TW201900209A - 包含T細胞接合抗體構築體之低pH值醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種低pH值醫藥組成物，其包含(a)抗體構築體，該抗體構築體包含結合靶細胞表面抗原之第一結構域、結合第二抗原之第二結構域及呈特定Fc形態之第三結構域；(b)至少一種緩衝劑；(c)至少一種醣；及(d)至少一種界面活性劑；且其中該醫藥組成物之pH值處於3.5至6之範圍內。

Description

包含T細胞接合抗體構築體之低pH值醫藥組成物
基於蛋白質之藥物為處在臨床(前)開發中及作為市售產品之發展最快速之治療劑之一。與小化學藥物相比，蛋白質藥物在相對較低之濃度下具有高特異性及活性，且通常用於治療高危害性疾病，諸如各種癌症、自體免疫性疾病及代謝病症(Roberts,Trends Biotechnol. 2014年7月, 32(7):372-80；Wang,Int J Pharm. 1999年8月20日, 185(2):129-88)。 由於工業規模純化方法之進步，現可在最初製造時便獲得高純度之基於蛋白質之藥物，諸如重組蛋白質。然而，蛋白質僅具有最低限度之穩定性，且非常易於發生化學降解及物理降解。化學降解係指涉及共價鍵之修飾，諸如脫醯胺化、氧化、裂解或新二硫橋形成、水解、異構化或去糖基化。物理降解包括蛋白質解摺疊、不合需要之吸附至表面及聚集。在蛋白質藥物之開發中，處理此等物理及化學不穩定性為最具挑戰性的任務之一(Chi等人, Pharm Res, 第20卷, 第9期, 2003年9月, 第1325-1336頁；Roberts, Trends Biotechnol. 2014年7月, 32(7):372-80)。 令人感興趣的基於蛋白質之藥物包括雙特異性分子，諸如BiTE® (雙特異性T細胞銜接子)抗體構築體，其為由兩個可撓性地連接之抗體衍生結合結構域製造的重組蛋白質構築體。BiTE® 抗體構築體之一個結合結構域對靶細胞上之所選腫瘤相關表面抗原具有特異性；第二結合結構域對T細胞上之T細胞受體複合物之次單元CD3具有特異性。由於其特定設計，BiTE® 抗體構築體特別適於瞬時連接T細胞與靶細胞，且同時有效地活化T細胞對靶細胞之固有細胞溶解潛力。對所開發之作為AMG 103及AMG 110進入臨床之第一代BiTE® 抗體構築體(參見WO 99/54440及WO 2005/040220)的重要進一步開發提供了結合至CD3ε鏈N末端之背景獨立抗原決定基的雙特異性抗體構築體(WO 2008/119567)。結合此所選抗原決定基之BiTE® 抗體構築體不僅對人類及白鬢狨(Callithrix jacchus )、棉冠獠狨(Saguinus oedipus )或松鼠猴(Saimiri sciureus ) CD3ε鏈顯示跨物種特異性，而且由於識別此特異性抗原決定基而非先前針對雙特異性T細胞接合分子中之CD3結合劑所描述的抗原決定基，故不會將T細胞非特異性地活化至與對上一代T細胞接合抗體所觀測之程度相同的程度。此T細胞活化減少與5名患者中較少或減少之T細胞再分佈有關，該較少或減少之T細胞再分佈被鑑定為副作用風險。 如WO 2008/119567中所描述之抗體構築體可能因自體內快速清除而受到困擾；因而，儘管其能夠快速達到大部分身體部位而且快速產生且更易於處理，但其活體內應用可能因其在活體內之短暫持續時間而受到限制。由於此小單鏈分子具有短活體內半衰期，故利用藉由連續靜脈內輸注進行長期投與來達成治療效應。然而，此種連續靜脈內輸注被分類為不適宜用於患者，且因而，在更適宜之替代治療方法的情況下，妨礙選擇已顯示在治療個別疾病方面更有效之化合物。因此，申請者已引入保留類似治療效力、具有直接產生之形式且具有有利藥物動力學性質，包括更久半衰期之雙特異性治療劑。 增加之半衰期一般適用於免疫球蛋白，尤其抗體且最尤其小尺寸抗體片段之活體內應用。此項技術中所描述之用以達成此種效應之方法包括使小雙特異性抗體構築體與較大蛋白質融合，此舉較佳不干擾BiTE® 抗體構築體之治療效應。此種進一步開發之雙特異性T細胞銜接子之實例包括例如US 2014/0302037、US 2014/0308285、WO 2014/144722、WO 2014/151910及WO 2015/048272中所描述之雙特異性Fc分子。 蛋白質聚集代表著蛋白質物理不穩定性之主要事件，且由於將溶劑與疏水性蛋白質殘基之間的熱動力學不利相互作用減至最少的固有傾向而發生。由於在再摺疊、純化、滅菌、運輸及儲存過程中往往遭遇此現象，故其尤其成問題。聚集甚至可在熱動力學上非常有利於蛋白質天然狀態之溶液條件(例如，中性pH值及37℃)下及不存在應力時發生(Chi等人, Pharm Res, 第20卷, 第9期, 2003年9月, 第1325-1336頁；Roberts, Trends Biotechnol. 2014年7月, 32(7):372-80；Wang, Int J Pharm. 1999年8月20日, 185(2):129-88；Mahler J Pharm Sci. 2009年9月, 98(9):2909-34)。 此外，必須保護半衰期延長型抗體構築體，諸如包含半衰期延長形態之雙特異性T細胞銜接子，諸如Fc分子，以免發生蛋白質聚集及/或其他降解事件。蛋白質聚集由於其可損害治療蛋白質之生物活性而成問題。此外，蛋白質聚集導致藥物產品不夠美觀，並且由於自最終產品移除聚集物需要進行精細純化步驟而降低產品產率。最近，存在聚集之蛋白質(即使為人類化蛋白質或完全人類蛋白質)可顯著增加患者對活性蛋白質單體產生免疫反應，從而導致形成中和抗體及抗藥性或其他不利副作用之風險的憂慮及證據亦有所增加(Mahler J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34。 一般而言，文獻中已有若干研究報導了藉由各種機制將蛋白質聚集減至最少。可藉由修飾蛋白質之一級結構，從而增大內部疏水性且減小外部疏水性來穩定蛋白質，且因而防止聚集物形成及其他化學變化。然而，對蛋白質進行基因工程改造可導致損害功能性及/或增加免疫原性。另一種方法聚焦於藉由使用各種機制，諸如溫度、壓力、pH值及鹽使聚集物解離(稱為「解聚」)，以便回收功能天然單體。當前，主要在下游處理之拋光步驟中將蛋白質聚集物作為雜質加以移除。然而，在高分子量(HMW)之含量較高的情況下，移除大量HMW不僅造成實質性產率損失，而且使穩固下游過程之設計變得具有挑戰性(Chi等人, Pharm Res, 第20卷, 第9期, 2003年9月, 第1325-1336頁)。 在生物學及生物技術應用中，保持蛋白質穩定性及活性提出了嚴重挑戰。此項技術中需要可提供增強之治療蛋白質穩定性且減少調配、填充、運輸、儲存及投與過程中之聚集及變性或降解，從而防止功能損失及不利免疫原性反應的最佳化醫藥組成物。本發明之目標為順應此需要，尤其關於半衰期延長型抗體構築體，諸如包含半衰期延長形態之雙特異性T細胞銜接子，諸如Fc分子。
基於蛋白質之醫藥，包括同時結合兩個(或更多個)不同的抗原的雙特異性(及/或多特異性)抗體，諸如雙特異性T細胞接合抗體構築體，傾向於蛋白質不穩定性。此延伸至包含半衰期延長形式(HLE形式)，包括單鏈Fc形式(稱為scFc)、異源Fc (亦稱為hetFc或異源二聚Fc、hFc)形式及人血清白蛋白(亦稱為HSA或hALB)融合物之彼等抗體構築體。蛋白質不穩定性且特定言之蛋白質聚集為生物技術工業中正在增長之挑戰，其中貫穿治療蛋白質之壽期，包括在再摺疊、純化、滅菌、運輸及儲存過程中均遭遇聚集。因而，本發明之目標為提供一種包含抗體構築體、較佳為半衰期延長形式、更佳為T細胞接合抗體構築體之穩定醫藥組成物。在本發明之上下文中，醫藥組成物較佳為液體組成物，或可為藉由凍乾而獲得之固體組成物，或可為復原液體組成物，其包含： (a) 抗體構築體，該抗體構築體包含至少三個結構域，其中： • 第一結構域結合靶細胞表面抗原，且具有處於4至9.5之範圍內的等電點(pI)； • 第二結構域結合第二抗原，且具有處於8至10、較佳8.5至9.0之範圍內的pI；且 • 較佳地，第三結構域包含兩個多肽單體，各多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域及CH3結構域，其中該兩個多肽單體經由肽連接子與彼此融合； (b) 至少一種緩衝劑； (c) 至少一種醣；及 (d) 至少一種界面活性劑； 且其中該醫藥組成物之pH值處於3.5至6之範圍內。 本發明之上下文設想該醫藥組成物包含呈單鏈抗體構築體形式之抗體構築體。 本發明之上下文更設想該第三結構域按胺基至羧基順序包含：鉸鏈-CH2結構域-CH3結構域-連接子-鉸鏈-CH2結構域-CH3結構域。 本發明之上下文尤其設想根據本發明之抗體構築體第三結構域。 本發明之上下文亦設想該第一結構域具有處於約4.0至約9.5、較佳約4.5至7.5或4.5至6.5範圍內之pI。 本發明之上下文設想該靶細胞表面抗原為腫瘤抗原、免疫學病症特異性抗原或病毒抗原。 本發明之上下文更設想該腫瘤抗原係選自由以下各項組成之群：CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFR、EGFRvIII、BCMA、PSMA、CD33、CD19、CD20及CD70。 本發明之上下文亦設想該第二結構域為CD3人類及/或獼猴CD3ε鏈之細胞外抗原決定基。 本發明之上下文設想該第二結構域具有處於8.5至9.0範圍內之pI。 本發明之上下文更設想該第三結構域之該等多肽單體中之每一者具有與選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群的序列存在至少90%一致性的胺基酸序列，或具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群的胺基酸序列。 本發明之上下文亦設想該CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。 本發明之上下文設想該第三結構域具有處於5.5至7.5、較佳6.0至7.0範圍內之pI。 本發明之上下文更設想 (i) 該第一結構域包含兩個抗體可變域且該第二結構域包含兩個抗體可變域； (ii) 該第一結構域包含一個抗體可變域且該第二結構域包含兩個抗體可變域； (iii) 該第一結構域包含兩個抗體可變域且該第二結構域包含一個抗體可變域；或 (iv) 該第一結構域包含一個抗體可變域且該第二結構域包含一個抗體可變域。 本發明之上下文設想該抗體構築體較佳按胺基至羧基順序包含： (a) 第一結構域； (b) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1-3； (c) 第二結構域； (d) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11及12； (e) 第三結構域之第一多肽單體； (f) 肽連接子，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 5、6、7及8；及 (g) 第三結構域之第二多肽單體。 本發明之上下文亦設想該至少一種緩衝劑為選自由以下各項組成之群的酸：乙酸鹽、麩胺酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、組胺酸、磷酸鹽、2-(N-嗎啉基)乙磺酸鹽或其組合。 本發明之上下文更設想該至少一種緩衝劑係以5至200 mM之濃度範圍，更佳以10至50 mM之濃度範圍存在。 本發明之上下文設想該至少一種醣係選自由以下各項組成之群：單醣、雙醣、環狀多醣、糖醇、線性分枝葡聚醣或線性非分枝葡聚醣。 本發明之上下文亦設想該雙醣係選自由以下各項組成之群：蔗糖、海藻糖及甘露糖醇、山梨糖醇及其組合。 本發明之上下文更設想該糖醇為山梨糖醇。 本發明之上下文設想該至少一種醣係以1%至15% (m/V)範圍內、較佳以9%至12% (m/V)濃度範圍內之濃度存在。 本發明之上下文亦設想該至少一種界面活性劑係選自由以下各項組成之群：聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯40、聚山梨糖醇酯60、聚山梨糖醇酯80、泊洛沙姆(poloxamer) 188、普洛尼克(pluronic) F68、曲拉通(triton) X-100、聚氧乙烯、PEG 3350、PEG 4000及其組合。 本發明之上下文更設想該至少一種界面活性劑係以0.004%至0.5% (m/V)範圍內、較佳以0.001%至0.01% (m/V)範圍內之濃度存在。 本發明之上下文設想該組成物之pH值處於4.0至5.0之範圍內，較佳為4.2。 本發明之上下文亦設想該醫藥組成物具有處於150至500 mOsm之範圍內的滲透壓。 本發明之上下文更設想該醫藥組成物進一步包含選自由以下各項組成之群的賦形劑：一或多種聚醇及一或多種胺基酸。 本發明之上下文設想該一或多種賦形劑係以0.1%至15% (w/V)之濃度範圍存在。 本發明之上下文亦設想該醫藥組成物包含： (a) 如前述申請專利範圍中任一項之抗體構築體； (b) 10 mM麩胺酸鹽或乙酸鹽； (c) 9% (m/V)蔗糖或6% (m/V)蔗糖及6% (m/V)羥丙基-β-環糊精； (d) 0.01% (m/V)聚山梨糖醇酯80， 且其中該液體醫藥組成物之pH值為4.2。 本發明之上下文更設想該抗體構築體係以0.1至8 mg/ml、較佳0.2至2.5 mg/ml、更佳0.25至1.0 mg/ml之濃度範圍存在。 本發明之上下文設想本發明之醫藥組成物為液體。 本發明之上下文亦設想該醫藥組成物為可藉由凍乾如前述申請專利範圍中任一項之液體醫藥組成物而獲得的固體醫藥組成物。 本發明之上下文更設想該醫藥組成物為可藉由用醫藥學上可接受之液體來復原可藉由凍乾獲得之固體醫藥組成物而獲得的液體醫藥組成物。 本發明之上下文設想該醫藥組成物係用於治療疾病，較佳增殖性疾病、免疫性疾病或病毒性疾病。 本發明之上下文亦設想該組成物係非經腸，較佳藉由輸注或注射經靜脈內投與。 本發明之上下文更設想該組成物係每週投與1、2、3、4、5、6或7次，或者每兩週1、2、3、4、5或6次，或者每月1或2次，或者每兩個月1或2次，最佳每週1次。
儘管當前治療性生物技術產品之品質較高且重組人類蛋白質與針對內源人類蛋白質之抗體類似，但蛋白質不穩定性仍為一個重要問題。除蛋白質聚集之品質相關後果，諸如可能損失蛋白質活性及藥物產品之不理想外觀以外，亦已報導可溶性蛋白質聚集物具有顯著細胞毒性效應，而且重要的是，其對於對蛋白質產物產生免疫反應而言為潛在風險因素。蛋白質聚集可在貫穿蛋白質之壽期的不同時間點，包括醱酵、再摺疊、純化、填充、運輸、儲存或投與時發生，且在很大程度上視各種環境因素而定。此項技術中非常需要增加治療蛋白質之穩定性且減少其聚集；且最佳化醫藥調配物可有助於進行此舉。 基於特定蛋白質之醫藥，諸如BiTEÒ 抗體構築體分子，在液體調配物中不具長期穩定性，且在加速溫度下，例如冷凍溫度4℃及以上尤其不穩定。藉由差示掃描量熱術初步檢查BiTEÒ抗體構築體(非HLE變異體及HLE變異體兩者)通常展現在中性pH值下之熱穩定性比在酸性pH值下高，例如，相對於pH 6或pH 7，在pH 4下顯示較低穩定性。因而，熟習此項技術者將建議此種抗體構築體之溶液穩定性將會下降。因此，對於根據本發明之抗體構築體，熟習此項技術者在其將採用一般應避免之不穩定scFv時將避免低pH值調配物。因此，根據本發明之抗體構築體反而在具有低pH值之液體醫藥組成物中甚至更穩定為非常令人驚訝之發現。 本發明之一般基礎原理為發現包含根據本發明之抗體構築體的液體醫藥組成物的膠體穩定性在低pH值下得以改良。本發明抗體構築體之第一結構域及第二結構域通常具有不同的等電點(pI)值。另外，第三結構域之pI亦通常與第二結構域之pI不同。在生理條件下，在pI更靠近酸性側時，例如具有約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5之pI，第一結構域及/或第三結構域正常可帶負電。即使第一結構域具有6.5以上，例如約7.0、7.5、8.0或8.5之pI，但此pI通常將低於第二結構域，第二結構域正常具有8.0至10.0、更通常約8.5至9.5、較佳約9.2之pI。另外，第三結構域正常具有6.0至7.0之微酸性pI，此意謂即使第一結構域之pI為微鹼性，第二結構域與第三結構域之間亦仍存在pI差異。結果，由於不同的結構域帶不同(亦即，相反)電荷，故至少一個結構域具有酸性pI且另一結構域具有鹼性pI之任何pI差異均將在生理條件下產生偶極。該等相反電荷可導致分子內及分子間靜電引力，由此又可能導致聚集且因而導致形成不合需要之高分子量(HMW)物質。該形成可嚴重影響溶液之穩定性或分散體之膠體穩定性。然而，若降低培養基之pH值，則所有結構域均得以質子化並且發生靜電排斥(參見圖2)。 舉例而言，據發現，在pH 7下，由於T細胞接合結構域上之正電荷及CD19結構域上之負電荷，故包含針對CD19之第一結構域及針對CD3之第二結構域的抗體構築體形成偶極。由此導致引力且因此導致聚集，從而導致膠體不穩定性。在約pH 4下，兩個結構域皆帶正電，且電荷排斥改良膠體穩定性。 另外，即使第一結構域與第二結構域之pI彼此接近，分別為例如第一結構域約8.0且第二結構域約8.5或9.0或9.5，兩個結構域在低於8之pH值下亦帶正電。在甚至更低之pH值，例如約4下，兩個結構域，例如靶結構域及T細胞接合結構域帶強正電。此導致甚至增強之電荷-電荷排斥，結果獲得確然較高之膠體穩定性。在存在第三結構域通常具有處於微酸性範圍內之pI且因而在pI方面始終與第二結構域不同的情況下，此效應得以增強。總之，根據本發明之抗體構築體始終受益於在具有低pH值，諸如6.0或更低或者5.5或更低或者5.0或更低或者4.5或更低，諸如4.2之培養基中一般具有質子化結構域。 根據本發明之抗體構築體之第一結構域，通常為腫瘤學標靶之scFv結構域，正常具有與通常為抗CD3結構域之第二結構域不同的pI。 通常，第二結構域(例如抗CD3結構域)具有處於8至10之範圍內，較佳為約8.5至9.5，最佳為約9.2之pI。 若第一結構域為抗CD19或抗CD33結構域，則第一結構域可具有約4.9至5.3之pI。若第一結構域為抗DLL3或抗EGFRvIII結構域，則第一結構域可具有約6至8或約9.0之pI。若第一結構域為抗CD70結構域，則第一結構域可具有約8.0至8.5之pI。若第一結構域為抗CDH19結構域，則第一結構域可具有約7.0至7.5之pI。若第一結構域為抗PSMA結構域，則第一結構域可具有約7.0至7.5之pI。若第一結構域為抗MSLN結構域，則第一結構域可具有約9.0至9.5之pI。若第一結構域為抗Flt3結構域，則第一結構域可具有約8.5至9.5之pI。 本發明之上下文設想調配物使具有不同的pI之結構域穩定的原理可應用於任何抗體構築體。在本發明之上下文中，包含第如本文中所描述之三結構域的雙特異性抗體構築體尤其適於由如本文中所描述之調配物加以穩定。然而，其他雙特異性抗體構築體，例如不存在此種第三結構域，亦可根據本發明而得以有效地穩定。舉例而言，設想根據本發明之抗體構築體可具有包含SEQ ID NO 1954-1956之HCDR及SEQ ID NO 1958-1960之LCDR的第一結構域。亦設想根據本發明之抗體構築體可具有包含SEQ ID NO 1957之VH及SEQ ID NO 1961之VL的第一結構域。甚至更設想根據本發明之抗體構築體之第一結構域可具有根據SEQ ID NO 1962之第一結構域。亦設想根據本發明之抗體構築體可具有根據SEQ ID NO 1963之序列。 然而，在本發明之上下文中，醫藥組成物之穩定效應不侷限於存在具有不同的pI之(結合)結構域的抗體構築體。因此，亦設想本發明之醫藥組成物提供針對抗體構築體之穩定調配物，該等抗體構築體存在具有不同的pI之部分，因而可藉由如本文中所描述之調配物加以穩定。此種部分可包含遮蔽此種抗體構築體之結合結構域的遮蔽部分，即使該等結合結構域自身在pI方面並無差異，但其仍需要如根據本發明之上下文中之醫藥組成物所提供之額外穩定。通常，此種包含遮蔽部分之抗體構築體為可活化抗體構築體。在本發明之上下文中，此種可活化抗體構築體可結合任何靶細胞表面抗原，諸如腫瘤抗原，較佳係選自由以下各項組成之群：CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFR、EGFRvIII、BCMA、PSMA、CD33、CD19、CD20及CD70。 此種可活化抗體構築體可為通常包含以下各項之抗體或其抗原結合片段：(i)至少兩個結合結構域，各結合結構域包含重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列；(ii)遮蔽部分，其抑制各結合結構域在未裂解狀態下與個別結合搭配物(諸如靶細胞表面)之結合；及(iii)位於(i)與(ii)之間的可裂解部分，其中該可裂解部分為充當例如蛋白酶之受質的多肽。通常，呈未裂解狀態之可活化抗體自N末端至C末端具有如下結構安排：遮蔽部分-可裂解部分-結合結構域或結合結構域-可裂解部分-遮蔽部分。根據本發明之醫藥組成物可尤其有益於賦予可活化抗體構築體以穩定性，其中該至少兩個結合結構域之至少兩個遮蔽部分之pI不同。舉例而言，一個遮蔽部分之pI可處於3至5、較佳3.5至4.5、更佳3.9至4.5之範圍內，而另一遮蔽部分之pI處於5.0至7.0、較佳5.5至6.0之範圍內。在此種情況下，通常發現將此種抗體構築體調配於根據本發明之醫藥組成物中可顯著減少該抗體構築體之聚集。通常，由於在低pH值下之相同質子化作用及根據本發明之醫藥組成物中的賦形劑的補充穩定功能，可顯著減少聚集(就高分子量(HMW)物質之百分比而言)，例如自約10%至約6%、5%、4%或甚至低於4%。通常發現在約4.2至4.8之pH值下，根據本發明之醫藥組成物中的HMW物質百分比低於4%。 較佳地，根據本發明之醫藥組成物之(溶液) pH值應低於根據本發明之抗體構築體之兩個或三個結構域中之任一者的pI，以使兩個結構域皆產生淨正電荷，從而在結構域間及結構域內皆產生排斥。pH值較佳為約4.0至5.5，更佳為4.2至4.8。 亦驚訝地發現，根據本發明之醫藥組成物可以高於預期之濃度包含根據本發明之抗體構築體。正常情況下，將如本文中所描述之抗體構築體儲存及/或僅以約1 mg/ml之濃度用於液體醫藥組成物中。在較高濃度下，觀察到聚集傾向。然而，如本文中所說明，較低pH值有助於靜電分子間及分子內排斥，從而降低聚集風險，並且可允許較高抗體構築體濃度，諸如1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0 mg/ml，而不存在(膠體)不穩定性。 進一步發現不含無機陰離子或包含無機陰離子之鹽(諸如氯化鈉)的本發明醫藥組成物較佳。較佳藉由庫存計量單位(SKU)內之非離子賦形劑(例如蔗糖)來調節本發明之醫藥組成物之張力。不希望受理論束縛，原因在於可藉由選擇充分不同於該分子之等電點的調配物pH值以便有利於如本文中所描述之靜電排斥而在物理上穩定蛋白質調配物。然而，可藉由與調配物中所存在之離子的相互作用來削弱此等排斥力。離子，特定言之無機陰離子，可減少或中和蛋白質表面之電荷，並且由於分子內排斥力減小而產生疏水性相互作用。因此，根據本發明之醫藥組成物較佳不含無機陰離子。所需緩衝化合物較佳僅包含有機陰離子，諸如麩胺酸根及/或乙酸根。因此，根據本發明之醫藥組成物較佳不含無機陰離子，諸如F- 、Cl- 、I- 及Br- 。特定言之，根據本發明之醫藥組成物較佳不含NaCl。 根據本發明之液體調配物中之抗體構築體的穩定性增加可有助於節省旨在獲得可儲存固體，亦即，乾燥醫藥組成物的昂貴而又費力之凍乾步驟。低pH值醫藥組成物亦可適於靜脈內投與。然而，在需要例如經皮下或經肌內投與時或在低pH值由於其他醫學原因而不可接受時，仍可由根據本發明之液體醫藥組成物獲得固體醫藥組成物。可在適合於所需投與形式或個體醫學需要之醫藥學上可接受之培養基中將如此獲得之凍乾物復原。另外，可藉由在低pH值下採用本發明之醫藥組成物來節省其他穩定劑，諸如Captisol®。 如本文中所提供之醫藥組成物使得所調配之雙特異性抗體構築體能夠穩定。評估調配參數對不同的雙特異性抗體構築體之影響顯示可視分子特徵，包括但不限於靶黏合劑中存在半衰期延長部分、IEP或cys夾鉗而將調配物最佳化。謹慎選擇如本文中所描述之最佳pH值及鹽含量非常重要。只要涉及穩定性，加速儲存條件下之恆溫長期穩定性研究與所研究之雙特異性抗體構築體之穩定性預測方法便有可能相關，如之前亦已對單株抗體所顯示。如本文中所描述之雙特異性抗體構築體在30℃長期儲存期間以及在穩定性預測方法期間為總體穩定的，使得所研究之參數之一部分保持相當穩定，使得發現相關性(包括例如DLS)具有挑戰性。藉由改變pH值及離子強度方面之調配條件，從而誘導雙特異性抗體對儲存及溫度應力之不同反應來補償此現象。然而，存在諸多穩定性預測方法，尤其是溫度勻變奈米DSF及溫度勻變DLS以及疏水性相互作用層析，其參數顯示與恆溫穩定性研究期間所評定之一些參數(例如次可見粒子計數、IF比率350 nm/330 nm及酸性電荷變異體之量)存在相當強且可理解之相關性。儘管如此，聚集之預測面臨諸多挑戰，因為線性降解動力學難以應用於長期穩定性，因此不排除具有延遲時間之隨機動力學以及由冷凍及解凍誘導之主要加速降解。如本文中所使用之穩定性預測技術提供對雙特異性抗體構築體在根據本發明之醫藥組成物中的穩定性的適用預測。 在本發明內，術語「穩定性」或「穩定」係關於醫藥組成物總體之穩定性，且特定言之係關於活性成分(亦即，雙特異性單鏈抗體構築體)本身之穩定性，特定言之，在調配、填充、運輸、儲存及投與期間。術語「穩定性」或「穩定」在本發明醫藥組成物及雙特異性單鏈抗體構築體之上下文中尤其係指減少或防止形成蛋白質聚集物(HMWS)。特定言之，術語「穩定性」亦係關於本文中所描述之醫藥組成物內所包含的雙特異性單鏈抗體構築體的膠體穩定性。「膠體穩定性」為膠體粒子(諸如蛋白質)保持分散在液體中持續較長時段(數天至數年)之能力。 如本文中所使用之術語「(蛋白質)聚集物」一般涵蓋較高分子量之蛋白質物質，諸如「寡聚體」或「多聚體」，而非所要限定物質(例如單體)。該術語在本文中可與術語「高分子量物質」及「HMWS」互換使用。蛋白質聚集物一般可在尺寸(介於小組合體(二聚體)至大組合體(次可見或甚至可見粒子)之範圍內且直徑在奈米至微米範圍內)、形態(大致球形至纖絲)、蛋白質結構(天然相對於非天然/變性)、分子間鍵結類型(共價相對於非共價)、可逆性及溶解度方面不同。可溶性聚集物涵蓋約1至100 nm之尺寸範圍，且蛋白質顆粒涵蓋次可見(~0.1-100 .m)及可見(＞100.m)範圍。該術語一般涵蓋所有上述類型之蛋白質聚集物。術語「(蛋白質)聚集物」因而係指兩種或更多種蛋白質單體之所有種類物理締合或化學連接之非天然種類。 術語「蛋白質聚集」或「非天然聚集」因而表示蛋白質分子組裝成由兩種或更多種蛋白質構成之複合物的過程，其中個別蛋白質表示為單體。導致蛋白質聚集之多種途徑可由多種條件誘導，包括溫度、機械應力(諸如振盪及攪拌)、泵抽、冷凍及/或解凍及調配。 溫度增加會加速化學反應，諸如蛋白質氧化及脫醯胺化，由此又可促進聚集。較高溫度亦在四級、三級及二級結構層面上直接影響蛋白質之構形，且可導致溫度誘導之解摺疊，從而可促進聚集。本申請案中所提及之溫度通常為長期儲存精緻蛋白質類藥物之深度冷凍溫度(-70℃)、正常冷凍溫度(-20℃)、冷藏溫度(4℃)、室溫(25℃)及生理溫度(37℃)。 在冷凍/解凍過程中，可由於複雜物理及化學變化，諸如產生新冰/溶液界面、吸附至容器表面、蛋白質及溶質低溫濃縮及由於緩衝組分結晶所致之pH值變化而發生蛋白變性及聚集。 蛋白質濃度增加亦可增強蛋白質聚集物之形成。在高蛋白質濃度下，發生巨分子擁擠，此術語用於描述巨分子溶質佔據高總體積對該溶液中各巨分子物質之特性的影響。根據此排外體積理論，可能有助於自組裝及因而可能聚集。 蛋白質液體調配物中往往需要抗微生物防腐劑，諸如苯甲醇及苯酚，以便在其儲存期限期間確保無菌，另外，多劑量調配物及某些藥物遞送系統，例如注射筆、微型泵及局部施用中需要抗微生物防腐劑。已報導許多防腐劑誘導蛋白質聚集，但尚未透徹理解潛在機制。已提出防腐劑結合至並填充易於聚集之解摺疊蛋白質狀態。 有利的是，設想本發明之醫藥組成物為穩定的，亦即，即使當經受應力(特定言之，熱應力)、儲存、表面誘導應力(諸如冷凍/解凍循環、起泡)、濃縮(藉由超濾及滲濾)或與諸如抗微生物防腐劑之有機化合物混合時保持不含或實質上不含蛋白質聚集物。較佳地，該醫藥組成物與所附實例中已評估評估之具有低pH值之組成物相比可具有類似或甚至改良之特徵。本發明之醫藥組成物較佳為基於蛋白質之藥物的均質溶液，諸如分散且較佳為單體雙特異性雙特異性抗體構築體。 本發明之上下文中設想提供一種適用於同時結合兩個(或更多個)不同的抗原的雙特異性(及/或多特異性)抗體的調配物。在某些實施例中，雙特異性抗體結合第一靶抗原，而第二抗原為表現一或多種FcR (例如FcγRIII)且執行一或多種可歸因於抗體Fc區之效應功能的效應細胞，亦即，白血球上所存在之細胞表面分子。抗體效應功能之實例包括但不限於Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體下調及B細胞活化。參與ADCC之效應細胞的實例包括但不限於細胞毒性T細胞、外周血單核細胞(PBMC)、天然殺手(NK)細胞、單核細胞及嗜中性球。 熟習此項技術者應瞭解，儘管該醫藥組成物有效地使活性成分(亦即，減少或抑制雙特異性抗體構築體形成蛋白質聚集物)穩定，但可能偶爾形成一些聚集物或構型異構物，然而實質上無損於醫藥組成物之總體可用性。在本文中，「實質上不含」聚集物意謂聚集物之量保持低於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1% (w/v)，尤其當亦經受環境應力時，例如，如所附實例中所評估。 尤其，Mahler等人,J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34已回顧用於確定可溶性及不溶性蛋白質聚集物之存在的方法。可藉由如所附實例中所描述之粒徑排阻超高效液相層析(SE-UPLC)來評估可溶性蛋白質聚集物之形成。SEC為用於對蛋白質聚集物進行偵測及定量的最常用分析方法之一。SEC分析允許用於聚集物之定尺寸及其定量。SEQ-UPLC允許對處於約5至1000 kDa之分子量範圍內的巨分子基於其形狀及尺寸進行選擇性快速分離。 蛋白質溶液顯示稱為蛋白光或混濁度之光學性質。溶液之光學性質隨所存在之分散及吸收光之粒子而變化。蛋白質為天然膠體，且水性調配物之混濁度視而蛋白質濃度、未溶解粒子之存在、粒度及每體積單位之粒子數而變化。混濁度可藉由UV-Vis光譜來量測為340至360 nm範圍內之光學密度且用於偵測可溶性及不溶性聚集物。 此外，藉由可視手段檢驗樣品仍為評定蛋白質聚集物之重要態樣。較佳根據德國醫藥法典(Deutscher Arzneimittel Codex；DAC)測試5對不存在或存在可見聚集物進行可視評估。 如本文中其他部分所闡述，設想本發明之醫藥組成物最可能在低pH值及其中視情況包含之其他穩定劑的作用下有利於增加雙特異性抗體構築體之膠體穩定性，且因而展現減少或甚至不存在之液相-液相分離(LLPS)。LLPS為熱力學驅動事件，其中均質蛋白質溶液在降低溫度時分離成貧蛋白質相(通常為上層)及富蛋白質相(通常為下層)。LLPS通常可簡單地藉由混合該兩相且升高溶液之溫度而完全逆轉。已將LLPS之出現歸因於短期吸引性蛋白質-蛋白質相互作用，使其成為蛋白質-蛋白質吸引強度之量度。已發現與不包含β-環糊精之醫藥組成物相比，根據本發明之包含β-環糊精之醫藥組成物在LLPS貧蛋白質相中包含較高濃度之雙特異性抗體構築體。因此，設想本發明之醫藥組成物在與對照物相比時展現減少之LLPS或完全不存在LLPS，且因而有助於增加本發明之雙特異性抗體構築體之膠體穩定性。可誘導LLPS，且可如所附實例中所描述來檢查不同相之蛋白質含量。 特定言之由於熱及/或化學變性所致之環境應力亦可導致構形變化，此又可能有利於聚集。令人驚訝的是，本發明之發明者發現雙特異性抗體構築體在構形變化方面亦得以穩定，如藉由量測芳族胺基酸之固有螢光發射強度所評估。本發明之醫藥組成物因此較佳亦減少或抑制構形異構物(亦即，非天然異常摺疊之蛋白質物質)之形成。 如先前所說明，本發明之穩定醫藥組成物包含經由第一結合結構域結合至靶細胞表面抗原且經由第二結合結構域結合至T細胞表面抗原CD3之雙特異性抗體構築體。 術語「抗體構築體」係指結構及/或功能為/基於抗體，例如全長或完整免疫球蛋白分子之結構及/或功能，及/或取自抗體或其片段之可變重鏈(VH)及/或可變輕鏈(VL)結構域的分子。因此抗體構築體能夠結合其特異性標靶或抗原。此外，根據本發明之抗體構築體之結合結構域包含抗體中允許標靶結合之最低結構要求。此最低要求可例如定義為至少存在三個輕鏈CDR (亦即，VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR (亦即，VH區之CDR1、CDR2及CDR3)，較佳存在所有六個CDR。用以定義抗體之最低結構要求的替代方法為分別定義特定標靶之結構內的抗體抗原決定基、標靶蛋白質中構成抗原決定基區(抗原決定基簇)之蛋白質結構域，或藉由參考與所定義之抗體之抗原決定基競爭的特定抗體。根據本發明之構築體所基於之抗體包括例如單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人類化抗體及人類抗體。 根據本發明之抗體構築體之結合結構域可例如包含以上提及之諸組CDR。彼等CDR較佳包含在抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)之構架中；然而，未必包含於兩者中。舉例而言，Fd片段具有兩個VH區，且通常在一定程度上保留完整抗原結合結構域之抗原結合功能。關於抗體片段、抗體變異體或結合結構域之形式的其他實例包括(1)具有VL、VH、CL及CH1結構域之單價片段Fab片段；(2)鉸鏈區中具有由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段F(ab')2 片段；(3) 具有兩個VH及CH1結構域之Fd片段；(4)具有抗體之單一臂之VL及VH結構域的Fv片段；(5)具有VH結構域之dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341 :544-546)；(6)經分離之互補性決定區(CDR)；及(7)單鏈Fv (scFv)，後者較佳(例如，來源於scFV庫)。根據本發明之抗體構築體之實施例的實例例如描述於WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910及WO 2015/048272中。 替代雙特異性抗原結合形式描述於例如美國專利申請公開案第2011/0054151號，該案係以引用之方式併入本文中。舉例而言，雙特異性抗原結合蛋白質可包含mAb-Fv形式，其中IgG抗體在C末端與Fv片段融合。替代地，可使用mAb-Fab形式，其中IgG抗體在C末端與Fab融合。mAb-Fab構築體含有CH及CL恆定域C末端- C末端Fv融合物，而mAb-Fv則不然。參見美國專利申請公開案第2011/0054151號之圖8。