JPH11501622A - 造血機能を調整するｉｔｉｍモチーフを含むペプチジル化合物とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、造血細胞機能を調節するための新規な生成物及び方法と、炎症を調節することのできる化合物を判別するための新規な生成物及び方法とに関する。本発明は、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭｐ１６０及びＩＴＩＭｐ７０を含む、分子の活性を変更可能な調節用試薬に細胞を接触させることで、造血細胞機能を調節する方法を含む。本発明はまた、試薬及び試薬に対して生じた抗体を符号化する配列を有する核酸分子を含むＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭｐ１６０及びＩＴＩＭｐ７０の活性を調節することのできる調節用試薬に関する。本発明はさらに、このような試薬を含む治療用組成物と、炎症から動物を保護するためのその利用とを含むものである。

Description

【発明の詳細な説明】 造血機能を調節するＩＴＩＭモチーフを含むペプチジル化合物とその利用 本発明は一部、ＡＩ−２１７６８、ＡＩ−２０５１９及びＤＫ−４７１２１と いう、全て国家保健機関により与えられた政府援助を受けてなされた。政府は本 発明に特定の権利を有する。 関連出願の引照 本出願は、１９９５年２月２８日付けで提出された米国出願第０８／３９７， ６２８号の一部継続出願であり、この一部継続出願の内容を全てここに参考文献 として編入する。 発明の分野 本発明は、信号形質導入経路を調節する生成物及びプロセスに関する。本発明 は特に、造血細胞の反応を調節するペプチド及び擬態を提供するものである。従 って、本発明は炎症及び免疫反応を調節する生成物及びプロセスを提供し、さら に、向上した薬品スクリーニング検定を提供するものである。 発明の背景 あらゆる多細胞生物において、細胞と細胞の伝達は、生物中に含まれる細胞種 のうちその多くの成長、分化及び代謝を調整している。長距離に渡る細胞間の伝 達は、信号分子として働く細胞外生成物（リガンド）が助けをしている。信号分 子は生物中を移動して特定の細胞に至り、そこでこの信号分子と結合する能力の あるレセプタを有する標的細胞においてのみ、特定の反応を誘発する。信号分子 がレセプタと結合すると、そのレセプタを持つ細胞内で複雑な細胞内反応が生じ 、その結果、細胞内に存在する分子の改質が起きたり、又は遺伝子発現のパター ンの変化が起きるなどして、細胞の生物学的機能が変化する。このプロセスは信 号形質導入と呼ばれる。 細胞は環境に適応するのに信号形質導入経路を利用している。信号形質導入経 路は、細胞外で受け取られた信号を、細胞膜、さらにその細胞の細胞質を通過さ せて核へと伝達する。このように伝達された信号は多くの場合細胞内の遺伝子発 現の変化を引き起こし、非転写的事象を介してではあるが、例えば膜構造や透過 率等もまた、問題の組成物が働く細胞内におけるシグナリング作用により調節さ れることがある。細胞内の信号形質導入には複数の細胞要素が関わっている。こ のような要素にはイニシエータ分子、変換器分子、増幅器分子、標的分子及び第 二伝令分子がある。ここで言う「分子」にはたんぱく質、リピド及びイオン（例 えばＣａ²⁺など）が含まれる。 イニシエータ分子は細胞内の信号形質導入を開始させることができる。イニシ エータ分子の一例は、細胞表面上の膜結合レセプタを含んだ変換器分子に結合す ることのできる細胞外リガンドである。細胞外リガンドには、例えばホルモン、 成長因子、抗原、分化作用因子、抗体分子、組織適合性分子、ミトゲン、及びそ の他の可溶性又は細胞結合分子が含まれよう。イニシエータ分子に結合した後、 レセプタ／変換器分子は、細胞の細胞膜を通じて細胞内増幅器分子へと信号を伝 達する。変換器分子には、信号形質導入に関わる細胞内たんぱく質と相互反応可 能な細胞質域を有するものであればいかなる細胞表面レセプタを含めることもで きよう。変換器分子は触媒部分を含んでいることもあり、また例えばキナーゼ又 はホスファターゼ等、触媒的に活性の分子をレセプタ部位に補充するものでもよ い。変換器分子の例として、Ｆｃレセプタ、Ｔ細胞抗原レセプタ、Ｂ細胞抗原レ セプタ、主組織適合性分子（ＭＨＣ）レセプタ、チロシンキナーゼレセプタ、ア ルファ及びベータアドレナリン作動薬、又はその他のＧたんぱく質−結合レセプ タ、並びにサイトカインレセプタ、成長因子レセプタ、ＣＤ２２、ＣＤ１９及び その他多数が含まれる。 レセプタはサブユニットと呼ばれる複数のたんぱく質から構成されていてもよ く、このようなたんぱく質の一種はマルチサブユニットレセプタと呼ばれ、マル チサブユニット免疫認識レセプタ（ＭＩＲＲ）である。ＭＩＲＲには複数の非共 有結合形のサブユニットを有するレセプタが含まれ、またｓｒｃ族のチロシンキ ナーゼと相互作用することができる。ＭＩＲＲには、Ｂ細胞抗原レセプタ（ＢＣ Ｒ）、Ｔ細胞抗原レセプタ（ＴＣＲ）、及びＦｃレセプタを含めることができる が、これらに限定されるものではない。ＦｃレセプタのＭＩＲＲの例としてはＦ ｃεＲ及びＦｃＲγがある。その他の種類のレセプタの例としては、Ｉｇ上族の 仲間及びレクチンレセプタがある。細胞表面レセプタはアダプタ分子により増幅 器分子に機能的に結び付いていてもよい。最終的には、増幅器分子の活性化によ り下流の効果器分子の転形が起きる。信号形質導入の結果、しばしば、遺伝子の 転写に変化が生じ、細胞の活性化状態に変化が起きる。 いかなるレセプタにおいても、信号形質導入経路の活性化を調節するメカニズ ム、並びにこれらのシグナル経路を消滅させるメカニズムがある。環境的信号に 適切に反応するには、肯定的調節及び否定的調節の両方が秩序だって進む必要が ある（トーマス著（１９９５）医学実験ジャーナル１８１：１９５３）。リンパ 球抗原レセプタ及びマスト細胞及び好塩基性ＩｇＥレセプタの場合には、抗原認 識の結果、細胞内たんぱく質チロシンキナーゼ、特にＳｒｃ族キナーゼの仲間や 、ＺＡＰ−７０／ｓｙｋキナーゼが活性化することとなる。これらのレセプタを 介した信号形質導入により、ＴＣＲ ＣＤ３／ζ鎖複合体、ＢＣＲのα及びβ鎖 、及びＦｃεＲＩのβ及びγ鎖の細胞質部分内で、臨界チロシンがリン酸化反応 を起こす。臨界の標的チロシンは、免疫レセプタチロシンベースの活性化モチー フ（ＩＴＡＭ）と呼ばれる配列モチーフ内に位置している。ＩＴＡＭ配列は免疫 細胞の活性化にとって重要である。 免疫細胞の否定的調節もまた免疫においては重要な役割を果たし、反応を正常 に消散させる。しかしながら、シグナル作用を終わらせるメカニズムはよく分か っていない。抗原及びＩｇＧ抗体から成る免疫複合体は、アレルギ反応につなが る恐れのある体液性免疫反応の有効な抑制物質であることが知られている（チャ ン他著、免疫学２１：９６７−９８１、１９７１及びコーラ他著、免疫学ジャー ナル１１９：１９７９−１９８６、１９７７）。免疫複合体の媒介する抗体生成 の抑制作用は、Ｂ細胞上におけるＩｇＧＦｃレセプタ（ＦｃγＲＩＩＢＩ）とＢ リンパ球抗原レセプタ（ＢＣＲ）との相互作用に左右されることが分かっている （フィリップス他著、免疫学ジャーナル１３０：６０２−６０６、１９８３）。 ＦｃγＲＩＩＢＩを符号化する遺伝子の変異分析の結果、細胞質部分内の１３ア ミ ノ酸モチーフが、否定的シグナリングには必要であることが判明している（ムタ 他著、（１９９４）ネイチャー誌、３６８：７０；アミゴレナ他著、（１９９２ ）、サイエンス誌２５６：１８０８−１８１２；及びフリッドマン他著、免疫学 レビュー誌１２５：４９−７６、１９９２）。 造血細胞は様々な機能を有するがその中には炎症及び免疫反応機能が含まれる 。数多くの疾患が造血細胞系統から得られる細胞に関係するものであり、このよ うな疾患には高度免疫性疾患、免疫欠乏性疾患、自己免疫性疾患、ガン及びアレ ルギ反応が含まれる。現在では、異常な炎症又は免疫反応に対する治療が好まし くない副作用を引き起こすことがある。 このように、動物の造血細胞機能を、このような機能の症状ではなく、その原 因に対処することで調節できる試薬の判別及び開発に対する要望が依然として残 っている。特に、特定の細胞分子に対する効果的な調節を行うことを可能とする 生成物及びプロセスに対する必要性があり、このような生成物及びプロセスがあ れば造血細胞機能を予測的にコントロールすること、ひいては、造血細胞の機能 不全により起こる様々な疾患の治療が可能となるであろう。 要約 本願発明は、造血細胞の様々な機能を制御するための構成及び方法に関する。 異なる造血細胞内の信号形質導入経路内の特定の分子同士の望ましくない相互作 用が認識されたことにより、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球、肥満 細胞などの細胞の制御を可能にする生成物及び方法が明らかになった。更に、本 願発明により、アレルギー反応、自己免疫性疾患、炎症反応、免疫不全性疾患、 免疫増殖性疾患を含む様々な病気の抑制及び治療が可能となった。 本願発明の一つの特徴は、一般式(Ｉ/Ｖ)Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃(Ｌ/Ｖ)で表されるＩＴ ＩＭモチーフを有する化合物に関する。ここでＩはイソロイシン又はそのミメト ープを表し、Ｖはバリン又はそのミメトープを表し、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃はそれぞれアミ ノ酸又はそのミメトープを表し、Ｙはチロシン、ホスフォチロシン又はそのミメ トープを表し、Ｌはロイシン又はそのミメトープを表す。好適な実施例において は、Ｘ₁はＧly、 Ａla、Ｖal、Ｉle、Ｌeu、Ｓer、Ｔhr、Ｃys、Ｇlu、Ａsp、Ｌys、Ａrg又はＨisを表す；Ｘ₂ はＧly、Ａla、Ｖal、Ｉle、Ｌeu、Ｓer、Ｃys又はＴhrを表す；Ｘ₃はＧly、Ａla、Ｖal、 Ｉle、Ｌeu、Ｓer、Ｃys、Ｔhr、Ｍet、Ａsn、Ｇln、Ｇlu又はＡspを表す。より好適な 実施例においては、Ｘ₁はＶal、Ｉle、Ｌeu、Ｓer、Ｔhr、Ａsp又はＨisを表す；Ｘ₂ はＡla、Ｖal、Ｓer又はＴhrを表す；Ｘ₃はＬeu、Ｉle、Ｔhr、Ｍet、Ｇln、Ｇlu又はＡ spを表す。本願発明の化合物を構成する典型的なＩＴＩＭモチーフは、ＶＴＹＡ ＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＴＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬＹＴＥＬ、Ｖ ＴＹＳＭＶ、ＶＴＹＴＴＬ、ＶＴＹＳＴＶ、ＶＩＹＳＤＬ及びＩＴＹＡＥＬを含み 、これらのモチーフは、好適なペプチドであるＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨ、Ｔ ＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＫＨ 、 ＥＱＤＰＱＥＶＴＹＡＱＬＮ 、 ＴＰＰＴＤ ＩＩＶＹＴＥＬＰＥＱＤＰＱＥＶＴＹＴＱＬＮ 、 ＴＰＰＴＤＩＩＶＹＴＥＬ Ｐ 、 ＥＱＤＰＥＥＶＴＹＡＱＬＤＴＰＰＴＤＴＩＬＹＴＥＬＰ 、 ＭＳＥ ＱＥＶＴＹＳＭＶＲＦ 、 ＭＳＥＱＥＶＴＹＴＴＬＲＦＭＳＥＱＥＶＴＹＳＴ ＶＲＦ及びＭＤＮＱＧＶＩＹＳＤＬＮＬの中に見出すことができる。 多くの実施例においては、非加水分解ホスフォチロシン類似体として、チロシ ン（Ｙ）を活性部位に配置するのが望ましいであろう。例えば、好適な実施例に おいては、Ｙは次の一般式で表される： ここで、Ｚは次の一般式からなるグループの中から選択される。 ここで、ｍはゼロまたは１から６までの整数である；Ｘは、ないか、又はＯ、 Ｓ或はＮを表す；Ｄ₁はＯ又はＳを表す；Ｄ₂はＮ₃、ＳＨ₂、ＮＨ₂又はＮＯ₂を表す ； Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ独立して水素、低級アルキル又は薬学上容認可能な塩を 表すか、又はＲ₁とＲ₂とが共にＯ-Ｐ-Ｏ、Ｏ-Ｖ-Ｏ又はＯ-Ａs-Ｏ原子と結合して 、５から８個の原子を環構造中に有す る複素環を形成する。 幾つかの実施例においては、ＩＴＩＭモチーフの少なくとも一部分は、自然に 発生したアミノ酸残分から得られる。しかし、本願発明は、全ての又は一部のＩ ＴＩＭモチーフがペプチド擬態であることをも意図している。例えば、ペプチド 擬態部分が逆行インバーソペプチド擬態、レトロエナシオペプチド擬態、トラン スオレフィンペプチド擬態及びホスフォネートペプチド擬態からなるグループの 中から選択されるので、ＩＴＩＭモチーフの全ての又は一部のペプチド主鎖を誘 導可能である。 好適な実施例においては、ＩＴＩＭモチーフは、それを含む化合物のペプチジ ル部分に存在する。このペプチジル部分は、分子重量が７５０〜７５００原子質 量単位であるが、より好適には、約７５０〜５０００原子質量単位であり、更に 好適には約７５０〜２５００原子質量単位である。このようなペプチドの分子重 量は一般的には６〜６０個のアミノ酸の長さに対応しているが、６、７、８、９ 、１０、１１、１２、１３、１５及び２０個のアミノ酸残分のペプチドが最も好 適である。 更に他の実施例においては、ＩＴＩＭモチーフは、一つ以上のペプチド結合（ 例えばポリペプチド単鎖の一部）により、少なくとも５０個のアミノ酸残分と共 有結合し、更に、元来ＩＴＩＭモチーフを含むポリペプチドと同一のＩＴＩＭモ チーフと、更に好適には少なくとも４０、３０又は２５個のアミノ酸残分と共有 結合している。 更に他の実施例においては、ＩＴＩＭモチーフは、元来ＩＴＩＭモチーフを含 むたんぱく質とは連結していない第２のアミノ酸配列を含む融解たんぱく質の一 部である。 好適な実施例においては、ＩＴＩＭモチーフを含む化合物は、たんぱく質チロ シンホスファターゼ、ＩＴＩＭ-p160又はＩＴＩＭ-p70等の信号形質導入たんぱ く質のＳＨ２領域と結合する。例えば、ＩＴＩＭモチーフはＰＴＰ１Ｃ及び／又 はＰＴＰ１Ｄと結合可能である。このような方法で、この化合物は、細胞成分の 信号形質導入活動を調整、即ち抑制したり増強／活性化することができる。好適 な実施例においては、ＩＴＩＭ化合物は、例えばＭＩＲＲの信号形質導入経路を 変更するなどの方法 によりＩＴＩＭ結合たんぱく質の酵素活動を変化させることで、造血細胞機能を 制御する。本願発明の好適なＩＴＩＭ化合物は、ＰＴＰ１Ｃと結合して、そのホ スファターゼ活動を活性化する。ＩＴＩＭ結合たんぱく質は、ホスフォチロシン に依存した方法で、即ち、ＳＨ２領域によりホスフォチロシンを認識することな どにより、コアＩＴＩＭペプチドと結合するたんぱく質である。 他の好適な実施例においては、ＩＴＩＭ化合物は、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ等 のＰＴＰaseとＣＤ22、ＮＫＩＲp58、Ｌy49又はＦcyレセプタとの結合を、リン酸 化されたＩＴＩＭ配列により拮抗的に阻害する。 好適な実施例においては、本願発明のＩＴＩＭ化合物は、例えばＢＣＲのＺap 70、p72syk、lyn、Ｖav、ＴＣＲz、ＦceＲ、Ｉga又はＩgbサブユニット等の信号形質導 入たんぱく質のリン酸化を変化させる、及び／又は、内部蓄積又は外部ミリュー から細胞内自由カルシウムを増加（移動）させるなど、造血細胞内での第２伝令 分子の生成を調整することが可能である。例えば、ＩＴＩＭ化合物を適量用いる ことにより、Ｂ細胞レセプタの交差結合により生じる細胞内カルシウムの可動化 を抑えることが可能である。 本願発明は、更に、生理的に容認可能な担体中で、上記ＩＴＩＭ化合物を含む 薬剤を調製し、その量が治療される動物の細胞中の細胞内信号経路を調整するの に治療的に有効な量であることを特徴とする。 本願発明の更に他の特徴は、ＰＴＰ１ＣのＳＨ２領域と結合してＰＴＰ１Ｃの ホスファターゼ活動を活性化することにより、ＣＤ22、ＮＫＩＲp58、Ｌy49及びＦ cyレセプタのうち一つ以上との結合を拮抗的に阻害するようなＩＴＩＭ擬態を提 供することにある。 本願発明の他の実施例は、ＣＤ22、ＮＫＩＲp58、Ｌy49及びＦcyレセプタ（Ｆcy ＲI、ＦcyＲII、ＦcyＲIII等）からなるグループの中から選択された負の調節因子 レセプタの可溶性ペプチド細片を提供する。このペプチドはＩＴＩＭモチーフを 含む。好適な実施例においては：ペプチドの分子重量は７５０〜７５００原子質 量単位である；ペプチドはＰＴＰ１ＣのＳＨ２領域と結合し、ＰＴＰ１Ｃのチロ シンホスファターゼ活動をアロステリックに制御する。 本願発明は、更に、一般式： (Ｉ/Ｖ)Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃(Ｌ/Ｖ) で表されるＩＴＩＭモチーフを有する化合物と細胞とを接触させることにより、 細胞内信号伝達経路内のＩＴＩＭ結合たんぱく質の活動を変化させることを含む 、細胞中の細胞内信号伝達経路の調整方法であって、 Ｉはイソロイシン又はそのミメトープを表し、Ｖはバリン又はそのミメトープ を表し、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃はそれぞれアミノ酸及びそのミメトープを表し、Ｙはチロシ ン、ホスフォチロシン又はそのミメトープを表し、Ｌはロイシン又はそのミメト ープを表し、細胞は、例えばＢ細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｔ細胞及び／又はナ チュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、細胞の処理は生体外でも生体内でも可能で あるような方法を提供することを特徴とする。 好適な実施例においては、上記方法は、免疫反応、炎症反応、血液凝固開始、 ヒスタミンの開放、ウィルスに感染した細胞の破壊及び／又は伝染性物質の破壊 を調整するために用いられる。例えば、抗体、サイトカイン、ケモカイン、補体 、プロスタグランジン、ロイコトリエン及び炎症媒体などの分子の生成及び／又 は放出を制御するために、本願発明の方法を用いることができる。 本願発明の方法は、免疫増殖性疾患、免疫不全性疾患、癌、自己免疫性疾患、 炎症性疾患およびアレルギー反応などの病気を治療又は防止するために用いるこ とができる。この方法は、自己抗体生成又はＩgＥによる好塩基球の脱顆粒を伴 う病気から動物を保護する。 好適な実施例においては、例えばＩＴＩＭに依存した活性化等、特定のＰＴＰ １Ｃホスファターゼ活動を刺激することによりＭＩＲＲの活動を抑制することで 、造血細胞機能を制御する方法が開示されている。 更に他の実施例において、本願発明は、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ-p16 0及びＩＴＩＭ-p70からなるグループの中から選択される制御分子の活動を変化 させることの可能な制御試薬を造血細胞に適量接触させることにより、造血細胞 機能を制御する方法を提供する。このような制御分子は、前述のＩＴＩＭ擬態に 加えて、pＹＸＸＬ及びpＹＸＸＶ等の一般的なホスフォチロシンペプチドと、抑 制ＩＴＩＭ含有レセプタたんぱく質と刺激レセプタたんぱく質とを交差結合させ ることが可能なバイスペシフィック抗体とを含む。好適な実施例においては、こ の方法は、免 疫増殖性疾患、免疫不全性疾患、癌、自己免疫性疾患、炎症性疾患及びアレルギ ー反応からなるグループの中から選択される造血細胞機能を変化させる。例えば 、抗体、サイトカイン、ケモカイン、補体、プロスタグランジン、ロイコトリエ ン及び炎症媒体などの分子の生成及び／又は放出を制御するために、本願発明の 方法を用いることができる。細胞は、例えばＢ細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｔ細 胞及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。細胞は、生体外でも生体内 でも処理可能である。自己抗体の生成又はＩgＥによる好塩基球の脱顆粒を伴う 疾患から動物を保護するために、この方法を用いることができる。 好適な実施例には、ＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄの特定ホスファターゼ活動を刺 激する等、ＭＩＲＲ活動を抑制することにより、造血細胞機能を制御する本願発 明の方法が開示されている。 本願発明の更に他の特徴は、動物に対し適量処方したときに、その動物の細胞 内での信号形質導入を制御することが可能な治療用化合物に関する。本願発明の 治療用化合物は、細胞内での異常な信号形質導入を一因とするすべての疾患の治 療に有効である。そのような疾患は、癌、自己免疫性疾患、免疫下全性疾患、免 疫増殖性疾患、アレルギー反応及び炎症性反応を含む。また、本願発明の治療用 化合物は、例えば組織や皮膚の移植などの医学的治療の際の免疫反応の抑制にも 有効である。自己免疫性疾患には、体狼瘡、重症黄疸、リウマチ様関節炎、イン シュリンによる真性糖尿病及び実験アレルギー性脳脊髄炎等が含まれる。免疫不 全性疾患には、ヒトのエイズ、重症多発性免疫不全症候群及び低ガンマグロブリ ン血症等が含まれる。免疫増殖性疾患には、リンパ腫及び白血病等が含まれる。 更に、本願発明の治療用化合物は、腫瘍の発生を含むすべての癌の治療に有用で ある。 本願発明はまた、ＳＨ２含有たんぱく質の信号形質導入活動を変化させること が可能な、更に他のＩＴＩＭ擬態等の薬剤を明らかにする方法を提供する。この 方法は、(a)(i)ＩＴＩＭモチーフを有するペプチド等の化合物と、(ii)ＳＨ２領 域によりＩＴＩＭモチーフのみと結合する、少なくとも一つのＳＨ２領域を含む 標的たんぱく質と、(iii)試薬と、を含む反応混合物を生成することと、(b)ＩＴ ＩＭモチーフと標的たんぱく質との相互作用を検出することとを含む。ここで、 標的たんぱく質 相互作用のレベルが、試薬を用いた場合と用いない場合とで統計学上大幅に異な ることから、試薬が、ＳＨ２含有標的たんぱく質のＩＴＩＭ信号形質導入活動を 変化させる作用を有することが示唆される。好適な実施例においては、標的たん ぱく質は、ＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄ等のＰＴＰaseであるか、又はＩＴＩＭ結 合たんぱく質である。 化合物と標的たんぱく質との相互作用を検出するには、標的たんぱく質の酵素 活動のレベルを検出する、あるいは化合物と標的たんぱく質との直接の相互作用 を検出する等、様々な方法が挙げられる。複数の実施例においては、反応混合物 は細胞全体であり、一つの又は細胞内のたんぱく質のリン酸化レベルを測定する ことにより、標的たんぱく質と化合物との相互作用を検出する。他の実施例では 、反応混合物は、細胞全体か又は細胞溶解産物であり、細胞内カルシウムのレベ ルを測定することにより、標的たんぱく質と化合物との相互作用を検出する。好 適な実施例においては、反応混合物は細胞内の化合物の組換え式により得られる 。 標的たんぱく質とＩＴＩＭ化合物との相互作用の検出には、当該技術分野にお ける数多くの好適な方法のうち何れを用いてもよい。例えば、好適な実施例にお いては、検出方法には、(i)細胞たんぱく質のリン酸化レベルの測定、(ii)細胞 内Ｃa²⁺レベルの測定、(iii)ジアキルグリセリドレベルの測定、(iv)リン酸イノ シトールレベルの測定、(v)myc、fos、jun等の即時初期(cＩＥ)遺伝子生成物の発 現レベルの測定、のうち一つ以上が含まれる。 次に述べる他の新規な治療標的を変化させる物質の検出にも、同様の方法を 用いることができる。例えば、本願発明には、(a)(i)ＰＴＰ１Ｃホスファターゼ と、(ii)リン酸化ＣＤ19たんぱく質又はそれから得られるＰＴＰ１Ｃ基質と、(i ii)試薬と、を含む反応混合物を生成することと、(b)ＰＴＰ１ＣとＣＤ19との相 互作用を検出することとを含む、ＣＤ19-伝達信号形質導入を変化させることの できる物質を検出する方法が開示されている。ＰＴＰ１ＣとＣＤ19との相互作用 のレベルが、試薬を用いた場合と用いない場合とで統計学上大幅に異なることに より、試薬が、ＣＤ19たんぱく質の信号形質導入活動を変化させる作用を有する ことが示唆される。 本願発明は、更に薬品スクリーニング検定をおこなうための器具を提供する 。造血細胞機能を制御可能な化合物を明らかにするための器具の例として、 ＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄホスファターゼ、ＰＴＰと結合しこれを活性化するこ との可能なＩＴＩＭ擬態、ＰＴＰ基質、及び推定制御化合物が挙げられる。 本願発明の更に他の特徴は、(a)患者から好塩基球を分離することと、(b)該 好塩基球をＦaＢ'lgＧ抗体及び総ＩgＧ抗体からなるグループから選択されたリ ガンドと接触させることと、(c)リガンドとの接触後の好塩基球内でのＰＹＰ１ Ｃ活動を検出することにより、造血細胞機能異常を診断することと、を含む造血 細胞機能異常の治療法を明らかにする方法を提供することにある。 本願発明の他の特徴と実施態様とは、次の図面と詳細な実施例についての説 明により、当業者に明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、抑制レセプタ間の配列を示す。本明細書で用いられた配列のＧenＢan k登録番号は：ヒトp58.183:Ｕ24074、ヒトp58.ＥＢ6:Ｕ24075、ヒトp70:Ｌ41269 、マウスＬy49Ａ:Ｍ25812、マウスＬy49Ｃ:Ｕ10304、マウスＬy49Ｇ4:Ｕ10093、 ヒトＣＤ22b:Ｘ59350、マウスＣＤ22b:Ｌ16928、ヒトＦcgＲＩＩＢ1:Ｍ31935、 マウスＦcgＲＩＩＢ1:Ｍ17515,ＮＫＧ2Ａ:Ｘ54867である。ストレッチに対応す るアミノ酸番号が示されている。 図２は、PI 3-キナーゼ抑制剤ＷortmanninによるＢＣＲ伝達Ｃa²⁺可動化の抑 制を示している。Ａ20細胞中のＣa²⁺可動化は、完全な（点線）ウサギの抗マウ スＩg抗体か、又は10nＭのＷortmanninがある場合（細線）又はない場合（太線 ）のＦ(ab‘)₂細片によって刺激される。Ａ20細胞は、Ｉndo-1 ＡＭ（分子プロ ーブ）を付加され、次に、Ｆ(ab‘)₂（12μg/ml）又は完全な（20μg/ml）ウサ ギの抗mIgのいずれかにより刺激され、[Ｃa²⁺]iがフローサイトメータ（形式50 Ｈ、Ｏrtho Ｄiagnostic Ｓystems）にて１５分間監視される。平均[Ｃa²⁺]i（ パネルＡ）及び反応した細胞のパーセント（パネルＢ）が、付属のデータ取得シ ステム及びＭultiＴＩＭＥソフトウェア(Ｐhoenix Ｆlow Ｓystems)により評価 される。 図３は、拡大ＢＣＲ伝達Ｃa²⁺の可動化にはＣＤ19が必要であることを示して いる。Ｊ558ＬＭm3ＣＤ45+がトランスフェクトされていない場合のＣＤ19の細胞 表 面発現がパネルＡに、Ｊ558ＬＭm3ＣＤ45+がヒトＣＤ19によりトランスフェクト されている場合のＣＤ19の細胞表面発現がパネルＢに図示されている。トランス フェクトされていない細胞列における抗原(ＮＰ₉-ＢＳＡ,3Ｍg/ml)に応じたＣa^{2 +} 可動化がパネルＣに、hＣＤ19にトランスフェクトされている細胞列における抗 原(ＮＰ₉-ＢＳＡ,3Ｍg/ml)に応じたＣa²⁺可動化がパネルＤに図示されている。h ＣＤ19の細胞表面発現は、細胞をフローサイトメトリー(ＦＡＣＳcan、Ｂecton Ｄickinson）分析で染色することにより検出された。Ｃa²⁺可動化は、図２の方 法で分析された。 発明の詳細な説明 レセプターリガンド間の相互作用でつながる信号形質導入経路は、細胞反応を コントロールする重要なメカニズムである。細胞表面レセプタで形質導入される 信号は、引き起こされる事象の細胞内カスケードに応じて、刺激因子又は抑制因 子のどちらとなるであろう。信号形質導入経路を調節できるポイントが数多くあ る。例として、リガンドのレセプタとの相互作用の調節、レセプタ／トランスデ ューサ分子とアダプタ分子との相互作用の調節、アダプタ分子と増幅器分子との 相互作用の調節、増幅器とその他の考えられる標的との相互作用の調節、又は第 二伝令器の発生の調節などが含まれる。 いかなる任意のレセプタであっても、信号形質導入経路の活性化を調節するメ カニズムが、このようなシグナリング経路を消滅させるメカニズムと共にある。 環境信号へ反応するには肯定的及び否定的調節が秩序だった方法で進まねばなら ない。従って、シグナリングを終わらせるメカニズムもまた刺激信号と同等に重 要である。活性化カスケードを適切に消滅させることができない場合、不適切な 反応が生じて様々な疾患状態を引き起こすことがある。本発明は、刺激又は抑制 信号の形質導入のバランスを変えることで、造血細胞の活性化を例えば強化する 又は抑制するなどして調整するのに用いることのできる物質を提供するものであ る。この治療的用途に加えて、本発明はさらに、その他の細胞調節用化合物の判 別に用いることのできる薬品スクリーニング検定法の開発に関するものである。 具体的には、本発明の様々な態様は、ＭＩＲＲ等々からの信号形質導入を下方 に調節している特定のメカニズムの解明から得ている。例えば、ここで開示する ように、例えばＦｃγＲＩＩＢＩ等のＢ細胞上のＦｃレセプタの、Ｂ細胞抗原レ セプタ（ＢＣＲ）とのコリゲーションは、ＦｃγＲによるたんぱく質チロシンホ スファターゼＰＴＰ１Ｃの補充を含んだメカニズムを介して、不全型ＢＣＲシグ ナリングを引き起こす。このＰＴＰ１Ｃのレセプタオリゴマーへの補充及び活性 化は、以下に示すように、ＰＴＰ１Ｃのカルボキシル−ターミリナルＳｒｃ同族 ２（ＳＨ２）部分と、ＦｃγＲの細胞質末尾に存在する、免疫レセプタチロシン ベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）と呼ばれるホスホチロシンモチーフとの結合が 媒介している。このように、ＰＴＰ１ＣはＢＣＲ−ＦｃγＲＩＩＢＩ否定的信号 協働作用の効果器であり、生体外及び生体内の両方における体液性免疫反応の上 方又は下方調節のための治療標的として、可能性を呈するものである。 さらに、ここで開示するように、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞毒性プ ログラムの抑制が、ＮＫ ＭＨＣクラスＩたんぱく質レセプタ（ＮＫＩＲ）内に 存在するＩＴＩＭ配列によってＰＴＰ１Ｃ及び／又はＰＴＰ１Ｄが補充されるこ とで行われる。ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の刺激により引き起こされた効果器機能は また、ＰＴＰ１Ｃ／１Ｄに依存するメカニズムによって抑制されることが示され ている。従って、ＩＴＩＭ配列による特定のホスファターゼの補充及び／又は活 性化は、明らかにいくつかのことなる経路がレセプタ機能を下方調節する手段と して共有するメカニズムである。 ＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄの活性化に重要な、ＩＴＩＭのコアペプチド配列が さらに開示されている。ＰＴＰ１Ｃの活性化にとって最適な配列は、ＳＨ２部分 の特異性に関連する、当分野での一般的教示とは対照的に、ホスホチロシンのＣ −ターミナル及びＮターミナルの両方にアミノ酸残分を必要とする。 本発明のさらに別の態様は、ＩＴＩＭ／ＰＴＰ相互作用を越えた新規の相互作 用の発見から得ている。例えば、付属の例は、ＢＣＲコレセプタＣＤ１９がＰＴ Ｐ１Ｃの明白な基質であることを説明している。ＦｃγＲで活性化されたＰＴＰ １ＣによるＣＤ１９の脱リン酸化により、ＣＤ１９のＰＩ−３Ｋとの結合が弱ま り、さらにＢＣＲの媒介するＣａ²⁺可動化ができなくなる。従って、ＰＴＰ１Ｃ によるＣＤ１９の脱リン酸化反応もまた、Ｂ細胞活性化及び／又は抑制を調節 する試薬開発のための治療上の標的として可能性を持つものである。 この他で治療上の標的として可能性を有するものは、以下に述べるＩＴＩＭｐ １６０及びＩＴＩＭｐ７０の相互作用である。ＰＴＰ１Ｃと同様、これらのたん ぱく質はそれぞれ、リン酸化したＩＴＩＭペプチドへの結合を呈し、ＩＴＩＭ結 合モチーフが存在することを示している。 本発明は、ＩＴＩＭ擬態から、ＣＤ１９又はその他の信号形質導入たんぱく質 の脱リン酸化をＩＴＩＭで活性化されたホスファターゼを抑制することで調節す る試薬まで、数々の異なる調節用試薬を考察したものであることが明らかになる であろう。本発明によれば、調節用試薬は細胞機能を調節することができるが、 その方法には、例えば信号形質導入分子と増幅器と、または標的分子との相互作 用を変える、信号形質導入分子とその標的分子との結合を変える、信号形質導入 分子の酵素的活性を変える、あるいは信号形質導入又はその他の標的分子のリン 酸化を調整する、などがある。ここで用いられる「結合を変える」という表現は 、一個の分子の別の分子との結合性を変えること、二個の分子の間の結合部位を 遮ること、又はある分子の別の分子域への伝達を阻止すること、あるいはある分 子をアロステリック的に変えてその分子の結合能力を高める又は弱めること、を 言うものと捉えてよい。信号形質導入経路の「調整」とは、細胞の活性化に対す る作動的又は拮抗的作用を含むものとして意図されている。当業者であれば理解 されるように、信号形質導入経路の変化は、推定上の調節的化合物がある場合の 検定結果と、この化合物がない場合の結果とを比較したときに、統計的な著しい 変化として示されるであろう。 本発明の化合物及びこれら化合物が利用される組成物は、一態様では、これら を用いて細胞内の信号形質導入を様々な段階で調節することで、幅広い種類の細 胞機能を調節することができるという点で特に有利である。以下でさらに詳細に 説明するように、本化合物を用いて、増殖、分化及び細胞死といった細胞事象だ けでなく、分泌及び代謝性（同化作用及び異化作用の両方）活性を細胞培養及び 生体内治療の両方で行わせることができる。さらに本発明の別の態様では、細胞 内の信号形質導入を調節することのできる更なる化合物を判別する方法を提供し ている。 本発明の化合物は造血細胞の活性化を調節することができる。本発明によれば 、造血細胞には赤血球（赤血球）及び白血球（白血球）が含まれる。白血球には 好中球（即ち多形核白血球）、好塩基球、好酸球、マスト細胞、巨核球、単球、 リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージが含まれる。本発 明における特に好適な造血細胞には、ＮＫ細胞、好塩基球、Ｂリンパ球（Ｂ細胞 ）及びＴリンパ球（Ｔ細胞）が含まれる。加えて、本化合物の使用により赤血球 の成長及び又は分化を調節することができる。 本発明の一態様は、造血細胞の活性を調節することのできるペプチド又はペプ チド類似体に関係するものである。特に、本発明のペプチドには、一般式（Ｉ／ Ｖ）ＸＹＸＸ（Ｌ／Ｖ）で表される一般的又はコアアミノ酸モチーフ（以下「Ｉ ＴＩＭ」モチーフと呼ぶ）が含まれるが、このときの式の各Ｉはイソロイシン又 はそのミメトープを、Ｖはバリン又はそのミメトープを、各Ｘは個別に何らかの アミノ酸又はそのミメトープを、Ｙはチロシン、ホスフォチロシン又はそれらの ミメトープを、そしてＬはロイシン又はそのミメトープをそれぞれ表すものであ る。好適な実施例ではチロシンの残分はリン酸化する。付属の例が示すように、 造血レセプタに関わる様々な信号形質導入プロセスを調整するのに、単離したＩ ＴＩＭモチーフで充分、つまり例えば必要な構造上の情報を含んでいる。 ある実施例では、本ＩＴＩＭペプチドは、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴ ＹＴＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬＹＴＥＬ、ＶＴＹＳＭＶ、ＶＴＹ ＴＴＬ、ＶＴＹＳＴＶ、ＶＩＹＳＤＬ又はＩＴＹＡＥＬ等、（Ｖ／Ｉ）ＸＹＸＸ （Ｖ／Ｌ）で表すことのできるＩＴＩＭ配列を含み、ただしこのとき各Ｖはバリ ン又はそのミメトープを、Ｔはスレオニン又はそのミメトープを、Ｙはホスフォ チロシン又はそのミメトープを、Ａはアラニン又はそのミメトープを、Ｑはグル タミン又はそのミメトープを、Ｌはロイシン又はそのミメトープを、Ｉはイソロ イシン又はそのミメトープを、Ｅはグルタミン酸又はそのミメトープを、Ｓはセ リン又はそのミメトープを、Ｍはメチオニン又はそのミメトープを、そしてＤは アスパラギン酸又はそのミメトープを、それぞれ表すものである。好適な実施例 ではチロシン残分はリン酸化する。別の実施例では、ＩＴＩＭペプチドは、ＥＱ ＤＰＱＥＶＴＹＡＱＬＮ、ＴＰＰＴＤＩＩＶＹＴＥＬＰ、ＥＱＤＰＱＥＶＴＹＴ ＱＬＮ、ＴＰＰＴＤＩＩＶＹＴＥＬＰ、ＥＱＤＰＥＥＶＴＹＡＱＬＤ、ＴＰＰＴ ＤＴＩＬＹＴＥＬＰ、ＭＳＥＱＥＶＴＹＳＭＶＲＦ、ＭＳＥＱＥＶＴＹＴＴＬＲ Ｆ、ＭＳＥＱＥＶＴＹＳＴＶＲＦ、又はＭＤＮＱＧＶＩＹＳＤＬＮＬのうちの一 つで表されるＩＴＩＭ配列を含む。好適なＩＴＩＭペプチドはＮＫＩＲｐ５８又 はＬｙ４９から得られる。好適な実施例ではチロシン残分はリン酸化する。 