、そのパートナーと共にＤＡＰ１２と同様に相互作用する）へ開裂させることによって達成され得る。従って、インタクトな長形態レセプターは、ＤＡＰ１２によって短縮されたレセプターのペアと置換され得る。組合わせの核酸構築物もまた、調製され得る。ＤＡＰ１０、およびＩＴＩＭ反復物、またはＩＴＩＭ置換物と同様に。
（ＩＶ．機能性改変体）
ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０抗原に対する生理学的応答の遮断は、おそらく競合阻害によって、ＤＡＰレセプター複合体へのパートナーの結合の阻害から生じ得る。従って、本発明のインビトロアッセイは、しばしば、単離されたタンパク質、組換えＤＡＰ１２を発現する細胞からの膜、これらの抗原のパートナー結合セグメントを含む可溶性フラグメント、または固体基材へ付着したフラグメントを使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメント変異および改変、または結合パートナー変異および改変のいずれかの効果の診断決定を可能にする。
本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイ（例えば、ここで抗原または抗原フラグメントに対する中和抗体は、タンパク質への結合のための試験化合物と競合する）の使用を意図する。同じ様式で、この抗体は、抗原の１つ以上の結合部位を共有するポリペプチドの存在を検出するために使用され得、そしてまた、他の結合パートナーによって占領され得る、タンパク質の結合部位を占領するために使用され得る。本発明はまた、パートナー間の膜貫通セグメントにおける荷電された残基の架橋を妨害する化合物についてのスクリーニングを意図する
。
さらに、ＤＡＰまたはＭＤＬ、および高い親和性のカウンターパート結合部位を含む、ＤＡＰまたはＭＤＬの可溶性フラグメントに対する中和抗体は、組織（例えば、異常な生理学を経験している組織）における結合機能を阻害するために使用され得る。他の成分と相互作用する細胞内ドメインはまた、薬物スクリーニングのための標的である。
ＤＡＰまたはＭＤＬ抗原の「誘導体」には、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、および他の化学部分との共有結合体または凝集結合体が含まれる。共有誘導体は、当該技術分野で周知の手段によって、ＤＡＰまたはＭＤＬ抗原アミノ酸側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端で見られる基への機能性の連結によって調製され得る。これらの誘導体には、カルボキシル末端の、またはカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体が非限定的に含まれ得る。アシル基は、Ｃ３〜Ｃ１８の正常アルキルを含むアルキル部分の群から選択され、それによってアルカノイルアロイル種を形成する。
特に、グリコシル化変化が含まれ、例えば、その合成およびプロセシング中に、または更なるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって作製される。タンパク質上に天然のＮ結合型部位は存在しないが、Ｏ結合型部位は存在し得、あるいはこのような部位を有する改変体は産生され得る。これを達成するために特に好ましい手段は、このようなプロセシングを通常は提供する細胞に由来するグリコシル化酵素、例えば、ヒトグリコシル化酵素に、ポリペプチドを曝露することによる。脱グリコシル化酵素もまた意図される。また、他のマイナーな改変を有する同じ一次アミノ酸配列の型を含み、これには、リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニン）が含まれる。
誘導体の主要な群は、例えば、ポリペプチドの他のタンパク質と、ＤＡＰ１２抗原またはそれらのフラグメントとの共有結合体である。これらの誘導体は、Ｎ−またはＣ−末端融合体のような組換え培養物中で、あるいは反応性側基によってタンパク質を架橋することにおけるそれらの有用性について当該技術分野で公知の薬剤の使用によって、合成され得る。架橋剤との好ましい誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭水化物部分、およびシステイン残基にある。
ＤＡＰ１２抗原と他の同種または異種タンパク質との間の融合ポリペプチドも提供される。同種ポリペプチドは、異なる表面マーカー間の融合物であり得、例えば、１つ以上のマーカータンパク質の結合特異性を示す、ハイブリッドタンパク質を生じる。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合物が、構築され得る。代表的な例は、レポーターポリペプチド（例えば、ルシフェラーゼ）の抗原のセグメントまたはドメイン（例えば、パートナー結合セグメント）との融合物であり、その結果、所望のパートナーの存在または位置が容易に決定され得る。例えば、Ｄｕｌｌら， 米国特許第４，８５９，６０９号（これを本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーには、細菌性β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子が挙げられる。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８１２−８１６を参照のこと。
ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ （１９８１） Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔｓ． ２２：１８５９−１８６２によって記載されたホスホルアミダイト法は、適切な合成ＤＮＡフラグメントを産生する。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングすることによって、または適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってしばしば得られる。
このようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分の付加もしくは除去によって化学的に改変されているアミノ酸残基、特にリン酸基に類似の分子形状を有する残基を有し得る。いくつかの実施態様では、改変は、有用な標識試薬であり、または精製標的、例えば、アフィニティー試薬として役立つ。
融合タンパク質は、代表的には組換え核酸方法によって、または合成ポリペプチド方法によってのいずれかで作製される。核酸操作および発現のための技術は、一般には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版） 第１巻−第３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。ポリペプチドの合成のための技術は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７；およびＡｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄに記載されている。
本発明はまた、アミノ酸配列の変更またはグリコシル化以外のこれらのＤＡＰ１２抗原の誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分との共有結合的または凝集的会合を含み得る。これらの誘導体は、一般的に、これらのクラスに分類される：（１）塩、（２）側鎖および末端残基共有改変、および（３）例えば、細胞膜との吸着複合体。このような共有結合的誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイにおける試薬として、または結合パートナーのアフィニティー精製のためのような精製方法において、有用である。例えば、ＤＡＰ１２抗原は、当該技術分野で周知の方法によって、臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのような固体支持体への共有結合によって固定され得、または抗ＤＡＰ１２抗体もしくはその結合パートナーのアッセイまたは精製における使用のために、グルタルアルデヒド架橋ありまたはなしで、ポリオレフィン表面上に吸着され得る。ＤＡＰ１２抗原はまた、検出可能な基で標識され得、例えば、クロラミンＴ手順によってチロシンへ放射性ヨウ素化（例えば、天然配列へ組み込まれる）され、希土類キレートに共有結合され、または診断アッセイにおける使用について別の蛍光部分に結合される。
本発明の可溶性ＤＡＰ抗原またはＭＤＬ抗原は、抗原またはこれらの多くのフラグメントに特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原として使用され得る。精製抗原は、タンパク質を含む不純な調製物の種々の形態による免疫によって調製されたモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントをスクリーニングするために使用され得る。特に、用語「抗体」はまた、天然抗体の抗原結合フラグメントを包含する。精製されたＤＡＰまたはＭＤＬはまた、上昇レベルのＤＡＰ、ＭＤＬ，または抗原を含む細胞フラグメント（これらの両方は、異常の診断または特異的な生理学的状態または疾患状態であり得る）の存在に応答して産生した抗体を検出するための試薬として使用され得る。さらに、ＤＡＰまたはＭＤＬフラグメントはまた、すぐ下で記載されるように、本発明の抗体を産生するための免疫原として役立ち得る。例えば、本発明は、抗体のアミノ酸配列または、例えば表１、２、または３で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸またはそれらのフラグメントに対して惹起された抗体を意図する。特に、本発明は、特異的フラグメントへの結合親和性を有する抗体、または特異的フラグメントに対して惹起された抗体を意図する。これらは、脂質二重層の外側、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかにに存在することが予測される。さらに、種々の構築物は、他の、分子の細胞外へ曝露された部分に関連する膜会合セグメントの融合から産生され得る。他の抗原複合体が使用され得、これは、レセプターパートナーとのＤＡＰまたはＭＤＬの複合体を含む。
本発明は、さらに密接に関連した改変体の単離を意図する。対立遺伝子改変体は、例えば本明細書中に記載された実施態様と９０〜９７％を超える同一性を示す、異なる個体に存在する。
本発明はまた、構造、発現、および機能において、明瞭性と類似性の両方を示す、関連抗原の群を単離するための手段を提供する。抗原の多くの生理学的効果の解明は、抗原の明瞭な種のカウンターパートの単離および特徴付けによって大きく加速される。特に、本発明は、異なる種においてさらなる同種遺伝実体を同定するために有用なプローブを提供する。
単離された遺伝子は、ＤＡＰまたはＭＤＬ、例えば、種型または細胞（これは、対応する抗原を欠失し、そしてネガティブバックグランド活性を示す）のいずれかの発現を欠失する細胞の形質転換を可能にする。ＣＤ９４またはＮＫＡＴ５でトランスフェクトされた種々の細胞型（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＹＴ、またはＢＡＦ３）は、ＤＡＰ１２でまたトランスフェクトされた場合のシグナリングを示し得る。形質転換された遺伝子の発現は、定義されるかまたは単一種改変体と共に、抗原性的に純粋な細胞株の単離を可能にする。このアプローチは、シグナリングの生理学的効果のより感度の良い検出および区別を可能にする。細胞成分フラグメント（例えば、細胞質または膜フラグメント）は単離されそして使用され得る。
レセプター結合によって提供される種々の分化機能をもたらす臨界構造要素の解剖は、現代の分子生物学の標準技術を使用して（特に関連するクラスのメンバーと比較して）可能である。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３９−１３３６に記載される同種スキャニング変異誘発技術；およびＯ’Ｄｏｗｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９８５−１５９９２；およびＬｅｃｈｌｅｉｔｅｒら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：４３８１−４３９０で使用されるアプローチを参照のこと。
特に、レセプターパートナー結合セグメントは、どの構造的な特徴が、結合親和性および特異性の両方において重要であるかを決定するために、種改変体間で置換され得る。異なるアレイ（例えば、ＤＡＰ１２改変体）は、異なる種改変体との相互作用の組み合わされた特性を示すパートナーについてスクリーニングするために使用される。
細胞内機能は、おそらく、抗原（これは、通常細胞質に接近し易い）のセグメントを含む。しかし、抗原インターナリゼーションは、特定の環境下で生じ得、そして細胞内成分と設計された「細胞外」セグメントとの間の相互作用も生じ得る。他の細胞内成分とＤＡＰ１２の相互作用の特異的セグメントは、突然変異誘発または直接の生化学的手段（例えば、架橋、親和性、または遺伝的方法）によって同定され得る。結晶学的方法または他の物理的方法による構造分析もまた、適用し得る。シグナル形質導入のメカニズムのさらなる研究には、親和性方法によって単離され得る、関連する成分の研究が含まれる。
ＤＡＰ１２抗原の発現および制御のさらなる研究が、追求される。抗原と関連する制御エレメントは、分化的、発生的、組織特異的または他の発現パターンを示し得る。上流または下流遺伝子領域（例えば、制御エレメント）は、目的のものである。
ＤＡＰ１２抗原の構造的研究は、アゴニストまたはアンタゴニスト特性を示す、新規の改変体、特にアナログの設計を導く。これは、活性の所望のスペクトルを示す改変体を単離するための、以前に記載したスクリーニング方法と組み合わせ得る。
他の細胞型における発現は、特定の抗原において、しばしばグリコシル化の差異を生じる。種々の種の改変体は、アミノ酸配列以外の構造的な差異に基づく明らかな機能を示し得る。差示的な改変は、差示的な機能が原因であり得、そしてこの効果の解明は、現在、可能である。
前述の説明は、主にヒトＤＡＰ１２に集中しているが、当業者は、本発明が、他のＤＡＰ１２抗原（例えば、霊長類および他の哺乳動物種改変体）を包含すると即座に理解する。さらに、ＤＡＰ１０遺伝子は、ＤＡＰ１２と類似の多くの特性を示し、そして類似の様式で改変され得る。ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、およびＭＤＬ−１が、互いに関連し得、そして全て特定の条件で多タンパク質複合体と関連し得る。
Ｖ．抗体
抗体は、天然に存在する形態および組み換え形態の両方での、ＤＡＰまたはＭＤＬ抗原の種々の対立遺伝子または種変異体およびそのフラグメントに対して惹起され得る。さらに、抗体は、活性形態もしくは不活性形態のいずれか、または天然のもしくは変性した形態でのＤＡＰ１２に対して惹起され得る。抗イディオタイプ抗体も意図される。
ＤＡＰまたはＭＤＬの所定のフラグメントに対する、結合フラグメントおよび一本鎖型を含む、抗体は、このフラグメントの免疫原性タンパク質とのの結合体での、動物の免疫によって惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常または欠損ＤＡＰまたはＭＤＬへの結合についてスクリーニングされるか、あるいはアゴニストまたはアンタゴニスト機能活性についてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常は、少なくとも約１ｍＭ、より通常には少なくとも約３００μＭ、代表的には少なくとも約１０μＭ、より代表的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、およびより好ましくは少なくとも約３μＭより良好のＫDで結合する（例えば、１μＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭなど）。
抗原結合フラグメントを含む本発明の抗体は、重要な診断または治療価値を有し得る。それらは、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、ＭＤＬ−１に対して結合する強力なアンタゴニストであり得、そして／またはパートナー結合を阻害し、または生物学的応答を誘発する能力を阻害し得る。それらはまた、非中和抗体として有用であり得、そして毒素または放射性核種と結合され得、その結果、抗体が抗原と結合したとき、細胞自身が殺される。さらに、これらの抗体は、直接的に、または間接的に、リンカーによって薬剤または他の治療剤と結合され得る。
本発明の抗体はまた、診断的適用において有用であり得る。捕捉または非中和抗体として、それらは、パートナー結合および／またはシグナル伝達を阻害しないで、ＤＡＰまたはＭＤＬと結合し得る。中性化抗体として、それらは、競合結合アッセイにおいて有用であり得る。それらはまた、ＤＡＰまたはＭＤＬまたはそのパートナーの検出または定量に有用である。
ＤＡＰ１２フラグメントは、他の物質、特に、ポリペプチドと結合され得、これは、免疫原として使用される融合または共有結合したポリペプチドとしてである。ＤＡＰ１２およびそのフラグメントは、様々な免疫原（キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風毒素など）と融合または共有結合し得る。ポリクローナル抗血清調製法の説明については、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ、１９６９；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＷｉｌｌｉａｍｓら（１９６７）Ｍｅｈｔｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。典型的な方法は、抗原での動物の超免疫化を含む。次に、動物の血液は、繰り返しての免疫化の後、すぐに集められ、そしてγ−グロブリンが単離される。あるいは、細胞がハイブリドーマ作製のため集められ得る。
いくつかの場合には、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなどのような種々の哺乳動物宿主からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （第４版）、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， ＣＡおよびそれに引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ （１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （第２版） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；そして特にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（これはモノクローナル抗体を生成する１つの方法を議論する）で見出され得る。簡単にまとめると、この方法は、動物に免疫原を注射する工程を包む。次いで、動物を屠殺し、そして細胞をその脾臓から採取し、次いでミエローマ細胞と融合する。結果物は、インビトロで再生し得るハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」である。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングして、個々のクローンを単離し、そのそれぞれは免疫原に対する単一抗体種を分泌する。このようにして、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質上で認識された特定の部位に応じて生成した、免疫動物からの、不死化されかつクローニングされた単一のＢ細胞の産物である。
他の適切な技術には、抗原性ポリペプチドに対して、または代わりに、ファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択に対してのリンパ球のインビトロの暴露が含まれる。Ｈｕｓｅら（１９８９）「ラムダファージ中での免疫グロブリンレパートリーのより大きなコンビナトリアルライブラリーの生成」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変ありまたはなしで使用され得、これらには、キメラまたはヒト化抗体が含まれる。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を、共有結合または非共有結合のいずれかで結合することによって標識される。広範な種々の標識および結合技術が公知であり、そして科学および特許文献の両方に広く報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が挙げられる。組換え免疫グロブリンもまた、産生され得る。Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。
本発明の抗体はまた、タンパク質を単離することにおけるアフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。カラムが調製され得、ここで、抗体は、固体支持体、例えば、粒子（アガロース、ＳＥＰＨＡＤＥＸなど）に連結され、細胞溶解物がカラムを通過し得、カラムが洗浄され、次いで穏和な変性剤の濃度を上昇させ、それによって精製したＤＡＰ１２タンパク質が放出される。
抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。通常、このような手順で使用される抗体は、抗体結合によって抗原の存在の検出を容易にする部分で標識される。
ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、またはＭＤＬ−１抗原に対して惹起された抗体はまた、抗イデオタイプ抗体を惹起するために使用される。これらは、各抗原の発現に関連した様々な免疫学的条件を検出または診断するのに有用である。
規定された免疫原（例えば、配列番号２または６のアミノ酸配列からなる免疫原）に対して生成した抗体と特異的に結合するか、または特異的に免疫反応性であるＤＡＰ１２タンパク質は、代表的には、イムノアッセイで測定される。このイムノアッセイは、代表的には、ポリクローナル抗血清（例えば、配列番号２または６のタンパク質に対して惹起されたもの）を使用する。この抗血清は、他のＣＤ３ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ３またはＦｃεＲγ）に対して低い交差反応性を有するように、好ましくは、同種から選抜され、そして、そのような交差反応性は、いずれもイムノアッセイで使用される前に免疫吸収によって取り除かれる。
イムノアッセイで使用する抗血清を作製するために、配列番号２または６のタンパク質またはその組み合わせは、本明細書に記載されたように単離される。例えば、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株で作製され得る。適切な宿主（例えば、Ｂａｌｂ／ｃのような純系マウス）は、代表的には、標準のアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）および標準マウス免疫化プロトコール（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記、を参照のこと）を使用して、選抜されたタンパク質で免疫化される。あるいは、本明細書で開示された配列由来のキャリアタンパク質と結合した合成ペプチドが、免疫原として使用され得る。ポリクローナル血清は、集められ、そしてイムノアッセイ（例えば、固体支持体で固定された免疫原を有する固相イムノアッセイ）で免疫原タンパク質に対して力価が測定される。１０4以上の力価を有するポリクローナル抗血清は、選抜され、そして他のＣＤ３ファミリーメンバー（例えば、霊長類またはげっ歯動物ＣＤ３）に対しての交差反応性を、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前記、５７０−５７３頁に記載されている１つのような競合結合イムノアッセイを使用して、試験される。好ましくは、少なくとも２個のＣＤ３ファミリーメンバーが、霊長類またはげっ歯動物ＤＡＰ１２にどちらかまたはいくつかと関連してこの測定に使用される。これらのＤＡＰ１２ファミリーメンバーは、本明細書に記載されたような標準の分子生物学およびタンパク質化学技術を使用して、組換えタンパク質として産生され得、そして単離され得る。同様な技術は、ＤＡＰ１０またはＭＤＬ−１に対して適用し得る。
競合結合様式におけるイムノアッセイは、交差反応性測定のために使用され得る。例えば、配列番号２および／または６のタンパク質が、固体支持体に結合され得る。このアッセイに加えられたタンパク質は、固定化された抗原に対して抗血清の結合で競合する。固定化したタンパク質に対して抗血清の結合で競合する上記タンパク質の能力が、配列番号２および／または６のタンパク質と比較された。上記タンパク質のパーセント交差反応性が標準の計算を使用して算出される。上記でリストされた各タンパク質と１０％より低い交差反応性を有する抗血清は、選択され、そしてプールされる。次に、交差反応性抗体が、上記にリストされているタンパク質との免疫吸収によって、プールされた抗血清から除かれる。
次に、免疫吸収されそしてプールされた抗血清は、上記のような競合結合イムノアッセイで、第２のタンパク質を免疫原タンパク質（例えば、配列番号２および／または６のＤＡＰ１２様たんぱく質）と比較するために使用される。この比較をするために、この２種のタンパク質が広い範囲の濃度でそれぞれアッセイされ、固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合を５０％を阻害するのに必要とされる各タンパク質の量が測定される。第２のタンパク質の必要量が、選抜されたタンパク質の必要とされる量の２倍より少ないならば、そのとき、第２のタンパク質は、免疫原に対して生成された抗体と特異的に結合すると言われる。
ＶＩ．核酸
ヒトＤＡＰまたはＭＤＬプローブ、またはそのフラグメントは、他の種由来の相同タンパク質、または同じ種または他の種における他の関連タンパク質をコードする核酸の同定または単離のために使用される。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術が使用され得る。
本発明は、例えば、ＤＡＰ１２ポリペプチドと対応する生物学的に活性のあるものをコードする、単離されたＤＮＡまたはフラグメントの使用を意図する。さらに、本発明は、適切な条件で本明細書に記載されたＤＮＡ配列とハイブリダイズできる、生物学的に活性のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする単離または組換えＤＮＡを含む。生物学的に活性のある該タンパク質またはポリペプチドは、インタクトなＤＡＰ１２またはフラグメントであり得、そして表１で示された核酸によってコードされるアミノ酸配列を有し得る。さらに、本研究は、単離または組換えＤＮＡ、またはそのフラグメントの使用を含む。これは、ＤＡＰ１２と相同なタンパクをコードするか、または、ヒトＤＡＰ１２をコードするｃＤＮＡをＰＣＲまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用して単離されたものである。この単離されたＤＮＡは、５’および３’近傍に各調節配列を有し得る（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル他）。