視情況，mAb-Fv及mAb-Fab構築體之N末端結合區缺乏輕鏈及CH1結構域(亦即，包含單結構域VHH區)。mAb-Fv及mAb-Fab構築體構築體含有三個可變區，使其二價結合第一抗原且單價結合第二抗原。適合之雙特異性抗原結合形式亦包括美國專利申請公開案第2011/0054151號中所描述之Fab-Fv及Fab-Fab構築體。Fab-Fv及Fab-Fab免疫球蛋白包含結合第一抗原之N末端Fab片段及結合第二抗原之C末端Fv或Fab片段。 異源二聚抗體較佳屬於IgG類別，該類別具有若干子類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，但亦預期IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。應理解，抗體亦可包含同型及/或子類之雜合物。舉例而言，涵蓋如以引用方式併入之美國專利公開案第2009/0163699號中所示之IgG1/G2雜合物之pI工程改造作為本發明之一部分。 全長抗體之片段，諸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab'、F(ab')2或「r IgG」(「半抗體」)亦在「結合結構域」或「結合……之結構域」之定義內。根據本發明之抗體構築體亦可包含經修飾之抗體片段，亦稱為抗體變異體，諸如scFv、二scFv或聯(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鏈、scFab、Fab2 、Fab3 、雙功能抗體、單鏈雙功能抗體、串聯雙功能抗體(Tandab)、串聯di-scFv、串聯三scFv；「多功能抗體」，諸如三功能抗體或四功能抗體；及與其他V區或結構域無關地特異性結合抗原或抗原決定基之單結構域抗體，諸如奈米抗體或僅包含一個可變域之單可變域抗體，該可變域可為VHH、VH或VL。 如本文中所使用，術語「單鏈Fv」、「單鏈抗體」或「scFv」係指包含來自於重鏈及輕鏈兩者之可變區但缺乏恆定區的單多肽鏈抗體片段。一般而言，單鏈抗體進一步包含介於VH與VL結構域之間的多肽連接子，從而使其能夠形成將允許抗原結合之所要結構。以下文獻詳細論述了單鏈抗體：Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York,第269-315頁(1994)。產生單鏈抗體之各種方法為已知的，包括以下文獻中所描述之彼等方法：美國專利第4,694,778號及第5,260,203號；國際專利申請公開案第WO 88/01649號；Bird (1988) Science 242:423-442；Huston等人, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Ward等人, (1989) Nature 334:54454；Skerra等人, (1988) Science 242:1038-1041。在特定實施例中，單鏈抗體亦可為雙特異性的、多特異性的、人類及/或人類化及/或合成的。 此外，術語「抗體構築體」之定義包括單價、二價及多價構築體及因而特異性結合僅兩個抗原結構之雙特異性構築體，以及多特異性構築體，其經由不同的結合結構域特異性結合超過兩個抗原結構，例如三個、四個或更多個。此外，術語「抗體構築體」之定義包括由僅一個多肽鏈組成之分子以及由超過一個多肽鏈組成之分子，該等鏈可為相同的(同源二聚體、同源三聚體或同源寡聚體)或不同的(異源二聚體、異源三聚體或異源寡聚體)。以上所鑑定之抗體及其變異體或衍生物之實例尤其描述於以下文獻中：Harlow及Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988)；及Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999)；Kontermann及Dübel, Antibody Engineering, Springer, 第2版, 2010；及Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009。 如本文中所使用之術語「雙特異性」係指「至少雙特異性」之抗體構築體，亦即，其至少包含第一結合結構域及第二結合結構域，其中該第一結合結構域結合一個抗原或標靶(在本文中：靶細胞表面抗原)，且該第二結合結構域結合另一抗原或標靶(例如CD3)。因此，根據本發明之抗體構築體包含針對至少兩個不同的抗原或標靶的特異性。舉例而言，第一結構域較佳不結合如本文中所描述之一或多種物質之CD3ε之細胞外抗原決定基。術語「靶細胞表面抗原」係指由細胞表現且存在於細胞表面從而對如本文中所描述之抗體構築體而言可及之抗原結構。其可為蛋白質，較佳為蛋白質之細胞外部分或碳水化合物結構，較佳為蛋白質之碳水化合物結構，諸如糖蛋白。其較佳為腫瘤抗原。術語本發明之「雙特異性抗體構築體」亦涵蓋多特異性抗體構築體，諸如三特異性抗體構築體，後者包括三個結合結構域，或具有超過三個(例如四個、五個)特異性之構築體。 如本文中所理解之雙特異性抗體及/或抗體構築體包括但不限於傳統雙特異性免疫球蛋白(例如BsIgG)、包含附加抗原結合結構域之IgG (例如輕鏈或重鏈之胺基或羧基末端連接至其他抗原結合結構域，諸如單結構域抗體或配對抗體可變域(例如Fv或scFv))、BsAb片段(例如雙特異性單鏈抗體)、雙特異性融合蛋白質(例如與效應部分融合之抗原結合結構域)及BsAb結合物。參見例如Spiess等人, Molecular Immunology 67(2) Part A: 97-106 (2015)，該文獻描述各種雙特異性形式並且係以引用之方式併入本文中。雙特異性構築體之實例包括但不限於雙功能抗體、單鏈雙功能抗體、串聯scFv、雙特異性T細胞銜接子(BiTE)形式(由連接子接合之兩個單鏈可變片段(scFv)組成的融合蛋白質)及Fab2雙特異性，以及包含全長抗體之經工程改造之構築體。參見例如Chames及Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9；以及Holliger及Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136；Wu等人, 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297；Michaelson等人, 2009, mAbs 1[2]:128-141；國際專利公開案第2009032782號及第2006020258號；Zuo等人, 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367；美國專利申請公開案第20020103345號；Shen等人, 2006, J Biol Chem 281[16]:10706-10714；Lu等人, 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672；以及Kontermann, 2012 MAbs 4(2):182，所有文獻均明確併入本文中。 鑒於根據本發明之抗體構築體為(至少)雙特異性的，其並非天然存在的且其顯著不同於天然存在之產物。「雙特異性」抗體構築體或免疫球蛋白因此為具有至少兩個不同的結合位點的人工雜交抗體或免疫球蛋白，該等結合位點具有不同的特異性。雙特異性抗體構築體可藉由多種方法產生，包括融合雜交瘤或連接Fab'片段。參見例如Songsivilai及Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)。 本發明之抗體構築體之至少兩個結合結構域及可變域(VH/VL)可能包含或可能不包含肽連接子(間隔肽)。根據本發明，術語「肽連接子」包含本發明抗體構築體之一個(可變及/或結合)結構域之胺基酸序列與另一(可變及/或結合)結構域之胺基酸序列藉以與彼此連接之胺基酸序列。肽連接子亦可用於融合本發明抗體構築體之第三結構域與其他結構域。此種肽連接子之基本技術特徵為其不包含任何聚合活性。適合之肽連接子為美國專利4,751,180及4,935,233或WO 88/09344中所描述之彼等肽連接子。肽連接子亦可用於連接其他結構域或模組或區域(諸如半衰期延長結構域)與本發明之抗體構築體。 本發明之抗體構築體較佳為「活體外產生之抗體構築體」。此術語係指根據以上定義之抗體構築體，其中在非免疫細胞選擇，例如活體外噬菌體呈現、蛋白質晶片或任何其他方法中產生可變區整體或一部分(例如至少一個CDR)，其中可測試候選序列結合抗原之能力。此術語因而較佳不包括僅藉由在動物之免疫細胞中進行基因組重排產生之序列。「重組抗體」為藉由使用重組DNA技術或基因工程改造所製造之抗體。 如本文中所使用之術語「單株抗體」(mAb)或單株抗體構築體係指獲自實質上均質之抗體群體的抗體，亦即，構成群體之個別抗體除了可能以微量存在之可能天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)以外為相同的。與通常包括針對不同決定子(或抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相反，單株抗體對抗原上之單一抗原位點或決定子具有高度特異性。除其特異性以外，單株抗體之有利之處在於其係藉由雜交瘤培養來合成，因此未受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特徵為獲自實質上均質之抗體群體，而不應被視為需要藉由任何特定方法來產生抗體。 為了製備單株抗體，獲得由連續細胞株培養產生之抗體的任何技術均可使用。舉例而言，欲使用之單株抗體可藉由Koehler等人, Nature, 256: 495 (1975)首先描述之雜交瘤方法來製造，或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)來製造。用於產生人類單株抗體之其他技術的實例包括三源雜交瘤(trioma)技術、人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72)及EBV雜交瘤技術(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)。 隨後可使用標準方法，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)及表面電漿子共振(BIACORE™)分析以鑑定產生特異性結合指定抗原之抗體的一或多種雜交瘤來篩檢雜交瘤。任何形式之相關抗原均可用作免疫原，例如重組抗原、天然存在之形式、其任何變異體或片段，以及其抗原性肽。如BIAcore系統中所使用之表面電漿子共振可用於增加結合靶細胞表面抗原之抗原決定基的噬菌體抗體的效率(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105；Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13)。 另一種製造單株抗體之例示性方法包括篩檢蛋白質表現庫，例如噬菌體呈現庫或核糖體呈現庫。噬菌體呈現描述於例如以下文獻中：Ladner等人, 美國專利第5,223,409號；Smith (1985) Science 228:1315-1317；Clackson等人, Nature, 352: 624-628 (1991)；及Marks等人, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)。 除了使用呈現庫以外，可使用相關抗原使非人類動物，例如囓齒動物(諸如小鼠、倉鼠、兔或大鼠)免疫。在一個實施例中，非人類動物包括人類免疫球蛋白基因之至少一部分。舉例而言，有可能用人類免疫球蛋白(Ig)基因座之大片段對缺乏小鼠抗體產生之小鼠品系進行工程改造。可使用雜交瘤技術產生來源於具有所要特異性之基因的抗原特異性單株抗體並且加以選擇。參見例如XENOMOUSE™；Green等人, (1994) Nature Genetics 7:13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096；及WO 96/33735。 亦可自非人類動物獲得單株抗體，隨後使用此項技術中已知的重組DNA技術加以修飾，例如人類化、去免疫化、致使嵌合等。經修飾之抗體構築體之實例包括非人類抗體之人類化變異體、「親和力成熟」抗體(參見例如Hawkins等人, J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992)；及Lowman等人, Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991))及具有改變之效應功能的抗體突變體(參見例如美國專利5,648,260；Kontermann及Dübel (2010),同上 ；及Little (2009),同上 )。 在免疫學上，親和力成熟為B細胞在免疫反應之過程中產生對抗原具有增加之親和力的抗體的過程。利用重複曝露於同一抗原，宿主將產生具有依次更大親和力之抗體。如同天然原型，活體外親和力成熟係基於突變及選擇原理。活體外親和力成熟已成功用於最佳化抗體、抗體構築體及抗體片段。使用輻射、化學誘變劑或易出錯PCR在CDR內引入隨機突變。另外，可藉由鏈改組來增加基因多樣性。使用呈現方法(如噬菌體呈現)進行兩輪或三輪突變及選擇通常產生親和力處於低奈莫耳範圍內之抗體片段。 抗體構築體之較佳胺基酸取代變異類型包括取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步開發之所得變異體相對於產生其之親本抗體將具有改良之生物學性質。產生此種取代變異體之便利途徑涉及使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡而言之，使若干個高變區位點(例如6至7個位點)突變以便在各位點處產生所有可能之胺基酸取代。如此產生之抗體變異體由絲狀噬菌體粒子以單價方式呈現為與包裝在各粒子內之M13之基因III產物的融合物。隨後如本文中所揭示來篩檢噬菌體呈現變異體之生物學活性(例如結合親和力)。為了鑑定用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑定顯著有助於抗原結合之高變區殘基。替代地，或另外，分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑定結合結構域與例如人類靶細胞表面抗原之間的接觸點可能為有益的。根據本文中詳述之技術，此種接觸殘基及相鄰殘基為取代候選物。一旦產生此種變異體，便如本文中所描述對一組變異體進行篩檢，且可選擇在一或多種相關分析中具有優越性質之抗體以供用於進一步開發。 特定言之，本發明之單株抗體及抗體構築體包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分為/與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體以及此種抗體之片段中的相應序列一致或同源，只要其展現所要生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984))。本文中之相關嵌合抗體包括包含來源於非人類靈長類動物(例如，舊大陸猴、猿等)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列的「靈長類化」抗體。已描述製造嵌合抗體之多種方法。參見例如Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81:6851, 1985；Takeda等人, Nature 314:452, 1985；Cabilly等人, 美國專利第4,816,567號；Boss等人, 美國專利第4,816,397號；Tanaguchi等人, EP 0171496；EP 0173494；及GB 2177096。 亦可藉由以例如WO 98/52976或WO 00/34317中所揭示之方法特異性缺失人類T細胞抗原決定基(稱為「去免疫化」之方法)來對抗體、抗體構築體、抗體片段或抗體變異體進行修飾。簡而言之，可分析抗體重鏈及輕鏈可變域中結合第II類MHC之肽；此等肽表示潛在T細胞抗原決定基(如WO 98/52976及WO 00/34317中所定義)。為了偵測潛在T細胞抗原決定基，可應用稱為「肽穿線」之電腦模型化方法，另外，可如WO 98/52976及WO 00/34317中所描述在人類第II類MHC結合肽之資料庫中檢索VH及VL序列中所存在之基序。此等基序結合18種主要第II類MHC DR異型中之任一種，且因而構成潛在T細胞抗原決定基。可藉由取代可變域中較少數目之胺基酸殘基或較佳藉由單一胺基酸取代來消除所偵測之潛在T細胞抗原決定基。通常進行保守取代。通常但並非排他性地，可使用對人類生殖系抗體序列中之某一位置常見之胺基酸。人類生殖系序列揭示於例如以下文獻中：Tomlinson等人, (1992) J. MoI. Biol. 227:776-798；Cook, G.P.等人, (1995) Immunol. Today 第16卷(5): 237-242；及Tomlinson等人, (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638。V BASE目錄提供了人類免疫球蛋白可變區序列之詳盡目錄(由英國劍橋之蛋白質工程改造中心(Centre for Protein Engineering，MRC)的Tomlinson, LA.等人編輯)。此等序列可用作人類序列來源，例如，用於構架區及CDR。亦可使用一致人類構架區，例如，如美國專利第6,300,064號中所描述。 「人類化」抗體、抗體構築體、其變異體或片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F (ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)為主要人類序列之抗體或免疫球蛋白，其含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列。在很大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自於受體高變區(亦即CDR)之殘基由來自於具有所要特異性、親和力及容量之諸如小鼠、大鼠、倉鼠或兔之非人類(例如囓齒動物)物種(供體抗體)之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基由相應非人類殘基置換。此外，如本文中所使用之「人類化抗體」亦可包含既未在受體抗體中又未在供體抗體中發現之殘基。進行此等修飾以進一步改善及最佳化抗體效能。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人, Nature, 321: 522-525 (1986)；Reichmann等人, Nature, 332: 323-329 (1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)。 可藉由用來自於人類Fv可變域之等價序列置換不直接參與抗原結合之Fv可變域序列來產生人類化抗體或其片段。以下文獻提供了用於產生人類化抗體或其片段之例示性方法：Morrison (1985) Science 229:1202-1207；Oi等人, (1986) BioTechniques 4:214；以及US 5,585,089、US 5,693,761、US 5,693,762、US 5,859,205及US 6,407,213。彼等方法包括分離、操縱及表現編碼來自於重鏈或輕鏈中之至少一者的免疫球蛋白Fv可變域之整體或一部分的核酸序列。此種核酸可獲自如以上所描述之產生針對預定標靶之抗體的雜交瘤以及來自其他來源。隨後可將編碼人類化抗體分子之重組DNA選殖至適當表現載體中。 亦可使用轉殖基因動物，諸如表現人類重鏈及輕鏈基因但不能夠表現內源小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因之小鼠來產生人類化抗體。Winter描述了可用於製備本文中所描述之人類化抗體的例示性CDR移植方法(美國專利第5,225,539號)。可用非人類CDR之至少一部分置換特定人類抗體之所有CDR，或可用非人類CDR置換僅一些CDR。僅必需置換人類化抗體與預定抗原結合所需數目之CDR。 可藉由引入保守取代、一致序列取代、生殖系取代及/或回復突變來將人類化抗體最佳化。可藉由此項技術中已知的若干技術中之任一種來製造此種經改變之免疫球蛋白分子(例如Teng等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983；Kozbor等人, Immunology Today, 4: 7279, 1983；Olsson等人, Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982；及EP 239 400)。 術語「人類抗體」、「人類抗體構築體」及「人類結合結構域」包括具有實質上對應於此項技術中已知的人類生殖系免疫球蛋白序列，包括例如Kabat等人(1991)( 同上 .) 所描述之彼等人類生殖系免疫球蛋白序列的諸如可變區或可變域及恆定區或恆定域之抗體區域的抗體、抗體構築體及結合結構域。本發明之人類抗體、抗體構築體或結合結構域可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)，例如在CDR中且特定言之，在CDR3中。人類抗體、抗體構築體或結合結構域可能有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多個位置經並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基置換。然而，如本文中所使用之人類抗體、抗體構築體及結合結構域之定義亦涵蓋「完全人類抗體」，其僅包括抗體，如可藉由使用諸如Xenomouse之技術或系統獲得之彼等抗體的未經人工及/或基因改變之人類序列。「完全人類抗體」較佳不包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基。 在一些實施例中，本發明之抗體構築體為「經分離」或「實質上純」之抗體構築體。「經分離」或「實質上純」當用於描述本文中所揭示之抗體構築體時意謂已自其產生環境之組分鑑定、分離及/或回收之抗體構築體。抗體構築體較佳不或實質上不與其產生環境之所有其他組分締合。其產生環境之污染組分，諸如由重組轉染細胞引起之污染組分為通常將干擾多肽之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。抗體構築體可例如構成指定樣品中之總蛋白質的至少約5重量%或至少約50重量%。應理解，經分離之蛋白質可構成總蛋白質含量之5重量%至99.9重量%，視情況而定。可藉由使用可誘導啟動子或高表現啟動子以顯著較高之濃度製造多肽，從而以增加之濃度水準製造多肽。該定義包括在此項技術中已知的多種生物體及/或宿主細胞中產生抗體構築體。在較佳實施例中，會將抗體構築體純化至(1)足以藉由使用旋杯式定序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(2)均質，藉由使用考馬斯藍或較佳銀染色在非還原或還原條件下進行SDS-PAGE。然而，一般將藉由至少一個純化步驟來製備經分離之抗體構築體。 結合本發明，術語「結合結構域」表徵與靶分子(抗原)上之指定靶抗原決定基或指定靶位點，分別例如CD33及CD3 (特異性)結合/相互作用/識別之結構域。第一結合結構域(識別例如CD33)之結構及功能且第二結合結構域(識別CD3)之結構及/或功能較佳亦為/基於抗體，例如全長或完整免疫球蛋白分子之結構及/或功能，及/或為/取自抗體或其片段之可變重鏈(VH)及/或可變輕鏈(VL)結構域。第一結合結構域較佳以存在三個輕鏈CDR (亦即，VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR (亦即，VH區之CDR1、CDR2及CDR3)為特徵。第二結合結構域較佳亦包含抗體中允許標靶結合之最低結構要求。第二結合結構域更佳至少包含三個輕鏈CDR (亦即，VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR (亦即，VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。設想藉由噬菌體呈現或庫篩檢方法而非藉由將來自於預先存在之(單株)抗體的CDR序列移植至支架中來產生或獲得第一及/或第二結合結構域。 根據本發明，結合結構域呈一或多種多肽之形式。此種多肽可包括蛋白質部分及非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑，諸如戊二醛)。蛋白質(包括其片段，較佳為生物學活性片段，及肽，通常具有少於30個胺基酸)包含兩個或更多個經由共價肽鍵彼此偶聯(從而產生胺基酸鏈)之胺基酸。 如本文中所使用之術語「多肽」描述一組通常由超過30個胺基酸組成之分子。多肽可進一步形成多聚體，諸如二聚體、三聚體及較高寡聚體，亦即，由超過一個多肽分子組成。形成此種二聚體、三聚體等之多肽分子可能相同或不相同。此種多聚物之相應高階結構因此稱為同源或異源二聚體、同源或異源三聚體等。異源三聚體之實例為抗體分子，在其天然存在之形式下，其由兩個相同輕多肽鏈及兩個相同重多肽鏈組成。術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」亦係指天然經修飾之肽/多肽/蛋白質，其中該修飾受例如轉譯後修飾，如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾影響。「肽」、「多肽」或「蛋白質」在本文中提及時亦可經化學修飾，諸如聚乙二醇化。此種修飾在此項技術中為熟知的且描述於下文中。 結合靶細胞表面抗原之結合結構域及/或結合CD3ε之結合結構域較佳為人類結合結構域。包含至少一個人類結合結構域之抗體及抗體構築體避免與具有非人類諸如囓齒動物(例如鼠類、大鼠、倉鼠或兔)可變及/或恆定區之抗體或抗體構築體相關的一些問題。存在此種囓齒動物來源之蛋白質可導致抗體或抗體構築體快速清除，或可導致患者對抗體或抗體構築體產生免疫反應。為了避免使用囓齒動物來源之抗體或抗體構築體，可藉由將人類抗體功能引入至囓齒動物中使得該囓齒動物產生完全人類抗體來產生人類或完全人類抗體/抗體構築體。 在YAC中選殖及重建兆鹼基尺寸之人類基因座並且將其引入小鼠生殖系中之能力提供了闡明非常大或粗略定位之基因座之功能組分以及產生人類疾病之適用模型的有效方法。此外，使用此種技術將小鼠基因座取代為其人類等效物可提供關於發育期間對人類基因產物之表現及調控、其與其他系統之通訊及其在疾病誘導及進展中之涉入的見解。 此種策略之重要實際應用為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入已使內源Ig基因不活化之小鼠中提供了研究抗體程式性表現及組裝之基礎機制以及其在B細胞發育中之作用的機會。此外，此種策略可提供產生完全人類單株抗體(mAb)之理想來源，此對於滿足抗體療法有望用於人類疾病而言為一個重要里程碑。預期完全人類抗體或抗體構築體可將小鼠或小鼠衍生化mAb固有之免疫原性及過敏性反應減至最小且因而增加所投與之抗體/抗體構築體的效力及安全性。預期使用完全人類抗體或抗體構築體可在需要重複化合物投與之慢性及復發性人類疾病，諸如炎症、自體免疫性及癌症的治療中提供實質性優勢。 針對此目標之一種方法為對缺乏具有人類Ig基因座大片段之小鼠抗體產生的小鼠品系進行工程改造，預期此種小鼠將產生人類抗體之大譜系而不存在小鼠抗體。大人類Ig片段將保留大可變基因多樣性以及對抗體產生及表現之適當調控。藉由利用抗體多樣化及選擇以及對人類蛋白質缺乏免疫耐受性之小鼠機制，此等小鼠品系中再現之人類抗體譜系將產生針對任何相關抗原，包括人類抗原之高親和力抗體。使用雜交瘤技術可容易地產生並選擇具有所要特異性之抗原特異性人類mAb。結合第一XenoMouse小鼠品系之產生來說明此一般策略(參見Green等人, Nature Genetics 7:13-21 (1994))。利用酵母人工染色體(YAC)對含有人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之245 kb及190 kb大小之生殖系構形片段的XenoMouse品系進行工程改造，該等基因座分別含有核心可變及恆定區序列。已證明含有YAC之人類Ig與用於重排及表現抗體之小鼠系統相容且能夠取代不活化之小鼠Ig基因。此由其能夠誘導B細胞發育、產生完全人類抗體之類成年人類譜系及產生抗原特異性人類mAb來證明。此等結果亦表明引入含有眾多V基因、其他調控元件及人類Ig恆定區之人類Ig基因座之較大部分可能實質上概括對感染及免疫之人類體液反應所特有的完整譜系。Green等人之工作最近延伸至藉由分別引入人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之兆鹼基大小之生殖系構形YAC片段而引入超過約80%之人類抗體譜系。參見Mendez等人, Nature Genetics 15:146-156 (1997)及美國專利申請案序號08/759,620。 XenoMouse小鼠之產生進一步論述並描繪於以下文獻中：美國專利申請案序號07/466,008、序號07/610,515、序號07/919,297、序號07/922,649、序號08/031,801、序號08/112,848、序號08/234,145、序號08/376,279、序號08/430,938、序號08/464,584、序號08/464,582、序號08/463,191、序號08/462,837、序號08/486,853、序號08/486,857、序號08/486,859、序號08/462,513、序號08/724,752及序號08/759,620；及美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號及第5,939,598號；以及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號。亦參見Mendez等人, Nature Genetics 15:146-156 (1997)；以及Green及Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)；EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310及WO 03/47336。 在替代方法中，其他人(包括GenPharm International, Inc.)已利用「微型基因座」方法。在微型基因座方法中，藉由包括來自於Ig基因座之小片(個別基因)來模擬外源Ig基因座。因而，將一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、μ恆定區及第二恆定區(較佳為γ恆定區)形成為構築體以便插入動物中。此方法描述於以下文獻中：美國專利第5,545,807號，其係頒予Surani等人；及美國專利第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號及第6,255,458號，該等專利中之每一者係頒予Lonberg及Kay；美國專利第5,591,669號及第6,023,010號，該兩專利係頒予Krimpenfort及Berns；美國專利第5,612,205號、第5,721,367號及第5,789,215號，該等專利係頒予Berns等人；以及美國專利第5,643,763號，該專利係頒予Choi及Dunn；以及GenPharm International美國專利申請案序號07/574,748、序號07/575,962、序號07/810,279、序號07/853,408、序號07/904,068、序號07/990,860、序號08/053,131、序號08/096,762、序號08/155,301、序號08/161,739、序號08/165,699、序號08/209,741。亦參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852及WO 98/24884，以及美國專利第5,981,175號。進一步參見Taylor等人, (1992)；Chen等人, (1993)；Tuaillon等人, (1993)；Choi等人, (1993)；Lonberg等人,(1994)；Taylor等人, (1994)；及Tuaillon等人, (1995)；Fishwild等人, (1996)。 Kirin亦已顯示由已藉由微細胞融合而引入染色體大片或整個染色體之小鼠產生人類抗體。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號。Xenerex Biosciences正在開發一種可能產生人類抗體之技術。在此技術中，用人類淋巴細胞，例如B及/或T細胞來重建SCID小鼠。隨後用抗原使小鼠免疫且可對該抗原產生免疫反應。參見美國專利第5,476,996號、第5,698,767號及第5,958,765號。 人類抗小鼠抗體(HAMA)反應已引導行業製備嵌合抗體或以其他方式人類化之抗體。然而，預期將觀察到某些人類抗嵌合抗體(HACA)反應，尤其在長期或多劑量利用抗體時。因而，將需要提供包含針對靶細胞表面抗原之人類結合結構域及針對CD3ε之人類結合結構域以便消除HAMA或HACA反應之影響及/或效應的抗體構築體。 根據本發明，術語「(特異性)結合」、「(特異性)識別」、「(特異性)針對」及「與……(特異性)反應」意謂結合結構域與靶分子(抗原) (在本文中分別為靶細胞表面抗原及CD3ε)上之指定抗原決定基或指定靶位點相互作用或特異性相互作用。 術語「抗原決定基」係指抗原上與諸如抗體或免疫球蛋白之結合結構域或者抗體或免疫球蛋白之衍生物、片段或變異體特異性結合的位點。「抗原決定基」為抗原的，且因而術語抗原決定基在本文中有時亦稱為「抗原結構」或「抗原決定子」。因而，結合結構域為「抗原相互作用位點」。該結合/相互作用亦可理解為定義「特異性識別」。 「抗原決定基」可由連續胺基酸或因蛋白質之三級摺疊而毗鄰的非連續胺基酸形成。「線性抗原決定基」為胺基酸一級序列包含所識別之抗原決定基的抗原決定基。線性抗原決定基通常在單一序列中包括至少3個或至少4個且更通常至少5個或至少6個或至少7個，例如約8至約10個胺基酸。 與線性抗原決定基相反，「構形抗原決定基」為其中包含該抗原決定基之胺基酸的一級序列並非所識別之抗原決定基的惟一定義組分的抗原決定基(例如，其中胺基酸之一級序列未必被結合結構域識別之抗原決定基)。通常，相對於線性抗原決定基，構形抗原決定基包含增加數目之胺基酸。就識別構形抗原決定基而言，結合結構域識別抗原，較佳肽或蛋白質或其片段之三維結構(在本發明之上下文中，針對該等結合結構域之一的抗原結構包含在靶細胞表面抗原蛋白質內)。