別の実施例では、本ＩＴＩＭペプチドは一般式ＩＸＹＸＸＬで例えばＩＴＹＳ ＬＬとして表されるコアＩＴＩＭ配列を含む。好適なＩＴＩＭペプチドはＴＡＥ ＮＴＩＴＹＳＬＬＫＨ又はＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨのいずれかで表され、た だしこのとき、各Ｅはグルタミン酸又はそのミメトープを、Ｇはグリシン又はそ のミメトープを、Ａはアラニン又はそのミメトープを、Ｎはアスパラギン又はそ のミメトープを、各Ｔはスレオニン又はそのミメトープを、Ｉはイソロイシン又 はそのミメトープを、Ｙはチロシン又はホスフォチロシン又はそれらのミメトー プを、Ｓはセリン又はそのミメトープを、各Ｌはロイシン又はそのミメトープを 、Ｋはリシン又はそのミメトープを、Ｍはメチオニン又はそのミメトープを、そ してＨはヒスチジン又はそのミメトープを、それぞれ表すものである。好適な実 施例ではチロシン残分はリン酸化する。好ましくは、ＩＴＩＭペプチドをＦｃレ セプタ配列から得るとよく、より好ましくはＢ細胞Ｆｃレセプタから得るとよい 。好適なＩＴＩＭペプチドはＦｃγＲＩＩ、より好ましくはＦｃγＲＩＩＢＩか ら得られる。 好適な実施例では、ＩＴＩＭモチーフのチロシン残分はリン酸化するか、ある いは、例えば以下に説明するようにホスフォチロシン類似体である。しかしなが らチロシン残分がリン酸化しない形もまた考慮に入れられている。 ＩＴＩＭ作動物質及びＩＴＩＭ拮抗物質（例えば「ＩＴＩＭ擬態」又は「ミメ トープ」）は、細胞たんぱく質内で行われるＩＴＩＭ配列による信号の形質導入 を、それぞれ模倣又は抑制することができる分子である。特にＩＴＩＭの媒介す るＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄの活性化の競合的抑制因子として。ＩＴＩＭに依存 する信号の作動物質又は拮抗物質は、例えば、ＩＴＩＭの結合するたんぱく質を 、アロステリック的に活性化するＩＴＩＭの擬態から得たり、例えばその酵素上 及び／又は結合上の特異性という特徴を変えたり、あるいはＩＴＩＭの結合する た んぱく質が自然発生したＩＴＩＭ配列と結合することを競合的に阻止することで 得ることができる。ＩＴＩＭの擬態は、抗体、サイトカイン、ケモカイン、補体 、プロスタグランジン、ロイコトリエン及びその他の炎症媒介物質の生成を、炎 症及び免疫反応に関係する細胞によって調節することができるものであれば生物 活性を有するものである。 例えば、本発明のＩＴＩＭ擬態は、信号形質導入を調整することにより、細胞 内基質のリン酸化、第二伝令分子の生成、そして遺伝子転写の活性化を最大限に 調節することができる。標的分子には、ホスファチジルイノシトール３−キナー ゼ（ＰＩ−３Ｋ）、Ｇｒｂ２、ｓｏｓ、Ｐ２１ｒａｓＧＡＰａｓｅ−作動性のた んぱく質及び関連するＰ１９０及びＰ６２たんぱく質、ＰＬＣγ１及びＰＬＣγ ２等のホスホリパーゼ、Ｓｈｃ、及びキナーゼのヤヌス（ＪＡＫ）族を含むＭＡ Ｐキナーゼを含めることができるがこれらに限定されるものではない。一実施例 では本発明の化合物は、ＢＣＲ、Ｚａｐ７０、ｐ７２ｓｙｋ、Ｌｙｎ、又はＶａ ｖのＴＣＲ、Ｉｇａ又はＩｇｂサブユニットのｚ鎖のリン酸化を調整することが できる。従って、本発明のＩＴＩＭ擬態を用いて自然生成物の生成を調整するこ とができるが、この自然生成物には、例えば、Ｃ５ａ、インターロイキン−８（ ＩＬ−８）、単球化学走性たんぱく質１α（ＭＩＰ１α）、単球化学走性たんぱ く質１β（ＭＩＰ１β）、単球化学走性誘因物質たんぱく質１（ＭＣＰ−１）、 単球化学走性誘因物質たんぱく質３（ＭＣＰ−３）、小板活性化因子（ＰＡＦ） 、Ｎ−フォルミル−メチオニル−ロイシル−［３Ｈ］フェニルアラニン（ＦＭＬ Ｐ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、ＬＴＣ４、ガストリン放出ペプチド（ ＧＲＰ）、ＲＡＮＴＥＳ、エオタクシン、リンフォタクチン、ＩＰ１０、Ｉ−３ ０９、ＥＮＡ７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、ＭＧＳＡ／ｇｒｏ、小板誘導成長 因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子１（ＩＧ Ｆ−１）、インシュリン、ＩｇＥ／抗原、ＩｇＧ／抗原、ＩｇＡ／抗原、主組織 適合性（ＭＨＣ）たんぱく質、ペプチド、スーパー抗原、抗原、インターロイキ ン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン− ４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ ＩＬ−６、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ− ９）、イン ターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、 インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４ ）インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１ ６）顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−巨核球コロニー刺激因子 （ＧＭ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、エリスロポイエチン （ＥＰＯ）、腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）、Ｆａｓ、インターフェロン−γ （ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−α／β（ＩＦＮ−α／β）、ＯＳＭ、Ｌｉ ｆ、ＣＮＴＦ、プロラクチン、神経ペプチド、カテコールアミン、Ａｃｈ、ヒス タミン、ペプチド好酸球遊走因子、ＴＸＡ２、又はＰＧＤ２がある。 発明の一実施例においては、本ＩＴＩＭ擬態は、たんぱく質チロシンホスファ ターゼの結合をめぐって、細胞表面レセプタの細胞質部分と競合することができ る。好適な実施例では、擬態は、ＳＨ２を含むたんぱく質チロシンホスファター ゼ（ＰＴＰ）の結合をめぐって、レセプタの細胞質部分の一部分、例えばＦｃγ ＲやＭＨＣクラスＩのナチュラルキラー細胞レセプタ（例えば、ＮＫＩＲｐ５８ 又はＬｙ４９）、ＣＤ２２、ＩＬ２βＲ、ＩＬ−３βＲ、ＥＰＯＲ、及びｃ−キ ットと競合することができる。ある好適な実施例では、本発明によるペプチドは 、ＳＨ２を含むＰＴＰの結合をめぐって、ＦｃγＲ又はＬｙ４９又はＮＫＩＲｐ ５８Ｒの細胞質部分の一部分と競合することができる。特に好適な実施例では、 本ペプチドは、ＳＨ２を含むＰＴＰの結合をめぐって、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩ Ｉ、ＦｃγＲＩＩＩ、Ｌｙ４９又はＮＫＩＲｐ５８Ｒの細胞質部分の一部分と、 より好ましくはＦｃγＲＩＩＢＩと競合することができる。好適な実施例ではＰ ＴＰはＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄのいずれかである。 別の実施例では、本ＩＴＩＭペプチドは核酸により符号化されており、この核 酸は、ＦｃγＲ、ＭＨＣクラスＩＲ、ＣＤ２２、ＩＬ２βＲ、ＩＬ３βＲ、又は ＥＰＯＲの細胞質部分のＩＴＩＭ部分を符号化している核酸と厳しい条件下で雑 種核酸を作る。特に好適な実施例では、本ペプチドを符号化する核酸は、特に、 ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、Ｌｙ４９又はＮＫＩＲｐ５８Ｒの 細胞質部分のＩＴＩＭ部分を含む核酸へと、より好ましくはＦｃγＲＩＩＢＩを 用いて、雑種核酸を作ることができる。 好適な実施例では、本発明のＩＴＩＭ擬態は、ＰＴＰのＣＤ１９との相互反応 を調整することができるが、それによりＣＤ１９のリン酸化パターンが変化する 。特に好適な実施例では、ホスファターゼ、例えばＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄの 活性化を通じて、本化合物は、ＣＤ１９上でｔｙｒ４８４及び／又は５１５を脱 リン酸化する。本発明のある実施例では、ＩＴＩＭ擬態はＰＩ３キナーゼの活性 化の調整につながる。別の実施例では、ＩＴＩＭ擬態はＰＬＣγの活性化を調整 することができる。さらに別の実施例では本擬態は、細胞内の第二伝令世代、例 えば細胞外から流れ込んだＣａ²⁺の調整を、ＣＤ１９のＰＩ３キナーゼ活性との 相互反応の抑制を引き起こすことで行わせる。別の実施例では、本ＩＴＩＭペプ チドは、ＩＰ３の生成、ひいては細胞内貯留分からのＣａ²⁺の放出を調整するこ とで、第二伝令世代を調整することができる。第二伝令世代の検出、及び従って 本ＩＴＩＭペプチドの作用の検出の方法は当業において公知である。可能な検出 方法の例を本明細書及び添付の例に説明する。 別の実施例では、本発明のＩＴＩＭ擬態は、Ｇｒｂ２又はｓｏｓの活性を、好 ましくはＳＨ２を含むＰＴＰに結合することで調整することができる。 さらに別の実施例では、本発明はＩＴＩＭ結合分子に関連している。ここで用 いられるように、ＩＴＩＭ結合分子は、ホスフォチロシン残分を介してＩＴＩＭ ペプチド又は擬態に結合することができる。好適な実施例では、ＩＴＩＭペプチ ド又は擬態はＳＨ２部分に結合する。より好適な実施例では、ＩＴＩＭ擬態は、 ペプチドがホスファターゼの活性を調節できるような熊様でＳＨ２を含むチロシ ンホスファターゼと結合する。特に好適な実施例では、ＩＴＩＭペプチドはＰＴ Ｐを活性化する。さらに別の実施例では、ＩＴＩＭ擬態の大きさ及び性質は、こ の化合物が、ＰＴＰのカルボキシターミナルのＳＨ２部分により結合されるよう なものである。別の実施例では、ＰＴＰ１Ｄ、ｐ１６０、又はＰ７０はＩＴＩＭ 結合分子である。 好適な実施例では、本発明のＩＴＩＭ擬態は、造血細胞内に存在するＰＴＰ、 例えばＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄに結合してその活性を調節する。より好適な実 施例では、本発明の擬態はＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１ＤのＳＨ２部分に結合するが 、これにより、この擬態が、ホスファターゼの活性をアロステリック的メカニズ ム により調節することとなる。特に好適な実施例では、本発明のＩＴＩＭは、カル ボキシターミナルのＳＨ２部分に結合するが、これにより、酵素のホスファター ゼ活性が増加することとなる。ホスファターゼ活性のこのような調整は、公知の 天然又は合成基質、例えば付属の例の説明するようなリン酸化ｌｙｎペプチドの リン酸化の程度の変化を測定することを含めて、いかなる数の技術を用いて測定 してもよい。 別の実施例では、本発明のＩＴＩＭペプチドは、ＰＴＰ１Ｃの特定の活性を刺 激することができる。ここで用いられるように、「特定の活性」という表現は、 ＰＴＰ１Ｃが、リン酸化した基質分子、例えばリン酸化ＣＤ１９、Ｓｙｋ、Ｌｙ ｎ、Ｆｙｎ又はＰＩ−３キナーゼを脱リン酸化できる比率を言う。特定の活性の 比率は、例えば、ＰＴＰ１Ｃがリン酸化した基質分子を脱リン酸化する割合で測 定することができる。好ましくは、本発明のＩＴＩＭペプチドは、ＰＴＰ１Ｃの 特定の活性を、約２倍と約１０倍との間で、より好ましくは約５倍との間で刺激 できるとよい。特定の活性の刺激は、例５で詳述するように、リン酸化したＦｙ ｎペプチドのあるところで、ペプチドをＰＴＰ１Ｃで培養したときに見られる。 本発明の調節用試薬は、信号形質導入分子の酵素活性を変えること、好ましく は信号形質導入分子の酵素活性を刺激することで造血細胞の機能を調節するもの である。加えて、本発明の調節用試薬は、ＭＩＲＲ、レクチンレセプタ、又はＩ ｇ上族レセプタを含む活性化レセプタの活性を調整することで造血細胞の機能を 調節するものである。好適な実施例では、本ＩＴＩＭは、ＢＣＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ εＲ、サイトカインレセプタ、又はＣＤ１６を介してシグナリングを調節する。 より好ましくは、本発明のペプチドは、ＣＤ２２、ＦｃεＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ 、ＮＫ１Ｒｐ５８、Ｌｙ４９、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ３Ｒｂ、ＥＰＯＲ、又はｃ−キ ット等の抑制レセプタを介して形質導入されるシグナルを調整することで、この ようなレセプタのうちの一つの形質導入する信号を調整するものであるとよい。 特に好適な実施例では、本発明のペプチドは、ＣＤ２２、ＦｃγＲＩＩＩ、ＮＫ ＩＲｐ５８、Ｌｙ４９、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ３Ｒｂ、ＥＰＯＲ、又はｃ−キットを 介して分子を抑制するものである。 本発明の一実施例は、細胞中において、信号形質導入分子ホスホチロシンホス ファターゼ１Ｃ（ＰＴＰ１Ｃ）、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０、及び／又は ＩＴＩＭ−ｐ７０のうち一つ又はそれ以上の活性を調節することのできる調節用 試薬を含む。細胞内においてＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０、及 び／又はＩＴＩＭ−ｐ７０の活性を調節するための適した方法は、分子の酵素活 性の変更、分子のその基質に対する結合能力の変更、細胞中の分子の濃度の変更 、及び／又は分子のリン酸化を含む。好適な実施例では、本ＩＴＩＭはＰＴＰの その基質への結合を調整することができる。別の好適な実施例ではＩＴＩＭは、 ＩＴＩＭｐ１６０又はＩＴＩＭｐ７０の、シグナリングカスケードでの上流又は 下流要素との結合を調整する。特に好適な実施例では、ＩＴＩＭペプチドは、Ｉ ＴＩＭｐ１６０又はｐ７０の結合をめぐって、ＣＤ２２、ＦｃγＲ、又はＭＨＣ クラスＩＲ等の否定的調節レセプタの細胞質部分と競合する。 本発明のある実施例は、ＰＴＰの酵素活性を変更することの可能な組成物に関 連する。好ましくは、このような試薬は、ＰＴＰのｓｒｃ同族域、好ましくはＰ ＴＰのｓｒｃ同族域２（ＳＨ２）域、より好ましくはＰＴＰのカルボキシルＳＨ ２部分と結合することの可能な化合物を含むとよい。別の実施例では本発明のペ プチドは、ＰＴＰ触媒の域に結合する。好適な実施例では、ＰＴＰは少なくとも ＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄのいずれかである。 別の実施例は、ＰＴＰのその基質に対する結合力を変更することのできる調節 用試薬を含む。好適な実施例ではＰＴＰは少なくともＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄ のいずれかである。好ましくはこのような試薬は、ＰＴＰのＳＨ２部分及び／又 は触媒部分、あるいは例えばＭＩＲＲのＩＴＡＭ部分上のチロシン自己リン酸化 部位等のＰＴＰの基質のホスフォチロシン部位と結合することのできる化合物を 含むとよい。好適なチロシン自己リン酸化部位はＢ細胞レセプタのＩｇα及びＩ ｇβサブユニットのｐＩＴＡＭの残分３９４である。特に好適な実施例では、こ のような試薬は、ＣＤ１９のホスフォチロシン４８４及び／又は５１５に結合す ることが可能である。ＰＴＰのその他の基質への結合を調整する能力もまた、本 ペプチドについて考察されている。 本発明の別の実施例は、細胞中のＰＴＰ１Ｃの濃度を変更することのできる調 節用試薬又はそのミメトープを含む。好ましくはこのような試薬は、ＰＴＰ１ Ｃを符号化するＰＴＰ１Ｃたんぱく質又は核酸分子を含むとよい（以下に詳述す る）。 本発明の別の実施例は、細胞中のＩＴＩＭ―ｐ７０の活性を変えることのでき る調節用試薬又はそのミメトープを含む。好ましくはこのような試薬は、ＩＴＩ Ｍ―ｐ７０の一部分（付属の例を参照のこと）に結合することができ、それによ りたんぱく質の酵素的又は基質結合活性が変化するような化合物を含むとよい。 また好ましい化合物として、ＩＴＩＭ―ｐ７０を符号化するたんぱく質又は核酸 分子等、細胞中のＩＴＩＭ―ｐ７０の濃度を上昇させることのできる化合物があ る。 本発明によれば、単離された、又は生物学的に純粋なペプチドは、自然ミリュ ーから切り離したペプチドである。従って、「単離した」及び「生物学的に純粋 な」とは、そのたんぱく質がどの程度まで精製されているかを必ずしも反映して いない。単離したＩＴＩＭ含有ペプチドは、天然の源から得ることができ、例え ば単離ペプチドは、組換えＤＮＡ技術や、当業において公知の化学的合成を用い て生成した全長たんぱく質から得ることができる。さらにペプチドを置換及び／ 又は誘導することができ、例えば、ミリストイル化、プレニル化又はパルミトイ ル化したアミノ酸を定着媒体としてアセチル化、グリコシル化、カルボキシメチ ル化することができる。本発明のある実施例は、ペプチドがＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ １Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及び／又はＩＴＩＭｐ７０によって結合できるような アミノ酸配列を有した単離ＩＴＩＭペプチドを含む。本発明のＩＴＩＭペプチド は、このペプチドが、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及び／又は ＩＴＩＭｐ７０の少なくとも一つの結合部位により結合できるような大きさであ るが、好ましくは少なくとも約４つのアミノ酸残分、より好ましくは少なくとも 約５つのアミノ酸残分、さらに好ましくは少なくとも約６つのアミノ酸残分の大 きさであるとよい。ある実施例では、本発明のＩＴＩＭペプチドは約１３アミノ 酸残分の大きさを有する。特に、本発明のＩＴＩＭペプチドは、ＳＨ２部分のＰ ＴＰ１Ｃにより結合できる。好ましくは、本発明のＩＴＩＭペプチドは、ＰＴＰ １ＣのカルボキシルＳＨ２部分により結合可能であるとよい。好適な実施例では 、本化合物のペプチジル構成成分は、ＩＴＩＭに加えて、ＩＴＩＭモチーフ が存在するたんぱく質の約２５以下のアミノ酸残分、より好ましくは１０から１ ５以下、さらに好ましくは６以下のアミノ酸残分を含むとよい。融解たんぱく質 など、ここに説明する特定のキメラ的ＩＴＩＭ組成物を例外として、好適な組成 物（特に異所的使用に向けて）には、ＩＴＩＭ−モチーフを含むと共に分子重量 が約７５０から７５００ダルトン、より好ましくは約１０００から５０００ダル トン、さらに好ましくは約１０００から２５００ダルトンの範囲内であるペプチ ドが含まれる。 本発明に基づけば、「ミメトープ」とは、本発明の単離化合物の能力を模倣す ることのできるいかなる化合物をも言う。実際のところ、本出願全体で用いられ ているように、ＩＴＩＭモチーフに関連した「ペプチド」という表現は、ミメト ープも含むものとして理解されよう。ミメトープは、崩壊に対する感応性が減少 するよう改変されながら調節的活性は保持しているペプチドであってもよい。ミ メトープのその他の例には、たんぱく質をベースにした化合物、炭水化物をベー スにした化合物、リピドをベースにした化合物、核酸をベースにした化合物、自 然有機化合物、合成で得られた有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／又は触 媒抗体、又はこれらの細片が含まれるが、これらに限定されるものではない。ミ メトープは、例えば、自然又は合成化合物のライブラリをスクリーニングして、 ここで開示するようにチロシンキナーゼの活性を調節することのできる化合物を 探すことで得られる。さらにミメトープは、例えば自然及び合成化合物のライブ ラリ、特に化学又は組合せのライブラリ（つまり、順序又は大きさが異なるが構 成するブロックが同じであるライブラリ）から得ることができる。さらに、ミメ トープは、例えば合理的な薬品設計によって得ることができる。合理的な薬品設 計では、本発明の化合物の三次元構造は、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）又はＸ線 結晶学によって分析することができる。次にこの三次元構造を用いて、例えばコ ンピュータモデリングにより、可能なミメトープの構造を予測することができる 。さらにこの予測されたミメトープ構造は、化学的合成、組換えＤＮＡ技術によ り、又は自然源（例えば植物、動物、バクテリア及び菌類）からミメトープを単 離することで得ることができる。 「アミノ酸残分」及び「ペプチド残分」という表現は、カルボキシル基（Ｃが 端部に結び付いた）の−ＯＨがないアミノ酸又はペプチド分子、あるいはアミノ 基（Ｎが端部に結び付いた）の陽子のないアミノ酸又はペプチド分子を意味して いる。概して、アミノ酸及び保護基を差すときにここで用いる省略語は、ＩＵＰ ＡＣ−ＩＵＢ生化学名委員会の推奨に基づいている（生化学誌（１９７２）１１ ：１７２６−１７３２を参照のこと）。例えば、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＬＥｕ、Ａｌ ａ及びＧｌｙはそれぞれ、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニン及び グリシンの「残分」を意味する。残分とは、対応するａ−アミノ酸から、カルボ キシル基のＯＨ部分、そしてアミノ基のＨ部分を消去することで得られるラジカ ルを意味する。「アミノ酸側鎖」という表現は、ケー．ディー．コップル氏が規 定したように、−ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯＯＨ部分を除いた部分のアミノ酸を意味す る「ペプチド及びアミノ酸」、ダブリュー．エー．ベンジャミン社、ニューヨー ク及びアムステルダム、１９６６年、２ページ及び３３ページ。通常のアミノ酸 のこのような側鎖の例は、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＳＣＨ₃（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ₂ （ＣＨ₃）−ＣＨ₂ＣＨ₃（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）₂（ロイ シンの側鎖）又はＨ−（グリシンの側鎖）である。 さらに、大部分については、本発明の用途に用いられるアミノ酸は、たんぱく 質に見られるような自然発生したアミノ酸であるか、あるいは、アミノ及びカル ボキシル基を含んだこのようなアミノ酸の同化作用又は異化作用による自然発生 生成物である。特に適したアミノ酸の側鎖には、以下のアミノ酸の側鎖から選択 されるものが含まれる。グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、 イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン 酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、 フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンである。 しかしながら、ミメトープの考察から明らかなように、アミノ酸という表現に は、さらに、ここで言及されるいかなる特定のアミノ酸の類似体、誘導体及び同 族体が含まれる。例えば、本発明は、側鎖が長く又は短くされていながら、環化 のためのカルボキシル、アミノ又はその他の反応性の前駆物質官能基を提供する アミノ酸類似体や、適した官能基を持つ変異側鎖を有するアミノ酸類似体の使用 も考察するものである。例えば当該のペプチド擬態には、例えばｂ−シアノアラ ニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、３−ホスフォセリン、ホモセ リン、１−メチルヒスチジン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシ −トリプトファン、又は３−メチルヒスチジン等のアミノ酸類似体が含まれよう 。ここで適した側鎖を有するその他の自然発生アミノ酸代謝産物又は前駆物質は 、当業者であれば理解されようが、これらも本発明の範囲に含まれるものである 。 さらに、アミノ酸の構造が立体異性体の形式を許容するものである場合は、こ のようなアミノ酸のＤ及びＬ立体異性体も含まれる。ここでアミノ酸及びアミノ 酸残分の形状は適した記号Ｄ、Ｌ、又はＤＬで指示されるが、さらに形状が指定 されない場合、アミノ酸又は残分は形状Ｄ、Ｌ、又はＤＬを有していてもよい。 本発明の化合物の中にはその構造が非対称の炭素原子を含んでいるものがあるこ とが注目されよう。従って、このような非対称性から生じる異性体は本発明の範 囲に含まれることが理解されねばならない。このような異性体は、伝統的な分離 技術や滅菌調整された合成により、ほぼ純粋な形で得られる。本出願の目的のた めに、特に明示する場合を除いて、アミノ酸と呼称されるものはＤ又はＬ立体異 性体の両方を含むものとして捉えられたいが、このアミノ酸はＬ立体異性体であ ることが好ましいことは理解されよう。 同様に、このようなミメトープにはホスフォチロシンの類似体も含めることが できる。例えば、ホスフォチロシン成分、ｐＴｙｒは一般式 ここで、Ｚは次の一般式からなるグループの中から選択される。 で表すことができるが、このとき、ｍはゼロ又は１から６までの範囲の整数であ り、Ｘは存在しないかあるいはＯ、Ｓ、又はＮを表し、Ｄ₁はＯ又はＳを表し、 Ｄ₂はＮ₃、ＳＨ₂、ＮＨ₂、又はＮＯ₂を表し、そしてＲ₁及びＲ₂は個別に水素、 低級アルキル、又は薬学上容認可能な塩、あるいはＲ₁及びＲ₂を、これらが結び 付いたＯ−Ｐ−Ｏ、Ｏ−Ｖ−Ｏ、又はＯ−Ａｓ−Ｏ原子と一緒に考えると、環構 造に５から８の原子を有する多環式リングを成すものである。パラ置換したフェ ニルアラニンが最も好ましい。多くの実施例では、ホスフォチロシンは非加水分 解性のホスフォチロシン類似体であることが好ましい。好適な実施例では、ホス フォチロシンはホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン（Ｆ₂Ｐｍｐ）であ る。 さらに、本出願及び親出願の開示から明らかなように、当該ＩＴＩＭペプチド のミメトープは非加水分解性のペプチド類似体として提供することもできる。分 かりやすくするために例を述べると、本発明のペプチド類似体は、例えば、ベン ゾジアゼピン（例えば、フライジンガー他著、化学及び生物学、ペプチドの項、 ジー．アール．マーシャル編、ＥＳＣＯＭパブリッシャー社、オランダ、ライデ ン、１９８８を参照のこと）、置換ガマラクタム環（ガーベイ他著、化学及び生 物学、ペプチドの項、ジー．アール．マーシャル編、ＥＳＣＯＭパブリッシャー 社、オランダ、ライデン、１９８８、ｐ１２３）、Ｃ−７擬態（ハフマン他著、 化学及び生物学、ペプチドの項、ジー．アール．マーシャル編、ＥＳＣＯＭパブ リッシャー社、オランダ、ライデン、１９８８、ｐ１０５）、ケト−メチレン擬 ペプチド（イウェンソン他著、（１９８６）医化学ジャーナル２９：２９５、及 びイウェンソン他著、構造及び機能（第９回アメリカペプチドシンポジウムの進 行）のペプチドの項、ピアスケミカル社、イリノイ州、ロックランド、１９８５ ）ｂ−ターンジペプチド核（ナガイ他著、（１９８５）テトラヘドロン書２６： ６４７及びサトウ他著（１９８６）化学ソサエティージャーナル、パーキントラ ンス１：１２３１）、ｂ−アミノアルコール（ゴードン他著、生化学生物理学研 究論文１２６：４１９、及びダン他著（１９８６）生化学生物理学研究論文１３ ４：７１）、ジアミノケトン（ナタラジャン他著（１９８４）生化学生物理学研 究論文１２４：１４１）、そしてメチレンアミノ−モディフェド（ローク他著、 化学及び生物学、ペプチドの項、ジー．アール．マーシャル編、ＥＳＣＯＭパブ リッシャー社、オランダ、ライデン、１９８８、ｐ１３４）を用いて生成するこ とができる。さらに、化学及び生物学、ペプチドの項、ジー．アール．マーシャ ル編、 ＥＳＣＯＭパブリッシャー社、オランダ、ライデン、１９８８の第三部、分析的 及び合成的方法を概ね参照されたい。） 代表的な実施例では、本ペプチド擬態はペプチドの逆−インバーソ類似体とし て得ることができる、図示すると、このＴＩＴＹＳＬＬペプチドは逆インバーソ 類似体： として生成することができる。 このような逆−インバーソ類似体は、当業において公知の方法で製造すること ができるが、その例にはシスト他が米国特許第４，５２２，７５２号で述べたも のがある。例えば、図示の逆−インバーソ類似体は以下の方法で製造することが できる。Ｎ−ターミナルスレオニンに対応するジェミナルジアミンの合成には、 保護スレオニン類似体をＨＯＢＴ−ＤＣＣカップリング条件下でアンモニア処理 してＮ−Ｂｏｃアミドを生じさせ、次に、ラダクリシュナ他著（１９７９）有機 化学ジャーナル、４４：１７４６が説明するようにＩ，Ｉ−ビス−（トリフルオ ロアセトキシ）イオドベンゼン（ＴＩＢ）を用いてホフマン型の転位を行う。次 に、生成したアミン塩を、側鎖で保護された（例えばベンジルエステルとして） Ｎ−ＦｍｏｃＤ−Ｉｌｅ残分に標準的な条件下で結合して擬ジペプチドを生じさ せる。このＦｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）基を、ジメチルホルム アミド内のピペリジンで除去して、その結果得たアミンを、ビストリメチルシリ ルアセトアミド（ＢＳＡ）でトリメチルシリル化した後、適切にアルキル化した 、側鎖で保護されたメルドラムの酸の誘導体を用いて、ピノリ氏に認められた米 国特許第５，０６１，８１１号が開示するように濃縮し、逆−インバーソトリペ プチド類似体を生じさせる。次に、この擬トリペプチドを、標準的な条件下でＬ −ホスフォチロシン類似体に結合して保護されたテトラペプチド類似体を生成す る。 保護基を取り除いてこの生成物を解放し、このステップを繰り返してテトラペプ チドを伸長させて全長ペプチドとする。混合ペプチド、例えば通常のペプチド鎖 交を含むものが生成されることが理解されよう。一般的な指針として、たんぱく 分解に最も感応性の高い部位を、擬態の切換に応じて選択される、より感受性の 低いアミド鎖交と変更する場合が多い。最終生成物又はその中間物質はＨＰＬＣ で精製することができる。 別の代表的実施例では、ペプチド擬態はペプチドの逆エナチオ類似体として得 ることができるが、この例は、代表的なＴＩＴＹＳＳＬペプチド に対して得られる、逆−エナチオペプチド類似体を例として挙げることができる 。このような逆−エナンチオ類似体は、チロシン又はホスフォチロシン類似体の Ｄ−エナチオマー及び市販のＤ−アミノ酸並びに標準的な固相又は溶液相のペプ チド合成技術を用いて合成することができる。例えば、好適な固相合成方法では 、適したアミノ保護された（ｔ−ブチルオキシカルボニル、Ｂｏｃ）Ｄ−スレオ ニン残分（又はその類似体）を固形の支持体、例えばクロロメチル樹脂に共有結 合させる。この樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄し、ＤＣＭ中でＴＦＡ処 理してＢＯＣ保護基を除去する。樹脂を洗浄かつ中和化し、次のＢｏｃで保護さ れたＤ−アミノ酸（Ｄ−Ｉｌｅ）を、ジイソプロピルカルボジイミドに結合する ことで導入する。この樹脂を再度洗浄し、このサイクルを、残ったアミノ酸（Ｄ −Ｔｈｒ、Ｄ−ｐＴｙｒ、等々）のそれぞれに対して順番に繰り返す。保護され た逆−エナンチオペプチドの合成完了後、保護基を取り除き、フッ化水素酸／ア ニソール／硫化メチル／チオアニソールで処理してこの固形の支持体からペプチ ドを剥がす。最終生成物をＨＰＬＣで精製して純粋な逆−エナンチオ類似体を得 る。 さらに別の代表的実施例では、トランス−オレフィン誘導体を当該のポリペプ チドのために製造することができる。例えば代表的な一オレフィン類似体を、図 示のＴＩＴＹＳＳＬペプチド： のために得ている。 ホスフォチロシンを含有するペプチドのトランスオレフィン類似体は、ワイ． ケー．シュー他著、（１９８７）テトラヘドロン書２８：３２２５の方法に基づ いて得ることができる。図示の例を参照すると、Ｂｏｃ−アミノＬ−Ｉｌｅは対 応するα−アミノアルデヒドに変換され、このα−アミノアルデヒドをビニルキ ュプレートで処理して、アルコールのジアステレオ異性体混合物を得るが、これ らは一緒に行われる。アリルアルコールはピリジン中の無水酢酸でアセチル化し 、オレフィンを四酸化オスミウム／過ヨウ素化ナトリウムを用いて剥がしてアル デヒドを生じさせ、このアルデヒドを、保護されたスレオニン前駆物質から得ら れたウィッティヒの試薬で濃縮してアリルアセテートを得る。このアリルアセテ ートはメタノール中の炭酸ナトリウムで選択的に加水分解し、このアリルアルコ ールをトリフェニルホスフィン及び四臭化炭素で処理してアリルブロミドを得る 。この化合物を酢酸中の亜鉛で還元して、新たに形成された中央部に、ジアステ レオマーの混合物として転位したトランスオレフィンを生じさせる。このジアス テレオマーを分離して、選択的トランスファー水素化分解により、遊離したカル ボキシル酸が姿を表すと擬ジペプチドが得られる。 この擬ジペプチドを次に、Ｃ−末端で適切に保護されたホスフォチロシン残分 と、そしてＮ−末端で保護されたスレオニン残分と、標準的な技術により結合し て保護されたテトラペプチド同配体を得る。次にこのテラペプチドを、Ｓｅｒ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕに関して同様な手段で得られたオレフィン系トリペプチド類似体 を用いてさらに濃縮する。次に保護基を強酸で取り除いて所望のペプチド類似体 を得るが、このペプチド類似体をさらにＨＰＬＣで精製してもよい。 その他の擬ジペプチドは、適切な原料のＢｏｃアミノ酸及びウィッティヒ試薬 を置換するだけで上述の方法により製造することができる。手続の変更が用いる 試薬の性質に応じて必要であろうが、このような変更はいかなるものも通常の慣 習であり、当業者には自明であろう。 さらに、上述の方法で合成された擬ジペプチドをその他の擬ジペプチドに結合 して、アミド官能価のあるところに複数のオレフィン官能価を持つペプチド類似 体を配することも可能である。例えば、ｐＴｙｒ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ、Ｓ ｅｒ−Ｌｅｕ、等々に対応する擬ジペプチドを作成して標準的な技術により互い に結合し、残分と残分の間にオレフィン結合を交互に有するＩＴＩＭペプチドの 類似体を得ることもできよう。 さらに別のクラスのペプチド擬態誘導体には、例えば部分的にホスホネートで 誘導されたＴＩＴＹＳＳＬペプチド： 等のホスホネート誘導体が含まれる。 このようなホスホネート誘導体の合成は公知の合成スキームから適応されよう。 例えば、ルーツ他著、化学及び生物学のペプチドの項（エスコム科学パブリッシ ャ社、ライデン、１９８８、ｐ．１１８）、ペトリロ他著、構造及び機能のペプ チドの項（第９回アメリカペプチドシンポジウム進行録、ピアスケミカル社、イ リノイ州、ロックランド、１９８５）を参照されたい。 上述したように、ＰＴＰ１Ｃの活性化のためのコアＩＴＩＭモチーフは一般式 （Ｉ／Ｖ）ＸＹＸＸ（Ｌ／Ｖ）で表され、好ましくはチロシンがリン酸化すると よい。従って、上に例示したペプチド擬態はそれぞれ、ヘキサメリックＩＴＹＳ ＳＬコアＩＴＩＭ配列に対応するよう得ることができる。 いくつかの実施例では、ＩＴＩＭミメトープは、細胞の形質膜のようなリピド 二分子層に交差することができよう。リピド二分子層を交差できるミメトープは 有機分子、特に炭水化物をベースにした分子であろう。さらに本発明に基づけば 、本発明の化合物には、一つ又はそれ以上のＩＴＩＭペプチドが互いに結び付い たコンカトマーが含まれよう。上述のように、ペプチドの多様なペプチド擬態誘 導体を生成することができる。 本発明はさらに、調節標的分子に結合するのに機能的な変異体配列（例えば同 族体）として可能性のあるものを判別するために特に有用な、組になった当該Ｉ ＴＩＭモチーフの組合せライブラリを考察するものである。このような組合せラ イブラリをスクリーニングする目的は、例えば、作動薬又は拮抗薬のどちらかと して働くことのできる、あるいは全く新しい活性を有する新規の同族体を作成す ることである。簡単に言えば、ＩＴＩＭ同族体は、ＰＴＰ１Ｃに対してより効果 的な結合を行うよう、本方法によって操作することができる。このように、自然 発生したたんぱく質から得たＩＴＩＭと比較して高い潜在能力を有する、組合せ 誘導同族体を作成することができる。 同様に、突然変異誘発により、対応する野生種のＩＴＩＭからかけ離れた細胞 内半減期を有する同族体を発生させることができる。