TWI767899B

TWI767899B - Psma及cd3雙特異性t細胞嚙合抗體構築體

Info

Publication number: TWI767899B
Application number: TW106103583A
Authority: TW
Inventors: 托拜爾斯瑞烏; 馬克斯蒙茲; 喬漢斯波西; 彼德庫佛; 派翠克霍夫曼; 馬修斯弗瑞德里奇; 班諾拉托; 潘蜜拉波格納; 安德列斯沃夫; 柯尼里斯龐波
Original assignee: 德商安美基研究（慕尼黑）公司
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2017-02-02
Publication date: 2022-06-21
Also published as: IL260920A; JP2022020636A; TN2018000266A1; WO2017134158A1; CN114716557A; PT3411404T; EA201891753A1; ES2935419T3; SI3411404T1; AU2017216237B2; EP3411404A1; IL260920B; CL2018002063A1; BR112018015415A2; SG10202007331WA; UA126656C2; US20210070878A1; MY195542A; JP7295916B2; ZA201804829B

Abstract

本發明提供具有特異性Fc模態(modality)之雙特異性抗體構築體，其特徵為包含結合至PSMA之第一域、結合至人類及獼猴(Macaca )CD3ε鏈之細胞外抗原決定基之第二域、以及為該特異性Fc模態之第三域。另外，本發明提供編碼該抗體構築體之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體、表現該構築體之宿主細胞及包含其之醫藥組合物。

Description

PSMA及CD3雙特異性T細胞嚙合抗體構築體

本發明係關於雙特異性抗體構築體。具體而言，本發明係關於具有特異性Fc模態之雙特異性T細胞嚙合抗體構築體。

雙特異性抗體衍生之分子例如BiTE^® (雙特異性T細胞嚙合子)抗體構築體係由兩種可撓連接的抗體衍生之結合域製成的重組蛋白構築體。BiTE^® 抗體構築體之一種結合域係對靶細胞上的選定腫瘤相關表面抗原具特異性；第二結合域係對CD3(T細胞上的T細胞受體複合體之亞單元)具特異性。BiTE^® 抗體構築體由於其特定設計而格外適於暫態連接T細胞與靶細胞且同時強力活化T細胞抗靶細胞之固有溶胞潛力。作為AMG 103及AMG 110開發進入臨床之第一代BiTE^® 抗體構築體(參見WO 99/54440及WO 2005/040220)的另一重要發展係提供結合至CD3ε鏈的N端的狀況獨立性抗原決定基之雙特異性抗體構築體(WO 2008/119567)。結合至該選定抗原決定基之BiTE^® 抗體構築體不僅僅顯示針對人類及白鬢狨(Callithrix jacchus )、棉冠獠狨(Saguinus oedipus )或松鼠猴(Saimiri sciureus )CD3ε鏈之跨物種特異性，而且由於識別該特異性抗原決定基(而非先前描述之雙特異性T細胞嚙合分子中之CD3結合子(binder)之抗原決定基)，因而不會將T細胞非特異性活化至針對前代T細胞嚙合抗體所觀察到之相同程度。T細胞活化之該減少係與病患中之較少或減少之T細胞再分配(後者被確認為副效應之風險)相關。

如WO 2008/119567中所述之抗體構築體可能遇到自身體快速清除；因此，雖然其等能夠快速到達身體之大部分部位，且快速產生及更容易處理，但其活體內應用可受其活體內簡短持續性限制。可使用以連續靜脈內輸注進行之延長投與來達成治療效應，因該單鏈小分子具有短活體內半衰期。然而，此類連續靜脈內輸注被認為對病患而言不方便，且因此在更方便之替代治療方法之情況下，會妨礙在各自疾病之治療中證實為更高效之化合物的選擇。因此，此項技術中需要保留相似治療功效、具有直接產生之形式且具有有利藥物動力學性質(包括較長半衰期)之雙特異性治療劑。

延長之半衰期通常適用於免疫球蛋白(尤其為抗體及更尤其為具有小尺寸之抗體片段)之活體內應用。此項技術中所述之用於達成此類效應之方法包括小型雙特異性抗體構築體與較大蛋白質(其較佳不干擾BiTE^® 之治療效應)之融合。雙特異性T細胞嚙合子之此類進一步開發之實例包括例如描述於US 2014/0302037、US 2014/0308285、WO 2014/144722、WO 2014/151910及WO 2015/048272中之雙特異性Fc分子。一種替代性策略係使用與該雙特異性分子融合之HSA或僅融合人類白蛋白結合肽(参见例如WO2013/128027、WO2014/140358)。

已識別前列腺癌之若干標誌物，包括例如前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP)(Hubert等人，PNAS 96(1999),14523-14528)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)(Reiter等人，Proc.Nat.Acad.Sci.95：1735-1740,1998)及前列腺特異性膜抗原(PSMA；PSM)(Israeli等人，Cancer Res.53(1993)。PSMA最初是由單株抗體(MAb)7E11來定義，該單株抗體衍生自以自淋巴結前列腺癌(LNCaP)細胞系之部分純化膜製劑進行免疫作用(Horoszewicz等人，Anticancer Res.7(1987),927-35)。選殖編碼PSMA蛋白之2.65-kb cDNA片段並隨後作圖至染色體11p11.2(Israeli等人，上述文獻；O’Keefe等人，Biochem.Biophys.Acta 1443(1998),113-127)。PSMA之初始分析證實前列腺分泌上皮細胞內之廣泛表現。免疫組織化學染色證實PSMA於增生性及良性組織中不表現或適度表現，而惡性組織以最大強度染色(Horoszewicz等人，上述文獻)。後續研究已重述此等結果並表示PSMA表現是迄今為止所檢查之實務上每個前列腺組織中之普遍特徵。此等報告進一步證實PSMA之表現與腫瘤侵襲性成比例急劇增加(Burger等人，Int.J.Cancer 100(2002),228-237；Chang等人，Cancer Res.59(1999),3192-98；Chang等人，Urology 57(2001),1179-83),Kawakami and Nakayama,Cancer Res.57(1997),2321-24；Liu等人，Cancer Res.57(1997),3629-34；Lopes等人，Cancer Res.50(1990),6423-29；Silver等人，Clin.Cancer Res.9(2003),6357-62；Sweat等人，Urology 52(1998),637-40；Troyer等人，Int.J.Cancer 62(1995),552-558；Wright等人，Urology 48(1996),326-334)。符合PSMA表現與腫瘤階段之間的相關性，增加之PSMA水平係與雄激素非依賴性前列腺癌(PCa)相關。自罹患前列腺癌之病患獲得之組織樣品之分析已證實：在物理閹割或雄激素去除療法之後，PSMA水平升高。與前列腺特異性抗原(其在雄激素去除之後下調)之表現不同，PSMA表現在原發性及轉移性腫瘤樣本中均顯著增加(Kawakami等人，Wright等人，上述文獻)。符合雄激素非依賴性腫瘤中之升高之表現，亦知曉PSMA轉綠受類固醇下調，且睪固酮之投與介導PSMA蛋白及mRNA水平之顯著降低(Israeli等人，Cancer Res.54(1994),1807-11；Wright等人，上述文獻)。PSMA於繼發性前列腺腫瘤及隱藏性轉移性疾病中亦高度表現。免疫組織化學分析已揭示與良性前列腺組織相比，在位於淋巴結、骨、軟組織及肺中之轉移性病灶內之PSMA表現相對強烈且均勻(Chang等人，(2001)，上述文獻；Murphy等人，Cancer 78(1996),809-818；Sweat等人，上述文獻)。一些報告亦已指示前列腺外組織(包括腎近端小管的一子集、腸刷狀緣膜的一些細胞及結腸隱窩(colonic crypt)中之稀少細胞)中有限的PSMA表現(Chang等人，(1999),Horoszewicz等人，Israeli等人，(1994),Lopes等人，Troyer等人，上述文獻)。然而，在此等組織中之PSMA水平通常比前列腺中所觀察到的水平低二至三個數量級(Sokoloff等人，Prostate 43(2000),150-157)。PSMA在經檢查之大多數實體癌之腫瘤相關新生血管生成分佈中亦表現，然而在正常血管內皮中不存在(Chang等人，(1999)，Liu等人，Silver等人，上述文獻)。雖然血管生成分佈內之PSMA表現之意義未知，但對腫瘤相關內皮之特異性使PSMA成為治療多種惡性病形式之潛在標靶。

此項技術中所述之雙特異性T細胞嚙合分子之所有半衰期延長形式(HLE形式)(其包括異源Fc(亦稱為異源二聚體Fc、hetFc或hFc)形式及人類血清白蛋白(亦稱為HSA或hALB)之融合物)具有個別缺點，例如非特異性T細胞活化、補體活化、不穩定性或不符合該等分子之所需半衰期延長之藥物動力學概況。因此，本發明之目標係提供一種雙特異性T細胞嚙合分子之半衰期延長形式，其克服針對當前技術水平分子所觀察到的此等個別缺點中之至少一者且當然較佳多於一者。因此，本發明提供具有特異性Fc模態(modality)之雙特異性抗體構築體，其特徵為包含結合至PSMA之第一域、結合至人類及獼猴(Macaca )CD3ε鏈之細胞外抗原決定基之第二域、以及第三域(其為該特異性Fc模態)。另外，本發明提供編碼該抗體構築體之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體、表現該構築體之宿主細胞及包含其之醫藥組合物。

圖1：圖1a顯示本發明之抗體構築體之一個實施例之圖。圖1b顯示異源二聚體Fc抗體構築體及圖1c顯示此項技術中所述之X體構築體。指示之電荷對係經引入以增強異源二聚化。圖1d顯示抗體構築體與人類血清白蛋白(HSA/hALB)之融合。

圖2：評估藉由標靶A HLE BiTE^® 抗體構築體之標靶非依賴性T細胞活化。2(a)：本發明之抗體構築體之48h活化分析，該分析基於人類PBMC(3x)；HLE BiTE^® 連續稀釋(以20nM開始；1：5，7x+空白)；具有或不具有FcR阻斷[10mg/mL huIgG(Kiovog,Baxter)]；CD4⁺ 、CD8⁺ T細胞上之CD69及CD25[未顯示]表現之FACS量測。2(b)：異源Fc抗體構築體之48h活化分析，該分析基於人類PBMC及CD14⁺ /CD33⁺ 細胞耗盡之PBMC(3x)；HLE BiTE^® 連續稀釋(以20nM開始；1：5，7x+空白)；CD4⁺ 、CD8⁺ T細胞上之CD69及CD25[未顯示]表現之FACS量測。

圖3：評估藉由標靶B HLE BiTE^® 抗體構築體之標靶非依賴性T細胞活化。3(a)：本發明之抗體構築體之48h活化分析，該分析基於人類PBMC(3x)；HLE BiTE^® 連續稀釋(以20nM開始；1：5,7x+空白)；具有或不具有FcR阻斷[10mg/mL huIgG(Kiovog,Baxter)]；CD4⁺ 、CD8⁺ T細胞上之CD69及CD25[未顯示]表現之FACS量測。3(b)：異源Fc抗體構築體之48h活化分析，該分析基於人類PBMC及CD14⁺ /CD33⁺ 細胞耗盡之PBMC(3x)；HLE BiTE^® 連續稀釋(以20nM開始；1：5,7x+空白)；CD4⁺ 、CD8⁺ T細胞上之CD69及CD25[未顯示]表現之FACS量測。3(c)：X體構築體之48h活化分析，該分析基於人類PBMC及CD14⁺ /CD33⁺ 細胞耗盡之PBMC(3x)；HLE BiTE^® 連續稀釋(以20nM開始；1：5，7x+空白)；CD4⁺ 、CD8⁺ T細胞上之CD69及CD25[未顯示]表現之FACS量測。3(d)至3(f)：將自三個不同健康人類供體單離之PBMC與漸增濃度之對標靶B抗原具特異性之HLE雙特異性抗體構築體一起培養48h。CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞上之活化標誌物CD69之表現係藉由流式細胞儀分析，使用對CD69具特異性之PE-Cy7共軛mab來測定。

圖4：BiTE^® Fc融合抗體構築體之補體C1q結合。將BiTE^® Fc融合抗體構築體(BiTE^® 單鏈Fc(三角形)、BiTE^® 異源Fc(正方形)、正則BiTE^® (圓圈))塗覆於Maxisorp板(以連續稀釋)上，接著以匯集之人類血清進行培養及以多株抗人類CC1q鼠類抗體進行培養，藉由山羊抗小鼠Fc-AP共軛物可視化。

圖5：兩種不同PSMA BiTE^® -HLE抗體構築體在食蟹猴中單劑量投與後之平均PK曲線。出於可比較性，血清濃度係經劑量標準化至15μg/kg並以nmol指示。

圖6：雙特異性scFc變異體D9F(SEQ ID NO：481)、T2G(SEQ ID NO：482)、D3L(SEQ ID NO：483)、T7I(SEQ ID NO：484)及K6C(SEQ ID NO：485)。本發明之一較佳抗體構築體顯示於SEQ ID NO：481中。

圖7：結合至人類FcRn之基於表面電漿子共振(SPR)之測定。在 SPR(Biacore)實驗中測試構築體D9F、T2G、D3L、T7I及K6C各者之與人類FcRn結合之能力。針對所有構築體以各自反應單位(RU)形式量測注射階段期間之最大結合，RU等效於FcRn塗覆之CCM5晶片上之因結合構築體所致之分子量增加。所有構築體係以一式兩份進行量測。一式兩份測定之平均值係繪圖於圖7A及7B中。

圖8：在SPR(Biacore)實驗中測試構築體D9F、T2G、D3L、T7I及K6C及人類IgG1-κ抗體MT201各者之結合至人類FcRn之能力。針對所有構築體以各自反應單位(RU)形式量測注射階段期間之最大結合，RU等效於FcRn塗覆之CCM5晶片上之因結合構築體所致之分子量增加。所有構築體係以一式兩份進行量測。對一式兩份測定之平均值繪圖，包括標準偏差誤差槓。

除本發明之抗體構築體(其較佳係雙特異性)之顯著延長半衰期以外，特異性Fc模態(亦即，根據本發明之第三域)之融合負責對本發明抗體構築體之第一及第二結合域之令人驚訝之顯著影響。因此，雖然T細胞嚙合抗體構築體之其他半衰期延長模態顯示個別較佳特徵，然而本發明特異性Fc模態之選擇允許提供通常顯示穩健分子形式之廣泛範圍之較佳特徵的雙特異性分子，及因此允許開發有前景之醫藥組合物。

因此，本發明提供一種抗體構築體，其包含：●第一域，其結合至PSMA；●第二域，其結合至人類及獼猴(Macaca )CD3ε鏈之細胞外抗原決定基；及●第三域，其包含兩種多肽單體，各包含鉸鏈、CH2域及CH3域，其中該等兩種多肽單體係經由肽連接子彼此融合。

術語「抗體構築體」係指其中結構及/或功能係基於具有(例如)全長或整個免疫球蛋白分子之抗體的結構及/或功能之分子。抗體構築體因此能夠結合至其特異性標靶或抗原及/或自抗體或其片段之可變重鏈(VH)及/或可變輕鏈(VL)域提取。此外，根據本發明之抗體構築體之結合域包括抗體之容許靶向結合之最小結構要求。該最小要求可(例如)藉由至少三個輕鏈CDR(亦即，VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(亦即，VH區之CDR1、CDR2及CDR3)之存在來定義，較佳具有全部六個CDR。定義抗體之最小結構要求之另一替代方法係特異性標靶之結構內之抗體之抗原決定基各自之定義、構成該抗原決定基區域(抗原決定基簇)之靶蛋白之蛋白質域之定義、或參考與所定義抗體之抗原決定基競爭之特異性抗體。根據本發明之構築體所基於之抗體包括(例如)單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、人類化抗體及人類抗體。

根據本發明之抗體構築體之結合域可例如包含上述CDR組。較佳地，彼等CDR包含於抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)之框架中；然而其不一定包含兩者。Fd片段(例如)具有兩個VH區且通常保留完整抗原結合域之一些抗原結合功能。抗體片段、抗體變異體或結合域之形式之其他實例包括(1)Fab片段(具有VL、VH、CL及CH1域之單價片段)；(2)F(ab')₂ 片段(具有在鉸鏈區由雙硫橋連接之兩個Fab片段的雙價片段)；(3)具有兩個VH及CH1域之Fd片段；(4)具有抗體之單臂之VL及VH域之Fv片段；(5)具有VH域之dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；(6)經單離之互補性決定區(CDR)及(7)單鏈Fv(scFv)，後者較佳(例如，衍生自scFv文庫)。根據本發明之抗體構築體之實施例之實例係例如描述於WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910及WO 2015/048272中。

全長抗體之片段例如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')2或「r IgG」(「半抗體」)亦位於「結合域」或「其所結合之域」之定義內。根據本發明之抗體構築體亦可包含抗體之經修飾片段，亦稱為抗體變異體，例如scFv、di-scFv或bi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鏈、scFab、Fab₂ 、Fab₃ 、雙功能抗體、單鏈雙功能抗體、串聯雙功能抗體(Tandab’s)、串聯di-scFv、串聯tri-scFv、「多功能抗體」(例如三功能抗體或四功能抗體)及單域抗體(例如奈米抗體或單可變域抗體(其包含僅一個可為VHH、VH或VL之可變域，其獨立於其他V區或域而特異性結合抗原或抗原決定基))。

如文中所使用，術語「單鏈Fv」、「單鏈抗體」或「scFv」係指單一多肽鏈抗體片段，其包含來自重鏈及輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。通常，單鏈抗體另外包含介於VH與VL域之間之多肽連接子，其能夠使單鏈抗體形成允許抗原結合之所需結構。單鏈抗體係詳細論述於Pluckthun之The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第13卷，Rosenburg and Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315(1994)頁中。產生單鏈抗體之各種方法係已知，包括彼等描述於美國專利案第4,694,778號及第5,260,203號；國際專利申請公開案號WO 88/01649；Bird(1988)Science 242：423-442；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Ward等人，(1989)Nature 334：54454；Skerra等人， (1988)Science 242：1038-1041中之方法。在具體實施例中，單鏈抗體亦可為雙特異性、多特異性、人類及/或人類化及/或合成。

另外，術語「抗體構築體」之定義包括單價、雙價及多價構築體且因此特異性結合至僅兩種抗原性結構之雙特異性構築體、以及經由獨特結合域特異性結合至多於兩種抗原性結構(例如三種、四種或更多種)之多特異性構築體。此外，術語「抗體構築體」之定義包括由僅一條多肽鏈組成之分子以及由多於一條多肽鏈(該等鏈可為相同(同源二聚體、同源三聚體或同源寡聚體)或不同(異源二聚體、異源三聚體或異源寡聚體))組成之分子。以上所識別之抗體及變異體或其衍生物之實例尤其係描述於Harlow及Lane,Antibodies a laboratory manual,CSHL Press(1988)及Using Antibodies：a laboratory manual,CSHL Press(1999)；Kontermann及Dübel,Antibody Engineering,Springer，第2版，2010及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009中。

如文中所使用，術語「雙特異性」係指為「至少雙特異性」之抗體構築體，亦即，其包含至少第一結合域及第二結合域，其中該第一結合域會結合至一種抗原或標靶(此處：PSMA)，且該第二結合域會結合至另一種抗原或標靶(此處：CD3)。因此，根據本發明之抗體構築體包含針對至少兩種不同抗原或標靶之特異性。例如，該第一域較佳不結合至如文中所述之物種中之一或多者之CD3之細胞外抗原決定基。術語「靶細胞表面抗原」係指由細胞表現且存在於細胞表面使得可供如文中所述之抗體構築體接近之抗原性結構。其可為蛋白質，較佳為蛋白質之細胞外部分，或碳水化合物結構，較佳為蛋白質(例如醣蛋白)之碳水化合物結構。其較佳為腫瘤抗原。本發明之術語「雙特異性抗體構築體」亦涵蓋多特異性抗體構築體，例如三特異性抗體構築體，後者包括三種結合域，或具有多於三種(例如，四種、五種......)特異性之構築體。

假定根據本發明之抗體構築體係(至少)雙特異性，其等非天然生成且其等顯著不同於天然生成之產物。因此「雙特異性」抗體構築體或免疫球蛋白係具有至少兩個帶不同特異性之獨特結合位點之人造雜合抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體構築體可藉由各種方法(包含融合瘤之融合或Fab'片段之連接)來產生。參見(例如)Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。

本發明之抗體構築體之至少兩個結合域及可變域(VH/VL)可包括或可不包括肽連接子(間隔肽)。術語「肽連接子」根據本發明包含一種用來使本發明之抗體構築體之一個(可變及/或結合)域之胺基酸序列與另一(可變及/或結合)域之胺基酸序列彼此相連之胺基酸序列。該等肽連接子亦可用於將第三域與本發明之抗體構築體之其他域融合。此類肽連接子之基本技術特徵係此類肽連接子不包含任何聚合活性。其中，合適之肽連接子係彼等描述於美國專利案第4,751,180號及第4,935,233號或WO 88/09344中者。該等肽連接子亦可用於將其他域或模組或區域(例如半衰期延長域)與本發明之抗體構築體連接。

本發明之抗體構築體較佳係「活體外產生之抗體構築體」。該術語係指根據上述定義之抗體構築體，其中可變區之全部或部分(例如，至少一個CDR)係以非免疫細胞選擇之方式(例如，活體外噬菌體顯示、蛋白質晶片或其中可測試候選序列之結合至抗原之能力之任何其他方法)來產生。該術語因此較佳排除僅由基因組重排於動物免疫細胞中產生之序列。「重組抗體」係經由使用重組DNA技術或遺傳工程而製得之抗體。

如本文所用之術語「單株抗體」(mAb)或單株抗體構築體係指一種自實質上同源之抗體群體所得到之抗體，亦即，除可能少量存在之潛在天然生成的突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化作用、醯胺化作用)以外，組成該群體之個別抗體係相同的。相對於通常包括針對不同決定子(或抗原決定基)之不同抗體之習知(多株)抗體製劑，單株抗體針對該抗原上之單抗原性位點或決定子具高度特異性。除其等特異性外，單株抗體的優點在於其等可藉由培養融合瘤培養加以合成，因此不會受到其他免疫球蛋白的污染。修飾語「單株」指示該抗體之特徵為獲得自實質上同源抗體群體，而並不應視為需以任何特定方法製造該抗體。

就製備單株抗體而言，可使用提供藉由連續細胞系培養所產生之抗體的任何技術。例如，待使用之單株抗體可藉由Koehler等人，Nature,256：495(1975)首先描述之融合瘤方法來製造，或可藉由重組DNA方法(參見，例如，美國專利案第4,816,567號)來製造。製備人類單株抗體之其他技術之實例包含三源融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)及EBV-融合瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。

融合瘤可然後使用標準方法(例如酶聯免疫吸附檢定(ELISA)及表面電漿子共振(BIACORE^TM )分析)篩選，以識別一或多個產生特異性結合至指定抗原之抗體之融合瘤。可使用任何形式之相關抗原作為免疫原，例如，重組抗原(天然生成之形式)、其任何變異體或片段、及其抗原性肽。應用於BIAcore系統中之表面電漿子共振可用於增加結合至靶細胞表面抗原之抗原決定基之噬菌體抗體的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。

製造單株抗體之另一示例性方法包括篩選蛋白質表現文庫例如噬菌體顯示或核糖體顯示文庫。噬菌體顯示係描述於例如Ladner等人，美國專利案第5,223,409號；Smith(1985)Science 228：1315-1317；Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中。

除使用顯示文庫以外，亦可使用相關抗原以使非人類動物，例如，囓齒動物(例如小鼠、倉鼠、兔或大鼠)免疫。在一個實施例中，該非人類動物包含至少一部分人類免疫球蛋白基因。例如，可用人類Ig(免疫球蛋白)基因座之大片段工程設計小鼠抗體產生中缺乏之小鼠品系。使用融合瘤技術，可製造自具有所需特異性之基因衍生之抗原特異性單株抗體並選擇。參見，例如，XENOMOUSE^TM ,Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21、US 2003-0070185、WO 96/34096及WO96/33735。

單株抗體亦可自非人類動物獲得及然後加以修飾，例如，使用此項技術中已知的重組DNA技術進行人類化、去免疫化、呈現嵌合等。經修飾之抗體構築體之實例包括非人類抗體之人類化變異體、「親和力成熟」抗體(參見，例如Hawkins等人，J.Mol.Biol.254,889-896(1992)及Lowman等人，Biochemistry 30,10832-10837(1991))及具有經改變之效應子功能之抗體突變體(參見，例如，美國專利案第5,648,260號，Kontermann及Dübel(2010)上述文獻及Little(2009)上述文獻)。

在免疫學中，親和力成熟係B細胞藉以在免疫反應過程期間產生對抗原親和力增加之抗體之過程。在重複曝露於相同抗原之情況下，宿主將產生親和力逐漸增大之抗體。類似天然原型，該活體外親和力成熟係基於突變及選擇之原理。該活體外親和力成熟已成功用以最佳化抗體、抗體構築體及抗體片段。使用輻射、化學突變原或易誤PCR在CDR內引入隨機突變。此外，可藉由鏈改組增加遺傳多樣性。使用顯示方法(例如噬菌體顯示)進行兩輪或三輪突變及選擇通常會產生具有在低奈米莫耳範圍內之親和力的抗體片段。

抗體構築體之胺基酸取代型變異之一較佳類型涉及取代親代抗體(例如，人類化抗體或人類抗體)之一或多個高度可變區殘基。通常，經選擇以供進一步開發之該(等)所得變異體相對於產生其等之親代抗體將具有改良之生物性質。產生此類取代型變異體之便捷方式涉及使用噬菌體顯示之親和力成熟。簡而言之，若干高度可變區位點(例如，6-7個位點)經突變以在每個位點產生所有可能之胺基酸取代。由此產生之抗體變異體係自絲狀噬菌體顆粒呈融合至封裝於每個顆粒內之M13之基因III產物形式以單價方式顯示。然後篩選噬菌體顯示之變異體之如本文揭示的其等生物活性(例如，結合親和力)。為識別候選高度可變區位點以供修飾，可進行丙胺酸掃描誘變以識別明顯有助於抗原結合之高度可變區殘基。或者或此外，分析抗原-抗體複合體之晶體結構以識別結合域與(例如)人類PSMA之間之接觸點可為有利的。此類接觸殘基及相鄰殘基係根據本文闡述之技術之取代的候選者。此類變異體一經產生，將該組變異體進行如本文所述之篩選，並可選擇在一或多個相關分析中具有優異性質之抗體以供進行進一步開發。

本發明之單株抗體及抗體構築體明確包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分係與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列是相同的或同源的，而該(等)鏈之其餘部分係與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列是相同的或同源的，及此類抗體之片段，只要其等顯示所需生物活性(美國專利案第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本文關注之嵌合抗體包括包含衍生自非人類靈長目(例如，舊大陸猴、人猿等)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列的「靈長類化」抗體。已描述製造嵌合抗體之各種方法。參見(例如)Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851,1985；Takeda等人，Nature 314：452,1985；Cabilly等人，美國專利案第4,816,567號；Boss等人，美國專利案第4,816,397號；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；及GB 2177096。

抗體、抗體構築體或抗體片段亦可藉由例如WO 98/52976及WO 00/34317中所揭示之方法藉由人類T細胞抗原決定基之特定缺失(稱為「去免疫作用」之方法)來修飾。簡而言之，可分析抗體之重鏈及輕鏈可變域之結合至MHC第II類之肽；此等肽表示潛在T細胞抗原決定基(如WO 98/52976及WO 00/34317中所定義)。就潛在T細胞抗原決定基之偵測而言，可應用稱為「肽穿線」之電腦建模方法，及此外可於人類MHC第Il類結合肽之資料庫中搜索存在於VH及VL序列中之基元(motif)，如描述於WO 98/52976及WO 00/34317中。此等基元會結合至18大類MHC第II類DR同種異型中之任何一者，且因此構成潛在T細胞抗原決定基。所偵測之潛在T細胞抗原決定基可藉由取代可變域中之少量胺基酸殘基，或較佳地，藉由單胺基酸取代來消除。通常，進行保守取代。通常(但非排他性)，可使用人類生殖系抗體序列中之位置常見的胺基酸。人類生殖系序列係揭示於(例如)Tomlinson等人，(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人，(1995)Immunol.Today第16(5)卷：237-242；及Tomlinson等人，(1995)EMBO J.14：14：4628-4638中。V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之綜合目錄(Tomlinson,LA.等人編，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)。此等序列可作為人類序列之來源，例如，用於框架區及CDR。亦可使用(例如)如描述於美國專利案第6,300,064號中之一致人類框架區。

「人類化」抗體、抗體構築體、其變異體或片段(例如抗體之Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原結合序列)係大部分人類序列之抗體或免疫球蛋白，其等含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列。就大部分而言，人類化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之高度可變區(亦稱為CDR)之殘基係經具有所需特異性、親和力及能力之來自非人類(例如，囓齒動物)物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔)之高度可變區的殘基取代。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基係經相應非人類殘基取代。此外，如本文使用之「人類化抗體」亦可包含既非在受體抗體中亦非在供體抗體中發現之殘基。作出此等修飾以進一步精修並最佳化抗體性能。該人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常係人類免疫球蛋白之恆定區)之至少一部分。詳情參見Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)。

人類化抗體或其片段可藉由以來自人類Fv可變域之等效序列取代Fv可變域中非直接涉及抗原結合之序列來產生。由Morrison(1985)Science 229：1202-1207；由Oi等人，(1986)BioTechniques 4：214；及由US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；及US 6,407,213提供用於產生人類化抗體或其片段之示例性方法。彼等方法包括單離、操控及表現編碼來自重鏈或輕鏈中之至少一者之免疫球蛋白Fv可變域之全部或部分之核酸序列。此類核酸可獲得自如上述產生抗預定靶之抗體之融合瘤，及獲得自其他來源。然後可將編碼人類化抗體分子之重組DNA選殖至合適之表現載體中。