舉例而言，當蛋白質分子摺疊以形成三維結構時，形成構形抗原決定基之某些胺基酸及/或多肽骨架變得毗鄰，使得抗體能夠識別該抗原決定基。測定抗原決定基構形之方法包括但不限於X射線結晶學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜以及定點自旋標記及電子順磁共振(EPR)光譜。 以下描述抗原決定基定位方法：當人類靶細胞表面抗原蛋白質中之區域(連續胺基酸區段)交換/置換為非人類且非靈長類靶細胞表面抗原(例如，小鼠靶細胞表面抗原，但亦可能設想如雞、大鼠、倉鼠、兔等之其他動物)之其相應區域時，預期結合結構域之結合會發生減少，除非該結合結構域可與所使用之非人類非靈長類靶細胞表面抗原交叉反應。相較於與人類靶細胞表面抗原蛋白質中相應區域之結合，該減少較佳為至少10%、20%、30%、40%或50%；更佳為至少60%、70%或80%，且最佳為90%、95%或甚至100%，其中與人類靶細胞表面抗原蛋白質中之相應區域的結合設定為100%。設想在CHO細胞中表現上述人類靶細胞表面抗原/非人類靶細胞表面抗原嵌合體。亦設想使人類靶細胞表面抗原/非人類靶細胞表面抗原嵌合體與不同膜結合蛋白質，諸如EpCAM之跨膜域及/或胞質域融合。 在替代或額外抗原決定基定位方法中，可產生人類靶細胞表面抗原細胞外域之若干截短型式，以便確定結合結構域所識別之特定區域。在此等截短型式中，自N末端開始逐步缺失不同的細胞外靶細胞表面抗原結構域/次結構域或區域。設想可在CHO細胞中表現截短之靶細胞表面抗原型式。亦設想可使截短之靶細胞表面抗原型式與不同膜結合蛋白質，諸如EpCAM之跨膜域及/或胞質域融合。亦設想截短之靶細胞表面抗原型式可涵蓋處於其N末端之信號肽結構域，例如來源於小鼠IgG重鏈信號肽之信號肽。此外，設想截短之靶細胞表面抗原型式可涵蓋處於其N末端之v5結構域(在信號肽之後)，從而允許驗證其正確表現於細胞表面上。預期不再涵蓋結合結構域所識別之靶細胞表面抗原區的彼等截短之靶細胞表面抗原型式將發生結合減少或損失。結合減少較佳為至少10%、20%、30%、40%、50%，更佳為至少60%、70%、80%，且最佳為90%、95%或甚至100%，其中與整個人類靶細胞表面抗原蛋白質(或其細胞外區或域)之結合設定為100。 另一種確定靶細胞表面抗原之特定殘基對由抗體構築體或結合結構域識別之貢獻的方法為丙胺酸掃描(參見例如Morrison KL及Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001年6月;5(3):302-7)，其中藉由丙胺酸置換欲分析之各殘基，例如經由定點突變誘發。使用丙胺酸，此係由於其不龐大、化學上惰性卻模擬許多其他胺基酸具有之二級結構參考物的甲基官能基。在需要保留突變殘基之尺寸的情況下，有時可使用龐大胺基酸，諸如纈胺酸或白胺酸。丙胺酸掃描為已使用較長時期之成熟技術。 結合結構域與抗原決定基或包含抗原決定基之區域之間的相互作用默示結合結構域對特定蛋白質或抗原上(在此：分別為靶細胞表面抗原及CD3)之抗原決定基或包含抗原決定基之區域展現明顯親和力，且一般而言，與除靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原不展現顯著反應性。「明顯親和力」包括以約10-6 M (KD)或更強之親和力結合。較佳地，當結合親和力為約10-12 至10-8 M、10-12 至10-9 M、10-12 至10-10 M、10-11 至10-8 M，較佳為約10-11 至10-9 M時，結合被視為具有特異性。可尤其藉由比較該結合結構域同靶蛋白質或抗原之反應與該結合結構域同除靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原之反應而容易地測試結合結構域是否特異性地與標靶反應或結合。較佳地，本發明之結合結構域基本上或實質上不結合除靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原(亦即，第一結合結構域不能夠結合除靶細胞表面抗原以外之蛋白質，且第二結合結構域不能夠結合除CD3以外之蛋白質)。根據本發明之抗體構築體的設想特徵為與其他HLE形式相比具有優越親和力。結果，此種優越親和力表明延長之活體內半衰期。根據本發明之抗體構築體之較長半衰期可減少持續時間及投與頻率，通常有助於改良患者順應性。此具有特殊重要性，因為本發明之抗體構築體尤其有益於非常虛弱或甚至多病之癌症患者。 術語「基本上/實質上不結合」或「不能夠結合」意謂本發明之結合結構域不結合除靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原，亦即，與除靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原顯示不超過30%，較佳不超過20%，更佳不超過10%，尤佳不超過9%、8%、7%、6%或5%之反應性，其中與靶細胞表面抗原或CD3之結合分別設定為100%。 據信特異性結合受結合結構域及抗原之胺基酸序列中的特異性基序影響。因而，由於其一級、二級及/或三級結構以及由於對該等結構之二級修飾而達成結合。抗原相互作用位點與其特異性抗原之間的特異性相互作用可引起該位點與該抗原簡單結合。此外，抗原相互作用位點與其特異性抗原之間的特異性相互作用可替代地或另外引發信號，例如，由於誘導抗原構形變化、抗原寡聚等。 術語「可變」係指在其序列中展現可變性且參與決定特定抗體之特異性及結合親和力的抗體或免疫球蛋白域部分(亦即，「可變域」)。可變重鏈(VH)與可變輕鏈(VL)配對在一起形成單一抗原結合位點。 可變性不均勻分佈在抗體之可變域中；其集中於重鏈及輕鏈可變區各自之次結構域中。此等次結構域稱為「高變區」或「互補性決定區」(CDR)。可變域之更保守(亦即，非高變)部分稱為「構架」區(FRM或FR)，且在三維空間中為六個CDR提供支架以形成抗原結合表面。天然存在之重鏈及輕鏈可變域各自包含四個FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，大部分採用β片構形，由三個高變區連接，由此形成環連接，且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之高變區由FRM維持緊密鄰近，且與來自於另一鏈之高變區一起促成抗原結合位點之形成(參見Kabat等人,同上 )。 術語「CDR」及其複數係指互補性決定區，其中三個組成輕鏈可變區之結合特徵(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)且三個組成重鏈可變區之結合特徵(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)。CDR含有大部分負責抗體與抗原之特異性相互作用且因此有助於抗體分子之功能活性的殘基：其為抗原特異性之主要決定子。 準確定義CDR邊界及長度服從不同的分類及編號系統。CDR可因此稱為Kabat、Chothia、接觸或任何其他邊界定義，包括本文中所描述之編號系統。儘管邊界不同，但此等系統各自在構成可變序列內之所謂「高變區」中具有一定程度之重疊。根據此等系統之CDR定義可因此在長度及關於相鄰構架區之邊界面積方面不同。參見例如Kabat (基於跨物種序列變異性之方法)、Chothia (基於對抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法)及/或MacCallum (Kabat等人,同上 ；Chothia等人, J. MoI. Biol, 1987, 196: 901-917；及MacCallum等人, J. MoI. Biol, 1996, 262: 732)。用於表徵抗原結合位點之再另一個標準為Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體所使用之AbM定義。參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Antibody Engineering Lab Manual (Duebel, S.及Kontermann, R.編, Springer-Verlag, Heidelberg)。在兩種殘基鑑定技術定義重疊區域而非相同區域之程度上，可將其組合以定義雜交CDR。然而，根據所謂Kabat系統之編號較佳。 通常，CDR形成可分類為典型結構之環結構。術語「典型結構」係指採用抗原結合(CDR)環之主鏈構形。根據比較結構研究，已發現六個抗原結合環中有五個僅具有有限譜系之可利用構形。可藉由多肽骨架之扭角來表徵各典型結構。抗體之間的對應環可因此具有非常類似之三維結構，但大部分環中存在高胺基酸序列變異性(Chothia及Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901；Chothia等人, Nature, 1989, 342: 877；Martin及Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800)。此外，所採用之環結構與圍繞其之胺基酸序列之間有關係。特定典型類別之構形由環之長度及處於環內關鍵位置上以及保守構架內(亦即，環外)之胺基酸殘基決定。因此可基於此等關鍵胺基酸殘基之存在而分配至特定典型類別。 術語「典型結構」亦可包括關於抗體線性序列之考慮，例如，如Kabat (Kabat等人,同上 )中所編錄。Kabat編號方案(系統)為用於按一貫方式對抗體可變域之胺基酸殘基進行編號的廣泛採用之標準，並且為本發明中所應用且亦在本文中之其他部分提及之較佳方案。其他結構考慮亦可用於確定抗體之典型結構。舉例而言，Kabat編號未充分體現之彼等差異可由Chothia等人及/或其他技術，例如結晶學及二維或三維電腦建模所揭示之編號系統加以描述。因此，可將指定抗體序列置入典型類別中，從而尤其允許鑑定適當框架序列(例如，基於庫中包括多種典型結構之需要)。抗體胺基酸序列之Kabat編號及如Chothia等人, 同上所描述之結構考慮及其解釋抗體結構之典型態樣的含義描述於文獻中。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維構形為此項技術中眾所周知的。關於抗體結構之綜述，參見Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow等人編, 1988。 輕鏈CDR3且尤其是重鏈CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內之抗原結合中的最重要決定子。在一些抗體構築體中，重鏈CDR3看似構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。僅僅CDR3可變之活體外選擇方案可用於改變抗體之結合性質或決定有助於抗原結合之殘基。因此，CDR3通常為抗體結合位點內之分子多樣性的最大來源。舉例而言，H3可短達兩個胺基酸殘基，或多於26個胺基酸。 在經典全長抗體或免疫球蛋白中，各輕(L)鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重(H)鏈，而兩個H鏈藉由一或多個二硫鍵彼此連接，視H鏈同型而定。通常將最鄰近於VH之CH結構域指定為CH1。恆定(「C」)域不直接參與抗原結合，但展現各種效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。抗體之Fc區包含在重鏈恆定域內且例如能夠與位於細胞表面之Fc受體相互作用。 抗體之基因序列在組裝及體細胞突變之後高度可變，且據估計此等變化之基因編碼1010 種不同的抗體分子(Immunoglobulin Genes, 第2版, Jonio等人編, Academic Press, San Diego, CA, 1995)。因此，免疫系統提供免疫球蛋白譜系。術語「譜系」係指完全或部分來源於編碼至少一種免疫球蛋白之至少一個序列的至少一個核苷酸序列。可藉由對重鏈之V、D及J區段以及輕鏈之V及J區段進行活體內重排來產生序列。替代地，可由響應於重排發生例如活體外刺激之細胞產生序列。替代地，可藉由DNA剪接、核苷酸合成、突變誘發及其他方法來獲得部分或所有序列，參見例如美國專利5,565,332。譜系可包括僅一個序列，或可包括複數個序列，包括基因多樣化集合中之序列。 結合本發明，術語「Fc部分」或「Fc單體」意謂包含至少一個具有免疫球蛋白分子之CH2結構域之功能的結構域及至少一個具有CH3結構域之功能的結構域的多肽。如自術語「Fc單體」顯而易見，包含彼等CH結構域之多肽為「多肽單體」。Fc單體可為包含除重鏈第一恆定區免疫球蛋白域(CH1)以外之免疫球蛋白恆定區之至少一個片段但至少維持一個CH2結構域之功能部分及一個CH3結構域之功能部分的多肽，其中該CH2結構域相對於該CH3結構域為胺基末端。在此定義之較佳態樣中，Fc單體可為包含Ig-Fc鉸鏈區、CH2區及CH3區之一部分的多肽恆定區，其中該鉸鏈區相對於該CH2結構域為胺基末端。設想本發明之鉸鏈區促進二聚。可藉由例如而不限於對免疫球蛋白區進行木瓜蛋白酶消化(固然獲得兩個Fc多肽之二聚體)來獲得此種Fc多肽分子。在此定義之另一態樣中，Fc單體可為包含CH2區及CH3區之一部分的多肽區。可藉由例如而不限於對免疫球蛋白分子進行胃蛋白酶消化來獲得此種Fc多肽分子。在一個實施例中，Fc單體之多肽序列實質上類似於以下各項之Fc多肽序列：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區、IgG3 Fc區、IgG4 Fc區、IgM Fc區、IgA Fc區、IgD Fc區及IgE Fc區。(參見例如Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993))。因為免疫球蛋白之間存在一些變化且僅出於澄清之目的，Fc單體係指IgA、IgD及IgG之最後兩個重鏈恆定區免疫球蛋白域以及IgE及IgM之最後三個重鏈恆定區免疫球蛋白域。如所提及，Fc單體亦可包括此等結構域之N末端的可撓性鉸鏈。對於IgA及IgM，Fc單體可包括J鏈。對於IgG，Fc部分包含免疫球蛋白域CH2及CH3以及處於前兩個結構域與CH2之間的鉸鏈。雖然Fc部分之邊界可變化，包含功能鉸鏈、CH2及CH3結構域之人類IgG重鏈Fc部分的實例可定義為例如包含鉸鏈結構域之殘基D231 (對應於以下表1中之D234)至P476 (對應於CH3結構域羧基末端之L476 (對於IgG4 ))，其中編號係根據Kabat。經由肽連接子彼此融合之兩個Fc部分或Fc單體定義本發明之抗體構築體的第三結構域，該第三結構域亦可定義為scFc結構域。 在本發明之一個實施例中，設想如本文中所揭示之scFc結構域，對應於彼此融合之Fc單體，僅包含在抗體構築體之第三結構域中。 根據本發明，可使用表1中所示之Kabat編號藉由類比來鑑定IgG鉸鏈區。根據以上，設想本發明之鉸鏈域/區包含對應於IgG1 序列區段之胺基酸殘基D234至P243，根據Kabat編號。同樣設想本發明之鉸鏈域/區包含IgG1鉸鏈序列DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 1449) (對應於如以下表1中所示之區段D234至P243；亦設想該序列之變化，限制條件為鉸鏈區仍促進二聚)或由其組成。在本發明之較佳實施例中，藉由N314X取代移除抗體構築體之第三結構域中的CH2結構域之Kabat位置314處之糖基化位點，其中X為除Q以外之任何胺基酸。該取代較佳為N314G取代。在一更佳實施例中，該CH2結構域另外包含以下取代(根據Kabat之位置) V321C及R309C (此等取代在Kabat位置309及321處引入結構域內半胱胺酸二硫橋)。 亦設想本發明之抗體構築體之第三結構域按胺基至羧基順序包含以下各項或由其組成：DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 1449) (亦即，鉸鏈)-CH2-CH3-連接子-DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 1449) (亦即，鉸鏈)-CH2-CH3。在一較佳實施例中，上述抗體構築體之肽連接子以胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，亦即Gly4 Ser (SEQ ID NO: 1)或其聚合物，亦即(Gly4 Ser)x為特徵，其中x為5或更大之整數(例如5、6、7、8等或更大)，較佳為6 ((Gly4Ser)6)。該構築體可進一步包含上述取代N314X，較佳N314G，及/或其他取代V321C及R309C。在如本文中之前所定義之本發明抗體構築體的較佳實施例中，設想第二結構域結合人類及/或獼猴CD3ε鏈之細胞外抗原決定基。 表1：鉸鏈區之胺基酸殘基的Kabat編號 在本發明之其他實施例中，鉸鏈域/區包含IgG2亞型鉸鏈序列ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 1450)、IgG3亞型鉸鏈序列ELKTPLDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 1451)或ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 1458)及/或IgG4亞型鉸鏈序列ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 1452)或由其組成。IgG1亞型鉸鏈序列可為以下序列EPKSCDKTHTCPPCP (如表1中所示且為SEQ ID NO: 1459)。因而亦設想此等核心鉸鏈區在本發明之範圍內。 可使用如表2中所示之Kabat編號藉由類比來鑑定IgG CH2及IgG CD3結構域之位置及序列： 表2：IgG CH2及CH3區之胺基酸殘基的Kabat編號 在本發明之一個實施例中，第一或兩個Fc單體之CH3結構域中之加重粗體胺基酸殘基被缺失。 第三結構域之多肽單體(「Fc部分」或「Fc單體」)藉以與彼此融合之肽連接子較佳包含至少25個胺基酸殘基(25、26、27、28、29、30等)。此肽連接子更佳包含至少30個胺基酸殘基(30、31、32、33、34、35等)。連接子包含至多40個胺基酸殘基亦較佳，更佳包含至多35個胺基酸殘基，最佳剛好包含30個胺基酸殘基。此種肽連接子之較佳實施例以胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，亦即Gly4 Ser (SEQ ID NO: 1)或其聚合物，亦即(Gly4 Ser)x為特徵，其中x為5或更大之整數(例如6、7或8)。該整數較佳為6或7，該整數更佳為6。 在使用連接子使第一結構域與第二結構域或使第一或第二結構域與第三結構域融合之情況下，此連接子較佳具有足以確保該第一結構域及該第二結構域各自可彼此獨立地保留其差異性結合特異性的長度及序列。對於本發明之抗體構築體中連接至少兩個結合結構域(或兩個可變域)之肽連接子，僅包含少量胺基酸殘基，例如12個胺基酸殘基或更少之彼等肽連接子較佳。因而，具有12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基之肽連接子較佳。具有少於5個胺基酸之設想肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸，其中富Gly連接子較佳。用於融合該第一結構域與該第二結構域之肽連接子的較佳實施例描繪於SEQ ID NO:1中。用於融合該第二結構域與該第三結構域之肽連接子的較佳連接子實施例為(Gly)4 連接子，對應於G4 連接子。 在以上所描述之「肽連接子」之一的情況下，尤佳「單一」胺基酸為Gly。因此，該肽連接子可由單一胺基酸Gly組成。在本發明之較佳實施例中，肽連接子係以胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，亦即Gly4 Ser (SEQ ID NO: 1)或其聚合物，亦即(Gly4 Ser)x為特徵，其中x為1或更大之整數(例如2或3)。較佳連接子描繪於SEQ ID NO: 1至12中。該肽連接子之特徵，包括不促進二級結構，在此項技術中為已知的，且描述於例如以下文獻中：Dall'Acqua等人(Biochem. (1998) 37, 9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol (1992) 29, 21-30)；以及Raag及Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)。此外不促進任何二級結構之肽連接子較佳。可例如藉由如實例中所描述進行基因工程改造來提供該等結構域與彼此之鍵聯。製備融合且可操作地連接之雙特異性單鏈構築體並且在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法在此項技術中為眾所周知的(例如WO 99/54440；或Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001)。 在抗體構築體或本發明之較佳實施例中，該第一結構域與該第二結構域形成呈選自由以下各項組成之群的形式的抗體構築體：(scFv)2 、scFv-單結構域mAb、雙功能抗體及彼等形式中之任一種的寡聚物 根據一尤佳實施例且如所附實例中所記錄，本發明之抗體構築體的該第一結構域及該第二結構域為「雙特異性單鏈抗體構築體」，更佳為雙特異性「單鏈Fv」(scFv)。雖然Fv片段之兩個結構域VL及VH係由單獨的基因編碼，但其可使用重組方法藉由如上文所描述之合成連接子接合，使其能夠製成單一蛋白質鏈中，其中VL及VH區配對以形成單價分子；參見例如Huston等人, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883)。使用熟習此項技術者已知的習知技術來獲得此等抗體片段，且用與完整或全長抗體相同的方式來評估該等片段之功能。單鏈可變片段(scFv)因此為通常用約10至約25個胺基酸、較佳約15至20個胺基酸之短連接肽連接免疫球蛋白之重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)的融合蛋白質。連接子通常富含甘胺酸(出於可撓性之目的)以及絲胺酸或蘇胺酸(出於溶解度之目的)，並且可連接VH之N末端與VL之C末端，或相反。此蛋白質保留原始免疫球蛋白之特異性，但移除恆定區且引入連接子。 雙特異性單鏈抗體構築體在此項技術中為已知的且描述於以下文獻中：WO 99/54440；Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970；Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025；Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197；Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103；Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426；Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56。所描述之用於產生單鏈抗體的技術(尤其參見美國專利4,946,778；Kontermann及Dübel (2010),同上 ；及Little (2009),同上 )可能適於產生特異性識別所選擇之標靶的單鏈抗體構築體。 可藉由連接兩個scFv分子(例如，用如上文所描述之連接子)對雙價(亦稱為二價)或雙特異性單鏈可變片段(具有形式(scFv)2 之雙scFv或二scFv)進行工程改造。若此兩個scFv分子具有相同結合特異性，則所得(scFv)2 分子較佳將稱為雙價的(亦即，其對同一靶抗原決定基具有兩個原子價)。若兩個scFv分子具有不同的結合特異性，則所得(scFv)2 分子較佳將稱為雙特異性的。可藉由產生具有兩個VH區及兩個VL區之單一肽鏈來進行連接，從而產生串聯scFv (參見例如Kufer P.等人,(2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244)。另一種可能性為產生連接肽對使兩個可變區摺疊在一起而言過短(例如約五個胺基酸)之scFv分子，從而迫使scFv二聚。此類型稱為雙功能抗體(參見例如Hollinger, Philipp等人, (1993年7月) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8)。 根據本發明，第一結構域、第二結構域或第一結構域與第二結構域可包含單結構域抗體，對應於單結構域抗體之可變域或至少CDR。單結構域抗體僅包含一個能夠選擇性地結合特定抗原而與其他V區或結構域無關的(單體)抗體可變域。對來自於在駱駝中發現之重鏈抗體的第一單結構域抗體進行工程改造，且此等稱為VH H片段。軟骨魚類亦具有可獲得稱為VNAR 片段之單結構域抗體的重鏈抗體(IgNAR)。替代方法為將來自於普通免疫球蛋白，例如來自於人類或囓齒動物之二聚可變域拆分成單體，因此獲得呈單結構域Ab形式之VH或VL。雖然對單結構域抗體之大部分研究目前係基於重鏈可變域，但來源於輕鏈之奈米抗體亦已顯示特異性結合靶抗原決定基。單結構域抗體之實例稱為sdAb、奈米抗體或單可變域抗體。 (單結構域mAb)2 因此為由(至少)兩個單結構域單株抗體構成之單株抗體構築體，該等單結構域單株抗體係單獨選自包含VH 、VL 、VH H及VNAR 之群。連接子較佳呈肽連接子形式。類似地，「scFv單結構域mAb」為由至少一個如以上所描述之單結構域抗體及一個如以上所描述之scFv分子構成的單株抗體構築體。再次，連接子較佳呈肽連接子形式。 可在競爭分析，諸如競爭ELISA或基於細胞之競爭分析中量測抗體構築體是否與另一指定抗體構築體競爭結合。亦可使用親和素偶聯之微粒(珠粒)。與經親和素塗佈之ELISA板類似，當與生物素化蛋白質反應時，此等珠粒中之每一者均可用作可在上面進行分析之基質。將抗原塗佈至珠粒上，隨後用第一抗體預塗佈。添加第二抗體且測定任何附加結合。可能之讀出手段包括流式細胞術。 T細胞或T淋巴細胞為一種在細胞免疫中起重要作用之淋巴細胞(本身為一種白血球)。T細胞存在若干子集，各自具有不同的功能。T細胞與其他淋巴細胞，諸如B細胞及NK細胞之不同之處可能在於細胞表面上存在T細胞受體(TCR)。TCR負責識別與主要組織相容性複合物(MHC)分子結合之抗原且係由兩個不同的蛋白質鏈構成。在95%之T細胞中，TCR由α (alpha)及β (beta)鏈組成。當TCR與抗原肽及MHC (肽/MHC複合物)接合時，經由相關酶、共同受體、專門化銜接分子及活化或釋放之轉錄因子介導的一系列生物化學事件來活化T淋巴細胞。 CD3受體複合物為蛋白質複合物且由四個鏈構成。在哺乳動物中，該複合物含有CD3γ (gamma)鏈、CD3δ (delta)鏈及兩個CD3ε (epsilon)鏈。此等鏈與T細胞受體(TCR)及所謂ζ (zeta)鏈締合以形成T細胞受體CD3複合物並且在T淋巴細胞中產生活化信號。CD3γ (gamma)、CD3δ (delta)及 CD3ε (epsilon)鏈為含有單一細胞外免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族的高度相關細胞表面蛋白質。CD3分子之細胞內尾部含有稱為免疫受體酪胺酸活化基序或簡稱ITAM之單一保守基序，其對TCR之信號傳導能力為必需的。CD3ε分子為人類中由處於染色體11上之CD3E 基因編碼之多肽。CD3ε之最佳抗原決定基包含在人類CD3ε細胞外域之胺基酸殘基1-27內。設想根據本發明之抗體構築體通常且適宜顯示較少非特異性T細胞活化，特異性免疫療法中不需要該非特異性T細胞活化。此性質轉譯為副作用風險降低。. 經由以多特異性、至少雙特異性抗體構築體募集T細胞對靶細胞進行重定向溶解包括細胞溶解突觸形成以及遞送穿孔素及顆粒酶。接合之T細胞能夠進行連續靶細胞溶解，且不受干擾肽抗原處理及呈現或純系T細胞分化之免疫逃避機制影響；參見例如WO 2007/042261。 可用多種方式量測由本發明之抗體構築體介導之細胞毒性。效應細胞可為例如經刺激之經富集(人類) CD8陽性T細胞或未受刺激之(人類)外周血單核細胞(PBMC)。若靶細胞具有獼猴起源或者表現或轉染有第一結構域所結合之獼猴靶細胞表面抗原，則效應細胞亦將獼猴起源，諸如獼猴T細胞株，例如4119LnPx。靶細胞將表現(至少細胞外域)靶細胞表面抗原，例如人類或獼猴靶細胞表面抗原。靶細胞可為穩定或瞬時轉染有靶細胞表面抗原，例如人類或獼猴靶細胞表面抗原之細胞株(諸如CHO)。替代地，靶細胞可為靶細胞表面抗原陽性天然表現細胞株。通常，預期在細胞表面上表現較高水準之靶細胞表面抗原的靶細胞株的情況下，EC50 值較低。效應因子與靶細胞(E:T)比率通常為約10:1，但亦可變化。可在51 Cr釋放分析(培育時間約18小時)中或在基於FACS之細胞毒性分析(培育時間約48小時)中量測靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體之細胞毒性活性。亦可能更改分析培育時間(細胞毒性反應)。量測細胞毒性之其他方法對熟習此項技術者為熟知的，且包括MTT或MTS分析、基於ATP之分析(包括生物發光分析)、磺酸基玫瑰紅B (SRB)分析、WST分析、選殖原性分析及ECIS技術。 較佳在基於細胞之細胞毒性分析中量測由本發明之靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體介導之細胞毒性活性。亦可在51 Cr釋放分析中對其進行量測。其係由EC50 值表示，對應於半最大有效濃度(誘導介於基線與最大值之間的細胞毒性反應的抗體構築體濃度)。靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體之EC50 值較佳≤5000 pM或≤4000 pM，更佳≤3000 pM或≤2000 pM，甚至更佳≤1000 pM或≤500 pM，甚至更佳≤400 pM或≤300 pM，甚至更佳≤200 pM，甚至更佳≤100 pM，甚至更佳≤50 pM，甚至更佳≤20 pM或≤10 pM，且最佳≤5 pM。 可在不同的分析中量測以上給出之EC50 值。熟習此項技術者意識到可預期當使用經刺激/富集之CD8+ T細胞作為效應細胞時，與未受刺激之PBMC相比，EC50 值較低。此外，可預期當靶細胞表現較高數目之靶細胞表面抗原時，與低標靶表現大鼠相比，EC50 值較低。舉例而言，當使用經刺激/富集之人類CD8+ T細胞作為效應細胞(且使用靶細胞表面抗原轉染之細胞(諸如CHO細胞)或靶細胞表面抗原陽性人類細胞株作為靶細胞)時，靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體之EC50 值較佳≤1000 pM，更佳≤500 pM，甚至更佳≤250 pM，甚至更佳≤100 pM，甚至更佳≤50 pM，甚至更佳≤10 pM，且最佳≤5 pM。當使用人類PBMC作為效應細胞時，靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體之EC50 值較佳≤5000 pM或≤4000 pM (特定言之，當靶細胞為靶細胞表面抗原陽性人類細胞株)時，更佳≤2000 pM (特定言之當靶細胞為靶細胞表面抗原轉染之細胞，諸如CHO細胞時)，更佳≤1000 pM或≤500 pM，甚至更佳≤200 pM，甚至更佳≤150 pM，甚至更佳≤100 pM，且最佳≤50 pM，或更低。當使用獼猴T細胞株，諸如LnPx4119作為效應細胞且使用獼猴靶細胞表面抗原轉染之細胞株，諸如CHO細胞作為靶細胞株時，靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體之EC50 值較佳≤2000 pM或≤1500 pM，更佳≤1000 pM或≤500 pM，甚至更佳≤300 pM或≤250 pM，甚至更佳≤100 pM，且最佳≤50 pM。 本發明之靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體較佳不誘導/介導靶細胞表面抗原陰性細胞，諸如CHO細胞之溶解或基本上不誘導/介導溶解。術語「不誘導溶解」、「基本上不誘導溶解」、「不介導溶解」或「基本上不介導溶解」意謂本發明之抗體構築體誘導或介導不超過30%、較佳不超過20%、更佳不超過10%、尤佳不超過9%、8%、7%、6%或5%之靶細胞表面抗原陰性細胞溶解，其中靶細胞表面抗原陽性人類細胞株之溶解設定為100%。此通常適用於至多500 nM之抗體構築體濃度。熟習此項技術者已知如何在不會更麻煩之情況下量測細胞溶解。此外，本說明書教示如何量測細胞溶解之特定說明。 個別靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體之單體與二聚同功型之間的細胞毒性活性差異稱為「效能差距」。此效能間隙可例如計算為分子單體形式與二聚形式之EC50 值之間的比率。本發明之靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體的效能間隙較佳≤5，更佳≤4，甚至更佳≤3，甚至更佳≤2且最佳≤1。 本發明之抗體構築體之第一及/或第二(或任何其他)結合結構域較佳對哺乳綱靈長類之成員具有跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施例，第一結合結構域及/或第二結合結構域除分別結合人類靶細胞表面抗原及人類CD3以外亦將結合靈長類，包括(但不限於)新大陸靈長類(諸如白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴)、舊大陸靈長類(諸如狒狒及獼猴)、長臂猿及非人類人亞科之靶細胞表面抗原/CD3。 在本發明之抗體構築體的一個實施例中，第一結構域結合人類靶細胞表面抗原且進一步結合獼猴靶細胞表面抗原，諸如食蟹獼猴之靶細胞表面抗原，且更佳結合獼猴細胞表面上所表現之獼猴靶細胞表面抗原。第一結合結構域對獼猴靶細胞表面抗原之親和力較佳≤15 nM，更佳≤10 nM，甚至更佳≤5 nM，甚至更佳≤1 nM，甚至更佳≤0.5 nM，甚至更佳≤0.1 nM，且最佳≤0.05 nM或甚至≤0.01 nM。 較佳地，根據本發明之抗體構築體對結合獼猴靶細胞表面抗原相對於人類靶細胞表面抗原[獼猴靶細胞表面抗原:人類靶細胞表面抗原]之親和力差距＜100，較佳＜20，更佳＜15，又較佳＜10，甚至更佳＜8，更佳＜6且最佳＜2。根據本發明之抗體構築體對結合獼猴靶細胞表面抗原相對於人類靶細胞表面抗原之親和力差距的較佳範圍介於0.1與20之間，更佳介於0.2與10之間，甚至更佳介於0.3與6之間，甚至更佳介於0.5與3之間或介於0.5與2.5之間，且最佳介於0.5與2之間或介於0.6與2之間。 