「単離された」核酸とは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマーといった核酸であり、これは、天然においてネイティブな配列に伴う他の成分（例えば、リボゾーム、ポリメラーゼおよび原種由来の隣接したゲノム配列）から実質的に分離されている。本発明は、その天然に存在している環境から除かれた核酸配列を含み、そして組換えまたはクローン化したＤＮＡ単離物および化学的に合成したアナログまたは異種系で生物学的に合成したアナログを含む。実質的に純粋な分子は、単離された形態の分子を含む。
単離された核酸は、一般的に、分子の均質な組成物である。しかし、いくつかの実施態様において、わずかな異種性を含む。この異種性は、代表的に、所望の生物学的機能または活性に重要でないポリマー末端または部分に認められる。あるいは、精製した配列の混合物が、例えば、縮重ＰＣＲ法において混合され得る。
「組換え」核酸は、その産生の方法またはその構造のいずれかによって規定される。その産生法に言及するとき（例えば、ある方法によって作製される産物）、この方法は、例えば、ヌクレオチド配列におけるヒト介入を含む、組換え核酸技術の利用である。あるいは、それは、天然にはお互い連続しない２つのフラグメントの融合を含む配列の生成によって調製される核酸であり得るが、天然の産物、例えば天然に存在する変異体は除外されることを意味する。従って、例えば、そのような天然には存在しないベクターで細胞を形質転換によって調製される産物が含まれ、同様に、合成オリゴヌクレオチド法を使用して得られる配列含む核酸が含まれる。そのようなことは、あるコドンを、同じアミノ酸または保存アミノ酸をコードする重複コドンで置き換えるためにしばしば行われ、同時に、例えば、制限部位または配列認識部位を代表的に導入または除去することが行われる。あるいは、単一の遺伝体（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｔｉｔｙ）を生成するために所望の機能の核酸セグメントをお互いに結合してなされる。この遺伝体は、一般に入手できる天然の形態には見出されない所望の機能の組み合わせを含む。制限酵素認識部位は、しばしばそのような人工操作の標的である。しかし、他の部位特定標的（例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列または他の有用な特徴）が、設計によって組み込まれ得る。同様の概念が組換え体（例えば、融合、ポリペプチド）に意図される。特に含まれるのは、遺伝コードの縮重により、これらの抗原のフラグメントと同様のポリペプチドをコードする合成核酸、および様々な異なった種変異体由来の配列融合物である。
核酸の文脈で、「フラグメント」とは、少なくとも約１７ヌクレオチドの連続したセグメントであり、一般に、少なくとも２０ヌクレオチド、より一般的に、少なくとも約２３ヌクレオチド、通常、少なくとも約２６ヌクレオチド、より通常、少なくとも約２９ヌクレオチド、しばしば、少なくとも約３２ヌクレオチド、よりしばしば、少なくとも約３５ヌクレオチド、代表的に、少なくとも約３８ヌクレオチド、より代表的に、少なくとも約４１ヌクレオチド、通常、少なくとも約４４ヌクレオチド、より通常少なくとも約４７ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約５０ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約５３ヌクレオチド、そして特に好ましい実施態様においては少なくとも約５６またはそれ以上のヌクレオチド（例えば、６０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００など）である。
例えば、ＤＡＰ１２タンパク質をコードするＤＮＡは、関連したまたは相同な抗原をコードする遺伝子、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ種、および異なった種由来の相同なタンパク質をコードするＤＮＡを同定するのに特に有用である。様々なＤＡＰ１２タンパク質は、配列において同様であるはずであり、そして本明細書に含まれる。しかし、ＤＡＰ１２とより離れた進化的関係を有するタンパク質でさえ、もし、十分な類似性を示すならば、これらの配列を使用して容易に単離され得る。霊長類のＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０およびＭＤＬ−１タンパク質は、特に興味がもたれる。
本発明は、本明細書で示された単離ＤＮＡと同一または高い相同性のＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子およびフラグメントをさらに包含する。特に、この配列は、しばしば、転写、翻訳およびＤＮＡ複製を制御するＤＮＡセグメントと作動可能に結合される。あるいは、ゲノム配列（例えば、イントロンを含んだもの）由来の組替えクローンは、トランスジェニック研究（例えば、トランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物を含む）および遺伝子治療に有用である。例えば、Ｇｏｏｄｎｏｗ（１９９２）「トランスジェニック動物」Ｒｏｉｔｔ編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１５０２−１５０４頁；Ｔｒａｖｉｓ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１３９２−１３９４；Ｋｕｈｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７０７−７１０；Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９８７ 編）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：１８０−１９９を参照のこと。天然の遺伝子配列と異種プロモーターとの作動可能な会合もまた提供され、同様に、例えば、受容体パートナーと共にＤＡＰ１２をコードするベクターが提供される。
相同な核酸配列は、比較されたとき、有意な配列の類似性を示す。核酸における相同性の基準は、配列の比較によって当業者に通常使用される相同性の測定か、またはハイブリダイゼーション条件に基くものいずれかである。ハイブリダイゼーション条件は、以下に非常に詳細に記載されている。
配列比較については、代表的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要ならば、サブ配列の座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムによって、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性が、指定されたプログラムパラメーターに基づいて計算される。
比較のための配列の光学的な整列が、実施され得る。これは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性配列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された手段（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または可視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、前記を参照のこと）による。
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、斬新的な対形式の整列を使用して、１群の関連配列から多数の配列整列を作成して、関係およびパーセント配列同一性を示す。また、整列を作成するために使用されたクラスター関係を示す、ツリーまたは樹状図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０の斬新的整列方法の簡素化されたものを使用する。使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３によって記載される方法に類似する。プログラムは、３００配列、各々、最大長５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸まで整列し得る。この多数整列手順は、２つの最も類似の配列の対形式整列で開始し、２つの整列した配列のクラスターを生じる。次いで、このクラスターを、整列した配列の次の最も関連した配列またはクラスターに対して整列させる。配列の２つのクラスターを、２つの個々の配列の対形式整列の単純な延長によって整列させる。最後の整列を、一連の斬新的な対形式整列によって達成する。このプログラムは、配列比較の領域について特異的配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することによって、およびプログラムパラメータを指定することによって実行される。例えば、以下のパラメータを使用して、参照配列を他の試験配列と比較してパーセント配列同一性関係を決定し得る：デフォルトギャップ重（３．００）、デフォルトギャップ長重（０．１０）、および加重末端ギャップ。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの他の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公衆に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に問題の配列における長さＷの短い語（ｗｏｒｄ）を同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、これは、データベース配列において同じ長さの語と整列した場合、いくつかのポジティブな値の閾値スコアＴに適合するかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近傍語スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前記）。これらの最初の近傍語ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見いだすために検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、語ヒットは、累加した整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿った両方向に伸長させる。各方向への語ヒットの伸長は、以下の場合停止される：累加した整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つ以上のネガティブなスコアリング残基整列の蓄積に起因して、累加したスコアがゼロ以下になる場合；あるいは、いずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の語長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
パーセント配列同一性を算出することの他に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が、偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似するとみなされる。
ポリペプチドの２つの核酸配列が、実質的に同一であることのさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載のように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、代表的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみによって異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの他の指標は、以下に記載のように、２つの分子が、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。
核酸配列比較状況における実質的同一とは、セグメントまたはその相補鎖のいずれかが、比較される場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列される場合に、そのヌクレオチドの少なくとも約５０％において、一般には少なくとも約５６％、より一般には少なくとも約５９％、普段は少なくとも約６２％、より普段は少なくとも約６５％、頻繁には少なくとも約６８％、より頻繁には少なくとも約７１％、代表的には少なくとも約７４％、より代表的には少なくとも約７７％、通常少なくとも約８０％、より通常には少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５〜９８％またはそれより高く、そして特定の実施態様において、そのヌクレオチドの約９９％以上高く同一であることを意味する。あるいは、実質的な同一性は、そのセグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、代表的には表１に由来する配列を用いて、鎖またはその相補物に対してハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチに対して少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在する場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。Ｋａｎｅｈｉｓａ（１９８４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３を参照のこと。相同性比較の長さは、記載されるように、より長いストレッチに対してであり得、そして特定の実施態様においては少なくとも約１７ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも約７５〜１００またはそれより多いヌクレオチド（例えば、１２５、１５０、２００、２５０、３００など）のストレッチに対してである。
ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション状況における同一性について言及する場合、塩、温度、有機溶媒およびハイブリダイゼーション反応において代表的に制御される他のパラメーターのストリンジェントな組合せ条件である。ストリンジェントな温度条件は、通常、約３０℃を超える、より通常には約３７℃を超える、代表的には約４５℃を超える、より代表的には約５５℃を超える、好ましくは約６５℃を超える、そしてより好ましくは約７０℃を超える温度を含む。ストリンジェント塩条件は、通常、約５００ｍＭ未満、通常約３５０ｍＭ未満、より通常は約２００ｍＭ未満、代表的には約１５０ｍＭ未満、好ましくは約１００ｍＭ未満、そしてより好ましくは約５０ｍＭ未満である。しかし、パラメーターの組合せは、任意の単一のパラメーターの尺度よりもはるかにより重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９−３７０を参照のこと。ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドに対して少なくとも２倍のバックグラウンド、好ましくは少なくとも３〜５倍またはそれを超えるバックグラウンドを与えるべきである。
他のヒト被験体からのＤＡＰまたはＭＤＬは、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによってクローニングおよび単離され得る。あるいは、あまり対立遺伝子特異性を示さない抗体調製物の調製は、発現クローニングアプローチにおいて有用であり得る。対立遺伝子改変体は、例えば、冗長なＰＣＲ（例えば、規定のプライマーを使用する）および配列分析の組合せを用いて、それにより、ヒト集団における対立遺伝子改変体についての情報を提供して特徴付けられ得る。
（ＶＩＩ．ＤＡＰまたはＭＤＬの作製；模倣体）
ＤＡＰまたはＭＤＬ抗原あるいはそれらのフラグメントをコードするＤＮＡは、化学合成、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングにより、または広汎な種々の細胞株または組織サンプルから調製されたゲノムライブラリをスクリーニングすることによって入手され得る。
このＤＮＡは、広汎な種々の宿主細胞において、全長抗原またはフラグメント（このフラグメントは、次いで、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成するために使用され得る）の合成のため；結合研究のため；改変された分子の構築および発現のため；ならびに構造／機能研究のために、発現され得る。各抗原またはそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換されまたはトランスフェクトされた宿主細胞において発現され得る。これらの分子は、タンパク質または細胞混入物（例えば、その組換え宿主に由来するもの）を含まないように実質的に精製され得、それゆえ、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤と合わされるときに、薬学的組成物において特に有用である。この抗原またはその部分は、他のタンパク質との融合物として発現され得る。
発現ベクターは代表的に、所望の抗原遺伝子またはそのフラグメントを含む自己複製性ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり、通常適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝子制御エレメントに作動可能に連結されている。これらの制御エレメントは、適切な宿主内での発現をもたらし得る。発現をもたらすために必要な特定型の制御エレメントは、使用される最終的な宿主細胞に依存する。一般的に、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含み得、そして代表的には転写プロモーター、必要に応じて、転写の開始を制御するオペレーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列を含む。発現ベクターはまた、通常、ベクターがその宿主細胞とは独立に複製することを可能にする複製起点を含む。
本発明のベクターは、例えば、ヒトＤＡＰ１２抗原、または生物学的に活性なポリペプチドをコードするそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む。このＤＮＡは、ウイルスプロモーターの制御下にあり得、そして選択マーカーをコードし得る。本発明はさらに、原核生物または真核生物宿主において霊長類ＤＡＰ１２抗原をコードする真核生物ｃＤＮＡを発現し得るこのような発現ベクターの使用を意図する。ここで、このベクターは、その宿主と適合性であり、そしてその抗原がコードされる真核生物ｃＤＮＡは、そのベクターを含む宿主の増殖により問題のｃＤＮＡが発現されるようにそのベクターに挿入されている。通常、発現ベクターは、その宿主細胞における安定な複製について、または１細胞あたりの所望の遺伝子のコピー数の合計を多大に増加させるための増幅について設計される。発現ベクターが宿主細胞において複製することを要求することが常に必要であるわけではない。例えば、種々の宿主において、その宿主細胞によって認識される複製起点を含まないベクターを用いてその抗原またはそのフラグメントの一過性発現をもたらすことも可能である。ヒトＤＡＰ１２遺伝子またはそのフラグメントの、組換えによる宿主ＤＮＡへの組込みを生じるベクターを使用することもまた可能である。
本明細書において使用される場合、ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、およびＤＮＡフラグメントの宿主のゲノムへの組込みを可能にする他のビヒクルを含む。発現ベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含む、特殊化されたベクターである。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、等価な機能を果たし、そして公知のまたは公知になる、他の全ての形態のベクターもまた本明細書における使用に適する。例えば、Ｐｏｕｗｅｌら、（１９８５および補遺）Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（１９８８）（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡを参照のこと。
形質転換された細胞は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたヒトＤＡＰ１２で形質転換またはトランスフェクトされた細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。形質転換された宿主細胞は、通常、抗原またはそのフラグメントを発現するが、そのＤＮＡのクローニング、増幅および操作の目的には、そのタンパク質を発現することは必要ではない。本発明はさらに、栄養培地において形質転換された細胞を培養すること、従ってその培養物においてタンパク質が蓄積することを可能にすることを意図する。このタンパク質は、その培養物または培養培地のいずれかから回収され得る。
本発明の目的のために、ＤＮＡ配列は、それが互いに機能的に関連する場合、作動可能に連結している。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、それがプレタンパク質として発現されるか、またはポリペプチドを細胞膜もしくはそのポリペプチドの分泌へと指向させるのに関与する場合、そのポリペプチドに作動可能に連結されている。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にする位置にある場合、コード配列に作動可能に連結されている。通常、作動可能な連結とは、連続でかつインフレームであることを意味するが、しかし、リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝子エレメントは、オペレーター配列に連続して連結していないが、なお結合しており、これは次いで発現を制御する。
適切な宿主細胞は、例えば、原核生物、下等真核生物および高等真核生物を含む。原核生物は、グラム陰性およびグラム陽性の両方の生物を含む（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。下等真核生物は、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ）、およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属の種を含む。高等真核生物は、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞および鳥類）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類および齧歯類）の動物細胞から樹立された組織培養細胞株を含む。
原核生物宿主ベクター系は、多数の異なる種について広汎な種々のベクターを含む。本明細書において使用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクターは、他の原核生物において使用される等価なベクターを包含するために遺伝的に使用される。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその多くの誘導体である。例えば、ヒトＤＡＰ１２抗原またはそのフラグメントを発現するに使用され得るベクターは、以下を含むようなベクターを含むがそれらに限定されない：ｌａｃプロモーター（ｐＵＣ系列）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモーター（ｐＩＮ系列）；λ−ｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃのようなハイブリッドプロモーター（ｐＤＲ５４０）。Ｂｒｏｓｉｕｓら（１９８８）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ λ−、ｔｒｐ−、ｌａｃ−、ａｎｄ Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、第１０章、２０５−２３６頁を参照のこと。
下等真核生物（例えば、酵母およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）は、例えば、ヒトＤＡＰ１２抗原配列含有ベクターを用いて形質転換され得る。本発明の目的のために、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。これは、下等真核生物を一般的に代表するために使用されるが、他の多数の株および種もまた利用可能である。酵母ベクターは代表的に、複製起点（組込み型でなければ）、選択遺伝子、プロモーター、所望のタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ、ならびに翻訳終結、ポリアデニル化および転写終結のための配列からなる。酵母について適切な発現ベクターは、３−ホスホグリセレートキナーゼおよび種々の他の解糖酵素遺伝子のプロモーターのような構成性プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターもしくはメタロチオネインプロモーターのような誘導性のプロモーターを含む。適切なベクターは、以下の型の誘導体を含む：自己複製性低コピー数（例えば、ＹＲｐ系列）、自己複製性多コピー数（例えば、ＹＥｐ系列）；組込み型（例えば、ＹＩｐ系列）；またはミニ染色体（例えば、ＹＣｐ系列）。
高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性なヒトＤＡＰまたはＭＤＬ抗原タンパク質の発現について好ましい宿主細胞である。原理的には、多くの高等真核生物組織培養細胞株が作動可能である（例えば、昆虫バキュロウイルス発現系（無脊椎動物供給源由来であれ、脊椎動物供給源由来であれ））。しかし、哺乳動物細胞は、プロセシングが翻訳と同時および翻訳後の両方であるので好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は、慣用手順となった。有用な細胞株の例は、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ベイビーラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、トリ細胞株およびサル（ＣＯＳ）細胞株を含む。そのような細胞株についての発現ベクターは通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表例は、ｐＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６−１１４２を参照のこと）；ｐＭＣ１ｎｅｏ ポリＡ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２を参照のこと）；およびｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０のようなバキュロウイルスベクターを含む。
ヒトＤＡＰまたはＭＤＬ抗原ポリペプチドを、特定のまたは規定されたグリコシル化パターンを提供する系において発現することがしばしば所望される。この場合において、通常のパターンは、その発現系により天然に供給されるものである。しかし、そのパターンは、そのポリペプチド（例えば、非グリコシル化形態）を、異種発現系に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝露することによって改変され得る。例えば、ＤＡＰ１２抗原遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素をコードする１以上の遺伝子と共に同時形質転換され得る。このアプローチを使用して、特定の哺乳動物グリコシル化パターンは、原核生物または他の細胞において達成可能であるかまたは近付けられる。