例えば、変化後のペプチド を、ペプチドの破壊又は下活性化につながるようなたんぱく分解性の崩壊に対し て、又はその他の細胞プロセスに対してより安定した、又はより不安定なものと することができる。このような同族体を用いて、ペプチドの半減期を調整するこ とで治療的発現のエンベロープを変更することができる。例えば半減期が短けれ ば、その生物学的作用はより過渡的となり、細胞内のペプチド量をより細かくコ ントロールすることができる。 本方法の代表的実施例においては、ＩＴＩＭモチーフの一集団のためのアミノ 酸配列は整列しているが、これは好ましくは、可能な限り最も高い同族体を促す ためである。このような変異体の一集団には、例えば、一又はそれ以上の細胞型 又は種からＦｃγＲＩＩＢ、Ｌｙ４９、又はＮＫＩＲｐ５８（図１を参照のこと ）を含めることができる。整列した配列の各位置に現れるアミノ酸を選択して、 組合せ配列の変質組を作ることができる。特定の変異体の整列した配列にアミノ 酸 が存在するかしないかは、基準配列のコンセンサス長に関係し、この長さは自然 のままでも人工のものでもよい。整列した配列に最も高い同族体を保持するには 、基準配列に比較したときの変異体の配列内の欠失をアミノ酸の空隙（−）で表 すことができるが、基準配列と比較したときの変異体内の挿入型突然変異は見逃 して、整列したときの変異体の配列から除くことができる。 説明すると、上述のように、ＩＴＩＭ配列を調べると、（Ｉ／Ｖ）ＸＹＸＸ（ Ｌ／Ｖ）というコンセンサス配列が見られる（図１を参照のこと）。これらの列 に基づいて組合せライブラリをＩＴＩＭペプチドのこの部分から生成することが でき、ＩＴＩＭペプチドの仲間は、レセプタたんぱく質のその他の部分がない場 合はレセプタたんぱく質の一部として表出するであろうが、このとき、このたん ぱく質のその他の部分は静的（例えばＦｃγＲ、ＮＫＩＲ等々）で、ＩＴＩＭコ ア配列に対応する残分のみが組合せ突然変異誘発により変えられるか、あるいは 無関係の融解たんぱく質の一部、例えばファージ膜たんぱく質又はチオレドキシ ンたんぱく質の一部として表出するであろう。代表的な実施例では、ＩＴＩＭ同 族体のライブラリは図１のレセプタＩＴＩＭ配列に基づいて、変質式： (Ile/Val)-Xaa(1)-Tyr-Xaa(2)-Xaa(3)-(Leu/Val) で表されるアミノ酸配列を有するよう生成することができるが、このとき、Ｘａ ａ（１）−Ｘａａ（３）はそれぞれ、図１の同じ位置のアミノ酸残分の一つから 選択され、例えばＸａａ（１）はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ又はＨｉｓであり、Ｘａａ（２）はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであ り、そしてＸａａ（３）はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｎｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又 はＡｓｐであろう。 さらに組合せライブラリの拡張を、例えば一つ又はそれ以上の変質位置におい て保存的突然変異を表すようなアミノ酸を含めることで行うことができる。この ような保存的突然変異を含めると、上述の式で表される潜在性の細胞サイクル調 節配列のライブラリを生じさせることができるが、このとき、Ｘａａ（１）はＧ ｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓであり、Ｘａａ（２）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａ ｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＴｈｒであり、そしてＸａａ（３）は Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐとなるであろう。あるいは、変質位置におけ るアミノ酸の置換は、アミノ酸側鎖の極性又は負荷に関係なく、等配電子の置換 などの位置的基準に基づいて行われてもよい。同様に、一つ又はそれ以上の変異 体位置（Ｘａａ）の完全に無作為の突然変異誘発を行ってもよく、例えばＸａａ （１）−（３）はそれぞれ、２０のアミノ酸（又はそのほかの類似体）のいずれ でもよい。 一実施例では、ＩＴＩＭライブラリは組合せ化学、例えば小型の有機／ペプチ ドライブラリの組合せライブラリを作るために当業で公知の技術を用いて得るこ とができる。例えば、ブロンデル他著（１９９５）化学傾向分析１４：８３、ア フィマックスの米国特許第５，３５９，１１５号及び第５，３６２，８９９号、 エルマンの米国特許第５，２８８，５１４号、スティル他のＰＣＴ公報ＷＯ９４ ／０８０５１号、チェン他著（１９９４）ＪＡＣＳ１１６：２６６１、カー他著 （１９９３）ＪＡＣＳ１１５：２５２、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１００９２号、Ｗ Ｏ９３／０９６６８号及びＷＯ９１／０７０８７号、並びにラーナー他によるＰ ＣＴ公報ＷＯ９３／２０２４２号を参照されたい。） 好適な実施例では組合せペプチドライブラリは、それぞれが少なくとも潜在性 ＩＴＩＭ配列の一部分を含むポリペプチドのライブラリを符号化している遺伝子 の変質ライブラリを介して作ることができる。例えば、合成オリゴヌクレオチド の混合物を酵素的にリゲートして遺伝子配列にすることができ、この結果、潜在 性ＩＴＩＭヌクレオチド配列の変質組を個々のポリペプチドとして、あるいは、 中にＩＴＩＭペプチド配列の組を含んだ、より大型の融解たんぱく質（例えばフ ァージディスプレイのために）として、表出するようにすることが可能である。 潜在性のＩＴＩＭ同族体の遺伝子ライブラリを、変質オリゴヌクレオチド配列 から作成する方法は数多くある。変質遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成器 内で行って、この合成遺伝子を発現に適した遺伝子へとリゲートすることができ る。遺伝子の変質組の目的は、一混合物では、潜在性ＩＴＩＭ配列の所望の組を 符号化する配列をすべて提供することである。変質オリゴヌクレオチドの合成は 当業において公知である（例えばナラング著、ＳＡ（１９８３）テトラヘドロン ３９：３、イタクラ他著（１９８１）組換えＤＮＡ、第３回クリーブランドシン ポジウム会報、マクロ分子、編集エージー ワルトン、アムステルダム、エルス ビアｐｐ２７３−２８９、イタクラ他著（１９８４）生化学研究年鑑、５３：３ ２３、イタクラ他著（１９８４）サイエンス誌１９８：１０５６、イケ他著（１ ９８３）核酸研究１１：４７７を参照されたい）。このような技術は他のたんぱ く質の発生指示で用いられてきた（例えばスコット他著（１９９０）サイエンス 誌２４９：３８６−３９０、ロバーツ他著（１９９２）ＰＮＡＳ８９：２４２９ −２４３３、デブリン他著（１９９０）サイエンス誌２４９：４０４−４０６、 ワーラ他著（１９９０）ＰＮＡＳ８７：６３７８−６３８２、並びに米国特許第 ５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号及び第５，０９６，８１５号を 参照されたい）。 点突然変異から生まれた組合せライブラリの遺伝子生成物をスクリーニングす るための幅広い範囲の技術が当業において公知である。このような技術は、一般 的には、ＩＴＩＭ配列の組合せ突然変異誘発によって生じた遺伝子ライブラリを 迅速にスクリーニングするよう適応させることができよう。大型の遺伝子ライブ ラリをスクリーニングするのに最も広く用いられている技術は、多くの場合、遺 伝子ライブラリをクローニングして複製可能な発現ベクターを作ること、そのベ クターのライブラリで適した細胞を形質転換すること、そしてこの組合せ遺伝子 を、所望の活性を検出すれば、生成物が検出された遺伝子を符号化しているベク ターを比較的容易に単離することのできるような条件下で発現させること、を含 むものである。説明したこのような検定は、組合せ突然変異誘発技術で生まれた 多数の変質配列をスクリーニングする必要があるときに、高い処理量で分析を行 うことができる。 スクリーニング検定の提示の実施例では、ＩＴＩＭ遺伝子ライブラリは、ウィ ルス性粒子表面上で融解たんぱく質として発現させることができる。例えば、糸 状ファージ系では、異種ペプチド配列は伝染ファージの表面上で発現させること で二つの著しい利益を提供することができる。第一に、これらのファージは大変 高い濃度で類縁マトリックスに適用することができるため、一度に大量の数のフ ァージをスクリーニングすることができる。第二に、各伝染ファージは組合せ遺 伝子生成物をその表面上で提示するため、もし特定のファージが類縁マトリック スから少量回収されたときには、このファージをまた別の回の感染で増幅するこ とができる。そっくりの大腸菌糸状ファージＭ１３、ｆｄ、及びｆｌのグループ が大抵の場合ファージの提示ライブラリにおいて用いられるが、それはファージ ｇＩＩＩ又はｇＶＩＩＩのどちらかの膜たんぱく質を用いることで、ウィルス性 粒子の極限被包物を破壊することなく融解たんぱく質を生成することができるか らである（ラドナー他によるＰＣＴ公報ＷＯ９０／０２９０９号、ガラード他に よるＰＣＴ公報ＷＯ９２／０９６９０号、マークス他著（１９９２）生物学化学 ジャーナル２６７：１６００７−１６０１０、グリフィス他著（１９９３）ＥＭ ＢＯＪ１２：７２５−７３４、クラックソン他著（１９９１）ネイチャー誌３５ ２：６２４−６２８、及びバーバス他著（１９９２）ＰＮＡＳ８９：４４５７− ４４６１）。 例えば、組換え型ファージ抗体システム（ＲＰＡＳ、ファーマシアカタログ番 号２７−９４００−０１）は、本発明のＩＴＩＭモチーフ組合せライブラリを発 現かつスクリーニングするために使用する際には容易に改変することができる。 例えば、ＲＰＡＳ器具のｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドは、ファージｇＩＩＩ膜 たんぱく質を符号化する遺伝子を含んでいる。このＩＴＩＭ組合せ遺伝子ライブ ラリをクローニングして、ｇＩＩＩ融解たんぱく質として発現するよう、ｇＩＩ Ｉ信号配列に隣接するファージミドを作ることができる。リゲーションの後、こ のファージミドを用いて競合大腸菌ＴＧ１細胞を形質変換する。形質変換した細 胞を次にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに感染させてファージミド及びその候補 ＩＴＩＭ遺伝子インサートを救護する。その結果生じる組換え型ファージは、特 定の候補ＩＴＩＭペプチドを符号化するファージミドＤＮＡを含有しており、対 応する融解膜たんぱく質の一つ又はそれ以上の複写物を表示する。このファージ が表示する候補たんぱく質は、例えばＰＴＰ１Ｃ標的を結合させることができ、 パンニングによって選別又は濃縮される。例えば、ファージライブラリは、グル タチオンで固定したＰＴＰ１Ｃ−ＧＳＴ融解たんぱく質上でパンニングを行うこ とができ、未結合のファージを細胞から洗い落とすことができる。次に、結合し たファージを単離し、組換え型ファージが野生種のｇＩＩＩ膜たんぱく質の少な くとも一つの複写物を発現していれば、これらは大腸菌を感染させるその能力を 保持していることとなる。このように、大腸菌を再感染させてパンニングする工 程を連続して数回行うとＩＴＩＭ同族体が著しく濃縮され、その生物学的作用を 判定するためにこの濃縮したＩＴＩＭの同族体に対してさらなる生物学的活性の スクリーニングを行う。従ってその後の選択、例えばライブラリから還元した組 の変異体を選択する際には、単なるＰＴＰ１Ｃの結合能力ではなく、より意味の 大きな基準に基づいて行うことができよう。例えば、細胞内の半減期又は選択性 を二回目のスクリーニングの選択基準とすることができる。 本発明のもう一つの態様は、本発明の調節用試薬を含む調合物を含むものであ る。個々で用いられるように、「ある」とは少なくとも一つ（つまり一つ又はそ れ以上の）を意味することがある。本発明の調合物には、細胞中のＰＴＰ１Ｃ、 ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及びＩＴＩＭ−ｐ７０を含むある分子の活性を 変えることで、前記分子の活性が変わったことにより造血細胞機能を調節できる 調節用試薬を含めることができる。好ましくは本発明の調合物は、アミノ酸配列 ＴＡＥＮＴＩＴＹＳＥＬＬＫＨ、ＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＡＨ、又はこれらの ミメトープを有する一つ又はそれ以上のペプチドを含むとよい。より好ましくは 、チロシン残分がリン酸化するとよい。より好適な実施例では、ＩＴＩＭは、Ｖ ＴＹＡＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＴＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬ ＹＴＥＬ、ＶＴＹＳＭＶ、ＶＴＹＴＴＬ、ＶＴＹＳＴＶ、ＶＩＹＳＤＬ、又はＩ ＴＹＡＥＬのいずれか一つで表されるとよく、そして好ましくはチロシン残分が リン酸化するとよい。好ましくはＩＴＩＭは、ＩＴＹＳＬＬ、又はＩＸＹＸＸＬ の一つを含むとよく、より好ましくは、チロシン残分がリン酸化するとよい。特 に好適な実施例では、本調合物は（Ｉ／Ｖ）ＸＹＸＸ（Ｌ／Ｖ）を含むとよく、 好ましくはチロシン残分がリン酸化するとよい。 例えば、本発明は薬学上容認可能な組成物を提供するものであるが、この組成 物は、一つ又はそれ以上の薬学上容認可能な担体（添加物）及び／又は希釈剤と 一緒に調合された、ここに述べる一つ又はそれ以上のＩＴＩＭ擬態を治療上効果 的な量、含むものである。以下に詳述するように、本発明による薬学的組成物は 、固体又は液体形での投与に向けて特に調合されてもよく、その投与方法には以 下の方法が含まれる：（１）経口投与、例えばドレンチ（水性又は非水性溶液又 は懸濁液）、錠剤、大丸薬、粉末、顆粒、舌への投与用のペーストなど、（２） 非経口投与、例えば皮下、筋肉内又は静脈内注射を例えば滅菌溶液又は懸濁液と して行うなど、（３）局所的投与、例えば、皮膚に対するクリーム、軟膏又は噴 霧剤として、など、（４）経膣又はイントラベクタル投与、例えばペッサリ、ク リーム又は泡として、（５）例えば吸入用の、エーロゾル剤又は微粉化スプレー として。 ここで用いる「治療上効果的な量」とは、本発明のＩＴＩＭペプチド又はペプ チド擬態を含む化合物、材料、又は組成物の量であって、動物の細胞中の少なく とも部分母集団において細胞内シグナリング経路を抑制する又は強めることで、 いかなる医学的治療にも適合する合理的な利益／危険性の割合で、処理を受けた 細胞のその経路の生物学的結果を変え、それにより何らかの所望の治療効果を生 むのに効果的な量を言う。 ある実施例では、細胞と接触させる調節用試薬の効果的な量には、Ｂ細胞中の 信号形質導入経路を調節することのできる量が含まれる。調節用試薬の好ましい 効果的な量は、試薬と接触した細胞中のＢ細胞レセプタの活性化を低減すること のできる量を含む。調節用試薬のより好ましい効果的な量は、Ｂ細胞レセプタと 機能的に結合した一つ又はそれ以上の信号形質導入分子（つまり、Ｂ細胞レセプ タと結合した抗原により、その活性を刺激又は抑制される分子）を脱リン酸化（ つまりリン酸化の程度を低減する）することのできる量を含む。調節用試薬のさ らにより好ましい効果的な量は、ＣＤ１９、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｓｙｋ、ＰＩ−３ キナーゼ、Ｉｇα、Ｉｇβ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＡ、Ｃ Ｄ３γ、ＣＤ３ε、ＴＣＲ−ｚｅｔａ、Ｓｈｃ及び／又はＰＬＣγの脱リン酸化 を誘発することのできる量を含む。信号形質導入分子の脱リン酸化の量は当業に おいて公知の方法を用いて測定することができる。具体的には、脱リン酸化検定 は、例５に詳述する方法を用いて行うことができる。 本発明の別の実施例では、細胞に接触させる調節用試薬の効果的な量は、Ｂ細 胞レセプタの交差結合の結果生じる細胞内カルシウムの可動化の程度を低減する ことのできる量を含み、このような低減は、試薬のないときにＢ細胞レセプタの 交差結合から生じる細胞内カルシウムの可動化の程度と比較される。好ましくは 調節用試薬の効果的な量は、試薬のない状態でのＢＣＲ交差結合から生じる細胞 内カルシウム可動化と比較したときのカルシウム可動化を約２倍、より好ましく は約３倍、さらに好ましくは約４倍に低減することのできる量であるとよい。Ｂ ＣＲ交差結合に反応したカルシウム可動化量は、当業者に公知の方法を用いて測 定することができる。具体的には、カルシウム可動化は、例６に述べる一般的方 法を用いて測定することができる。 本発明の別の実施例では、細胞に接触させる調節用試薬の効果的量は細胞の生 むヒスタミンの量を減少させることのできる量を含む。好ましくは、調節用試薬 の効果的な量は細胞のヒスタミン生成のレベルを約２倍に低減することのできる 量を含むとよい。同様に、そして異なる実施例では、本発明の方法に用いる調節 用試薬の効果的量は、細胞によるＩＬ−５生成レベルを、好ましくは約２倍、よ り好ましくは約３倍、さらに好ましくは約４倍に変更することのできる量を含む 。さらに同様に、そして異なる実施例では、本発明の方法に用いる調節用試薬の 効果的な量は、細胞によるＩＬ−８生成レベルを、好ましくは約２倍、より好ま しくは約３倍、さらに好ましくは約４倍に変更する量を含む。細胞の生成するヒ スタミン、ＩＬ−５及びＩＬ−８の濃度は、当業者に公知の方法を用いて計測す ることができる。具体的には、ＩＬ−５又はＩＬ−８の濃度は、例えば、酵素に 関連したイムノアッセイ又はラジオイムノアッセイにおいて、それぞれＩＬ−５ 又はＩＬ−８に特定的に結合する抗体を用いて計測することができる。 ここで用いる「薬学上容認可能な」という表現は、健全な医学的判断の見地か ら見て、過度の毒性、過敏症状、アレルギ反応、又はその他の問題又は合併症を 起こすことなく、人間及び動物の組織に接触させて用いるのに適した、合理的な 利益／危険性の割合に見合う化合物、材料、組成物及び／又は適用形態を言う。 ここで用いる「薬学上容認可能な担体」とは、当該ペプチド及びペプチド擬態 物質を身体の一組織又は部分から身体の別の組織又は部分へと運ぶ又は輸送する ことに関わる、液体又は固体の充填剤、希釈剤、付形剤、溶媒又は封入材料等の 薬学上容認可能な材料、組成物、あるいは、ビヒクルを意味する。各担体は、そ の調合物中の他の成分と適合性があるという意味で、かつ、被験者に対して害が ないという意味で「容認可能」でなくてはならない。薬学上容認可能な担体とし て働くことのできる材料の例には、（１）ラクトース、グルコース及びショ糖等 の糖類、（２）コーンスターチ及びイモの澱粉等の澱粉類、（３）セルロース及 びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロー ス及びアセチルセルロース等、（４）粉状トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼ ラチン、（７）タルク、（８）ココアバターや座薬ろう等の付形剤、（９）ピー ナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆 油等の油類、（１０）プロピレングリコール等のグリコール類、（１１）グリセ リン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール等のポリオール 、（１２）オレイン酸エチル及びラウレートエチル等のエステル、（１３）寒天 、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５） アルギン酸、（１６）無発熱因子水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液 、（１９）エチルアルコール、（２０）燐酸緩衝液、及び、（２１）薬剤調合に 用いられるその他の非毒性適合物質が含まれる。 上述のように、本ＩＴＩＭ擬態のあるいくつかの実施例には、アミノ又はアル キルアミノのような基本的な官能基を含めてもよく、そのため、薬学上容認可能 な酸を用いて薬学上容認可能な塩基を形成することができる。この意味で「薬学 上容認可能な塩」とは、本発明のペプチド又はペプチド擬態の、比較的に非毒性 の、無機及び有機酸添加塩を言う。このような塩は、本発明の化合物の最終的な 単離及び精製の際に原位置で調製したり、あるいは、精製されたペプチド又はペ プチド擬態を遊離した基質の形のまま適した有機又は無機酸と別々に反応させて 、その結果形成された塩を単離することで調製することができる。代表的な塩に は、臭酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アセテート、吉草 酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香 酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩 、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシレート、グルコヘプトネート、ラ クトビオネート及びラウリルスルホネート等々が含まれる（例えば、バージ他著 、（１ ９７７）「製薬上の塩」、薬学サイエンスジャーナル、６６：１−１９、を参照 のこと）。 その他の場合として、本発明の化合物には一つ又はそれ以上の酸性の官能基を 含めてもよく、そのため、薬学上容認可能な塩を薬学上容認可能な塩基を用いて 形成することができる。この場合の「薬学上容認可能な塩」とは、本発明のペプ チド又はペプチド擬態の、比較的に非毒性の、無機又は有機塩基添加塩を言う。 このような塩も、同様に、ペプチド又はペプチド擬態の最終的な単離及び精製の 間に原位置で調製したり、あるいは、精製化合物を遊離酸の形のまま、例えば、 薬学上容認可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩のような適した 塩基や、アンモニア、あるいは薬学上容認可能な有機質の第一、第二、又は第三 アミンと別々に反応させることで調製することができる。代表的なアルカリ又は アルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシ ウム、及びアルミニウム塩、等々がある。塩基添加塩の調合に用いることのでき る、代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミ ン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、等々がある（例えば 、バージ他著による上述の文献を参照のこと）。 湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸 マグネシウム、並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、スイートニング、調味料及び芳 香剤、保存薬及び抗酸化剤もまた、組成中に存在していてもよい。 薬学上容認可能な抗酸化剤の例には、（１）水溶性の抗酸化剤、例えばアスコ ルビン酸、塩酸塩システイン、二硫酸塩ナトリウム、異性重亜硫酸ナトリウム、 亜硫酸ナトリウム、等々、（２）油溶性の抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミ チン酸塩、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン （ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール、等々、 及び、（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ ＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、等々、が含まれる。 本発明の調合物には、口、鼻腔、局所（頬及び舌下を含む）、直腸、膣、エー ロゾル及び／又は非経口投与に適したものが含まれる。調合物は便利なように適 用量単位で提供してもよく、また、調剤技術において公知のいかなる方法を用い て調剤してもよい。一回分の適用量を調剤するときに担体材料と組み合わせるこ とのできる有効成分の量は、治療を受ける主体、投与のその特定の形態に応じて 異なるであろう。一回分の適用量を調剤するときに担体材料と組み合わせること のできる有効成分の量はほぼ、治療効果を生じるペプチド又はペプチド擬態の量 となるであろう。多くの場合、１００％のうち、この量は約１％から約９９％、 好ましくは約５％から約７０％、最も好ましくは約１０％から約３０％の範囲の 有効成分となるであろう。 これらの調合物又は組成物を調剤する方法は、本発明の化合物を、担体及び選 択に応じて一つ又はそれ以上の付属成分に会合させるステップを含む。一般的に は、この調合物は、本発明のペプチド又はペプチド擬態を、液体担体、又は細密 に分割された固形担体、あるいはその両方に、均等かつ密接に会合させ、さらに 必要な場合には製品を付形することで調剤される。 経口投与に適した本発明の調合物は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼ ンジ（調味基礎材料、多くの場合ショ糖、アラビアゴム又はトラガカントを用い て）、粉末剤、顆粒剤、又は、水性又は非水性の溶液又は懸濁液の形を採っても 、あるいは、水中油形又は油中水形の乳剤として、又はエリキシル剤又はシロッ プ剤として、あるいは香錠(例えばゼラチン及びグリセリンなどの不活性の基質 や、ショ糖及びアラビアゴムなど)及び／又は含そう剤、等々の形を採用しても よく、このとき各々は本発明による化合物を所定量、有効成分として含有するも のである。本発明のペプチド又はペプチド擬態はまた、巨丸剤、舐剤又はペース ト剤として投与してもよい。 経口投与用の本発明品の固形投与形態（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末 剤、顆粒剤、等々）においては、有効成分を一種又はそれ以上の薬学上容認可能 な担体と混合するが、この担体は例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸塩二カ ルシウム、及び／又は（１）充填剤又は増量剤、例えば澱粉、ラクトース、ショ 糖、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸など、（２）結合剤、例えば カルボキシメチルセルロース、アルキン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン 、ショ糖及び／又はアラビアゴムなど、（３）湿潤剤、例えばグリセロールなど 、（４）分解剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、イモ又はタピオカ澱粉、アルギ ン 酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなど、（５）消散遅延剤、例えばパラ フィン、（６）吸収加速剤、例えば第四アンモニウム化合物、（７）浸潤剤、例 えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート、（８）吸収剤、例え ばカオリン及びベントナイトクレイ、（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン 酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウ リル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物、そして（１０）着色剤、のうちのい ずれかである。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、薬剤の組成にはさらに緩衝剤を 含めてもよい。同様の種類の固形組成物はまた、高分子重量ポリエチレングリコ ール等々と同様、ラクトース又は乳糖等の付形剤を用いることで軟質又は硬質の 充填ゼラチンカプセルの充填剤として利用してもよい。 錠剤は圧縮法又は成形法により製造することができ、選択に応じて一種又はそ れ以上の付属成分を加えてもよい。圧縮された錠剤は、結合剤（例えばゼラチン 又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性の希釈剤、保存料 、分解剤（例えばデンプングリコレートナトリウム又は架橋カルボキシメチルセ ルロースナトリウム）、界面活性剤又は拡散剤を用いて調製してもよい。成形錠 剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末ペプチド又はペプチド擬態の混合物を 、適した機械を用いて成形することで製造してもよい。 糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒剤等、本発明の薬剤組成物の錠剤及びその他 の固形投与用の形態は、選択に応じて、筋目を付けたり、あるいは、例えば腸溶 剤のコーティングや、薬剤調製技術で公知のその他のコーティング等のコーティ ング及び殻を施してもよい。これらはまた、所望の剥離形等のポリマーマトリッ クス、リポソーム、及び／又は微小球が得られるよう、例えばヒドロキシプロピ ルメチルセルロースを様々な割合で用いることで、有効成分が剥離するのを遅延 又は調整すべく調剤してもよい。これらは、例えばバクテリア保持フィルタを通 じてフィルタ濾過したり、無菌水で溶解可能な滅菌固形組成物の形状をした滅菌 剤を加えたり、あるいはその他の無菌の注入可能な媒体を使用直前に加えたりし て滅菌してもよい。これらの組成物には、選択に応じてさらに乳白剤を含めても よく、また、その有効成分が、胃腸管の特定部位でのみ、あるいは特定部位で特 に剥離するような組成物としたり、さらに選択に応じて、遅れて剥離するような 組成物としてもよい。使用可能な埋封組成物の例としては高分子物質及びろうが 含まれる。有効成分はまた、適当な場合には上述の付形剤を一種又はそれ以上用 いてミクロ被包形としてもよい。 本発明の化合物の経口投与用の液体適用形状には、薬学上容認可能なエマルジ ョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤が含まれ る。有効成分に加えて、液体投与形状では当分野で通常用いられる不活性の希釈 剤を含めてもよく、この希釈剤には、例えば水等の溶媒や、例えばエチルアルコ ール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベン ジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレン グリコール、油脂（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ 油、ひまし油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポ リエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物 等の可溶化剤及び乳化剤がある。 不活性の希釈剤の他にも、経口用の本組成物には、例えば湿潤剤、乳化剤及び 懸濁剤、スィートニング、調味料、着色剤、芳香剤及び保存剤等の補助剤を含め てもよい。 懸濁液では、有効なペプチド又はペプチド擬態に加えて、例えばエトキシル基 イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンの エステル、微晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及 びトラガカント並びにこれらの混合物等の懸濁剤を含んでいてもよい。 直腸又は膣投与用の本発明の薬剤組成の調合物は座薬として提供してもよく、 この座薬は一種又はそれ以上の本発明の化合物を、一種又はそれ以上の適した非 炎症性の付形剤又は担体と混合させることで調製することができるが、この付形 剤又は担体は、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬用ろう又 はサリチレートを含み、また、室温では固形であるが、体温では液体となるため 直腸又は膣腔で溶けて有効なペプチド擬態を放出するものであろう。 経膣投与に適した本発明の調合物はまた、ペッサリー、タンポン、クリーム、 ゲル、ペースト、泡又は噴霧状の調合物であって、当分野で適切であると公知の 担体を含んだ調合物を含む。 本発明のペプチド又はペプチド擬態の局所用又は経皮用投与に向けた適用形状 は、粉末、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ 及び吸入剤を含む。有効化合物は滅菌状態で薬学上容認可能な担体、そして必要 であればいかなる保存料、緩衝剤、又は推進剤と混合してもよい。 軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、本発明の有効ペプチド又はペプチド 擬態に加えて、例えば動物性及び植物性脂肪、油脂、ろう、パラフィン、でんぷ ん、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベ ントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物などの付形剤を 含んでいてもよい。 粉末及び噴霧は、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水 酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミドの粉末、又はこれらの物質 の混合物による付形剤を含んでいてもよい。さらに噴霧は、例えばクロロフルオ ロ炭化水素のような通常の推進剤や、例えばブタン及びプロパンのような揮発性 の不飽和炭化水素を含んでいてもよい。 経皮用パッチは、本発明の化合物の身体への供与を調整できるという点で有利 である。このような適用形状は、本ペプチド擬態を適した媒質中で溶解又は拡散 させることで製造することができる。吸収促進剤をさらに用いれば、本ペプチド 擬態の皮膚通過量を増加させることができる。このような通過率は、率調整膜を 提供するか、あるいは本ペプチド擬態をポリマーマトリックス状又はゲルとして 拡散させることで調整可能である。 眼用調合物、眼用軟膏、粉末、溶液、等々もまた、本発明の範囲内にあるもの として考えられている。 非経口投与に適した本発明の薬剤組成物は、一種又はそれ以上の本発明のペプ チド又はペプチド擬態を、一種又はそれ以上の薬学上容認可能の無菌等張性の水 性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョンや、無菌粉末と組み合わせ たものを含むが、この無菌粉末は使用直前に無菌の注入可能な溶液又は分散液に 再構成してもよく、さらに抗酸化剤、緩衝剤や静菌剤をこの中に含めても、ある いはこの調合物を被験者の血液と等張性にする溶質、又は懸濁剤あるいは増粘剤 を含めてもよい。 本発明の薬剤組成物に用いることのできる、適した水性及び非水性の担体の例 には、水、エタノール、ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール 、ポリエチレングリコール、等々）、及びこれらの適した混合物、オリーブ油な どの植物性油脂、並びにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが含ま れる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材を用いたり、分 散液の場合には粒子の大きさを規定値に維持したり、サーファクタントを用いる ことで維持することができる。 これらの組成物にはまた、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を 含めてもよい。微生物の活性を防止するには、様々な抗菌物質及び抗カビ剤、例 えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール、等々を含めるとより 確実となろう。さらに、例えば糖類、塩化ナトリウム、等々の等張作用因子を組 成物に含めることが望ましいであろう。さらに、モノステアリン酸アルミニウム 及びゼラチンなど、吸収を遅らせる物質を含めることで、注入薬物の吸収時間を 長くすることが可能であろう。 場合によっては、薬品の作用を長引かせるために、皮下又は筋肉注射から薬品 の吸収を遅らせることが好ましい。これは、水溶性の乏しい、結晶質又は非晶質 の物質の液体懸濁液を用いることで達成することができる。