本發明之抗體構築體的第二(結合)結構域結合人類CD3ε及/或獼猴CD3ε。在一較佳實施例中，該第二結構域更結合白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3ε。白鬢狨及棉冠獠狨均為屬於狨科之新大陸靈長類動物，而松鼠猴為屬於捲尾猴科之新大陸靈長類動物。 對於本發明之抗體構築體而言較佳的是結合人類及/或獼猴CD3上之細胞外抗原決定基的第二結構域包含有包含選自以下之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的VL區： (a) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 27中所描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 28中所描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 29中所描繪之CDR-L3； (b) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 117中所描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 118中所描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 119中所描繪之CDR-L3；以及 (c) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 153中所描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 154中所描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 155中所描繪之CDR-L3。 在本發明之抗體構築體的亦較佳實施例中，結合人類及/或獼猴CD3ε鏈之細胞外抗原決定基的第二結構域包含有包含選自以下之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的VH區： (a) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 12中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 13中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 14中所描繪之CDR-H3； (b) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 30中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 31中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 32中所描繪之CDR-H3； (c) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 48中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 49中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 50中所描繪之CDR-H3； (d) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 66中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 67中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 68中所描繪之CDR-H3； (e) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 84中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 85中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 86中所描繪之CDR-H3； (f) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 102中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 103中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 104中所描繪之CDR-H3； (g) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 120中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 121中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 122中所描繪之CDR-H3； (h) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 138中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 139中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 140中所描繪之CDR-H3； (i) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 156中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 157中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 158中所描繪之CDR-H3；以及 (j) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 174中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 175中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 176中所描繪之CDR-H3。 在本發明之抗體構築體之較佳實施例中，將以上所描述之三組VL CDR與以上所描述之十組VH CDR組合在第二結合結構域內從而形成(30)組，每一組包含CDR-L 1-3及CDR-H 1-3。 對於本發明之抗體構築體而言，較佳的是結合CD3之第二結構域包含選自由以下各項組成之群的VL區：如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183中所描繪或如SEQ ID NO: 13中所描繪之VL區。 亦較佳的是結合CD3之第二結構域包含選自由以下各項組成之群的VH區：如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中所描繪或如SEQ ID NO: 14中所描繪之VH區。 更佳地，本發明之抗體構築體係以結合CD3之第二結構域包含選自由以下各項組成之群的VL區及VH區為特徵： (a) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 17或21中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 15或19中所描繪之VH區； (b) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 35或39中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 33或37中所描繪之VH區； (c) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 53或57中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 51或55中所描繪之VH區； (d) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 71或75中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 69或73中所描繪之VH區； (e) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 89或93中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 87或91中所描繪之VH區； (f) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 107或111中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 105或109中所描繪之VH區； (g) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 125或129中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 123或127中所描繪之VH區； (h) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 143或147中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 141或145中所描繪之VH區； (i) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 161或165中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 159或163中所描繪之VH區；以及 (j) 如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 179或183中所描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO: 177或181中所描繪之VH區。 關於本發明之抗體構築體，亦較佳的是結合CD3之第二結構域包含如SEQ ID NO: 13中所描繪之VL區及如SEQ ID NO: 14中所描繪之VH區。 根據本發明之抗體構築體之較佳實施例，第一結構域及/或第二結構域具有以下形式：VH區與VL區之配對呈單鏈抗體(scFv)形式。VH區及VL區按VH-VL或VL-VH順序排列。較佳VH區位於連接子序列之N末端，而VL區位於連接子序列之C末端。 以上所描述之本發明抗體構築體的較佳實施例係以結合CD3之第二結構域包含選自由WO 2008/119567之SEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187組成之群或者如SEQ ID NO: 15中所描繪之胺基酸序列為特徵。 本發明之範疇內亦包括對抗體構築體進行共價修飾，且一般但並非始終在轉譯後進行。舉例而言，藉由使抗體構築體之特定胺基酸殘基與能夠同所選側鏈或者N或C末端殘基反應之有機衍生化劑反應而將抗體構築體之若干種共價修飾引入分子中。 半胱胺醯基殘基最通常與α-鹵基乙酸酯(及相應胺)，諸如氯乙酸或氯乙醯胺反應，得到羧基甲基或羧基醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑醯基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應而得以衍生化。 藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應對組胺醯基殘基進行衍生化，因為此試劑相對而言對組胺醯基側鏈具有特異性。對溴苯甲醯甲基溴亦適用；該反應較佳在pH 6.0之0.1 M二甲胂酸鈉溶液中進行。使離胺醯基及胺基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酐反應。利用此等試劑進行衍生化具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。其他適用於衍生化含α-胺基之殘基的試劑包括醯亞胺基酯，諸如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；及轉胺酶催化之與乙醛酸之反應。 藉由與一或若干種習知試劑反應來修飾精胺醯基殘基，該等試劑中有苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚三酮。精胺酸殘基之衍生化需要在鹼性條件下進行反應，因為存在高pKa之胍官能基。此外，此等試劑可與離胺酸基團以及精胺酸ε-胺基反應。 可對酪胺醯基殘基進行特定修飾，尤其令人感興趣的是藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最通常分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。使用125 I或131 I對酪胺醯基殘基進行碘化以製備經標記之蛋白質，以供用於放射免疫分析，以上所描述之氯胺T方法為適合的。 藉由與碳化二亞胺(R'—N=C=N--R')反應對羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)進行選擇性修飾，其中R及R'視情況為不同的烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，藉由與銨離子反應將天冬胺醯基及麩胺醯基殘基轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。 用雙官能試劑進行衍生化適用於使本發明之抗體構築體與水不溶性支撐基質或表面交聯以供用於多種方法中。通常使用之交聯劑包括例如1,1-雙(二疊氮乙醯基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸之酯；同雙官能醯亞胺基酯，包括二琥珀醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)及雙官能馬來醯亞胺，諸如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷。諸如3-[(對疊氮基苯基)二硫]丙醯胺甲酯之衍生化劑產生能夠在光存在下形成交聯的光活化中間物。替代地，採用諸如溴化氰活化之碳水化合物之反應性水不溶性基質及如美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中所描述之反應性基質進行蛋白質固定。 麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基往往脫去醯胺基而分別成為相應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。替代地，在輕度酸性條件下使此等殘基脫去醯胺基。此等殘基之任一種形式均屬於本發明之範疇內。 其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或酥胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, 第79-86頁)、N末端胺之乙醯化及任何C末端羧基之醯胺化。 本發明之範疇所包括的對抗體構築體之另一種類型共價修飾包括改變蛋白質之糖基化模式。如此項技術中已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或者產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下論述特定表現系統。 多肽之糖基化通常為N連接型或O連接型。N連接型係指碳水化合物部分附接至天冬醯胺酸殘基側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為針對碳水化合物部分與天冬醯胺酸側鏈之酶促附接的識別序列。因而，多肽中存在此等三肽序列中之任一者皆可產生潛在糖基化位點。O連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。 糖基化位點添加至抗體構築體宜藉由改變胺基酸序列以使其含有以上所描述之三肽序列中的一或多個來實現(對於N連接型糖基化位點)。該變化亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加或取代至起始序列來進行(對於O連接型糖基化位點)。為簡便起見，較佳藉由DNA層級上之變化，特定言之藉由使編碼多肽之DNA在預選鹼基處突變以便產生將轉譯成所要胺基酸之密碼子來改變抗體構築體之胺基酸序列。 增加抗體構築體上之碳水化合物部分的數目的另一種手段為藉由使糖苷與蛋白質發生化學或酶促偶聯。此等程序之有利之處在於其不需要在宿主細胞中產生具有糖化能力以用於N連接型或O連接型糖基化的蛋白質。視所使用之偶聯模式而定，糖可附接至(a)精胺酸及組胺酸；(b)游離羧基；(c)游離硫氫基，諸如半胱胺酸之彼等硫氫基；(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等游離羥基；(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基；或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330以及Aplin及Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., 第259-306頁中。 移除起始抗體構築體上所存在之碳水化合物部分可用化學或酶促方式實現。化學去糖基化需要使蛋白質曝露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯基葡萄糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)以外之大部分或所有糖裂解，而保持多肽完整。Hakimuddin等人, 1987,Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人, 1981,Anal. Biochem. 118:131描述了化學去糖基化。可藉由如Thotakura等人, 1987, Meth. Enzymol. 138:350所描述使用各種內切糖苷酶及外切糖苷酶來達成多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解。可藉由如Duskin等人, 1982, J. Biol. Chem. 257:3105所描述使用化合物衣黴素來防止潛在糖基化位點處之糖基化。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵聯之形成。 本文中亦涵蓋抗體構築體之其他修飾。舉例而言，抗體構築體之另一類型共價修飾包括以美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所闡述之方式將抗體構築體連接至各種非蛋白質聚合物，包括但不限於各種聚醇，諸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇共聚物。另外，如此項技術中已知，可在抗體構築體內之不同位置上進行胺基酸取代，例如，以便有助於添加諸如PEG之聚合物。 在一些實施例中，本發明之抗體構築體之共價修飾包括添加一或多個標記。標記基團可經由不同長度之間隔臂與抗體構築體偶聯以減小潛在空間位阻。用於標記蛋白質之各種方法在此項技術中為已知的且可用於進行本發明。術語「標記」或「標記基團」係指任何可偵測標記。一般而言，標記屬於多種類別，視將偵測其之分析法而定，以下實例包括但不限於： a) 同位素標記，其可為放射性同位素或重同位素，諸如放射性同位素或放射性核種(例如3 H、14 C、15 N、35 S、89 Zr、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I) b) 磁性標記(例如磁性粒子) c) 氧化還原活性部分 d) 光學染料(包括但不限於發色團、磷光體及螢光團)，諸如螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、化學發光基團及可為「小分子」螢光團或蛋白質螢光團之螢光團 e) 酶基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶) f) 生物素化基團 g) 由第二報告基因識別之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈配對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤等) 「螢光標記」意謂可經由其固有螢光性質加以偵測之任何分子。適合之螢光標記包括但不限於螢光素、若丹明、四甲基若丹明、曙紅、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石綠、二苯乙烯、螢蝦黃、瀑布藍J、得克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC紅705、奧勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布藍、瀑布黃及R-藻紅素(PE) (Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、若丹明及得克薩斯紅(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7 (Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。適合之光學染料，包括螢光團，描述於Richard P. Haugland之Molecular Probes Handbook中。 適合之蛋白質螢光標記亦包括但不限於綠色螢光蛋白，包括海腎、海筆或水母屬GFP (Chalfie等人, 1994,Science 263:802-805)、EGFP (Clontech Laboratories, Inc.，Genbank登錄號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies, Inc.，1801 de Maisonneuve Blvd. West，8th Floor，Montreal，Quebec，Canada H3H 1J9；Stauber, 1998,Biotechniques 24:462-471；Heim等人, 1996,Curr. Biol. 6:178-182)、增強型黃色螢光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories., Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人, 1993,J. Immunol. 150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5,292,658號、第5,418,155號、第5,683,888號、第5,741,668號、第5,777,079號、第5,804,387號、第5,874,304號、第5,876,995號、第5,925,558號)。 本發明之抗體構築體亦可包含例如有助於分離該分子或有關於改適該分子之藥物動力學概況的其他結構域。有助於分離抗體構築體之結構域可選自可在分離方法，例如分離管柱中加以俘獲之肽基元或後期引入部分。此種其他結構域之非限制性實施例包括稱為Myc標籤、HAT標籤、HA標籤、TAP標籤、GST標籤、幾丁質結合結構域(CBD標籤)、麥芽糖結合蛋白質( MBP標籤)、Flag標籤、Strep標籤及其變異體(例如StrepII標籤)以及His標籤之肽基元。所有本文中所揭示之以所鑑定之CDR為特徵的抗體構築體均可包含His標籤結構域，該結構域一般稱為分子胺基酸序列中連續His殘基，較佳五個且更佳六個His殘基(六組胺酸)之重複單元。His標籤可例如位於抗體構築體之N末端或C末端處，其較佳位於C末端。最佳地，六組胺酸標籤(HHHHHH) (SEQ ID NO:16)經由肽鍵連接至根據本發明之抗體構築體的C末端。另外，可將PLGA-PEG-PLGA結合物系統與聚組胺酸標籤組合以用於持續釋放應用及達成改良之藥物動力學概況。 亦涵蓋本文中所描述之抗體構築體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體構築體之結合親和力及/或其他生物學性質。藉由將適當之核苷酸變化引入抗體構築體核酸中或藉由肽合成來製備抗體構築體之胺基酸序列變異體。所有以下所描述之胺基酸序列修飾均將產生仍保留未修飾親本分子之所要生物活性(結合靶細胞表面抗原及CD3)的抗體構築體。 術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」通常係指具有其得到技術認可之定義的胺基酸，諸如選自由以下各項組成之群的胺基酸：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺酸(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(Val或V)，但需要時可使用經修飾之胺基酸、合成胺基酸或稀有胺基酸。一般而言，胺基酸可分組為具有非極性側鏈(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；帶負電側鏈(例如Asp、Glu)；帶正電側鏈(例如Arg、His、Lys)；或不帶電極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp及Tyr)。 胺基酸修飾包括例如抗體構築體之胺基酸序列內的殘基的缺失及/或插入及/或取代。對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構築體，限制條件為該最終構築體具有所要特徵。胺基酸變化亦可改變抗體構築體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置。 舉例而言，各CDR中可插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6個胺基酸(固然，視其長度而定)，而各FR中可插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。胺基酸序列插入抗體構築體中較佳包括含有一百個以上殘基之多肽的介於1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基之長度範圍內之胺基及/或羧基末端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。亦可在本發明之抗體構築體的第三結構域內進行相應修飾。本發明之抗體構築體之插入變異體包括融合至酶之抗體構築體之N末端或C末端或融合至多肽。 取代突變誘發之最感興趣位點包括(但不限於)重鏈及/或輕鏈之CDR，特定言之高變區，但亦涵蓋重鏈及/或輕鏈中之FR變化。取代較佳為如本文中所描述之保守取代。較佳地，可取代CDR中之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，而可取代構架區(FR)中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸，視CDR或FR之長度而定。舉例而言，若CDR序列涵蓋6個胺基酸，則設想取代此等胺基酸中之一、二或三個。類似地，若CDR序列涵蓋15個胺基酸，則設想取代此等胺基酸中之一、二、三、四、五或六個。 用於鑑定抗體構築體中對於突變誘發為較佳位置之某些殘基或區域的適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)所描述。此處，鑑定抗體構築體內基團或靶殘基群組(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電胺基酸(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)加以置換，以影響胺基酸與抗原決定基之相互作用。 隨後藉由在取代位點處或針對取代位點引入進一步或其他變異體來改良對取代顯示出功能敏感性之彼等胺基酸位置。因而，儘管用於引入胺基酸序列變化之位點或區域為預定的，但無須預定突變本身之性質。舉例而言，為了分析或最佳化突變在指定位點處之性能，可在靶密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機突變誘發，且對所表現之抗體構築體變異體篩檢所要活性之最佳組合。用於在具有已知序列之DNA中的預定位點進行取代突變的技術為眾所周知的，例如M13引子突變誘發及PCR突變誘發。使用抗原結合活性(諸如靶細胞表面抗原或CD3結合)分析對突變體進行篩檢。 一般而言，若胺基酸經重鏈及/或輕鏈之一或多個或者所有CDR取代，則隨後獲得之「經取代」之序列較佳與「原始」CDR序列存在至少60%或65%、更佳70%或75%、甚至更佳80%或85%且尤佳90%或95%一致性。此意謂CDR之長度視其與「經取代」之序列的一致程度而定。舉例而言，具有5個胺基酸之CDR較佳與其經取代之序列存在80%一致性，以便有至少一個胺基酸經取代。相應地，抗體構築體之CDR可與其經取代之序列具有不同程度之一致性，例如，CDRL1可具有80%，而CDRL3可具有90%。 較佳取代(或置換)為保守取代。然而，設想任何取代(包括非保守取代或者以下表3中所列出之「例示性取代」中之一或多者)，只要抗體構築體保留其經由第一結構域結合靶細胞表面抗原及經由第二結構域及/或其與隨後經取代之序列具有一致性(與「原始」CDR序列存在至少60%或65%、更佳70%或75%、甚至更佳80%或85%且尤佳90%或95%一致性)的CDR結合CD3 (相應地為CD3ε)的能力。 保守取代示於表3中「較佳取代」之標題下。若此種取代引起生物活性變化，則可引入表3中指定為「例示性取代」或如以下參考胺基酸類別進一步描述之更多實質性變化且針對所要特徵來篩檢產物。 表3：胺基酸取代 藉由選擇在其對維持以下各項之效應方面顯著不同的取代來實現對本發明抗體構築體之生物學性質的實質性修飾：(a)多肽骨架在取代區域中之結構，例如呈片狀或螺旋狀構形；(b)分子在標靶位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈整體。基於共同側鏈性質將天然存在之殘基分成數組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。 非保守取代將使得有必要將此等類別之一的成員交換為另一類別。一般可用絲胺酸取代任何不參與維持抗體構築體之適當構形的半胱胺酸殘基，以改良分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反，可對抗體添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段時)。 對於胺基酸序列，藉由使用此項技術中已知的標準技術來測定序列一致性及/或相似性，包括但不限於Smith及Waterman, 1981,Adv. Appl. Math. 2:482之局部序列一致性算法、Needleman及Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. 48:443之序列一致性比對算法、Pearson及Lipman, 1988,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444之相似性檢索法、此等算法之電腦實施(Wisconsin Genetics Software Package中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)、Devereux等人, 1984,Nucl. Acid Res. 12:387-395所描述之最佳擬合序列程式(較佳使用缺省設定)或藉由觀察。較佳藉由FastDB基於以下參數來計算一致性百分比：錯配罰分1；間隙罰分1；間隙尺寸罰分0.33；及接合罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁(1988), Alan R. Liss, Inc.。 適用算法之實例為PILEUP。PILEUP使用漸進性逐對比對由一組相關序列產生多重序列比對。其亦可繪製顯示用於產生比對之簇集關係的樹圖。PILEUP使用Feng及Doolittle, 1987,J. Mol. Evol. 35:351-360之漸進性比對方法之簡化版；該方法類似於Higgins及Sharp, 1989,CABIOS 5:151-153所描述之方法。適用之PILEUP參數包括缺省間隙權重3.00、缺省間隙長度權重0.10及加權末端間隙。 適用算法之另一實例為BLAST算法，其描述於以下文獻中：Altschul等人, 1990,J. Mol. Biol. 215:403-410；Altschul等人, 1997,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；及Karin等人, 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787。尤其適用之BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其係獲自Altschul等人, 1996,Methods in Enzymology 266:460-480。WU-BLAST-2使用若干檢索參數，其中大部分設定為缺省值。用以下值設定可調節參數：重疊跨距=1，重疊分數=0.125，字組臨界值(T)=II。HSP S及HSP S2參數為動力學值且由程式本身確定，視正檢索相關序列之特定資料庫的特定序列及組成物之組成而定；然而，可調節該等值以增加靈敏度。 其他適用算法為如Altschul等人, 1993,Nucl. Acids Res. 25:3389-3402所報導之間隙BLAST。間隙BLAST使用BLOSUM-62取代評分；臨界值T參數設定為9；觸發無間隙延伸之雙擊方法以10+k之代價負載間隙長度k；Xu設定為16；且Xg在資料庫檢索階段設定為40且在算法輸出階段設定為67。