JP7189141B2 - Ｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクトを含む低ｐＨ医薬組成物 - Google Patents

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タンパク質系医薬品は、（前）臨床開発において及び市販製品として最も成長著しい治療薬に含まれる。低分子化学薬剤と比較して、タンパク質医薬品は、比較的低い濃度で高い特異性及び活性を有し、通常、種々の癌、自己免疫疾患及び代謝障害などの大きい影響のある疾患の療法を提供する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０、Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．１９９９ Ａｕｇ ２０；１８５（２）：１２９－８８）。
商業規模での精製プロセスの進歩により、現在、組換え体タンパク質などのタンパク質系医薬品は、最初の製造時に高い純度で得ることができる。しかしながら、タンパク質は、わずかに安定であるにすぎず、化学的にも物理的にも非常に劣化しやすい。化学的劣化は、脱アミド、酸化、新たなジスルフィド架橋の切断若しくは形成、加水分解、異性化又は脱グリコシルなどの共有結合を伴う修飾を指す。物理的劣化には、タンパク質のアンフォールディング、表面への望ましくない吸着及び凝集が含まれる。これらの物理的及び化学的な不安定性への対処は、タンパク質医薬品の開発において最も難しい課題の１つである（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ ２００３，ｐｐ．１３２５－１３３６、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０）。
興味深いタンパク質系医薬品としては、２つの柔軟に連結された抗体に由来する結合ドメインから構成される組換え体タンパク質コンストラクトであるＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体コンストラクトなどの二重特異性分子が挙げられる。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの１つの結合ドメインは、標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり、第２の結合ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３に特異的である。それらの特別な設計により、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトは、Ｔ細胞を標的細胞と一過的に結び付け、同時に標的細胞に対するＴ細胞の固有の細胞溶解能を強力に活性化するのに独特に適している。ＡＭＧ１０３及びＡＭＧ１１０としてクリニックに展開された第一世代のＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの重要なさらなる開発（国際公開第９９／５４４４０号パンフレット及び国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレットを参照されたい）は、ＣＤ３ε鎖のＮ末端のコンテクスト非依存的なエピトープに結合する二重特異性抗体コンストラクトを提供した（国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット）。この選出されたエピトープに結合するＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトは、ヒト及びマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３ε鎖に対する種間特異性を示さないだけでなく、二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子において以前に記載されたＣＤ３結合体のエピトープの代わりにこの特異的エピトープを認識するため、前世代のＴ細胞エンゲージ抗体で観察されたのと同程度にＴ細胞を非特異的に活性化しない。このＴ細胞活性化の低下は、患者におけるより少ない又は減少したＴ細胞再分布と関係し、これは、副作用のリスクがあると判断された。
国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載された抗体コンストラクトは、体内からの迅速なクリアランスを受けると考えられ、したがって、それらは、体内のほとんどの部分に迅速に到達することができ、且つ迅速に製造でき、取り扱いが容易であるが、それらのインビボ適用は、それらのインビボにおける短い持続性によって制限され得る。この小さい単鎖分子は、インビボ半減期が短いため、治療効果を達成するために持続点滴静注による継続投与が使用された。しかしながら、そのような持続点滴静注は、患者にとって不便な類のものであり、したがって、より便利な代替的な治療手法の場合、それぞれの疾患の治療においてより効果的であることが実証された化合物の選出を妨げる。したがって、本出願人は、同様の治療効果を保持し、生産が単純である形式を有し、且つ長期の半減期を含む好ましい薬物動態特性を有する二重特異性の治療薬を提起した。
長い半減期は、一般に、免疫グロブリン、特に抗体、また最も特定すると小サイズの抗体フラグメントのインビボ適用において有用である。そのような効果を達成するために当技術分野において記載された手法は、小さい二重特異性抗体コンストラクトの、好ましくはＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの治療効果を妨げないより大きいタンパク質との融合を含む。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのそのようなさらなる開発の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書、国際公開第２０１４／１４４７２２号パンフレット、国際公開第２０１４／１５１９１０号パンフレット及び国際公開第２０１５／０４８２７２号パンフレットに記載される二重特異性Ｆｃ分子を含む。
タンパク質凝集は、タンパク質の物理的不安定性の主要な現象に相当するものであり、溶媒と疎水性タンパク質残基との間の熱力学的に不利な相互作用を最小化する固有の傾向に起因して生じる。タンパク質凝集は、リフォールディング、精製、滅菌、輸送及び保管のプロセス中に日常的に起こるため、特に問題がある。凝集は、タンパク質の天然状態が熱力学的に極めて有利な（例えば、中性ｐＨ及び３７℃）溶液条件下であっても、ストレスの不在下であっても生じる場合がある（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ ２００３，ｐｐ．１３２５－１３３６、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０、Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．１９９９ Ａｕｇ ２０；１８５（２）：１２９－８８、Ｍａｈｌｅｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００９ Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９－３４）。
また、Ｆｃ分子などの半減期延長様式を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの半減期延長抗体コンストラクトは、タンパク質凝集及び／又は他の劣化現象から保護されるべきである。タンパク質凝集が問題となるのは、治療用タンパク質の生物活性を弱めることがあるためである。さらに、タンパク質の凝集は、薬物製品の望ましくない外観をもたらし、また最終産物から凝集体を除去するために必要とされる綿密な精製工程により産物収率を低下させる。より最近では、凝集したタンパク質の存在により（ヒト化タンパク質又は完全なヒトタンパク質であっても）、患者は、活性タンパク質単量体に対する免疫反応を起こすことになり、その結果、中和抗体及び薬物耐性の形成又は他の有害な副作用がもたらされるというリスクが顕著に増大する可能性があるといった懸念及びエビデンスも増加している（Ｍａｈｌｅｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００９ Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９－３４。
概して、文献において、様々な機構によってタンパク質凝集を最小化するいくつかの試みが報告されている。タンパク質を、それらの一次構造を改変して、それにより内部の疎水性を増大させ、且つ外部の疎水性を低減することによって安定化し、こうして凝集体形成及び他の化学的変化から保護することができる。しかしながら、タンパク質の遺伝子操作は、機能性の喪失及び／又は免疫原性の増大をもたらす場合がある。別の手法は、凝集体の解離（「脱凝集」と呼ばれる）に着目し、温度、圧力、ｐＨ及び塩などの様々な機構を使用することによって機能的な天然単量体を回復させる。現時点では、タンパク質凝集体は、主に下流処理のプロセシング工程において不純物として除去される。しかしながら、高分子量（ＨＭＷ）のレベルが高い場合、顕著な量のＨＭＷ除去により、実質的な収率損失がもたらされるだけでなく、堅牢な下流プロセスの設計が困難なものとなる（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ ２００３，ｐｐ．１３２５－１３３６）。
国際公開第９９／５４４４０号 国際公開第２００５／０４０２２０号 国際公開第２００８／１１９５６７号 米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号明細書 米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書 国際公開第２０１４／１４４７２２号 国際公開第２０１４／１５１９１０号 国際公開第２０１５／０４８２７２号
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０ Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．１９９９ Ａｕｇ ２０；１８５（２）：１２９－８８ Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ ２００３，ｐｐ．１３２５－１３３６ Ｍａｈｌｅｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００９ Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９－３４
生物学及びバイオテクノロジー用途におけるタンパク質の安定性及び活性の維持は、深刻な課題を提起する。治療用タンパク質の安定化を増強し、製剤、充填、輸送、保管及び投与中の凝集並びに変性又は劣化を低減することにより、機能喪失及び有害な免疫原性反応を防止する最適化された医薬組成物が当技術分野において必要とされている。特に、Ｆｃ分子などの半減期延長様式を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの半減期延長抗体コンストラクトに関して、このような必要性に応じることが本発明の目的である。
二重特異性Ｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクトなどの２つ（以上）の異なる抗原に同時に結合する二重特異性（及び／又は多重特異性）抗体を含むタンパク質系医薬品は、タンパク質不安定性を呈する傾向がある。これは、単鎖Ｆｃ形式（ｓｃＦｃと称される）、ヘテロＦｃ（ｈｅｔＦｃ又はヘテロ二量体Ｆｃとも称される、ｈＦｃ）形式及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ又はｈＡＬＢとも称される）の融合体を含む半減期延長形式（ＨＬＥ形式）を含むそれらの抗体コンストラクトまで及ぶ。タンパク質不安定性及び特にタンパク質凝集は、バイオテクノロジー産業において深刻化している課題であり、凝集は、リフォールディング、精製、滅菌、輸送及び保管のプロセス中を含む治療用タンパク質の寿命にわたって直面するものである。したがって、抗体コンストラクト、好ましくは半減期延長形式、さらに好ましくはＴ細胞エンゲージ抗体コンストラクトを含む安定な医薬組成物を提供することが本発明の目的である。本発明に関連して、好ましくは液体組成物であるか、凍結乾燥によって得られる固体組成物であり得るか、又は再構成された液体組成物であり得る医薬組成物は、
（ａ）少なくとも３つのドメインを含む抗体コンストラクトであって、
・第１のドメインは、標的細胞の表面抗原に結合し、且つ４～９．５の範囲の等電点（ｐＩ）を有し；
・第２のドメインは、第２の抗原に結合し、且つ８～１０、好ましくは８．５～９．０の範囲のｐＩを有し；及び
・好ましくは第３のドメインは、それぞれヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される、抗体コンストラクト；
（ｂ）少なくとも１種の緩衝剤；
（ｃ）少なくとも１種の糖類；及び
（ｄ）少なくとも１種の界面活性剤
を含み、医薬組成物のｐＨは、３．５～６の範囲である。
医薬組成物は、単鎖抗体コンストラクトである抗体コンストラクトを含むことが本発明に関連して想定される。
さらに、前記第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメイン－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインを含むことが本発明に関連して想定される。
特に、本発明による抗体コンストラクトは、第３のドメインを含むことが本発明に関連して想定される。
第１のドメインは、約４．０～９．５、好ましくは約４．５～７．５又は４．５～６．５の範囲のｐＩを有することも本発明に関連して想定される。
標的細胞の表面抗原は、腫瘍抗原、免疫障害に特異的な抗原又はウイルス抗原であることが本発明に関連して想定される。
腫瘍抗原は、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ７０からなる群から選択されることが本発明に関連してさらに想定される。
第２のドメインは、ＣＤ３のヒト及び／又はマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープであることも本発明に関連して想定される。
第２のドメインは、８．５～９．０の範囲のｐＩを有することが本発明に関連して想定される。
前記第３のドメインのポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７～２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１７～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することが本発明に関連してさらに想定される。
ＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含むことも本発明に関連して想定される。
第３のドメインは、５．５～７．５、好ましくは６．０～７．０の範囲のｐＩを有することが本発明に関連して想定される。
（ｉ）第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉ）第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉｉ）第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含むか；又は
（ｉｖ）第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含む
ことが本発明に関連してさらに想定される。
抗体コンストラクトは、好ましくは、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含むことが本発明に関連して想定される。
少なくとも１種の緩衝剤は、酢酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸塩又はこれらの組み合わせからなる群から選択される酸であることも本発明に関連して想定される。
少なくとも１種の緩衝剤は、５～２００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは１０～５０ｍＭの濃度範囲で存在することが本発明に関連してさらに想定される。
少なくとも１種の糖類は、単糖類、二糖類、環状多糖類、糖アルコール、直鎖状分岐状デキストラン又は直鎖状非分岐状デキストランからなる群から選択されることが本発明に関連して想定される。
二糖類は、スクロース、トレハロース及びマンニトール、ソルビトール並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されることも本発明に関連して想定される。
糖アルコールは、ソルビトールであることが本発明に関連してさらに想定される。
少なくとも１種の糖類は、１～１５％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度、好ましくは９～１２％（ｍ／Ｖ）の濃度範囲で存在することが本発明に関連して想定される。
少なくとも１種の界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニックＦ６８、トリトンＸ－１００、ポリオキシエチレン、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることも本発明に関連して想定される。
少なくとも１種の界面活性剤は、０．００４～０．５％（ｍ／Ｖ）の範囲、好ましくは０．００１～０．０１％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度で存在することが本発明に関連してさらに想定される。
組成物のｐＨは、４．０～５．０の範囲、好ましくは４．２であることが本発明に関連して想定される。
医薬組成物は、１５０～５００ｍＯｓｍの範囲のモル浸透圧濃度を有することも本発明に関連して想定される。
医薬組成物は、１種以上のポリオール及び１種以上のアミノ酸からなる群から選択される賦形剤をさらに含むことが本発明に関連してさらに想定される。
前記１種以上の賦形剤は、０．１～１５％（ｗ／Ｖ）の濃度範囲で存在することが本発明に関連して想定される。
医薬組成物は、
（ａ）前述の請求項のいずれか１つの抗体コンストラクト、
（ｂ）１０ｍＭのグルタミン酸塩又は酢酸塩、
（ｃ）９％（ｍ／Ｖ）のスクロース又は６％（ｍ／Ｖ）のスクロース及び６％（ｍ／Ｖ）のヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、
（ｄ）０．０１％（ｍ／Ｖ）のポリソルベート８０
を含み、液体医薬組成物のｐＨは、４．２であることも本発明に関連して想定される。
抗体コンストラクトは、０．１～８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２～２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５～１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在することが本発明に関連してさらに想定される。
本発明の医薬組成物は、液体であることが本発明に関連して想定される。
医薬組成物は、前述の請求項のいずれか１つの液体医薬組成物の凍結乾燥によって得ることができる固体医薬組成物であることも本発明に関連して想定される。
医薬組成物は、薬学的に許容される液体との凍結乾燥によって得ることができる固体医薬組成物を再構成することによって得ることができる液体医薬組成物であることが本発明に関連してさらに想定される。
医薬組成物に関連して、疾患、好ましくは増殖性疾患、免疫疾患又はウイルス性疾患の治療における使用のためのものが想定される。
組成物は、非経口的に、好ましくは点滴又は注射による静注によって投与されることも本発明に関連して想定される。
組成物は、１週間に１、２、３、４、５、６若しくは７回、又は２週間毎に１、２、３、４、５若しくは６回、又は１ヶ月に１若しくは２回、又は２ヶ月毎に１若しくは２回、最も好ましくは１週間に１回投与されることが本発明に関連してさらに想定される。
（ａ）本発明の抗体コンストラクトの一実施形態の図を示す。（ｂ）ヘテロ二量体Ｆｃ抗体コンストラクトを示す。（ｃ）当技術分野で記載されるＸボディコンストラクトを示す。示されている電荷対は、ヘテロ二量体化を強化するために導入される。（ｄ）抗体コンストラクトとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ又はｈＡＬＢ）との融合体を示す。 ほぼ中性ｐＨで異なる電荷を有する抗体コンストラクトドメイン及び低ｐＨで同様の正電荷を有する抗体コンストラクトドメインの概略図である。 ｐＨ４及びｐＨ７でＨＬＥを有しないＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体コンストラクトのＤＳＣサーモグラムである。ｐＨ４でのＴｍは、ｐＨ７でのＴｍより５．５Ｃ低い。 ｐＨ６に対してｐＨ４において測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ抗体コンストラクトの高分子量種の割合を示す。低い方の４．０のｐＨでより少量の凝集が見られる。 ３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて４Ｃ（時点Ｔ０、２ｗ、４ｗ）、２５℃（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）及び３７Ｃ（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥのメインピークの割合を示す。Ｇ４ＳｕＴは、１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％ポリソルベート８０を含み、Ｇ４ＴｒＴは、１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／ｖ）トレハロース、０．０１％ポリソルベート８０を含み、且つＧ４ＭＳｕＴは、１０ｍＭグルタミン酸塩、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、２％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０を含む。安定性は、ｐＨ４で実証された。 ３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて－２０℃（Ｔ０、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥのメインピークの割合を示す。 ３種の異なる製剤：Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて４Ｃ（Ｔ０、２ｗ、４ｗ）、２５℃（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）及び３７℃（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥの高分子量（ＨＭＷ）ピークの割合を示す。 ３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて－２０℃（Ｔ０、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥのＨＭＷピークの割合を示す。 ３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて４Ｃ（Ｔ０、２ｗ、４ｗ）、２５Ｃ（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）及び３７Ｃ（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥの低分子量ピークの割合を示す。 ６ヶ月後のｐＨ範囲４～７の様々な緩衝液中におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ非ｓｃＦＣ抗体コンストラクトのメインピークの割合である。ｐＨ４．０において、抗体コンストラクトは、最も高いメインピークの割合を有する。 ４℃における異なる製剤における異なる濃度でのＣＤ３３－ｓｃＦｃ抗体コンストラクトのメインピークの割合を示す。「ｃｃＨＦＣ」は、特異的に改変されてｃｙｓで固められたｓｃＦｃドメインを意味する。低ｐＨ製剤は、一貫してより多くの単量体種を有する。 ２５℃における異なる製剤における異なる濃度でのＣＤ３３－ｓｃＦｃ抗体コンストラクトのメインピークの割合を示す。「ｃｃＨＦＣ」は、特異的に改変されてｃｙｓで固められたｓｃＦｃドメインを意味する。低ｐＨ製剤は、一貫してより多くの単量体種を有する。 Ｔ０、７日目、１４日目及び１ヶ月目でｐＨに応じてＳＥＣによって測定されたカノニカルな（非ＨＬＥ）ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの凝集の割合である。図は、低ｐＨでの凝集量が劇的に低くなることを実証している。 Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（Ｓｔａｔｓｏｆｔ）によって生成された製剤パラメータの関数における予測値及び有用性のプロファイルである。 製剤に応じてサイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）によって決定されたＭＳＬＮ－ｓｃＦｃ製剤中の高分子量種（ＨＭＷＳ）の含量割合の概要である。 製剤に応じてサイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）によって決定されたＣＤ３３ｃｃ－ｓｃＦｃ製剤中の高分子量種（ＨＭＷＳ）の含量割合の概要である。
現在の治療用バイオテクノロジー製品は、高品質であり、且つ組換え体ヒトタンパク質及び抗体は、内在性のヒトタンパク質に類似しているものの、タンパク質の不安定性は、依然として重要な懸念事項である。起こり得るタンパク質活性の喪失及び薬物製品の望ましくない外観などのタンパク質凝集の品質に関する影響に加えて、可溶性のタンパク質凝集体は、顕著な細胞毒性作用を有することが報告されており、重要なこととして、可溶性のタンパク質凝集体は、タンパク質製品に対する免疫反応の発生に関する潜在的なリスク因子となる。タンパク質凝集は、発酵、リフォールディング、精製、充填、輸送、保管又は投与を含めたタンパク質の寿命にわたる様々な時点で起こる可能性があり、且つ様々な環境因子に強く左右される。当技術分野では、治療用タンパク質における安定性の増大及び凝集の低減が極めて必要とされており、最適化された医薬製剤がこれを行うのに役立ち得る。
ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト分子などの特定のタンパク質系医薬品は、長期間にわたって液体製剤中で安定ではなく、特に加速温度、例えば４℃以上の冷蔵温度で安定ではない。示差走査熱量測定によるＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの非ＨＬＥ及びＨＬＥのバリアントの両方の最初の試験は、通常、酸性ｐＨ値よりも中性において高い熱安定性を示し、例えばｐＨ６又はｐＨ７に対してｐＨ４で低い安定性を示す。したがって、当業者であれば、このような抗体コンストラクトの溶液安定性が低減するはずであると提案するであろう。結果的に、当業者であれば、通常避けられるべきであるｓｃＦｖの不安定化を想定するため、本発明による抗体コンストラクトに関して低ｐＨ製剤を避けるであろう。したがって、反対に、本発明による抗体コンストラクトが、低ｐＨ値を有する液体医薬組成物中においてより一層安定であることは、極めて驚くべき発見であった。
本発明の基盤となる普遍的なコンセプトは、本発明による抗体コンストラクトを含む液体医薬組成物のコロイド安定性が低ｐＨで向上するという発見である。本発明の抗体コンストラクトは、通常、それらの第１及び第２のドメインに関して異なる等電点（ｐＩ）値を有する。加えて、第３のドメインのｐＩも、通常、第２のドメインのｐＩと異なる。生理的条件下では、第１及び／又は第３のドメインは、通常、ｐＩが、例えば、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０又は６．５のｐＩを有する酸性側にあるため、負に荷電し得る。たとえ第１のドメインが６，５を超える、例えば約７．０、７．５、８．０又は８．５のｐＩを有するとしても、このｐＩは、通常、一般に８．０～１０．０、より典型的には約８．５～９．５、好ましくは約９．２のｐＩを有する第２のドメインのものよりも低いであろう。加えて、第３のドメインは、通常、６．０～７．０の弱酸性のｐＩを有し、これは、たとえ第１のドメインのｐＩが弱塩基性であるとしても、第２のドメインと第３のドメインとの間のｐＩの相違は、維持されることを意味する。結果として、別々のドメインが異なる、すなわち反対の電荷を有するため、少なくとも１つのドメインが酸性ｐＩ及び塩基性ｐＩとしての別のドメインを有する任意のｐＩ差による双極子が生理的条件下でもたらされることになる。前述の反対の電荷は、分子内及び分子間の静電引力をもたらし得、それにより凝集及びしたがって望ましくない高分子量（ＨＭＷ）種の形成がもたらされる場合がある。前述の形成は、溶液の安定性又は分散体のコロイド安定性に重大な影響を及ぼし得る。しかしながら、媒体のｐＨが低い場合、全てのドメインは、プロトン化され、静電反発力が生じる（図２を参照されたい）。
例えば、ｐＨ７では、ＣＤ１９に対する第１のドメイン及びＣＤ３に対する第２のドメインを含む抗体コンストラクトは、Ｔ細胞エンゲージドメイン上の正電荷及びＣＤ１９ドメイン上の負電荷によって双極子を形成する。これが引力をもたらし、結果としてコロイド不安定性を引き起こす凝集をもたらす。約ｐＨ４では、両方のドメインは、正に荷電し、電荷斥力によりコロイド安定性が向上する。
加えて、たとえ第１及び第２のドメインのｐＩがそれぞれ互いに近い、例えば第１のドメインが約８．０であり、且つ第２のドメインが約８．５又は９．０又は９．５であるとしても、両方のドメインは、８よりも低いｐＨ値ですでに正に荷電している。さらに低いｐＨ、例えば約４では、２つのドメイン、例えば標的及びＴ細胞エンゲージドメインは、著しく正に荷電する。これにより一層増大した電荷－電荷斥力がもたらされ、結果として明らかに高いコロイド安定性がもたらされる。この効果は、通常、弱酸性の範囲のｐＩを有し、したがってｐＩに関して第２のドメインと常に異なる第３のドメインが存在する場合に追加される。要するに、本発明による抗体コンストラクトは、常に、６．０以下、又は５．５以下、又は５．０以下、又は４．５以下、例えば４．２などの低ｐＨを有する媒体中において一般にプロトン化されたドメインを有することから恩恵を被っている。
一般に腫瘍学標的のためのｓｃＦｖドメインである本発明による抗体コンストラクトの第１のドメインは、通常、一般に抗ＣＤ３ドメインである第２のドメインと異なるｐＩを有する。
典型的には、第２のドメイン、例えば抗ＣＤ３ドメインは、８～１０、好ましくは約８．５～９．５の範囲、最も好ましくは約９．２のｐＩを有する。
第１のドメインが抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ３３ドメインである場合、第１のドメインは、約４．９～５．３のｐＩを有し得る。第１のドメインが抗ＤＬＬ３又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩドメインである場合、第１のドメインは、約６～８又は約９．０のｐＩを有し得る。第１のドメインが抗ＣＤ７０ドメインである場合、第１のドメインは、約８．０～８．５のｐＩを有し得る。第１のドメインが抗ＣＤＨ１９ドメインである場合、第１のドメインは、約７．０～７．５のｐＩを有し得る。第１のドメインが抗ＰＳＭＡドメインである場合、第１のドメインは、約７．０～７．５のｐＩを有し得る。第１のドメインが抗ＭＳＬＮドメインである場合、第１のドメインは、約９．０～９．５のｐＩを有し得る。第１のドメインが抗Ｆｌｔ３ドメインである場合、第１のドメインは、約８．５～９．５のｐＩを有し得る。
異なるｐＩのドメインを安定化する製剤のコンセプトは、任意の抗体コンストラクトに適用され得ることが本発明に関連して想定される。本発明に関連して、本明細書で記載される第３のドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトは、特に本明細書で記載される製剤によって安定化されるのに適している。しかしながら、例えば、このような第３のドメインを有しない他の二重特異性抗体コンストラクトも本発明に従って効率的に安定化され得る。例えば、本発明による抗体コンストラクトは、配列番号１９５４～１９５６のＨＣＤＲ及び配列番号１９５８～１９６０のＬＣＤＲを含む第１のドメインを有し得ることが想定される。本発明による抗体コンストラクトは、配列番号１９５７のＶＨ及び配列番号１９６１のＶＬを含む第１のドメインを有し得ることも想定される。本発明による抗体コンストラクトの第１のドメインは、配列番号１９６２による第１のドメインを有し得ることがさらに想定される。本発明による抗体コンストラクトは、配列番号１９６３による配列を有し得ることも想定される。
しかしながら、本発明に関連して、医薬組成物の安定化効果は、異なるｐＩの（結合）ドメインを有する抗体コンストラクトに限定されない。したがって、本医薬組成物は、こうして本明細書に記載される製剤によって安定化され得る異なるｐＩの部分とともに提供される抗体コンストラクトに対する安定化製剤を提供することも想定される。このような部分は、結合ドメイン自体が、本発明に関連して医薬組成物に従って提供されるさらなる安定化を必要とすることになるように、ｐＩの異ならない場合でも、そのような抗体コンストラクトの結合ドメインをマスクするマスキング部分を含み得る。通常、マスキング部分を含むこのような抗体コンストラクトは、活性化可能な抗体コンストラクトである。本発明に関連して、このような活性化可能な抗体コンストラクトは、好ましくは、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ７０からなる群から選択される腫瘍抗原などの任意の標的細胞の表面抗原に結合し得る。
このような活性化可能な抗体コンストラクトは、通常、（ｉ）それぞれが重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を含む少なくとも２つの結合ドメイン、（ｉｉ）未切断状態において標的細胞表面などの対応する結合パートナーへのそれぞれの結合ドメインの結合を阻害するマスキング部分、及び（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との間に位置する切断可能な部分であって、例えばプロテアーゼの基質として機能するポリペプチドである切断可能な部分を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであり得る。通常、未切断状態の切断可能な抗体は、次のとおりのＮ末端からＣ末端への構造配置を有する：マスキング部分－切断可能な部分－結合ドメイン又は結合ドメイン－切断可能な部分－マスキング部分。本発明による医薬組成物は、活性化可能な抗体コンストラクトへの安定性の付与において特に有利であり得るが、少なくとも２つの結合ドメインの少なくとも２つのマスキング部分のｐＩが異なる。例えば、一方のマスキング部分のｐＩは、３～５、好ましくは３．５～４．５、より好ましくは３．９～４．５の範囲であり得る一方、他方のマスキング部分は、５．０～７．０、好ましくは５．５～６．０の範囲である。このような場合、本発明による医薬組成物中でこのような抗体コンストラクトを製剤化する際、前記抗体コンストラクトの凝集は、著しく低減する場合があることが通常見出される。通常、高分子量（ＨＭＷ）種のパーセンタイルに換算した凝集は、低ｐＨでの同じプロトン化及び本発明による医薬組成物中の賦形剤の追加の安定化機能により、例えば約１０％～約６、５、４又は４％未満にさえ著しく低減する場合がある。４％未満のパーセンタイルのＨＭＷ種は、通常、約４．２～４．８のｐＨを有する本発明による医薬組成物中で見出される。
好ましくは、本発明による医薬組成物の（溶液）ｐＨは、両方のドメインについて正味の正電荷をもたらして、ドメイン間とドメイン内との両方に斥力をもたらすため、本発明による抗体コンストラクトの２つ又は３つのドメインのいずれのｐＩよりも低くなるべきである。約４．０～５．５のｐＨ値が好ましく、４．２～４．８がより好ましい。
驚くべきことに、本発明による医薬組成物は、予想されるよりも高濃度で本発明による抗体コンストラクトを含み得ることも見出された。一般に、本明細書で記載される抗体コンストラクトは、最大で約１ｍｇ／ｍｌの濃度で液体医薬組成物中において保管及び／又は使用される。より高い濃度では、凝集の傾向が観察される。しかしながら、本明細書で説明されるとおり、低ｐＨが、凝集のリスクを低減する静電気的な分子間及び分子内斥力に寄与し、（コロイドの）不安定性を有しないで１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５又は８．０ｍｇ／ｍｌなどのより高い抗体コンストラクト濃度が可能になり得る。
本発明の医薬組成物は、無機陰イオン又は塩化ナトリウムなどの無機陰イオンを含む塩を含まないことが好ましいことがさらに見出された。本発明の医薬組成物の浸透圧は、最小管理単位（ＳＫＵ）内で非イオン性賦形剤（例えば、スクロース）によって調整されることが好ましい。理論に束縛されるものではないが、タンパク質製剤は、本明細書で記載される静電反発力に有利であるために分子の等電点と十分に異なる製剤ｐＨ値を選択することにより、物理的に安定化され得ることがその理由である。しかしながら、これらの斥力は、製剤中に存在するイオンとの相互作用によって弱められ得る。イオン、特に無機陰イオンは、タンパク質の表面の電荷を最小化又は中和する可能性があり、且つ分子内斥力の低減によって疎水性相互作用を生じさせる可能性がある。したがって、本発明による医薬組成物は、無機陰イオンを含まないことが好ましい。必要とされる緩衝剤化合物としてグルタミン酸塩及び／又は酢酸塩などの有機陰イオンのみを含むことが好ましい。したがって、本発明による医薬組成物は、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｉ－及びＢｒ－などの無機陰イオンを含まないことが好ましい。特に、本発明による医薬組成物は、ＮａＣｌを含まないことが好ましい。
本発明による液体製剤中の抗体コンストラクトの安定性の増大は、貯蔵可能な固体、すなわち乾燥医薬組成物を得るための、費用がかかり面倒な凍結乾燥の工程を省くことに寄与し得る。また、低ｐＨの医薬組成物は、静注投与に好適であり得る。しかしながら、例えば皮下又は筋肉内投与が必要である場合又は他の医学的な理由のために低ｐＨが許容されない場合、固体医薬組成物を引き続き本発明による液体医薬組成物から得ることができる。このようにして得られた凍結乾燥物は、投与又は個別の医学的必要性に要求される形態に好適な薬学的に許容される媒体中で再構成され得る。加えて、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）などのさらなる安定化剤は、低ｐＨの本医薬組成物の使用によって不要になり得る。
本明細書で提示される医薬組成物により、製剤化された二重特異性抗体コンストラクトの安定が可能になる。様々な二重特異性抗体コンストラクトの製剤パラメータの影響の評価は、製剤が、標的結合体中の半減期延長部分、ＩＥＰ又はシステインクランプの存在を含むが、これらに限定されない分子の特徴に依存して最適化され得ることを示す。本明細書に記載されるとおりの至適ｐＨ及び塩含量の慎重な選択が不可欠である。安定性に関する限り、加速された保管条件での等温性の長期間安定性試験と調査される二重特異性抗体コンストラクトについての安定性予測方法とを関連付けることは、それが以前にモノクローナル抗体についても示されているため可能である。本明細書に記載される二重特異性抗体コンストラクトは、３０℃での長期間の保管中及び安定性予測方法中、全体的に安定であり、その結果、調査されるパラメータの部分は、相当に堅牢なままであり、例えばＤＬＳ流体力学的半径を含む相関を見出すことが困難になる。この現象は、保管及び温度ストレスに対する二重特異性抗体の様々な反応を含む、ｐＨ及びイオン強度における製剤条件を変えることによって補正される。しかしながら、安定性予測方法、特に温度勾配ｎａｎｏＤＳＦ及び温度勾配ＤＬＳ並びに疎水性相互作用クロマトグラフィーがあり、そのパラメータは、等温性の安定性試験中に評価される一部のパラメータ、例えばサブビジブル粒子の数、ＩＦ比３５０ｎｍ／３３０ｎｍ及び酸性電荷バリアントの量に対して非常に強力且つ理解可能な相関を示す。それにもかかわらず、長期間安定性に対する線形劣化動力学の適用は、難しく、したがって遅延時間並びに凍結及び解凍により誘導される主要な加速劣化を有する確率的動力学を排除しないため、凝集の予測は、課題に直面する。本明細書で使用される安定性予測技術は、本発明による医薬組成物中の二重特異性抗体コンストラクトの安定性に対して有用な予測をもたらす。
本発明において、用語「安定性」又は「安定化」は、医薬組成物全体の安定性に関し、また特に活性成分（例えば、二重特異性単鎖抗体コンストラクト）自体の具体的には製剤、充填、輸送、保管及び投与中の安定性に関する。本発明の医薬組成物及び二重特異性単鎖抗体コンストラクトに関連して、用語「安定性」又は「安定な」は、特にタンパク質凝集体（ＨＭＷＳ）の形成の低減又は防止を指す。特に、用語「安定性」は、本明細書で記載される医薬組成物内に含まれる二重特異性単鎖抗体コンストラクトのコロイド安定性にも関する。「コロイド安定性」は、コロイド粒子（タンパク質など）が液体中において長期間（数日～数年）分散されたままとなる能力である。
本明細書で使用する場合、用語「（タンパク質）凝集体」は、通常、所望の既定の種（例えば、単量体）ではなく、「オリゴマー」又は「マルチマー」などの高分子量のタンパク質種を包含する。本用語は、本明細書において用語「高分子量種」及び「ＨＭＷＳ」と互換的に使用される。タンパク質凝集体は、通常、サイズ（小型（二量体）～大型の集合体（サブビジブル粒子又はさらに目に見える粒子）の範囲であり、且つナノメートル～マイクロメートルの直径範囲）、形態（ほぼ球状～線維状）、タンパク質構造（天然対非天然／変性）、分子間結合の種類（共有結合性対非共有結合性）、可逆性及び可溶性の点で異なり得る。可溶性凝集体は、およそ１～１００ｎｍのサイズ範囲を占め、タンパク質微粒子は、顕微鏡下でないと見えない（約０．１～１００．ｍ）及び目に見える（＞１００．ｍ）範囲を占める。前述の種類のタンパク質凝集体の全ては、通常、本用語に包含される。したがって、用語「（タンパク質）凝集体」は、２つ以上のタンパク質単量体の物理的に会合した又は化学的に結合したあらゆる種類の非天然種を指す。
したがって、用語「タンパク質凝集」又は「非天然凝集」は、タンパク質分子が２つ以上のタンパク質で構成された複合体を構築するプロセスを示し、個々のタンパク質は、単量体として示される。タンパク質凝集に至る複数の経路が存在し、タンパク質凝集は、温度、振盪及び撹拌などの機械的ストレス、ポンピング、凍結及び／又は解凍並びに製剤を含む多様な条件によって誘導され得る。
温度の上昇は、タンパク質の酸化及び脱アミドなどの化学反応を加速させ、それにより凝集を促進し得る。また、高温は、タンパク質の立体構造に対して四次構造、三次構造及び二次構造のレベルで直接的に影響を及ぼし、凝集を促進し得る温度誘導性のアンフォールディングをもたらし得る。本願において参照される温度は、通常、繊細なタンパク質系医薬品の長期間の保管のための超低温冷凍温度（－７０℃）、通常の冷凍温度（－２０℃）、冷蔵温度（４℃）、室温（２５℃）及び生理的温度（３７℃）である。
タンパク質の変性及び凝集は、新たな氷／溶液界面の生成、コンテナ表面への吸着、タンパク質及び溶質の凍結濃縮及び緩衝液成分の結晶化によるｐＨ変化など、複雑な物理的及び化学的な変化に起因して凍結／解凍中に生じる可能性がある。
タンパク質濃度の上昇もタンパク質凝集体の形成を増強し得る。高タンパク質濃度では、高分子溶質による高い全体積占有率がその溶液中の各高分子種の挙動に及ぼす作用を説明するために使用される用語の高分子クラウディングが生じる。この排除体積理論によれば、自己集合及びこのような潜在的凝集が有利になる場合がある。
