ES2322791T3 - Proteinas receptoras de mamiferos; reactivos y metodos relacionados. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado que comprende una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% a la secuencia de aminoácidos madura (residuos 1-361) de SEC ID Nº:
Description
Proteínas receptoras de mamíferos; reactivos y
métodos relacionados.
La presente invención se refiere a composiciones
y métodos para influir en la fisiología de mamíferos, que incluyen
la función del sistema inmune. En particular, proporciona métodos
para regular el desarrollo y/o el sistema inmune. También se
describen usos de diagnóstico y terapéuticos de estos
materiales.
La tecnología de ADN recombinante se refiere en
general a técnicas para integrar información genética de una fuente
donadora en vectores para procesamiento posterior, tal como mediante
la introducción en un hospedador, por lo que la información
genética transferida se copia y/o expresa en el ambiente nuevo.
Comúnmente, la información genética existe en forma de ADN
complementario (ADNc) obtenido a partir de ARN mensajero (ARNm) que
codifica un producto de proteína deseado. El vehículo
frecuentemente es un plásmido que tiene la capacidad de incorporar
ADNc para replicación posterior en un hospedador y, en algunos
casos, para controlar realmente la expresión del ADNc y dirigir de
ese modo la síntesis directa del producto codificado en el
hospedador. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª ed.) vols.
1-3, CSH Press, NY.
Durante algún tiempo, se ha sabido que la
respuesta inmune de mamíferos se basa en una serie de interacciones
celulares complejas, denominadas la "red inmune".
Investigaciones recientes han proporcionado nuevas perspectivas en
el funcionamiento interno de esta red. Aunque sigue siendo claro que
gran parte de la respuesta inmune, de hecho, tiene que ver con las
interacciones en forma de red de los linfocitos, macrófagos,
granulocitos y otras células, ahora los inmunólogos generalmente
sostienen la opinión de que las proteínas solubles, conocidas como
linfoquinas, citoquinas o monoquinas, juegan papeles críticos en el
control de estas interacciones celulares. Por tanto, hay un interés
considerable en el aislamiento, caracterización y mecanismos de
acción de factores moduladores de células, cuya comprensión
conducirá a avances importantes en el diagnóstico y terapia de
muchas anormalidades médicas, por ejemplo, trastornos del sistema
inmune.
Las linfoquinas al parecer son mediadoras de
actividades celulares en una diversidad de formas. Véase, por
ejemplo, Paul (ed. 1996) Fundamental Inmunology 3ª ed., Raven Press,
Nueva York y Thomson (ed. 1994) The Cytokine Handbook 2ª ed.,
Academic Press, San Diego. Se ha demostrado que apoyan la
proliferación, crecimiento y/o diferenciación de células madre
hematopoyéticas pluripotenciales en un gran número de progenitores
que comprenden linajes celulares diversos que constituyen un
sistema inmune complejo. Las interacciones apropiadas y equilibradas
entre los componentes celulares son necesarias para una respuesta
inmune sana. Los linajes celulares diferentes con frecuencia
responden de una manera diferente cuando se administran linfoquinas
junto con otros agentes.
Linajes celulares especialmente importantes para
la respuesta inmune incluyen dos clases de linfocitos: células B,
que pueden producir y secretar inmunoglobulinas (proteínas con la
capacidad de reconocer y unirse a material extraño para lograr su
remoción) y células T de diversos subconjuntos que secretan
linfoquinas e inducen o suprimen a las células B y diversas células
diferentes (incluyendo otras células T) constituyendo la red inmune.
Estos linfocitos interaccionan con muchos otros tipos de
células.
La incapacidad general para mantener células del
sistema inmune in vitro ha obstaculizado la investigación
para entender mejor y tratar diversos trastornos inmunes. Los
inmunólogos han observado que el cultivo de muchas de estas células
se puede conseguir mediante el uso de sobrenadantes de células T y
otras células; que contienen diversos factores de crecimiento, que
incluyen muchas de las linfoquinas.
Existen diversos factores de crecimiento y
reguladores que modulan el desarrollo morfogenético. Estos incluyen,
por ejemplo, los ligandos de Toll, que dan señales uniéndose a
receptores que comparten elementos estructurales y mecanísticos
característicos de los receptores IL-1. Véase, por
ejemplo, Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:
973-983 y Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell
& Devel. Biol. 12: 393-416. También se conocen
otros receptores para citoquinas. Con frecuencia, existen al menos
dos subunidades críticas en el receptor funcional. Véase, por
ejemplo, Gonda y D'Andrea (1997) Blood 89: 355-369;
Presky, et al. (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 93:
14002-14007; Drachman y Kaushansky (1995) Curr,
Opin. Hematol. 2: 22-28; Theze (1994) Eur. Cytokine
Netw. 5: 353-368 y Lemmon y Schlessinger (1994)
Trends Biochem. Sci. 19: 459-463. El documento WO
99/20755 describe una secuencia GP130 murina (mGP130).
A partir de lo anterior, es evidente que el
descubrimiento y desarrollo de nuevas proteínas solubles y sus
receptores, incluyendo aquellas que son similares a linfoquinas,
deben contribuir a nuevas terapias para una amplia gama de
afecciones degenerativas o anormales que implican directa o
indirectamente el desarrollo, diferenciación o función, por
ejemplo, del sistema inmune y/o células hematopoyéticas. En
particular, el descubrimiento y entendimiento de receptores nuevos
de moléculas similares a linfoquina que mejoran o potencian las
actividades beneficiosas de otras linfoquinas serán altamente
provechosos. La presente invención proporciona receptores nuevos
para ligandos que muestran similitud a composiciones similares a
citoquina y compuestos relacionados y métodos para su uso.
La presente invención se dirige a receptores
nuevos relacionados con receptores de citoquina, por ejemplo,
estructuras moleculares similares a receptor de citoquina de
primates, denominadas Subunidades de Receptor de Citoquina ADNX
(DCRS) y sus actividades biológicas. En particular, proporciona
descripción de una subunidad, denominada DCRS2. Incluye ácidos
nucleicos que codifican los polipéptidos y métodos para su
producción y uso. Los ácidos nucleicos de la invención se
caracterizan, en parte, por su homología a secuencias de ADN
complementario (ADNc) clonadas descritas en este documento.
La presente invención proporciona un polipéptido
aislado que comprende una homología de secuencia de aminoácidos de
al menos el 70% a la secuencia de aminoácidos madura (residuos
1-361) de la SEC ID Nº: 2. En la medida en que las
mismas estén abarcadas por las reivindicaciones adjuntas, se
proporcionan las siguientes realizaciones, concretamente una
composición de material seleccionado entre: un polipéptido DCRS2
sustancialmente puro o recombinante que comprende al menos tres
segmentos no solapados distintos de al menos cuatro aminoácidos
idénticos a segmentos de SEC ID Nº: 2; un polipéptido DCRS2
sustancialmente puro o recombinante que comprende al menos dos
segmentos no solapados distintos de al menos cinco aminoácidos
idénticos a segmentos de SEC ID Nº: 2; una secuencia natural DCRS2
que comprende SEC ID Nº: 2 madura o un polipéptido de fusión que
comprende secuencia DCRS2. En determinada realización, la invención
comprende dicho polipéptido DCRS2 antigénico sustancialmente puro o
aislado, donde los segmentos no solapados distintos de identidad:
incluyen uno de al menos ocho aminoácidos; incluyen uno de al menos
cuatro aminoácidos y un segundo de al menos cinco aminoácidos;
incluyen al menos tres segmentos de al menos cuatro, cinco y seis
aminoácidos o incluyen uno de al menos doce aminoácidos. Otras
realizaciones incluyen aquellas donde: el polipéptido DCRS2:
comprende una secuencia madura de la Tabla 1; es una forma no
glicosilada de DCRS2; es de un primate, tal como un ser humano;
comprende al menos 17 aminoácidos de SEC ID Nº: 2; presenta al
menos cuatro segmentos no solapados de al menos siete aminoácidos de
SEC ID Nº: 2; es una variante alélica natural de DCRS2; tiene una
longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; presenta al
menos dos epítopos no solapados que son específicos para un DCRS2 de
primate; es glicosilado; tiene un peso molecular de al menos 30 kD
con glicosilación natural; es un polipéptido sintético; está unido
a un sustrato sólido; está conjugado a otra resto químico; es una
sustitución cinco veces o menos de la secuencia natural o es una
variante de deleción o inserción de una secuencia natural. Otras
realizaciones incluyen una composición que comprende: un DCRS2
sustancialmente puro y otro miembro de la familia de Receptor de
Interferón; un polipéptido DCRS2 estéril; el polipéptido DCRS2 y un
vehículo, donde el vehículo es: un compuesto acuoso, que incluye
agua, solución salina y/o tampón y/o formulado para administración
oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. Las realizaciones de
polipéptidos de fusión incluyen las que comprenden: una secuencia de
proteína madura de la Tabla 1; una etiqueta de detección o
purificación, que incluye una secuencia de FLAG, His6 o Ig o
secuencia de otra proteína receptora de interferón. Las
realizaciones de equipo incluyen las que comprenden un polipéptido
de este tipo y: un compartimiento que comprende la proteína o
polipéptido o instrucciones para uso o desecho de reactivos en el
equipo.
Las realizaciones de compuesto de unión
incluyen, por ejemplo, un compuesto de unión que comprende un sitio
de unión de antígeno de un anticuerpo, que se une específicamente a
un polipéptido DCRS2 natural, donde: el compuesto de unión está en
un recipiente; el polipéptido DCRS2 es de un ser humano; el
compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab o Fab2; el compuesto de
unión se conjuga a otro resto químico o el anticuerpo: se crea
contra una secuencia de péptidos de un polipéptido maduro de la
Tabla 1; se crea contra un DCRS2 maduro; se crea para un DCRS2
humano purificado; es inmunoseleccionado; es un anticuerpo
policlonal; se une a un DCRS2 desnaturalizado; presenta un Kd para
antígeno de al menos 30 \muM; está unido a un sustrato sólido, que
incluye una perla o una membrana de plástico; está en una
composición estéril o está detectablemente marcado, incluyendo un
marcador radiactivo o fluorescente. Los equipos incluyen los que
comprenden el compuesto de unión y: un compartimiento que comprende
el compuesto de unión o instrucciones para uso o desecho de los
reactivos en el equipo.
Se proporcionan métodos, por ejemplo, para
producir un complejo antígeno: anticuerpo, que comprende poner en
contacto en condiciones apropiadas un polipéptido DCRS2 de primate
de la invención con un anticuerpo descrito, permitiendo de ese modo
que se forme el complejo. Este incluye donde: el complejo se
purifica a partir de otros receptores de interferón; el complejo se
purifica a partir de otro anticuerpo; el contacto es con una
muestra que comprende un interferón; el contacto permite la
detección cuantitativa del antígeno; el contacto es con una muestra
que comprende el antígeno o el contacto permite la detección
cuantitativa del anticuerpo.
Se proporcionan diversas composiciones
relacionadas, por ejemplo, una composición que comprende: un
compuesto de unión estéril, como se ha descrito o el compuesto de
unión descrito y un vehículo, donde el vehículo es: un compuesto
acuoso, que incluye agua, solución salina y/o tampón y/o formulado
para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.
