WO2007122815A1 - Ｂｉｒ１に対する二価抗体 - Google Patents

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WO2007122815A1
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Hideaki Tada
Tomoyuki Odani
Akira Fujiki
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Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07K2317/626—Diabody or triabody

Definitions

  • the present invention relates to B cell immunoglobulin receptor 1 (hereinafter sometimes abbreviated as BIR 1) and T cell receptor complex or sputum cell receptor.
  • BIR 1 B cell immunoglobulin receptor 1
  • T cell receptor complex or sputum cell receptor T cell receptor complex or sputum cell receptor.
  • the present invention relates to a bivalent antibody that recognizes an immune receptor such as a body complex, a polynucleotide encoding the same, and a pharmaceutical use of the bivalent antibody.
  • BIR1 according to the present invention is reported in Patent Document 1.
  • B I R 1 has an immunosuppressive motif structure I T I ec (I ⁇ unorec sign tor Tyrosine-based Inhibitory Motif) in its intracellular region.
  • CT LA-4 (see Non-patent document 2), PD-1 (see Non-patent document 2), FcyRlIB (see Non-patent document 3), etc. are known as molecules having ITIM. .
  • CT LA-4 and PD-1 are TCR receptors on the same cell (hereinafter abbreviated as TCR), which aggregates with the complex and suppresses the tyrosine kinase activity that constitutes its activation signal. It suppresses T cell activation via the complex.
  • FcyRl 1 B aggregates with the B cell receptor (hereinafter abbreviated as BCR) complex on the same cell and suppresses the tyrosine kinase activity that constitutes its activation signal. Suppression of B cell activation by antigen-antibody complex.
  • B I 1 is expressed in 3 cells, T cells, monocytes, and antigen-presenting cells, and is predicted to have a function of suppressing activation by these immune stimuli.
  • a bivalent antibody is an asymmetric antibody having two different antigen specificities and having an independent antigen recognition site (Patent Document 2, Patent Document 3, Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5, And Non-Patent Document 6).
  • a diabody is the smallest unit of a divalent antibody, and the variable region of the heavy chain and the variable region of the light chain that are derived from the same parent antibody are non-covalently bonded to each other. It was devised by utilizing the property of forming more heterodimers (see Patent Literature 4, Non-Patent Literature 7, and Non-Patent Literature 8).
  • Patent Document 1 International Publication No. 99/33873 Pamphlet
  • Patent Document 2 US Pat. No. 5,922,845
  • Patent Document 3 US Patent No. 5837243
  • Patent Document 4 International Publication No. 93Z1 1 1 61
  • Patent Document 5 Special Table 2004-51 2005 Publication
  • Patent Document 6 Special Table 2003-507069
  • Patent Document 7 International Publication No. 2004Z072286
  • Non-Patent Document 1 Daria V ach P, 3 others, “European journal of immunology.”, 1988, Vol. 18, No. 12, p. 1 901-1 905
  • Non-Patent Document 2 I shida Y, 2 others, “The ⁇ MBO journal”, 1 992, Vol. 11, Vol. 11, No. 1, p. 3887-95
  • Non-Patent Document 3 S tenge I in S, 2 others, “The EMBO journal.” j, 1 988, Vol. 7, No. 4, p. 1 053- 1 0 59
  • Non-Patent Document 4 Z e id I r R, 6 others, “Journal of Immunology”, 1 999, vol. 63, p. 1 246-1252
  • Non-Patent Document 5 S omasundaram C, 4 others, “Human ant i bodies”, 1 999, Vol. 9, p. 47-54
  • Non-Patent Document 6 Ke I er Ding, Outside 7 Name, “Cancer Re search”, 1 997, 57, p. 4008-401 4
  • Non-Patent Document 7 Hoi I inger, “Procedinas of the Nashi National Academy of Sciences of the United States of America ”, 1 993, 90, p. 64 44-6448
  • Non-Patent Document 8 Fabrication Le Ga Gal and 3 others, “Protein Engineering, Design & Selection”, 2004, 17th, 4th, p. 357-36 6
  • Substances that express or enhance the immunosuppressive function of BIR 1 are novel aspects for diseases involving BIR 1, such as autoimmune diseases, rejection after organ transplantation, allergic diseases and inflammatory diseases. Therefore, there is a need for the development of such medicines.
  • the inventors have found that a bivalent antibody against 1 achieves its purpose, and has completed the invention.
  • BIR 1 since BIR 1 has ITIM in its intracellular region, the present inventors dephosphorylate to ITIM by aggregating with an immune receptor such as TCR complex or BCR complex. We thought that BIR 1 could transmit an inhibitory signal through oxidase mobilization. Then, it was confirmed that the substance that physically aggregates BIR 1 and TCR complex or BCR complex, that is, the bivalent antibody of the present invention expresses or enhances the immunosuppressive function of BIR 1, and the present invention is completed. did.
  • the present invention has the following configuration.
  • Each of the two polypeptides that form the antigen recognition region of the BIR 1 antibody is one of the two polypeptides that form the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein expressed in BIR 1 expressing cells.
  • Directly or linker A bivalent antibody having a configuration linked through one.
  • the two polypeptides forming the antigen recognition region of the BIR 1 antibody are a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the two polypeptides forming the antigen recognition region of an antibody against a membrane protein expressed in a BIR 1-expressing cell are a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 and represented by SEQ ID NO: 13
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is linked to the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 through a peptide linker.
  • the peptide linker is one (GI y -GI y—GI y—GI y—S e r) n ⁇ (the left side represents the N-terminus, the right side represents the C-terminus, and n represents an integer of 1 to 4.)
  • the bivalent antibody according to (6) is one (GI y -GI y—GI y—GI y—S e r) n ⁇ (the left side represents the N-terminus, the right side represents the C-terminus, and n represents an integer of 1 to 4.)
  • the bivalent antibody according to (6).
  • polypeptide comprising the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17
  • a replication or expression vector comprising the polynucleotide according to (1 2).
  • Each of the two polypeptides that form the antigen recognition region of the BIR 1 antibody consists of two polypeptides that form the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein expressed in BIR 1 expressing cells.
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, a bivalent antibody having a configuration linked to each of these directly or via a linker.
  • autoimmune disease is a disease selected from a disease having a high level of lupus anticoagulation factor, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and Takayasu arteritis. object.
  • Each of the two polypeptides that form the antigen recognition region of the BIR 1 antibody is recognized by the antibody against the membrane protein expressed in BIR 1 expressing cells.
  • a bivalent antibody having a structure linked directly or via a linker to each one of two polypeptides forming a recognition domain, a steroid drug, a non-steroid anti-inflammatory drug, an immunosuppressive drug, and A pharmaceutical comprising a combination of one or more selected from antiallergic drugs.
  • Each of the two polypeptides that form the antigen recognition region of the BIR 1 antibody is composed of two polypeptides that form the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein expressed in BIR 1 expressing cells.
  • An effective amount of a bivalent antibody having a configuration linked to each one directly or via a linker is administered to a mammal, characterized by autoimmune disease, rejection after organ transplantation, allergy A method for the prevention and Z or treatment of diseases selected from diseases and inflammatory diseases.
  • BIR 1 antibody (22) forming an antigen recognition region of BIR 1 antibody for the manufacture of a preventive and Z or therapeutic agent for diseases selected from autoimmune diseases, rejection after organ transplantation, allergic diseases and inflammatory diseases
  • a preventive and Z or therapeutic agent for diseases selected from autoimmune diseases, rejection after organ transplantation, allergic diseases and inflammatory diseases
  • Each of the two polypeptides has a structure in which it is bound directly or via a linker to one of the two polypeptides that form the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein expressed in BIR1-expressing cells.
  • the two polypeptides forming the antigen recognition region of the BIR 1 antibody are polypeptides having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9, and are expressed in BIR 1 expressing cells
  • the bivalent antibody according to (5) above, wherein the two polypeptides forming the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein are polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 13.
  • the bivalent antibody of the present invention has an activity to express or enhance the immunosuppressive function of BIR1.
  • FIG. 1 shows the antigen-binding reaction of the biotinylated anti-B-BIR1 monoclonal antibody in Example 1.
  • FIG. 2 shows suppression of IL-12 production via BCR activation by cross-linking of rabbit BIR1 and BCR complex in Example 2.
  • FIG. 3 shows the configuration of a bivalent antibody expression vector in Example 4.
  • BIR 1 means human BIR 1 and the corresponding mammalian immune receptor.
  • mammals include chimpanzees, force quizzes, mice, rats, guinea pigs, dogs, and pigs.
  • a protein having substantially the same amino acid sequence is a protein having the same function as that of a protein having one amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • some amino acids preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2 in the amino acid sequence selected from the amino acid sequences represented by the sequence numbers 1 to 6 are deleted.
  • amino acids preferably 1-5, more preferably 1-2
  • amino acid sequence has several amino acids (preferably 1-5, more Preferably, 1 to 2)
  • amino acid sequences are also included.
  • the position of deletion, substitution or insertion of the above amino acid and the type of the substituted amino acid are not particularly limited, but a modification to improve the refolding is preferable.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as two amino acid sequences may be simply abbreviated as “ ⁇ IR 1”.
  • B I R 1 antibody refers to an anti-B I R 1 monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody may be abbreviated as “Ma b.”) (For example, mouse anti-human BIR 1 Mab, rat anti-human BIR 1 Mab, human anti-human BIR 1 Ma b, etc.) or In the case of a non-human antibody, such a chimeric antibody (for example, CDR (Complementarity Determining Region: the same meaning as the antigen recognition region) transplanted antibody) or a portion thereof (for example, F (a b ′) 2 , F ab ⁇ Fa b. And F v or sc F v etc.).
  • CDR Complementarity Determining Region: the same meaning as the antigen recognition region
  • the two polypeptides forming the antigen recognition region of the BIR 1 antibody refers to the antibody that forms the antigen recognition region (hereinafter sometimes abbreviated as CDR). It means a part of heavy chain (H chain) (for example, heavy chain variable region (VH) etc.) and a part of light chain (L chain) (for example, light chain variable region (VL) etc.).
  • CDR antigen recognition region
  • B I R 1-expressing cells include cells expressing B I R 1 and primary cultured cells in vivo and cells forcibly expressing B I R 1.
  • TCR or TCR complex for example, BCR or BCR complex, activated Fey receptor (for example, F c RI (Journal of Biological Chemistry, 1991, 266, 20, p.13449- 13455), F cr III (Nature 333 (6 173), 568-570 (1988))).
  • CD 1 4ZT LR4 complex (Nature, 2000, 406, 780-785), and F ce RI (Proc. Natl. Acad. Sci. US A., 1988, vol. 85, p. 1907-1911), CD 1 9ZCD21 complex (Journal of Iunology, 1989, vol. 143, p. 712- 717) and the like.
  • the TCR complex means at least a Q? Subunit and a ⁇ A complex composed of a T cell receptor composed of subunits and a CD3 composed of subunits, S subunits, subunits and: subunits.
  • the BCR complex includes at least membrane-bound immunoglobulin, CD79Q subunit (The EMBO Journal, 1988, Vol. 11, No. 11, p. 3457-3464), and CD 79 Complex composed of subunits (Europian Journal of Immunology, 1992, Vol. 22, No. 6, p.1621-1625).
  • an antibody against a membrane protein expressed in a BIR 1-expressing cell means a monoclonal antibody against the membrane protein according to the present invention (eg, mouse anti-human membrane protein Mab, rat anti-human membrane) Protein Ma b, human anti-human membrane protein Ma b or the like) or, in the case of non-human antibodies, humanized chimeric antibodies (eg CDR-grafted antibodies) or parts thereof (eg F (a b ′) 2 , F ab ⁇ Fa b. And F v or sc F v etc.).
  • a monoclonal antibody against the membrane protein according to the present invention eg, mouse anti-human membrane protein Mab, rat anti-human membrane) Protein Ma b, human anti-human membrane protein Ma b or the like
  • humanized chimeric antibodies eg CDR-grafted antibodies
  • parts thereof eg F (a b ′) 2 , F ab ⁇ Fa b. And F v or sc F v etc.
  • two polypeptides forming an antigen recognition region of an antibody against a membrane protein expressed in a BIR1-expressing cell are a part of the H chain of the antibody that forms the CDR (for example, VH etc.) and a part of L chain (eg VL etc.) are meant.
  • an antibody against the "TCR complex" as a membrane protein according to the present invention for example, an anti-CD 3 antibody (for example, UCHT 1, NU_T 3, Leu 4, HI T3 a, X35, PS 1 MEM_57, OKT3, RI V9, 1 2 F 6 and WT32).
  • an anti-CD 3 antibody for example, UCHT 1, NU_T 3, Leu 4, HI T3 a, X35, PS 1 MEM_57, OKT3, RI V9, 1 2 F 6 and WT32.
  • Examples of the antibody against the "BCR complex" as a membrane protein according to the present invention include, for example, an anti-human IgG antibody (for example, 17 F 1 2 etc.), an anti-IgG (H + L) polyclonal antibody.
  • Anti-CD79a antibody for example, HM 47
  • anti-CD79b antibody for example, CB3-1 and SN8
  • Examples of the antibody against the "CD19ZCD21 complex" as the membrane protein according to the present invention include an anti-human CD19 antibody (for example, 4G7 etc.) and the like.
  • each of the two polypeptides forming the antigen recognition region of the BIR 1 antibody forms two antigen recognition regions of the antibody against the membrane protein expressed in the BIR 1-expressing cell.
  • “Directly” bound to each peptide, either directly or via a linker, means that a cysteine residue in the polypeptide is oxidized to form a disulfide bond. For example.
  • the "linker” is not particularly limited as long as it can connect the respective parts constituting the bivalent antibody of the present invention while maintaining an appropriate distance.
  • non-peptidic linkers to which a reactive group or interaction group arbitrarily selected from maleimide derivatives, hydrazide derivatives and the like are added.
  • Peptide linkers include those having a length of 2 to 50 amino acids, such as one (GI y-GI y GI y-GI y-ser) n ", -Sir-AI a- L ys -T hr -T hr -P ro, ⁇ ser -AI a -L ys -T hr -T h '_ P' o -L ys-L eu -GI y ⁇ GI y-, -A rg— AI a—A sp -AI a -AI a -P ro, ⁇ A rg -AI a -A sp -AI a -AI a—P ro -T hr -V a I -ser ⁇ , -A rg -AI a- A sp— AI a -AI a -AI a -AI -AI
  • non-peptidic linker a commercially available one can be used, and for example, phenylene dimaleimide (manufactured by Aldrich) is available.
  • the two polypeptides that form the antigen recognition region of the BIR 1 antibody are the two polypeptides that form the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein expressed in the BIR 1-expressing cell.
  • a bivalent antibody having a structure in which each is directly or via a linker is a membrane in which two polypeptides forming the antigen recognition region of a BIR 1 antibody are expressed in BIR 1 expressing cells. It means a divalent antibody having a constitution in which it is bound to two polypeptides forming the antigen recognition region of an antibody against a protein, either directly or via a linker.
  • one of the two polypeptides forming the antigen recognition region of the BIR 1 antibody is one of the two polypeptides forming the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein expressed in the BIR 1-expressing cell.
  • An antibody against a membrane protein expressed in a BIR 1-expressing cell is either a unit bound directly or via a linker, and the other of the two polypeptides that form the antigen recognition region of the BIR 1 antibody.
  • the structure of this bivalent antibody includes the following structures. That is,
  • a part of the H chain containing the CDR of the BIR 1 antibody (for example, VH, etc.) directly or via a linker is one of the L chains containing the CDR of the antibody against the membrane protein of the present invention.
  • a polypeptide or polypeptide complex having a structure bound to a part (for example, VL) and a part of the L chain (for example, VL) containing CDR of BIR 1 antibody are directly or via a linker.
  • a polypeptide or a polypeptide complex having a structure bound to a part of an H chain (for example, VH) containing CDR of the antibody against the membrane protein according to the present invention is covalently bonded. (For example, disulfide bonds) or non-covalent bonds (for example, hydrogen bonds, hydrophobic bonds, electrostatic interactions and their combined bonds) that can form complexes, and
  • the “configuration folded so as to form a functional CDR of an antibody” means a configuration in which the folded antibody forms an antigen recognition region capable of binding to a target antigen.
  • Etc. are mentioned. Hereinafter, these may be abbreviated as “the bivalent antibody of the present invention”.
  • the bivalent antibody of the present invention includes those in which each component is prepared by the method described below. That is,
  • a part of the H chain containing CDR of BIR1 antibody or the membrane according to the present invention Any part of the L chain containing the CDR of the antibody against the protein is on the N-terminal side.
  • Either a part of the L chain containing the CDR of the BIR 1 antibody or a part of the H chain containing the CDR of the antibody against the membrane protein of the present invention is placed on the N-terminal side. Also good.
  • the bivalent antibody having the structure (2a) is produced by the method (A) above, the order and direction in which the portions are arranged form a functional CDR of each antibody. As long as it has a structure that can be folded to obtain, specifically,
  • a part of H chain containing CDR of antibody against membrane protein according to the present invention, part of L chain containing CDR of BIR 1 antibody, one of H chain containing 0 of 31 1 antibody And a part of the L chain containing the CDR of the antibody against the membrane protein according to the present invention are each in the order of the description through a peptide linker (however, each peptide linker may be different). Having a configuration coupled in series,
  • each of the H chains may have a structure in which each of the H chains is connected in series in the order of description via a peptide linker (however, each peptide linker may be different).
  • DNA encoding each antibody is isolated from the hyperidoma producing each antibody, and partial fragments of both DNAs are fused by gene recombination technology.
  • a method of producing a bivalent antibody from the transformant by transforming an appropriate host cell using an expression vector into which the prepared DNA has been inserted can be mentioned.
  • the case where each of them is bonded via an appropriate carrier is also included.
  • the lysyl side chain in the biotin ligase substrate peptide added to the end of the polypeptide constituting each component of the bivalent antibody of the present invention is biotinylated with biotin ligase (eg, Bir A) and avid. Or sliver avidin derivatives or those formed by binding to an appropriate carrier to which they are added.
  • Examples of the method for attaching a non-peptide linker to each component of the bivalent antibody of the present invention include, for example, reacting a linker having a succinimide group introduced with the amino group of the polypeptide that is a component.
  • Method Journal of Biologic Chem i stry, 1989, 264, p. 272-279
  • a linker in which a maleimide group has been introduced, a thiol group of a polypeptide that is a constituent of the linker (Ann. New York Acad. Sci., 1975, Vol. 254, No. 203)
  • reacting the hydrazino-linked linker with the aldehyde group of the polypeptide which is a constituent of the linker.
  • Biotech. Appl. Biochem. 1987, Vol. 9, p. 488-496
  • it can also implement by the method according to an Example.
  • the bivalent antibody of the present invention or each component thereof may have any of a carboxyl group, an amide group, or an ester group at the C-terminus.
  • the bivalent antibody of the present invention has a carboxyl group other than the C-terminus, the carboxyl group may be amidated or esterified.