人類化抗體亦可使用表現人類重鏈及輕鏈基因，但無法表現內源性小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因之基因轉殖動物(例如小鼠)來產生。Winter描述可用以製備如本文描述之人類化抗體之示例性CDR移植方法(美國專利案第5,225,539號)。特定人類抗體之所有CDR可經非人類CDR之至少部分取代，或僅一些CDR可經非人類CDR取代。僅需取代人類化抗體結合至預定抗原所需之CDR數。

人類化抗體可藉由引入保守取代、一致序列取代、生殖系取代及/或回復突變來最佳化。此類經改變之免疫球蛋白分子可藉由此項技術中已知的若干種技術中之任何一者來製造(例如，Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80：7308-7312,1983；Kozbor等人，Immunology Today,4：7279,1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.,92：3-16,1982及EP 239 400)。

術語「人類抗體」、「人類抗體構築體」及「人類結合域」包括具有實質上對應於此項技術中已知的人類生殖系免疫球蛋白序列(包括(例如)彼等由Kabat等人，(1991)(上述文獻)描述者)之抗體區域(例如可變區(或域)及恆定區(或域))的抗體、抗體構築體及結合域。本發明之人類抗體、抗體構築體或結合域可(例如)在CDR中及特定言之在CDR3中包括非藉由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。人類抗體、抗體構築體或結合域可具有至少一、二、三、四、五或更多個經非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基取代之位置。如本文使用之人類抗體、抗體構築體及結合域之定義亦考慮全人類抗體，該等全人類抗體僅包括非人工及/或遺傳改變之人類抗體序列，因為彼等可藉由使用技術或系統例如Xenomouse衍生。較佳地，「全人類抗體」不包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基。

在一些實施例中，本發明之抗體構築體係「單離的」或「實質上純的」抗體構築體。當「單離的」或「實質上純的」用以描述本文揭示之抗體構築體時意謂已經自其製造環境之成分中識別、分離及/或回收之抗體構築體。較佳地，該抗體構築體係與其製造環境之所有其他成分沒有或實質上沒有結合關係。其製造環境之污染物成分(例如由重組經轉染之細胞產生之污染物成分)係將通常干擾多肽之診斷性或治療性用途之材料，且可包括酵素、激素及其他蛋白質類或非蛋白質類溶質。該等抗體構築體可(例如)構成給定樣品中之總蛋白質的至少約5重量%，或至少約50重量%。應暸解該單離的蛋白質可視情況構成總蛋白質含量之自5重量%至99.9重量%。該多肽可通過使用可誘導型啟動子或高表現型啟動子在明顯較高濃度下製造，使得其在增加之濃度水準下製造。該定義包括抗體構築體於此項技術已知的各種生物體及/或宿主細胞中之產生。在較佳實施例中，將該抗體構築體純化(1)至藉由使用旋杯定序儀獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或純化(2)至藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色之均勻性。但通常，單離的抗體構築體將藉由至少一個純化步驟來製備。

術語「結合域」結合本發明表徵(特異性)結合至靶分子(抗原)(此處：分別為PSMA及CD3)上之給定靶抗原決定基或給定靶位點/與其相互作用/將其識別的域。第一結合域(識別PSMA)之結構及功能及較佳亦第二結合域(識別CD3)之結構及/或功能係基於抗體(例如，全長或整個免疫球蛋白分子)之結構及/或功能，及/或係自抗體或其片段之可變重鏈(VH)域及/或可變輕鏈(VL)域提取。較佳地，該第一結合域之特徵係存在三個輕鏈CDR(亦即，VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及存在三個重鏈CDR(亦即，VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。該第二結合域較佳亦包含抗體之容許靶向結合之最小結構要求。更佳地，該第二結合域包含至少三個輕鏈CDR(亦即，VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(亦即，VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。設想藉由噬菌體顯示或文庫篩選方法而非藉由將來自預先存在之(單株)抗體之CDR序列移植至支架(scaffold)內來產生或獲得該第一及/或第二結合域。

根據本發明，結合域係呈一或多個多肽之形式。此類多肽可包含蛋白質類部分及非蛋白質類部分(例如，化學連接子或例如戊二醛之化學交聯劑)。蛋白質(包含其片段，較佳係生物活性片段及通常具有小於30個胺基酸之肽)包含兩個或更多個經由共價肽鍵彼此偶合之胺基酸(從而產生胺基酸鏈)。

如本文使用之術語「多肽」描述一群通常由多於30個胺基酸組成之分子。多肽可進一步形成例如二聚體、三聚體及更高寡聚體之多聚體(亦即，由多於一個多肽分子組成)。形成此類二聚體、三聚體等之多肽分子可相同或不相同。因此將此類多聚體之相應高階結構稱為同源二聚體或異源二聚體、同源三聚體或異源三聚體等。異源多聚體之實例係一種由兩個相同多肽輕鏈及兩個相同多肽重鏈組成之呈其天然生成形式之抗體分子。術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」亦係指經天然修飾之肽/多肽/蛋白質，其中該修飾係(例如)藉由轉譯後修飾(例如醣苷化、乙醯化、磷酸化及類似方法)實現。「肽」、「多肽」或「蛋白質」在本文中提及時亦可為經化學修飾(例如聚乙二醇化)。此類修飾係此項技術中熟知並描述於下文中。

較佳地，結合至PSMA之結合域及/或結合至CD3ε之結合域係人類結合域。包含至少一個人類結合域之抗體及抗體構築體避免與具有非人類(例如囓齒動物(例如，鼠類、大鼠、倉鼠或兔))可變區及/或恆定區之抗體或抗體構築體相關之一些問題。此類囓齒動物衍生之蛋白質之存在可導致抗體或抗體構築體之快速清除或可導致病患產生對抗抗體或抗體構築體的免疫反應。為避免使用囓齒動物衍生之抗體或抗體構築體，可通過在囓齒動物中引入人類抗體功能使得囓齒動物產生全人類抗體而產生人類或全人類抗體/抗體構築體。

選殖及重構YAC中之兆鹼基大小之人類基因座並將其等引入小鼠生殖系中之能力提供一種闡明極大或經粗略作圖之基因座之功能性成分並產生人類疾病之有用模型之有效方法。此外，使用此種技術以用小鼠基因座之人類等效物取代小鼠基因座可提供發育期間之人類基因產物之表現及調節、其等與其他系統之通訊及其等於疾病誘發及進展中之參與的獨特洞察。

此種策略之一重要實務應用係小鼠體液免疫系統之「人類化」。於其中內源性Ig基因已經不活化之小鼠中引入人類免疫球蛋白(Ig)基因座為研究抗體之程式化表現及組裝相關之機制及其等於B細胞發育中之作用提供機會。此外，此種策略可為製造全人類單株抗體(mAb)提供理想來源，一個實現人類疾病之抗體療法之前景的重要里程碑。預期全人類抗體或抗體構築體最小化小鼠或小鼠衍生之mAb所固有之免疫原性及過敏性反應並因此增強經投與之抗體/抗體構築體之功效及安全性。可預期全人類抗體或抗體構築體之使用在治療需重複之化合物投與之慢性及再發性人類疾病(例如炎症、自身免疫性及癌症)中提供實質性優勢。

實現該目標之一種方法係以人類Ig基因座之大片段工程設計在小鼠抗體製造中缺陷之小鼠品系，預期此類小鼠將在不存在小鼠抗體之情況下產生種類繁多之人類抗體。人類Ig大片段將保留大可變基因多樣性及抗體製造及表現之適當調節。藉由利用用於抗體多樣化及選擇之小鼠機械及對人類蛋白質之免疫耐受性之缺乏，此等小鼠品系中之重新產生之人類抗體庫應產生抗任何受關注之抗原(包含人類抗原)之高親和力抗體。使用融合瘤技術，可易於產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類mAb。結合第一代XenoMouse小鼠品系證實該一般策略(參見Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。該等Xenomouse小鼠品系係以分別含有人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之245kb及190kb大小之生殖系結構(configuration)片段之酵母菌人造染色體(YAC)來工程設計，人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座含有核心可變及恆定區序列。含有人類Ig之YAC經證實可與用於抗體之重排及表現之小鼠系統相容且能夠取代不活化之小鼠Ig基因。此係由其等誘導B細胞發育以產生全人類抗體之成人狀人類庫及產生抗原特異性人類mAb之能力證實。此等結果亦表明：含有較大數量之V 基因、額外調節元件及人類Ig恆定區之人類Ig基因座之較大部分之引入可實質上重演該完全庫，該庫係對感染及免疫作用之人類體液性反應之特徵。Green等人之工作最近延伸至通過分別引入人類重鏈基因座及K輕鏈基因座之兆鹼基大小之生殖系結構YAC片段引入人類抗體庫之大於約80%。參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)及美國專利申請案序號08/759,620。

XenoMouse小鼠之製造係進一步討論並描繪於美國專利申請案序號07/466,008、序號07/610,515、序號07/919,297、序號07/922,649、序號08/031,801、序號08/112,848、序號08/234,145、序號08/376,279、序號08/430,938、序號08/464,584、序號08/464,582、序號08/463,191、序號08/462,837、序號08/486,853、序號08/486,857、序號08/486,859、序號08/462,513、序號08/724,752及序號08/759,620中；及美國專利案第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號及第5,939,598號中及日本專利案第3 068 180 B2號、第3 3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號中。亦參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)及Green與Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310及WO 03/47336。

在一替代方法中，其他人(包括GenPharm International,Inc.)已利用「迷你基因座(minilocus)」方法。在迷你基因座方法中，外源性Ig基因座係通過內涵來自Ig基因座之片(個別基因)來模仿。因此，一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、mu恆定區及第二恆定區(較佳係γ恆定區)係形成為構築體以插入動物中。該方法描述於Surani等人之美國專利案第5,545,807號及各自係Lonberg及Kay之美國專利案第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號及第6,255,458號、Krimpenfort及Berns之美國專利案第5,591,669號及第6,023.,010號、Berns等人之美國專利案第5,612,205號、第5,721,367號及第5,789,215號及Choi及Dunn之美國專利案第5,643,763號及GenPharm International之美國專利申請案序號07/574,748、序號07/575,962、序號07/810,279、序號07/853,408、序號07/904,068、序號07/990,860、序號08/053,131、序號08/096,762、序號08/155,301、序號08/161,739、序號08/165,699、序號08/209,741。亦參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852及WO 98/24884及美國專利案第5,981,175號。另參見Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)及Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。

Kirin亦已證實自小鼠產生人類抗體，其中已通過微液槽融合引入大片染色體或全部染色體。參見歐洲專利申請案第773 288及843 961號。Xenerex Biosciences正在開發一種可能產生人類抗體之技術。在該項技術中，以人類淋巴細胞(例如，B及/或T細胞)重構SCID小鼠。然後，小鼠經抗原免疫化並可產生抗該抗原之免疫反應。參見美國專利案第5,476,996號、第5,698,767號及第5,958,765號。

人類抗小鼠抗體(HAMA)反應已帶動製備嵌合或以其他方式人類化抗體之產業。然而預期將觀察到某些人類抗嵌合抗體(HACA)反應，特別係在抗體之長期或多劑量利用中。因此，希望提供包含抗PSMA之人類結合域及抗CD3ε之人類結合域的抗體構築體以消除HAMA或HACA反應之顧慮及/或效應。

術語「(特異性)結合至」、「(特異性)識別」、「(特異性)導向」及「與其(特異性)反應」根據本發明意謂結合域與靶分子(抗原)(此處：分別為PSMA及CD3ε)上之給定抗原決定基或給定靶位點相互作用或特異性相互作用。

術語「抗原決定基」係指抗原上之特異性結合至結合域(例如抗體或免疫球蛋白或抗體或免疫球蛋白之衍生物、片段或變異體)之位點。「抗原決定基」係抗原性的且因此術語抗原決定基在本文中有時亦稱為「抗原性結構」或「抗原性決定子」。因此，結合域係「抗原相互作用位點」。該結合/相互作用亦理解為定義「特異性識別」。

「抗原決定基」可藉由鄰接胺基酸或以蛋白質之三級折疊相鄰之非鄰接胺基酸兩者來形成。「線性抗原決定基」係其中胺基酸初級序列包含經識別之抗原決定基之抗原決定基。線性抗原決定基通常以獨特序列包含至少3個或至少4個，及更通常係至少5個或至少6個或至少7個(例如，約8個至約10個)胺基酸。

與線性抗原決定基相反，「構形(conformational)抗原決定基」係以下之抗原決定基：其中組成該抗原決定基之胺基酸之初級序列非係經識別之抗原決定基之唯一定義成分(例如，其中胺基酸之初級序列不一定被結合域識別之抗原決定基)。通常，構形抗原決定基包括相較於線性抗原決定基增加之胺基酸數。關於構形抗原決定基之識別，結合域識別抗原(較佳係肽或蛋白質或其片段)之三維結構(在本發明之內文中，靶細胞表面抗原蛋白質內包含用於結合域中之一者的抗原性結構)。例如，當蛋白質分子折疊以形成三維結構時，形成構形抗原決定基之某些胺基酸及/或多肽主鏈變得相鄰，使抗體能夠識別該抗原決定基。判定抗原決定基之構形之方法包括(但不限於)x射線晶體繞射法、二維核磁共振(2D-NMR)光譜術及定點自旋標記及電子順磁共振(EPR)光譜術。

一種用於抗原決定基作圖之方法描述於下文中：當人類PSMA蛋白中之區域(鄰接胺基酸延伸物)經非人類及非靈長類PSMA(例如，小鼠PSMA，但亦可設想其他例如雞、大鼠、倉鼠、兔等)之其相應區域交換/取代時，預期會發生結合域之結合之下降，除非該結合域對於所使用之非人類、非靈長類PSMA具有交叉反應性。該下降較佳係與對人類PSMA蛋白中之各自區域之結合相比，至少10%、20%、30%、40%或50%；更佳至少60%、70%或80%，及最佳90%、95%或甚至100%，藉此，與人類PSMA蛋白中之各自區域之結合設定為100%。設想使前述人類PSMA/非人類PSMA嵌合體於CHO細胞中表現。亦設想使人類PSMA/非人類PSMA嵌合體與不同膜結合蛋白(例如EpCAM)之跨膜域及/或細胞質域融合。

在替代性或其他抗原決定基作圖方法中，可產生人類PSMA細胞外域之若干截短形式，以確定由結合域所識別之特異區。在此等截短形式中，自N端開始逐步刪除不同細胞外PSMA域/子域或區。設想可使截短PSMA形式於CHO細胞中表現。亦設想可使該等截短PSMA形式與不同膜結合蛋白(例如EpCAM)之跨膜域及/或細胞質域融合。亦設想該等截短PSMA形式可涵蓋位於其N端之信號肽域，例如自小鼠IgG重鏈信號肽衍生之信號肽。另外設想該等截短PSMA形式可涵蓋位於其N端之v5域(跟在信號肽後面)，其允許證實其於細胞表面之正確表現。預期以彼等不涵蓋任何由結合域所識別之PSMA區之截短PSMA形式會發生結合之下降或損失。該結合之下降較佳係至少10%、20%、30%、40%或50%；更佳至少60%、70%或80%，及最佳90%、95%或甚至100%，藉此，與整個人類PSMA蛋白(或其細胞外區或域)之結合設定為100%。

確定PSMA之特異性殘基對抗體構築體或結合域之識別之貢獻之另一方法係丙胺酸掃描(參見例如Morrison KL及Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.2001 Jun；5(3)：302-7)，其中欲分析之各殘基係藉由丙胺酸，例如經由定點誘變來取代。使用丙胺酸是因為其具有非龐大化學惰性甲基官能基，該官能基然而可模擬許多其他胺基酸具有的二級結構參照物。有時，在期望突變殘基之尺寸保守的情況下，可使用龐大胺基酸例如纈胺酸或白胺酸。丙胺酸掃描係一種已被長久使用之成熟技術。

結合域與抗原決定基或包含該抗原決定基之區域之間之相互作用意謂結合域顯示對特定蛋白質或抗原(此處：分別為PSMA及CD3)上之抗原決定基/包含該抗原決定基之區域之相當可觀親和力且通常不顯示與除PSMA或CD3以外之蛋白質或抗原之明顯反應性。「相當可觀親和力」包括以約10^-6 M(KD)或更強的親和力結合。較佳地，當該結合親和力係約10^-12 至10^-8 M、10^-12 至10^-9 M、10^-12 至10^-10 M、10^-11 至10^-8 M，較佳係約10^-11 至10^-9 M時，認為結合係特異性的。結合域是否與靶特異性反應或特異性結合至靶可容易藉由(尤其)比較該結合域與靶蛋白或抗原之反應與該結合域與除PSMA或CD3外之蛋白質或抗原之反應來測試。較佳地，本發明之結合域基本上或實質上不結合至除PSMA或CD3以外之蛋白質或抗原(亦即，第一結合域不能夠結合至除PSMA以外之蛋白質及第二結合域不能夠結合至除CD3以外之蛋白質)。設想使根據本發明之抗體構築體具有比其他HLE形式優越之親和力特徵之特徵。此類優越親和力因此表明延長之活體內半衰期。根據本發明之抗體構築體之較長半衰期可減少投與之持續時間及頻率，此通常助於改善病患順服性。此係特別重要，因為本發明之抗體構築體特別有利於非常虛弱或甚至多病變(mutimorbide)癌症病患。

術語「基本上/實質上不結合」或「不能結合」意謂本發明之結合域不結合除PSMA或CD3以外之蛋白質或抗原，亦即，不顯示與除PSMA或CD3以外之蛋白質或抗原之多於30%，較佳不多於20%，更佳不多於10%，特別佳不多於9%、8%、7%、6%或5%之反應性，藉此，與分別PSMA或CD3之結合設定為100%。

據信，特異性結合係藉由結合域及抗原之胺基酸序列中之特異性基元來實現。因此，該結合係由於其一級、二級及/或三級結構以及由於該等結構之二次修飾來達成。抗原相互位點與其特異性抗原之特異性相互作用可導致該位點簡單結合至該抗原。另外，抗原相互位點與其特異性抗原之特異性相互作用可替代性或另外導致信號之啟動，例如因為誘導抗原構形的改變、抗原的寡聚化等。

術語「可變」係指抗體或免疫球蛋白域之顯示序列具有可變性且涉及決定特定抗體之特異性及結合親和力之部分(亦即，「可變域」)。可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之配對共同形成單抗原結合位點。

可變性係非均勻地分佈於抗體之整個可變域上；其集中於重鏈及輕鏈可變區之各者之子域上。此等子域稱為「高度可變區」或「互補性決定區」(CDR)。可變域之更保守(亦即，非高度可變)部分稱為「框架」區 (FRM或FR)並為呈三維空間之六個CDR提供支架以形成抗原結合表面。天然生成之重鏈及輕鏈之可變域各包括四個FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其等主要採取藉由形成回環連接之三個高度可變區連接之β折疊結構，及在一些情況下形成β折疊結構之一部分。每個鏈中之高度可變區係藉由FRM緊密相鄰地保持在一起並與其他鏈之高度可變區促成形成抗原結合位點(參見Kabat等人之上述文獻)。

術語「CDR」及其複數「CDR」係指互補性決定區，其等三個(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)組成輕鏈可變區之結合性狀及三個(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)組成重鏈可變區之結合性狀。CDR含有大多數負責抗體與抗原之特異性相互作用之殘基並因此有助於抗體分子之功能活性：其等係抗原特異性之主要決定子。

精確定義之CDR邊界及長度受制於不同分類及編號系統。CDR可因此藉由Kabat、Chothia、接觸或任何其他邊界定義(包含本文描述之編號系統)提及。儘管邊界不同，但此等系統中之各者在構成可變序列中之所謂「高度可變區」之胺基酸方面具有某種程度之重疊。根據此等系統之CDR定義可因此相對於相鄰框架區而在長度及邊界區域中有所差異。參見(例如)Kabat(一種基於跨物種序列可變性之方法)、Chothia(一種基於抗原抗體複合體結晶研究之方法)及/或MacCallum(Kabat等人；Chothia等人，J.Mol.Biol,1987,196：901-917；及MacCallum等人，J.Mol.Biol,1996,262：732之上述文獻)。用於表徵抗原結合位點之另一標準係Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體所用之AbM定義。參見(例如)Antibody Engineering Lab Manual(編輯：Duebel,S.及Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)中之Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains。就兩個殘基識別技術定義重疊區域而非相同區域之程度而言，可將其等組合以定義雜合CDR。然而，根據所謂之Kabat系統之編號較佳。

通常，CDR形成可分類為正則結構之回環結構。術語「正則結構」係指抗原結合(CDR)回環採取之主鏈構形。自比較性結構研究中已發現：六個抗原結合回環中之五個僅具有有限數量之有效構形。每個正則結構可藉由多肽主鏈之扭轉角來表徵。儘管回環之大部分具有高胺基酸序列可變性，但抗體間之對應回環可因此具有極相似之三維結構(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,1987,196：901；Chothia等人，Nature,1989,342：877；Martin及Thornton,J.Mol.Biol,1996,263：800)。此外，經採取之回環結構與圍繞其之胺基酸序列之間具有相關性。特定正則類別之構形係由該回環之長度及存在於該回環內及保守框架內(亦即，該回環外)之關鍵位置之胺基酸殘基決定。因此對特定正則類別之分配可基於此等關鍵胺基酸殘基之存在而做出。

術語「正則結構」亦可包括關於抗體之線性序列(例如，如藉由Kabat分類(Kabat等人之上述文獻))之考量。該Kabat編號方案(系統)係一種廣泛採取之以一致方式編號抗體可變域之胺基酸殘基之標準且係如亦於本文別處提及之本發明中應用之較佳方案。亦可使用額外結構考量以判定抗體之正則結構。例如，藉由Kabat編號無法充分體現之彼等差異可藉由Chothia等人之編號系統描述及/或藉由其他技術(例如，結晶學及二維或三維之計算建模)揭示。因此，可將給定之抗體序列置於正則類別中，該正則類別容許尤其識別合適之框架(classis)序列(例如，基於渴望包括文庫中之各種正則結構)。抗體胺基酸序列之Kabat編號及如藉由Chothia等人之上述文獻描述之結構考量及其於解釋抗體結構之正則態樣之意涵描述於該文獻中。此項技術中熟知不同類別之免疫球蛋白之亞單元結構及三維結構。為檢視抗體結構，參見Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow等人編，1988。

輕鏈之CDR3及(特定言之)重鏈之CDR3可構成抗原結合中之位於輕鏈及重鏈可變區內之最重要決定子。在一些抗體構築體中，該重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體間之接觸之主要區域。可使用僅CDR3變化之活體外選擇方案以改變抗體之結合性質或判定有助於抗原之結合之殘基。因此，CDR3通常係抗體結合位點中之分子多樣性之最大來源。H3(例如)可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。

在經典全長抗體或免疫球蛋白中，各輕(L)鏈係藉由一個共價雙硫鍵與重鏈(H)連接，而兩條H鏈係經由一個或兩個雙硫鍵(視H鏈同型物而定)而彼此連接。與VH最接近之CH域通常稱為CH1。恆定「C」域係不直接涉及抗原結合，但顯示各種效應子功能例如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。抗體之Fc區係包含於重鏈恆定域內且例如能夠與定位於細胞表面之Fc受體相互作用。

組裝及體細胞突變後之抗體基因之序列高度變化，並評估此等經變化之基因以編碼10¹⁰ 個不同抗體分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人編，Academic Press,San Diego,CA,1995)。因此，該免疫系統提供免疫球蛋白庫。術語「庫」係指至少一個自至少一個編碼至少一個免疫球蛋白之序列完全或部分衍生的核苷酸序列。該(等)序列可藉由重鏈之V、D及J段及輕鏈之V及J段之活體內重排產生。或者，該(等)序列可自細胞對重排發生(例如，活體外刺激)之反應來產生。或者，該(等)序列中之部分或全部可藉由DNA剪接、核苷酸合成、誘變及其他方法(參見，例如，美國專利案第5,565,332號)獲得。庫可包含僅一個序列或可包含複數個序列(包含遺傳多樣性收集中之序列)。

術語「Fc部分」或「Fc單體」結合本發明意謂多肽，其包含至少一個具有免疫球蛋白分子之CH2域功能之域及至少一個具有免疫球蛋白分子之CH3域功能之域。自術語「Fc單體」可知，包含彼等CH域之多肽係「多肽單體」。Fc單體可為包含免疫球蛋白之恆定區之至少一個片段之多肽，其不包含重鏈之第一恆定區免疫球蛋白域(CH1)，但至少保留一個CH2域之功能部分及一個CH3之功能部分，其中該CH2域對該CH3域係胺基端。在該定義之一較佳態樣中，Fc單體可為包含Ig-Fc鉸鏈區之部分的多肽恆定區、CH2區及CH3區，其中該鉸鏈區對CH2域係胺基端。設想本發明之鉸鏈區促進二聚化。此類Fc多肽分子可(例如但不限於)藉由木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白區(當然產生兩條Fc多肽之二聚體)來獲得。在該定義之另一態樣中，Fc單體可為多肽區，其包含CH2區之部分及CH3區。此類Fc多肽分子可(例如但不限於)藉由胃蛋白酶消化免疫球蛋白分子來獲得。在一個實施例中，Fc單體之多肽序列係實質上與以下之Fc多肽序列類似：IgG₁ Fc區、IgG₂ Fc區、IgG₃ Fc區、IgG₄ Fc區、IgM Fc區、IgA Fc區、IgD Fc區及IgE Fc區。(參見例如Padlan,Molecular Immunology,31(3),169-217(1993))。因為免疫球蛋白之間存在一些變異，因此僅為清楚起見，Fc單體係指IgA、IgD及IgG之後兩個重鏈恆定區免疫球蛋白域及IgE及IgM之後三個重鏈恆定區免疫球蛋白域。如上所述，該Fc單體亦可包括此等域之可撓性鉸鏈N端。對於IgA及IgM，該Fc單體可包括J鏈。對於IgG，該Fc部分包含免疫球蛋白域CH2及CH3及介於前兩個域與CH2之間之鉸鏈。雖然Fc部分之邊界可變化，但例如包含功能鉸鏈、CH2及CH3域之人類IgG重鏈Fc部分之一實例可經定義例如以包含殘基D231(位於鉸鏈域，對應下表1中的D234)至CH3域之羧基端之P476(分別係L476(對於IgG₄ ))，其中該編號係根據Kabat。經由肽連接子彼此融合之兩個Fc部分或Fc單體界定本發明之抗體構築體之第三域，其亦可定義為scFc域。

在本發明之一個實施例中，設想如文中揭示之scFc域，分別係彼此融合之Fc單體僅包含於抗體構築體之第三域中。

根據本發明，IgG鉸鏈區可藉由類似使用如表1中所述之Kabat編號來識別。根據上文，針對根據本發明之本發明鉸鏈域/區所設想之最低要求係包含對應根據Kabat編號之D231 D234至P243之IgG1序列延伸物之胺基酸殘基。亦設想本發明之鉸鏈域/區包含IgG1鉸鏈序列DKTHTCPPCP(SEQ ID NO：477)(對應如下表1中所示之延伸物D234至P243，亦設想該等序列之變異，條件是鉸鏈區仍促進二聚化)或由其組成。在本發明之一個較佳實施例中，抗體構築體之第三域中之CH2域之Kabat位置314醣苷化位點係藉由N314X取代來移除，其中X係除Q以外之任何胺基酸。該取代較佳係N314G取代。在一更佳實施例中，該CH2域另外包含以下取代(根據Kabat之位置)V321C及R3()9C(此等取代在Kabat位置309及321引入域內半胱胺酸雙硫橋)。

亦設想本發明抗體構築體之第三域按胺基至羧基順序包含：DKTHTCPPCP(SEQ ID NO：477)(亦即，鉸鏈)-CH2-CH3-連接子-DKTHTCPPCP(SEQ ID NO：477)(亦即，鉸鏈)-CH2-CH3或由其組成。在一較佳實施例中，前述抗體構築體之肽連接子係以胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(亦即，Gly4Ser(SEQ ID NO：1)或其聚合物(亦即， (Gly4Ser)x，其中x係5或更大(例如，5、6、7、8等或更大)之整數，6係較佳((Gly4Ser)6))為特徵。該構築體可另外包含前述取代N314X(較佳N314G)及/或進一步取代V321C及R309C。在如前文中所定義之本發明抗體構築體之一較佳實施例中，設想第二域結合至人類及/或獼猴CD3ε鏈之細胞外抗原決定基。

在本發明之其他實施例中，鉸鏈域/區包含IgG2亞型鉸鏈序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：478)、IgG3亞型鉸鏈序列ELKTPLDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：479)或ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：486)及/或IgG4亞型鉸鏈序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：480)或由其組成。該IgG1亞型鉸鏈序列可為以下序列EPKSCDKTHTCPPCP(如表1及SEQ ID NO：487中所示)。因此，本發明內文中亦設想此等核心鉸鏈區。

IgG CH2及IgG CD3域之定位及序列可藉由使用如表2中所述之Kabat編號的同功性來識別。

在本發明之一個實施例中，第一或兩個Fc單體之C3域中之粗體強調的胺基酸缺失。

該肽連接子(藉其可使第三域之多肽單體(「Fc部分」或「Fc單體」)彼此融合)較佳包含至少25個胺基酸殘基(25、26、27、28、29、30等)。更佳地，該肽連接子包含至少30個胺基酸參加(30、31、32、33、34、35等)。亦較佳地，該連接子包含至多40個胺基酸殘基，更佳至多35個胺基酸殘基，最佳確切30個胺基酸殘基。此肽連接子之一較佳實施例的特徵為胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(亦即Gly₄ Ser(SEQ ID NO：1))或其聚合物(亦即(Gly₄ Ser)x，其中x係5或更大之整數(例如，6、7或8))。較佳地，該整數係6或7，更佳該整數係6。

在使用連接子以將第一域融合至第二域或以將第一或第二域融合至第三域之事件中，該連接子較佳具有足以確保第一及第二域各可獨立於另一者而保留其差異結合特異性之長度及序列。對於連接本發明抗體構築體之至少兩個結合域(或兩個可變域)之肽連接子，彼等肽連接子較佳包含僅少數胺基酸殘基(例如12個胺基酸殘基或更少)。因此，以具有12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基之肽連接子為較佳。所設想的具有少於5個胺基酸之肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸，其中以富含Gly之連接子為較佳。融合第一及第二域之肽連接子之一較佳實施例係描繪於SEQ ID NO：1中。用於融合第二及第三域之肽連接子之一較佳連接子實施例係(Gly)₄ -連接子，亦稱為G₄ -連接子。