ベンジルアルコール及びフェノールなどの抗菌保存剤は、タンパク質液体製剤において貯蔵寿命中の無菌性を保証するために必要となる場合が多く、加えて、多用量製剤及びある種の薬物送達システム、例えば注射ペン、ミニポンプ及び局所適用においても必要とされる。多くの保存剤についてタンパク質凝集を誘発することが報告されているが、根底にある機構は、十分に理解されていない。保存剤が、凝集を起こしやすい折り畳まれていないタンパク質状態に結合し、それを集合させていることが提唱されている。
有利には、本発明の医薬組成物は、安定であることが想定され、すなわちストレス、特に熱ストレス、保管、表面に誘導されるストレス（例えば、凍結／解凍サイクル、発泡）、濃縮（限外濾過及びダイアフィルトレーションによる）又は抗菌保存剤などの有機化合物との混合に供されている場合でも、タンパク質凝集体を含まないか又は実質的に含まない状態を保つことが想定される。好ましくは、医薬組成物は、付属の実施例で評価された低ｐＨを有する組成物と比較して同様の又は一層向上した特徴を有し得る。本発明の医薬組成物は、分散し、且つ好ましくは単量体である二重特異性単鎖抗体コンストラクトなどのタンパク質系医薬品の均質な溶液であることが好ましい。
２つ（以上）の異なる抗原に同時に結合する二重特異性（及び／又は多重特異性）抗体に好適な製剤を提供することが本発明に関連して想定される。ある種の実施形態では、二重特異性抗体は、第１の標的抗原に結合する一方、第２の抗原は、エフェクター細胞、すなわち１つ以上のＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）を発現し、且つ抗体のＦｃ領域に起因する１つ以上のエフェクター機能を遂行する白血球上に存在する細胞表面分子である。エフェクター機能の例としては、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、ファゴサイトーシス、細胞表面受容体の下方制御及びＢ細胞活性化が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＤＣＣに関与するエフェクター細胞の例としては、細胞傷害性Ｔ細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球及び好中球が挙げられるが、これらに限定されない。
当業者であれば、本医薬組成物が効果的に活性成分の安定化をもたらす（すなわち二重特異性単鎖抗体コンストラクトのタンパク質凝集体の形成を低減又は阻害する）ものの、場合により、いくつかの凝集体又は立体構造異性体が医薬組成物の全体的な可用性を実質的に損なうことなく形成され得ることを理解するであろう。これに関連して、凝集体を「実質的に含まない」とは、凝集体の量が、特に環境ストレス、例えば付属の実施例で評価されるとおりのストレスに供される場合でも、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％（ｗ／ｖ）未満のままであることを意味する。
可溶性及び不溶性のタンパク質凝集体の存在を決定するための方法は、とりわけ、Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００９ Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９－３４によって概説されている。可溶性のタンパク質凝集体の形成は、付属の実施例に記載されるとおり、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）によって評価することができる。ＳＥＣは、タンパク質凝集体の検出及び定量化に最もよく使用されている分析方法の１つである。ＳＥＣ分析により、凝集体のサイズの決定及び定量化の両方が可能になる。ＳＥＱ－ＵＰＬＣにより、約５～１０００ｋＤａの分子量範囲で高分子の形状及びサイズ（流体力学的半径）に基づいて高分子の選択的且つ迅速な分離が可能になる。
タンパク質溶液は、タンパク光又は混濁度と呼ばれる光学的特性を示す。溶液の光学的特性は、存在する粒子が光を散乱し吸収する機能である。タンパク質は、天然のコロイドであり、水性製剤の混濁度は、タンパク質濃度、溶解していない粒子の存在、粒子サイズ及び単位体積当たりの粒子数に依存する。混濁度は、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法によって３４０～３６０ｎｍの範囲における光学密度として測定することができ、可溶性及び不溶性の凝集体両方を検出するのに使用することができる。
さらに、視覚的手段による試料の検査も依然としてタンパク質凝集体の評価における重要な側面である。目に見える凝集体の有無の視覚的評価は、好ましくは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ Ｃｏｄｅｘ（ＤＡＣ）試験５に従って実施される。
本明細書の他の箇所で説明されるとおり、本発明の医薬組成物は、おそらく低ｐＨ及び任意選択的にそれに含まれるさらなる安定化剤の作用により、二重特異性単鎖抗体コンストラクトのコロイド安定性の増大に有利であり、したがって液－液相分離（ＬＬＰＳ）の低減又は一層の不在を示すことが想定される。ＬＬＰＳは、熱力学的に促進される現象であり、均質なタンパク質溶液が温度低下によってタンパク質の乏しい相（通常、上層）とタンパク質の豊富な相（通常、下層）とに分離する現象である。ＬＬＰＳは、通常、単にこの２つの相を混合し溶液の温度を上げることによって完全に元に戻すことができる。ＬＬＰＳの発生は、短い範囲における引力性のタンパク質－タンパク質相互作用に起因し、これは、タンパク質－タンパク質引力の強さの尺度となる。本発明によるβ－シクロデキストリンを含む医薬組成物は、β－シクロデキストリンを含まない医薬組成物と比較して、高濃度の二重特異性抗体コンストラクトをＬＬＰＳのタンパク質の乏しい相中に含むことが見出された。したがって、本発明の医薬組成物は、対照と比較した場合、ＬＬＰＳの低減又はＬＬＰＳの完全な不在を呈し、したがって本発明の二重特異性抗体コンストラクトのコロイド安定性の増大を促進することが想定される。ＬＬＰＳは、誘導可能であり、異なる相のタンパク質含量を付属の実施例に記載のとおりに調べることができる。
環境ストレスは、特に熱及び／又は化学的変性に起因して立体構造変化をもたらす場合もあり、それにより凝集に有利となり得る。驚くべきことに、本発明者らは、芳香族アミノ酸の固有の蛍光発光強度を測定することによって評価されるとおり、二重特異性抗体コンストラクトが立体構造変化に対しても安定化されることを見出した。したがって、本発明の医薬組成物は、好ましくは、立体構造異性体（すなわち非天然の異常に折り畳まれたタンパク質種）の形成も低減又は阻害する。
先に説明したとおり、本発明の安定な医薬組成物は、第１の結合ドメインを介して標的細胞の表面抗原に結合し、且つ第２の結合ドメインを介してＴ細胞の表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性抗体コンストラクトを含む。
用語「抗体コンストラクト」は、その構造及び／又は機能が、抗体、例えば全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／若しくは機能に基づき、且つ／又は抗体若しくはそのフラグメントの可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから抽出される分子を指す。したがって、抗体コンストラクトは、その特異的な標的又は抗原に結合することができる。さらに、本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在によって定義され得る。抗体の最小構造要件を定義する代替の手法は、特異的な標的の構造、それぞれエピトープ領域を構成する標的タンパク質のタンパク質ドメイン（エピトープクラスター）内での抗体のエピトープの定義であるか、又は定義された抗体のエピトープと競合する特異的な抗体を参照することによる。本発明によるコンストラクトに基づく抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含む。
本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインは、例えば、上で参照されたグループのＣＤＲを含み得る。好ましくは、それらのＣＤＲは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク内に含まれるが、それが両方を含む必要はない。Ｆｄフラグメントは、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。抗体フラグメント、抗体バリアント又は結合ドメインの形式についてのさらなる例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（２）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）並びに（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリ由来のもの）。本発明による抗体コンストラクトの実施形態の例は、例えば、国際公開第００／００６６０５号パンフレット、国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレット、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３７８３８号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３７号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号明細書、国際公開第２０１４／１４４７２２号パンフレット、国際公開第２０１４／１５１９１０号パンフレット及び国際公開第２０１５／０４８２７２号パンフレットに記載されている。
代替の二重特異性抗原結合形式は、例えば、本明細書に参照として組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５４１５１号明細書に記載される。例えば、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ抗体がＣ末端でＦｖフラグメントと融合されているｍＡｂ－Ｆｖ形式を含み得る。代わりに、ＩｇＧ抗体がＣ末端でＦａｂと融合されているｍＡｂ－Ｆａｂ形式が使用され得る。ｍＡｂ－Ｆａｂコンストラクトは、ＣＨ及びＣＬ定常ドメインＣ末端を含有するが、ｍＡｂ－Ｆｖは、Ｃ末端Ｆｖ融合体にそれらを含有しない。米国特許出願公開第２０１１／００５４１５１号明細書の図８を参照されたい。任意選択的に、ｍＡｂ－Ｆｖ及びｍＡｂ－ＦａｂコンストラクトのＮ末端結合領域は、軽鎖及びＣＨ１ドメインを欠く（すなわち単一ドメインＶＨＨ領域を含む）。ｍＡｂ－Ｆｖ及びｍＡｂ－Ｆａｂコンストラクトは、３つの可変領域を含有し、その結果、それらは、第１の抗原に二価で結合し、且つ第２の抗原に一価で結合する。好適な二重特異性抗原結合形式には、米国特許出願公開第２０１１／００５４１５１号明細書に記載されるＦａｂ－Ｆｖ及びＦａｂ－Ｆａｂコンストラクトも含まれる。Ｆａｂ－Ｆｖ及びＦａｂ－Ｆａｂ免疫グロブリンは、第１の抗原に結合するＮ末端Ｆａｂフラグメントを含み、Ｃ末端Ｆｖ又はＦａｂフラグメントは、第２の抗原に結合する。
好ましくは、ヘテロ二量体抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない複数のサブクラスを有するＩｇＧクラスの抗体であるが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥも考えられる。抗体は、アイソタイプ及び／又はサブクラスのハイブリッドも含み得ることが理解されるべきである。例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号明細書に示されるとおりのＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ操作が本開示の一部として考えられる。
「結合ドメイン」又は「～に結合するドメイン」の定義には、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は「ｒＩｇＧ」（「半抗体」）などの全長抗体のフラグメントも含まれる。本発明による抗体コンストラクトは、抗体バリアントとも呼ばれる、抗体の改変されたフラグメント、例えばｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ又はｂｉ（ｓ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖ、「マルチボディ」、例えばトリアボディ又はテトラボディ及び単一ドメイン抗体、例えばナノボディ又は他のＶ領域若しくはドメインに非依存的に抗原若しくはエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ若しくはＶＬであり得る１つのみの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体も含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「単鎖Ｆｖ」、「単鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖及び軽鎖の両方の由来の可変領域を含むが、定常領域を欠く単一ポリペプチド鎖抗体フラグメントを指す。通常、単鎖抗体は、ＶＨ及びＶＬドメイン間において、抗原への結合を可能にする所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）においてＰｌｕｃｋｔｈｕｎによって詳細に議論されている。単鎖抗体を作製する様々な方法が知られており、米国特許第４，６９４，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書；国際特許出願公開国際公開第８８／０１６４９号パンフレット；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１に記載されるものを含む。特定の実施形態において、単鎖抗体は、二重特異性、多重特異性、ヒト及び／若しくはヒト化並びに／又は合成性でもあり得る。
さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、一価、二価及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）コンストラクト、したがって２つのみの抗原性構造に特異的に結合する二重特異性コンストラクト並びに異なる結合ドメインを通じて３つ以上の抗原性構造、例えば３つ、４つ以上に特異的に結合する多重特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）／多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）コンストラクトを含む。さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、１つのみのポリペプチド鎖からなる分子及び鎖が同一（ホモ二量体、ホモ三量体若しくはホモオリゴマー）であるか、又は異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体若しくはヘテロオリゴマー）かのいずれかであり得る２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子を含む。上記で特定された抗体及びそのバリアント又は誘導体の例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ２００９に記載されている。
本明細書で使用する場合、用語「二重特異性」は、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを指し、すなわち、それは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインは、１つの抗原又は標的（ここで、標的細胞の表面抗原）に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原又は標的（例えば、ＣＤ３）に結合する。したがって、本発明による抗体コンストラクトは、少なくとも２つの異なる抗原又は標的に対する特異性を備える。例えば、第１のドメインは、好ましくは、本明細書に記載される種の１つ以上のＣＤ３εの細胞外エピトープに結合しない。用語「標的細胞の表面抗原」は、細胞によって発現され、且つ本明細書に記載される抗体コンストラクトがアクセスできるようにその細胞表面に存在する抗原性構造を指す。それは、タンパク質、好ましくはタンパク質の細胞外部分又は糖質構造、好ましくは糖タンパク質などのタンパク質の糖質構造であり得る。それは、腫瘍抗原であることが好ましい。本発明の用語「二重特異性抗体コンストラクト」は、多重特異性抗体コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト又は４つ以上（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトも包含する。
本明細書で理解されるとおりの二重特異性抗体及び／又は抗体コンストラクトとしては、従来型の二重特異性免疫グロブリン（例えば、ＢｓＩｇＧ）、付加された抗原結合ドメイン（例えば、軽鎖又は重鎖のアミノ末端若しくはカルボキシ末端が、単一ドメイン抗体又は対になった抗体可変ドメイン（例えば、Ｆｖ又はｓｃＦｖ）などの追加の抗原結合ドメインに連結される）を含むＩｇＧ、ＢｓＡｂフラグメント（例えば、二重特異性単鎖抗体）、二重特異性融合タンパク質（例えば、エフェクター部分に融合された抗原結合ドメイン）及びＢｓＡｂコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、様々な二重特異性形式を記載し、参照として本明細書に組み込まれるＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照されたい。二重特異性コンストラクトの例としては、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）形式（リンカーによって結合される２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質）及びＦａｂ２二重特異性体並びに全長抗体を含む改変されたコンストラクトが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、全てが明示的に本明細書に組み込まれるＣｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ １［６］：１－９；及びＨｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３［９］：１１２６－１１３６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５［１１］：１２９０－１２９７；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ １［２］：１２８－１４１；国際公開第２００９０３２７８２号パンフレット及び同第２００６０２０２５８号パンフレット；Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３［５］：３６１－３６７；米国特許出願公開第２００２０１０３３４５号明細書；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１［１６］：１０７０６－１０７１４；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０［２０］：１９６６５－１９６７２；及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２ ＭＡｂｓ ４（２）：１８２を参照されたい。
本発明による抗体コンストラクトが（少なくとも）二重特異性である場合、それらは、天然に存在せず、且つそれらは、天然に存在する産物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗体コンストラクト又は免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体又は免疫グロブリンである。二重特異性抗体コンストラクトは、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）を参照されたい。
本発明の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変及び／又は結合）ドメイン及びもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーは、第３のドメインを本発明の抗体コンストラクトの他のドメインに融合するためにも使用され得る。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、それがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されるものがある。ペプチドリンカーは、他のドメイン又はモジュール又は領域（半減期延長ドメインなど）を本発明の抗体コンストラクトに結合するためにも使用され得る。
本発明の抗体コンストラクトは、「インビトロで作製された抗体コンストラクト」であることが好ましい。本用語は、可変領域の全て又は一部（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞の選択、例えばインビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ又は抗原結合能に関して候補配列を試験することができる任意の他の方法において作製される、上記定義による抗体コンストラクトを指す。したがって、本用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ作製される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術又は遺伝子工学の使用により作製された抗体である。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又はモノクローナル抗体コンストラクトは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち少量存在する可能性がある、考えられる天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、異なる決定基（又はエピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位又は決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
モノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養により産生される抗体をもたらす任意の技術を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７－９６）が挙げられる。
次に、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングして、指定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、その任意のバリアント又はフラグメント並びにその抗原性ペプチドなど、任意の形態の関連抗原が免疫原として使用され得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用して、標的細胞の表面抗原のエピトープにファージ抗体が結合する効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７－１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７－１３）。
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して、非ヒト動物、例えば齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギ又はラットなど）を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きいフラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択し得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１、米国特許出願公開第２００３－００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得た後、当技術分野で知られる組換えＤＮＡ技術を用いて、例えばヒト化、脱免疫、キメラ化などの改変を行うこともできる。改変抗体コンストラクトの例としては、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９－８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２－１０８３７（１９９１）を参照されたい）エフェクター機能及びが改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照されたい）が挙げられる。
免疫学において、親和性成熟とは、免疫反応の過程で抗原に対する親和性の増大した抗体をＢ細胞が産生するプロセスである。同一抗原への反復暴露により、宿主は、親和性が連続的に増大する抗体を産生することになる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、変異と選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟を問題なく使用して、抗体、抗体コンストラクト及び抗体フラグメントを最適化している。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原又はエラープローンＰＣＲを用いて導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェイン・シャッフリング法によって増大させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を用いた２又は３ラウンドの変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントが得られる。
抗体コンストラクトの好ましいタイプのアミノ酸置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴うものである。一般に、さらなる開発のために選択されて得られるバリアントは、それらが生成された親抗体と比べて向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換バリアントを生成するための簡便な方法には、ファージディスプレイを用いる親和性成熟が含まれる。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７部位）は、それぞれの部位で可能な全てのアミノ酸置換が生じるように変異される。そのようにして生成された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。次に、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書に開示されるとおりにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャニング変異導入法を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。代わりに又は加えて、結合ドメインと例えばヒト標的細胞の表面抗原との接触点を同定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益な場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述される技術による置換の候補である。そのようなバリアントを生成してから、バリアントのパネルに対して、本明細書に記載されるとおりのスクリーニングを施し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択し得る。
本発明のモノクローナル抗体及び抗体コンストラクトは、特に重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残部は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。
抗体、抗体コンストラクト、抗体フラグメント又は抗体バリアントは、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット又は国際公開第００／３４３１７号パンフレットの実施例に開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によっても改変され得る。簡潔に説明すると、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを分析することができる。これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに定義される）に相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに記載されるとおり、「ペプチドスレッディング法」と呼ばれるコンピュータモデリング手法を適用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースにおいて、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合するため、潜在的なＴ細胞エピトープとなる。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することにより、又は好ましくは単一のアミノ酸置換により除去することができる。通常、保存的置換を行う。全てではないが多くの場合、ヒト生殖細胞系列の抗体配列内の位置に共通するアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖細胞系列配列については、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７－２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８－４６３８に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥ総覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる編集）。これらの配列をヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲに使用することができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されるコンセンサスヒトフレームワーク領域を使用することもできる。
「ヒト化」抗体、抗体コンストラクト、バリアント又はそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合部分配列）は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、大部分がヒト配列である抗体又は免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲともいう）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ハムスター又はウサギなどの非ヒト（例えば齧歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基も含む場合がある。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させ、最適化するためになされる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む場合がある。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。
ヒト化抗体又はそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメイン由来の均等な配列で置換することによって生成することができる。ヒト化抗体又はそのフラグメントを生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４並びに米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，８５９，２０５号明細書及び米国特許第６，４０７，２１３号明細書により提供される。それらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は一部分をコードする核酸配列を単離、操作及び発現することを含む。そのような核酸を、上記のとおりの所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ及び他の供給源から得ることができる。次に、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡが適切な発現ベクターにクローニングされ得る。
ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどのトランスジェニック動物を用いて作製され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全ては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換されるか又はＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置換され得る。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置換することのみが必要である。
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／又は復帰変異の導入によって最適化することができる。このような改変免疫グロブリン分子は、当技術分野で知られる複数の技術のいずれによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８－７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３－１６，１９８２及び欧州特許第２３９４００号明細書）。
用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体コンストラクト」及び「ヒト結合ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（前掲）によって記載されたものを含む、当技術分野で知られるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変及び定常領域又はドメインなどの抗体領域を有する抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発により又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える位置を有し得る。しかしながら、本明細書で使用する場合、ヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術又はシステムを使用することによって得ることができる、非人為的且つ／又は遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む「完全ヒト抗体」も意図している。好ましくは、「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンによってコードされないアミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、「単離された」又は「実質的に純粋な」抗体コンストラクトである。本明細書に開示される抗体コンストラクトを記載するために使用する場合、「単離された」又は「実質的に純粋な」は、その産生環境の成分から同定、分離及び／又は回収された抗体コンストラクトを意味する。好ましくは、抗体コンストラクトは、その産生環境由来の他の全ての成分との会合を有しないか又は実質的に有しない。組換えトランスフェクト細胞から生じる成分などのその産生環境の混入成分は、通常、ポリペプチドについての診断又は治療用途を妨げる材料であり、これは、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。抗体コンストラクトは、例えば、所与の試料中の全タンパク質の少なくとも約５重量％又は少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、環境に応じて総タンパク質含量の５重量％～９９．９重量％を構成し得ると理解される。ポリペプチドが高い濃度レベルで作製されるように、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターの使用によって著しく高濃度でポリペプチドが作製され得る。この定義は、当技術分野で知られる多様な生物体及び／又は宿主細胞での抗体コンストラクトの産生を含む。好ましい実施形態では、抗体コンストラクトは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（２）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いた非還元若しくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均一性まで精製されることになる。ただし、通常、単離された抗体コンストラクトは、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。
用語「結合ドメイン」は、本発明との関係では、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位、例えばそれぞれＣＤ３３及びＣＤ３と（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインと見なす。第１の結合ドメイン（例えばＣＤ３３を認識する）の構造及び機能、好ましくは第２の結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／又は機能も、抗体の例えば全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能に基づき、且つ／又は抗体又はそのフラグメントの可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから抽出される。好ましくは、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在によって特徴付けられる。第２の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列をスキャフォールドに移植する以外のファージディスプレイ又はライブラリスクリーニング法によって作製されるか又は得られることが想定される。
本発明によれば、結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態である。このようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカー又はグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）を含み得る。タンパク質（そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント及び通常３０個未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、（アミノ酸の鎖をもたらす）共有ペプチド結合を通じて相互に結合された２つ以上のアミノ酸を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、通常、３０個を超えるアミノ酸からなる分子群を表す。ポリペプチドは、二量体、三量体及びより高次のオリゴマーなどのマルチマーをさらに形成し、すなわち２つ以上のポリペプチド分子からなる場合もある。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても同一でなくてもよい。このようなマルチマーの対応する高次構造は、したがって、ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる抗体分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。本明細書で参照される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペグ化などの化学修飾されたものでもあり得る。このような修飾は、当技術分野でよく知られており、本明細書で以下に記載される。
好ましくは、標的細胞の表面抗原に結合する結合ドメイン及び／又はＣＤ３εに結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体コンストラクトは、齧歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター又はウサギ）などの非ヒト可変及び／又は定常領域を有する抗体又は抗体コンストラクトに伴う問題の一部を回避する。このような齧歯類由来タンパク質が存在すると、抗体又は抗体コンストラクトの迅速なクリアランスをもたらす可能性があるか、又は患者による抗体又は抗体コンストラクトに対する免疫反応を発生させる可能性がある。齧歯類由来抗体又は抗体コンストラクトの使用を避けるために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯類に導入することにより、ヒト又は完全ヒト抗体／抗体コンストラクトを生成することができる。
ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニング及び再構築する能力及びそれらをマウス生殖細胞系列に導入する能力は、非常に大きいか又は粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明並びにヒト疾患の有用なモデルの生成にとって強力な手法を提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均等物で置換するそのような技術を使用すれば、発生期のヒト遺伝子産物の発現及び調節、それらと他の系との伝達並びに疾患の誘発及び進行へのそれらの関与について独特の見解を得ることができるであろう。
このような戦略の重要な実用化は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が不活性化されたマウスへのヒトＩｇ遺伝子座の導入により、抗体のプログラムされた発現及び構築並びにＢ細胞の発生におけるそれらの役割の基礎となる機構を研究する機会が得られる。さらに、このような戦略であれば、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンとなる完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製にとって理想的な供給源を得ることができるであろう。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトは、マウスｍＡｂ又はマウス由来ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー反応を最小化し、それによって投与される抗体／抗体コンストラクトの有効性及び安全性を増大させることが期待される。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトの使用により、化合物の反復投与を必要とする慢性及び再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫及び癌の治療に大幅な利点が得られるものと期待され得る。