  • the bivalent antibody of the present invention or each component thereof has an N-terminal amino acid residue
  • a protecting group for example, a C1-6 acyl group (for example, a formyl group, an acetyl group, etc.), etc.
  • an N-terminus generated by cleavage in vivo Pyrroglutamine-oxidized glutamine residues and substituents on the side chains of amino acids in the molecule eg —OH, —SH, amino groups, imidazole groups, indole groups, guanidino groups, etc.
  • it may be protected with a C 1-6 acyl group (eg, formyl group, acetyl group, etc.) or a sugar chain bound thereto.
  • the bivalent antibody of the present invention may be produced as a salt thereof.
  • the salt include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Examples include succinic acid, tartaric acid, citrate, phosphoric acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, glutamic acid, salts with gluconic acid, and the like.
  • inorganic acids eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • “BI R1 antibody” is preferably a mouse anti-human BIR 1 monoclonal antibody, a rat anti-human BIR 1 monoclonal antibody, or a human anti-human BIR 1 monoclonal antibody, more preferably a human anti-human ⁇ IR. 1 monoclonal antibody.
  • a mouse anti-human BIR 1 monoclonal antibody specifically, on March 17th, 2006, 1-chome, East 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent received at the Biological Depositary Center (Accession Number: FERM ⁇ —20846),
  • Hybridona named Hybridona OK31J produces.
  • the two polypeptides J forming the antigen recognition region of the BIR 1 antibody are preferably VH and VL of the antibody.
  • VH and V specifically, Polypeptides having amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 7 and 9, respectively, polypeptides having amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 23, respectively, and SEQ ID NOs: 25 and And a polypeptide having an amino acid sequence represented by 27.
  • the “membrane protein according to the present invention” is preferably a TCR or TCR complex or a BCR or BCR complex, and more preferably a BCR or BCR complex.
  • the "antibody against a membrane protein present in the cell membrane of a cell expressing BIR 1" is preferably a mouse monoclonal antibody, a rat monoclonal antibody against the membrane protein according to the present invention, or A human monoclonal antibody, more preferably a rabbit monoclonal antibody against the membrane protein of the present invention.
  • the mouse monoclonal antibody against the membrane protein according to the present invention is an anti-human CD3 antibody, specifically, a mouse anti-human CD3 antibody produced from the hybridoma clone OKT3 can be mentioned.
  • the two polypeptides forming the antigen recognition region of the antibody against the membrane protein according to the present invention are preferably VH and VL of anti-human CD3 antibody, VH of anti-human IgG antibody And VL, or VH and VL of the anti-human CD19 antibody.
  • VH and VL of the anti-human CD3 antibody include polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 11 and 13, respectively.
  • V specifically, polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 29 and 31, respectively.
  • Specific examples of VH and V of the anti-human CD 19 antibody include And polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33 and 35, respectively.
  • “peptide linker” preferably includes 5 to 20 amino acids in length, and specifically, (GI y — G I y — GI y G I y S er) n — (The left side represents the N-terminal, the right side represents the C-terminal, and n represents an integer of “! To 4”.), More preferably, _G I yG I y—GI y_GI y—S e “one or one ( GI y—GI y—GI y—GI y — S er) 3 _.
  • a part of the H chain containing the CDR of the BIR 1 antibody binds directly to a part of the L chain containing the CDR of the antibody against the membrane protein of the present invention via a linker.
  • a part of H chain containing CDR of BIR 1 antibody binds to part of L chain containing CDR of antibody against the membrane protein of the present invention via a peptide linker.
  • the polypeptide has the structure in which the VH of the BIR 1 antibody is bound to the VL of the CD 3 antibody via the peptide linker, specifically, SEQ ID NO: 1.
  • 5 is a polypeptide having the amino acid sequence represented by 5.
  • a part of the L chain containing the CDR of the BIR 1 antibody binds directly to a part of the H chain containing the CDR of the antibody against the membrane protein of the present invention via a linker.
  • a part of the L chain containing the CDR of the BIR 1 antibody binds to a part of the H chain containing the CDR of the antibody against the membrane protein of the present invention via the peptide linker.
  • the polypeptide has a structure in which the VL of the BIR 1 antibody binds to the VH of the CD 3 antibody via the peptide linker, specifically, SEQ ID NO: 1.
  • 7 is a polypeptide having the amino acid sequence represented by 7.
  • a part of the H chain containing the CDR of the BIR 1 antibody, a part of the L chain containing the CDR of the antibody against the membrane protein of the present invention, a part of the L chain containing the CDR of the BIR 1 antibody And a part of the H chain containing CDR of the antibody against the membrane protein according to the present invention are connected in series either directly or via a linker (however, each linker may be different).
  • each of the VIR of the BIR 1 antibody, the V of the antibody against the membrane protein according to the present invention, the VL of the BIR 1 antibody, and the VH of the antibody against the membrane protein according to the present invention is a peptide linker.
  • each peptide linker may be different.
  • the order in which each portion is arranged forms a functional CDR of each antibody.
  • each of the BIR 1 antibody VH, the CD 3 antibody VL, the BIR 1 antibody VL, and the CD 3 antibody VH is a peptide.
  • Having a structure in which the linkers are linked in series via a linker (however, each peptide linker may be different) (however, the order in which each part is arranged is the functional function of each antibody) It is limited to those having a structure that can be folded so as to form a CDR.
  • polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 which is VH of anti-human BIR 1 antibody, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 which is VL of anti-human BIR 1 antibody A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 which is a VH of an anti-human CD3 antibody, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 which is a VL of an anti-human CD3 antibody
  • a polypeptide having a structure in which each is linked in series via each peptide linker (however, each peptide linker may be different).
  • the sequence order of each polypeptide is limited to those that can be folded so as to form the functional CDR of each antibody. Specifically, (2 a-1 a) SEQ ID NO: 7, Sequence of number 1 1, SEQ ID NO: 1 3, and SEQ ID NO: 9,
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 can be mentioned.
  • the polynucleotide encoding the bivalent antibody of the present invention may be any as long as it has a base sequence encoding the bivalent antibody of the present invention.
  • the polynucleotide encoding the bivalent antibody of the present invention lacks some amino acids (preferably 1 to 5, more preferably 1) of the polypeptide encoded by it. Deletions, substitutions or insertions into other amino acids, or modifications that combine them.
  • Phe is TTT or TTC
  • Leu is TTA, TTG, CT, CTC, CTA or CTG
  • IIe is AT , ATC or ATA, Met for ATG, V a I for GT, GTC, GTA or GTG, Ser for TC, TCC, TCA or TCG, ⁇ “0 for 0, CCC, CCA Or CCG
  • T hr is AC, AC, ACA or ACG
  • AI a is GC, GCC, GCA or GCG
  • Tyr is TAT or TAC
  • His is CAT or CAC
  • GIn is CAA or CAG
  • As n is AAT or A AC
  • Lys is AAA or A AG
  • a sp is GAT or GAC
  • GI u is GAA or GAG
  • Cys is TGT or TGC
  • Trp is TGG
  • a rg Corresponds to CG, CGC, 0 or 00
  • Ser corresponds to AG T or A
  • the polynucleotide encoding the bivalent antibody of the present invention includes a polynucleotide in which each codon corresponding to each amino acid in the amino acid sequence of the bivalent antibody of the present invention is arbitrarily combined.
  • a part thereof may be substituted with another corresponding codon.
  • polynucleotide of the present invention may be any of genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, RNA, and DNA-RNA hybrid.
  • the polynucleotide of the present invention includes those having the following constitution. That is,
  • a part of H chain containing CDR of BIR 1 antibody (for example, VH etc.) is part of L chain containing CDR of antibody against membrane protein of the present invention via peptide linker (
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having a structure bound to VL, etc., and a part of an L chain containing CDR of BIR 1 antibody (for example, VL) is related to the present invention via a peptide linker.
  • a part of H chain containing CDR of BIR 1 antibody for example, VH
  • a part of L chain containing CDR of antibody against membrane protein of the present invention for example, VL
  • BIR 1 Part of the L chain containing the CDR of the antibody eg VL, etc.
  • each of a part of the H chain (for example, VH etc.) containing CDRs of the antibody against the membrane protein according to the present invention is connected via a peptide linker (however, each peptide linker may be different).
  • a polypeptide having a structure connected in series however, the order in which the portions are arranged is limited to that having a structure that can be folded so as to form a functional CDR of each antibody).
  • the polynucleotide in (1b) above is a polynucleotide encoding a part of the H chain containing the CDR of the BIR 1 antibody or the CDR of the antibody against the membrane protein according to the present invention. Any of the polynucleotides encoding a part of the chain may be arranged on the 5 ′ end side thereof, and a polynucleotide encoding a part of the L chain containing the CDR of the BIR 1 antibody or the membrane protein according to the present invention Any of the polynucleotides encoding a part of the H chain containing the CDR of the antibody against may be arranged on the 5 ′ end side thereof.
  • the polynucleotide in (2b) above should have a structure in which the order in which each portion is arranged is folded so that a functional CDR of each antibody can be formed.
  • Specific examples include polynucleotides encoding the polypeptides listed in (2 a_ 1) to (2 a_ 4) above.
  • polynucleotides constituting the polynucleotide of the present invention as a polynucleotide encoding a part of the H chain containing CDR of BIR 1 antibody, for example, represented by SEQ ID NO: 8, 22, or 26
  • examples of the polynucleotide encoding a part of the L chain containing CDR of BIR 1 antibody include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, 24, or 28. And the like.
  • the membrane protein according to the present invention is CD 3 as a polynucleotide encoding a part of the H chain containing CDR of the antibody against the membrane protein according to the present invention, for example, SEQ ID NO: 1
  • a membrane protein according to the present invention is a BCR complex.
  • a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 30 can be mentioned, and when the membrane protein according to the present invention is CD19, for example, it is represented by SEQ ID NO: 34.
  • a polynucleotide having a base sequence of when the membrane protein according to the present invention is CD 3 as a polynucleotide encoding a part of the L chain containing CDR of the antibody against the membrane protein according to the present invention, for example, it is represented by SEQ ID NO: 14
  • a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 is used.
  • the membrane protein according to the present invention is CD 19, for example, a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 can be mentioned.
  • the polynucleotide encoding the VH of the BIR 1 antibody is preferably a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, and preferably the polynucleotide encoding the VL of the BIR 1 antibody.
  • a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and is preferably represented by SEQ ID NO: 12 as a polynucleotide encoding the VH of an antibody against CD 3, which is a membrane protein according to the present invention.
  • a polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 is preferable as the polynucleotide encoding the VL of the CD3 antibody.
  • the combination of polynucleotides listed in (1b) is preferably a combination of polynucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18 respectively.
  • the polynucleotide (2b) is preferably
  • An expression vector having the polynucleotide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the expression vector of the present invention) is obtained by linking the polynucleotide of the present invention downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • an expression vector for example,
  • E. coli expression vector e.g., p BR322, p BR325, p UC 1 2, p UC 1 3, other generally those marketed
  • Bacillus subtilis plasmid e.g., P UB 1 1 0, p TP5, pC 1 94, other commercially available vectors
  • yeast expression vectors e.g, pSH 19, pSH 15, other commonly available vectors
  • animal cell expression vectors eg, pA 1- 1 1.
  • pacteriophage such as sphage, retrovirus, vaccinia virus, baculovirus and other animal viruses. it can.
  • Examples of the host of the transformant of the present invention include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Examples of the genus Escherichia include Escherichia coli (for example, K 1 2, DH 1, J ⁇ 1 03. JA221, HB 1101, and C 600).
  • Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis (for example, MI 1 14 and 207-21).
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, and Pichia pastor is.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, S f cells (eg, S f 9 cells and S f 21 cells), MG 1 cells, and High Five TM cells are used. It is done. When the virus is BmN P V, BmN cells are used. As insects, for example, silkworm larvae are used.
  • the animal cell may be any cell as long as it is transformed transiently, continuously, or stably by the expression vector of the present invention. More preferably, it is a stably transformed cell that can continuously or stably express the bivalent antibody of the present invention, for example, COS 1 cell, COS 7 cell, CHO cells, CHO—K 1 cells, HEK293 cells, NS 0 cells, U 937 cells, Jurkat cells, He Ia cells, D aud ⁇ cells, K562 cells, mouse L cells, NIH 3 T 3 cells, A549 Cells, BHK-21 cells, BRL-3A cells, HepG2 cells, HUVEC, PC12 cells, RAW264.7 cells, THP-1 cells, and L929 cells.
  • COS 1 cell COS 7 cell
  • CHO cells CHO—K 1 cells, HEK293 cells, NS 0 cells, U 937 cells
  • Jurkat cells He Ia cells
  • D aud ⁇ cells K562 cells
  • mouse L cells NIH 3
  • the transformant of the present invention can be prepared by transforming a host with the expression vector of the present invention. Transformation can be performed according to a known method or a method according to the example depending on the type of host. In addition, the above-mentioned hosts can be obtained from depository institutions.
  • the bivalent antibody of the present invention can be produced using a gene recombination technique (Jou rnal of I ⁇ unology Medicine, 1999, Vol.231, No.1-2, p.177-189, U.S. Patent No. 4704692, U.S. Patent No. 4946778, U.S. Patent No. 5990275 US Patent No. 599451 1, US Patent No. 6027725, European Patent No. 404097, International Publication No. 93Z1 1 1 61, Hollinger, Proc. Natl. Acad. Sc in USA 1993, 90, p.6444-6448).
  • DNA prepared from a hybridoma that produces monoclonal antibodies against each antigen is isolated from DNA encoding each antibody, and a partial fragment of both DNAs is fused by gene recombination technology.
  • a bivalent antibody can be produced from the transformant by transforming an appropriate host cell using an expression vector into which is inserted.
  • a bivalent antibody can be obtained by culturing the transformant under appropriate conditions and separating and purifying the produced protein.
  • step (1) monoclonal antibodies were prepared using the Kohrider and Milstein Hypridoma method (Nature, 1975, Vol. 256, No. 5517, p.495-497). Can be produced.
  • mouse, rat, hidge, goat, rabbit or guinea pig can be used, but mouse or rat is preferably used. It can also be performed using an immunization method called “DNA immunization” (Nature Iunology, 2001, Vol. 2, No. 3, p.261-267).
  • F v or sc F v can be obtained by treating the antibodies with a protease enzyme and reducing them if necessary.
  • the cDNA can be isolated from an antibody-producing hyperpridoma and produced using an expression vector prepared by genetic modification.
  • F (a b ') 2 is a complete chromatographic digestion of purified monoclonal antibody with pepsin and affinity chromatographs such as ion exchange chromatography, gel filtration, protein A or protein G column. It can be purified by any method of GRAPHI. Since pepsin digestion time varies depending on the Ig subtype, it must be prepared appropriately. Fa b ′ can be prepared by partially reducing the prepared F (ab ′) 2 with 2_mercaptoethylamine. In addition, Fab can be prepared by direct digestion with the digestive enzyme papain in the presence of cysteine and purification.
  • sc FV single chain Fv
  • sc FV single chain Fv
  • DNA encoding VH and VL CDRs is ligated with DNA encoding a neutral amino acid (for example, a polypeptide containing glycine and Z or serine), and an expression vector containing this recombinant DNA is appropriately used.
  • a neutral amino acid for example, a polypeptide containing glycine and Z or serine
  • VL and VH are arranged at the N-terminal side of VL, and even if VH is arranged through a linker, the N-terminal side is VH, and VL is arranged through a linker. Any of those described above may be used.
  • a humanized chimeric antibody of each antibody can be prepared by substituting a part of a non-human antibody prepared by immunizing a mammal other than human with a part of human antibody. Specifically, it is known that it can be produced by constructing a chimera with a gene encoding the constant region of rabbit antibody (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1987, 84). Vol., P.3439-3443, Journal of Iunology, 1987, Vol.139, No.1, p.3521). The DNA sequence of rabbit constant region is known, and the constant region gene can be easily obtained from a known clone. Subsequently, the DNA sequence encoding the CDR of the antibody is fused to the rabbit constant region sequence.
  • the isotype of baboon constant region depends on the desired effector function or antibody-dependent cytotoxic activity. You can choose by gender. Preferred isotypes are IgG1, IgG3 and IgG4. Also, any of human light chain constant region, ⁇ chain or; chain can be used. This hatched chimeric antibody can be expressed by a conventional method.
  • Human antibodies include mice introduced with human immunoglobulin constant region genes (Xenomouse (Chemical Biology, 2000, Vol. 7, No. 8, P.R185-6), Humab mouse (infection and immunity, 2002, 70, 2, p.612-9), TC mouse (Biotechnology and Genetics Enginnering Revew, 2002, 19, p.73-82), KM mouse (Cloning Stem Cel Is, 2002, Vol. 4, No. 1, p.91-102)). Furthermore, antibody-producing lymphocytes isolated from these mice were used as hyperidomas, and the target antibody was Can be mass-produced. It can also be prepared by the phage 'display method (FEBS Letter, 1998, Vol. 441, pages 20-24). This method uses a phage in which a rabbit antibody gene is incorporated into circular single-stranded DNA, and allows the rabbit antibody to be expressed on the surface of the phage in a form fused with the outer shell protein constituting the phage. .
  • RNA is separated from the hyperidoma, a gene encoding the antibody or a part thereof is isolated, and a gene encoding a part of each isolated antibody is genetically engineered. It consists of a process of recombination by a conventional method.
  • the step of separating all RNA or mRNA from the hyperidoma is a known method (hereinafter, unless otherwise specified, Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory or Cur rent Protocol in Mo I ecuCDC Biology).
  • the step of isolating the gene encoding the antibody or part thereof can be performed by amplification by RT_PCR using an appropriate synthetic DNA primer or by selection with hybridization with their labeled probe.
  • the high crystallization method can be performed according to a known method.
  • An expression vector expressing the bivalent antibody of the present invention is obtained by encoding a part of the isolated antibody of the present invention.
  • the required amount can be obtained by recombining the gene to be stored by a known or genetic engineering technique according to the Examples and then inserting the gene into an expression vector and introducing it into a suitable host.
  • the transformant is cultured and produced in the cell or secreted outside the cell. Furthermore, it can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a known method or a method according to the Examples.
  • the bivalent antibody of the present invention is extracted from cultured cells, the cells are suspended in an appropriate buffer solution, and the cells are disrupted by ultrasonic waves, lysozyme, Z, or freeze-thawing, and then the distant cells.
  • a method for obtaining a crude extract of soluble protein by heart separation or filtration is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride and a surfactant such as T RITON (registered trademark) X — 100.
  • Separation and purification of the bivalent antibody of the present invention contained in the obtained soluble fraction can be carried out according to a known method or a method according to Examples.
  • methods that utilize solubility such as salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, etc.
  • a method using a difference in charge such as ion exchange chromatography, a method using specific affinity such as affinity chromatography, a hydrophobicity such as hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography, etc.