上述「肽連接子」中之一者之狀況中之一特別佳「單」胺基酸係Gly。因此，該肽連接子可由單胺基酸係Gly組成。在本發明之一較佳實施例中，肽連接子之特徵為胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(亦即Gly₄ Ser(SEQ ID NO：1))或其聚合物(亦即(Gly₄ Ser)x，其中x係1或更大之整數(例如，2或3))。較佳連接子係描繪於SEQ ID NO：1至12中。該肽連接子(其包含二級結構之促進之缺乏)之特徵係此項技術中已知且描述於例如Dall’Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29,21-30)及Raag及Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。以另外不促進任何二級結構之肽連接子為較佳。該等域至彼此之連接可例如藉由如實例中所述之基因工程來提供。用於製備經融合且以可操作方式連接之雙特異性單鏈構築體並使其於哺乳動物細胞或細菌中表現之方法係此項技術中熟知(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。

在本發明之抗體構築體之一較佳實施例中，第一及第二域形成呈選自由以下組成之群之形式之抗體構築體：(scFv)₂ 、scFv-單域mAb、雙功能抗體及彼等形式中之任何一者之寡聚體。

根據一特別佳實施例，並如隨附實例中所述，本發明之抗體構築體之第一及第二域係「雙特異性單鏈抗體構築體」，更佳雙特異性「單鏈Fv」(scFv)。雖然Fv片段之兩個域(VL及VH)受獨立基因編碼，但其等可使用重組方法藉由合成連接子(如前文所述)來連接，該合成連接子能夠使其等製備成其中VL及VH區配對以形成單價分子之蛋白質單鏈；參見例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。此等抗體片段係利用熟習此項技術者知曉的常規技術而獲得，且該等片段係以與完整抗體相同的方式來評估功能。單鏈可變片段(scFv)因此係免疫球蛋白之重鏈(VH)之可變區及免疫球蛋白之輕鏈(VL)之可變區之融合蛋白，其通常以具有約10至約25個胺基酸(較佳約15至20個胺基酸)之短連接肽連接。該連接子通常富含甘胺酸而具有可撓性以及富含絲胺酸或蘇胺酸而具有溶解性，且可連接VH之N端與VL之C端，或反之亦然。雖然移除恆定區及引入連接子，但該蛋白質仍保留原始免疫球蛋白之特異性。

雙特異性單鏈抗體構築體係此項技術中已知且描述於WO 99/54440；Mack,J.Immunol.(1997),158,3965-3970；Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,(1997),45,193-197；Löffler,Blood,(2000),95,6,2098-2103；Brühl,Immunol.,(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.,(1999),293,41-56中。針對產生單鏈抗體所述之技術(參見尤其美國專利案4,946,778、Kontermann及Dübel(2010)上述文獻及Little(2009)上述文獻)可經採用以產生特異性識別選定標靶之單鏈抗體構築體。

雙價(亦稱為二價)或雙特異性單鏈可變片段((具有(scFv)₂ 形式之bi- scFv或di-scFv)可藉由連接兩個scFv分子(例如藉由如前文所述之連接子)來工程設計。倘若此等兩個scFv分子具有相同結合特異性，則所得(scFv)₂ 分子將較佳稱為雙價(亦即，其針對相同標靶抗原決定基具有兩個效價)。倘若此等兩個scFv分子具有不同結合特異性，則所得(scFv)₂ 分子將較佳稱為雙特異性。該連接可藉由產生具有兩個VH區及兩個VL區之單一肽鏈，產生串聯scFv來完成(參見例如Kufer P.等人(2004)Trends in Biotechnology 22(5)：238-244)。另一種可能性係以連接肽產生scFv分子，該等連接肽過短以致於無法使兩個可變區折疊在一起(例如，約五個胺基酸)，從而使該等scFv二聚化。此類型稱為雙功能抗體(參見例如Hollinger,Philipp等人，(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(14)：6444-8)。

根據本發明，第一、第二或第一及第二域可含單域抗體，分別為單域抗體之可變域或至少CDR。單域抗體包含僅一個(單體)抗體可變域，其能夠選擇性結合至特異性抗原，與其他V區或域無關。第一單域抗體係自駱駝抗體中發現之重鏈抗體經工程設計，且此等稱為V_H H片段。軟骨魚(Cartilaginous fish)亦具有重鏈抗體(IgNAR)，自其可獲得稱為V_NAR 片段之單域抗體。一種替代性方法係將來自共同免疫球蛋白(例如來自人類或囓齒動物)之二聚可變域分解成單體，因此獲得VH或VL作為單域Ab。雖然目前大多數針對單域抗體之研究係基於重鏈可變域，自輕鏈衍生之奈米抗體亦顯示特異性結合至標靶抗原決定基。單域抗體之實例稱為sdAb、奈米抗體或單可變域抗體。

因此，(單域mAb)₂ 係由(至少)兩個單域單株抗體(其等個別地選自包含V_H 、V_L 、V_H H及V_NAR 之群組)組成之單株抗體構築體。該連接子較佳呈肽連接子之形式。類似地，「scFv-單域mAb」係由至少一個上述單域抗體及一個上述scFv分子組成之單株抗體構築體。再次，該連接子較佳呈肽連接子之形式。

抗體構築體是否與另一給定抗體構築體競爭性結合可於競爭分析例如競爭性ELISA或基於細胞之競爭分析中量測。亦可使用抗生物素蛋白(avidin)偶聯之微粒(珠粒)。與經抗生物素蛋白塗覆之ELISA板類似，當與生物素化蛋白反應時，此等珠粒各用作可進行分析之受質。將抗原塗覆至珠粒上並隨後經第一抗體預塗覆。添加第二抗體並測定任何其他結合。讀取之可能方式包括流式細胞測量術。

T細胞或T淋巴細胞係一種淋巴細胞類型(其本身為一種白血球類型)，其在細胞介導之免疫性中具有重要作用。T細胞存在若干種子集，各具有獨特功能。T細胞可藉由細胞表面上存在T細胞受體(TCR)而區別於其他淋巴細胞例如B細胞及NK細胞。該TCR負責識別與主要組織相容性複合體(MHC)分子結合之抗原且由兩種不同蛋白質鏈組成。在95%的T細胞中，TCR由阿爾法(α)及貝塔(β)鏈組成。當TCR嚙合抗原性肽及MHC(肽/MHC複合體)時，T淋巴細胞經由一系列由相關酵素、共受體、特殊化適體分子及活化之或釋放之轉綠因子介導之生物化學事件而活化。

CD3受體複合體係蛋白質複合體且由四條鏈組成。在哺乳動物中，該複合體含有CD3γ(伽馬)鏈、CD3δ(德塔)鏈及兩條CD3ε(艾蒲賽隴)鏈。此等鏈與T細胞受體(TCR)及所謂之ζ(澤塔)鏈結合以形成T細胞受體CD3複合體且以在T淋巴細胞中產生活化信號。CD3γ(伽馬)鏈、CD3δ(德塔)鏈及CD3ε(艾蒲賽隴)鏈係免疫球蛋白超家族之包含單細胞外免疫球蛋白域之高度相關細胞表面蛋白質。CD3分子之細胞內尾巴包含單一保守基元，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或簡稱為ITAM，其對於TCR之信號傳遞能力而言是必要的。CD3ε分子係多肽，其在人類中係由位於11號染色體上之CD3E基因編碼。CD3ε之最佳抗原決定基係包含於人類CD3ε細胞外域之胺基酸殘基1至27內。設想根據本發明之抗體構築體通常且宜顯示較少非特異性T細胞活化，其在特異性免疫療法中非所欲。此相當於副作用之減低風險。

經由募集T細胞以多特異性(至少雙特異性)抗體構築體重定向溶解靶細胞涉及溶細胞突觸形成及穿孔素及顆粒酶之遞送。嚙合之T細胞能夠連續溶解靶細胞且不受干擾肽抗原處理及呈遞或選殖T細胞分化之免疫逃逸機制影響；參見例如WO 2007/042261。

由本發明之抗體構築體介導之細胞毒性可以各種方式量測。效應子細胞可為例如受激之富集型(人類)CD8陽性T細胞或未受激之(人類)周邊血液單核細胞(PBMC)。倘若靶細胞係獼猴起源或表現或經與第一域結合之獼猴PSMA轉染，則效應子細胞應亦為獼猴起源例如獼猴T細胞系，例如4119LnPx。該等靶細胞應表現PSMA(例如人類或獼猴PSMA)(之至少細胞外域)。靶細胞可為經PSMA(例如人類或獼猴PSMA)穩定或暫態轉染之細胞系(例如CHO)。通常預期在細胞表面上表現較高水平之PSMA的靶細胞系的EC₅₀ 值較低。效應子對靶細胞(E：T)之比值通常係約10：1，但亦可變化。PSMAxCD3雙特異性抗體構築體之細胞毒性活性可於⁵¹ 鉻釋放分析(培養時間約18小時)中或於基於FACS之細胞毒性分析(培養時間約48小時)中量測。分析培養時間(細胞毒性反應)之修改亦係可能的。量測細胞毒性之其他方法係熟習此項技術者熟知且包括MTT或MTS分析、基於ATP之分析(包括生物發光分析)、磺醯羅丹明B(SRB)分析、WST分析、選殖性分析及ECIS技術。

由本發明之PSMAxCD3雙特異性抗體構築體介導之細胞毒性活性較佳係於基於細胞之細胞毒性分析中量測。其亦可於⁵¹ 鉻釋放分析中量測。其由EC₅₀ 值表示，EC₅₀ 值對應半最大有效濃度(誘導介於基線與最大值之間之半途之細胞毒性反應之抗體構築體濃度)。較佳地，PSMAxCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值係

5000pM或

4000pM，更佳

3000pM或

2000pM，甚至更佳

1000pM或

500pM，甚至更佳

400pM或

300pM，甚至更佳

200pM，甚至更佳

100pM，甚至更佳

50pM，甚至更佳

20pM或

10pM，及最佳

5pM。

上述給定EC₅₀ 值可於不同分析中量測。熟習此項技術者知曉：與未受激之PBMC相比，當使用受激/富集CD8⁺ T細胞作為效應子細胞時，可預期EC₅₀ 值更低。可另外預期，與低標靶表現大鼠相比，當靶細胞表現高數量PSMA時，EC₅₀ 值更低。例如，當使用受激/富集CD8⁺ T細胞作為效應子細胞(及使用PSMA轉染之細胞例如CHO細胞或PSMA陽性人類細胞系作為靶細胞)時，PSMAxCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值較佳係

1000pM，更佳

500pM，甚至更佳

250pM，甚至更佳

100pM，甚至更佳

50pM，甚至更佳

10pM，及最佳

5pM。當使用PBMC作為效應子細胞時，PSMAxCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值較佳係

5000pM或

4000pM(特定言之當靶細胞係PSMA陽性人類細胞系時)，更佳

2000pM(特定言之當靶細胞係PSMA轉染之細胞例如CHO細胞時)，更佳

1000pM或

500pM，甚至更佳

200pM，甚至更佳

100pM，甚至更佳

150pM，甚至更佳

100pM，及最佳

50pM或更低。當使用獼猴T細胞系例如LnPx4119作為效應子細胞，及使用獼猴PSMA轉染之細胞系例如CHO 細胞作為靶細胞系時，PSMAxCD3雙特異性抗體構築體之EC₅₀ 值較佳係

2000pM或

1500pM，更佳

1000pM或

500pM，甚至更佳

300pM或

250pM，甚至更佳

100pM，及最佳

50pM。

較佳地，本發明之PSMAxCD3雙特異性抗體構築體不誘導/介導溶解或基本上不誘導/介導溶解PSMA陰性細胞例如CHO細胞。術語「不誘導溶解」、「基本上不誘導溶解」、「不介導溶解」、「基本上不介導溶解」意謂本發明之抗體構築體不誘導或介導大於30%，較佳不大於20%，更佳不大於10%，特別佳不大於9%、8%、7%、6%或5%的PSMA陰性細胞之溶解，藉此PSMA陽性人類細胞系之溶解設定為100%。此通常適用於抗體構築體之至多500nM之濃度。熟習此項技術者知曉如何簡便地量測細胞溶解。另外，本說明書教示如何量測細胞溶解之具體說明。

個別PSMAxCD3雙特異性抗體構築體之單體及二聚體同功異型體之間之細胞毒性活性之差異稱作「效力差距(potency gap)」。此效力差距可例如計算為分子之單體及二聚體形式之EC₅₀ 值之間之比例。本發明之PSMAxCD3雙特異性抗體構築體之效力差距較佳係

5，更佳

4，甚至更佳

3，甚至更佳

2及最佳

1。

本發明之抗體構築體之第一及/或第二(或任何其他)結合域較佳係對哺乳動物靈長目之成員具跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合域係例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施例，第一及/或第二結合域除分別結合至人類PSMA及人類CD3以外亦結合至靈長類(包括但不限於新世界靈長類(例如白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴)、舊世界靈長類(例如狒狒(baboon)及獼猴)、長臂猿(gibbon)及非人類人亞科(homininae))之PSMA/CD3。

在本發明之抗體構築體之一個實施例中，該第一域結合至人類PSMA及另外結合至獼猴PSMA(例如食蟹猴(Macaca fascicularis)之PSMA)及更佳結合至表現於獼猴表面細胞上之獼猴PSMA。第一域對PSMA(較佳人類PSMA)之親和力較佳係

100nM或

50nM，更佳

25nM或

20nM，更佳

15nM或

10nM，甚至更佳

5nM，甚至更佳

2.5nM或

2nM，甚至更佳

1nM，甚至更佳

0.6nM，甚至更佳

0.5nM，及最佳

0.4nM。該親和力可例如於BIAcore分析或Scatchard分析中量測。測定該親和力之其他方法亦為熟習此項技術者熟知。第一域對獼猴PSMA之親和力較佳係

15nM，更佳

10nM，甚至更佳

5nM，甚至更佳

1nM，甚至更佳

0.5nM，甚至更佳

0.1nM，及最佳

0.05nM或甚至

0.01nM。

較佳地，根據本發明之抗體構築體對結合獼猴PSMA相對於人類PSMA之親和力差距[ma PSMA：hu PSMA](如例如藉由BiaCore或藉由Scatchard分析測定)係<100，較佳<20，更佳<15，更佳<10，甚至更佳<8，更佳<6及最佳<2。根據本發明之抗體構築體對結合獼猴PSMA相對於人類PSMA之親和力差距之較佳範圍係介於0.1與20之間，更佳介於0.2與10之間，甚至更佳介於0.3與6之間，甚至更佳介於0.5與3之間或介於0.5與2.5之間，及最佳介於0.5與2之間或介於0.6與2之間。

本發明之抗體構築體之第二域結合至人類CD3ε及/或結合至獼猴CD3ε。在一較佳實施例中，該第二域另外結合至白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3ε。白鬢狨及棉冠獠狨均為屬於狨猴科(Callitrichidae)家族之新世界靈長類，而松鼠猴係卷尾猴科家族(Cebidae)之新世界靈長類。

對於本發明之抗體構築體而言較佳的是，結合至人類及/或獼猴CD3ε 鏈之細胞外抗原決定基之第二域包含包括選自以下之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區：(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：27中所述之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：28中所述之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：29中所述之CDR-L3；(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：117中所述之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：118中所述之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：119中所述之CDR-L3；及(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：153中所述之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：154中所述之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：155中所述之CDR-L3。

在本發明之另一較佳實施例中，結合至人類及/或獼猴CD3ε鏈之細胞外抗原決定基之第二域包含包括選自以下之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區：(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：12中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：13中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：14中所述之CDR-H3；(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：30中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：31中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：32中所述之CDR-H3；(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：48中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：49中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：50中所述之CDR-H3； (d)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：66中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：67中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：68中所述之CDR-H3；(e)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：84中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：85中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：86中所述之CDR-H3；(f)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：102中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：103中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：104中所述之CDR-H3；(g)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：120中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：121中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：122中所述之CDR-H3；(h)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：138中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：139中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：140中所述之CDR-H3；(i)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：156中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：157中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：158中所述之CDR-H3；及(j)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：174中所述之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO：175中所述之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：176中所述之CDR-H3。

在本發明之抗體構築體之一較佳實施例中，將上述三組VL CDR與上述十組VH CDR組合於第二結合域內組合以形成(30)組，各包含CDR-L 1- 3及CDR-H 1-3。

對於本發明之抗體構築體而言較佳的是，結合至CD3之第二域包含包括選自由彼等描述於WO 2008/119567之SEQ ID NO：17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183或描述於SEQ ID NO：13中者組成之群之VL區。

亦較佳的是，結合至CD3之第二域包含包括選自由彼等描述於WO 2008/119567之SEQ ID NO：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181或如SEQ ID NO：14中中者組成之群之VH區。

更佳地，本發明之抗體構築體之特徵為結合至CD3之包含選自由以下組成之群之VL區及VH區之第二域：(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：17或21中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：15或19中所述之VH區；(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：35或39中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：33或37中所述之VH區；(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：53或57中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：51或55中所述之VH區；(d)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：71或75中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：69或73中所述之VH區；(e)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：89或93中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：87或91中所述之VH區；(f)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：107或111中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：105或109中所述之VH區； (g)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：125或129中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：123或127中所述之VH區；(h)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：143或147中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：141或145中所述之VH區；(i)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：161或165中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：159或163中所述之VH區；及(j)如WO 2008/119567之SEQ ID NO：179或183中所述之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO：177或181中所述之VH區。

結合本發明之抗體構築體亦較佳的為結合至CD3之包含如SEQ ID NO：13中所述之VL區及如SEQ ID NO：14中所述之VH區之第二域。

根據本發明之抗體構築體之一較佳實施例，該第一及/或第二域具有以下形式：VH區及VL區之對係呈單鏈抗體(scFv)之形式。VH區及VL區係以順序VH-VL或VL-VH配置。較佳的是，VH區係定位在連接子序列之N端，及VL區係定位在該連接子序列之C端。

上述本發明抗體構築體之一較佳實施例之特徵為結合至CD3之包含選自由WO 2008/119567之SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187組成之群之胺基酸序列或如SEQ ID NO：15中所述之胺基酸序列之第二域。

亦設想本發明之抗體構築體之第一結合域包含包括選自由以下組成之群之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區及包括選自由以下組成之群之CDR-H1、CDR-H2及CDR-3之VH區：(a)如SEQ ID NO：45中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：46中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：47中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：42中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：43中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：44中所述之CDR-H3；(b)如SEQ ID NO：63中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：64中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：65中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：60中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：61中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：62中所述之CDR-H3；(c)如SEQ ID NO：81中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：82中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：83中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：78中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：79中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：80中所述之CDR-H3；(d)如SEQ ID NO：99中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：100中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：101中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：96中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：97中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：98中所述之CDR-H3；(e)如SEQ ID NO：117中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：118中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：119中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：114中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：115中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：116中所述之CDR-H3；(f)如SEQ ID NO：135中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：136中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：137中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：132中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：133中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：134中所述之CDR-H3； (g)如SEQ ID NO：153中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：154中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：155中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：150中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：151中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：152中所述之CDR-H3；(h)如SEQ ID NO：171中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：172中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：173中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：168中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：169中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：170中所述之CDR-H3；(i)如SEQ ID NO：189中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：190中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：191中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：186中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：187中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：188中所述之CDR-H3；(j)如SEQ ID NO：207中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：208中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：209中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：204中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：205中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：206中所述之CDR-H3；(k)如SEQ ID NO：225中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：226中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：227中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：222中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：223中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：224中所述之CDR-H3；(l)如SEQ ID NO：243中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：244中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：245中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：240中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：241中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：242中所述之CDR-H3；(m)如SEQ ID NO：261中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：262中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：263中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：258中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：259中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：260中所述之CDR-H3；(n)如SEQ ID NO：279中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：280中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：281中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：276中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：277中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：278中所述之CDR-H3；及(o)如SEQ ID NO：297中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：298中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：299中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：294中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：295中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：296中所述之CDR-H3；(p)如SEQ ID NO：315中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：316中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：317中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：312中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：313中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：314中所述之CDR-H3；(q)如SEQ ID NO：330中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：331中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：332中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：327中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：328中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：329中所述之CDR-H3；(r)如SEQ ID NO：345中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：346中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：347中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：342 中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：343中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：344中所述之CDR-H3；(s)如SEQ ID NO：360中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：361中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：362中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：357中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：358中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：359中所述之CDR-H3；(t)如SEQ ID NO：375中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：376中所述之CDR-L2、如SEQ I D NO：377中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：372中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：373中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：374中所述之CDR-H3；(u)如SEQ ID NO：390中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：391中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：392中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：387中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：388中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：389中所述之CDR-H3；(v)如SEQ ID NO：405中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：406中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：407中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：402中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：403中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：404中所述之CDR-H3；(w)如SEQ ID NO：420中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：421中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：422中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：417中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：418中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：419中所述之CDR-H3；(x)如SEQ ID NO：435中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：436中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：437中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：432中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：433中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：434中所述之CDR-H3；(y)如SEQ ID NO：45()中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：451中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：452中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：447中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：448中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：449中所述之CDR-H3；(z)如SEQ ID NO：465中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：466中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：467中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：462中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：463中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：464中所述之CDR-H3。

另外設想本發明之抗體構築體之第一結合域包含選自由以下組成之群之VH區及VL區：(a)如SEQ ID NO：48中所述之VH區及如SEQ ID NO：49中所述之VL區；(b)如SEQ ID NO：66中所述之VH區及如SEQ ID NO：67中所述之VL區；(c)如SEQ ID NO：72中所述之VH區及如SEQ ID NO：73中所述之VL區；(d)如SEQ ID NO：84中所述之VH區及如SEQ ID NO：85中所述之VL區；(e)如SEQ ID NO：90中所述之VH區及如SEQ ID NO：91中所述之VL區； (f)如SEQ ID NO：102中所述之VH區及如SEQ ID NO：103中所述之VL區；(g)如SEQ ID NO：108中所述之VH區及如SEQ ID NO：109中所述之VL區；(h)如SEQ ID NO：120中所述之VH區及如SEQ ID NO：121中所述之VL區；(i)如SEQ ID NO：126中所述之VH區及如SEQ ID NO：127中所述之VL區；(j)如SEQ ID NO：138中所述之VH區及如SEQ ID NO：139中所述之VL區；(k)如SEQ ID NO：144中所述之VH區及如SEQ ID NO：145中所述之VL區；(l)如SEQ ID NO：156中所述之VH區及如SEQ ID NO：157中所述之VL區；(m)如SEQ ID NO：162中所述之VH區及如SEQ ID NO：163中所述之VL區；(h)如SEQ ID NO：180中所述之VH區及如SEQ ID NO：181中所述之VL區；(n)如SEQ ID NO：192中所述之VH區及如SEQ ID NO：193中所述之VL區；(o)如SEQ ID NO：198中所述之VH區及如SEQ ID NO：199中所述之VL區；(p)如SEQ ID NO：210中所述之VH區及如SEQ ID NO：211中所述之VL區；(q)如SEQ ID NO：216中所述之VH區及如SEQ ID NO：217中所述之VL區；(r)如SEQ ID NO：228中所述之VH區及如SEQ ID NO：229中所述之VL區；(s)如SEQ ID NO：234中所述之VH區及如SEQ ID NO：235中所述之VL區；(t)如SEQ ID NO：246中所述之VH區及如SEQ ID NO：247中所述之VL區；(u)如SEQ ID NO：252中所述之VH區及如SEQ ID NO：253中所述之VL區；(v)如SEQ ID NO：264中所述之VH區及如SEQ ID NO：265中所述之VL區；(w)如SEQ ID NO：270中所述之VH區及如SEQ ID NO：271中所述之VL區；(x)如SEQ ID NO：282中所述之VH區及如SEQ ID NO：283中所述之VL區；(y)如SEQ ID NO：288中所述之VH區及如SEQ ID NO：289中所述之VL區；(z)如SEQ ID NO：300中所述之VH區及如SEQ ID NO：301中所述之VL區；(ab)如SEQ ID NO：306中所述之VH區及如SEQ ID NO：307中所述之VL區； (ac)如SEQ ID NO：54中所述之VH區及如SEQ ID NO：55中所述之VL區；(ad)如SEQ ID NO：174中所述之VH區及如SEQ ID NO：175中所述之VL區；(ae)如SEQ ID NO：318中所述之VH區及如SEQ ID NO：319中所述之VL區；(af)如SEQ ID NO：333中所述之VH區及如SEQ ID NO：334中所述之VL區；(ag)如SEQ ID NO：348中所述之VH區及如SEQ ID NO：349中所述之VL區；(ah)如SEQ ID NO：363中所述之VH區及如SEQ ID NO：364中所述之VL區；(ai)如SEQ ID NO：378中所述之VH區及如SEQ ID NO：379中所述之VL區；(aj)如SEQ ID NO：393中所述之VH區及如SEQ ID NO：394中所述之VL區；(ak)如SEQ ID NO：408中所述之VH區及如SEQ ID NO：409中所述之VL區；(al)如SEQ ID NO：423中所述之VH區及如SEQ ID NO：424中所述之VL區；(am)如SEQ ID NO：438中所述之VH區及如SEQ ID NO：439中所述之VL區；(an)如SEQ ID NO：453中所述之VH區及如SEQ ID NO：454中所述之VL區；及(ao)如SEQ ID NO：468中所述之VH區及如SEQ ID NO：469中所述之VL區。

另外設想本發明之抗體構築體之第一結合域包含選自彼等描述於SEQ ID NO：50、56、68、74、86、92、104、110、122、128、140、146、158、164、176、182、194、200、212、218、230、236、248、254、266、272、284、290、302、308、320、335、350、365、380、395、410、425、440、455及470中者組成之群之胺基酸序列。

本發明另外提供一種包含或具有選自由SEQ ID NO：51、57、69、75、87、93、105、111、123、129、141、147、159、165、177、183、195、201、213、219、231、237、249、255、267、273、285、291、303、309、321、324、336、339、351、354、366、369、381、384、396、399、411、414、426、429、441、444、456、459、471及474組成之群之胺基酸序列之抗體構築體。

抗體構築體之共價修飾亦包括於本發明之範圍內，且通常(但不總是)在轉譯後修飾來完成。例如，抗體構築體之共價修飾之若干類型係藉由使該抗體構築體之特異性胺基酸殘基與有機衍生劑(其能夠與選定側鏈或N-或C-端殘基反應)反應而引入分子中。

半胱胺醯殘基最常見與α-鹵代乙酸鹽(及對應胺)(例如氯乙酸或氯乙醯胺)反應以提供羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯殘基亦係藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯磷酸鹽、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基-2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑反應來衍生。

組胺醯殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦炭酸二乙酯反應來衍生，因為此試劑對組胺醯側鏈具有相對特異性。對溴苯醯甲基溴亦適用；該反應較佳在pH 6.0下在0.1M甲胂酸鈉中進行。離胺醯基及胺基端殘基係與琥珀酸或其他羧酸酸酐反應。使用此等試劑之衍生反應具有逆轉離胺醯基殘基之電荷之效應。其他適用於衍生含有α-胺基之殘基之試劑包括例如甲基吡啶亞胺酸甲酯之亞胺酸酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氫化氯硼、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮；及經轉胺酶催化之與乙醛酸鹽的反應。

精胺醯殘基係藉由與一種或若干種習知試劑反應來修飾，該等試劑尤其係苯基乙二醛、2,3-丁二銅、1,2-環己二酮及茚三酮。因為胍官能基之高pKa，因此精胺酸殘基之衍生反應需要在鹼性條件下進行。此外，此等試劑可與離胺酸之基團及精胺酸ε-胺基基團反應。

可進行酪胺醯殘基之特異性修飾，且特別關注於藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷之反應將光譜標記引入酪胺醯殘基中。最通常，使用N-乙醯咪唑及四硝基甲烷以分別形成O-乙醯酪胺醯物質及3-硝基衍生物。使用¹²⁵ I或¹³¹ I碘化酪胺醯殘基以製備經標記之蛋白質以用於放射性免疫分析(上述氯胺T方法係適合的)。

藉由與碳二亞胺(R'-N=C=N--R')之反應選擇性修飾羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)，其中R及R'視需要係不同烷基，例如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子之反應轉化為天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。

利用雙官能試劑進行之衍化反應適用於使本發明之抗體構築體交聯至各種方法中所用之水不溶性支撐基質或表面。常用交聯試劑包含(例如)1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯類(例如)，與4-疊氮基水楊酸形成之酯類)、同源雙官能亞胺基酯(包括二琥珀醯亞胺酯例如3,3'-二硫基雙(琥珀醯亞胺丙酸酯))及雙官能馬來醯亞胺(例如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷)。例如3-[(對疊氮苯基)二硫]丙醯亞胺甲酯之衍化劑產生能夠在光之存在下形成交聯之可光活化中間物。或者，使用例如描述於美國專利案第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中之經溴化氰活化之碳水化合物之反應性水不溶性基質及反應性底物以供蛋白質固定化。

麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基通常脫醯胺基分別成為相應之麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，此等殘基在弱酸性條件下脫醯胺基。此等殘基之任一形式落於本發明之範圍內。

其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983，第79-86頁)；N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。

包含在本發明範圍內之抗體構築體之另一類型之共價修飾包括改變蛋白質之醣苷化模式。如此項技術中已知，醣苷化模式可取決於蛋白質之兩種序列(例如，存在或缺乏特定醣苷化胺基酸殘基，如下文討論)，或製造該蛋白質之宿主細胞或生物。下文討論特定表現系統。

多肽之醣苷化通常係N-連接型或O-連接型。N-連接型係指碳水化合物僅附接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外之任何胺基酸)係用於碳水化合物部分至天冬醯胺酸側鏈之酶催化附接之識別序列。因此，多肽中之此等三肽序列之任一者之存在產生可能之醣苷化位點。O-連接型醣苷化係指糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附接至羥基胺基酸，最通常係絲胺酸或蘇胺酸，然而亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