この目標に向けた手法の１つが、マウス抗体の産生に欠損があるマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大きいフラグメントを用いて操作することであり、これは、このようなマウスが、マウス抗体を生じずに広範なレパートリーのヒト抗体を産生するであろうとの予測に立つものであった。大きいヒトＩｇフラグメントは、可変遺伝子の広範な多様性並びに抗体の産生及び発現の適切な調節を保持すると考えられる。抗体の多様化及び選択並びにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如ためにマウス機構を利用することにより、このマウス系統において再現されるヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高親和性の抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を使用すれば、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製及び選択することができるであろう。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４）を参照されたい）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、可変領域及び定常領域のコア配列を含有したヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列配置フラグメントを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて操作された。このヒトＩｇを含有するＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方に関してマウス系への適合性があることが証明されており、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子を置換することが可能であった。これは、それらがＢ細胞の発生を誘導して、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトｍＡｂを産生する能力によって実証された。これらの結果は、多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入が、感染及び免疫化に対するヒト液性応答を特徴とする実質的に完全なレパートリーを再現し得ることも示唆した。最近、Ｇｒｅｅｎらの研究を発展させ、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれのメガベースサイズの生殖細胞系列配置ＹＡＣフラグメントの導入により、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％超が導入された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）及び米国特許出願公開第０８／７５９，６２０号明細書を参照されたい。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの作製は、米国特許出願公開第０７／４６６，００８号明細書、同第０７／６１０，５１５号明細書、同第０７／９１９，２９７号明細書、同第０７／９２２，６４９号明細書、同第０８／０３１，８０１号明細書、同第０８／１１２，８４８号明細書、同第０８／２３４，１４５号明細書、同第０８／３７６，２７９号明細書、同第０８／４３０，９３８号明細書、同第０８／４６４，５８４号明細書、同第０８／４６４，５８２号明細書、同第０８／４６３，１９１号明細書、同第０８／４６２，８３７号明細書、同第０８／４８６，８５３号明細書、同第０８／４８６，８５７号明細書、同第０８／４８６，８５９号明細書、同第０８／４６２，５１３号明細書、同第０８／７２４，７５２号明細書及び同第０８／７５９，６２０号明細書；並びに米国特許第６，１６２，９６３号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書及び同第５，９３９，５９８号明細書並びに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号公報、同第３０６８５０６Ｂ２号公報及び同第３０６８５０７Ｂ２号公報でさらに議論され詳述されている。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－４９５（１９９８）、欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第００／７６３１０号パンフレット及び国際公開第０３／４７３３６号パンフレットも参照されたい。
別の手法では、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，を含む他社が「ミニ遺伝子座」の手法を利用している。このミニ遺伝子座の手法において、外来性Ｉｇ遺伝子座は、このＩｇ遺伝子座由来の断片（個々の遺伝子）を含めることにより模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域及び第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）は、動物に挿入されるコンストラクトを形成する。この手法は、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙのそれぞれに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，６２５，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，７７０，４２９号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；及び同第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び同第６，０２３．０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号明細書；同第５，７２１，３６７号明細書；及び同第５，７８９，２１５号明細書並びにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号明細書並びにＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願公開第０７／５７４，７４８号明細書、同第０７／５７５，９６２号明細書、同第０７／８１０，２７９号明細書、同第０７／８５３，４０８号明細書、同第０７／９０４，０６８号明細書、同第０７／９９０，８６０号明細書、同第０８／０５３，１３１号明細書、同第０８／０９６，７６２号明細書、同第０８／１５５，３０１号明細書、同第０８／１６１，７３９号明細書、同第０８／１６５，６９９号明細書、同第０８／２０９，７４１号明細書に記載されている。欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット及び国際公開第９８／２４８８４号パンフレット並びに米国特許第５，９８１，１７５号明細書も参照されたい。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。
Ｋｉｒｉｎも、マイクロセル融合によって大きい染色体片又は染色体全体が導入された、マウスからのヒト抗体の産生を実証した。欧州特許出願公開第７７３２８８号明細書及び同第８４３９６１号明細書を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、有望なヒト抗体産生技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスをヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞で再構成する。その後、マウスは、抗原で免疫化され、その抗原に対する免疫反応を発生させることができる。米国特許第５，４７６，９９６号明細書；同第５，６９８，７６７号明細書；及び同第５，９５８，７６５号明細書を参照されたい。
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、産業界がキメラ又は別の方法でヒト化された抗体を作製する要因となった。しかしながら、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応は、特に慢性又は複数回用量での抗体の利用において観察されることになると予想される。したがって、ＨＡＭＡ若しくはＨＡＣＡ反応の懸念及び／又は影響をなくすために、標的細胞の表面抗原に対するヒト結合ドメイン及びＣＤ３εに対するヒト結合ドメインを含む抗体コンストラクトを提供することが望ましいと考えられる。
用語「（特異的に）結合する」、（特異的に）認識する」、「（特異的に）誘導される」及び「（特異的に）反応する」は、本発明によれば、結合ドメインが標的分子（抗原）上の所与のエピトープ又は所与の標的部位、すなわち本明細書ではそれぞれ標的細胞の表面抗原及びＣＤ３εと相互作用するか又は特異的に相互作用することを意味する。
用語「エピトープ」は、抗体若しくは免疫グロブリン又は抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体、フラグメント若しくはバリアントなどの結合ドメインが特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、抗原性であり、したがって、エピトープという用語は、本明細書において「抗原性構造」又は「抗原決定基」と称する場合もある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用は、「特異的認識」も定義すると理解される。
「エピトープ」は、連続したアミノ酸又はタンパク質の三次元フォールディングによって並列される非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸の一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、通常、特有の配列内に少なくとも３つ又は少なくとも４つ及びより一般的に少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、例えば約８～約１０のアミノ酸を含む。
「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを定義する唯一の要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。一般に、立体構造エピトープは、線状エピトープと比較して多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチド若しくはタンパク質又はそれらのフラグメントの三次元構造を認識する（本発明に関連して、結合ドメインの１つに対する抗原性構造が標的細胞の表面抗原タンパク質内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成する場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／又はポリペプチド骨格が並列した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法としては、ｘ線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ－ＮＭＲ）分光分析、及び部位特異的スピンラベル法及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
エピトープマッピングの方法を以下に記載する。ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質の領域（隣接するひと続きのアミノ酸）が、非ヒト及び非霊長類の標的細胞の表面抗原（例えば、マウス標的細胞の表面抗原であるが、他にニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなどのものも考えられる）の対応する領域で交換／置換される場合、使用されている非ヒト、非霊長類の標的細胞の表面抗原に対して結合ドメインが交差反応性でない限り、結合ドメインの結合性の低減が起こると予想される。前述の低減は、ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質の対応する領域への結合を１００％とした場合、ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質内の対応する領域への結合と比較して好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％；より好ましくは少なくとも６０％、７０％又は８０％及び最も好ましくは９０％、９５％又はさらに１００％である。上記のヒト標的細胞の表面抗原／非ヒト標的細胞の表面抗原のキメラは、ＣＨＯ細胞において発現されることが想定される。また、ヒト標的細胞の表面抗原／非ヒト標的細胞の表面抗原のキメラは、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合されることも想定される。
エピトープマッピングの代替的又は追加の方法では、結合ドメインによって認識される特定の領域を決定するために、ヒト標的細胞の表面抗原細胞外ドメインのいくつかの短縮型が作製され得る。これらの短縮型では、細胞外の異なる標的細胞の表面抗原ドメイン／サブドメイン又は領域は、Ｎ末端から開始して段階的に欠失される。短縮型の標的細胞の表面抗原は、ＣＨＯ細胞で発現され得ることが想定される。また、短縮型の標的細胞の表面抗原は、ＥｐＣＡＭなどの異なる膜結合タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合される場合があることも想定される。また、短縮型の標的細胞の表面抗原は、それらのＮ末端にシグナルペプチドドメイン、例えばマウスＩｇＧ重鎖シグナルペプチドに由来するシグナルペプチドを包含する場合があることも想定される。さらに、短縮型の標的細胞の表面抗原は、細胞表面上でのそれらの正確な発現を確認できる（シグナルペプチドに続く）Ｎ末端におけるｖ５ドメインを包含する場合があることも想定される。結合ドメインによって認識される標的細胞の表面抗原領域をもはや包含しない短縮型の標的細胞の表面抗原では、結合の低減又は喪失が起こると予想される。結合の低減は、ヒト標的細胞の表面抗原タンパク質全体（又はその細胞外領域若しくはドメイン）への結合を１００％とした場合、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％及び最も好ましくは９０％、９５％又はさらに１００％である。
抗体コンストラクト又は結合ドメインによる認識に対する標的細胞の表面抗原の特定の残基の寄与を決定するためのさらなる方法は、分析される各残基を例えば部位特異的変異誘発によってアラニンで置換するアラニンスキャニング（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＫＬ＆Ｗｅｉｓｓ ＧＡ．Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｊｕｎ；５（３）：３０２－７を参照されたい）である。アラニンが使用される理由は、嵩高くなく、化学的に不活性であり、それでも多くの他のアミノ酸が有している二次構造基準を模倣するメチル官能基を有しているためである。変異される残基のサイズを保存することが望ましい場合、ときにバリン又はロイシンなどの嵩高いアミノ酸を使用し得る。アラニンスキャニングは、長期にわたり使用されてきた成熟した技術である。
結合ドメインと、エピトープ又はエピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質又は抗原（本明細書では、それぞれ標的細胞の表面抗原及びＣＤ３）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対して測定可能な親和性を示し、且つ一般に標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して著しい反応性を示さないことを意味する。「測定可能な親和性」は、約１０－６Ｍ（ＫＤ）又はそれより強い親和性を有する結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０－１２～１０－８Ｍ、１０－１２～１０－９Ｍ、１０－１２～１０－１０Ｍ、１０－１１～１０－８Ｍ、好ましくは約１０－１１～１０－９Ｍである場合、結合を特異的と見なす。結合ドメインが標的と特異的に反応するか又は標的に結合するかどうかは、とりわけ、標的タンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応を標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応と比較することにより、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に本質的に又は実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは、標的細胞の表面抗原以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。他のＨＬＥ形式と比較して優れた親和性特性を有することは、本発明による抗体コンストラクトの想定される特徴である。このような優れた親和性は、結果として、インビボでの半減期の延長を示唆する。本発明による抗体コンストラクトのより長い半減期は、投与期間及び頻度を減少させる場合があり、これは、通常、患者のコンプライアンスの改善に寄与する。これは、特に重要なことであり、なぜなら、本発明の抗体コンストラクトは、非常に衰弱した又はさらに多疾患である癌患者に特に有益であるためである。
用語「本質的／実質的に結合しない」又は「結合することができない」は、本発明の結合ドメインが標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に結合せず、すなわち標的細胞の表面抗原又はＣＤ３のそれぞれに対する結合を１００％とした場合、標的細胞の表面抗原又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の反応性を示さないことを意味する。
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列内の特異的モチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらの一次、二次及び／又は三次構造の結果として並びに前記構造の二次的修飾の結果として生じる。抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、抗原に対する前記側の単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、例えば抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化などにより、代替的に又は追加的にシグナルの開始がもたらされ得る。
用語「可変」は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対がともに単一の抗原結合部位を形成する。
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して共同で保持されており、他の鎖の超可変領域とともに抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，を参照されたい）。
用語「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。すなわち、それらは、抗原特異性の主要な決定基である。
ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍを参照されたい（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技術が同一の領域ではなく重複する領域を定義する程度まで、それらを組み合わせて、ハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式に従う付番が好ましい。
通常、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することができるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループの５つは、利用可能な立体構造の限られたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造をポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分において、高いアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されたループ構造とその周辺のアミノ酸配列との間に関連性が存在する。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さにより、及びそのループ内並びに保存的フレームワーク内（すなわちループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。
用語「カノニカル構造」は、例えばＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲）により分類されるとおり、抗体の線状配列に関する考慮も含み得る。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている標準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるとおり本発明での適用に好ましいスキームである。さらなる構造的な考慮が抗体のカノニカル構造を決定するために使用される場合がある。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違をＣｈｏｔｈｉａらの付番方式によって記載することができ、且つ／又は他の技術、例えば結晶学及び二次元若しくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、（例えば、種々のカノニカル構造をライブラリに含めるという要求に基づいて）適切なシャーシ配列の同定が可能であるカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔ付番法及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（前掲）に記載される構造的な考慮並びに抗体構造のカノニカルな側面の解釈に対するそれらの意義については、文献に記載されている。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当技術分野でよく知られている。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。
軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子となる場合がある。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触領域になると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させることができるか、又はいずれの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、ＣＤＲ３は、通常、抗体結合部位内での分子的多様性の最大の源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基程度の短いもの又は２６個超のアミノ酸であり得る。
古典的な全長抗体又は免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは、通常、ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性、細胞介在性の細胞傷害性及び補体活性化などの種々のエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。
構築及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は、極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は、１０１０の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体又は一部が由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。この配列は、重鎖のＶ、ＤＪセグメント並びに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再編成によって生成され得る。代わりに、この配列は、再編成を生じさせる、例えばインビトロ刺激に応答して細胞から生成され得る。代わりに、この配列の一部又は全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発及び他の方法によって得られる場合がある（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）。レパートリーは、１つの配列のみを含むか、又は遺伝的に多様なコレクション内のものを含む複数の配列を含み得る。
用語「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」は、本発明との関係では、免疫グロブリン分子のＣＨ２ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメイン及びＣＨ３ドメインの機能を有する少なくとも１つのドメインを含むポリペプチドを意味する。「Ｆｃ単量体」という用語から明らかなとおり、それらのＣＨドメインを含むポリペプチドは、「ポリペプチド単量体」である。Ｆｃ単量体は、少なくとも重鎖の第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）を除く免疫グロブリンの定常領域のフラグメントを含むが、少なくとも１つのＣＨ２ドメインの機能的部分及び１つのＣＨ３ドメインの機能的部分を維持しており、ＣＨ２ドメインがＣＨ３ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチドであり得る。本定義の好ましい態様において、Ｆｃ単量体は、Ｉｇ－Ｆｃヒンジ領域の一部、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、ヒンジ領域がＣＨ２ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチド定常領域であり得る。本発明のヒンジ領域は、二量体化を促進することが想定される。このようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン領域のパパイン消化（当然のことながら、２つのＦｃポリペプチドの二量体を生じる）によって入手され得るが、これに限定されない。本定義の別の態様において、Ｆｃ単量体は、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の一部を含むポリペプチド領域であり得る。このようなＦｃポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン分子のペプシン消化によって入手され得るが、これに限定されない。一実施形態において、Ｆｃ単量体のポリペプチド配列は、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ２Ｆｃ領域、ＩｇＧ３Ｆｃ領域、ＩｇＧ４Ｆｃ領域、ＩｇＭＦｃ領域、ＩｇＡＦｃ領域、ＩｇＤＦｃ領域及びＩｇＥＦｃ領域のＦｃポリペプチド配列と実質的に同様である。（例えば、Ｐａｄｌａｎ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３１（３），１６９－２１７（１９９３）を参照されたい）。免疫グロブリン間に一定の変種が存在するため、及び単に明確性のために、Ｆｃ単量体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの末尾の２つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメイン並びにＩｇＥ及びＩｇＭの末尾の３つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメインを指す。言及されるとおり、Ｆｃ単量体は、これらのドメインのＮ末端側に可動性のヒンジも含み得る。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃ単量体は、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃ部分は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３並びに最初の２つのドメインとＣＨ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ部分の境界は、異なる場合があるが、機能的ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分の例は、例えば、Ｋａｂａｔに従う付番でＣＨ３ドメインのカルボキシル末端の残基Ｄ２３１（ヒンジドメインの－以下の表１のＤ２３４に相当）～Ｐ４７６、Ｌ４７６（ＩｇＧ４の場合）をそれぞれ含むように定義され得る。ペプチドリンカーを介して互いに融合される２つのＦｃ部分又はＦｃ単量体は、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインを定義し、これは、ｓｃＦｃドメインとも定義され得る。
本発明の一実施形態において、本明細書に開示されるｓｃＦｃドメイン、それぞれ互いに融合されるＦｃ単量体は、抗体コンストラクトの第３のドメインにのみ含まれることが想定される。
本発明に一致して、ＩｇＧヒンジ領域は、表１に記述されるＫａｂａｔ付番を用いた類似性によって同定され得る。上記に一致して、本発明のヒンジドメイン／領域は、Ｋａｂａｔ付番によるＤ２３４～Ｐ２４３の一続きのＩｇＧ１配列に相当するアミノ酸残基を含むことが想定される。本発明のヒンジドメイン／領域がＩｇＧ１ヒンジ配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１４４９）（以下の表１に示される一続きのＤ２３４～Ｐ２４３に相当する － ヒンジ領域がなお二量体化を促進する限り、前記配列の変種も想定される）を含むか又はそれからなることも同様に想定される。本発明の好ましい実施形態において、抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位は、Ｎ３１４Ｘ置換によって除去され、ここで、Ｘは、Ｑではない任意のアミノ酸である。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇ置換である。より好ましい実施形態において、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換をさらに含む（位置は、Ｋａｂａｔに従う）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。
本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１４４９）（すなわちヒンジ）－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１４４９）（すなわちヒンジ）－ＣＨ２－ＣＨ３を含むか又はそれからなることも想定される。上記抗体コンストラクトのペプチドリンカーは、好ましい実施形態において、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、５又はそれを超える整数（例えば、５、６、７、８など又はそれを超える）であり、６が好ましい（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６）。前記コンストラクトは、上記の置換Ｎ３１４Ｘ、好ましくはＮ３１４Ｇ並びに／又はさらなる置換Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃをさらに含み得る。本明細書に上記で定義される本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態において、第２のドメインは、ヒト及び／又はマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープに結合することが想定される。
Figure 0007189141000001
本発明のさらなる実施形態において、ヒンジドメイン／領域は、ＩｇＧ２サブタイプのヒンジ配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１４５０）、ＩｇＧ３サブタイプヒンジ配列ＥＬＫＴＰＬＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１４５１）若しくはＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１４５８）及び／又はＩｇＧ４サブタイプヒンジ配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号１４５２）を含むか又はそれらからなる。ＩｇＧ１サブタイプヒンジ配列は、次の配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（表１及び配列番号１４５９において示される）であり得る。したがって、これらのコアヒンジ領域も本発明に関連して想定される。
ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＤ３ドメインの位置並びに配列は、表２に記述されるＫａｂａｔ付番を用いた類似性によって同定され得る。
Figure 0007189141000002
本発明の一実施形態では、第１又は両方のＦｃ単量体のＣＨ３ドメイン内の太字で強調表示されたアミノ酸残基は、欠失される。
第３のドメインのポリペプチド単量体（「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ単量体」）を互いに融合するペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも２５アミノ酸残基（２５、２６、２７、２８、２９、３０など）を含む。より好ましくは、このペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸残基（３０、３１、３２、３３、３４、３５など）を含む。リンカーが最大４０アミノ酸残基を含むことも好ましく、より好ましくは最大３５アミノ酸残基、最も好ましくはちょうど３０アミノ酸残基である。このようなペプチドリンカーの好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、５又はそれを超える整数（例えば、６、７又は８）である。好ましくは、整数は、６又は７であり、より好ましくは、整数は、６である。
第１のドメインを第２のドメインと融合するために、又は第１若しくは第２のドメインを第３のドメインと融合するためにリンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第１及び第２のドメインの各々が互いに独立してそれらの異なる結合特異性を確実に保持できる十分な長さ及び配列のリンカーである。本発明の抗体コンストラクト内の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば１２アミノ酸残基以下を含むものが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、Ｇｌｙに富んだリンカーが好ましい。第１及び第２のドメインの融合のためのペプチドリンカーの好ましい実施形態は、配列番号１に示される。第２及び第３のドメインを融合するためのペプチドリンカーの好ましいリンカー実施形態は、（Ｇｌｙ）４－リンカーであり、それぞれＧ４－リンカーである。
上記の「ペプチドリンカー」の１つに関連して特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、前記ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。本発明の好ましい実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、１又はそれより大きい整数（例えば、２又は３）である。好ましいリンカーは、配列番号１～１２に示される。二次構造を促進しないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で知られており、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）に記載されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの相互の連結を、例えば、実施例に記載されるとおりの遺伝子操作によって提供することができる。融合され作動可能に連結された二重特異性単鎖コンストラクトを作製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。
抗体コンストラクト又は本発明の好ましい実施形態において、第１及び第２のドメインは、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ、ダイアボディ及びそれらの形式のいずれかのオリゴマーからなる群から選択される形式の抗体コンストラクトを形成する。
特に好ましい実施形態に従い、且つ付属の実施例において記述されるとおり、本発明の抗体コンストラクトの第１及び第２のドメインは、「二重特異性単鎖抗体コンストラクト」、より好ましくは二重特異性「単鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が１価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする、本明細書の上記のとおりの合成リンカーによって結合することができる；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる従来技術を用いて得られ、且つそのフラグメントは、完全又は全長抗体と同じ様式で機能について評価される。したがって、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常、約１０～約２５アミノ酸、好ましくは約１５～２０アミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシン及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、当技術分野で知られており、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６に記載されている。単鎖抗体の作製に関して記載された技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０），前掲及びＬｉｔｔｌｅ（２００９），前掲を参照されたい）は、選出された標的を特異的に認識する単鎖抗体コンストラクトを作製するために適合させることができる。
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性単鎖可変フラグメント（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ－ｓｃＦｖ又はｄｉ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を（例えば、本明細書の上記に記載されるリンカーを用いて）連結することにより作り出すことができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二価と呼ぶことが好ましい（すなわち、それは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これらの２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによってなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一体に折り畳むには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。この型は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４－８を参照されたい）。
本発明に一致して、第１のドメイン、第２のドメイン又は第１及び第２のドメインは、それぞれ単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体の可変ドメイン又は単一ドメイン抗体の少なくともＣＤＲを含み得る。単一ドメイン抗体は、他のＶ領域又はドメインに非依存的に特異抗原に選択的に結合することができる１つのみの（単量体の）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から作り出され、これらは、ＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、そこからＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替的な手法は、例えばヒト又は齧歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨ又はＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は、現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ又は単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ」は、少なくとも１つの上記の単一ドメイン抗体及び１つの上記のｓｃＦｖ分子から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。この場合も、リンカーは、ペプチドリンカーの形態であることが好ましい。
抗体コンストラクトが別の所与の抗体コンストラクトと競合して結合するかどうかは、競合ＥＬＩＳＡ又は細胞を用いた競合アッセイなどの競合アッセイで測定することができる。アビジンを結合したマイクロ粒子（ビーズ）を使用することもできる。アビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと同様に、ビオチン化タンパク質と反応させる際、これらのビーズのそれぞれを基材として使用することができ、その上でアッセイを実施することができる。抗原をビーズ上にコーティングし、次に一次抗体でプレコーティングする。二次抗体を添加して、任意のさらなる結合を確認する。読み取りのために可能な手段としては、フローサイトメトリーが挙げられる。
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体白血球の一種）の一種である。Ｔ細胞には、それぞれ異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在する。Ｔ細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在する点で他のリンパ球、例えばＢ細胞及びＮＫ細胞と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与し、２つの異なるタンパク質鎖から構成される。９５％のＴ細胞において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と結合するとき、Ｔリンパ球が、関連酵素、共受容体、特化したアダプター分子及び活性化又は放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じて活性化される。