對應於約22個位元之評分觸發間隙對準。 一般而言，個別變異體CDR或VH/VL序列與本文中所描繪之序列之間的胺基酸同源性、相似性或一致性為至少60%，且更通常具有至少65%或70%之較佳增加之同源性或一致性，更佳至少75%或80%，甚至更佳為至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%。以類似方式，相對於本文中所鑑定之結合蛋白質之核酸序列的「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與抗體構築體編碼序列中之核苷酸殘基一致的核苷酸殘基的百分比。特定方法利用WU-BLAST-2之BLASTN模組設定為缺省參數，其中重疊跨距及重疊分數分別設定為1及0.125。 一般而言，編碼個別變異體CDR或VH/VL序列之核苷酸序列與本文中所描繪之核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或一致性為至少60%，且更通常具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%及幾乎100%之較佳增加之同源性或一致性。因而，「變異體CDR」或「變異體VH/VL區」為與本發明之親本CDR/VH/VL具有指定同源性、相似性或一致性的區域，且具有生物功能，包括但不限於親本CDR或VH/VL之特異性及/或活性之至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。 在一個實施例中，根據本發明之抗體構築體與人類生殖系之一致性百分比為≥70%或≥75%，更佳為≥80%或≥85%，甚至更佳為≥90%，且最佳為≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%或甚至≥96%。認為與人類抗體生殖系基因產物之一致性為治療蛋白質在治療期間在患者體內引發對藥物之免疫反應之風險降低的重要特徵。Hwang及Foote (「Immunogenicity of engineered antibodies」; Methods 36 (2005) 3-10)證明減少藥物抗體構築體之非人類部分引起在治療期間在患者體內誘導抗藥物抗體之風險降低。藉由比較眾多臨床評估抗體藥物及個別免疫原性資料，顯示出以下傾向：抗體V區之人類化使得蛋白質之免疫原性(平均5.1%之患者)低於攜帶未改變之非人類V區的抗體(平均23.59%之患者)。因此，呈抗體構築體形式之基於V區之蛋白質治療劑需要與人類序列具有高度一致性。出於此確定生殖系一致性之目的，可使用Vector NTI軟體比對VL之V區與人類生殖系V區段及J區段之胺基酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，且藉由將一致胺基酸殘基除以VL之胺基酸殘基總數之百分比來計算胺基酸序列。VH區段可同樣如此(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，除了可由於VH CDR3之高度多樣性而不包括VH CDR3及缺乏存在人類生殖系VH CDR3比對搭配物。隨後可使用重組技術來增加與人類抗體生殖系基因之序列一致性。 在另一實施例中，本發明之雙特異性抗體構築體在標準研究規模條件下，例如在標準兩步純化方法中展現高單體產率。根據本發明之抗體構築體的單體產率較佳為≥0.25 mg/L上清液，更佳為≥ 0.5 mg/L上清液，甚至更佳≥1 mg/L上清液，且最佳為≥ 3 mg/L上清液。 同樣，可測定抗體構築體之二聚抗體構築體同功型產率且因此測定單體百分比(亦即，單體:(單體+二聚體))。可例如在對來自於滾瓶中之標準化研究規模製造的培養物上清液進行的SEC純化步驟中獲得單體及二聚抗體構築體之產量以及計算單體百分比。在一個實施例中，抗體構築體之單體百分比為≥80%，更佳為≥85%，甚至更佳為≥90%，且最佳為≥95%。 在一個實施例中，抗體構築體具有較佳≤5或≤4，更佳≤3.5或≤3，甚至更佳≤2.5或≤2且最佳≤1.5或≤1之血漿穩定性(存在血漿時之EC50與不存在血漿時之EC50的比率)。可藉由在37℃下在人類血漿中將構築體培育24小時來測試抗體構築體之血漿穩定性，繼而在51 Cr釋放細胞毒性分析中進行EC50測定。細胞毒性分析中之效應細胞可為經刺激之經富集人類CD8陽性T細胞。靶細胞可例如為經人類靶細胞表面抗原轉染之CHO細胞。可將效應細胞:靶細胞(E:T)比率選擇為10:1。用於此目的之人類血漿庫來源於藉由經EDTA塗佈之注射器收集的健康供體血液。藉由離心移除細胞組分且收集上部血漿相，隨後彙集。作為對照，稀釋抗體構築體，隨後立即在RPMI-1640培養基中進行細胞毒性分析。將血漿穩定性計算為EC50 (血漿培育之後)與EC50 (對照物)之比率。 此外較佳的是本發明之抗體構築體之單體向二聚體轉化率較低。可在不同的條件下量測轉化率且藉由高效粒徑排阻層析加以分析。舉例而言，可在37℃及例如100 μg/ml或250 μg/ml之濃度下在培育箱中對抗體構築體之單體同功型進行培育，持續7天。在此等條件下，較佳的是本發明之抗體構築體顯示≤5%、更佳≤4%、甚至更佳≤3%、甚至更佳≤2.5%、甚至更佳≤2%、甚至更佳≤1.5%且最佳≤1%或≤0.5%或甚至0%之二聚體百分比。 亦較佳的是本發明之雙特異性抗體構築體在眾多冷凍/解凍循環之後存在極低二聚體轉化率。舉例而言，將抗體構築體單體調節至250 μg/ml之濃度，例如，在通用調配緩衝液中，並且經受三個冷凍/解凍循環(在 -80℃下冷凍30分鐘，繼而在室溫下解凍30分鐘)，繼而進行高效SEC以測定已轉化成二聚抗體構築體之初始單體抗體構築體的百分比。較佳地，雙特異性抗體構築體之二聚物百分比為≤5%，更佳為≤4%，甚至更佳為≤3%，甚至更佳為≤2.5%，甚至更佳為≤2%，甚至更佳為≤1.5%且最佳為≤1%或甚至≤0.5%，例如在三個冷凍/解凍循環之後。 本發明之雙特異性抗體構築體較佳顯示良好熱穩定性，其中聚集溫度≥45℃或≥50℃，更佳≥52℃或≥54℃，甚至更佳≥56℃或≥57℃，且最佳≥58℃或≥59℃。可依據抗體聚集溫度來確定熱穩定性參數如下：將處於濃度250 μg/ml下之抗體溶液轉移至單次使用光析管中且置於動態光散射(DLS)裝置中。以0.5℃/min之加熱速率將樣品自40℃加熱至70℃，其中恆定擷取量測半徑。將指示蛋白質熔融及聚集之半徑增加用於計算抗體之聚集溫度。 替代地，可藉由差示掃描量熱術(DSC)來測定溫度熔融曲線，以確定抗體構築體之固有生物物理學蛋白質穩定性。使用MicroCal LLC (Northampton，MA，U.S.A) VP-DSC裝置來進行此等實驗。記錄含有抗體構築體之樣品自20℃至90℃之能量吸收，與僅含有調配緩衝液之樣品相比較。將抗體構築體調節至250 μg/ml之最終濃度，例如在SEC運作緩衝液中。為了記錄個別熔融曲線，逐步增加總體樣品溫度。在各溫度T下，記錄樣品及調配緩衝液參考物之能量吸收。將樣品能量吸收Cp (kcal/mol/℃)減參考物能量吸收之差值相對於個別溫度進行繪圖。熔融溫度定義為能量吸收之第一最大值時的溫度。 亦設想本發明之靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構築體具有≤0.2、較佳≤0.15、更佳≤0.12、甚至更佳≤0.1且最佳≤0.08之混濁度(如在將經純化之單體抗體構築體濃縮至2.5 mg/ml且隔夜培育之後藉由OD340所量測)。 在另一實施例中，根據本發明之抗體構築體在酸性pH值下為穩定的。抗體構築體愈耐受諸如pH 5.5 (運作例如陽離子交換層析所需之pH值)或5.5以下、諸如pH 4.0至5.5之非生理pH值，自離子交換管柱溶析之抗體構築體相對於負載蛋白質之總量的回收率愈高。在pH 5.5下，抗體構築體自離子(例如陽離子)交換管柱之回收率較佳為≥30%，更佳為≥40%，更佳為≥50%，甚至更佳為≥60%，甚至更佳為≥70%，甚至更佳為≥80%，甚至更佳為≥90%，甚至更佳為≥95%，且最佳為≥99%。 此外設想本發明之雙特異性抗體構築體展現治療效力或抗腫瘤活性。可例如在如晚期人類腫瘤異種移植模型之以下實例中所揭示之研究中評定此性質： 熟習此項技術者知曉如何修改或改適此研究之某些參數，諸如注入之腫瘤細胞數目、注入部位、移植之人類T細胞數目、雙特異性抗體構築體之投與量及時間線，而仍獲得有意義且可再現之結果。較佳地，腫瘤生長抑制T/C [%]為≤70或≤60，更佳為≤50或≤40，甚至更佳為≤30或≤20，且最佳為≤10或≤5或甚至≤2.5。 在本發明之抗體構築體之較佳實施例中，抗體構築體為單鏈抗體構築體。 亦在本發明之抗體構築體之較佳實施例中，該第三結構域按胺基至羧基順序包含： 鉸鏈-CH2-CH3-連接子-鉸鏈-CH2-CH3。 在本發明之一個實施例中，第三結構域之該等多肽單體各自具有與選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群的序列存在至少90%一致性的胺基酸序列。在一較佳實施例或本發明中，該等多肽單體中之每一者具有選自SEQ ID NO: 17-24的胺基酸序列。 亦在本發明之一個實施例中，第三結構域之一個或較佳每一(兩個)多肽單體之CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。如此項技術中已知，術語「半胱胺酸二硫橋」係指具有通用結構R-S-S-R 之官能基。該鍵聯亦稱為SS鍵或二硫橋，且係藉由使半胱胺酸殘基之兩個硫醇基偶聯而獲得。對於本發明之抗體構築體而言，尤佳的是將成熟抗體構築體中形成半胱胺酸二硫橋之半胱胺酸引入CH2結構域中對應於309及321之胺基酸序列中(Kabat編號)。 在本發明之一個實施例中，移除CH2結構域之Kabat位置314上的糖基化位點。較佳的是藉由N314X取代來達成此糖基化位點移除，其中X為除Q以外之任何胺基酸。該取代較佳為N314G取代。在一更佳實施例中，該CH2結構域另外包含以下取代(根據Kabat之位置) V321C及R309C (此等取代在Kabat位置309及321處引入結構域內半胱胺酸二硫橋)。 假定與例如此項技術中已知的雙特異性異源Fc抗體構築體(圖1b)相比，本發明之抗體構築體之較佳特徵可尤其關於在CH2結構域中引入以上所描述之修飾。因而，對於本發明之構築體而言較佳的是本發明之抗體構築體之第三結構域中的CH2結構域包含處於Kabat位置309及321處之結構域內半胱胺酸二硫橋及/或藉由如上之N314X取代，較佳藉由N314G取代移除處於Kabat位置314之糖基化位點。 在本發明之另一較佳實施例中，本發明之抗體構築體之第三結構域中的CH2結構域包含處於Kabat位置309及321處之結構域內半胱胺酸二硫橋且藉由N314G取代移除Kabat位置314處之糖基化位點。最佳地，本發明之抗體構築體之第三結構域之多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17及18組成之群的胺基酸序列。 在一個實施例中，本發明提供一種抗體構築體，其中： (i) 該第一結構域包含兩個抗體可變域且該第二結構域包含兩個抗體可變域； (ii) 該第一結構域包含一個抗體可變域且該第二結構域包含兩個抗體可變域； (iii) 該第一結構域包含兩個抗體可變域且該第二結構域包含一個抗體可變域；或 (iv) 該第一結構域包含一個抗體可變域且該第二結構域包含一個抗體可變域。 因此，該第一結構域及該第二結構域可為各包含兩個抗體可變域，諸如VH結構域及VL結構域之結合結構域。此種包含兩個抗體可變域之結合結構域的實例描述於上文中且包含例如上文所描述之Fv片段、scFv片段或Fab片段。替代地，彼等結合結構域中之任一者或兩者皆可僅包含單一可變域。此種單結構域結合結構域之實例描述於上文中，且包含例如與其他V區或結構域無關地特異性結合抗原或抗原決定基的奈米抗體或僅包含一個可變域之單可變域抗體，該可變域可為VHH、VH或VL。 在本發明之抗體構築體之較佳實施例中，第一結構域及第二結構域經由肽連接子與第三結構域融合。較佳肽連接子已描述於上文中且以胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，亦即Gly4 Ser (SEQ ID NO: 1)或其聚合物，亦即(Gly4 Ser)x為特徵，其中x為1或更大之整數(例如2或3)。用於使該第一結構域及第二結構域與第三結構域融合之尤佳連接子描繪於SEQ ID NO: 1中。 在較佳實施例中，本發明之抗體構築體的特徵在於按胺基至羧基順序包含： (a) 該第一結構域； (b) 肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群的胺基酸序列； (c) 該第二結構域； (d) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11及12； (e) 該第三結構域之第一多肽單體； (f) 肽連接子，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 5、6、7及8；及 (g) 該第三結構域之第二多肽單體。 在本發明之一個態樣中，該第一結構域所結合之靶細胞表面抗原為腫瘤抗原、免疫學病症特異性抗原或病毒抗原。如本文中所使用之術語「腫瘤抗原」可理解為腫瘤細胞上所存在之彼等抗原。此等抗原可存在於具有細胞外部分之細胞表面上，該細胞外部分通常與該分子之跨膜部分及細胞質部分組合。此等抗原有時可僅由腫瘤細胞而決不會由正常細胞呈現。腫瘤抗原可僅表現於腫瘤細胞上，或可表示與正常細胞相比存在腫瘤特異性突變。在此情況下，將其稱為腫瘤特異性抗原。更常見的是由腫瘤細胞及正常細胞呈現之抗原，且將其稱為腫瘤相關抗原。與正常細胞相比，此等腫瘤相關抗原可過度表現，且由於腫瘤組織相較於正常組織之不太緻密結構而在腫瘤細胞中易於發生抗體結合。如本文中所使用之腫瘤抗原的非限制性實例為CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFRvIII、CD33、CD19、CD20及CD70。 在本發明之抗體構築體之較佳實施例中，腫瘤抗原係選自由以下各項組成之群：CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFRvIII、CD33、CD19、CD20、CD70、PSMA及BCMA。 在本發明之一個態樣中，抗體構築體按胺基至羧基順序包含： (a) 第一結構域，該第一結構域具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：52、70、58、76、88、106、124、94、112、130、142、160、178、148、166、184、196、214、232、202、220、238、250、266、282、298、255、271、287、303、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、327、343、359、375、391、407、423、439、455、471、487、503、519、353、551、592、608、624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848、864、880、896、912、928、944、960、976、992、1008、1024、1040、1056、1072、1088、1104、1120、1136、1152、1168、1184、597、613、629、645、661、677、693、709、725、741、757、773、789、805、821、837、853、869、885、901、917、933、949、965、981、997、1013、1029、1045、1061、1077、1093、1109、1125、1141、1157、1173、1189、1277、1289、1301、1313、1325、1337、1349、1361、1373、1385、1397、1409、1421、1433、1445；及選自SEQ ID NO 1460至1518中所包含之針對BCMA之序列；及與PSMA相關之50、56、68、74、86、92、104、110、122、128、140、146、158、164、176、182、194、200、212、218、230、236、248、254、266、272、284、290、302、308，其中上述SEQ ID NO: 50至308中之每一者必須減去等於41之值以獲得補充序列表12中之相應編號；及補充序列表12中與PSMA相關之SEQ ID No 320、335、350、365、380、395、410、425、440、455及470； (b) 肽連接子，該肽連接子具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群的胺基酸序列； (c) 第二結構域，該第二結構域具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：WO 2008/119567之SEQ ID NO: SEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或SEQ ID NO: 15； (d) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11及12； (e) 第三結構域之第一多肽單體，該第一多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群的多肽序列； (f) 肽連接子，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 5、6、7及8；及 (g) 第三結構域之第二多肽單體，該第二多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群的多肽序列。 與此較佳實施例一致，經由肽連接子與單鏈多肽融合之第一結構域及第二結構域包含選自由以下各項組成之群的序列： (a) SEQ ID NO: 53及59； CD33 (b) SEQ ID NO: 71及77； EGFRvIII (c) SEQ ID NO: 89、107、125、95、113及131； MSLN (d) SEQ ID NO: 143、161、179、149、167及185； CDH19 (e) SEQ ID NO: 197、215、233、203、221及239； DLL3 (f) SEQ ID NO: 251、267、283、299、256、272、288及304；CD19 (g) SEQ ID NO: 323、339、355、371、387、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、328、344、360、376、392、408、424、440、456、472、488、504、520、536及552； FLT3 (h) SEQ ID NO: 593、609、625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849、865、881、897、913、929、945、961、977、993、1009、1025、1041、1057、1073、1089、1105、1121、1137、1153、1169、1185、598、614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838、854、870、886、902、918、934、950、966、982、998、1014、1030、1046、1062、1078、1094、1110、1126、1142、1158、1174及1190； CD70 (i) SEQ ID NO: 1268；及 CD20 (j) SEQ ID NO: 1278、1290、1302、1314、1326、1338、1350、1362、1374、1386、1398、1410、1422、1434、1446； CD19 (k) SEQ ID No: 1472、1478、1491、1497、1509、1515中所包含之個別序列； BCMA (l) SEQ ID NO: 1527、1533、1545、1551、1563、1569、1581、1587、1599、1605、1617、1623、1635、1641、1653、1659、1671、1677、1689、1695、1707、1713、1725、1731、1743、1749、1761 1767、1779、1785、1797、1812、1827、1842、1857、1872、1887、1902、1917、1927、1937、1947、1962 PSMA。 在一個態樣中，本發明之抗體構築體係以具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列為特徵： (a) SEQ ID NO: 54、55、60及61； CD33 (b) SEQ ID NO: 72、73、78及79； EGFRvIII (c) SEQ ID NO: 90、91、96、97、108, 109、114及115； MSLN (d) SEQ ID NO: 144、145、150、151、162、163、168、169、180、181、186及187； CDH19 (e) SEQ ID NO: 198、199、204、205、216、217、222、223、234、235、240及241； DLL3 (f) SEQ ID NO: 252、306、257、307、268、308、273、309、284、310、289、311、300、312、305及313； CD19 (g) SEQ ID NO: 324、554、329、555、340、556、345、557、356、558、361、559、372、560、377、561,388、562、393、563、404、564、409、565、420、566、425、567、436、568、441、569、452、570、457、571,468、572、473、573、484、574、489、575、500、576、505、577、516、578、521、579、532、580、537、581、548、582、553及583； FLT3 (h) SEQ ID NO: 594、610、626、642、658、674、690、706、722、738、754、77、786、802、818、834、850、866、882、898、914、930、946、962、978、994、1010、1026、1042、1058、1074、1090、1106、1122、1138、1154、1170、1186、599、615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839、855、871、887、903、919、935、951、967、983、999、1015、1031、1047、1063、1079、1095、1111、1127、1143、1159、1175、1191及1192-1267； CD70 (i) SEQ ID NO: 43；CD20 (j) SEQ ID No: 1279、1280、1291、1292、1303、1304、1315、1316、1327、1328、1339、1340、1351、1352、1363、1364、1375、1376、1387、1388、1399,1400、1411、1412、1423、1424、1435、1436、1447、1448； CD19 (k) SEQ ID No: 1473、1474、1475、1479 1480、1481、1492、1493、1494、1498、1499、1500、1510、1511、1512、1516、1517、1518中所包含之個別序列； BCMA (l) 1528、1529、1530、1534、1535、1536、1546、1547、1548、1552、1553、1554、1564、1565、1566、1570、1571、1572、1582、1583、1584、1588、1589、1590、1600、1601、1602、1606、1607、1608、1618、1619、1620、1624、1625、1626、1636、1637、1638、1642、1643、1644、1654、1655、1656、1660、1661、1662、1672、1673、1674、1678、1679、1680、1690、1691、1692、1696、1697、1698、1708、1709、1710、1714、1715、1716、1726、1727、1728、1732、1733、1734、1744、1745、1746、1750、1751、1752、 1762、1763、1764、1768、1769、1770、1774、1775、1776、1786、1787、1788、1798、1799、1800、1801、1802、1803、1813、1814、1815、1816、1817、1818、1828、1829、1830、1831、1832、1833、1843、1844、1845、1846、1847、1848、1858、1859、1860、1861、1862、1863、1873、1874、1875、1876、1877、1878、1888、1889、1890、1891、1892、1893、1903、1904、1905、1906、1907、1908、1918、1919、1920、1921、1922、1923、1933、1934、1935、1936、1937、1938、1948、1949、1950、1951、1952、1953及1963 PSAM 本發明進一步提供一種編碼本發明之抗體構築體的聚核苷酸/核酸分子。聚核苷酸為由共價鍵結於鏈中之13個或更多個核苷酸單體構成的生物聚合物。DNA (諸如cDNA)及RNA (諸如mRNA)為具有不同生物功能之聚核苷酸的實例。核苷酸為充當如DNA或RNA之核酸分子的單體或次單元的有機分子。核酸分子或聚核苷酸可為雙股及單股、線性及環形的。其較佳包含於載體中，該載體較佳包含於宿主細胞中。該宿主細胞例如在用本發明之載體或聚核苷酸轉型或轉染之後能夠表現抗體構築體。出於該目的，使聚核苷酸或核酸分子可操作地與控制序列連接。 遺傳密碼為將遺傳物質(核酸)內所編碼之資訊轉譯成蛋白質的一組規則。使用同時輸送胺基酸且讀取mRNA三個核苷酸之tRNA分子，藉由按mRNA所規定之順序連接胺基酸的核糖體實現活細胞中進行生物解碼。密碼定義此等核苷酸三聯體(稱為密碼子)序列如何規定在蛋白質合成期間接下來將添加何種胺基酸。一些例外情況為核酸序列中之三核苷酸密碼子規定單一胺基酸。因為絕大多數基因係用完全相同之密碼編碼，故此特定密碼往往稱為典型或標準遺傳密碼。儘管遺傳密碼決定指定編碼區之蛋白質序列，但其他基因組區域可影響在何時及在何處產生此等蛋白質。 此外，本發明提供一種包含本發明之聚核苷酸/核酸分子的載體。載體為用作轉移(外來)遺傳物質至細胞中之媒劑的核酸分子。術語「載體」涵蓋但不侷限於質體、病毒、黏質體及人工染色體。一般而言，經工程改造之載體包含複製起點、多選殖位點及可選擇標記物。載體本身一般為核苷酸序列，通常包含插入(轉殖基因)之DNA序列及充當載體「骨架」之較大序列。新式載體可涵蓋除轉殖基因插入及骨架以外之其他特徵：啟動子、基因標記物、抗生素抗性、報告基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。特定言之，稱為表現載體(表現構築體)之載體係用於在靶細胞中表現轉殖基因，且一般具有控制序列。 術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所必需的DNA序列。舉例而言，適合於原核生物之控制序列包括啟動子、視情況存在之操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。 當核酸與另一核酸序列處於功能關係中時，核酸得以「可操作地連接」。舉例而言，若前驅序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前驅蛋白質，則其可操作地連接至多肽之DNA；若啟動子或增強子影響序列之轉錄，則其可操作地連接至編碼序列；或若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯，則其可操作地連接至編碼序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為連續的且在分泌前導序列之情況下為連續的且處於讀取相中。然而，增強子不必為連續的。連接係藉由在適宜限制位點處進行結紮來實現。若此種位點不存在，則根據習知實務使用合成寡核苷酸銜接子或連接子。 「轉染」為謹慎地將核酸分子或聚核苷酸(包括載體)引入至靶細胞中之過程。該術語主要用於真核細胞中之非病毒方法。轉導通常用於描述核酸分子或聚核苷酸之病毒介導之轉移。動物細胞之轉染通常包括在細胞膜中開出瞬時孔隙或「孔」以允許吸收物質。可使用磷酸鈣、藉由電穿孔、藉由細胞擠壓或藉由混合陽離子脂質與該物質以產生脂質體來進行轉染，由此與細胞膜融合並且將其負荷沈積在內部。 術語「轉型」用於描述核酸分子或聚核苷酸(包括載體)非病毒轉移至細菌中以及非動物真核細胞，包括植物細胞中。轉型因此為由經由細胞膜自其周圍直接攝取且隨後併入外源遺傳物質(核酸分子)而引起的細菌或非動物真核細胞之基因變化。轉型可藉由人工手段來實現。為了發生轉型，必須使細胞或細菌處於勝任狀態，該狀態可在對諸如饑餓及細胞密度之環境條件產生時間限制反應時出現。 此外，本發明提供經聚核苷酸/核酸分子或經本發明之載體轉型或轉染的宿主細胞。如本文中所使用，術語「宿主細胞」或「受體細胞」意欲包括可成為或已成為載體、外源核酸分子及編碼本發明之抗體構築體之聚核苷酸的受體及/或抗體構築體本身之受體的任何個別細胞或細胞培養物。利用轉型、轉染及其類似手段來進行將個別物質引入細胞中。術語「宿主細胞」亦意欲包括單一細胞之後代或潛在後代。因為可能由於天然、意外或故意突變或由於環境影響而在後繼世代中出現某些修飾，故此種後代事實上未必與親本細胞完全一致(在形態上或者在基因組或總DNA補體方面)，但仍包括如本文中所使用之術語的範疇內。適合之宿主細胞包括原核或真核細胞，且亦包括但不限於細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及動物細胞，諸如昆蟲細胞及哺乳動物細胞，例如鼠類、大鼠、獼猴或人類。 可在細菌中產生本發明之抗體構築體。表現之後，自大腸桿菌細胞糊中分離出處於可溶部分中之本發明抗體構築體，且可藉由例如親和層析及/或粒徑排阻進行純化。可類似於用於純化例如CHO細胞中所表現之抗體的方法來進行最終純化。 除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物對於本發明之抗體構築體而言亦為適合之構築體選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或普通烘焙酵母為最常用的。然而，眾多其他菌屬、菌種及菌株為常用的且適用於本文中，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克盧費氏酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如乳酸克盧費氏酵母(K. lactis )、鬆脆克盧費氏酵母(K. fragilis ) (ATCC 12424)、保加利亞克盧費氏酵母(K. bulgaricus ) (ATCC 16045)、維克拉米克盧費氏酵母(K. wickeramii ) (ATCC 24178)、瓦爾蒂克盧費氏酵母(K. waltii ) (ATCC 56500)、曲索拉魯姆克盧費氏酵母(K. drosophilarum ) (ATCC 36906)、嗜熱克盧費氏酵母(K. thermotolerans )及馬克斯克盧費氏酵母(K. marxianus )；耶氏酵母屬(yarrowia) (EP 402 226)；巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris ) (EP 183 070)；念珠菌屬(Candida)；瑞氏木黴(Trichoderma reesia ) (EP 244 234)；粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa )；許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)，諸如西方許旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌，諸如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麯黴屬(Aspergillus)宿主，諸如構巢麯黴(A. nidulans )及黑麯黴(A. niger )。 適用於表現本發明之糖基化抗體構築體的宿主細胞來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定許多桿狀病毒株及變異體以及來自於諸如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda ) (毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti ) (蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus ) (蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster ) (果蠅)及家蠶(Bombyx mori )之宿主的相應可感染昆蟲宿主細胞。用於轉染之多種病毒株可公開獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica ) NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且根據本發明，此種病毒可用作本文中之病毒，特定言之用於轉染草地貪夜蛾細胞。 棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、擬南芥及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。適用於在植物細胞培養物中產生蛋白質之選殖及表現載體對熟習此項技術者為已知的。參見例如Hiatt等人, Nature (1989) 342: 76-78；Owen等人, (1992) Bio/Technology 10: 790-794；Artsaenko等人, (1995) The Plant J 8: 745-750；及Fecker等人, (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986。 