これにより、薬品の 吸収率はその溶解率に左右されることとなるが、この溶解率は結晶の大きさ及び 結晶の形状に左右されるであろう。あるいは、腸管外投与した薬品の吸収を遅ら せるには、薬品を油性のビヒクル中で溶解又は懸濁させても達成できる。 注入可能な蓄積成形品は、本ペプチド又はペプチド擬態のマイクロカプセルの マトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマーに形 成することで製造される。また、薬品のポリマーに対する比に応じて、そして使 用したその特定のポリマーの性質に応じて、薬品の剥離率を調整することができ る。その他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無 水物）がある。蓄積注入可能調合物はまた、薬品を、身体組織に適合性のあるリ ポソーム又はミクロエマルジョン内に閉じ込めることで調製される。 本発明の化合物をヒト及び動物に対して薬剤として投与する場合には、単体で 与えたり、あるいは、例えば０．１％から９９．５％（より好ましくは０．５か ら９０％）の有効成分を薬学上容認可能な担体と組み合わせて含有した薬剤組成 物として与えることができる。 本発明の調剤は、経口、非経口、局所的、又は直腸を通じて与えてよい。また 本調剤は各投与経路に適した形態で与えてもよいことはもちろんである。例えば 錠剤又はカプセルの形態でも、注射、吸入、目薬、軟膏、座薬等々の形態での投 与、つまり注射、温浸又は吸入による投与や、ローション又は軟膏による局所的 投与、座薬による直腸投与形態でもよい。経口投与が好ましい。 ここで用いる「非経口投与」及び「非経口的に投与する」という表現は、腸内 及び局所的投与以外の、多くの場合注射による投与方法を意味し、静脈内、筋肉 内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表 皮下、関節、被膜下、クモ膜下、脊髄及び胸骨内注射及び温浸を含むが、これら に限定されるものではない。 ここで用いる「全身投与」、「全身的に投与する」、「末梢投与」及び「末梢 に投与する」という表現は、化合物、薬品又はその他の材料を、中枢神経に直接 投与する以外の方法により、被験者の全身に進入するように投与することを意味 し、代謝及びその他の同様なプロセス、例えば皮下投与に準ずるものである。 これらのペプチド及びペプチド擬態は、治療を目的としてヒト及びその他の動 物に投与されるが、それには、例えば噴霧による口腔、鼻腔投与、直腸、経膣、 非経口、槽内投与、及び、粉末、軟膏、点眼薬等による頬及び舌下を含む局所的 投与を含むいかなる適した投与経路を経てもよい。 選択した投与経路に関係なく、本発明の化合物は、適した水化物形態及び／又 は本発明による薬剤組成物中に用いることができるが、当業者に公知の通常の方 法を用いて薬学上容認可能な適用形態に調製されるものである。 本発明による薬剤組成物中の有効成分の実際の適用レベルは、被験者に害を与 えることなく、特定の被験者、組成、及び投与の形態から見て所望の治療上の反 応をもたらすのに効果的な量の有効成分を得るよう、変更してもよい。 選択される適用レベルは様々な因子によって左右されるが、この因子には、使 用した本発明による特定のペプチド又はペプチド擬態の活性、又はエステルの活 性、塩あるいはアミドの活性、投与の経路、投与時間、使用中の特定の化合物の 排出率、治療期間、その特定のペプチド擬態と組み合わせて用いた他の薬品、化 合物及び／又は材料、被験者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以 前の治療歴、等々、医療分野で公知の因子が含まれる。 当分野における通常の技術を有する医師又は獣医であれば、必要な薬剤組成物 の効果的な量を決定し、処方することが容易に可能である。例えば、医師又は獣 医は、薬剤組成中の本発明による化合物の適用量を、所望の効果を上げるのに必 要な量よりも抑えて開始し、この適用量を、所望の効果が得られるまで次第に増 やすことも可能であろう。 多くの場合、本発明のペプチド又はペプチド擬態の適した一日当りの適用量は 、治療効果を上げるには最も低い適用量の化合物量となるであろう。このような 効果的な適用量は、通常、上述の因子により異なるであろう。一般的には、一被 験者に対する本発明の化合物の静脈内、脳室内及び皮下適用量は、提示の鎮痛効 果のために用いる場合、一日当り、体重に対して約０．０００１ミリグラム乃至 約１００ミリグラム／１キログラムの範囲内であろう。 また必要に応じて、有効ペプチド又はペプチド擬態の効果的な一日当りの適用 量を、２、３、４、５、６又はそれ以上に小分けして、選択的には単位適用量の 形態として、適した間隔を置きながら終日かけて分けて投与してもよい。 本発明の化合物を単体で投与することも可能であるが、本ペプチド又はペプチ ド擬態を薬剤調合物（組成物）として投与することが好ましい。 本発明のさらに別の熊様は、ここに開示されるように本発明の化合物のペプチ ジル形態を符号化する、単離された核酸分子に関するものである。本発明によれ ば、核酸に言及するときは核酸分子をも言及するものである。本発明に基づくと 、単離した核酸分子は、自然ミリューから切り離した核酸分子（つまり、ヒトに よる操作を介した分子）である。従って、「単離した」という表現は必ずしも核 酸分子の精製の程度を反映するものではない。単離される核酸分子には、ＤＮＡ 、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡ、又はＲＮＡのハイブリッド又は誘導体を含めること ができる。本発明の核酸分子には、核酸分子の発現（例えば転写又は翻訳支配域 ）、全長又は部分的符号域、及びこれらの組合せをコントロールする調節域を含 めることができる。本発明の核酸分子のいかなる部分も、（１）分子を自然ミリ ュー から単離する、（２）組換えＤＮＡ技術（例えばＰＣＲ増幅、クローニング）を 用いる、又は（３）化学的合成方法を用いる、ことで作成することができる。 本発明の核酸分子は、本発明の化合物を符号化する自然の核酸分子の機能的同 等物を含み、この同等物には、自然の対立遺伝子変異体、並びに、ヌクレオチド を挿入、消去、置き換え、及び／又は転化するという変更を行った核酸分子であ って、この変更により、信号形質導入を調節することのできる本発明の化合物を 符号化するこの核酸分子の能力が実質的に干渉されないよう行った改変核酸分子 が含まれるがこれらに限定されるものではない。好ましい機能的同等物は、例え ばＦｃγＲ、Ｃｄ２２、ＮＫＩＲｐ５８又はＬｙ４９たんぱく質から得られたＩ ＴＩＭペプチドを符号化する核酸分子の少なくとも一部分へと、厳しい条件下で 雑種核酸を作ることのできる核酸配列を含む。厳しい雑種核酸生成条件は、サン ブルック他著、分子クローニング：研究室用手引、コールドスプリングハーバー ラブズプレス社刊、１９８９に説明されており、この文献全体をここに参照文献 として編入する）。 ある特定の核酸分子にどのような特定の変更を行うことができるかを判断する 材料として、当業者はいくつかの因子を考慮せねばならないが、このような因子 から、当業者であれば、本発明の実施可能な実施例を、不要な実験を行うことな く理解されるであろう。例えば、このような因子には、本発明の化合物が符号化 されている特定の機能域は維持されるよう核酸分子に対する変更を行うことが含 まれ、この特定の機能域には、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及 び／又はＩＴＩＭ−ｐ７０で結合されることができ、かつ、このようなたんぱく 質及び機能的ホスファターゼ部分の活性を調節することのできるＩＴＩＭモチー フが含まれている。これら様々な特性の機能試験（例えば結合検査、ホスファタ ーゼ検定、リピドリン酸化検定）により、当業者は、どのような変更がその核酸 分子に対して適切であり、どのような変更はそうでないか、判断することができ る。これらの様々な特性の機能試験（例えば結合検査、キナーゼ検定、リピドリ ン酸化検定）により、当業者は、どのような変更がその核酸分子に対して適切で あり、どのような変更はそうでないか、判断することができる。 一実施例では、本発明のＩＴＩＭ核酸は、コンセンサスポリペプチド（Ｉ／Ｖ ） ＸＹＸＸ（Ｌ／Ｖ）で表されるＩＴＩＭペプチド配列を含むポリペプチドを符号 化するものである。好適なＩＴＩＭ核酸には、例えばペプチドに見ることのでき るＴＡＥＮＴＩＴＹＳＥＬＬＫＨ、ＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨ等の、アミノ酸 配列ＩＴＹＳＬＬ又はＩＸＹＸＸＬを含むＩＴＩＭモチーフのための符号化配列 を含む。その他のＩＴＩＭ核酸分子は、例えばＶＴＹＡＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、Ｖ ＴＹＴＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬＹＴＥＬ、ＶＴＹＳＭＶ、ＶＴ ＹＴＴＬ、ＶＴＹＳＴＶ、ＶＩＹＳＤＬ、又はＩＴＹＡＥＬのようなＩＴＩＭペ プチド配列を含むＩＴＩＭペプチドを符号化するものである。 別の一実施例では、本発明の単離された核酸分子は、ここに説明するようにＰ ＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及び／又はＩＴＩＭ−ｐ７０を符号 化する核酸配列を含む。ＰＴＰ１Ｃ核酸分子には、（シェン他著、ネイチャー誌 ３５２：７３６−７３９、１９９１、マシューズ他著、分子細胞生物学１２：２ ３９６−２４０５、１９９２、及びプラッツキー他著、米国国家科学アカデミー 会報、８９：１１２３−１１２７、１９９２）開示されるようにアミノ酸配列を 有するＰＴＰ１Ｃたんぱく質又はそのミメトープの少なくとも一部分を符号化す る核酸配列を含めることができる。好適な実施例では、核酸は、ＰＴＰ１Ｃから ＩＴＩＭ−結合ＳＨ２部分を符号化する。 ＩＴＩＭペプチドを符号化する核酸分子の少なくとも一部分は、本発明のＩＴ ＩＭペプチドを生成すべく重要な構成部分（例えば支配要素）の少なくとも一部 分のために符号化を行うその他のいかなる配列とも共役的に結合させる（標準的 組換えＤＮＡ法を用いて）ことができる。この配列は、配列がイン−フレームで 転写されるよう結び付けられてもよく、これにより、チロシンホスファターゼを 含有するＳＨ２の活性を調節することのできる機能的ＩＴＩＭペプチドを生成す ることができる。 加えて、本ペプチドを符号化する核酸を用いて、融解たんぱく質を符号化する キメラ様の遺伝子を作ることができる。例えば、組換えにより生じたＩＴＩＭペ プチドをホスト細胞から分泌するよう命令する配列などの信号配列を符号化する 核酸配列を加えることができる。信号配列を符号化する核酸配列は、核酸分子の ５’端部（アミノ末端部）に（塩基対結合により）共有結合される。有用な信号 配列が当業において公知である（アーシュテッター他著（１９９２）遺伝子１１ ０：２５を参照のこと）。好適な信号又は先導部分はＦｃγＲ、ＣＤ２２、ＮＫ ＩＲｐ５８又はＬｙ４９に自然に結合した部分である。好適な膜内外部分はＦｃ γＲ、ＣＤ２２、ＮＫＩＲｐ５８又はＬｙ４９に自然に結合した部分を含む。 膜結合形態のＩＴＩＭペプチドを得るには、ペプチドをリピド含有標的分子又 は膜に定着させることのできる膜内外部分（移行停止配列を含む）を少なくとも 一部分、ペプチドに提供する、キメラ様の核酸配列を用いることができる。膜内 外部分を符号化する核酸配列は、本発明のＩＴＩＭペプチドを符号化する核酸分 子の５’又は３’端部のどちらか一方に（塩基対結合により）共役結合している 。膜内外部分をそのＮ−末端部に持つ本発明のペプチドを含む融解ポリペプチド を符号化するキメラ様核酸分子を用いて、膜で定着された形態のＩＴＩＭペプチ ドを提供することができ、このとき、問題のペプチドは細胞膜の細胞質表面に存 在することになる。あるいは、細胞膜の細胞外表面にペプチドを提供すべく、Ｉ ＴＩＭを符号化する核酸配列の３’端部にリゲートした膜内外配列を符号化する 核酸配列を提供するようなキメラ様遺伝子を構成することができる。さらに、信 号ペプチド及び／又は膜内外配列、並びにこのキメラ様遺伝子内のＩＴＩＭペプ チド配列に対するこれらの方向性を選択することで、当該ペプチドを細胞内の様 々な室に偏在させることが可能なことは明らかである。加えて、モチーフを定着 させるその他の膜を用いることで、例えばキメラ様ペプチドのプレニル化を指示 したり（例えばファルネシルトランスフェラーゼ又はゲラニルゲラニルトランス フェラーゼ認識配列を用いて）、ホスファチジルイノシトールのペプチドへの結 合を命令することが可能なことも明白であろう。 融解たんぱく質を用いて当該ペプチドの偏在を命令することに加えて、融解た んぱく質はペプチドの生成／精製を高めることができることは広く認識されてい る。例えば、融解部分を本発明の化合物の一部として含めると、生成時、保管時 、及び／又は使用時の化合物の安定性を高めることができる。さらに、本発明の 化合物の精製を容易にするための手段として融解部分に機能させることができ、 例えば得られた融解たんぱく質を親和クロマトグラフィーを用いて精製すること が可能となる。例えば、ＩＴＩＭペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ ラ ーゼ（ＧＳＴ）融解たんぱく質として生じさせることができる。このようなＧＳ Ｔ−融解たんぱく質は、例えばグルタチオン−誘導マトリックスを用いることで 当該ペプチドの精製を容易とすることができる（例えば、分子生物学の現在のプ ロトコル、編集オースベル他、（ニューヨーク、ジョンワイリー＆サンズ、１９ ９１）を参照のこと）。ＧＳＴ成分と当該ペプチドとの間に、例えばファクター Ｘ開裂部位などのたんぱく分解性の開裂部位を加えると、当該ペプチドの剥離が 可能となる。さらに別の実施例では、Ｎｉ²⁺金属樹脂を用いた親和クロマトグラ フィーによるポリ（Ｈｉｓ）−ペプチドの精製を可能とするために、例えばポリ −（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂部位の配列等、精製先導配列のための融解 遺伝子符号を、ペプチドのＮ−末端部での信号配列として用いることができる。 こうして次に精製先導配列をエンテロキナーゼを用いた処理により取り除くこと ができる（例えばホチュリ他著（１９８７）クロマトグラフィージャーナル４１ １：１７７、及びジャンクネヒト他著ＰＮＡＳ８８：８９７２を参照のこと）。 融合遺伝子を作る技術は公知である。基本的には、異なるポリペプチド配列に ついて様々なＤＮＡ細片符号を結び付けることは、リゲーションのためのブラン ト端又はスタガー端ターミニ、適切なターミニを提供するための制限酵素温浸、 該当する場合には付着端の充填、不要な結び付きを避けるためのアルカリホスフ ァターゼ処理、及び酵素リゲーションを用いた従来の技術によって行われている 。 あるいは、自動ＤＮＡ合成器を含む従来の技術によりキメラ様遺伝子を合成する ことができる。別の方法では、遺伝子細片のＰＣＲ増幅を二つの連続する遺伝子 細片の間に補助的懸垂を生じさせるアンカープライマを用いて行うことができ、 この二つの遺伝子細片を次に焼還してキメラ様遺伝子配列を生じさせることがで きる（例えば、分子生物学の現在のプロトコル、編集オースベル他、ジョンワイ リー＆サンズ、１９９２を参照のこと）。 場合によっては、融解たんぱく質のＩＴＩＭペプチド部分とその他の細片との 間に、未構造のポリペプチドリンカを導入することが必要となろう。このリンカ により、融解たんぱく質の柔軟性が容易に高められ、その結果、ＩＴＩＭペプチ ドが標的分子と自由に相互作用することができ、また二つの細片間の立体障害を 減らすことができ、さらに各細片が適切に折り畳まれる。このリンカは天然のも のでよく、例えばたんぱく質の二つの部分の間にランダムコイルとして存在する ことが確認された配列である。あるいは、リンカは合成のものでもよい。例えば 、配列（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃を合成未構造リンカとして用いることも可能である。 この種類のリンカは、ハストン他著（１９８８）ＰＮＡＳ８５：４８７９及び米 国特許第５，０９１，５１３号に述べられている。 本発明はさらに、ホスト細胞で発現可能なベクターに効果的に結び付けられた 本発明の化合物を符号化する核酸分子を含む組換え分子を含む。ここで用いられ るように、「効果的に結び付けられた」とは、核酸配列を、この配列が細胞中に 転移したときに発現可能なように発現ベクタに挿入することを言う。個々で用い られるように、「発現ベクタ」とは、ホスト細胞を転移させて、好ましくは細胞 内で複写している適した核酸分子を発現させることのできるＲＮＡ又はＤＮＡベ クタである。発現ベクタは原核性又は真核性のどちらでもよいが、通常はウィル ス又はプラスミドである。 所望の発現ベクタの構成は当業者に公知の方法で行うことができ、発現は真核 系又は原核系のどちらにおいて起きるものでもよい。適した原核系はバクテリア 菌株であり、このバクテリア菌株には大腸菌の多種の菌株、バチルス属の多種の 菌株又はシュードモナス属の多種の菌株が含まれるがこれらに限定されるもので はない。原核系では、複写部位と共にホスト細胞と適合性のある種から得た制御 配列を内包するプラスミドが用いられる。制御配列には、プロモータ、オペレー タ、エンハンサ、リボソーム結合部位、及びシャイン−ダルガーノ配列が含まれ るが、これらに限定されるものではない。真核性のホスト細胞で用いることので きる発現系は、適した真核性遺伝子から得たプロモータを含む。使用可能な哺乳 類におけるプロモータには、ＳＶ４９から初期又は後期のプロモータ、又はその 他のウィルス性プロモータ、例えばバクロウィルス、ポリオーマウィルス、アデ ノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス又は鳥肉腫ウィルスから得たものが含まれる。 本発明の発現ベクタには、本発明の組換え細胞中で機能する（つまり遺伝子発現 する）ベクタであればいかなるものも含まれ、その中には細菌性、酵母菌、その 他の菌類、昆虫、プラントママリアン細胞が含まれる。発現系は、当業者に公知 の方法を用いて本発明の核酸分子に効果的に結び付けられた上述の制御要素のい ずれからでも構成することができる（例えば前掲のサンブロック他著の文献を参 照のこと）。 本発明のホスト細胞は、本発明の化合物を自然に生成することができる細胞で あっても、又は、本発明の化合物を符号化する核酸分子をトラスフェクトされた ときに本発明の化合物を生成することのできる細胞であってもよい。本発明のホ スト細胞は、細菌細胞、菌の細胞、昆虫の細胞、植物及び哺乳類の細胞が含まれ るが、これらに限定されるものではない。より好適なホスト細胞にはエシェリキ ア属、バチルス属、サッカロミセス属、ＳＦ９及びショウジョウバエが含まれる 。 組換え細胞は好ましくは、ホスト細胞を、一つ又は複数の組換え分子で形質転 換することで作成するとよいが、この組換え分子は各々、一つ又はそれ以上の転 写制御配列を含んだ発現ベクタに効果的に結び付いた本発明による一つ又はそれ 以上の核酸分子を含むものである。本発明の組換え分子は、形質転換をしようと する細胞の核酸分子の発現を効果的に調節することのできる転写制御配列の少な くとも一つに効果的に結び付いた、前述の核酸分子を少なくとも一つ含むことの できる分子である。 当業者であれば、組換えＤＮＡ技術の利用により、例えばホスト細胞中の核酸 分子の複写物の数を操作することで、形質転換した核酸分子の発現が向上すると 共に、そのような核酸分子が転写される効率、及びその結果得た転写物が翻訳さ れる効率、並びに翻訳後の変更の効率が向上することが理解されよう。本発明の 核酸分子の発現を増加させるために用いることのできる組換え技術には、核酸分 子を高転写物数のプラスミドに効果的に結び付けるステップ、核酸分子を一つ又 はそれ以上のホスト細胞クロモゾームに統合するステップ、ベクタ安定性配列を プラスミドに加えるステップ、転写制御信号（例えばプロモータ、オペレータ、 エンハンサ）を置き換える又は変更するステップ、翻訳制御信号を置き換える又 は変更するステップ、本発明の核酸分子をホスト細胞の用いている符号に対応す るよう変更するステップ、転写を不安定にさせる配列を消去するステップ、そし て発酵中に組換え酵素生成物から組換え細胞成長を一時的に分離する制御信号の 使用、が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の発現した組換 えペプチドの活性は、このようなペプチドを符号化する核酸を細片化する、変更 する、又は誘導化することで向上させてもよい。 本発明によれば、本発明の組換え細胞を用いて本発明の化合物を作成すること ができるが、それには、このような細胞を、このような化合物を生じるのに効果 的な条件下で培養した後その化合物を回収する方法がある。本発明の化合物を作 成するのに効果的な条件には、適した媒体、バイオリアクタ、温度、ペーハ及び ペプチド生成を可能とする酸素条件が含まれるが、これらに限定されるものでは ない。適した媒体とは、その中で本発明の細胞が、培養されたときに本発明の化 合物を生成することのできるあらゆる媒体を言う。効果的な媒体は、典型的には 、同化可能な炭水化物、窒素及びリン酸塩源を適した塩、鉱物、金属、及び、そ の他の栄養素、例えばビタミンを含む水性の媒体である。媒体は複合栄養素を含 んでいてもよく、あるいは、規定された最小限の媒体であってもよい。媒体はま た、特定の組換え分子の発現を選択的に行わせる化学的試薬を含有していてもよ い。このような試薬には、ネオマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ク ロラムフェニコール及びミコフェノール酸が含まれるが、これらに限定されるも のではない。 生成に用いたベクタ及びホスト系に応じて、得られる本発明の化合物は、組換 え細胞内に留まるか、又は発酵媒体中に分泌されるか、二つの細胞膜の間の間隙 、例えば大腸菌のピロプラスマ間隙に分泌されるか、又は細胞又はウィルス膜の 外側表面に保持される。「化合物を回収する」という表現は単に、化合物を含ん だ発酵媒体全体を回収することを言い、必ずしも分離又は精製を行うステップが さらにあることを暗に言うものではない。本発明の化合物は様々な標準的たんぱ く質精製技術を用いて精製することができ、このような精製技術には、親和クロ マトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、フィルタ濾過、電気泳動法、疎水 性相互作用クロマトグラフィ、ゲルフィルタ濾過クロマトグラフィ、リバースフ ェイズクロマトグラフィ、コンカナバリンＡクロマトグラフィ、クロマトフォー カシング、較差可溶可法、及びイムノプレシピテーションがあるが、これらに限 定されるものではない。本発明の化合物は、好ましくは「ほぼ純粋な」形態で取 り出されるとよい。ここで用いられるように、「ほぼ純粋な」とは、本化合物を 治療用組成物として用いたり、検定システムに用いた場合に効果を出すことので き る純度を言う。本発明によるほぼ純粋な化合物であれば、例えば、細胞中でチロ シンホスファターゼを含有したＳＨ２部分の活性を、このような細胞にほぼ毒性 を呈することなく調節できるはずである。 組換えペプチドの源の提供に加えて、本出願の発現ベクタを用いて様々な遺伝 子治療用組成物を精製することができる。従って、当該ＩＴＩＭペプチドの発現 構造は、いかなる生物学的に効果的な担体、例えば、生体内で細胞を組換え遺伝 子に効果的にトランスフェクトすることのできる調合物又は組成物で投与しても よい。その方法には、当該遺伝子をウィルス性ベクタに挿入することが含まれる が、このウィルス性ベクタには、組換えレトロウィルス、アデノウィルス、アデ ノ関連性ウィルス、及び単純性疱疹ウィルス−１、あるいは組換えバクテリア又 は真核性プラスミドが含まれる。ウィルス性ベクタを用いて細胞を直接トランス フェクトすることができるが、プラスミドＤＮＡは、例えばカチオンのリポソー ム（リポフェクチン）又は誘導（例えば共役抗体）、ポリリシン共役、グラマシ ジンＳ、人工ウィルスのエンベロープ又はその他の細胞内担体の助けを得て、並 びに生体内で行われた遺伝子構成物又はＣａＰＯ₄沈殿物の直接注入の助けを得 て行うことができる。適した標的細胞の形質導入は遺伝子治療の重要な第一歩で あるから、特にどの遺伝子伝達システムを選択するかは、意図した標的の表現型 及び投与経路、例えば局所又は全身投与といった因子に左右されることが理解さ れよう。 当該たんぱく質の一つを符号化する核酸を細胞内へ生体内導入するための好適 なアプローチは、遺伝子生成物を符号化する核酸、例えばｃＤＮＡを含んだウィ ルス性ベクタの使用である。ウィルスベクタに対する細胞の感染は、標的とされ 多細胞が高い比率で核酸を受け取ることができるという利点がある。さらに、ウ ィルス性ベクタ内で、例えばそのウィルス性ベクタ内に含まれたｃＤＮＡにより 符号化された分子は、ウィルス性ベクタの核酸を取り込んだ細胞において効果的 に発現する。 レトロウィルスのベクタ及びアデノ関連性ウィルスのベクタは、外来性遺伝子 を生体内、特にヒトにおいて移行させる場合に選択すべき組換え遺伝子運搬シス テムであると広く理解されている。これらのベクタは遺伝子の細胞内への運搬を 効率的に行い、移行した核酸はポストの染色体ＤＮＡに安定的に統合される。レ トロウィルスを用いる場合の最も重要なことはその使用の安全性を確認すること 、特に、細胞母集団中で野生種のウィルスが拡散する可能性に関して確認するこ とである。複製−欠陥的レトロウィルスのみを生み出す専用の細胞種（「パッケ ージングセル」と呼ばれる）の開発により、遺伝子治療におけるレトロウィルス の利用度が高まってきたことと共に、欠陥レトロウィルスが、遺伝子治療を目的 とした遺伝子移行における使用に向けてよく特徴づけられている(確認にはミラ ー、エー．ディー．著（１９９０）血液７６：２７１を参照のこと)。このよう に、組換えレトロウィルスが構成されるときに、レトロウィルスの符号化配列（ ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）は当該ペプチドの一つを符号化する核酸により置き換 えられ、その結果そのレトロウィルスの複製は欠陥を有することとなる。複製の 欠陥レトロウィルスは次にウィリオンにパッケージングされ、このウィリオンに より、標準的技術を用いてヘルパーウィルスの使用を通じて標的細胞を感染させ ることができる。組換えレトロウィルスを生成するプロトコル、及び、生体外又 は生体内で細胞をこのようなウィルスに感染させるためのプロトコルは、分子生 物学における現在のプロトコル、オースベル他（編集）グリーンパブリッシング アソシエーツ、（１９８９）、セクション９．１０−９．１４及びその他の標準 的研究室用手引きに見ることができる。適したレトロウィルスの例には、当業者 によく知られるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭが含まれる。環境栄養性及 び両栄養性レトロウィルスシステムの両方を作成するのに適したパッケージング ウィルス種の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２及びΨＡｍが含まれる。レト ロウィルスを用いて多様な遺伝子が、生体外及び／又は生体内で、神経細胞、上 皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む数多くの異な る種類の細胞に導入されてきた（例えば、エグリティス他著（１９８５）サイエ ンス誌２３０：１３９５−１３９８、ダノス及びマリガン著（１９８８）米国国 家科学アカデミー会報、８５：６４６０−６４６４、ウィルソン他著（１９８８ ）米国国家科学アカデミー会報、８５：３０１４−３０１８、アーメンターノ他 著（１９９０）米国国家科学アカデミー会報、８７：６１４１−６１４５、フー バ他著（１９９１）米国国家科学アカデミー会報、８８：８０３９−８０４３、 フェリー他 著（１９９１）米国国家科学アカデミー会報、８８：８３７７−８３８１、チョ ードハリ他著（１９９１）サイエンス誌２５４：１８０２−１８０５、ファンボ イスシェム他著（１９９２）米国国家科学アカデミー会報、８９：７６４０−７ ６４４、ケイ他著（１９９２）ヒト遺伝子治療３：６４１−６４７、ダイ他著（ １９９２）米国国家科学アカデミー会報、８９：１０８９２−１０８９５、ユー 他著（１９９３）免疫学ジャーナル１５０：４１０４−４１１５、米国特許第４ ，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／ ０７１３６号、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５ ３４５号、及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３号を参照のこと）。 さらに、ウィルス粒子の表面上でウィルスパッケージングたんぱく質を変更す ることでレトロウィルスの感染スペクトル、ひいてはレトロウィルスをベースに したベクタの感染スペクトルを制限することができることが示されている（例え ば、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２５２３４号、ＷＯ９４／０６９２０号、及びＷＯ９ ４／１１５２４号を参照のこと）。例えばレトロウィルスベクタの感染スペクト ルを変更するための戦略には、細胞表面抗原に特異的な抗体をウィルスのｅｎｖ たんぱく質に結合する（ルー他著（１９８９）米国国家科学アカデミー会報、８ ６：９０７９−９０８３、ジュラン他著（１９９２）遺伝子ウィルス学ジャーナ ル７３：３２５１−３２５５、及びグード他著（１９８３）ウィルス学１６３： ２５１−２５４）、又は細胞表面リガンドをウィルスのｅｎｖたんぱく質に結合 する（ネダ他著（１９９１）生物化学ジャーナル２６６：１４１４３−１４１４ ６）ことが含まれる、結合は、たんぱく質又はその他の変種（例えばｅｎｖたん ぱく質をアシアログリコプロテインに変換するラクトース）を用いた化学的な交 差結合の形態を採ってもよく、また、融解たんぱく質（例えば単鎖抗体／ｅｎｖ 融解たんぱく質）を作成することで行ってもよい。この技術は、特定の組織種に 感染を制限するもしくは差し向けるために用いることができ、またこれを用いて 環境栄養性ベクタを両栄養性ベクタに変換することができる。 さらに、レトロウィルスによる遺伝子運搬の利用は、レトロウィルスベクタの 組換え遺伝子の発現を支配する、組織又は細胞に特定の転写調節配列を利用する ことで向上させることができる。 本発明に用いることのできるウィルス遺伝子運搬システムのもう一つのものは 、アデノウィルスから得たベクタを利用するものである。アデノウィルスのゲノ ムは、そのゲノムが問題の遺伝子生成物を符号化するが、通常の消散ウィルスラ イフサイクルにおいて複製を作る能力という点で下活性であるというように操作 することができる（例えばバークナ他著（１９８８）バイオ技術６：６１６、ロ ーゼンフェルド他著（１９９１）サイエンス誌２５２：４３１−４３４、及びロ ーゼンフェルド他著（１９９２）細胞６８：１４３−１５５を参照のこと）。ア デノウィルス菌株Ａｄ種５ｄｌ３２４又はアデノウィルスのその他の菌株（例え ばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等々）から得る適したアデノウィルスベクタは当業者 に公知である。組換えアデノウィルスは特定の場合において有利であるが、それ は、組換えアデノウィルスは非分裂性の細胞に感染することができ、また、気道 上皮（ローゼンフェルド他著（１９９２）上記の文献）、内皮（レマーチャンド 他著（１９９２）米国国家科学アカデミー会報、８９：６４８２−６４８６）、 肝細胞（ハーツ及びジェラルド著（１９９３）米国国家科学アカデミー会報、９ ０：２８１２−２８１６）及び筋細胞（クアンティン他著（１９９２）米国国家 科学アカデミー会報、８９：２５８１−２５８４）を含む幅広い細胞種を感染さ せるのに用いることができるからである。さらにこのウィルス粒子は比較的安定 しており、精製及び濃縮に向いており、また上述のように、感染性のスペクトル に影響を与えるような改変が可能である。さらに、導入されたアデノウィルスの ＤＮＡ（及びその中に含まれた異種のＤＮＡ）はホスト細胞のゲノムに統合され ずエピゾーム状を維持するため、導入されたＤＮＡがホストのゲノム（例えばレ トロウィルスのＤＮＡ）に統合された位置での挿入による突然変異誘発の結果引 き起こされる問題を避けることができる。さらに、アデノウィルスゲノムの異種 ＤＮＡを運ぶ能力は、その他の遺伝子運搬ベクタに比較して大きい（最大８キロ ベース）（上述のバークナ他著の文献、ハーアーマンド及びグラハム著（１９８ ６）ウィルス学ジャーナル５７：２６７）。現在使われている、よって本発明が 好適と見なす大部分の複製−欠陥的アデノウィルスベクタは、ウィルスＥ１及び Ｅ３遺伝子の全て又は一部について削除されるが、アデノウィルス遺伝子材料の ８０％をも保持する（例えば、ジョーンズ他著（１９７９）細胞１６：６８３、 バ ークナ他著、上述の文献、及びグラハム他著、分子生物学における方法、イー． ジェー．マレー編、（ニュージャージー州ハマナ、クリフトン１９９１）第７編 、１０９−１２７ページを参照のこと）。挿入されたＩＴＩＭ遺伝子の発現は、 例えばＥ１Ａプロモータ、大後期プロモータ（ＭＬＰ）及び関連する先導配列、 Ｅ３プロモータ、又は外因的に転化されたプロモータ配列にコントロールさせる ことができる。 当該ペプチド符号遺伝子の運搬に用いることのできるウィルスベクタシステム のさらにもう一つのものは、アデノ関連性ウィルス（ＡＡＶ）である。アデノ関 連性ウィルスは自然発生する欠陥ウィルスであり、効率的な複製及び生産的なラ イフサイクルのために、例えばアデノウィルス又はヘルペスウィルス等、他のウ ィルスをヘルパウィルスとして必要とするものである（確認にはムゼッカ他著、 ミクロ及び免疫学の細菌の話題(１９９２)１５８：９７−１２９を参照のこと） 。またこのウィルスは、そのＤＮＡを非分裂性の細胞に統合させる、そして安定 した統合を高い頻度で見せる数少ないウィルスの一つである（例えば、フロッテ 他著（１９９２）呼吸、細胞、分子生物学アメリカンジャーナル７：３４９−３ ５６、サムルスキ他著（１９８９）ウィルス学ジャーナル６３：３８２２−３８ ２８、及びマクローグリン他著（１９８９）ウィルス学ジャーナル６２：１９６ ３−１９７３）。 ＡＡＶのわずか３００個の塩基対を含んだベクタをパッケージして統合するこ とができる。外生ＤＮＡのための間隙は約４．５ｋｂに限られている。トラッチ ン他著（１９８５）分子細胞生物学５：３２５１−３２６０の述べるようなＡＡ Ｖベクタを用いてＤＮＡを細胞内に導入することができる。多様な核酸が様々な 細胞種にＡＡＶベクタを用いて導入されてきた（例えば、ハーモナット他著（１ ９８４）米国国家科学アカデミー会報、８１：６４６６−６４７０、トラッチン 他著（１９８５）分子細胞生物学４：２０７２−２０８１、ウォンディスフォー ド他著（１９８８）分子内分泌学２：３２−３９、トラッチン他著（１９８４） ウィルス学ジャーナル５１：６１１−６１９、及びフロッテ他著（１９９３）生 物化学ジャーナル２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。 遺伝治療用の用途があると考えられるその他のウィルスベクタのシステムは、 ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス、及びいくつかのＲＮＡウィルスから得 られてきた。特に、ヘルペスウィルスベクタは、中枢神経系及び眼組織の細胞中 に組換えＤＮＡを存続させるためのユニークな戦略を提供すると考えられる（ペ ポーズ他著（１９９４）眼結石力科学の調査３５：２６６２−２６６６）。 ウィルス移行法に加え、上述のような非ウィルス法を用いても、動物の組織中 で組換えＩＴＩＭを発現させることができる。遺伝子移行の非ウィルス法の大部 分は、哺乳類の細胞がその取り込みに用いている通常のメカニズム、そしてマク ロ分子の細胞内輸送に頼るものである。好適な実施例では、本発明の非ウィルス 経由遺伝子運搬は、標的細胞のペプチド符号化細胞の取り込みのための貪食経路 に依存している。この種の代表的な遺伝子運搬システムには、リポソーム誘導シ ステム、ポリ−リシン共役、及び人工ウィルスエンベロープが含まれる。 代表的実施例では、ＩＴＩＭペプチドを符号化する遺伝子は、表面に正電荷を 持つリポソーム（例えばリポフェクチン）及び（選択的に）標的組織の細胞表面 抗原に対する抗体の標識を付したリポソームに捕捉させることができる（ミズノ 他著（１９９２）脳神経外科２０：５４７−５５１、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０６ ３０９、日本特許出願第１０４７３８１号、及びヨーロッパ特許公報ＥＰ−Ａ− ４３０７５号）。