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、関連性の高い免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわち略称ＩＴＡＭとして知られる単一の保存的モチーフを含有する。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトの第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。最も好ましいＣＤ３イプシロンのエピトープは、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１～２７の範囲に含まれる。本発明による抗体コンストラクトは、典型的且つ有利には、特異的免疫療法において望ましくない非特異的Ｔ細胞活性化をわずかにのみ示すと想定される。これは、副作用のリスクが低いことになる。
多重特異性、少なくとも二重特異性抗体コンストラクトによるＴ細胞の動員を介するリダイレクトされた標的細胞の溶解は、細胞溶解性シナプスの形成並びにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。結合したＴ細胞は、連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示又はクローナルなＴ細胞分化を妨げる免疫回避機構による影響を受けない（例えば、国際公開第２００７／０４２２６１号パンフレットを参照されたい）。
本発明の抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は未刺激の（ヒト）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク起源である場合又は第１のドメインによって結合されるマカク標的細胞の表面抗原を発現するか若しくはそれでトランスフェクトされる場合、エフェクター細胞もマカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなどのマカク起源のものであるべきである。標的細胞は、標的細胞の表面抗原、例えばヒト又はマカク標的細胞の表面抗原（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、標的細胞の表面抗原、例えばヒト又はマカク標的細胞の表面抗原で安定的に又は一過的にトランスフェクトされている細胞株（ＣＨＯなど）であり得る。代わりに、標的細胞は、天然の標的細胞の表面抗原陽性発現細胞株であり得る。通常、ＥＣ５０値は、細胞表面に高レベルの標的細胞の表面抗原を発現する標的細胞株で低くなると予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、通常、約１０：１であるが、これは、変動し得る。標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの細胞傷害活性は、５１Ｃｒ放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）又はＦＡＣＳを用いた細胞傷害性アッセイ（約４８時間インキュベーション時間）において測定することができる。アッセイのインキュベーション時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者によく知られており、ＭＴＴ又はＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰ系アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ及びＥＣＩＳ技術を含む。
本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞を用いた細胞傷害性アッセイで測定される。これは、５１Ｃｒ放出アッセイでも測定され得る。細胞傷害活性は、ＥＣ５０値によって表され、これは、半数効果濃度（ベースラインと最大値との中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体コンストラクトの濃度）に相当する。好ましくは、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭ、より好ましくは≦３０００ｐＭ又は≦２０００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦４００ｐＭ又は≦３００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦２０ｐＭ又は≦１０ｐＭ及び最も好ましくは≦５ｐＭである。
様々なアッセイにおいて、上記の所与のＥＣ５０値を測定することができる。刺激された／濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合、未刺激のＰＢＭＣと比較してＥＣ５０値が低くなると予想できることを当業者は認識している。さらに、ＥＣ５０値は、標的細胞が多数の標的細胞の表面抗原を発現する場合、標的発現の少ないラットと比較して低くなると予想することができる。例えば、刺激された／濃縮ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する場合（及びＣＨＯ細胞などの標的細胞の表面抗原をトランスフェクトされた細胞又は標的細胞の表面抗原陽性ヒト細胞株のいずれかを標的細胞として使用する場合）、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは≦１０００ｐＭ、より好ましくは≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ、さらにより好ましくは≦５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１０ｐＭ及び最も好ましくは≦５ｐＭである。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する場合、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、≦５０００ｐＭ又は≦４０００ｐＭ（特に標的細胞が標的細胞の表面抗原陽性ヒト細胞株である場合）、より好ましくは≦２０００ｐＭ（特に標的細胞がＣＨＯ細胞などの標的細胞の表面抗原でトランスフェクトされた細胞である場合）、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦２００ｐＭ、さらにより好ましくは≦１５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ及び最も好ましくは≦５０ｐＭ又はそれ未満である。ＬｎＰｘ４１１９などのマカクＴ細胞株をエフェクター細胞として使用し、ＣＨＯ細胞などのマカク標的細胞の表面抗原でトランスフェクトされた細胞株を標的細胞株として使用する場合、標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、≦２０００ｐＭ又は≦１５００ｐＭ、より好ましくは≦１０００ｐＭ又は≦５００ｐＭ、さらにより好ましくは≦３００ｐＭ又は≦２５０ｐＭ、さらにより好ましくは≦１００ｐＭ及び最も好ましくは≦５０ｐＭである。
好ましくは、本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトは、ＣＨＯ細胞などの標的細胞の表面抗原陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、又は溶解を本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」又は「溶解を本質的に媒介しない」は、標的細胞の表面抗原陽性ヒト細胞株の溶解を１００％とした場合、本発明の抗体コンストラクトが標的細胞の表面抗原陰性細胞の３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の溶解を誘導又は媒介しないことを意味する。これは、通常、５００ｎＭまでの抗体コンストラクトの濃度で当てはまる。当業者は、さらなる労力を伴わずに細胞溶解を測定する方法を知っている。さらに、本明細書では細胞溶解の測定方法の具体的な指示を教示する。
個々の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの単量体アイソフォームと二量体アイソフォームとの間の細胞傷害活性の差を「効力ギャップ」と称する。この効力ギャップは、例えば、その分子の単量体形態のＥＣ５０値と二量体形態のＥＣ５０値との間の比率として算出することができる。本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの効力ギャップは、好ましくは、≦５、より好ましくは≦４、さらにより好ましくは≦３、さらにより好ましくは≦２及び最も好ましくは≦１である。
本発明の抗体コンストラクトの第１及び／又は第２の（又は任意のさらなる）結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーにおいて異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインは、例えば、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載されている。一実施形態によれば、第１及び／又は第２の結合ドメインは、ヒト標的細胞の表面抗原及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）など）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル及び非ヒトのヒト亜科動物を含む（ただし、これらに限定されない）霊長類の標的細胞の表面抗原／ＣＤ３にもそれぞれ結合することになる。
本発明の抗体コンストラクトの一実施形態において、第１のドメインは、ヒト標的細胞の表面抗原に結合し、且つカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の標的細胞の表面抗原などのマカク標的細胞の表面抗原、より好ましくはマカク細胞の表面で発現されるマカク標的細胞の表面抗原にさらに結合する。マカク標的細胞の表面抗原に対する第１の結合ドメインの親和性は、好ましくは、≦１５ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、さらにより好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．５ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭ及び最も好ましくは≦０．０５ｎＭ又はさらに≦０．０１ｎＭである。
好ましくは、本発明による抗体コンストラクトの、（例えば、ＢｉａＣｏｒｅ又はスキャッチャード分析により決定される）マカク標的細胞の表面抗原対ヒト標的細胞の表面抗原［ｍａ 標的細胞の表面抗原：ｈｕ 標的細胞の表面抗原］の結合親和性ギャップは、＜１００、好ましくは＜２０、より好ましくは＜１５、さらに好ましくは＜１０、さらにより好ましくは＜８、より好ましくは＜６及び最も好ましくは＜２である。本発明による抗体コンストラクトの、マカク標的細胞の表面抗原対ヒト標的細胞の表面抗原の結合親和性ギャップの好ましい範囲は、０．１～２０、より好ましくは０．２～１０、さらにより好ましくは０．３～６、さらにより好ましくは０．５～３又は０．５～２．５及び最も好ましくは０．５～２又は０．６～２である。
本発明の抗体コンストラクトの第２の（結合）ドメインは、ヒトＣＤ３イプシロン及び／又はマカクＣＤ３イプシロンに結合する。好ましい実施形態において、第２のドメインは、マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）ＣＤ３イプシロンにさらに結合する。マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）及びワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）は、両方ともマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類であるが、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ）は、オマキザル（Ｃｅｂｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類である。
本発明の抗体コンストラクトに関して、ヒト及び／又はマカクＣＤ３の細胞外エピトープに結合する第２の結合ドメインは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２９に示されるＣＤＲ－Ｌ３；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１７に示されるＣＤＲ－Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１８に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１１９に示されるＣＤＲ－Ｌ３；並びに
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５３に示されるＣＤＲ－Ｌ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５４に示されるＣＤＲ－Ｌ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５５に示されるＣＤＲ－Ｌ３
から選択されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬ領域を含むことが好ましい。
本発明の抗体コンストラクトのさらに好ましい実施形態において、ヒト及び／又はマカクＣＤ３イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第２のドメインは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３２に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号４８に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号４９に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５０に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｄ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６６に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６７に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６８に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｅ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８６に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｆ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０２に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０３に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０４に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｇ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２０に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２１に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２２に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｈ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３８に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１３９に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４０に示されるＣＤＲ－Ｈ３；
（ｉ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５６に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５７に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５８に示されるＣＤＲ－Ｈ３；並びに
（ｊ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７４に示されるＣＤＲ－Ｈ１、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７５に示されるＣＤＲ－Ｈ２、及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７６に示されるＣＤＲ－Ｈ３
から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨ領域を含む。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態において、第２の結合ドメイン内でＶＬ ＣＤＲの上記３群をＶＨ ＣＤＲの上記１０群と組み合わせて、それぞれＣＤＲ－Ｌ１～３及びＣＤＲ－Ｈ１～３を含む（３０）群を形成する。
本発明の抗体コンストラクトに関して、ＣＤ３に結合する第２のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７、２１、３５、３９、５３、５７、７１、７５、８９、９３、１０７、１１１、１２５、１２９、１４３、１４７、１６１、１６５、１７９若しくは１８３で示されるか又は配列番号１３で示されるＶＬ領域からなる群から選択されるＶＬ領域を含むことが好ましい。
ＣＤ３に結合する第２のドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５、１９、３３、３７、５１、５５、６９、７３、８７、９１、１０５、１０９、１２３、１２７、１４１、１４５、１５９、１６３、１７７若しくは１８１で示されるか又は配列番号１４で示されるＶＨ領域からなる群から選択されるＶＨ領域を含むことも好ましい。
より好ましくは、本発明の抗体コンストラクトは、
（ａ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７又は２１に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５又は１９に示されるＶＨ領域；
（ｂ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３５又は３９に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号３３又は３７に示されるＶＨ領域；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５３又は５７に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号５１又は５５に示されるＶＨ領域；
（ｄ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号７１又は７５に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号６９又は７３に示されるＶＨ領域；
（ｅ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８９又は９３に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号８７又は９１に示されるＶＨ領域；
（ｆ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０７又は１１１に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１０５又は１０９に示されるＶＨ領域；
（ｇ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２５又は１２９に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１２３又は１２７に示されるＶＨ領域；
（ｈ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４３又は１４７に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１４１又は１４５に示されるＶＨ領域；
（ｉ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１６１又は１６５に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１５９又は１６３に示されるＶＨ領域；並びに
（ｊ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７９又は１８３に示されるＶＬ領域及び国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号１７７又は１８１に示されるＶＨ領域
からなる群から選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含むＤＣ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。
配列番号１３に示されるＶＬ領域及び配列番号１４に示されるＶＨ領域を含むＣＤ３に結合する第２のドメインも本発明の抗体コンストラクトとの関係で好ましい。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態によれば、第１の及び／又は第２のドメインは、以下の形式を有する：ＶＨ領域とＶＬ領域との対は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式である。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＨの順に配置される。ＶＨ領域がリンカー配列のＮ末端に配置され、且つＶＬ領域がリンカー配列のＣ末端に配置されることが好ましい。
本発明の上記の抗体コンストラクトの好ましい実施形態は、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７からなる群から選択されるか又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３に結合する第２のドメインによって特徴付けられる。
抗体コンストラクトの共有結合的修飾も本発明の範囲内に含まれ、これは、常にではないものの通常、翻訳後に行われる。例えば、抗体コンストラクトのいくつかの種類の共有結合的修飾は、抗体コンストラクトの特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、α－ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリ安息香酸、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール又はクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５～７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化され、なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ－ブロモフェナシルブロミドも有用であり、この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ－アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソ尿素；２，４－ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
アルギニル残基は、１つ又は複数の従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応により修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンイプシロン－アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミジゾール（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製する上記のクロラミンＴ法が好適である。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、任意選択的に異なるアルキル基、例えば１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド又は１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
二官能性物質による誘導体化は、本発明の抗体コンストラクトを、様々な方法に使用するための非水溶性の支持マトリックス又は支持表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４－アジドサリチル酸とのエステルなどのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３，３－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル及びビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化され得る中間体が得られる。代わりに、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性非水溶性マトリックス並びに米国特許第３，９６９，２８７号明細書；同第３，６９１，０１６号明細書；同第４，１９５，１２８号明細書；同第４，２４７，６４２号明細書；同第４，２２９，５３７号明細書；及び同第４，３３０，４４０号明細書に記載されている反応性基材がタンパク質の固定化に使用される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化されて、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。代わりに、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲に含まれる。
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９－８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれる抗体コンストラクトの別の種類の共有結合的修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンの変更を含む。当技術分野で知られるとおり、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論じる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は非存在）又はそのタンパク質を産生する宿主細胞若しくは生物体の両方に依存し得る。個々の発現系について以下で論じる。
ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖の付加を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（ただし、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的付加のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれか存在が潜在的なグリコシル化部位をもたらす。Ｏ結合型グリコシル化は、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つの糖のヒドロキシアミノ酸への付加を指し、最も一般的にはセリン又はスレオニンであるが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリジンが使用される場合もある。
抗体コンストラクトへのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより行うと好都合である。改変は、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）開始配列への１つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によってもなされ得る。簡潔には、抗体コンストラクトのアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変更、特に所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生じるようにポリペプチドをコードするＤＮＡを、事前に選択した塩基で変異させることによって改変することが好ましい。
抗体コンストラクト上の糖鎖の数を増加させる別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖が（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６に記載されている。
出発抗体コンストラクト上に存在する糖鎖の除去は、化学的又は酵素的に行われ得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は均等な化合物へのタンパク質の曝露が必要となる。この処理により、ポリペプチドは無傷な状態のままで、結合している糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載されている。ポリペプチド上の糖鎖の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されるとおりの様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載されるとおりの化合物ツニカマイシンの使用により妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質－Ｎ－グリコシド結合の形成を阻止する。
本明細書では、抗体コンストラクトの他の修飾も企図される。例えば、抗体コンストラクトの別の種類の共有結合的修飾は、様々な非タンパク質性ポリマーへの抗体コンストラクトの連結を含み、ポリマーとしては、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書に示される様式の様々なポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない。加えて、当技術分野で知られるとおり、例えば、ＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために抗体コンストラクト内の様々な位置でアミノ酸置換がなされ得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの共有結合的修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームを介して標識基が抗体コンストラクトに結合され得る。タンパク質を標識するための様々な方法が当技術分野で知られており、本発明を実施する際に使用することができる。用語「標識」又は「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、標識を検出しようとするアッセイに応じて様々なクラスに分類され、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）などの放射性同位体又は重同位体であり得る同位体標識
ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基及び「低分子」蛍光体又はタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素（発色団、蛍光体及びフルオロフォアを含むが、これらに限定されない）
ｅ）酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を介して検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー及びＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアを含む好適な光学色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
好適なタンパク質性蛍光標識としては、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ又はＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２－８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２－４７１；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８－１８２）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８－５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３－２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９８／１４６０５号パンフレット、国際公開第９８／２６２７７号パンフレット、国際公開第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５，２９２，６５８号明細書；同第５，４１８，１５５号明細書；同第５，６８３，８８８号明細書；同第５，７４１，６６８号明細書；同第５，７７７，０７９号明細書；同第５，８０４，３８７号明細書；同第５，８７４，３０４号明細書；同第５，８７６，９９５号明細書；同第５，９２５，５５８号明細書）も挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗体コンストラクトは、例えば、その分子の単離に役立つか又はその分子の薬物動態プロファイルの適合に関連する追加ドメインも含み得る。抗体コンストラクトの単離に役立つドメインは、単離方法、例えば単離用カラムで捕捉できるペプチドモチーフ又は二次的に導入される部分から選択され得る。このような追加ドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその変種（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）並びにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。同定されたＣＤＲによって特徴付けられる本明細書で開示される抗体コンストラクトの全ては、分子のアミノ酸配列中の連続するＨｉｓ残基、好ましくは５つ、より好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサヒスチジン）のリピートとして一般に知られるＨｉｓタグドメインを含み得る。Ｈｉｓタグは、例えば、抗体コンストラクトのＮ末端にもＣ末端にも配置され得るが、Ｃ末端に配置されることが好ましい。最も好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１６）を、ペプチド結合を介して本発明による抗体コンストラクトのＣ末端に結合する。加えて、持続放出用途及び薬物動態プロファイルの向上のために、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡのコンジュゲート系をポリヒスチジンタグと組み合わせ得る。
本明細書に記載される抗体コンストラクトのアミノ酸配列改変も企図される。例えば、抗体コンストラクトの結合親和性及び／又は他の生物学的特性の向上が望ましい場合がある。抗体コンストラクトのアミノ酸配列バリアントは、抗体コンストラクトの核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって又はペプチド合成によって作製される。以下に記載されるアミノ酸配列改変の全ては、未改変の親分子の所望の生物活性（標的細胞の表面抗原及びＣＤ３への結合）を引き続き保持する抗体コンストラクトをもたらすはずである。
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、通常、その技術分野で認められている定義を有するアミノ酸、例えばアラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｈｅ又はＩ）；ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リジン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、必要に応じて修飾アミノ酸、合成アミノ酸又は希少アミノ酸を使用し得る。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；又は無電荷極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）の存在によって分類することができる。
アミノ酸改変は、例えば、抗体コンストラクトのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を保持することを条件として、最終コンストラクトに到達するように欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行う。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの抗体コンストラクトの翻訳後プロセスも変え得る。
例えば、１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸がＣＤＲの各々において（当然のことながら、それらの長さに依存する）挿入、置換又は欠失され得る一方、ＦＲの各々において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５個のアミノ酸が挿入、置換又は欠失され得る。好ましくは、抗体コンストラクトへのアミノ酸配列の挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。対応する改変を本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内で実施し得る。本発明の抗体コンストラクトの挿入バリアントは、抗体コンストラクトのＮ末端若しくはＣ末端への酵素の融合又はポリペプチドへの融合を含む。
置換変異誘発にとって最も重要な部位としては、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが（これらに限定されるものではない）、重鎖及び／又は軽鎖におけるＦＲの改変も企図される。置換は、本明細書に記載される保存的置換であることが好ましい。好ましくは、ＣＤＲ又はＦＲの長さに応じて、ＣＤＲでは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を置換し得る一方、フレームワーク領域（ＦＲ）では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５個のアミノ酸を置換し得る。例えば、ＣＤＲ配列が６個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２又は３個が置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５又は６個が置換されることが想定される。
変異誘発について好ましい位置である抗体コンストラクトの特定の残基又は領域を同定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）に記載されるとおり「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれる。この方法では、抗体コンストラクト内の残基又は標的残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与える中性又は負電荷アミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）で置き換えられる。
次に、さらなるバリアント又は他のバリアントを置換部位に、すなわち置換部位の代わりに導入することにより、置換に対して機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置を厳選する。このように、アミノ酸配列変種を導入する部位又は領域は、予め決定されるが、変異の性質自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析又は最適化するために、アラニンスキャニング又はランダム変異誘発が標的コドン又は標的領域で実施される場合があり、発現される抗体コンストラクトのバリアントは、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡ内の所定部位に置換変異を行う技術は、よく知られており、例えばＭ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、標的細胞の表面抗原又はＣＤ３結合などの抗原結合活性のアッセイを使用して行われる。
一般に、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ以上又は全てにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列は、「当初の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％及び特に好ましくは９０％又は９５％同一であることが好ましい。これは、それが「置換された」配列とどの程度同一であるかがＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５個のアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１個の置換されたアミノ酸を有するために、その置換された配列と８０％同一であることが好ましい。したがって、抗体コンストラクトのＣＤＲは、それらの置換配列に対して異なる程度の同一性を有する場合があり、例えば、ＣＤＲＬ１が８０％を有する場合がある一方、ＣＤＲＬ３は９０％を有する場合がある。
好ましい置換（又は置き換え）は、保存的置換である。しかしながら、抗体コンストラクトが、それぞれ第１の結合ドメインを介して標的細胞の表面抗原に結合し、第２の結合ドメインを介してＣＤ３、ＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持する限り、且つ／又はそのＣＤＲが置換後の配列に対して同一性を有している（「当初の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％又は６５％、より好ましくは７０％又は７５％、さらにより好ましくは８０％又は８５％及び特に好ましくは９０％又は９５％同一である）限り、（非保存的置換又は以下の表３に列挙される「例示的な置換」の１つ以上を含む）任意の置換が想定される。