向抗體構築體添加醣苷化位點係藉由改變胺基酸序列以使得其含有一或多個上述三肽序列(就N-連接型醣苷化位點而言)來便捷地完成。該改變亦可藉由向起始序列添加或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基(就O-連接型醣苷化位點)。出於方便之目的，抗體構築體之胺基酸序列較佳係通過在DNA級別上之變化來改變，特別藉由於既定預選鹼基處使編碼該多肽之DNA突變使得產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子。

增加抗體構築體上之碳水化合物部分之數量之其他方法係藉由化學或酶催化偶合糖苷與蛋白質。此等程序的優點在於其等無需在具有N-及O-連接型醣苷化之醣苷化能力之宿主細胞中製造蛋白質。取決於所用之偶合模式，該(等)糖可附接至(a)精胺酸及組胺酸；(b)游離羧基；(c)游離硫氫基(例如半胱胺酸之彼等)；(d)游離羥基(例如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等)；(e)芳族殘基(例如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等)；或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306頁中。

存在於起始抗體構築體上之碳水化合物部分之移除可化學或酶催化地完成。化學去醣苷化需將蛋白質曝露於化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯葡萄糖胺或N-乙醯半乳胺糖)外之大部分或所有糖裂解，同時保持多肽完整。化學去醣苷化係由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52及由Edge等人，1981,Anal. Biochem.118：131描述。多肽上之碳水化合物部分之酶催化裂解可藉由使用如由Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350描述之多種內切-及外切醣苷酶來達成。潛在醣苷化位點處之醣苷化可藉由使用化合物衣黴素(tunicamycin)來阻止，如由Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105描述。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷連接之形成。

本文預期抗體構築體之其他修飾。例如，該抗體構築體之另一類型之共價修飾包括將該抗體構築體以美國專利案第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所闡述之方式連接至各種非蛋白質類聚合物，包括(但不限於)各種多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧伸烷基、或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。此外，如此項技術中已知，胺基酸取代可在該抗體構築體內之各種位置中作出，(例如)以促進例如PEG之聚合物之加成。

在一些實施例中，本發明之抗體構築體之共價修飾包括添加一或多種標記。標記基團可經由各種長度之間隔臂偶合至該抗體構築體以減少可能之空間位阻。標記蛋白質之各種方法係此項技術中已知並可用以進行本發明。術語「標記」或「標記基團」係指任何可偵測之標記。通常，標記取決於待偵測其之分析而落於各種分類中，包含(但不限於)以下實例：

a)同位素標記，其等可為放射性或重同位素，例如放射性同位素或放射性核種(例如，³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁸⁹ Zr、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I)；b)磁性標記(例如，磁性顆粒)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料(包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團)，例如螢光基團(例如，FITC、羅丹明、鑭系磷光體)；化學發光基團及可為「小分子」螢光或蛋白質類螢光之螢光團；e)酶催化基團(例如，山葵過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；f)生物素化基團；g)藉由二級受體識別之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鍊成對序列、用於二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。

「螢光標記」意謂可經由其固有螢光性質而被偵測之任何分子。合適之螢光標記包括(但不限於)螢光黃、羅丹明、四甲基羅丹明、曙紅、紅螢素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠(Malacite green)、二苯乙烯、羅氏黃(Lucifer Yellow)、Cascade藍J、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade藍、Cascade黃及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、羅丹明及德克薩斯紅(Texas Red)(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。合適之光學染料(包括螢光團)描述於Richard P.Haugland之Molecular Probes Handbook中。

合適之蛋白質類螢光標記亦包括(但不限於)綠螢光蛋白質，包括GFP之海腎、海鰓或多管水母物種(Chalfie等人，1994,Science 263：802-805)、EGFP(Clontecb Laboratories,Inc.,Genbank寄存編號U55762)、藍螢光蛋白質(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996,Curr.Biol.6：178-182)、增強之黃螢光蛋白質(EYFP,Clontech Laboratories,Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人，1993,J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利案第5,292,658號、第5,418,155號、第5,683,888號、第5,741,668號、第5,777,079號、第5,804,387號、第5,874,304號、第5,876,995號、第5,925,558號)。

本發明之抗體構築體亦可包含額外域，其等(例如)有助於單離分子或與該分子之經調適之藥物動力學曲線相關。有助於單離抗體構築體之域可選自可於單離方法(例如，單離柱)中捕獲之肽基元或第二引入之部分。此類額外域之非限制性實施例包括稱為Myc標籤、HAT標籤、HA標籤、TAP標籤、GST標籤、幾丁質結合域(CBD標籤)、麥芽糖結合蛋白質(MBP標籤)、旗標(Flag)標籤、鏈球菌(Strep)標籤及其變異體(例如，鏈球菌II(StrepII)標籤)及His標籤之肽基元。所有文中所揭示之抗體構築體可包含His標籤域，其通常稱為分子之胺基酸序列中之鄰接His殘基之重複，較佳具有5個及更佳具有6個His殘基(六-組胺酸)。該His標籤可定位於例如抗體構築體之N-或C-端，較佳其定位於C-端。更佳地，六-組胺酸標籤(HHHHHH)(SEQ ID NO：16)係經由肽鍵連接至根據本發明之抗體構築體之C-端。另外，PLGA-PEG-PLGA之共軛物體系可與聚組胺酸標籤組合以用於緩釋應用及改良之藥物動力學曲線。

亦預期本文描述之抗體構築體之胺基酸序列修飾。例如，可需要改良該抗體構築體之結合親和力及/或其他生物性質。該等抗體構築體之胺基酸序列變異體係藉由將合適之核苷酸變化引入抗體構築體核酸中或藉由肽合成來製備。下文描述之胺基酸序列之所有修飾應導致仍保留未經修飾之親代分子之所需生物活性(結合至PSMA及結合至CD3)的抗體構築體。

術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」通常係指具有經其技術認可之定義之胺基酸，例如選自由以下組成之群之胺基酸：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺酸(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩醯胺酸(Gln或Q)、麩胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(He或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)及纈胺酸(Val或V)，然而當需要時可使用經修飾、合成或罕見之胺基酸。通常，可將胺基酸分類為具有非極性側鏈(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)、帶負電之側鏈(例如，Asp、Glu)、帶正電之側鏈(例如，Arg、His、Lys)；或不帶電之極性側鏈(例如，Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp及Tyr)。

胺基酸修飾包括(例如)抗體構築體之胺基酸序列中之殘基之缺失及/或插入及/或取代。作出缺失、插入及取代之任何組合以達成最終構築體，條件是該最終構築體具有所需特徵。該等胺基酸變化亦可改變該等抗體構築體之轉譯後過程，例如改變醣苷化位點之數量或位置。

例如，可在各CDR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6個胺基酸(當然，取決於其等長度)，同時可在各FR中插入、取代或缺失1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。較佳地，胺基酸序列插入抗體構築體中包括長度範圍在自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基至包含一百或更多個殘基之多肽之胺基-及/或羧基端融合物，及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。對應修飾亦可在本發明之抗體構築體之第三域內進行。本發明之抗體構築體之插入變異體包括與酵素之抗體構築體之N端或C端之融合或與多肽之融合。

最受關注之用於取代誘變之位點包括(但不限於)重鏈及/或輕鏈之CDR，特定言之高度可變區，但亦預期重鏈及/或輕鏈中之FR變化。該等取代較佳係如本文描述之保守取代。較佳地，可在CDR中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，同時可在框架區(FR)中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸，此取決於CDR或FR之長度。例如，若CDR序列涵蓋6個胺基酸，則設想此等胺基酸中之一、二或三個經取代。同樣，若CDR序列涵蓋15個胺基酸，則設想此等胺基酸中之一、二、三、四、五或六個經取代。

一種識別抗體構築體之作為誘變之較佳位置之某些殘基或區域之有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells於Science,244：1081-1085(1989)中所描述。此處，識別抗體構築體內之靶殘基之一殘基或一組殘基(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)並經中性或帶負電之胺基酸(最佳係丙胺酸或聚丙胺酸)取代以影響胺基酸與抗原決定基之相互作用。

然後藉由在取代位點或為取代位點引入進一步或其他變異體以精修證實對該等取代官能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，雖然預先判定用於引入胺基酸序列變異之位點或區域，但無需預先判定突變本身之性質。例如，為分析或最佳化給定位點之突變之性能，可在靶密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機誘變，及針對所需活性之最佳組合篩選經表現之抗體構築體變異體。用於在具有已知序列之DNA中之預定位點作出取代突變之技術係熟知，例如，M13引物誘變及PCR誘變。突變體之篩選係使用抗原結合活性(諸如，PSMA或CD3結合)之分析完成。

通常，若重鏈及/或輕鏈之一個或多個或全部CDR中之胺基酸經取代，則較佳地，由此獲得之「經取代」之序列與「初始」CDR序列之一致性係至少60%或65%，更佳係70%或75%，甚至更佳係80%或85%，及特別佳係90%或95%。此意謂與「經取代」之序列之一致性程度取決於CDR之長度。例如，具有5個胺基酸之CDR與其經取代之序列之一致性較佳係80%以使至少一個胺基酸經取代。因此，該抗體構築體之CDR與其經取代之序列可具有不同程度的一致性，例如，CDRL1可具有80%，而CDRL3可具有90%。

較佳之取代(或替換)係保守取代。然而，設想任何取代(包括非保守取代或來自列於下表3中所列之「示例性取代」中之一或多種)，只要該抗體構築體保留其經由第一結合域結合至PSMA及經由第二結合域結合至CD3ε之能力及/或其CDR與然後經取代之序列具有一致性(與「初始」CDR序列之一致性係至少60%或65%，更佳係70%或75%，甚至更佳係80%或85%，及特別佳係90%或95%)。

保守取代顯示於表3中之「較佳取代」之標題下。若此類取代導致生物活性之變化，則可引入更多實質性變化(在表3中命名為「示例性取代」，或如下文參考胺基酸類別進一步描述)並針對所需特徵篩選產物。

本發明之抗體構築體之生物性質之實質性修飾係藉由選擇使其在對保持以下方面之效應上顯著不同之取代而完成：(a)多肽主鏈之取代區域中之結構，例如，為片或螺旋狀構形；(b)分子在靶位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈之體積。基於共同側鏈性質將天然生成之殘基分組為：(1)疏水性：正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及(6)芳族性：trp、tyr、phe。

非保守取代將涉及使此等類別中之一成員交換為另一類別。不涉及保持抗體構築體之合適構形之任何半胱胺酸殘基可通常經絲胺酸取代以改善該分子之抗氧化穩定性並阻止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改善其穩定性(特定言之，在該抗體係抗體片段例如Fv片段的情況下)。

就胺基酸序列而言，序列一致性及/或相似性係藉由使用此項技術中已知的標準技術或藉由檢查測定，該等標準技術包括(但不限於)Smith及Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2：482之局部序列一致性演算法；Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443之序列一致性比對演算法；Pearson及Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444之用於類似性方法之研究；此等演算法之電腦化實施(在Wisconsin遺傳學軟體包，遺傳學電腦組，575 Science Drive,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)，由Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12：387-395描述之最佳擬合序列程式(較佳使用預設值)。較佳地，一致性百分率係基於下列參數藉由FastDB計算：誤配罰分為1；間隙罰分為1；間隙尺寸罰分為0.33；及連接罰分為30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988), Alan R.Liss,Inc。

有用之演算法之一實例係PILEUP。PILEUP使用進行性逐對比對產生來自相關序列之群之多個序列比對。其亦可繪製顯示用以產生比對之聚類關係之樹。PILEUP使用Feng及Doolittle,1987,J.Mol.Evol.35：351-360之進行性比對方法的簡化形式；該方法類似於由Higgins及Sharp,1989,CABIOS 5：151-153描述之方法。有用PILEUP參數包括3.00之預設間隙加權、0.10之預設間隙長度加權及加權之端間隙。

有用演算法之另一實例係BLAST演算法，其描述於：Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；及Karin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787中。一種特別有用之BLAST程式係WU-BLAST-2程式，其係獲得自Altschul等人，1996,Methods in Enzymology 266：460-480。WU-BLAST-2使用若干研究參數，該等參數中之大多數設定為預設值。可調參數設定具有下列值：重疊跨距=1；重疊分數=0.125；字臨限值(T)=II。HSP S及HSP S2參數係動態值並藉由程式本身確定，此取決於特定序列之組成及正搜索受關注序列之特定資料庫的組成；然而，可調整該等值以增強靈敏度。

其他有用演算法係由Altschul等人，1993,Nucl.Acids Res.25：3389-3402報告之間隙(gapped)BLAST。間隙BLAST使用BLOSUM-62取代分；臨限值T參數設定為9；兩次命中方法(two-hit method)以啟動無間隙延伸，使k的間隙長度負載10+k的耗值(cost)；Xu設定為16，及Xg在資料庫搜索階段設定為40及在演算法之輸出階段設定為67。藉由相當於約22個位元之分數啟動間隙比對。

通常，個別變異體CDR或VH/VL序列之間與本文描繪之序列之胺基酸同源性、相似性或一致性係至少60%，及更通常具有至少65%或70%，更佳係至少75%或80%，甚至更佳係至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及近乎100%之較佳漸增同源性或一致性。以相似方式，將相對於經本文識別之結合蛋白質之核酸序列之「核酸序列一致性百分率(%)」定義為候選序列中與抗體構築體之編碼序列中之核苷酸殘基相同之核苷酸殘基的百分率。特定方法利用設定為預設參數之WU-BLAST-2之BLASTN模組，及分別將重疊跨距與重疊分數設定為1及0.125。

通常，編碼個別變異體CDR或VH/VL序列之核苷酸序列與本文描述之核苷酸序列之間之核酸序列同源性、相似性或一致性係至少60%，及更通常具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%及近乎100%之較佳漸增同源性或一致性。因此，「變異體CDR」或「變異體VH/VL區」係與本發明之親代CDR/VH/VL具有特定同源性、相似性或一致性並共用生物功能(包括(但不限於)親代CDR或VH/VL之特異性及/或活性之至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

在一個實施例中，根據本發明之抗體構築體之與人類生殖系之一致性之百分率係

70%或

75%，更佳係

80%或

85%，甚至更佳係

90%，及最佳係

91%、

92%、

93%、

94%、

95%或甚至

96%。認為與人類抗體生殖系基因產物之一致性係減小治療性蛋白質在治療期間引起病患之抗藥物免疫反應之風險的重要特徵。Hwang及Foote(「Immunogenicity of engineered antibodies」；Methods 36(2005)3-10)證實藥物抗體構築體之非人類部分之減少導致在治療期間引起病患之抗藥物抗體之風險降低。藉由比較全部數量之臨床評估之抗體藥物及各自免疫原性資料，顯示抗體之V區之人類化使得該蛋白質(平均5.1%之病患)比攜載未經改變之非人類V區之抗體(平均23.59%之病患)具有更低免疫原性的趨勢。與人類序列之較高程度一致性因此係呈抗體構築體形式之基於V區之蛋白質療法所期望的。出於測定生殖系一致性之目的，可使用Vector NTI軟體將VL之V區與人類生殖系v區段及J區段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)之胺基酸序列比對並藉由相同胺基酸殘基除以VL之胺基酸殘基之總數以百分率計算該胺基酸序列。對VH區段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)亦可進行該相同操作，不同之處在於可排除VH CDR3，因其高多樣性及缺乏現存人類生殖系VH CDR3之比對搭檔。然後重組技術可用以增加與人類抗體生殖系基因之序列一致性。

在另一實施例中，本發明之雙特異性抗體構築體在標準研究規模條件(例如，在標準兩步純化方法中)下顯示高單體產率。本發明之抗體構築體之單體產率較佳係

0.25mg/L上清液，更佳係

0.5mg/L，甚至更佳係

1mg/L，及最佳係

3mg/L上清液。

同樣，可測定該等抗體構築體之二聚抗體構築體同功異型體之產率及單體百分率(即，單體：(單體+二聚體))。單體及二聚抗體構築體之生產率及經計算之單體百分率可(例如)以輥瓶中之標準化研究規模生產之培養物上清液的SEC純化步驟獲得。在一個實施例中，該等抗體構築體之單體百分率係

80%，更佳係

85%，甚至更佳係

90%，及最佳係

95%。

在一個實施例中，該等抗體構築體具有較佳之血漿穩定性(具血漿之EC50對無血漿之EC50之比值)係

5或

4，更佳係

3.5或

3，甚至更佳係

2.5或

2，及最佳係

1.5或

1。抗體構築體之血漿穩定性可藉由在37℃下將該構築體於人類血漿中培養24小時且接著在⁵¹ 鉻釋放細胞毒性分析中進行EC50測定來測試。細胞毒性分析中之效應子細胞可經刺激以富集人類CD8陽性T細胞。靶細胞可(例如)係經人類PSMA轉染之CHO細胞。效應子對靶細胞(E：T)之比值可選為10：1。出於該目的使用之人類血漿池係衍生自健康供體之藉由經EDTA塗覆之注射器收集之血液。藉由離心移除細胞成分及收集上層血漿相及隨後匯集。作為對照，在細胞毒性分析前立即將抗體構築體稀釋於RPMI-1640培養基中。血漿穩定性計算為EC50(血漿培養後)對EC50(對照)之比值。

此外較佳地，本發明之抗體構築體之單體至二聚體之轉化係低的。該轉化可在不同條件下量測並藉由高效尺寸排除層析分析。例如，該等抗體構築體之單體同功異型體之培養可在37℃下及例如100μg/ml或250μg/ml之濃度在培養箱中進行7天。在此等條件下，較佳地，本發明之抗體構築體顯示

5%，更佳

4%，甚至更佳

3%，甚至更佳

2.5%，甚至更佳

2%，甚至更佳

1.5%，及最佳

1%或0.5%或甚至0%之二聚體百分率。

亦較佳地，本發明之雙特異性抗體構築體在多個冷凍/解凍循環後呈現極低二聚體轉化率。例如，將該抗體構築體單體(例如)在通用調配緩衝液中調整至250μg/ml之濃度，並經受三個冷凍/解凍循環(在-80℃下冷凍30min，接著在室溫下解凍30min)，接著進行高效SEC以測定已轉化為二聚抗體構築體的初始單體抗體構築體之百分率。該等雙特異性抗體構築體之二聚體百分率例如在三個冷凍/解凍循環後較佳係

5%，更佳係

4%，甚至更佳係

3%，甚至更佳係

2.5%，甚至更佳係

2%，甚至更佳係

1.5%，及最佳係

1%或甚至

0.5%。

本發明之雙特異性抗體構築體較佳顯示有利熱穩定性，其具有

45℃或

50℃，更佳

52℃或

54℃，甚至更佳

56℃或

57℃，及最佳

58℃或

59℃的聚集溫度。該熱穩定性參數可就抗體聚集溫度而言如下來測定：將濃度250μg/ml下之抗體溶液轉移至單次用比色皿中並放置於動態光散射(DLS)裝置中。將樣品以0.5℃/min之加熱速率自40℃加熱至70℃，不斷採集所量測半徑。使用指示蛋白質之熔融及聚集之半徑之增加以計算抗體之聚集溫度。

或者，可藉由示差掃描熱量法(DSC)測定溫度熔融曲線以判定該等抗體構築體之固有生物物理蛋白質穩定性。此等實驗係使用MicroCal LLC(Northampton,MA,U.S.A)VP-DSC裝置進行。相較於僅含有調配物緩衝液之樣品，自20℃至90℃記錄含有抗體構築體之樣品之能量攝取。將該等抗體構築體(例如)在SEC運行緩衝液中調整至250μg/ml之最終濃度。為記錄各自熔融曲線，逐步升高整體樣品溫度。在每個溫度T下，記錄樣品及調配物緩衝液參考之能量攝取。繪製樣品之能量攝取Cp(kcal/莫耳/℃)減去參考之能量攝取Cp之差值相對於各自溫度之曲線圖。熔融溫度定義為能量攝取之第一最大值下之溫度。

亦設想使本發明之PSMAxCD3雙特異性抗體構築體具有

0.2，較佳

0.15，更佳

0.12，甚至更佳

0.1，及最佳

0.08之混濁度(在經純化之單體抗體構築體之濃度達到2.5mg/ml並過夜培養後藉由OD340量測)。

在另一實施例中，根據本發明之抗體構築體係在生理或稍微更低pH(亦即，約pH7.4至6.0)下穩定。抗體構築體在例如約pH 6.0之非生理pH下表現越耐受，則洗脫自離子交換柱之抗體構築體相對於負載蛋白質總量之回收率越高。在約pH 6.0下自離子(例如，陽離子)交換柱之抗體構築體之回收率較佳係

30%，更佳係

40%，更佳係

50%，甚至更佳係

60%，甚至更佳係

70%，甚至更佳係

80%，甚至更佳係

90%，甚至更佳係

95%，及最佳係

99%。

此外設想本發明之雙特異性抗體構築體顯示治療功效或抗腫瘤活性。此可例如於如晚期人類腫瘤異種移植模型之下列實例中揭示之研究中進行評估。

在研究之第1日，將人類靶細胞抗原(此處：PSMA)陽性癌症細胞系之5x10⁶ 個細胞皮下注射於雌性NOD/SCID小鼠之右背側中。當平均腫瘤體積達約100mm³ 時，藉由將約2x10⁷ 個細胞注入動物之腹腔中以將活體外擴增之人類CD3陽性T細胞移植於小鼠中。媒劑對照組1之小鼠不接受效應子細胞並用作未經移植對照以與媒劑對照組2(接受效應子細胞)進行比較以監測僅T細胞對於腫瘤生長之影響。當平均腫瘤體積達約200mm³ 時，抗體治療開始。每個治療組在治療開始之日時之平均腫瘤尺寸不應統計學不同於任何其他組(方差分析)。以0.5mg/kg/天之PSMAxCD3雙特異性抗體構築體藉由靜脈內推注約15至20天來治療小鼠。藉由卡尺在研究期間測量腫瘤並藉由腫瘤體積(TV)之組內比較評估進展。藉由計算TV為T/C%=100 x(分析組之中值TV)/(對照組2之中值TV)來測定腫瘤生長抑制T/C[%]。

熟練者知曉如何修改或調適本研究之某些參數(例如經注射腫瘤細胞的數量；注射部位、經移植之人類T細胞之數量；待投與之雙特異性抗體構築體之量、及時間線，同時仍達成有意義且可重複之結果。較佳地，該腫瘤生長抑制T/C[%]係

70或

60，更佳係

50或

40，甚至更佳係

30或

20及最佳係

10或

5或甚至係

2.5。

在本發明之抗體構築體之一較佳實施例中，該抗體構築體係單鏈抗體構築體。

亦在本發明之抗體構築體之一較佳實施例中，該第三域以胺基至羧基順序包含：鉸鏈-CH2-CH3-連接子-鉸鏈-CH2-CH3。

在本發明之一個實施例中，第三域之該等多肽單體各具有與選自由SEQ ID NO：17-24組成之群之序列具有至少90%一致性之胺基酸序列。在本發明之一較佳實施例中，該等多肽單體各具有選自SEQ ID NO：17-24之胺基酸序列。

亦在本發明之一個實施例中，第三域之一個或較佳各(兩個)多肽單體之CH2域包含域內半胱胺酸雙硫橋。如此項技術中知曉，術語「半胱胺酸雙硫橋」係指具有通式結構R-S-S-R之官能基。該連接亦稱為SS鍵或雙硫橋且由半胱胺酸殘基之兩個硫醇基之偶合來衍生。對於本發明之抗體構築體而言特別佳的是，將於成熟抗體構築體中形成半胱胺酸雙硫橋之半胱胺酸引入CH2域之對應309及321(Kabat編號)之胺基酸序列中。

在本發明之一個實施例中，CH2域之Kabat位置314中之醣苷化位點係經移除。較佳地，醣苷化位點之此移除係藉由N314X取代來達成，其中X係除Q以外之任何胺基酸。該取代較佳係N314G取代N314G取代。在一更佳實施例中，該CH2域另外包含以下取代(位置根據Kabat編號)V321C及R309C(此等取代在Kabat位置309及321引入域內半胱胺酸雙硫橋)。

據推測，本發明之抗體構築體相比例如此項技術中已知之雙特異性異源Fc抗體構築體(圖1b)之較佳特徵可尤其係與在CH2域中引入上述修飾有關。因此，對於本發明之構築體而言較佳的是，本發明之抗體構築體之第三域中之CH2域包含位於Kabat位置309及321之域內半胱胺酸雙硫橋及/或位於Kabat位置314之醣苷化位點係藉由上述N314G N314X取代(較佳藉由N314G取代)來移除。

在本發明之另一較佳實施例中，本發明之抗體構築體之第三域中之CH2域包含位於Kabat位置309及321之域內半胱胺酸雙硫橋及/或位於Kabat位置314之醣苷化位點係藉由N314G取代來移除。更佳地，本發明之抗體構築體之第三域之多肽單體具有選自由SEQ ID NO：17及18組成之群之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明提供一種抗體構築體，其中：(i)第一域包含兩個抗體可變域且第二域包含兩個抗體可變域；(ii)第一域包含一個抗體可變域且第二域包含兩個抗體可變域；(iii)第一域包含兩個抗體可變域且第二域包含一個抗體可變域；或(iv)第一域包含一個抗體可變域且第二域包含一個抗體可變域。

因此，該第一及第二域可為結合域，其包含各兩個抗體可變域例如VH及VL域。此類包含兩個抗體可變域之結合域之實例係如文中所述且包括例如如上文所述之Fv片段、scFv片段或Fab片段。或者，彼等結合域中之一者或兩者可僅包含單可變域。此類單域結合域之實例係如上文所述且包括例如奈米抗體或單可變域抗體，其包含僅一個獨立於其他V區或域而特異性結合抗原或抗原決定基之可變域(其可為VHH、VH或VL)。

在本發明之抗體構築體之一較佳實施例中，使第一及第二域經由肽連接子融合至第三域。較佳之肽連接子已描述於上文中且特徵為胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(亦即，Gly₄ Ser(SEQ ID NO：1))或其聚合物(亦即，(Gly₄ Ser)x，其中x係1或更大之整數(例如，2或3))。用於使第一及第二域融合至第三域之特別佳連接子係描述於SEQ ID NO：1中。

在一較佳實施例中，本發明之抗體構築體之特徵係以胺基至羧基順序包含：(a)第一域；(b)肽連接子，其具有選自由SEQ ID NO：1-3組成之群之胺基酸序列；(c)第二域；(d)肽連接子，其具有選自由SEQ ID NO：1、2、3、9、10、11及12組成之群之胺基酸序列；(e)第三域之第一多肽單體；(f)肽連接子，其具有選自由SEQ ID NO：5、6、7及8組成之群之胺基酸序列；及(g)第三域之第二多肽單體。

本發明之抗體構築體包含結合至PSMA(較佳結合至PSMA之細胞外域(ECD))之第一域。應瞭解，術語「結合至PSMA之細胞外域」在本發明之內文中意謂該結合域結合至靶細胞表面上所表現之PSMA。根據本發明之第一域因此較佳結合至PSMA，當其由天然表現細胞或細胞系及/或經PSMA轉形或(穩定/暫態)轉染之細胞或細胞系來表現時。在一較佳實施例中，當PSMA在活體外結合分析例如BIAcore或Scatchard中用作「靶」或「配體」分子時，第一結合域亦結合至PSMA。「靶細胞」可為在其表面上表現PSMA之任何原核或真核細胞；較佳地，該靶細胞係人類或動物身體之部分之細胞，例如表現特異性PSMA之癌症或腫瘤細胞。

較佳地，第一結合域結合至人類PSMA/PSMA ECD。在一更佳實施例中，其結合至獼猴PSMA/PSMA ECD。根據最佳實施例，其結合至人類及獼猴PSMA/PSMA ECD。「PSMA細胞外域」或「PSMA ECD」係指基本上不含PSMA之跨膜及細胞質域之PSMA區或序列。熟習此項技術者應瞭解，針對本發明之PSMA多肽所識別之跨膜域係依據此項技術中常用於識別該類型疏水域之標準來識別。跨膜域之確切邊界可變化，但在文中具體所述之域之任何一端最大可能變化不多於約5個胺基酸。

結合至PSMA之較佳結合域係揭示於WO 2010/037836及WO 2011/121110中。此等申請案中所述之針對PSMA之任何結合域可用於本發明內文中。

在本發明之一個態樣中，該抗體構築體按胺基至羧基順序包含：(a)第一域，其具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：50、56、68、74、86、92、104、110、122、128、140、146、158、164、176、182、194、200、212、218、230、236、248、254、266、272、284、290、302、308、320、335、350、365、380、395、410、425、440、455、470；(b)肽連接子，其具有選自由SEQ ID NO：1-3組成之群之胺基酸序列；(c)第二域，其具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：WO 2008/119567之SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或如SEQ ID NO：15中所述之胺基酸序列； (d)肽連接子，其具有選自由SEQ ID NO：1、2、3、9、10、11及12組成之群之胺基酸序列；(e)第三域之第一多肽單體，其具有選自由SEQ ID NO：17-24組成之群之多肽序列；(f)肽連接子，其具有選自由SEQ ID NO：5、6、7及8組成之群之胺基酸序列；及(g)第三域之第二多肽單體，其具有選自由SEQ ID NO：17-24組成之群之多肽序列。

根據此較佳實施例，經由肽連接子融合至單鏈多肽之第一及第二域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：51、57、69、75、87、93、105、111、123、129、141、147、159、165、177、183、195、201、213、219、231、237、249、255、267、273、285、291、303、309、321、324、336、339、351、354、366、369、381、384、396、399、411、414、426、429、441、444、456、459、471及474。

在一個態樣中，本發明之抗體構築體之特徵在於具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：52、53、58、59、70、71、76、77、88、89、94、95、106、107、112、113、124、125、130、131、142、143、148、149、160、161、166、167、178、179、184、185、196、197、202、203、214、215、220、221、232、233、238、239、250、251、256、257、268、269、274、275、286、287、292、293、304、305、310、311、322、323、325、326、337、338、340、341、352、353、355、356、367、368、370、371、382、383、385、386、397、398、400、401、412、413、415、416、427、428、430、431、442、 443、445、446、457、458、460、461、472、473、475及476。