例えば、リンパ腫細胞のリポフェクションは、リンパ腫関連性 抗原に対する単クローン抗体の標識を付したリポソームを用いて行うことができ る。リポソーム運搬法はまた、小型のペプチド及び、たんぱく質までも細胞に直 接送ることのできる方法としてよく知られており、ＩＴＩＭペプチド及び擬態を 直接運搬するのに利用可能な方法である。 さらに別の提示の実施例では、遺伝子運搬システムは、ポリ−リシン等の遺伝 子結合物質に交差結合した抗体又は細胞表面リガンドを含む（例えば、ＰＣＴ公 報ＷＯ９３／０４７０１号、ＷＯ９２／２２６３５号、ＷＯ９２／２０３１６号 、ＷＯ９２／１９７４９号、及びＷＯ９２／０６１８０号を参照のこと）。例え ば、当該ペプチド遺伝子構造を用いて、例えばポリ−リシンなど、ポリカチオン に共役のアシアログリコプロテインを含む可溶性ポリヌクレオチド担体を用いる ことで、生体内で肝細胞をトランスフェクトすることができる。（米国特許第５ ，１６６，３２０号を参照のこと）。さらに、貪食を介した当該核酸構成のこの 効果 的な運搬は、そのエンドソーム構造からの遺伝子の脱出を高める物質を用いれば さらに向上することが理解されるであろう。例えば、インフルエンザＨＡ遺伝子 生成物のアデノウィルス又はフソジェニックペプチド全体を、この運搬システム の一部として用いＤＮＡ含有エンドソームの効率的な分裂を引き起こすことがで きる（マリガン他著(１９９３)サイエンス誌２６０−９２６、ワグナー他著(１ ９９２)米国国家科学アカデミー会報、８９：７９３４、及びクリスチアーノ他 著（１９９３）米国国家科学アカデミー会報９０：２１２２）。 臨床の実際では、この遺伝子運搬システムは数ある方法のうちいかなる方法を 用いても被験者に導入することができ、その方法は各々、当分野でよく知られて いる。例えば、本遺伝子運搬システムの医療用調剤は、例えば静脈内注射などに より全身的に導入することができ、標的細胞内への本構成物の特定的形質導入は 、主に、トランスフェクションの特異性から起きるが、この特異性は、遺伝子運 搬ビヒクル、遺伝子の発現を支配する転写調節配列による、細胞型又は組織型発 現、及びこれらの組合せが提供するものである。別の実施例では、組換え遺伝子 の最初の運搬は動物への導入という点でより制限されており、かなり局所的にな っている。例えば、遺伝子運搬ビヒクルはカテーテル（米国特許第５，３２８， ４７０号）又は定位注射（例えばチェン他著（１９９４）米国国家科学アカデミ ー会報、９１：３０５４−３０５７）で導入することができる。 本発明の別の態様は、ＩＴＩＭ依存性信号形質導入経路を調整することのでき る化合物を判別するよう構成された多種の薬品スクリーニング検定に関するもの である。化合物及び自然抽出物のライブラリを検査する数多くの薬品スクリーニ ングプログラムの中で、高処理量の検定が、所定時間内に最大数の化合物を調べ るには好ましい。無細胞システム、例えば精製又は準精製たんぱく質から得るよ うなシステムで行われる検定は、「主要な」スクリーニングとしてしばしば好ま れるが、それは、これらの検定が、テスト化合物が仲介する標的分子内の変化を 早く進行させ、かつその変化を比較的容易に検出することができるように作成す ることが可能だからである。さらに、この生体外システムでは、テスト化合物の 細胞内毒性作用及び／又は生物学的利用能をほとんど無視することができ、その 代わりにこの検定は、薬品の標的分子に対する作用を、例えば多種の信号形質導 入たんぱく質の結合親和性における変化を表すものとして注目するものである。 ＩＴＩＭ／ＴＰＴ１Ｃの相互作用を以下に分かりやすくするために説明するが 、ここで述べるその他の相互作用、例えばＩＴＩＭ／ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ／ｐ １６０、ＩＴＩＭ／ｐ７０、及びＰＴＰ１Ｃ／ＣＤ１９間の相互作用はそれぞれ 、治療用標的として可能性があり、従って以下に述べる薬品スクリーニング検定 に類似であると考えられることは明白であろう。 本発明のスクリーニング検定の一例では、当該化合物は、単離かつ精製したポ リペプチドに接触させるが、このポリペプチドは通常、ＩＴＩＭポリペプチド配 列に結合することができる。このように、本化合物とＰＴＰ１Ｃポリペプチドと の混合物に対して、次にＩＴＩＭポリペプチドを含有する組成物を加える。この ＩＴＩＭは短いペプチドの形態でもよく、又は、ＦｃγＲＩＩＢＩのサイトプラ スミドコマイン等、ＩＴＩＭ配列を含んだたんぱく質のより大型の可溶性部分で もよい。ＩＴＩＭ／ＰＴＰ１Ｃ複合体の検出及び定量化により、ＩＴＩＭとＰＴ Ｐ１Ｃポリペプチドの間に複合体が形成されるのを抑制した（又は強めた）とき の本化合物の効験を判断する手段が提供されることになる。この化合物の効験は 、様々な濃度のテスト化合物を用いて得たデータから適用量反応曲線を作成する ことで評価することができる。さらに制御検定を行うことで比較のための基線を 生むことができる。この制御検定では、単離かつ精製したＩＴＩＭを、ＰＴＰ１ Ｃたんぱく質を含有する組成物に加えて、形成されたＩＴＩＭ／ＰＴＰ１Ｃ複合 体を、テスト化合物のない状態で定量化する。一般的には、反応物を混合する順 序は変更可能であり、同時に混合してもよいことは理解されるであろう。 標的ＰＴＰ１ＣポリペプチドとＩＴＩＭポリペプチドとの間の複合体形成は、 様々な技術により検出してもよい。例えば、複合体の形成状態の変化は、例えば 放射性標識（例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、又は³Ｈ）、蛍光標識（例えばＦＩＴ Ｃ）、又は酵素標識を付されたＰＴＰ１Ｃ又はＩＴＩＭポリペプチド等、検出可 能に標識を付されたたんぱく質を用いて、免疫検定又はクロマトグラフィ検出法 により定量化することができる。酵素標識を付されたＰＴＰ１Ｃの使用は、単離 したＳＨ２部分などの、酵素的に不活性なホスファターゼ部分を用いた場合にの み使用されることはもちろんであるが、それは、このたんぱく質が測定可能な 本来の活性を有する可能性があり、その活性がここで述べるように検出されるこ とがあるからである。 典型的には、検定の自動化に対応するためと同様、このたんぱく質の一方又は 両方の未複合形からＰＴＰ１Ｃ／ＩＴＩＭ複合体を容易に切り離すためには、Ｐ ＴＰ１Ｃ又はＩＴＩＭポリペプチドのどちらかを非可動化することが好ましいで あろう。ＩＴＩＭのＰＴＰ１Ｃへの結合は、候補物質のあるなしに関係なく、反 応体を含有するのに適した容物であればいかなるものでも達成される。その例に は、マイクロタイタ皿、試験管、及びマイクロ遠心管が含まれる。一実施例では 、たんぱく質のマトリックスへの結合を可能とする部分を加える融解たんぱく質 を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｐ ＴＰ１Ｃ（ＧＳＴ／ＰＴＰ１Ｃ）融解たんぱく質を、グルタチオンセファロース ビーズ（シグマケミカル社製、ミズーリ州セントルイス）又はグルタチオン誘導 マイクロタイタ皿に吸収させ、これを次にＩＴＩＭポリペプチド、例えば³⁵Ｓで 標識付けしたＩＴＩＭポリペプチドと、テスト化合物とに組合せ、この混合物を 、複合体形成を導く条件下、例えば塩及びペーハから見た生理学的条件、しかし ながら例えば０．６ＭのＮａＣｌ又は０．１％のトリトンＸ−１００等の洗浄剤 を含んだ緩衝液中で摂氏４度という条件など、わずかにより厳しい条件が好まし いであろうが、そのような条件下でインキュベートする。インギューベートの後 、このビーズを洗浄して未結合のＩＴＩＭポリペプチドを除去し、非可動化した マトリックスの放射性標識を直接判定する（例えばきらきら光るビーズ）か、又 は、ＰＴＰ１Ｃ／ＩＴＩＭ複合体を次に解離させた上澄みで判定する。あるいは 、この複合体をマトリックスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離すると、ビ ーズ細片中に見られるＩＴＩＭポリペプチドを、付属の例に説明するような標準 的な電気泳動を用いてそのゲルから定量化することができる。 マトリックス上にたんぱく質を非可動化するその他の技術も当該検定に用いる ことができる。例えば、ＰＴＰ１Ｃ又はＩＴＩＭたんぱく質のどちらも、ビオチ ン及びストレプタビジンの共役を用いて非可動化することができる。例えばビオ チニル化したＰＴＰ１Ｃ分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシン イミド）から、当業において公知の技術（例えばビオチニル化器具、ピアスケミ カル社製、イリノイ州ロックフォード）を用いて生成し、ストレプタビジン被覆 した９６ウェルプレート（ピアスケミカル社製）の溜め中で非可動化することが できる。あるいは、ＰＴＰ１Ｃに対して反応性、しかしＩＴＩＭの結合を妨げる ことのない抗体をこのプレートの溜めに誘導し、ＰＴＰ１Ｃを抗体共役によりこ の溜め中に捕捉してもよい。上述のように、ＩＴＩＭポリペプチド及びテスト化 合物の調剤を、ＰＴＰ１Ｃを提供するプレートの溜め中でインキュベートすると 、この溜め中に捕捉されたＰＴＰ１Ｃ／ＩＴＩＭ複合体の量を定量化することが できる。このような複合体を検出する方法の例には、ＧＳＴで非可動化される複 合体に関して上述したものに加えて、ＩＴＩＭポリペプチドに対して反応性を有 する抗体、又はＰＴＰ１Ｃに対して反応性を有し、ＩＴＩＭポリペプチドとの結 合をめぐって競合する抗体を用いた、複合体の免疫検出、並びにＩＴＩＭポリペ プチドに関連した外因性の酵素活性を検出することに依拠する酵素結合検定が含 まれる。後者の場合、酵素を化学的に共役するか、又は、ＩＴＩＭポリペプチド との融解たんぱく質として提供することができる。分かりやすく言えば、ＩＴＩ Ｍポリペプチドをワサビペルオキシダーゼと化学的に交差結合させるか又は遺伝 子的に融合させて、その複合体に捕捉されたＩＴＩＭポリペプチド量を、その酵 素の色素産生基質、例えば、３，３’−ジアミノ−ベンザジンテトラヒドロクロ ライド又は４−クロロ−１−ナフトールを用いて評価することができる。同様に 、ＩＴＩＭポリペプチド及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融解 たんぱく質を提供することができ、形成された複合物を、１−クロロ−ジニトロ ベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することで定量化することができる（ハビグ 他著（１９７４）生物化学ジャーナル２４９：７１３０）。 複合体中に捕捉されたたんぱく質の一つを定量化するために免疫検定に依拠す るプロセスにはたんぱく質に対する抗体、例えば抗ＩＴＩＭ又は抗ＰＴＰ１Ｃ抗 体を用いることができる。あるいは、複合体中で検出しようとするたんぱく質を 「エピトープの標識付け」して融解たんぱく質とすることができ、この融解たん ぱく質は、ＩＴＩＭポリペプチド又はＰＴＰ１Ｃ配列に加えて、第二のポリペプ チドを含むものであり、この第二のポリペプチドに対する抗体は容易に入手でき る（例えば市販のものなど）。例えば、上述のＧＳＴ融解たんぱく質を用いても 、 ＧＳＴ成分に対する抗体を用いて結合を定量化することが可能である。利用可能 なその他のエピトープの標識には、ｃ−ｍｙｃから１０−残分配列を含むｍｙｃ −エピトープ（例えば、エリソン他著（１９９１）生物化学ジャーナル２６６： ２１１５０−２１１５７を参照のこと）や、ｐＦＬＡＧシステム（インタナショ ナルバイオテクノロジーズ社製）又はｐＥＺＺ−たんぱく質Ａシステム（ファー マシア社製、ニュージャージー州）が含まれる。 さらに別の実施例では、本発明のポリペプチドは、チオレドキシンキメラ様た んぱく質の一部として配置することができ、このチオレドキシンを標的たんぱく 質に結合するよう命令する外因性ペプチドの能力を、候補物質のある状態及びな い状態で評価することができる。説明すると、大腸菌チオレドキシン（ｔｒｘＡ ）たんぱく質の変更版をより大型の担体たんぱく質として用いることができる（ ラバリー他著、バイオテクノロジ１１：１８７−１９３、１９９３）。ｔｒｘＡ の結晶構造（〜１２ｋＤ）から、このたんぱく質が、大変小型でありながら、グ リシン３３及びプロリン３４を含む活性部分域が突出するループを形成している ことが分かる。Ｇｌｙ３３とＰｒｏ３４との間に突出するループに挿入されたペ プチドが、ｔｒｘＡの表面に提示されるであろう。例えば、このループに挿入さ れたたんぱく質発現ペプチドを用いて、抗ペプチド単クローン性抗体の生成に成 功してきた。このようなペプチドループは、挿入されたペプチドがその酵素（Ｄ ＤＤＫ）の認識部位を有する場合、エンテロペプチダーゼに消化させることがで きる。さらに、ｔｒｘＡ担体たんぱく質はその他にも好ましい特徴を有する。第 一に、Ｓ．セレビジ細胞中のｔｒｘＡの過発現はそれらの成長に否定的作用を及 ぼすことがない。第二に、不溶性ペプチドのｔｒｘＡたんぱく質への融解は、こ れらのたんぱく質が大腸菌中で可溶性のまま保たれることを助ける。第三に、ｔ ｒｘＡ融解たんぱく質は大腸菌の細胞質膜の内側周辺に偏在するため、浸透によ る衝撃で容易に放出させることができる。最後に、実際上重要な点だが、グリシ ン３３及びプロリン３４を符号化するＤＮＡ中に独特なＲｓｒＩＩ制限部位が存 在ことにより、ペプチドを容易に挿入することができる。 例示の実施例では、ＩＴＩＭポリペプチドはチオレドキシンの活性部位ループ に提供することができ、この分子のＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄに結合する能力を 評価することができる。さらに、このような構成物を用いることで、関連するＩ ＴＩＭの組合せライブラリを作ることができ、これらのライブラリをスクリーニ ングして標的分子に結合する能力を保持する変異体を判別することができる。 上記のチオレドキシンキメラ、及びそれに類似の構成物は、直接の無細胞結合 検定に用いることができる。あるいは、これらを用いて、米国特許第５，２８３ ，３１７号、ザーボス他著（１９９３）細胞７２：２２３−２３２、マヅラ他著 （１９９３）生物化学ジャーナル２６８：１２０４６−１２０５４、バーテル他 著（１９９３）バイオ技術１４：９２０−９２４、及びイワブチ他著（１９９３ ）腫瘍遺伝子８：１６９３−１６９６が述べるようなシステムを利用して相互作 用トラップ検定（ＩＴＳ）を作成することができる。無細胞結合検定と同様、Ｉ ＴＳ検定は、例えばＰＴＰ１Ｃ等の標的たんぱく質に対するＩＴＩＭペプチドの 結合を破壊する物質を検出するのに用いることができる。 相互作用トラップ検定は、二つの別々の融解たんぱく質から機能的転写アクチ ベータたんぱく質を生体内で再形成することに依拠するものであるが、この二つ の融解たんぱく質のうち一つは、チオレドキシン／ＩＴＩＭキメラ等、チオレド キシンキメラに融解する転写アクチベータのＤＮＡ結合部分を含むものである。 二番目の融解たんぱく質は、例えばＰＴＰ１Ｃポリペプチド、好ましくは触媒的 に不活性の突然変異体に融解した転写活性化部分（例えばＲＮＡポリメラーゼの 転写を開始させることのできる）を含むものである。各融解たんぱく質のＩＴＩ Ｍ及びＰＴＰ１Ｃ部分が相互作用すると、転写アクチベータたんぱく質の二つの 部分が充分接近してレポータ遺伝子の転写を引き起こす。レポータの転写レベル を検出すれば、ＰＴＰ１ＣがＩＴＩＭに結合するのを抑制する（又は強める）テ スト物質の能力を評価することができる。 例示の実施例では、サッカロミセス属セレビジＹＰＢ２細胞は、ＧＡＬ４ｄｂ −チオレドキシン／ＩＴＩＭ融解を符号化するプラスミド、及び、ＰＴＰ１Ｃの 調節部分に融解したＧＡＬ４ａｄ部分を符号化するプラスミドで同時に形質変換 される。さらに、この菌株の形質変換は、その結果、ＧＡＬ４−反応性プロモー タが表現型のマーカの発現が促されるように行われる。例えば、ヒスチジンのな いところでの成長能力はＨＩＳ３遺伝子の発現に左右される。ＨＩＳ３遺伝子が ＧＡＬ４−反応性プロモータの支配下にある場合は、この栄養素要求性の表現型 が浮き上がることは、機能的ＧＡＬ４アクチベータがＩＴＩＭとＰＴＰ１Ｃたん ぱく質との相互作用により再形成されたことを示すものである。このように、Ｐ ＴＰ１ＣがＩＴＩＭと相互作用することを抑制できるテスト物質により、ヒスチ ジンのないところでは成長の不可能な酵母菌細胞が導かれるであろう。あるいは 、表現型マーカ（例えばＨＩＳ３遺伝子の代わりに）は、発現したときに否定的 選択をさせるもの（例えば細胞毒性の）でもよく、その場合は、ＩＴＩＭ／ＰＴ Ｐ１Ｃ相互作用を崩壊させる物質は、細胞に肯定的な成長選択をさせる。 さらに、上記検定は、特異性を調べるためにＩＴＩＭモチーフの結合に二つの 異なる標的を可能にした較差スクリーニングに向けて作成することができること は明白であろう。 さらに別の実施例では、本検定は、当該ＩＴＩＭペプチドの一つの相互作用性 を有する形質導入たんぱく質の酵素的活性に対するテスト物質の作用を評価する ものである。例示の実施例では、このような器具は、（１）チロシンホスファタ ーゼ、（２）チロシンホスファターゼの活性を刺激することのできる、本発明の 化合物、及び（３）チロシンホスファターゼの活性を計測する手段を含む。例え ばこの器具にチロシンホスファターゼで変更され得る主要標的分子と、このよう な改変を検出する手段とを追加して抑制化合物を判別することは、当業者の技術 の範囲内である。チロシンホスファターゼの活性は、例えば主要標的分子の脱リ ン酸化又は変更を計測する、又は、ホスファターゼによるそれらのリン酸化した 細片を計測することで計測可能である。合成基質は、例えばｐ−ニトロフェニル ホスフェート、３，０−メチル−１−フルオロセインモノホスフェート又はフル オロセインジホスフェートが公知である。 本発明の別の態様は、造血細胞機能を調節可能な化合物を判別する方法を含み 、この方法は、（１）ＰＴＰ１Ｃの酵素活性を維持するのに適した条件下で推定 上の調節試薬をＰＴＰ１Ｃに接触させるステップ、及び（２）接触ステップ後、 ＰＴＰ１Ｃの活性を判定することで、その化合物が造血細胞機能を調節できるか どうかを判定するステップを含む。ある一実施例では、この方法は、（１）適し た緩衝液及びリン酸化Ｆｙｎペプチドを含んだ容器内で推定上の調節化合物をＰ Ｔ Ｐ１Ｃと接触させ、（２）Ｆｙｎペプチドからの［³²Ｐ］の剥離を測定する、こ とで生体外で行われる。別の実施例では、この方法は、（ａ）ＰＴＰ１Ｃ、膜結 合免疫グロブリン及び膜結合Ｆｃレセプタを有するＢ細胞を推定上の調節化合物 と接触させ、（ｂ）その細胞を、膜結合免疫グロブリンと膜結合Ｆｃレセプタと をコリゲートすることのできる抗体に接触させ、（ｃ）細胞を溶解させ、（ｄ） 細胞内分子のリン酸化状態を判定する、ことで細胞をベースとした検定で行われ る。リン酸化を測定するのに適した細胞内分子には、ＣＤ１９、Ｓｙｋ、Ｌｙｎ 、Ｆｙｎ、ＰＩ−３キナーゼ、Ｉｇα、Ｉｇβ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、 ＦｃγＲＩＩＡ、Ｓｈｃ及び／又はＰＬＣγが含まれるが、これらに限定される ものではない。 細胞をベースとした検定の別の実施例では、この方法は、（ａ）ＰＴＰ１Ｃ及 び膜結合Ｆｃレセプタを有する好塩基球を推定上の調節化合物と接触させ、(ｂ) 細胞表面上の活性化及び抑制レセプタ、例えばＢＣＲ、及びＦｃγＲ又はＣｄ１ ６及びＮＫＩＲｐ５９又はＬｙ４９をコリゲートし、(ｃ)細胞を溶解させ、(ｄ) 細胞内分子のリン酸化状態を判定する、ことで行われる。リン酸化を測定するの に適した細胞内分子には、ＰＩ−３キナーゼ、ＦｃεＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩ及 び／又はＰＬＣγが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明によ れば、細胞内分子のリン酸化状態を検出する方法にはＥＬＩＳＡ検定又はＦＡＣ Ｓ分析が含まれる。好ましくは、溶解した細胞を、ＥＬＩＳＡプレートに結合し た細胞内分子に特異的な抗体に接触させられるとよい。このプレートを洗浄した 後、検出可能な標識（例えばフルオロセイン、放射性同位体又はアルカリホスフ ァターゼ）で結合された抗−ホスフォチロシン抗体と接触させることができる。 ＥＬＩＳＡプレートに結合した抗ホスフォチロシン抗体の量を測定して、推定上 の調節化合物による細胞内分子のリン酸化又は脱リン酸化の程度を調べることが できる。 本発明の別の態様は、異常な造血細胞機能の治療法を判別する方法を含み、そ の方法は、（１）被験者から好塩基球を単離し、（２）その好塩基球を、Ｆａｂ ’ＩｇＧ抗体及び全ＩｇＧ抗体を含むリガンドに接触させ、（３）リガンド接触 ステップ後の好塩基球内のＰＴＰ１Ｃ活性を調べることで異常な造血細胞機能を 診 断する、ことを含む。好ましくは、本方法で用いる好塩基球はヒトの被験者から 単離するとよい。 本発明の別の態様は、細胞をベースとした検定を用いて信号形質導入を調節す ることのできる化合物を判別する方法を含む。ある実施例では、信号形質導入を 調整（活性化又は抑制のいずれか）可能な化合物を判別するのに有用な、本発明 による細胞をベースとした検定は、（ａ）化合物が細胞内に進入可能な態様で細 胞をテスト化合物に接触させるステップと、（ｂ）化合物及び細胞をインキュベ ートしてその化合物を適した細胞内分子と結合させると共に、選択に応じて、細 胞表面分子を凝集させるステップと、（ｃ）細胞を溶解するステップと、（ｄ） 化合物に結合した細胞内分子のリン酸化状態を判断するステップとを含む。適し た細胞には哺乳類の細胞が含まれるがこれに限定されるものではない。適した細 胞内分子には、ｓｒｃ−族チロシンキナーゼ、特にＣｄ１９、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、 Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、及びＺａｐ７０が 含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞内分子のリン酸化状態を検 出する方法には、ＥＬＩＳＡ検定又はＦＡＣＳ分析が含まれる。好ましくは、溶 解した細胞を、ＥＬＩＳＡプレートに結合した細胞内分子に特異的な抗体に接触 させられるとよい。このプレートを洗浄した後、上に詳述した標識で結合された 抗−ホスフォチロシン抗体と接触させることができる。ＥＬＩＳＡプレートに結 合した抗ホスフォチロシン抗体の量を測定して、推定上の刺激化合物による細胞 内分子のリン酸化の程度ひいては刺激の程度を調べることができる。細胞内分子 のリン酸化状態を調べる別の方法には、細胞内分子に特異的な抗体を、溶解した 細胞に、溶液中で接触させることが含まれる。抗ホスフォチロシン抗体をそのよ う域に加えてＦＡＣＳ分析法により分析することが可能である。抗ホスフォチロ シン抗体には蛍光標識を付したり、又は標識を有する第二抗体をその溶液に加え てもよい。 さらに別の実施例では、本発明による細胞をベースとした検定には、（ａ）細 胞を推定上の抑制化合物と接触させるステップと、（ｂ）その化合物を細胞と共 にインキュベートして化合物を細胞内分子に結合させるステップと、（ｃ）膜結 合レセプタを細胞表面上にリゲートするステップと、（ｄ）細胞内のカルシウム 可動化を抑制する推定上抑制分子の能力を判断するステップと、を含めることが できる。適した細胞には哺乳類の細胞が含まれるが、これに限定されるものでは ない。適した推定上の調節分子には、本発明のＳｙｋ選択性、Ｓｈｃ選択性、又 はＰＩ−３Ｋ選択性ペプチドのミメトープが含まれる。カルシウムの可動性は、 ジャストメント他著、免疫学ジャーナル１４３：８８１−８８６、１９８９が概 ね述べた方法を用いて測定することができる。 さらに別の実施例では、本発明の細胞をベースとした検定には、（ａ）細胞を 推定上の抑制化合物と接触させるステップと、（ｂ）その化合物を細胞と共にイ ンキュベートして化合物を細胞内分子に結合させるステップと、（ｃ）膜結合レ セプタを細胞表面上にリゲートするステップと、（ｄ）細胞内でのリン酸化ホス ホイノシチドの形成を抑制する推定上の抑制分子の能力を判断するステップと、 を含めることができる。適した細胞には哺乳類の細胞が含まれるが、これに限定 されるものではない。リン酸化ホスホイノシチドの形成は、ランソム他（免疫学 ジャーナル１３７：７０８−７１５、１９８６）が概ね述べた方法を用いて測定 することができる。 好適な実施例では、本発明の細胞をベースとした検定で用いられる細胞は、推 定上抑制化合物と接触させる前に透過性化される。本発明の検定で細胞を透過性 とするのに用いる技術は当業において公知である。 本発明はまた、ＩＴＩＭで活性化されるＰＴＰの、例えばＩＴＩＭ配列に関連 した相互作用など、ここに述べる様々な相互作用を抑制するまたは強めることの できる物質を判別する方法及び器具を提供するものである。これらの検定は、簡 単な競合結合検定法から、全細胞システム内の細胞内信号形質導入の調整を検出 する検定までの範囲にわたる。 例として器具は、（１）ＰＴＰ１Ｃたんぱく質、（２）ＰＴＰ１Ｃによる脱リ ン酸化の可能な基質、（３）基質の脱リン酸化を検出する手段、及び（４）ＰＴ Ｐ１Ｃの活性を変える推定上調節化合物の能力が、検出手段により調べられるこ と、を含む。例えばこの器具に適した緩衝液を加え、この緩衝液中で脱リン酸化 検定を行うなど、調節化合物を判別すべく本発明の器具に変更を加えることは、 当業者の技術の範囲内である。本発明の器具と共に用いるのに適した基質には、 リン酸化物、ＣＤ１９、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｓｙｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂ ｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、Ｚａｐ７０、Ｉｇα、Ｉｇβ、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲ Ｉγ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＣＤ３ε、ＴＣＲ−ｚｅｔａ、Ｓｈｃ、Ｐ１３キナーゼ 、及び／又はＰＬＣγが含まれる。本発明の器具に有用な、脱リン酸化を検出す る適した手段には、例５に概ね述べる検出方法が含まれる。 本発明はまた、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０又はＩＴＩＭ− ｐ７０に選択的に結合することのできる抗体を含む。結合は当業者に公知の様々 な方法を用いて測定することができるが、その方法には、イムノブロット検定、 免疫沈降検定、酵素免疫検定（例えばＥＬＩＳＡ）、放射性免疫検定、免疫蛍光 抗体検定および免疫電子顕微鏡法が含まれる。例えば前述のサンブルック他著の 文献を参照されたい。 本発明の抗体は、多クローン性又は単クローン性抗体のいずれでもよい。本発 明の抗体には、機能的同等物、例えば、抗体細片及び、単鎖抗体を含む遺伝子操 作抗体で、その抗体を得るために用いるたんぱく質又はミメトープの少なくとも 一つのエピトープに選択的に結合可能なものが含まれる。好適な抗体は、ＩＴＩ Ｍ−ｐ１６０又はＩＴＩＭ−ｐ７０ あるいは、全長ＩＴＩＭ−ｐ１６０又はＩ ＴＩＭ−ｐ７０を符号化する核酸分子から生じた融解たんぱく質の一部、あるい はそのミメトープの一部を含むペプチドに反応して生じるとよい。 本発明のさらに別の態様は、様々な造血異常の治療及び／又は予防における、 上述の調節化合物の使用に関するものである。 免疫反応の発現には、細胞外信号による免疫細胞の活性化が必要である。リン パ球抗原レセプタの場合、抗原の認識の結果、細胞内たんぱく質チロシンキナー ゼ、特にＳｒｃ族キナーゼに属するものが、ＺＡＰ−７０／ｓｙｋキナーゼと共 に活性化し、チロシンのリン酸化が進む。例えば、ＴＣＲ又はＢＣＲを経由した 信号形質導入により、ＴＣＲＣＤ３／ζ鎖複合体又はＢＣＲのａ及びｂ鎖の細胞 質部分内の臨界チロシンのリン酸化が起こる。この臨界チロシンはＩＴＡＭ配列 内に位置している。加えて、ホスフォイノシチド（ＰＩ）の加水分解が開始し、 それにより細胞質遊離カルシウムが上昇してＢ細胞の増殖、分化、及び抗体分泌 が起きる（ダンブロシオ他著（１９９５）サイエンス誌２６８：２９３）。 たんぱく質チロシンキナーゼの活性化は、数多くのことなるレセプタ種が刺激 を受けたときに発生する。リン酸化の上昇が招く可能性のある結果の一つとして 、基質の活性化状態の変更がある。リン酸化により、信号形質導入経路における 上流又は下流要素とのたんぱく質の相互作用が変化することもある。例えば、多 数のサイトソルのシグナリング分子で見られるｓｒｃ同族体２（ＳＨ２）部分は 、チロシン−リン酸化たんぱく質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）との直接的な相 互作用を仲介する（ソンヤン及びカントレー（１９９５）ＴＩＢＳ２０：４７０ ）。このＳＨ２部分は、約１００アミノ酸から成る球状部分であり、ホスフォペ プチドのホスフォチロシン成分を直接結合するポケットを有する。ＳＨ２部分は 二つのクラスに分類することのできる幅広い範囲の分子について明らかになって いる。一方のクラスは、機能的又は酵素的部分を含むたんぱく質、例えばｓｒｃ 族のチロシンキナーゼ、ホスフォリパーゼＣγ、ＧＴＰａｓｅ活性化たんぱく質 、二つのたんぱく質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄ）、転 写ファクタＩＳＧＦ−３、及び推定上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換器、Ｖａｖ、を含む クラスである。もう一方のクラスのたんばく質は、触媒部分が何ら不明であり、 ほとんどＳＨ２及びＳＨ３部分のみから構成されるたんぱく質である。このグル ープには、Ｃｒｋ、ＧＲＢ２、及びＮｃｋが含まれる。これらのたんぱく質の中 には、変換器分子を下流の効果器分子に結び付けるアダプタとして機能するもの があるようである（リー他著（１９９４）分子細胞生物学１４：５０９）。 多くの異なるレセプタもまた、ＰＩ１３キナーゼを活性化させることとなる。 ＰＩ１３キナーゼがＳＨ２部分に結合すると、ＰＬＣγの細胞膜への転座や活性 化が生じることがある。ＰＬＣの活性化はＰＩのターンオーバー及びジアシルグ リセロール及びイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩｎｓＰ３）の生 成が起きる。ＩＰ３は細胞内Ｃａ²⁺の増加及び、遺伝子転写の変更を含めた細胞 の活性化を引き起こすことが知られている。例えば、ＩＰ３の生成により細胞内 カルシウムが放出されることがあるが、その結果カルモジュリンキナーゼIIが活 性化したり、さらにその結果、ｅｔｓ−１プロト−オンコーたんぱく質と呼ばれ るＤＮＡ結合たんぱく質がセリンリン酸化することがある。ジアシルグリセロー ルは信号形質導入たんぱく質であるたんぱく質キナーゼＣを活性化することが でき、これがＡＰＩＤＮＡ結合たんぱく質複合体の活性に影響を与える。信号形 質導入経路により、例えばｃ−ｆｏｓ、ｅｇｒ−１、及びｃ−ｍｙｃ等の遺伝子 の転写活性化が起きることが可能である。 免疫反応の下方調整はさらに信号形質導入にも関わる。免疫複合体を仲介した 抗体生成の抑制は、ＢＣＲとＩｇＧのＦｃ域（ＦｃγＲＩＩＢＩ）に対するレセ プタとのコリゲーションに左右されることが示されている。ＦｃγＲＩＩＢＩを 符号化する遺伝子の突然変異分析の結果、細胞質部分中には１３のアミノ酸モチ ーフが否定的シグナリングのために必要であることが判明している（ムタ他著（ １９９４）ネイチャー誌３６８：７０、アミゴレナ他著（１９９２）サイエンス 誌２５６：１８０８−１８１２、及びフリッドマン他著、免疫学レビュー１２５ ：４９−７６、１９９２）。この配列は免疫レセプタチロシンベース抑制モチー フ（ＩＴＩＭ）と呼ばれている（ダンブロシオ他著（１９９５）サイエンス誌２ ６８：２９３）。ＩＴＩＭモチーフは、Ｌｙ４９、ＮＫＩＲｐ５８、Ｆｃｇレセ プタ、及びＣＤ２２を含むいくつかのレセプタで判明している。あるＩＴＩＭ配 列配列を図１に示す。加えて、ＳＨ２結合ＩＴＩＭが、マウスのエリスロポイエ チンレセプタ（ＥＰＯＲ）、ヒトＩＬ−２ｂＲ、ヒトＩＬ−３ｂＲ、及びｃ−ｋ ｉｔレセプタについて説明がなされてきた（トーマス著（１９９５）医学実験ジ ャーナル１８１：１９５３）。ＰＴＰのＣＯＯＨを端部に持つＳＨ２部分に結合 するＮＫＩＲｐ５８、Ｌｙ４９、Ｆｅｇレセプタ、及びＣＤ２２に存在するＩＴ ＩＭモチーフとは対照的に、後者のグループのレセプタに存在するＩＴＩＭモチ ーフはＮＨ２を端部に持つＳＨ２部分に結合する。 細胞内信号の発生及び伝播において、たんぱく質対たんぱく質の相互作用は上 流及び下流の構成要素の相互作用を仲介する上で重要である。例えば、ＢＣＲを 介したＢ細胞の活性化の結果、ＣＤ２２、膜内外レクチンとＢＣＲとの急速な結 合が起き、ＣＤ２２のチロシンリン酸化が起きる。リン酸化したＣＤ２２は三つ の別々のホスフォチロシン残分を介してＰＴＰ１Ｃと結合する（トーマス著（１ ９９５）医学実験ジャーナル１８１：１９５３）。ＰＴＰ１Ｃは、免疫反応の下 方調整において特殊な役割を果たすと考えられているが、それは、一つにはＰＴ Ｐ１Ｃを欠いた虫食いマウスの表現型に基づいている。ＰＴＰ１Ｃがこのように 働くのではないかと仮定されている態様には、刺激前にはＢＣＲを不活性に保ち 、及び／又はＢＣＲが抗原に反応するときにスレショルド値を調節しているとい うものがある（上述のトーマスによる文献）。ホスフォチロシンの仲介する認識 のもう一つの例は、Ｂ細胞コレセプタであるＣＤ１９により描かれている。ＣＤ １９はＢＣＲのリゲーションが起きると急速にリン酸化する。チロシン４８４及 び／又は５１５上のＣＤ１９のリン酸化は、ＰＩキナーゼｐ８５サブユニットの ＳＨ２部分を介してＰＩ−３キナーゼの補充及び活性化を開始させる（チューベ ソン他著（１９９３）サイエンス誌２６０：９８６）。ここに初めて開示するよ うに、ＣＤ１９はＰＴＰ１Ｃのための基質でもあるため、ＰＴＰ１ＣによるＣＤ １９の脱リン酸化は免疫細胞抑制において重要であると考えられる。 理論に縛られることは望まないが、免疫複合体の仲介するＢＣＲ−ＦｃγＲＩ ＩＢＩコリゲーションによる抗体生成の抑制は、例えばＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１ Ｄなどのたんぱく質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）が仲介していると考えら れる。ＦｃγＲＩＩＢＩのリゲーションが起きると、ＰＴＰはＦｃγＲＩＩＢＩ のチロシンリン酸化ＩＴＩＭモチーフにＰＴＰカルボキシＳＨ２部分で非共有結 合的に結合する。ＰＴＰのＩＴＩＭモチーフとの結合によりこの酵素が活性化さ れる。活性化したＰＴＰは、ＦｃγＲＩＩＢＩのＩＴＩＭモチーフと結合するた めにＢＣＲ−ＦｃγＲＩＩＢＩと共に偏在する。このＰＴＰは次にその基質と相 互作用して活性化に重要なざん分を脱リン酸化する。考えられる基質には、レセ プタの一つ又はそれ以上のサブユニットが含まれる（例えばＣＤ１９、Ｉｇ−α 、Ｉｇ−β、Ｌｙｎ及び／又はＳｙｋ）。あるいは、ＰＴＰはその他の細胞シグ ナリング分子、例えばＳｈｃ又はホスフォチジルイノシトール−３（ＰＩ−キナ ーゼ）と相互作用するとも考えられる。好適な実施例では、ＩＴＩＭで活性化し たＰＴＰ１ＣはＣＤ１９と相互作用してこれを脱リン酸化する。前述の分子の一 つ又はそれ以上が脱リン酸化により、細胞の抗体生成を刺激する一つ又はそれ以 上の信号形質導入経路を不活性化することができる。従って、ＩＴＩＭ擬態を用 いてＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄ等のホスファターゼの酵素的及び偏在性質を変更 することでＢＣＲシグナリングを調整することができる。 本発明はまたナチュラルキラー細胞の活性化を調整する方法を提供するもので ある。ＮＫ細胞は、悪性の細胞に対する抵抗や特定のウィルス性及び微生物感染 において重要である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩのたんぱく質（例えばＮＫＩ Ｒｐ５８及びＬｙ４９）のための細胞表面レセプタを発現する。これらのレセプ タのそのリガンドとの結び付きによりＮＫ細胞の細胞毒性プログラムが概ね抑制 される。同様のレセプタはＴ細胞の小集団により発現されるが、これらの結び付 きの結果、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の刺激によって開始した異なる効果器機能が抑 制される。ヒトＮＫＩＲ遺伝子はＩｇ遺伝子上科に属するが、マウスの同等のＮ ＫＩＲは二量体レクチン科に属する。これら異なる進化起源にも拘らず、ＨＬＡ −Ｃ−特異的ヒトＰ５８．１８３レセプタと、Ｈ−２Ｄｄ−及びＨ−２Ｄｋ−特 異的マウスＬｙ４９Ａレセプタは、同じたんぱく質チロシンホスファターゼ、Ｐ ＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄを、重要な細胞質内チロシン残分のリン酸化にあたって 補充する。