ＤＡＰ抗原はまた、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に結合された形態で産生され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ）を用いた処理によって膜から取り出され得る。これは、その抗原を、生物学的に活性な形態で放出し、そしてタンパク質化学の標準的な手順による精製を可能にする。例えば、Ｌｏｗ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９８８：４２７−４５４；Ｔｓｅら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１００３−１００８；およびＢｒｕｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４：１２７５−１２８３を参照のこと。あるいは、精製セグメントを、その配列中で、例えば、Ｎ末端またはＣ末端にて操作して、そのタンパク質産物の精製または検出の補助をし得る。そのようなセグメントを除去する手段もまた、操作され得る（例えば、プロテアーゼ切断部位）。
配列の全体が公知であるので、霊長類のＤＡＰまたはＭＤＬ抗原、そのフラグメントまたは誘導体は、ペプチドを合成するための従来のプロセスによって調製され得る。これらは、以下に記載されるようなプロセスを含む：ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化還元プロセス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）／付加プロセスが使用され得る。固相合成および液相合成の両方は、上記のプロセスに適用可能である。
ヒトＤＡＰまたはＭＤＬ抗原、フラグメントまたは誘導体が、ペプチド合成において代表的に使用されるように、一般に、いわゆる段階プロセス（これは、アミノ酸を末端アミノ酸と、１つずつ順番に縮合する工程を含む）によるか、または末端アミノ酸にペプチドフラグメントを結合させることにより、上記のプロセスに従って適切に調製される。結合反応において使用されないアミノ基は、不正確な位置での結合を予防するために保護されねばならない。
固相合成が適用される場合、Ｃ末端アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して不溶性キャリアまたは支持体に結合される。その不溶性キャリアは、それが反応性カルボキシル基への結合能を有する限り、特に限定されない。このような不溶性のキャリアの例は、ハロメチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂またはブロモメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニルヒドラジド化樹脂などを含む。
アミノ基保護アミノ酸は、その活性化されたカルボキシル基と以前に形成されたペプチドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して順番に結合されて、ペプチドをステップバイステップに合成する。完全な配列を合成した後、ペプチドを、不溶性キャリアから分離して、そのペプチドを産生する。この固相アプローチは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６によって一般的に記載される。
調製された抗原およびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段（例えば、抽出、沈澱、電気泳動および種々の形態のクロマトグラフィーなど）によって反応混合物から単離および精製され得る。本発明のヒトＤＡＰ１２抗原は、その所望される用途に応じて、種々の程度の純度で入手され得る。精製は、本明細書に開示されるタンパク質精製技術の使用によって、または本明細書に開示される抗体の使用によって、例えば、免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーにおいて達成され得る。この免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、まずその抗体を固相支持体に結合し、次いでその結合された抗体を細胞の可溶化した溶解物、例えば、ＤＡＰ１２抗原を発現する他の細胞の溶解物、あるいはＤＮＡ技術の結果としてＤＡＰ１２抗原を産生する細胞の溶解物または上清と接触させることによって実行される。下記を参照のこと。
（ＶＩＩＩ．用途）
本発明は、本明細書において他の場所、例えば、発達異常または生理的異常についての一般的な説明において、または診断のためのキットの説明において下記に記載されるように、診断適用において用途が見い出される試薬を提供する。
白血球の活性化において重要であるレセプターの多く（Ｔ細胞抗原レセプター、およびイムノグロブリンおよびＦｃレセプターを含む）は、内因性シグナル伝達特性を欠くが、それらのシグナルをイムノレセプターチロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ、ＹｘｘＬ−６〜８アミノ酸スペーサ−−ＹｘｘＬ）をそれらの細胞質ドメインに含む他の膜タンパク質との非共有結合によって伝達する。例えば、Ｔ細胞抗原レセプターは、ＩＴＡＭ配列を含むＣＤ３γ、δ、ε、およびζタンパク質と会合する。同様に、Ｂ細胞上の表面イムノグロブリンは、ＩＴＡＭ配列を含み、そしてシグナル伝達に必要であるＣＤ７９ＡおよびＣＤ７９Ｂと会合する。ＮＫ細胞上のＩｇＧ（ＣＤ１６）についてのＦｃレセプターは、ＣＤ３ζまたはＩｇＥ Ｆｃレセプターγサブユニット（両方ともＩＴＡＭを含む）と会合し、そしてマスト細胞上の高親和性ＩｇＥレセプターはＩｇＥ Ｆｃレセプターγサブユニットと会合する。従って、ＩＴＡＭを含む会合したタンパク質は、白血球上の活性化レセプターの集合における一般的な戦略を代表する。
近年、構造的に多様である、白血球レセプターファミリーのいくつかの新たなファミリーが同定された。特定のイソ形態のＫＩＲ、ＩＬＴ／ＭＩＲ、Ｌｙ４９、およびＣＤ９４／ＮＫＧ２のファミリーのレセプターは、陽性シグナル伝達と関連するが；しかし、これらの分子（例えば、ＫＩＲ−ＮＫＡＴ５、ＫＩＲ−ｃｌ３９、ＩＬＴ１、ｇｐ９１／ＰＩＲ、およびＣＤ９４）は、それらの細胞質ドメインにおいて、陽性シグナル伝達能力に一致する配列を欠いている。
Ｔ細胞抗原レセプター、免疫グロブリンレセプター、およびＦｃレセプターは全て、ＩＴＡＭを含む他の小さなサブユニットとの会合によりシグナル伝達機能を達成するとすると、これらの他の白血球レセプターは同様のストラテジーを使用し得ると思われる。
従って、利用可能な配列データベースが、ヒトおよびマウスのＣＤ３γ、δ、ε、およびζ、ならびにＩｇＥ Ｆｃレセプターγ鎖のタンパク質配列を用いて探索された。膜貫通セグメントに酸性残基（Ｄ）および細胞質ドメインに完全ＩＴＡＭ配列を有する約１２ｋｄの推定膜タンパク質をコードする、ＬＶＡ０３Ａと称されるＥＳＴが、同定された。この短い細胞外ドメインにおけるシステイン残基は、この分子がジスルフィド結合ダイマーとして発現し得ることを示唆する。分布研究は、この遺伝子がマクロファージ、樹状細胞、いくつかのＴ細胞、およびＮＫ細胞において転写されることを示す。このタンパク質はＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）と称されている。類似の遺伝子もまた同定され、ＤＡＰ１０と称されているが、これはＩＴＩＭモチーフを有する。
ＩＴＡＭを含有するレセプターは全て、白血球機能（例えば、Ｔ細胞抗原レセプター、免疫グロブリンレセプター、Ｆｃレセプター）を誘導するのに重要である。従って、おそらくＤＡＰ１２は白血球中のシグナル伝達において重要な役割をもつ。ＤＡＰ１２のアゴニストおよびアンタゴニストはそれぞれ、免疫応答（すなわち、増殖、サイトカイン産生、アポトーシスの誘導、または細胞媒介細胞傷害性の誘発）の増強または阻害のいずれかにおいて有用性を提供するはずである。
ＹｘｘＭモチーフを含むレセプターは、いくらかのシグナル伝達分子（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ１９）において重要であると同定されている。従って、ＤＡＰ１０はおそらく、シグナル伝達において重要な役割を持つ。ＤＡＰ１０のアゴニストおよびアンタゴニストはそれぞれ、免疫応答（すなわち、増殖、サイトカイン産生、アポトーシスの誘導、または細胞媒介細胞傷害性の誘発）の増強または阻害のいずれかにおいて有用性を提供するはずである。
ＤＡＰ１２は、いくつかの異なる膜レセプター、例えばＴ細胞抗原レセプター、プレＴ細胞抗原レセプター、免疫グロブリンレセプター、Ｆｃレセプター、ＫＩＲファミリーのレセプター、ＩＬＴ／ＭＩＲファミリーのレセプター、ＬＡＩＲファミリーのレセプター、ｇｐ９１／ＰＩＲファミリーのレセプター、Ｌｙ４９ファミリーのレセプター（特にＬｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈ）、およびＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーのレセプターに必然的には限定しないが、これらと非共有結合的に会合し得ることが予想される。この中に、ＭＤＬ−１がある。従って、前記レセプターとのＤＡＰ１２相互作用に影響する試薬は、これらの分子の機能を、治療処置について増強あるいは抑制し得る（すなわち、ワクチン接種または免疫不全疾患について免疫を増強するか、自己免疫疾患または移植の場合の免疫応答を抑制する）。ＤＡＰと、これらのレセプターのいずれか１つとの組合せは、例えばこの相互作用および引き続きのシグナル伝達の妨害因子についての薬物のスクリーニングのために、それらの相互作用から生じる構造複合体に対する抗体と同様に、有用である。
このＤＡＰ１２は、β２様インテグリンシグナル伝達の役割を演じ得る。β２インテグリンが、Ｓｙｋを含むＰ Ｔｙｒキナーゼ依存性シグナルを伝達し得ることは明らかである。Ｓｙｋノックアウトにおいて、β２はシグナル伝達しない。この経路はまたおそらく、負の調節因子としてＦｃγＲ（単球／マクロファージおよびＢ細胞中）を含む。しかし、Ｓｙｋがβ２インテグリンと会合する既知の道はない。なぜなら、これらは、それらの細胞質ドメイン中にＩＴＡＭ含有配列を有さないからである。さらに、この公知のＩＴＡＭ含有タンパク質がβ２と会合し得るという証拠はない。従って、ＤＡＰ１２は、β２と会合するものについての有力候補または原型である。
本発明はまた、顕著な治療値を有する試薬を提供する。ヒトＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０（天然に存在するまたは組換え）、そのフラグメント、およびそれに対する抗体は、霊長類ＤＡＰへの結合親和性を有すると同定された化合物とともに、異常増殖、例えば、ガン様状態または変性性状態を含む、異常なＢ細胞応答に関連する状態の処置に有用であるはずである。異常増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細書で提供される組成物を使用する適切な治療処置によって調節され得る。例えば、ＤＡＰ１２の異常な発現または異常な誘発に関連する疾患または障害は、この抗原のアゴニストまたはアンタゴニストについての可能性の高い標的であるはずである。ＤＡＰ１２はおそらく、免疫細胞の活性化または調節の役割を演じ、これは免疫学的応答（例えば自己免疫障害またはアレルギー反応）に影響を及ぼす。
さらに、ＤＡＰ：ＤＡＰ結合パートナー相互作用は、相互作用する細胞を活性化、増殖、および／または分化させるＴ、ＮＫ、ＤＣ、または単球細胞相互作用に関与し得る。そうであれば、処置は、このＤＡＰ：ＤＡＰ結合パートナーシグナル伝達（特に、増殖、サイトカイン産生、アポトーシスの誘導、または細胞媒介細胞傷害性の誘発のような免疫応答を増強または阻害する）への干渉により生じ得る。このシグナルの遮断は、例えば可溶性ＤＡＰまたはＤＡＰに対する抗体、あるいはこのＤＡＰとそのレセプター複合体パートナーとの機能的な相互作用を破壊する薬物により、もたらされ得る。
他の異常発生状態は、ノーザンブロット分析によってＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０ ｍＲＮＡを有することが示される細胞タイプ、例えば、リンパ球、ＮＫ、単球、および樹状細胞のそれぞれで公知である。Ｂｅｒｋｏｗ （編） Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｒａｈｗａｙ， ＮＪ；およびＴｈｏｒｎら Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ＮＹを参照のこと。例えば、治療免疫抑制は、この分子を介するＴリンパ球およびＢリンパ球相互作用をブロックすることにより達成され得る。それは、移植中の自己免疫疾患および移植片注入を制御するための重要な治療を表す。この遮断は、ブロッキング結合組成物、例えば中和抗体でもたらされ得る。
組換えＤＡＰまたはＤＡＰ抗体は、精製され得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬を、生理学的に無害の安定化剤および賦形剤とともに、例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫アジュバント）中で、追加の活性成分と、治療用途のために組み合わせ得る。これらの組み合わせおよび提供された組成物を滅菌濾過し、そして投与バイアル中の凍結乾燥によるような投与形態で、または安定化した水性調製物中での貯蔵に置かれ得る。本発明はまた、補体結合しない抗体またはその結合フラグメントの使用を意図する。
ＤＡＰまたはそのフラグメントを使用する薬物スクリーニングは、会合した成分の単離を含む、ＤＡＰへの結合親和性を有する化合物を同定するために実施され得る。次いで、その後の生物学的アッセイは、化合物が本来の刺激活性を有するかどうか、そしてしたがって、これがシグナル伝達を遮断するという点で、ブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために利用され得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、抗原を活性化し得、したがって、これがＤＡＰの活性を刺激するという点で、アゴニストである。本発明は、さらに、アンタゴニストとしてのＤＡＰに対する抗体の治療使用を意図する。このアプローチは、他のＤＡＰまたはＭＤＬ種改変体に特に有用であるはずである。
効果的治療に必要な試薬の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与される他の製剤を含む、多くの異なる因子に依存する。したがって、処置投与量は、安全性および効率を最適にするために滴定されるべきである。代表的には、インビトロで使用される投与量は、これらの試薬のインサイチュ投与に有用な量で有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置に有効な用量の動物テストは、ヒト投与量の予測指標をさらに提供する。種々の考察が、例えば、Ｇｉｌｍａｎら （１９９０編） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （第８版） Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （第１７版） （１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎ．に記載される。投与方法は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮拡散などについて、本明細書中および以下に議論される。薬学的に受容可能なキャリアには、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｒａｈｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙに記載の他の化合物が挙げられる。投与量範囲は、適切なキャリアとともに、通常は１ｍＭより低い濃度、代表的には約１０μＭより低い濃度、通常は約１００ｎＭより低い濃度、好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル濃度）より低い濃度、および最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル濃度）より低い濃度の量であると予測される。徐放性処方物、または徐放性装置は、しばしば、持続投与に利用される。
ヒトＤＡＰまたはＭＤＬ、そのフラグメント、およびそれに対する抗体またはそのフラグメントに対する抗体、アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿主に直接投与され得、あるいは化合物のサイズに依存して、投与前にオボアルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質にそれらを結合体化することが望ましくあり得る。治療処方物は、多くの従来の投与処方物中で投与され得る。活性成分が単独で投与されることは可能であるが、薬学的処方物としてそれを提示することが好ましい。処方物は、代表的には、その１つ以上の受容可能なキャリアとともに、上記で定義したように、少なくとも１つの活性成分を含む。各キャリアは、他の成分と適合可能であるという意味で薬学的かつ生理学的の両方で受容可能であるべきであり、そして患者に有害であってはならない。処方物は局所的な、経口、直腸、鼻、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）投与に適切なものを含む。処方物は、便利に単位投与形態で、滅菌形態で存在され得、そして薬学の技術分野で周知の多くの方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら （１９９０編） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （第８版） Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （第１７版） （１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎ．を参照のこと。本発明の治療は、他の薬剤と併用されるか、あるいは関連して使用され得る。
本発明のＤＡＰまたはＭＤＬ抗原の天然に存在するおよび組換えの両方の形態とも、タンパク質への結合活性について化合物をスクリーニングし得るキットおよびアッセイ方法に、特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法が、短期間で数万の化合物のスクリーニングを可能にするように、近年開発されている。例えば、Ｆｏｄｏｒら （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３（これは、固体基材上で合成した複数の規定のポリマーによる結合親和性のテストのための手段を記載する）を参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明によって提供されるような大量の精製された可溶性ＤＡＰまたはＭＤＬ利用可能性によって、非常に容易にされ得る。
例えば、一旦ＤＡＰまたはＭＤＬが構造的に定義されると、アンタゴニストが、通常見いだされ得る。潜在的なアンタゴニストのテストをすることは、現在、精製されたＤＡＰまたはＭＤＬを使用する、高度に自動化されたアッセイ法の開発の際に可能である。特に、新しいアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書で有用になったスクリーニング技法を使用することによって発見される。複数のＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、またはＭＤＬ−１タンパク質についての組み合わせ結合親和性を有することが見いだされた化合物、例えば、ＤＡＰまたはＭＤＬの対立遺伝子改変体に対するアンタゴニストとして作用し得る化合物が、特に重要である。
さらに、このＤＡＰ：ＤＡＰ結合パートナーを介するシグナル伝達は、他のシグナルと組合せて機能し得るので、このような経路との組合せ治療もまた考えられ得る。従って、複数シグナル経路のアンタゴニズム、または複数経路での刺激は有用であり得る。さらに、このＤＡＰ１２のＭＤＬ−１、および多分またＤＡＰ１０との関連を用いて、この記載した遺伝子の種々の組合せが重要であり得る。
本発明は、種々の薬物スクリーニング技法のいずれかにおいて組換え抗原を使用することによって化合物をスクリーニングするために特に有用である。特定の化合物についてのスクリーニングにおいて組換えタンパク質を使用する利点は、以下を包含する：（ａ）特定のソースからのＤＡＰ１２の改良された再生可能なソース；（ｂ）アッセイにおいてより良好なシグナル／ノイズ比を与える潜在的により多数の細胞当たりの抗原分子；および（ｃ）種改変体特異性（より大きな生物学的および疾患特異性を理論的に与える）。
薬物スクリーニングの１つの方法は、ＤＡＰおよび／またはＭＤＬを発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換される真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。他の細胞からの単離またはそのレセプター複合体パートナーとの組合せにおいて、ＤＡＰを発現する細胞を単離し得る。このような細胞は、生存可能なまたは固定された形態のいずれかで、標準的抗原／パートナー結合アッセイのために使用され得る。Ｐａｒｃｅら （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉら （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：４００７−４０１１（これらは、細胞性応答を検出するための感度の高い方法を記載する）も参照のこと。細胞（ＤＡＰのソース）が、抗原に対する既知の結合親和性を有する標識化化合物、およびＤＡＰに対する結合親和性が測定されるテスト化合物と接触およびインキュベートされる、競合アッセイが、特に有用である。次いで、結合化合物および遊離化合物を分離して、結合の程度を評価する。結合したテスト化合物の量は、結合測定した標識化化合物の量に反比例する。多くの技法が、結合の程度を評価するために遊離の化合物から結合したものを分離するために使用され得る。この分離工程は、代表的には、フィルターへの接着その後の洗浄、プラスチックへの接着その後の洗浄、または細胞膜の遠心分離のような手順を包含し得る。生細胞もまた、ＤＡＰ媒介機能、例えば第２メッセンジャーレベル、すなわちＣａ++；細胞増殖；イノシトールリン酸プール変換（ｐｏｏｌ ｃｈａｎｇｅ）；などに対する薬物の効果についてスクリーニングするために使用され得る。いくつかの検出方法は、分離工程の削除を可能にする（例えば、近接感度検出システム）。カルシウム感受性色素は、蛍光定量器（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）または蛍光細胞選別装置を用いて、Ｃａ++レベルを検出するのに有用である。
他の方法は、ヒトＤＡＰまたはＭＤＬのソースとして形質転換した真核生物または原核生物宿主細胞からの膜を利用する。これらの細胞は、ヒトＤＡＰまたはＭＤＬ抗原の発現を指示するＤＮＡベクターで安定に形質転換される。本質的に、膜は、細胞から調製され、そして上記の競合アッセイのようなレセプター複合体結合アッセイで使用される。
さらに他のアプローチは、形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞からの可溶化した未精製のＤＡＰまたは可溶化した精製ＤＡＰを使用することである。これは、増加した特異性、自動化する能力、および高い薬物テスト処理能力の利点を有する「分子」結合アッセイを可能にする。
薬物スクリーニングのための他の技法は、ヒトＤＡＰまたはＭＤＬに対する適切な結合親和性を有する化合物についての高い処理能力のスクリーニングを提供するアプローチを包含し、そしてＧｅｙｓｅｎ，ヨーロッパ特許出願第８４／０３５６４号（１９８４年９月１３日に公開）に詳細に記載される。最初に、多数の異なる小ペプチドテスト化合物を、固体基材（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の適切な表面）上で合成する。Ｆｏｄｏｒら（１９９１）を参照のこと。次いで、すべてのピンを、可溶化した未精製のＤＡＰまたは可溶化した精製ＤＡＰと反応させ、そして洗浄する。次の工程は、結合したＤＡＰを検出する工程を包含する。
合理的薬物設計もまた、このＤＡＰまたはＭＤＬおよび他のエフェクターの分子形状の構造研究に基づき得る。エフェクターは、レセプター複合体結合に応じて他の機能を媒介する他のタンパク質、または通常この抗原と相互作用する他のタンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定するための１つの手段は、物理的構造決定（例えば、ｘ線結晶学または２次元ＮＭＲ技法）である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについてのガイダンスを提供する。タンパク質構造決定の詳細な記載については、例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ （１９７６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
精製ＤＡＰまたはＭＤＬは、上述の薬物スクリーニング技術における使用のために、プレート上に直接コートされ得る。しかし、これらの抗原に対する非中和抗体は、捕獲抗体として、この固相上にそれぞれのＤＡＰまたはＭＤＬを固定化するのに使用され得る。
ＩＸ．キット
本発明はまた、ＤＡＰまたはＭＤＬ、あるいは結合パートナーの存在を検出するための種々の診断キットおよび方法における、ＤＡＰまたはＭＤＬタンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代表的には、キットは、規定のＤＡＰまたはＭＤＬペプチドまたは遺伝子セグメントまたは一方もしくは他方を認識する試薬のいずれかを含む区画を有する。
例えばＤＡＰ１２に対するテスト化合物の結合親和性を決定するためのキットは、代表的には、テスト化合物；標識化化合物、例えば、ＤＡＰ１２に対して既知の結合親和性を有するレセプター複合体結合パートナーまたは抗体；ＤＡＰ１２のソース（天然に存在するまたは組換え）；およびＤＡＰ１２を固定化するための固相のような、遊離の標識化化合物から結合したものを分離するための手段を含む。一旦化合物がスクリーニングされると、ＤＡＰ１２に対して適切な結合親和性を有する化合物は、それらがアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するために、当該技術分野で周知のように、適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換えＤＡＰ１２ポリペプチドの利用可能性はまた、このようなアッセイを校正するための十分定義された標準を提供する。
例えば、試料中のＤＡＰ１２の、濃度を決定するために好ましいキットは、代表的には、ＤＡＰ１２に対する公知の結合親和性を有する標識化化合物（例えば、抗体）、ＤＡＰ１２のソース（天然に存在するまたは組換え）、および遊離の標識された化合物から結合したものを分離するための手段（例えば、ＤＡＰ１２を固定するための固相）を含む。試薬を含む区画、および説明書が、通常提供される。