保存的置換を表３の「好ましい置換」の見出し下に示す。このような置換が生物活性を変化させる場合、表３において「例示的な置換」と称されるか、又はアミノ酸クラスに関連して以下でさらに記載する、より実質的な変更を導入し、所望の特徴について産物をスクリーニングし得る。
Figure 0007189141000003
本発明の抗体コンストラクトの生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）例えばシート状若しくはらせん状の立体構造としての置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対する影響が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性；ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向性に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。抗体コンストラクトの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を一般的にはセリンで置換することで、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を回避し得る。逆に、抗体にシステイン結合を付加することで、（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を向上させ得る。
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当技術分野で知られる標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の部分配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより又は目視により決定される。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ法によるペアワイズアラインメントを使用して関連配列群から多重配列アラインメントを生成する。これにより、アラインメントの生成に使用されたクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３により記載されたものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００のデフォルトのギャップ加重、０．１０のデフォルトのギャップ長加重及び加重エンドギャップを含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から入手したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定する：重複範囲＝１、重複割合＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、個々の配列の構成及び目的配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じてプログラム自体によって設定されるが、感度を上げるために値を調整し得る。
他の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されたｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメータは、９に設定され、ギャップなし伸長をもたらすｔｗｏ－ｈｉｔ法は、ギャップ長ｋのコストを１０＋ｋとし、Ｘｕは、１６に設定され、Ｘｇは、データベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップありアラインメントは、約２２ビットに相当するスコアによってもたらされる。
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列間のアミノ酸相同性、類似性又は同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％又は８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。同様に、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体コンストラクトのコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の割合と定義される。具体的な方法では、重複範囲及び重複割合がそれぞれ１及び０．１２５を有するデフォルトパラメータに設定されたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
一般に、個々のバリアントＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列をコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列間の核酸配列相同性、類似性又は同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。したがって、「バリアントＣＤＲ」又は「バリアントＶＨ／ＶＬ領域」は、本発明の親ＣＤＲ／ＶＨ／ＶＬに対して特定の相同性、類似性又は同一性を有するものであり、且つ親ＣＤＲ若しくはＶＨ／ＶＬの特異性及び／又は活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含むが、これらに限定されない生物学的機能を共有している。
一実施形態では、本発明による抗体コンストラクトのヒト生殖細胞系列に対する同一性の割合は、≧７０％又は≧７５％、より好ましくは≧８０％又は≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％又はさらに≧９６％である。ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子産物に対する同一性は、治療用タンパク質が治療中の患者の薬物に対する免疫反応を誘発するリスクを低減するための重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ＆Ｆｏｏｔｅ（「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）３－１０）は、薬物抗体コンストラクトの非ヒト部分の減少が治療中の患者における抗薬物抗体の誘発リスクの低減をもたらすことを実証している。膨大な数の臨床評価済み抗体薬物及び対応する免疫原性データを比較することにより、抗体のＶ領域のヒト化は、未改変の非ヒトＶ領域を保有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりもタンパク質の免疫原性が少ない（患者の平均５．１％）という傾向を示している。したがって、Ｖ領域をベースにした抗体コンストラクトの形態でのタンパク質治療薬に関して、ヒト配列に対する同一性が高いことが望ましい。この生殖細胞系列同一性の決定のために、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを用いて、ＶＬのＶ領域をヒト生殖細胞系列Ｖセグメント及びＪセグメントのアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）とアラインメントし、同一のアミノ酸残基数をＶＬの総アミノ酸残基数で割ることによりアミノ酸配列をパーセントで算出することができる。ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についても同様の方法が可能であるが、例外として、ＶＨ ＣＤＲ３は、多様性が高く、既存のヒト生殖細胞系列ＶＨ ＣＤＲ３のアラインメントパートナーを欠くために除外され得る。続いて、組換え技術を使用して、ヒト抗体生殖細胞系列遺伝子に対する配列同一性を増大させることができる。
さらなる実施形態では、本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、標準的な研究規模の条件下において、例えば標準的な二段階精製プロセスで高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明による抗体コンストラクトの単量体収量は、≧０．２５ｍｇ／Ｌ上清、より好ましくは≧０．５ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは≧１ｍｇ／Ｌ及び最も好ましくは≧３ｍｇ／Ｌ上清である。
同様に、抗体コンストラクトの二量体抗体コンストラクトアイソフォームの収量及びそのため単量体の割合（すなわち単量体：（単量体＋二量体））が決定され得る。単量体及び二量体抗体コンストラクトの生産性並びに算出される単量体の割合は、例えば、ローラーボトル中における標準化された研究規模の製造に由来する培養上清のＳＥＣ精製工程で取得することができる。一実施形態では、抗体コンストラクトの単量体の割合は、≧８０％、より好ましくは≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％及び最も好ましくは≧９５％である。
一実施形態では、抗体コンストラクトは、好ましくは、≦５又は≦４、より好ましくは≦３．５又は≦３、さらにより好ましくは≦２．５又は≦２及び最も好ましくは≦１．５又は≦１の血漿安定性（血漿非存在下でのＥＣ５０に対する血漿存在下でのＥＣ５０の比率）を有する。抗体コンストラクトの血漿安定性は、コンストラクトをヒト血漿中、３７℃で２４時間インキュベートし、続いて５１クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてＥＣ５０を決定することにより試験することができる。細胞傷害性アッセイにおけるエフェクター細胞は、刺激された濃縮ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞であり得る。標的細胞は、例えば、ヒト標的細胞の表面抗原でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり得る。エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、１０：１を選択することができる。この目的で使用されるヒト血漿プールは、ＥＤＴＡコーティングされたシリンジによって回収された健常ドナーの血液に由来する。細胞成分を遠心分離により除去して、上部血漿相を回収し、その後、プールする。対照として、抗体コンストラクトを細胞傷害性アッセイの直前にＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈する。血漿安定性は、ＥＣ５０（対照）に対するＥＣ５０（血漿インキュベーション後）の比率として算出される。
本発明の抗体コンストラクトの単量体から二量体への変換率は、低いことがさらに好ましい。変換率は、異なる条件下で測定し、高速サイズ排除クロマトグラフィーによって分析することができる。例えば、抗体コンストラクトの単量体アイソフォームのインキュベーションは、インキュベーター内で例えば１００μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌの濃度において３７℃で７日間行われ得る。これらの条件下において、本発明の抗体コンストラクトは、≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又は≦０．５％又はさらに０％の二量体の割合を示すことが好ましい。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、数回の凍結／解凍サイクル後、非常に低い二量体変換率を示すことも好ましい。例えば、抗体コンストラクトの単量体を例えば汎用の製剤緩衝液中、２５０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、３回の凍結／解凍サイクル（－８０℃で３０分間の凍結後、室温で３０分間の解凍）にかけた後、高速ＳＥＣを行い、二量体抗体コンストラクトに変換された初期単量体抗体コンストラクトの割合を決定する。好ましくは、二重特異性抗体コンストラクトの二量体の割合は、例えば、３回の凍結／解凍サイクル後に≦５％、より好ましくは≦４％、さらにより好ましくは≦３％、さらにより好ましくは≦２．５％、さらにより好ましくは≦２％、さらにより好ましくは≦１．５％及び最も好ましくは≦１％又はさらに≦０．５％である。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、≧４５℃又は≧５０℃、より好ましくは≧５２℃又は≧５４℃、さらにより好ましくは≧５６℃又は≧５７℃及び最も好ましくは≧５８℃又は≧５９℃の凝集温度で良好な熱安定性を示す。抗体の凝集温度の観点から熱安定性パラメータを以下のように決定することができる：濃度２５０μｇ／ｍｌの抗体溶液を単回使用のキュベットに移し、動的光散乱（ＤＬＳ）装置内に置く。測定半径を常時取得しながら、０．５℃／分の加熱速度で４０℃から７０℃まで試料を加熱する。タンパク質の融解及び凝集を示す半径の増大を使用して、抗体の凝集温度を算出する。
代わりに、融解温度曲線を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定して、抗体コンストラクトの固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定することができる。これらの実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ）ＶＰ－ＤＳＣ装置を使用して実施する。抗体コンストラクトを含有する試料のエネルギー取り込みを２０℃から９０℃まで記録して、製剤緩衝液のみを含有する試料と比較する。抗体コンストラクトを例えばＳＥＣランニング緩衝液中において最終濃度２５０μｇ／ｍｌに調整する。それぞれの融解曲線を記録するために試料の全体温度を段階的に上昇させる。各温度Ｔでの試料及び製剤緩衝液標準物質のエネルギー取り込みを記録する。試料から標準物質を差し引いたエネルギー取り込みＣｐ（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ／℃）の差をそれぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みが最初に最大となる温度と定義される。
本発明の標的細胞の表面抗原×ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトは、≦０．２、好ましくは≦０．１５、より好ましくは≦０．１２、さらにより好ましくは≦０．１及び最も好ましくは≦０．０８の混濁度（精製された単量体抗体コンストラクトを２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、一晩インキュベートした後、ＯＤ３４０により測定される）を有するとも想定される。
さらなる実施形態では、本発明による抗体コンストラクトは、酸性ｐＨで安定である。非生理的ｐＨ、例えばｐＨ５．５（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーの実行に必要とされるｐＨ）以下、例えばｐＨ４．０～５．５で抗体コンストラクトが示す耐性が高いほど、充填されたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出する抗体コンストラクトの回収率が高くなる。ｐＨ５．５でのイオン（例えば、陽イオン）交換カラムからの抗体コンストラクトの回収率は、好ましくは、≧３０％、より好ましくは≧４０％、より好ましくは≧５０％、さらにより好ましくは≧６０％、さらにより好ましくは≧７０％、さらにより好ましくは≧８０％、さらにより好ましくは≧９０％、さらにより好ましくは≧９５％及び最も好ましくは≧９９％である。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、治療有効性又は抗腫瘍活性を示すことがさらに想定される。これは、例えば、以下の進行期のヒト腫瘍異種移植モデルの実施例に開示される試験において評価することができる。
当業者は、この試験の特定のパラメータ、例えば注射する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトＴ細胞の数、投与する二重特異性抗体コンストラクトの量及び予定表を変更又は適合させながらも、有意義で再現性のある結果を得る方法を知っている。好ましくは、腫瘍増殖抑制Ｔ／Ｃ［％］は、≦７０若しくは≦６０、より好ましくは≦５０若しくは≦４０、さらにより好ましくは≦３０若しくは≦２０及び最も好ましくは≦１０若しくは≦５又はさらに≦２．５である。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、抗体コンストラクトは、単鎖抗体コンストラクトである。
また、本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、前記第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
を含む。
本発明の一実施形態では、第３のドメインの前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７～２４からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態又は本発明では、前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７～２４から選択されるアミノ酸配列を有する。
また、本発明の一実施形態では、第３のドメインの１つ又は好ましくは各々（両方）のポリペプチド単量体のＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む。当技術分野で知られるとおり、用語「システインジスルフィド架橋」は、一般構造Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒを有する官能基を指す。この連結は、ＳＳ結合又はジスルフィド架橋とも呼ばれ、システイン残基の２つのチオール基のカップリングによって得られる。本発明の抗体コンストラクトに関して、成熟抗体コンストラクト内でシステインジスルフィド架橋を形成するシステインは、３０９及び３２１（Ｋａｂａｔ付番）に相当するＣＨ２ドメインのアミノ酸配列に導入されることが特に好ましい。
本発明の一実施形態では、ＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が除去される。このグリコシル化部位の除去は、Ｎ３１４Ｘ置換によって達成されることが好ましく、ここで、Ｘは、Ｑではない任意のアミノ酸である。前記置換は、好ましくは、Ｎ３１４Ｇ置換である。より好ましい実施形態では、前記ＣＨ２ドメインは、以下の置換をさらに含む（位置は、Ｋａｂａｔに従う）Ｖ３２１Ｃ及びＲ３０９Ｃ（これらの置換は、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１でドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。
例えば、当技術分野で知られる二重特異性ヘテロＦｃ抗体コンストラクト（図１ｂ）と比較した本発明の抗体コンストラクトの好ましい特徴は、とりわけ、ＣＨ２ドメインにおける上記の改変の導入に関連し得ると考えられる。したがって、本発明のコンストラクトに関して、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインがＫａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つ／又はＫａｂａｔ位置３１４のグリコシル化部位が上記のとおりＮ３１４Ｘ置換により、好ましくはＮ３１４Ｇ置換により除去されることが好ましい。
本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメイン内のＣＨ２ドメインは、Ｋａｂａｔ位置３０９及び３２１にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、且つＫａｂａｔ位３１４のグリコシル化部位がＮ３１４Ｇ置換によって除去される。最も好ましくは、本発明の抗体コンストラクトの第３のドメインのポリペプチド単量体は、配列番号１７及び１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明は、抗体コンストラクトであって、
（ｉ）第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉ）第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含むか；
（ｉｉｉ）第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含むか；又は
（ｉｖ）第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、且つ第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含む、抗体コンストラクトを提供する。
したがって、第１及び第２のドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインなどの各々２つの抗体可変ドメインを含む結合ドメインであり得る。本明細書で上記される２つの抗体可変ドメインを含むこのような結合ドメインの例は、例えば、本明細書で上記されるＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントを含む。代わりに、それらの結合ドメインのいずれか一方又は両方は、単一の可変ドメインのみを含み得る。本明細書で上記されるこのような単一ドメイン結合ドメインの例は、例えば、他のＶ領域又はドメインに非依存的に抗原又はエピトープに特異的に結合するＶＨＨ、ＶＨ又はＶＬであり得る１つのみの可変ドメインを含むナノボディ又は単一可変ドメイン抗体を含む。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、第１及び第２のドメインは、ペプチドリンカーを介して第３のドメインに融合される。好ましいペプチドリンカーは、本明細書で上記されており、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴付けられ、ここで、ｘは、１又はそれより大きい整数（例えば、２又は３）である。第３のドメインに対する第１及び第２のドメインの融合において特に好ましいリンカーは、配列番号１に示される。
好ましい実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含むことで特徴付けられる。
本発明の一態様では、第１のドメインによって結合される標的細胞の表面抗原は、腫瘍抗原、免疫障害に特異的な抗原又はウイルス抗原である。本明細書で使用する場合、用語「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞上に提示されるそれらの抗原として理解され得る。これらの抗原は、細胞外部分とともに細胞表面上に提示され得、多くの場合、分子の膜貫通部分及び細胞質部分を併せ持つ。これらの抗原は、場合により腫瘍細胞によってのみ提示され得、正常細胞によって決して提示され得ない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上に限って発現され得るか、又は正常細胞と比較して腫瘍特異的変異を示す可能性がある。この場合、それらは、腫瘍特異抗原と呼ばれる。より一般的な抗原は、腫瘍細胞及び正常細胞によって提示される抗原であり、それらは、腫瘍関連抗原と呼ばれる。これらの腫瘍関連抗原は、正常細胞と比較して過剰発現され得るか、又は正常細胞と比較して腫瘍組織のコンパクトさに欠ける構造に起因して腫瘍細胞において抗体結合のために利用できる。本明細書で使用される腫瘍抗原の非限定的な例は、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ７０である。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７０、ＰＳＭＡ及びＢＣＭＡからなる群から選択される。
本発明の一態様では、抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルの順に、
（ａ）配列番号５２、７０、５８、７６、８８、１０６、１２４、９４、１１２、１３０、１４２，１６０、１７８、１４８、１６６、１８４、１９６、２１４、２３２、２０２、２２０、２３８、２５０、２６６、２８２、２９８、２５５、２７１、２８７、３０３、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、３２７、３４３、３５９、３７５、３９１、４０７、４２３、４３９、４５５、４７１、４８７、５０３、５１９、３５３、５５１、５９２、６０８、６２４、６４０、６５６、６７２、６８８、７０４、７２０、７３６、７５２、７６８、７８４、８００、８１６、８３２、８４８、８６４、８８０、８９６、９１２、９２８、９４４、９６０、９７６、９９２、１００８、１０２４、１０４０、１０５６、１０７２、１０８８、１１０４、１１２０、１１３６、１１５２、１１６８、１１８４、５９７、６１３、６２９、６４５、６６１、６７７、６９３、７０９、７２５、７４１、７５７、７７３、７８９、８０５、８２１、８３７、８５３、８６９、８８５、９０１、９１７、９３３、９４９、９６５、９８１、９９７、１０１３、１０２９、１０４５、１０６１、１０７７、１０９３、１１０９、１１２５、１１４１、１１５７、１１７３、１１８９、１２７７、１２８９、１３０１、１３１３、１３２５、１３３７、１３４９、１３６１、１３７３、１３８５、１３９７、１４０９、１４２１、１４３３、１４４５からなる群から選択され、且つ配列番号１４６０～１５１８に含まれるＢＣＭＡに対して特異的な配列；並びにＰＳＭＡに関連する５０、５６、６８、７４、８６、９２、１０４、１１０、１２２、１２８、１４０、１４６、１５８、１６４、１７６、１８２、１９４、２００、２１２、２１８、２３０、２３６、２４８、２５４、２６６、２７２、２８４、２９０、３０２、３０８（ここで、前述の配列番号５０～３０８の各々は、追加の配列表１２における対応する番号を得るために４１と等しい値によって引かれる必要がある）及び追加の配列表１２においてＰＳＭＡに関連する配列番号３２０、３３５、３５０、３６５、３８０、３９５、４１０、４２５、４４０、４５５及び４７０から選択されるアミノ酸配列を有する第１のドメイン；
（ｂ）配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｃ）国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号配列番号２３、２５、４１、４３、５９、６１、７７、７９、９５、９７、１１３、１１５、１３１、１３３、１４９、１５１、１６７、１６９、１８５若しくは１８７又は配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸を有する第２のドメイン；
（ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
（ｅ）配列番号１７～２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
（ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
（ｇ）配列番号１７～２４からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
を含む。
この好ましい実施形態に一致して、ペプチドリンカーを介して単鎖ポリペプチドに融合される第１及び第２のドメインは、
（ａ）配列番号５３及び５９；ＣＤ３３
（ｂ）配列番号７１及び７７；ＥＧＦＲｖＩＩＩ
（ｃ）配列番号８９、１０７、１２５、９５、１１３及び１３１；ＭＳＬＮ
（ｄ）配列番号１４３、１６１、１７９、１４９、１６７及び１８５；ＣＤＨ１９
（ｅ）配列番号１９７、２１５、２３３、２０３、２２１及び２３９；ＤＬＬ３
（ｆ）配列番号２５１、２６７、２８３、２９９、２５６、２７２、２８８及び３０４；ＣＤ１９
（ｇ）配列番号３２３、３３９、３５５、３７１、３８７、４０３、４１９、４３５、４５１、４６７、４８３、４９９、５１５、５３１、５４７、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、５３６及び５５２；ＦＬＴ３
（ｈ）配列番号５９３、６０９、６２５、６４１、６５７、６７３、６８９、７０５、７２１、７３７、７５３、７６９、７８５、８０１、８１７、８３３、８４９、８６５、８８１、８９７、９１３、９２９、９４５、９６１、９７７、９９３、１００９、１０２５、１０４１、１０５７、１０７３、１０８９、１１０５、１１２１、１１３７、１１５３、１１６９、１１８５、５９８、６１４、６３０、６４６、６６２、６７８、６９４、７１０、７２６、７４２、７５８、７７４、７９０、８０６、８２２、８３８、８５４、８７０、８８６、９０２、９１８、９３４、９５０、９６６、９８２、９９８、１０１４、１０３０、１０４６、１０６２、１０７８、１０９４、１１１０、１１２６、１１４２、１１５８、１１７４及び１１９０；ＣＤ７０
（ｉ）配列番号１２６８；及びＣＤ２０
（ｊ）配列番号１２７８、１２９０、１３０２、１３１４、１３２６、１３３８、１３５０、１３６２、１３７４、１３８６、１３９８、１４１０、１４２２、１４３４、１４４６．ＣＤ１９
（ｋ）配列番号１４７２、１４７８、１４９１、１４９７、１５０９、１５１５に含まれるそれぞれの配列ＢＣＭＡ
（ｌ）配列番号１５２７、１５３３、１５４５、１５５１、１５６３、１５６９、１５８１、１５８７、１５９９、１６０５、１６１７、１６２３、１６３５、１６４１、１６５３、１６５９、１６７１、１６７７、１６８９、１６９５、１７０７、１７１３、１７２５、１７３１、１７４３、１７４９、１７６１、１７６７、１７７９、１７８５、１７９７、１８１２、１８２７、１８４２、１８５７、１８７２、１８８７、１９０２、１９１７、１９２７、１９３７、１９４７、１９６２ ＰＳＭＡ
からなる群から選択される配列を含む。
一態様では、本発明の抗体コンストラクトは、
（ａ）配列番号５４、５５、６０及び６１；ＣＤ３３
（ｂ）配列番号７２、７３、７８及び７９；ＥＧＦＲｖＩＩＩ
（ｃ）配列番号９０、９１、９６、９７、１０８、１０９、１１４及び１１５；ＭＳＬＮ
（ｄ）配列番号１４４、１４５、１５０、１５１、１６２、１６３、１６８、１６９、１８０、１８１、１８６及び１８７；ＣＤＨ１９
（ｅ）配列番号１９８、１９９、２０４、２０５、２１６、２１７、２２２、２２３、２３４、２３５、２４０及び２４１；ＤＬＬ３
（ｆ）配列番号２５２、３０６、２５７、３０７、２６８、３０８、２７３、３０９、２８４、３１０、２８９、３１１、３００、３１２、３０５及び３１３；ＣＤ１９
（ｇ）配列番号３２４、５５４、３２９、５５５、３４０、５５６、３４５、５５７、３５６、５５８、３６１、５５９、３７２、５６０、３７７、５６１、３８８、５６２、３９３、５６３、４０４、５６４、４０９、５６５、４２０、５６６、４２５、５６７、４３６、５６８、４４１、５６９、４５２、５７０、４５７、５７１、４６８、５７２、４７３、５７３、４８４、５７４、４８９、５７５、５００、５７６、５０５、５７７、５１６、５７８、５２１、５７９、５３２、５８０、５３７、５８１、５４８、５８２、５５３及び５８３；ＦＬＴ３
（ｈ）配列番号５９４、６１０、６２６、６４２、６５８、６７４、６９０、７０６、７２２、７３８、７５４、７７、７８６、８０２、８１８、８３４、８５０、８６６、８８２、８９８、９１４、９３０、９４６、９６２、９７８、９９４、１０１０、１０２６、１０４２、１０５８、１０７４、１０９０、１１０６、１１２２、１１３８、１１５４、１１７０、１１８６、５９９、６１５、６３１、６４７、６６３、６７９、６９５、７１１、７２７、７４３、７５９、７７５、７９１、８０７、８２３、８３９、８５５、８７１、８８７、９０３、９１９、９３５、９５１、９６７、９８３、９９９、１０１５、１０３１、１０４７、１０６３、１０７９、１０９５、１１１１、１１２７、１１４３、１１５９、１１７５、１１９１及び１１９２～１２６７；ＣＤ７０
（ｉ）配列番号４３；ＣＤ２０
（ｊ）配列番号１２７９、１２８０、１２９１、１２９２、１３０３、１３０４、１３１５、１３１６、１３２７、１３２８、１３３９、１３４０、１３５１、１３５２、１３６３、１３６４、１３７５、１３７６、１３８７、１３８８、１３９９，１４００、１４１１、１４１２、１４２３、１４２４、１４３５、１４３６、１４４７、１４４８．ＣＤ１９
（ｋ）配列番号１４７３、１４７４、１４７５、１４７９、１４８０、１４８１、１４９２、１４９３、１４９４、１４９８、１４９９、１５００、１５１０、１５１１、１５１２、１５１６、１５１７、１５１８ ＢＣＭＡ
（ｌ）１５２８、１５２９、１５３０、１５３４、１５３５、１５３６、１５４６、１５４７、１５４８、１５５２、１５５３、１５５４、１５６４、１５６５、１５６６、１５７０、１５７１、１５７２、１５８２、１５８３、１５８４、１５８８、１５８９、１５９０、１６００、１６０１、１６０２、１６０６、１６０７、１６０８、１６１８、１６１９、１６２０、１６２４、１６２５、１６２６、１６３６、１６３７、１６３８、１６４２、１６４３、１６４４、１６５４、１６５５、１６５６、１６６０、１６６１、１６６２、１６７２、１６７３、１６７４、１６７８、１６７９、１６８０、１６９０、１６９１、１６９２、１６９６、１６９７、１６９８、１７０８、１７０９、１７１０、１７１４、１７１５、１７１６、１７２６、１７２７、１７２８、１７３２、１７３３、１７３４、１７４４、１７４５、１７４６、１７５０、１７５１、１７５２、１７６２、１７６３、１７６４、１７６８、１７６９、１７７０、１７７４、１７７５、１７７６、１７８６、１７８７、１７８８、１７９８、１７９９、１８００、１８０１、１８０２、１８０３、１８１３、１８１４、１８１５、１８１６、１８１７、１８１８、１８２８、１８２９、１８３０、１８３１、１８３２、１８３３、１８４３、１８４４、１８４５、１８４６、１８４７、１８４８、１８５８、１８５９、１８６０、１８６１、１８６２、１８６３、１８７３、１８７４、１８７５、１８７６、１８７７、１８７８、１８８８、１８８９、１８９０、１８９１、１８９２、１８９３、１９０３、１９０４、１９０５、１９０６、１９０７、１９０８、１９１８、１９１９、１９２０、１９２１、１９２２、１９２３、１９３３、１９３４、１９３５、１９３６、１９３７、１９３８、１９４８、１９４９、１９５０、１９５１、１９５２、１９５３及び１９６３ ＰＳＡＭ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することによって特徴付けられる。
本発明は、本発明の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子をさらに提供する。ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合された１３個以上のヌクレオチド単量体で構成される生体高分子である。ＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのような核酸分子の単量体又はサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子又はポリヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖、線状及び環状であり得る。好ましくは宿主細胞内に含まれるベクター内にそれが含まれることが好ましい。前記宿主細胞は、例えば、本発明のベクター又はポリヌクレオチドを用いた形質転換又はトランスフェクション後、抗体コンストラクトを発現することができる。それを目的として、ポリヌクレオチド又は核酸分子は、制御配列に作動可能に連結される。
遺伝暗号は、遺伝子材料（核酸）内にコードされた情報をタンパク質に翻訳するルールのセットである。生細胞中での生物学的解読は、アミノ酸を運搬し、ｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドを一度に読み取るｔＲＮＡ分子を使用して、ｍＲＮＡによって指定された順にアミノ酸を結合するリボソームによって行われる。この暗号は、コドンと呼ばれる三つ組のヌクレオチド配列が、タンパク質の合成時に次に付加されることになるアミノ酸をどのように指定するかを定義する。いくつかの例外はあるが、核酸配列中の３ヌクレオチドのコドンは、１つのアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子は、厳密に同じ暗号で暗号化されているため、この特定の暗号を基準遺伝暗号又は標準遺伝暗号と称する場合が多い。遺伝暗号は、所与のコード領域のタンパク質配列を決定するが、他のゲノム領域がこれらのタンパク質が産生される時期及び場所に影響を及ぼし得る。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、（外来）遺伝子材料を細胞内に移すための媒体として使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含するが、これらに限定されない。一般に、遺伝子操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位及び選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）及びベクターの「骨格」の役割をするより大きい配列を含むヌクレオチド配列、一般にＤＮＡ配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えて、プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグといった追加の特徴を包含する場合がある。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは、特に標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に制御配列を有する。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択的にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係にある場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列若しくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーター若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されているか；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していること、及び分泌リーダーの場合には連続し且つ読み取り枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによってなされる。このような部位が存在しない場合、従来の慣例に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に標的細胞に導入する方法である。本用語は、ほとんどの場合、真核細胞における非ウイルス的方法に使用される。形質導入は、核酸分子又はポリヌクレオチドのウイルス媒介性の移入を表すために使用される場合が多い。動物細胞のトランスフェクションは、通常、細胞膜に一過性の細孔、すなわち「穴」を開けて、物質の取り込みを可能にすることを伴う。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、エレクトロポレーションにより、細胞の圧迫により、又は陽イオン性脂質とリポソームを生成する物質とを混合し、細胞膜と融合させ、内部のカーゴを蓄積することにより行うことができる。
用語「形質転換」は、細菌への及び植物細胞を含む非動物真核細胞への核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス的移入を表すために使用される。したがって、形質転換は、細胞膜を通じたその周辺からの直接的取り込み及びそれに続く外来性遺伝子材料（核酸分子）の組み込みから生じる、細菌又は非動物真核細胞の遺伝的改変である。形質転換は、人為的手段によって生じさせることができる。形質転換を生じさせるには、細胞又は細菌は、飢餓及び細胞密度などの環境条件に対する時限応答として形質転換が起こり得るコンピテントな状態でなければならない。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」又は「レシピエント細胞」は、本発明の抗体コンストラクトをコードするベクター、外来性核酸分子及びポリヌクレオチドのレシピエント；並びに／又はその抗体コンストラクト自体のレシピエントであり得るか、又はそうであった任意の個々の細胞又は細胞培養物を含むことが意図される。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクションなどによって実施される。用語「宿主細胞」は、単一細胞の子孫又は潜在的子孫を含むことも意図する。後継世代において、自然発生的、偶発的若しくは意図的な変異のいずれかに起因して、又は環境的影響に起因して一定の改変が生じる場合があるため、そのような子孫は、実際には、（形態学的に又はゲノム若しくは全ＤＮＡの組に関して）親細胞と完全に同一でない場合もあるが、なおも本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。好適な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含み、また細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカク又はヒトを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体コンストラクトは、細菌内で産生することができる。発現後、本発明の抗体コンストラクトを可溶性画分中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペーストから単離し、例えば親和性クロマトグラフィー及び／又はサイズ排除によって精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体の精製方法と同様に実施することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が本発明の抗体コンストラクトのための好適なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、多くの他の属、種及び系統が一般に利用可能であり、且つ本発明において有用であり、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｋ．ウィッカラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ワルチイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マルキサヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２２２６号明細書）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３０７０号明細書）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４２３４号明細書）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；並びに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。