  • the bivalent antibody of the present invention obtained by the above method is a free form
  • the free form can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the bivalent antibody of the present invention is obtained from a rabbit reticulocyte lysate, an insect cell lysate, a wheat germ lysate, an Escherichia coli lysate, etc. In vitro using a cell-free protein translation system It can also be produced by oral translation. Further, the polynucleotide of the present invention can be produced as a saddle type using a cell-free transcription Z translation system containing RNA polymerase.
  • the bivalent antibody of the present invention can also be expressed as a fusion protein with another protein or tag (for example, Fc region of antibody, glutathione S-transferase, protein A, hexahistidine, etc.).
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography and excised with Z or an appropriate protease (for example, enterokinase, thrombin, etc.) for efficient purification.
  • the bivalent antibody of the present invention is a method of Reading et al. Using Hypridoma, that is, a hybrid Hypridoma is prepared by further fusing two kinds of Hypridoma producing monoclonal antibodies. It can also be produced by a method for selecting a hybrid hybridoma that produces a bivalent antibody (US Pat. No. 4,474,893).
  • the bivalent antibody of the present invention can be obtained by known chemical methods (Archives of biochemistry and biophysics., 1961, 90, p.460-462, Science, 1985, 299, p.81-83). In these methods, two types of antibodies are hydrolyzed by an enzyme, then the disulfide bond of the antibody H chain is cleaved with a reducing agent, followed by mixing and reoxidizing different types of antibodies to divalent antibodies. Is what you get. Further, a method using a crosslinking agent such as daltaraldehyde or carpositimide (Japanese Patent Laid-Open No. 2-1556, US Pat. No. 5,260,203, US Pat. No. 5,455,030, US Pat.
  • the antigenicity or toxicity of the bivalent antibody of the present invention is very low, Safe enough to use.
  • the bivalent antibody of the present invention suppresses immunity by expressing or enhancing the immunosuppressive function of BIR 1, diseases involving BIR 1, such as autoimmune diseases, rejection after organ transplantation, allergic diseases And can be used for the prevention and Z or treatment of diseases selected from inflammatory diseases.
  • autoimmune disease for which prevention and Z or treatment can be expected by administration of the bivalent antibody of the present invention or a medicament comprising the same, for example, arthritis, autoimmune hepatitis, autoimmune glomerulonephritis, self Immune isletitis, autoimmune orchitis, autoimmune ovitis, ulcerative colitis, Siedalen syndrome, Crohn's disease, Peche's gonorrhea, u-gener granulomatosis, hypersensitivity vasculitis, nodular artery Peritonitis, Hashimoto's disease, myxedema, Graves' disease, Addison's disease, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia, pernicious anemia, myasthenia gravis, demyelinating disease, aortic inflammation group, psoriasis, pemphigus Acne, pemphigoid, collagen disease (eg systemic lupus erythemato
  • lupus anticoagulant factor is also high disease.
  • diseases with high levels of lupus anticoagulant include, for example, systemic lupus erythematosus, arterial thrombosis (eg, cerebral infarction, etc.), venous thrombosis, habitual miscarriage, thrombocytopenia, and anti-phospholipid antibody syndrome, etc. Is mentioned.
  • a rejection after organ transplantation that can be expected to be prevented and Z or treated by administration of a bivalent antibody or a medicine comprising the same in the present invention
  • a bivalent antibody or a medicine comprising the same in the present invention
  • kidney transplantation, liver transplantation, skin transplantation, small intestine transplantation examples include rejection after heart transplantation and Z or lung transplantation, rejection in bone marrow transplantation, and graft-versus-host disease.
  • an allergic disease for which prevention and Z or treatment can be expected by administration of the bivalent antibody of the present invention or a medicine comprising the same for example, asthma, bronchial asthma, atopic dermatitis, urticaria, allergic Rhinitis (eg, hay fever) Allergic conjunctivitis (eg, hay fever), allergic gastroenteritis, anaphylactic shock, food allergy, etc.
  • Inflammatory diseases for which prevention and Z or treatment can be expected by administration of the bivalent antibody of the present invention or a medicament comprising the same include, for example, dermatitis (for example, contact dermatitis and atopic dermatitis) Etc.), colitis (eg, ulcerative colitis and Crohn's disease, etc.), vasculitis (eg, Takayasu arteritis, giant cell arteritis (temporal arteritis), polyarteritis nodosa, Wegener's granulomatosis , Cheyag, Strauss Syndrome (allergic granulomatous vasculitis), allergic dermatological vasculitis, Henoch ⁇ Sihan line purpura, hypersensitivity vasculitis, vasculitis syndrome, obstructive thromboangiitis (Burger's disease) Arthritis (eg, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, tuberculos
  • the bivalent antibody of the present invention when used as a pharmaceutical, it can be administered as a pharmaceutical composition alone or mixed with various pharmacologically acceptable formulation adjuvants.
  • a pharmaceutical composition is usually administered by a parenteral route, but can also be administered orally. Examples of parenteral administration include administration by injection, transdermal, transmucosal, nasal, and transpulmonary administration.
  • Such injections include solutions, suspensions, emulsions, and solid injections used by dissolving or suspending in a solvent at the time of use.
  • An injection is used by dissolving, suspending or emulsifying one or more active substances in a solvent.
  • a solvent for example, an aqueous solvent (for example, distilled water, physiological saline, Ringer's solution, etc.) or an oily solvent (for example, olive oil, rubber) Vegetable oils such as sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, alcohols such as ethanol) and combinations thereof.
  • this injection includes a stabilizer (eg, rabbit serum albumin, etc.), a solubilizing agent (eg, polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannii! ⁇ L, trehalose, benzyl benzoate, Ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, sodium salicylate, sodium acetate, etc., suspending agents (eg stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid) , Surfactants such as lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate (eg, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, Hydroxy polymers such as droxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, etc.), polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated cast
  • injections can be produced by a method commonly used in the field of pharmaceutical technology, such as the method described in the Japanese Pharmacopoeia. For example, it is sterilized in the final process or manufactured by aseptic operation.
  • aseptic solid preparations such as freeze-dried products are manufactured and sterilized or sterile distilled water for injection or others before use. It can also be used by dissolving in the above solvent.
  • injection solutions can be supplied in containers of a prescribed capacity such as plastic or glass vials, ampoules, syringes, and syringes, and containers of a large capacity such as bottles.
  • the dose of the bivalent antibody of the present invention varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but it is usually 1 dose per adult. in the range of ng to 500 mg, preferably in the range of 5 mg to 300 mg, once every few days, once every three days, once every two days, once a few times a day It can be administered parenterally (preferably intravenously) or it can be administered intravenously in the range of 1 hour to 24 hours per day. Since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or administration may be necessary beyond the range.
  • the injection for parenteral administration includes all injections, and also includes infusions.
  • intramuscular injections For example, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections, arterial injections, intravenous injections, intraperitoneal injections, spinal cavity injections and Intravenous drops.
  • local administration may be performed targeting a part of the target organism (one tissue such as an organ), or by administration to the blood vessel, the whole organism
  • the antibody of the present invention may be circulated.
  • a gene encoding the bivalent antibody of the present invention to be administered can be introduced into a living body using a gene therapy technique.
  • the bivalent antibody of the present invention can be locally administered to a region where treatment is desired. For example, local administration during surgery, use of a catheter, or targeted gene delivery of a base sequence encoding the bivalent antibody of the present invention can be administered.
  • the bivalent antibody of the present invention comprises
  • the combination drug of the bivalent antibody of the present invention and another drug may be administered in the form of a combination drug in which both components are combined in one preparation, or in a form of administration in separate preparations. It may be.
  • simultaneous administration and administration by time lag are included.
  • administration by time difference may be such that the bivalent antibody of the present invention is administered first and the other drug is administered later, or the other drug is administered first and the bivalent antibody of the present invention is administered later.
  • Each administration method may be the same or different.
  • the dose of the other drug can be appropriately selected based on the clinically used dose.
  • the mixing ratio of the bivalent antibody of the present invention and other drugs can be appropriately selected depending on the age, weight, administration method, administration time, target disease or symptom, or a combination thereof. For example, 0.001 to 100 parts by mass of another drug may be used per 1 part by mass of the bivalent antibody of the present invention. Two or more other drugs may be administered in combination at an appropriate ratio.
  • other drugs that complement and enhance or prevent Z or therapeutic effects of the bivalent antibody of the present invention are not only those that have been found so far, but will be found in the future based on the mechanism described above. Included.
  • the disease that exhibits the preventive and Z or therapeutic effects is not particularly limited, and any disease that complements and enhances the Z or therapeutic effect of the divalent antibody of the present invention may be used.
  • Other drugs for autoimmune disease of the bivalent antibody of the present invention rejection after organ transplantation, prevention of allergic disease or inflammatory disease and supplementation of Z or therapeutic effect and Z or enhancement
  • steroid drugs non-steroidal anti-inflammatory drugs, immunosuppressive drugs, antiallergic drugs (for example, chemical transmitter release inhibitors, antihistamines, thromboxane synthase inhibitors, thromboxane antagonists) And Th 2 site force-in inhibitors), phosphodiesterase inhibitors (PDE 4), mediator release inhibitors, and the like.
  • topical drugs include, for example, clobetasol propionate, diflorazone acetate, fluocinonide, mometasone furancarboxylate, betamethasone dipropionate, betamethasone butyrate propionate, betamethasone valerate, diflupre Donato, Pudesonide, Diflucortron valerate, Amcinonide, Halsinonide, Dexamethasone, Dexamethasone propionate, Dexamethasone valerate, Dexamethasone acetate, Hydrocortisone acetate, Hydrocortisone butyrate, Hydrocortisone propionate, Prodionate propionate Propropionate Fluocinolone acetonide, beclomethasone propionate, ⁇ liamcinolone acetonide, flumezone pivalate, alcrometa propionate Zon, clobetasone butyrate
  • steroidal drugs for example, cortisone acetate, hydrocortisone, hydrocortisone sodium phosphate, hydrocortisone sodium succinate, flucortisone sodium acetate, prednisolone, prednisolone acetate, prednisolone sodium succinate, butylacetate Prednisolone, sodium prednisolone phosphate, halopredon acetate, methyl prednisolone, methylprednisolone acetate, methylprednisolone sodium succinate, triamcinolone, triamcinolone acetate, diamucinolone acetonide dexamethasone dexamethasone dexamethasone And acetic acid parameterzone and betamethasone.
  • beclomethasone propionate for example, beclomethasone propionate, flutizone propionate, budesonide, flunisolide, ⁇ riamcinolone, ST-126P, ciclesonide, dexamethasone palmitate, mometasone furan carbonate, plasterone sulfonate, deflazacote, methyl prednisolone List of Streptane and methylprednisolone sodium succinate.
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs include, for example, aspirin, loxonin, dic oral fenac, celecoxib, thiaprofenic acid, aluminoprofen, flurbiprofen axetil, zaltoprofen, suprofen, ketoprofen, pranoprofen, fentianazak , Droxicam, ibuprofen, aceclofenac, amphenac , Bimesulide, Etlicoxib, Ketorolac ⁇ Torometamol, Parecoxib, Benzaritto ⁇ disodium, auranofin, Loki Sopurofen sodium ⁇ , bucillamine, Akutaritto, cinnamic acid Pirokishi cam, Nabume tons, Sala Brazosport Ruff Avi lysine, lornoxicam, Merokishika arm, Jiaserein, mouth Fuekokishibu and valdecoxib, and the like
  • Examples of the basic non-steroidal anti-inflammatory drug include thiaramide hydrochloride, chinolidine hydrochloride, epyrizole, and emorphazone.
  • immunosuppressive drugs include azathioprine, ascomycin, Eveguchi Limus, orthoclone OKT 3, corticosteroid, salazosulfaviridine, cyclosporine, cyclophosphamide, sirolimus, takuguchi limus hydrate, Deo Xyspargarine, bucillamine, prednisolone, mofethyl mycophenolate, mizoribine, methylprednisolone, methotrexer ⁇ ⁇ , leflunomide, and anti-human lymphocyte globulin.
  • chemical transmitter release inhibitors include, for example, sodium cromoglycate, tranilast, amlexanox, levirinast, ibudilast, pemirolast potassium, dazanolast, nedocromil, cromoglycan and israpaphant Is mentioned.
  • antihistamines include, for example, diphenhydramine, diphenvillarin hydrochloride, difenilvillin teocleate, clemastine fumarate, dimenhydrin ⁇ , d I-chlorphenirami maleate , D-chlorpheniramine maleate, triprolidine hydrochloride, promethazine hydrochloride, alimemazine tartrate, isothipentyl hydrochloride, homochlorcyclidine hydrochloride, hydroxyzine, cyproheptadine hydrochloride, repotency vastin hydrochloride, atemizole, bepotastine, desported latazine, TAK-427, ZCR-2060, NIP-530, mometasoneph mouth candy, mizolastine, BP-294, andlast, auranofin and acribastine.
  • diphenhydramine diphenvillarin hydrochloride
  • examples of thromboxane synthase inhibitors include ozadarel hydrochloride and imitrodast sodium
  • examples of thromboxane antagonists include seratrodast, ramatroban, and domitroban calcium hydrate.
  • examples of the Th 2 site force-in inhibitor include subratast sonatimod tosilate, T-614, SR-31747 and the like.
  • Phosphodiesterase inhibitors include, for example, cilomilas ⁇ , oral flumilast, arophilin, aptazolam, cypamfilin, oral ribulum, 0PC-6535, 0N0-6126. IC-485, AWD-12-281, CC- 10004. CC-1088. KW-4 490, I irimi last. ZK-117137. YM-976, BY-61-9987. CC-7085, CDC-998. MEM-1414, ND-125U Bay19-8004, D- 4396, PD-168787. NIK-616. SCH-35159U V-11294A.
  • mediator release inhibitors examples include amlexanox, ibudilast, cromoglycate sodium, dazanolast, tranilast, pemirolast potassium, and repirinast.
  • Human BIR 1 extracellular domain protein 60 g was mixed with erMax adjuvant (Sigma) and administered intraperitoneally to BALBZc mice as an antigen. .
  • the same antigen 60 g was mixed with erMax adjuvant and administered intraperitoneally to mice.
  • the same antigen 40 g was finally administered intraperitoneally to the mice.
  • the spleen was removed from the mouse.
  • Lymphocytes were isolated from the spleen obtained in (1) above, mixed with mouse myeloma P3 U 1 at about 4: 1, and cell fusion was performed using polyethylene glycol.
  • RPMI 1 640/1 5% FCSZH AT medium was used to select rehybridomas, and EL I SA and flow cytometry were used to screen high-pridoma producing the desired antibody.
  • Positive hybridomas were recloned by the limiting dilution method to obtain anti-human BIR1 monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • ascites was collected after 2 weeks. The antibody produced in the ascites was purified using a Pros mark-G column (Millipore).
  • the anti-human BIR 1 monoclonal antibody purified in (2) above (clone: 0K3 1, 0K151, 0K170) was biotinylated using the EZ-Link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation Kit (PIE RCE) .
  • the biotinylated anti-human BIR1 monoclonal antibody produced recognized human BIR1.
  • 0K31, 0K15U 0 ⁇ 170 represents each clone of anti-human BIR1 monoclonal antibody, and Isotype control represents a negative control.
  • 3 ⁇ 4MI2 ⁇ BIR ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4] control by human BIR 1 and BCR t
  • Nephrase BIR 1 inhibitory action by cross-linking of human BIR 1 and BCR complex suppresses IL-12 production through BCR activation Evaluated as an effect.
  • BIR1 suppressed IL_2 production via BCR activation by cross-linking of human BIRR1 and BCR complex.
  • Example 3 Cloning of DNA encoding the human CDR1 of pile human BIR 1 pile rest Anti-human BIR 1 antibody Hypri-Doma OK31 (reception number: FERM AP -20846), OK 1 51, OK 1 70 to SV Total RNA Isolation Total RNA was prepared using System (Promega).
  • I ⁇ 0 heavy chain 0 is the following primer 1 (SEQ ID NO: 37) and primer 2 (SEQ ID NO: 3 8), I gG
  • the light chain CDR was subjected to primary PCR and nested PCR using primer 3 (SEQ ID NO: 39) and primer 4 (SEQ ID NO: 40).
  • the PCR reaction was performed using PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc.), first holding at 96 for 1 minute, followed by temperature operation at 98 for 10 seconds, 64 for 15 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The test was repeated 30 times, and finally held at 72 ° C for 10 minutes.
  • the plasmid DNA was purified and the IgH VH region (SEQ ID NO: 8) and IgG VL region (anti-human BIR1 antibody OK31) SEQ ID NO: 1 0), OK 1 51 Ig G VH region ( SEQ ID NO: 22) and IgG VL region (SEQ ID NO: 24), 0 170 1 ⁇ 0 1 "1 region (SEQ ID NO: 26) and I ⁇ 0 1_ region (SEQ ID NO: 28), respectively was determined.
  • IgH VH region SEQ ID NO: 8
  • IgG VL region anti-human BIR1 antibody OK31
  • the DNA encoding the bivalent antibody is based on the DNA of the anti-human BIR 1 antibody OK31 CDR (VH and VL) isolated in Example 3 and the anti-human CD 3 antibody OKT 3 CDR (VH and VL). It was prepared by chemical synthesis (SEQ ID NO: 20) and ligated to an expression vector. After transforming Escherichia coli DH5 with this plasmid, the plasmid DNA was purified to obtain a bivalent antibody expression vector.
  • MI5 Two fflfitfT's .fe 71: ⁇
  • the bivalent antibody was expressed by introducing the expression vector prepared in Example 4 into 293 T cells using LipofectAMINE Plus (Inv manufactured by rogen). That is, the cells were cultured for several days after gene introduction, and the culture supernatant was collected. After concentrating the culture supernatant, the bivalent antibody was purified using a HisTrap HP column (GE Hea manufactured by hcare).
  • bivalent antibody to cell surface antigens (BIR1 and CD3) is confirmed by flow cytometry.
  • Human BIR1-expressing CHO cell line (hereinafter sometimes referred to as ⁇ BIR1-positive ⁇ CD3-negative cells) or “BIR 1 (+) ZCD 3 (-) eel I s”) and rabbit CD 3 expression
  • ⁇ BIR1-positive ⁇ CD3-negative cells or “BIR 1 (+) ZCD 3 (-) eel I s”
  • BIR 1 (+) ZCD 3 (+) eel I s rabbit CD 3 expression
  • BIR 1 negative ⁇ CD 3 positive cells (hereinafter sometimes referred to as “BIR 1 negative ⁇ CD 3 positive cells” or “BIR 1 ( ⁇ ) ZCD3 (+) eel I s”) were prepared in Example 5.
  • Add titered antibody (1 or 10 g) let stand on ice for a while, then add secondary antibody and let stand on ice for 30 minutes. Then, analyze by flow cytometry to confirm the antigen reactivity of the bivalent antibody.
  • peripheral blood mononuclear cells are prepared from peripheral blood of healthy humans using Lymphopr-marked tubes (manufactured by AXIS-SH I ELD).
  • Cells hemolysis buffer (0. 80/0 NH 4 CI, 0. 1% KC0 3, 1 mM EDTA) was suspended in, hemolyzing erythrocytes.