Las realizaciones de ácidos nucleicos incluyen,
por ejemplo, un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica
el polipéptido DCRS2, donde dicho polipéptido DCRS2 comprende una
homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% a la
secuencia de aminoácidos madura (residuos 1-361) de
la SEC ID Nº: 2. En la medida en que las mismas estén abarcadas por
las reivindicaciones adjuntas, también se proporcionan las
siguientes realizaciones, concretamente donde el: DCRS2 es de un
ser humano o el ácido nucleico: codifica una secuencia de péptido
antigénico de la Tabla 1; codifica una pluralidad de secuencias de
péptido antigénico de la Tabla 1; muestra identidad sobre al menos
trece nucleótidos a un ADNc natural que codifica el segmento; es un
vector de expresión; comprende además un origen de replicación; es
de una fuente natural; comprende un marcador detectable; comprende
secuencia de nucleótidos sintética; es menor que 6 kb,
preferiblemente menor que 3 kb; es de un primate; comprende una
secuencia codificante de longitud completa natural; es una sonda de
hibridación para un gen que codifica el DCRS2 o es un cebador de
PCR, producto de PCR o cebador de mutagénesis. Otras realizaciones
de la invención incluyen una célula o tejido que comprende el ácido
nucleico recombinante descrito. Preferiblemente, la célula es: una
célula procariota; una célula eucariota; una célula bacteriana; una
célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero;
una célula de ratón; una célula de primate o una célula humana.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las realizaciones de equipo incluyen las que
comprenden un ácido nucleico descrito y: un compartimiento que
comprende el ácido nucleico; un compartimiento que comprende además
un polipéptido DCRS2 de primate o instrucciones para uso o desecho
de los reactivos en el equipo.
Realizaciones de ácidos nucleicos alternativas
incluyen un ácido nucleico que: hibrida en condiciones de lavado de
30 minutos a 30ºC y sal menos de 2 M a la parte codificante de SEC
ID Nº: 1 o muestra identidad sobre un tramo de al menos
aproximadamente 30 nucleótidos a un DCRS2 de primate. Determinadas
realizaciones incluyen aquellas donde el ácido nucleico hibrida a
la parte codificante de SEC ID Nº: 1 y las condiciones de lavado
son a 45ºC y/o sal 500 mM o las condiciones de lavado son a 55ºC y/o
sal 150 mM. También descrito en este documento, el tramo es de al
menos 55 nucleótidos o el tramo es de al menos 75 nucleótidos.
Otros usos incluyen el de modular la fisiología
o desarrollo de una célula o células de cultivo de tejido que
comprende poner en contacto la célula con un agonista o antagonista
de un DCRS2 de mamífero. Preferiblemente, la célula se transforma
con un ácido nucleico que codifica un DCRS2 y otra subunidad de
receptor de citoquina.
- I.
- General
- II.
- Actividades
- III.
- Ácidos nucleicos
- A.
- fragmentos, secuencia, sondas codificantes
- B.
- mutaciones, quimeras, fusiones
- C.
- preparación de ácidos nucleicos
- D.
- vectores, células que comprenden
\vskip1.000000\baselineskip
- IV.
- Proteínas, Péptidos
- A.
- fragmentos, secuencia, inmunógenos, antígenos
- B.
- muteínas
- C.
- agonistas/antagonistas, equivalentes funcionales
- D.
- preparación de proteínas
\vskip1.000000\baselineskip
- V.
- Preparación de ácidos nucleicos, proteínas
- A.
- sintéticos
- B.
- recombinantes
- C.
- fuentes naturales
\vskip1.000000\baselineskip
- VI.
- Anticuerpos
- A.
- policlonales
- B.
- monoclonales
- C.
- fragmentos; Kd
- D.
- anticuerpos anti-idiotípicos
- E.
- líneas celulares de hibridoma
\global\parskip1.000000\baselineskip
- VII.
- Equipos y Métodos para cuantificar DCRS2
- A.
- ELISA
- B.
- ensayo codificante de ARNm
- C.
- cualitativo/cuantitativo
- D.
- equipos
\vskip1.000000\baselineskip
- VIII.
- Composiciones terapéuticas, métodos
- A.
- composiciones de combinación
- B.
- dosis unitaria
- C.
- administración
\vskip1.000000\baselineskip
- IX.
- Selección
- X.
- Ligandos
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona la secuencia
de aminoácidos y secuencia de ADN de moléculas de subunidad
similares a receptores de citoquina de mamífero, en este documento
de primate, a las cuales se denomina Subunidad 2 de Receptor de
Citoquina DNAX (DCRS2) que tienen propiedades definidas
particulares, tanto estructurales como biológicas. Diversos ADNc
que codifican estas moléculas se obtuvieron a partir de genotecas de
secuencias de ADNc de primate, por ejemplo, de ser humano. Otros
homólogos de primates u otros mamíferos también serían
deseados.
deseados.
Algunos de los métodos convencionales aplicables
se describen o se hace referencia a los mismos, por ejemplo, en
Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press;
Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, (2ª ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY;
Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates,
Brooklyn, NY o Ausubel, et al. (1987 y suplementos
periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley,
Nueva York.
La secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 1) y de
aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 2) de un segmento
codificante DCRS2 humano se muestra en la Tabla 1. Es probable que
exista al menos una variante de empalme con un dominio intracelular
más largo y probablemente mostrará motivos de señalización
característicos. La secuencia de señal pronosticada se indica, pero
puede depender del tipo de célula o puede ser unos cuantos residuos
en cualquier dirección. Los sitios de glicosilación N potenciales
están en los residuos de Asparagina 6, 24, 58, 118, 157, 209 y 250.
Los enlaces de disulfuro probablemente se encuentran entre residuos
de cisteína en las posiciones 29 y 78 y un motivo C__CXW conservado
se encuentra en las posiciones 110/121/123. Se distinguen el
triptofano en 219 y el motivo WxxWS de 281-285. El
segmento desde aproximadamente 1-101 es un dominio
Ig; desde aproximadamente 102-195 es un dominio de
unión a citoquina 1; desde aproximadamente 196-297
es un dominio de unión a citoquina 2; desde aproximadamente
298-330 es un enlazador; desde aproximadamente
331-353 es un segmento de transmembrana y desde
aproximadamente 354-361 es un dominio intracelular.
Estos sitios y límites son notables.
En la Tabla 2 se proporciona la secuencia de
ácidos nucleicos de traducción inversa.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
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\newpage
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La Tabla 3 muestra la comparación de las
secuencias disponibles de receptores de primates y roedores con el
DCRS2 (AS11) de primates, por ejemplo, humanos. El DCRS2 muestra
similitud particular a la subunidad alfa del receptor
IL-11, aunque se puede alinear con las subunidades
alfa del receptor p40 e IL-6. Es probablemente una
subunidad alfa y por tanto se debe unir a ligando sin la necesidad
de una subunidad beta. Es probable que la biología sea similar a la
subunidad de receptor IL-6.
Como se usa en este documento, el término DCRS2
se usará para describir una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Tabla 1. En muchos casos, un fragmento
sustancial de la misma será equivalente funcionalmente o
estructuralmente, incluyendo, por ejemplo, un dominio extracelular o
intracelular. La invención también incluye una variación de
proteína del alelo de DCRS2 respectivo cuya secuencia se
proporciona, por ejemplo, una muteína o construcción extracelular
soluble. Típicamente, tales agonistas o antagonistas mostrarán
diferencias de secuencia menores de aproximadamente el 10% y, por
tanto, con frecuencia tendrán sustituciones de entre 1 y 11 veces,
por ejemplo, 2, 3, 5, 7 veces y otras. También abarca variantes
alélicas y otras variantes, por ejemplo, polimórfica natural, de la
proteína descrita. Típicamente, se unirá a su ligando biológico
correspondiente, quizás en un estado dimerizado con una subunidad
de receptor alfa, con alta afinidad, por ejemplo, al menos
aproximadamente 100 nM, habitualmente mejor que aproximadamente 30
nM, preferiblemente mejor que 10 nM y más preferiblemente mejor que
aproximadamente 3 nM. El término también se usará en este documento
para referirse a formas de origen natural relacionadas, por
ejemplo, alelos, variantes polimórficas y variantes metabólicas de
la proteína de mamífero. Formas preferidas de los complejos
receptores se unirán al ligando apropiado con una afinidad y
selectividad apropiadas para una interacción
ligando-receptor.
Esta invención también abarca combinaciones de
proteínas o péptidos que tienen identidad de secuencia de
aminoácidos sustancial con la secuencia de aminoácidos de la Tabla
1. Incluirán variantes de secuencia con relativamente pocas
sustituciones, por ejemplo, preferiblemente menos de aproximadamente
3-5.
Un "fragmento" o "segmento" de
polipéptido sustancial es un tramo de residuos de aminoácidos de al
menos aproximadamente 8 aminoácidos, aminoácidos, con frecuencia al
menos 14 aminoácidos, más frecuentemente al menos 16 aminoácidos,
típicamente al menos 18 aminoácidos, más típicamente al menos 20
aminoácidos, habitualmente al menos 22 aminoácidos, más
habitualmente al menos 24 aminoácidos, preferiblemente al menos 26
aminoácidos, más preferiblemente al menos 28 aminoácidos y al menos
aproximadamente 30 y, en realizaciones particularmente preferidas,
al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos. Las secuencias de
segmentos de proteínas diferentes se pueden comparar unas con otras
sobre tramos de longitud apropiada. En muchas situaciones, los
fragmentos pueden mostrar propiedades funcionales de las
subunidades intactas, por ejemplo, el dominio extracelular del
receptor de transmembrana puede retener las características de
unión de ligando y se puede usar para preparar un complejo similar
al receptor soluble.
La homología de secuencia de aminoácidos o
identidad de secuencia, se determina optimizando coincidencias de
residuos. En algunas comparaciones, se pueden introducir huecos,
según se requiera. Véase, por ejemplo, Needleham, et al.,
(1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankiff, et
al., (1983) capítulo uno en Time Warps, String Edits and
Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison,
Addison-Wesley, Reading, MA y paquetes de software
de IntelliGenetics, Mountain View, CA y the University of Wisconsin
Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Esto cambia cuando se
consideran sustituciones conservativas como coincidencias. Las
sustituciones conservativas típicamente incluyen sustituciones
dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina,
isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina,
glutamina; serina, treonina; lisina, arginina y fenilalanina,
tirosina. Las secuencias de aminoácidos homólogas tienen por objeto
incluir variaciones alélicas naturales y entre especies en la
secuencia de citoquina. Las proteínas o péptidos homólogos típicos
tendrán una homología del 50 al 100% (si se pueden introducir
huecos), a una homología del 60 al 100% (si se incluyen
sustituciones conservativas) con un segmento de secuencia de
aminoácidos de la Tabla 1. Para los polipéptidos de la invención,
las mediciones de homología serán al menos de aproximadamente el
70%, generalmente al menos el 36%, más generalmente al menos el
81%, con frecuencia al menos el 85%, más frecuentemente al menos el
88%, típicamente al menos el 90%, más típicamente al menos el 92%,
habitualmente al menos el 94%, más habitualmente al menos el 95%,
preferiblemente al menos el 96% y más preferiblemente al menos el
97% y en realizaciones particularmente preferidas, al menos el 98%
o más. El grado de homología variará con la longitud de los
segmentos comparados. Las proteínas o péptidos homólogos, tales
como las variantes alélicas, compartirán la mayoría de las
actividades biológicas con las realizaciones descritas en la Tabla
1.