これらの結果は、多様なＮＫＩＲが信号を下方調節することのできる 共通の経路があり、ＮＫ及びＴ細胞の活性化プログラムとなっていることを立証 するものである。これらの発見はまた、ヒト及びマウスの両方のＮＫＩＲで発現 する、そして最初にＦｃγＲＩＩＢＩにおいて説かれた、免疫レセプタチロシン をベースとした抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）の配列を認識するための必要条件を規 定するものである。 ＮＫ細胞は細胞毒性のリンパ球であり、様々な標的細胞の溶解を誘発できる。 これがなされる一つのメカニズムは、抗体で被覆された標的細胞を、抗体に応じ た細胞毒性プログラム（ＡＤＣＣ）を介して溶解に導く。自然の細胞毒性プログ ラムの誘発は、標的細胞の溶解を起こすが、これは変更された形態の、ＭＨＣク ラスＩ分子では発現しなかったり、発現したりする（ヨコヤマ、ダブリュ．エム 著、免疫学の現在の意見７：１１０、ローレット、ディー．エイチ、及びダブリ ュ．ヘルド、著１９９５、細胞８２：６９７、ガンプレッツ、ジェー．イー．及 びピー．パーハム１９９５、ネイチャー誌３７８：２４５）。ＡＤＣＣでは、多 重結合性ＣＤ１６レセプタ複合体の結び付きは、たんぱく質チロシンキナーゼ( ＰＴＫ)依存の経路を活性化してＣＤ３ｚ及び／又はＦｃｅＲＩｇにおいて発現 するＩＴＡＭ（免疫レセプタチロシンベース活性化モチーフ）のチロシンリン酸 化を発生させる（ビビエ他著、１９９１、免疫学ジャーナル、１４６：２０６、 オ ーシー他著、１９９１、米国国家科学アカデミー手続集、８８：３５０、アイン スパー他著、１９９１、米国国家科学アカデミー手続集、８８：６２７９、サル セド他著、１９９３、医学実験ジャーナル、１７７：１４５、）。次に、リン酸 化したＩＴＡＭはＳＨ−２−タンデムＰＴＫ、例えばＺＡＰ−７０及びｐ７２５ Ｓｙｋを補充し（ビビエ他著、１９９３、免疫学ジャーナル、２３：１８７２、 スタール他著、１９９４、免疫学ヨーロッパジャーナル２４：２４９１）、この 結果、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマスト細胞で説明された下流の活性化が引き起こさ れる（ワイス、エー．及びディー．アール．リットマン、１９９４、細胞７６： ２６３）。最近、ＮＫ細胞の活性化を抑制することのできるＭＨＣクラスＩに特 異的なレセプタのＮＫＩＲ族がヒト及びマウスの両方で説明された（カーホラー 他著、１９９２、ネイチャー誌、３５８：６６、モレッタ他著、１９９３、医学 実験ジャーナル、１７８：５９７、フィリップス他著、１９９５、サイエンス誌 ２６８：４０）。ヒトのＮＫＩＲはＩｇ上族に属し、その細胞外部分の二つ又は 三つのＩｇ様部分を特徴とするが、これらの部分は、それぞれＨＬＡ−Ｃ−特異 的ｐ５８及びＨＬＡ−Ｂ−特異的ｐ７０／ＮＫＢＩレセプタに相当する（ワット マン他著、１９９５、免疫性２：４３９、コロナ、エム．及びジェー．サマリデ ィス著、１９９５、サイエンス誌２６８：４０５、ダンドレア他著、１９９５、 免疫学ジャーナル１５５：２３０６）。細胞質内の尾部は７６−８４のアミノ酸 長を有し、保存性が高く（ヒトＮＫＩＲのものの間では７３％アミノ酸同一性） 、当初はＩＴＡＭ様であると説明された二つの(Ｉ／Ｖ)ｘｙｘｘＬを含んでいる 。このような細胞質内の配列の統一性はＮＫＩＲの仲介する抑制にとっては重要 だと考えられる。実際、この分子の自然発生する形態である、平頭の２−アミノ 酸カルボキシを端部に持つ最初のＹ残分の形態は、ＮＫ細胞の抑制ではなく活性 化を仲介する。にも拘らず両方の（Ｉ／Ｖ）ｘＹｘｘｌの間のスペーサ域の異常 な長さは、ＣＤ３／ＴＣＲ−、ＦｃＲ−、及びＢＣＲ−結合した分子にある伝統 的な６−８のアミノ酸ではなく２６ものアミノ酸長があり、これらの二つのスト レッチの独立した、そしておそらくは異なる機能を意味するものであろう。この 線に沿って、単一の細胞質内（ｌ／Ｖ）ｘＹｘｘＬ配列がＦｃγＲＩＩＢＩに含 まれるが、これが、表面Ｉｇの誘発するＢ細胞活性化の抑制を仲介すると示され て いる（ダンブロシオ他著、１９９５、サイエンス誌２６８：２９３）。トランス フェクトした細胞の研究の結果、さらに、ＦｃｇＲＩＩＢＩＩＴＩＭが、Ｆｃｅ ＲＩ複合体と同様、ＣＤ３／ＴＣＲを介して仲介される細胞の分解を抑制するこ とが可能なことが示された（デーロン他著、１９９５、免疫性３：１）。Ｆｃｇ ＲＩＩＢＩＩの誘発した抑制による分子の解体から、マウスのＦｃｇＲＩＩＢＩ ＩＴＩＭが、ＢＣＲ−ＦｃｇＲＩＩＢＩの結び付きによりリン酸化し、ＰＴＰ１ Ｃを含むいくつかのたんぱく質を回収することが分かった（ダンブロシオ他著、 １９９５、サイエンス誌２６８：２９３）。ＰＴＰａｓｅＰＴＰ１Ｃ（ＨＣＰ、 ＳＨＰ、ＳＨ−ＰＴＰ１）は、Ｃを端部に持つ触媒部分に結合した二つのタンデ ムＳＨ−２部分を発現する造血特異性ＰＴＰａｓｅである（ストーン、アール． エル．及びジェー．イー．ディクソン著、１９９４、生物化学ジャーナル２６９ ：３１３２３）。ＰＴＰ１Ｃは、エリスロポイエチンレセプタ並びにＫｉｔ／Ｓ ＣＦレセプタの信号の終止等、数多くの抑制シグナリングに関係している。加え て、Ｂ細胞分子ＣＤ２２は、チロシンがリン酸化したときにＰＴＰ１Ｃを結合さ せることのできる３Ｉ／ＶｘＹｘｘＬストレッチを含み、Ｂ細胞活性化プログラ ムを調節する（ドウーディ他著、１９９５、サイエンス誌２６９：２４２、キャ ンベル、エム．エー．及びエヌ．アール．クリンマン著、１９９５、免疫学ヨー ロッパジャーナル２５：１５７３）。注目すべきに、（Ｉ／Ｖ）ｘＹｘｘ）（Ｌ ／Ｖ）は、ヒトのレクチンレセプタＮＫＧ２Ａ及びＢだけでなく、マウスのレク チンＮＫＩＲＬｙ−４９Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ１及びＧ４でも発現する（図１を参照の こと）。これらの観察は、推定上のＩＴＩＭ様配列がヒト及びマウスのＮＫＩＲ に存在することに適合し、このことが、これらの別々の遺伝子起源（Ｉｇ上科対 レクチン）にも拘らず、ＰＴＰ１Ｃ等のＰＴＰａｓｅの補充を通じて、これらの 抑制機能を働かせていると考えられる。 上述のメカニズムに基づいて、本発明の一実施例はある細胞システムを含むが 、この細胞システムにおいては、活性化レセプタは否定的調節レセプタとコリゲ ートさせる、例えばＦｃγＲＩＩは、 このＦｃγＲＩＩにより調節されるＢ細 胞レセプタとコリゲートさせるものである。次にこの細胞を、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴ Ｐ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及びＩＴＩＭ−ｐ７０を含むたんぱく質に結合可能 な 調節試薬と接触させる。好ましくは、ＦｃγＲＩＩは、アミノ酸配列ＴＡＥＮＴ ＩＴＹＳＬＬＫＨ、ＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨを含むとよいが、好ましくはこ の配列中のチロシン残分がリン酸化するとよい。より好ましくは、ＦｃγＲＩＩ はアミノ酸配列ＩＴＹＳＬＬ、さらに好ましくはＩＸＹＸＸＬを含むとよく、そ のチロシン残分はリン酸化することが好ましい。特に好適な実施例では、試薬は コア配列（（Ｉ／Ｖ）ＸＹＸＸ（Ｌ／Ｖ）、を含むが、より好適な実施例では、 そのチロシンがリン酸化するとよい。 さらに上述のメカニズムに基づいて、本発明のもう一つの実施例は抗体生成を 調節する方法を含むものであり、この方法には、Ｂ細胞レセプタ、ＦｃγＲＩＩ Ｉ、ＦｃεＲＩ及び／又はＦｃγＲＩＩのいずれかから選択したレセプタを有す る細胞を、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及びＩＴＩＭ−ｐ７０ を含むたんぱく質に結合可能な調節用試薬に接触させるステップが含まれるが、 このときこのたんぱく質は、Ｂ細胞レセプタ、及びＦｃγＲＩＩ、ＦｃεＲＩ及 びＦｃγＲＩＩ、並びにＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＩのいずれかから選択さ れるレセプタの組合せのコリゲーションによる生物学的反応を変更可能であるた め、抗体生成及び／又は増殖の調整が行われるものとする。抗体生成が抑制され る場合では、アレルギ反応及び自己免疫疾患などの疾患から動物を保護する点で 本発明は特に有用である。抗体生成が刺激される場合では、エイズ等、動物に対 して免疫化を行うことのできる疾患（感染物質により生じる疾患）から動物を保 護すると点で有用である。 本発明の別の態様は、本発明の調節用試薬に細胞を接触させることで、細胞内 の信号形質導入分子の活性を調節することができるという認識に関する。一実施 例では、造血細胞機能を調節する方法は、細胞を、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、Ｉ ＴＩＭ−ｐ１６０及びＩＴＩＭ−ｐ７０のいずれかから選択されたたんぱく質に 結合可能な効果的な量の本発明による調節用試薬に、そのたんぱく質の活性が変 更される（例えば抑制される又は刺激される）ような態様で接触させることで、 造血細胞機能を調節することを含む。別の実施例では、造血細胞機能を調節する 方法は、細胞を、その細胞中のＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及 びＩＴＩＭ−ｐ７０のいずれかから選択された分子の濃度を変更することのでき る、効果的な量の本発明による調節用試薬に接触させることで、造血細胞機能を 調節することを含む。 本発明のさらに別の態様は、細胞内シグナリング経路を調整するために、当該 ＩＴＩＭペプチド又はペプチド擬態又はその他のＩＴＩＭ擬態を利用することで ある。ここで用いられるように、「ＩＴＩＭ擬態」とは、レセプタのＩＴＩＭ配 列の仲介する信号形質導入活性を作動させる又は拮抗することのできる物質を言 う。上述のＩＴＩＭペプチド及びペプチド擬態はもちろん、上述の薬品スクリー ニング検定で発見されたようにＩＴＩＭ擬態である。さらに、当業において説か れたその他のＳＨ２結合物質は、例えばＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄを活性化する ためには当該ＩＴＩＭペプチド程はおそらくは最適とは言えないが、しかしなが らこれを用いてもＩＴＩＭ依存性の活性を調整することはできよう。例えば、Ｉ ＴＩＭ擬態は、バホーキンによるＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１８号の述べるホ スフォチロシンベンゾジアゼピンペプチド擬態、及び、シュールソンによるＰＣ Ｔ出願ＷＯ９４／０８６００号の述べるホスフォチロシンペプチドに類似のもの でもよく、これらの両公報は、例えば我々のデータが示唆するように−２位置に アミノ酸残分を含まないｐＹＸＸＬに相当するテトラペプチドを説明している。 しかしながら、このような他のホスフォチロシン含有ペプチドは、自生のＩＴＩ Ｍが相互作用するＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０、ＩＴＩＭ−ｐ ７０、及び／又はその他の細胞標的と相互作用可能とも考えられる。これらのＩ ＴＩＭ擬態に、自生ＩＴＩＭのＰＴＰ活性を模倣させてもよく、ホスファターゼ をアロステリックに活性化することはできないが、ＰＴＰ１ＣＳＨ２部分に競合 結合することでそのような活性に対して作動的（例えば抑制的）であってもよい 。 一般的には、ＩＴＩＭ擬態は生体内（例えば被験者又は動物への投与）又は生 体外（細胞培養での利用）で細胞と接触させることで、成長因子、サイトカイン 又はその他のレセプタリガンドに対する造血細胞の反応性を変え、細胞の増殖を 調整する、細胞の分化に影響を与える、又は細胞の効果器機能、例えば抗体生成 、抗体依存性細胞毒性、サイトカインの分泌、その他の可溶性媒介物（予備形成 媒介物を含む）の分泌、又は細胞崩壊等を調整することができる。本発明の一態 様では、当該化合物は、酵素活性を有するたんぱく質の信号形質導入能力を調整 す るものである。酵素の例には、細胞質チロシンキナーゼ（例えばＳｒｃ、Ｌｃｋ ）ホスフォチロシンホスファターゼ、ホスフォリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）等々が 含まれる。このように、本発明の化合物とのＳＨ−２の仲介する相互作用を抑制 する、又は模倣すると、酵素の活性化を調整することができ、また酵素の区分化 又は偏在化を変えることができる。 当該化合物はまた、好塩基性細胞及びマスト細胞の脱顆粒を伴う炎症性及びア レルギー性反応等、様々なＩｇＥを媒体とした疾患の治療用の治療的養生法の一 部として利用することができる。例えば、本発明の化合物は慢性的アレルギ性炎 症の制御、並びに喘息治療に用いることができる。 簡単に言うと、即時型の過敏症、例えばアナフィラキシ、アレルギ性鼻炎、ア トピ性皮膚炎、喘息、アレルギ性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺臓炎、外 因性喘息、枯草熱、及び特定の食物又は薬品に対するアレルギ反応などは、免疫 グロブリンアイソタイプの一つ、つまりＩｇＥが主に介在するものである。Ｉｇ Ｅを介在したアレルギ反応においては、アレルゲンは、マスト細胞及び好塩基性 白血球（好塩基球）表面上のレセプタ（例えばＭＩＲＲ）に結合するＩｇＥに結 合する。アレルゲンが結び付いたことにより、表面ＩｇＥ分子の交差結合、ひい てはその下にあるＩｇＥのＦｃ部分（ＦｃεＲ）のレセプタの交差結合が起き、 ヒスタミン、中性プロテアーゼ（例えばトリプターゼ、キモトリプターゼ、カル ボキシペプチダーゼ）、ＬＴＣ４、ＬＴＢ４、ＰＧＤ２、ＴＸＡ２、ＰＡＦ、サ イトカイン(例えばＩＬ−４又はＴＮＦα)、アナフィラキシの遅反応性物質（Ｓ ＲＡ）、及びセロトニン等の薬理学的媒介物質の剥離により細胞脱顆粒を引き起 こす。これらマスト細胞及び好塩基球生成物の剥離は、病理学的反応及びアレル ギ症状を引き起こす。 本発明のもう一つの実施例には、ヒスタミン、ＩＬ−５及び／又はＩＬ−８、 あるいは過敏性反応のその他の媒介物など、マスト細胞又は好塩基球の媒介物質 の剥離及び／又は生成を調節する方法が含まれ、この方法には、好塩基球又はマ スト細胞を、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及びＩＴＩＭ−ｐ７ ０を含むたんぱく質に結合可能な、効果的な量の調節用試薬に接触させることが 含まれるが、このとき、このたんぱく質は、ＦｃγＲＩＩＩ及び／又はＦｃε ＲＩのＦｃγＲＩＩとのコリゲーションによる生物学的反応を変えられるもので あるため、結果としてヒスタミン、ＩＬ−５及び／又はＩＬ−８の生成又は剥離 が抑制されることとなる。ヒスタミン又はサイトカインの生成が抑制される場合 では、アレルギ性又はその他の免疫反応から動物を保護するという点で本発明は 特に有用である。ＩＬ−５が刺激される場合では、抗体生成が必要な疾患の治療 、例えば免疫不全疾患又は感染による疾患から動物を保護するという点で本発明 は特に有用である。 本発明のさらに別の実施例は、ホスファターゼＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１Ｄの不 活性化を抑制する、抑制作用的ＩＴＩＭ擬態又はその他の物質の補助剤としての 利用を特徴としている。例えばＰＴＰ１Ｃの、リンパ球中の抗原誘発シグナリン グを下方調節する能力を妨げることで、このような物質を用いて、このような化 合物と同時に投与された抗原に対する体液性及び／又は細胞性反応を高めること ができる。例えば、ＰＴＰ１Ｃに結合するがホスファターゼを活性化しない又は その偏在化を抑制するようなＩＴＩＭ擬態は有用な補助剤であろう。同様に、ホ スファターゼの活性を直接抑制する化合物、例えば上述の検定で見いだされるよ うなものもまた、補助剤として利用可能であろう。 同様な原則により、多様な免疫不全の治療において免疫反応性を高めるべくこ れらの補助剤を用いてもよい。 本発明はさらに、当該化合物はまた、好塩基性細胞及びマスト細胞の脱顆粒を 伴う炎症性及びアレルギー性反応等、様々なＩｇＥを媒体とした疾患治療用の治 療的養生法の一部として用いることのできる物質に関する。本発明はある実施例 では、ＦｃεＲシグナリングを調整することで好塩基球及び／又はマスト細胞の 活性化を調整することのできるＩＴＩＭペプチド又は核酸、特にＩＴＩＭ薬剤調 合物を提供するものである。別の実施例では、本発明は、ＩｇＥにより結び付け られたＦｃεＲのシグナリングを抑制すべく、Ｆｃεレセプタ（ＦｃεＲ）をＦ ｃγＲに交差結合するための二特異的抗体を提供する。例えば、本発明の二特異 的抗体を慢性アレルギ性炎症の制御並びに喘息治療に用いることができる。 簡単に言うと、即時型の過敏症、例えばアトピー性皮膚炎、外因性喘息、枯草 熱、及び特定の食物又は薬品に対するアレルギ反応などは、免疫グロブリンアイ ソタイプの一つ、つまりＩｇＥが主に介在するものである。ＩｇＥを介在したア レルギ反応においては、アレルゲンは、マスト細胞及び好塩基性白血球（好塩基 球）表面上のレセプタ（例えばＭＩＲＲ）に結合するＩｇＥに結合する。アレル ゲンが結び付いたことにより、表面ＩｇＥ分子の交差結合、ひいてはその下にあ るＩｇＥのＦｃ部分（ＦｃεＲ）のレセプタの交差結合が起き、ヒスタミン、ア ナフィラキシの遅反応性物質（ＳＲＡ）、及びセロトニン等の薬理学的媒介物質 の剥離により細胞脱顆粒を引き起こす。これらマスト細胞及び好塩基球生成物の 剥離は、病理学的反応及びアレルギ症状を引き起こす。 免疫グロブリンのための高親和性レセプタ、ＦｃεＲＩ、の抗原を媒介とした 凝集の結果、複数のシグナリング経路が活性化し、アレルギ反省の媒介物が放出 される。しかしながら、添付の例に述べるように、ＦｃεＲＩのＦｃγＲとのコ リゲーションの結果、ＦｃεＲの信号形質導入の下方調節が起きる。特定の理論 に縛られるのは望まないが、コリゲートしたＦｃεＲによってＰＴＰ１Ｃ等のＰ ＴＰが補充されると、ＦｃεＲＩのα及びβサブユニット中のＩＴＡＭモチーフ チロシンの脱顆粒が起きると考えられ、これによってチロシンキナーゼＳｙｋの リン酸化レセプタとの結合が拮抗されるか、あるいはＣＤ１９類似体によるＰＩ １３キナーゼの活性化を抑制してＦｃεＲのシグナリングを妨げると考えられる 。前者の結合はＳｙｋのＳＨ２部分により媒介されるが、媒介物質の放出につな がるシグナリング経路の活性化には重要であると信じられる。従って、本発明の 化合物によるＦｃεＲ媒介信号経路の破壊は、このような細胞の脱顆粒を伴う疾 患又は外傷の予防及び／又は直接的治療に資することができる。 さらに、多数のサイトカインにより好塩基球の反応及びマスト細胞の反応の両 方が上方調節されることが次第に明白となってきている。結論的には、例えばア レルギ性病変の治療において、Ｆｃεレセプタ信号の抑制に加えて、サイトカイ ンの誘発する信号形質導入を選択的に調整することに当該化合物を用いることが 可能だと考えられる。 各抗体分子を特徴づける機能の一つは、抗原決定因子に対する特異的結合であ る。生体内の抗体は二価かつ単一特異性であり、二つの同一の抗原結合部位を含 む。抗体分子による抗原の特異的結合は、重及び軽鎖の両方の多様な域（Ｆａｂ ） から成るその抗体の構造によって決定される。二重の特異性を有する抗体は、特 異性の異なる抗体を、二本の重鎖を互いに結び付ける二硫化物の橋の選択的分割 にさらすことで調製されてきた。次に抗体半分子を中性ペーハの下で再結合させ て二重の特異性を有するハイブリッド抗体を生成する。このようなアプローチを 用いて、ＦｃεＲ及びＦｃγＲを交差結合させることのできる二特異性の抗体を 作ることができる。 ニソンホフ他著（１９６２）ネイチャー誌１９４：３５５は二特異性の抗体分 子の生体外生成に適用できる一方法を述べている。このニソンホフ法によれば、 単一等異性の抗−ＦｃεＲ抗体及び抗−ＦｃγＲ抗体をペプシンで処理して各抗 体のＦｃ部分を取り除き、単一の二硫化物結合で共有結合された二つの抗原結合 域（Ｆａｂ）とする。この結合を次に還元条件の下で裂いた後、二つの抗体細片 プールを組合せ、酸化条件の下で再結合して二特異性の抗体を生成する。 ブレナン他著（１９８５）サイエンス誌２９９：３１では、単一クローン性の 抗体から二特異性の抗体細片を調製するための化学的手続が述べられている。こ の手続では、ニソンホフ技術を改良したものを用いてＦａｂ細片を分割した後、 この半細片を再構成して二特異性の抗体分子を形成している。Ｆａｂ細片は亜ヒ 酸ナトリウムのあるところで還元してビシナル−ジメルカプロールを安定させる と共に細胞内二硫化物の形成を妨げる。その他の改良は、半Ｆａｂ細片の一方の チオールをチオニトロベンゾエート誘導体として活性化することを含むものであ った。このプロセスにより、抗−ＦｃεＲ及び抗−ＦｃγＲＦａｂから二特異性 の抗体を生成することができる。 リュー他著（１９８５）ＰＮＡＳ８２：８６４８は二特異性の抗体を形成する 化学的手続を開示している。この方法により、抗−ＦｃεＲ及び抗−ＦｃγＲ抗 体は共役結合される。抗−ＦｃεＲ及び抗−ＦｃγＲ抗体をまず、Ｎ−ｓｕｃ− シニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応さ せる。チオール基を、分割した抗−ＦｃεＲ及び抗−ＦｃγＲ抗体に２−イミノ チオレンを用いて結び付ける。そこでこの二つの改良された半抗体である、抗− ＦｃεＲ及び抗−ＦｃγＲ抗体混合して二つの抗体を共有結合させる。 さらに別の実施例では、本発明による｛抗−ＦｃεＲ対抗−ＦｃγＲ｝二特異 性抗体をハイブリドーマから生成することができる。抗体生成ハイブリドーマの 融解による二特異性の単一クローン性抗体の調製は、ミルスタイン及びクエロ著 （１９８３）ネイチャー誌３０５：５３７及びＰＣＴ出願ＷＯ８３／０３６７９ 号に述べられている。この方法では、二つのハイブリドーマ｛それぞれ抗−Ｆｃ εＲ及び抗−ＦｃγＲ抗体を表現する｝を融合してハイブリッドのハイブリドー マを生成する。これらのハイブリッドのハイブリドーマの分泌物を、予め規定し た二特異性の単一クローン性抗体を生成するものを選択する。ハイブリッドのハ イブリドーマが生成する二特異性単一クローン性抗体は複合分子であり、抗原結 合部位と共にＦｃ域を含むものである。 ここに述べた二特異性単一クローン性抗体の薬学的調剤は、上述の方法のいず れかを用いて薬学的調剤として形成することができよう。 以下の例は、描写を目的としたものであり、本発明の範囲を限定するよう意図 されてはいない。 実施例実施例１ この実施例では、ＰＴＰ１Ｃ、ＩＴＩＭ−ｐ１６０及びＩＴＩＭ− ｐ７０が、共沈に於いて分子を結合するＩＴＩＭである事が説明される。 ＴＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＫＨ及びＴＡＥＮＴＩＴ（ｐ）ＹＳＬＬＫＨの連鎖を 夫れ夫れ有するリン酸化されない（ＩＴＩＭペプチド）及びチロシンリン酸化マ ウスＩＴＩＭペプチド(ｐｌＩＴＩＭ)が、マクロモルキュラーリソーシズ社(コ ロラド州Ｆｔ．コリンズ)によって合成された。 Ａ２０Ｂリンパ腫細胞は、コールドスプリングハーバー研究所の出版物（１９ ８９年、ハーロウ及びレーン共著「抗体：実験の手引き」１９８８年コールドス プリングハーバー研究所出版局）で一般的に説明されている方法を用いて、［³⁵ Ｓ］−メチオニンでロード(load)された。［³⁵Ｓ］−メチオニンＡ２０細胞は、 数種類の様々な標本を準備する為に用いられた。最初の標本には、１ｍｌ当り１ ｘ１０⁸の刺激されていないＡ２０細胞が含まれていた。また、２番目の標本に は、摂氏３７度で２分間、完全な（８０μｇ／ｍｌ）ラビット抗ｍＩｇ抗体（ジ ムド，カリフォルニア州サンフランシスコ）で刺激された１ｍｌ当り１ｘ１０⁸ ）のＡ２０細胞が、３番目の標本には、ラビット抗ｍＩｇ抗体のＦ（ａｂ’）₂ （５０μｇ／ｍｌ）で刺激された１ｍｌ当り１ｘ１０⁸のＡ２０細胞が含まれて いた。これらの標本に含まれている細胞は，１％のＮＰ−４０溶解緩衝剤で直ち に溶出された（１％のＮＰ−４０、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのト リスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２．０ｍＭのオルトバナデートナトリウム(sodium orthovanadate)、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．４ｍＭのＥＤＴＡ、１ ０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニル弗化物(phenylmethylsulfo nyl fluoride)、及び各２μｇ／ミリリットルのアプロチニン、リューペプチン( leupeptin)、及びａ−１抗トリプシン）。ペプチド吸着物は次のように製造され た。つまり、刺激されていない、完全な、又は刺激されたラビット抗ｍＩｇ抗体 刺激［³⁵Ｓ］−メチオニン標識付きＡ２０細胞（１標本当りの細胞数２０ｘ１０⁶ ）の別々の１％ＮＰ−４０の溶解産物のポストニュークリア(postnuclear)０． ４ｍｌを、ＩＴＩＭか、あるいはｐＩＴＩＭペプチド（２０μｇ）のどちらか一 方を結合させたセファローズビード（１０μｌの５０％スラリー）で、摂氏４度 で１時間定温放置するものであった。吸収された物質は、凍結乾燥により引続い て除去される２．２％のギ酸（０．１ｍｌ）で溶出された。ペプチド吸着物は、 ＳＤＳ減少サンプル緩衝剤中で５分間煮沸され、また１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ によって細分された。ペプチドが結合したビードから溶出された［³⁵Ｓ］−メチ オニンは全て、放射性写真撮影により確認された。 ＩＴＩＭペプチドに吸収された標本では、蛋白質は一つも確認されなかった。 しかしながら、ｐＩＴＩＭペプチドで定温放置された刺激されていない細胞溶解 産物及び刺激された細胞溶解産物には、３つの蛋白質が確認された。その蛋白質 の相対的な分子量は１６０．７０ｋＤａと１６０．６５ｋＤａであった。分子量 １６０の蛋白質は、ここではＩＴＩＭ−ｐ１６０と称され、また分子量７０の蛋 白質は、ここではＩＴＩＭ−ｐ７０と称される。実施例２ この実施例では、チロシンのリン酸化されたｐＩＴＩＭ結合の６５ ｋＤａ蛋白質のアミノ酸連鎖が説明される。 実施例１で説明されたこれら３つのｐＩＴＩＭ結合の蛋白質の標本は、１００ μｌのｐＩＴＩＭペプチドで定温放置することにより、また５０ｍＭ（１００μ ｌ）ｐ−ＮＰＰ（ホスフォチロシン類似体）を用いて全てのペプチドが結合蛋白 質を溶出することにより、５ｘ１０⁹Ａ２０細胞のＮＰ−４０溶解産物から分離 された。これら溶出された蛋白質は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で溶解さ れ、また６５ｋＤａ帯は、イモビロン−Ｐ薄膜（マサツーセッツ州ベッドフォー ド、ミリポール社）の上へ移された。その薄膜上で分離された蛋白質は、ＰＲＯ ＣＩＳＥ応用バイオシステムアミノ酸シ−ケンサー（応用バイオシステム、カリ フォルニア州）を用いてＮ末端配列分析を実行した。そのＮ末端１７アミノ酸連 鎖は、ホスフォチロシンフォスファターゼＰＴＰ１Ｃ（ＨＣＰあるいはＳＨ−Ｐ ＴＰ１としても知られる）と完全に同等であることが判明した。実施例３ この実施例では、アミノ酸連鎖のデータを検証するために、ＰＴＰ １Ｃに特有の抗体を用いて免疫ブロット(blot)実験が説明されている。 ｐＩＴＩＭペプチド吸着物が実施例１と同様に準備される。その吸着物は、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解され、蛋白質は、電気泳動法によりイモビロン−Ｐ 薄膜に移される。抗ＰＴＰ１Ｃ抗体は、バクテリア式に発現させたＧＳＴ融合蛋 白質（残分１から１９３）から切離されたＰＴＰ１Ｃ蛋白質のＮ末端部分を用い て、ラビットに免疫を与えることで準備された。多クローン抗血清は、当業で標 準的な技術を用いて移転された蛋白質を含んでいる薄膜を検査するために使用さ れた。その結果生じた免疫ブロットは、増幅化学ルミネセンス（ＥＣＬ）検出装 置（アマーシャム、英国バッキンハムシャー州）によってデベロップ(develop) させた。 分子量６５ｋＤａを有する蛋白質が、抗ＰＴＰ１Ｃ抗血清を用いて確認された 。さらに、同量のＰＴＰ１Ｃが、完全な、そしてＦ（ａｂ’）₂のラビット抗ｍ Ｉｇで刺激されたもの及び刺激されていないＡ２０細胞のｐＩＴＩＭペプチド吸 着物中に存在していた。したがって、ＰＴＰ１ＣとｐＩＴＩＭペプチドとの結合 に 総合すれば、このような免疫沈降の研究結果では、完全な抗ｍＩｇ抗体だけが 、ＦｃγＲＩＩＢ１のチロシンリン酸化を誘発するので、ＢＣＲとＦｃγＲＩＩ Ｂ１とのリゲーションは、ＦｃγＲＩＩＢ１のチロシンリン酸化に必要である事 が示されている。更にこの結果が示しているのは、ＦｃγＲＩＩＢ１のチロシン リン酸化によって、ＰＴＰ１Ｃが、活性化され共にリゲーションされたＦｃγＲ ＩＩＢ／ＢＣＲ複合体に補充される事である。実施例５ この実施例では、ｐＩＴＩＭペプチドと相互作用するＰＴＰ１Ｃ上 の位置を確認することが説明される。 Ａ． 融合蛋白質分析 ＰＴＰ１ＣアミノあるいはカルボキシルＳＨ２領域の、バクテリア的発現され たＧＳＴ融合蛋白質（クラーク等、サイエンス誌２５８巻１２３から１２６頁、 １９９２年刊）は、実施例１で説明された方法にしたがって準備された刺激され ていないＡ２０細胞、完全なＡ２０細胞、あるいはＦ（ａｂ’）₂抗ｍＩｇで刺 激されたＡ２０細胞で定温放置した。ＰＴＰ１Ｃ融合蛋白質吸着物に含まれた蛋 白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解され、実施例２のようにブロットペーパ ーに移転された。そのブロットペーパーは、実施例３のように、抗ホスフォチロ シン及び抗ＦｃγＲＩＩＢ１で免疫ブロットされた。 抗ＦｃγＲＩＩＢ１及び抗ＰＴＰ１Ｃ抗体の両方を用いて得られた免疫ブロッ トの結果が示したのは、ＰＴＰ１ＣのアミノＳＨ２部分ではなく、カルボキシル を含む融合蛋白質が、チロシンリン酸化されたＦｃγＲＩＩＢ１を、完全な抗ｍ Ｉｇ抗体刺激細胞の溶解産物から、沈殿させることができることである。実験で 同様に判明したのは、ＰＴＰ１Ｃのカルボキシル及びアミノＳＨ２領域は両方と も、刺激されていない細胞あるいはＦ（ａｂ’）₂刺激された細胞からのＦｃγ ＲＩＩＢ１には結合されていないことで、したがってＰＴＰ１ＣとＦｃγＲＩＩ Ｂ１との間の相互作用に必要なことは、ＢＣＲコリゲーション及び／又はＦｃγ ＲＩＩＢ１のコリゲーションに依存するチロシンリン酸化である。 は、ＰＴＰ１Ｃ酵素をレセプタで媒介して変異させる必要がない事が示された。実施例４ この実施例では、生体内でＦｃγＲＩＩＢ１に結合するＰＴＰ１Ｃ の確認が説明される。 ２．４Ｇ２（３０μｇ）で被覆されたセファローズビード（２５μｌの５０％ スラリー）で、摂氏４度で１５分間、定温放置することにより、刺激されていな いラビット抗ｍＩｇ抗体Ａ２０細胞か（１標本当り５０ｘ１０⁶）、完全なラビ ット抗ｍＩｇ抗体Ａ２０細胞か(１標本当り５０ｘ１０⁶)、あるいはＦ（ａｂ’ ）₂で刺激されたラビット抗ｍＩｇ抗体Ａ２０細胞（１標本当り５０ｘ１０⁶）の 、０．１ｍｌのポストニュークリア(postnuclear)１％ＮＰ−４０溶解産物から 、ＦｃγＲＩＩＢ１が免疫沈降された。免疫沈降された蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥで溶解され、実施例２で説明された方法を用いてブロットペーパーに移され た。抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体を含む腹水を１：１０００に薄めたもの、抗ホスフォ チロシン抗体を１：１０００に薄めたもの（Ａｂ２、オンコジーンサイエンス、 ニューヨーク州ユニオンデール）、及び抗ＰＴＰ１Ｃ抗血清を１：１０００に薄 めたもので、そのブロットペーパーは、次々と免疫ブロットされた。 抗ホスフォチロシン抗体で得られた免疫ブロットの結果では、ＦｃγＲＩＩＢ １は、完全な抗ｍＩｇ抗体でＡ２０細胞が刺激される際に、チロシンがリン酸化 したものである事が示された。刺激されていない細胞あるいはＦ（ａｂ’）₂抗 ｍＩｇ抗体で定温放置された細胞では、チロシンリン酸化刺激は一切見られなか った。抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体を用いて得られた免疫ブロットの結果では、完全な 抗ｍＩｇ抗体でのＡ２０細胞の刺激は、免疫沈降に於けるＦｃγＲＩＩＢ１のレ ベルに何ら影響しないことが示された。 抗ＰＴＰ１Ｃ抗体を用いて得られた免疫ブロットの結果が示したのは、ＰＴＰ １Ｃは、完全な抗ｍＩｇ抗体で刺激された細胞に於いてのみ、ＦｃγＲＩＩＢ１ と共に免疫沈降するという事である。Ｆ（ａｂ’）₂抗ｍＩｇ抗体による刺激に よって、ＰＴＰ１Ｃ結合が誘発されることはなかったが、他方では、蛋白質の類 似の全体的なチロシンリン酸化が誘発された。 Ｂ． ペプチド分析 ＰＴＰ１ＣのカルボキシルＳＨ２部分が、チロシンリン酸化ＦｃγＲＩＩＢ１ と結合するのを確定する際には、その結合はｐＩＴＩＭを用いて確認された。実 施例１で説明されたように、５μｇのｐＩＴＩＭが結合したセファローズビード で、沈殿した２０μｇのＰＴＰ１ＣカルボキシルあるいはアミノＳＨ２部分融合 蛋白質を定温放置することにより、ペプチド吸着物が準備された。ペプチド吸着 物に含まれた蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解され、またそのゲルはコマ シーブルー（Ｃｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）で着色された。 コマシーブルーで着色されたゲルからは、カルボキシルＳＨ２領域を含むＰＴ Ｐ１Ｃ融合蛋白質が、ｐＩＴＩＭペプチドに結合されている事が示された。しか しながら、アミノＳＨ２領域を含むＰＴＰ１Ｃ融合蛋白質は、ｐＩＴＩＭペプチ ドに結合されなかった。したがって、この結果が示しているのは、ＰＴＰ１Ｃは 、カルボキシルＳＨ２とｐＩＴＩＭとの相互作用を媒介にして、チロシンリン酸 化されたＦｃγＲＩＩＢ１と直接結合する事である。実施例６ この実施例では、リン酸化Ｌｙｎ自己リン酸化部位（ａｕｔｏｐｈ ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）ペプチドからの［³²Ｐ］の分離を測定 することにより、ＰＴＰ１Ｃに結合するｐＩＴＩＭが、ＰＴＰ１Ｃフォスファタ ーゼの活性に及ぼす影響が説明される。 実施例１に説明された方法を用いて、刺激されていないＡ２０細胞（２ｘ１０⁸ ）の１％ＮＰ−４０溶解産物（オルトバナジン酸塩ナトリウム及びピロリン酸 塩ナトリウムを欠く）を、セファローズビードで被覆された２５０μｇのｐＩＴ ＩＭで定温放置することにより分離された。摂氏４０度で１時間の定温放置の後 、ペプチドで被覆されたビードは、１％のＮＰ−４０溶解緩衝剤で２度洗浄され 、フォスファターゼ緩衝剤（１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＥＤＡＴ、０．１％２−メルカトエタノール、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン） で一度洗浄された。ｐＩＴＩＭ結合ＰＴＰ１Ｃは、フォスファターゼ緩衝剤に於 いて５０μＭのｐ−ＮＰＰの３００μｌで溶出された。このｐ−ＮＰＰは、摂氏 ４ 度で３０分間、３０ｘ量フォスファターゼ緩衝剤で、マイクロコン１０チューブ （アミコン社、マサチューセッツ州ベバリー）に於いて遠心分離器によって透析 による溶解液から分離された。 自己リン酸化部位を含む連鎖ＲＲＬＩＥＤＮＥＹＴＡＲＱＧＡを有するペプチ ド（Ｆｙｎペプチド）は、マクロモルキュラーリソーシズ社で入手した。Ｆｙｎ ペプチドは、チロシン残分で、［³²Ｐ］−ＡＰＴ及びＢサブユニットを用いてリ ン酸化され、またインシュリンレセプタキナーゼの場合は、ヒッペン他著『生化 学』３２：１２４０５から１２４１０、１９９３年刊に説明された方法を用いて 、リン酸化された。その後、リン酸化されたＦｙｎペプチドは、上記のように分 離されたＰＴＰ１Ｃのフォスファターゼ活性化をテストするために用いられた。 レクライダー等によって一般的に説明された方法（生物および化学ジャーナル誌 ２６８：２１４７８から２１４８１、１９９３年刊）を用いて、２０μｌの溶出 ＰＴＰ１Ｃ及び３０，０００ｃｐｍの［³²Ｐ］−ＡＰＴ標識Ｆｙｎペプチドの存 在下で、最終的には４０μｌの量で、摂氏３０度に於いて１５分間、Ｆｙｎペプ チドの脱リン酸化が実行された。