  • T cells are purified using Nylon Fiber Column T (Roche) and suspended in a medium (RPMI 1640 medium containing 10% urine fetal serum).
  • Pre-prepared 24well plate coated with anti-human Q? S S TCR antibody (5 gZm L; manufactured by BD Pharmingen), and prepared 2 ⁇ 10 6 T cells of Zm LZ well. Sowing at a rate. Subsequently, 1 mL of a medium containing anti-human CD28 antibody (1 gZmL; manufactured by BD Pharmingen) is added and cultured for 60 hours. After antibody-stimulated cells were collected and cultured for 12 hours without stimulation, T cells were applied to a 96-well plate previously coated with anti-anti-ST CR antibody (0.1 gZm L). Seed 1 X 10 6 1 00 LZ wells, add divalent antibody to 1 gZ wells, and culture. 48 hours later, cell proliferation is measured using Cell Prol iferation EL ISA (Roche), using Brd U (promodoxyuracil) uptake as an index.
  • the bivalent antibody of the present invention expresses or enhances the immunosuppressive function of BIR 1, it is a novel aspect of autoimmune disease, rejection after organ transplantation, allergic disease and inflammatory disease. Useful as a preventive and Z or therapeutic agent.

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Abstract

［課題］ＢＩＲ１（B cell immnoglobulin receptor 1）関連疾患、例えば自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー性疾患および炎症性疾患等に対する予防および／または治療薬となりうる、ＢＩＲ１の免疫抑制機能を発現ないし増強する抗体の提供。 ［解決手段］ＢＩＲ１抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリペプチドが、ＢＩＲ１発現細胞に発現する膜タンパク質（例えばＢＣＲ、ＢＣＲ複合体、ＴＣＲ、ＴＣＲ複合体）に対する抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリペプチドのそれぞれ一方に、直接またはリンカーを介して結合された構成を有する二価抗体、それをコードするポリヌクレオチド、およびその医薬用途。特にＢＩＲ１抗体のＶＨ、ＣＤ３抗体のＶＬ、ＣＤ３抗体のＶＨ、ＢＩＲ１抗体のＶＬが順に５～２０アミノ酸長のペプチドリンカーを介して結合された二価抗体、それをコードするポリヌクレオチド、およびその医薬用途。

Description

明 細 書
B I R 1に対する二価抗体
技術分野
[0001] 本発明は、 B細胞免疫グロブリン受容体 1 (B cell i mmunog I obu I in recep tor 1；以下、 B I R 1と略記することがある。 ） および T細胞受容体複合体 もしくは Β細胞受容体複合体等の免疫受容体を認識する二価抗体、 それをコ 一ドするポリヌクレオチドならびにその二価抗体の医薬用途に関する。
背景技術
[0002] 本発明に係る B I R 1は、 特許文献 1に報告されている。 B I R 1はその 細胞内領域に免疫抑制性のモチーフ構造である I T I Μ (I隱 unorec印 tor Ty rosine - based Inhibitory Motif) を有してしゝる。
[0003] I T I Mを有する分子として、 CT LA— 4 (非特許文献 1参照） 、 PD - 1 (非特許文献 2参照） および F c yR l I B (非特許文献 3参照） 等が 知られている。 CT L A— 4および P D— 1は、 同一細胞上の T細胞受容体 (以下、 TCRと略記する。 ） 複合体と凝集し、 その活性化シグナルを構成 するチロシンキナーゼ活性を抑制することにより、 TCR複合体を介した T 細胞の活性化を抑制している。 一方、 F c yR l 1 Bは、 同一細胞上の B細 胞受容体 （以下、 BCRと略記する。 ） 複合体と凝集し、 その活性化シグナ ルを構成するチロシンキナーゼ活性を抑制することにより、 抗原一抗体複合 体による B細胞の活性化を抑制している。 B I 1は3細胞、 T細胞、 単球 、 および抗原提示細胞に発現しているが、 これらの免疫刺激による活性化を 抑制する機能を有すると予測される。
[0004] 二価抗体とは、 2つの異なる抗原特異性を有する、 独立した抗原認識部位 を持ち合わせた非対称の抗体である （特許文献 2、 特許文献 3、 非特許文献 4、 非特許文献 5、 および非特許文献 6参照） 。
[0005] また、 ダイアポディ （diabody) とは二価抗体の最小単位であり、 それぞれ 同じ親抗体由来の重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが互いに非共有結合に よりへテロ二量体を形成するという性質を利用し考案されたものである （特 許文献 4、 非特許文献 7、 非特許文献 8参照） 。
[0006] CT LA_4に対する二価抗体は特許文献 5に、 PD_ 1に対する二価抗 体は特許文献 6および特許文献 7において報告されているが、 B I R 1に対 する二価抗体に関する報告はない。
[0007] 特許文献 1 ：国際公開第 99/33873号パンフレツ卜
特許文献 2：米国特許第 5922845号明細書
特許文献 3：米国特許第 5837243号明細書
特許文献 4 :国際公開第 93Z1 1 1 61号パンフレツ卜
特許文献 5：特表 2004-51 2005号公報
特許文献 6：特表 2003— 507069号公報
特許文献 7：国際公開第 2004Z072286号パンフレツ卜
非特許文献 1 ： Da r i a V a c h P， 外 3名， 「ョ一口ビアン ジャーナ レ ォブ ィムノロジ一 (European journal of immunology. )」 ， 1 988年 ， 第 1 8巻， 第 1 2号， p. 1 901 - 1 905
非特許文献 2： I s h i d a Y， 外 2名， 「ザ ェンポ ジャーナル (The Ε MBO journal)」 ， 1 992年， 第 1 1巻， 第 1 1号， p. 3887-95 非特許文献 3： S t e n g e I i n S、 外 2名， 「ザ ェンポ ジャーナル (The EMBO journal. )j , 1 988年， 第 7巻， 第 4号， p. 1 053- 1 0 59
非特許文献 4 : Z e i d I e r R、 外 6名， 「ジャーナル ォブ ィムノロ ジー（Journal of Immunology)」 ， 1 999年、 第 1 63巻、 p. 1 246- 1 252
非特許文献 5： S o m a s u n d a r a m C、 外 4名， 「ヒューマン アン チポディーズ（Human ant i bodies)」 ， 1 999年， 第 9巻， p. 47-54 非特許文献 6 : Ke I e r 丁、 外 7名， 「キャンサー リサーチ（Cancer Re search)」 ， 1 997年， 第 57巻， p. 4008-401 4
非特許文献 7 : H o i I i n g e r, 「プロシーディンダス ォブ ザ ナシ ョナル アカデミー ォブ サイエンシーズ ォブ ジ ユナイテッド ス テイツ ォブ ァメリカ (Proceedings of the National Academy of Science s of the United States of America)」 ， 1 993年， 第 90巻， p. 64 44-6448
非特許文献 8 : F a b r i c e L e Ga l し 外 3名， 「プロテイン ェ ンジニアリング， デザイン アンド セレクション（Protein Engineering, D esign & Selection)」 ， 2004年， 第 1 7巻， 第 4号， p. 357-36 6
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] B I R 1の免疫抑制機能を発現ないし増強する物質は、 B I R 1が関与す る疾患、 例えば、 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性疾患 および炎症性疾患等に対する新たな側面からの予防および Zまたは治療薬と なる可能性があり、 そのような医薬の開発が求められている。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 B I R
1に対する二価抗体がその目的を達成することを見出し、 発明を完成した。
[0010] すなわち、 本発明者らは、 B I R 1がその細胞内領域に I T I Mを有する ことから、 T C R複合体や B C R複合体等の免疫受容体と凝集させることに よって、 その I T I Mへの脱リン酸化酵素の動員を介し、 B I R 1が抑制性 シグナルを伝達することができると考えた。 そして、 B I R 1と TCR複合 体あるいは BCR複合体等を物理的に凝集させる物質、 すなわち、 本発明の 二価抗体が B I R 1の免疫抑制機能を発現ないし増強することを確認し、 本 発明を完成した。
[0011] すなわち、 本発明は以下の構成からなる。
( 1 ) B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれ ぞれが、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識 領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリンカ 一を介して結合された構成を有する二価抗体。
(2) 膜タンパク質が、 T細胞受容体複合体を構成する膜タンパク質また は B細胞受容体複合体を構成する膜タンパク質である前記 （1 ) 記載の二価 抗体。
(3) B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドが、 配 列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドおよび配列番号 9で 表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである前記 （1 ) 記載の二価抗 体。
(4) B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識 領域を形成する二つのポリペプチドが、 配列番号 1 1で表されるアミノ酸配 列を有するポリべプチドおよび配列番号 1 3で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチドである前記 （1 ) 記載の二価抗体。
(5) リンカーがぺプチドリンカーである前記 （ 1 ) 記載の二価抗体。
(6) ペプチドリンカ一が、 5〜20アミノ酸長を有するポリペプチドで ある前記 （5) 記載の二価抗体。
( 7 ) 配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドがぺプチ ドリンカ一を介して配列番号 1 3で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプ チドに結合された構成を有するポリべプチドおよび配列番号 9で表されるァ ミノ酸配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して配列番号 1 1 で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドに結合された構成を有するポ リペプチドからなる前記 （6) 記載の二価抗体。
( 8 ) 配列番号 7で表されるポリべプチド、 配列番号 1 3で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列を有 するポリべプチド、 および配列番号 9で表されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチドのそれぞれが、 前記 （6) 記載のペプチドリンカ一 （ただし、 当該 ペプチドリンカ一は同じでも異なっていてもよい。 ） を介して、 当該記載順 で結合した構成を有する前記 （6) 記載の二価抗体。
(9) ペプチドリンカ一が、 一 （G I y -G I y— G I y— G I y— S e r) n- (左側が N末端を、 右側が C末端を表し、 nは 1〜4の整数を表す。 ) である前記 （6) 記載の二価抗体。
(1 0) 配列番号 1 5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよ び配列番号 1 7で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドからなる前記
(7) 記載の二価抗体。
(1 1 ) 配列番号 1 9で表されるアミノ酸配列を有する前記 （8) 記載の 二価 ί几体。
(1 2) 前記 （8) 記載の二価抗体をコードするポリヌクレオチド。
(1 3) 配列番号 20で表される塩基配列を有する前記 （1 2) 記載のポ リヌクレオチド。
(1 4) 前記 （1 2) 記載のポリヌクレオチドを有する複製または発現べ クタ一。
(1 5) 前記 （1 4) 記載の複製または発現ベクターによる形質転換体。
(1 6) B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそ れぞれが、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認 識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリン カーを介して結合された構成を有する二価抗体を有効成分として含有してな る医薬組成物。
(1 7) B I R 1が関与する疾患の予防および Ζまたは治療剤である前記 (1 6) 記載の医薬組成物。
(1 8) B I R 1が関与する疾患が、 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反 応、 アレルギー性疾患および炎症性疾患から選択される疾患である前記 （1 7) 記載の医薬組成物。
(1 9) 自己免疫疾患が、 ループス抗凝固因子が高値な疾患、 全身性エリ テマトーデス、 関節リウマチ、 多発性硬化症および高安動脈炎から選択され る疾患である前記 （1 8) 記載の医薬組成物。
(20) B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそ れぞれが、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認 識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリン カーを介して結合された構成を有する二価抗体と、 ステロイド薬、 非ステロ イド系抗炎症薬、 免疫抑制薬、 および抗アレルギー薬から選択される 1種以 上を組み合わせてなる医薬。
(21 ) B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそ れぞれが、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認 識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリン カーを介して結合された構成を有する二価抗体の有効量を哺乳動物に投与す ることを特徴とする、 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性 疾患および炎症性疾患から選択される疾患の予防および Zまたは治療方法。
(22) 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性疾患および 炎症性疾患から選択される疾患の予防および Zまたは治療剤を製造するため の、 B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ が、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域 を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリンカ一を 介して結合された構成を有する二価抗体の使用。
(23) 受領番号 FERM AP— 20846で特定されるハイプリドー マから産生されるマウス抗ヒ卜 B I R 1モノクローナル抗体。
(24) 受領番号 FERM AP— 20846で特定されるハイプリドー マ。
(25) B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドが、 配列番号 7および配列番号 9で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチド であって、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認 識領域を形成する二つのポリペプチドが、 配列番号 1 1および配列番号 1 3 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである前記 （5) 記載の二価 抗体。
(26) (a)配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドと配 列番号 1 3で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチがぺプチドリンカ一 を介して結合された構成を有するポリべプチド、 および (b)配列番号 9で表さ れるアミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるアミノ酸 配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有 するポリペプチドからなる前記 （2 5 ) 記載の二価抗体。
( 2 7 ) (a)配列番号 7で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドと配 列番号 1 3で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチがぺプチドリンカ一 を介して結合された構成を有するポリべプチド、 および (b)配列番号 9で表さ れるアミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるアミノ酸 配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有 するポリべプチドが、 当該記載順でぺプチドリンカーを介して結合された構 成を有するポリペプチド （ただし、 各々のペプチドリンカ一は同じでも異な つていてもよい。 ） である前記 （2 6 ) 記載の二価抗体。
( 2 8 ) (a)配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドと配 列番号 1 3で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチがぺプチドリンカ一 を介して結合された構成を有するポリペプチドが、 配列番号 1 5で表される アミノ酸配列を有するポリべプチドであって、 （b)配列番号 9で表されるアミ ノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるァミノ酸配列を有 するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有するポリ ぺプチドが、 配列番号 1 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドで ある前記 （2 6 ) 記載の二価抗体。
( 2 9 ) (a)配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドと配 列番号 1 3で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチがぺプチドリンカ一 を介して結合された構成を有するポリべプチド、 および (b)配列番号 9で表さ れるアミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるアミノ酸 配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有 するポリべプチドが、 当該記載順でぺプチドリンカーを介して結合された構 成を有するポリペプチドが、 配列番号 1 9で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチドである前記 （2 7 ) 記載の二価抗体。 発明の効果
[0012] 本発明の二価抗体は B I R 1の免疫抑制機能を発現ないし増強する活性を 有する。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1 ]実施例 1におけるビォチン化抗ヒ卜 B I R 1モノクローナル抗体の抗原 結合反応を示す。
[図 2]実施例 2におけるヒ卜 B I R 1と B C R複合体の架橋による B C R活性 化を介した I L一 2産生の抑制を示す。
[図 3]実施例 4における二価抗体発現べクタ一の構成を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0014] [二価抗体]
本発明において、 B I R 1はヒト B I R 1およびそれに相当する哺乳動物 の免疫受容体を意味する。 ここで、 哺乳動物にはチンパンジー、 力二クイザ ル、 マウス、 ラッ卜、 モルモッ ト、 ィヌ、 およびブタ等を含む。 さらに、 具 体的には、 配列番号 1〜6で表されるアミノ酸配列から選択される一つのァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質 である。 ここで、 「実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質」 は、 配列番号 1〜 6で表されるアミノ酸配列から選択される一つのァミノ酸配列 を有するタンパク質の機能と同じ機能を有するタンパク質であって、 その配 列番号 1〜 6で表されるァミノ酸配列から選択されるァミノ酸配列中の一部 のアミノ酸 （好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜2個） が欠失したも の、 その一部のアミノ酸 （好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜2個） が他のアミノ酸と置換したもの、 そのアミノ酸配列に数個のアミノ酸 （好ま しくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜2個） が付加または挿入されたもの、 およびそれらを組み合わせたァミノ酸配列を有するものをも含む。 ここで、 上記アミノ酸の欠失、 置換、 または挿入の位置、 置換アミノ酸の種類は特に 限定されないが、 そのリホールディングの向上等のために行われる改変が好 ましい。 以下、 「配列番号 1〜6で表されるアミノ酸配列から選択される一 つのァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタン パク質」 を、 単に ΓΒ I R 1」 と略記することがある。