本発明のグリコシル化抗体コンストラクトの発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株及びバリアント並びにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファカリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１バリアント及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ－５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスを、本発明による本明細書のウイルスとして、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用し得る。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ及びタバコの植物細胞培養物も宿主として使用することができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に知られている。例えば、Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６－７８、Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９０－７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８：７４５－７５０及びＦｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２：９７９－９８６を参照されたい。
しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の増殖は、通例の手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養物中で増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、１４１３ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５ １）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２）３８３：４４－６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体コンストラクトの作製方法であって、本発明の抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、産生された抗体コンストラクトを培養物から回収することとを含む方法を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「培養」は、培地中の好適な条件下におけるインビトロでの細胞の維持、分化、成長、増殖及び／又は伝播を指す。用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むが、これらに限定されない、本発明の抗体コンストラクトの作製に関与するいずれの工程も含む。
組換え技術を使用する場合、抗体コンストラクトは、細胞膜周辺腔において細胞内で産生され得るか、又は培地中に直接分泌され得る。抗体コンストラクトが細胞内で産生される場合、第１段階として、例えば遠心分離又は限外濾過により、宿主細胞又は溶解したフラグメントの粒子状の細片を除去する。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞片は、遠心分離により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、一般にそのような発現系からの上清を、最初に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、前述の段階のいずれかにおいてＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれ得、また外来性の汚染菌の増殖を防止するために抗生物質が含まれ得る。
宿主細胞から調製された本発明の抗体コンストラクトは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び親和性クロマトグラフィーを用いて回収又は精製することができる。回収される抗体に応じて、他のタンパク質精製技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿法も利用可能である。本発明の抗体コンストラクトがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。
親和性クロマトグラフィーは、好ましい精製技術である。親和性リガンドを結合するマトリックスは、最も多くの場合にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えばコントロールドポアガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成できるものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。
さらに、本発明は、本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製された抗体コンストラクトを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において、抗体コンストラクトの均質性は、≧８０％であることが好ましく、より好ましくは≧８１％、≧８２％、≧８３％、≧８４％又は≧８５％、さらに好ましくは≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％又は≧９０％、なおさらに好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％又は≧９５％及び最も好ましくは≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％である。
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与に好適な組成物に関する。本発明の特に好ましい医薬組成物は、１つ又は複数の本発明の抗体コンストラクトを好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、医薬組成物は、１つ以上の（薬学的に有効な）担体、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤及び／又はアジュバントの好適な製剤をさらに含む。許容される組成物の成分は、採用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。本発明の医薬組成物は、液体、凍結及び凍結乾燥組成物を含むが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。一般に、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与、特に非経口投与に適合するあらゆる水性及び非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、リポソーム、分散媒体及びコーティングを意味する。医薬組成物におけるそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野でよく知られており、そのような担体を含む組成物は、よく知られる従来法によって製剤化することができる。
特定の実施形態は、本発明の抗体コンストラクト及びさらに１つ以上の賦形剤、例えば本節及び本明細書の他の箇所に例示的に記載されているものを含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的又は生物学的特性の調整及び／又は有効性を向上させ、且つ／若しくはこのような製剤を安定化するための本発明の方法並びに例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与中及びこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び損傷に対する方法など、広範囲の目的を考慮して本発明で使用することができる。
ある種の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は浸透を変更、持続又は保護することを目的とする製剤材料を含有し得る（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８” Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。このような実施形態では、好適な製剤材料は、以下を含み得るが、これらに限定されない：
・荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩及び／又はヒスチジンを含むアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２－フェニルアラニン
・抗菌剤及び抗真菌剤などの抗菌薬
・アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；
・約４．０～６．５、好ましくは４．２～４．８の酸性ｐＨに組成物を維持するために使用される緩衝液、緩衝系及び緩衝化剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩；例えば又は約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液；
・非水性溶媒、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル；
・生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む水性担体；
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー；
・マンニトール又はグリシンなどの充填剤；
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；
・等張剤及び吸収遅延剤；
・錯化剤、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）
・注入剤；
・単糖類；二糖類；及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；糖質は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトール又はキシリトールであり得る；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質性担体、例えばヒト若しくはウシ血清アルブミン、ゼラチン又は好ましくはヒト起源の免疫グロブリン；
・着色及び着香剤；
・硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤；
・乳化剤；
・ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー）
・ナトリウムなどの塩形成対イオン；
・抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤；例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素である）；
・Ｚｎ－タンパク質錯体などの金属錯体；
・溶媒及び共溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；
・糖及び糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトール又はキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコール；
・懸濁化剤；
・界面活性剤又は湿潤剤、例えばプルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）；界面活性剤は、好ましくは、＞１．２ＫＤの分子量を有する洗剤及び／又は好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得；好ましい洗剤の非限定的な例は、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｗｅｅｎ ８５であり；好ましいポリエーテルの非限定的な例は、ＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００及びＰＥＧ ５０００である；
・スクロース又はソルビトールなどの安定性増強剤；
・等張性増強剤、例えばアルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール；
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は固定油を含む非経口送達ビヒクル；
・体液及び栄養補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースをベースにしたものなど）を含む静脈内送達ビヒクル。
医薬組成物の異なる成分（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有し得ることは、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は、緩衝液、安定化剤及び／又は抗酸化剤として作用することができ；マンニトールは、充填剤及び／又は等張性増強剤として作用することができ；塩化ナトリウムは、送達ビヒクル及び／又は等張性増強剤として作用することができるなどである。
本発明の組成物は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えて、組成物の使用目的に応じてさらなる生物学的に活性な薬剤を含む場合があることが想定される。このような薬剤は、当技術分野で知られる胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を防ぐ薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物及び／又はサイトカインなどの薬剤であり得る。また、本発明の抗体コンストラクトは、併用療法で、すなわち別の抗癌薬と併用して適用されることも想定される。
ある種の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて当業者により決定されることになる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（前掲）を参照されたい。ある種の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体コンストラクトの物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビトロクリアランス速度に影響し得る。ある種の実施形態では、医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、本質的に水性又は非水性であり得る。例えば、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水も例示的なビヒクルである。ある種の実施形態では、本発明の組成物の抗体コンストラクトは、凍結乾燥ケーク又は水性溶液の形態において、所望の度合いの純度を有する選択された組成物を任意選択的に配合剤（前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって保管のために調製され得る。さらに、ある種の実施形態では、本発明の抗体コンストラクトは、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化され得る。
非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の所望の抗体コンストラクトを含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、本発明の抗体コンストラクトは、その中で適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。ある種の実施形態では、製剤は、デポ注射を介して送達できる産物の制御放出又は持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームと、所望の分子との製剤を含み得る。ある種の実施形態では、血中での持続時間を向上させる効果を有するヒアルロン酸も使用される場合がある。ある種の実施形態では、移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の抗体コンストラクトを導入し得る。
さらなる医薬組成物が当業者に明らかであり、これには、持続性又は制御性の送達／放出製剤中に本発明の抗体コンストラクトを含む製剤が含まれる。様々な他の持続性又は制御性の送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子又は多孔ビーズ及びデポ注射を製剤化する技術も当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第９３／００８２９号明細書を参照されたい。持続放出性製剤は、成形物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書に開示される）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。持続放出性組成物は、当技術分野で知られるいくつかの方法のいずれかによって作製可能なリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；同第０８８，０４６号明細書及び同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。
抗体コンストラクトはまた、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンに封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に用いられる医薬組成物は、通常、滅菌製剤として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通した濾過によって行うことができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前後のいずれに実施され得る。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液中に保存することができる。非経口組成物は、一般に、滅菌したアクセスポートを有するコンテナ、例えば皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静注液バッグ又はバイアル中に入れられる。
本発明の別の態様は、国際特許出願国際公開第０６１３８１８１Ａ２号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０２２５９９号明細書）に記載される、医薬組成物として使用することができる本発明の製剤の自己緩衝性抗体コンストラクトを含む。タンパク質の安定化並びにこれに関して有用な製剤材料及び方法に対して様々な説明が利用可能であり、例えばＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５－９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」 ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９－７５（２００２）、特に獣医学的及び／又はヒト医療用途のタンパク質医薬品及びプロセスに関して、特に本発明による自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を参照されたい。
塩は、本発明のある種の実施形態に従って、例えば製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整するため、且つ／又は本発明による組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解度及び／若しくは物理的安定性を向上させるために使用され得る。よく知られているとおり、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、且つタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力及び反発相互作用の強度を低減することにより、天然状態のタンパク質を安定化することができる。イオンは、特にタンパク質の変性ペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化することもできる。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによりタンパク質の凝集及び不溶化を防止又は低減することもできる。
イオン種によってタンパク質に及ぼすそれらの効果は、著しく異なる。イオン及びタンパク質に対するその効果の分類上の順位付けがいくつか立案されており、これを本発明による医薬組成物の製剤化に使用することができる。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化する溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化する溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性及び／又は可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果により、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。
遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤及び抗酸化剤として、並びに他の標準的用途として、本発明の様々な実施形態による本発明の製剤の抗体コンストラクトに使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥において適切なケークの構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロース及びソルビトール並びに多価アルコール、例えばグリセロール及びプロピレングリコール並びに本明細書での議論を目的としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質を物理的及び化学的劣化過程から保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールは、製剤の等張性を調整するのにも有用である。ポリオールの中で本発明の選択された実施形態において有用なのは、マンニトールであり、これは、凍結乾燥製剤においてケークの構造安定性を確保するために一般に使用される。マンニトールはケ、ークの構造安定性を確保する。一般に、これは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースとともに使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための薬剤及び輸送中又は製造工程でのバルク調製時の凍結解凍ストレスから保護するための安定化剤として好ましいものの中に含まれる。還元糖（遊離アルデヒド基又はケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、それらは、一般に、本発明による使用のための好ましいポリオールの中に含まれない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースも、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化を生じさせる点で本発明の好ましいポリオールの中に含まれない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化すること及び凍結保護物質として有用であり、この点に関して本発明に使用することができる。
本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面への吸着並びに気体－液体界面、固体－液体界面及び液体－液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいことがある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、一般に、タンパク質濃度と反比例し、通常、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は、慣例的に、表面吸着を防止するか、最小化するか、又は低減するために使用される。この点に関して本発明において有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤は、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般に使用される。任意の所与の界面活性剤は、通常、一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するため、この点において、界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化劣化を起こしやすく、多くの場合、供給されるとき、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。したがって、ポリソルベートは、注意して使用すべきであり、使用時には最小影響濃度で用いなければならない。この点で、ポリソルベートは、賦形剤を最小影響濃度で用いるべきとする一般通則を例示している。
本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、１種以上の抗酸化剤をさらに含む。適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することにより、且つ光への暴露を回避することにより、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止することができる。抗酸化賦形剤を、タンパク質の酸化劣化を防止するためにも同様に使用することができる。この点で特に有用な抗酸化剤には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤及びキレート剤が含まれる。本発明による治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。この点で、ＥＤＴＡが本発明による好ましい抗酸化剤である。抗酸化剤は、タンパク質を損傷することがある。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは、特に分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための抗酸化剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するか又はその可能性を十分に低減するように選択される。
本発明による製剤は、タンパク質の補因子であり、タンパク質配位化合物を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンは、タンパク質を分解するいくつかの過程も阻害することができる。しかしながら、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程も触媒する。マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化することができ、これは、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化されることがあり、その凝集は、Ａｌ＋３イオンによって増大し得る。
本発明の製剤の抗体コンストラクトの実施形態は、１種以上の保存剤をさらに含む。保存剤は、同じコンテナからの２回以上の取り出しを伴う複数回用量の非経口製剤を開発する際に必要となる。その主たる機能は、製剤の有効期間又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、且つ製品の無菌性を確保することである。一般に使用される保存剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ－クレゾールが挙げられる。保存剤は低分子の非経口薬との使用において長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかしながら、複数回用量製剤が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。保存処理された製剤の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのようなペンデバイスは、少なくとも４つが現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ－クレゾールにより製剤化されている。保存処理された剤形の製剤化及び開発中、いくつかの態様を考慮する必要がある。製剤中の効果的な保存剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の保存剤を、タンパク質の安定性を損なうことなく抗微生物効果を付与する濃度範囲で試験することが必要となる。
予想されるとおり、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥され、使用時に保存剤を含有する希釈剤で再構成することができる。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、保存剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８～２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、保存剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証される必要がある。
本明細書で開示される抗体コンストラクトは、免疫リポソームとしても製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質の配置と同様に二層構造で配置される。抗体コンストラクトを含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書；並びに国際公開第９７／３８７３１号パンフレットに記載される、当技術分野で知られる方法によって調製される。循環時間が長くなったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって作製することができる。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームを、所定の孔径のフィルターを通して押し出す。本発明の抗体コンストラクトのＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されるとおりに、リポソームにコンジュゲートすることができる。任意選択的に、化学療法剤がリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
医薬組成物を製剤化した後、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存し得る。このような製剤は、使用準備済の形態又は投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥）形態のいずれかで保存され得る。
本明細書で定義される医薬組成物の生物活性は、例えば、以下の実施例、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）によって記載されるとおりの細胞傷害性アッセイによって決定することができる。本明細書で使用する場合、「有効性」又は「インビボ有効性」は、例えば、標準化されたＮＣＩの反応基準を用いた、本発明の医薬組成物による療法に対する反応を指す。本発明の医薬組成物を用いる療法の成功又はインビボ有効性は、その意図された目的、すなわち組成物がその所望の効果、すなわち病的細胞、例えば腫瘍細胞の激減を引き起こす能力に関する組成物の有効性を指す。インビボ有効性は、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺を含むが、これらに限定されない、それぞれの疾患実体についての確立された標準的方法によって観測され得る。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメータ及び他の確立された標準的方法が使用され得る。さらに、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影法（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの基準に基づく反応評価［Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ，Ｈｏｒｎｉｎｇ ＳＪ，Ｃｏｉｆｆｉｅｒ Ｂ，Ｓｈｉｐｐ ＭＡ，Ｆｉｓｈｅｒ ＲＩ，Ｃｏｎｎｏｒｓ ＪＭ，Ｌｉｓｔｅｒ ＴＡ，Ｖｏｓｅ Ｊ，Ｇｒｉｌｌｏ－Ｌｏｐｅｚ Ａ，Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ Ａ，Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ Ｆ，Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ Ｄ，Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ Ｗ，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ，Ｃａｒｔｅｒ Ｗ，Ｈｏｐｐｅ Ｒ，Ｃａｎｅｌｌｏｓ ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９ Ａｐｒ；１７（４）：１２４４］）、ポジトロン放出断層走査、白血球の計数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄穿刺、リンパ節生検／組織学及び様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）並びに他の確立された標準的方法が使用され得る。
本発明の医薬組成物などの薬物の開発におけるもう１つの主な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、候補薬物の薬物動態プロファイル、すなわち特定の薬物が所与の病態を治療する能力に影響する薬物動態パラメータのプロファイルが確立され得る。薬物が特定の疾患実体を治療する能力に影響する薬物の薬物動態パラメータとしては、半減期、分布容積、肝臓の初回通過代謝及び血清結合の程度が挙げられるが、これらに限定されない。所与の薬物の有効性は、上記のパラメータの各々によって影響を受ける可能性がある。
「半減期」は、投与された薬物の５０％が生物学的過程、例えば代謝、排泄などを通じて排出される時間を意味する。「肝臓の初回通過代謝」は、肝臓との初回接触時、すなわち肝臓を最初に通過する間に代謝される薬物の傾向を意味する。「分布容積」は、例えば、細胞内及び細胞外空間、組織及び臓器などのような、身体の様々な区画にわたる薬物の保持度並びにこれらの区画内での薬物の分布を意味する。「血清結合の程度」は、薬物がアルブミンなどの血清タンパク質と相互作用して結合し、薬物の生物活性の低減又は消失をもたらす傾向を意味する。
薬物動態パラメータは、投与される所与量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、ラグタイム（Ｔｌａｇ）、Ｔｍａｘ、吸収速度、より多くの作用発現及び／又はＣｍａｘも含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液コンパートメント中の薬物の量を意味する。「ラグタイム」は、薬物の投与から、血液又は血漿中での薬物の検出及び測定が可能になるまでの遅延時間を意味する。「Ｔｍａｘ」は、その後に薬物の最高血中濃度に到達する時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物によって得られる最高血中濃度である。薬物が生物学的効果に必要とされる血中濃度又は組織濃度に達するまでの時間は、全てのパラメータに影響される。先に概説したチンパンジーではない霊長類における前臨床動物試験において決定され得る種間特異性を示す二重特異性抗体コンストラクトの薬物動態パラメータは、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５），１－１２）による刊行物にも規定されている。
本発明の好ましい態様では、医薬組成物は、約－２０℃で少なくとも４週間安定である。付属の実施例から明らかなように、対応する最先端の抗体コンストラクトの質に対する本発明の抗体コンストラクトの質は、異なる系を使用して試験され得る。それらの試験は、「ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ５Ｃ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑ６Ｂ」に準拠するものであることが理解され、それにより、その産物の同一性、純度及び能力の変化の確実な検出をもたらす安定性指標プロファイルを提供するよう選択される。純度という用語は、相対的な用語であることが十分に受け入れられている。グリコシル化、脱アミド又は他の異種性の影響に起因して、生物工学的／生物学的産物の絶対的な純度は、通常、２つ以上の方法によって評価されるべきであり、得られる純度の値は、方法依存的である。安定性試験の目的のために、純度の試験は、分解産物の決定方法に合わせるべきである。
本発明の抗体コンストラクトを含む医薬組成物の質の評価のために、例えば溶液中の可溶性凝集物の含有量（サイズ排除によるＨＭＷＳ）を分析することによって分析され得る。約－２０℃での少なくとも４週間の安定性は、１．５％ＨＭＷＳ未満、好ましくは１％ＨＭＷＳ未満の含有量によって特徴付けられる。
医薬組成物としての抗体コンストラクトのための好ましい製剤は、上記に詳細に説明される。しかしながら、厳密な以下の製剤は、あまり好ましくなく、したがって放棄される場合がある。
・製剤Ａ：
２０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ Ｌ－アルギニン塩酸塩、６％（ｗ／Ｖ）トレハロース二水和物、０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０ ｐＨ６．０
・製剤Ｂ：
１０ｍＭ グルタミン酸塩、４％（ｗ／Ｖ）マンニトール、２％（ｗ／Ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０ ｐＨ４．０
医薬組成物の形態の本発明の抗体コンストラクトの安定性の評価の他の例は、付属の実施例４～１２に提供される。それらの実施例において、本発明の抗体コンストラクトの実施形態は、異なる医薬製剤において異なるストレス条件に関して試験され、その結果が当技術分野で知られる他の半減期延長（ＨＬＥ）形式の二重特異性Ｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクトと比較される。一般に、本発明による特定のＦｃ様式で提供される抗体コンストラクトは、通常、異なるＨＬＥ形式とともに提供される抗体コンストラクト及びいかなるＨＬＥ形式も有しない抗体コンストラクト（例えば、「カノニカル」な抗体コンストラクト）の両方と比較して、温度及び光ストレスなどの広範囲のストレス条件に対してより安定であることが想定される。前述の温度安定性は、低温（凍結温度を含む室温未満）及び高温（体温までの又は体温を超える温度を含む室温超）の両方に関連し得る。当業者が認めるとおり、診療において避けるのが困難なストレスに対するそのような安定性の向上により、診療において分解産物がより少なくなるため、抗体コンストラクトがより安全になる。結果として、前述の安定性の向上は、安全性の向上を意味する。
一実施形態は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患又は免疫障害の予防、治療又は改善に使用するための本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを提供する。
本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者において、本明細書に記載される病的な医学的状態を治療、改善及び／又は予防する医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的治療及び予防的又は抑止的手段の両方を指す。治療は、疾患、疾患の症状又は疾患素因を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変化させる、矯正する、改善する、好転させる又は影響を与えることを目的とした、疾患／障害、疾患／障害の症状又は疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織又は細胞に対する製剤の適用又は投与を含む。
本明細書で使用する場合、用語「改善」は、本発明による抗体コンストラクトのそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す腫瘍又は癌若しくは転移性癌を有する患者の疾患状態のあらゆる好転を指す。そのような好転は、患者の腫瘍又は癌若しくは転移性癌の進行の緩徐化又は停止として見られる場合もある。本明細書で使用する場合、用語「予防」は、本発明による抗体コンストラクトのそれを必要とする対象への投与による、本明細書の以下に示す腫瘍又は癌若しくは転移性癌を有する患者の発症又は再発の回避を意味する。
用語「疾患」は、本明細書に記載される抗体コンストラクト又は医薬組成物を用いた治療から恩恵を被ることになる任意の病態を指す。これは、哺乳動物を対象の疾患に罹患させやすくする病的状況を含む、慢性及び急性の障害又は疾患を含む。
「新生物」は、組織の異常な増殖であり、必ずしもそうとは限らないが、通常、腫瘤を形成する。また、腫瘤を形成する場合、それは、一般に「腫瘍」と呼ばれる。新生物又は腫瘍は、良性、潜在性悪性（前癌性）又は悪性であり得る。悪性新生物は、一般に癌と呼ばれる。それらは、通常、周囲の組織に侵入してそれを破壊し、転移を形成し得、すなわち、それらは、身体の他の部分、組織又は臓器に広がる。したがって、用語「転移性癌」は、原発腫瘍のもの以外の他の組織又は臓器への転移を包含する。リンパ腫及び白血病は、リンパ系新生物である。本発明の目的において、それらは、用語「腫瘍」又は「癌」にも包含される。
用語「ウイルス性疾患」は、対象のウイルス感染の結果である疾患を表す。
本明細書で使用する場合、用語「免疫障害」は、この用語の一般的な定義に沿って自己免疫疾患、過敏症、免疫不全などの免疫障害を表す。
一実施形態では、本発明は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、ウイルス性疾患又は免疫障害の治療又は改善のための方法であって、それを必要とする対象に本発明の抗体コンストラクト又は本発明の方法に従って作製される抗体コンストラクトを投与する工程を含む方法を提供する。
用語「必要とする対象」又は「治療を必要とする」対象は、すでにその障害を有する対象及びその障害を予防しようとする対象を含む。必要とする対象又は「患者」は、予防的治療又は治療的治療のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
本発明の抗体コンストラクトは、一般に、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲において、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に合わせて設計されることになる。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で製剤化される。