Como se usa en este documento, la expresión
"actividad biológica" se usa para describir, sin limitación,
efectos sobre respuestas inflamatorias, inmunidad innata y/o
desarrollo morfogénico por ligandos similares a citoquina. Por
ejemplo, esos receptores mediarían las actividades de la fosfatasa o
fosforilasa, actividades que se miden fácilmente mediante
procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Hardie, et
al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I y II,
Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth.
Enzymol. 200: 38-62; Hunter, et al. (1992)
Cell 70: 375-388; Lewin (1990) Cell 61:
743-752; Pines, et al. (1991) Coll Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 56: 449-463 y Parker,
et al. (1993) Nature 363: 736-738. Los
receptores o partes de los mismos, pueden ser útiles como enzimas
marcadoras de fosfato para marcar sustratos generales o específicos.
Las subunidades también pueden ser inmunógenos funcionales para
inducir anticuerpos de reconocimiento o antígenos capaces de unir
anticuerpos.
Las expresiones ligando, agonista, antagonista y
análogo de, por ejemplo, un DCRS2, incluyen moléculas que modulan
las respuestas celulares características a proteínas de ligando de
citoquina, así como moléculas que poseen las características de
competencia de unión estructural más convencionales de interacciones
ligando-receptor, por ejemplo, donde el receptor es
un receptor natural o un anticuerpo. Las respuestas celulares
probablemente están típicamente mediadas a través de las rutas del
receptor tirosina quinasa.
También, un ligando es una molécula que sirve
como un ligando natural al cual se une dicho receptor o un análogo
del mismo o una molécula que es un análogo funcional del ligando
natural. El análogo funcional puede ser un ligando con
modificaciones estructurales o puede ser una molécula completamente
no relacionada que tenga una forma molecular que interaccione con
los determinantes de unión de ligando apropiados. Los ligandos
pueden servir como agonistas o antagonistas, véase, por ejemplo,
Goodman, et al. (eds. 1990) Goodman & Gilman's: The
Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press. Nueva
York.
El diseño racional de fármacos se puede basar
también en estudios estructurales de las formas moleculares de un
receptor o anticuerpo y otros efectores o ligandos. Véase, por
ejemplo, Herz, et al. (1997) J. Recept. Signal Transduct.
Res. 17: 671-776 y Chaiken, et al. (1996)
Trends Biotechnol. 14: 369-375. Los efectores
pueden ser otras proteínas que son mediadoras de otras funciones en
respuesta a unión de ligando u otras proteínas que normalmente
interaccionan con el receptor. Un medio para determinar qué sitios
interaccionan con otras proteínas específicas es una determinación
de estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos x o
técnicas de RMN bidimensionales. Estas proporcionarán una guía
acerca de cuáles residuos de aminoácidos forman regiones de
contacto molecular. Para una descripción detallada de la
determinación estructural de proteína, véase, por ejemplo, Blundell
y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, Nueva
York.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas similares a receptor de citoquina
tendrán varias actividades biológicas diferentes, por ejemplo,
modular la proliferación celular o el metabolismo de fosfato,
añadiéndose o retirándose de sustratos específicos, típicamente
proteínas. Esto dará como resultado la modulación de una función
inflamatoria, otra respuesta inmune innata o un efecto morfológico.
La subunidad probablemente tendrá una unión de baja afinidad
específica al ligando.
El DCRS2 tiene los motivos característicos de un
receptor de señalización a través de la ruta JAK. Véase, por
ejemplo, Ihle, et al. (1997) Stem Cells 15 (supl. 1):
105-111; Silvennoinen, et al. (1997) APMIS
105: 497-509; Levy (1997) Cytokine Growth Factor
Review 8: 81-90; Winston y Hunter (1996) Current
Biol. 6: 668-671; Barrett (1996) Baillieres Clin.
Gastroenterol. 10: 1-15 y Briscoe, et al.
(1996) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351:
167-171.
Las actividades biológicas de las subunidades de
receptor de citoquina estarán relacionadas con la adición o
remoción de restos de fosfato a los sustratos, típicamente de una
manera específica, pero ocasionalmente de una manera no específica.
Los sustratos se pueden identificar o las condiciones para actividad
enzimática se pueden ensayar mediante métodos convencionales, por
ejemplo, como se ha descrito en Hardie, et al. (eds. 1995)
The Protein Kinase FactBook vols. I y II, Academic Press, San Diego,
CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:
38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:
375-388; Lewin (1950) Cell 61:
743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 56: 449-463 y Parker,
et al. (1993) Nature 363: 736-738.
Las subunidades de receptor se pueden combinar
para formar complejos funcionales, por ejemplo, que pueden ser
útiles para unir ligando o preparar anticuerpos. Estas tendrán usos
de diagnóstico substanciales, que incluyen detección o
cuantificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención contempla el uso de ácidos
nucleicos o fragmentos aislados, por ejemplo, que codifiquen estas
proteínas o proteínas estrechamente relacionadas o fragmentos de las
mismas, por ejemplo, para codificar un polipéptido correspondiente,
preferiblemente uno que sea biológicamente activo. Además, esta
invención abarca ADN aislados o recombinantes que codifican
combinaciones de tales proteínas o polipéptidos que tienen
secuencias características, por ejemplo, de los DCRS2, en la medida
en que estén abarcados por las reivindicaciones adjuntas.
Típicamente, el ácido nucleico es capaz de hibridación, en
condiciones apropiadas, con un segmento de secuencia de ácidos
nucleicos mostrado en la Tabla 1, pero preferiblemente no con un
segmento correspondiente de otros receptores descritos en la Tabla
3. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser una
proteína de longitud completa o fragmento y típicamente tendrá un
segmento de secuencia de aminoácidos altamente homólogo, por
ejemplo, que muestra tramos significativos de identidad, a uno
mostrado en la Tabla 1. Adicionalmente, esta invención abarca el
uso de ácido nucleico aislado o recombinante o fragmentos del mismo,
que codifica proteínas que tienen fragmentos que son equivalentes a
las proteínas DCRS2, en la medida en que estén abarcados por las
reivindicaciones adjuntas. Los ácidos nucleicos aislados pueden
tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y
3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición
poly-A y otros del gen natural. También se
proporcionan combinaciones, como se ha descrito.
Un ácido nucleico "aislado" es un ácido
nucleico, por ejemplo, un ARN, un ADN o un polímero mixto, que es
sustancialmente puro, por ejemplo, separado de otros componentes que
acompañan naturalmente a una secuencia nativa, tales como
ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas flanqueantes de las
especies que lo originan. El término abarca una secuencia de ácidos
nucleicos que se ha retirado de su ambiente de origen natural e
incluye aislados de ADN recombinante o clonado, que de ese modo se
pueden distinguir de las composiciones de origen natural y análogos
químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados por
sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye
formas aisladas de la molécula completamente o sustancialmente
pura.
Un ácido nucleico aislado generalmente será una
composición homogénea de moléculas pero, en algunas realizaciones,
contendrá heterogeneidad, preferiblemente menor. Esta heterogeneidad
se observa típicamente en los extremos del polímero o partes no
críticas para una función o actividad biológica deseada.
Un ácido nucleico "recombinante" se define
típicamente por su método de producción o su estructura. En
referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto
hecho por un procedimiento, siendo este procedimiento uso de
técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, que implica la
intervención humana en la secuencia de nucleótidos. Típicamente
esta intervención implica manipulación in vitro, aunque en
determinadas circunstancias puede implicar técnicas de reproducción
animal más clásicas. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico
preparado mediante generación de una secuencia que comprenda fusión
de dos fragmentos que no sean naturalmente contiguos entre sí, pero
tiene por objeto excluir productos de naturaleza, por ejemplo,
mutantes de origen natural como se encuentran en su estado natural.
Por tanto, por ejemplo, se contemplan productos preparados mediante
transformación de células con un vector que no es de origen natural,
como lo son los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia
obtenida usando cualquier proceso de oligonucleótido sintético. Un
proceso de este tipo con frecuencia se realiza para reemplazar un
codón con un codón redundante que codifique el mismo o un
aminoácido conservativo, aunque típicamente introduciendo o
retirando un sitio de reconocimiento de secuencia de enzima de
restricción. Alternativamente, el procedimiento se realiza para unir
entre sí segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para
generar una entidad genética única que comprenda una combinación
deseada de funciones que no se observa en las formas naturales
disponibles comúnmente, por ejemplo, que codifique una proteína de
fusión. Los sitios de reconocimiento de enzima de restricción con
frecuencia son la diana de dichas manipulaciones artificiales, pero
otras dianas específicas de sitio, por ejemplo, promotores, sitios
de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de
control u otros elementos útiles se pueden incorporar mediante
diseño. Un concepto similar se pretende para un polipéptido
recombinante, por ejemplo, de fusión. Este incluirá una repetición
dimérica. Se incluyen específicamente, en la medida en que los
mismos estén abarcados por las reivindicaciones adjuntas, ácidos
nucleicos sintéticos que, por redundancia del código genético,
codifican polipéptidos equivalentes a fragmentos de DCRS2 y fusiones
de secuencias de diversas moléculas relacionadas diferentes, por
ejemplo, otros miembros de la familia de receptores de
citoquina.
Un "fragmento" en un contexto de ácido
nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17
nucleótidos, generalmente al menos 21 nucleótidos, más generalmente
al menos 25 nucleótidos, ordinariamente al menos 30 nucleótidos,
más ordinariamente al menos 35 nucleótidos, con frecuencia al menos
39 nucleótidos, más frecuentemente al menos 45 nucleótidos,
típicamente al menos 50 nucleótidos, más típicamente al menos 55
nucleótidos, habitualmente al menos 60 nucleótidos, más
habitualmente al menos 66 nucleótidos, preferiblemente al menos 72
nucleótidos, más preferiblemente al menos 79 nucleótidos y en casos
particulares será de al menos 85 o más nucleótidos. Típicamente, se
pueden comparar fragmentos de secuencias genéticas diferentes unos
con otros en tramos de longitud apropiada, segmentos
particularmente definidos tales como los dominios que se describen
más adelante.
Un ácido nucleico que codifica el DCRS2 será
particularmente útil para identificar genes, especies de ARNm y
ADNc que se codifican a sí mismas o a proteínas estrechamente
relacionadas, así como ADN que codifican variantes polimórficas,
alélicas u otras variantes genéticas, por ejemplo, a partir de
individuos diferentes o especies relacionadas. Sondas preferidas
para tales selecciones son las regiones de la interleuquina que se
conservan entre variantes polimórficas diferentes o que contienen
nucleótidos que carecen de especificidad y preferiblemente serán de
longitud completa o casi completa. En otras situaciones, las
secuencias específicas de variantes polimórficas serán más
útiles.
Esta invención abarca además, en la medida en
los mismos estén abarcados por las reivindicaciones adjuntas,
moléculas y fragmentos de ácido nucleico recombinante que tienen una
secuencia de ácido nucleico idéntica a o altamente homóloga al ADN
aislado que se expone en este documento. En particular, las
secuencias con frecuencia estarán unidas funcionalmente a segmentos
de ADN que controlan la transcripción, la traducción y la
replicación de ADN. Estos segmentos adicionales típicamente
ayudarán a la expresión del segmento de ácido nucleico deseado.
Secuencias de ácidos nucleicos homólogas o
altamente idénticas, cuando se comparan unas con otras, por ejemplo,
secuencias de DCRS2, muestran similitud significativa. Los
convencionales para homología en ácidos nucleicos son mediciones de
homología usadas generalmente en la técnica por comparación de
secuencias o basadas en condiciones de hibridación. Las condiciones
de hibridación comparativas se describen con mayor detalle más
adelante.