[0015] 本発明において、 「B I R 1抗体」 とは、 抗 B I R 1モノクローナル抗体
(以下、 モノクローナル抗体を 「Ma b」 と略記することがある。 ） （例え ば、 マウス抗ヒ卜 B I R 1 Ma b、 ラット抗ヒト B I R 1 Ma b、 ヒト抗ヒ 卜 B I R 1 Ma b等) もしくは非ヒ卜抗体の場合にはそれらのヒ卜化キメラ 抗体 （例えば、 C D R (Complementarity Determining Region：相補性決定 領域。 抗原認識領域と同じ意味を表わす。 ） 移植抗体等） またはそれらの部 分 （例えば、 F(a b')2、 F a b\ Fa b. および F vもしくは s c F v等 ) 等が挙げられる。
[0016] 本発明において、 「B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべ プチド」 とは、 その抗原認識領域 （以下、 CDRと略記することがある。 ） を形成する、 その抗体の重鎖 （H鎖） の一部 （例えば、 重鎖可変領域 （VH ) 等） および軽鎖 （L鎖） の一部 （例えば、 軽鎖可変領域 （VL) 等） を意 味する。
[0017] 本発明において、 「B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質」 とは、 B
I R 1が発現している細胞と同じ細胞に発現している膜タンパク質を意味す る。 以下、 これを 「本発明に係る膜タンパク質」 と略記することがある。 こ こで、 「B I R 1発現細胞」 は、 生体内で B I R 1を発現している細胞およ び初代培養細胞ならびに B I R 1を強制発現させている細胞をも含む。 例え ば、 TCRもしくは TCR複合体、 BCRもしくは BCR複合体、 活性化型 F e y受容体 （例えば、 F c R I (Journal of Biological Chemistry, 19 91年， 第 266巻， 第 20号， p.13449-13455) 、 F c r I I I (Nature 333 (6 173), 568-570 (1988)) ) . CD 1 4ZT LR4複合体 （Nature, 2000年， 第 406巻， p.780-785) 、 および F c e R I (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. ， 1988年， 第 85巻， p.1907-1911) 、 CD 1 9ZCD21複合体 （Journal of I隱 unology, 1989年， 第 143巻， p.712-717) 等が挙げられる。
[0018] 本発明において、 TCR複合体とは、 少なくとも、 Q?サブユニットと ^サ ブユニットから構成される T細胞受容体と、 サブユニット、 Sサブュニッ 卜、 サブュニッ卜および ：サブュニッ卜から構成される CD3から構成さ れる複合体である。
[0019] 本発明において、 BCR複合体とは、 少なくとも、 膜結合型ィムノグロブ リン、 CD79Q?サブユニット （The EMBO Journal, 1988年， 第 7巻， 第 11号 ， p.3457-3464) 、 および C D 79 サブユニット （Europian Journal of Im munology, 1992年， 第 22巻， 第 6号， p.1621-1625) から構成される複合体で める。
[0020] 本発明において、 「B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗 体」 とは、 本発明に係る膜タンパク質に対するモノクローナル抗体 （例えば 、 マウス抗ヒト該膜タンパク質 Ma b、 ラット抗ヒト該膜タンパク質 Ma b 、 ヒト抗ヒト該膜タンパク質 Ma b等） もしくは非ヒト抗体の場合にはそれ らのヒト化キメラ抗体 （例えば、 CDR移植抗体等） またはそれらの部分 （ 例えば、 F(a b')2、 F a b\ Fa b. および F vもしくは s c F v等） 等 が挙げられる。
[0021] 本発明において、 「B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗 体の抗原認識領域を形成する二つのポリペプチド」 とは、 その CDRを形成 する、 その抗体の H鎖の一部 （例えば、 VH等） および L鎖の一部 （例えば 、 VL等） を意味する。
[0022] 本発明に係る膜タンパク質としての 「TCR複合体」 に対する抗体として は、 例えば、 抗 C D 3抗体 （例えば、 U C H T 1、 N U _ T 3、 L e u 4、 H I T3 a、 X35、 PS 1、 MEM_57、 OKT3、 R I V9、 1 2 F 6および WT32等） 等が挙げられる。
[0023] 本発明に係る膜タンパク質としての 「BCR複合体」 に対する抗体として は、 例えば、 抗ヒ卜 I gG抗体 （例えば、 1 7 F 1 2等） 、 抗 I gG (H + L) ポリクローナル抗体、 抗 CD 79 a抗体 （例えば、 H M 47等） 、 およ び抗 CD 79 b抗体 （例えば、 CB3— 1および SN8等） 等が挙げられる [0024] 本発明に係る膜タンパク質としての 「CD 1 9ZCD21複合体」 に対す る抗体としては、 例えば、 抗ヒト CD 1 9抗体 （例えば、 4G7等） 等が挙 げられる。
[0025] 本発明において、 「B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべ プチドのそれぞれが、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗 体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接に またはリンカ一を介して結合された構成を有する二価抗体」 における 「直接 に」 結合されるとは、 当該ポリペプチド中のシスティン残基が酸化により、 ジスルフィド結合を形成すること等が挙げられる。
[0026] 本発明において、 「リンカ一」 は本発明の二価抗体を構成する各部分を適 切な距離を保って繋ぐことができるものであれば特に限定されない。 例えば 、 本発明の二価抗体の一部として各構成部分と一体となって発現されるぺプ チドリンカーや、 任意の長さの P EG等のスぺーサ一の両末端に、 ビォチン 、 スクシンィミジル誘導体、 マレイミド誘導体、 およびヒドラジド誘導体等 から任意に選択された反応基あるいは相互作用基が付加された非べプチド性 リンカ一等が挙げられる。
[0027] ペプチドリンカ一としては、 2〜 50個のアミノ酸長からなるものが挙げ られ、 例えば、 一 (G I y ― G I y G I y ― G I y ― s e r) n " 、 -S i r— A I a— L y s -T h r -T h r -P r o 、 ― s e r -A I a -L y s -T h r -T h 「 _ P「 o -L y s - L e u -G I y ― G I y- 、 -A r g— A I a— A s p -A I a -A I a -P r o 、 ― A r g -A I a -A s p -A I a -A I a— P r o -T h r -V a I -s e r ― 、 -A r g -A I a— A s p— A I a -A I a -A I a -A I a -G I y ― G I y- P 「 o—
G I y— S e r― 、 または ― A r g ― A I a ― A s P ― A I a -A I a -A
I a -A I a - ( -G I y ― G I y G I y ― G I y ― S e r _) m - (左 が N末端、 右側が C末端を表し、 nおよび mは、 それぞれ独立して 1〜4の 整数 ¾:表す。 ) (Protein Engineering, Design & Selection, Vol.17, No.4 , p.357-355 (2004) ) 等が挙げられる。 [0028] 非ペプチド性リンカ一としては、 市販されているものを使用することがで き、 例えば、 フエ二レンジマレイミド （Phenylenedimaleimide； Aldrich社製 ) が入手可能である。
[0029] 本発明において、 「B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべ プチドが、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認 識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリン カーを介して結合された構成を有する二価抗体」 とは、 B I R 1抗体の抗原 認識領域を形成する二つのポリべプチドが、 B I R 1発現細胞に発現する膜 タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドに、 それぞれ互いに直接にまたはリンカ一を介して結合された構成を有する二価 抗体を意味する。 より具体的には、 B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する 二つのポリべプチドの一方が、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に 対する抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのいずれか一方に 直接にまたはリンカ一を介して結合した単位、 および B I R 1抗体の抗原認 識領域を形成する二つのポリべプチドのもう一方が、 B I R 1発現細胞に発 現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリぺプ チドのもう一方に直接にまたはリンカ一を介して結合した単位を含む構成を 有する二価抗体を意味する。 両単位は、 直接にまたはリンカ一を介して結合 していてもよいし、 水素結合、 疎水結合、 静電的相互作用等の非共有結合に より結合していてもよい。 この二価抗体の構成には、 以下の構成が含まれる 。 すなわち、
(1 a) B I R 1抗体の CD Rを含む H鎖の一部 （例えば、 VH等） が、 直 接にもしくはリンカーを介して、 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の CDRを含む L鎖の一部 （例えば、 VL等） に結合した構成を有するポリべ プチドまたはポリペプチド複合体と、 B I R 1抗体の CDRを含む L鎖の一 部 （例えば、 VL等） が、 直接にもしくはリンカ一を介して、 本発明に係る 膜タンパク質に対する抗体の CD Rを含む H鎖の一部 （例えば、 VH等） に 結合した構成を有するポリべプチドまたはポリべプチド複合体が、 共有結合 (例えば、 ジスルフィド結合） または非共有結合 （例えば、 水素結合、 疎水 結合、 静電的相互作用およびそれらの複合的な結合） により、 複合体を形成 し得るもの、 ならびに
( 2 a ) B I R 1抗体の C D Rを含む H鎖の一部 （例えば、 V H等） 、 本発 明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む L鎖の一部 （例えば、 V L等） 、 B I R 1抗体の C D Rを含む L鎖の一部 （例えば、 V L等） 、 およ び本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む H鎖の一部 （例え ば、 V H等） のそれぞれが、 直接にもしくはリンカ一 （ただし、 各リンカ一 は異なっていてもよい。 ） を介して、 直列に結合した構成を有するもの （た だし、 各部分が配列される順序および方向はそれぞれの抗体の機能的な C D Rを形成し得るように折り畳まれる構成を有するものに限られる。 ここでの
「抗体の機能的な C D Rを形成しうるように折り畳まれる構成」 とは、 折り 畳まれた抗体が標的の抗原と結合しうる抗原認識領域を形成するような構成 を意味する。 ） 等が挙げられる。 以下、 これらを 「本発明の二価抗体」 と略 記することがある。
[0030] さらに、 本発明の二価抗体には、 その各構成部分が以下に挙げる方法で製 造される構成を有するものも含まれる。 すなわち、
( A) B I R 1抗体の C D Rを形成する二つのポリペプチドが、 直接にまた はペプチドリンカ一を介して、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に 対する抗体の C D Rを形成する二つのポリべプチドと一体となって製造され るもの、 ならびに
( B ) B I R 1抗体の C D Rを形成する二つのポリべプチドおよび B I R 1 発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の C D Rを形成する二つのポ リベプチドがそれぞれ製造され、 直接にまたは非べプチド性リンカーを介し てそれぞれ互いに結合された構成を有するものが挙げられる。
[0031 ] ここで、 上記 （A) の方法で上記 （1 a ) の構成を有する二価抗体を製造 する場合には、 B I R 1抗体の C D Rを含む H鎖の一部または本発明に係る 膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む L鎖の一部のいずれが N末端側に 配置されていてもよく、 B I R 1抗体の CD Rを含む L鎖の一部または本発 明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む H鎖の一部のいずれが N 末端側に配置されていてもよい。
ここで、 上記 （A) の方法で上記 （2 a) の構成を有する二価抗体を製造 する場合には、 各部分が配列される順序および方向はそれぞれの抗体の機能 的な C D Rを形成し得るように折リ畳まれる構成を有するものであればよい が、 具体的には、
(2 a- 1 ) B I R 1抗体の CD Rを含む H鎖の一部、 本発明に係る膜タン パク質に対する抗体の C D Rを含む L鎖の一部、 本発明に係る膜タンパク質 に対する抗体の CD Rを含む H鎖の一部、 および B I 1抗体の〇0 を含 む L鎖の一部のそれぞれが、 ペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリンカ 一は同じでも異なっていてもよい。 ） を介して、 当該記載順にて直列に結合 した構成を有するもの、
(2 a-2) B I R 1抗体の CD Rを含む L鎖の一部、 本発明に係る膜タン パク質に対する抗体の C D Rを含む H鎖の一部、 本発明に係る膜タンパク質 に対する抗体の CD Rを含む L鎖の一部、 B I R 1抗体の CDRを含む H鎖 の一部のそれぞれが、 ペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリンカ一は異 なっていてもよい。 ） を介して、 当該記載順にて直列に結合した構成を有す るもの、
(2 a-3) 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の CDRを含む H鎖の 一部、 B I R 1抗体の CDRを含む L鎖の一部、 31 1抗体の〇0 を含 む H鎖の一部、 および本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含 む L鎖の一部のそれぞれが、 ペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリンカ 一は異なっていてもよい。 ） を介して、 当該記載順にて直列に結合した構成 を有するもの、
(2 a-4) 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の CDRを含む L鎖の 一部、 B I R 1抗体の CDRを含む H鎖の一部、 31 1抗体の〇0 を含 む L鎖の一部、 および本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含 む H鎖の一部のそれぞれが、 ペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリンカ 一は異なっていてもよい。 ） を介して、 当該記載順にて直列に結合した構成 を有するもの等が挙げられる。
[0033] 上記 （A) の方法としては、 各抗体を産生するハイプリドーマから、 それ ぞれの抗体をコードする D N Aを単離し、 遺伝子組換技術によリ両 D N Aの 部分断片を融合させて作製された D N Aを挿入した発現べクターを用いて、 適当な宿主細胞を形質転換させることにより、 その形質転換体から二価抗体 を産生させる方法が挙げられる。
[0034] ここで、 上記 （B ) の場合には、 さらに適当な担体を介してそれぞれが結 合される場合も含まれる。 例えば、 本発明の二価抗体の各構成部分を構成す るポリべプチドの末端に付加されたビォチンリガーゼ基質べプチド内のリシ ル側鎖を、 ビォチンリガーゼ （例えば、 B i r A) でビォチン化し、 ァビジ ンもしくはス卜レブ卜アビジン誘導体あるいはそれらが付加された適当な担 体に結合させることによって構成したものが挙げられる。
[0035] 非べプチド性リンカーを本発明の二価抗体の各構成部分に結合させる方法 としては、 例えば、 スクシンイミド基が導入されたリンカ一をその構成部分 であるポリペプチドのァミノ基に反応させる方法 （Journa l of B i o l og i ca l C hem i stry, 1989年， 第 264巻， p. 272-279) 、 マレイミド基が導入されたリン カーをその構成部分であるポリべプチドのチオール基に反応させる方法 （Ann . New York Acad. Sc i . , 1975年， 第 254巻， 第 203号） 、 ヒドラジノ基が導入 されたリンカ一をその構成部分であるポリべプチドのアルデヒド基に反応さ せる方法 (B i otech. App l . B i ochem. , 1987年， 第 9巻， p. 488-496) 等が挙げ られる。 また、 実施例に準じた方法により実施することもできる。
[0036] 本発明の二価抗体またはその各構成部分は、 その C末端がカルボキシル基 、 アミド基、 またはエステル基のいずれのものであってもよい。 本発明の二 価抗体が C末端以外にカルボキシル基を有している場合、 そのカルボキシル 基がアミド化またはエステル化されていてもよい。
[0037] 本発明の二価抗体またはその各構成部分は、 その N末端のアミノ酸残基 （ 例えば、 メチォニン残基等） のァミノ基が保護基 （例えば、 C1〜6ァシル 基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等） 等） で保護されているもの、 生体 内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化した もの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 — OH、—SH、 アミ ノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基等） が適当な保護基 （ 例えば、 C 1〜6ァシル基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等） 等） で保 護されているものあるいは糖鎖が結合したものであってもよい。
[0038] 本発明の二価抗体はその塩として製造されてもよい。 塩は、 酸または塩基 との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸 付加塩が好ましい。 そのような塩には、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リン ゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸 、 グルタ ミン酸、 グルコン酸との塩等が含まれる。
[0039] 本発明において、 「B I R1抗体」 として好ましくは、 マウス抗ヒト B I R 1モノクローナル抗体、 ラット抗ヒト B I R 1モノクローナル抗体、 ヒト 抗ヒト B I R 1モノクローナル抗体であり、 より好ましくはヒト抗ヒト Β I R 1モノクローナル抗体である。 ここで、 マウス抗ヒト B I R 1モノクロ一 ナル抗体として、 具体的には、 2006年 3月 1 7日に、 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許 生物寄託センターに受領され （受託番号： FERM Ρ— 20846)、
「H y b r i d ornaOK31J と命名したハイプリドーマが産生するもの が挙げられる。
[0040] 本発明において、 「B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべ プチド J として好ましくは、 その抗体の VHおよび VLである。 その VHお よび Vしとして、 具体的には、 それぞれ配列番号 7および 9で表されるアミ ノ酸配列を有するポリべプチド、 それぞれ配列番号 21および 23で表され るアミノ酸配列を有するポリべプチドならびにそれぞれ配列番号 25および 27で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドが挙げられる。
[0041] 本発明において、 「本発明に係る膜タンパク質」 として好ましくは、 TC Rもしくは T C R複合体または B C Rもしくは B C R複合体であり、 より好 ましくは BCRもしくは BC R複合体である。
[0042] 本発明において、 「B I R 1が発現している細胞の細胞膜に存在する膜タ ンパク質に対する抗体」 として好ましくは、 本発明に係る膜タンパク質に対 するマウスモノクローナル抗体、 ラットモノクローナル抗体、 またはヒトモ ノクローナル抗体であり、 より好ましくは本発明に係る膜タンパク質に対す るヒ卜モノクローナル抗体である。 本発明に係る膜タンパク質に対するマウ スモノクローナル抗体が、 抗ヒ卜 CD 3抗体である場合には、 具体的には、 ハイプリ ドーマクローン OKT 3から産生されるマウス抗ヒ卜 CD3抗体が 挙げられる。
[0043] 本発明において、 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域 を形成する二つのポリべプチドとして好ましくは、 抗ヒ卜 CD 3抗体の VH および V L、 抗ヒト I g G抗体の VHおよび V L、 または抗ヒ卜 CD 1 9抗 体の VHおよび V Lである。 抗ヒ卜 CD 3抗体の VHおよび V Lとして、 具 体的には、 それぞれ配列番号 1 1および 1 3で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチドが挙げられ、 抗ヒト I g G抗体の VHおよび Vしとして、 具 体的には、 それぞれ配列番号 29および 31で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチドが挙げられ、 抗ヒト CD 1 9抗体の VHおよび Vしとして、 具体的には、 それぞれ配列番号 33および 35で表されるアミノ酸配列を有 するポリべプチドが挙げられる。