試料中のＤＡＰ１２の濃度を決定する１つの方法は、代表的に以下の工程：（１）ＤＡＰ１２ソースを構成する試料から膜を調製する工程；（２）この膜を洗浄し、それらを緩衝液に懸濁する工程；（３）適切な界面活性剤が添加された培養培地中で、この膜をインキュベートすることによりＤＡＰ１２を可溶化する工程；（４）この可溶化したＤＡＰ１２の界面活性剤濃度を調整する工程；（５）前記希釈を放射標識した抗体と接触およびインキュベートし、複合体を形成する工程；（６）例えば、ポリエチレンイミン処理したフィルターを介する濾過によりこの複合体を回収する工程；および（７）この回収した複合体の放射活性を測定する工程、を含む。
ヒトＤＡＰまたはＤＡＰフラグメントに特異的な抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、例えばＤＡＰおよび／またはそのフラグメントの上昇したレベルの存在を検出するための診断適用に有用である。このような診断アッセイは、ライゼート、生存細胞、固定した細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液、を用い得、そしてさらに、血清中のＤＡＰに関する抗原の検出などを包含し得る。診断アッセイは、均質（遊離の試薬と抗原−パートナー複合体との間の分離工程なし）または不均質（分離工程あり）であり得る。種々の市販のアッセイが存在し、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、酵素増倍免疫検定法（ＥＭＩＴ）、基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）などである。例えば、非標識化抗体を、標識された、かつＤＡＰまたはその特定のフラグメントに対する抗体を認識する、二次抗体を使用することによって行い得る。これらのアッセイはまた、文献で広く議論されている。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨを参照のこと。
抗イディオタイプ抗体は、このようなものが種々の異常状態の診断であり得る場合、ヒトＤＡＰに対する抗体の存在を診断するための類似の用途を有し得る。例えば、ＤＡＰの過剰産生は、特に、ガンまたは異常分化のような増殖性細胞状態において、異常な生理学的状態の診断となり得る、種々の免疫学的反応の生成を生じ得る。
頻繁には、診断アッセイのための試薬は、アッセイの感度を最適にするように、キット中に供給される。本発明については、アッセイの性質に依存して、プロトコル、および標識、標識されたまたは標識されていない抗体またはレセプター、あるいは標識されたＤＡＰまたはＭＤＬが提供される。これは、通常、緩衝液、安定化剤、酵素に対する基質のようなシグナル産生に必要な物質などのような、他の添加物と一緒である。好ましくは、このキットはまた、適切な使用および使用後の内容物の処理の仕方の指示書を含む。代表的には、このキットは、各有用な試薬のためのコンパートメントを有する。望ましくは、これらの試薬が、アッセイを行うための試薬の適切な濃度を提供する水性媒体中で再構成され得る場合、試薬は、乾燥した凍結乾燥した粉末として提供される。
薬物スクリーニングおよび診断アッセイの上記の構成成分のいずれかは、改変なしで使用され得、あるいは種々の方法で改変され得る。例えば、標識することは、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する部分を共有または非共有結合することによって達成され得る。これらのアッセイのいずれかにおいて、テスト化合物、ＤＡＰ、ＭＤＬ、またはそれらに対する抗体は、直接または間接的に標識され得る。直接的に標識するための可能性は、以下の標識群を包含する：125Ｉのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光極性化の変化をモニタリングし得る蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）。これらの両特許は、本明細書中に参考として援用される。間接的に標識するための可能性は、１つの構成成分のビオチン化、次いで上記の標識群の１つにカップリングしたアビジンに結合することを包含する。
また、遊離の結合化合物から結合したものを、あるいは遊離のテスト化合物から結合したものを分離する多くの方法がある。ＤＡＰまたはＭＤＬは、種々のマトリクス上に固定化され得、次いで洗浄され得る。適切なマトリクスには、ＥＬＩＳＡプレートのようなプラスチック、フィルター、およびビーズが挙げられる。マトリクスにＤＡＰまたはＭＤＬを固定化する方法には、限定することなく、プラスチックへの直接付着、捕獲抗体の使用、化学的カップリング、およびビオチン−アビジンが挙げられる。このアプローチの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒、または硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を含む、いくつかの方法のいずれかによって、抗原／結合化合物複合体の沈殿反応を包含する。他の適切な分離技法には、限定することなく、Ｒａｔｔｌｅら （１９８４） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３０：１４５７−１４６１に記載のフルオレセイン抗体磁化可能粒子方法、および米国特許第４，６５９，６７８号に記載のような二重抗体磁性粒子分離方法が挙げられる。
種々の標識へタンパク質またはそのフラグメントを連結する方法は、文献に広く報告されている。技法の多くは、ペプチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用による活性化されたカルボキシル基の使用、連結のためのクロロアセチルのような活性化ハロゲンまたはマレイミドのような活性化オレフィンとメルカプト基との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、これらの適用における使用を見いだす。
本発明の別の診断局面は、ＤＡＰまたはＭＤＬの配列から得たポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、異常状態、例えば、ガンまたは発生問題を有する疑いのある患者からの試料において抗原のレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。ＲＮＡおよびＤＮＡの両方のヌクレオチド配列の調製、その配列の標識化、およびその配列の好ましいサイズは、文献において広い説明および議論を受け入れている。通常には、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１４ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数キロ塩基までであり得る。種々の標識は、最も一般的には放射性核種、特に32Ｐを用い得る。しかし、他の技法もまた、例えば、ポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン改変されたヌクレオチドを使用して、用いられ得る。次いで、このビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用し、これは、放射性核種、蛍光団、酵素などのような広範な種々の標識で標識され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む、特異的二重鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。次に、抗体が標識され得、そして二重鎖が表面に結合され、そのため表面上の二重鎖の形成の際に、二重鎖へ結合した抗体の存在が検出され得るアッセイを行い得る。新規アンチセンスＲＮＡに対するプローブの使用は、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナススクリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド放出翻訳（ＨＲＴ）、およびハイブリッド停止翻訳（ＨＡＲＴ）のような任意の従来の技法において行われ得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技法を包含する。
他のマーカーの定性的または定量的存在についてもまたテストする診断キットもまた、意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組み合わせに依存し得る。したがって、キットは、マーカーの組み合わせについてテストし得る。例えば、Ｖｉａｌｌｅｔら（１９８９） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ． １：８９−９７を参照のこと。
Ｘ．レセプター複合体パートナー
本明細書におけるＤＡＰおよびＭＤＬタンパク質の記載は、レセプター複合体パートナーを同定するための手段を提供する。このようなレセプター複合体パートナーは、相当に高い親和性で、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、および／またはＭＤＬ−１に特異的に結合するはずである。ＤＡＰまたはＭＤＬのいずれかの標識化がそのパートナーを検出することを可能にする種々の構築物が、利用可能とされる。例えば、ＤＡＰ１２の直接標識化、二次標識化のためのマーカー（例えば、ＦＬＡＧまたは他のエピトープタグ）のそれへの融合、Ｉｇドメイン融合などが、結合パートナーの検出を可能にする。これは、生化学的精製、または発現クローン化アプローチにおける標識または選択のためのアフィニティー法と同様に、組織学的であり得る。ツーハイブリッド選択システムもまた、利用可能なＤＡＰ１２配列を有する適切な構築物を作製することに適用され得る。例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６を参照のこと。
本発明の広い範囲は、以下の実施例を参考にして最良に理解され、この実施例は、本発明を特定の実施態様に限定することを意図しない。
（Ｉ．一般的方法）
標準的方法のいくつかは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら （１９８２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版） Ｖｏｌ． １−３， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｂｒｏｏｋｌｙｎ， ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら （１９８７年および補遺） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載または参照される。タンパク質精製の方法には、硫酸アンモニウム沈殿法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などのような方法が挙げられる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら （１９８７年および定期的補遺）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ （１９９０）「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １８２およびこのシリーズの他の巻；およびタンパク質精製産物の使用における製造業者の文献（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ、またはＢｉｏ−Ｒａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）を参照のこと。組換え技法との組み合わせは、適切なセグメント（例えば、ＦＬＡＧ配列またはプロテアーゼ除去可能配列によって融合され得る等価物）への融合を可能にする。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ （１９８９） Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ １２：６９−７０；Ｈｏｃｈｕｌｉ （１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｌａｔｅ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ」Ｓｅｔｌｏｗ （編） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：８７−９８， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；およびＣｒｏｗｅら （１９９２） ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ： Ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｙｔｅｍ ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡを参照のこと。
標準的な免疫学的技術は、例えば、Ｈｅｒｔｚｅｎｂｅｒｇら、（１９９６編）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１〜４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；およびＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第７０、７３、７４、８４、９２、９３、１０８、１１６、１２１、１３２、１５０、１６２、および１６３巻に記載されている。神経細胞生物学的活性のためのアッセイは、例えば、Ｗｏｕｔｅｒｌｏｏｄ（１９９５編）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｍｏｄｕｌｅｓ １０， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＮｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪに記載されている。発生系の方法は、Ｍｅｉｓａｍｉ（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載されている。
ＦＡＣＳ分析は、Ｍｅｌａｍｅｄら （１９９０） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；Ｓｈａｐｉｒｏ （１９８８） Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら （１９９３） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに記載される。
コンピューター配列分析は、例えば、入手可能なソフトウェアプログラム（ＧＣＧ（Ｕ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびＧｅｎＢａｎｋソースからのプログラムを含む）を使用して、実施される。公的な配列データベースもまた使用された（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよび他）。
（ＩＩ．ＰＣＲによるヒトＤＡＰフラグメントの増幅）
２つのプライマーを、提供された配列に従って設計する。ＰＣＲ産物を得る機会を増大させるために、ヒトＴＨＰ−１細胞、Ｔｈ１ Ｔ細胞、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０で活性化された単球、またはＮＫ細胞を使用する。産物を精製し、ｐＣＲTMベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）にサブクローン化し、次いで配列決定する。表１、２、および３を参照のこと。
（ＩＩＩ．ヒトＤＡＰおよびＭＤＬの組織分布）
ハイブリダイゼーション分析またはＰＣＲ分析が使用され得る。ハイブリダイゼーションによる予備データは、マクロファージ、樹状細胞、いくつかのＴ細胞、およびＮＫ細胞における発現を示唆する。分析は、ノーザン、サザン、またはｃＤＮＡノーザン技術によるものであり得る。ウェスタンブロッティングは、適切な抗体または血清を使用して実施され得る。ゲノム配列もまた、標準的な技術によって決定され得る。
ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により、１つのＤＡＰ１２遺伝子のゲノム構成と一致した制限酵素消化パターンが明らかになった。ノーザンブロット分析は、約０．７ｋｂのＤＡＰ１２転写物が末梢血白血球およびヒト脾臓に豊富に存在するが、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸または結腸には存在しないことを示した。ＤＡＰ１２転写物は、２つのヒトＮＫ細胞株ＮＫＬおよびＮＫ９２から単離されたＲＮＡにおいて検出されたが、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ白血病細胞株またはＪＹ ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株においては検出されなかった。ｃＤＮＡライブラリーの大パネルのサザンブロット分析によって、ヒト末梢血休止単核細胞、樹状細胞（そこからＤＡＰ１２がクローン化された）、末梢血単球、およびＮＫ細胞株およびクローンにおいてＤＡＰ１２が優勢に発現していることが明らかになった。
ＤＡＰ１０における初期分布データは、それが、ＮＫ細胞、単球、および樹状細胞において高度に発現されていることを示す。それは、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞においては、高度に発現されていないようである。
ＭＤＬ−１は、その発現が、ｃＤＮＡライブラリーの大パネルのサザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲにより分析されるように、単球、マクロファージ、および樹状細胞に制限されるようである。ＭＤＬ−１転写物は、Ｔ細胞（プレＴ細胞、休止Ｔ細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２ Ｔ細胞株およびクローン）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球、マスト細胞株、および内皮細胞株においては検出されなかった。ヒト胎児組織ライブラリーのパネルは、胎児脾臓ライブラリーとのハイブリダイゼーションを示すが、他のライブラリーとは示さなかった。このことは、ＭＤＬ−１転写物が非造血起源の細胞タイプでは発現されないことを示唆する。
（ＩＶ．げっ歯類ＤＡＰおよびＭＤＬ ｃＤＮＡの単離）
表１、２、および３の配列は、マウス対応物の単離を可能にするプローブまたはプライマーの設計を可能にする。霊長類配列およびげっ歯類配列と共に、他の種の対応物が、保存配列（核酸またはエピトープのいずれか）を使用して同定され得る。
（Ｖ．単離されたクローンの配列決定）
上記のように単離されたクローンを配列決定するために、標準的な方法が使用される。発現のための適切な構築物を、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、バキュロウイルス、または哺乳動物細胞タイプにおいて、調製する。好ましい細胞タイプには、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＹ、またはＢａｆ３が含まれる。ＡＴＣＣカタログを参照のこと。
（ＶＩ．ヒトＤＡＰおよびＭＤＬタンパク質の発現）
可溶性ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧタンパク質は、ＣＯＳ−７細胞において一過的に発現される。アミノ末端またはカルボキシ末端にＦＬＡＧペプチドを示すＤＡＰ１２の組換え形態（Ｈｏｐｐｅら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０５−１２１０）を、発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに導入し、続いて、エレクトロポレーションによってＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトする。エレクトロポレートされた細胞を、１％ Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ ＨＵを補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＤＭＥＭ培地単独で増殖させる。同様の方法をＤＡＰ１０またはＭＤＬ−１についても使用する。
（ＶＩＩ．可溶性ＤＡＰ ＦＬＡＧタンパク質の精製）
可溶性ＤＡＰ１２ ＦＬＡＧを含有する上清を、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗマトリックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｓａｌｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に付着させたＣｕ++イオンの２０ｍｌカラムに通す。結合緩衝液（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｂｕｆｆｅｒキット、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）での洗浄後、金属イオンにより保持されたタンパク質をイミダゾールの勾配を用いて溶出させる。溶出画分中のヒトＤＡＰ１２ ＦＬＡＧの含有量を、例えば、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）を用いるドットブロットによるか、または還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルーおよび銀染色によって決定する。次いで、ＤＡＰ１２ ＦＬＡＧタンパク質含有画分をプールし、そしてＰＢＳに対して透析する。
（ＶＩＩＩ．膜ＤＡＰまたはＭＤＬの安定発現）
ネイティブな膜形態を発現ベクター（例えば、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、これは、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターに連結されたＲＳＶ−ＬＴＲエンハンサーを含む）にサブクローン化する。次いで、この構築物を、エレクトロポレーションによって、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充した選択的０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ＤＭＥＭに播種する。
安定にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞における膜ＤＡＰ１２タンパク質の生化学的特徴付けは、代謝標識化を用いて実施され得る。細胞を、例えば、１０％ウシ胎児血清および１μｌ最終デキサメタゾンを補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）において培養する。次いで、細胞を35Ｓ−Ｍｅｔおよび35Ｓ−Ｃｙｓと共にインキュベートし、細胞タンパク質を標識する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下でのそのタンパク質の分析は、１２ｋＤａタンパク質を示すはずであるが、非トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞の溶解物では示さない。いくらかの他の構造的特徴は、公知である（例えば、グリコシル化部位など）。
（ＩＸ．ＤＡＰに特異的な抗体の調製）
近交系Ｂａｌｂ／ｃマウスを、霊長類タンパク質の組換え形態で腹腔内免疫する。動物を、適切な時点で、さらなるアジュバントと共にまたはアジュバントなしでタンパク質で追加免疫し、抗体産生をさらに刺激する。血清を採集するか、またはハイブリドーマを、採取した脾臓を用いて生成した。
あるいは、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、その遺伝子またはそれらのフラグメントで形質転換した細胞（内因性または外因性のいずれかの細胞）で、またはその抗原の発現について富化された単離膜で免疫する。血清を、適切な時期、代表的には、多数のさらなる投与後に採集する。種々の遺伝子治療技術が、免疫応答を生成するために、例えば、インサイチュでのタンパク質の産生において、有用であり得る。
モノクローナル抗体が作製され得る。例えば、脾細胞を適切な融合パートナーと融合し、そしてハイブリドーマを標準的な手順によって増殖培地中で選択する。ハイブリドーマ上清を、ヒトＤＡＰ１２に結合する抗体の存在について、例えば、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイによって、スクリーニングする。ヒトＤＡＰ１２を特異的に認識するが、他の種改変体を認識しない抗体が、選択または調製され得る。
別の方法では、合成ペプチドまたは精製タンパク質を免疫系に提示して、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成する。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。適切な状況では、結合試薬は、上記のように（例えば、蛍光または他の方法で）標識されるか、またはパニング方法のための基質に固定化される。核酸はまた、動物中の細胞に導入されて、抗原を産生し得、これは、免疫応答を惹起するように働く。例えば、Ｗａｎｇら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：４１５６−４１６０；Ｂａｒｒｙら（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：６１６−６１９；およびＸｉａｎｇら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：１２９−１３５を参照のこと。
ＤＡＰタンパク質の両方についての抗体が、以下に記載するように、作製され、そして使用されている。
（Ｘ．ヒトＤＡＰのマッピング）
染色体スプレッドを調製する。インサイチュハイブリダイゼーションを、７２時間培養したフィトヘマグルチニン刺激ヒトリンパ球から得られた染色体調製物において実施する。良質のハイブリダイゼーション後染色体バンド形成を確実にするために、培養（６０μｇ／ｍｌの培地）の最後の７時間、５−ブロモデオキシウリジンを添加した。
プライマーを用いて増幅されたＰＣＲフラグメントを、適切なベクターにクローン化する。このベクターを3Ｈでのニックトランスレーションによって標識する。放射性標識プローブを、Ｍａｔｔｅｉら（１９８５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６９：３２７−３３１に記載のように、最終濃度２００ｎｇ／ｍｌのハイブリダイゼーション溶液で、中期スプレッドにハイブリダイズさせる。
核トラックエマルジョン（ＫＯＤＡＫ ＮＴＢ2）でコーティングした後、スライドを露出させる。バンド形成手順の間の銀粒のスリッピングを避けるために、染色体スプレッドを緩衝化ギムザ溶液でまず染色し、そして中期を写真撮影する。次いで、蛍光色素−光分解−ギムザ（ＦＰＧ）法によってＲバンド形成を行い、そして分析前に中期を再度写真撮影する。