La identidad sustancial en el contexto de
comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que los
segmentos o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son
idénticos cuando se alinean de forma óptima, con inserciones o
deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente el
60% de los nucleótidos, generalmente al menos el 66%,
ordinariamente al menos el 71%, con frecuencia al menos el 76%, más
frecuentemente al menos el 80%, habitualmente al menos el 84%, más
habitualmente al menos el 88%, típicamente al menos el 91%, más
típicamente al menos aproximadamente el 93%, preferiblemente al
menos aproximadamente el 95%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 96 al 98% o más y, en realizaciones particulares,
tan alta como aproximadamente el 99% o más de los nucleótidos,
incluyendo, por ejemplo, segmentos que codifican dominios
estructurales tales como los segmentos que se describen más
adelante. De forma alternativa, la identidad sustancial existirá
cuando los segmentos se hibriden en condiciones de hibridación
selectiva, a una hebra o su complemento, típicamente usando una
secuencia obtenida de la Tabla 1. Típicamente, como se describe en
este documento, la hibridación selectiva ocurrirá cuando exista una
homología de al menos el 55% a lo largo de un tramo de al menos
aproximadamente 14 nucleótidos, más típicamente de al menos
aproximadamente el 65%, preferiblemente de al menos aproximadamente
el 75% y más preferiblemente de al menos aproximadamente el 90%.
Véase, Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12:
203-213. La longitud de comparación de homología,
como se ha descrito, puede ser a lo largo de tramos más largos y en
determinadas realizaciones será a lo largo de un tramo de al menos
aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente de al menos
aproximadamente 20 nucleótidos, ordinariamente de al menos
aproximadamente 24 nucleótidos, habitualmente de al menos
aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente de al menos
aproximadamente 32 nucleótidos, más típicamente de al menos
aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente de al menos
aproximadamente 50 nucleótidos y más preferiblemente al menos
aproximadamente de 75 a 100 o más nucleótidos. Esto incluye, por
ejemplo, 125, 150, 175, 200, 225, 246, 273 y otras longitudes.
Condiciones rigurosas, con referencia a
homología en el contexto de hibridación, serán condiciones rigurosas
combinadas de sal, temperatura, solventes orgánicos y otros
parámetros típicamente controlados en reacciones de hibridación.
Las condiciones de temperatura rigurosas habitualmente incluirán
temperaturas de más de aproximadamente 30ºC, más habitualmente de
más de aproximadamente 37ºC, típicamente de más de aproximadamente
45ºC, más típicamente de más de aproximadamente 55ºC,
preferiblemente de más de aproximadamente 65ºC y más preferiblemente
de más de aproximadamente 70ºC. Las condiciones rigurosas de sal
ordinariamente serán menores de aproximadamente 500 mM,
habitualmente menores de 400 mM, más habitualmente menores de
aproximadamente 300 mM, típicamente menores de aproximadamente 200
mM, preferiblemente menores de aproximadamente 100 mM y más
preferiblemente menores de aproximadamente 80 mM, incluso hasta
menores de aproximadamente 20 mM. Sin embargo, la combinación de
parámetros es mucho más importante que la medición de cualquier
parámetro único. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J.
Mol. Biol. 31: 349-370.
El ADN aislado se puede modificar fácilmente
mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos,
inserciones de nucleótidos e inversiones de tramos de nucleótidos.
Estas modificaciones dan como resultado secuencias de ADN nuevas
que codifican esta proteína o sus derivados. Estas secuencias
modificadas se pueden usar para producir proteínas mutantes
(muteínas) o para mejorar la expresión de especies variantes. La
expresión mejorada puede implicar amplificación génica,
transcripción aumentada, traducción aumentada y otros mecanismos.
Tales derivados similares a DCRS2 mutantes incluyen mutaciones
predeterminadas o específicas de sitio de la proteína o sus
fragmentos, que incluyen mutaciones silenciosas usando código
genético degenerado. "DCRS2 mutante" como se usa en este
documento, abarca un polipéptido que cae de otra manera dentro de la
definición de homología del DCRS2 como se ha expuesto
anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que
difiere de la de otras proteínas similares a receptor de citoquina
como se encuentra en la naturaleza a modo de deleción, sustitución
o inserción. En particular, "DCRS2 mutante específico de sitio"
abarca una proteína que tiene una identidad de secuencia sustancial
con una proteína de la Tabla 1 y típicamente comparte la mayoría de
las actividades o efectos biológicos de las formas descritas en este
documento.
Aunque los sitios de mutación específica de
sitio son predeterminados, los mutantes no necesitan ser específicos
de sitio. La mutagénesis de DCRS2 de mamífero se puede conseguir
realizando inserciones o deleciones de aminoácidos en el gen,
acopladas con expresión. Las sustituciones, deleciones, inserciones
o muchas combinaciones se pueden generar para llegar a una
construcción final. Las inserciones incluyen fusiones
amino-terminal o carboxi-terminal.
La mutagénesis aleatoria se puede conducir en un codón diana y los
mutantes de DCRS2 de mamífero expresados se pueden seleccionar para
la actividad deseada, proporcionando algún aspecto de una relación
estructura-actividad. Los métodos para realizar
mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que
tienen una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, por
ejemplo, por mutagénesis de cebador M13. Véase también Sambrook,
et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y suplementos
periódicos).
Las mutaciones en el ADN normalmente no
colocarían secuencias codificantes fuera de las fases de lectura y
preferiblemente no crearían regiones complementarias que pudieran
hibridar para producir estructura de ARNm secundaria tales como
bucles o pasadores.
El método de fosforamidita descrito por Beaucage
y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862,
producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Con frecuencia se
obtendrá un fragmento bicatenario sintetizando la hebra
complementaria e hibridando la hebra consigo misma en condiciones
apropiadas o añadiendo la hebra complementaria usando ADN
polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.
Las técnicas de reacción en cadena de polimerasa
(PCR) con frecuencia se pueden aplicar en mutagénesis.
Alternativamente, los cebadores de mutagénesis son métodos usados
comúnmente para generar mutaciones definidas en sitios
predeterminados. Véase, por ejemplo., Innis, et al. (eds.
1990) PCR Protocols: A Guide to methods and Applications Academic
Press, San Diego, CA y Dieffenbach y Dveksler (1995; eds.) PCR
Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.
Ciertas realizaciones de la invención se dirigen
a composiciones de combinación que comprenden las secuencias de
receptor o ligando descritas, en la medida en que las mismas estén
abarcadas por las reivindicaciones adjuntas. En otras
realizaciones, se pueden unir partes funcionales de las secuencias
para codificar proteínas de fusión. En otras formas, se pueden
sustituir variantes de las secuencias descritas.
Como se ha descrito anteriormente, la presente
invención abarca DCRS2 de primate, por ejemplo, cuyas secuencias se
describen en la Tabla 1 y se han descrito anteriormente. También se
contemplan variantes alélicas y otras variantes que incluyen, por
ejemplo, proteínas de fusión que combinan partes de tales secuencias
con otras, incluyendo, por ejemplo, etiquetas de epítopo y dominios
funcionales, en la medida en que las mismas estén abarcadas por las
reivindicaciones adjuntas.
La presente invención también proporciona
proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión
heterólogas usando segmentos de esas proteínas de primate. Una
proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o
segmentos que naturalmente no están normalmente fusionadas de la
misma manera. Por tanto, el producto de fusión de un DCRS2 con otro
receptor de citoquina es una molécula de proteína continua que tiene
secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, típicamente
hecho como un producto de traducción único y que muestra
propiedades, por ejemplo, secuencia y antigenicidad, obtenidas de
cada péptido de fuente. Un concepto similar se aplica a secuencias
de ácidos nucleicos heterólogas. También se proporcionan
combinaciones de diversas proteínas designadas en complejos.
Además, se pueden realizar nuevas construcciones
combinando dominios funcionales o estructurales similares de otras
proteínas relacionadas, por ejemplo, receptores de citoquina o
receptores similares a Toll, que incluyen variantes de especie. Por
ejemplo, se pueden "intercambiar" segmentos unión de ligandos u
otros segmentos entre diferentes polipéptidos o fragmentos de
fusión nuevos. Véase, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989)
Science 243: 1330-1336 y O'Dowd, et al.
(1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. Por tanto,
se producirán nuevos polipéptidos quiméricos que muestran nuevas
combinaciones de especificidades a partir del enlace funcional de
especificidades de unión de receptor. Por ejemplo, los dominios de
unión de ligando de otras moléculas receptoras relacionadas se
pueden añadir o se pueden sustituir por otros dominios de éstas o
proteínas relacionadas. La proteína resultante con frecuencia
tendrá función y propiedades híbridas. Por ejemplo, una proteína de
fusión puede incluir un dominio de dirección que puede servir para
proporcionar el secuestro de la proteína de fusión a un organelo
subcelular particular.
Se pueden seleccionar parejas y secuencias de
fusión candidatas de diversas bases de datos de secuencias, por
ejemplo, GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA y BCG,
University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison,
WI., que se incorporan cada una en este documento como referencia.
En particular, son particularmente preferidas las combinaciones de
secuencias de polipéptido proporcionadas en las Tablas 1 y 3. Se
pueden sustituir formas variantes de las proteínas en las
combinaciones descritas.
La presente invención particularmente
proporciona muteínas que unen ligandos similares a citoquina y/o que
se influyen en la transducción de señal. La alineación estructural
de DCRS2 humano con otros miembros de la familia de receptores de
citoquina muestra características/residuos conservados. Véase la
Tabla 3. La alineación de la secuencia de DCRS2 humana con otros
miembros de la familia de receptores de citoquina indica diversas
características compartidas estructural y funcionalmente. Véase
también Bazan, et al. (1996) Nature 379: 591; Lodi, et
al. (1994) Science 263: 1762-1766; Sayle y
Milner-White (1995) TIBS 20: 374-376
y Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:
263-269.
Son particularmente preferidas sustituciones con
secuencias de ratón o secuencias humanas. Por el contrario,
sustituciones conservativas lejanas de las regiones de interacción
de unión de ligando probablemente conservarán la mayoría de las
actividades de señalización y sustituciones conservativas lejanas de
los dominios intracelulares probablemente conservarán la mayoría de
las propiedades de unión de ligando.
"Derivados" del receptor DCRS2 de primate
incluyen mutantes de secuencia de aminoácidos, variantes de
glicosilación, derivados metabólicos y conjugados covalentes o
agregativos con otros restos químicos. Los derivados covalentes se
pueden preparar mediante enlace de funcionalidades a grupos que se
encuentran en las cadenas laterales de aminoácidos de DCRS2 o en
los grupos N-terminal o C-terminal,
por ejemplo, por medios que son conocidos en la técnica. Estos
derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas
alifáticas del extremo carboxilo o de residuos que contienen
cadenas laterales de carboxilo derivados, derivados
O-acilo de residuos que contienen grupo hidroxilo y
derivados N-acilo de los residuos que contienen
aminoácidos amino terminal o grupo amino, por ejemplo, lisina o
arginina. Los grupos acilo se seleccionan entre el grupo de restos
alquilo, que incluyen alquilo normal de C3 a C18, formando de este
modo especies alcanoil aroilo.