本發明另外提供一種編碼本發明之抗體構築體之多肽/核酸分子。聚核苷酸係一種由13個或更多個於鏈中共價結合之核苷酸單體組成之生物聚合物。DNA(例如cDNA)及RNA(例如mRNA)係具有不同生物功能之聚核苷酸之實例。核苷酸係充當核酸分子(例如DNA或RNA)之單體或亞單元之有機分子。核酸分子或聚核苷酸可為雙股及單股，線性及圓形。其較佳包含於載體中，該載體較佳包含於宿主細胞中。該宿主細胞係(例如，經本發明之載體或聚核苷酸轉形或轉染後)能夠表現該抗體構築體。出於該種目的，該聚核苷酸或核酸分子可以操作方式與控制序列連接。

遺傳密碼係將於遺傳材料(核酸)內編碼之資訊轉譯為蛋白質之規則組。使用tRNA分子以攜載胺基酸並每一次讀取mRNA三個核苷酸，藉由以mRNA規定之順序連接胺基酸之核糖體完成活細胞中之生物解碼。該密碼定義此等核苷酸三聯體(稱為密碼子)之序列如何在蛋白質合成期間規定下一個將添加之胺基酸。在某些異常情況下，核酸序列中之三核苷酸密碼子規定單個胺基酸。由於以完全相同密碼編碼絕大多數基因，因此該特定密碼通常稱為正則或標準遺傳密碼。雖然該遺傳密碼決定給定編碼區域之蛋白質序列，但其他基因組區域可影響何時何地製造此等蛋白質。

此外，本發明提供一種包括本發明之聚核苷酸/核酸分子之載體。載體係一種用作媒介以遞送(外源)遺傳材料進入細胞中之核酸分子。術語「載體」涵蓋(但不限於)質體、病毒、黏質體及人造染色體。通常，經工程設計之載體包括複製之起源；多選殖位點及可選擇之標誌物。該載體本身通常係核苷酸序列，一般係DNA序列，其包含插入(轉殖基因)及充當該載體之「主鏈」之較大序列。現代載體可涵蓋除轉殖基因插入及主鏈外之額外特徵：啟動子、基因標誌物、抗生素耐性、報導基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體(表現構築體)之載體特別用於在靶細胞中表現轉殖基因，且通常具有控制序列。

術語「控制序列」係指特定宿主生物體中用以表現以操作方式連接的編碼序列時所必需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列包括例如啟動子、視情況之操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。

當一核酸與另一核酸序列發生功能關係時，則該核酸係為「以操作方式連接」。例如，若用於預序列或分泌前導之DNA表現為參與多肽之分泌之預蛋白質，則其係以操作方式連接至用於該多肽之DNA；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其係以操作方式連接至該編碼序列；或若核糖體結合位點係經定位以促進轉譯，則其係以操作方式連接至編碼序列。通常，「以操作方式連接」意謂連接之DNA序列係鄰近的，而在分泌前導之情況下，連接之DNA序列係鄰近的並為順讀一致之方式。然而，強化子不一定係鄰近的。連接可由適宜限制酶切位點之接合而完成。若此類位點不存在，則根據習知實務使用合成性寡聚核苷酸轉接子或連接子。

「轉染」係將核酸分子或聚核苷酸(包含載體)故意引入靶細胞中之方法。該術語主要用於在真核細胞中之非病毒方法。轉導通常用以描述核酸分子或聚核苷酸之病毒介導之轉移。動物細胞之轉染通常通常涉及細胞膜中之開放瞬態孔或「孔」，以容許攝取材料。轉染可使用磷酸鈣；藉由電穿孔；藉由細胞中止或藉由混合陽離子脂質與該材料以產生脂質體(其等與細胞膜融合並將其等裝載物寄存於內部)來進行。

術語「轉形」係用以描述核酸分子或聚核苷酸(包含載體)非病毒轉移至細菌中，及亦進入非動物之真核細胞(包含植物細胞)中。轉形因此係由通過細胞膜自其周圍直接攝取及隨後併入外源性遺傳材料(核酸分子)引起之細菌或非動物性真核細胞之遺傳變化。轉形可藉由人造方式來實現。為使轉形發生，細胞或細菌必須處於競爭狀態，此可以對例如飢餓及細胞密度之對環境條件之時間限制性反應的形式出現。

此外，本發明提供一種經本發明之聚核苷酸/核酸分子或經本發明之載體轉形或轉染之宿主細胞。如本文使用，術語「宿主細胞」或「受體細胞」旨在包括可為或已係編碼本發明之抗體構築體之載體、外源性核酸分子及聚核苷酸之受體；及/或抗體構築體本身之受體之任何個別細胞或細胞培養物。各自材料引入細胞中係藉由轉形、轉染及類似方式進行。術語「宿主細胞」亦旨在包括單細胞之子代或可能子代。由於某些修飾可因自然、意外或故意突變或因環境影響而發生於繼代中，因此該子代(事實上)與親代細胞非完全相同(在形態學或基因組或總DNA補體中)，但仍包含於如本文使用之術語之範圍中。合適之宿主細胞包括原核細胞或真核細胞，及亦包括(但不限於)細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞，及動物細胞例如昆蟲細胞及哺乳動物細胞(例如，鼠類、大鼠、獼猴或人類)。

本發明之抗體構築體可於細菌中產生。表現後，本發明之抗體構築體單離自可溶部分之大腸桿菌細胞團及可通過(例如)親和力層析及/或尺寸排除進行純化。最終純化可以類似於用於純化於(例如)CHO細胞中表現之抗體之方法進行。

除原核生物外，例如絲狀真菌或酵母之真核微生物係適用於本發明之抗體構築體之選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )或一般之麵包酵母。然而，大量其他屬、種及品系通常可用且在本文中適用，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、克魯維酵母(Kluyveromyces)宿主例如乳酸克魯維酵母(K.lactis )、脆壁克魯維酵母(K.fragilis )(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus )(ATCC 16045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii )(ATCC 24178)、瓦爾提魯維酵母(K.waltii )(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum )(ATCC 36906)、熱克魯維酵母(K.thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus )；耶羅維亞酵母屬(yarrowia )(EP 402 226)；畢赤酵母屬(Pichia pastoris )(EP 183 070)；假絲酵母屬(Candida )；專氏木黴菌(Trichoderma reesia )(EP 244 234)；紅麵包黴菌(Neurospora crassa )；例如許旺酵母西花薊馬(Schwanniomyces occidentalis )之許旺酵母屬(Schwanniomyces )；及例如麵包紅黴屬(Neurospora )、青黴屬(Penicillium )、彎頸黴屬(Tolypocladium )之絲狀真菌及例如構巢麯黴(A.nidulans )與黑麯黴(A.niger )之麯黴屬(Aspergillus )宿主。

適用於表現本發明之經醣苷化之抗體構築體之宿主細胞係衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別許多桿狀病毒株及變異體及來自例如以下各者之相應容許昆蟲宿主細胞：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(蠋)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)。可公開獲得用於轉染之各種病毒株，例如，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5株，且此類病毒根據本發明可於本文中作為病毒使用，(特定言之)係用於草地夜蛾細胞之轉染。

亦可使用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛花、番茄、阿拉伯芥(Arabidopsis)及煙草之植物細胞培養物作為宿主。可用於在植物細胞培養物中製造蛋白質的選殖及表現載體係熟習此項技術者已知。參見(例如)Hiatt等人，Nature(1989)342：76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology 10：790-794；Artsaenko等人(1995)The Plant J 8：745-750及Fecker等人(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。

然而，脊椎動物細胞最受關注，且在培養物(組織培養物)中繁殖脊椎動物細胞已成為常用程序。適用之哺乳動物宿主細胞系之實例係藉由SV40轉形之猴腎臟CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎臟系(經次選殖以在懸浮培養物中生長的293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；嬰兒倉鼠腎臟細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞特利氏細胞(sertoli cell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎臟細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎臟細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝臟細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝臟細胞(Hep G2,1413 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL5 1)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.(1982)383：44-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤系(Hep G2)。

在另一實施例中，本發明提供一種用於製造本發明之抗體構築體之方法，該方法包括在容許表現本發明之抗體構築體之條件下培養本發明之宿主細胞並自該培養物中回收經製造之抗體構築體。

如本文使用，術語「培養」係指細胞在合適條件下於培養基中之活體外維持、分化、生長、增殖及/或繁殖。術語「表現」包括涉及製造本發明之抗體構築體之任何步驟，包括(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。

當使用重組技術時，抗體構築體可在細胞內於周質空間內製造或直接分泌於培養基中。若於細胞內製造抗體構築體，則作為第一步驟，例如，藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或細胞溶解之片段)。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述一種用於單離抗體之程序，該等抗體係分泌至大腸桿菌之周質空間中。簡而言之，細胞團在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲磺醯氟(PMSF)存在下歷時約30分鐘解凍。藉由離心法移除細胞碎片。在將抗體分泌於培養基中之情況下，來自此類表現體系之上清液通常使用市售蛋白質濃度過濾器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)首先濃縮。例如PMSF之蛋白酶抑制劑可包括於前述步驟之任一步驟中以抑制蛋白水解及可包含抗生素以阻止外來污染物之生長。

製備自宿主細胞之本發明之抗體構築體可使用(例如)氫氧磷灰石層析、凝膠電泳、滲析及親和力層析經回收或純化。取決於待回收之抗體亦可利用用於蛋白質純化之其他技術，例如在離子交換柱上分餾、乙醇沉澱、逆相HPLC、矽膠層析、肝素SEPHAROSE^TM 上之層析、陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬胺酸柱)上之層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱。在本發明之抗體構築體包括CH3域之情況下，Bakerbond ABX樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。

親和力層析係較佳之純化技術。附接親和配體之基質最通常係瓊脂糖，但可利用其他基質。機械穩定基質(例如可控孔玻璃或聚(聚乙烯-二乙烯)苯)允許比瓊脂糖所能達到之更快流速且更短處理時間。

此外，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明之方法製造之抗體構築體。對於本發明之醫藥組合物而言較佳的是，抗體構築體同源性係

80%，更佳

81%、

82%、

83%、

84%或

85%，更佳

86%、

87%、

88%、

89%或

90%，仍更佳

91%、

92%、

93%、

94%或

95%及最佳

96%、

97%、

98%或

99%。

如文中所使用，術語「醫藥組合物」係關於適用於投與病患(較佳人類病患)之組合物。本發明之特別佳醫藥組合物包含一種或複數種本發明之抗體構築體(較佳呈治療有效量)。較佳地，該醫藥組合物另外包含具有一或多種(醫藥上有效)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。該組合物之可接受成分較佳在所用劑量及濃度下對受體無毒。本發明之醫藥組合物包括但不限於液體、冷凍及凍乾組合物。

本發明組合物可包含醫藥上可接受之載劑。一般而言，如文中所使用，「醫藥上可接受之載劑」意謂可與醫藥投與(特定言之與非經腸投與)相容之任何且所有水性及非水性溶液、無菌溶液、溶劑、緩衝液例如磷酸緩衝鹽水(PBS)溶液、水、懸浮液、乳液例如油/水乳液、各種類型潤濕劑、脂質體、分散介質及包衣。此類介質及試劑於醫藥組合物中之用途係此項技術中熟知，且包含此類載劑之組合物可藉由熟知習知方法來調配。

某些實施例提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體構築體及其他一或多種賦形劑例如彼等示例性描述於本章節及文中任何其他地方之賦形劑。因此，賦形劑可用於本發明中用於各種目的，例如調節調配物之物理、化學或生物性質，例如調節黏度及或本發明之方法以改良有效性及或使此類調配物及方法穩定而不因例如在製造、運輸、儲存、預用製備、投與及此後期間發生之應力而降解及腐敗。

在某些實施例中，該醫藥組合物可包含調配材料以用於修改、維持或保存該組合物之例如pH、滲透度、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶離或釋放速率、吸附或滲入(參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18"版，(A.R.Genrmo編輯)，1990,Mack Publishing Company)。在此類實施例中，適宜調配材料可包括但不限於：●胺基酸，例如甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、脯胺酸、2-苯丙胺酸，包括帶電胺基酸，較佳離胺酸、乙酸離胺酸、精胺酸、麩胺酸及/或組胺酸；●抗微生物劑例如抗細菌劑及抗真菌劑；●抗氧化劑例如抗壞血酸、甲硫胺酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉；●緩衝液、緩衝體系及緩衝劑，其等用於將該組合物維持在生理pH或稍低pH下；緩衝液之實例係硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽及組胺酸；例如約pH 7.0-8.5之Tris緩衝液；●非水性溶劑，例如丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)及可注射之有機酯(例如油酸乙酯)；●水性載劑包括水、醇性/水溶液、乳液或懸浮液、鹽水及緩衝介質；●生物可降解聚合物，例如聚酯；●增積劑，例如甘露醇或甘胺酸；●螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；●等滲及吸收延遲劑；●複合劑，例如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；●填充劑；●單醣；二醣；及其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可為非還原糖，較佳海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇；●(低分子量)蛋白質、多肽或蛋白質類載劑例如人類或胎牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，較佳為人類起源；●著色劑及調味劑；●含硫還原劑，例如胱胺酸、硫辛酸、硫乙醇酸鈉、硫甘油、[α]-單硫甘油、及硫代硫酸鈉；●稀釋劑；●乳化劑；●親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；●成鹽抗衡離子，例如鈉；●防腐劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及類似物；實例係：氯化苄二甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己啶、山梨酸或過氧化氫； ●金屬錯合物，例如Zn-蛋白質錯合物；●溶劑及共溶劑(例如，甘油、丙二醇或聚乙二醇)；●糖及糖醇，例如海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、甘露醇、山梨糖醇或木糖醇水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、環多醇(例如肌醇(inositol))、聚乙二醇；及多元糖醇；●懸浮劑；●表面活性劑或潤濕劑，例如泊洛尼克(pluronic)、PEG、山梨醇酐酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、triton、緩血三胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙伯(tyloxapal)；表面活性劑可為清潔劑(較佳具有>1.2KD之分子量)及/或聚醚(較佳具有>3KD之分子量)；較佳清潔劑之非限制性實例係Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80及Tween 85；較佳聚醚之非限制性實例係PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000及PEG 5000；●穩定性增強劑，例如蔗糖或山梨糖醇；●滲透增強劑，例如鹼金屬鹵化物，較佳氯化鈉或氯化鉀，甘露醇山梨糖醇；●非經腸遞送媒劑，包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖及氯化鈉、乳酸化林格氏或固定油；●靜脈內遞送媒劑，包括流體及營養補充液、電解質補充液(例如以林格氏葡萄糖為基礎之彼等)。

熟習此項技術者明瞭，醫藥組合物之不同成分(例如，彼等上述所列者)可具有不同效應，例如及胺基酸可作為緩衝液、穩定劑及/或抗氧化劑；甘露醇可作為增積劑及/或滲透增強劑；氯化鈉可作為遞送媒劑及/或滲透增強劑等。

設想本發明組合物除文中所定義之本發明多肽以外亦可包含其他生物活性劑，此視該組合物之預定用途而定。此類試劑可為作用於胃腸道系統之藥物；作為抑制細胞生長之藥物；預防高尿酸血症之藥物；抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇類)；調節發炎反應之藥物；作用於循環系統之藥物及/或此項技術中已知之試劑例如細胞介素。亦設想本發明之抗體構築體應用於共同療法(co-therapy)，亦即與另一抗癌藥物組合。

在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者根據例如預定投與途徑、遞送形式及所需劑量來決定。參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些實施例中，此類組合物可影響本發明之抗體構築體之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑在性質上可為水性或非水性。例如，適宜媒劑或載劑可為注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液，可補充組合物中常見之其他材料以供非經腸投與。中性緩衝鹽水或鹽水與血清白蛋白之混合物係其他示例性媒劑。在某些實施例中，本發明組合物之抗體構築體可藉由使具有所需純度之選定組合物與可選調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)混合成凍乾餅或水溶液形式來製備以供貯存。另外，在某些實施例中，本發明之抗體構築體可使用適當賦形劑(例如蔗糖)調配成凍乾物。

當預期非經腸投與時，本發明中所使用之治療組合物可以不含熱原之非經腸可接受之水溶液(其包含所需本發明抗體構築體溶於醫藥上可接受之媒劑)形式提供。特別適用於非經腸注射之媒劑係無菌蒸餾水，其中本發明之抗體構築體係調配成適宜保存之無菌等滲溶液。在某些實施例中，該製法可涉及調配所需分子與試劑例如可注射微球、生物可蝕顆粒、聚合性化合物(例如聚乳酸酯或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體，其等可提供可經由積存型注射而遞送之產物之可控或持續釋放。在某些實施例中，亦可使用透明質酸，其具有促進在循環中持續時間之效應。在某些實施例中，可使用可植入藥物遞送裝置以引入所需抗體構築體。

熟習此項技術者將明瞭其他醫藥組合物，其包括在持續-或可控遞送/釋放調配物中涉及本發明之抗體構築體之調配物。用於調配各種其他持續-或可控遞送構件例如脂質體載劑、生物可蝕微粒或孔性珠粒及積存型注射之技術亦為熟習此項技術者已知。參見例如，國際專利申請案PCT/US93/00829，其描述孔性聚合性微粒之可控釋放以遞送醫藥組合物。持續釋放製劑可包括呈成型物件(例如薄膜或微膠囊)形式之半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳交酯(如描述於美國專利案第3,773,919號及歐洲專利申請公開案EP 058481中)、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277及Langer,1982,Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案EP 133,988)。持續釋放組合物亦可包括脂質體，其可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者來製備。參見例如Eppstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；歐洲專利申請公開案EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949。

該抗體構築體亦可包裹於(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合製得之微膠囊(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中；包裹於膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或包裹於巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Oslo,A.編輯，(1980)中。

用於活體內投與之醫藥組合物係通常呈無菌製劑形式提供。滅菌可藉由濾過無菌過濾膜來完成。在凍乾組合物時，使用此方法進行之滅菌可在凍乾及復水之前或之後進行。用於非經腸投與之組合物可以凍乾形式或溶液形式貯存。非經腸組合物通常係置於具有無菌訪問端口之容器，例如，具有可被皮下注射針刺穿之瓶塞之靜脈輸液袋或小瓶。

本發明之另一態樣包括本發明調配物之自緩衝抗體構築體，其可用作醫藥組合物，如國際專利申請案WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述。關於蛋白質穩定化及就此而言適用之調配材料及方法之各種闡述可得，例如Arakawa等人，「Solvent interactions in pharmaceutical formulations」,Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等人，「Physical stabilization of proteins in aqueous solution」,RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY AND PRACTICE,Carpenter及Manning編，Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)，及Randolph等人，「Surfactant-protein interactions」,Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，參見特定言之與賦形劑及其用於根據本發明之自緩衝蛋白質調配物之方法有關之部分，尤其關於用於動物及/或人類醫學用途之蛋白質醫藥產品及方法之部分。

根據本發明之某些實施例，鹽可用於調節調配物之離子強度及/或等滲性及/或改良根據本發明之組合物之蛋白質或其他組分之溶解度及/或物理穩定性。眾所周知，離子可藉由結合至蛋白質表面上之帶電殘基及藉由遮罩蛋白質中之帶電及極性基團並減少其靜電相互作用、吸引及排斥相互作用之強度來穩定蛋白質之天然狀態。離子亦可藉由結合至特定言之蛋白質之變性肽連接(--CONH)來穩定蛋白質之變性狀態。此外，與蛋白質中之帶電及極性基團之離子性相互作用可減少分子內靜電相互作用並由此阻止或減少蛋白質聚集及不溶性。

離子種類在其對於蛋白質之效應方面顯著不同。已開發可用於調配根據本發明之醫藥組合物之諸多類別分級之離子及其於蛋白質之效應。一個實例係Hofmeister系列，其以離子性及極性非離子性溶質於蛋白質在溶液中之構形穩定性之效應來對離子性及極性非離子性溶質分級。穩定性溶質係稱作「親液劑」。去穩定性溶質係稱作「離液劑」。親液劑通常以高濃度(例如，>1莫耳硫酸銨)使用以自溶液使蛋白質沉澱(「鹽析」)。離液劑通常用於使蛋白質變性及/或增溶(「鹽溶」)。離子對「鹽溶」及「鹽析」之相對有效性界定其在Hofmeister系列中之位置。

游離胺基酸可在根據本發明之各種實施例之本發明調配物之抗體構築體中用作增積劑、穩定劑及抗氧化劑以及其他標準用途。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於使蛋白質穩定於調配物中。甘胺酸適用於凍乾以確保正確餅結構及性質。精胺酸可適用於抑制蛋白質聚集(在液體及凍乾調配物中)。甲硫胺酸適用作抗氧化劑。

多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖及山梨糖醇及多元醇諸如例如甘油及聚乙二醇及(用於文中討論目的)聚乙二醇(PEG)及相關物質。多元醇係親液劑。其等係適用於液體及凍乾調配物中以保護蛋白質不遭受物理及化學降解過程之穩定劑。多元醇亦適用於調整調配物之滲透性。尤其適用於本發明選定實施例中之多元醇係甘露醇，其常用於確保呈凍乾調配物形式之餅之結構穩定性。其確保餅之結構穩定性。其通常與凍乾保護劑例如蔗糖一起使用。山梨糖醇及蔗糖係用於調整滲透性並作為穩定劑以保護不受運輸期間之冷凍-解凍應力或在製造方法期間製備塊體之尤其佳試劑。還原糖(其包含游離醛基或酮基)例如葡萄糖及乳糖可糖化表面離胺酸及精胺酸殘基。因此，其等通常不為根據本發明使用之尤其佳多元醇。另外，形成此類反應性物質之糖例如蔗糖(其在酸性條件下經水解以形成果糖及葡萄糖且因此引起糖化)因此亦不為本發明之尤其佳多元醇。PEG適用於穩定蛋白質並作為低溫保護劑且可就此用於本發明中。

本發明調配物之抗體構築體之實施例另外包含表面活性劑。蛋白質分子可易於吸附於表面上並易於變性及因此在氣液、固液及液液界面聚集。此等效應通常與蛋白質濃度呈反比例。此等有害相互作用通常與蛋白質濃度呈反比例且通常藉由物理攪拌而加劇，例如彼等在運輸及處理產品期間所產生者。表面活性劑通常用於阻止、最小化或減少表面吸附。因此，適用於本發明中之表面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、山梨醇酐聚乙氧基化物之其他脂肪酸酯、及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。表面活性劑亦常用於控制蛋白質構形穩定性。表面活性劑之用途就此係蛋白質特異性，因為任何給定表面活性劑通常將穩定一些蛋白質及去穩定其他蛋白質。

聚山梨醇酯易於氧化降解且通常(如供應態)包含足量過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈(尤其甲硫胺酸)之氧化。因此，聚山梨醇酯應小心使用，且當使用時，應以其最低有效濃度使用。就此而言，聚山梨醇酯例示一般規則，賦形劑應以其最低有效濃度使用。

本發明調配物之抗體構築體之實施例另外包含一或多種抗氧化劑。蛋白質在醫藥組合物中之有害氧化作用可藉由維持適當周圍氧氣濃度及溫度及藉由避免曝光而預防至一定程度。亦可使用抗氧化劑賦形劑以預防蛋白質之氧化降解。因此，尤其適用抗氧化劑係還原劑、氧/自由基清除劑及螯合劑。用於根據本發明之治療性蛋白質調配物之抗氧化劑較佳係水溶性且在產品之整個儲架期過程中維持其活性。EDTA就此而言係根據本發明之較佳抗氧化劑。抗氧化劑可破壞蛋白質。例如，還原劑(例如特定言之胱胺酸)可破壞分子內雙硫鍵。因此，用於本發明之抗氧化劑係經選擇以尤其消除或足以減少其本身在調配中破壞蛋白質之可能性。

根據本發明之調配物可包括金屬離子，其為蛋白質輔助因子且為形成蛋白質配位錯合物所必需，例如形成某些胰島素懸浮液所必需之鋅。金屬離子亦可抑制一些降解蛋白質之過程。然而，金屬離子亦催化降解蛋白質之物理及化學過程。鎂離子(10-120mM)可用於抑制天冬胺酸或異天冬胺酸之異構化。Ca⁺² 離子(至多100mM)可增加人類脫氧核糖核酸酶之穩定性。然而，Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 可使rhDNA酶去穩定。類似地，Ca⁺² 及Sr⁺² 可使因子VIII(Factor VIII)穩定，其可藉由Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 、Cu⁺² 及Fe⁺² 去穩定，及其聚集可藉由Al⁺³ 離子來增加。

本發明調配物之抗體構築體之實施例另外包含一或多種防腐劑。當開發涉及自相同容器多於一次提取之多劑量非經腸調配物時，防腐劑係必要的。其主要功能係抑制微生物生長並確保在整個藥品之儲架期或使用期間之產品無菌性。常用防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。雖然防腐劑具有與小分子非經腸物一起使用之長期歷史，但是包括防腐劑之蛋白質調配物之開發仍可具有挑戰性。防腐劑幾乎始終具有對蛋白質之去穩定效應(聚集)，且此已成為限制其在多劑量蛋白質調配物中之使用之主要因素。迄今為止，大多數蛋白質藥物已經調配以僅供單次使用。然而，當多劑量調配物係可能時，其具有能夠方便病患及增加市場性之附加優勢。一個良好實例係人類生長激素(hGH)之實例，其中防腐調配物之開發已導致更方便的多次使用型注射筆產品之商業化。目前市場上可購得至少四種包含具有hGH之防腐調配物之此類筆裝置。Norditropin(液體，Novo Nordisk),Nutropin AQ(液體，Genentech)及Genotropin(凍乾雙腔盒，Pharmacia & Upjohn)包含苯酚，而Somatrope(Eli Lilly)係經間甲酚調配。在調配及開發防腐劑型期間需要考慮若干態樣。藥品中之有效防腐濃度必須經最佳化。此需要測試劑型中之給定防腐劑，其具有賦予抗微生物有效性而不減損蛋白質穩定性之濃度範圍。

正如可預期的，包含防腐劑之液體調配物之開發比凍乾調配物更具挑戰性。冷凍乾燥產物可經凍乾而無需防腐劑且在使用時經含有防腐劑之稀釋劑復水。此縮短防腐劑與蛋白質接觸之時間，從而使相關穩定性風險最小化。針對液體調配物，防腐劑有效性及穩定性應維持整個產品儲架期(約18至24個月)。值得注意的重點是應確定包含活性藥物及所有賦形劑組分之最終調配物中之防腐劑有效性。

文中所揭示之抗體構築體亦可調配成免疫脂質體。「脂質體」係由各種類型之脂質、磷脂及/或適用於將藥物遞送至哺乳動物之表面活性劑組成之小型囊泡(vesicle)。脂質體之組分係通常以雙層形式排布，與生物膜之脂質排布類似。包含抗體構築體之脂質體係藉由此項技術中已知之方法(例如描述於Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；美國專利案第4,485,045號及第4,544,545號；及W0 97/38731)來製備。具有增強之循環時間之脂質體揭示於美國專利案第5,013,556號中。特別適用之脂質體可藉由逆向蒸發法以包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之液體組合物來產生。將脂質體擠壓通過具有確定孔徑之過濾器以產生具有所需直徑之脂質體。本發明之抗體構築體之Fab'片段可經由雙硫鍵交換反應共軛至如Martin等人，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述之脂質體。化學治療劑係視需要包含於脂質體內。參見Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。

當醫藥組合物已經調配後，其可以溶液、懸浮液、凝膠、乳化液、固體、結晶之形式或以脫水或凍乾粉之形式貯存於無菌小瓶中。此類調配物可以即用形式或以投與前復水之形式(凍乾)貯存。

文中所定義之醫藥組合物之生物活性可例如藉由細胞毒性分析(如以下實例中所描述，如WO 99/54440中所述或由Schlereth等人，(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)中所述)來測定。如文中所使用，「功效」或「活體內功效」係指對本發明之醫藥組合物之療法之反應(使用例如標準NCI反應標準)。使用本發明之醫藥組合物之療法之成功或活體內功效係指該組合物就其預定目的(亦即，該組合物引起其所需效應之能力，亦即，病理細胞(例如腫瘤細胞)之耗盡)之有效性。該活體內功效可藉由用於各自疾病實體之既定標準方法(包括但不限於白血細胞計數、螢光活化細胞分選、骨髓穿刺)來監測。另外，可使用各種疾病特異性臨床化學參數及其他既定標準方法。此外，可使用電腦輔助斷層攝影術、X 射線、核磁共振斷層攝影術(例如，用於基於國家癌症研究所之反應評定[Cheson BD、Horning SJ、Coiffier B、Shipp MA、Fisher RI、Connors JM、Lister TA、Vose J、Grillo-Lopez A、Hagenbeek A、Cabanillas F、Klippensten D、Hiddemann W、Castellino R、Harris NL、Armitage JO、Carter W、Hoppe R、Canellos GP.非霍奇金淋巴瘤標準化反應標準之國際研討會報告(Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas).NCI贊助國際工作組(NCI Sponsored International Working Group).J Clin Oncol.1999年4月；17(4)：1244])、正電子發射斷層攝影術掃描、白血細胞計數、螢光活化細胞分選、骨髓穿刺、淋巴結生檢/組織學及各種淋巴瘤特異性化學參數(例如，乳酸脫氫酶)及其他既定標準方法。

開發例如本發明之醫藥組合物之藥物中之另一主要挑戰係藥物動力學性質之可預測調節。為此，可建立藥物候選者之藥物動力學曲線(亦即，影響特定藥物治療既定病症之能力之藥物動力學參數之曲線)。影響藥物治療某個疾病實例之能力之動力學參數包括但不限於：半衰期、分佈體積、肝臟首關代謝及血清結合程度。既定藥劑之功效可受上述各參數影響。具有特異性FC模態之本發明抗體構築體之設想特徵係其包含例如藥物動力學行為之差異。根據本發明之半衰期延長之靶向抗體構築體較佳顯示與該抗體構築體之「正則」非HLE形式相比，具有令人驚訝之增加之活體內滯留時間。