ヒトＤＡＰ１２のゲノム構成は、染色体１９ｑ１３．１において約４ｋｂにわたる５つのエキソンからなる。ヒトＫＩＲ遺伝子（Ｂａｋｅｒら（１９９５）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３：５１１）および関連ＬＡＩＲ（Ｍｅｙａａｒｄら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：２８３−２９０）、ならびにＩＬＴ／ＭＩＲ（Ｗａｇｔｍａｎｎら、（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６１５−６１８）遺伝子は全て、染色体１９ｑ１３．４の近くに位置する。
（ＸＩ．ＤＡＰおよびＭＤＬ生物学）
ＤＡＰ１２は、その細胞質ドメイン中に免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するジスルフィド結合ホモダイマーである。これは、ＮＫ細胞、単球、および樹状細胞において優勢に発現される。この分子は、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を欠くキラー細胞阻害レセプター（ＫＩＲ）ファミリーの膜糖タンパク質と、非共有結合的に会合する。トランスフェクタントにおいて発現された架橋ＫＩＲ２ＤＳ２−ＤＡＰ１２複合体は、細胞タンパク質のチロシン−リン酸化および初期活性化抗原のアップレギュレーションにより示されるように、細胞活性化を生じる。リン酸化ＤＡＰ１２ペプチドは、ＺＡＰ−７０およびＳｙｋタンパク質チロシンキナーゼを結合する。このことは、Ｔ細胞およびＢ細胞の抗原レセプターに類似した活性化経路を示唆する。
ＮＫ細胞は、免疫グロブリンおよびＣタイプレクチンスーパーファミリーの膜レセプターを発現する。このレセプターは、ＭＨＣクラスＩを認識し、そしてＮＫ細胞媒介細胞傷害性を阻害する。Ｌａｎｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：３７１−３７８。これらの阻害性レセプター（ヒトＫＩＲ、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、およびげっ歯類Ｌｙ４９を包含する）は、それらの細胞質ドメインに、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ）１または２を補充するＩＴＩＭを有し、ＮＫ細胞機能の不活性化を生じる。Ｂｕｒｓｈｔｙｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：７７−８５；Ｏｌｃｅｓｅら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５３１−４５３４；およびＨｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９。ＫＩＲ、Ｌｙ４９、およびＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターのいくらかのイソ型はＩＴＩＭ配列を欠き、そしてこれらの「非阻害性」レセプターは、ＮＫ細胞機能を阻害するよりむしろ活性化し得ることが提唱されている。Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０８−３６０９；Ｂｉａｓｓｏｎｉら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：６４５−６５０；およびＭａｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：２１１９−２１２８。非阻害性ＫＩＲ２ＤＳ２分子がＲＢＬ−２Ｈ３好塩基球性白血病においてトランスフェクションによって発現された場合、レセプターが連結されたときには細胞活性化は観察されなかった。このことは、これらの「非阻害性」ＮＫレセプターが固有のシグナル伝達特性を欠き得ることを示唆する。Ｂｌｅｒｙら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：８９８９−８９９６。
最近、Ｏｌｃｅｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５０８３−５０８６は、ジスルフィド結合ダイマーとして発現された約１２ｋＤの未知のリンタンパク質が、ＮＫ細胞溶解物からの非阻害性ＫＩＲ２ＤＳ２糖タンパク質で免疫沈降したことを報告した。細胞表面Ｉｇレセプター、Ｔ細胞抗原レセプター（ＴｃＲ）、およびいくらかのＦｃレセプター（ＦｃＲ）は、これらのレセプター複合体によるシグナル伝達に必要とされるＩＴＡＭ配列（Ｄ／ＥｘｘＹｘｘＬ／Ｉ−ｘ6-8−ＹｘｘＬ／Ｉ；Ｒｅｔｈ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：３８３−３８４）を含む小膜貫通タンパク質（例えば、ＣＤ３δ、γ、ε、ζサブユニット、ＣＤ７９α、β、ＦｃεＲＩ−γ）と、非共有結合的に会合する。Ｃｈａｎら（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５５５−５９２。従って、おそらく、これらの非阻害性ＮＫ細胞レセプターは、ポジティブなシグナル伝達を仲介するために、同様の特性を有する会合タンパク質を必要とし得ると思われる。
ｃＤＮＡライブラリーの大パネル由来の発現タグ配列（ＥＳＴ）のデータベースを、ヒトＣＤ３δ、γ、ε、ζ、およびＦｃεＲＩ−γタンパク質配列と相同性を有する分子について、ＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムプログラムを用いて検索した。ヒトＣＤ１＋樹状細胞ライブラリー由来のＥＳＴを、この分子におけるＩＴＡＭの同定に基づくさらなる研究のために選択した。６０４ｂｐのｃＤＮＡの配列決定により、３３９ヌクレオチドのオープンリーディングフレームが明らかになった。これは、１１３アミノ酸の推定Ｉ型膜タンパク質をコードする（配列番号１および２を参照のこと）。このタンパク質（ＤＡＰ１２と称する）は、２７アミノ酸のリーダー、１４アミノ酸の細胞外ドメイン、２４アミノ酸の膜貫通セグメント、および４８アミノ酸の細胞質領域で構成される。ＤＡＰ１２は、ヒトＣＤ３δ、γ、ε、ζおよびＦｃεＲＩ−γタンパク質との相同性が２５％未満であるが、細胞質ドメインは、ペプチドＥＳＰＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ（配列番号２を参照のこと）を含む。これは、プロトタイプのＩＴＡＭコンセンサス配列に正確に相当する。プロテインキナーゼＣ（残基７９〜８１および１０７〜１０９）およびカゼインキナーゼＩＩ（残基８５〜８８）によるリン酸化のための潜在部位もまた、ＤＡＰ１２細胞質領域に存在する。膜貫通領域は、ＣＤ３サブユニットの膜貫通ドメインにも保存された荷電アミノ酸（Ｄ）を含む。ＤＡＰ１２の潜在的マウスホモログは、ヒトＤＡＰ１２タンパク質と約７０％相同であり、そして膜貫通領域に保存Ｄ残基、細胞外ドメインに保存Ｃ残基、および細胞質領域にＩＴＡＭを有する。
非阻害性ＫＩＲ（Ｂｉａｓｓｏｎｉら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：６４５−６５０）、Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈ（Ｍａｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：２１１９−２１２８）、ＣＤ９４（Ｃｈａｎｇら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２４３３−２４３７）、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅ（Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７−１０２０）、およびＩＬＴ１（ＳａｍａｒｉｄｉｓおよびＣｏｌｏｎｎａ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：６６０−６６５）レセプターの顕著な特徴は、膜貫通ドメイン中の塩基性アミノ酸（ＫまたはＲ）の存在である。膜貫通ドメイン中のマルチサブユニットレセプター複合体のタンパク質間の反対電荷に荷電したアミノ酸を介した相互作用の前例、例えばＣＤ３／ＴｃＲ複合体（Ｃｈａｎら（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５５５−５９２）を仮定して、本発明者らは、ＤＡＰ１２が、膜貫通領域にＫを含む非阻害性ＫＩＲ２ＤＳ２糖タンパク質と会合するかどうかを試験した（ＣｏｌｏｎｎａおよびＳａｍｒｉｄｉｓ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４０５−４０８）。マウスＢａ／Ｆ３プレ−Ｂ細胞系を、ＫＩＲ２ＤＳ２をコードするｃＤＮＡ単独で、またはＮ末端にＦＬＡＧエピトープタグを含むＤＡＰ１２ ｃＤＮＡと共にトランスフェクトして、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂによる検出を可能とした。トランスフェクト体を、細胞表面発現について、抗ＫＩＲ ｍＡｂ ＤＸ２７または抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２によるポジティブ染色に基づいてフローサイトメトリーによって選択した。ＫＩＲ２ＤＳ２ Ｂａ／Ｆ３およびＫＩＲ２ＤＳ２＋ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ Ｂａ／Ｆ３トランスフェクト体を１２５Ｉで表面標識し、１％ジギトニンで溶解して、膜タンパク質複合体の非共有結合的会合を保存し、そして抗ＫＩＲ ｍＡｂまたは抗ＦＬＡＧ ｍＡｂで免疫沈降した。ＦＬＡＧエピトープ中のチロシン残基は放射性ヨード化のための部位を与え、ＤＡＰ１２タンパク質を可視化させる。抗ＫＩＲ ｍＡｂは、約５０〜６０ｋＤの１２５Ｉ標識種を、ＫＩＲ２ＤＳ２ Ｂａ／Ｆ３細胞およびＫＩＲ２ＤＳ２＋ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ Ｂａ／Ｆ３トランスフェクト体の両方から免疫沈降し、これはＫＩＲ２ＤＳ２糖タンパク質の予想された分子量と一致する。さらなる１２５Ｉ標識された約１２ｋＤのタンパク質が、抗ＫＩＲ ｍＡｂによって、ＫＩＲ２ＤＳ２＋ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧトランスフェクト体から共に免疫沈降したが、ＫＩＲ２ＤＳ２のみを発現するトランスフェクト体からは免疫沈降しなかった。相反的に、ＫＩＲ２ＤＳ２と同等に移動する１２５Ｉ標識された糖タンパク質が、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂによって、ＫＩＲ２ＤＳ２＋ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ Ｂａ／Ｆ３細胞から共に免疫沈降したが、ＫＩＲ２ＤＳ２のみのトランスフェクト体からは免疫沈降しなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって還元または非還元条件のいずれかを用いて分析した免疫沈降物の比較は、ＤＡＰ１２が細胞表面でジスルフィド結合二量体として発現することを示す。ＤＡＰ１２の細胞表面発現を、ＫＩＲ２ＤＳ２を用いずＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ ｃＤＮＡ単独でトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞の表面上で検出することは不可能であったことに留意すべきである。しかし、ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧタンパク質は細胞質中で検出され、これは、ＣＤ３タンパク質による場合と同様に、ＤＡＰ１２が細胞表面に効率的に輸送されるためには、そのパートナーサブユニットと会合することが必要であり得ることを示唆する（Ｃｌｅｖｅｒｓら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６２９−６６２）。さらに、予備試験結果は、ＤＡＰ１
２が、その膜貫通ドメイン中に荷電残基を欠く阻害性ＫＩＲアイソタイプとは会合しないことを示した。
ＤＡＰ１２の細胞質ドメインに対応するペプチド（ＩＴＥＴＥＳＰＹ＊ＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹ＊ＳＤＬＮＴＱＲＰ；配列番号２参照）は、未リン酸化タンパク質として、あるいは両Ｙ残基上にリン酸を含むもののいずれかとして合成された。ジャーカット Ｔ細胞またはＮＫ細胞クローンＡ６由来のライセートをビオチン化ペプチドと共にインキュベートし、そして複合体をアビジン−アガロースを用いて沈降させた。ウェスタンブロット分析は、未リン酸化ペプチドではなく両Ｙ残基上でリン酸化されたＤＡＰ１２ペプチドが、ＺＡＰ−７０キナーゼとの複合体を形成したことを示した。未リン酸化ＤＡＰ１２ペプチドではなくチロシンリン酸化ＤＡＰ１２ペプチドはまた、ＮＫ細胞由来のライセート中でＳｙｋタンパク質チロシンキナーゼと複合体を形成する。これらのキナーゼのリン酸化ＤＡＰ１２に対する結合は、リン酸化ＩＴＡＭ含有ＣＤ３サブユニットとＳｙＫまたはＺＡＰ−７０キナーゼとの間でＴｃＲシグナル化の間に示される相互作用を著しく連想させる。Ｉｗａｓｈｉｍａら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１１３６−１１３９；およびＣｈａｎら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４７５８−４７６６。
Ｔ細胞上のＣＤ３／ＴｃＲ複合体またはＢ細胞上のＩｇレセプター複合体の連結が、細胞の活性化を生じた。従って、ＫＩＲ２ＤＳ２−ＤＡＰ１２複合体の架橋の機能的な結果を試験するための研究を企てた。ＫＩＲ２ＤＳ２単独またはＫＩＲ２ＤＳ２−ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ複合体のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクト体を抗ＫＩＲ ｍＡｂ ＤＸ２７または抗ＦＬＡＧ ｍＡｂと共にインキュベートし、ついでヤギ抗マウスＩｇと共にインキュベートして、架橋を与えた。抗ＫＩＲまたは抗ＦＬＡＧ ｍＡｂで刺激された、ＫＩＲ２ＤＳ２−ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ複合体を発現するＢａ／Ｆ３細胞中の全細胞タンパク質の試験によって、いくつかの細胞基質のチロシンリン酸化が明らかになった。抗ＦＬＡＧ ｍＡｂによる免疫沈降および抗ホスホチロシンｍＡｂによるウェスタンブロット分析は、ＫＩＲ２ＤＳ２−ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧトランスフェクト体の抗ＫＩＲ ｍＡｂによる架橋がＤＡＰ１２タンパク質のチロシンリン酸化を誘導し、その結果、リン酸化ＤＡＰ１２とＳｙｋタンパク質チロシンキナーゼとが会合することを示した。対照的に、ＫＩＲ２ＤＳ２のみを発現するＢａ／Ｆ３細胞は抗ＫＩＲ ｍＡｂによる架橋によって活性化されなかった。同様に、ＣＤ６９発現のアップレギュレーションは、ＫＩＲ２ＤＳ２単独ではなくＫＩＲ２ＤＳ２およびＤＡＰ１２の両方でトランスフェクトされたジャーカット Ｔ白血病細胞において、これらのレセプターが抗ＫＩＲ ｍＡｂで架橋された場合に、観察された。これらの結果は、ＤＡＰ１２がこれらの宿主細胞におけるＫＩＲ２ＤＳ２シグナル伝達のために必要であり、かつその原因であることを示し、そして、ＫＩＲ２ＤＳ２分子はＮＫ細胞中で機能するがＫＩＲ２ＤＳ２のみを発現するトランスフェクト体中では機能しないことを示す、以前の観察に一致する。Ｂｌｅｒｙら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：８９８９−８９９６。
これらの研究は、ＤＡＰ１２が、ＴｃＲ複合体中のＣＤ３サブユニットおよびＢ細胞レセプター複合体中のＣＤ７９サブユニットの機能と同様に、ＮＫ細胞中のＫＩＲ分子の非阻害性アイソタイプと会合し得ること、およびこれらのレセプターを介して細胞を活性化させることを示唆する。単球および樹状細胞中のＤＡＰ１２の発現は、これらの細胞型中に存在する非阻害性ＫＩＲと同様の他のレセプターとの会合を予想させる。見込みのある候補は、ヒト単球によって発現される最近同定されたＩＬＴ／ＭＩＲの分子のファミリー（Ｗａｇｔｍａｎｎら（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６１５−６１８；およびＳａｍａｒｉｄｉｓおよびＣｏｌｏｎｎａ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：６６０−６６５）およびげっ歯類の骨髄およびＢ細胞中のＰＩＲ−Ａ分子（Ｈａｙａｍｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７３２０−７３２７；およびＫｕｂａｇａｗａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５２６１−５２６６）である。さらに、ＤＡＰ１２の物理的性質は、マウス胸腺細胞上のプレ−Ｔ細胞レセプター複合体中で同定された新規の二量体１２ｋＤリンタンパク質と同様である。Ｔａｋａｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：７４１−７４７。従って、ＤＡＰ１２は異なる細胞系統において、多様なレセプターのアレイによって媒介される細胞活性化において機能し得る。
（クローニングおよび配列分析）
ＤＮＡＸ配列データベースのＴＢＬＡＳＴＮサーチを、ヒトＣＤ３δ、γ、ε、ζおよびＦｃεＲＩ−γタンパク質配列を用いて行った。プラスミドＬＬ６０３中のｃＤＮＡ挿入断片が、ヒトＣＤ１＋樹状細胞ライブラリにおいて同定され、これを単離し、そして自動配列決定（ＡＢＩ）に供した。
（ＤＮＡおよびＲＮＡ）
ヒト組織由来のＲＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ノーザンブロットおよびサザンブロット分析を記載のように行った。Ｃｈａｎｇら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２４３３−２４３７。
（トランスフェクション）
ＣＤ８リーダーセグメントを含み、その後にＦＬＡＧペプチドエピトープが続き、そしてＤＡＰ１２の細胞外セグメント、膜貫通セグメント、および細胞質セグメントに連結したｃＤＮＡをｐＭＸ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクター（Ｏｎｉｈｓｉら（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２４：３２４−３２９；Ｄｒ．Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ、ＤＮＡＸのご厚意により提供）中にサブクローン化し、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞系（Ｄｒ．Ｇ．Ｎｏｌａｎ、Ｓｔａｎｆｏｒｄのご厚意により提供）を用いてパッケージングし、そしてウイルスを用いてマウスプレ−Ｂ細胞系Ｂａ／Ｆ３（Ｏｎｉｈｓｉら（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２４：３２４−３２９）に感染させた。ＫＩＲ２ＤＳ２（Ｄｒ．Ｍ．Ｃｏｌｏｎｎａ、Ｂａｓｅｌのご厚意により提供）をコードするＮＫＡＴ５ ｃＤＮＡ（ＣｏｌｏｎｎａおよびＳａｍａｒｉｄｉｓ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４０５−４０８）をｐＭＸ−ｎｅｏレトロウイルスベクター中にサブクローン化した。Ｂａ／Ｆ３細胞を感染させ、薬剤選択し、そしてフローサイトメトリーを用いてトランスフェクト体を単離した。Ｏｎｉｈｓｉら（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２４：３２４−３２９。ＤＡＰ１２ ｃＤＮＡを、ジャーカット細胞中での一時的な発現のために、プラスミドの導入のためのエレクトロポレーションを用いてｐＥＦ−ＢＯＳベクター中にサブクローン化した。Ｗｕら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４３３７−４３４６。
（免疫沈降）
細胞を125Ｉで標識し、そして溶解バッファー（ｐＨ７．８、１％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）、０．１２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリエタノールアミン、０．０１％ ＮａＮ3、およびプロテアーゼインヒビター）中に可溶化した。Ｌａｎｉｅｒら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８０３−８０５。細胞ライセートを氷上で２時間、ウサギ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ）およびマウス抗ＫＩＲ２Ｄ ｍＡｂ ＤＸ２７、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２（Ｋｏｄａｋ）、またはコントロールＩｇＧで被覆されたＰａｎｓｏｒｂｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共にインキュベートし、そして次に５ｍＭのＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼインヒビターを含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄した。Ｌａｎｉｅｒら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８０３−８０５。ＤＡＰ１２の細胞質ドメイン中の残基ＩＴＥＴＥＳＰＹ*ＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹ*ＳＤＬＮＴＱＲＰに対応するビオチン化ペプチド（配列番号２参照）を、未リン酸化で、あるいは両Ｙ残基上にリン酸を含むように、合成した（Ｄｒ．Ｃ．Ｔｕｒｃｋ、ＵＣＳＦのご厚意により提供）。対照の未リン酸化およびＹ−リン酸化ＣＤ３ζペプチド（Ｉｗａｓｈｉｍａら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１１３６−１１３９）はＤｒ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ（ＵＣＳＦ）から寄贈られた。ビオチン化ペプチドをジャーカットまたはＮＫクローンＡ６細胞由来のライセートと共にインキュベートし、アビジン−アガロースで沈降させ、そして１％ ＮＰ−４０およびプロテアーゼインヒビターを含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で洗浄した（Ｉｗａｓｈｉｍａら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１１３６−１１３９）。免疫沈降物をウェスタンブロット（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：１６３−１７２）によって、抗ＺＡＰ−７０ ｍＡｂまたはウサギ抗Ｓｙｋ特異的抗血清（Ｉｗａｓｈｉｍａら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：１１３６−１１３９；Ａｒｔ Ｗｅｉｓｓ、ＵＣＳＦのご厚意により提供）を用いて分析した。
（細胞活性化）
ＫＩＲ２ＤＳ２単独、ＤＡＰ１２（ＦＬＡＧエピトープタグ化）単独、またはＫＩＲ２ＤＳ２−ＤＡＰ１２複合体のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞を、表示されたｍＡｂと共に４℃でインキュベートし、洗浄し、そして次にＦ（ａｂ’）2ヤギ抗マウスＩｇで３分間、３７℃で架橋した。細胞を１％ＮＰ−４０およびプロテアーゼインヒビターを含むＴＢＳ中で溶解した。ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧの細胞ライセート全体または抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ Ｍ２を用いる免疫沈降物を、ウェスタンブロットによってＨＲＰ結合抗ホスホチロシンｍＡｂ ４Ｇ１０（ＵＢＩ）を用いて分析した。レトロウイルスベクター（Ｏｎｉｈｓｉら（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２４：３２４−３２９）を用いてＮＫＡＴ５ ｃＤＮＡ（ＣｏｌｏｎｎａおよびＳａｍａｒｉｄｉｓ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４０５−４０８）で安定にトランスフェクトされたジャーカット細胞を、ヒトＤＡＰ１２ ｃＤＮＡを用いるエレクトロポレーションによって、ｐＥＦ−ＢＯＳベクター中に一時的にトランスフェクトし、あるいは対照ベクターで偽トランスフェクトした。Ｗｕら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４３３７−４３４６。２４時間後、トランスフェクト体を、コントロールＩｇまたは抗ＫＩＲ ｍＡｂ ＤＸ２７でプレコート（５μｇ／ｍｌ）したマイクロタイタープレート中でインキュベートした。１２時間のインキュベーションの後、トランスフェクト体を収集し、次いでＦＩＴＣ結合抗ＣＤ６９またはコントロールｍＡｂで染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。ＬａｎｉｅｒおよびＲｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１９２−１９９。
（ＸＩＩ．ＤＡＰ１２は活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ ＮＫ細胞レセプターと会合する）
ＭＨＣクラスＩに対する阻害性ＮＫ細胞レセプターが、免疫レセプターチロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）（これは細胞内チロシンホスファターゼを補充し、かつＮＫ細胞エフェクター機能を妨害する）を発現する場合、活性化ＮＫ細胞レセプターは細胞刺激に必要とされる固有の配列を欠く。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣはＣ型レクチンスーパーファミリーの活性化ＮＫ細胞レセプターであり、これはＨＬＡ−Ｅと結合し、免疫レセプターチロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む膜レセプターであるＤＡＰ１２と非共有結合的に会合する。細胞表面上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃの効率的な発現にはＤＡＰ１２の存在が必要とされ、そしてＤＡＰ１２およびＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメイン中の荷電残基がこの相互作用のために必要である。これらの結果は、細胞の活性化および阻害に関与するＭＨＣクラスＩに対するＮＫ細胞レセプターの構築のための分子的基礎を提供する。