様々な量のＩＴＩＭペプチド、ｐＩＴＩＭペプ チド、チロシンリン酸化されたＩｇ−α（ＥＮＬ（ｐ）ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭ （ｐ）ＹＥＤＩ）及びＦｃεＲＩ−βＩＴＡＭペプチド（ＤＲＬ（ｐ）ＹＥＥＬ ＮＨＶ（ｐ）ＹＳＰＩ（ｐ）ＹＳＥＬ）存在下または被存在かで評価分析が行わ れた。基質からの［³²Ｐ］の分離は、レクライダー等（同）で説明されたように 確定された。 ３つの別個の実験が上記説明のように実施され、各々の標本は二通り実験され た。フォスファターゼ評価分析の結果では、ｐＩＴＩＭペプチドを追加すると、 ＰＴＰ１Ｃ酵素の特有の活性が４倍に増加した。ＩＴＩＭペプチドは、ＰＴＰ１ Ｃ活性を抑制しなかったが、一方では、チロシンリン酸化Ｉｇ−α及びＦｃεＲ Ｉ−βＩＴＡＭペプチドは、かなり［³²Ｐ］の分離を抑制した。総合すれば、結 果としては、ＰＴＰ１ＣとｐＩＴＩＭペプチドとの結合は、このような活性を増 強させることにより、ＰＴＰ１Ｃのフォスファターゼ活性を調整する。実施例７ この実施例では、ＩＴＩＭチロシンを欠く突然変異したＦｃγＲＩ ＩＢ１を用いてＦｃγＲＩＩＢ１の抑制作用とＦｃγＲＩＩＢ１ＩＴＩＭのチロ シンリン酸化との関係及び生体内でのＰＴＰ１Ｃとの結合が説明される。 アミノ酸残分３１４で切形されたＦｃγＲＩＩＢ１を記号化したり、ＩＴＩＭ のチロシン３０９がアラニン（ＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａ）で代用されるアミノ酸 残分３１４で切形された野生型ＩＴＩＭ（ＣＴ３１４ＷＴ）及びアミノ酸残分３ １４で切形されたＦｃγＲＩＩＢ１を含む発現ベクトルが、ＩＩＡ１．６細胞へ と形質転換され（ジョーンズ等による免疫学ジャーナル誌１３６：３４８から３ ５２、１９８６年刊で一般的に説明されている）、そしてこの明細書で、夫れ夫 れＣＴ３１４ＷＴ−ＩＩＡ１．６細胞及びＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａ−ＩＩＡ１． ６細胞と称されている。 夫れ夫れの細胞ラインの表面にあるＣＴ３１４ＷＴ及びＣＴ３１４Ｙ３０９− Ａと記号化されたレセプタの発現は、以下のように確認された。即ち、約１ｘ１ ０⁶ＣＴ３１４ＷＴ−ＩＩＡ１．６細胞及びＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａ−ＩＩＡ１ ．６細胞については、バイオタイニレートされた（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ） ２．４Ｇ２抗体及び蛍光化アビジン（ターゴ社、カリフォルニア州バーリンゲー ム）あるいはｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎａｔｅｄアビジンのみで着色され、そしてジ ャステメント等による免疫学ジャーナル誌１４３：８８１から８８６、１９８９ 年刊で説明されているように、フロー血球計算（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン デ ィクトン社、カリフォルニア州リッチモンド）によって分析された。結果が示し たのは、ＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａ−ＩＩＡ１．６細胞は、バックグラウンド以上 に増加した数のＣＴ３１４ＷＴ符号化レセプタを発現し、またＣＴ３１４Ｙ３０ ９−Ａ−ＩＩＡ１．６細胞がバックグラウンド以上に増加した数のＣＴ３１４Ｙ ３０９−Ａ符号化レセプタを発現したことであった。 Ａ．『カルシウム評価分析』 ＣＴ３１４ＷＴ及びＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａ記号化レセプタが、そのＢＣＲと のリゲーションの後にＣＡ²⁺の可動化を抑制する能力が評価分析された。１ｘ１ ０⁶ＣＴ３１４ＷＴ−ＩＩＡ１．６細胞及びＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａ−ＩＩＡ１ ．６細胞は、５μＭのインド−１ＡＭ(モルキュラープローブ、ワシントン州 ユージン)で、ジャステメント他(同)で説明されている方法を用いてロード(load )された。その後、インドがロードされた細胞は、１２μｇ／ｍｌの抗ｍＩｇ抗 体か、２０μｇ／ｍｌの完全な抗ｍＩｇ抗体の何れか一方で刺激され、ＣＡ²⁺反 応が、フロー血球計算（型式５０Ｈ、オルト診断装置、マサチーセッツ州ウエス トウッド）で記録された。反応細胞％は、付属のデータ捕捉装置及びＭｕｌｔｉ ＴＩＭＥソフトウェア（フェニックスフロー装置社、カルフォルニア州サンディ エゴ）を用いて評価された。 結果では、Ｆ（ａｂ’）₂抗ｍＩｇ抗体でＣＴ３１４ＷＴ−ＩＩＡ１．６細胞 を刺激すると、刺激が完全な抗ｍＩｇ抗体で行われる場合は、かなり抑制された ［Ｃａ²⁺］_iの増加を誘発したということを示した。したがって、その切形は、 かならずしもＦｃγＲＩＩＢ１の否定的信号をそれほど抑制しないことを示した 。対照的に、トランスフェクトされていない細胞、あるいはＣＴ３１４Ｙ３０９ −Ａ−ＩＩＡ１．６細胞は、完全な抗ｍＩｇ抗体、あるいはＦ（ａｂ’）₂抗ｍ Ｉｇ抗体での刺激によって同様な遅延相にあるＣａ²⁺の可動化を示した。したが って、ＩＴＩＭのチロシンが、Ｃａ²⁺の可動化の抑制には不可欠であるという事 が分かった。Ｃａ²⁺の小規模の可動化は、ＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａ突然変異Ｆｃ γＲＩＩＢ１とのＢＣＲリゲーションに反応して検出され、細胞膜領域内の他の 部分が、ＦｃγＲＩＩＢ１媒介否定的信号を発する際に、一定の役割を担ってい る可能性を示している。 Ｂ． チロシンリン酸化の研究 ＦｃγＲＩＩＢ１は、実施例２に説明された方法を用いて、刺激を与えられて いないか、完全な（８０μｇ／ｍｌ）、あるいはＦ（ａｂ’）₂（５０μｇ／ｍ ｌ）で刺激された、ＩＩＡ１．６トランスフェクト細胞（１標本当り５０ｘ１０⁶ ）から免疫沈降された。免疫沈降物質は、実施例２で説明された方法でギ酸溶 出によって集められ、ＳＤＳ減少サンプル緩衝剤の中で５分間煮沸された後で、 １０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで細分され、イモビロン−Ｐに電気泳動によって移転 され、そして抗フォスフォホスフォチロシン抗抗体及び抗ＦｃγＲＩＩＢ１抗体 で順に免疫ブロットに晒された。免疫ブロットは、ＥＣＬ検出装置（アマーシャ ム）でデベロップさせた。 結果としては、完全な抗ｍＩｇ抗体で刺激された細胞から分離されたＣＴ３１ ４ＷＴは、チロシンリン酸化され、ＰＴＰ１Ｃ蛋白質を結合したことが示された 。反対にＣＴ３１４Ｙ３０９−Ａレセプタは、リン酸化されず、またＢＣＲコリ ゲーション後にＰＴＰ１Ｃを結合しなかった 前段のカルシウム評価分析結果と併せると、これらのデータが示しているのは 、ＩＴＩＭのチロシンリン酸化は、ＰＴＰ１Ｃ結合にも、ＦｃγＲＩＩＢ１媒介 否定的信号も重要であるということであり、ＰＴＰ１Ｃ結合は、ＦｃγＲＩＩＢ １作用に不可欠であることを示唆している。実施例８ この実施例では、ＦｃεＲ１媒介シグナリング及びラット塩基好性 白血病細胞に於けるＰＴＰ１Ｃ発現が説明される。 内生的Ｆｃεレセプタ（ＦｃεＲ１）を発現するラットの塩基好性白血病（Ｒ ＢＬ）細胞は、標識ベクトル記号化ＦｃγＲＩＩＢで形質転換された。その形質 転換されたＲＢＬ細胞に於けるＰＴＰ１Ｃ発現は、抗ＰＴＰ１Ｃ抗血清を用いて 完全な細胞溶解産物の免疫ブロットによって確認された。その免疫ブロットの結 果では、形質転換されたＲＢＬ細胞が、Ａ２０Ｂ細胞に匹敵する量のＰＴＰ１Ｃ を発現させる事が示された。 上記説明の形質転換されたＲＢＬ細胞を用いて、ＦｃεＲ１凝集に続いて生じ るチロシンリン酸化の範囲が、Ｋ４６μＢリンパ腫細胞と比較された。Ｋ４６μ Ｂリンパ腫細胞（１ｍｌ当り４ｘ１０⁷）は、５０μｇ／ｍｌの単クローン性抗 ＩｇＭ抗体（ｂ−７−６）で、摂氏３７度で３分間、刺激された。ＲＢＬ細胞（ １ｍｌ当り１ｘ１０⁶）は、ＤＮＰ特有ｌｇＥ抗体で一晩、またＤＮＰ−ＢＳＡ 抗原（２０ｎｇ／ｍｌ）で、摂氏３７度で３分間、定温放置された。刺激された 、あるいは刺激されていない細胞の澄んだ１％ＮＰ−４０溶解産物が準備され（ Ｋ４６μには１ｘ１０⁶細胞の当量、ＲＢＬには１ｘ１０⁵細胞の当量）、そして ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、還元状態の下で細分された。蛋白質は、イモビロンに移さ れ、抗ホスフォチロシン特有抗体を用いて免疫ブロット分析され、そしてＥＣＬ 法で視覚化された。 免疫ブロットの結果が示しているのは、形質転換されたＲＢＬ細胞は、ラットＩ ｇＥ抗ＤＮＰ抗体及びＤＮＰ−ＢＳＡ抗原を用いるＦｃεＲ１凝集時に、蛋白質 チロシンリン酸化及び反応を示すことである。実施例９ この例は、ヒト及びマウスのナチュラルキラー細胞抑制レセプタ」が 、ＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄたんぱく質チロシンホスファターゼを補充すること を示すものである。材料及び方法 ペプチド マウスでは、Ｌｙ４９がＨ−２Ｄ^d及びＨ−２Ｄ^kと直接相互作用する （カーホファー、エフ．エム．、アール．ケー．リボード及びダブリュ．エム． ヨコヤマ著、１９９２、ネイチャー誌３５８：６６）が、ヒトでは、ｐ５８．１ ８３がＨＬＡ−Ｃｗ３と相互作用する（モレッタ、Ａ、Ｍ ビターレ、Ｃ．ボッ ティーノ、Ａ．Ｍ．オレンゴ、Ｌ．モレッリ、Ｒ．オーギュリアーロ、Ｍ．バー バレシ、Ｅ．チッコーン、及びＬ．モレッタ著、１９９３、医学研究ジャーナル １７８：５９７）。以下のペプチドが、非リン酸化又はチロシンリン酸化した状 態で得られた。アミノ酸の番号（下付番号）は符号配列の開始残分Ｍからである 。 リン酸化したＣＤ３ζ１、ＦｃεＲＩｇ、ｐ５８．１８３．１及びｐ５８．１８ ３．２ペプチドがネオシステム（フランス）から得られ、Ｎ−ターミナルビオチ ンと合成された。未リン酸化ペプチドはマルセーユ−ルュミニ免疫センタでＰ． フーケにより合成され、ビオチニル化した又はしていないＮ−ターミナル（ＮＨ Ｓ−ＬＣ−ビオチン、ピアス社製）として得られた。ビオチニル化ペプチドはス トレプタビジン−アガロースビーズ（シグマ社製）に、Ｌｙ４９ペプチドはＣｎ Ｂｒ−セファロースビーズ（ファーマシア社製）に、メーカの推奨するように結 合させた。 表面プラズモン共振 ＢＩＡコア装置（ファーマシア社製）でＳＰＲ測定を行っ た。ＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｃ−ＳＨ２（Ｎ＋Ｃ）及びＧＳＴ−ＺＡＰ−７０−ＳＨ２ （Ｎ＋Ｃ）融解たんぱく質は既に説明され（モレッタ他著、１９９３、医学実験 ジャーナル１７８：５９７ｄ、指示されたように（ダンブロシオ他著、１９９５ 、サイエンス誌２６８：２９３）ＤＨ５ａ溶解産物から精製された。組換えＨｉ ｓ標識付全長ＰＴＰ１Ｄたんぱく質をＮｉ−アフィニティカラムで精製した。ビ オチニル化ペプチド（２ｎｇ）をストレプタビジンマイクロチップ上に非可動化 して、それらの非可動性を、抗ホスフォチロシンｍＡｂ（４Ｇ１０、ＵＢＩ）の 結合により確認した。 細胞及び細胞溶解産物 ｐ５８．１８３ＮＫＩＲを発現するＣＤ３／ＴＣＲ⁺Ｔ 細胞を末梢血液リンパ球から分離して、上述のように組換えＩＬ−２（１００Ｕ ／ｍｌ）のあるところで培養した。ヒトＮＫ細胞種ＮＫ３．３（コーンブルス他 著、１９８２、免疫学ジャーナル１２９：２８３１）及びＮＫＬ（カウフマン他 著、１９９５、米国国家科学アカデミー手続集９２：６４８４）を、１０％のヒ トＡＢ血清及びペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ−１６４０中 で保持した。細胞を、氷上で１５分間、ＮＰ−４０溶解緩衝液（１％のＮＰ−４ ０、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、 １ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＮａピロリン酸塩、０．４ｍ ＭのＮａバナジン酸塩）中で溶解させた。不溶性の物質を１２，０００ｒｐｍで １５分間の遠心法により取り除いた後、試料を直接用いるか、あるいはビーズに 結合したペプチドを用いて親和性精製を行った。ビオチニル化ペプチド（５ｍｇ ／ｍｌ）ストレプタビジン−アガロースビーズに１時間、摂氏４度で結合させた （シグマ社）後、ビーズをＤ−ビオチン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて１時間、摂氏 ４度で飽和させた（シグマ社）。溶解緩衝液で３回洗浄した後、試料を還元試料 緩衝液（ニューイングランドビオラブズ）により化合させて沸騰させ、さらにＳ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)により分離した。 抗−ＰＴＰ１Ｃ（０．５ｍｇ／ｍｌ）及び抗−ＰＴＰ１Ｄ（０．１ｍｇ／ｍｌ） ｍＡｂはトランスダクションラボラトリーズから購入した。ワサビペルオキシダ ーゼ−共役ウサギ抗−マウス抗血清（シグマ）及びＥＣＬ検出システム（アマー シャム）を用いて免疫ブロットを呈させた。 ＲＢＬ細胞は、ご厚意によりマーク デーロン博士（パリ、キュリーインステ ィテュート）から得た（デーロン他著、１９９５、免疫性３：１）。ＲＢＬ細胞 を、ＲＳＶ−５．ｇｂｔ発現ベクタ中でｐ５８．１８３を符号化する１８３．６ ｃＤＮＡを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。安定し たトランスフェクタントが、キサンチン（２５０ｍｇ／ｍｌ）、ヒポキサンチン （１３．６ｍｇ／ｍｌ）及びミコフェノール酸（２ｍｇ／ｍｌ）の存在する培養 により得られた。ｐ５８．１８３ｍｐ細胞表面での発現を、免疫蛍光法及び血球 計算法による分析で確認した。代表的クローン（Ｔ５８．Ａ）から得た細胞を、 ３分間摂氏３７度で１５０ｍＭのペルバナジン酸ナトリウムのあるところ、又は ないところで刺激した。次に細胞をすぐ、摂氏４度でＮＰ−４０溶解緩衝液中で 溶解させて、１０ｍｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３ｅ又は抗−ＧＬ１８３ｍＡｂ、及びた んぱく質Ｇセファロースビーズを用いて免疫沈降を行った。 ＰＴＰ１Ｃ／ＰＴＰ１Ｄ結合 リン酸化したｐ５８．１８３ペプチドに結合する ＰＴＰ１Ｃを、ヒトＴ及びＮＫ細胞溶解産物について調べた。ＮＫ３．３細胞は ＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解させて、未リン酸化のｐ５８．１８３．１と、ス トレプタビジン−アガロースビーズに結合したリン酸化したｐ５８．１８３１及 びｐ５８.１８３.２ペプチドと共に吸収された。親和結合たんぱく質は１０％の ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に溶かして、ニトロセルロースに移行させ、抗ＰＴＰ１Ｃ及 び抗ＰＴＰ１ＤｍＡｂで調べた。ＮＫＬについては、細胞（１５×１０⁶細胞／ 試料）は上述のように調製され、ビーズに結合したリン酸化Ｐ５８．１８３．１ 、Ｐ５８．１８３．２及びＣＤ３ｚ．１ペプチドと吸収された。免疫ブロットを 抗−ＰＴＰ１ＣｍＡｂで調べた。ｐ５８⁺Ｔリンパ球を上述のように調製して、 ビーズに結合したリン酸化ｐ５８．１８３．１及びＣＤ３ζ．１ペプチドと吸収 させるか、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥで直接溶解させた。免疫ブロットは抗−Ｐ ＴＰ１ＣｍＡｂで調べた。 Ｐ５８．１８３分子を発現するＰＢＬ細胞をペルバナジン酸ナトリウムで刺激す るか、又はしなかった。ＮＰ−４０の溶解産物を調製して、非還元条件のもとで ８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで直接溶解させるか、あるいは、抗−ＣＤ３ε（ＵＣＨ Ｔ１、ＩｇＧ１）又は抗−ｐ５８．１８３（ＧＬ１８３、ＩｇＧ１）ｍＡｂを用 いて免疫沈降を行った。免疫ブロットは抗−ＰＴＰ１ＣｍＡｂで調べた。 組換えＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｃ（Ｎ＋Ｃ）−ＳＨ２融解たんぱく質及びＨｉｓ−Ｐ ＴＰ１Ｄに結合しているリン酸化Ｐ５８．１８３ペプチドの測定を、ＢＩＡコア ＨＢＳ媒質中の５００ｎＭの組換えたんぱく質を用いてＢＩＡコア上で行った。 フロー率は１０ｍｌ／ｍｉｎ．で一定に保たれた。この代表的実験では、それぞ れ１００及び１５０Ｕのｐ５８．１８３．１及びｐ５８．１８３．２リン酸化ペ プチドをストレプタビジンマイクロチップ上に非可動化した。再生緩衝液は、１ ０ｍＭのＮａＯＨ（ペーハー：１０）を補ったＢＩＡコアＨＢＳ媒質であった。 結果は、注入媒質を考慮に入れて、各試料について得た、手を加えていない値を 背景ＲＵから引いたものに相当する修正共振単位として表した。 ＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄに結合しているチロシン−リン酸化ヒト及びマウス ＮＫＩＲを比較するために、Ａ２０ネズミＢリンパ腫細胞から得たＮＰ−４０溶 解産物を、Ｌｙ４９−又はリン酸化Ｌｙ４９−ビーズのいずれかと吸収させた。 試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、多クローン性ウサギ抗−ＰＴＰ１Ｃ及び抗 −ＰＴＰ１Ｄ抗体と明らかにした。ＷＣＬは全細胞溶解産物である。結合は、吸 収中の溶解産物に５０ｍＭの−ρニトロフェニールホスフェート（ｐＮＰＰ）、 つまりホスフォチロシンの類似体を加えて抑制した。 Ａ２０細胞溶解産物を上述にように調製して、未リン酸化又はリン酸化Ｆｃｇ ＲＩＩＢＩＩＴＩＭペプチドを用いて吸収を行った。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで 分析して、多クローン性ウサギ抗−ＰＴＰ１Ｃ及び抗−ＰＴＰ１Ｄ抗体と明らか にした。結合は、吸収中の溶解産物に５０ｍＭのｐＮＰＰを加えて抑制した。 さらにＮＰ−４０溶解産物をジャーキャットヒトＴ白血病細胞から調製した。 試料を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶かし、ニトロセルロースに移行させてそれ ぞれを抗−ＰＴＰ１及びＰＴＰ１ＤｍＡｂで調べた。 結果 ヒトＮＫＩＲ分子が二つの独立したＩＴＩＭ配列を含む可能性を直接調べるた めに、ｐ５８．１８３細胞質内配列のＮ−ターミナルＹ₃₀₃（ｐ５８．１８３． １ペプチド）及びＣ−ターミナルＹ₃₃₃（ｐ５８．１８３．２ペプチド）残分を 取り囲む未リン酸化及びリン酸化ペプチドを合成した。これらのペプチドをビー ズに結合した後、二つの異なるヒトＮＫ細胞種であるＮＫ３．３及びＮＫＬから 調製した溶解産物と、ヒトｐ５８．１８３⁺Ｔ細胞溶解産物とを吸収させ、抗− ＰＴＰ１ＣｍＡｂを用いて免疫ブロッティングを行った。リン酸化ｐ５８．１８ ３ペプチドはそれぞれ、これらの細胞で発現するＰＴＰ１Ｃ ＰＴＰａｓｅを結 合する。未リン酸化ｐ５８．１８３ペプチドを用いた場合では結合は検出されな かったが、これは、ＰＴＰ１Ｃの補充にはｐ５８チロシンのリン酸化が必要であ ることを示すものである。加えて、ｐ５８．１８３をトランスフェクトした細胞 から調製したｐ５８．１８３免疫沈降物はＰＴＰ１Ｃを含むため、ＰＴＰ１Ｃと リン酸化ＮＫＩＲとの結合を生体内で確認したことになる。重要なことに、この 結合が検出できるのは、ｐ５８．１８３をトランスフェクトした細胞をペルバナ ジン酸塩、つまりＰＴＫ−依存性の経路の作動物質で刺激した場合のみであり（ ドナデュ他著、１９９４、生物化学ジャーナル、２６９：３２８２８）、ＰＴＰ １Ｃがｐ５８．１８３のチロシンリン酸化形態に結合したことと合致する。 ＰＴＰ１Ｃに加えて、ＳＨ２−タンデムＰＴＰａｓｅの族はＰＴＰ１Ｄ（Ｓｙ ｐ、ＰＴＰ２Ｃ、ＳＨ−ＰＴＰ２）及びショウジョウバエ同族中びり節（ｃｓｗ ）を含む。ＰＴＰ１Ｄは遍在的に発現し、ＰＴＫ−依存性シグナリングメカニズ ムを調節する（ストーン、Ｒ．Ｌ．，及びＪ．Ｅ．ディクソン著、１９９４、生 物化学ジャーナル２６９：３１３２３）。従って、未リン酸化及びリン酸化ｐ５ ８．１８３ペプチドと共に吸収されたＮＫ細胞溶解産物についても、ＰＴＰ１Ｄ の結合を調べた。リン酸化Ｐ５８．１８３ペプチドはそれぞれＰＴＰ１Ｄを結合 していたが、未リン酸化Ｐ５８．１８３．１では結合は検出されなかった。ヒト ＮＫＩＲｐ５８は、ＦｃｅＲＩｇ及びＣＤ３ｚを含む多重結合の非共有的複合体 であ ることが示されている（ボッティーノ他著、１９９４、免疫学ヨーロッパジャー ナル、２４：２５２７）。ＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄの二重チロシンリン酸化Ｃ Ｄ３ｚ．１及びＦｃｅＲＩｇＩＴＡＭペプチドに体する結合は検出することはで きないが、これは、チロシンリン酸化ヒトＮＫＩＲのＰＴＰａｓｅ補充の特異性 を強調するものである。注目すべきことに、その他のＳＨ−２含有たんぱく質、 例えばｐ５６^lck及びｐ５９^fynの結合は、同様のペプチド吸収及び免疫ブロッテ ィング条件では検出されなかった（データの提示なし）。 未リン酸化ｐ５８．１８３．１ペプチドの場合と同様、未リン酸化ｐ５８．１ ８３．２ペプチドに対する結合は検出されなかった。この実験においてＰＴＰ１ Ｄに対応するより大きな信号は、抗−ＰＴＰ１ＣｍＡｂによるＰＴＰ１Ｃの認識 と比較すると抗−ＰＴＰ１ＤｍＡｂによるＰＴＰ１Ｄの認識の方が良いことの結 果である。 次にＰＴＰａｓｅに対するリン酸化ｐ５８．１８３の結合を表面プラズモン共 振（ＳＰＲ）を用いてリアルタイムで測定した。リン酸化ｐ５８．１８３．１及 びリン酸化ｐ５８．１８３．２ペプチドのＰＴＰ１Ｃに対する結合を、組換えＧ ＳＴ−ＰＴＰ１Ｃ−ＳＨ２（Ｎ＋Ｃ）融解たんぱく質を用いて観察し、リン酸化 ＮＫＩＲはそのＳＨ２部分を介して直接ＰＴＰ１ＣＰＴＰａｓｅを結合すること を確認した。Ｋｄ値の計算により評価すると、Ｎ−ターミナルｐ５８．１８３． １リン酸化ペプチドは、Ｃ−ターミナルｐ５８．１８３．２リン酸化ペプチドに 比べてＰＴＰ１Ｃをより強い結合力で結合する。 分離したＺＡＰ−７０タンデムＳＨ２部分に対するリン酸化ＣＤ３ｚ．１の結 合力は、ＰＴＰ１ＣタンデムＳＨ２部分に対するｐ５８．１８３リン酸化ペプチ ドの結合力に比べて大きかったが、後者は、ＰＴＰ１ＤがＰＤＧＦレセプタＹ_{10 09} リン酸化ペプチドに結合したことを示すＫ_dと合致するものである（ハイヤ他 著、１９９５、生化学３４：１０４０）。ＳＰＲ表１から計算すると、ＰＴＰ１ Ｄの各リン酸化ｐ５８．１８３ペプチドに対する結合は、ＰＴＰ１Ｃの結合より も４から６倍効率が低い。）これらのデータは、さらに、ｐ５８．１８３ＩＴＩ Ｍ様配列の結合力における階層状態を裏付けるものであるが、なぜなら、Ｎ−タ ーミナルｐ５８．１８３．１リン酸化ペプチドは、両ＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄ を、Ｃ−ターミナルｐ５８．１８３．２リン酸化ペプチドよりもより効率的に 結合するからである。 マウスＬｙ４９族の仲間もまたＩ／ＶｘＹｘｘＬＩＴＩＭ様配列を発現すると いう我々の観察に合致して、ＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１ＤＰＴＰａｓｅのリン酸化 対未リン酸化Ｌｙ４９細胞質内モチーフによる補充をテストした。リン酸化Ｌｙ ４９ＡペプチドはＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄを補充したが、Ａ２０細胞溶解産物 中、未リン酸化Ｌｙ４９Ａペプチドについては結合は検出されなかった。これら の実験では、Ｌｙ４９ＡペプチドがＰＴＰ１Ｃに結合するためにはチロシンリン 酸化が必要であるという確認を、ホスフォチロシン類似体であるρＮＰＰを用い た競合によりさらに行った。このように、Ｌｙ４９Ａで得た結果は、ヒトＮＫＩ Ｒ及びＦｃｇＲＩＩＢＩＩＴＩＭに関する我々の観察と同様であった。しかしな がら、ジャーキャット細胞で吸収されたＰＴＰａｓｅの量から判断すると、各ｐ ５８．１８３リン酸化ペプチドで観察された結合に比較すると、ＰＴＰ１Ｃ及び ＰＴＰ１Ｄのリン酸化Ｌｙ４９Ａに対する結合はより効率が低い。これらの細胞 では、Ｌｙ４９ＡのＰＴＰ１Ｃに対する結合は観察されなかったが、この明白な 食い違いは、おそらくはジャーキャット細胞に比較するとＡ２０細胞中にはより 多い量のＰＴＰ１Ｃが存在することを反映する（データの提示なし）。実際のと ころ、ＰＴＰ１Ｃに対する結合の競合相手であるリン酸化Ｐ５８．１８３．１に 対してリン酸化Ｌｙ４９ＡのＩＣ₅₀は、リン酸化ｐ５８．１８３．２のＩＣ₅₀と 同程度の大きさである（表２）、リン酸化Ｌｙ４９Ａが確かにＰＴＰ１Ｃに結合 することが裏付けられている。 配列の同族及びチロシンリン酸化時のＰＴＰａｓｅ補充に基づいて、ヒト及び マウスの両方のＮＫＩＲ細胞質内部分で発現するＩ／ＶｘＹｘｘＬ／Ｖモチーフ をＩＴＩＭと定義できると出願人は提案する。しかしながら、リン酸化したヒト ＮＫＩＲ及びＦｃｇＲＩＩＢＩＩＴＩＭは優先的にＰＴＰ１Ｃを補充する一方、 我々にデータは、リン酸化したマウスのＮＫＩＲＩＴＩＭは、ＰＴＰ１Ｃとより 、より大きな結合力でＰＴＰ１Ｄと結合することを示している。これらの観察は また、ＳＨ２部分の補充のためには、カノニカルｐＹ＋３アミノ酸に加えて、リ ン酸化チロシン残分のアミノ酸Ｎ−ターミナルが重要な必須条件である可能性を 示唆している（ソンヤン、Ｚ．及びＬ．Ｃ．カントレー著、１９９５、ＴＩＢＳ ２０：４７０）。このような配列認識に必要な条件が、ホスフォチロシン配列に 結合するＰＴＰ１ＤＳＨ２について既に引証されており、我々のデータとも合致 するが、ｖの位置がｐＹ−２にあることが重要であるとしてこの条件に含まれて いる（ハイヤ他著、１９９５、生化学、３４：１０４０）。 ＡＤＣＣ−依存性及びＣＤ３／ＴＣＲ−依存性形質導入経路とは対照的に、Ｍ ＨＣクラスＩレセプタのエンゲージメントに結合するシグナリングプログラムは 未だ不明である。ＮＫＩＲ細胞質内配列に存在するチロシンリン酸化ＩＴＩＭに よるＰＴＰａｓｅの補充は、あるシグナリングメカニズムがあり、このメカニズ ムにより、ＮＫＩＲのエンゲージメントが、ＮＫ及びＴ細胞の活性化プログラム の抑制につながることを実証するものである。リン酸化ＦｃｇＲＩＩＢＩＩＴＩ ＭによるＰＴＰａｓｅの補充と同様、我々の結果は、ＮＫＩＲと活性的レセプタ 、つまり、Ｔ及びＮＫ細胞中のそれぞれＣＤ３／ＴＣＲ及びＡＤＣＣレセプタ複 合体とのコエンゲージメントが、細胞質内ＮＫＩＲＩＴＩＭのリン酸化を引き起 こすことができ、その結果この細胞質内ＮＫＩＲＩＴＩＭがＰＴＰ１Ｃを補充す ることを示唆している。ＰＴＰ１Ｃの不足した虫食マウスにおいて活性化レセプ タ、例えばＢＣＲの調節不能があることは、これらのレセプタの下流にあるシグ ナリング要素の脱リン酸化が、活性反応の統一性にとっては中核であることを示 す(ダンブロシオ他著、１９９５、サイエンス誌、２６８：２９３)。虫食いマウ スから分離したＮＫ細胞の分化及び機能に欠陥があることは注目に値する(クー 他著、１９９１、免疫学ジャーナル、１４７：１１９４)。ＰＴＰ１Ｃ基質は明 らかに なっていないが、魅力的な可能性の一つは、ＳＨ２−タンデムＰＴＫ、例えばＺ ＡＰ−７０及びｐ７２^Sykのリン酸化形熊がＰＴＰ１Ｃにより脱リン酸化する可 能性である。実際にＴ細胞では、変更されたペプチドリガンドのＣＤ３／ＴＣＲ 複合体による認識の結果、ＣＤ３ｚＩＴＡＭによるＺＡＰ−７０の補充が、ＺＡ Ｐ−７０のリン酸化を伴わずに誘発され、不全型の信号が発生する（マドレナス 他著、１９９５、サイエンス誌２６７：５１５、ドゥマギストリ他著、１９９２ 、細胞６８： ６２５）。このように、同様な戦略はまた、Ｔ及びＮＫ細胞の活性化プログラム を抑制するのにＮＫＩＲが用いてきた戦略ではないかと考えられる。この意味で 、ＮＫ細胞の溶解から保護される標的細胞の、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の表面発現 による認識が、ホスファチジルイノシトール４，５二ホスフェートの加水分解の 抑制を引き起こし、その結果細胞質内カルシウム可動化の防止がなされることが 最近説かれた（カウフマン他著、１９９５、米国国家化学アカデミー手続集９２ ：６４８４）。同様に、変更されたペプチドリガンドによるＣＤ３／ＴＣＲ複合 体のエンゲージメント後のホスファチジルイノシトール４，５二ホスフェート加 水分解の不在も説明された（ドゥマギストリ他著、１９９２、細胞６８：６２５ ）。 もう一つの可能性は、ヤヌスＰＴＫ（ＪＡＫ）族の仲間が、ＮＫＩＲにより補 充されるＰＴＰａｓｅの標的ではないかというものである。ＮＫ細胞活性化プロ グラムにおけるＪＡＫＰＴＫの関連はまだ報告されないが、ＪＡＫ３^-/-突然変 異マウスはＮＫ細胞を欠き、ＰＴＰ１ＣはＪＡＫ１、ＪＡＫ２及びＴＹＫ２の機 能の下方調節に関係がある（パーク他著、１９９５、免疫性３：７７１、イェッ タ他著、１９９５、生物化学ジャーナル２７０：１８１７９）。 リン酸化ＮＫＩＲの結合が、ＰＴＰａｓｅ触媒活性の活性化につながるのかど うか、リン酸化ＦｃｇＲＩＩＢＩＩＴＩＭ及びＣＤ２２について説かれた程はま だ明らかにされていない（ダンブロシオ他著、１９９５、サイエンス誌２６８： ２９３、ドゥーディ他著、１９９５、サイエンス誌、２６９：２４２、キャンベ ル、Ｍ．Ａ．及びＮ．Ｒ．クリンマン著、１９９５、免疫学ヨーロッパジャーナ ル２５：１５７３）。この点で、ＰＴＰ１Ｃ又はＰＴＰ１ＤタンデムＳＨ２部分 の同時占有は、一つのみＳＨ２部分を占有する場合より、より強力なＰＴＰａｓ ｅ活性の刺激につながる(プラスキ他著、１９９５、生物化学ジャーナル２７０ ：２８９７)。ｐ５８．１８３リン酸化ペプチドのそれぞれはＰＴＰ１ＣＳＨ２ 部分を結合することができるが、各リン酸化ＮＫＩＲＩＴＩＭは主に同じＰＴＰ １Ｃ−ＳＨ２部分に結合し、二重のＳＨ２占有を理由としてＰＴＰａｓｅ活性を 強める働きはしない。リン酸化ＮＫＩＲのＰＴＰａｓｅ機能に対する作用に関係 なく、補充されたＰＴＰａｓｅが、ＰＴＰ１Ｃについて示されたように、補充及 び／又は活性化を他の効果器／アダプタ分子のために行うドッキング分子として 働く可能性もある（リー他著、１９９４、分子細胞生物学１４：５０９）。 自然の細胞毒性プログラムの分子崩壊はＮＫＩＲの発見につながった。マウス のＮＫＩＲはレクチンであり、ヒトのＮＫＩＲはＩｇ様部分を含むが、両レセプ タはＭＨＣクラスＩを結合し、エンゲージメントするとＮＫ及びＴ細胞の活性化 プログラムを抑制する形質導入を行う。これらの大きな構造上の違いにも拘らず 、我々のデータはヒト及びマウスのＮＫＩＲが、細胞質内チロシンリン酸化に則 して、ＳＨ２タンデムＰＴＰａｓｅＰＴＰ１Ｃ及びＰＴＰ１Ｄを補充することを 示している。マウスのレクチンＮＫＩＲ及びヒトのＩｇ様ＮＫＩＲの間の類似性 は、両タイプのレセプタが共通の形質導入経路を有していることを示し、Ｔ及び ＮＫリンパ球によるＭＨＣクラスＩの認識について驚くべき収斂進化を実証する ものであり、ＭＨＣクラスＩの品質管理の重要を示唆する。実施例１０ 本実施例は、ＣＤ１９チロシンリン酸化及びＰＩ−３キナーゼと の結合を抑制することにより、否定的なＦＣγＲＩＩＢ１シグナリングが媒介さ れることを説明する。 ＩｇＧのＢ細胞レセプタ（ＦｃｇＲＩＩＢ１）は、Ｂ細胞の活性化及び免疫反 応を阻止する否定的シグナリングの有力な変換器である。ＦｃｇＲＩＩＢ１とＢ リンパ球抗原レセ０プター（ＢＣＲ）のコリゲーションは、ホスフォイノシチド 加水分解及びＣａ²⁺の可動化の早期停止を引き起こし、よってＢＣＲ媒介増殖性 の反応を阻止する。これまでの研究で、この抑制性の信号は、蛋白質チロシンホ スファターゼＰＴＰ１Ｃを補充(recuit補充？)して、活性化するＦｃｇＲＩ ＩＢ１ Ｔｙｒ³⁰⁹に媒介されることが分かっている。しかし、ＰＴＰ１Ｃの標 的が何かは分かっていない。ここに開示されているように、ＢＣＲシグナリング のＦｃｇＲＩＩＢ１抑制はＢＣＲコレセプタ(coreceptor)であるＣＤ１９の脱リ ン酸化によって媒介される。ＣＤ１９の脱リン酸化は、ＣＤ１９のＰＩ−３キナ ーゼとの結合を弱め、結局はＢＣＲ媒介Ｃａ²⁺可動化を起させないようにする。 この結果は、ＦｃｇＲＩＩＢのＢＣＲとの共結合(co-engagement)が体液性の免 疫学的応答を抑制する分子的仕組みを表している。 抗原レセプタのＢリンパ球上の連結（リゲーション）は、Ｂ細胞レセプタ（Ｂ ＣＲ）サブユニットＩｇａとＩｇｂ及びコレセプタであるＣＤ１９の急なチロシ ンリン酸化をもたらす。（Ｄ．Ａ．ツベソン等、サイエンス誌２６０、９８６− ９８９（１９３３）Ｎ．Ｊ．チャルプニー等、ＥＭＢＯジャーナル誌１２、２６ ９１−２６９６（１９９３））。Ｉｇａ（tｙｒ^182&193）及びＩｇｂ（ｔｙｒ^{19 5&206} ）のリン酸化（Ｈ．フラスウィンケル、Ｍ．レス、ＥＭＢＯジャーナル誌 １３、８３−８９（１９９４）；Ｄ．クロケット等、生化学ジャーナル誌２６９ 、６４９１−６４９７（１９９４））は、そのＳＨ２部分を介してＢＣＲを結合 するＳｒｃ及びＳｙｋ族のキナーゼの補充及び活性化を引き起こす（Ａ.Ｌ.バー クハート等、米国自然科学アカデミー会報８８、７４１０−７４１４（１９９１ ）。Ｔ．ヤマダ等、欧州生化学ジャーナル誌２１３、４５５−４５９（１９９３ ）；Ｓ．Ａ．ジョンソン等、免疫学ジャーナル誌１５５、４５９６−４６０３（ １９９５））。さらに、ＢＣＲリゲーションはまたｐ２１^rasの活性化にも繋が り（Ａ．Ｅ．ハードウッド、Ｊ．Ｃ．キャンビア、免疫学ジャーナル誌１５１、 ４５１３−４５２２（１９９３））、Ｃａ²⁺の可動化にも繋がる。チロシン残分 ４８４及び／又は５１５におけるＣＤ１９リン酸化は、ＰＩ−３キナーゼの補充 及び活性化を引き起こす。そして、チロシン３９３のリン酸化は、多官能価のオ ンコプロテイン(oncoprotein)ＶＡＶを補充することがある（Ｄ．Ａ．ツベソン 等、サイエンス誌２６０、９８６−９８９（１９３３）。 こうした効果器の補充及びその後の活性化は、細胞表面分子の発現増加などの 様々な反応を引き起こし、これらには，細胞消滅、増殖、分化、更にＴ細胞／Ｂ 細胞の共同において作用するＭＨＣクラスＩＩ及びＢ７．２（ＣＤ８６）が含ま れる。 ＩｇＧ免疫グロブリン恒常域（ＦｃｇＲＩＩＢ１）に対するＢ細胞の低親和性 レセプタの抗原レセプタとのコリゲーション(coligation)は、不全なＢＣＲシグ ナリングに至り、その結果として生物学的反応を阻止する（Ｐ．Ｌ．チャン、Ｎ ．Ｒ．Ｓ．Ｃ．シンクレアー、免疫学誌２１、９６７−９８１（１９７１）；Ｎ ．Ｅ．フィリップス、Ｄ．Ｃ．パーカー、免疫学ジャーナル誌１３０、６０２− ６０６（１９８３））。ＦｃｇＲＩＩＢの抑制作用は、レセプタコリゲーション の後にリン酸化するチロシン残分を含む１３アミノ酸セグメントによって媒介さ れることが以前の研究から推定されている（Ｓ．アミゴレナ等、サイエンス誌２ ５６、１８０８−１８１２（１９９２）；Ｗ．Ｈ．フリードマン等、免疫学レビ ュー誌１２５、４９−７６（１９９２）；Ｔ．ムタ等、ネイチャー誌３６８、７ ０−７４、（１９９４））。このリン酸化はＳＨ２を含むチロシンホスファター ゼＰＴＰ１Ｃ（別名ＨＣＰ，ＳＨＰ，ＳＨＰＴＰ−１）の結合及び活性化に繋が る（Ｄ．ダマート等、サイエンス誌２６８、２９３−２９７、（１９９５））。 しかし、ＢＣＲシグナリングカスケードにおけるその作用は知られていない。 材料及び方法 抗体 本研究において使用された抗体は全てラビットのポリクロナール抗体 である。ＣＤ１９及びＩｇａの免疫原は完全な細胞形質部分、ｌｙｎ（残分１− １３１）、Ｓｙｋ（［Ｃ．Ｇ．クーチャー等、分子細胞生物学誌、１３、５２４ ９（１９９４）］に記載の結合域）、ｐ８５（Ｎ末端ＳＨ３部分）である。抗Ｖ ＡＶはサンタクルーズ社製のもので、抗ｐ８５はアップステート人間工学社製で （ウエスタンブロット(western blotting)用）、抗ホスフォチロシン(anti-phos photyrosine)（Ａｂ−２）は腫瘍遺伝子科学社製のものである。免疫沈降用には 、親和性精製抗体（抗ｓｙｋは除く）をＣＮＢｒ−セハローゼ(Sepharose)に１ ｍｇ／ｍｌ及び２０μｇで結合した。Ｓｙｋ免疫沈降は２０μリットルの粗血清 及び１０μリットルの蛋白質−Ａセハローゼ(Sepharose)（ファーマシア(Pharma cia)）を用いて行われた。ウエスタンブロット(western blotting)は、一 次抗体及びペルオキシダーゼ共役蛋白質Ａ（アマーシャム(Amersham)）又はホス フォチロシン(phosphotyprosine)のラットの抗マウスＩｇＧ１（ジメド(Zymed) ）を用いて行われた。ＣＤ１９構成 ヒトＣＤ１９のｃＤＮＡがｐＭＴ２（デューク大学のトーマス ・テダーから寄贈）からＥｃｏＲ１蒸解(digest)によって分離し、ｐＳＫブルー スクリプト(Bluescript)(ストラタゲン(Stratagene))にサブクローン(subclone) した。