「半衰期」意謂其中投與之藥物之50%經由生物過程(例如代謝、排洩等)被消除之時間。「肝臟首關代謝」意謂藥物在首次接觸肝臟後(亦即，在其首次通過肝臟期間)被代謝之傾向。「分佈體積」意謂藥物在整個身體各種腔室(比如例如細胞內及細胞外空間、組織及器官等)中之滯留之程度及該藥物在此等腔室內之分佈之程度。「血清結合程度」意謂藥物與血清蛋白質(例如白蛋白)相互作用並與其結合(從而導致該藥物之生物活性之減少或損失)之傾向。

藥物動力學參數亦包括給定量所投與藥物之生物利用度、延遲時間(Tlag)、Tmax、吸收速率、更高起效(more onset)及/或Cmax。「生物利用度」意謂藥物在血液腔室中之量。「延遲時間」意謂藥物投與與其於血液或血漿中之檢測及可量測性之間是時間延遲。「Tmax」係達到藥物最大血液濃度後之時間，及「Cmax」係針對給定藥物獲得之最大血液濃度。達到藥物之血液或組織濃度(其為藥物生物效應所需)之時間係受所有參數影響。顯示跨物種特異性之雙特異性抗體構築體之藥物動力學參數(其可於臨床前動物測試中於上述非黑猩猩靈長類中測定)亦描述於例如Schlereth等人之出版物(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)中。

在本發明之一較佳態樣中，該醫藥組合物可在約-20℃下穩定至少四週。自隨附實例明顯可知，本發明之抗體構築體之品質與此項技術抗體構築體之對應狀態之品質可使用不同系統來測試。彼等測試應理解為符合「ICH Harmonised Tripartite Guideline：Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C and Specifications：Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B 」，及因此經選擇以提供指示穩定性之概況，其提供待偵測產物之同一性、純度及效力之變化之確定性。廣泛接受的是，術語純度係相對術語。由於醣苷化、脫醯胺或其他異質性，生物科技/生物產品之絕對純度應通常藉由多於一種方法來評定且推導之純度值係方法依賴性。對於穩定性測試目的，純度測試應聚焦於用於測定降解產物之方法。

評估包含本發明之抗體構築體之醫藥組合物之品質時，可藉由例如：分析溶液中之可溶性聚集物之含量(HMWS，採用分子大小篩析法)來分析。較佳地，在約-20℃下保持至少四週穩定性之特徵在於小於1.5% HMWS(較佳小於1% HMWS)之含量。

抗體構築體之作為醫藥組合物之較佳調配物可例如包含調配物之如下所述組分：●調配物：磷酸鉀、L-精胺酸鹽酸鹽、海藻糖二水合物、聚山梨醇酯80，pH 6.0

用於評定呈醫藥組合物形式之本發明之抗體構築體之穩定性之其他實例提供於隨附實例4-12中。在彼等實例中，本發明之抗體構築體之實施例係針對在不同醫藥調配物中之不同應力條件來測試且將結果與此項技術中已知之雙特異性T細胞嚙合抗體構築體之其他半衰期延長(HLE)形式比較。一般而言，設想與具有不同HLE形式之抗體構築體及不具有任何HLE形式之抗體構築體(例如，「正則」抗體構築體)相比，根據本發明之具有特異性FC模態之抗體構築體通常在廣泛應力條件例如溫度及光應力下更穩定。該溫度穩定性可與降低之(低於室溫，包括冷凍)及增加之(高於室溫，包括高達或高於體溫之溫度)溫度兩者相關。如熟習此項技術者將知曉，此類與應力(其在臨床實務中難以避免)相關之改良之穩定性使得該抗體構築體更安全，因為較低降解產物將在臨床實務中發生。因此，該增加之穩定性意謂增加之安全性。

一個實施例提供本發明之抗體構築體或根據本發明之方法所產生之抗體構築體，其用於預防、治療或改善與PSMA表現或PSMA過表現相關之癌症。

本文描述之調配物可作為醫藥組合物用於治療、改善及/或預防有此需要之病患之如本文描述之病理學醫療病症。術語「治療」係指治療性治療及預防性措施兩者。治療包括向來自患有疾病/病症、疾病/病症之症狀或疾病/病症之傾向之病患之身體、單獨之組織或細胞應用或投與該調配物，以達成治癒、癒合、緩解、減輕、改變、補救、改善、改良或影響該疾病、該疾病之症狀或該疾病之傾向之目的。

如本文使用之術語「改善」係指藉由向有此需要之個體投與根據本發明之抗體構築體而達成具有下文中指定之疾病之病患之疾病狀態的任何改良。此類改良亦可視為減緩或停止病患疾病之進展。如本文使用之術語「預防」意謂藉由向有此需要之個體投與本發明之抗體構築體以避免罹患本文指定之腫瘤或癌症或轉移性癌症之病患之發生或再發生。

術語「疾病」係指將受益於使用本文描述之抗體構築體或醫藥組合物之治療的任何病症。此包括慢性及急性病症或或疾病，包括彼等使哺乳動物傾向罹患所述疾病之病理學病症。

「贅瘤」係組織之異常生長，但通常不一定形成塊(mass)。當亦形成塊時，其通常稱作「腫瘤」。贅瘤或腫瘤或可為良性、潛在惡性(癌前)或惡性。惡性贅瘤通常稱作癌症。其等通常侵襲並破壞周圍組織且可形成轉移，亦即，其等擴散至身體之其他部位、組織或器官。因此，術語「轉移性癌症」涵蓋除原始腫瘤之一者以外之到達其他組織或器官之轉移。淋巴瘤及白血病係淋巴贅瘤。對於本發明之目的，其等亦為術語「腫瘤」或「癌症」涵蓋。

術語「病毒性疾病」描述由個體之病毒性感染所致之疾病。

如文中所使用，術語「免疫病症」描述符合此術語免疫病症(例如自身免疫性疾病、過敏反應、免疫缺陷)之普通定義。

在一個實施例中，本發明提供一種用於治療或改善與PSMA表現或PSMA過表現有關之癌症之方法，其包括對有需要之個體投與本發明之抗體構築體或根據本發明方法所產生之抗體構築體之步驟。PSMAxCD3雙特異性單鏈抗體係對於治療癌症(較佳實體腫瘤，更佳癌及前列腺癌)而言特別有利。

術語「有需要之個體」或彼等「有需要治療」者包括彼等已患有疾病者及彼等待預防疾病者。有需要之個體或「病患」包括接受預防性或治療性治療之人類及其他哺乳動物個體。

本發明之抗體構築體通常將根據特定途徑及投與方法、特定劑量及投與頻率、特定疾病之特定治療以及尤其生物利用度及持久性之範圍來設計。將該組合物之材料較佳調配為投與位點可接受之濃度。

調配物及組合物因此可根據本發明設計以藉由任何合適之投與途徑進行遞送。在本發明之內文中，投與途徑包括(但不限於)：●局部途徑(例如經皮膚、吸入、經鼻、經眼、經耳(auricular/aural)、經陰道、經黏膜)；●經腸途徑(例如經口、經胃腸、經舌下、經唇下、經頰、經直腸)；及●非經腸途徑(例如靜脈內、動脈內、骨內、肌肉內、腦內、腦室內、硬膜外、囊內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心臟內、皮膚內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、經皮、鼻內、透皮、滑膜內、管腔內)。

本發明之醫藥組合物及抗體構築體特別適用於非經腸投與，例如，皮下或靜脈內遞送，例如藉由注射(例如推注)，或藉由輸注(例如連續輸注)。醫藥組合物可使用醫學裝置來投與。用於投與醫藥組合物之醫學裝置之實例描述於美國專利案第4,475,196號、第4,439,196號、第4,447,224號、第4,447,233號、第4,486,194號、第4,487,603號、第4,596,556號、第4,790,824號、第4,941,880號、第5,064,413號、第5,312,335號、第5,312,335號、第5,383,851號及第5,399,163號中。

特定言之，本發明提供合適之組合物之不間斷投與。作為一非限制性實例，不間斷或實質上不間斷(即，連續)投與可藉由病患穿戴之小型泵系統以計量流入該病患體內之治療劑來實現。包含本發明之抗體構築體之醫藥組合物可藉由使用該等泵系統投與。此類泵系統通常為此項技術中已知，且通常依賴於含有待輸注之治療劑之盒的週期性交換。當交換此類泵系統中之盒時，可接著發生原本不間斷流入病患體內之治療劑之暫時性中斷。在此類情況下，在盒更換之前之投與階段及在盒更換後之投與階段將仍視為在醫藥方式之意義內且本發明之方法同時組成此類治療性藥劑之「不間斷投與」。

本發明之抗體構築體之連續或不間斷投與可藉助於流體遞送裝置或小型泵系統(包括用於驅動流體流出容器之流體驅動機制及用於啟動該驅動機制之啟動機制)以靜脈內或皮下實現。用於皮下投與之泵系統可包含用於刺穿病患皮膚並將合適之組合物遞送至該病患體內之針或插管。該等泵系統可獨立於靜脈、動脈或血管直接固定或附接至該病患之皮膚，從而容許在該泵系統與該病患之皮膚之間之直接接觸。該泵系統可附接至該病患之皮膚24小時至長達數日。該泵系統可具有小尺寸及小體積容器。作為一非限制性實例，用於待投與之合適之醫藥組合物之容器之體積可在0.1與50ml之間。

連續投與亦可藉助於穿於皮膚上並間隔更換之貼片以經皮實現。熟習此項技術者將瞭解適用於該目的之用於藥物遞送之貼片系統。值得注意的是，經皮投與係特別適用於不間斷投與，因為可有利地同時完成第一耗盡之貼片之更換(例如)與在皮膚表面上直接毗鄰於該第一耗盡之貼片及立即在移除該第一耗盡之貼片前配置新的第二貼片。不出現流動中斷或電力電池故障之問題。

若已凍乾該醫藥組合物，則將該經凍乾之材料在投與前首先於合適之液體中復水。經凍乾之材料可於(例如)注射用抑菌水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)或在蛋白質於凍乾前之相同調配物中復水。

本發明之組合物可以合適之劑量向個體投與，該合適之劑量可(例如)藉由劑量遞增研究藉由向非黑猩猩靈長類(例如，獼猴)投與漸增劑量之顯示本文描述之跨物種特異性之本發明之抗體構築體判定。如上所述，顯示本文描述之跨物種特異性之本發明之抗體構築體可以相同形式在非黑猩猩靈長類之臨床測試中有利地使用及在人類中作為藥物。劑量方案將由主治醫師及臨床因素判定。如在醫學技術中熟知，用於任一病患之劑量取決於許多因素，包括病患尺寸、體表面積、年齡、待投與之特定化合物、性別、投與時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。

術語「有效劑量」定義為足以達成或至少部分達成所需效應之量。術語「治療有效量」定義為足以治癒或至少部分阻止已經罹患疾病之病患中之該疾病及其併發症之量。有效用於此用途之量或劑量將取決於待治療之病症(適應症)、經遞送之抗體構築體、治療性情境及目的、疾病之嚴重性、先前療法、病患之臨床歷史及對治療劑之反應、投與途徑、病患之尺寸(體重、身體表面積或器官尺寸)及/或情況(年齡及一般健康情況)、及病患自我免疫系統之一般情況。合適之劑量可根據主治醫師之判斷調整使得其可向患者投與一次或一系列投與，及以獲得最佳治療效果。

典型劑量可取決於上文提及之因素自約0.1μg/kg上至約30mg/kg或更大之範圍內變化。在特定實施例中，該劑量可自1.0μg/kg上至約20mg/kg之範圍內變化，視需要自10μg/kg上至約10mg/kg或自100μg/kg上至約5mg/kg之範圍內變化。

治療有效量之本發明之抗體構築體較佳導致疾病症狀之嚴重性減小、疾病無症狀週期之頻率或持續時間增加或預防因疾病折磨而產生之損害或殘疾。為治療上文描述之與PSMA表現相關之疾病，治療有效量之本發明之抗體構築體(此處，抗PSMA/抗-CD3抗體構築體)相對於未經治療之病患較佳抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%；至少約40%；至少約50%；至少約60%；至少約70%；至少約80%或至少約90%。化合物抑制腫瘤生長之能力可在預測效力之動物模型中評估。

該醫藥組合物可作為唯一治療劑或與例如所需之抗癌症療法(例如，其他蛋白質類及非蛋白質類藥物)之額外療法組合投與。此等藥物可與包含如本文定義之本發明之抗體構築體之組合物同時投與或以時間定義之間隔及劑量在該抗體構築體之投與前或後分開投與。

如本文使用之術語「有效且非毒性劑量」係指本發明之抗體構築體之可容忍之劑量，該劑量足夠高以引起病理學細胞之損耗、腫瘤消除、腫瘤收縮或疾病之穩定化而無或基本上無主要毒性效果。此類有效非毒性劑量可(例如)藉由此項技術中描述之劑量遞增研究測定且應低於引發嚴重不良副事件(劑量限制性毒性，DLT)之劑量。

如本文使用之術語「毒性」係指在不良事件或嚴重不良事件中證實之藥物之毒性效果。此等副事件可係指在投與後通常缺乏藥物之耐受性及/或缺乏局部耐受性。毒性亦可包括藥物引起之致畸或致癌作用。

如本文使用之術語「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」定義藥物之投與而在投與後及在應用藥物之較長期間內不直接引發嚴重不良事件(局部耐受性)。「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」可在治療期間及隨訪期間(例如)以規律間隔評估。測量包括臨床評估，例如，器官表現及實驗室異常情況之篩選。可進行臨床評估並根據NCI-CTC及/或MedDRA標準記錄/編碼正常研究結果之偏差。器官表現可包括例如過敏/免疫、血液/骨髓、心律失常、凝血及類似物之標準，如例如不良事件通用術語標準3.0版(CTCAE)中所述。可測試之實驗室參數包括(例如)血液學、臨床化學、凝血概況及尿液分析及其他體液例如血清、血漿、淋巴或脊椎流體、液體及類似物之檢查。安全性因此可例如藉由物理檢查、成像技術(亦即，超音波、x射線、CT掃描、核磁共振成像(MRI)、使用技術裝置之其他量度(亦即，心電圖)、生命體徵；藉由測量實驗室參數並記錄不良事件來評估。例如，根據本發明之用途及方法中之非黑猩猩靈長類中之不良事件可藉由組織病理學及/或組織化學方法檢查。

上文之術語亦參考(例如)生物技術衍生之醫藥S6的臨床前安全性評估(Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6)；ICH協調三方原則(ICH Harmonised Tripartite Guideline)；1997年7月16日之ICH指導委員會會議(ICH Steering Committee meeting)。

最後，本發明提供一種套組，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明之方法所產生之抗體構築體、本發明之載體及/或本發明之宿主細胞。

在本發明之內文中，術語「套組」意謂兩個或更多個組件，其中一者對應於本發明之抗體構築體、醫藥組合物、載體或宿主細胞-共同封裝於一容器、接收器或其他裝置中。套組可因此描述為足以達成某一目的之可作為單一裝置出售之一組產品及/或器具。

該套組可包含一個或多個含有投與用之合適劑量(參見上文)之本發明之抗體構築體或醫藥組合物之具有任何形狀、尺寸及材料(較佳係防水材料，例如，塑膠或玻璃)之接收器(例如小瓶、安瓶、容器、注射器、瓶、包)。該套組可另外包含使用說明書(例如，以傳單或說明手冊之形式)、投與本發明之抗體構築體之構件(例如注射器、泵、浸出器及類似物)、用於復水本發明之抗體構築體之構件及/或稀釋本發明之抗體構築體之構件。

本發明亦提供用於單劑量投與裝置之套組。本發明之套組亦可包含含有經乾燥/經凍乾之抗體構築體之第一接收器，及含有水性調配物之第二接收器。在本發明之某些實施例中，提供包含單室及多室預填充注射器(例如，液體注射器及拋棄式注射器)的套組。

必須注意，如本文使用，除非內文另有明確說明，否則單數形式「一」、「一個」及「該(the)」包含複數個指示物。因此，例如，提及「一試劑」包括一或多種此類不同試劑及提及「該方法」包括提及可為本文描述之方法改良或替代之一般技術者已知的等效步驟及方法。

除非另有指示，否則位元於一系列要素之前之術語「至少」應理解為係指該等系列中之每一種要素。熟習此項技術者將知曉或能夠確定僅使用例行實驗，本發明之特定實施例之許多等效物。本發明意欲涵蓋此類等效物。

本文中無論在何種情況下使用之術語「及/或」包括藉由該術語連接之要素之「及」、「或」及「所有或任何其他組合」之含義。

如本文使用之術語「約(about)」或「近似(approximately)」意謂在給定值或範圍之20%內，較佳係在10%內，及最佳係在5%內。然而，其亦包括具體數字(concrete number)，例如約20包括20。

術語「小於」或「大於」包括具體數字。例如，小於20意謂小於或等於。類似地，多於或大於分別意謂多於或等於，或大於或等於。

於本說明書及後面的申請專利範圍通篇中，除非本文需要，否則詞語「包含(comprise)」及變化形式諸如「包含(comprises/comprising)」將理解為意指包括所述的整數或步驟或整數或步驟之群，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群。當文中使用時，術語「包含(comprising)」可用術語「含有(containing)」或「包括(including)」替換，或有時當文中使用時，用術語「具有(having)」替換。

當文中使用時，術語「由......組成(consisting of)」排除申請專利範圍要素中未指定之任何要素、步驟或組分。當文中使用時，術語「基本上由......組成(consisting essentially of)」不排除不實質性影響申請專利範圍之基本且新穎特徵之材料或步驟。

在文中每種情況下，術語「包含」、「基本上由其組成」及「由其組成」中之任一者可用另外兩種形式中之任一者替換。

應瞭解，本發明不限於文中所述之特定方法、方案、試劑及成分等且因此可變化。文中所用之術語係僅用於描述特定實施例之目的，且不意欲限制僅由申請專利範圍定義之本發明之範圍。

本說明書之內容通篇中所引述之所有公開案及專利案(包括所有專利案、專利公開案、科學公開案、製造商之說明書、說明等)(不論上文或下文)均以全文引用之方式併入本文中。本文中的任何內容均不應被視為承認本發明因為先前發明而無權先於該揭示內容。以引用之方式併入之材料在一定程度上與本說明書矛盾或不一致時，本說明書將取代任何此類材料。

本發明及其優勢之更佳瞭解將自僅用於說明性目的而提供之以下實例來獲得。然而，該等實例無意以任何方式限制本發明之範圍。

實例1 ：在缺乏靶細胞之情況下，BiTE ^® 誘導T細胞上之CD69表現

將自健康人類供體單離之PBMC與漸增標靶B/CD3或標靶A/CD3 HLE雙特異性抗體構築體一起培養48h。活化標誌物CD69於T細胞上之表現係藉由免疫染色及流式細胞測量術及抗原特異性共軛物mAb來測定。

針對所有抗CDH19構築體觀察到與CD69上調有關之標靶非依賴性T細胞活化，但最顯著的是異源Fc及交叉抗體(crossbody)分子。抗標靶B-scFc上調CD69係以較高濃度發生且幅度係部分低於其他兩個基於Fc之構築體。

對於抗標靶A，針對含scFc之分子幾乎沒有觀察到標靶非依賴性T細胞活化，而在缺乏靶細胞之情況下，異源Fc構築體誘導CD69在T細胞之細胞表面上之強上調。

針對以下構築體評估由在C端含有單鏈Fc或異源Fc融合物之BiTE^® 抗體構築體誘導之標靶非依賴性T細胞活化：

BiTE^® 抗體構築體(連續稀釋：0.1pM-2μM)

a. 標靶A-I2C scFc；1.14mg/mL； b. 標靶A異源Fc；1.02mg/

人類PBMC效應子細胞(3個供體；#065、#823、#836(scFc)#401、#415、#433(異源Fc)；#590、#595、598、#605(X體))。

48h培養時間。

利用流式細胞測量術及抗原特異性共軛物mAb測定CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞上之CD69表現。結果參見圖2。

針對以下構築體評估由在C端含有單鏈Fc、異源-Fc或交叉抗體融合物之BiTE^® 抗體構築體誘導之標靶非依賴性T細胞活化：

BiTE^® 抗體構築體(連續稀釋：0.1pM-2μM)

c. 標靶B-I2C scFc；245.3μg/mL； d. 標靶B異源Fc；1mg/mL

e. 標靶B交叉抗體；6.3mg/mL

人類PBMC效應子細胞(3至4個供體；#386、#392、#401(scFc)#282、#284、#287(異源Fc))。48h培養時間。

利用流式細胞測量術及抗原特異性共軛物mAb測定CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞上之CD69表現。結果參見圖3。

針對於此等分析中所測試之若干雙特異性抗體構築體觀察到與CD69上調有關之標靶非依賴性T細胞活化。當與各自scFc抗體構築體相比時，該CD69上調係對於正則BiTE^® 抗體構築體、異源Fc及交叉抗體抗體構築體而言實質上更顯著。scFc構築體上調CD69係實質上以較高濃度發生且幅度係部分低於其他兩個基於Fc之構築體。

對於抗標靶B scFc抗體構築體，沒有觀察到標靶非依賴性T細胞活化，而在缺乏靶細胞之情況下，異源Fc及X體抗體構築體誘導CD69在T細胞之細胞表面上之強上調。因此，根據本發明之scFc抗體構築體顯示例如非特異性T細胞活化(例如，此處例舉之CD69上調)(其為特異性免疫療法中非所欲)之優勢。

材料及方法

標靶B

針對以下構築體，由含有單鏈Fc之BiTE^® 抗體構築體誘導標靶非依賴性T細胞活化：

1. BiTE^® 抗體構築體(連續稀釋：1.3pM-20nM)

1. 標靶B-scFc

2. 人類PBMC效應子細胞(3個供體)

3. 48h培養時間。

4. 使用對CD69具特異性之PE-Cy7共軛mAb流式細胞測量分析CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞上之CD69表現。

實例2 ：

將純化之BiTE^® 抗體構築體以遞減濃度(100nM，1：4稀釋)塗覆於 Maxisorb板上。在用PBS-T清洗3x並用PBS/3%(w/v)BSA(60min,37℃)阻斷後，將匯集之人類血漿在室溫下以80rpm培養60min。在3x清洗後，添加對人類Clq亞單元A(CClq)具特異性之小鼠單株抗體(Thermo MA1-83963,1：500)(持續60min，80rpm，室溫)，在所述清洗步驟後，將山羊抗小鼠Fc-POX mAb(1：5,000)在室溫下以80rpm培養60min。再次清洗後，培養TMB受質並在比色反應後藉由添加H₂ SO₄ 來停止。吸光度係在450nm下測定。

結果：如圖4中所示，在高濃度下，BiTE^® 異源Fc抗體構築體(正方形)比BiTE^® 單鏈Fc抗體構築體(三角形)顯示對人類CClq之更高結合信號。作為陰性對照，使用正則BiTE^® 抗體構築體(圓圈)，其顯示無顯著CClq結合。

實例3：與半衰期延長模態融合之BiTE^® 抗體構築體之藥物動力學

於食蟹猴中於藥物動力學(PK)研究之情境中測試兩種PSMA靶向BiTE^® 抗體構築體。一種BiTE^® 抗體構築體係與scFc半衰期延長(HLE)部分融合，而另一種係以單非半衰期延長(非HLO)「正則」BiTE^® 抗體構築體之形式使用。兩種分子之對應命名簡要概述於下表4中。

BiTE^® -HLE抗體構築體(化合物11a)係以短靜脈內推注之形式投與，正則抗體構築體係以連續靜脈內輸注之形式投與(化合物11b)。為比較兩種抗體構築體之藥物動力學參數，對於正則PSMA-BiTE^® 抗體構築體僅顯示輸注結束後立即開始之終末期(terminal phase)。BiTE^® 抗體構築體係以分別15μg/kg(化合物11a)及15.4μg/kg/天(化合物11b)之劑量線性藥物動力學相關範圍來投與。出於比較，所示血清濃度係經劑量標準化及分子量標準化(以nmol指示)。

對於上述化合物各者而言，使用一組兩隻動物。收集血液樣品並製備血清以測定血清濃度。血清BiTE^® 抗體構築體濃度係使用免疫分析來量測。此夾心ELISA分析係藉由經由特異性BiTE^® 靶向抗體捕獲來進行，而使用針對該構築體之CD3結合部分之抗體以供偵測。使用血清濃度-時間曲線以測定PK參數。

兩種研究設計之血液採樣時間點列於下表5中。

示例性顯示兩種BiTE^® 抗體構築體之藥物動力學。各化合物組代表與scFc半衰期延長部分融合或以正則分子形式遺留之相同BiTE^® 抗體構築體。可定量BiTE^® -HLE抗體構築體投與後於所有動物中所有時間點之所有蛋白質血清濃度。(圖5)。

藥物動力學參數係使用標準非隔室分析(NCA)方法來測定。使用非隔室分析，評估以下PK參數：AUC_inf (血清濃度-時間曲線下面積)、Vss(穩態下之分佈體積)、CL(全身清除率)及終末t_1/2 (終末半衰期)。

各測試化合物之PK參數作為n=2之平均值概述於下表6中。

一般而言，正則PSMA-BiTE^® 抗體構築體之PK曲線描述與此等正則蛋白質之清除機制有關之極陡峭遞減血清濃度曲線。半衰期延長之PSMA靶向BiTE^® -scFc抗體構築體在於食蟹猴中單一測試項目投與後顯示雙相指數遞減。

總之，該與scFc HLE模態融合之PSMA-BiTE^® 抗體構築體(化合物11a)顯示43014h*ng/mL的平均AUC_inf 、0.4mL/h/kg的全身清除率值以及98mL/kg的對應分佈體積。化合物11b(正則，亦即非半衰期延長之PSMA靶向BiTE^® 抗體構築體)顯示13.5mL/h/kg的高清除率，從而導致7763h*ng/mL的低血清曝露。

所測試之兩種不同BiTE^® 抗體構築體之藥物動力學行為之差異例示半衰期延長之PSMA靶向BiTE^® -scFc抗體構築體優於對應正則非HLE形式之一般優勢(尤其在物質於體內之滯留時間方面)。

實例4 ：

使用具有10kDa截止分子量(MWCO)之膜經由超過濾/透濾對分別含有純化之標靶A-hALB、標靶A-hFc及標靶A-scFc抗體構築體之預調配之原料藥進行緩衝液交換。藉由添加濃原液來達成最終調配物。各構築體之所得調配物列於表7中。靶蛋白濃度係1.0mg/mL。將調配之標靶A抗體構築體於I型玻璃小瓶中填充至1mL，該等小瓶藉由丁基橡膠塞子塞住並用鋁密封劑捲軋。將經填充之小瓶在-20、5、25及37℃下培養。使各形式之一個小瓶經歷五個冷凍及解凍(F/T)循環。目標冷凍溫度係-29℃。目標解凍溫度係2℃。斜升速率係約0.3K/min。

根據Ph Eur 2.9.20描述之方法由訓練有素的操作員評定可見顆粒。每小瓶之可見顆粒計數係描繪於表7中。若與標靶A-hALB及標靶A-scFc相比，則標靶A-hFc之可見(大於125μm)蛋白質類顆粒之數量係更高。

上述樣品亦藉由尺寸排除超高效層析(SE-UPLC)來分析以定量高分子物質(HMWS)之百分比含量。SE-UPLC係在AcquityH-Class UPLC系統(Waters)使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150mm管柱(Waters)進行。管柱溫度係設定在25℃。尺寸變異體之分離係藉由應用等濃度方法及0.4mL/min的流動速率來達成。移動相係由100mM磷酸鈉、250mM NaCl(pH 6.8)組成。運行時間總計6.0分鐘。樣品在自動進樣機內維持在8℃下，直至分析。注射總量3μg蛋白質。為避免帶出(carry over)，在各樣品後進行40%乙腈之中間注射。偵測係基於螢光發射(在280nm下激發，在325nm下發射)。峰積分係使用Empower^® 軟體進行。報告HMWS曲線下相對面積(表8)。

獨立於應力條件，基於Fc之抗體構築體顯示在調配物變異體G40MSuT中比在K60RTrT中更低之HMWS含量。顯而易見的是，在G40MSuT以及K60RTrT製劑中，標靶A-scFc比標靶A-hFc含有更低HMWS。其較佳調配物(G40MSuT)中之標靶A-hFc比調配於K60RTrT中之標靶A-hALB更易於HMWS形成。在先前實驗中，此緩衝液對於基於hALB之構築體顯示改良之穩定潛勢。

表8 ：受應力及未受應力(T0 )標靶A-hALB、-hFc 及-scFc 抗體構築體製劑中經由SE-UPLC 測定之HMWS 含量之概覽

n.t.=未測試

在熱應力(在37℃下培養)後化學修飾之豐度係藉由肽圖譜來監測。蛋白質樣品用酵素進行消化並使用逆相層析分離所得肽。將管柱溶離物直接注射至質譜儀之離子源中以識別並定量該等肽。

為達成最大覆蓋，進行兩次單獨酵素消化：一次使用胰蛋白酶及一次使用胰凝乳蛋白酶。在各情況下，該等蛋白質用鹽酸胍變性及隨後用二硫蘇糖醇(DTT)還原。在用DTT培養後，藉由添加碘乙酸來烷基化游離半胱胺酸殘基。將樣品隨後進行緩衝液交換成50mM Tris pH 7.8，以供消化。將胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶各以1：10(樣品：酵素)之比例添加至單獨反應管中。使樣品在37℃下消化30min且藉由添加三氟乙酸來淬滅反應。

將5μg各消化物之負載分開注射至於0.1%(V/V)甲酸(FA)中平衡之Zorbax SB-C18(Agilent #859700-902)逆相管柱上。使用156分鐘梯度的上至含有0.1% FA之90%乙腈以將該等肽直接溶離至Q-Exactive Plus質譜儀(Thermo Scientific)之電噴霧離子源中。於資料依賴性模式(data dependent mode)下使用前12方法(top 12 method)來收集資料，在前12方法中，全掃描(解析70 000；掃描範圍200-2000 m/z)之後進行12種最豐富離子(解析17 500)之高能碰撞解離(HCD)。