ＮＫ細胞はリンパ球であり、特定の細菌、寄生虫、およびウイルスに対する先天性免疫応答に関与する（ＳｃｏｔｔおよびＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３４−４０；Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ（１９８９）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１８７−３７６に概説される）。ＮＫ細胞がどのようにして病原体を認識するかは明確ではない。しかし、このプロセスの１つの局面は、感染の結果としてＭＨＣクラスＩが失われているか、あるいは発現がダウンレギュレートされている宿主細胞の検出および除去を伴い得る。ＮＫ細胞は、細胞で媒介される細胞毒性およびサイトカイン産生を活性化し得るかまたは阻害し得るかのいずれかであるＭＨＣクラスＩに対するレセプターを発現し得る（Ｌａｎｉｅｒ（１９８８）Ｃｅｌｌ ９２：７０５−７０７；Ｌａｎｉｅｒ（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３５９−３９３に概説される）。ＭＨＣクラスＩに対するいくつかのタイプのＮＫ細胞レセプターが同定されている（Ｌａｎｉｅｒ（１９８８）Ｃｅｌｌ ９２：７０５−７０７）。ヒトにおいては、キラー細胞阻害レセプター（ＫＩＲ）は、Ｉｇスーパーファミリーの遺伝子でコードされる分子の小さいファミリーを含む（ＣｏｌｏｎｎａおよびＳａｍａｒｉｄｉｓ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４０５−４０８；Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２３０６−２３１０；Ｗａｇｔｍａｎｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：４３９−４４９）。ＫＩＲファミリー内で、特定のアイソタイプは細胞外領域中に２つのＩｇドメイン（ＫＩＲ２Ｄ）または３つのＩｇドメイン（ＫＩＲ３Ｄ）を有し、これはそれぞれ多型性ＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−Ｂリガンドの認識に各々関与する（ＤｏｈｒｉｎｇおよびＣｏｌｏｎｎａ（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３６５−３６９；Ｆａｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７１７８−７１８３；Ｌｉｔｗｉｎら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：５３７−５４３；ＲａｊａｇｏｐａｌａｎおよびＬｏｎｇ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１５２３−１５２８；Ｒａｊｏら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５６８−５７１；およびＷａｇｍａｎｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：８０１−８０９）。不均一性はまた、異なるＫＩＲ分子の膜貫通および細胞質ドメイン中にも存在する。リガンドが結合すると、その細胞質ドメインにＩＴＩＭを有するＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬと称する）はＳＨＰ−１を補充し、ＮＫ細胞エフェクター機能を妨げる（Ｂｕｒｓｈｔｙｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４：７７−８５；Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：９３−１００；Ｆｒｙら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：２９５−３００；およびＯｌｃｅｓｅら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５３１−４５３４）。対照的に、ＩＴＩＭを欠き、かつ塩基性Ｋアミノ酸を膜貫通領域中に有するＫＩＲアイソタイプ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）はＮＫ細胞活性化に関連している（Ｂｉａｓｓｏｎｉら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８３：６４５−６５０；Ｏｌｃｅｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５０８３−５０８６）。ＫＩＲ２ＤＳはＩＴＡＭを有するアダプター分子ＤＡＰ１２と非共有結合的に会合し、これはＮＫ細胞の表面上にジスルフィド結合ホモ二量体として発現する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：５９９−６０９；Ｌａｎｉｅｒ（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２：７０５−７０７；Ｏｌｃｅｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５０８３−５０８６）。ＫＩＲ２ＤＳが架橋すると、ＤＡＰ１２のＩＴＡＭ中のチロシン残基はリン酸化され、そしてＺＡＰ−７０またはＳｙｋを補充し、細胞の活性化を生じる（Ｌａｎｉｅｒ（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２：７０５−７０７）。ヒトＤＡＰ１２はＫＩＲ遺伝子ファミリーに近いヒト染色体１９ｑ１３．１上に存在し（Ｂａｋｅｒら（１９９５）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３：５１１）ＫＩＲとＤＡＰ１２との間の遺伝子連鎖を実証する。
他のタイプのＮＫ細胞レセプターＣＤ９４／ＮＫＧ２はヘテロ二量体であり、これはＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｃ糖タンパク質のいずれかに対してジスルフィド結合した不変のＣＤ９４糖タンパク質から構成される（Ｂｒｏｏｋｓら（１９９７） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：７９５−８００；Ｃａｒｒｅｔｅｒｏら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５６３−５７５；Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５）。ＣＤ９４（Ｃｈａｎｇら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２４３３−２４３７）、そして４つのＮＫＧ２遺伝子（ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、およびＮＫＧ２Ｄ／Ｆ；Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９；およびＰｌｏｕｇａｓｔｅｌおよびＴｒｏｗｓｄａｌｅ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８３５−２８３９）は全てＣ型レクチンスーパーファミリーのメンバーであり、「ＮＫ複合体」中のヒト染色体１２ｐ１２−ｐ１３上で近くに連鎖している（Ｒｅｎｅｄｏら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４６：３０７−３１１）。ヒトＣＤ９４およびＮＫＧ２遺伝子のげっ歯類の相同体は、ヒト染色体１２とシンテニーのマウスおよびラットの染色体上の「ＮＫ複合体」中に位置する（Ｂｅｒｇら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４４４−４５０；Ｄｉｓｓｅｎら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２０８０−２０８６；およびＶａｎｃｅら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：３２３６−３２４１）。
ＣＤ９４に対する抗体は、標的を有するＦｃレセプターに対するＮＫ細胞媒介細胞毒性を活性化し得るかまたは阻害し得るかのいずれかであり、そして単一の個体から単離された異なるＮＫ細胞クローンは、これらの機能的アッセイにおいて不均一な挙動を示す（Ｂｒｕｍｂａｕｇｈら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２８０４−２８１２；Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉ１１ａｒら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５３６７−５３７４；およびＰｅｒｅｚ−Ｖｉｌｌａｒら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５７７９−５７８８）。この現象は、ＣＤ９４がＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｃのいずれかとジスルフィド結合したヘテロ二量体を形成することの発見によって説明され得る。（Ｂｒｏｏｋｓら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：７９５−８００；Ｃａｎｔｏｎｉら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２７−３３８；Ｃａｒｒｅｔｅｒｏら（１９９７）；およびＬａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５）。ＮＫＧ２ＡはＩＴＩＭ配列を細胞質ドメイン中に含み、これはレセプターと結合すると、チロシンがリン酸化され、そしてＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２を補充し、これが次にＮＫエフェクター機能を阻害する（Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９；およびＬｅ Ｄｒｅａｎら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２６４−２７６）。対照的に、ＮＫＧ２ＣはＩＴＩＭを欠き、そしてレセプターへの結合は、ＮＫ細胞の活性化を生じる（Ｃａｎｔｏｎｉら（１９９８） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２７−３３８；およびＨｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）。ＣＤ９４はＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃの両方を細胞表面に輸送するのに必要である（Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５）。個体におけるＮＫ細胞集団内で、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターは重複したサブ集団上に発現され、そしていくつかのＮＫ細胞はＮＫＧ２ＡまたはＮＫＧ２Ｃのいずれとも会合しないＣＤ９４タンパク質を発現し得る（Ｃａｎｔｏｎｉら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２７−３３８）。従って、ＣＤ９４およびＮＫＧ２タンパク質は個体において多様なレセプターレパートリーを形成し得る。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣレセプターはＨＬＡ−Ｅを認識する（Ｂｏｒｒｅｇｏら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：８１３−８１８；Ｂｒａｕｄら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５１９２−５１９６）。ＨＬＡ−Ｅは非古典的なＭＨＣクラスＩ分子であり、他の古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質のリーダーセグメント由来の９アミノ酸ペプチドに結合するユニークな特性を有する（Ｂｒａｕｄら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１１６４−１１６９)。ＮＫＧ２Ａ中のＩＴＩＭはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの阻害的機能を説明するが、ＣＤ９４もＮＫＧ２Ｃもその細胞質ドメインに固有のシグナル化能力を提供する配列を有していない。しかし、ＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域へのに塩基性アミノ酸の存在は、ＤＡＰ１２レセプターとの相互作用の可能性を示唆する。
（ＤＡＰ１２のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターとの会合）
ＤＡＰ１２が活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプター複合体と会合し得るかどうかを決定するために、マウスｐｒｅ−Ｂ細胞系であるＢａ／Ｆ３を、ヒトＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、およびＤＡＰ１２（Ｎ末端にＦＬＡＧエピトープを含み細胞表面での検出を可能とする）をコードするエコトロピックなレトロウイルスで共に感染させた。以前の結果（Ｌａｎｉｅｒ（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２：７０５−７０７）と一致して、ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２単独でのＢａ／Ｆ３細胞中へのトランスフェクトは、このレセプターの細胞表面への発現を可能にしないが、ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２タンパク質はこれらのトランスフェクト体の細胞質中で細胞質染色およびウエスタンブロット分析によって測定されるように検出された。同様に、ＮＫＧ２Ｃで同時感染させたＢａ／Ｆ３細胞またはＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２＋Ｂａ／Ｆ３トランスフェクト体において、ＮＫＧ２Ｃ単独の細胞表面発現は検出され得なかった。対照的に、ＣＤ９４単独がＢａ／Ｆ３細胞の細胞表面上に発現された。しかし、ＣＤ９４は、ＣＤ９４とＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２の両方で同時感染されたＢａ／Ｆ３細胞の細胞表面へのＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２の輸送ができないが、ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２はこれらのトランスフェクト体の細胞質中でウエスタンブロットおよび細胞質免疫蛍光法によって検出される。さらに、ＣＤ９４＋Ｂａ／Ｆ３細胞をＮＫＧ２Ｃをコードするレトロウイルスで感染させると、細胞表面上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロ二量体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ複合体を検出する抗血清を用いて、検出されなかった（Ｂｒａｕｄら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５１９２−５１９６；Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５）（しかし、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロ二量体の低レベルの表面発現を、強力なプロモーターを高度に効率的なトランスフェクション系（例えば２９３Ｔ細胞）中に含むエピソームベクターを用いて得ることは可能である；Ｂｒａｕｄら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５１９２−５１９６；Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５）。Ｂａ／Ｆ３細胞がヒトＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、およびＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２をコードするレトロウイルスで感染された場合、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ／ＤＡＰ１２トランスフェクト体の細胞表面上でＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２およびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターの発現が検出された。集合的に、これらの実験は、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、およびＤＡＰ１２で構成されるマルチサブユニットレセプター複合体の存在を支持する。
ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、およびＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２を発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクト体を125Ｉで標識し、ジギトニン界面活性剤中に可溶化して、非共有結合膜レセプター複合体を保存し（Ｌａｎｉｅｒら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８０３−８０５）、そしてヒトＣＤ９４またはＦＬＡＧに対する抗体で免疫沈降させた。抗ＣＤ９４を用いるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ／ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２ Ｂａ／Ｆ３トランスフェクト体からの免疫沈降は、125Ｉ標識タンパク質がＮＫＧ２ＣおよびＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２の予想された移動度と一致することを明らかにした。ヒトＣＤ９４は125Ｉで効率的に標識されないことが以前報告されており（Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：１６３−１７２）、そのため抗ＣＤ９４ ｍＡｂで免疫沈降した約４０ｋＤの放射標識サブユニットはＣＤ９４にジスルフィド結合したＮＫＧ２Ｃ糖タンパク質を表す（Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５）。非還元条件を用いて分析した場合、ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２は主としてジスルフィド結合ホモ二量体として移動し、そしてＮＫＧ２Ｃの移動度はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロ二量体の存在に一致した。従って、最小のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ−ＤＡＰ１２レセプター複合体は、ジスルフィド結合したＤＡＰ１２ホモ二量体がジスルフィド結合したＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロ二量体と非共有結合的に会合して構成された四量体であり得る。
（ＸＩＩＩ．ＤＡＰ１２は、ＤＡＰ１２およびＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメイン中の荷電残基を用いたＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃの細胞表面発現に必要である）
（マルチサブユニット複合体の構築におけるＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＤＡＰ１２レセプターの膜貫通領域中の荷電アミノ酸の役割）
ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃタンパク質は７５％のアミノ酸同一性を示し（Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）、そしてＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターは両方とも共通のリガンドＨＬＡ−Ｅに結合する（Ｂｒａｕｄら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５１９２−５１９６）。ＮＫＧ２ＡとＮＫＧ２Ｃとの間の顕著な違いはＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域における塩基性残基の存在であり、これはＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４では存在しない。ＮＫＧ２Ｃとは対照的に、ＣＤ９４＋Ｂａ／Ｆ３細胞にヒトＮＫＧ２Ａをコードするレトロウイルスを感染させると、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ複合体がＤＡＰ１２の非存在下で細胞表面上に発現される。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ複合体がＢａ／Ｆ３細胞上に存在するとＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２は細胞表面上に発現されないが、ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２タンパク質はこれらのトランスフェクト体の細胞質中で免疫蛍光法およびウエスタンブロット分析によって検出された。
他のマルチサブユニット膜レセプターは、その膜貫通領域中の酸性および塩基性アミノ酸によって形成される塩橋を通じて会合することが示されている（例えばＣＤ３／ＴｃＲ（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２７８３−２７９３；Ｃｏｓｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４１４−４１６；Ｍｏｒｌｅｙら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１９７１−１９７８）ので、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃとの会合のためのＤＡＰ１２中のＤ残基の必要性を試験した。ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２中のＤ残基を部位特異的変異誘発によってＡに転換し、そしてこの変異体レセプターをＢａ／Ｆ３細胞中にトランスフェクトした。野生型ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２とは異なり、Ｄ−Ａ膜貫通ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２変異体レセプターは、他のサブユニットの非存在下で細胞表面上に発現し、これは膜貫通中のＤ残基が、ＣＤ３タンパク質の膜貫通中の荷電残基の機能と同様に、ＤＡＰ１２の保持シグナルとして働くことを示す（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら（１９９０）Ｃｅｌｌ ６３：５０３−５１３；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２７８３−２７９３；Ｃｏｓｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４１４−４１６）。前記のように、ＣＤ９４およびＮＫＧ２ＣでトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞は、ＤＡＰ１２の非存在下では細胞表面上にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロ二量体を効率よく発現しない。これらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ＋Ｂａ／Ｆ３トランスフェクト体をＤ−Ａ膜貫通ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２変異体レセプターで感染させると、これらの細胞の抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２特異的抗血清との限界反応性（ｍａｒｇｉｎａｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）によって示されるように、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃは細胞表面上に効率よく発現されない（しかしＮＫＧ２Ｃタンパク質はウエスタンブロット分析によってトランスフェクト体の細胞質中で検出される）。
ＮＫＧ２ＡとＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインの比較は、ＮＫＧ２Ｃ中のＫ残基の存在を示し、これはこの残基がＤＡＰ１２中のＤ残基との相互作用の原因であり得ることを示唆する。従って、ＮＫＧ２Ｃ中のＫを部位特異的変異誘発によってＬに転換し、そしてＫ−Ｌ膜貫通ＮＫＧ２Ｃ変異体を、ＤＡＰ１２およびＣＤ９４を発現するＢａ／Ｆ３細胞中にトランスフェクトした。ＣＤ９４およびＫ−Ｌ膜貫通ＮＫＧ２Ｃ変異体で同時トランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞はＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２の表面発現を可能にしなかったが、ＤＡＰ１２はウエスタンブロット分析によって細胞質中で検出された。非常に低レベルのＣＤ９４／Ｋ−Ｌ膜貫通ＮＫＧ２Ｃ変異体レセプターが、抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ抗血清を用いて、これらのトランスフェクト体の表面上で検出された。ＮＫＧ２Ｃの膜貫通中のＫ残基は保持シグナルとして働き得るが、ＮＫＧ２ＣはまたモチーフＤｘｘｘＬＬを発現し、これはまたＣＤ３γ中に存在し、そしてＣＤ３タンパク質の分解、輸送および局在化（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：２１５６−２１６６；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３８：２７１−２８１；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２：２９９−３１０；ＬｅｔｏｕｒｎｅｕｒおよびＫｌａｕｓｎｅｒ（１９９２）Ｃｅｌｌ．６９：１１４３−１１５７）、ならびにアダプタータンパク質−１（ＡＰ−１）およびアダプタータンパク質−２の結合（ＡＰ−２；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：２７１−２８１）に関与していることに留意すべきである。