このＣＤ１９のｃＤＮＡはその後、ｐＳＫからヒンド(Hind)ＩＩＩ／Ｃｌ ａ Ｉ制限蒸解によって分離し、ｐＬＮＣＸにクローンとして発生させた（ウイ リアムズ、フレッド・ハッチンセン癌センター、ワシントン州シアトル）。この 構成は、ＧＰ＋Ｅ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞にエレクトロポレート(electroporate)し 、７２時間後に上澄みを収集した。１μｇ／ｍｌのツニカミシン(tunicamysine) の中で１２時間定温放置した後、ＧＰ＋Ｅ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、上記の収集し た細胞上澄みと共に定温放置することによりｐＬＮＣＸ・ｈＣＤ１９レトロウイ ルスに感染させた。Ｇ４１８（ギブコ−ＢＲＬ）選択（１μｇ／ｍｌ）に続いて 、ウイルス発現クローンが選択された。これらの細胞から収集したウイルスは、 Ｊ５５８Ｌμｍ１３骨髄腫細胞を感染させるのに用いられた。ヒトＣＤ１９肯定 的Ｊ５５８Ｌμｍ３細胞は、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）選択後に、マウス単一ク ローン系をもちいてバルク感染母集団からｑからヒトＣＤ１９への細胞選別によ って得られた（キャルタグ研究所、カリフォルニア州サンフランシスコ）。チロシンリン酸化実験 細胞（１０⁸／ｍｌ）をＦ（ａｂ’）₂（１２μｇ／ｍ ｌ）又は完全な（２０μｇ／ｍｌ）ラビット抗ｍＩｇを用いて刺激しつつ、或は 刺激しないで放置し、ピコフュージ(picofuge)としてペレット化して刺激抗体を 取り除き、その後１％のＮＰ−４０溶解緩衝剤［１％のＮＰ−４０、１５０ｍＭ のＮａＣｌ、１０ｍＭのトリスＨｃｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのオルトバナデ ートナトリウム(sodium orthovanadate)、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０ ．４ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニル弗 化物(phenylmethylsulfonyl floride)、及び各２μｇ／ｍｌのアプロチニン、 リューペプチン(leupeptin)、及びａ−１抗トリプシン］の中で溶解し、エッペ ンドルフマイクロフュージで１４，０００ｒｐｍの速度で５分間回転させ、洗浄 剤に不溶性の物質を取り除いた。非特異的バンドを抑制するため、ＳＤＳが上記 の溶解産物（最終的に０．５％）に加え、その溶解産物を５分間煮沸し、溶解緩 衝剤で１から５倍まで希釈した。次に溶解産物をシグナリング分子が表示される まで抗体と共に１５分間定温放置し、溶解緩衝剤で３回素早く洗浄し、ＳＤＳを 減少させるサンプル緩衝剤で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで細分し、イモビロン −Ｐ膜(ミリポア(Millipore)）に移した。れらの膜は５％のウシの血清アルブミ ンでブロックし、抗ホスフォチロシン及び抗効果器抗体で免疫ブロットし、強化 化学ルミネセンス（ＥＣＬ）検出装置（アマーシャム）でデベロップ(develop) させた。 ＢＣＲ媒介チロシンリン酸化後のＦｃｇＲＩＩＢ１のＢＣＲ媒介チロシンリン 酸化後のコリゲーション(coligation)への影響を測定するため、Ａ２０及びＩＩ Ａ１．６（Ａ２０のＦｃｇＲＩＩＢ１の否定的変異体）Ｂリンパ腫細胞を刺激薬 なしで培養するか、マウス免疫グロブリンに対するラビット抗体の完全な又はＦ （ａｂ’）₂断片で刺激した。ホスフォチロシン及び効果器を順に免疫ブロット した後、像を走査し、抗ホスフォチロシン信号及び抗効果器信号の画素密度を測 定した。その値は、存在する効果器の量に合せて正規化された。ｐ８５／ＣＤ１９結合 Ａ２０細胞を、２分間刺激薬なしで培養するか、完全 な又はＦ（ａｂ’）₂ラビット抗マウスＩｇの抗体で刺激した。細胞を溶解し、 ＣＤ１９またはｐ８５は免疫ブロットした。免疫沈降物は洗浄し、ＳＤＳを減少 させるサンプル緩衝剤で溶出させ、１０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥで細分し、 イモビロン−Ｐ膜(ミリポア(Millipore)）に移した。れらの膜は、上記のように 抗ＣＤ１９及び抗ｐ８５で順に免疫ブロットした。ＰＩ ３−キナーゼ活動のＤ Ｃ１９との共沈が、上記のように刺激され溶解されたＡ２０細胞から推定された 。免疫沈降物は洗浄し、ＰＩを基質として用いてＰＩ ３−キナーゼ活動に関し て評価分析し、反応生成物が薄層クロマトグラフィーによって消散(resolve)さ れた。³²ＰＯ₄のホスファチジルイノシトールリン酸エステル（ＰＩＰ）への取 入れは ホスフォリマージャー(Phosphorimager)を用いてその量を計った。 結果 抗原レセプタシグナリング経路中のＰＴＰ１Ｃのターゲットを定義するため、 出願人は、ＢＣＲの架橋のみの後とＦｃｇＲＩＩＢ１をＢＣＲと架橋した後に、 基質(substrate)チロシンリン酸化を比較した。ＦｃｇＲＩＩＢ１肯定的ネズミ Ｂリンパ腫細胞ラインＡ２０及びそのＦｃｇＲＩＩＢ１の否定的変異体を、完全 な（Ｉ）又はＦ（ａｂ’）₂ラビット抗マウス免疫グロブリンで刺激した。そし てチロシンでリン酸化した蛋白質のスペクトルを前細胞溶解産物の抗ホスフォチ ロシン免疫ブロットによって比較した。ＢＣＲのみによって刺激された後にリン 酸化した顕著な基質(substrate)の中では、１つの主たる種がＢＣＲ−ＦｃｇＲ ＩＩＢ１コリゲーション(coligation)後に見当たらないだけであった。この種は 、１１５ｋＤａまでの見掛けの分子質量を持ち、ネズミのＣＤ１９に対応する位 置まで移行した。ＦｃｇＲＩＩＢ１のリン酸化及び１６０ｋＤａにおける未確認 種は、ＦｃｇＲＩＩＢ１及びＢＣＲが架橋された時のみ見られた。ＦｃｇＲＩＩ Ｂ１否定的細胞が完全な抗レセプタ抗体で刺激された場合は、ＣＤ１９の不成功 リン酸化もｐ１６０及びＦｃｇＲＩＩＢ１のリン酸化も見られなかった。このデ ータは、ＢＣＲ連結時のチロシンリン酸化された主基質の中では、ＣＤ１９がＰ ＴＰ１Ｃの基質かもしれない事を示している。 ＦｃｇＲＩＩＢ１がＢＣＲとコリゲーションした際に、ＣＤ１９が早まって脱 リン酸化した可能性が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで細分した免疫沈降物を刺激されたＢ 細胞から抗ホスフォチロシン免疫ブロットすることによって確認された。分析さ れた基質は、ＣＤ１９、Ｉｇａ、ＶＡＶ、ＬｙｎおよびＳｙｋがあり、ＢＣＲリ ーゲーション後にＣＤ１９は最も迅速にリン酸化され、ＦｃｇＲＩＩＢ１コリゲ ーション後に直ちに脱リン酸化された。ＣＤ１９は最も初期においても(１５秒) チロシンリン酸化が顕著に低下したレベルにあることを示した。Ｉｇａのチロシ ンリン酸化の低下は４５秒時点で明確になったのみで、１２０秒経過時までには 背景レベル（７３％）まで減少した。Ｓｙｋのチロシンリン酸化状態の若干の減 少が１２０秒及び３００秒経過時に検出されたが、ＬｙｎやＶＡＶのリン酸化で は差は検出されなかった。ＦｃｇＲＩＩＢ１表示の欠如に一致して、ＩＩＡ１． ６を完全な又はＦ（ａｂ’）₂抗レセプタ抗体で刺激すると、これら基質の蛋白 質チロシンリン酸化の同等レベル及び継続時間を引き起こした。 これまでの研究から、ＣＤ１９中のチロシン残分４８４及び／又は５１５のリ ン酸化は、ＰＩ−３キナーゼｐ８５サブユニットのＳＨ２部分を介してＰＩ−３ キナーゼの結合を引き起こすことが知られている（Ｄ．Ａ．ツベソン等、サイエ ンス誌２６０、９８６−９８９（１９３３））。ＣＤ１９中のリン酸化のＦｃｇ ＲＩＩＢ１媒介減少が、ＰＩ−３キナーゼとの結合を防いだのか終結させたのか を調べるため、ＣＤ１９とＰＩ−３キナーゼを、完全な又はＦ（ａｂ’）₂で刺 激したＡ２０細胞のＮＰ−４０の溶解産物から免疫沈降させた。免疫沈降物は、 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で細分し、ＰＶ ＤＦ膜に移し、抗ＣＤ１９及び抗ｐ８５で順に吸い取った。これまでに発表され た結果と同様に（Ｄ．Ａ．ツベソン、同上）、細胞をＦ（ａｂ’）₂抗レセプタ 抗体で刺激した際は、ＣＤ１９と結合したｐ８５の量は顕著に増加した。対照的 に、細胞がＦｃｇＲＩＩＢ１とＢＣＲを架橋した完全なの抗体で刺激された際は 、ＣＤ１９と結合したｐ８５のレベルは、ほぼ基底レベルに留まった。この結合 増加は、抗ＣＤ１９または抗ｐ８５による沈降で実証された。よってＢＣＲとの ＦｃｇＲＩＩＢ１コリゲーションはＣＤ１９の脱リン酸化を引き起こし、免疫ブ ロットに基づいて検出可能なｐ８５の補充を防いだ。 更に、ＣＤ１９のリン酸化がＰＩ−３キナーゼのレセプタ・共レセプタ複合体 への活動の補充減に至るかを推定するため、刺激を受けないＡ２０細胞又はＦ( ａｂ’)₂又は完全なラビット抗マウスＩｇで刺激されたＡ２０細胞からのＣＤ１ ９免疫沈降物に対してＰＩ−３キナーゼの評価分析が行われた。刺激を受けてい ない細胞から分離されたＣＤ１９はこの評価分析の背景を僅かに上回るＰＩ−３ キナーゼ活動レベルを含むにすぎなかった。しかし、ＢＣＲ刺激の（Ｆ（ａｂ’ ）₂）後には、ＣＤ１９に関連したＰＩ−３キナーゼ活動量は１９倍以上にもな った。重要な点は、ＣＤ１９チロシンリン酸化に対する作用に加え、ＢＣＲとの ＦｃｇＲＩＩＢ１コリゲーションが、ＣＤ１９のＰＩ−３キナーゼ活動への結合 を ７５％減少させたことである。ＦｃｇＲＩＩＢ１否定的細胞ラインＩＩＡ１．６ を使った対照実験によって、この減少した結合のＦｃレセプタ依存性が確認され た。 ＢＣＲとのＦｃｇＲＩＩＢ１コリゲーションの作用は詳しく発表されており、 その作用はＢＣＲ媒介の細胞外カルシウム流入が早く終結してしまうことである （図２参照）（Ｈ．Ａ．ウィルソン等、免疫学ジャーナル誌１３８、１７１２− １７１８（１９８７）；Ｄ．クロケット等、細胞生物学ジャーナル誌１２１，３ ５５−３６３（１９９３））。総合すると、この発見と上述の発見は、不全型な Ｃａ²⁺の可動化はＰＩ−３キナーゼ活性化失敗に起因する可能性を示唆している 。ＰＩ−３キナーゼの活動は幾つかの（全部でない）細胞型におけるＣａ²⁺の可 動化に関係している。ＰＩ−３キナーゼがＢＣＲ媒介Ｃａ²⁺の可動化に関係して いるかどうかを調べるため、出願人はＰＩ−３キナーゼ阻害物質であるヴォート マニン（Ｈ．ヤノ等、生物化学ジャーナル誌２６８、２５８４６−２５８５６（ １９９３）；Ｔ．オカダ等、生物化学ジャーナル誌２６９（１９９４））及びＬ ｙ２９４００２（Ｃ．Ｊ．ブラホス等、生物化学ジャーナル誌２６９、５２４１ −５２４８（１９９４））がＢＣＲ媒介Ｃａ²⁺の可動化に与える影響を推定した 。図２に示されているように、１０ｎＭボートマニンは、ＢＣＲ媒介されたＣａ²⁺ の可動化をかなり抑制した。同様の結果はＬｙ２９４００２においても観察さ れた。ＦｃｇＲＩＩＢ１架橋とは異なり、ボートマニンは初期及び長期のＣａ²⁺ 反応を抑制した。これは、ＦｃｇＲＩＩＢ１・ＢＣＲコリゲーション後に否定的 シグナリングを達成する際に、ＦｃｇＲＩＩＢ１及びＰＴＰ１Ｃを補充し、且つ 活性化する必要性により課せられたタイムラグによるのかもしれない。上記の結 果は、ＢＣＲ媒介Ｃａ²⁺の可動化及びＦｃｇＲＩＩＢ１コリゲーションによるそ の中断における、ＣＤ１９リン酸化及びＰＩ−３キナーゼ転座の決定的な役割と も一致する。 ＰＩ−３キナーゼとＣａ²⁺の可動化の関係に更に直接的に考察するため、ＢＣ Ｒ媒介されたＣａ²⁺の可動化を、免疫ブロットで判断する限り外生のＢ細胞抗体 レセプタ及びＣＤ４５を発現するがＣＤ１９は発現しないプラスマ細胞腫細胞ラ イン（Ｊ５５８Ｌμｍ３ＣＤ４５＋）において分析した。この細胞のヒトＣ Ｄ１９＋変異体を、レトロウイルス変換(retroviral transformation)によって 生成した（図３参照）。ＣＤ１９^-細胞ラインでのＢＣＲのコリゲーションは、 Ｃａ²⁺の可動化に至ったが、初期フラックスのみ観察された。対照的に、ＣＤ１ ９が発現された場合は、初期及び長期のＣａ²⁺可動化が観察され、通常のＢ細胞 及びＡ２０細胞を思い起こさせる。よって、ＦｃｇＲＩＩＢ１がＢＣＲにコリゲ ーションされる際に観察されるように、ＣＤ１９の作用がない場合は長期のＣａ²⁺ 可動化が失われる結果となる。 これらの結果が示しているのは、ＰＩ−３キナーゼのＣＤ１９媒介補充及び活 性化が、細胞外Ｃａ²⁺流入のＢＣＲ媒介可動化に必要だということである。この 反応のＰＩ−３キナーゼ調整の分子的主成分(molecular basis)は明らかでない が、ＰＩ−３キナーゼのリン酸化されたイノシトール脂質生成物が、ＳＨ２部分 を結合するという最近の考察によって、ＰＩ−３キナーゼの活性化が、ＰＬＣｇ のその基質が存在する細胞膜への転座につながることの可能性を示唆している（ Ｌ．Ｅ．ラメー、Ｃ．Ｓ．チェン、Ｌ．Ｃ．カントレー、細胞誌８３、８２１− ８３０（１９９５））。これはポリホスフォイノシチド加水分解及びＩＰ３の開 放を通じてのカルシウム可動化を促進するのかもしれない。 遺伝子導入及び遺伝子切除動物を使ったＣＤ１９発現の最近の遺伝子操作によ って、Ｂ細胞発達及び免疫反応におけるＣＤ１９の重要な役割を証明する研究が 可能になった（Ｌ．ｊ．ゾー等、分子及び細胞生物学誌１４、３８８４−３８９ ４（１９９４）；Ｒ．Ｃ．リカート、Ｋ．ラジェウスキー、Ｊ．ローズ、ネイチ ャー誌３７６、３５２−３５５、（１９９５）；Ｐ．エンゲル等、免疫誌３、３ ９−５０、（１９９５）；Ｓ．サトウ、Ｄ．Ａ．スティーバー、Ｔ．Ｆ．テダー 、米国自然科学アカデミー会報９２、１１５５８−１１５６２（１９９５））。 ＣＤ１９の過発現はＢ細胞の発達欠陥及び周辺部におけるＢ細胞数の減少に繋が る（Ｌ.Ｊ.ゾー等、分子及び細胞生物学誌１４、３８８４−３８９４(１９９４) ）。出願人は、ＣＤ１９の過発現は抗原選択にたいする応答においてＢＣＲ−Ｃ Ｄ１９シグナリングを向上させる結果となりうるのではないかと仮説を立てる。 この増大したシグナリングは、ＰＩ−３キナーゼの活性化により媒介され、Ｂ細 胞を選択するよりむしろ削除に繋がり、またＢ細胞の発達欠陥として現れるのか もし れない。遺伝子切除マウスから得られたＢ細胞の免疫反応の研究は、ＣＤ１９が ＣＤ１９媒介による活性化及び胚芽中心形成に極めて重要な役割を果たしている ことを示唆している。よって、ＣＤ１９はＰＩ−３キナーゼ及びその他の効果器 の活性化を向上させることで抗原に対する感応性を高めるのかもしれない。この 仮説に符合して、ＣＤ１９又はＣＤ２１のＢＣＲとの架橋は、Ｂ細胞の活性化を 顕著に高める（Ｒ．Ｈ．カーター、Ｄ．Ｔ．フィアソン、サイエンス誌２５６、 １０５−１０７（１９９２）；Ｌ．Ｄ．シュルツ等、細胞誌７３、１４４５−１ ４５４（１９９３））。これらの発見に基づいて、ＣＤ１９がＦｃｇＲＩＩＢ１ ／ＰＴＰ１Ｃ媒介のシグナリングのターゲットであれば、通常のＢ細胞内のＦｃ ｇＲＩＩＢ１−ＢＣＲ架橋の結果は、ＣＤ１９^-/-Ｂ細胞内のＢＣＲ架橋の結果 と類似であろうとも予想でき、またその通りなのである。つまり、何れの状況に おいても刺激は増殖欠陥及び抗体生成欠陥に至る（Ｐ．Ｌ．チャン、Ｎ．Ｒ．Ｓ ．Ｃシンクレアー、免疫学誌２１、９６７−９８１（１９７１）；Ｎ．Ｅ．フィ ィップス、Ｄ．Ｃ．カーター、免疫学ジャーナル誌１３０、６０２−６０６（１ ９８３）；Ｐ．エンゲル等、免疫誌３、３９−５０、（１９９５）；Ｓ．サトウ 、Ｄ．Ａ．スティーバー、Ｔ．Ｆ．テダー、米国自然科学アカデミー会報９２、 １１５５８−１１５６２（１９９５））。最後に、ＣＤ１９のシグナリングを否 定的調節するものとしてのＰＴＰ１Ｃの役割に更に符合するのが、虫食い(mothe aten)(ＰＴＰ１Ｃ^-/-)マウスのある種の表現型の特性である。これらのマウスは 、ＣＤ１９^-/-Ｂマウスに対するＣＤ１９^+/+Ｂマウスに見られるように、循環免 疫グロブリンのレベルの増加を示す（Ｌ．Ｄ．シュルツ等、細胞誌７３、１４４ ５−１４５４（１９９３））。虫食いマウスにはＰＴＰ１Ｃが欠如していること が、ＣＤ１９のシグナリングを向上させ、また循環免疫グロブリンのレベルを増 加させるのかもしれない。この研究は、肯定的及び否定的膜内外信号の統合の新 しい分子の機構を解明するものである。これらの経路の動的な相互作用は、免疫 調節において明らかに重要な役割を果たしている。実施例１１ 本実施例は、重要なＩＴＩＭ残分を検出するためのアラニン走査 突然変異誘発の利用について述べる。 本実験では、Ａ２０・Ｂ細胞リンパ腫細胞のＦｃγＲＩＩＢ１否定的突然変異 体であるＩＩＡＩ．６細胞が、通常の技術を使ってアラニン走査突然変異誘発を 行なったＦｃγＲＩＩＢ１を使って再形成された（カニンガム及びウェルズ（１ ９８９）サイエンス誌２４４：１０８１−１０８５）。様々な部位(site)でアラ ニン代理を持ったＦｃγＲＩＩＢ１を発現する細胞の評価分析を行ない、レセプ タのＢＣＲとのコリゲーションの後のＢ細胞活性化を抑制する能力を調べた。Ｂ 細胞活性化は、抗体による細胞の刺激の後の細胞内Ｃａ²⁺の変化を測定すること によって評価した。上記の実施例で述べたように、細胞にはインド１ＡＭをロー ド(load)した。インドをロードした細胞は、その後２０μｇ／ｍｌの完全な抗ｍ Ｉｇ抗体で刺激し、Ｃａ²⁺反応は上述したようにフロー血球計算法で記録した。 Ｃａ²⁺フラックスを抑制する各アミノ酸においてアラニンと置換されたＦｃγＲ ＩＩＢ１レセプタＩＴＩＭの能力は＋として採点した（つまり、突然変異作用の 欠如）。また、突然変異したＩＴＩＭがＣａ²⁺フラックスに影響を与える能力が ないことは、−として採点した（つまり、ＩＴＩＭの作用の喪失に至る突然変異 ）。これらの結果は表３に示し、非常に重要なチロシン残分に加え、チロシンに 対する−１、−２、及び＋３位置でのアミノ酸はＩＴＩＭの抑制作用にとって非 常に重要であることを示している。 実施例１２ 本実施例は、骨髄から得られた好塩基球のＩｇＥ媒介活性化はＦ ｃｇＲシグナリングにより抑制されることを示している。 ネズミの骨髄からのマスト細胞を、通常の方法でマウスの大腿骨から得た。細 胞は試験管内でＩＬ−３とｃ−キットリガンドで培養し、マスト細胞を得るため に濃縮した。その結果、得られた細胞はＦｃεＲ発現及び作用規準（刺激直後に セロトニン開放）に基づくと９５％を超えるマスト細胞を含んでいた。これらの 骨髄マスト細胞はＦｃγＩＩ及びＦｃεＲを発現した。これまでの実施例で述べ たように、細胞はインド１Ａをロード(load)した。細胞は活性化しないで表面の ＩｇεＲを占めるように一価ＩｇＥ抗体を加え定温放置した。細胞は次に、Ｉｇ ＧもＩｇＥも認識するラビット抗マウスＩｇのＦ（ａｂ’）₂断片または制御ラ ビット抗マウスＩｇを加え定温放置した。上述したようにＣａ²⁺フラックスをフ ロー血球計算法で記録した。ＦｃεＲを架橋するためのＦ（ａｂ’）₂断片を使 用したことは、細胞内の自由Ｃａ²⁺の増加に繋がった。制御ラビット抗マウスＩ ｇはＦｃｇＲＩＩを結合することができ、ＦｃγＩＩ及びＦｃεＲの両方を介し た信号形質導入となったが、この制御ラビット抗マウスＩｇを使用した結果、Ｃ ａ²⁺フラックスが抑制された。ＦｃｇＲＩＩは、Ｂ細胞中と同様にマスト細胞中 で下方調節的反応(downregulatory response)を媒介できることがこの実施例で は示されている。更に、同じ実験が虫食いマウスでも行われたが、これはＰＴＰ １Ｃが不足している。これらの動物から得た骨髄マスト細胞の中では、ＦｃεＲ とＦｃｇＲＩＩが架橋された際には、Ｃａ²⁺フラックスの抑制は観察されなかっ た。よって、下方調節的反応におけるＰＴＰ１Ｃの重要性を実証している。 本発明の様々な実施例を詳しく説明してきたが、これら実施例の変更及び改良 は当業者であれば思いつくであろう。しかし、こうした変更及び改良は以下の特 許請求の範囲に明示されているように本発明の範囲に含まれることを理解する必 要がある。 これまで引用された参考文献及び出版物は、言及してここに組み入れられたも のとする。 同等物 ここに説明された発明の具体的な実施例の同等物が可能であることは、当業者 には直ちに、又は単純な実験のみを行えば明らかであろう。これらの同等物は、 以下の特許請求の範囲に包含されるものである。特許請求の範囲（翻訳文）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＥ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ 7/08 ＡＢＹ 14/705 ＡＢＣ Ｇ０１Ｎ 33/566 ＡＤＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式 （Ｉ／Ｖ）Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃（Ｌ／Ｖ） で表されるＩＴＩＭモチーフを含むペプチジル化合物であって、 このとき、Ｉはイソロイシン又はそのミメトープを、Ｖはバリン又はそのミメト ープを、各Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃は個別にアミノ酸又はそのミメトープを、Ｙはチロ シン、ホスフォチロシン又はこれらのミメトープを、そしてＬはロイシン又はそ のミメトープを表す、ペプチジル化合物。 ２．Ｘ₁がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ 、Ｇｌu、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓを、Ｘ₂がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ 、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ又はＴｈｒを、そしてＸ₃がＧｌｙ、Ａｌａ 、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ 、Ｇｌｕ、又はＡｓｐを表す、請求項１に記載の化合物。 ３．Ｘ₁がＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ又はＨｉｓを、Ｘ₂ がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ又はＴｈｒを、そしてＸ₃がＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ 、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐを表す、請求項１に記載の化合物。 ４．ＩＴＩＭモチーフが、ＩＴＹＳＬＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹ ＴＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬＹＴＥＬ、ＶＴＹＳＭＶ、ＶＴＹＴ ＴＬ、ＶＴＹＳＴＶ、ＶＩＹＳＤＬ、又はＩＴＹＡＥＬのいずれかで表される、 請求項１に記載の化合物。 ５．ＩＴＩＭモチーフが、ＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨ、ＴＡＥＮＴＩＴＹＳＬ ＬＫＨ、ＥＱＤＰＱＥＶＴＹＡＱＬＮ、ＴＰＰＴＤＩＩＶＹＴＥＬＰ、ＥＱＤＰ ＱＥＶＴＹＴＱＬＮ、ＴＰＰＴＤＩＩＶＹＴＥＬＰ、ＥＱＤＰＥＥＶＴＹＡＱＬ Ｄ、ＴＰＰＴＤＴＩＬＹＴＥＬＰ、ＭＳＥＱＥＶＴＹＳＭＶＲＦ、ＭＳＥＱＥＶ ＴＹＴＴＬＲＦ、ＭＳＥＱＥＶＴＹＳＴＶＲＦ、又はＭＤＮＱＧＶＩＹＳＯＬＮ Ｌのいずれかで表される、請求項４に記載の化合物。 ６．Ｙが非加水分解性ホスフォチロシン類似体である、請求項１に記載の化合物 。 ７．Ｙが一般式 で表され、このときＺが、 のいずれかから選択され、ここでｍはゼロ又は１から６までの範囲の整数であり 、Ｘは存在しないか又はＯ、Ｓ、又はＮを表し、Ｄ₁はＯ又はＳを表し、Ｄ₂はＮ₃ 、ＳＨ₂、ＮＨ₂、又はＮＯ₂を表し、Ｒ₁及びＲ₂はそれぞれ、個別に水素、低級 アルキル、又は薬学上容認可能な塩を表すか、あるいは、Ｒ₁及びＲ₂はこれらが 結び付いたＯ−Ｐ−Ｏ、Ｏ−Ｖ−Ｏ又はＯ−Ａｓ−Ｏ原子と共に考えたときに環 構造内に５から８の原子を有する多環式環を成すものである、請求項１に記載の 化合物。 ８．前記化合物の少なくとも一部分が自然発生したアミノ酸残分から得られる、 請求項１に記載の化合物。 ９．化合物がペプチド擬態である、請求項１に記載の化合物。 １０．化合物がペプチド擬態であり、逆インバーソペプチド擬態、逆エナチオペ プチド擬態、トランス−オレフィンペプチド擬態及びホスフォネートペプチド擬 態のいずれかから選択される、請求項９に記載の化合物。 １１．化合物の分子重量が７５０から７５００ダルトンの範囲内である、請求項 １に記載の化合物。 １２．長さが６から２５のアミノ酸のペプチドに相当する、請求項１に記載の化 合物。 １３．前記ＩＴＩＭが、一つ又はそれ以上のペプチド結合により、前記ＩＴＩＭ モチーフに加えて５０以下のアミノ酸残分と共有結合しており、前記５０以下の アミノ酸残分は、たんぱく質中で前記ＩＴＩＭモチーフのすぐ隣にあるポリペプ チド配列と同一であり、前記ＩＴＩＭは前記たんぱく質中で自然発生するもので ある、請求項１に記載の化合物。 １４．化合物が、前記ＩＴＩＭモチーフ及び第二アミノ酸配列を含む融解たんぱ く質である、請求項１に記載の化合物。 １５．化合物が、たんぱく質チロシンホスファターゼ１Ｃ（ＰＴＰ１Ｃ）に結合 して前記ＰＴＰ１Ｃのホスファターゼ活性を活性化する、請求項１に記載の化合 物。 １６．前記ＩＴＩＭモチーフが、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ｐ１６０及びｐ７０ のいずれかより選択される細胞構成成分に結合する、請求項１に記載の化合物。 １７．結合により、細胞構成成分の信号形質導入活性が抑制される、請求項１６ に記載の化合物。 １８．結合により、細胞構成成分の信号形質導入活性が活性化される、請求項１ ６に記載の化合物。 １９．前記ＩＴＩＭモチーフが、信号形質導入たんぱく質のＳＨ２部分に結合す る、請求項１に記載の化合物。 ２０．化合物が、ＩＴＩＭ結合たんぱく質の酵素的活性を変更することで造血細 胞機能を調節する、請求項１に記載の化合物。 ２１．化合物が、ＭＩＲＲの信号形質導入経路を変更することで造血細胞機能を 調節する、請求項１に記載の化合物。 ２２．化合物が、ＰＴＰａｓｅとＣＤ２２、ＮＫＩＲｐ５８、Ｌｙ４９、又はＦ ｃγＲの細胞質部分との結合を競合的に抑制する、請求項１に記載の化合物。 ２３．生理学的に容認可能な担体中に、治療を施そうとする動物の細胞中の細胞 内シグナリング経路を調製するのに有用な、治療上効果的な量の請求項１による 化合物を含んだ薬剤。 ２４．たんぱく質チロシンホスファターゼ１Ｃ（ＰＴＰ１Ｃ）のＳＨ部分に結合 し、前記ＰＴＰ１Ｃのホスファターゼ活性を活性化し、ＣＤ２２、ＮＫＩＲｐ５ ８、Ｌｙ４９及びＦｃγレセプタのうち一つ又はそれ以上のＩＴＩＭモチーフと との結合を競合的に抑制するＩＴＩＭ擬態。 ２５．一般式（Ｉ／Ｖ）Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃（Ｌ／Ｖ）（配列識別番号１）で表される ＩＴＩＭモチーフであって、たんぱく質チロシンホスファターゼのＳＨ２部分に 結合するたんぱく質中のＩＴＩＭ配列に対応するＩＴＩＭモチーフを含む、単離 されたＩＴＩＭペプチド又はそのミメトープであって、前記式中のＩはイソロイ シン又はそのミメトープを、Ｖはバリン又はそのミメトープを、Ｘ₁Ｘ₂及びＸ₃ はそれぞれ個別にアミノ酸又はそのミメトープを、Ｙはチロシン、ホスフォチロ シン又はこれらのミメトープを、そしてＬはロイシン又はそのミメトープを表す 、単離されたＩＴＩＭペプチド又はそのミメトープ。 ２６．ＣＤ２２、ＮＫＩＲｐ５８、Ｌｙ４９及びＦｃγレセプタのいずれかより 選択される否定的調節レセプタの、ＩＴＩＭモチーフを含む可溶性ペプチド細片 。 ２７．ペプチドの分子重量が７５０から７５００ダルトンの範囲内である、請求 項２６に記載のペプチド。 ２８．ペプチドがたんぱく質チロシンホスファターゼ１Ｃ（ＰＴＰ１Ｃ）のＳＨ ２部分に結合する、請求項２６に記載のペプチド。 ２９．ＰＴＰ１Ｃに対する前記ペプチドの結合により、ＰＴＰ１Ｃのチロシンホ スファターゼ活性がアロステリック的に調節される、請求項２８に記載のペプチ ド。 ３０．レセプタが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、Ｌｙ４９、Ｎ ＫＩＲｐ５８のいずれか一つである、請求項２６に記載の化合物。 ３１．レセプタがＦｃγＲＩＩＢＩである、請求項２６に記載の化合物。 ３２．一般式： （Ｉ／Ｖ）Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃（Ｌ／Ｖ）（配列識別番号１） で表されるＩＴＩＭモチーフを含む化合物に細胞を接触させることで細胞内シグ ナリング経路に関わるＩＴＩＭ結合たんぱく質の活性を変更することを含む細胞 中の細胞内シグナリング経路を調整する方法であって、前記式中のＩはイソロイ シン又はそのミメトープを、Ｖはバリン又はそのミメトープを、Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃ はそれぞれ個別にアミノ酸又はそのミメトープを、Ｙはチロシン、ホスフォチ ロシン又はこれらのミメトープを、そしてＬはロイシン又はそのミメトープを表 す、方法。 ３３．ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭｐ１６０及びＩＴＩＭｐ７０のいずれ かから選択される調節分子の活性を変更可能な、効果的な量の調節用試薬に造血 細胞を接触させることを含む、造血細胞機能を調節する方法。 ３４．調節物質がＩＴＩＭ擬態を含む、請求項３３に記載の方法。 ３５．前記ＩＴＩＭ擬態が、一般式： （Ｉ／Ｖ）Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃（Ｌ／Ｖ）（配列識別番号１） で表されるＩＴＩＭモチーフを有するペプチド又はペプチド擬態であり、前記式 中のＩはイソロイシン又はそのミメトープを、Ｖはバリン又はそのミメトープを 、Ｘ₁、Ｘ₂及びＸ₃はそれぞれ個別にアミノ酸又はそのミメトープを、Ｙはチロ シン、ホスフォチロシン又はこれらのミメトープを、そしてＬはロイシン又はそ のミメトープを表す、請求項３３に記載の方法。 ３６．前記調節物質が、刺激レセプタたんぱく質と抑制ＩＴＩＭ含有レセプタた んぱく質とを交差結合可能な二特異的抗体である、請求項３３に記載の方法。 ３７．前記造血細胞機能が、抗体反応、血餅開始、炎症反応、サイトカイン又は 媒介物質の放出、あるいは細胞毒性のいずれかから選択される、請求項３３に記 載の方法。 ３８．前記造血細胞機能が、炎症反応又は抗体反応のいずれかから選択される、 請求項３３に記載の方法。 ３９．前記方法が、造血細胞機能を抑制することで造血細胞機能を調節する、請 求項３３に記載の方法。 ４０．前記方法が、抗体、サイトカイン、又は炎症媒介物質のいずれかから選択 される分子の生成及び／又は放出を調節する、請求項３３に記載の方法。 ４１．前記方法が、ＭＩＲＲの活性を抑制することで造血細胞機能を調節する、 請求項３３に記載の方法。 ４２．前記調節用試薬が、ＰＴＰ１Ｃの特定のホスファターゼ活性を刺激する、 請求項３３に記載の方法。 ４３．前記方法が、免疫増殖疾患、免疫不全疾患、ガン、自己免疫疾患、感染症 及びアレルギ反応のいずれかから選択される疾患に関連する造血細胞機能を調節 する、請求項３３に記載の方法。 ４４．前記方法が、自己抗体生成に関連する疾患、ＦｃεＲ誘発性脱顆粒に関連 する疾患、又はＡＤＣＣに関連する疾患のいずれかから選択される疾患から動物 を保護する、請求項３３に記載の方法。 ４５．前記細胞がＢ細胞である、請求項３３に記載の方法。 ４６．治療が抗体生成を抑制するものである、請求項４５に記載の方法。 ４７．前記細胞がマスト細胞又は好塩基球のいずれかである、請求項３３に記載 の方法。 ４８．治療がアレルギ反応を抑制するものである、請求項４７に記載の方法。 ４９．前記細胞がＮＫ細胞である、請求項３３に記載の方法。 ５０．前記細胞が生体外で処理される、請求項３３に記載の方法。 ５１．前記細胞が生体内で処理される、請求項３３に記載の方法。 ５２．被験者の造血細胞を、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭｐ１６０及びＩ ＴＩＭｐ７０のいずれかから選択される調節分子の活性を変更可能な、ある量の ＩＴＩＭ擬態に接触させることを含む、自己免疫疾患を治療する方法。 ５３．被験者の造血細胞を、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｄ、ＩＴＩＭｐ１６０及びＩ ＴＩＭｐ７０のいずれかから選択される調節分子の活性を変更可能な、ある量の ＩＴＩＭ擬態に接触させることを含む、アレルギ反応疾患を治療する方法。 ５４．被験者の造血細胞を、ＦｃεレセプタとＦｃγレセプタとを交差結合可能 な、ある量の二特異的抗体に接触させることを含む、アレルギ反応疾患を治療す る方法。 ５５．（ａ）（ｉ）ＩＴＩＭモチーフを含むポリペプチドと、 （ｉｉ）ＳＨ２部分により前記ＩＴＩＭモチーフを特定的に結合する少なくとも 一つのＳＨ２部分を含む標的たんぱく質と、 （ｉｉｉ）テスト物質と、 を含む反応混合物を形成するステップと、 （ｂ）前記標的たんぱく質と前記ＩＴＩＭモチーフとの相互作用を検出するステ ップと、 を含む、ＳＨ２含有たんぱく質の機能を変更可能な物質を判別する方法であって 、前記テスト物質がある場合の前記標的たんぱく質とＩＴＩＭポリペプチドとの 相互作用と、前記テスト物質がない場合の相互作用のレベルとを比較したときの 統計的な著しい差異が、前記ＳＨ２含有標的たんぱく質の信号形質導入活性を変 更する活性を前記テスト物質が持つことを示すものである、方法。 ５６．上記構成部分のうち一つ又はそれ以上が組換えにより発現する、請求項５ ５に記載の方法。 ５７．前記ＳＨ２含有標的がＰＴＰａｓｅである、請求項５７に記載の方法。 ５８．前記標的たんぱく質と前記化合物との相互作用の検出が、ＰＴＰａｓｅの 酵素的活性レベルの測定を含む、請求項５８に記載の方法。 ５９．前記反応混合物が細胞全体であり、前記標的たんぱく質と前記化合物との 相互作用の検出が （ｉ）細胞たんぱく質のリン酸化のレベル （ｉｉ）細胞内Ｃａ²⁺のレベル、 （ｉｉｉ）ジアシルグリセリドのレベル、 （ｉｖ）イノシトールホスフェートのレベル、 （ｖ）即時初期（ｃＩＥ）遺伝子生成物の発現レベル のうち一つ又はそれ以上を測定することを含む、請求項５５に記載の方法。 ６０．前記標的たんぱく質と前記化合物との相互作用の検出が、前記標的たんぱ く質により結合される化合物の量を判定することを含む、請求項５５に記載の方 法。 ６１．前記反応混合物が無細胞反応混合物である、請求項５５に記載の方法。 ６２．前記反応混合物が二つのハイブリッド検定である、請求項５５に記載の方 法。 ６３．前記反応混合物が、細胞中の前記化合物の組換え発現により得られる、請 求項５５に記載の方法。 ６４．（ａ）（ｉ）ＰＴＰ１Ｃホスファターゼと、 （ｉｉ）リン酸化ＣＤ１９たんぱく質と、 （ｉｉｉ）テスト物質と を含む反応混合物を形成するステップと、 （ｂ）ＰＴＰ１ＣとＣＤ１９との相互作用を検出するステップと を含む、ＣＤ１９の媒介する信号形質導入を変更可能な物質を判別する方法であ って、 前記テスト物質がある場合のＰＴＰ１ＣとＣＤ１９との相互作用と、前記テス ト物質がない場合の相互作用のレベルとを比較したときの統計的な著しい差異が 、ＣＤ１９たんぱく質の形質導入活性を変更する活性を前記テスト物質が持つこ とを示すものである、方法。 ６５．（ａ）ホスファチジルイノシトールキナーゼのキナーゼサブユニット、キ ナーゼサブユニットを結合可能なＣＤ１９の酸配列を含むポリペプチドを含む反 応混合物を形成するステップと、 （ｂ）キナーゼとＣＤ１９ペプチドとの相互作用を検出するステップと を含む、ホスファチジルイノシトールキナーゼのＳＨ２を媒介とした活性化を調 整することのできる化合物を判別する方法であって、 前記テスト物質がある場合のキナーゼサブユニットとＣＤ１９ペプチドとの相 互作用と、前記テスト物質がない場合の相互作用のレベルとを比較したときの統 計的な著しい差異が、ホスファチジルイノシトールキナーゼのＳＨ２を媒介とし た活性化を調整する活性を前記テスト物質が持つことを示すものである、方法。 ６６．ＰＴＰ１Ｃホスファターゼ、前記ＰＴＰ１Ｃを結合及び活性化可能なＩＴ ＩＭ擬態、ＰＴＰ１Ｃ基質及び推定上の調節化合物を含む、造血細胞機能を調節 することのできる化合物を判別する装置。 ６７．造血細胞を請求項１の化合物に接触させるステップを含む、免疫反応を調 整する方法。