[0044] 本発明において、 「ペプチドリンカ一」 として好ましくは、 5〜20個の アミノ酸長からなるものが挙げられ、 具体的には、 一 （G I y_G I y— G I y-G I y-S e r) n_ (左側が N末端、 右側が C末端を表し、 nは"!〜 4の整数を表す。 ） であり、 より好ましくは、 _G I y-G I y— G I y_ G I y— S e 「一または一 (G I y— G I y— G I y— G I y_S e r ) 3_ である。 [0045] 本発明において、 B I R 1抗体の C D Rを含む H鎖の一部が、 直接にもし <はリンカーを介して、 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを 含む L鎖の一部に結合した構成を有するポリべプチドとして好ましくは、 B I R 1抗体の C D Rを含む H鎖の一部が、 ペプチドリンカ一を介して本発明 に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む L鎖の一部に結合した構成 を有するポリペプチドであり、 より好ましくは、 B I R 1抗体の V Hが、 ぺ プチドリンカ一を介して C D 3抗体の V Lに結合した構成を有するものであ リ、 具体的には、 配列番号 1 5で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチ ドである。
[0046] 本発明において、 B I R 1抗体の C D Rを含む L鎖の一部が、 直接にもし <はリンカーを介して、 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを 含む H鎖の一部に結合した構成を有するポリべプチドとして好ましくは、 B I R 1抗体の C D Rを含む L鎖の一部が、 ペプチドリンカ一を介して本発明 に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む H鎖の一部に結合した構成 を有するポリペプチドであり、 より好ましくは、 B I R 1抗体の V Lが、 ぺ プチドリンカ一を介して C D 3抗体の V Hに結合した構成を有するものであ リ、 具体的には、 配列番号 1 7で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチ ドである。
[0047] 本発明において、 B I R 1抗体の C D Rを含む H鎖の一部、 本発明に係る 膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む L鎖の一部、 B I R 1抗体の C D Rを含む L鎖の一部、 および本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む H鎖の一部のそれぞれが、 直接にもしくはリンカ一 （ただし、 各リ ンカ一は異なっていてもよい。 ） を介して、 直列に結合した構成を有するも の （ただし、 各部分が配列される順序および方向はそれぞれの抗体の機能的 な C D Rを形成し得るように折り畳まれる構成を有するものに限られる。 ） として好ましくは、 各部分がペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリンカ 一は異なっていてもよい。 ） を介して直列に結合した構成を有するもの （た だし、 各部分が配列される順序はそれぞれの抗体の機能的な C D Rを形成し 得るように折り畳まれる構成を有するものに限られる。 ） であり、 より好ま しくは、 B I R 1抗体の VH、 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の V し、 B I R 1抗体の VL、 および本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の VHのそれぞれが、 ペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリンカ一は異な つていてもよい。 ） を介して直列に結合した構成を有するもの （ただし、 各 部分が配列される順序はそれぞれの抗体の機能的な C D Rを形成し得るよう に折り畳まれる構成を有するものに限られる。 ） であり、 さらに好ましくは 、 B I R 1抗体の VH、 CD 3抗体の V L、 B I R 1抗体の V L、 および C D 3抗体の VHのそれぞれが、 ペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリン カーは異なっていてもよい。 ） を介して直列に結合した構成を有するもの （ ただし、 各部分が配列される順序はそれぞれの抗体の機能的な C D Rを形成 し得るように折り畳まれる構成を有するものに限られる。 ） である。
具体的には、 抗ヒト B I R 1抗体の VHである配列番号 7で表されるアミ ノ酸配列を有するポリべプチド、 抗ヒト B I R 1抗体の V Lである配列番号 9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 抗ヒ卜 CD 3抗体の VH である配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 および 抗ヒ卜 CD 3抗体の VLである配列番号 1 3で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチドが、 直列に、 かつ各々ペプチドリンカ一 （ただし、 各べプチ ドリンカ一は異なっていてもよい。 ） を介して結合した構成を有するものが 挙げられる。 各ポリべプチドの配列順序はそれぞれの抗体の機能的な CD R を形成し得るように折り畳まれる構成を有するものに限られ、 具体的には、 (2 a- 1 a) 配列番号 7、 配列番号 1 1、 配列番号 1 3、 および配列番号 9の順序、
(2 a-2 a) 配列番号 1 1、 配列番号 9、 配列番号 7、 および配列番号 1 3の順序、
(2 a-3 a) 配列番号 9、 配列番号 1 1、 配列番号 1 3、 および配列番号 7の順序、 および
(2 a-4 a) 配列番号 1 3、 配列番号 7、 配列番号 9、 および配列番号 1 1の順序が挙げられる。 各ポリべプチド間に介在するべプチドリンカ一はそ れぞれ同一でも異なっていてもよい。
[0049] さらに具体的には、 配列番号 1 9で表されるアミノ酸配列を有するポリべ プチドが挙げられる。
[0050] 以下に、 本明細書に記載されるアミノ酸配列と本発明の二価抗体あるいは 二価抗体を構成するポリべプチドとの対応関係を示す。
[0051] [表 1]
Figure imgf000021_0001
[0052] [ポリヌクレオチド]
本発明の二価抗体をコードするポリヌクレオチドとしては、 本発明の二価 抗体をコードする塩基配列を有するものであればいずれのものであってもよ い。
[0053] さらに、 本発明の二価抗体をコードするポリヌクレオチドには、 それがコ ードするポリペプチドの一部のアミノ酸 （好ましくは 1〜5個、 より好まし くは 1個） が欠失、 他のアミノ酸への置換もしくは挿入、 またはそれらが組 み合わされた改変がされるよう改変されたものが含まれる。 例えば、 本発明 の二価抗体を構成するアミノ酸に対応するコドンのうち、 P h eには TTT または TTC、 L e uには TTA、 TTG、 CT丁、 CTC、 CTAまたは CTG、 I I eには AT丁、 ATCまたは ATA、 Me tには ATG、 V a Iには GT丁、 GTC、 GTAまたは GTG、 S e rには TC丁、 TCC、 TCAまたは TCG、 卩 「 0には〇〇丁、 CCC、 CCAまたは CCG、 T h rには AC丁、 ACC、 ACAまたは ACG、 A I aには GC丁、 GCC 、 GCAまたは GCG、 T y rには T A Tまたは T A C、 H i sには CAT または CAC、 G I nには C A Aまたは C AG、 As nには AATまたは A AC、 L y sには A A Aまたは A AG、 A s pには G A Tまたは G A C、 G I uには GAAまたは GAG、 C y sには T G Tまたは T G C、 T r pには TGG、 A r gには CG丁、 CGC、 〇0 または〇00、 S e rには AG Tまたは AGC、 A r gには AG Aまたは AGG、 および G I yには GGT 、 GGC、 GG Aまたは GGGにそれぞれ対応しているので、 本発明の二価 抗体をコードするポリヌクレオチドには、 本発明の二価抗体のアミノ酸配列 中の各ァミノ酸に対応する各コドンが任意に組み合わされたポリヌクレオチ ドが含まれる。 特に、 本発明の形質転換体における二価抗体の発現効率を向 上させるために、 その一部が対応する他のコドンに置換される場合がある。 以下、 これらを 「本発明のポリヌクレオチド」 と略記することがある。 また 、 本発明のポリヌクレオチドは、 ゲノム DNA、 c DNA、 合成 DNA、 R N A、 DN A— RN Aハイブリッドのいずれでもよい。
本発明のポリヌクレオチドとしては、 以下のような構成を有するものが含 まれる。 すなわち、
(1 b) B I R 1抗体の CD Rを含む H鎖の一部 （例えば、 VH等） が、 ぺ プチドリンカ一を介して本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の CD Rを 含む L鎖の一部 （例えば、 VL等） に結合した構成を有するポリペプチドを コードするポリヌクレオチド、 B I R 1抗体の CDRを含む L鎖の一部 （例 えば、 VL等） が、 ペプチドリンカ一を介して本発明に係る膜タンパク質に 対する抗体の CD Rを含む H鎖の一部 （例えば、 VH等） に結合した構成を 有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 およびそれらの組み合 わせ、 ならびに
(2 b) B I R 1抗体の CDRを含む H鎖の一部 （例えば、 VH等） 、 本発 明に係る膜タンパク質に対する抗体の CDRを含む L鎖の一部 （例えば、 V L等） 、 B I R 1抗体の CD Rを含む L鎖の一部 （例えば、 V L等） 、 およ び本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む H鎖の一部 （例え ば、 VH等） のそれぞれが、 ペプチドリンカ一 （ただし、 各ペプチドリンカ 一は異なっていてもよい。 ） を介して直列に結合した構成を有するポリぺプ チド （ただし、 各部分が配列される順序はそれぞれの抗体の機能的な CD R を形成し得るように折り畳まれる構成を有するものに限られる。 ） をコード するポリヌクレオチドが挙げられる。
[0055] ここで、 上記 （1 b) におけるポリヌクレオチドは、 B I R 1抗体の CD Rを含む H鎖の一部をコードするポリヌクレオチドまたは本発明に係る膜タ ンパク質に対する抗体の CDRを含む L鎖の一部をコードするポリヌクレオ チドのいずれが、 その 5' 末端側に配置されていてもよく、 B I R 1抗体の CDRを含む L鎖の一部をコードするポリヌクレオチドまたは本発明に係る 膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む H鎖の一部をコードするポリヌク レオチドのいずれが、 その 5' 末端側に配置されていてもよい。
[0056] ここで、 上記 （2 b) におけるポリヌクレオチドは、 各部分が配列される 順序はそれぞれの抗体の機能的な C D Rを形成し得るように折リ畳まれる構 成を有するものであればよいが、 具体的には、 上記 （2 a_ 1 ) 〜 （2 a_ 4) に挙げられるポリべプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる
[0057] 本発明のポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドのうち、 B I R 1 抗体の CD Rを含む H鎖の一部をコードするポリヌクレオチドとして、 例え ば、 配列番号 8、 22、 または 26で表される塩基配列を有するポリヌクレ ォチド等が挙げられ、 B I R 1抗体の CD Rを含む L鎖の一部をコードする ポリヌクレオチドとして、 例えば、 配列番号 1 0、 24、 または 28で表さ れる塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。
[0058] 一方、 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の CD Rを含む H鎖の一部 をコードするポリヌクレオチドとして、 本発明に係る膜タンパク質が CD 3 である場合には、 例えば、 配列番号 1 2で表される塩基配列を有するポリヌ クレオチド等が挙げられ、 本発明に係る膜タンパク質が BCR複合体である 場合には、 例えば、 配列番号 3 0で表される塩基配列を有するポリヌクレオ チド等が挙げられ、 本発明に係る膜タンパク質が C D 1 9である場合には、 例えば、 配列番号 3 4で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙 げられる。 また、 本発明に係る膜タンパク質に対する抗体の C D Rを含む L 鎖の一部をコードするポリヌクレオチドとして、 本発明に係る膜タンパク質 が C D 3である場合には、 例えば、 配列番号 1 4で表される塩基配列を有す るポリヌクレオチド等が挙げられ、 本発明に係る膜タンパク質が B C R複合 体である場合には、 例えば、 配列番号 3 2で表される塩基配列を有するポリ ヌクレオチド等が挙げられ、 本発明に係る膜タンパク質が C D 1 9である場 合には、 例えば、 配列番号 3 6で表される塩基配列を有するポリヌクレオチ ド等が挙げられる。
[0059] 本発明において、 B I R 1抗体の V Hをコードするポリヌクレオチドとし て好ましくは、 配列番号 8で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドで あり、 B I R 1抗体の V Lをコードするポリヌクレオチドとして好ましくは 、 配列番号 1 0で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、 本発 明に係る膜タンパク質である C D 3に対する抗体の V Hをコードするポリヌ クレオチドとして好ましくは、 配列番号 1 2で表される塩基配列を有するポ リヌクレオチドであり、 同 C D 3抗体の V Lをコードするポリヌクレオチド として好ましくは、 配列番号 1 4で表される塩基配列を有するポリヌクレオ チドである。
[0060] 本発明において （1 b ) に挙げられるポリヌクレオチドの組み合わせとし て好ましくは、 それぞれ配列番号 1 6および配列番号 1 8で表される塩基配 列を有するポリヌクレオチドの組み合わせである。
[0061 ] 本発明において （2 b ) に挙げられるポリヌクレオチドとして好ましくは
、 配列番号 2 0で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
[0062] 以下に、 本明細書に記載される塩基配列と本発明の二価抗体あるいは二価 抗体を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの対応関係を 示す。 [表 2]
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[発現ベクター]
本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクター （以下、 本発明の発現べ クタ一と略記することがある。 ） は、 本発明のポリヌクレオチドを適当な発 現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより調製することがで きる。 その調製は遺伝子組み換え手法に関する公知の方法または実施例に準 じた方法により行うことができる。 ここで、 発現ベクターとしては、 例えば
、 大腸菌用発現ベクター （例えば、 p BR322、 p BR325、 p UC 1 2、 p UC 1 3、 その他一般に市販されているもの） 、 枯草菌由来プラスミ ド （例えば、 P UB 1 1 0、 p TP5、 pC 1 94、 その他一般に市販され ているもの） 、 酵母用発現ベクター （例えば、 pSH 1 9、 pSH 1 5、 そ の他一般に市販されているもの） 、 動物細胞用発現ベクター （例えば、 pA 1 - 1 1. pXT 1、 p RcZCMV、 p RcZRSV、 p c DNA lZN e o、 その他一般に市販されているもの） 、 スファージ等のパクテリオファ ージ、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルス等の動物ゥ ィルスを用いることができる。
[形質転換体]
本発明の形質転換体の宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチル ス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 および動物細胞等が挙げられる。 [0065] ェシエリヒア属菌としては、 例えば、 ェシエリヒア■コリ （Escherichia c ol i) (例えば、 K 1 2、 DH 1、 J Μ 1 03. JA221、 HB 1 01、 お よび C 600等） が用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ■サブチルス （Baci I lus subti I is) (例えば、 M I 1 1 4および 207— 2 1等） が挙げられる。
[0066] 酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス■セレビシェ （Saccharomyces c erevisiae) 、 シゾサッカロマイセス■ボンべ (Schizosaccharomyces pombe ) 、 およびピキア■パストリス （Pi chi a pastor is) 等が挙げられる。
[0067] 昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c N P Vの場合、 S f細胞 （例 えば、 S f 9細胞および S f 21細胞） 、 MG 1細胞、 および H i g h F i v e TM細胞等が用いられる。 ウィルスが BmN P Vの場合、 BmN細胞 等が用いられる。 昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫等が用いられる。
[0068] 動物細胞としては、 本発明の発現ベクターによリー過的、 継続的、 または 安定的に形質転換される細胞であれば、 いずれの細胞であってもよい。 より 好ましくは、 安定的に形質転換される細胞であって、 本発明の二価抗体を継 続的または安定的に発現することができる細胞であり、 例えば、 COS 1細 胞、 COS 7細胞、 CHO細胞、 CHO— K 1細胞、 HEK293細胞、 N S 0細胞、 U 937細胞、 J u r k a t細胞、 H e I a細胞、 D a u d ί細 胞、 K562細胞、 マウス L細胞、 N I H 3 T 3細胞、 A549細胞、 BH K—21細胞、 BRL— 3A細胞、 H e pG2細胞、 HUVEC、 PC 1 2 細胞、 RAW264. 7細胞、 THP— 1細胞、 および L 929細胞等が挙 げられる。
[0069] 本発明の形質転換体は、 本発明の発現ベクターで宿主を形質転換すること によって調製することができる。 形質転換は、 宿主の種類に応じて、 公知の 方法あるいは実施例に準じた方法に従って実施することができる。 また、 上 記した宿主は、 寄託機関等から入手することができる。
[二価抗体の製造方法]
本発明の二価抗体は、 遺伝子組換技術を用いて作製することができる （Jou rnal of I隱 unology Medicine, 1999年， 第 231巻， 第 1-2号， p.177〜189、 米 国特許第 4704692号明細書、 米国特許第 4946778号明細書、 米 国特許第 5990275号明細書、 米国特許第 599451 1号明細書、 米 国特許第 6027725号明細書、 欧州特許第 404097号明細書、 国際 公開第 93Z1 1 1 61号パンフレット、 Hol linger, Proc. Natl. Acad. Sc に USA., 1993年， 第 90巻， p.6444-6448) 。 すなわち、 それぞれの抗原に対 するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマから、 それぞれの抗体を コードする D N Aを単離し、 遺伝子組換技術によリ両 D N Aの部分断片を融 合させて作製された DN Aを挿入した発現ベクターを用いて、 適当な宿主細 胞を形質転換させることにより、 その形質転換体から二価抗体を産生させる ことができる。 具体的には、
( 1 ) 抗 B I R 1モノクローナル抗体および本発明に係る膜タンパク質に対 するモノクローナル抗体を産生するそれぞれのハイプリドーマを単離して、
(2) それぞれのハイプリドーマから抗体遺伝子を単離して、 それぞれの抗 体の可変領域をコードする DN Aをぺプチドリンカーをコードする DN Aで 連結された DN A断片を発現ベクターに組み込み、 適当な宿主に導入して、
(3) その形質転換体を適当な条件下で培養し、 産生されたタンパク質を分 離精製することにより二価抗体を得ることができる。
[0070] 各工程を以下によリ具体的に説明する。
(1 ) の工程において、 モノクローナル抗体は、 コーラ一 （Kohler) とミル シュタイン （Milstein) のハイプリドーマ法 （Nature, 1975年， 第 256巻， 第 5517号， p.495〜497) を使用して作製することができる。 当該方法で免疫さ れる動物としては、 マウス、 ラッ卜、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギまたはモルモッ 卜が可能であるが、 好ましくはマウスまたはラッ卜が用いられる。 また、 " DNA免疫" と呼ばれる免疫法 （Nature I隱 unology, 2001年， 第 2巻， 第 3号 ， p.261-267) を使用しても実施することができる。
[0071] F(a b')2、 Fa b'、 Fa b. および F vもしくは s c F vは、 それら抗 体をプロテアーゼ酵素により処理し、 必要により還元して得ることができる 。 また、 抗体を産生するハイプリドーマから、 その c DNAを単離し、 遺伝 子改変によって作製された発現ベクターを用いて産生することもできる。
[0072] 例えば、 F(a b')2は、 精製されたモノクローナル抗体をペプシンで完全 に消化し、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲルろ過、 プロテイン Aあるい はプロテイン Gカラムなどのァフィ二ティークロマ卜グラフィ一のいずれか の方法により精製することができる。 ペプシンの消化時間は、 I gサブタイ プにより異なるため、 適当に調製することが必要である。 Fa b'は、 調製し た F ( a b ' ) 2を 2 _メルカプトェチルァミンで部分還元することによつて作 製することができる。 また、 Fa bは、 システィン存在下で消化酵素パパィ ンで直接消化し、 精製して作製することができる。