（ＸＩＶ．ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ／ＤＡＰ１２およびＫＩＲ２ＤＳ２／ＤＡＰ１２複合体を介するシグナル伝達）
ＫＩＲ２ＤＳ２／ＤＡＰ１２複合体を発現するトランスフェクト体中のＫＩＲ２ＤＳ２の連結の結果、ＤＡＰ１２および他の細胞基質のチロシンリン酸化が生じ、そしてリン酸化ＤＡＰ１２とＳｙｋとが会合する（Ｌａｎｉｅｒ（１９８８）Ｃｅｌｌ ９２：７０５−７０７）。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ／ＤＡＰ１２複合体を発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクト体上のＣＤ９４またはＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２のいずれかの連結は、ＤＡＰ１２およびＳｙｋを含む多くの細胞タンパク質のチロシンリン酸化を引き起こした。これらの結果は、架橋ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣがおそらくＤＡＰ１２を介して細胞活性化を誘導することを示す。ＤＡＰ１２非存在下での、あるいはＤ−Ａ膜貫通ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２変異体を発現するトランスフェクト体中でのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃの連結が機能的な結果を有するかどうかは扱わなかった。なぜならＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃは野生型ＤＡＰ１２の非存在下では効率的に発現されなかったからである。
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃとは異なり、ＫＩＲ２ＤＳ２分子はＤＡＰ１２の非存在下で細胞表面上に発現するが、これらは細胞活性化を誘導し得ない（Ｂｌｅｒｙら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：８９８９−８９９６；Ｌａｎｉｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：７０３−７０７）。ＫＩＲ２ＤＳ２＋Ｂａ／Ｆ３細胞を、野生型ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２またはＤ−Ａ膜貫通ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２変異体レセプターのいずれかをコードするレトロウイルスで感染させた。ＫＩＲ２ＤＳ２および変異体ＤＡＰ１２タンパク質の両方が細胞表面上に発現した。しかし、Ｄ−Ａ膜貫通ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２変異体タンパク質は、ＫＩＲ２ＤＳ２によって125Ｉ標識トランスフェクト体から共免疫沈降しなかった。さらに、抗ＫＩＲ ｍＡｂとの連結はこれらの細胞を活性化に失敗し、他方、Ｄ−Ａ膜貫通ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２変異体レセプターと抗ＦＬＡＧ ｍＡｂとの直接架橋は細胞タンパク質のチロシンリン酸化を誘導した。ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃと同様に、ＫＩＲ２ＤＳ２タンパク質は対応のＫＩＲ２ＤＬ２を有し、これは膜貫通中に荷電アミノ酸を欠き、そしてＩＴＩＭをその細胞質ドメイン中に含む。ＫＩＲ２ＤＬ２はＤＡＰ１２と会合できないことが以前に報告されている（Ｌａｎｉｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：７０３−７０７）。集合的に、これらの知見は、ＤＡＰ１２とＫＩＲ２ＤＳ２またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ複合体のいずれかとの会合が、これらのタンパク質の膜貫通ドメインに関連する相互作用から生ずるらしいことを示す。
これらの複合体におけるＤＡＰ１２およびＫＩＲ２ＤＳ２またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃの化学量論は決定されていない。ＤＡＰ１２ジスルフィド結合ホモ二量体は２つのＤ残基を有し（すなわち、各ＤＡＰ１２タンパク質中に１つ）、これはＫＩＲ２ＤＳ２またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通中に存在するＫ残基と相互作用し得る。ＣＤ９４は膜貫通中に荷電残基を欠くので、ＤＡＰ１２はアダプターとして機能し得、２つのＫＩＲ２ＤＳ２モノマーまたは２つのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロ二量体と単一のＤＡＰ１２ホモ二量体とを会合させる。
（ＸＶ．ヒトＮＫ細胞中でのＤＡＰ１２とＣＤ９４との会合）
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターは、ＮＫ細胞の活性化に関係していることが以前に示されている（Ｃａｎｔｏｎｉら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２７−３３８；Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）。ＮＫ細胞クローンおよびポリクローナルＮＫ細胞株を、抗ＣＤ９４ ｍＡｂの存在下で、Ｆｃレセプターを保有しているＰ８１５標的細胞に対する再指向された細胞傷害性を媒介するそれらの能力に基づいて選択した。このことは、活性化するＣＤ９４会合レセプター複合体（おそらく、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ）の存在を示唆する（Ｃａｎｔｏｎｉら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２７−３３８）。ＮＫ細胞クローンおよびポリクローナルＮＫ細胞株を125Ｉ標識し、多サブユニットレセプター複合体を維持するためにジギトニン界面活性剤中で溶解させ、そしてＤＡＰ１２会合タンパク質を、抗ＤＡＰ１２抗血清を使用して免疫共沈降させた。ＤＡＰ１２会合タンパク質を、ｐＨ１１．５緩衝液を用いて溶出し、複合体を解離させ、次いで、溶出したタンパク質をコントロールｍＡｂまたは抗ＣＤ９４ ｍＡｂで再度免疫沈降させた。ポリクローナルＮＫ細胞株について、125Ｉタンパク質と特異的に反応した抗ＣＤ９４ ｍＡｂが、最初の抗ＤＡＰ１２免疫沈降によって溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析においては、この分子は、非還元条件下では約７０ｋＤで移動し、そして還元条件下では約４０ｋＤで移動した。同じ結果が、ＮＫ細胞クローンを使用して得られた。ＣＤ９４自体は125Ｉ標識されていないので（Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：１６３−１７２）、おそらく、ＣＤ９４会合125Ｉ標識したタンパク質がＮＫＧ２Ｃを表すようであるが、ＮＫＧ２Ｃ特異的血清学的試薬はこのことを確認するためには利用可能ではない。それにもかかわらず、これらの知見は、ヒトＮＫ細胞の細胞表面上でのＣＤ９４／ＤＡＰ１２レセプター複合体の存在を実証する。
（対を形成している活性化レセプターおよび阻害性レセプター）
ＫＩＲ遺伝子ファミリーは、細胞の活性化または細胞の阻害のいずれかにおいて関係しているレセプターをコードする（Ｂｉａｓｓｏｎｉら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：６４５−６５０；Ｏｌｃｅｓｅら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５０８３−５０８６）。阻害性レセプターは、それらの細胞質ドメインにＩＴＩＭ配列を含み、そして膜貫通セグメント中の荷電した残基を欠いている。一方、活性化レセプターはＩＴＩＭを欠いており、しばしばより短い細胞質領域を有し、そして膜貫通部分に荷電したアミノ酸を有する。この一般的なストラテジーはまた、ＮＫＧ２（Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）、Ｌｙ４９（Ｓｍｉｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１０６８−１０７９）、ＰＩＲ（Ｈａｙａｍｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７３２０−７３２７；Ｋｕｂａｇａｗａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５２６１−５２６６）、およびＩＬＴ（ＬＩＲ）（Ｂｏｒｇｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５１９２−５１９６；ＳａｍａｒｉｄｉｓおよびＣｏｌｏｎｎａ（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：６６０−６６５）遺伝子ファミリーにおいて明らかである。これらは全て、可能性のある阻害性および活性化レセプターを含む。
ＤＡＰ１２が、ＫＩＲおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターの両方の活性化イソ型と会合することが、本明細書中で示されている。阻害性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターおよび活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターの両方が、同じリガンドであるＨＬＡ−Ｅに結合する（Ｂｒａｕｄら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５１９２−５１９６）。ＭＨＣクラスＩを認識する対を形成した阻害性レセプターおよび活性化レセプターの生物学的な比はいくらであろうか。活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ／ＤＡＰ１２レセプター複合体は、阻害性ＮＫＧ２Ａレセプター中のＩＴＩＭ配列をリン酸化するチロシンキナーゼを刺激するように作用し得、その結果、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２の漸増を生じ得る（Ｌｅ Ｄｒｅａｎら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２６４−２７６）。しかし、このことはおそらくおこりそうにないようである。なぜなら、全ＮＫ細胞集団中でＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃが別々に発現され、そしてＮＫ細胞のサブセットのみが両方のレセプターを発現するからである（Ｃａｎｔｏｎｉら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２７−３３８；およびＨｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）。阻害性ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターの非存在下でのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞の存在は、ＨＬＡ−Ｅとの遭遇の際のこれらの細胞の活性化の可能性を提供する。ＨＬＡ−Ｅは、正常な組織中で広範に発現される（Ｇｅｒａｇｈｔｙら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６６９−２６７３；Ｌｅｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：５１９９−５２０４；Ｕｌｂｒｅｃｈｔら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２９４５−２９５３）；従って、ＣＤ９４／Ｎ
ＫＧ２Ｃ／ＤＡＰ１２を介するＮＫ細胞の活性化は、自己免疫を生じ得る。しかし、最近の研究は、全てのＮＫ細胞クローンが、自己のＭＨＣクラスＩリガンドに対して少なくとも１つの阻害性レセプター（ＫＩＲまたはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａのいずれか）を発現し、従って、正常な自己由来の組織の破壊を防ぐようであることを示唆する（Ｕｈｒｂｅｒｇら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：７５３−７６３；Ｖａｌｉａｎｔｅら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：７３９−７５１）。自己のクラスＩリガンドに対する活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ／ＤＡＰ１２レセプターおよび阻害性ＫＩＲを発現するＮＫ細胞クローンは、ＫＩＲクラスＩリガンドの発現を欠失しているが、ＨＬＡ−Ｅの発現は保持している宿主細胞を認識し、そして排除する可能性を有する。このモデルは、実験的な試験を必要とするが、ＨＬＡ−Ｅに結合する能力を有するリーダーペプチドをコードするが、感染の結果として従来のＭＨＣクラスＩ分子の発現をダウンレギュレートする病原体に対する防御を提供する。
（トランスフェクタント）
使用したｃＤＮＡは、ヒトＣＤ９４（Ｃｈａｎｇら、１９９５）、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃ（Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）、ＫＩＲ２ＤＳ２（ＮＫＡＴ５、ＣｏｌｏｎｎａおよびＳａｍａｒｉｄｉｓ，１９９５））、ならびにＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２（Ｌａｎｉｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：７０３−７０７）であった。Ｄ残基（コドンＧＡＣ）をＡ残基（コドンＧＣＣ）に置換したＤ−Ａ膜貫通ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２変異体ｃＤＮＡ、およびＫ残基（コドンＡＡＡ）をＬ残基（ＴＴＡ）に置換したＫ−Ｌ膜貫通ＮＫＧ２Ｃ変異体ｃＤＮＡを、従来技術を使用するＰＣＲ変異誘発によって生成した。ＮＫＧ２Ｃ停止コドンのすぐ前のＣＯＯＨ末端上にＦＬＡＧエピトープを含有するＮＫＧ２Ｃ ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって生成した。ｃＤＮＡを、配列決定し、そしてｐＭＸ−ｎｅｏまたはｐＭＸ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクター中にサブクローン化した（Ｏｎｉｈｓｉら（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２４：３２４−３２９）。プラスミドＤＮＡを、Φ−ＮＸ−Ｅエコトロピックレトロウイルスパッケージング細胞（Ｇ．Ｎｏｌａｎ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ）からの寛大な贈与）中に、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用してトランスフェクトした（Ｏｎｉｈｓｉら、１９９６）。ウイルス上清を２日後に回収し、そしてマウスＢａ／Ｆ３プレＢ細胞（Ｏｎｉｈｓｉら、１９９６）を感染させるために使用した。感染の２日後、細胞を選択培地に移し、そしてヒトＮＫ細胞レセプターを安定に発現するＢａ／Ｆ３細胞を、均質な高レベルの発現について、フローサイトメトリーによって分離した。
（抗体およびフローサイトメトリー）
使用したｍＡｂは、抗ＣＤ９４（ＤＸ２２；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：１６３−１７２）またはＨＰ−３Ｄ９ ｍＡｂ（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｏｔｅｔ（１９９５）、１４３７−１４３９頁、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎら（編）、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；抗ＫＩＲ２Ｄ ｍＡｂ（ＤＸ２７；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：１６３−１７２）、抗ＮＫＲ−ＰＩＡ（ＤＸ１；Ｌａｎｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：２４１７−２４２８）、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２ ｍＡｂ、Ｋｏｄａｋ）、抗ＮＫＧ２Ａ／Ｃ（８Ｅ４ ｍＡｂ；Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）、およびコントロールマウスＩｇＧ１ ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）であった。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃへテロダイマーに特異的なウサギ抗血清を、記載されているように調製した（Ｌａｚｅｔｉｃら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４７４１−４７４５）。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇおよびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇ二次抗体を、ＣａｌＴａｇ（Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から購入した。免疫蛍光およびフローサイトメトリーを、記載されているように行った（ＬａｎｉｅｒおよびＲｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１９２−１９９）。
（生化学）
トランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞を125Ｉで標識し、そしてジギトニン溶解緩衝液（ｐＨ７．８、１％のジギトニン、０．１２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリエタノールアミン、０．０１％のＮａＮ3、およびプロテアーゼインヒビター；Ｌａｎｉｅｒら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８０３−８０５）中で可溶化した。細胞溶解物を、ウサギ抗マウス／ラットＩｇ（Ｓｉｇｍａ）および抗ＣＤ９４（ＤＸ２２ ｍＡｂ）、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２ ｍＡｂ）またはコントロールＩｇＧでコートしたＰａｎｓｏｒｂｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）とともに、２時間氷上でインキュベートし、次いで、洗浄した。免疫沈降物を、１０％の２−メルカプトエタノールの存在下または非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁し、１８％のＴｒｉｓ／グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で泳動し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用することによって可視化した。
ヒトＮＫ細胞クローンおよびポリクローナルヒトＮＫ細胞株（記載されているように培養した（Ｙｓｓｅｌら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：２３９−２５４）、ＣＤ３−、ＣＤ５６＋末梢血ＮＫ細胞）を125Ｉで標識し、そしてジギトニン溶解緩衝液中に可溶化した。125Ｉ細胞溶解物を、ウサギＩｇでコートしたＰａｎｓｏｒｂｉｎとともに予め一晩明澄化し、次いで、アフィニティー精製したウサギ抗ＤＡＰ１２抗血清（ヒトＤＡＰ１２の細胞質ドメイン全体を含有するＧＳＴ融合タンパク質に対して標準的な方法によって生成した）でコートしたＰａｎｓｏｒｂｉｎとともに２時間氷上でインキュベートした。ＤＡＰ１２会合タンパク質を、２５μｌの５０ｍＭのジエチルアミン（ｐＨ１１．５）中に溶出させ、そして１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡキャリアタンパク質とともに０．５ｍｌの１％ＮＰ−４０溶解緩衝液（プロテアーゼインヒビターを含有する、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に移した。ＤＡＰ１２に会合した溶出されたタンパク質を、セファロースビーズに結合させた抗ＣＤ９４ ｍＡｂ（ＨＰ−３Ｄ９およびＤＸ２２）またはセファロースビーズに結合させた抗ＮＫＲ−Ｐ１Ａ ｍＡｂ（ＤＸ１）（ネガティブコントロールとして使用した）を用いて、再度免疫沈降させた。免疫沈降物を、１％のＮＰ−４０溶解緩衝液中で洗浄し、１０％の２−メルカプトエタノールの存在下または非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁し、１８％のＴｒｉｓ／グリシンゲル上で泳動し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用することによって可視化した。
抗ＦＬＡＧ（Ｍ２ ｍＡｂ）または抗−ＮＫＧ２Ａ／Ｃ（８Ｅ４ ｍＡｂ；Ｈｏｕｃｈｉｎｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６０３−３６０９）を使用するウェスタンブロット分析を、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：１６３−１７２に記載されているように行った。８Ｅ４ ｍＡｂは、ウェスタンブロット分析によってＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃの両方を検出するが、免疫沈降せず、かつ免疫蛍光アッセイにおいて、これらの抗原に結合しない。
（細胞の刺激）
トランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞を、ＣＤ９４、ＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２、またはＫＩＲ２ＤＳ２を認識する２０μｇ／ｍｌのｍＡｂを含有する０．５％のＢＳＡを含有する冷却したＰＢＳ中に、５×１０7細胞／ｍｌで、再懸濁した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）2（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中に再懸濁し、そして３７℃にて３分間インキュベートした。細胞を、ペレット化し、記載されているように（Ｌａｎｉｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：７０３−７０７）、氷冷した溶解緩衝液（プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターであるアプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦ、ＥＤＴＡ、ＮａＶＯ4、およびＮａＦを含有する、１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に１０8／ｍｌで再懸濁した。ＳｙｋおよびＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２を、ウサギ抗Ｓｙｋ抗血清（Ｊｏｅ Ｂｏｌｅｎ、ＤＮＡＸによって寛大に提供された）または抗ＦＬＡＧ（Ｍ２ ｍＡｂ）で免疫沈降させた。細胞溶解物（２〜３×１０6細胞と等量）および免疫沈降物を、Ｔｒｉｓ／グリシンゲル上で泳動させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロットし、ブロックし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ホスホチロシンｍＡｂ ４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブし、洗浄し、そして化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて発光させた。
（ＸＶＩ．Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９ＨとのマウスＤＡＰ１２の会合）
Ｌｙ４９レセプターファミリーのいくつかのメンバーは、適切なＭＨＣクラスＩ分子を発現する標的のＮＫ細胞媒介性の溶解を阻害する。それらの細胞質ドメイン中のイムノレセプターチロシンに基づく阻害性モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｔｉｆｓ：ＩＴＩＭ）を欠失している２つのＬｙ４９分子である、Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈは、イムノレセプターチロシンに基づく活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆ：ＩＴＩＭ）を保有する分子である、マウスＤＡＰ１２と会合する。Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９ＨのいずれかとＤＡＰ１２との同時トランスフェクションは、Ｌｙ４９およびＤＡＰ１２の両方の表面発現を誘導する。Ｌｙ４９／ＤＡＰ１２複合体は、トランスフェクトされた細胞から免疫共沈降され、このことは、形質膜中のＬｙ４９ＤまたはＬｙ４９ＨとのＤＡＰ１２の物理的な会合を実証する。Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９Ｈのいずれかを認識する抗体でのトランスフェクタントの刺激は、細胞の複数の基質のチロシンリン酸化の誘導によって評価されるような、細胞の活性化を生じる。