En particular, se incluyen alteraciones de
glicosilación, por ejemplo, realizadas modificando los patrones de
glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento
o en etapas de procesamiento adicionales. Los medios
particularmente preferidos para conseguir esto son exponiendo el
polipéptido a enzimas glicosilantes obtenidas de células que
normalmente proporcionan tal procesamiento, por ejemplo, enzimas de
glicosilación de mamíferos. También se contemplan enzimas de
desglicosilación. También se incluyen versiones de la misma
secuencia de aminoácidos primaria que tienen otras modificaciones
menores, que incluyen residuos de aminoácidos fosforilados, por
ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.
Un grupo importante de derivados son los
conjugados covalentes de los receptores o fragmentos de los mismos
con otras proteínas de polipéptidos. Estos derivados se pueden
sintetizar en cultivo recombinante tal como fusiones en
N-terminal o C-terminal o mediante
el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en
proteínas de entrecruzamiento a través de grupos laterales
reactivos. Los sitios de derivación preferidos con agentes de
entrecruzamiento están en grupos amino libres, restos de
carbohidratos y residuos de cisteína.
También se proporcionan polipéptidos de fusión
entre los receptores y otras proteínas homólogas o heterólogas. Los
polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre receptores
diferentes, dando como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida
que muestra especificidad de unión para múltiples ligandos de
citoquina diferentes o un receptor que pueda tener especificidad
ampliada o debilitada de efecto de sustrato. Análogamente, se pueden
construir fusiones heterólogas que presenten una combinación de
propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Ejemplos
típicos son fusiones de un polipéptido indicador, por ejemplo,
luciferasa, con un segmento o dominio de un receptor, por ejemplo,
un segmento de unión de ligando, para que la presencia o
emplazamiento de un ligando deseado se pueda determinar fácilmente.
Véase, por ejemplo, Dull, et al., Patente de EE.UU. Nº
4.859.609. Otras parejas de fusión génica incluyen
glutatión-S-transferasa (GST),
\beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A,
\beta-lactamasa, alfa amilasa, alcohol
deshidrogenasa y factor de acoplamiento alfa de levadura. Véase,
por ejemplo, Godowski, et al. (1988) Science 241:
812-816. Las proteínas marcadas con frecuencia se
sustituirán en las combinaciones de proteínas descritas.
El método de fosforamidita descrito por Beaucage
y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862,
producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Con frecuencia se
obtendrá un fragmento bicatenario sintetizando la hebra
complementaria e hibridando la hebra en condiciones apropiadas o
añadiendo la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una
secuencia de cebador apropiada.
Tales polipéptidos también pueden tener residuos
de aminoácidos que se han modificado químicamente por fosforilación,
sulfonación, biotinilación o la adición o remoción de otros restos,
particularmente los que tienen formas moleculares similares a
grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán
reactivos marcadores útiles o sirven como dianas de purificación,
por ejemplo, ligandos de afinidad.
Las proteínas de fusión típicamente se
prepararán por métodos de ácido nucleico recombinante o por métodos
de polipéptido sintético. Técnicas para manipulación y expresión de
ácidos nucleicos se describen en general, por ejemplo, en Sambrook,
et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª
ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory y
Ausubel, et al. (eds. 1987 y suplementos periódicos) Current
Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York, que se
incorporan en este documento como referencia. Las técnicas para
síntesis de polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield
(1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156; Merrifield
(1986) Science 232: 341-347 y Atherton, et
al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach,
IRL Press, Oxford. Véase también Dawson, et al. (1994)
Science 266: 776-779 para métodos para preparar
polipéptidos más grandes.
Esta invención también contempla el uso de
derivados de un DCRS2 distintos a variaciones en la secuencia de
aminoácidos o glicosilación. Tales derivados pueden implicar
asociación covalente o agregativa con restos químicos. Estos
derivados generalmente caen en tres clases: (1) sales, (2)
modificaciones covalentes de residuos de cadena lateral y
terminales y (3) complejos de adsorción, por ejemplo con membranas
celulares. Dichos derivados covalentes o agregativos son útiles
como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en métodos de
purificación tales como para purificación de afinidad de un
receptor u otra molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo. Por
ejemplo, se puede inmovilizar un ligando de citoquina por unión
covalente a un soporte sólido tal como Sefarosa activada con
bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en la
técnica o adsorber sobre superficies de poliolefina, con o sin
entrecruzamiento de glutaraldehído, para uso en el ensayo o
purificación de un receptor de citoquina, anticuerpos u otras
moléculas similares. El ligando también se puede marcar con un
grupo detectable, por ejemplo tratado con radioyodo por el
procedimiento de cloramina T, unida covalentemente a quelatos de
tierras raras o conjugado a otro resto fluorescente para usarse en
ensayos de diagnóstico.
Se puede usar una combinación, por ejemplo, que
incluye un DCRS2 de esta invención como un inmunógeno para la
producción de antisueros o anticuerpos específicos, por ejemplo,
capaces de distinguir entre otros miembros de la familia de
receptores de citoquina, para la combinación descrita. Los complejos
se pueden usar para seleccionar anticuerpos monoclonales o
fragmentos de unión a antígeno preparados por inmunización con
diversas formas de preparaciones impuras que contienen la proteína.
En particular, el término "anticuerpos" también abarca
fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos naturales, por
ejemplo, Fab, Fab2, Fv, etc. El DCRS2 purificado también se puede
usar como un reactivo para detectar anticuerpos generados en
respuesta a la presencia de niveles elevados de expresión o
trastornos inmunológicos que conducen a la producción de anticuerpos
al receptor endógeno. Adicionalmente, fragmentos de DCRS2 también
pueden servir como inmunógenos para producir los anticuerpos de la
presente invención, como se ha descrito inmediatamente más adelante,
en la medida en que los mismos estén abarcados por las
reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, esta invención contempla
anticuerpos que tienen afinidad de unión a o que son generados
contra las secuencias de aminoácidos mostradas en la Tabla 1,
fragmentos de las mismas o diversos péptidos homólogos. En
particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen
afinidad de unión a o que se han generados contra fragmentos
específicos que se pronostica que son o que realmente se exponen en
la superficie exterior del DCRS2 nativo. Complejos de combinaciones
de proteínas también serán útiles y se pueden realizar
preparaciones de anticuerpos para los mismos.
Se puede producir el bloqueo de respuesta
fisiológica a los ligandos de receptor a partir de la inhibición de
unión de ligando al receptor, probablemente a través de inhibición
competitiva. Por tanto, los ensayos in vitro de la presente
invención con frecuencia usarán anticuerpos o segmentos de unión a
antígeno de estos anticuerpos o fragmentos unidos a sustratos de
fase sólida. Estos ensayos también permitirán la determinación de
diagnóstico de los efectos de mutaciones y modificaciones de región
de unión a ligando u otras mutaciones y modificaciones, por
ejemplo, que afectan la función de señalización o enzimática.
Esa invención también contempla el uso de
ensayos de selección de fármaco competitivos, por ejemplo, donde
anticuerpos neutralizantes para los complejos o fragmentos de
receptor compiten con un compuesto de ensayo para unirse a un
ligando o a otro anticuerpo. De esta manera, los anticuerpos o
fragmentos neutralizantes se pueden usar para detectar la presencia
de un polipéptido que comparta uno o más sitios de unión a un
receptor y también se pueden usar para ocupar sitios de unión sobre
un receptor que de otra manera pudiera unirse a un ligando.
Se pueden obtener ADN que codifica la proteína o
fragmentos de la misma mediante síntesis química, selección de
genotecas de ADNc o seleccionando genotecas genómicas preparadas a
partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de
tejido. Se pueden aislar secuencias naturales usando métodos
convencionales y las secuencias que se proporcionan en este
documento, por ejemplo, en la Tabla 1. Se pueden identificar otros
homólogos de especie mediante técnicas de hibridación o por diversas
técnicas de PCR, combinadas con o buscando en bases de datos de
secuencias, por ejemplo, GenBank.
Este ADN se puede expresar en una amplia
variedad de células hospedadoras para la síntesis de un receptor de
longitud completa o fragmentos que a su vez, por ejemplo, se pueden
usar para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para
estudios de unión; para construcción y expresión de unión de ligando
modificada o dominios de quinasa/fosfatasa y para estudios de
estructura/función. Se pueden expresar variantes o fragmentos en
células hospedadoras que se transforman o transfectan con vectores
de expresión apropiados. Estas moléculas pueden estar
sustancialmente libres de proteína o contaminantes celulares,
diferentes a los obtenidos del hospedador recombinante y, por lo
tanto, son particularmente útiles en las composiciones farmacéuticas
cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente
aceptable. La proteína o partes de la misma, se pueden expresar
como fusiones con otras proteínas. Combinaciones de las proteínas
descritas o ácidos nucleicos que las codifican, son particularmente
interesantes.
Los vectores de expresión son típicamente
construcciones de ADN o ARN de autorreplicación que contienen el
gen receptor deseado o sus fragmentos, habitualmente unidos
funcionalmente a elementos de control genético adecuados que se
reconocen en una célula hospedadora adecuada. Estos elementos de
control son capaces de lograr expresión dentro de un hospedador
adecuado. Los genes múltiples se pueden expresar de forma coordinada
y pueden estar en un mensaje policistrónico. El tipo específico de
elementos de control necesario para lograr expresión dependerá de
la célula hospedadora final usada. Generalmente, los elementos de
control genético pueden incluir un sistema de promotor procariota o
un sistema de control de expresión de promotor eucariota y
típicamente incluyen un promotor transcripcional, un operador
opcional para controlar el inicio de la transcripción, potenciadores
de transcripción para elevar el nivel de expresión de ARNm, una
secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma adecuado y
secuencias que terminan la transcripción y traducción. Los vectores
de expresión también contendrán habitualmente un origen de
replicación que permite que el vector se replique independientemente
de la célula hospedadora.
Los vectores de esta invención incluyen los que
contienen ADN que codifica una combinación de proteínas, como se ha
descrito o un polipéptido equivalente biológicamente activo, en la
medida en que los mismos estén abarcados por las reivindicaciones
adjuntas. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y
puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla
además el uso de tales vectores de expresión que son capaces de
expresar ADNc eucariotas que codifican tales proteínas en un
hospedador procariota o eucariota, donde el vector es compatible
con la célula hospedadora y donde los ADNc eucariotas se insertan en
el vector para que el crecimiento de la célula hospedadora que
contiene el vector exprese los ADNc en cuestión. Habitualmente, los
vectores de expresión se diseñan para replicación estable en sus
células hospedadoras o para amplificación para aumentar enormemente
el número total de copias del gen deseables por célula. No siempre
es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una
célula hospedadora, por ejemplo, es posible lograr expresión
transitoria de la proteína o sus fragmentos en diversos hospedadores
usando vectores que no contienen un origen de replicación que se
reconoce por la célula hospedadora. También es posible usar vectores
que produzcan integración de las partes codificantes de proteína en
el ADN de la célula hospedadora o mediante recombinación.
Como se usa en este documento, los vectores
comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN
integrables y otros vehículos que permiten la integración de
fragmentos de ADN en el genoma de la célula hospedadora. Los
vectores de expresión son vectores especializados que contienen
elementos de control genético que logran la expresión de genes
unidos funcionalmente. Los plásmidos son la forma más comúnmente
usada de vector pero todas las otras formas de vectores que tienen
una función equivalente y que son o llegan a ser conocidas en la
técnica son adecuadas para uso en este documento. Véase, por
ejemplo, e. g., Pouwels, et al., (1985 y Suplementos)
Cloning Vectores: A Laboratoty Manual, Elsevier, N.Y., y Rodríguez,
et al., (eds 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning
Vectores and Their Uses, Butherswoth, Boston.