然而，在脊椎動物細胞中最有利，且在培養物(組織培養物)中繁殖脊椎動物細胞已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為藉由SV40加以轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞株(經次選殖以便在懸浮液培養中生長之293或293細胞，Graham等人, J. Gen Virol. 36 : 59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980))；猴腎細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI細胞(Mather等人, Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝細胞瘤細胞株(Hep G2)。 在另一實施例中，本發明提供一種產生本發明之抗體構築體的方法，該方法包括在允許表現本發明之抗體構築體的條件下培養本發明之宿主細胞及自培養物中回收所產生之抗體構築體。 如本文中所使用，術語「培養」係指細胞在適合條件下在培養基中進行活體外維持、分化、生長、增殖及/或繁殖。術語「表現」包括產生本發明之抗體構築體所涉及的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。 當使用重組技術時，可在胞周質空間中細胞內產生抗體構築體，或直接分泌至培養基中。若在細胞內產生抗體構築體，則作為第一步驟，移除顆粒狀碎片(宿主細胞或已溶解片段)，例如藉由離心或超濾。Carter等人, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)描述了一種用於分離已分泌至大腸桿菌之胞周質空間的抗體的程序。簡而言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下，使細胞糊在約30分鐘內解凍。可藉由離心來移除細胞碎片。在抗體被分泌至培養基中之情況下，一般首先使用市售蛋白質濃縮過濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元來濃縮得自於此種表現系統之上清液。上述步驟中之任一者中均可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解作用，且可包括抗生素以防止偶生污染物之生長。 可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透滲析及親和層析對由宿主細胞製備之本發明抗體構築體進行回收或純化。視欲回收之抗體而定，亦可利用其他蛋白質純化技術，諸如在離子交換管柱上分餾、乙醇沈澱、逆相HPLC、在矽膠上層析、在肝素SEPHAROSE™上層析、在陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。在本發明之抗體包含CH3結構域時，Bakerbond ABX樹脂(J.T. Baker，Phillipsburg，NJ)適用於進行純化。 親和層析為較佳純化技術。親和力配位體所連接之基質為最常用之瓊脂糖，但可利用其他基質。機械穩定之基質，諸如受控孔隙玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯允許比瓊脂糖更快之流速及更短之處理時間。 此外，本發明提供一種包含本發明之抗體構築體或根據本發明方法產生之抗體構築體的醫藥組成物。對於本發明之醫藥組成物而言，較佳的是抗體構築體之均質性為≥80%，更佳為81%、≥82%、≥83%、≥84%或≥85%，更佳為≥86%、≥87%、≥88%、≥89%或≥90%，再更佳為≥91%、≥92%、≥93%、≥94%或≥95%，且最佳為≥96%、≥97%、≥98%或≥99%。 如本文中所使用，術語「醫藥組成物」係指適合投與患者、較佳人類患者之組成物。本發明之尤佳醫藥組成物較佳以治療有效量包含一種或複數種本發明抗體構築體。該醫藥組成物較佳進一步包含一或多種(醫藥學上有效之)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑之適合調配物。該組成物之可接受成分較佳在所採用之劑量及濃度下對受體無毒。本發明之醫藥組成物包括但不限於液體、冷凍及凍乾組成物。 本發明之組成物可包含醫藥學上可接受之載劑。一般而言，如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」意謂與醫藥投與，特定言之與非經腸投與相容之任何及所有水性及非水性溶液、無菌溶液、溶劑、緩衝液例如磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)溶液、水、懸浮液、乳液諸如油/水乳液、各種類型潤濕劑、脂質體、分散介質及包衣劑。此種介質及試劑於醫藥組成物中之用途在此項技術中為眾所周知的，且可藉由眾所周知的習知方法來調配包含此種載劑之組成物。 某些實施例提供包含本發明之抗體構築體且進一步包含一或多種賦形劑，諸如此部分及本文其他部分中說明性地描述之彼等賦形劑的醫藥組成物。就此而言，本發明中可出於多種目的而使用賦形劑，諸如調節調配物之物理、化學或生物學性質(諸如調節黏度)及或本發明方法之物理、化學或生物學性質，以改良有效性及或穩定此種調配物及方法以免由於例如製造、運輸、儲存、使用前製備、投與期間及此後出現之應力而受到降解及損壞。 在某些實施例中，該醫藥組成物可含有調配物質以用於改進、維持或防腐之目的，例如pH值、滲透壓、黏度、澄清度、色彩、等滲透壓性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、組成物之吸附或滲透(參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第18版, (A.R. Genrmo編), 1990, Mack Publishing Company)。在此種實施例中，適合之調配物質可包括但不限於： • 胺基酸，諸如甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、脯胺酸、2-苯丙胺酸，包括帶電胺基酸，較佳為離胺酸、乙酸離胺酸、精胺酸、麩胺酸鹽及/或組胺酸； • 抗微生物劑，諸如抗細菌劑及抗真菌劑； • 抗氧化劑，諸如抗壞血酸、甲硫胺酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉； • 用於維持組成物處於約4.0至6.5、較佳4.2至4.8之酸性pH值下的緩衝液、緩衝系統及緩衝劑；緩衝液之實例為硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽、組胺酸及乙酸鹽；例如，或約pH 4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液； • 非水性溶劑，諸如丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯； • 水性載劑，包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水及緩衝介質； • 生物可降解聚合物，諸如聚酯； • 增積劑，諸如甘露糖醇或甘胺酸； • 螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)； • 等滲透壓劑及吸收延遲劑； • 複合劑，諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精； • 填充劑； • 單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可為非還原糖，較佳為海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇； • (低分子量)蛋白質、多肽或蛋白質載劑，諸如人類或牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，較佳具有人類起源； • 著色劑及調味劑； • 含硫還原劑，諸如麩胱甘肽、硫辛酸、巰乙酸鈉、硫甘油、[α]-單硫甘油及硫代硫酸鈉； • 稀釋劑； • 乳化劑； • 親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮； • 成鹽相對離子，諸如鈉； • 防腐劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物；實例為：殺藻胺、苯甲酸、水楊酸、乙汞硫柳酸鈉、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定、山梨酸或過氧化氫； • 金屬錯合物，諸如Zn-蛋白質錯合物； • 溶劑及共溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)； • 糖及糖醇，諸如海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、甘露糖醇、山梨糖醇或木糖醇、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌糖醇、半乳糖醇、甘油、環多醇(例如肌醇)、聚乙二醇；及多羥基糖醇； • 懸浮劑； • 界面活性劑或潤濕劑，諸如普洛尼克、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨糖醇酯類(諸如聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯)、曲拉通、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)；界面活性劑可為較佳具有＞1.2 KD之分子量的清潔劑及/或較佳具有＞3 KD之分子量的聚醚；較佳清潔劑之非限制性實例為Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80及Tween 85；較佳聚醚之非限制性實例為PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000及PEG 5000； • 穩定性增強劑，諸如蔗糖或山梨糖醇； • 張力增強劑，諸如鹼金屬鹵化物，較佳為氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇、山梨糖醇； • 非經腸遞送媒劑，包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖液(Ringer's dextrose)、葡萄糖及氯化鈉、乳酸化林格氏液或不揮發性油； • 靜脈內遞送媒劑，包括體液及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏葡萄糖液之彼等電解質補充劑)。 熟習此項技術者應顯而易見，醫藥組成物之不同成分(例如以上所列出之彼等成分)可具有例如不同的作用，且胺基酸可充當緩衝劑、穩定劑及/或抗氧化劑；甘露糖醇可充當增積劑及/或張力增強劑；氯化鈉可充當遞送媒劑及/或張力增強劑；等等。 設想除本文中所定義之本發明多肽以外，本發明之組成物亦可包含其他生物活性劑，視組成物之預定用途而定。此種藥劑可為作用於胃腸系統之藥物、充當細胞抑制劑之藥物、預防高尿酸血症之藥物、抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇)、調節炎症性反應之藥物、作用於循環系統之藥物及/或諸如此項技術中已知的細胞激素之藥劑。亦設想本發明之抗體構築體應用於共同療法中，亦即，與另一抗癌藥物組合。 在某些實施例中，最佳醫藥組成物將由熟習此項技術者視例如預定投與途徑、遞送形式及所要劑量來決定。參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 同上。在某些實施例中，此種組成物可影響本發明之抗體構築體的物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組成物中之主要媒劑或載劑本質上可為水性或非水性的。舉例而言，適合之媒劑或載劑可為可能補充有非經腸投與組成物中常用之其他物質的注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液。中性緩衝生理鹽水或與血清白蛋白混合之生理鹽水為其他例示性媒劑。在某些實施例中，可藉由將具有所要純度之所選組成物與視情況選用之調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 同上)混合來製備呈凍乾餅或水溶液形式之本發明抗體構築體組成物以供儲存。此外，在某些實施例中，可使用適當賦形劑(諸如蔗糖)將本發明之抗體構築體調配為凍乾物。 當預期非經腸投與時，用於本發明之治療組成物可呈包含處於醫藥學上可接受之媒劑中的所要本發明抗體構築體的無熱原、非經腸可接受之水溶液的形式提供。尤其適用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中本發明之抗體構築體調配為經適當防腐之無菌等滲透壓溶液。在某些實施例中，該製備可包括調配所要分子與諸如可注射微球體、生物可蝕粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑，由此可提供可經由貯庫注射遞送之產物的控制或持續釋放。在某些實施例中，亦可使用透明質酸，其具有促進在循環中之持續時間的作用。在某些實施例中，可使用可植入藥物遞送裝置來引入所要抗體構築體。 其他醫藥組成物對於熟習此項技術者將顯而易見，包括呈持續或控制遞送/釋放調配物形式之包括本發明抗體構築體之調配物。用於調配多種其他持續或控制遞送手段(諸如脂質體載劑、生物可蝕微粒或多孔珠粒及貯庫注射劑)之技術對於熟習此項技術者亦為已知的。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，該案描述控制釋放多孔聚合物微粒以用於遞送醫藥組成物。持續釋放製劑可包括呈成型製品(例如，膜或微膠囊)形式之半滲透聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸鹽共聚物(Sidman等人, 1983, Biopolymers 2:547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯) (Langer等人, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277；及Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人, 1981, 同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組成物亦可包括脂質體，其可藉由此項技術中已知的若干方法中的任一種來製備。參見例如Eppstein等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號、第EP 088,046號及第EP 143,949號。 抗體構築體亦可嵌埋於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中之例如藉由團聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。此種技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Oslo, A.編, (1980)中。 用於活體內投與之醫藥組成物通常呈無菌製劑形式提供。可藉由經無菌過濾膜過濾而實現滅菌。當將組成物凍乾時，可在凍乾及復原之前或之後使用此方法進行滅菌。用於非經腸投與之組成物可呈凍乾形式或呈溶液形式儲存。一般將非經腸組成物置於具有無菌接取口之容器中，例如，靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶。 本發明之另一態樣包括本發明調配物之自緩衝抗體構築體，其可用作醫藥組成物，如國際專利申請案WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599)中所描述。已對在此方面適用之蛋白質穩定及調配物質及方法進行廣泛闡述，諸如Arakawa等人, 「Solvent interactions in pharmaceutical formulations」, Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991)；Kendrick等人, 「Physical stabilization of proteins in aqueous solution」, RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter及Manning編, Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002)；及Randolph等人, 「Surfactant-protein interactions」, Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)，特定言之，參見與根據本發明之自緩衝蛋白質調配物相同的關於賦形劑及方法之部分，尤其關於供獸醫及/或人類醫療使用之蛋白質醫藥產物及方法。 根據本發明之某些實施例，可使用鹽來例如調節調配物之離子強度及/或等滲透壓性及/或改良根據本發明之組成物的蛋白質或其他成分之溶解度及/或物理穩定性。眾所周知，離子可藉由結合蛋白質表面上之帶電殘基及藉由屏蔽蛋白質中之帶電及極性基團且降低其靜電相互作用、吸引相互作用及排斥相互作用之強度來穩定蛋白質之天然狀態。特定言之，離子亦可藉由結合蛋白質之變性肽鍵(--CONH)來穩定蛋白質之變性狀態。此外，與蛋白質中帶電及極性基團之離子相互作用亦可減少分子間靜電相互作用，且由此防止或減少蛋白質聚集及不溶性。 離子物質在其對蛋白質之影響方面存在顯著差異。已發現可用於調配根據本發明之醫藥組成物的離子的眾多類別等級及其對蛋白質之影響。一個實例為霍夫邁斯特序列，其依據離子溶質及極性非離子溶質對蛋白質在溶液中之構形穩定性的影響來對其進行分級。致穩定溶質稱為「親液劑」。致不穩定溶質稱為「離液劑」。親液劑通常以高濃度(例如＞1莫耳濃度硫酸銨)使用，以便使蛋白質自溶液中沈澱(「鹽析」)。離液劑通常用於使蛋白質變性及/或溶解(「鹽溶」)。用於「鹽溶」及「鹽析」之離子的相對有效性定義其在霍夫邁斯特序列中之位置。 游離胺基酸可作為增積劑、穩定劑及抗氧化劑用於根據本發明之各種實施例的本發明抗體構築體調配物以及其他標準用途中。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於使調配物中之蛋白質穩定。甘胺酸適用於凍乾以確保正確餅結構及性質。精胺酸可能適用於在液體調配物及凍乾調配物兩者中抑制蛋白質聚集。甲硫胺酸適用作抗氧化劑。 聚醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖及山梨糖醇，以及多元醇，諸如甘油及丙二醇，以及出於本文中所論述之目的，聚乙二醇(PEG)及相關物質。聚醇為親液劑。其為適用於液體調配物及凍乾調配物兩者中以保護蛋白質免受物理及化學降解過程影響之穩定劑。聚醇亦適用於調節調配物之張力。適用於本發明之所選實施例的聚醇有通常用於確保凍乾調配物餅之結構穩定性的甘露糖醇。其確保餅之結構穩定性。其一般與凍乾保護劑，例如蔗糖一起使用。山梨糖醇及蔗糖屬於較佳張力調節劑，且作為穩定劑以防止運輸期間之凍融應力或製造過程中製備塊體。還原糖(其含有游離醛基或酮基)，諸如葡萄糖及乳糖，可使表面離胺酸及精胺酸殘基發生醣化。因此，其一般不屬於根據本發明使用之較佳聚醇。另外，形成此種反應性物質之糖，諸如在酸性條件下水解成果糖及葡萄糖且因此引起醣化之蔗糖，就此而言亦不屬於本發明之較佳聚醇。PEG適用於使蛋白質穩定及作為低溫保護劑，且就此而言可用於本發明中。 本發明之抗體構築體調配物之實施例進一步包含界面活性劑。蛋白質分子可能易於吸附於表面上且變性，並且隨之聚集在空氣-液體、固體-液體及液體-液體界面處。此等作用一般與蛋白質濃度成反比。此等不利相互作用一般與蛋白質濃度成反比，且通常因物理振盪，諸如產品運輸及處理過程中所產生之物理振盪而加重。界面活性劑通常用於防止、最小化或減少表面吸附。本發明中之適用界面活性劑就此而言包括聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80、脫水山梨糖醇聚乙氧基醇之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188。界面活性劑亦常用於控制蛋白質構形穩定性。界面活性劑之使用就此而言具有蛋白質特異性，此係因為任何指定界面活性劑均通常將使一些蛋白質穩定且使其他蛋白質不穩定。 聚山梨糖醇酯容易發生氧化降解，且在供應時往往含有足以致使蛋白質殘基側鏈、尤其是甲硫胺酸氧化之量的過氧化物。因此，應謹慎使用聚山梨糖醇酯，並且當使用時應採用其最低有效濃度。就此而言，聚山梨糖醇酯例示應以最低有效濃度使用賦形劑之一般規則。 本發明之抗體構築體調配物之實施例進一步包含一或多種抗氧化劑。在一定程度上，可藉由維持適當水準之環境氧及溫度以及藉由避免曝露於光來防止醫藥調配物中之蛋白質發生不利氧化。亦可使用抗氧化賦形劑來防止蛋白質之氧化降解。就此而言，適用抗氧化劑有還原劑、氧/自由基清除劑及螯合劑。用於根據本發明之治療蛋白質調配物中的抗氧化劑較佳為水溶性的且在產品之整個儲架壽命中維持其活性。就此而言，EDTA為根據本發明之較佳抗氧化劑。抗氧化劑可破壞蛋白質。舉例而言，諸如麩胱甘肽之還原劑尤其可破壞分子內二硫鍵聯。因而，對用於本發明中之抗氧化劑進行選擇，以尤其消除或充分降低其自身破壞調配物中之蛋白質的可能性。 根據本發明之調配物可包括作為蛋白質輔因子且對於形成蛋白質配位錯合物而言必需的金屬離子，諸如對於形成某些胰島素懸浮液而言必需的鋅。金屬離子亦可抑制一些使蛋白質降解之過程。然而，金屬離子亦催化使蛋白質降解之物理及化學過程。可使用鎂離子(10-120 mM)抑制天冬胺酸異構化形成異天冬胺酸。Ca+2 離子(至多100 mM)可增加人類去氧核糖核酸酶之穩定性。然而，Mg+2 、Mn+2 及Zn+2 可使rhDNA酶不穩定。類似地，Ca+2 及Sr+2 可使因子VIII穩定，Mg+2 、Mn+2 及Zn+2 、Cu+2 及Fe+2 可使其不穩定，且Al+3 離子可增加其聚集。 本發明之抗體構築體調配物之實施例進一步包含一或多種防腐劑。當開發涉及自同一容器中取出超過一次之多劑量非經腸調配物時，防腐劑為必需的。其主要功能為抑制微生物生長及在藥物產品之整個儲架壽命或使用期限中確保產品無菌。常用防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。雖然防腐劑具有用於小分子非經腸劑之悠久歷史，但開發包括防腐劑之蛋白質調配物可能具有挑戰性。防腐劑幾乎始終對蛋白質具有致不穩定作用(聚集)，且此已成為限制其用於多劑量蛋白質調配物中之主要因素。迄今為止，大部分蛋白質藥物調配為僅供單次使用。然而，當多劑量調配物有可能時，其具有實現患者便利性及增加市場性之附加優勢。良好實例為人類生長激素(hGH)，其中開發防腐調配物已導致更便利之多次使用注射筆出現商業化。市場上現有至少四種此種含有hGH之防腐調配物的筆裝置。Norditropin (液體，Novo Nordisk)、Nutropin AQ (液體，Genentech)及Genotropin (凍乾，雙腔室藥筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而Somatrope (Eli Lilly)係用間甲酚調配。在調配及開發防腐劑型期間需要考慮若干態樣。必須對藥物產品中之有效防腐劑濃度進行最佳化。此需要用賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性之濃度範圍在劑型中測試指定防腐劑。 正如所料，開發含有防腐劑之液體調配物比凍乾調配物更具挑戰性。可在無防腐劑之情況下將冷凍乾燥產物凍乾，且在使用時用含防腐劑之稀釋劑復原。由此縮短防腐劑與蛋白質接觸之時間，從而顯著降低相關穩定性風險。在液體調配物之情況下，應在整個產品儲架壽命(約18至24個月)內維持防腐劑有效性及穩定性。應注意之要點為含有活性藥物及所有賦形劑組分之最終調配物中應顯示防腐劑有效性。 本文中所揭示之抗體構築體亦可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或界面活性劑構成之小囊泡，其適用於遞送藥物至哺乳動物。脂質體之組分通常排列於雙層結構中，類似於生物膜之脂質排列。含有抗體構築體之脂質體係藉由此項技術中已知的方法來製備，諸如以下文獻中所描述：Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及WO 97/38731。具有增加之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物來產生。使脂質體經由具有限定孔徑之過濾器擠出以產生具有所要直徑之脂質體。本發明之抗體構築體之Fab'片段可經由二硫鍵互換反應結合至如Martin等人, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)中所描述之脂質體。脂質體內視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人, J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)。 一旦已調配醫藥組成物後，其便可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或者作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。此種調配物可呈即用形式或呈投與前復原形式(例如凍乾)儲存。 可例如藉由細胞毒性分析來測定本文中所定義之醫藥組成物之生物活性，如以下實例中、WO 99/54440中或Schlereth等人(Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12)所描述。如本文中所使用之「效力」或「活體內效力」係指對利用本發明之醫藥組成物的療法的反應，使用例如標準化NCI反應準則。使用本發明之醫藥組成物的療法的成果或活體內效力係指組成物用於其預定目的之有效性，亦即，組成物產生其所要效應(亦即，病理性細胞，例如腫瘤細胞之耗竭)之能力。可藉由對個別病種建立標準方法來監測活體內效力，包括但不限於白血球計數、差示法、螢光活化細胞分選、骨髓吸出。另外，可使用各種疾病特異性臨床化學參數及其他確立標準方法。此外，可使用電腦輔助斷層攝影、X射線、核磁共振斷層攝影(例如，對於基於國家癌症學會準則之反應評定[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999年4月; 17(4): 1244])、正電子發射斷層攝影掃描、白血球計數、差示法、螢光活化細胞分選、骨髓吸出、淋巴結活檢/組織學以及各種淋巴瘤特異性臨床化學參數(例如乳酸脫氫酶)及其他確立標準方法。 在諸如本發明醫藥組成物之藥物的開發中的另一主要挑戰為藥物動力學性質之可預測調節。為此，可確定藥物候選物之藥物動力學輪廓，亦即，影響特定藥物治療指定病狀之能力的藥物動力學參數的輪廓。藥物之影響藥物治療某一病種之能力的藥物動力學參數包括但不限於：半衰期、分佈體積、肝臟首過代謝及血清結合度。指定藥物試劑之效力可受以上所提及之參數中之每一者影響。 「半衰期」意謂50%之所投與藥物被生物過程，例如代謝、排泌等消除之時間。「肝臟首過代謝」意謂藥物在第一次與肝臟接觸後，亦即，在其第一次通過肝臟期間被代謝之傾向。「分佈體積」意謂藥物通過體內不同區室，如例如細胞內及細胞外空間、組織及器官等之滯留度及藥物在此等區室內之分佈。「血清結合度」意謂藥物與血清蛋白相互作用及結合血清蛋白，諸如白蛋白，從而導致藥物之生物活性降低或喪失的傾向。 藥物動力學參數亦包括生體可用率、時滯(Tlag)、Tmax、吸收率、更快起效及/或指定量之投與藥物的Cmax。「生體可用率」意謂血液區室中之藥物的量。「時滯」意謂投與藥物與可在血液或血漿中偵測及量測到其之間的時間延遲。「Tmax」為藥物達到最大血液濃度之後的時間，且「Cmax」為用指定藥物獲得之最大血液濃度。達到藥物之生物效應所需之血液或組織藥物濃度的時間受所有參數影響。例如Schlereth等人之出版物(Cancer Immunol. Immunother. 20(2005), 1-12)中亦闡述可在如以上所概述之非黑猩猩靈長類動物中進行之臨床前動物試驗中測定展現跨物種特異性之雙特異性抗體構築體之藥物動力學參數。 在本發明之較佳態樣中，醫藥組成物在約-20℃下穩定至少四週。如自所附實例顯而易見，可使用不同的系統來測試本發明之抗體構築體之品質相對於先前技術抗體構築體之相應狀態之品質。應理解，彼等測試符合「ICH Harmonised Tripartite Guideline:Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C andSpecifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B 」，且因而被選擇用於提供穩定性指示輪廓，由此提供偵測產物之一致性、純度及效能變化的必然性。已廣泛接受術語純度為相對術語。由於糖基化、脫醯胺化或其他異質性之影響，通常將藉由超過一種方法來評定生物技術/生物產品之絕對純度且所得出之純度值具有方法依賴性。出於穩定性測試之目的，純度測試將聚焦於測定降解產物之方法。 為了評定包含本發明之抗體構築體之醫藥組成物的品質，可藉由例如分析溶液中可溶性聚集物之含量(HMWS，依據粒徑排阻)加以分析。在約-20℃下穩定至少四週較佳以少於1.5% HMWS、較佳少於1% HMWS之含量為特徵。 以上詳細展示了呈醫藥組成物形式之較佳抗體構築體調配物。然而，以下調配物可能不太可取且因而被棄用： • 調配物A： 20 mM磷酸鉀、150 mM L-精胺酸鹽酸鹽、6% (w/V)二水合海藻糖、0.01% (w/V)聚山梨糖醇酯80，pH 6.0 • 調配物B： 10 mM麩胺酸鹽、4% (w/V)甘露糖醇、2% (w/V)蔗糖、0.01% (w/V)聚山梨糖醇酯80，pH 4.0 評定呈醫藥組成物形式之本發明抗體構築體之穩定性的其他實例提供於所附實例4至實例12中。在彼等實例中，就於不同醫藥調配物中之不同應力狀態測試本發明之抗體構築體之實施例，並且將結果與此項技術中已知的雙特異性T細胞接合抗體構築體之其他半衰期延長(HLE)形式相比較。一般而言，設想根據本發明之具有特定FC形態之抗體構築體通常在大範圍應力狀態，諸如溫度及光應力下比具有不同HLE形式之抗體構築體及不具任何HLE形式之抗體構築體(例如，「典型」抗體構築體)兩者更穩定。該溫度穩定性可有關於降低之溫度(室溫以下，包括冷凍)及增高之溫度(室溫以上，包括高達或高於體溫之溫度)。如熟習此項技術者應承認，就臨床實踐中幾乎不可避免之應力而言，此種改良之穩定性使得抗體構築體安全，此係因為臨床實踐中將出現較少降解產物之故。結果，該增加之穩定性意謂增加之安全性。 一個實施例提供本發明之抗體構築體或根據本發明方法產生之抗體構築體，以用於預防、治療或改善增殖性疾病、腫瘤疾病、病毒性疾病或免疫學病症。 本文中所描述之調配物適用作醫藥組成物用於治療、改善及/或預防有需要之患者的如本文中所描述之病理學醫學病狀。術語「治療」係指治療性治療及預防性措施。治療包括向具有疾病/病症、疾病/病症之症狀或疾病/病症之素因的患者體內、分離之組織或細胞應用或投與調配物，目的在於治癒、醫治、緩解、減輕、改變、補救、改善、改良或影響疾病、疾病之症狀或疾病之素因。 如本文中所使用之術語「改善」係指藉由向有需要之個體投與根據本發明之抗體構築體而對患有如下文所說明之腫瘤或癌症或轉移性癌症的患者的疾病狀態產生的任何改良。此種改良亦可視作患者之腫瘤或癌症或轉移性癌症之進展減緩或終止。如本文中所使用之術語「預防」意謂藉由向有需要之個體投與根據本發明之抗體構築體來避免患有如下文所說明之腫瘤或癌症或轉移性癌症之患者發作或復發。 術語「疾病」係指將受益於用本文中所描述之抗體構築體或醫藥組成物進行治療的任何病狀。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物傾向於所論述之疾病的病理學病狀。 「贅生物」為組織異常生長，通常但並非一貫形成腫塊。當亦形成腫塊時，其通常稱為「腫瘤」。贅生物或腫瘤或可為良性的、潛在惡性的(癌前)或惡性的。惡性贅生物通常稱為癌症。其通常侵襲並破壞周圍組織並且可形成轉移，亦即，其擴散至體內其他部分、組織或器官。因此，術語「轉移性癌症」涵蓋轉移至除原始腫瘤之組織或器官以外的其他組織或器官。淋巴瘤及白血病為淋巴贅生物。出於本發明之目的，其亦由術語「腫瘤」或「癌症」涵蓋。 術語「病毒性疾病」描述由個體之病毒感染引起的疾病。 如本文中所使用之術語「免疫學病症」描述符合此術語之常用定義的免疫學病症，諸如自體免疫疾病、過敏、免疫缺乏。 在一個實施例中，本發明提供一種治療或改善增殖性疾病、腫瘤疾病、病毒性疾病或免疫學病症之方法，該方法包括向有需要之個體投與本發明之抗體構築體或根據本發明方法產生之抗體構築體的步驟。 術語「有需要之個體」或「需要治療」之彼等個體包括已患有病症之彼等個體以及欲預防病症之彼等個體。有需要之個體或「患者」包括接受預防性或治療性治療之人類及其他哺乳動物個體。 本發明之抗體構築體一般將設計成針對特定投與途徑及方法、針對特定劑量及投與頻率、針對特定疾病之特定治療、具有一定範圍之生體利用率及持續時間等等。較佳以對投與部位而言可接受之濃度來調配組成物之物質。 因而可根據本發明設計調配物及組成物，以便藉由任何適合之投與途徑進行遞送。在本發明之上下文中，投與途徑包括但不限於 • 局部途徑(諸如經表皮、吸入、經鼻、經眼、經耳、經陰道、經黏膜)； • 經腸途徑(諸如經口、經胃腸、經舌下、經唇下、經口腔、經直腸)；及 • 非經腸途徑(諸如經靜脈內、經動脈內、經骨內、經肌肉內、經腦內、經腦室內、經硬膜外、經鞘內、經皮下、經腹膜內、經羊膜外、經關節內、經心內、經皮內、經病變內、經子宮內、經膀胱內、經玻璃體內、經皮、經鼻內、經黏膜、經滑膜內、經管腔內)。 本發明之醫藥組成物及抗體構築體尤其適用於非經腸投與，例如經皮下或靜脈內遞送，例如藉由注射，諸如藥團注射，或藉由輸注，諸如連續輸注。可使用醫療裝置投與醫藥組成物。