ＮＫ細胞は、適切な多型性クラスＩリガンドの認識の際に阻害性シグナルを送達する、ＭＨＣクラスＩのレセプターを発現し、これによって標的の溶解の阻害を生じる。Ｈ−２についてのプロトタイプの阻害性レセプターであるマウスＬｙ４９Ａ（Ｋａｒｌｈｏｆｅｒら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５８：６６）は、ナチュラルキラー細胞およびＴ細胞の小さい集団上で発現されるＣ型レクチンファミリーの、ホモダイマーのＩＩ型の膜内在性タンパク質である。Ｌｙ４９ファミリーは、９個の遺伝子（Ｌｙ４９ＡからＩ）を含む（Ｓｍｉｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１０６８；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２８７；Ｔａｋｅｉら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５５：６７）。Ｌｙ４９分子のうちの７個（ＲｙａｎおよびＳｅａｍａｎ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５５：７９）は、それらの細胞質ドメイン中にＩＴＩＭを有する（Ｖ／ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）（Ｔｈｏｍａｓ（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１９５３；Ｌａｎｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：３７１）。Ｌｕ４９ＡおよびＬｙ４９Ｇ２中のリン酸化されたＩＴＩＭは、細胞質性チロシンホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２に結合する（Ｏｌｃｅｓｅら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５３１；Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：６７３；およびＭａｓｏｎら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４１８７）。そのリガンドＨ−２ＤdによるＬｙ４９Ａへの結合は、標的細胞とＮＫ細胞との相互作用によって誘導される初期の活性化事象を妨害する（Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：６７３）。Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９ＨはＩＴＩＭを欠失しており、そしてそれらの膜貫通ドメイン内に正に荷電したアルギニン残基を有する。Ｌｙ４９Ｄは、阻害性シグナルの送達が不可能であり、そして実際に、ＮＫ細胞を活性化し得る（Ｍａｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：２１１９）。
ヒトＮＫ細胞は、分子の機能的な類似のセットである、キラー細胞阻害性レセプター（ＫＩＲ）を発現する。これは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する（Ｌａｎｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：３７１）。ＫＩＲは、Ｌｙ４９と同様に、それらの細胞質性ドメイン中のＩＴＩＭの存在または非存在に基づいて、２つのサブファミリーに分類され得る。ＫＩＲ２ＤＬまたはＫＩＲ３ＤＬはＩＴＩＭを有し、そしてそれらのＭＨＣクラスＩリガンドを発現する標的の溶解を阻害する。ＩＴＩＭを欠失しているＫＩＲイソ型（ＫＩＲ２ＤＳ）は、それらの膜貫通ドメイン中に正に荷電した残基を有し、そして活性化シグナルを送達する（Ｍｏｒｅｔｔａら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：８７５；Ｂｉａｓｓｏｎｉら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：６４５）。ＤＡＰ１２（これは、ＫＩＲ２ＤＳ２と非共有的に会合する（Ｌａｎｉｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：７０３−７０７））は、その細胞質のテール中にＩＴＡＭを有し、そしてその膜貫通ドメイン中に負に荷電したアスパラギン酸残基を有する。ＫＩＲ２ＤＳ２／ＤＡＰ１２複合体の連結によって、細胞の活性化を生じる。マウスＤＡＰ１２とＬｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈとの会合、ならびに下流のシグナル伝達経路を活性化するこれらの複合体の能力を、試験した。
Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈの転写物が、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞中に存在する（２０）。Ｌｙ４９Ｄは、ＮＫ細胞の約５０％で発現され（Ｍａｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：２１１９）、そして１６ｋＤのチロシンホスホプロテインと会合する（Ｍａｓｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４１４８−４１５２）。マウスＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞と同様に、活性化ＫＩＲ２ＤＳと会合しそして細胞の活性化を媒介する分子であるＤＡＰ１２（Ｌａｎｉｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：７０３）のｍＲＮＡを転写する。Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９ＨがＤＡＰ１２と会合するかどうかを試験するために、Ｂａ／Ｆ３細胞を、エピトープタグ化マウスＤＡＰ１２（ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ）で安定にトランスフェクトした。Ｂａ／Ｆ３−ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ細胞は、細胞表面ではＤＡＰ１２を発現しない。次いで、Ｂａ／Ｆ３またはＢａ／Ｆ３−ＤＡＰ１２トランスフェクタントを、Ｌｙ４９Ｄ、ｍｙｃエピトープタグ化Ｌｙ４９Ｈ（Ｌｙ４９Ｈ−ｍｙｃ）、またはコントロールとしてのＬｙ４９Ａのいずれかをコードするレトロウイルスで感染させた。Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈ−ｍｙｃの両方ともが、Ｂａ／Ｆ３細胞中にトランスフェクトされた場合に、細胞表面上で適切なレベルでは発現されなかった。対照的に、Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９Ｈ−ｍｙｃのいずれかでのＢａ／Ｆ３−ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ細胞のトランスフェクションは、Ｌｙ４９およびＤＡＰ１２−ＦＬＡＧの両方の高レベルの表面発現を生じた。このことは、Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９ＨがＤＡＰ１２と会合することを示唆する。
Ｌｙ４９およびＤＡＰ１２の膜貫通部分中の荷電した残基がそれらの会合のために重要であるかどうかを、試験した。Ｌｙ４９Ａは、その細胞外ドメインにおいてＬｙ４９Ｄと８６％のアミノ酸同一性を共有するが、その膜貫通セグメント中でアルギニンを欠失している。Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９Ｈとは対照的に、Ｌｙ４９ＡをＢａ／Ｆ３またはＢａ／Ｆ３−ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ細胞中に安定にトランスフェクトした場合、これは、単独でまたはＤＡＰ１２−ＦＬＡＧの存在下で、細胞表面で発現され、そしてＤＡＰ１２−ＦＬＡＧの表面発現を誘導することができなかった。Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９Ｈ−ｍｙｃと、ＤＡＰ１２との間の相互作用は、両方のＬｙ４９分子がＢａ／Ｆ３−ヒトＤＡＰ１２−ＦＬＡＧトランスフェクタントの表面上で発現されるので、種限定的ではない。しかし、Ｌｙ４９ＤまたはＬｙ４９Ｈのいずれも、膜貫通部分中の負に荷電したアスパラギン酸がロイシンに変異した、変異体ヒトＤＡＰ１２分子で安定にトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞の表面上では発現されなかった。従って、Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈの両方が、細胞表面に効率的に到達するためにはＤＡＰ１２と会合しなければならず、そしてそれらの相互作用はおそらく、ＤＡＰ１２およびＬｙ４９の膜貫通部分中の反対に荷電した残基によって媒介される。
Ｌｙ４９ＤおよびＬｙ４９Ｈが細胞表面でＤＡＰ１２と非共有的に会合することを確認するために、Ｌｙ４９Ｄ／ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧまたはＬｙ４９Ｈ−ｍｙｃ／ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧのＢａ／Ｆ３トランスフェクタントを、表面をヨウ素化し、ジギトニンで溶解させ、そして免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。抗Ｌｙ４９ＤでのＢａ／Ｆ３−Ｌｙ４９Ｄ／ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ溶解物の免疫沈降物は、Ｌｙ４９ＤおよびＤＡＰ１２−ＦＬＡＧとしてのそれらの実体と一致する大きさを有する、２つのヨウ素化された種を示した。同一のパターンを、抗ＦＬＡＧを用いて観察し、これによって、２つの種がＬｙ４９ＤおよびＤＡＰ１２−ＦＬＡＧであることを確認した。抗ｍｙｃまたは抗ＦＬＡＧを用いたＢａ／Ｆ３−Ｌｙ４９Ｈ−ｍｙｃ／ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧ溶解物の免疫沈降物は、同様のパターンを示した。これらの結果は、形質膜中のＬｙ４９ＤまたはＬｙ４９Ｈと、ＤＡＰ１２との物理的な相互作用を実証する。
（ＸＶＩＩ．Ｌｙ４９／ＤＡＰ１２複合体は細胞内活性化シグナルを伝達する）
ＤＡＰ１２はＩＴＡＭを有し、そしてＬｙ４９Ｄの結合は、ＮＫ細胞を活性化する（Ｍａｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：２１１９）ので、Ｌｙ４９／ＤＡＰ１２複合体が活性化シグナルを伝達するかどうかを問うた。抗Ｌｙ４９または抗ＦＬＡＧでのＬｙ４９Ｄ／ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧおよびＬｙ４９Ｈ−ｍｙｃ／ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧトランスフェクタントの架橋によって、両方の細胞株において、ＤＡＰ１２−ＦＬＡＧおよびＳｙｋを含む多くの細胞性タンパク質のチロシンリン酸化を生じた。これらのデータは、Ｌｙ４９Ｄ／ＤＡＰ１２およびＬｙ４９Ｈ／ＤＡＰ１２が、連結の際に細胞の活性化を開始し得る、細胞表面上で機能的な複合体を形成することの証拠を提供する。
これらの活性化レセプターの生理学的なリガンドは何であろうか。Ｌｙ４９Ｄは、Ｈ−２ＤdおよびＨ−２Ｄkに結合する阻害性レセプターであるＬｙ４９Ａ（Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１５５３；Ｋａｎｅ（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１０１１；Ｄａｎｉｅｌｓら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：６８７）とその細胞外ドメインにおいて８６％のアミノ酸同一性を共有する（Ｓｍｉｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１０６８）。Ｌｙ４９Ｈは、Ｈ−２Ｋbを含むいくつかのクラスＩ分子と相互作用する別の阻害性レセプターであるＬｙ４９Ｃ（Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１５５３）とその細胞外ドメインにおいて９０％のアミノ酸同一性を共有する（Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２８７）。従って、Ｌｙ４９のこれらの活性化形態は、ＭＨＣクラスＩ分子と相互作用し得る。インビボおよびインビトロの両方でのＮＫ細胞によるポジティブなアロ認識の証拠が、ラットにおいて存在する（Ｒｏｌｓｔａｄら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５５：９１に概説されている）。同様に、マウスＮＫ細胞は、ポジティブな様式で特定のクラスＩ分子を発現する同種異系の骨髄細胞を認識し、そしてインビボでのそれらの拒絶を媒介する（Ｏｈｌｅｎら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：６６６；Ｇｅｏｒｇｅら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１５５：２９）。マウスＬｙ４９ＤおよびＬｙ４９ＨがＤＡＰ１２と会合し、そして活性化レセプターを形成することが示されており、これによってＮＫ細胞によるポジティブなアロ認識の可能性のある説明が提供される。
クラスＩリガンドを認識する活性化ＮＫレセプターおよび阻害性ＮＫレセプターの両方の存在がどのように調和され得るであろうか。３つのモデルを想定する。第１のモデルにおいては、活性化レセプターの結合は、未成熟なＮＫ細胞の成熟を促進する発生の間に作用する。しかし、これまでのところ、発生の間に、阻害性レセプターの出現以前の活性化レセプターの出現の証拠は存在しない。第２のモデルは、ＮＫ細胞が、同じクラスＩリガンドについての活性化レセプターおよび阻害性レセプターを有することを提唱する。クラスＩの結合の際に、活性化レセプターは、阻害性レセプターのＩＴＩＭをリン酸化するタンパク質チロシンキナーゼを補充し、これによってＮＫ細胞の不活化を生じる。ほとんどのヒトＮＫ細胞クローンが少なくとも１つの活性化レセプターおよび１つの阻害性レセプターを有するが、これらは、同じリガンドを認識し得る対を、必ずしも有さない。最後に、第３のモデルは、ＮＫ細胞が、異なるクラスＩ対立遺伝子の阻害性および活性化レセプターを発現すると予測する。このモデルにおいては、両方のレセプターのリガンドが結合する場合に、阻害性レセプターの結合が優位を占める。阻害性レセプターのリガンドがダウンレギュレートされるかまたは欠失される場合、活性化レセプターは、そのリガンドが存在する場合に、「異常な」細胞の溶解を誘発し得る。このモデルは、複数の阻害性および活性化レセプターが同じ細胞によって発現され得るという利点を有し、ＮＫクローンにおける所見とより一致する予測である。さらに、標的細胞によるＭＨＣクラスＩ分子全ての欠失の場合において、他の活性化機構が、ＮＫ細胞による溶解を開始しなければならない。
（ＸＶＩＩＩ． 会合したタンパク質の単離）
ＤＡＰ１２は、会合するパートナーの非存在下で細胞中で発現された場合に、細胞内に局在化したままである。この観察を、新規のＤＡＰ１２会合タンパク質のクローニングの目的で、例えば、膜への細胞性局在のプロセスにおいて必要である遺伝子を発現クローニングするために、使用した。会合したタンパク質を有さない細胞をＤＡＰ１２でトランスフェクトし、そしてタンパク質は細胞内局在化したままであった。これらの細胞を、ＤＡＰ１２表面局在化のために必要なアクセサリータンパク質を発現クローニングするために使用し得た。ストラテジーを、「ＤＡＰトラップ」と命名した。
この目的を達成するために、マウスＤＡＰ１２のＦＬＡＧタグ化形態を、発現ベクター（例えば、ｐＲＥＰ１０）を使用して２９３Ｔ細胞中で発現させた。ハイグロマイシンの存在下で、安定なＤＡＰ１２発現細胞株ＤＴ３８１を選択した。細胞表面での自発的なＤＡＰ１２の発現のバックグラウンドを減少させるために、ＤＴ３８１細胞を、Ｍ２抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ（Ｋｏｄａｋ）を使用してフローサイトメトリーによってネガティブに選択した。新規のＤＡＰ１２会合タンパク質をクローン化するために、Ｊ７７４マクロファージ細胞株由来のｐＪＥＦ１４発現ライブラリーを、ＤＴ３８１細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、フローサイトメトリーによってＤＡＰ１２の細胞表面発現について選択した。これは、２色染色によって行った：ＤＡＰ１２を、Ｍ２抗ＦＬＡＧ ｍＡｂを使用して、続いて、ビオチン結合抗マウスＩｇＧ１ ｍＡｂ（＃０２２３２Ｄ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、続いてストレプトアビジン−ＰＥでの、３工程のインキュベーションを使用して可視化した。トランスフェクトしたＤＴ３８１細胞上のＦｃレセプターを、直接的なＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１６／３２ ｍＡｂ ２．４Ｇ２（＃０１２４４Ｄ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して可視化した。単一のＰＥポジティブである細胞のみを分離した。抗ＣＤ１６／３２ ｍＡｂを用いた染色は、Ｊ７７４細胞中に豊富に存在するＦｃレセプターのクローニングを回避するために必要であった。
分離した細胞に由来するプラスミドをレスキューし、そしてＤＮＡを、ＤＨ１０Ｂ細菌中に再度形質転換した。サブライブラリーを得、そして発現クローニングの次の回に供した。３回の選択後、３回目のサブライブラリーに由来する５００個の単一の細菌コロニーを、５×１２×８コロニーからなる三次元マトリックスを構築するために、９６ウェルプレート形式で増殖させた。このマトリックスの各Ｘ、Ｙ、およびＺ座標のプールから得たＤＮＡを、再度ＤＴ３８１細胞にトランスフェクトし、そしてそのトランスフェクタントをＤＡＰ１２表面発現についてスクリーニングした。
これによって、Ｃ型レクチンスーパーファミリーの１６５アミノ酸のＩＩ型膜貫通タンパク質を両方ともがコードする、２つの同一のクローンの同定した。この遺伝子／タンパク質を、Ｍｙｌｏｉｄ ＤＡＰ１２会合レクチン１（ＭＤＬ−１）と命名した。マウス由来のＭＤＬ−１のこの実施態様は、２残基の細胞内領域、２３残基の膜貫通領域、およびＣ型レクチンドメインを含有する１４０残基の細胞外領域を有する。膜貫通セグメントは荷電したアミノ酸を有し、細胞外領域は３つの推定のＮグリコシル化部位を有する。ＢＬＡＳＴ検索によって、このクローンが７５ヌクレオチドの付加的なストレッチを有し、それによって膜貫通領域のすぐ外側の細胞外の２５残基のさらなるストレッチを生じることを除いて、高度に相同な全長のマウスＥＳＴであるＡＡ１８６０１５（これは、上記の２つのクローンと同一である）を明らかにした。従って、短形態および長形態の２つの実施態様が存在する。配列の残りは同一である。
ＤＮＡＸ配列データベース内の検索によって、相同なヒトＥＳＴである＃９７−１１２８Ａ１２（これは、ＭＤＬ−１のヒトホモログをコードする）を明らかにした。マウスＭＤＬ−１は、多くの関連する表面タンパク質（これらは、遺伝子のファミリーにおいて存在し得る）とは対照的に、単一の遺伝子によってコードされるようである。マウスのＭＤＬ−１発現は、単球、マクロファージ、および樹状細胞に限定される。
ＭＤＬ−１遺伝子が、膜に対するＤＡＰ１２の局在化において重要であるようであり、そして興味深い構造的特徴を有するので、ＭＤＬ−１は、おそらく、膜複合体中のＤＡＰ１２と会合する。従って、複合体の破壊は、ＤＡＰ１２−レセプター複合体の機能の興味深いブロックを導き得る。このことは、会合を妨害する化合物についての低分子薬物スクリーニングに対する明らかなアプローチを示唆する。あるいは、膜貫通フラグメントは、機能的な会合をブロックし得る。細胞外領域に対する抗体（タンパク質単独であるか、または機能的な複合体中の成分の組み合わせのいずれか）が、診断または治療的な状況において有用である。
ＤＡＰ１０もまた、アクセサリータンパク質と会合するようである。詳細には、穏やかな変性条件下でのＤＡＰ１０の免疫沈降によって、約４０〜４１ｋＤのタンパク質のバンドの免疫共沈降を生じる。ノイラミニダーゼ処理またはＯ−グリカナーゼ処理は、約３８〜３９ｋＤへの分子量の減少を生じる。Ｎ−グリカナーゼ処理は、約２８〜３０ｋＤへの分子量の減少を生じる。これらは、グリコシル化を伴わないタンパク質が約２６〜３０ｋＤａであることを示唆する。標準的な方法または微量配列決定法を、免疫沈降によって単離したタンパク質に適用し得る。配列を用いて、重複ＰＣＲプライマーまたは他の技術を、遺伝子を単離するために適用し得る。あるいは、配列は、配列データベース中での適合による遺伝子の同定を可能にし得る。
さらに、ＤＡＰ１０もまた、ＤＡＰ−トラップストラテジーに供される。発現クローニング技術を適用し、ＤＡＰ１２を用いる場合と同様に、ｃＤＮＡライブラリーから遺伝子をクローン化し得る。分布の情報は、そのようなための適切な細胞株およびｃＤＮＡライブラリーの選択を可能にする。
本明細書中の全ての引用は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的にかつ個々に、参考として援用されることが示されるかのようにと、同じ程度で本明細書中で参考として援用される。
当業者に明らかであるように、本発明の多くの改変およびバリエーションが、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中で記載される具体的な実施態様は、例示の目的によってのみ提供され、そして本発明は、添付の請求の範囲に与えられる等価物の権利の完全な範囲とともに、添付の請求の範囲の文言によって制限される。
（配列表）
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Claims (30)

  1. 実質的に純粋なまたは組換えのポリペプチドであって、配列番号１２もしくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドと、以下：
    ａ）ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６、もしくは免疫グロブリンペプチドが挙げられる、検出タグもしくは精製タグ；
    ｂ）細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子；または
    ｃ）別の膜タンパク質の配列
    とを含む、融合タンパク質。
  3. 配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 抗体に由来する抗原結合部分を含む結合化合物であって、
    該抗体に由来する抗原結合部分は、請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合し、ここで該抗体は、以下：
    ｉ）以下に示されるアミノ酸配列：
    Figure 0004855513
    Figure 0004855513
     または
    Figure 0004855513
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     を含むポリペプチドに対して惹起されたか；
    ｉｉ）免疫選択されているか；
    ｉｉｉ）ポリクローナル抗体であるか；
    ｉｖ）変性されている該ポリペプチドに結合するか；
    ｖ）ビーズもしくはプラスチック膜が挙げられる固体基材に付着されているか；
    ｖｉ）滅菌組成物中にあるか；または
    ｖｉｉ）放射性標識もしくは蛍光標識を含めて、検出可能に標識されている、
    抗体である、
    結合化合物。
  5. 配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  6. 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  7. モノクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。
  8. ポリクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。
  9. ヒト化抗体である、請求項５に記載の抗体。
  10. キメラ抗体である、請求項５に記載の抗体。
  11. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸または組換え核酸。
  12. 配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の核酸。
  13. 請求項１１に記載の核酸であって、該核酸は、以下：
    ａ）発現ベクター中に存在するか；
    ｂ）複製起点をさらに含むか；
    ｃ）検出可能な標識を含むか；
    ｄ）合成ヌクレオチド配列を含むか；
    ｅ）６ｋｂ未満であるか；
    ｆ）天然完全長コード配列を含むか；
    ｇ）ＭＤＬ−１をコードする遺伝子のハイブリダイゼーションプローブであるか；または
    ｈ）ＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物、もしくは変異誘発プライマーである、
    核酸。
  14. 少なくとも５０℃、４００ｍＭ塩未満、および５０％ホルムアミドのストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１１もしくは配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする、核酸。
  15. 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の核酸。
  16. 配列番号１１のヌクレオチド１５７〜７１７を含む、請求項１１に記載の核酸。
  17. 配列番号１３のヌクレオチド１４０〜７０９を含む、請求項１１に記載の核酸。
  18. 請求項１１に記載の組換え核酸を含む、細胞または組織。
  19. ａ）原核生物細胞；
    ｂ）真核生物細胞；
    ｃ）細菌細胞；
    ｄ）酵母細胞；
    ｅ）昆虫細胞；
    ｆ）哺乳動物細胞；
    ｇ）マウス細胞；
    ｈ）霊長類細胞；または
    ｉ）ヒト細胞、
    である、請求項１８に記載の細胞。
  20. キットであって、請求項１１に記載の核酸と、以下：
    ａ）該核酸を含む区画；
    ｂ）配列番号１２に示されるポリペプチドおよび／もしくは配列番号１４に示されるポリペプチドをさらに含む区画；ならびに／または
    ｃ）該キットにおける試薬の使用もしくは処分のための説明書
    とを含む、キット。
  21. 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  22. 免疫グロブリンに融合された配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む前記ポリペプチドを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  23. 免疫グロブリンに融合された配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む前記ポリペプチドを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  24. 請求項４に記載の結合化合物とキャリアとを含む、組成物。
  25. 請求項５に記載の抗体とキャリアとを含む、組成物。
  26. 請求項６に記載の抗体とキャリアとを含む、組成物。
  27. 請求項７に記載の抗体とキャリアとを含む、組成物。
  28. 請求項８に記載の抗体とキャリアとを含む、組成物。
  29. 請求項９に記載の抗体とキャリアとを含む、組成物。
  30. 請求項１０に記載の抗体とキャリアとを含む、組成物。
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