[0073] 一方、 s c F V (single chain Fv) は、 ジョストらの方法 （Journal of B io logical Chemistry, 1994年， 第 269巻， 第 42号， p.26267-26273) により作 製することができる。 すなわち、 VHおよび V Lの CDRをそれぞれコード する DNAを中性アミノ酸 （例えば、 グリシンおよび Zまたはセリンを含む ポリペプチド） をコードする DN Aで連結し、 この組み換え DN Aを含む発 現べクターを適当な宿主細胞で発現させることによつて作製することができ る。 ここで、 VLと VHの配置は、 N末端側が VLであり、 リンカ一を介し て VHが配置されているものであっても、 N末端側が VHであり、 それにリ ンカーを介して V Lが配置されているもののいずれであってもよい。
[0074] 各抗体のヒト化キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された 非ヒ卜抗体の一部をヒ卜抗体の一部に置換することによって作製できる。 具 体的には、 ヒ卜抗体の定常領域をコードする遺伝子とのキメラを構築するこ とによって作製できることが知られている （Proc. Natl. Acad. Sci. (USA ) ， 1987年， 第 84巻， p.3439-3443、 Journal of I隱 unology, 1987年， 第 139 巻， 第 1号， p.3521) 。 ヒ卜の定常領域の DNA配列は公知であり、 その定常 領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。 続いて、 抗体の CD R をコードする DNA配列をヒ卜の定常領域の配列に融合させる。 ヒ卜の定常 領域のアイソタイプは所望のエフェクター機能または抗体依存性細胞傷害活 性によって選択できる。 好ましいアイソタイプは I gG 1、 I gG3および I gG4である。 また、 ヒト軽鎖定常領域、 κ鎖または；鎖のいずれも用い ることができる。 このヒ卜化キメラ抗体は通常の方法によって発現させるこ とができる。
[0075] ヒト抗体は、 ヒト免疫グロブリンの定常領域遺伝子を導入されたマウス （ ゼノマウス （Chemical Biology, 2000年， 第 7巻， 第 8号， P.R185-6) 、 ヒュ ーマブマウス （infection and immunity, 2002年， 第 70巻， 第 2号， p.612-9 ) 、 TCマウス (Biotechnology and Genetics Enginner ing Revew, 2002年 ， 第 19巻， p.73-82) 、 KMマウス (Cloning Stem Cel Is, 2002年， 第 4巻， 第 1号， p.91-102) ) を利用して作製することができ、 さらにそれらマウスか ら単離した抗体産生リンパ球をハイプリドーマにして、 目的の抗体を量産さ せることができる。 また、 ファージ 'ディスプレイ法 （FEBS Letter, 1998年 ， 第 441巻， P.20-24) によっても作製することができる。 この方法は、 環状 一本鎖 DNAにヒ卜抗体遺伝子を組み込んだファージを利用して、 ファージ を構成する外殻タンパク質と融合した形で、 ヒ卜抗体をファージの表面に発 現させることができる。
(2) の工程は、 ハイプリドーマから RN Aを分離し、 その抗体またはその 一部をコードする遺伝子を単離する工程および単離された各抗体の一部をコ ードする遺伝子を遺伝子工学的手法により組み換える工程からなる。
[0076] まず、 ハイプリドーマから全 RN Aまたは mRN Aを分離する工程は、 公 知の方法 （以下、 公知の方法は特に記載がなければ、 Molecular Cloning, 19 89年， Cold Spring Harbor Laboratoryまたは Cur rent Protocol in Mo I ecu I a r Bio logyに記載の方法） に従って行うことができる。 抗体またはその部分を コードする遺伝子を単離する工程は、 適切な合成 DN Aプライマーを用いて R T _ P C R法によって増幅させるか、 それらの標識プローブとのハイプリ ダイゼーシヨンによって選別することによって実施できる。 なお、 ハイプリ ダイゼーシヨンの方法は公知の方法に従っても行うことができる。 本発明の 二価抗体を発現する発現ベクターは、 本発明の単離された抗体の一部をコー ドする遺伝子を、 公知のあるいは実施例に準じた遺伝子工学的手法により組 み換え、 さらに、 発現ベクターに挿入されて適当な宿主に導入することよつ て必要量得ることができる。
( 3 ) の工程である本発明の二価抗体を産生する方法としては、 上記形質転 換体を培養し、 その細胞内で生産あるいは細胞外に分泌させる方法がある。 さらに、 形質転換体を培養して得られる培養物から、 公知の方法または実施 例に準じた方法に従って分離精製することができる。 例えば、 本発明の二価 抗体を培養菌体から抽出する場合、 その菌体を適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、 リゾチーム、 および Zまたは凍結融解等によって菌体を破壊した後、 遠 心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる 。 その緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジン等の蛋白質変性剤や T R I T O N ( 登録商標） X _ 1 0 0等の界面活性剤を含んでいてもよい。
[0077] 得られた可溶性画分中に含まれる本発明の二価抗体の分離精製は、 公知の 方法または実施例に準じた方法に従って実施することができる。 例えば、 塩 析ゃ溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過 法、 および S D S一ポリァクリルァミドゲル電気泳動法等の分子量の差を利 用する方法、 イオン交換クロマ卜グラフィ一等の荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一等の特異的親和性を利用する方法、 疎水 性クロマ卜グラフィーおよび逆相クロマ卜グラフィ一等の疎水性の差を利用 する方法、 等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等で実施するこ とができ、 さらに、 これらの方法を適宜組み合わせて実施することができる
[0078] 上記方法によって得られた本発明の二価抗体が遊離体である場合には、 公 知の方法あるいはそれに準じる方法によって、 その遊離体を塩に変換するこ とができる。
[0079] さらに、 本発明の二価抗体は、 上記の本発明のポリヌクレオチドを錶型と して、 ゥサギ網状赤血球ライセー卜、 昆虫細胞ライセ一卜、 コムギ胚芽ライ セー卜、 大腸菌ライセー卜等からなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビ卜 口翻訳することによつても製造することができる。 また、 RNAポリメラー ゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用いて、 本発明のポリヌクレオチドを錶型と しても製造することができる。
[0080] 本発明の二価抗体を他のタンパク質あるいはタグ （例えば、 抗体の F c領 域、 グルタチオン Sトランスフェラーゼ、 プロテイン A、 およびへキサヒス チジン等） との融合タンパク質として発現させることもできる。 その融合タ ンパク質は、 ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一による精製および Zまたは 適当なプロテアーゼ （例えば、 ェンテロカイネース、 トロンビン等） による 切り出しができ、 効率よく精製できる。
[0081] 本発明の二価抗体は、 ハイプリドーマを用いたリーディング （Reading) ら の方法、 すなわち、 モノクローナル抗体を産生する 2種類のハイプリドーマ をさらに融合してハイブリッドハイプリドーマを作製し、 目的とする二価抗 体を産生するハイブリツドハイブリドーマを選択する方法によっても製造す ることができる （米国特許第 4474893号明細書） 。
[0082] さらに、 本発明の二価抗体は、 公知の化学的方法 （Archives of biochemis try and biophysics. , 1961年， 第 90巻， p.460〜462、 Science, 1985年， 第 2 99巻， p.81〜83) によっても製造することができる。 これらの方法は、 2種 類の抗体を酵素によりそれぞれ加水分解した後、 抗体の H鎖のジスルフィド 結合を還元剤で切断し、 続いて異種の抗体を混合し再酸化することで二価抗 体を得るものである。 また、 ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド等の架橋 剤を用いた方法 （特開平 2_ 1 556号公報、 米国特許第 5260203号 明細書、 米国特許第 5455030号明細書、 米国特許第 488 1 1 75号 明細書、 米国特許第 5 1 32405号明細書、 米国特許第 509 1 5 1 3号 明細書、 米国特許第 5476786号明細書、 米国特許第 50 1 3653号 明細書、 米国特許第 5258498号明細書、 および米国特許第 54828 58号明細書に記載されている方法） によっても実施することができる。
[毒性]
本発明の二価抗体の抗原性ないし毒性は非常に低いものであり、 医薬とし て使用するために十分安全である。
[医薬品への適用]
本発明の二価抗体は、 B I R 1の免疫抑制機能の発現ないし増強すること で免疫を抑制することから、 B I R 1の関与する疾患、 例えば自己免疫疾患 、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性疾患および炎症性疾患から選択され る疾患の予防および Zまたは治療に用いることができる。
[0083] 本発明の二価抗体またはそれを含んでなる医薬の投与により、 予防および Zまたは治療が期待できる自己免疫疾患として、 例えば、 関節炎、 自己免疫 性肝炎、 自己免疫性糸球体腎炎、 自己免疫性塍島炎、 自己免疫性精巣炎、 自 己免疫性卵巣炎、 潰瘍性大腸炎、 シエーダレン症候群、 クローン病、 ペーチ エツ卜病、 ゥ Xゲナー肉芽腫症、 過敏性血管炎、 結節性動脈周囲炎、 橋本病 、 粘液水腫、 バセドウ病、 アジソン病、 自己免疫性溶血性貧血、 突発性血小 板減少症、 悪性貧血、 重症筋無力症、 脱髄疾患、 大動脈炎症群、 乾癬、 天疱 瘡、 類天疱瘡、 膠原病 （例えば、 全身性エリテマトーデス、 慢性関節リウマ チ、 汎発性強皮症、 全身性進行性硬化症、 皮膚筋炎、 結節性多発性動脈炎お よびリウマチ熱等） 、 ギラン，バレー症候群、 多腺性自己免疫症候群 I I型、 原発性胆汁性肝硬変、 尋常性白斑および 1型糖尿病等が挙げられる。 さらに 、 ループス抗凝固因子が高値な疾患も挙げられる。 ここで、 ループス抗凝固 因子が高値な疾患としては、 例えば、 全身性エリテマトーデス、 動脈血栓症 (例えば、 脳梗塞等） 、 静脈血栓症、 習慣性流産、 血小板減少症および抗リ ン脂質抗体症候群等が挙げられる。
[0084] 本発明に二価抗体またはそれを含んでなる医薬の投与により、 予防および Zまたは治療が期待できる臓器移植後の拒絶反応として、 例えば、 腎移植、 肝移植、 皮膚移植、 小腸移植、 心移植および Zまたは肺移植後の拒絶反応、 骨髄移植における拒絶反応および移植片対宿主病等が挙げられる。
[0085] 本発明の二価抗体またはそれを含んでなる医薬の投与により、 予防および Zまたは治療が期待できるアレルギー性疾患として、 例えば、 喘息、 気管支 喘息、 アトピー性皮膚炎、 蓴麻疹、 アレルギー性鼻炎 （例えば、 花粉症等） 、 アレルギー性結膜炎 （例えば、 花粉症等） 、 アレルギー性胃腸炎、 ァナフ イラキシーショック、 食物アレルギー等が挙げられる。
[0086] 本発明の二価抗体またはそれを含んでなる医薬の投与により、 予防および Zまたは治療が期待できる炎症性疾患として、 例えば、 皮膚炎 （例えば、 接 触性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎等） 、 大腸炎 （例えば、 潰瘍性大腸炎お よびクローン病等） 、 血管炎 （例えば、 高安動脈炎、 巨細胞動脈炎 （側頭動 脈炎） 、 結節性多発動脈炎、 ゥェゲナー肉芽腫症、 チヤーグ，ストラウス症 候群 （アレルギー性肉芽腫性血管炎） 、 アレルギー性皮膚血管炎、 へノッホ ■シエーンライン紫斑病、 過敏性血管炎、 血管炎症候群、 閉塞性血栓性血管 炎 （バージャ一病） 、 結節性血管炎等） 、 関節炎 （例えば、 リウマチ関節炎 、 慢性関節リウマチ、 変形性関節炎、 結核性関節炎、 化膿性関節炎、 乾癬性 関節炎、 膝内症、 特発性骨壊死症および骨関節炎等） 、 肝炎 （例えば、 ウイ ルス性肝炎および自己免疫性肝炎等） 、 腎炎 （例えば、 急性糸球体腎炎、 慢 性腎炎、 急速進行性腎炎症候群、 溶連菌感染後急性糸球体腎炎、 膜性増殖性 糸球体腎炎、 G o o d p a s t u r e症候群、 メサンギゥム増殖性糸球体腎 炎 （ I g A腎症） および間質性腎炎等） 、 胃炎 （例えば、 急性感染性胃炎お よびアレルギー性胃炎、 慢性胃炎等） 、 塍炎、 腸炎、 喉頭炎、 神経炎等が挙 げられる。
[0087] 本発明の二価抗体を医薬として用いる場合、 単独あるいは薬理的に許容さ れる各種製剤補助剤と混合して医薬組成物として投与することができる。 そ のような医薬組成物としては、 通常、 非経口投与経路で投与されるが、 経口 で投与することもできる。 非経口投与としては、 注射剤による投与、 経皮、 経粘膜、 経鼻、 経肺での投与が挙げられる。
[0088] そのような注射剤は、 溶液、 懸濁液、 乳濁液、 および用時溶剤に溶解また は懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。
[0089] 注射剤は、 ひとつまたはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、 懸濁、 または 乳化させて用いられる。 溶剤として、 例えば、 水性溶剤 （例えば、 蒸留水、 生理的食塩水、 リンゲル液等） あるいは油性溶剤 （例えば、 ォリーブ油、 ゴ マ油、 綿実油、 トウモロコシ油等の植物油、 プロピレングリコール、 ポリエ チレングリコール、 エタノールのようなアルコール類等） およびそれらの組 み合わせを使用できる。
[0090] さらに、 この注射剤は、 安定剤 （例えば、 ヒ卜血清アルブミン等） 、 溶解 補助剤 （例えば、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール、 D—マ ン二！ ^一ル、 トレハロース、 安息香酸ベンジル、 エタノール、 トリスァミノ メタン、 コレステロール、 トリエタノールァミン、 炭酸ナトリウム、 クェン 酸ナトリウム、 サリチル酸ナトリウム、 酢酸ナトリウム等） 、 懸濁化剤 （例 えば、 ステアリルトリエタノールァミン、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ラウリ ルァミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化ベンザルコニゥム、 塩化べンゼトニ ゥム、 モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤 （例えば、 ポリビニルァ ルコール、 ポリビニルピロリ ドン、 カルポキシメチルセルロースナトリウム 、 メチルセルロース、 ヒドロキシメチルセルロース、 ヒドロキシェチルセル ロース、 ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等） 、 ポリソルべ 一卜類、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等） 、 乳化剤、 無痛化剤 （例えば 、 ベンジルアルコール等） 、 等張化剤 （例えば、 塩化ナトリウム、 グリセリ ン、 D _マンニトール、 D _ソルビトール、 ブドウ糖等） 、 緩衝剤、 保存剤 (例えば、 メチルパラベン、 プロピルパラベン、 ベンジルアルコール、 クロ ロブタノール、 フエノール等） 、 防腐剤 （例えば、 パラォキシ安息香酸エス テル類、 クロロブタノール、 ベンジルアルコール、 フエネチルアルコール、 デヒドロ酢酸、 ソルビン酸等） 、 抗酸化剤 （例えば、 亜硫酸塩、 ァスコルビ ン酸塩等） 、 分散剤 （例えば、 ポリソルベー卜 8 0、 ポリオキシエチレン硬 化ヒマシ油 6 0、 ポリエチレングリコール、 カルポキシメチルセルロース、 アルギン酸ナトリウム等） 等を含んでいてもよい。
[0091 ] これら注射剤は、 製剤技術分野において慣用の方法、 例えば、 日本薬局方 に記載の方法等により製造することができる。 例えば、 最終工程において滅 菌するか無菌操作法によって製造される。 また、 無菌の固形剤、 例えば、 凍 結乾燥品を製造し、 その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他 の溶剤に溶解して使用することもできる。
[0092] これら注射液は、 プラスチック製またはガラス製のバイアル、 アンプル、 シリンジ、 注射器等の規定容量の形状の容器、 ならびに瓶等の大容量の形状 の容器で供給することができる。
[0093] 本発明の二価抗体の投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により、 その投与量が異なるが、 通常、 成人一人あたり、 1回に つき、 1 n gから 5 0 0 O m gの範囲、 好ましくは 5 O m gから 3 0 0 0 m gの範囲で、 数日に 1回、 3日に 1回、 2日に 1回、 1日 1回から数回非経 口投与 （好ましくは、 静脈内投与） されるか、 または 1日 1時間から 2 4時 間の範囲で静脈内に持続投与できる。 投与量は種々の条件により変動するの で、 上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、 また範囲を越えて投与 の必要な場合もある。
[0094] 非経口投与のための注射剤としては、 すべての注射剤を含み、 点滴剤も包 含する。 例えば、 筋肉への注射剤、 皮下への注射剤、 皮内への注射剤、 動脈 内への注射剤、 静脈内への注射剤、 腹腔内への注射剤、 脊髄腔への注射剤お よび静脈内への点滴剤等を含む。 注射剤を投与する方法としては、 対象とな る生物体の体内の一部分 （臓器等の一組織） を標的として局所的に投与を行 つても良いし、 血管に投与することにより、 生物体全体に本発明の抗体を循 環させてもよい。 また、 複数箇所の標的に同時に投与を行ってもよい。 また 、 投与する本発明の二価抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用い て生体に導入することもできる。 本発明の二価抗体をコードする遺伝子を生 体に導入し、 発現させる手法は公知である。 また、 本発明の二価抗体を、 処 置を施したい領域に局所的に投与することもできる。 例えば、 手術中の局所 注入、 カテーテルの使用、 または本発明の二価抗体をコードする塩基配列の 標的化遺伝子送達によリ投与することも可能である。
[0095] 本発明の二価抗体は、
( 1 ) 本発明の予防および Zまたは治療剤の予防および Zまたは治療効果の 補完および Zまたは増強、 ( 2 ) 本発明の予防および Zまたは治療剤の動態、 吸収改善、 投与量の低減 および Zまたは
( 3 ) 本発明の予防および Zまたは治療剤の副作用の軽減のために、 他の薬 剤と組み合わせて投与してもよい。
[0096] 本発明の二価抗体と他の薬剤の併用剤は、 1つの製剤中に両成分を配合し た配合剤の形態で投与してもよく、 また別々の製剤にして投与する形態をと つてもよい。 この別々の製剤にして投与する場合には、 同時投与および時間 差による投与が含まれる。 また、 時間差による投与は、 本発明の二価抗体を 先に投与し、 他の薬剤を後に投与してもよいし、 他の薬剤を先に投与し、 本 発明の二価抗体を後に投与してもよく、 それぞれの投与方法は同じでも異な つていてもよい。
[0097] 他の薬剤の投与量は、 臨床上用いられている用量を基準として適宜選択す ることができる。 また、 本発明の二価抗体と他の薬剤の配合比は、 投与対象 の年齢、 体重、 投与方法、 投与時間、 対象疾患もしくは症状またはそれらの 組み合わせ等により適宜選択することができる。 例えば、 本発明の二価抗体 1質量部に対し、 他の薬剤を 0. 0 1〜 1 0 0質量部用いればよい。 他の薬 剤は任意の 2種以上を適宜の割合で組み合わせて投与してもよい。 また、 本 発明の二価抗体の予防および Zまたは治療効果を補完および Zまたは増強す る他の薬剤には、 上記したメカニズムに基づいて、 現在までに見出されてい るものだけでなく今後見出されるものも含まれる。
[0098] この併用により、 予防および Zまたは治療効果を奏する疾患は特に限定さ れず、 本発明の二価抗体の予防および Zまたは治療効果を補完および Zまた は増強する疾患であればよい。
[0099] 本発明の二価抗体の自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性 疾患もしくは炎症性疾患の予防および Zまたは治療効果の補完および Zまた は増強のための他の薬剤としては、 例えば、 ステロイド薬、 非ステロイド系 抗炎症薬、 免疫抑制薬、 抗アレルギー薬 （例えば、 化学伝達物質遊離抑制薬 、 抗ヒスタミン薬、 トロンポキサン合成酵素阻害薬、 トロンポキサン拮抗薬 および T h 2サイト力イン阻害薬等） 、 ホスホジエステラーゼ阻害薬 （P D E 4 ) およびメディエーター遊離抑制薬等が挙げられる。
[0100] ステロイド薬のうち、 外用薬としては、 例えば、 プロピオン酸クロべタゾ ール、 酢酸ジフロラゾン、 フルオシノニド、 フランカルボン酸モメタゾン、 ジプロピオン酸ベタメタゾン、 酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、 吉草酸ベタ メタゾン、 ジフルプレドナート、 プデソニド、 吉草酸ジフルコルトロン、 ァ ムシノニド、 ハルシノニド、 デキサメタゾン、 プロピオン酸デキサメタゾン 、 吉草酸デキサメタゾン、 酢酸デキサメタゾン、 酢酸ヒドロコルチゾン、 酪 酸ヒドロコルチゾン、 酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、 プロピオン酸デ プロドン、 吉草酸酢酸プレドニゾロン、 フルオシノロンァセトニド、 プロピ オン酸べクロメタゾン、 卜リアムシノロンァセトニド、 ピバル酸フルメタゾ ン、 プロピオン酸アルクロメタゾン、 酪酸クロベタゾン、 プレドニゾロン、 プロピオン酸ぺクロメタゾンおよびフルドロキシコルチド等が挙げられる。