用於投與醫藥組成物之醫療裝置之實例描述於美國專利第4,475,196號、第4,439,196號、第4,447,224號、第4,447,233號、第4,486,194號、第4,487,603號、第4,596,556號、第4,790,824號、第4,941,880號、第5,064,413號、第5,312,335號、第5,312,335號、第5,383,851號及第5,399,163中。 特定言之，本發明提供適合組成物之不間斷投與。作為一非限制性實例，不間斷或實質上不間斷，亦即，連續投與可藉由患者佩戴之用於計量流入患者體內之治療劑的小型泵系統來實現。可藉由使用該泵系統來投與包含本發明之抗體構築體的醫藥組成物。此種泵系統一般為此項技術中已知的，且通常依賴於週期性更換含有欲輸注之治療劑的藥筒。當更換此種泵系統中之藥筒時，可尋求暫時中斷否則不間斷之流入患者體內之治療劑流。在此種情況下，藥筒替換前之投與階段及藥筒替換後之投與階段仍將被視為在本發明之醫藥裝置及方法共同組成一種「不間斷投與」此種治療劑之含義內。 構築體可利用包括用於驅動流體流出儲存器之流體驅動機構及用於啟動該驅動機構之啟動機構的流體遞送裝置或小型泵系統經靜脈內或皮下進行本發明之抗體構築體之連續或不間斷投與。用於經皮下投與之泵系統可包括用於穿透患者之皮膚並且將適合之組成物遞送至患者體內的針或插管。該泵系統可直接固定或附接至患者之皮膚而與靜脈、動脈或血管無關，由此允許該泵系統與患者之皮膚直接接觸。泵系統可附接至患者之皮膚持續24小時直至若干天。泵系統可具有較小尺寸且具有較小容積之儲存器。作為一非限制性實例，欲投與之適合醫藥組成物的儲存器的容積可處於0.1與50 ml之間。 亦可利用佩戴於皮膚上且以一定間隔加以替換之貼片經皮進行連續投與。熟習此項技術者瞭解適用於此目的之藥物遞送用貼片系統。應注意，經皮投與尤其順應於不間斷投與，此係因為更換第一廢貼片可有利地與例如在皮膚表面上緊鄰第一廢貼片處且緊接移除第一廢貼片之前置放新的第二貼片同時實現。不會出現流體間斷問題或電源電池故障。 若醫藥組成物已凍乾，則投與前首先在適當液體中復原凍乾物質。可在例如抑細菌注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)或與凍乾前蛋白質所處之調配物相同的調配物中復原凍乾物質。 可將本發明之組成物以適合之劑量投與個體，該適合之劑量可例如利用藉由向非黑猩猩靈長類動物，例如獼猴投與遞增劑量之本文中所描述之展現跨物種特異性之本發明抗體構築體的劑量遞增研究來決定。如以上所闡述，本文中所描述之展現跨物種特異性之本發明抗體構築體可有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物之臨床前測試及作為藥物用於人類。劑量方案將由主治醫師及臨床因素決定。如醫學技術中眾所周知，任一患者之劑量均視許多因素而定，包括患者之體型、體表面積、年齡、欲投與之特定化合物、性別、投與時間及途徑、一般健康狀況及並行投與之其他藥物。 術語「有效劑量」定義為足以達成或至少部分地達成所要效應之量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分地阻滯已罹患疾病之患者的疾病及其併發症的量。對此用途有效之量或劑量將視所治療之病狀(適應症)、所遞送之抗體構築體、治療情形及目標、疾病之嚴重程度、先前療法、患者之臨床史及對治療劑之反應、投與途徑、患者之體型(體重、體表面積或器官大小)及/或狀況(年齡及一般健康狀況)以及患者自身免疫系統之一般狀態而定。可根據主治醫師之判斷來調節適當劑量，以便可一次性或經一系列投與而將其投與患者，及以便獲得最佳治療效應。 視以上所提及之因素而定，典型劑量可介於約0.1 μg/kg至多達約30 mg/kg或更高之範圍內。在特定實施例中，劑量可介於1.0 μg/kg直至約20 mg/kg，視情況10 μg/kg直至約10 mg/kg或100 μg/kg直至約5 mg/kg之範圍內。 治療有效量之本發明抗體構築體較佳降低疾病症狀之嚴重程度、增加無疾病症狀時段之頻率或持續時間或者預防由於病痛所致之損傷或失能。相對於未治療之患者，在治療表現靶細胞抗原之腫瘤時，治療有效量之本發明抗體構築體，例如抗靶細胞抗原/抗CD3抗體構築體較佳抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可在預示效力之動物模型中評估化合物抑制腫瘤生長之能力。 醫藥組成物可作為溶膠治療劑或視需要與其他療法，諸如抗癌療法，例如其他蛋白質及非蛋白質藥物組合投與。此等藥物可與包含如本文中所定義之本發明抗體構築體的組成物同時或在以時間限定之間隔及劑量投與該抗體構築體之前或之後分開投與。 如本文中所使用之術語「有效且無毒之劑量」係指本發明抗體構築體之高達足以引起病理性細胞耗竭、腫瘤消除、腫瘤收縮或疾病穩定而不存在或基本上不存在重大毒性效應之可耐受劑量。此種有效且無毒之劑量可例如藉由此項技術中所描述之劑量遞增研究來確定，且應低於誘導嚴重不利副事件(劑量限制毒性，DLT)之劑量。 如本文中所使用之術語「毒性」係指不良事件或嚴重不良事件中所體現之藥物毒性效應。此等副事件可能係指投與之後缺乏總體藥物耐受性及/或缺乏局部耐受性。毒性亦可包括由藥物引起之致畸效應或致癌效應。 如本文中所使用之術語「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」定義在投與之後(局部耐受性)及較久藥物應用時段期間不直接誘導嚴重不良事件之情況下投與藥物。可例如在治療及隨訪時段期間定期評估「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」。量測包括臨床評估，例如器官體現，及篩檢實驗室異常。可根據NCI-CTC及/或MedDRA標準來進行臨床評估且記錄/編碼相對於正常發現之偏差。器官體現可包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律不整、凝固及其類似項之準則，如例如不良事件常用術語準則v3.0 (CTCAE)中所闡述。可測試之實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝固輪廓及尿液分析以及對其他體液，諸如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體及其類似物之檢查。因而，可例如藉由身體檢查、成像技術(亦即超音波、X射線、CT掃描、磁共振成象(MRI)、其他利用技術裝置之措施(亦即，心電圖)、生命體征、藉由量測實驗室參數及記錄不良事件來評定安全性。舉例而言，可藉由組織病理學及/或組織化學方法來檢查非黑猩猩靈長類動物在根據本發明之用途及方法中的不良事件。 例如生物技術衍生藥物臨床前安全性評估S6、ICH協調三分規範、1997年7月16日之ICH指導委員會會議中亦提及以上術語。 最後，本發明提供一種套組，該套組包含本發明之抗體構築體或根據本發明方法產生之抗體構築體、本發明之醫藥組成物、本發明之聚核苷酸、本發明之載體及/或本發明之宿主細胞。 在本發明之上下文中，術語「套組」意謂共同封裝於容器、儲器或其他器物中之兩種或更多種組分，其中一種對應於本發明之抗體構築體、醫藥組成物、載體或宿主細胞。套組因此可描述為足以達成某一目標之一組產品及/或器具，其可作為單一單元銷售。 該套組可包含一或多個具有任何適當形狀、大小及材料(較佳為防水材料，例如塑膠或玻璃)之儲器(諸如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶、袋)，該一或多個儲器含有適量之本發明之抗體構築體或醫藥組成物以供投與(參見上文)。該套組可另外含有使用指導(例如呈活頁或使用手冊形式)；用於投與本發明之抗體構築體之構件，諸如注射器、泵、輸注器或其類似物；用於復原本發明之抗體構築體的構件；及/或用於稀釋本發明之抗體構築體的構件。 本發明亦提供具有單劑量投與單元之套組。本發明之套組亦可含有包含乾燥/凍乾抗體構築體之第一儲器及包含水性調配物之第二儲器。在本發明之某些實施例中，提供含有單腔室及多腔室預填充注射器(例如液體注射器及凍乾劑注射器)之套組。 本發明之醫藥組成物進一步包含緩衝劑，該緩衝劑可選自由以下各項組成之群：磷酸鉀、乙酸/乙酸鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、琥珀酸/琥珀酸鈉、酒石酸/酒石酸鈉、組胺酸/組胺酸鹽酸鹽、甘胺酸、Tris、麩胺酸鹽、乙酸鹽及其混合物，且特定言之選自磷酸鉀、檸檬酸/檸檬酸鈉、琥珀酸、組胺酸、麩胺酸鹽、乙酸鹽及其組合。 適合之緩衝劑濃度涵蓋約200 mM或更低之濃度，諸如約190 mM、180 mM、170 mM、160 mM、150 mM、140 mM、130 mM、120 mM、110 mM、100 mM、80 mM、70 mM、60 mM、50 mM、40 mM、30 mM、20 mM、10 mM或5 mM。熟習此項技術者應能夠調節緩衝劑濃度以便提供如本文中所描述之醫藥組成物之穩定性。特定言之，本發明之醫藥組成物中之設想緩衝劑濃度介於約5 mM至約200 mM、較佳約5 mM至約100 mM且更佳約10 mM至約50 mM之範圍內。 如本文中所使用，術語「醫藥組成物」係指適合投與有需要之個體的組成物。術語「個體」或「個人」或「動物」或「患者」在本文中可互換用於指需要投與本發明之醫藥組成物的任何個體，特定言之，哺乳動物個體。哺乳動物個體包括人類、非人類靈長類動物、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛及其類似物，以人類較佳。本發明之醫藥組成物為穩定的且在醫藥學上可接受的，亦即，能夠在投與醫藥組成物之個體中引發所要治療效應而不引起任何不合需要之局部或全身效應。特定言之，本發明之醫藥學上可接受之組成物可為無菌的及/或醫藥學上惰性的。特定言之，術語「醫藥學上可接受」可意謂經管理機構或其他一般認可之藥典批准用於動物且更特定言之用於人類。 本發明之醫藥組成物包含較佳治療有效量之一種或複數種本文中所描述之雙特異性單鏈抗體構築體，β-環糊精及緩衝劑。「治療有效量」意謂引發所要治療效應之該構築體之量。治療效力及毒性可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如ED50 (在50%群體中之治療有效劑量)及LD50 (在50%群體中之致死劑量)。治療效應與毒性效應之間的劑量比為治療指數，並且可將其表述為比率ED50/LD50。展現較大治療指數之醫藥組成物一般較佳。 該組成物可包含β-環糊精及先前所描述之緩衝劑。該醫藥組成物可視情況包含一或多種其他賦形劑，只要其不降低或消除如本文中所描述之其有利性質且特定言之其穩定性即可。 本發明中可出於多種目的而使用賦形劑，諸如調節調配物之物理、化學或生物學性質(諸如調節黏度)及或本發明方法之物理、化學或生物學性質，以進一步改良有效性及或進一步穩定此種調配物及方法以免由於例如製造、運輸、儲存、使用前製備、投與期間及此後出現之應力而受到降解及損壞。術語「賦形劑」一般包括填充劑、黏合劑、崩解劑、包衣劑、吸附劑、抗黏附劑、助流劑、防腐劑、抗氧化劑、調味劑、著色劑、甜味劑、溶劑、共溶劑、緩衝劑、螯合劑、黏度賦予劑、界面活性劑、稀釋劑、潤濕劑、載劑、稀釋劑、防腐劑、乳化劑、穩定劑及張力調節劑。 熟習此項技術者應顯而易見，醫藥組成物之不同賦形劑(例如以上所列出之彼等賦形劑)可具有例如不同的作用，且胺基酸可充當緩衝劑、穩定劑及/或抗氧化劑；甘露糖醇可充當增積劑及/或張力增強劑；氯化鈉可充當遞送媒劑及/或張力增強劑；等等。 聚醇為適用於液體及凍乾調配物兩者以保護蛋白質免受物理及化學降解過程影響之穩定劑，而且亦適用於調節調配物之張力。聚醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖及山梨糖醇，以及多元醇，諸如甘油及丙二醇，以及出於本文中所論述之目的，聚乙二醇(PEG)及相關物質。甘露糖醇通常用於確保凍乾調配物餅之結構穩定性。其確保餅之結構穩定性。其一般與凍乾保護劑，例如蔗糖一起使用。山梨糖醇及蔗糖為常用張力調節劑，且作為防止運輸期間之凍融應力或製造過程中製備塊體的穩定劑。PEG適用於穩定蛋白質且作為低溫保護劑。 界面活性劑通常用於防止、最小化或減少表面吸附。蛋白質分子可能易於吸附於表面上且變性，並且隨之聚集在空氣-液體、固體-液體及液體-液體界面處。此等作用一般與蛋白質濃度成反比。此等不利相互作用一般與蛋白質濃度成反比，且通常因物理振盪，諸如產品運輸及處理過程中所產生之物理振盪而加重。常用界面活性劑包括聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80、脫水山梨糖醇聚乙氧基醇之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188。界面活性劑亦常用於控制蛋白質構形穩定性。界面活性劑之使用就此而言具有蛋白質特異性，此係因為任何指定界面活性劑均通常將使一些蛋白質穩定且使其他蛋白質不穩定。 聚山梨糖醇酯容易發生氧化降解，且在供應時往往含有足以致使蛋白質殘基側鏈、尤其是甲硫胺酸氧化之量的過氧化物。因此，應謹慎使用聚山梨糖醇酯，並且當使用時應採用其最低有效濃度。 在一定程度上，抗氧化劑可藉由維持適當水準之環境氧及溫度以及藉由避免曝露於光來防止醫藥調配物中之蛋白質發生不利氧化。亦可使用抗氧化賦形劑來防止蛋白質之氧化降解。就此而言，適用抗氧化劑有還原劑、氧/自由基清除劑及螯合劑。用於治療蛋白質調配物中之抗氧化劑較佳為水溶性的，且在產品之整個儲架壽命中維持其活性。EDTA為適用實例。 金屬離子可充當蛋白質輔因子且使得能夠形成蛋白質配位錯合物。金屬離子亦可抑制一些使蛋白質降解之過程。然而，金屬離子亦催化使蛋白質降解之物理及化學過程。可使用鎂離子(10-120 mM)抑制天冬胺酸異構化形成異天冬胺酸。Ca+2 離子(至多100 mM)可增加人類去氧核糖核酸酶之穩定性。然而，Mg+2 、Mn+2 及Zn+2 可使rhDNA酶不穩定。類似地，Ca+2 及Sr+2 可使因子VIII穩定，Mg+2 、Mn+2 及Zn+2 、Cu+2 及Fe+2 可使其不穩定，且Al+3 離子可增加其聚集。 防腐劑之主要功能為抑制微生物生長及在藥物產品之整個儲架壽命或使用期限中確保產品無菌，且多劑量調配物尤其需要防腐劑。常用防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。雖然防腐劑具有用於小分子非經腸劑之悠久歷史，但開發包括防腐劑之蛋白質調配物可能具有挑戰性。防腐劑幾乎始終對蛋白質具有致不穩定作用(聚集)，且此已成為限制其用於蛋白質調配物中之主要因素。迄今為止，大部分蛋白質藥物調配為僅供單次使用。然而，當多劑量調配物有可能時，其具有實現患者便利性及增加市場性之附加優勢。良好實例為人類生長激素(hGH)，其中開發防腐調配物已導致更便利之多次使用注射筆出現商業化。 正如所料，開發含有防腐劑之液體調配物比凍乾調配物更具挑戰性。可在無防腐劑之情況下將冷凍乾燥產物凍乾，且在使用時用含防腐劑之稀釋劑復原。由此縮短防腐劑與蛋白質接觸之時間，從而顯著降低相關穩定性風險。在液體調配物之情況下，應在整個產品儲架壽命(約18至24個月)內維持防腐劑有效性及穩定性。應注意之要點為含有活性藥物及所有賦形劑組分之最終調配物中應顯示防腐劑有效性。 根據本發明，可使用鹽來例如調節醫藥調配物之離子強度及/或等滲透壓性及/或進一步改良抗體構築體或其他成分之溶解度及/或物理穩定性。眾所周知，離子可藉由結合蛋白質表面上之帶電殘基及藉由屏蔽蛋白質中之帶電及極性基團且降低其靜電相互作用、吸引相互作用及排斥相互作用之強度來穩定蛋白質之天然狀態。特定言之，離子亦可藉由結合蛋白質之變性肽鍵(--CONH)來穩定蛋白質之變性狀態。此外，與蛋白質中帶電及極性基團之離子相互作用亦可減少分子間靜電相互作用，且由此防止或減少蛋白質聚集及不溶性。離子物質在其對蛋白質之影響方面存在顯著差異。已發現可用於調配根據本發明之醫藥組成物的離子的眾多類別等級及其對蛋白質之影響。一個實例為霍夫邁斯特序列，其依據離子溶質及極性非離子溶質對蛋白質在溶液中之構形穩定性的影響來對其進行分級。致穩定溶質稱為「親液劑」。致不穩定溶質稱為「離液劑」。親液劑通常以高濃度(例如＞1莫耳濃度硫酸銨)使用，以便使蛋白質自溶液中沈澱(「鹽析」)。離液劑通常用於使蛋白質變性及/或溶解(「鹽溶」)。用於「鹽溶」及「鹽析」之離子的相對有效性定義其在霍夫邁斯特序列中之位置。 游離胺基酸可作為增積劑、穩定劑及抗氧化劑用於醫藥組成物以及其他標準用途中。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於使調配物中之蛋白質穩定。甘胺酸適用於凍乾以確保正確餅結構及性質。精胺酸可能適用於在液體調配物及凍乾調配物兩者中抑制蛋白質聚集。甲硫胺酸適用作抗氧化劑。 尤其適用於調配醫藥組成物之賦形劑包括蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、精胺酸、離胺酸、聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80、泊洛沙姆188、普洛尼克及其組合。該等賦形劑可以不同的濃度存在於醫藥組成物中，只要該組成物展現如本文中所例示之理想性質，且特定言之有助於穩定所含有之雙特異性單鏈抗體構築體即可。舉例而言，蔗糖可以介於2% (w/v)與12% (w/v)之間的濃度，亦即，以12% (w/v)、11% (w/v)、10% (w/v)、9% (w/v)、8% (w/v)、7% (w/v)、6% (w/v)、5% (w/v)、4% (w/v)、3% (w/v)或2% (w/v)之濃度存在於醫藥組成物中。較佳蔗糖濃度介於4 % (w/v)與10% (w/v)之間的範圍內，且更佳介於6 % (w/v)與10% (w/v)之間。聚山梨糖醇酯80可以介於0.001% (w/v)與0.5% (w/v)之間的濃度，亦即，以0.5% (w/v)、0.2% (w/v)、0.1% (w/v)、0.08% (w/v)、0.05% (w/v)、0.02% (w/v)、0.01% (w/v)、0.008% (w/v)、0.005% (w/v)、0.002% (w/v)或0.001% (w/v)之濃度存在於醫藥組成物中。較佳聚山梨糖醇酯80濃度介於0.002% (w/v)與0.5% (w/v)之間的範圍內，且更佳介於0.005% (w/v)與0.02% (w/v)之間。 適用於調配醫藥組成物之防腐劑一般包括抗微生物劑(例如抗細菌或抗真菌劑)、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物；實例為：殺藻胺、苯甲酸、水楊酸、乙汞硫柳酸鈉、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定、山梨酸或過氧化氫)。抗微生物防腐劑為用於藉由減少微生物繁殖來延長藥物之儲架壽命的物質。尤其適用於調配本發明之醫藥組成物的防腐劑包括苯甲醇、氯丁醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、對羥基苯甲酸丙酯、乙汞硫柳酸鈉。此等防腐劑之結構及典型使用濃度描述於Meyer等人, J Pharm Sci. 96(12), 3155之表1中。 上述防腐劑可以不同的濃度存在於醫藥組成物中。舉例而言，苯甲醇可以介於0.2%與1.1% (v/v)之間的範圍內的濃度存在，氯丁醇係以介於0.3%至0.5% (v/v)之間的範圍內的濃度存在，苯酚係以介於0.07%與0.5% (v/v)之間的範圍內的濃度存在，間甲酚係以介於0.17%與0-32% (v/v)之間的範圍內的濃度存在，或乙汞硫柳酸鈉係以介於0.003%至0.01% (v/v)之間的範圍內的濃度存在。對羥基苯甲酸甲酯之較佳濃度處於0.05%與0.5% (v/v)之範圍內，苯氧乙醇之較佳濃度處於0.1%與3% (v/v)之範圍內，且對羥基苯甲酸丙酯之較佳濃度處於0.05 %與0.5 % (v/v)之範圍內。 然而，亦設想醫藥組成物不包含任何防腐劑。特定言之，本發明尤其提供一種不含防腐劑之醫藥組成物，其包含濃度為約0.5 mg/ml之雙特異性單鏈抗體構築體、濃度為約1% (w/v)之磺酸基丁基醚-β-環糊精鈉鹽及濃度為約10 mM之磷酸鉀，且進一步包含濃度為約8% (w/v)之蔗糖及濃度為約0.01 % (w/v)之聚山梨糖醇酯80，pH值為約6.0。 本發明之醫藥組成物可調配成各種形式，例如呈固體、液體、冷凍、氣體或凍乾形式，並且尤其可呈軟膏、乳膏、經皮貼片、凝膠、粉末、錠劑、溶液、氣霧劑、顆粒劑、丸劑、懸浮液、乳液、膠囊、糖漿、液體、酏劑、浸膏、酊劑或流浸膏形式。 一般而言，可構想本發明之醫藥組成物的各種儲存及/或劑量形式，視例如預定投與途徑、遞送形式及所要劑量而定(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第22版, Oslo, A.編, (2012))。熟習此項技術者應意識到，對特定劑型之此種選擇可例如影響本發明之抗體構築體之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除率速率。 舉例而言，醫藥組成物中之主要媒劑或載劑本質上可為水性或非水性的。適合之媒劑或載劑可為可能補充有非經腸投與組成物中常用之其他物質的注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液。中性緩衝生理鹽水或與血清白蛋白混合之生理鹽水為其他例示性媒劑。 當預期非經腸投與時，本發明之治療組成物可呈包含處於醫藥學上可接受之媒劑中的所要抗體構築體的無熱原、非經腸可接受之水溶液的形式提供。尤其適用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中將抗體構築體調配為適當經防腐之無菌等滲透壓溶液。該製備可包括調配所要分子與諸如可注射微球體、生物可蝕粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑，由此可提供可經由貯庫注射遞送之產物的控制或持續釋放。亦可使用透明質酸，其具有促進在循環中之持續時間的作用。可使用可植入藥物遞送裝置來引入所要抗體構築體。 本文中亦設想持續或控制遞送/釋放調配物。用於調配多種其他持續或控制遞送手段(諸如脂質體載劑、生物可蝕微粒或多孔珠粒及貯庫注射劑)之技術對於熟習此項技術者亦為已知的。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，該案描述控制釋放多孔聚合物微粒以用於遞送醫藥組成物。持續釋放製劑可包括呈成型製品(例如，膜或微膠囊)形式之半滲透聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸鹽共聚物(Sidman等人, 1983, Biopolymers 2:547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯) (Langer等人, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277；及Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人, 1981, 同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組成物亦可包括脂質體，其可藉由此項技術中已知的若干方法中的任一種來製備。參見例如Eppstein等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號、第EP 088,046號及第EP 143,949號。抗體構築體亦可嵌埋於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中之例如藉由團聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。此種技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第22版, Oslo, A.編, (2012)中。 用於活體內投與之醫藥組成物通常呈無菌製劑形式提供。可藉由經無菌過濾膜過濾而實現滅菌。當將組成物凍乾時，可在凍乾及復原之前或之後使用此方法進行滅菌。用於非經腸投與之組成物可呈凍乾形式或呈溶液形式儲存。一般將非經腸組成物置於具有無菌接取口之容器中，例如，靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶。 本文中所揭示之抗體構築體亦可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或界面活性劑構成之小囊泡，其適用於遞送藥物至哺乳動物。脂質體之組分通常排列於雙層結構中，類似於生物膜之脂質排列。含有抗體構築體之脂質體係藉由此項技術中已知的方法來製備，諸如以下文獻中所描述：Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及WO 97/38731。具有增加之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法利用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物來產生。使脂質體經由具有限定孔徑之過濾器擠出以產生具有所要直徑之脂質體。本發明之抗體構築體之Fab'片段可經由二硫鍵互換反應結合至如Martin等人, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)中所描述之脂質體。脂質體內視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人, J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)。 設想除本文中所定義之雙特異性單鏈抗體構築體以外，本發明之組成物亦可包含其他生物活性劑，視組成物之預定用途而定。此種藥劑可能呈作用於腫瘤及/或惡性細胞之特定藥物的形式，但亦設想其他活性劑，視醫藥組成物之預定用途而定，包括作用於胃腸系統之藥劑、抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇)、調節炎症性反應之藥物、作用於循環系統之藥物及/或諸如此項技術中已知的細胞激素之藥劑。亦設想本發明之醫藥組成物應用於共同療法中，亦即，與另一抗癌藥物組合。 一旦已調配醫藥組成物後，其便可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或者作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。此種調配物可呈即用形式或呈投與前復原形式(例如凍乾)儲存。例如，可在例如抑細菌注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)或與凍乾前蛋白質所處之調配物相同的調配物中復原凍乾物質。 一般可調配本發明之醫藥組成物以便藉由任何適合之投與途徑進行遞送。在本發明之上下文中，給藥途徑包括但不限於局部途徑(諸如經表皮、吸入、經鼻、經眼、經耳、經陰道、經黏膜)；經腸途徑(諸如經口、經胃腸、經舌下、經唇下、經口腔、經直腸)；及非經腸途徑(諸如經靜脈內、經動脈內、經骨內、經肌肉內、經腦內、經腦室內、經硬膜外、經鞘內、經皮下、經腹膜內、經羊膜外、經關節內、經心內、經皮內、經病變內、經子宮內、經膀胱內、經玻璃體內、經皮、經鼻內、經黏膜、經滑膜內、經管腔內)。 本文中所描述之醫藥組成物尤其適用於非經腸投與，例如經皮下或靜脈內遞送，例如藉由注射，諸如藥團注射，或藉由輸注，諸如連續輸注。可使用醫療裝置投與醫藥組成物。用於投與醫藥組成物之醫療裝置之實例描述於美國專利第4,475,196號、第4,439,196號、第4,447,224號、第4,447,233號、第4,486,194號、第4,487,603號、第4,596,556號、第4,790,824號、第4,941,880號、第5,064,413號、第5,312,335號、第5,312,335號、第5,383,851號及第5,399,163中。 亦可不間斷地投與本發明之醫藥組成物。作為一非限制性實例，不間斷或實質上不間斷，亦即，連續投與可藉由患者佩戴之用於計量流入患者體內之抗體構築體的小型泵系統來實現。可藉由使用該泵系統來投與醫藥組成物。此種泵系統一般為此項技術中已知的，且通常依賴於週期性更換含有欲輸注之治療劑的藥筒。當更換此種泵系統中之藥筒時，可尋求暫時中斷否則不間斷之流入患者體內之治療劑流。在此種情況下，藥筒替換前之投與階段及藥筒替換後之投與階段仍將被視為在本發明之醫藥裝置及方法共同組成一種「不間斷投與」此種治療劑之含義內。 可利用包括用於驅動流體流出儲存器之流體驅動機構及用於啟動該驅動機構之啟動機構的流體遞送裝置或小型泵系統經靜脈內或皮下進行本發明之醫藥組成物之連續或不間斷投與。用於經皮下投與之泵系統可包括用於穿透患者之皮膚並且將適合之組成物遞送至患者體內的針或插管。該泵系統可直接固定或附接至患者之皮膚而與靜脈、動脈或血管無關，由此允許該泵系統與患者之皮膚直接接觸。泵系統可附接至患者之皮膚持續24小時直至若干天。泵系統可具有較小尺寸且具有較小容積之儲存器。作為一非限制性實例，欲投與之適合醫藥組成物的儲存器的容積可處於0.1與50 ml之間。 亦可利用佩戴於皮膚上且以一定間隔加以替換之貼片經皮達成連續投與。熟習此項技術者瞭解適用於此目的之藥物遞送用貼片系統。應注意，經皮投與尤其順應於不間斷投與，此係因為更換第一廢貼片可有利地與例如在皮膚表面上緊鄰第一廢貼片處且緊接移除第一廢貼片之前置放新的第二貼片同時實現。不會出現流體間斷問題或電源電池故障。 熟習此項技術者將容易理解本發明之醫藥組成物一般可包含上述賦形劑中之任一種或其他活性劑，或可以任何適合之形式提供，只要其穩定且較佳展現與所附實例中已評估之包含β-環糊精之醫藥組成物相同的有利性質即可。熟習此項技術者將能夠調節各種組分以便提供穩定，亦即較佳實質上不含雙特異性單鏈抗體片段之聚集物及/或構形異構物的醫藥組成物。 ***** 必須注意，除非上下文另外清楚指示，否則如本文中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數參考物。因而，舉例而言，提及「一試劑」包括此種不同的試劑中之一或多種，且提及「該方法」包括提及熟習此項技術者已知的可修改或替代本文中所描述之方法的等效步驟及方法。 除非另外指示，否則位於一系列要素之前的術語「至少」應理解為係指該系列中之每個要素。熟習此項技術者僅使用常規實驗便將認識到或能夠確定本文中所描述之本發明之特定實施例的許多等效方案。意欲本發明涵蓋此種等效方案。 術語「及/或」在用於本文中時包括「及」、「或」及「由該術語連接之要素的所有或任何其他組合」的含義。 如本文中所使用之術語「約」或「大致」意謂在指定值或範圍之20%內，較佳在10%內，且更佳在5%內。然而，其亦包括名數，例如約20包括20。 術語「少於」或「大於」包括名數。舉例而言，小於20意謂小於或等於。類似地，多於或大於分別意謂多於或等於或者大於或等於。 貫穿本說明書及以下申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則字組「包含」及變化形式應理解為隱含包括所陳述之整數或步驟或者整數或步驟群組，而不排除任何其他整數或步驟或者整數或步驟群組。當用於本文中時，術語「包含」可用術語「含有」或「包括」或有時當用於本文中時用術語「具有」替代。 當用於本文中時，「由……組成」排除申請專利範圍內容中未說明之任何要素、步驟或成分。當用於本文中時，「基本上由……組成」不排除本質上不影響申請專利範圍之基本及新穎特徵的材料或步驟。 在本文中之各情況下，術語「包含」、「基本上由……組成」及「由……組成」中之每一者均可用另兩個術語替換。 應理解，本發明不限於本文中所描述之特定方法、方案、材料、試劑及物質等，且因而可變化。本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇僅由申請專利範圍來限定。 本說明書全文，無論上文抑或下文所引用之所有出版物及專利(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商之說明書、說明等)均以全文引用之方式併入本文中。本文中之任何內容均不應被視為承認本發明由於先前發明而無權先於此種揭示內容。在以引用之方式併入之材料與本說明書相矛盾或不一致的程度上，本說明書將優先於任何此種材料。 將自僅出於說明目的而提供之以下實例中獲得對本發明及其優勢之更透徹理解。該等實例不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實例 實例 1 將典型EGFRvIII BiTE®抗體構築體分別提供於pH 7.0或pH 4.0緩衝溶液中並且進行DSC。獲得抗體構築體之DSC熔融溫度，呈單一熔融事件形式。在pH 7下，Tm為65℃，而在pH 4下，Tm為59.5℃，亦即，比在中性培養基中低(參見圖3中之溫度記錄圖)。一般而言，Tm愈高代表化合物之穩定性愈高。實例 2 使用分子量截止值(MWCO)為10 kDa之膜，經由超濾/滲濾對分別含有經純化之典型或scFc提供之BiTE抗體構築體的預調配原料藥進行緩衝液交換,該等BiTE抗體構築體具有針對CDH19、EGFRvIII、CD33及CD19之第一靶結構域。藉由添加濃儲備溶液來達成最終調配物。各構築體之所得調配物為由20 mM磷酸鉀、150 mM L-精胺酸鹽酸鹽、6% (w/V)二水合海藻糖、0.01% (w/V)聚山梨糖醇酯80構成之處於pH 6.0下之K60RTrT及由10 mM麩胺酸鹽、4% (w/V)甘露糖醇、2% (w/V)蔗糖、0.01% (w/V)聚山梨糖醇酯80構成之處於pH 4.0下之G40MSuT。蛋白質濃度總計1.0 mg/mL。向1950 μL各測試溶液中摻加50 μL 1000 ppm矽標準溶液(Specpure，來自AlfaAesar，產品編號38717)，產生25 ppm尖峰。未摻加之測試溶液充當對照樣品。將摻加之測試溶液以及對照樣品填充至3cc I型玻璃小瓶中，且在37℃下培育24小時。藉由SE-UPLC分析所有樣品，以便對HMWS之量進行定量。作為結果，圖4(a)顯示在pH 4相對於pH 6下量測之CDH19 scFc抗體構築體之高分子量物質之百分比。在較低之pH 4.0下可見較低程度之聚集。圖4(b)顯示在4℃ (時間點T0、2w、4w)、25℃ (T0、1w、2w、4w)及37℃ (T0、1w、2w、4w)下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之主峰百分比：G4SuT包含10 mM麩胺酸鹽、9% (w/v)蔗糖、0.01%聚山梨糖醇酯80，G4TrT包含10 mM麩胺酸鹽、9% (w/v)海藻糖、0.01%聚山梨糖醇酯80，且G4MSuT包含10 mM麩胺酸鹽、4% (w/v)甘露糖醇、2%蔗糖、0.01%聚山梨糖醇酯80。在pH 4下顯示穩定性。將個別抗體構築體調配物儲存在不同的條件下以便進行穩定性監測。