基於精確質量及串聯質譜使用內部軟體來識別肽。識別係手動證實。經修飾肽及未修飾肽之相對量係基於離子豐度使用Pinpoint軟體(Thermo Scientific)來計算。

於標靶A-hALB、-hFc及-scFc抗體構築體製劑中偵測之互補決定區(CDR)及半衰期延長部分(hALB或Fc)之化學修飾之百分比以表9給出。當比較類似調配條件時，顯而易見的是，總體上，化學修飾係在scFc構築體中具最低豐富。

n.a.=不適用；n.t.=未測試

實例5 ：

使如實例4下所述調配之標靶A-hALB、-hFc、-scFc抗體構築體經歷pH跳躍實驗。初始材料之濃度係1.0mg/mL。將0.38mL體積之各初始材料填充至玻璃小瓶中。在37℃下預處理後，對該等溶液外加20倍磷酸緩衝液鹽水(PBS)，其由0.090M磷酸鉀、0.480M磷酸鈉(均為鹼性)、0.052M氯化鉀及2.76M NaCl組成。將外加樣品在37℃下培養兩週。培養後，其等藉由SE-UPLC使用實例4下所述之方法來分析且報告HMWS之百分比含量(表10)。當比較調配於K60RTrT中之所有構築體時，HMWS含量按以下順序增加：hALB<scFc<hFc。於G40MSuT中調配時，標靶A-scFc亦顯示比標靶A-hFc更低之HMWS含量。

表10 ：受應力(pH跳躍+2w 37℃)標靶A-hALB、-hFc 及-scFc抗體構 築體製劑中經由SE-UPLC測定之HMWS 含量之概覽

實例6 ：

使如實例4下所述調配之標靶A-hALB、-hFc及-scFc抗體構築體經歷攪拌應力。初始材料之濃度係1.0mg/mL。使0.5mL體積之各溶液濾過適當0.22μm過濾器並填充至3cc玻璃小瓶中。將該等小瓶放置於塑膠盒中，確保該等小瓶在攪拌期間不棄置於盒內。將盒放置於定軌振盪器上。將樣品在500rpm下攪拌65小時。根據Ph Eur 2.9.20所述之方法來評定可見顆粒。該方法係藉由訓練有素的操作員來進行。每小瓶的可見顆粒計數描述於表11中。僅在標靶A-hFc製劑中觀察到可見蛋白質類顆粒。

亦藉由尺寸排除超高效層析(SE-UPLC)來分析上述樣品以定量高分子量物質(HMWS)之百分比含量。應用實例4中所述之相同方法。攪拌樣品之HMWS含量概述於表12中。當比較K60RTrT製劑時，HMWS之形成在標靶A-hFc抗體構築體中最顯著。HMWS係在標靶A-hFc中比在標靶A-scFc中更具豐度。

表12：受應力(pH跳躍+2w 37℃)標靶A-hALB、-hFc 及-scFc製劑中經由SE-UPLC 測定之HMWS含量之概覽

實例7 ：

使如實例4下所述調配之標靶A-hALB、-hFc及-scFc抗體構築體曝露於可見及UVA光(光應力)。蛋白質濃度在所有製劑中總計1mg/mL。使蛋白質溶液濾過具有0.22μm孔徑之過濾器並在I型玻璃小瓶中填充至0.5mL。使標靶A-hALB及-scFc經歷兩種不同測試，分別包括0.2MLux可見光/25W*h/m² UVA光及1.2MLux可見光/173W*h/m² 。使標靶A-hFc經歷兩種不同測試，分別包括0.2MLux可見光且不含UVA光及1.2MLux可見光/30W*h/m² UVA光。將腔室溫度調整至25℃。光曝露後，藉由目視檢查(表13)、SE-UPLC(表14)及肽圖譜(表15)來分析樣品。上述方法係根據實例4下描述之程序來進行。對於兩種測試而言，雖然使標靶A-hALB及-scFc抗體構築體曝露於較高劑量UVA光，但未觀察到可見蛋白質類顆粒，而標靶A-hFc抗體構築體樣品顯示每小瓶一個可見蛋白質類顆粒，與調配物無關。

¹⁾ 0.2MLux可見光/25W*h/m² UVA光，²⁾ 0.2MLux可見光且無UVA光，³⁾ 1.2MLux可見光/173W*h/m² ，⁴⁾ 1.2MLux可見光/30W*h/m²

當於K60RTrT中調配蛋白質時，HMWS按以下順序增加：標靶A-hALB<-scFc<-hFc抗體構築體。當於G40MSuT中調配時，基於Fc之構築體之HMWS可減小。然而，標靶A-scFc之HMWS再次較不顯著。標靶A-hFc抗體構築體揭示對UVA光曝露尤其敏感。

於標靶A-hALB、-hFc及-scFc抗體構築體製劑中偵測到之互補決定區(CDR)及半衰期延長部分(hALB或Fc)之化學修飾之百分比以表15給出。當比較類似調配條件時，顯而易見的是，總體上，化學修飾係在scFc構築體中具最低豐富。

表15 ：標靶A-hALB、-hFc 及-scFc 抗體構築體製劑中在光曝露後經由肽圖譜測定之化學修飾之概覽

n.a.=不適用；n.t.=未測試

實例8 ：

根據實例4中所述之程序，將標靶A-hALB抗體構築體調配於K60RTrT中及將標靶A-scFc抗體構築體調配於G40MSuT中。蛋白質濃度總計0.05mg/mL。用500μL測試溶液填充玻璃(硼矽酸鹽，I型，自West購得之13mm 3cc小瓶，貨號68000375)及聚丙烯測試容器(2mL，帶O環，例如購自Sarstedt，貨號72.694.005)。使測試溶液於第一測試容器中靜置五分鐘。隨後取樣150μL分液以供分析。將剩餘測試溶液(350μL)自一個測試容器連續轉移至下一個(總共五個容器)。在各小瓶中，使該溶液在下一次轉移之前靜置五分鐘。每個轉移步驟使用相同移液管。使用30mL聚碳酸酯瓶(Nalgene，PCS-000295，帶蓋子，PP/20-415/ZTPE)進行相同測試。對於此容器類型，對第一容器填充5mL。在取樣150μL分液後，將殘餘體積自一個測試容器轉移至下一個(根據上述程序)。藉由SE-UPLC(如實例4下所述之方法)分析自容器#1及#5倒取之樣品。另外，蛋白質偵測係用PDA偵測器(280nm)進行以測定蛋白質濃度。自各測試容器之百分比蛋白質回收率係由表16給出。其顯示，標靶A-scFc抗體構築體之蛋白質回收率比標靶A-hALB抗體構築體更顯著，與容器類型無關。

實例9：

根據實例4中所述之程序，將標靶A-hALB抗體構築體調配於K60RTrT中及將標靶A-scFc抗體構築體調配於K60RTrT及G40MSuT中。蛋白質濃度總計1.0mg/mL。將1950μL各測試溶液外加50μL 1000ppm矽標準溶液(自AlfaAesar購得之Specpure，貨號38717)，從而導致25ppm外加物。未外加測試溶液用作對照樣品。將經外加之測試溶液以及對照樣品填充至3cc I型玻璃小瓶中並在37℃下培養24小時。所有樣品藉由SE- UPLC根據實例4中所述之方法來分析以定量HMWS之量(表17)。

實例10 ：

使用具有10kDa截止分子量(MWCO)之膜經由超過濾/透濾對分別含有經純化之標靶C(cc)-hALB、標靶C(cc)-hFc及標靶C(cc)-scFc抗體構築體之預調配原料藥進行緩衝液交換。藉由添加濃原液來達成最終調配物。各構築體之所得調配物列於表18中。靶蛋白濃度係1.0mg/mL。將調配之標靶C(cc)構築體於I型玻璃小瓶中填充至1mL，該等小瓶藉由丁基橡膠塞子塞住並用鋁密封劑捲軋。將經填充之小瓶在-20、5、25及37℃下培養。使各形式之一個小瓶經歷五個冷凍及解凍(F/T)循環。目標冷凍溫度係-29℃。目標解凍溫度係2℃。斜升速率係約0.3K/min。亦藉由尺寸排除超高效層析(SE-UPLC)來分析上述樣品以定量高分子量物質(HMWS)之百分比含量。SE-UPLC係根據實例4下所述之方法來進行。當調配於K60RTrT中時，HMWS在未受應力樣品中按以下順序增加：scFc<hALB<hFc。觀察到scFc構築體之冷凍解凍應力後之HMWS之增加最不顯著。hFc抗體構築體揭示在-20℃下最易於HMWS形成。HMWS含量在5℃下貯存四週後增加。此等條件下之HMWS形成對於基於Fc之構築體而言比基於白蛋白之構築體更顯著。在K60RTrT中，在高貯存溫度(25及37℃)下未觀察到HMWS之顯著增加。當調配於G40MSuT中時，未受應力樣品中之所有構築體揭示類似HMWS含量。若與基於白蛋白之構築體相比，冷凍解凍期間之增加對於基於Fc之構築體而言更突出。在G40MSuT中，hFc構築體在-20℃下貯存期間最不穩定。僅觀察到hALB構築體在液體貯存期間之HMWS之相當大增加。

n.t.=未測試

藉由肽圖譜根據實例4中所述之方法來監測在熱應力(在37℃下培養)後化學修飾之豐度。於標靶C(cc)-hALB、-hFc及-scFc製劑中偵測之互補決定區(CDR)之化學修飾之百分比以表19給出。總之，標靶C(cc)-scFc顯示CDR中最低量之化學修飾。顯而易見的是，scFc構築體之尤其CDR之脫醯胺最不顯著。

n.a.=不適用；n.t.=未測試

實例11 ：

使如實例4下所述調配之標靶C(cc)-hALB、-hFc及-scFc抗體構築體經歷pH跳躍實驗。初始材料之濃度係1.0mg/mL。將0.38mL體積之各初始材料填充至玻璃小瓶中。在37℃下預處理後，對該等溶液外加20倍磷酸緩衝液鹽水(PBS)，其由0.090M磷酸鉀、0.480M磷酸鈉(均為鹼性)、0.052M氯化鉀及2.76M NaCl組成。將外加樣品在37℃下培養兩週。培養後，藉由SE-UPLC使用實例4下所述之方法來分析其等且報告HMWS之百分比含量(表20)。若與標靶C(cc)-hALB及-hFc相比，標靶C(cc)-scFc構築體在pH跳躍後顯示最低HMWS含量，與調配物無關。

實例12 ：

使如實例10下所述調配之標靶C(cc)-hALB、-hFc及-scFc抗體構築體經歷攪拌應力。初始材料之濃度係1.0mg/mL。使0.5mL體積之各溶液濾過適當0.22μm過濾器並填充至3cc I型玻璃小瓶中。將該等小瓶放置於塑膠盒中，確保該等小瓶在攪拌期間不棄置於盒內。將盒放置於定軌振盪器上。將樣品在500rpm下攪拌65小時。樣品藉由SE-UPLC來分析以定量高分子量物質(HMWS)之百分比含量。應用如實例4中所述之相同方法。攪拌樣品之HMWS含量由表21概述。於任一種調配物中，標靶C(cc)-scF之HMWS之形成最不顯著。

表21 ：經由SE-UPLC測定之 受應力(pH跳躍+2w 37℃)標靶C(cc)-

實例13 ：

使如實例4下所述調配之標靶C(cc)-hALB、-hFc及-scFc抗體構築體曝露於可見及UVA光(光應力)。蛋白質濃度在所有製劑中總計1mg/mL。使蛋白質溶液濾過具有0.22μm孔徑之過濾器並在I型玻璃小瓶中填充至0.5mL。使標靶C(cc)-hALB及-scFc經歷兩種不同測試，分別包括0.2MLux可見光/25W*h/m² UVA光及1.2MLux可見光/173W*h/m² 。使標靶C(cc)-hFc經歷兩種不同測試，分別包括0.2MLux可見光且不含UVA光及1.2MLux可見光/30W*h/m² UVA光。將腔室溫度調整至25℃。光曝露後，樣品藉由SE-UPLC(表22)及肽圖(表23)來分析。上述方法係根據實例4下描述之程序來進行。雖然較高UVA光強度應用於標靶C(cc)-scFc，但此構築體抗HMWS形成係穩定的。相反，在測試2條件後，標靶C(cc)-hFc及標靶C(cc)-hALB顯示HMWS增加。

總之，標靶C(cc)-scFc之光曝露後之化學修飾最不顯著。在標靶C(cc)-hALB及標靶C(cc)-hFc中，尤其CDR之脫醯胺形成至較高程度。當比較基於Fc之構築體時，其揭示雖然scFc構築體曝露於比hFc構築體更高之UVA光劑量，但標靶C(cc)-scFc較不易於Fc部分之化學修飾。表23亦列示標靶C(cc)-hALB中之白蛋白部分之最豐富化學修飾，此證實此構築體之半衰期延長部分比標靶C(cc)-hFc及-scFc抗體構築體之Fc部分在化學上更多降解。

實例14

將針對靶向標靶C所設計之不同BiTE^® 抗體構築體(包括標靶C非半衰期延長(非HLE，「正則」)、標靶C-hALB(包含人類血清白蛋白)及標靶C-scFc(包含scFC模態作為上述第三域))調配於包含100mM L精胺酸鹽酸鹽、8%(w/v)海藻糖二水合物及聚山梨醇酯80之溶液中。對於hALB及scFc，靶蛋白濃度係1.0mg/mL，及對於HLE形式，靶蛋白濃度係0.4mg/mL。將調配之BiTE^® 抗體構築體於I型玻璃小瓶中填充至1mL，該等小瓶藉由丁基橡膠塞子塞住並用鋁密封劑捲軋。將經填充之小瓶在-20℃及37℃下培養(不含及含25ppm矽，其以其誘導蛋白質聚集之潛能而已知)4週。使上述構築體曝露於光(1.2MLux可見光/173W*h/m2 UVA光)。對於光應力，腔室溫度設定在25℃。貯存在-70℃下之樣品用作對照(T0)。

藉由尺寸排除超高效層析(SE-UPLC)以一式兩份分析上述樣品以定量高分子物質(HMWS)之百分比含量。SE-UPLC係在Aquity H-Class UPLC系統(Waters)上使用Acquity UPLC BEH200 SEC 150mm管柱(Waters)進行。管柱溫度設定在25℃。尺寸變異體之分離係藉由應用等濃度方法及0.4mL/min的流動速率來達成。移動相係由100mM磷酸鈉、250mM NaCl(pH 6.8)組成。運行時間總計6.0分鐘。樣品在自動進樣機內維持在8℃下，直至分析。注射總量3μg蛋白質。為避免帶出，在各樣品後進行40%乙腈之中間注射。偵測係基於螢光(在280nm下激發，在325nm下發射)。峰積分係使用Empower^® 軟體進行。報告HMWS曲線下相對面積(24)。

在不受應力樣品內，scFc構築體之HMWS係最不顯著。在-20℃下貯存4週期間排他地觀察到HMWS形成。於此等條件下，HMWS含量按以下順序增加：scFc<hALB<非HLE。

另外，藉由微流體成像(MFI)使用自Fluid Imaging Technologies,Inc購得之Flowcam評定在缺乏及存在矽之情況下自熱應力衍生之樣品的次可見顆粒之豐度。該儀器配備FC80FV流動池。應用十倍光學放大倍數。用無顆粒水證實系統適宜性。應用每秒20幀之自動成像速率。黑暗及明亮臨限值分別設定在25及20像素。單一量測之樣品體積總計0.25mL。樣品係以一式三份量測。在各一式三份之前，將該系統用0.5mL各自樣品溶液沖刷。在各一式三份開始時及之間，進行1.0mL無顆粒水清洗。用Visual Spreadsheet軟體進行資料評估。樣品係以一式三份進行量測。結果概述於表25中。

熱應力導致含有非HLE及hALB構築體之製劑中之次可見顆粒形成。相反，該scFc構築體保持穩定。添加矽時，不會促進形成可見度以下之顆粒，與BiTE^® 抗體構築體之性質無關。

表25 ：在缺乏及存在矽之情況下，在熱應力後藉由MFI 之標靶F 非HLE(正則)、-hALB 及-scFc 製劑中次可見顆粒之評定

亦藉由弱陽離子交換(WCX)層析來分析來自熱應力之樣品以使用來自Waters的UPLC Aquity H Class定量帶電變異體之百分比含量。應用Protein-Pak Hi Res CM 7ìm 4.6 x 100mm管柱(Waters，目錄號186004929)。將管柱溫度調整至30℃。流動速率設定在0.65mL/min。如下設計所應用之梯度(表26)。自動進樣機之溫度維持在2-8℃。

注射總量3μg蛋白質。偵測係基於螢光發射(在280nm下激發，在325nm下發射)。峰積分係使用Empower^® 軟體進行。報告主峰曲線下相對面積以及酸性及鹼性帶電變異體曲線下相對面積(表27)。

熱應力導致減小之主峰百分比，其必須歸因於酸性帶電變異體之占主導之形成。scFc構築體之主峰百分比之損失最不顯著(7.5%)。在光曝露後，鹼性帶電變異體形成於具有延長半衰期之兩種構築體中。在hALB及scFc構築體中，鹼性帶電變異體之增加介於5至6%之間。

另外，使用基於LabChip GXII系統(Perkin Elmer)之微流體毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)分析定量熱及光應力樣品中之樣品純度。樣品變性溶液係由補充34mM二硫蘇糖醇之HT蛋白質表現樣品緩衝液(由Perkin Elmer提供)組成。各樣品用該變性溶液1：8稀釋並與蛋白質表現試劑(protein express ladder)一起加熱至70℃達10分鐘。將35μL注射用水(WFI)添加至40μL變性樣品中。將120μL WFI添加至12μL蛋白質表現試劑中。將樣品、蛋白質表現試劑、蛋白質表現清洗緩衝液、凝膠染料及脫色溶液轉移至各自容器中。將樣品以電動力學方式自微量滴定盤裝載至整合分離、染色、脫色及偵測蛋白質及其尺寸變異體之晶片上。評估所得電泳圖並報告純度變化。應力後所偵測之百分比純度之概覽由表28給出並與未受應力樣品(T0)比較。

若與非HLE構築體在所有條件下比較，則觀察到hALB及scFc構築體具有更高純度。在熱及光應力後，偵測到hALB及scFc構築體與T0相比之純度之稍微降低。在37℃下貯存4週後之純度損失對於hALB構築體而言總計8.4%及對於scFc構築體而言總計6.6%。光曝露後之損失在hALB與scFc之間可比較。

實例15

在pH 7.0下調配針對靶向標靶D所設計之不同BiTE^® 抗體構築體(包括標靶D-hALB及標靶D-scFc)。對於兩種構築體，靶蛋白濃度係1.0mg/mL。將調配之BiTE^® 抗體構築體於I型玻璃小瓶中填充至1mL，該等小瓶藉由丁基橡膠塞子塞住並用鋁密封劑捲軋。將經填充之小瓶在37℃(標靶D-hALB)及40℃(標靶D-scFc)下培養4週。貯存於-70℃下之樣品用作對照(T0)。藉由SE-UPLC根據實例4下所述之方法來分析樣品。結果概述於表29中。

若與hALB構築體(4.0%)相比，雖然培養溫度稍微較高，但scFc構築體在熱應力後顯示減小之單體損失(2.3%)。

實例16

檢查針對靶向標靶PSMA所設計之不同BiTE^® 抗體構築體(包括PSMA-非HLE(正則)及PSMA-scFc)。靶蛋白濃度係1.0mg/mL。將調配之BiTE^® 抗體構築體於I型玻璃小瓶中填充至1mL，該等小瓶藉由丁基橡膠塞子塞住並用鋁密封劑捲軋。將經填充之小瓶在-20℃及37℃(不含及含25ppm矽)下培養4週。使上述構築體亦曝露於光1.2MLux可見光/173W*h/m² UVA光)。對於光應力，腔室溫度設定在25℃。貯存於-70℃下之樣品用作對照(T0)。藉由SE-UPLC根據實例4下所述之方法來分析所有樣品。結果概述於表30中。

scFc構築體顯示在所有測試條件下比非HLE構築體更高之單體含量，此指示scFc構築體之高(聚集物)或低分子量物質(片段)之較低形成傾向。

另外，藉由微流體成像(MFI)使用實例14下所述之方法評定在缺乏及存在矽之情況下自熱應力衍生之樣品的次可見顆粒之豐度。結果概述於表31中。

當在缺乏及存在矽之情況下經歷熱應力時，scFc構築體揭示比非 HLE構築體顯著更低之次可見顆粒之豐度。

亦藉由弱陽離子交換(WCX)層析來分析來自熱及光應力之樣品以使用來自Waters的UPLC Aquity H Class根據實例14下所述之方法定量帶電變異體之百分比含量。報告主峰曲線下相對面積以及酸性及鹼性帶電變異體曲線下相對面積(表32)。

scFc構築體顯示比非HLE構築體更高之主峰百分比(更低量帶電變異體)。當比較經歷熱應力之樣品時，此差異最顯著，此指示scFc構築體之更高化學穩定性。

另外，使用基於LabChip GXII系統(Perkin Elmer)之微流體毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)分析根據實例14下所述之方法定量熱及光應力樣品中之樣品純度。應力後所偵測之百分比純度之概覽由表33給出並與未受應力樣品(T0)比較。

若與非HLE構築體比較，則觀察到scFc構築體具有更高純度，與應力條件無關。因此，如在此所例示，scFc抗體構築體在廣泛應力條件下比非HLE抗體構築體更穩定，且因此，更安全及更好地適用於在實務中具有不斷變化之應力條件之通用臨床工作。

實例17

檢查針對靶向標靶B所設計之不同BiTE^® 抗體構築體(包括標靶B-X體及標靶B-scFc)。靶蛋白濃度係1.0mg/mL。將調配之BiTE^® 抗體構築體於I型玻璃小瓶中填充至1mL，該等小瓶藉由丁基橡膠塞子塞住並用鋁密封劑捲軋。將經填充之小瓶在-20℃及37℃下培養4週。另外，使所有樣品曝露於光1.2MLux可見光/173W*h/m² UVA光。將腔室溫度調整至25℃。貯存於-70℃下之樣品用作對照(T0)。藉由SE-UPLC根據實例14下所述之方法來分析貯存於-20及-37℃下之樣品。結果概述於表34中。

若與X體比較時，當分別於-20及37℃下貯存四週時，scFc構築體保留更高單體含量。

另外，藉由微流體成像(MFI)使用實例14下所述之方法評定未受應力樣品之次可見顆粒之豐度。結果概述於表35中。若與CD19-X體製劑相比，CD19-scFc製劑顯示顯著更低量之次可見顆粒。此適用於所有包括之粒級。

亦藉由弱陽離子交換(WCX)層析來分析來自光應力之樣品以使用來自Waters的UPLC Aquity H Class根據實例14下所述之方法定量帶電變異體之百分比含量。報告主峰曲線下相對面積以及酸性及鹼性帶電變異體曲線下相對面積(表36)。

若與X體相比，scFc構築體顯示令人驚訝之增強之抗光曝露之穩定性，此由主峰之低顯著損失(其與X體構築體之5.5%相比，總計1.4%)來指示。因此，自該示例性情境下可得出，具有scFc域作為HLE之抗PSMA抗體構築體係在應力抗性方面優於包含不同HLE之其他抗體構築體且因此具有令人驚訝之改良穩定性之特徵。

實例18 雙特異性scFc 變異體之尺寸排除層析

藉由尺寸排除層析根據標準程序測試構築體D9F、T2G、D3L、T7I及K6C(參見圖6)各者之運行行為。詳細而言，使限定量之25μg各構築體在室溫下於Superdex 200 increase 10/300GL管柱上於檸檬酸鹽離胺酸(10mM及75mM，pH7)中運行(750μl/min)並記錄OD 280nm。隨後，比較構築體之滯留時間。因此，與T2G、D3L、T7I及K6C相比，構築體D9F顯示令人驚訝之延遲之溶離(表37)，此指示Fc域之結構/配置方面之差異。滯留時間之此差異以在鉸鏈區及CH2及CH2CH3與CH3之連接中具有未成對半胱胺酸之構築體T7I最為顯著(18.98min vs.18.62min，相差0.36min)。然而，將BSA對照之各自滯留時間考慮在內，D9F及T2G之間之0.16min滯留時間差異亦顯著的。BSA對照顯示單體為19.07min之滯留時間及二聚體為16.82min，此顯示雙分子量為2.25min之滯留時間差異。因此，由於該等構築體具有僅Fc部分之結構差異，所以0.16min的滯留時間差異係顯著的。總之，構築體D9F顯示最長滯留時間，此指示最強結合。此結論導致預期D9F亦具有最長活體內半衰期。

實例19 ：與人類FcRn(FCGRT/B2M) 結合之基於表面電漿子共振之測定

於SPR(Biacore)實驗中根據標準程序測試構築體D9F、T2G、D3L、T7I及K6C(圖6)各者之結合人類FcRn之能力。詳細而言，藉由使用乙酸鈉緩衝液pH 4.5及由200mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA pH 6.0組成之運行緩衝液，以450-500RU之FCGRT/B2M(ACRO Biosystems)固定CM5感測器晶片(GE Healthcare)。在隨後運行中，該等構築體以於200mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA(pH 6.0及36℃)中稀釋成之兩種濃度250nM及125nM注射。以30μl/min流動速率進行締合90秒，接著在30μl/min流動速率下，於200mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA(pH 6.0，36℃)中進行解離期90秒。以30μl/min用10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA pH 7.4進行後續再生10秒。

量測注射期間所有構築體之最大結合性作為各自反應單位(RU)，其等同於經FcRn塗覆之CM5晶片上之因結合構築體所致之分子量增加。所有構築體以一式兩份量測。一式兩份測定之平均值分別描繪於圖7A及7B中。

因此，與T2G、D3L、T7I及K6C相比，構築體D9F顯示經FcRn塗覆之CM5晶片上之質量更高之顯著增加，此指示D9F與人類FcRn之較強結合親和力。各構築體在兩種濃度下均得到此觀察結果。

抗FcRn之結合係經由該等構築體內之Fc部分來介導。如文獻中所述之抗人類FcRn之較強結合係較長活體內半衰期之指標，因為各蛋白質之較高細胞內營救及因此降低之降解速率。因此，與其他構築體相比，D9F與人類FcRn之較強結合使得此分子明顯優越地作為治療分子之基礎以允許潛在藥物於病患中之較長曝露及較低藥物投與頻率。

實例20 ：與人類FcRn(FCGRT/B2M) 結合之基於表面電漿子共振之測定

於SPR(Biacore)實驗中根據標準程序測試構築體D9F、T2G、D3L、T7I及K6C及人類IgG1-κ抗體MT201各者之其結合人類FcRn之能力。詳細而言，藉由使用乙酸鈉緩衝液pH 4.5及由200mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA pH 6.0組成之運行緩衝液以約350RU FCGRT/B2M(ACRO Biosystems)固定CM5感測器晶片(GE Healthcare)。該等構築體及人類IgG1-κ對照(MT201)在隨後以稀釋於200mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA(pH 6.0及36℃)中之125nM之濃度注射。以30μl/min流動速率進行締合90秒，接著在30μl/min流動速率下於200mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA(pH 6.0，36℃)中進行解離期60每秒。以30μl/min用10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA pH 7.4進行後續再生10秒。

量測注射期間所有構築體之最大結合作為各自反應單位(RU)，其等同於經FcRn塗覆之CM5晶片上之因結合構築體所致之分子量增加。所有構築體以一式兩份量測。一式兩份測定之平均值描繪於圖8中，包括標準偏差誤差槓。

因此，與T2G、D3L、T7I及K6C相比，構築體D9F顯示經FcRn塗覆之CM5晶片上之質量更高之顯著增加，此指示D9F與人類FcRn之較強結合親和力。D9F之經FcRn塗覆之CM5晶片上之質量增加極比擬與人類IgG1-κ對照抗體MT201之質量增加，此指示構築體D9F與人類FcRn之結合性。

抗FcRn之結合係經由該等構築體內之人類IgG1 Fc部分來介導。如此項領域中所述之抗人類FcRn之較強結合係較長活體內半衰期之指標，因為各自蛋白質之較高細胞內營救及因此降低之降解速率。因此，與其他構築體相比，D9F與位於人類IgG1-κ對照抗體(MT201)範圍內之人類FcRn之較強結合使得此分子明顯優越地作為治療分子之基礎以允許潛在藥物於病患中之較長曝露(推測位於全人類IgG1抗體之範圍內)及較低藥物投與頻率。

<110> 德商安美基研究(慕尼黑)公司(AMGEN RESEARCH(MUNICH)GMBH)