Las células transformadas son células,
preferiblemente de mamífero, que se han transformado o transfectado
con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Las
células hospedadoras transformadas habitualmente expresan las
proteínas deseadas, pero para propósitos de clonación, amplificación
y manipulación de su ADN, no necesitan expresar las proteínas
objeto. Esta invención contempla además cultivar células
transformadas en un medio de nutrientes, permitiendo de este modo
que se acumulen las proteínas. Las proteínas se pueden recuperar a
partir del cultivo o, en determinados casos, a partir del medio de
cultivo.
Para propósitos de esta invención, las
secuencias de ácidos nucleicos están unidas funcionalmente cuando
están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el
ADN para una presecuencia o líder secretor está unido
funcionalmente a un polipéptido si se expresa como una preproteína o
participa en la dirección del polipéptido a la membrana celular o
en la secreción del polipéptido. Un promotor está unido
funcionalmente a una secuencia codificante si controla la
transcripción del polipéptido; un sitio de unión al ribosoma está
unido funcionalmente a una secuencia codificante si está colocado
para permitir la traducción. Habitualmente, unido funcionalmente
significa contiguos y en fase de lectura, sin embargo, determinados
elementos genéticos tales como genes represores no están unidos de
forma contigua pero se unen a secuencias de operador que a su vez
controlan la expresión.
Las células hospedadoras adecuadas incluyen
células procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores.
Las procariotas incluyen organismos tanto gram negativos como gram
positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Las
eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S.
cerevisiae y Pichia y especies del género
Dictyostelium. Las células eucariotas superiores incluyen
líneas celulares de cultivo de tejido establecidas de células
animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de
insectos y aves, como de origen mamífero, por ejemplo, seres
humanos, primates y roedores.
Los sistemas de hospedador
procariota-vector incluyen una amplia variedad de
vectores para muchas especies diferentes. Como se usa en este
documento, E. coli y sus vectores se usarán genéricamente
para incluir vectores equivalentes usados en otros procariotas. Un
vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o muchos de sus
derivados. Los vectores que se pueden usar para expresar el receptor
o sus fragmentos incluyen, pero no se limitan a, vectores tales
como los que contienen el promotor lac (serie pUC); promotor trp
(pBR322-trp); promotor Ipp (la serie pIN);
promotores lambda-pP o pR (pOTS) o promotores
híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al.
(1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trip-, lac-, and
Ipp-derived Promoters", en Vectors: A. Survey of
Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds. Rodríguez y
Denhardt), Buttersworth, Boston, Charter 10, págs.
205-236.
Los eucariotas inferiores, por ejemplo,
levaduras y Dictyostelium, se pueden transformar con vectores
que contienen secuencia DCRS2. Para propósitos de esta invención,
el hospedador eucariota inferior más común es la levadura del pan,
Saccharomyces cerevisiae. Se usará para representar
genéricamente eucariotas inferiores aunque también están
disponibles varias cepas y especies diferentes. Los vectores de
levadura típicamente consisten en un origen de replicación (excepto
el de tipo integrador), un gen de selección, un promotor, ADN que
codifica el receptor o sus fragmentos y secuencias para terminación
de traducción, poliadenilación y terminación de transcripción. Los
vectores de expresión adecuados para levadura incluyen los
promotores constitutivos tales como
3-fosfoglicerato quinasa y diversos promotores de
gen de enzima glicolítica diferentes o promotores inducibles tales
como el promotor de la alcohol deshidrogenasa 2 o promotor de
metalotionina. Vectores adecuados incluyen derivados de los
siguientes tipos: número de copia bajo de
auto-replicación (tal como la serie YRp), número de
copia alto de auto-replicación (tal como la serie
YEp); tipos de integración (tales como la serie YIp) o mini
cromosomas (tales como la serie YCp).
Las células de cultivo del tejido eucariotas
superiores normalmente son las células hospedadoras preferidas para
expresión de las proteínas de interleuquina o receptoras
funcionalmente activas. En principio, muchas líneas celulares de
cultivo de tejido eucariota superior son viables, por ejemplo,
sistemas de expresión de baculovirus de insecto a partir de una
fuente de invertebrados o de vertebrados. Sin embargo, se prefieren
las células de mamífero. La transformación o transfección y
propagación de tales células se ha convertido en un procedimiento
de rutina. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen las
células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO),
líneas celulares de riñón de rata bebé (BRK), líneas celulares de
insecto, líneas celulares de ave y líneas celulares de mono (COS).
Los vectores de expresión de tales líneas celulares habitualmente
incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de
iniciación de traducción, sitios de empalme de ARN (si se usa ADN
genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de
transcripción. Esos vectores también contienen habitualmente un gen
de selección o gen de amplificación. Los vectores de expresión
adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que portan
promotores obtenidos, por ejemplo, de fuentes tales como
adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vaccinia o citomegalovirus.
Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados
incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama, et al., (1985) Mol. Cell
Biol. 5: 1136-1142; pMCIneo PolyA, véase Thomas,
et al., (1987) Cell. 51: 503-512 y un vector
de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610.
Para proteínas secretadas y algunas proteínas de
membrana, una fase de lectura abierta habitualmente codifica un
polipéptido que consiste en un producto maduro o secretado enlazado
covalentemente en su extremo N, a un péptido de señal. El péptido
de señal se escinde antes de la secreción del polipéptido maduro o
activo. El sitio de escisión se puede predecir con un alto grado de
precisión a partir de reglas empíricas, por ejemplo,
von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14:
4683-4690 y Nielsen, et al., (1997) Protein
Eng. 10: 1-12 y la composición precisa de
aminoácidos del péptido de señal con frecuencia no parece ser
crítica para su función, por ejemplo, Randall et al., (1989)
Science 243: 1156-1159; Kaiser et al., (1987)
Science 235: 312-317. Las proteínas maduras de la
invención se pueden determinar fácilmente usando métodos
convencionales.
Con frecuencia se deseará expresar estos
polipéptidos en un sistema que proporcione un patrón de
glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón
habitual será el proporcionado naturalmente por el sistema de
expresión. Sin embargo, el patrón será modificable exponiendo el
polipéptido, por ejemplo, una forma no glicosilada, a proteínas
glicosilantes apropiadas introducidas en un sistema de expresión
heterólogo. Por ejemplo, el gen receptor se puede cotransformar con
uno o más genes que codifican enzimas glicosilantes de mamífero o
de otro tipo. Usando este enfoque, se conseguirán determinados
patrones de glicosilación de mamífero en células procariotas o de
otro tipo. La expresión en células procariotas típicamente conducirá
a formas no glicosiladas de proteína.
La fuente de DCRS2 puede ser una célula
hospedadora eucariota o procariota que exprese DCRS2 recombinante,
tal como se ha descrito anteriormente. La fuente también puede ser
una línea celular, pero otras líneas celulares de mamífero también
se contemplan en esta invención, siendo la línea celular preferida
la de la especie humana.
Ahora que se conocen las secuencias, se pueden
preparar DCRS2 de primates, fragmentos o derivados de los mismos
mediante procesos convencionales para sintetizar péptidos. Estos
incluyen procesos tales como los que se describen en Stewart y
Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co.,
Rockford IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide
Synthesis, Springer Verlag, Nueva York; y Bodanszky (1984) The
Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nueva York. Por
ejemplo, se puede usar un proceso de azida, un proceso de cloruro
ácido, un proceso de anhídrido ácido, un proceso de anhídrido mixto,
un proceso de éster activo (por ejemplo, éster de
p-nitrofenílico, éster de
N-hidroxisuccinimida o éster de cianometilo), un
proceso de carbodimidazol, un proceso
oxidativo-reductivo o un proceso de
diciclosil-carbodiimida (DCCD)/aditivo. La síntesis
de fase sólida y de fase de solución son ambas aplicables a los
procesos anteriores. Se pueden usar técnicas similares con
secuencias de DCRS2 parciales.
Las proteínas fragmentos o derivados de DCRS2 se
preparan adecuadamente de acuerdo con los procesos anteriores como
se emplea típicamente en síntesis peptídica, generalmente por un
proceso denominado por etapas que comprende condensar un aminoácido
al aminoácido terminal, uno por uno en secuencia o por acoplamiento
de péptidos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se
están usando en la reacción de acoplamiento típicamente se tienen
que proteger para evitar el acoplamiento en un sitio incorrecto.
Si se adopta una síntesis de fase sólida, el
aminoácido C-terminal está unido a un vehículo o
soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El vehículo
insoluble no está particularmente limitado mientras tenga una
capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de
tales vehículos insolubles incluyen resinas de halogenometilo,
tales como resinas de clorometilo o resina de bromometilo, resinas
de hidroximetilo, resinas fenólicas, resinas
terc-alquiloxicarbonilohidrazidadas y similares.
Un aminoácido protegido con grupo amino se une
en secuencia a través de condensación de su grupo carboxilo
activado y el grupo amino reactivo del péptido o cadena formada
previamente, para sintetizar el péptido etapa a etapa. Después de
sintetizar la secuencia completa, el péptido se divide del vehículo
insoluble para producir el péptido. Este enfoque de fase sólida se
describe en general en Merrifield, et al., (1963) in J. Am.
Chem Soc. 85: 2149-2156.
La proteína preparada y fragmentos de la misma
se pueden aislar y purificar a partir de la mezcla de reacción por
medio de separación de péptidos, por ejemplo, por extracción,
precipitación, electroforesis, diversas formas de cromatografía y
similares. Los receptores de esta invención se pueden obtener en
grados variables de pureza dependiendo de los usos deseados. La
purificación se puede conseguir mediante el uso de técnicas de
purificación de proteína descritas en este documento, véase más
adelante o mediante el uso de los anticuerpos descritos en este
documento en métodos de cromatografía de afinidad inmunoabsorbente.
Esta cromatografía de afinidad inmunoabsorbente se lleva a cabo
enlazando en primer lugar los anticuerpos a un soporte sólido y
después poniendo en contacto los anticuerpos enlazados con lisados
solubilizados de células apropiadas, lisados de otras células que
expresan el receptor o lisados o sobrenadantes de células que
producen proteína como resultado de técnicas de ADN, véase más
adelante.
En general, la proteína purificada será al menos
aproximadamente el 40% pura, ordinariamente al menos aproximadamente
el 50% pura, habitualmente al menos aproximadamente el 60% pura,
típicamente al menos aproximadamente el 70% pura, más típicamente
al menos aproximadamente el 80% pura, preferiblemente al menos
aproximadamente el 90% pura y más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95% pura y en realizaciones particulares, del
97%-99% o más. La pureza será habitualmente sobre una base en peso,
pero también puede ser sobre una base molar. Se aplicarán
diferentes ensayos según sea apropiado. Proteínas individuales se
pueden purificar y combinar a partir de entonces.
Se pueden generar anticuerpos para las diversos
proteínas DCRS2 de mamífero, por ejemplo, de primate y fragmentos
de las mismas, tanto en formas nativas de origen natural como en sus
formas recombinantes, siendo la diferencia que es más probable que
los anticuerpos para el receptor activo reconozcan epítopos que sólo
están presentes en conformaciones nativas. La detección de antígeno
desnaturalizado también puede ser útil, por ejemplo, en análisis de
Western. También se contemplan anticuerpos
anti-idiotípicos, que serían útiles como agonistas
o antagonistas de un receptor natural o un anticuerpo.