圖4(c)顯示在-20℃下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之主峰百分比。圖4(d)顯示在4℃(T0、2w、4w)、25℃(T0、1w、2w、4w)及37℃(T0、1w、2w、4w)下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之高分子量(HMW)峰百分比。圖4(e)顯示在-20℃(T0、4w)下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之HMW峰百分比。圖4(f)顯示在4℃(T0、2w、4w)、25℃(T0、1w、2w、4w)及37℃(T0、1w、2w、4w)下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之低分子量峰百分比。圖5顯示在6個月之後量測之EGFRvIII非scFC抗體構築體在pH範圍4至7之不同緩衝液中之主峰百分比。在pH 4.0下，抗體構築體具有最高主峰百分比。圖6：(a)顯示以不同濃度處於不同調配物中之CD33-scFc抗體構築體在4℃下之主峰百分比。「ccHFC」表示經特定修飾之cys駱駝化scFc結構域。低pH值調配物一貫具有較高單體物質。(b)顯示以不同濃度處於不同調配物中之CD33-scFc抗體構築體在25℃下之主峰百分比。「ccHFC」表示經特定修飾之cys駱駝化scFc結構域。低pH值調配物一貫具有較高單體物質。圖7：T0、7天、14天及1個月時如藉由SEC所量測之典型(非HLE) CD19×CD3 BiTE®抗體構築體之聚集百分比隨pH值變化之函數。該圖顯示在低pH值下，聚集量大幅降低。實例 3 ： 依序使用固定金屬親和層析(IMAC)及粒徑排阻層析(SEC)來純化EGFRvIII BiTE®抗體構築體。SEC溶析液含有處於20 mM檸檬酸及2% (w/v)二水合海藻糖中之0.43 mg/mL EGFRvIII，pH 5.0。將材料分成三部分。將第一部分保持在pH 5.0下。將其他部分之pH值分別調節至6.0及7.0。將所有部分濾過孔徑為0.2 μm之過濾器。最後藉由摻加濃賦形劑儲備溶液來調配各部分。表4提供關於最終調配物之概述。各調配物中之EGFRvIII濃度等於0.1 mg/mL。將調配物填充至1.0 mL 2R I型玻璃小瓶中，用丁基橡膠塞及觸發式鋁封封閉。表 4 ：測試調配物之概述。以下計畫表示具有 2(4-0) 種不同調配物之四因子全因素實驗設計。以星號 (*) 標記之調配物表示實驗設計之中點且已以一式三份製備。 將調配物在25℃下儲存四天，隨後藉由350 nm下之光學密度量測、粒徑排阻超高效層析及弱陽離子交換(WCX)層析加以分析。在96孔板中使用來自於Tecan之Tecan Infinite M1000板讀數器來量測350 nm下之光學密度。使用以下等式來計算聚集指數(AI)： AI = OD350 nm /(OD280 nm -OD350nm ) 應用SEC來測定各調配物中之高分子量物質(HMWS)的含量百分比及在應力之後的蛋白質濃度。在使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm管柱(Waters)之Aquity H-Class UPLC系統(Waters)上進行SE-UPLC。將柱溫設定至25℃。藉由應用等度方法，利用0.4 mL/min之流速來達成尺寸變異體之分離。移動相由100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl pH 6.8構成。運作時間總計6.0分鐘。將樣品於自動取樣器內保持在8℃下直至分析。注射總量3 μg之蛋白質。為了避免夾帶，在各樣品之後用40% ACN進行中間注射。基於螢光(激發280 nm，發射325 nm)進行偵測，以便對HMWS進行定量。為了測定蛋白質濃度，經由光二極體陣列(PDA)在280 nm下進行偵測。使用Empower® 軟體進行峰積分。報告HMWS之相對曲線下面積。 在使用Protein-Pak Hi Res CM 7 μm管柱(Waters，目錄號186004929)之Aquity H-Class UPLC系統(Waters)上進行WCX層析。將柱溫設定至30℃。藉由應用表 5 中所描述之梯度方法，使用0.65 mL/min之流速來達成電荷變異體之分離。移動相A及移動相B由20 mM磷酸鈉pH 6.5及20 mM磷酸鈉構成。表 5 ：用於 WCX 層析之梯度 將樣品於自動取樣器內保持在8℃下直至分析。將5 μg蛋白質注射至管柱上。用移動相A預稀釋樣品。為了避免夾帶，在各樣品之後用40% ACN進行中間注射。基於螢光(激發280 nm，發射325 nm)進行偵測。使用Empower® 軟體進行峰值積分。報告主峰(天然物質)之相對曲線下面積(AUC)。 使用Statistica軟體(Statsoft)來統計學評估以上調配參數對所量測之聚集指數、HMWS含量百分比、蛋白質濃度及WCX主峰豐度的影響。圖 8 描繪預測值分佈及合意性。最佳調配物謀求低聚集指數、低HMWS、高蛋白質濃度及高主峰百分比。如圖 8 所說明，藉由使用L-精案酸、高PS 80濃度及在低pH值下調配使合意性最大化。實例 4 使用蛋白A、陽離子交換(CEX)及羥基磷灰石(HA)層析來純化間皮素(MSLN)-scFc BiTE抗體構築體。隨後使用超濾/滲濾(UFDF)對HA溶析液進行預調配。藉由摻加濃賦形劑儲備溶液來達成最終調配物。表 6 提供關於測試調配物之概述。表 6 ：關於測試調配物之概述 將以上調配物填充至1.3 mL 2R I型玻璃小瓶中，用丁基橡膠塞及觸發式鋁封封閉。將調配物儲存在-20℃、25℃及37℃下多達四週及在2℃至8℃下多達15週。在所指定之時間點吸取樣品。另外，對樣品進行五個連續冷凍解凍循環(20℃-＞-50℃-＞20℃，0.3 K/min，在目標溫度下保持一小時)。藉由粒徑排阻超高效層析(SE-UPLC)及肽定位(僅針對無應力樣品及儲存於37℃下之樣品)來分析樣品。 在使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm管柱(Waters)之Aquity H-Class UPLC系統(Waters)上進行SE-UPLC。將柱溫設定至25℃。藉由應用等度方法，利用0.4 mL/min之流速來達成尺寸變異體之分離。移動相由100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl pH 6.8構成。運作時間總計6.0分鐘。將樣品於自動取樣器內保持在8℃下直至分析。注射總量3 μg之蛋白質。為了避免夾帶，在各樣品之後用40% ACN進行中間注射。基於螢光(激發280 nm，發射325 nm)進行偵測。使用Empower® 軟體進行峰積分。報告HMWS之相對曲線下面積(圖 9 )。 在熱應力(於37℃下培育)後藉由肽定位來監測化學修飾之豐度。對蛋白質樣品進行酶促消化且使用逆相層析來分離所得肽。將管柱溶析液直接注入質譜儀之離子源中以便對肽進行鑑定及定量。 為了達成最大覆蓋率，進行兩次單獨酶消化：一次利用胰蛋白酶且一次利用胰凝乳蛋白酶。在各情況下，利用氯化胍使蛋白質變性，隨後用二硫蘇糖醇(DTT)進行還原。在DTT中培育之後，藉由添加碘乙酸使游離半胱胺酸殘基發生烷基化。隨後將樣品緩衝液交換至50 mM Tris pH 7.8中以便進行消化。將胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶各自以1:10之比率(樣品:酶)添加至個別反應管中。在37℃下將樣品消化30分鐘，且藉由添加三氟乙酸來淬滅反應物。 將5 μg各消化液之負載單獨注射至已於0.1% (V/V)甲酸(FA)中平衡之Zorbax SB-C18 (Agilent，編號859700-902)逆相管柱上。使用含有0.1% FA之至多90%乙腈之156分鐘梯度將肽直接溶析至Q-Exactive Plus質譜儀(Thermo Scientific)之電噴霧離子源中。使用前12方法，以數據依賴性模式收集數據，在該方法中進行全掃描(解析度70 000；掃描範圍200-2000 m/z)，繼而對12種最豐富離子進行高能碰撞解離(HCD) (解析度17 500)。 使用內部軟體基於準確質量及串聯質譜來鑑定肽。人工驗證鑑定結果。使用Pinpoint軟體(Thermo Scientific)基於離子豐度來計算經修飾及未經修飾之肽的相對量。 圖7提供補體決定區(CDR)及半衰期延長部分之化學修飾之百分比。 如圖 9 中所顯示，當在pH 4.0下調配MSLN-scFc時，若與處於pH 6.0或7.0下之調配物相比，則HMWS之豐度顯著降低。表 7 提供在37℃下儲存兩週之後化學修飾隨調配物而變化之概述。 如表 7 所概述，當在pH 4.0下進行調配時，若與pH 6.0及7.0相比，則MLSN-scFc不太傾向於化學修飾。表 7 ：經由肽定位測定之應力 MSLN-scFc 調配物中之化學修飾 [%] 的概述 實例 5 使用蛋白A、陽離子交換(CEX)及羥基磷灰石(HA)層析來純化CD33cc-scFc BiTE抗體構築體。隨後使用超濾/滲濾(UFDF)對HA溶析液進行預調配。藉由摻加濃賦形劑儲備溶液來達成最終調配物。表 8 提供關於測試調配物之概述。表 8 ：關於測試調配物之概述 將以上調配物填充至1.3 mL 2R I型玻璃小瓶中，用丁基橡膠塞及觸發式鋁封封閉。將調配物儲存在-20℃、2℃至8℃、25℃及37℃下多達四週。在所指定之時間點吸取樣品。另外，對樣品進行五個連續冷凍解凍循環(20℃-＞-50℃-＞20℃，0.3 K/min，在目標溫度下保持一小時)。藉由粒徑排阻超高效層析(SE-UPLC)及肽定位(僅針對無應力樣品及儲存於37℃下之樣品)來分析樣品。 在使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm管柱(Waters)之Aquity H-Class UPLC系統(Waters)上進行SE-UPLC。將柱溫設定至25℃。藉由應用等度方法，利用0.4 mL/min之流速來達成尺寸變異體之分離。移動相由100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl pH 6.8構成。運作時間總計6.0分鐘。將樣品於自動取樣器內保持在8℃下直至分析。注射總量3 μg之蛋白質。為了避免夾帶，在各樣品之後用40% ACN進行中間注射。基於螢光(激發280 nm，發射325 nm)進行偵測。使用Empower® 軟體進行峰積分。報告HMWS之相對曲線下面積(圖 10 )。 在熱應力(於37℃下培育)後藉由肽定位來監測化學修飾之豐度。對蛋白質樣品進行酶促消化且使用逆相層析來分離所得肽。將管柱溶析液直接注入質譜儀之離子源中以便對肽進行鑑定及定量。 為了達成最大覆蓋率，進行兩次單獨酶消化：一次利用胰蛋白酶且一次利用胰凝乳蛋白酶。在各情況下，利用氯化胍使蛋白質變性，隨後用二硫蘇糖醇(DTT)進行還原。在DTT中培育之後，藉由添加碘乙酸使游離半胱胺酸殘基發生烷基化。隨後將樣品緩衝液交換至50 mM Tris pH 7.8中以便進行消化。將胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶各自以1:10之比率(樣品:酶)添加至個別反應管中。在37℃下將樣品消化30分鐘，且藉由添加三氟乙酸來淬滅反應物。 將5 μg各消化液之負載單獨注射至已於0.1% (V/V)甲酸(FA)中平衡之Zorbax SB-C18 (Agilent，編號859700-902)逆相管柱上。使用含有0.1% FA之至多90%乙腈之156分鐘梯度將肽直接溶析至Q-Exactive Plus質譜儀(Thermo Scientific)之電噴霧離子源中。使用前12方法，以數據依賴性模式收集數據，在該方法中進行全掃描(解析度70 000；掃描範圍200-2000 m/z)，繼而對12種最豐富離子進行高能碰撞解離(HCD) (解析度17 500)。 使用內部軟體基於準確質量及串聯質譜來鑑定肽。人工驗證鑑定結果。使用Pinpoint軟體(Thermo Scientific)基於離子豐度來計算經修飾及未經修飾之肽的相對量。 表9提供補體決定區(CDR)及半衰期延長部分之化學修飾之百分比。 如圖 10 中所顯示，當在pH 4.0下調配CD33cc-scFc時，若與處於pH 6.0或7.0下之調配物相比，則HMWS之豐度顯著降低。表 9 提供在37℃下儲存兩週之後化學修飾隨調配物而變化之概述。 如表 9 所概述，當在pH 4.0下進行調配時，若與pH 6.0及7.0相比，則CD33cc-scFc不太傾向於化學修飾。表 9 ：經由肽定位測定之應力 CD33cc-scFc 調配物中之化學修飾 [%] 的概述 實例 6 ： 使用分子量截止值(MWCO)為10 kDa之膜，經由超濾/滲濾對分別含有經純化之MSLN-hALB、MSLN-hFc及MSLN-scFc的預調配原料藥進行緩衝液交換。藉由添加濃儲備溶液來達成最終調配物。各構築體之所得調配物為由20 mM磷酸鉀、150 mM L-精胺酸鹽酸鹽、6% (w/V)二水合海藻糖、0.01% (w/V)聚山梨糖醇酯80構成之處於pH 6.0下之K60RTrT及由10 mM麩胺酸鹽、4% (w/V)甘露糖醇、2% (w/V)蔗糖、0.01% (w/V)聚山梨糖醇酯80構成之處於pH 4.0下之G40MSuT。在K60RTrT中調配MSLN-hALB，且在K60RTrT及G40MSuT中調配MSLN-scFc。蛋白質濃度總計1.0 mg/mL。向1950 μL各測試溶液中摻加50 μL 1000 ppm矽標準溶液(Specpure，來自AlfaAesar，產品編號38717)，產生25 ppm尖峰。未摻加之測試溶液充當對照樣品。將摻加之測試溶液以及對照樣品填充至3cc I型玻璃小瓶中，且在37℃下培育24小時。根據實例4中所描述之方法，藉由SE-UPLC分析所有樣品，以便對HMWS之量進行定量(表10)。當在K60RTrT中進行調配時，MSLN-hALB及MSLN-scFc在矽摻加後顯示類似之HMWS增加。對於scFc構築體，已證明可藉由將調配物pH值降至4.0來減少此增加。根據初步實驗，此方法對MLSN-hALB不可行，此係因為其顯示在5.0及5.0以下之調配物pH值下發生破碎。表 10 ：關於在摻加25 ppm矽之後經由SE-UPLC測定之MSLN-hALB及MSLN-scFc製劑中HMWS含量的概述 對於scFc構築體，已證明可藉由將調配物pH值降至4.0來減少非所要高分子量物質之增加。根據初步實驗，此方法對MLSN-hALB不可行，此係因為其顯示在5.0及5.0以下之調配物pH值下發生破碎。因此，所發現之有益調配物尤其適合於根據本發明之抗體構築體，諸如作為第三結構域之scFc。實例 7 ： 在20 mM單水合檸檬酸、100 mML-精胺酸單鹽酸鹽中在pH 4.8下調配不含半衰期延長部分之靶向EGFRvIII之非HLE (半衰期延長) BiTE®抗體構築體(BiTE® A)。使用4 M儲備溶液將此溶液之諸多部分摻加0 mM、100 mM及200 mM氯化鈉。將各部分之濃度調節至0.8 mg BiTE A/mL。將最終溶液等分至2.5 mL即用型10R I型玻璃小瓶中，用丁基橡膠塞及觸發式鋁封封閉。將此等溶液在30℃下儲存12週，且使用不同的分析方法來評定穩定性。 在由Bio Sample Manager-FTN、Bio Quaternary Solvent Manager及光二極體陣列(PDA)偵測器組成之ACQUITY UPLC H-Class Bio System (Waters，Milford，MA，USA)上進行SE-UPLC，以便測定蛋白質濃度。使用Acquity UPLC Protein BEH 200 SEC管柱(填充1.7 µm，4.6×150 mm) (Waters，Milford，MA，USA)進行層析分離。將柱溫維持在25℃。將100 µL之各樣品溶液填充至具有PTFE/矽酮隔膜之玻璃螺口小瓶(Waters，Milford，MA，USA)。將自動取樣器之溫度控制在8℃。 以一式兩份對樣品進行量測，其中每次運作將3 µg/樣品裝載至管柱，在約0.8 mg/mL之蛋白質濃度下對應於3.8 µL之注射體積。在等度條件下，使用100 mM磷酸鈉緩衝液pH 6.8之移動相與額外250 mM氯化鈉緩衝液一起以0.4 mL/min之流速進行樣品溶析。系統自動預混合運作緩衝液，其中500 mM磷酸二氫鈉裝載至通道A上，500 mM磷酸二鈉裝載至通道B上，1 M氯化鈉裝載至通道C上且HPLC等級水裝載至通道D上。在樣品運作之間，注入10 µL 40%乙腈。在各分析開始、中間及結束時，量測蛋白質標準物以確保系統適合性。運作時間設定為6分鐘。 利用UV偵測溶析之樣品，測定在280 nm波長下之吸光度。使用Empower軟體(Waters，Milford，MA，USA)擷取層析譜並且積分。分析層析譜之曲線下面積(AUC)以便對樣品進行濃度測定。值提供為獨立樣品一式三份之平均值與相應的標準偏差。 使用以下等式計算蛋白質濃度： 等式：由曲線下面積 (AUC) 值 (mAU*s) 計算樣品濃度 (mg/mL) 。參數概述於表 1 中。 表 11 . 用於計算樣品濃度 (mg/mL) 之 SE-UPLC 方法的參數。 表 12 中提供BiTE® A製劑之蛋白質濃度隨配方及儲存時間而變化。儘管在不存在氯化鈉之情況下蛋白質濃度在一定時間內保持恆定，但在含鹽製劑中觀測到顯著蛋白質損失。含200 mM氯化鈉之調配物中的蛋白質損失最明顯。表 12 ：蛋白質濃度隨調配物及儲存時間而變化 應用光阻隔來量測BiTE® A製劑內大於10 µm及25 µm之次可見粒子的量。在配備有HRLD 150感測器之HIAC 9703+液體粒子計數系統(Beckmann Coulter，Brea，CA，USA)上進行光阻隔量測。使用相應的PharmSpec 3軟體來進行資料擷取及分析。在樣品分析之前，藉由量測EZYTM-Cal粒度標準物5 µm (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)及EZYTM-Cal粒度標準物15 µm (Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)來驗證系統適合性。 對於各樣品，以10 mL/min之流速對0.2 mL樣品體積進行四次量測。因為第一次運作被丟棄，故粒子濃度提供為後三個量測值之平均值。在樣品量測之前及中間進行空白測試。測定不含粒子之水的粒子濃度以確保10個粒子/mL≥2 µm及1個粒子/mL≥10 µm之最大量。大於10 µm及25 µm之粒子的次可見粒子濃度提供為獨立的三次重複之平均值。表 13 概述含BiTE® A之製劑的次可見粒子計數隨調配物及儲存時間而變化。次可見粒子計數在不存在氯化鈉之情況下最低且隨時間僅存在邊界變化。添加氯化鈉產生相當之初始粒子計數。然而，次可見粒子之量在存在鹽之情況下隨時間顯著增加。此顯示在不存在氯化鈉之情況下製劑含有之膠體穩定性得以改良。表 13 ：每 mL 之次可見粒子計數隨調配物及儲存時間而變化 藉由奈米差示掃描量熱術(奈米DSF)對含BiTE® A之製劑進行熱分析。使用Prometheus NT.48儀器(NanoTemper Technologies，Munich，Germany)及相應的PRThermControl軟體(NanoTemper Technologies，Munich，Germany)來監測以不同方式調配之BiTE® A製劑的解摺疊及聚集特性。為了分析蛋白質解摺疊溫度Tm及偵測聚集溫度Tagg，藉由毛細管力將10 µL每種樣品填充至Prometheus NT.48標準毛細管(NanoTemper Technologies，Munich，Germany)並且置於儀器中。以一式三份量測樣品。溫度勻變範圍界定為自20℃至95℃，加熱速率為1℃/min。 使用Prometheus PRThermControl軟體(NanoTemper Technologies，Munich，Germany)進行資料分析。在熱解摺疊實驗之情況下，將螢光比(F350 nm/F330 nm)對應之一階導數相對於溫度繪圖。對於聚集偵測，將散射光強度對應之一階導數相對於溫度進行繪圖。 蛋白質解摺疊溫度(Tm )及聚集溫度(Tagg )作為由三次重複實驗計算之平均值與標準偏差提供於表 14 中。據顯示，在不存在氯化鈉之情況下，解摺疊(Tm )及蛋白質聚集(Tagg )發生在較高溫度下。此指示不含鹽之調配物的構形穩定性及膠體穩定性得以增強。表 14 ：利用 奈米 DSF 表徵熱解摺疊及聚集特性隨調配物而變化 實例 8 ： 在10 mM L-麩胺酸、9% (w/v)蔗糖中在pH 4.8下調配兩種靶向BCMA之BiTE®抗體構築體，該兩種抗體構築體在針對BCMA之結構域中存在額外cys夾鉗(BiTE® F)或不存在額外cys夾鉗(BiTE® E)且在C末端含有單鏈Fc結構域。使用4 M儲備溶液將此溶液之諸多部分摻加0 mM、100 mM及200 mM氯化鈉。將各部分之濃度調節至0.8 mg BiTE® /mL。將最終溶液等分至2.5 mL即用型10R I型玻璃小瓶中，用丁基橡膠塞及觸發式鋁封封閉。將此等溶液在30℃下儲存12週，且使用不同的分析方法來評定穩定性。 如實例 7 中所描述來進行SE-UPLC。藉由使用280 nm之激發波長量測在325 nm下之螢光發射強度來進行偵測。相對曲線下面積(AUC)可歸因於低分子量物質(LMWS)。如表 15 中所示，在不存在氯化鈉之情況下，一定時間內之LMWS形成不太明顯且指示無鹽製劑之穩定性得以改良。表 15 ： BiTE ® E 及 BiTE ® F 製劑中之 LMWS 之相對量隨調配物及儲存時間而變化 如實例 7 中所描述來進行光阻隔。表 16 中提供BiTE® E及BiTE® F製劑中之次可見粒子的豐度隨調配物及儲存而變化。若與含鹽製劑相比，則不存在氯化鈉時次可見粒子不太明顯，與儲存時間無關。此指示BiTE® E及BiTE® F在不含鹽之調配物中的膠體穩定性得以改良。表 16 ：每 mL 之次可見粒子計數隨調配物及儲存時間而變化 使用實例7中所描述之方法，藉由奈米差示掃描量熱術(奈米DSF)對BiTE® E及BiTE® F製劑進行熱分析。蛋白質解摺疊溫度(Tm )及聚集溫度(Tagg )作為由三次重複實驗計算之平均值與標準偏差提供於表 17 中。據顯示，若與含有0或100 mM氯化鈉之製劑相比，則存在200 mM NaCl時解摺疊(Tm )發生在較高溫度下。在測試溫度範圍內未偵測到無鹽製劑之蛋白質聚集。相反，觀測到含有氯化鈉之製劑的蛋白質聚集。鹽濃度愈高，聚集溫度越低。以上發現指示不含鹽之調配物的構形穩定性及膠體穩定性得以增強。表 17 ：利用奈米 DSF 表徵熱解摺疊及聚集特性隨調配物而變化 n.d. =未偵測到表 18 ：序列表
圖 1 ： 圖1a顯示本發明之抗體構築體之一個實施例的圖。圖1b顯示此項技術中所描述之異源二聚Fc抗體構築體及1c為X體構築體。引入所指示之帶電配對以便執行異源二聚。圖1d顯示抗體構築體與人血清白蛋白(HSA或hALB)之融合。圖 2 ： 抗體構築體結構域在約中性pH值下帶不同電荷且在較低pH值下類似地帶正電的示意性圖示。圖 3 ： 不存在HLE之EGFRvIII抗體構築體在pH 4及pH 7下之DSC溫度記錄圖。在pH 4下，Tm為5.5℃，低於pH 7下之Tm。圖 4 ： (a)顯示在pH 4相對於pH 6下量測之CDH19 scFc抗體構築體之高分子量物質之百分比。在較低pH值4.0下可見較低程度之聚集；(b)顯示在4℃(時間點T0、2w、4w)、25℃(T0、1w、2w、4w)及37℃(T0、1w、2w、4w)下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之主峰百分比：G4SuT包含10 mM麩胺酸鹽、9% (w/v)蔗糖、0.01%聚山梨糖醇酯80，G4TrT包含10 mM麩胺酸鹽、9% (w/v)海藻糖、0.01%聚山梨糖醇酯80，且G4MSuT包含10 mM麩胺酸鹽、4% (w/v)甘露糖醇、2%蔗糖、0.01%聚山梨糖醇酯80。在pH 4下顯示穩定性。(c)顯示在-20℃下(T0、4w)藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之主峰百分比。(d)顯示在4℃(T0、2w、4w)、25℃(T0、1w、2w、4w)及37℃(T0、1w、2w、4w)下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之高分子量(HMW)峰百分比。(e)顯示在-20℃下(T0、4w)藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之HMW峰百分比。(f)顯示在4℃(T0、2w、4w)、25℃(T0、1w、2w、4w)及37℃(T0、1w、2w、4w)下藉由SEC量測之三種不同調配物G4SuT、G4TrT及G4MSuT中之CDH19 scFc BiTE之低分子量峰百分比。圖 5 ： 6個月之後量測之EGFRvIII非scFC抗體構築體在pH範圍4至7之不同緩衝液中之主峰百分比。在pH 4.0下，抗體構築體具有最高主峰百分比。圖 6 ： (a)顯示以不同濃度處於不同調配物中之CD33-scFc抗體構築體在4℃下之主峰百分比。「ccHFC」表示經特定修飾之cys駱駝化scFc結構域。低pH值調配物一貫具有較高單體物質。(b)顯示以不同濃度處於不同調配物中之CD33-scFc抗體構築體在25℃下之主峰百分比。「ccHFC」表示經特定修飾之cys駱駝化scFc結構域。低pH值調配物一貫具有較高單體物質。圖 7 ： T0、7天、14天及1個月時如藉由SEC所量測之典型(非HLE) CD19×CD3 BiTE®抗體構築體之聚集百分比隨pH值變化之函數。該圖顯示在低pH值下，聚集量大幅降低。圖 8 ： 預測值分佈及合意性隨由Statistica軟體(Statsoft)產生之調配參數而變化。圖 9 ： 關於藉由粒徑排阻超高效層析(SE-UPLC)所測定之MSLN-scFc製劑中之高分子量物質(HMWS)之含量百分比隨配方而變化的概述圖 10 ： 關於藉由粒徑排阻超高效層析(SE-UPLC)所測定之CD33cc-scFc製劑中之高分子量物質(HMWS)之含量百分比隨配方而變化的概述。

Claims (33)

  1. 一種液體醫藥組成物，其包含： (a) 抗體構築體，該抗體構築體包含至少三個結構域，其中： • 第一結構域結合靶細胞表面抗原，且具有4至9.5之範圍內的等電點(pI)； • 第二結構域結合第二抗原，且具有8至10，較佳8.5至9.5之範圍內的pI；且 • 第三結構域包含兩個多肽單體，各多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域及CH3結構域，其中該兩個多肽單體經由肽連接子與彼此融合； (b) 至少一種緩衝劑； (c) 至少一種醣；及 (d) 至少一種界面活性劑； 且其中該醫藥組成物之pH值為3.5至6之範圍內。
  2. 如請求項1之液體醫藥組成物，其中該抗體構築體為單鏈抗體構築體。
  3. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該第三結構域按胺基至羧基順序包含： 鉸鏈-CH2結構域-CH3結構域-連接子-鉸鏈-CH2結構域-CH3結構域。
  4. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該第一結構域具有4.5至6.5之範圍內的pI。
  5. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該靶細胞表面抗原為腫瘤抗原、免疫性病症特異性抗原或病毒抗原。
  6. 如請求項5之液體醫藥組成物，其中該腫瘤抗原係選自由以下各項組成之群：CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFR、EGFRvIII、BCMA、PSMA、CD33、CD19、CD20及CD70。
  7. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該第二結構域為人類及/或獼猴CD3ε鏈之細胞外抗原決定基。
  8. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該第二結構域具有8.5至9.0之範圍內的pI。
  9. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該第三結構域之該等多肽單體中之每一者具有與選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群的序列具有至少90%一致性的胺基酸序列，或具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群的胺基酸序列。
  10. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。
  11. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該第三結構域具有5.5至7.5，較佳6.0至7.0之範圍內的pI。
  12. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中： (i) 該第一結構域包含兩個抗體可變域且該第二結構域包含兩個抗體可變域； (ii) 該第一結構域包含一個抗體可變域且該第二結構域包含兩個抗體可變域； (iii) 該第一結構域包含兩個抗體可變域且該第二結構域包含一個抗體可變域；或 (iv) 該第一結構域包含一個抗體可變域且該第二結構域包含一個抗體可變域。
  13. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該抗體構築體較佳按胺基至羧基順序包含： (a) 該第一結構域； (b) 肽連接子，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1-3； (c) 該第二結構域； (d) 肽連接子，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11及12； (e) 該第三結構域之該第一多肽單體； (f) 肽連接子，其具有選自由以下各項組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 5、6、7及8；及 (g) 該第三結構域之該第二多肽單體。
  14. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該至少一種緩衝劑為選自由以下各項組成之群的酸：乙酸鹽、麩胺酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、組胺酸、磷酸鹽、2-(N-嗎啉基)乙磺酸鹽或其組合。
  15. 如請求項14之液體醫藥組成物，其中該至少一種緩衝劑係以5至200 mM之濃度範圍，更佳以10至50 mM之濃度範圍存在。
  16. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該至少一種醣係選自由以下各項組成之群：單醣、雙醣、環狀多醣、糖醇、線性分枝葡聚醣或線性非分枝葡聚醣。
  17. 如請求項16之液體醫藥組成物，其中該雙醣係選自由以下各項組成之群：蔗糖、海藻糖及甘露糖醇、山梨糖醇及其組合。
  18. 如請求項16之液體醫藥組成物，其中該糖醇為山梨糖醇。
  19. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該至少一種醣係以1%至15% (m/V)之範圍內，較佳係9%至12% (m/V)之濃度範圍內的濃度存在。
  20. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該至少一種界面活性劑係選自由以下各項組成之群：聚山梨糖醇酯(polysorbate)20、聚山梨糖醇酯40、聚山梨糖醇酯60、聚山梨糖醇酯80、泊洛沙姆(poloxamer) 188、普洛尼克(pluronic) F68、曲拉通(triton) X-100、聚氧乙烯、PEG 3350、PEG 4000及其組合。
  21. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該至少一種界面活性劑係以0.004%至0.5% (m/V)之範圍內，較佳係0.001%至0.01% (m/V)之範圍內的濃度存在。
  22. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該組成物之pH值為4.0至5.0之範圍內，較佳為4.2。
  23. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其具有150至500 mOsm之範圍內的滲透壓。
  24. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其進一步進一步包含選自由一或多種多元醇及一或多種胺基酸組成之群的賦形劑。
  25. 如請求項24之液體醫藥組成物，其中該一或多種賦形劑係以0.1%至15% (w/V)之濃度範圍存在。
  26. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該組成物不含無機陰離子。
  27. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該組成物包含 (a) 如前述請求項中任一項之抗體構築體； (b) 10 mM麩胺酸鹽或乙酸鹽； (c) 9% (m/V)蔗糖或6% (m/V)蔗糖與6% (m/V)羥丙基-β-環糊精； (d) 0.01% (m/V)聚山梨糖醇酯80， 且其中該液體醫藥組成物之pH值為4.2。
  28. 如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物，其中該抗體構築體係以0.1至8 mg/ml，較佳0.2至2.5 mg/ml，更佳0.25至1.0 mg/ml之濃度範圍存在。
  29. 一種固體醫藥組成物，其可由如前述請求項中任一項之液體醫藥組成物經過凍乾而製得。
  30. 一種液體醫藥組成物，其可使用醫藥學上可接受之液體來復原如請求項29之固體醫藥組成物而製得。
  31. 如前述請求項中任一項之組成物，其係用於治療疾病，較佳係增殖性疾病、免疫性疾病或病毒性疾病。
  32. 如請求項31之組成物，其中該組成物係以非經腸式，較佳係藉由輸注或注射而經靜脈內投與。
  33. 如請求項31之組成物，其中該組成物係每週投與1、2、3、4、5、6或7次，或者每兩週1、2、3、4、5或6次，或者每月1或2次，或者每兩個月1或2次，最佳每週1次。
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