<120> PSMA及CD3雙特異性T細胞嚙合抗體構築體

<130> 32243/50402A

<140> TW106103583

<141> 2017-02-02

<150> US 62/290,875

<151> 2016-02-03

<160> 586

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

<210> 7

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

<210> 8

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

<210> 13

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

<210> 14

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

<210> 15

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

<210> 17

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

<210> 18

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

<210> 19

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

<210> 20

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

<210> 21

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 21

<210> 22

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

<210> 23

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 23

<210> 24

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 24

<210> 25

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

<210> 26

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

<210> 27

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 27

<210> 28

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

<210> 29

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

<210> 30

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 30

<210> 31

<211> 484

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 31

<210> 32

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 32

<210> 33

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 33

<210> 34

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 34

<210> 35

<211> 1091

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 35

<210> 36

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 36

<210> 37

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 37

<210> 38

<211> 732

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 38

<210> 39

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 39

<210> 40

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 40

<210> 41

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 41

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 42

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 43

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 44

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 45

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 46

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 47

<210> 48

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 48

<210> 49

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 49

<210> 50

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 50

<210> 51

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 51

<210> 52

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 52

<210> 53

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 53

<210> 54

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 54

<210> 55

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 55

<210> 56

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 56

<210> 57

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 57

<210> 58

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 58

<210> 59

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 59

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 60

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 61

<210> 62

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 62

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 63

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 64

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 65

<210> 66

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 66

<210> 67

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 67

<210> 68

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 68

<210> 69

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 69

<210> 70

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 70

<210> 71

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 71

<210> 72

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 72

<210> 73

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 73

<210> 74

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 74

<210> 75

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 75

<210> 76

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 76

<210> 77

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 77

<210> 78

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 78

<210> 79

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 79

<210> 80

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 80

<210> 81

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 81

<210> 82

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 82

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 83

<210> 84

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 84

<210> 85

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 85

<210> 86

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 86

<210> 87

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 87

<210> 88

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 88

<210> 89

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 89

<210> 90

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 90

<210> 91

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 91

<210> 92

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 92

<210> 93

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 93

<210> 94

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 94

<210> 95

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 95

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 96

<210> 97

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 97

<210> 98

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 98

<210> 99

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 99

<210> 100

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 100

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 101

<210> 102

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 102

<210> 103

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 103

<210> 104

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 104

<210> 105

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 105

<210> 106

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 106

<210> 107

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 107

<210> 108

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 108

<210> 109

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 109

<210> 110

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 110

<210> 111

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 111

<210> 112

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 112

<210> 113

<211> 984

<217> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 113

<210> 114

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 114

<210> 115

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 115

<210> 116

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 116

<210> 117

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 117

<210> 118

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 118

<210> 119

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 119

<210> 120

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 120

<210> 121

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 121

<210> 122

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 122

<210> 123

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 123

<210> 124

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 124

<210> 125

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 125

<210> 126

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 126

<210> 127

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 127

<210> 128

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 128

<210> 129

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 129

<210> 130

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 130

<210> 131

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 131

<210> 132

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 132

<210> 133

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 133

<210> 134

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 134

<210> 135

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 135

<210> 136

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 136

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 137

<210> 138

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 138

<210> 139

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 139

<210> 140

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 140

<210> 141

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 141

<210> 142

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 142

<210> 143

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 143

<210> 144

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 144

<210> 145

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 145

<210> 146

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 146

<210> 147

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 147

<210> 148

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 148

<210> 149

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 149

<210> 150

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 150

<210> 151

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 151

<210> 152

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 152

<210> 153

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 153

<210> 154

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 154

<210> 155

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 155

<210> 156

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 156

<210> 157

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 157

<210> 158

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 158

<210> 159

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 159

<210> 160

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 160

<210> 101

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 161

<210> 162

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 162

<210> 163

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 163

<210> 164

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 164

<210> 165

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 165

<210> 166

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 166

<210> 167

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 167

<210> 168

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 168

<210> 169

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 169

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 170

<210> 171

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 171

<210> 172

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 172

<210> 173

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 173

<210> 174

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 174

<210> 175

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 175

<210> 176

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 176

<210> 177

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 177

<210> 178

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 178

<210> 179

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 179

<210> 180

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 180

<210> 181

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 181

<210> 182

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 182

<210> 183

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 183

<210> 184

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 184

<210> 185

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 185

<210> 186

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 186

<210> 187

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 187

<210> 188

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 188

<210> 189

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 189

<210> 190

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 190

<210> 191

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 191

<210> 192

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 192

<210> 193

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 193

<210> 194

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 194

<210> 195

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 195

<210> 196

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 196

<210> 197

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 197

<210> 198

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 198

<210> 199

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 199

<210> 200

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 200

<210> 201

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 201

<210> 202

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 202

<210> 203

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 203

<210> 204

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 204

<210> 205

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 205

<210> 206

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 206

<210> 207

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 207

<210> 208

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 208

<210> 209

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 209

<210> 210

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 210

<210> 211

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 211

<210> 212

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 212

<210> 213

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 213

<210> 214

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 214

<210> 215

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 215

<210> 216

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 216

<210> 217

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 217

<210> 218

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 218

<210> 219

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 219

<210> 220

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 220

<210> 221

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 221

<210> 222

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 222

<210> 223

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 223

<210> 224

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 224

<210> 225

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 225

<210> 226

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 226

<210> 227

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 227

<210> 228

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 228

<210> 229

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 229

<210> 230

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 230

<210> 231

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 231

<210> 232

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 232

<210> 233

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 233

<210> 234

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 234

<210> 235

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 235

<210> 236

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 236

<210> 237

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 237

<210> 238

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 238

<210> 239

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 239

<210> 240

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 240

<210> 241

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 241

<210> 242

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 242

<210> 243

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 243

<210> 244

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 244

<210> 245

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 245

<210> 246

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 246

<210> 247

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 247

<210> 248

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 248

<210> 249

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 249

<210> 250

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 250

<210> 251

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 251

<210> 252

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 252

<210> 253

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 253

<210> 254

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 254

<210> 255

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 255

<210> 256

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 256

<210> 257

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 257

<210> 258

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 258

<210> 259

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 259

<210> 260

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 260

<210> 261

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 261

<210> 262

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 262

<210> 263

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 263

<210> 264

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 264

<210> 265

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 265

<210> 266

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 266

<210> 267

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 267

<210> 268

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 268

<210> 269

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 269

<210> 270

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 270

<210> 271

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 271

<210> 272

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 272

<210> 273

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 273

<210> 274

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 274

<210> 275

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 275

<210> 276

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 276

<210> 277

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 277

<210> 278

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 278

<210> 279

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 279

<210> 280

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 280

<210> 281

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 281

<210> 282

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 282

<210> 283

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 283

<210> 284

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 284

<210> 285

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 285

<210> 286

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 286

<210> 287

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 287

<210> 288

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 288

<210> 289

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 289

<210> 290

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 290

<210> 291

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 291

<210> 292

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 292

<210> 293

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 293

<210> 294

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 294

<210> 295

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 295

<210> 296

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 296

<210> 297

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 297

<210> 298

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 298

<210> 299

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 299

<210> 300

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 300

<210> 301

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 301

<210> 302

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 302

<210> 303

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 303

<210> 304

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 304

<210> 305

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 305

<210> 306

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 306

<210> 307

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 307

<210> 308

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 308

<210> 309

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 309

<210> 310

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 310

<210> 311

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 311

<210> 312

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 312

<210> 313

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 313

<210> 314

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 314

<210> 315

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 315

<210> 316

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 316

<210> 317

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 317

<210> 318

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 318

<210> 319

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 319

<210> 320

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 320

<210> 321

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 321

<210> 322

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 322

<210> 323

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 323

<210> 324

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 324

<210> 325

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 325

<210> 326

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 326

<210> 327

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 327

<210> 328

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 328

<210> 329

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 329

<210> 330

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 330

<210> 331

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 331

<210> 332

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 332

<210> 333

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 333

<210> 334

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 334

<210> 335

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 335

<210> 336

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 336

<210> 337

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 337

<210> 338

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 338

<210> 339

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 339

<210> 340

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 340

<210> 341

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 341

<210> 342

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 342

<210> 343

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 343

<210> 344

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 344

<210> 345

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 345

<210> 346

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 346

<210> 347

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 347

<210> 348

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 348

<210> 349

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 349

<210> 350

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 350

<210> 351

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 351

<210> 352

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 352

<210> 353

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 353

<210> 354

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 354

<210> 355

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 355

<210> 356

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 356

<210> 357

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 357

<210> 358

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 358

<210> 359

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 359

<210> 360

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 360

<210> 361

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 361

<210> 362

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 362

<210> 363

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 363

<210> 364

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 364

<210> 365

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 365

<210> 366

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 366

<210> 367

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 367

<210> 368

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 368

<210> 369

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 369

<210> 370

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 370

<210> 371

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 371

<210> 372

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 372

<210> 373

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 373

<210> 374

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 374

<210> 375

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 375

<210> 376

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 376

<210> 377

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 377

<210> 378

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 378

<210> 379

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 379

<210> 380

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 380

<210> 381

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 381

<210> 382

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 382

<210> 383

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 383

<210> 384

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 384

<210> 385

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 385

<210> 386

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 386

<210> 387

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 387

<210> 388

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 388

<210> 389

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 389

<210> 390

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 390

<210> 391

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 391

<210> 392

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 392

<210> 393

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 393

<210> 394

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 394

<210> 395

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 395

<210> 396

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 396

<210> 397

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 397

<210> 398

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 398

<210> 399

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 399

<210> 400

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 400

<210> 401

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 401

<210> 402

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 402

<210> 403

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 403

<210> 404

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 404

<210> 405

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 405

<210> 406

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 406

<210> 407

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 407

<210> 408

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 408

<210> 409

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 409

<210> 410

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 410

<210> 411

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 411

<210> 412

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 412

<210> 413

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 413

<210> 414

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 414

<210> 415

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 415

<210> 416

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 416

<210> 417

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 417

<210> 418

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 418

<210> 419

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 419

<210> 420

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 420

<210> 421

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 421

<210> 422

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 422

<210> 423

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 423

<210> 424

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 424

<210> 425

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 425

<210> 426

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 426

<210> 427

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 427

<210> 428

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 428

<210> 429

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 429

<210> 430

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 430

<210> 431

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 431

<210> 432

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 432

<210> 433

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 433

<210> 434

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 434

<210> 435

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 435

<210> 436

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 436

<210> 437

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 437

<210> 438

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 438

<210> 439

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 439

<210> 440

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 440

<210> 441

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 441

<210> 442

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 442

<210> 443

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 443

<210> 444

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 444

<210> 445

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 445

<210> 446

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 446

<210> 447

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 447

<210> 448

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 448

<210> 449

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 449

<210> 450

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 450

<210> 451

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 451

<210> 452

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 452

<210> 453

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 453

<210> 454

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 454

<210> 455

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 455

<210> 456

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 456

<210> 457

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 457

<210> 458

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 458

<210> 459

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 459

<210> 460

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 460

<210> 461

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 461

<210> 462

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 462

<210> 463

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 463

<210> 464

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 464

<210> 465

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 465

<210> 466

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 466

<210> 467

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 467

<210> 468

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 468

<210> 469

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 469

<210> 470

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 470

<210> 471

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 471

<210> 472

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 472

<210> 473

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 473

<210> 474

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 474

<210> 475

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 475

<210> 476

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 476

<210> 477

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 477

<210> 478

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 478

<210> 479

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 479

<210> 480

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 480

<210> 481

<211> 994

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 481

<210> 482

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 482

<210> 483

<211> 1004

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 483

<210> 484

<211> 994

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 484

<210> 485

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 485

<210> 486

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 486

<210> 487

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 487

<210> 488

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之CDR-H1

<400> 488

<210> 489

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之CDR-H2

<400> 489

<210> 490

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之CDR-H3

<400> 490

<210> 491

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之VH

<400> 491

<210> 492

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之VL

<400> 492

<210> 493

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之VH-P

<400> 493

<210> 494

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之VL-P

<400> 494

<210> 495

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之VH-VL

<400> 495

<210> 496

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F6A之VH-VL-P

<400> 496

<210> 497

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之CDR-L1

<400> 497

<210> 498

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之CDR-L2

<400> 498

<210> 499

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之CDR-L3

<400> 499

<210> 500

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之CDR-H1

<400> 500

<210> 501

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之CDR-H2

<400> 501

<210> 502

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之CDR-H3

<400> 502

<210> 503

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之VH

<400> 503

<210> 504

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之VL

<400> 504

<210> 505

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之VH-P

<400> 505

<210> 506

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之VL-P

<400> 506

<210> 507

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之VH-VL

<400> 507

<210> 508

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2C之VH-VL-P

<400> 508

<210> 509

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之CDR-H1

<400> 509

<210> 510

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之CDR-H2

<400> 510

<210> 511

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之CDR-H3

<400> 511

<210> 512

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之VH

<400> 512

<210> 513

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之VL

<400> 513

<210> 514

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之VH-P

<400> 514

<210> 515

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之VL-P

<400> 515

<210> 516

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之VH-VL

<400> 516

<210> 517

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1E之VH-VL-P

<400> 517

<210> 518

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之CDR-H1

<400> 518

<210> 519

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之CDR-H2

<400> 519

<210> 520

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之CDR-H3

<400> 520

<210> 521

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之VH

<400> 521

<210> 522

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之VL

<400> 522

<210> 523

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之VH-P

<400> 523

<210> 524

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4Hv之VL-P

<400> 524

<210> 525

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之VH-VL

<400> 525

<210> 526

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4H之VH-VL-P

<400> 526

<210> 527

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之CDR-H1

<400> 527

<210> 528

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之CDR-H2

<400> 528

<210> 529

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之CDR-H3

<400> 529

<210> 530

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之VH

<400> 530

<210> 531

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之VL

<400> 531

<210> 532

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之VH-P

<400> 532

<210> 533

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之VL-P

<400> 533

<210> 534

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之VH-VL

<400> 534

<210> 535

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A2J之VH-VL-P

<400> 535

<210> 536

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之CDR-H1

<400> 536

<210> 537

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之CDR-H2

<400> 537

<210> 538

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之CDR-H3

<400> 538

<210> 539

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之VH

<400> 539

<210> 540

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之VL

<400> 540

<210> 541

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之VH-P

<400> 541

<210> 542

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之VL-P

<400> 542

<210> 543

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之VH-VL

<400> 543

<210> 544

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E1L之VH-VL-P

<400> 544

<210> 545

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之CDR-L1

<400> 545

<210> 546

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之CDR-L2

<400> 546

<210> 547

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之CDR-L3

<400> 547

<210> 548

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之CDR-H1

<400> 548

<210> 549

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之CDR-H2

<400> 549

<210> 550

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之CDR-H3

<400> 550

<210> 551

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之VH

<400> 551

<210> 552

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之VL

<400> 552

<210> 553

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之VH-P

<400> 553

<210> 554

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之VL-P

<400> 554

<210> 555

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之VH-VL

<400> 555

<210> 556

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2M之VH-VL-P

<400> 556

<210> 557

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之CDR-H1

<400> 557

<210> 558

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之CDR-H2

<400> 558

<210> 559

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之CDR-H3

<400> 559

<210> 560

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之VH

<400> 560

<210> 561

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之VL

<400> 561

<210> 562

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之VH-P

<400> 562

<210> 563

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之VL-P

<400> 563

<210> 564

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之VH-VL

<400> 564

<210> 565

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F7O之VH-VL-P

<400> 565

<210> 566

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之CDR-L1

<400> 566

<210> 567

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之CDR-L2

<400> 567

<210> 568

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之CDR-L3

<400> 568

<210> 569

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之CDR-H1

<400> 569

<210> 570

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之CDR-H2

<400> 570

<210> 571

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之CDR-H3

<400> 571

<210> 572

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之VH

<400> 572

<210> 573

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之VL

<400> 573

<210> 574

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之VH-P

<400> 574

<210> 575

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之VL-P

<400> 575

<210> 576

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之VH-VL

<400> 576

<210> 577

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F12Q之VH-VL-P

<400> 577

<210> 578

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之CDR-H1

<400> 578

<210> 579

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之CDR-H2

<400> 579

<210> 580

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之CDR-H3

<400> 580

<210> 581

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之VH

<400> 581

<210> 582

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之VL

<400> 582

<210> 583

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之VH-P

<400> 583

<210> 584

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之VL-P

<400> 584

<210> 585

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之VH-VL

<400> 585

<210> 586

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I2C之VH-VL-P

<400> 586

Claims

一種抗體構築體，其按胺基至羧基順序包含：第一域，其結合至PSMA；第二域，其結合至人類及獼猴(Macaca )CD3ε鏈之細胞外抗原決定基；及第三域，其包含兩種Fc單體，各Fc單體包含鉸鏈、CH2域及CH3域，其中該等兩種Fc單體係經由肽連接子彼此融合，其中該第三域按胺基至羧基順序包含：鉸鏈-CH2-CH3-連接子-鉸鏈-CH2-CH3。
如請求項1之抗體構築體，其中該抗體構築體係單鏈抗體構築體。
如請求項1或2之抗體構築體，其中第三域之各該Fc單體包含選自由SED ID NO：17至24組成之群之胺基酸序列。
如請求項3之抗體構築體，其中第三域之各該Fc單體具有選自SED ID NO：17至24之胺基酸序列。
如請求項4之抗體構築體，其中第三域之各該Fc單體具有SED ID NO：17之胺基酸序列。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該CH2域包含域內半胱胺酸雙硫橋。
如請求項1或2之抗體構築體，其中(i)該第一域包含兩個抗體可變域，且該第二域包含兩個抗體可變域；(ii)該第一域包含一個抗體可變域，且該第二域包含兩個抗體可變域；(iii)該第一域包含兩個抗體可變域，且該第二域包含一個抗體可變域；或(iv)該第一域包含一個抗體可變域，且該第二域包含一個抗體可變域。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該第一域及該第二域係經由肽連接子融合至該第三域。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該抗體構築體按胺基至羧基順序包含：(a)該第一域；(b)肽連接子，其具有選自由SED ID NO：1至3組成之群之胺基酸序列；(c)該第二域；(d)肽連接子，其具有選自由SED ID NO：1、2、3、9、10、11及12組成之群之胺基酸序列；(e)該第三域之該第一Fc單體； (f)肽連接子，其具有選自由SED ID NO：5、6、7及8組成之群之胺基酸序列；及(g)該第三域之該第二Fc單體。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該抗體構築體之第一域包含VL區及VH區，VL區包括選自由以下組成之群之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，以及VH區包括選自由以下組成之群之CDR-H1、CDR-H2及CDR-3：(a)如SEQ ID NO：45中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：46中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：47中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：42中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：43中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：44中所述之CDR-H3；(b)如SEQ ID NO：63中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：64中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：65中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：60中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：61中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：62中所述之CDR-H3；(c)如SEQ ID NO：81中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：82中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：83中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：78中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：79中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：80中所述之CDR-H3；(d)如SEQ ID NO：99中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：100中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：101中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：96中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：97中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：98中所述之CDR-H3；(e)如SEQ ID NO：117中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：118中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：119中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：114中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：115中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：116中所述之CDR-H3；(f)如SEQ ID NO：135中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：136中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：137中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：132中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：133中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：134中所述之CDR-H3；(g)如SEQ ID NO：153中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：154中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：155中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：150中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：151中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：152中所述之CDR-H3；(h)如SEQ ID NO：171中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：172中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：173中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：168中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：169中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：170中所述之CDR-H3；(i)如SEQ ID NO：189中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：190中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：191中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：186中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：187中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：188中所述之CDR-H3；(j)如SEQ ID NO：207中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：208中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：209中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：204 中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：205中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：206中所述之CDR-H3；(k)如SEQ ID NO：225中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：226中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：227中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：222中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：223中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：224中所述之CDR-H3；(l)如SEQ ID NO：243中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：244中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：245中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：240中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：241中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：242中所述之CDR-H3；(m)如SEQ ID NO：261中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：262中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：263中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：258中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：259中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：260中所述之CDR-H3；(n)如SEQ ID NO：279中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：280中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：281中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：276中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：277中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：278中所述之CDR-H3；及(o)如SEQ ID NO：297中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：298中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：299中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：294中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：295中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：296中所述之CDR-H3；(p)如SEQ ID NO：315中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：316中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：317中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：312中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：313中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：314中所述之CDR-H3；(q)如SEQ ID NO：330中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：331中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：332中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：327中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：328中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：329中所述之CDR-H3；(r)如SEQ ID NO：345中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：346中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：347中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：342中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：343中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：344中所述之CDR-H3；(s)如SEQ ID NO：360中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：361中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：362中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：357中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：358中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：359中所述之CDR-H3；(t)如SEQ ID NO：375中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：376中所述之CDR-L2、如SEQ I D NO：377中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：372中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：373中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：374中所述之CDR-H3；(u)如SEQ ID NO：390中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：391中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：392中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：387中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：388中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：389中所述之CDR-H3； (v)如SEQ ID NO：405中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：406中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：407中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：402中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：403中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：404中所述之CDR-H3；(w)如SEQ ID NO：420中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：421中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：422中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：417中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：418中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：419中所述之CDR-H3；(x)如SEQ ID NO：435中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：436中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：437中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：432中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：433中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：434中所述之CDR-H3；(y)如SEQ ID NO：450中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：451中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：452中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：447中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：448中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：449中所述之CDR-H3；及(z)如SEQ ID NO：465中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：466中所述之CDR-L2、如SEQ ID NO：467中所述之CDR-L3、如SEQ ID NO：462中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：463中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：464中所述之CDR-H3。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該抗體構築體之第一域包含選自由以下組成之群之VH區及VL區： (a)如SEQ ID NO：48中所述之VH區，及如SEQ ID NO：49中所述之VL區；(b)如SEQ ID NO：66中所述之VH區，及如SEQ ID NO：67中所述之VL區；(c)如SEQ ID NO：72中所述之VH區，及如SEQ ID NO：73中所述之VL區；(d)如SEQ ID NO：84中所述之VH區，及如SEQ ID NO：85中所述之VL區；(e)如SEQ ID NO：90中所述之VH區，及如SEQ ID NO：91中所述之VL區；(f)如SEQ ID NO：102中所述之VH區，及如SEQ ID NO：103中所述之VL區；(g)如SEQ ID NO：108中所述之VH區，及如SEQ ID NO：109中所述之VL區；(h)如SEQ ID NO：120中所述之VH區，及如SEQ ID NO：121中所述之VL區；(i)如SEQ ID NO：126中所述之VH區，及如SEQ ID NO：127中所述之VL區；(j)如SEQ ID NO：138中所述之VH區，及如SEQ ID NO：139中所述之VL區；(k)如SEQ ID NO：144中所述之VH區，及如SEQ ID NO：145中所述之VL區；(l)如SEQ ID NO：156中所述之VH區，及如SEQ ID NO：157中所述之VL區；(m)如SEQ ID NO：162中所述之VH區，及如SEQ ID NO：163中所述之VL區；(h)如SEQ ID NO：180中所述之VH區，及如SEQ ID NO：181中所述之VL區；(n)如SEQ ID NO：192中所述之VH區，及如SEQ ID NO：193中所述之VL區；(o)如SEQ ID NO：198中所述之VH區，及如SEQ ID NO：199中所述之VL區；(p)如SEQ ID NO：210中所述之VH區，及如SEQ ID NO：211中所述之VL區；(q)如SEQ ID NO：216中所述之VH區，及如SEQ ID NO：217中所述之VL區；(r)如SEQ ID NO：228中所述之VH區，及如SEQ ID NO：229中所述之VL區；(s)如SEQ ID NO：234中所述之VH區，及如SEQ ID NO：235中所述之VL區；(t)如SEQ ID NO：246中所述之VH區，及如SEQ ID NO：247中所述之VL區；(u)如SEQ ID NO：252中所述之VH區，及如SEQ ID NO：253中所述之VL區；(v)如SEQ ID NO：264中所述之VH區及如SEQ ID NO：265中所述之VL區； (w)如SEQ ID NO：270中所述之VH區，及如SEQ ID NO：271中所述之VL區；(x)如SEQ ID NO：282中所述之VH區，及如SEQ ID NO：283中所述之VL區；(y)如SEQ ID NO：288中所述之VH區，及如SEQ ID NO：289中所述之VL區；(z)如SEQ ID NO：300中所述之VH區，及如SEQ ID NO：301中所述之VL區；(ab)如SEQ ID NO：306中所述之VH區，及如SEQ ID NO：307中所述之VL區；(ac)如SEQ ID NO：54中所述之VH區，及如SEQ ID NO：55中所述之VL區；(ad)如SEQ ID NO：174中所述之VH區，及如SEQ ID NO：175中所述之VL區；(ae)如SEQ ID NO：318中所述之VH區，及如SEQ ID NO：319中所述之VL區；(af)如SEQ ID NO：333中所述之VH區，及如SEQ ID NO：334中所述之VL區；(ag)如SEQ ID NO：348中所述之VH區，及如SEQ ID NO：349中所述之VL區；(ah)如SEQ ID NO：363中所述之VH區，及如SEQ ID NO：364中所述之VL區；(ai)如SEQ ID NO：378中所述之VH區，及如SEQ ID NO：379中所述之VL區；(aj)如SEQ ID NO：393中所述之VH區，及如SEQ ID NO：394中所述之VL區；(ak)如SEQ ID NO：408中所述之VH區，及如SEQ ID NO：409中所述之VL區；(al)如SEQ ID NO：423中所述之VH區，及如SEQ ID NO：424中所述之VL區；(am)如SEQ ID NO：438中所述之VH區，及如SEQ ID NO：439中所述之VL區；(an)如SEQ ID NO：453中所述之VH區，及如SEQ ID NO：454中所述之VL區；及(ao)如SEQ ID NO：468中所述之VH區，及如SEQ ID NO：469中所述之VL區。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該第二域包含包括選自以下之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區：(a)如SEQ ID NO：497中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：498中所述之CDR-L2及如SEQ ID NO：499中所述之CDR-L3；(b)如SEQ ID NO：545中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：546中所述之CDR-L2及如SEQ ID NO：547中所述之CDR-L3；及(c)如SEQ ID NO：566中所述之CDR-L1、如SEQ ID NO：567中所述之CDR-L2及如SEQ ID NO：568中所述之CDR-L3；以及包含包括選自以下之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區： (a)如SEQ ID NO：488中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：489中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：490中所述之CDR-H3；(b)如SEQ ID NO：500中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：501中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：502中所述之CDR-H3；(c)如SEQ ID NO：509中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：510中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：511中所述之CDR-H3；(d)如SEQ ID NO：518中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：519中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：520中所述之CDR-H3；(e)如SEQ ID NO：527中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：528中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：529中所述之CDR-H3；(f)如SEQ ID NO：536中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：537中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：538中所述之CDR-H3；(g)如SEQ ID NO：548中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：549中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：550中所述之CDR-H3；(h)如SEQ ID NO：557中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：558中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：559中所述之CDR-H3；(i)如SEQ ID NO：569中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：570中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：571中所述之CDR-H3；及(j)如SEQ ID NO：578中所述之CDR-H1、如SEQ ID NO：579中所述之CDR-H2及如SEQ ID NO：580中所述之CDR-H3。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該第二域包含選自由以下組成之群之VL區及VH區： (a)如SEQ ID NO：492或494中所述之VL區，及如SEQ ID NO：491或493中所述之VH區；(b)如SEQ ID NO：504或506中所述之VL區，及如SEQ ID NO：503或505中所述之VH區；(c)如SEQ ID NO：513或515中所述之VL區，及如SEQ ID NO：512或514中所述之VH區；(d)如SEQ ID NO：522或524中所述之VL區，及如SEQ ID NO：521或523中所述之VH區；(e)如SEQ ID NO：531或533中所述之VL區，及如SEQ ID NO：530或532中所述之VH區；(f)如SEQ ID NO：540或542中所述之VL區，及如SEQ ID NO：539或541中所述之VH區；(g)如SEQ ID NO：552或554中所述之VL區，及如SEQ ID NO：551或553中所述之VH區；(h)如SEQ ID NO：561或563中所述之VL區，及如SEQ ID NO：560或562中所述之VH區；(i)如SEQ ID NO：573或575中所述之VL區，及如SEQ ID NO：572或574中所述之VH區；及(j)如SEQ ID NO：582或584中所述之VL區，及如SEQ ID NO：581或583中所述之VH區。
如請求項1或2之抗體構築體，其中該抗體構築體按胺基至羧基順序包含： (a)該第一域，其具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：50、56、68、74、86、92、104、110、122、128、140、146、158、164、176、182、194、200、212、218、230、236、248、254、266、272、284、290、302、308、320、335、350、365、380、395、410、425、440、455及470；(b)肽連接子，其具有選自由SED ID NO：1至3組成之群之胺基酸序列；(c)該第二域，其具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：585、495、496、507、508、516、517、525、526、534、535、543、544、555、556、564、565、576、577及586或如SEQ ID NO：15中所述之胺基酸序列；(d)肽連接子，其具有選自由SED ID NO：1、2、3、9、10、11及12組成之群之胺基酸序列；(e)該第三域之該第一Fc單體，其具有選自由SED ID NO：17至24組成之群之胺基酸序列；(f)肽連接子，其具有選自由SED ID NO：5、6、7及8組成之群之胺基酸序列；及(g)該第三域之該第二Fc單體，其具有選自由SED ID NO：17至24組成之群之胺基酸序列。
如請求項14之抗體構築體，其具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：52、53、58、59、70、71、76、77、88、89、94、95、106、107、112、113、124、125、130、131、142、143、148、 149、160、161、166、167、178、179、184、185、196、197、202、203、214、215、220、221、232、233、238、239、250、251、256、257、268、269、274、275、286、287、292、293、304、305、310、311、322、323、325、326、337、338、340、341、352、353、355、356、367、368、370、371、382、383、385、386、397、398、400、401、412、413、415、416、427、428、430、431、442、443、445、446、457、458、460、461、472、473、475及476。
如請求項15之抗體構築體，其包含SED ID NO：220之胺基酸序列。
如請求項15之抗體構築體，其包含SED ID NO：304之胺基酸序列。
如請求項15之抗體構築體，其包含SED ID NO：382之胺基酸序列。
一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至18中任一項中所定義之抗體構築體。
一種載體，其包含如請求項19中所定義之聚核苷酸。
一種宿主細胞，其經如請求項19中所定義之聚核苷酸或經如請求項20中所定義之載體轉形或轉染。
一種用於製造如請求項1至18中任一項之抗體構築體之方法，該方法包括在容許表現如請求項1至18中任一項中所定義之抗體構築體之條件下培養如請求項21中所定義之宿主細胞並自該培養物中回收所製造之抗體構築體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之抗體構築體或根據請求項22之方法製造之抗體構築體。
如請求項23之醫藥組合物，其係在約-20℃下穩定至少四週。
如請求項1或2之抗體構築體或根據請求項22之方法製造之抗體構築體，其用於預防、治療或改善選自增生性疾病、腫瘤性疾病、癌症或免疫病症之疾病。
如請求項25之抗體構築體，其中該癌症係前列腺癌。
一種如請求項1至18中任一項之抗體構築體或根據請求項22之方法製造之抗體構築體之用途，其係用於製備治療或改善增生性疾病、腫瘤性疾病、癌症或免疫病症之藥劑。
如請求項27之用途，其中該癌症係前列腺癌。