Los anticuerpos, que incluyen fragmentos de
unión y versiones de cadena única, contra fragmentos predeterminados
de la proteína se pueden generar por inmunización de animales con
conjugados de los fragmentos con proteínas inmunógenas. Los
anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que
secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden
seleccionar para unión a proteína normal o defectuosa o seleccionar
para actividad agonista o antagonista. Estos anticuerpos
monoclonales habitualmente se unirán con al menos un K_{D} de
aproximadamente 1 mM, más habitualmente de al menos aproximadamente
300 \muM, típicamente de al menos aproximadamente 100 \muM, más
típicamente de al menos aproximadamente 30 \muM, preferiblemente
de al menos aproximadamente 10 \muM y más preferiblemente de al
menos aproximadamente 3 \muM o mejor.
Los anticuerpos, que incluyen fragmentos de
unión a antígeno, de esta invención pueden tener valor diagnóstico
o terapéutico significativo. Los mismos pueden ser antagonistas
potentes que se unen al receptor e inhiben la unión al ligando o
inhiben la capacidad del receptor para provocar una respuesta
biológica, por ejemplo, actuar sobre su sustrato. Estos también
pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y se pueden
acoplar a toxinas o radionúclidos para unirse a células productoras
o células localizadas hacia la fuente de la interleuquina. Además,
estos anticuerpos se pueden conjugar a fármacos u otros agentes
terapéuticos en forma directa o indirecta por medio de un
enlazador.
Los anticuerpos de esta invención también pueden
ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de
captura o no neutralizantes, se pueden unir al receptor sin inhibir
unión al ligando o sustrato. Como anticuerpos neutralizantes,
pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También pueden
ser útiles para detectar o cuantificar ligando. Se pueden usar como
reactivos para análisis de transferencia Western o para
inmunoprecipitación o inmunopurificación de proteína respectiva.
Análogamente, los ácidos nucleicos y proteínas se pueden inmovilizar
a sustratos sólidos para métodos de purificación o detección de
afinidad. Los sustratos pueden ser, por ejemplo, perlas de resina
sólida o láminas de plástico.
Los fragmentos de proteína se pueden unir a
otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos
fusionados o unidos covalentemente para usarse como inmunógenos. Los
receptores de citoquina de mamífero y fragmentos se pueden fusionar
o enlazarse covalentemente a una diversidad de inmunógenos, tales
como hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero bovino,
toxoide tetánico, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical Division,
Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological
Reactions, Dover Publications Nueva York; y Williams, et
al., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol 1,
Academic Press, Nueva York, para descripciones de métodos de
preparación de antisueros policlonales. Un método típico implica la
hiper-inmunización de un animal con un antígeno.
Después la sangre del animal se recoge poco después de las
inmunizaciones repetidas y se aísla la gamma globulina.
En algunos casos, es deseable preparar
anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores
mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos,
etc. La descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos
monoclonales se puede observar, por ejemplo, en Stites et
al., (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.), Lange
Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias mencionadas en el
mismo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH
Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice
(2ª ed.) Academic Press Nueva York y particularmente en Kohler y
Milstein (1975) en Nature 256: 495-497, que
describen un método para generar anticuerpos monoclonales.
Resumiendo brevemente, este método implica inyectar a un animal un
inmunógeno. Después el animal se sacrifica y se toman células de su
bazo, que después se fusionan con células de mieloma. El resultado
es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de
reproducirse in vitro. Después la población de hibridomas se
selecciona para aislar clones individuales, cada uno de los cuales
secreta una especie única de anticuerpo al inmunógeno. De esta
manera, las especies de anticuerpo individuales obtenidas son los
productos de células B únicas inmortalizadas y clonadas a partir
del animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico
reconocido sobre la sustancia inmunógena.
Otras técnicas adecuadas implican la exposición
in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos
o alternativamente a la selección de genotecas de anticuerpos en
fagos o vectores similares. Véase Huse, et al, (1989) "Generation
of a Large Combinatorial Library of The Immunoglobulin Repertoire in
Phage Lambda", Science 246: 1275-1281; y Ward,
et al. (1989) Nature 341: 544-546.
Los polipéptidos y anticuerpos de la presente
invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo
anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los
polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniendo de forma covalente o
no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se
conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación
y se describen de forma exhaustiva tanto en la bibliografía
científica como de patentes. Los marcadores adecuados incluyen
radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos
fluorescentes, restos quimioluminicentes, partículas magnéticas y
similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores
incluyen las patentes de EE.UU. Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350;
3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. También, se pueden
producir inmunoglobulinas recombinantes o quiméricas, véase
Cabilly, patente de EE.UU. Nº 4.816.567 o preparados en ratones
transgénicos, véase Mendez et al., (1997) Nature
Genetics 15: 146-156.
Los anticuerpos de esta invención también se
pueden usar para cromatografía de afinidad en el aislamiento de
proteínas de DCRS2 o péptidos. Se pueden preparar columnas donde los
anticuerpos se enlacen a un soporte sólido, por ejemplo,
partículas, tales como agarosa, Sephadex o similares, donde un
lisado celular se puede hacer pasar a través de la columna, la
columna se lava, seguido de concentraciones crecientes de un
desnaturalizador suave, mediante lo cual se liberará la proteína
purificada. Alternativamente, la proteína se puede usar para
purificar anticuerpo. Se pueden aplicar absorciones cruzadas o
agotamientos apropiados.
Los anticuerpos también se pueden usar para
seleccionar genotecas de expresión para productos de expresión
particulares. Habitualmente, los anticuerpos usados en dicho
procedimiento se marcarán con un resto que permita la detección
fácil de la presencia de antígeno por unión al anticuerpo.
Los anticuerpos generados contra un receptor de
citoquina también se usarán para generar anticuerpos
anti-idiotípicos. Estos serán útiles para detectar
o diagnosticar diversas afecciones inmunológicas relacionadas con la
expresión de la proteína o células que expresan la proteína.
También serán útiles como agonistas o antagonistas del ligando, que
pueden ser inhibidores competitivos o sustitutos para ligandos de
origen natural.
En un inmunoensayo, se determina típicamente una
proteína receptora de citoquina que se une específicamente o que es
específicamente inmunorreactiva a un anticuerpo generado contra un
inmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consiste en la
secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2. El inmunoensayo
típicamente usa un antisuero policlonal que se generó, por ejemplo,
para una proteína de SEC ID Nº: 2. Este antisuero se selecciona
para tener reactividad cruzada baja contra otros miembros de la
familia de receptores de citoquina, por ejemplo, subunidad alfa de
receptor IL-11, subunidad alfa de receptor
IL-6 p p40, preferiblemente de la misma especie y
se retira cualquier reactividad cruzada mediante la inmunoabsorción
antes de usarse en el inmunoensayo.
Para producir antisuero para uso en un
inmunoensayo, la proteína, por ejemplo, de SEC ID Nº: 2, se aísla
como se ha descrito en este documento. Por ejemplo, se puede
producir proteína recombinante en una línea celular de mamífero. Un
hospedador apropiado, por ejemplo, una cepa endogámica de ratones
tal como Balb/c, se inmuniza con la proteína seleccionada, usando
típicamente un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund
y un protocolo de inmunización de ratón convencional (véase Harlow
y Lane, anteriormente). Alternativamente, se puede usar un péptido
sintético obtenido a partir de las secuencias descritas en este
documento y conjugado a una proteína portadora como un inmunógeno.
Los sueros policlonales se recogen y se titulan frente a la proteína
inmunógena en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo de fase
sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los
antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayores se
seleccionan y se ensayan para determinar su reactividad cruzada
contra otros miembros de la familia de receptores de citoquina, por
ejemplo, subunidad alfa del receptor IL-11 y/o p40,
usando un inmunoensayo de unión competitiva tal como el que se ha
descrito en Harlow y Lane, anteriormente, en las páginas
570-573. Preferiblemente, se usan al menos dos
miembros de la familia de receptores de citoquina en esta
determinación. Estos miembros de la familia de receptores de
citoquina se pueden producir como proteínas recombinantes y aislar
usando técnicas de biología molecular y química de proteínas
convencionales como se ha descrito en este documento.
Los inmunoensayos en el formato de unión
competitiva se pueden usar para las determinaciones de reactividad
cruzada. Por ejemplo, la proteína de SEC ID Nº: 2 se puede
inmovilizar en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo
compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La
capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión de
los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con las
proteínas, por ejemplo, de la subunidad alfa de receptor
IL-11 o p40. El porcentaje de reactividad cruzada
para las proteínas anteriores se calcula usando cálculos
convencionales. Los antisueros con reactividad cruzada de menos del
10% con cada una de las proteínas enumeradas anteriormente se
seleccionan y agrupan. Después los anticuerpos de reacción cruzada
se retiran de los antisueros agrupados por inmunoabsorción con las
proteínas enumeradas anteriormente.
Después los antisueros inmunoabsorbidos y
agrupados se usan en un inmunoensayo de unión competitiva como se
ha descrito anteriormente para comparar una segunda proteína con la
proteína de inmunógeno (por ejemplo, la proteína similar a DCRS2 de
SEC ID Nº: 2). Para realizar esta comparación, cada una de las dos
proteínas se ensayaron en un amplio intervalo de concentraciones y
se determinó la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el
50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la
cantidad requerida de la segunda proteína es menor que el doble de
la cantidad de la proteína o proteínas seleccionadas que se
requiere, entonces se dice que la segunda proteína se une
específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.
Se entiende que estas proteínas receptoras de
citoquina son miembros de una familia de proteínas homólogas que
comprenden al menos 6 genes identificados hasta ahora. Para un
producto de gen particular, tal como el DCRS2, el término se
refiere no sólo a las secuencias de aminoácidos descritas en este
documento, sino también a otras proteínas que son variantes
alélicas, no-alélicas o de especies. También se
entiende que los términos incluyen mutaciones no naturales
introducidas por mutación deliberada usando tecnología recombinante
convencional tal como mutación puntual o cortando secciones cortas
de ADN que codifican las proteínas respectivas o sustituyendo
aminoácidos nuevos o añadiendo nuevos aminoácidos. Tales
alteraciones menores típicamente mantendrán sustancialmente la
inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica.
Por lo tanto, estas alteraciones incluyen proteínas que son
específicamente inmunorreactivas con una proteína DCRS2 de origen
natural designada. Las propiedades biológicas de las proteínas
alteradas se pueden determinar expresando la proteína en una línea
celular apropiada y midiendo el efecto apropiado, por ejemplo, en
linfocitos transfectados. Las modificaciones de proteína
particulares consideradas menores incluirían sustitución
conservativa de aminoácidos con propiedades químicas similares,
como se ha descrito anteriormente para la familia de receptores de
citoquina en su totalidad. Alineando una proteína de forma óptima
con la proteína de los receptores de citoquina y usando los
inmunoensayos convencionales descritos en este documento para
determinar inmunoidentidad, se pueden determinar las composiciones
de proteína de la invención.
Las formas tanto de origen natural como
recombinantes de las moléculas similares a receptor de citoquina de
esta invención son particularmente útiles en equipos y métodos de
ensayo. Por ejemplo, estos métodos también se aplicarían a
selección para actividad de unión, por ejemplo, ligandos para estas
proteínas. Se han desarrollado varios métodos de ensayo
automatizados en los últimos años para permitir la selección de
decenas de cientos de compuestos por año. Véase, por ejemplo, una
estación de trabajo automatizada BIOMEK, Beckman Instruments, Palo
Alto, California, y Fodor et al., (1991) Science 251:
767-773. Este último describe medios para ensayar
la unión por una pluralidad de polímeros definidos sintetizados
sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados para
seleccionar un ligando o proteínas homólogas agonistas/antagonistas
se puede facilitar en gran medida mediante la disponibilidad de
grandes cantidades de receptores de citoquina solubles purificados
en un estado activo tal como se proporciona en esta invención.