[0101 ] ステロイド薬のうち、 内服薬あるいは注射剤としては、 例えば、 酢酸コル チゾン、 ヒドロコルチゾン、 リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、 コハク酸 ヒドロコルチゾンナトリウム、 酢酸フルド口コルチゾン、 プレドニゾロン、 酢酸プレドニゾロン、 コハク酸プレドニゾロンナトリウム、 ブチル酢酸プレ ドニゾロン、 リン酸プレドニゾロンナトリウム、 酢酸ハロプレドン、 メチル プレドニゾロン、 酢酸メチルプレドニゾロン、 コハク酸メチルプレドニゾロ ンナトリウム、 トリアムシノロン、 酢酸トリアムシノロン、 卜リアムシノロ ンァセトニド、 デキサメタゾン、 酢酸デキサメタゾン、 リン酸デキサメタゾ ンナトリウム、 パルミチン酸デキサメタゾン、 酢酸パラメタゾンおよびベタ メタゾン等が挙げられ、 吸入剤としては、 例えば、 プロピオン酸べクロメタ ゾン、 プロピオン酸フルチ力ゾン、 ブデソニド、 フルニソリ ド、 卜リアムシ ノロン、 ST-126P、 シクレソニド、 デキサメタゾンパルミテート、 モメタゾン フランカルポネート、 プラステロンスルホネート、 デフラザコート、 メチル プレドニゾロンスレプタネ一卜およびメチルプレドニゾロンナトリウムスク シネート等が挙げられる。 [0102] 非ステロイド抗炎症薬としては、 例えば、 アスピリン、 ロキソニン、 ジク 口フエナク、 セレコキシブ、 チアプロフェン酸、 アルミノプロフェン、 フル ルビプロフェンアキセチル、 ザルトプロフェン、 スプロフェン、 ケトプロフ ェン、 プラノプロフェン、 フェンチアザク、 ドロキシカム、 イブプロフェン 、 ァセクロフエナク、 アンフエナク ■ナトリウム、 テノキシカム、 ォキサブ ロジン、 ピロキシカム、 ェモルファゾン、 トルフエナム酸、 インドメタシン フアルネシル、 マレイン酸プログルメタシン、 スリンダク、 モフエゾラク、 エトドラク、 ロナゾラク ■カルシウム、 アンピロキシカム、 メサラジン、 デ フラザコー卜、 二メスリ ド、 エトリコキシブ、 ケトロラック ■ トロメタモー ル、 パレコキシブ、 口ベンザリット■二ナトリウム、 オーラノフィン、 ロキ ソプロフェン■ナトリウム、 ブシラミン、 ァクタリット、 けい皮酸ピロキシ カム、 ナブメ トン、 サラゾスルフアビリジン、 ロルノキシカム、 メロキシカ ム、 ジァセレイン、 口フエコキシブおよびバルデコキシブ等が挙げられる。
[0103] 塩基性非ステロイド抗炎症薬としては、 例えば、 塩酸チアラミド、 塩酸チ ノリジン、 ェピリゾール、 ェモルファゾン等が挙げられる。
[0104] 免疫抑制薬としては、 例えば、 ァザチォプリン、 ァスコマイシン、 エベ口 リムス、 オルソクローン O K T 3、 コルチコステロイド、 サラゾスルフアビ リジン、 シクロスポリン、 シクロフォスフアミド、 シロリムス、 タク口リム ス水和物、 デォキシスパーガリン、 ブシラミン、 プレドニゾロン、 ミコフエ ノール酸モフエチル、 ミゾリビン、 メチルプレドニゾロン、 メ トトレキサー 卜、 レフルノミドおよび抗ヒ卜リンパ球グロプリン等が挙げられる。
[0105] 抗アレルギー薬のうち、 化学伝達物質遊離抑制薬としては、 例えば、 クロ モグリク酸ナトリウム、 トラニラスト、 アンレキサノクス、 レビリナスト、 イブジラスト、 ぺミロラストカリウム、 ダザノラスト、 ネドクロミル、 クロ モグリカー卜およびイスラパファント等が挙げられる。
[0106] 抗アレルギー薬のうち、 抗ヒスタミン薬としては、 例えば、 ジフェンヒド ラミン、 塩酸ジフエ二ルビラリン、 テオクル酸ジフエ二ルビラリン、 フマル 酸クレマスチン、 ジメンヒドリナー卜、 d I —マレイン酸クロルフエニラミ ン、 d—マレイン酸クロルフエ二ラミン、 塩酸トリプロリジン、 塩酸プロメ タジン、 酒石酸ァリメマジン、 塩酸イソチペンジル、 塩酸ホモクロルシクリ ジン、 ヒドロキシジン、 塩酸シプロヘプタジン、 塩酸レポ力バスチン、 ァス テミゾール、 べポタスチン、 デス口ラタジン、 TAK-427、 ZCR-2060、 NIP-530 、 モメタゾンフ口エー卜、 ミゾラスチン、 BP-294、 アンドラスト、 オーラノ フィンおよびァクリバスチン等が挙げられる。
[0107] 抗アレルギー薬のうち、 トロンポキサン合成酵素阻害薬としては、 例えば 、 塩酸ォザダレルおよびイミトロダストナトリウム等が挙げられ、 トロンポ キサン拮抗薬としては、 例えば、 セラトロダスト、 ラマトロバン、 ドミトロ バンカルシウム水和物、 KT-2-962等が挙げられ、 T h 2サイト力イン阻害薬 としては、 例えば、 トシル酸スブラタストソナチモド、 T-614、 SR-31747等が 挙げられる。
[0108] ホスホジエステラーゼ阻害薬 （PDE4) としては、 例えば、 シロミラス 卜、 口フルミラスト、 ァロフィリン、 ァチゾラム、 シパムフィリン、 口リブ ラム、 0PC-6535、 0N0-6126. IC-485、 AWD-12-281、 CC-10004. CC-1088. KW-4 490、 I irimi last. ZK-117137. YM-976、 BY-61-9987. CC-7085、 CDC-998. MEM -1414、 ND-125U Bay19-8004、 D-4396、 PD-168787. NIK-616. SCH-35159U V -11294A等が挙げられる。
[0109] メディエーター遊離抑制薬としては、 例えば、 アンレキサノクス、 イブジ ラスト、 クロモグリク酸ナトリウム、 ダザノラスト、 トラニラスト、 ぺミロ ラストカリウム、 レピリナスト等が挙げられる。
実施例
[0110] 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 これらは本発明 の範囲を制限するものではない。
：枯上卜 B I R 1モノクローナル杭休の作製
( 1 ) ヒト B I R 1細胞外領域タンパク質を用いた抗原感作
抗原としてヒト B I R 1細胞外領域タンパク質 （60 g) を Tは erMaxァ ジュバント （Sigma社製） と混合し、 BALBZcマウスの腹腔内に投与した 。 初回投与 2週間後に、 同抗原 （60 g) を Tは erMaxアジュバントと混合 し、 マウスの腹腔内に投与した。 追加免疫約 1 0日後に、 同抗原 （40 g ) をマウスの腹腔内に最終投与した。 3日後にマウスから脾臓を摘出した。
(2) 抗ヒト B I R 1モノクローナル抗体の作製
上記 （1 ) で得た脾臓よりリンパ球を分離し、 マウスミエローマ P3 U 1 と約 4 ： 1で混合し、 ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。
RPM I 1 640/1 5%FCSZH AT培地によリハイブリ ドーマを選択 し、 EL I SAおよびフローサイトメ トリーにより、 目的の抗体を産生して いるハイプリ ドーマのスクリーニングを行った。 陽性ハイプリ ドーマを限界 希釈法によリクローニングし、 抗ヒト B I R 1モノクローナル抗体産生ハイ プリ ドーマを取得した。 このようにして得たハイプリ ドーマを BALBZc マウスの腹腔に接種後、 2週間以降に腹水を採取した。 腹水中に産生された 抗体は Pros印- Gカラム (Millipore社製) を用いて精製した。
(3) 抗ヒト B I R 1モノクローナル抗体のビォチン化
上記 （2) で精製した抗ヒ卜 B I R 1モノクローナル抗体 （クローン： 0K3 1, 0K151, 0K170) は EZ-Link NHS-PEO Sol id Phase Biotinylation Kit (PIE RCE社製） を用いてビォチン化を行った。
[0111] 図 1に示すように、 作製されたビォチン化抗ヒ卜 B I R 1モノクローナル 抗体はヒ卜 B I R 1を認識した。 図中、 0K31、 0K15U 0Κ170は抗ヒ卜 B I R 1モノクローナル抗体の各クローンを表し、 Isotype controlは陰性対照を表 す。
¾MI2： ヒ卜 B I R 1と BCR t の ネ喬による BCR † ^匕の ¾]制 ヒト B I R 1と B C R複合体の架橋による B I R 1の抑制作用は、 B C R 活性化を介した I L一 2産生に対する抑制効果として評価した。
[0112] ヒト B I R 1を安定発現させた、 1 X 1 05個のマウス B細胞株 A20I IA1.6
(J. I隱 unol.， 1986年， 第 136巻， P.348-356) に、 ビォチン化抗マウス I g G (H&L) 抗体 Fa b ( 1 gZ80 L ； Rockland社製） を添加し、 室温で 30分間反応させた。 細胞を氷冷した後、 ビォチン化抗ヒ卜 B I R 1 抗体 （5 gZ20 L) を添加し、 4°Cで 1時間反応させた。 氷冷した培 地で細胞を 1回洗浄後、 ストレプトアビジン溶液 （25 gZmL ; 200 L) に懸濁し、 96ゥエルプレートに播種した。 37°Cで 24時間培養し た後、 Quant ikine Immunoassay Mouse IL-2 EL ISA Kit (R&D Systems社製） を用いて、 各培養上清中の I L_2量を測定した。
[0113] 図 2に示すように、 ヒト B I R 1と BCR複合体の架橋により、 B I R 1 は BCR活性化を介した I L_ 2産生を抑制した。
実施例 3 ：杭ヒト B I R 1杭休の CD Rをコードする DN Aのクローニング 抗ヒト B I R 1抗体ハイプリ ドーマ OK31 (受領番号： FERM AP -20846) 、 OK 1 51、 OK 1 70から SV Total RNA Isolation Syst em (Promega社製） を用いて total RNAを調製した。
[0114] 抗ヒト B I R 1抗体の CD Rをコードする DN Aを取得するために、 SMART
RACE cDNA Ampl ification Kit (タカラバイオ社製） を用いて 5' -RACE (rapi d ampl ification of cDNA ends) を実施した。 添付文書に従って、 それぞれ のハイプリ ドーマ c DN Aライブラリーを作製した後、 I §0重鎖の〇0 は、 以下のプライマー 1 (配列番号 37) およびプライマー 2 (配列番号 3 8) を、 I gG軽鎖の CDRはプライマー 3 (配列番号 39) およびプライ マー 4 (配列番号 40) を用いて、 primary PCRおよび nested PCRを実施した 。 PCR反応は PrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製) を用い、 最初 96 で 1分間保持し、 続いて 98 で 1 0秒間、 64 で 1 5秒間、 72 °Cで 1分間の温度操作を 25〜 30回繰り返し、 最後に 72 °Cで 1 0分 間保持して行った。
[0115] P C R反応で増幅された D N Aをァガロースゲル電気泳動によって分離後 、 予測されるサイズの DN A断片を Mi nE lute Gel Extraction Kit (QIAGEN社 製） にて回収し、 これをクローニングベクターに連結させた。 さらに、 この プラスミドで大腸菌 DH 5ひを形質転換させた後、 プラスミド DNAを精製 して、 抗ヒト B I R 1抗体 OK31の I g Gの VH領域 （配列番号 8) お よび I g Gの V L領域 （配列番号 1 0) 、 OK 1 51の I g Gの VH領域 （ 配列番号 22) および I gGの VL領域 （配列番号 24) 、 0 170の 1 §0の 1"1領域 （配列番号 26) および I §0の 1_領域 （配列番号 28) のそれぞれの c D N Aの塩基配列を決定した。
¾MI4 ：二 fflfitf [ 現.ベクターのィ乍
二価抗体をコードする D N Aは、 実施例 3で単離した抗ヒト B I R 1抗体 OK31の CDR (VHと VL) と抗ヒト C D 3抗体 O K T 3の C D R (V Hと VL) の DN Aに基づき、 化学合成にて作製し （配列番号 20) 、 発現 ベクターへ連結した。 このプラスミドで大腸菌 DH 5ひを形質転換させた後 、 プラスミド DNAを精製して、 二価抗体発現ベクターを取得した。
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二価抗体は、 実施例 4で作製した発現ベクターを LipofectAMINE Plus (Inv は rogen社製） にて、 293 T細胞に導入することで発現させた。 すなわち、 遺伝子導入後数日間培養し、 その培養上清を回収した。 この培養上清を濃縮 した後、 HisTrap HP column (GE Heaは hcare社製） を用いて二価抗体を精製 した。
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二価抗体の細胞表面抗原 （B I R 1および CD3) に対する反応性をフロ 一サイトメトリーによって確認する。
ヒト B I R 1発現 CHO細胞株 （以下、 Γ B I R 1陽性■ C D 3陰性細胞 」 あるいは 「B I R 1 (+ ) ZCD 3 (-) e e l I s」 と表記することが ある。 ） およびヒ卜 CD 3発現 CHO細胞株 （以下、 「B I R 1陰性■ CD 3陽性細胞」 あるいは 「B I R 1 (―) ZCD3 ( + ) e e l I s」 と表記 することがある。 ） のそれぞれに、 実施例 5で作製した二価抗体 （1または 10 g) を添加し、 一時氷上に静置した後、 続いて、 二次抗体を添加して 氷上で 30分間静置する。 その後、 フローサイトメトリーにて解析し、 二価 抗体の抗原反応性を確認する。
^MI ：二 fflfitf [ の 言忍
二価抗体の活性確認は、 活性化ヒ卜末梢血 T細胞の増殖に対する抑制効果 として評価する。
[0117] 具体的には、 健常人ヒ卜末梢血から Lymphopr印 Tube (AX I S-SH I ELD社製） を用いて末梢血単核球を調製する。 細胞を溶血バッファー （0. 80/0 N H4 C I , 0. 1 % KC03, 1 mM E D T A) に懸濁させ、 赤血球を溶血さ せる。 続いて、 Nylon Fiber Column T (Roche社製） を用いて T細胞を精製し 、 培地 （1 0%ゥシ胎児血清を含む RPM I 1 640培地） に懸濁する。
[0118] 予め、 抗ヒト Q?)S TCR抗体 （5 gZm L ； BD Pharmingen社製） をコー 卜した 24ゥエルプレー卜に、 先に調製した T細胞を 2 X 1 06個 Zm LZゥ エルの割合で播種する。 続いて、 抗ヒト CD 28抗体 （ 1 gZm L ； BD Ph armingen社製） を含む培地 1 m Lを添加して、 60時間培養する。 抗体刺激 した細胞を回収し、 無刺激下で 1 2時間培養した後、 予め、 抗ひ) S T CR抗 体 （0. 1 gZm L) をコートしておいた 96ゥエルプレートに、 T細胞 を 1 X 1 06個 1 00 LZゥエルで播き、 これに二価抗体を 1 gZゥェ ルで添加して培養する。 48時間後に、 Cel l Prol iferation EL ISA (Roche社 製） を用いて、 B r d U (プロモデォキシゥラシル） の取り込みを指標とし て細胞増殖を測定する。
産業上の利用可能性
[0119] 本発明の二価抗体は B I R 1の免疫抑制機能を発現ないし増強することか ら、 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性疾患および炎症性 疾患等に対する新たな側面からの予防および Zまたは治療薬として有用であ る。

Claims

請求の範囲
[1 ] B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれが 、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を 形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリンカ一を介 して結合された構成を有する二価抗体。
[2] 膜タンパク質が、 T細胞受容体複合体を構成する膜タンパク質または B細 胞受容体複合体を構成する膜タンパク質である請求の範囲 1記載の二価抗体
[3] B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドが、 配列番号
7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドおよび配列番号 9で表され るァミノ酸配列を有するポリべプチドである請求の範囲 1記載の二価抗体。
[4] B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を 形成する二つのポリペプチドが、 配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列を有 するポリべプチドおよび配列番号 1 3で表されるアミノ酸配列を有するポリ ぺプチドである請求の範囲 1記載の二価抗体。
[5] リンカーがぺプチドリンカーである請求の範囲 1記載の二価抗体。
[6] B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドが、 配列番号
7および配列番号 9で表されるァミノ酸配列を有するポリペプチドであって 、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を 形成する二つのポリペプチドが、 配列番号 1 1および配列番号 1 3で表され るァミノ酸配列を有するポリべプチドである請求の範囲 5記載の二価抗体。
[7] (a)配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1
3で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介し て結合された構成を有するポリべプチド、 および (b)配列番号 9で表されるァ ミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるァミノ酸配列を 有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有するポ リベプチドからなる請求の範囲 6記載の二価抗体。
[8] (a)配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 3で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介し て結合された構成を有するポリべプチド、 および (b)配列番号 9で表されるァ ミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるァミノ酸配列を 有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有するポ リベプチドが、 当該記載順でぺプチドリンカーを介して結合された構成を有 するポリペプチド （ただし、 各々のペプチドリンカ一は同じでも異なってい てもよい。 ） である請求の範囲 7記載の二価抗体。
[9] ペプチドリンカ一が、 5〜2 0アミノ酸長を有するポリペプチドである請 求の範囲 5記載の二価抗体。
[10] 5〜2 0アミノ酸長を有するポリペプチドが、 一 （G I y _ G I y— G I y - G I y - S e r ) n _ (左側が N末端を、 右側が C末端を表し、 nは"!〜 4の整数を表す。 ） である請求の範囲 9記載の二価抗体。
[11 ] (a)配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 3で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介し て結合された構成を有するポリペプチドが、 配列番号 1 5で表されるァミノ 酸配列を有するポリべプチドであって、 （b)配列番号 9で表されるアミノ酸配 列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるァミノ酸配列を有するポ リベプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有するポリべプチ ドが、 配列番号 1 7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請 求の範囲 7記載の二価抗体。
[12] (a)配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 3で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介し て結合された構成を有するポリべプチド、 および (b)配列番号 9で表されるァ ミノ酸配列を有するポリべプチドと配列番号 1 1で表されるァミノ酸配列を 有するポリべプチドがぺプチドリンカ一を介して結合された構成を有するポ リベプチドが、 当該記載順でぺプチドリンカーを介して結合された構成を有 するポリべプチドが、 配列番号 1 9で表されるァミノ酸配列を有するポリべ プチドである請求の範囲 8記載の二価抗体。
[13] 請求の範囲 8記載の二価抗体をコードするポリヌクレオチド。
[14] 配列番号 2 0で表される塩基配列を有する請求の範囲 1 3記載のポリヌク レオチド。
[15] 請求の範囲 1 3記載のポリヌクレオチドを有する複製または発現ベクター
[16] 請求の範囲 1 5記載の複製または発現ベクターによる形質転換体。
[17] B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれが 、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を 形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリンカ一を介 して結合された構成を有する二価抗体を有効成分として含有してなる医薬組 成物。
[18] B I R 1が関与する疾患の予防および Zまたは治療剤である請求の範囲 1 7記載の医薬組成物。
[19] B I R 1が関与する疾患が、 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 ァレ ルギー性疾患および炎症性疾患から選択される疾患である請求の範囲 1 8記 載の医薬組成物。
[20] 自己免疫疾患が、 ループス抗凝固因子が高値な疾患、 全身性エリテマトー デス、 関節リウマチ、 多発性硬化症および高安動脈炎から選択される疾患で ある請求の範囲 1 9記載の医薬組成物。
[21 ] B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれが 、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を 形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリンカ一を介 して結合された構成を有する二価抗体と、 ステロイド薬、 非ステロイド系抗 炎症薬、 免疫抑制薬、 および抗アレルギー薬から選択される 1種以上を組み 合わせてなる医薬。
[22] B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれが 、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を 形成する二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリンカ一を介 して結合された構成を有する二価抗体の有効量を哺乳動物に投与することを 特徴とする、 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性疾患およ び炎症性疾患から選択される疾患の予防および Zまたは治療方法。
[23] 自己免疫疾患、 臓器移植後の拒絶反応、 アレルギー性疾患および炎症性疾 患から選択される疾患の予防および Zまたは治療剤を製造するための、 B I R 1抗体の抗原認識領域を形成する二つのポリべプチドのそれぞれが、 B I R 1発現細胞に発現する膜タンパク質に対する抗体の抗原認識領域を形成す る二つのポリべプチドのそれぞれ一方に、 直接にまたはリンカ一を介して結 合された構成を有する二価抗体の使用。
[24] 受領番号 F E R M A P— 2 0 8 4 6で特定されるハイプリドーマから産 生されるマウス抗ヒ卜 B I R 1モノクローナル抗体。
[25] 受領番号 F E R M A P— 2 0 8 4 6で特定されるハイプリドーマ。
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