したがって、製剤及び組成物は、本発明に従って任意の好適な投与経路による送達に合わせて設計され得る。本発明に関連して、投与経路は、
・局所経路（例えば、皮膚上、吸入、鼻、眼、耳介／耳、膣、粘膜）；
・腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）を含むが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物及び抗体コンストラクトは、例えば、ボーラス注射などの注射又は持続注入などの注入による非経口投与、例えば皮下又は静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与され得る。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。
特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を実現する。非限定的な例として、中断のない又は実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療薬の流入を調整するための、患者が装着した小型ポンプシステムによって実現され得る。本発明の抗体コンストラクトを含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与することができる。そのようなポンプシステムは、一般に当技術分野で知られており、通常、注入する治療薬を含有するカートリッジの定期交換に依拠する。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、交換時以外には中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が結果として生じる場合がある。そのような場合でも、カートリッジ交換前の投与段階及びカートリッジ交換後の投与段階はなお、ともにこのような治療薬の「中断のない投与」を構成する本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内と見なされるであろう。
本発明の抗体コンストラクトの連続投与又は中断のない投与は、流体をレザバーから送り出すための流体送出機構及び送出機構を駆動するための駆動機構を含む、流体送達デバイス又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与であり得る。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚に穿通し、好適な組成物を患者体内に送達するための針又はカニューレを含み得る。前記ポンプシステムを、静脈、動脈又は血管を問わず、患者の皮膚に直接固定又は装着することでポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることが可能になる。このポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間～数日間装着することができる。レザバーの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のためのレザバーの容積は、０．１～５０ｍｌであり得る。
連続投与は、皮膚に装着され時折交換されるパッチによって経皮的でもあり得る。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、例えば、第１の使用済みパッチの直接隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流入の中断又は電池故障の問題は生じない。
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、まず凍結乾燥材料を投与前に適切な液体で再構成する。凍結乾燥材料を、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤で再構成し得る。
本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトをチンパンジーではない霊長類、例えばマカクに用量を増加させながら投与することによる用量漸増試験によって決定できる好適な用量で対象に投与することができる。上述のとおり、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトは、チンパンジーではない霊長類の前臨床試験において同一の形態で使用でき、且つヒトにおける薬物として使用できるという利点がある。投与計画は、主治医が臨床的要因によって決定することになる。医学分野でよく知られるとおり、ある１人の患者に対する投与量は、その患者の体格、体表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身健康状態並びに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因に依存する。
用語「有効用量」又は「有効投与量」は、所望の効果を達成するか又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療有効用量」は、疾患にすでに罹患している患者の疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量又は用量は、治療される病態（適応症）、送達される抗体コンストラクト、治療の内容及び目的、疾患の重症度、前治療、患者の病歴及び治療薬に対する反応性、投与経路、体格（体重、体表面積又は臓器サイズ）及び／又は患者の状態（年齢及び全身健康状態）並びに患者自身の免疫系の全身状態に依存することになる。適当な用量は、１回の投与又は複数回にわたる投与で患者に投与できるように、また最適な治療効果を得るために主治医の判断に従って調整することができる。
典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ～最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１０μｇ／ｋｇ～最大約１０ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ～最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療有効量の本発明の抗体コンストラクトは、好ましくは、疾患症状の重症度を低下させるか、疾患症状がない期間の頻度若しくは期間を増加させるか、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害を防止する。標的細胞の抗原発現腫瘍の治療に関して、治療有効量の本発明の抗体コンストラクト、例えば抗標的細胞抗原／抗ＣＤ３抗体コンストラクトは、好ましくは、細胞増殖又は腫瘍増殖を未治療の患者と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、有効性を予測する動物モデルにおいて評価され得る。
医薬組成物は、１回の治療で投与することも、又は必要に応じて抗癌療法などの追加治療、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と併用して投与することもできる。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明の抗体コンストラクトを含む組成物と同時に投与され得るか、又は前記抗体コンストラクトの投与前若しくは投与後に既定の時間間隔及び用量で別々に投与され得る。
本明細書で使用する場合、用語「有効且つ非毒性用量」は、重大な毒性作用を生じさせずに又は本質的に生じさせずに、病的細胞の激減、腫瘍の除去、腫瘍の縮退又は疾患の安定化をもたらすのに十分である、本発明の抗体コンストラクトの許容用量を指す。そのような有効且つ非毒性用量は、例えば、当技術分野で記載されている用量漸増試験によって決定され得、その用量は、重篤な有害副事象を誘発する用量未満であるべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。
本明細書で使用する場合、用語「毒性」は、有害事象又は重篤な有害事象として現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副事象は、全身的な薬物忍容性の欠如及び／又は投与後の局所的な忍容性の欠如を指す場合がある。毒性は、その薬物によって引き起こされる催奇性作用又は発癌性作用も含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、投与直後に（局所忍容性）及びより長期の薬物適用期間中に重篤な有害事象を誘発しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、例えば、治療中及び経過観察期間中に定期的に評価することができる。測定値は、臨床評価、例えば臓器の所見及び臨床検査値異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、ＮＣＩ－ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ標準に従って正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の所見は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準を含み得る。試験され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿検査並びに他の体液、例えば血清、血漿、リンパ液又は脊髄液、髄液などの検査を含む。したがって、安全性は、例えば、身体検査、画像化技術（すなわち超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的デバイスを用いた他の計測（すなわち心電図）、バイタルサインにより、検査パラメータを測定し、有害事象を記録することにより評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法において、チンパンジーではない霊長類における有害事象は、組織病理学的方法及び／又は組織化学的方法により試験され得る。
上記の用語は、例えば、１９９７年７月１６日のＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ６；ＩＣＨ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｍｅｅｔｉｎｇでも参照されている。
最後に、本発明は、本発明の抗体コンストラクト、本発明の方法に従って作製された抗体コンストラクト、本発明の医薬組成物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター及び／又は本発明の宿主細胞を含むキットを提供する。
本発明に関連して、用語「キット」は、２つ以上の構成要素がコンテナ、容器又は他にまとめて梱包されており、構成要素の１つが本発明の抗体コンストラクト、医薬組成物、ベクター又は宿主細胞に相当するものを意味する。したがって、キットは、単品として販売することができる特定の目的を達成するのに十分な製品及び／又は用具の一式であると説明することができる。
キットは、投与に適した投与量（上記を参照されたい）の本発明の抗体コンストラクト又は医薬組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ及び材質（好ましくは防水性、例えばプラスチック又はガラス）の１つ以上の容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含み得る。キットは、（例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態の）使用のための指示書、本発明の抗体コンストラクトを投与するための手段、例えばシリンジ、ポンプ、インフューザーなど、本発明の抗体コンストラクトを再構成するための手段及び／又は本発明の抗体コンストラクトを希釈するための手段をさらに含み得る。
本発明は、単回用量投与単位のためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥／凍結乾燥された抗体コンストラクトを含む第１の容器及び水性製剤を含む第２の容器も含み得る。本発明のある種の実施形態では、単一チャンバー及び多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及び溶解シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
本発明の医薬組成物は、緩衝液をさらに含み、それは、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタミン酸塩、酢酸塩及びこれらの混合物、特にリン酸カリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、グルタミン酸塩、酢酸塩及びこれらの組み合せからなる群から選択され得る。
好適な緩衝液濃度は、約２００ｍＭ以下、例えば約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０又は５ｍＭの濃度を包含する。当業者であれば、本明細書に記載される医薬組成物の安定性をもたらすために容易に緩衝液濃度を調整することができるであろう。本発明の医薬組成物において想定される緩衝液濃度は、具体的には約５～約２００ｍＭ、好ましくは約５～約１００ｍＭ及びより好ましくは約１０～約５０ｍＭの範囲である。
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、それを必要とする患者への投与に好適な組成物に関する。用語「対象」、又は「個体」、又は「動物」、又は「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の医薬組成物の投与が望ましい任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれ、ヒトが好ましい。本発明の医薬組成物は、安定であり、且つ薬学的に許容されるものであり、すなわち医薬組成物が投与される対象においていかなる望ましくない局所的又は全身的な作用も引き起こすことなく所望の治療効果を引き出すことができる。本発明の薬学的に許容される組成物は、特に無菌であり、且つ／又は薬学的に不活性であり得る。具体的には、用語「薬学的に許容される」は、動物における使用及びより特定するとヒトにおける使用のための、規制当局又は他の一般に認識されている薬局方によって承認されていることを意味し得る。
本発明の医薬組成物は、好ましくは、治療有効量の１つ又は複数の本明細書に記載の二重特異性単鎖抗体コンストラクト、β－シクロデキストリン及び緩衝液を含む。「治療有効量」は、所望の治療効果を引き出す前記コンストラクトの量を意味する。治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）によって決定することができる。治療効果と毒性作用との間の用量比は、治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表現することができる。大きい治療指数を示す医薬組成物が一般に好ましい。
組成物は、β－シクロデキストリン及び前に記載された緩衝液を含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載の有利な特性、特に安定性を低減するか又は消失させない限り、任意選択的に１つ以上のさらなる賦形剤を含み得る。
賦形剤は、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的又は生物学的特性の調整及び／又はさらに有効性を向上させ、且つ／若しくはこのような製剤をさらに安定化するための本発明の方法並びに例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与中及びこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び損傷に対する方法など、広範囲の目的のために本発明で使用することができる。用語「賦形剤」は、概して、充填剤、結合剤、崩壊罪、コーティング、吸着剤、付着防止剤、滑剤、保存剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、甘味剤、溶媒、共溶媒、緩衝化剤、キレート剤、粘性付与剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定剤及び浸透圧調節剤を含む。
医薬組成物の異なる賦形剤（例えば、上記に列挙したもの）が異なる効果を有し得ることは、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は、緩衝液、安定化剤及び／又は抗酸化剤として作用することができ；マンニトールは、充填剤及び／又は等張性増強剤として作用することができ；塩化ナトリウムは、送達ビヒクル及び／又は等張性増強剤として作用することができるなどである。
ポリオールは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質を物理的及び化学的な劣化プロセスから保護する有用な安定剤であり、また製剤の浸透圧調整にも有用である。ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロース及びソルビトール並びに多価アルコール、例えばグリセロール及びプロピレングリコール並びに本明細書での議論を目的としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。マンニトールは、凍結乾燥製剤におけるケークの構造安定性を確保するために一般的に使用されている。マンニトールは、ケークの構造安定性を確保する。一般に、これは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースとともに使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための薬剤及び輸送中又は製造工程でのバルク調製時の凍結解凍ストレスから保護するための安定化剤として一般的に使用される。ＰＥＧは、タンパク質の安定化に有用であり、また凍結保護物質としても有用である。
界面活性剤は、慣例的に、表面吸着の防止、最小化又は低減に使用される。タンパク質分子は、表面への吸着並びに気体－液体界面、固体－液体界面及び液体－液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいことがある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、一般に、タンパク質濃度と反比例し、通常、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。一般的に使用される界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル及びポロキサマー１８８が挙げられる。界面活性剤は、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般に使用される。任意の所与の界面活性剤は、通常、一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するため、この点において、界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化劣化を起こしやすく、多くの場合、供給されるとき、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。したがって、ポリソルベートは、注意して使用すべきであり、使用時には最小影響濃度で用いなければならない。
抗酸化剤は、適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することにより、且つ光への暴露を回避することにより、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止することができる。抗酸化賦形剤を、タンパク質の酸化劣化を防止するためにも同様に使用することができる。この点で特に有用な抗酸化剤には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤及びキレート剤が含まれる。治療用タンパク質製剤に使用するための抗酸化剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。ＥＤＴＡが有用な例である。
金属イオンは、タンパク質補因子として作用することができ、タンパク質配位錯体の形成を可能にする。金属イオンは、タンパク質を分解するいくつかの過程も阻害することができる。しかしながら、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程も触媒する。マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化することができ、これは、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化されることがあり、その凝集は、Ａｌ＋３イオンによって増大し得る。
保存剤の主要な機能は、微生物の増殖の阻害であり、製剤の有効期間又は使用期間にわたって製品の無菌性を確保し、特に複数回用量製剤に対して必要とされる。一般に使用される保存剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ－クレゾールが挙げられる。保存剤は、低分子の非経口薬との使用において長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これがタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかしながら、複数回用量製剤が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。保存処理された製剤の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。
予想されるとおり、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥され、使用時に保存剤を含有する希釈剤で再構成することができる。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、保存剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８～２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、保存剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証される必要がある。
塩は、例えば、医薬組成物のイオン強度及び／又は等張性を調整し、且つ／又は抗体コンストラクト若しくは他の成分の可溶性及び／若しくは物理的安定性をさらに向上させるために本発明に従って使用され得る。よく知られているとおり、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、且つタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力及び反発相互作用の強度を低減することにより、天然状態のタンパク質を安定化することができる。イオンは、特にタンパク質の変性ペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化することもできる。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによりタンパク質の凝集及び不溶化を防止又は低減することもできる。イオン種によってタンパク質に及ぼすそれらの効果は、異なる。イオン及びタンパク質に対するその効果の分類上の順位付けが多数立案されており、これを本発明による医薬組成物の製剤化に使用することができる。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化する溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化する溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性及び／又は可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果により、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。
遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤及び抗酸化剤として並びに他の標準的用途として、医薬組成物中で使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥において適切なケークの構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
医薬組成物の製剤化に特に有用な賦形剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック及びこれらの組み合わせが挙げられる。前記賦形剤は、組成物が本明細書で例示される所望の特性を示し、特に含有されている二重特異性単鎖抗体コンストラクトの安定化を促進する限り、種々の濃度で医薬組成物中に存在し得る。例えば、スクロースは、医薬組成物中に２％（ｗ／ｖ）～１２％（ｗ／ｖ）の濃度、すなわち１２％（ｗ／ｖ）、１１％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）又は２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。好ましいスクロース濃度は、４％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは６％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。ポリソルベート８０は、医薬組成物中に０．００１％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）の濃度、すなわち０．５％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００８％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、０．００２％（ｗ／ｖ）又は０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。好ましいポリソルベート８０濃度は、０．００２％（ｗ／ｖ）～０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）～０．０２％（ｗ／ｖ）の範囲である。
医薬組成物の製剤化に有用な保存剤としては、一般に、抗菌薬（例えば、抗細菌薬又は抗真菌薬）、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられ；例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素である。抗菌保存剤は、微生物の増殖を低減することにより薬の有効期間を延長するために使用される物質である。本発明の医薬組成物の製剤化に特に有用な保存剤としては、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタ－クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン、チオメロサールが挙げられる。これらの保存剤を使用するための構造及び典型的濃度は、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９６（１２），３１５５の表１に記載されている。
前述の保存剤は、種々の濃度で医薬組成物中に存在し得る。例えば、ベンジルアルコールは、０．２～１．１％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度、クロロブタノールは、０．３～０．５％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度、フェノールは、０．０７～０．５％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度、メタ－クレゾールは、０．１７～０－３２％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度、又はチオメロサールは、０．００３～０．０１％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で存在し得る。メチルパラベンの好ましい濃度は、０．０５～０．５％（ｖ／ｖ）の範囲であり、フェノキシエタノールについて０．１～３％（ｖ／ｖ）の範囲であり、プロピルパラベンについて０．０５～０．５％（ｖ／ｖ）の範囲である。
しかしながら、医薬組成物がいかなる保存剤も含まないことも考えられる。特に、本明細書では、とりわけ、保存剤を含まない医薬組成物であって、約６．０のｐＨで約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の二重特異性単鎖抗体コンストラクト、約１％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル－β－シクロデキストリンナトリウム塩、約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウム並びにさらに約８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含む医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば固体、液体、凍結、気体又は凍結乾燥の形態で製剤化することができ、とりわけ軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアロゾル、顆粒剤、丸剤、懸濁液、エマルジョン、カプセル、シロップ剤、液体、エリキシル剤、抽出物、チンキ又は流エキスの形態であり得る。
一般に、本発明の医薬組成物に関して、とりわけ、意図される投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて様々な保管形態及び／又は剤形が考えられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（２０１２）を参照されたい）。当業者であれば、このような特定の剤形の選択は、例えば、本発明の抗体コンストラクトの物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得ることを認識するであろう。
例えば、医薬組成物中の主なビヒクル又は担体は、本質的に水性又は非水性であり得る。好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水も例示的なビヒクルである。
非経口投与が企図される場合、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の抗体コンストラクトを含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、抗体コンストラクトは、その中で適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。製剤は、デポ注射を介して送達できる産物の制御放出又は持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームと、所望の分子との製剤を含み得る。循環中での持続時間を向上させる効果を有するヒアルロン酸も使用される場合がある。移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の抗体コンストラクトを導入し得る。
持続性又は制御性の送達／放出製剤も本明細書で想定される。様々な他の持続性又は制御性の送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子又は多孔ビーズ及びデポ注射を製剤化する技術も当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第９３／００８２９号明細書を参照されたい。持続放出性製剤は、成形物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書に開示される）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。持続放出性組成物は、当技術分野で知られるいくつかの方法のいずれかによって作製可能なリポソームも含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；同第０８８，０４６号明細書及び同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。抗体コンストラクトは、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにも封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（２０１２）に開示されている。
インビボ投与に用いられる医薬組成物は、通常、滅菌製剤として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通した濾過によって行うことができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前後のいずれに実施され得る。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液中に保存することができる。非経口組成物は、一般に、滅菌したアクセスポートを有するコンテナ、例えば皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静注液バッグ又はバイアル中に入れられる。
本明細書で開示される抗体コンストラクトは、免疫リポソームとしても製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質の配置と同様に二層構造で配置される。抗体コンストラクトを含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書；並びに国際公開第９７／３８７３１号パンフレットに記載される、当技術分野で知られる方法によって調製される。循環時間が長くなったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法によって作製することができる。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームを、所定の孔径のフィルターを通して押し出す。本発明の抗体コンストラクトのＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応により、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６－２８８（１９８２）に記載されるとおりに、リポソームにコンジュゲートすることができる。任意選択的に、化学療法剤がリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
本発明の組成物は、本明細書で定義される二重特異性単鎖抗体コンストラクトに加えて、組成物の使用目的に応じてさらなる生物学的に活性な薬剤を含む場合があることが想定される。このような薬剤は、特に腫瘍及び／又は悪性細胞に作用する薬物であり得るが、医薬組成物の使用目的に応じて他の活性剤も考えられ、これには、当技術分野において知られる胃腸系に作用する薬剤、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に作用する薬物及び／又はサイトカインなどの薬剤が含まれる。また、本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち別の抗癌薬と併用して適用されることも想定される。
医薬組成物を製剤化した後、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存し得る。このような製剤は、使用準備済の形態又は投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥）形態で保存され得る。例えば、凍結乾燥組成物を、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤で再構成し得る。
本発明の医薬組成物は、概して、任意の好適な投与経路による送達のために製剤化され得る。本発明に関連して、投与経路としては、局所経路（例えば、皮膚上、吸入、鼻、点眼、耳介／耳、膣、粘膜）；経腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射などの注射又は持続注入などの注入による非経口投与、例えば皮下又は静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与され得る。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。
本発明の医薬組成物はまた、中断することなく投与され得る。非限定的な例として、中断のない又は実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への抗体コンストラクトの流入を調整するための、患者により装着される小型ポンプシステムによって実現され得る。医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与することができる。そのようなポンプシステムは、一般に当技術分野で知られており、通常、注入する治療薬を含有するカートリッジの定期交換に依拠する。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、交換時以外には中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が結果として生じる場合がある。そのような場合でも、カートリッジ交換前の投与段階及びカートリッジ交換後の投与段階はなお、ともにこのような治療薬の「中断のない投与」を構成する本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内と見なされるであろう。
本発明の医薬組成物の連続投与又は中断のない投与は、流体をレザバーから送り出すための流体送出機構及び送出機構を駆動するための駆動機構を含む、流体送達デバイス又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与であり得る。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚に穿通し、好適な組成物を患者体内に送達するための針又はカニューレを含み得る。前記ポンプシステムを、静脈、動脈又は血管を問わず、患者の皮膚に直接固定又は装着することでポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることが可能になる。このポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間～数日間装着することができる。レザバーの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のためのレザバーの容積は、０．１～５０ｍｌであり得る。
連続投与は、皮膚に装着され時折交換されるパッチによって経皮的にも行われ得る。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、例えば、第１の使用済みパッチの直接隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流入の中断又は電池故障の問題は生じない。
当業者であれば、本発明の医薬組成物は、概して前述の賦形剤又は追加の活性剤のいずれかを含み得るか、又は安定であり且つ好ましくは付属の実施例で評価されているβ－シクロデキストリンを含む医薬組成物と同じ有利な特性を示す限り、任意の好適な形態で提供され得ることを容易に理解するであろう。当業者であれば、安定である医薬組成物、すなわち好ましくは内部に含まれる二重特異性単鎖抗体フラグメントの凝集体及び／又は立体構造異性体を実質的に含まない医薬組成物を提供するように様々な成分を容易に調整できるであろう。
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」に対する参照は、１つ以上のこのような種々の試薬を含み、「方法」に対する参照は、本明細書に記載される方法のために改変され得るか又は本明細書に記載される方法と置換され得る、当業者に知られる均等な工程及び方法に対する参照を含む。
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者であれば、単なる通例的な実験により、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識することになるか又は確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含されるものとする。
用語「及び／又は」は、本明細書のいずれの場所で使用される場合でも、「及び」、「又は」及び「前記用語によって接続される要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用する場合、用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内及びより好ましくは５％以内を意味する。ただし、この用語は、具体的な数字も含み、例えば、約２０は、２０を含む。
用語「～未満」又は「～より大きい」は、具体的な数字を含む。例えば、２０未満は、未満又はそれに等しいことを意味する。同様に、～を超える又は～より大きいは、それぞれ～を超える若しくはそれに等しい、又は～より大きい若しくはそれに等しいことを意味する。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」などのバリエーションは、述べられる整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、用語「含む」は、用語「含有する」若しくは「包含する」又は本明細書で使用する場合にはときに用語「有する」とも置き換えることができる。
本明細書で使用する場合、「～からなる」は、請求項の要素で特定されていない任意の要素、工程又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「～から本質的になる」は、請求項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。
本明細書では、各場合において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれかを他の２つの用語のいずれかに置き換え得る。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬及び物質などに限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するように意図されてはおらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
本明細書の本文全体において引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってこのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾又は一致しない限り、本明細書は、いかなるこのような資料よりも優先される。
本発明及びその利点のより適切な理解が以下の実施例から得られることになるが、本実施例は、例示目的で提供されるにすぎない。本実施例は、決して本発明の範囲を限定するように意図されていない。
実施例１：
カノニカルなＥＧＦＲｖＩＩＩ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトをｐＨ７．０又はｐＨ４．０のいずれかの緩衝液中に準備し、それぞれＤＳＣにかけた。抗体コンストラクトのＤＳＣ融解温度を単一の融解現象として得た。ｐＨ７でのＴｍは、６５℃であった一方、ｐＨ４でのＴｍは、５９．５℃であり、すなわち中性媒体中より低かった（図３のサーモグラムを参照されたい）。一般に、Ｔｍが高いほど化合物の安定性が高いことを意味する。
実施例２：
それぞれＣＤＨ１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ３３及びＣＤ１９に対する第１の標的ドメインを有する精製された標準的又はｓｃＦｃとして提供されたＢｉＴＥ抗体コンストラクトを含有する予め製剤化された原体を、１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用した限外濾過／ダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。高濃度の原液を加えることによって最終製剤を得た。各コンストラクトについて得られた製剤は、ｐＨ６．０において２０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ Ｌ－アルギニン塩酸塩、６％（ｗ／Ｖ）トレハロース二水和物、０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０で構成されるＫ６０ＲＴｒＴ及びｐＨ４．０において１０ｍＭグルタミン酸塩、４％（ｗ／Ｖ）マンニトール、２％（ｗ／Ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０で構成されるＧ４０ＭＳｕＴである。タンパク質濃度は、合計１．０ｍｇ／ｍＬになった。１９５０μＬの各試験溶液に５０μＬの１０００ｐｐｍシリコン標準溶液（ＡｌｆａＡｅｓａｒのＳｐｅｃｐｕｒｅ，Ａｒｔ．Ｎｏ．３８７１７）をスパイクして、２５ｐｐｍのスパイクを得た。スパイクされていない試験溶液は、対照試料としての役割を果たした。スパイクされた試験溶液及び対照試料を３ｃｃのＩ型ガラスバイアルに充填し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＨＭＷＳの量を定量するために全ての試料をＳＥ－ＵＰＬＣにより分析した。結果として、図４（ａ）は、ｐＨ４及びｐＨ６において測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ抗体コンストラクトの高分子量種の割合を示す。低い方の４．０のｐＨでより少ない凝集が見られる。図４（ｂ）は、３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて４℃（時点Ｔ０、２ｗ、４ｗ）、２５℃（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）及び３７Ｃ（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥのメインピークの割合を示す：Ｇ４ＳｕＴは、１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％ポリソルベート８０を含み、Ｇ４ＴｒＴは１０ｍＭグルタミン酸塩、９％（ｗ／ｖ）トレハロース、０．０１％ポリソルベート８０を含み、且つＧ４ＭＳｕＴは１０ｍＭグルタミン酸塩、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、２％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０を含む。安定性は、ｐＨ４で実証された。それぞれの抗体コンストラクト製剤を安定性のモニタリングのために様々な条件で保存した。図４（ｃ）は、３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて－２０℃（Ｔ０、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥのメインピークの割合を示す。図４（ｄ）は、３種の異なる製剤：Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて４Ｃ（Ｔ０、２ｗ、４ｗ）、２５℃（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）及び３７℃（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥの高分子量（ＨＭＷ）ピークの割合を示す。図４（ｅ）は、３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて－２０℃（Ｔ０、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥのＨＭＷピークの割合を示す。図４（ｆ）は、３種の異なる製剤 － Ｇ４ＳｕＴ、Ｇ４ＴｒＴ及びＧ４ＭＳｕＴにおいて４Ｃ（Ｔ０、２ｗ、４ｗ）、２５Ｃ（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）及び３７Ｃ（Ｔ０、１ｗ、２ｗ、４ｗ）でのＳＥＣによって測定されたＣＤＨ１９ ｓｃＦｃ ＢｉＴＥの低分子量ピークの割合を示す。図５は、６ヶ月後のｐＨ範囲４～７の様々な緩衝液中におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ非ｓｃＦＣ抗体コンストラクトのメインピークの割合を示す。ｐＨ４．０において、抗体コンストラクトは、最も高いメインピークの割合を有する。図６：（ａ）は、４℃における異なる製剤における異なる濃度でのＣＤ３３－ｓｃＦｃ抗体コンストラクトのメインピークの割合を示す。「ｃｃＨＦＣ」は、特異的に改変されてｃｙｓで固められたｓｃＦｃドメインを意味する。低ｐＨ製剤は、一貫してより多くの単量体種を有する。（ｂ）は、２５℃における異なる製剤における異なる濃度でのＣＤ３３－ｓｃＦｃ抗体コンストラクトのメインピークの割合を示す。「ｃｃＨＦＣ」は、より多くの単量体種を一貫して有する特異的に改変されてｃｙｓで固められたｓｃＦｃドメインの低ｐＨ製剤を意味する。図７：Ｔ０、７日目、１４日目及び１ヶ月目でｐＨに応じてＳＥＣによって測定されたカノニカルな（非ＨＬＥ）ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの凝集の割合である。図は、低ｐＨでの凝集量が劇的に低くなることを実証している。
実施例３：ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトを、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製した。ＳＥＣ溶出液は、ｐＨ５．０の２０ｍＭクエン酸及び２％（ｗ／ｖ）トレハロース二水和物中の０．４３ｍｇ／ｍＬ ＥＧＦＲｖＩＩＩを含有した。この材料を３つの画分に分けた。第１の画分は、ｐＨ５．０に維持した。他の画分のｐＨは、それぞれ６．０及び７．０に調整した。全ての画分を、０．２μｍの孔径を有するフィルターに通して濾過した。各画分は、最終的に高濃度賦形剤の原液でスパイクすることによって製剤化された。最終製剤の概要を表４に提供する。各製剤におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬに等しかった。製剤を２Ｒ Ｉ型ガラスバイアルにおいて１．０ｍＬに充填し、これをブチルゴムの栓及びアルミニウムのフリップオフシールで閉じた。
Figure 0007189141000004
製剤を２５℃で４日間保存し、続いて３５０ｎｍでの光学密度測定、サイズ排除超高速クロマトグラフィー及び弱陽イオン交換（ＷＣＸ）クロマトグラフィーによって分析した。３５０ｎｍでの光学密度は、ＴｅｃａｎのＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して９６ウェルプレートにおいて測定した。凝集指数（ＡＩ）は、以下の式を使用して計算された。
ＡＩ＝ＯＤ３５０ｎｍ／（ＯＤ２８０ｎｍ－ＯＤ３５０ｎｍ）
ＳＥＣを利用して、ストレス後の各製剤中の高分子量種（ＨＭＷＳ）の含有割合及びタンパク質濃度を決定した。ＳＥ－ＵＰＬＣは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ １５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＡｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施した。カラム温度を２５℃に設定した。サイズバリアントの分離は、０．４ｍＬ／分の流速で均一溶媒法を適用することによって行われた。移動相は、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．８で構成された。実行時間は、合計で６．０分である。試料は、分析までオートサンプラー内において８℃で保持された。総量３μｇのタンパク質を注入した。キャリーオーバーを回避するために、各試料後に４０％ＡＣＮによる中間注入を実施した。ＨＭＷＳの定量化のために、検出は、蛍光（２８０ｎｍでの励起、３２５ｎｍでの発光）に基づいた。タンパク質濃度の決定のために、２８０ｎｍでのフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）を介する検出を使用した。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用してピークの積分を実施した。ＨＭＷＳの相対的な曲線下面積を報告した。
ＷＣＸクロマトグラフィーは、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐａｋ Ｈｉ Ｒｅｓ ＣＭ ７μｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ．カタログ番号１８６００４９２９）を使用してＡｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施した。カラム温度を３０℃に設定した。荷電バリアントの分離は、０．６５ｍＬ／分の流速で表５に示される勾配法を適用することによって行われた。移動相Ａ及びＢは、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５及び２０ｍＭリン酸ナトリウムで構成された。
Figure 0007189141000005
試料は、分析までオートサンプラー内において８℃で保持された。５μｇのタンパク質をカラムに注入した。試料を移動相Ａで事前に希釈した。キャリーオーバーを回避するために、各試料後に４０％ＡＣＮによる中間注入を実施した。検出は、蛍光（Ｅｘ ２８０ｎｍ、Ｅｘ ３２５ｎｍ）に基づいた。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用してピークの積分を実施した。メインピーク（天然種）の相対的な曲線下面積（ＡＵＣ）を報告した。
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（Ｓｔａｔｓｏｆｔ）を使用して、測定された凝集指数、ＨＭＷＳの含量割合、タンパク質濃度及びＷＣＸメインピークの存在量に対する上記製剤化パラメータの影響を統計的に評価した。予測値及び有用性に関するプロファイルを図８に記載する。低い凝集指数、少ないＨＭＷＳ、高いタンパク質濃度及び高いメインピークの割合のために最適な製剤化を図る。図８によって示されるとおり、Ｌ－アルギニンの使用、高濃度のＰＳ８０及び低ｐＨ値での製剤化によって有用性が最大化される。
実施例４
メソセリン（ＭＳＬＮ）－ｓｘＦｃ ＢｉＴＥ抗体コンストラクトは、プロテインＡ、陽イオン交換（ＣＥＸ）及びヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを使用して精製された。次に、ＨＡ溶出液を、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を使用して予備製剤化した。高濃度賦形剤の原液をスパイクすることによって最終製剤を得た。試験製剤の概要を表６に提供する。
Figure 0007189141000006
上記製剤を２Ｒ Ｉ型ガラスバイアルにおいて１．３ｍＬに充填し、これをブチルゴムの栓及びアルミニウムのフリップオフシールで閉じた。製剤を－２０℃、２５℃及び３７℃で最大４週間並びに２～８℃で最大１５週間保存した。試料を指定の時点で取り出した。さらに、試料を５回の連続した凍結融解サイクル（０．３Ｋ／分で２０℃－＞－５０℃－＞２０℃、目的の温度で１時間保持）にかけた。試料をサイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）及びペプチドマッピング（ストレスを受けていない試料及び３７℃で保存された試料についてのみ）によって分析した。
ＳＥ－ＵＰＬＣは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ １５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＡｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施した。カラム温度を２５℃に設定した。サイズバリアントの分離は、０．４ｍＬ／分の流速で均一溶媒法を適用することによって行われた。移動相は、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．８で構成された。実行時間は、合計で６．０分である。試料は、分析までオートサンプラー内において８℃で保持された。総量３μｇのタンパク質を注入した。キャリーオーバーを回避するために、各試料後に４０％ＡＣＮによる中間注入を実施した。検出は、蛍光（２８０ｎｍでの励起、３２５ｎｍでの発光）に基づいた。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用してピークの積分を実施した。ＨＭＷＳの相対的な曲線下面積を報告した（図９）。
熱ストレス（３７℃でのインキュベーション）時の化学修飾の存在量をペプチドマッピングによって観測した。タンパク質試料を酵素的に消化し、得られたペプチドを、逆相クロマトグラフィーを使用して分離した。ペプチドの同定及び定量化のために、カラム溶出液を質量分析計のイオン源に直接注入した。
カバレッジを最大化するために、トリプシンによって１回及びキモトリプシンによって１回の、２つの別々の酵素消化を実施した。それぞれの場合にタンパク質を塩酸グアニジウムで変性させ、続いてジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した。ＤＴＴ中でのインキュベーション後、遊離システイン残基をヨード酢酸の添加によってアルキル化した。続いて、消化のために試料を５０ｍＭトリスｐＨ７．８に緩衝液交換した。トリプシン及びキモトリプシンをそれぞれ１：１０（試料：酵素）の比で別々の反応チューブに加えた。試料を３７℃で３０分間消化し、トリフルオロ酢酸の添加によって反応をクエンチした。
５μｇの量の各消化物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸（ＦＡ）で平衡化したＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ＃８５９７００－９０２）逆相カラムに別々に注入した。０．１％ＦＡを含有する最大９０％アセトニトリルまでの１５６分間の勾配を使用して、ペプチドをＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のエレクトロスプレーイオン源に直接溶出させた。データは、フルスキャン（分解能７００００；走査範囲２００～２０００ｍ／ｚ）後に１２個の最も豊富なイオンの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）（分解能１７５００）を行う上位１２個の方式を用いてデータ依存的な様式で取得した。
ペプチドを、内製のソフトウェアを用いて精密質量及びタンデム質量スペクトルに基づいて同定した。同定は、手動で検証された。修飾及び非修飾ペプチドの相対量を、Ｐｉｎｐｏｉｎｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてイオン存在量に基づいて計算した。
相補性決定領域（ＣＤＲ）及び半減期延長部分の化学修飾の割合がエラーで参照元が見つからない７に示されている。
図９において実証されるとおり、ＨＭＷＳの存在量は、ＭＳＬＮ－ｓｃＦｃがｐＨ４．０で製剤化される場合、ｐＨ６．０又はｐＨ７．０での製剤と比較して有意に減少する。表７は、３７℃で２週間の保管後の製剤の機能に応じた化学修飾の概要を提供する。
表７に概要が示されるとおり、ＭＬＳＮ－ｓｃＦｃは、ｐＨ４．０で製剤化される場合、ｐＨ６．０又はｐＨ７．０と比較して化学修飾を受けにくい。
Figure 0007189141000007
実施例５
ＣＤ３３ｃｃ－ｓｃＦｘ ＢｉＴＥ抗体コンストラクトを、プロテインＡ、陽イオン交換（ＣＥＸ）及びヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを使用して精製した。次に、ＨＡ溶出液を限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を使用して予備製剤化した。高濃度賦形剤の原液をスパイクすることによって最終製剤を得た。試験製剤の概要を表８に提供する。
Figure 0007189141000008
上記製剤を２Ｒ Ｉ型ガラスバイアルにおいて１．３ｍＬに充填し、これをブチルゴムの栓及びアルミニウムのフリップオフシールで閉じた。製剤を－２０℃、２～８℃、２５℃及び３７℃で最大４週間保存した。試料を指定の時点で取り出した。さらに、試料を５回の連続した凍結融解サイクル（０．３Ｋ／分で２０℃－＞－５０℃－＞２０℃、目的の温度で１時間保持）にかけた。試料をサイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）及びペプチドマッピング（ストレスを受けていない試料及び３７℃で保存された試料についてのみ）によって分析した。
ＳＥ－ＵＰＬＣは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ １５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＡｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施した。カラム温度を２５℃に設定した。サイズバリアントの分離は、０．４ｍＬ／分の流速で均一溶媒法を適用することによって行われた。移動相は、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．８で構成された。実行時間は、合計で６．０分である。試料は、分析までオートサンプラー内において８℃で保持された。総量３μｇのタンパク質を注入した。キャリーオーバーを回避するために、各試料後に４０％ＡＣＮによる中間注入を実施した。検出は、蛍光（２８０ｎｍでの励起、３２５ｎｍでの発光）に基づいた。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用してピークの積分を実施した。ＨＭＷＳの相対的な曲線下面積を報告した（図１０）。
熱ストレス（３７℃でのインキュベーション）時の化学修飾の存在量をペプチドマッピングによって観測した。タンパク質試料を酵素的に消化し、得られたペプチドを、逆相クロマトグラフィーを使用して分離した。ペプチドの同定及び定量化のために、カラム溶出液を質量分析計のイオン源に直接注入した。
カバレッジを最大化するために、トリプシンによって１回及びキモトリプシンによって１回の、２つの別々の酵素消化を実施した。それぞれの場合にタンパク質を塩酸グアニジウムで変性させ、続いてジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した。ＤＴＴ中でのインキュベーション後、遊離システイン残基をヨード酢酸の添加によってアルキル化した。続いて、消化のために試料を５０ｍＭトリスｐＨ７．８に緩衝液交換した。トリプシン及びキモトリプシンをそれぞれ１：１０（試料：酵素）の比で別々の反応チューブに加えた。試料を３７℃で３０分間消化し、トリフルオロ酢酸の添加によって反応をクエンチした。
５μｇの量の各消化物を、０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸（ＦＡ）で平衡化したＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ＃８５９７００－９０２）逆相カラムに別々に注入した。０．１％ＦＡを含有する最大９０％アセトニトリルまでの１５６分間の勾配を使用して、ペプチドをＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のエレクトロスプレーイオン源に直接溶出させた。データは、フルスキャン（分解能７００００；走査範囲２００～２０００ｍ／ｚ）後に１２個の最も豊富なイオンの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）（分解能１７５００）を行う上位１２個の方式を用いてデータ依存的な様式で取得した。
ペプチドを、内製のソフトウェアを用いて精密質量及びタンデム質量スペクトルに基づいて同定した。同定は、手動で検証された。修飾及び非修飾ペプチドの相対量を、Ｐｉｎｐｏｉｎｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてイオン存在量に基づいて計算した。
相補性決定領域（ＣＤＲ）及び半減期延長部分の化学修飾の割合がエラーで参照元が見つからない９に示されている。
図１０において実証されるとおり、ＨＭＷＳの存在量は、ＣＤ３３ｃｃ－ｓｃＦｃがｐＨ４．０で製剤化される場合、ｐＨ６．０又はｐＨ７．０と比較して有意に減少する。表７は、３７℃で２週間の保管後の製剤の機能に応じた化学修飾の概要を提供する。
表９に概要が示されるとおり、ＣＤ３３ｃｃ－ｓｃＦｃは、ｐＨ４．０で製剤化される場合、ｐＨ６．０又はｐＨ７．０と比較して化学修飾を受けにくい。
Figure 0007189141000009
実施例６：
それぞれ精製されたＭＳＬＮ－ｈＡＬＢ、ＭＳＬＮ－ｈＦｃ及びＭＳＬＮ－ｓｃＦｃを含有する予め製剤化された原体を、１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用した限外濾過／ダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。高濃度の原液を加えることによって最終製剤を得た。各コンストラクトについて得られた製剤は、ｐＨ６．０において２０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ Ｌ－アルギニン塩酸塩、６％（ｗ／Ｖ）トレハロース二水和物、０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０で構成されるＫ６０ＲＴｒＴ及びｐＨ４．０において１０ｍＭグルタミン酸塩、４％（ｗ／Ｖ）マンニトール、２％（ｗ／Ｖ）スクロース、０．０１％（ｗ／Ｖ）ポリソルベート８０で構成されるＧ４０ＭＳｕＴである。ＭＳＬＮ－ｈＡＬＢは、Ｋ６０ＲＴｒＴ中で製剤化され、ＭＳＬＮ－ｓｃＦｃは、Ｋ６０ＲＴｒＴ及びＧ４０ＭＳｕＴ中で製剤化された。タンパク質濃度は、合計１．０ｍｇ／ｍＬになった。１９５０μＬの各試験溶液に５０μＬの１０００ｐｐｍシリコン標準溶液（ＡｌｆａＡｅｓａｒのＳｐｅｃｐｕｒｅ，Ａｒｔ．Ｎｏ．３８７１７）をスパイクして、２５ｐｐｍのスパイクを得た。スパイクされていない試験溶液は対照試料としての役割を果たした。スパイクされた試験溶液及び対照試料を３ｃｃのＩ型ガラスバイアルに充填し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＨＭＷＳの量を定量するために、全ての試料を、実施例４に記載される方法に従ってＳＥ－ＵＰＬＣにより分析した（表１０）。Ｋ６０ＲＴｒＴ中で製剤化されるとき、ＭＳＬＮ－ｈＡＬＢ及び－ｓｃＦｃは、シリコンのスパイク時にＨＭＷＳにおいて同様の増加を示した。ｓｃＦｃコンストラクトについて、この増加は、製剤ｐＨを４．０に低下させることによって低減し得ることを示すことができた。予備的な実験によれば、この手法は、５．０以下の製剤ｐＨ値で断片化を受けることが明らかになったため、ＭＬＳＮ－ｈＡＬＢで実行可能ではない。
Figure 0007189141000010
ｓｃＦｃコンストラクトについて、望ましくない高分子量種の増加は、製剤ｐＨを４．０に低下させることによって低減し得ることを示すことができた。予備的な実験によれば、この手法は、５．０以下の製剤ｐＨ値で断片化を受けることが明らかになったため、ＭＬＳＮ－ｈＡＬＢで実行可能ではない。したがって、見出された有利な製剤は、第３のドメインとしてのｓｃＦｃなどの本発明による抗体コンストラクトに特に好適である。
実施例７：
ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化する半減期延長部分を含まない非ＨＬＥ（半減期延長）ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクト（ＢｉＴＥ（登録商標）Ａ）は、ｐＨ４．８の２０ｍＭクエン酸一水和物、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩中で製剤化された。４Ｍの原液を用いて０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの塩化ナトリウムでこの溶液の画分をスパイクした。各画分の濃度を１ｍＬ当たり０．８ｍｇのＢｉＴＥ Ａに調整した。最終溶液を使用準備済の１０Ｒ Ｉ型ガラスバイアルにおいて２．５ｍＬに等分し、これをブチルゴムの栓及びアルミニウムのフリップオフシールで閉じた。これらの溶液を３０℃で１２週間保存し、各種分析法を用いて安定性を評価した。
ＳＥ－ＵＰＬＣを、Ｂｉｏ Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ－ＦＴＮ、Ｂｉｏ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ、タンパク質濃度を決定するためのフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器からなるＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で実施した。クロマトグラフィーによる分離を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ２００ ＳＥＣカラム（充填済み １．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。カラム温度を２５℃に維持した。１００μＬの各試料溶液を、ＰＴＦＥ／シリコンセプタムを伴うガラススクリューネックバイアル（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に充填した。オートサンプラーを８℃で温度管理した。
１回の分析当たり約０．８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で３．８μＬの注入量に相当するカラムにロードされた３μｇ／試料を用いて、試料を二つ組で測定した。ｐＨ６．８の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液及び追加の２５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液の移動相を用いて、０．４ｍＬ／分の流速で均一溶媒条件下において試料の溶出を実施した。チャネルＡにロードされた５００ｍＭリン酸二水素ナトリウム、チャネルＢ上の５００ｍＭリン酸水素ナトリウム、チャネルＣ上の１Ｍ塩化ナトリウム及びチャネルＤ上のＨＰＬＣグレード水を有するシステムにより、ランニング緩衝液を自動で事前に混合した。試料の分析間に１０μＬの４０％アセトニトリルを注入した。各分析の最初、中間及び最後にタンパク質標準を測定してシステムの適合性を確保した。実行時間を６分に設定した。
溶出された試料を、２８０ｎｍの波長で決定されたＵＶ吸収によって検出した。クロマトグラムの取得及び積分を、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて実施した。試料の濃度決定のために曲線下面積（ＡＵＣ）に関してクロマトグラムを分析した。値は、対応する標準偏差を有する三つ組の独立した試料の平均値として与えられる。タンパク質濃度は、以下の式を用いて計算された：
Figure 0007189141000011
 式：ｍＡＵ＊Ｓにおける曲線下面積（ＡＵＣ）値からｍｇ／ｍＬの試料濃度を計算する。パラメータは、表１１において概説される。
Figure 0007189141000012
製剤及び保管時間に応じたＢｉＴＥ（登録商標）Ａ製剤のタンパク質濃度が表１２において示される。タンパク質濃度は、塩化ナトリウムの非存在下で時間が経過しても一定であるが、塩を含有する製剤においてタンパク質の著しい減少が観察された。タンパク質の減少は、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む製剤において最も顕著であった。
Figure 0007189141000013
光遮蔽を適用して、ＢｉＴＥ（登録商標）Ａ製剤内の１０～２５μｍより大きいサブビジブル粒子の量を測定した。光遮蔽測定を、ＨＲＬＤ １５０センサーを備えたＨＩＡＣ ９７０３＋液体粒子計数システム（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で実施した。データの取得及び分析を、対応するＰｈａｒｍＳｐｅｃ ３ソフトウェアを用いて行った。試料分析前にシステム適合性をＥＺＹＴＭ－Ｃａｌ粒径標準５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びＥＺＹＴＭ－Ｃａｌ粒径標準１５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の測定によって検証した。
各試料について、４回の測定を０．２ｍＬ試料体積で１０ｍＬ／分の流速において実施した。最初の分析は、破棄されるため、粒子濃度は、後の３回の測定の平均として得られた。試料測定前及び測定間に空試験を実施した。粒子を含まない水の粒子濃度を決定して、最大量で１０個の粒子／ｍＬ≧２μｍ及び１個の粒子／ｍＬ≧１０μｍを担保する。１０～２５μｍより大きい粒子に関するサブビジブル粒子濃度は、独立した三つ組の平均値として得られる。
表１３は、製剤及び保管時間に応じたＢｉＴＥ（登録商標）Ａ含有製剤に関するサブビジブル粒子の個数を概説している。サブビジブル粒子の個数は、塩化ナトリウムの非存在下で最低であり、時間の経過によりわずかに変化した。塩化ナトリウムの添加により、同等の最初の粒子数が得られた。しかしながら、サブビジブル粒子の量は、塩の存在下で時間の経過とともに著しく増加した。これは、含有する製剤のコロイド安定性が塩化ナトリウムの非存在下で向上することを実証している。
Figure 0007189141000014
ＢｉＴＥ（登録商標）Ａ含有製剤をナノ示差走査熱量測定（ｎａｎｏＤＳＦ）によって熱的に分析した。各様に製剤化されたＢｉＴＥ（登録商標）Ａ製剤のアンフォールディング及び凝集挙動を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８機器（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び対応するＰＲＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌソフトウェア（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観測した。タンパク質がアンフォールディングする温度Ｔｍの分析及び凝集温度Ｔａｇｇの検出のために、１試料当たり１０μＬを、毛管力によってＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８の標準的なキャピラリ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に充填し、機器内に置いた。試料を三つ組で測定した。温度勾配を１℃／分の加熱速度で２０℃から９５℃にすると定義した。
データ分析を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＰＲＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌソフトウェア（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。熱的なアンフォールディング実験の場合、蛍光比（Ｆ３５０ｎｍ／Ｆ３３０ｎｍ）のそれぞれの一次導関数を温度に対してプロットした。凝集の検出について、散乱光強度のそれぞれの一次関数を温度に対してプロットした。
タンパク質がアンフォールディングする温度（Ｔｍ）及び凝集温度（Ｔａｇｇ）は、三つ組から計算された標準偏差を伴う平均値として表１４において示される。アンフォールディング（Ｔｍ）及びタンパク質凝集（Ｔａｇｇ）は、塩化ナトリウムの非存在下でより高い温度において生じることが実証された。これは、塩を含まない製剤の立体構造安定性及びコロイド安定性が増したことを示す。
Figure 0007189141000015
実施例８：
Ｃ末端に単鎖Ｆｃドメインを含有し、ＢＣＭＡに特異的なドメイン中に追加のシステインクランプを有する（ＢｉＴＥ（登録商標）Ｆ）及び有しない（ＢｉＴＥ（登録商標）Ｅ）ＢＣＭＡを標的化する２つのＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトをｐＨ４．８の１０ｍＭ Ｌ－グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）スクロース中で製剤化した。４Ｍの原液を用いて０ｍＭ、１００ｍＭ及び２００ｍＭの塩化ナトリウムでこの溶液の画分をスパイクした。各画分の濃度を１ｍＬ当たり０．８ｍｇのＢｉＴＥ（登録商標）に調整した。最終溶液を使用準備済の１０Ｒ Ｉ型ガラスバイアルにおいて２．５ｍＬに等分し、これをブチルゴムの栓及びアルミニウムのフリップオフシールで閉じた。これらの溶液を３０℃で１２週間保存し、各種分析法を用いて安定性を評価した。
実施例７に記載されるとおりにＳＥ－ＵＰＬＣを実施した。２８０ｎｍの励起波長を使用して、３２５ｎｍでの蛍光発光強度を測定することによって検出を行った。相対的な曲線下面積（ＡＵＣ）は、低分子量種（ＬＭＷＳ）に起因する。表１５において示されるとおり、経時的なＬＭＷＳの形成は、塩化ナトリウムの非存在下でより少なくなり、塩を含まない製剤の安定性の向上を示す。
Figure 0007189141000016
実施例７に記載されるとおりに光遮蔽を実施した。製剤並びに保管に応じたＢｉＴＥ（登録商標）Ｅ及びＢｉＴＥ（登録商標）Ｆにおけるサブビジブル粒子の存在量が表１６において示される。サブビジブル粒子は、塩を含有する製剤と比較した場合、保管時間に依存せずに塩化ナトリウムの非存在下でより少なくなった。これは、塩を含まない製剤中のＢｉＴＥ（登録商標）ＥとＢｉＴＥ（登録商標）Ｆのコロイド安定性の向上を示す。
Figure 0007189141000017
ＢｉＴＥ（登録商標）Ｅ及びＢｉＴＥ（登録商標）Ｆ製剤を、実施例７に記載される方法を使用して、ナノ示差走査熱量測定（ｎａｎｏＤＳＦ）によって熱的に分析した。タンパク質がアンフォールディングする温度（Ｔｍ）及び凝集温度（Ｔａｇｇ）は、三つ組から計算された標準偏差を伴う平均値として表１７において示される。０ｍＭ又は１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する製剤と比較した場合、２００ｍＭのＮａＣｌの存在下において、アンフォールディング（Ｔｍ）がより高い温度で生じることが実証された。タンパク質凝集は、試験された温度範囲において塩を含まない製剤で検出されなかった。反対に、タンパク質凝集は、塩化ナトリウムを含有する製剤において観察された。凝集温度は、塩濃度が高くなるほど低くなった。上記の結果は、塩を含まない製剤の立体構造安定性及びコロイド安定性が増したことを示す。
Figure 0007189141000018
Figure 0007189141000019
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Claims (16)

  1. 液体医薬組成物であって、
    （ａ）少なくとも３つのドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトであって、
    ・第１のドメインは、腫瘍抗原、免疫障害に特異的な抗原又はウイルス抗原からなる群から選択される標的細胞の表面抗原に結合し、４～９．５の範囲の等電点（ｐＩ）を有し；
    ・第２のドメインは、ＣＤ３のヒト及び／又はマカクＣＤ３ε鎖の細胞外エピトープである第２の抗原に結合し、８～１０、好ましくは８．５～９．５の範囲のｐＩを有し；及び
    ・第３のドメインは、それぞれヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つのポリペプチド単量体を含み、前記２つのポリペプチド単量体は、ペプチドリンカーを介して互いに融合され、第３のドメインは、５．５～７．５の範囲のｐＩを有する、
    抗体コンストラクト；
    （ｂ）酢酸塩、グルタミン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される酸を含む、少なくとも１種の緩衝剤；
    （ｃ）スクロース、トレハロース、マンニトール及びスクロース、並びにこれらの組み合わせから選択される少なくとも１種の糖類；及び
    （ｄ）ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、又はポリソルベート８０を含む、少なくとも１種の界面活性剤
    を含み、前記医薬組成物は、塩化ナトリウムを含まず、前記医薬組成物のｐＨは、４．０～５．０の範囲である、液体医薬組成物。
  2. 前記抗体コンストラクトは、単鎖抗体コンストラクトである、請求項１に記載の液体医薬組成物。
  3. 前記第３のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
    ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメイン－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメイン
    を含む、請求項１又は２に記載の液体医薬組成物。
  4. 前記腫瘍抗原は、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ７０からなる群から選択される、請求項１に記載の液体医薬組成物。
  5. 前記第３のドメインの前記ポリペプチド単量体の各々は、配列番号１７～２４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１７～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、及び／又は、前記ＣＨ２ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. （ｉ）前記第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、前記第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含む；
    （ｉｉ）前記第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、前記第２のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含む；
    （ｉｉｉ）前記第１のドメインは、２つの抗体可変ドメインを含み、前記第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含む；又は
    （ｉｖ）前記第１のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含み、前記第２のドメインは、１つの抗体可変ドメインを含む、
    請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記抗体コンストラクトは、好ましくはアミノからカルボキシルの順に、
    （ａ）前記第１のドメイン；
    （ｂ）配列番号１～３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｃ）前記第２のドメイン；
    （ｄ）配列番号１、２、３、９、１０、１１及び１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；
    （ｅ）前記第３のドメインの第１のポリペプチド単量体；
    （ｆ）配列番号５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー；及び
    （ｇ）前記第３のドメインの第２のポリペプチド単量体
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  8. 前記少なくとも１種の緩衝剤は、５～１００ｍＭの濃度範囲で存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  9. 前記少なくとも１種の糖類は、１～１５％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  10. 前記少なくとも１種の界面活性剤は、０．００４～０．５％（ｍ／Ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  11. １５０～５００ｍＯｓｍの範囲のモル浸透圧濃度を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  12. 一又は複数のポリオール及び一又は複数のアミノ酸からなる群から選択される賦形剤をさらに含み、前記１種以上の賦形剤は、好ましくは０．１～１５％（ｗ／Ｖ）の濃度範囲で存在し、及び／又は、前記組成物は、好ましくは無機陰イオンを含まない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  13. （ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体コンストラクト、
    （ｂ）１０ｍＭのグルタミン酸塩又は酢酸塩、
    （ｃ）９％（ｍ／Ｖ）のスクロース又は６％（ｍ／Ｖ）のスクロース及び６％（ｍ／Ｖ）のヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、
    （ｄ）０．０１％（ｍ／Ｖ）のポリソルベート８０
    を含み、前記液体医薬組成物のｐＨは、４．２である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  14. 前記抗体コンストラクトは、０．１～８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２～２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５～１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の液体医薬組成物。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の液体医薬組成物の凍結乾燥によって得ることができる固体医薬組成物、又は、薬学的に許容される液体とともに前記固体医薬組成物を再構成することによって得ることができる液体医薬組成物。
  16. 疾患、好ましくは増殖性疾患、免疫疾患又はウイルス性疾患の治療における使用のための、好ましくは非経口的に、より好ましくは点滴又は注射による静注によって投与され、好ましくは１週間に１、２、３、４、５、６若しくは７回、又は２週間毎に１、２、３、４、５若しくは６回、又は１ヶ月に１若しくは２回、又は２ヶ月毎に１若しくは２回、最も好ましくは１週間に１回投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
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