Se puede recubrir DCRS2 purificado directamente
sobre placas para uso en técnicas de selección de ligando
mencionadas anteriormente. Sin embargo, los anticuerpos no
neutralizantes para estas proteínas se pueden usar como anticuerpos
de captura para inmovilizar el receptor respectivo sobre la fase
sólida, útil, por ejemplo, en usos de diagnóstico.
Esta invención también contempla el uso de
DCRS2, fragmentos del mismo, péptidos y sus productos de fusión en
una variedad de equipos y métodos de diagnóstico para detectar la
presencia de la proteína o su ligando. Alternativamente o
adicionalmente, se pueden incorporar anticuerpos contra las
moléculas en los equipos y métodos. Típicamente, el equipo tendrá
un compartimiento que contenga un péptido DCRS2 o segmento de gen o
un reactivo que reconozca uno o el otro. Típicamente, los reactivos
de reconocimiento, en el caso de péptidos, serían un receptor o
anticuerpo o en el caso de un segmento de gen, sería habitualmente
una sonda de hibridación.
Un equipo preferido para determinar la
concentración de DCRS2 en una muestra típicamente comprendería un
compuesto marcado, por ejemplo, ligando o anticuerpo, que tenga
afinidad de unión conocida para DCRS2, una fuente de DCRS2 (de
origen natural o recombinante) como un control positivo y un medio
para separar la unión del compuesto marcado libre, por ejemplo una
fase sólida para inmovilizar el DCRS2 en la muestra de ensayo.
Normalmente se proporcionarán compartimientos que contengan
reactivos e instrucciones. También se proporcionarán equipos que
contengan ácidos nucleicos o proteínas apropiados.
Los anticuerpos, que incluyen fragmentos de
unión a antígeno, específicos para DCRS2 de mamífero o un fragmento
de péptido o fragmentos de receptor son útiles en aplicaciones de
diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de
ligando y/o sus fragmentos. Ensayos de diagnóstico pueden ser
homogéneos (sin una etapa de separación entre reactivo libre y
complejo anticuerpo-antígeno) o heterogéneos (con
una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales,
tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima (ELISA), inmunoensayo de enzima (EIA), técnica de
inmunoensayo multiplicado de enzima (EMIT), inmunoensayo
fluorescente marcado con sustrato (SLFIA) y similares. Por ejemplo,
se pueden emplear anticuerpos no marcados usando un segundo
anticuerpo que esté marcado y que reconozca el anticuerpo para un
receptor de citoquina o para un fragmento particular del mismo.
Estos ensayos también se han descrito de forma exhaustiva en la
bibliografía. Véase, por ejemplo, Hrlow y Lane (1988) Antibodies A
Laboratory Manual, CSH, y Coligan (ed. 1991 y suplementos
periódicos) Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, Nueva
York.
Los anticuerpos anti-idiotípicos
pueden tener uso similar para servir como agonistas o antagonistas
de receptores de citoquina. Estos serían útiles como reactivos
terapéuticos en circunstancias apropiadas.
Frecuentemente, los reactivos para ensayos de
diagnóstico se suministran en equipos, para optimizar la
sensibilidad del ensayo. Para la invención objeto, dependiendo de
la naturaleza del ensayo, el protocolo y el marcador, se
proporciona anticuerpo marcado o no marcado o ligando marcado. Esto
se realiza habitualmente junto con otros aditivos, tales como
tampones, estabilizadores, materiales necesarios para la producción
de señal tales como sustratos para enzimas y similares.
Preferiblemente, el equipo también contendrá instrucciones para el
uso apropiado desecho de los contenidos después del uso.
Típicamente, el equipo tiene compartimientos para cada reactivo
útil y contendrá instrucciones para el uso apropiado y desecho de
los reactivos. De manera deseable, los reactivos se proporcionan
como un polvo liofilizado seco, donde los reactivos se pueden
reconstituir en un medio acuoso que tenga concentraciones
apropiadas para realizar el ensayo.
Los constituyentes de los ensayos de diagnóstico
mencionados anteriormente se pueden usar sin modificación o se
pueden modificar en una variedad de formas. Por ejemplo, el marcaje
se puede conseguir uniendo covalentemente o no covalentemente un
resto que proporcione de forma directa o indirecta una señal
detectable. En muchos de estos ensayos, se puede marcar un
compuesto de ensayo, receptor de citoquina o anticuerpos para el
mismo de forma directa o indirecta. Las posibilidades para el
marcaje directo incluyen grupos de marcadores: radiomarcadores
tales como ^{125}I, enzimas (patente de EE.UU. Nº 3.645.090) tales
como peroxidasa y fosfatasa alcalina y marcadores fluorescentes
(patente de EE.UU. Nº 3.940.475) capaces de supervisar el cambio en
la intensidad de fluorescencia, desplazamiento de longitud de onda
o polarización de fluorescencia.
Las posibilidades de marcaje indirecto incluyen
biotinilación de un constituyente seguida de unión a avidina
acoplada a uno de los grupos de marcadores anteriores.
También existen numerosos métodos para separar
la unión del ligando libre o, alternativamente, la unión del
compuesto de ensayo libre. El receptor de citoquina se puede
inmovilizar sobre diversas matrices seguido de lavado. Las matrices
adecuadas incluyen plástico tal como una placa, filtros y glóbulos
de ELISA. Los métodos para inmovilizar el receptor a una matriz
incluyen, sin limitación, adhesión directa a plástico, uso de un
anticuerpo de captura, acoplamiento químico y
biotina-avidina. La última etapa en este enfoque
implica la precipitación del complejo anticuerpo/antígeno por
cualquiera de varios métodos que incluyen los que utilizan, por
ejemplo, un solvente orgánico tal como polietilénglicol o una sal
tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas
incluyen, sin limitación, el método de partícula magnetizable de
anticuerpo de fluoresceína descrito en Rattle et al., (1984)
Clin. Chem. 30 (9): 1457-1461 y la separación de
partícula magnética de anticuerpo doble como se ha descrito en la
patente de EE.UU. Nº 4.659.678.
\newpage
Se han presentado de forma exhaustiva en la
bibliografía métodos para enlazar proteína o fragmentos a diversos
marcadores y no requieren discusión detallada en este documento.
Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo
activados mediante el uso de carbodiimida o ésteres activos para
formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres por reacción
de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo
o una olefina activada tal como maleimida, para enlace o similar. En
estas solicitudes también se usarán proteínas de fusión.
Otro aspecto de diagnóstico de esta invención
implica el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos
tomadas de la secuencia de un receptor de citoquina. Estas
secuencias se pueden usar como sondas para detectar niveles del
receptor de citoquina respectivo en pacientes que se sospecha que
tienen un trastorno inmunológico. La preparación de secuencias de
nucleótidos tanto de ARN como de ADN, el marcaje de las secuencias y
el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia
descripción y tratamiento en la bibliografía. Normalmente, una
sonda de oligonucleótidos debe tener al menos aproximadamente 14
nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos
y las sondas de polinucleótidos pueden ser de hasta varias
kilobases. Se pueden emplear diversos marcadores, lo más comúnmente
radionúclidos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, también se
pueden emplear otras técnicas, tales como uso de nucleótidos
modificados con biotina para introducción en un polinucleótido. La
biotina sirve entonces como el sitio para unirse a avidina o
anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia variedad de
marcadores, tales como radionúclidos, agentes fluorescentes, enzimas
o similares. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que
pueden reconocer dúplex específicos, que incluyen dúplex de ADN,
dúplex de ARN, dúplex híbridos de ARN-ARN o dúplex
de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden
marcar y el ensayo se puede realizar donde el dúplex se une a una
superficie, para que se pueda detectar la formación de dúplex sobre
la superficie, la presencia de anticuerpo unido al dúplex. El uso de
sondas para el ARN antisentido nuevo se puede llevar a cabo en
técnicas convencionales tales como hibridación de ácidos nucleicos,
selección de más y menos, sonda de recombinación, traducción
permitida por hibridación (HART) y traducción impedida por
hibridación (HART). Esto también incluye técnicas de amplificación
tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR).
También se contemplan equipos de diagnóstico que
también se para ensayar la presencia cualitativa o cuantitativa de
otros marcadores. El diagnóstico o pronóstico puede depender de la
combinación de indicios múltiples usados como marcadores. Por lo
tanto, los equipos pueden ensayar combinaciones de marcadores.
Véase, por ejemplo, Viallet et al., (1989) Progress in
Growth Factor Res. 1: 89-87.
Esta invención proporciona reactivos con valor
terapéutico significativo. Véase, por ejemplo, Levitzki (1996)
Curr. Opin. Cell. Biol. 8: 239-244. Los receptores
de citoquina (de origen natural o recombinantes), fragmentos de los
mismos, receptores de muteína y anticuerpos, junto con compuestos
que se ha identificado que tienen afinidad de unión a los
receptores o anticuerpos, deben ser útiles en el tratamiento de
afecciones que presentan expresión anormal de los receptores de sus
ligandos. Tal anormalidad típicamente se manifestará mediante
trastornos inmunológicos. Adicionalmente, esta invención debe
proporcionar valor terapéutico en diversas enfermedades o
trastornos asociados con expresión anormal o activación anormal de
respuesta al ligando. Por ejemplo, se ha sugerido que los ligandos
de IL-1 están implicados en desarrollo morfológico,
por ejemplo, determinación de polaridad
dorso-ventral y respuestas inmunes, particularmente
las respuestas innatas primitivas. Véase, por ejemplo, Sun, et
al., (1991) Eur. J. Biochem. 196: 247254 y Hultmark
(1994) Nature 367: 116-117.
Los receptores de citoquina recombinantes,
muteínas, anticuerpos agonistas o antagonistas para los mismos o
anticuerpos se pueden purificar y después administrar a un paciente.
Estos reactivos se pueden combinar para uso terapéutico con
ingredientes activos adicionales, por ejemplo, en vehículos o
diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, junto con
estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas
combinaciones pueden ser estériles, por ejemplo, se pueden filtrar
y colocar en formas farmacéuticas como por liofilización en viales
de dosificación o almacenamiento en preparaciones acuosas
estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de
anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que no se unen al
complemento.
Se puede realizar la selección de ligando que
usa receptor de citoquina o fragmentos del mismo para identificar
moléculas que tengan afinidad de unión a los receptores. Después se
pueden utilizar ensayos biológicos posteriores para determinar si
un ligando putativo puede proporcionar unión competitiva, que pueda
bloquear la actividad estimulante intrínseca. Se pueden usar
fragmentos de receptor como un bloqueante o antagonista ya que
bloquea la actividad del ligando. Análogamente, un compuesto que
tiene actividad estimulante intrínseca puede activar el receptor y,
por lo tanto, es un agonista ya que estimula la actividad del
ligando, por ejemplo, induciendo la señalización. Esta invención
contempla además el uso terapéutico de anticuerpos para receptores
de citoquina como antagonistas.
Las cantidades de reactivos necesarias para
terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, que
incluyen medios de administración, sitio diana, vida fisiológica
del reactivo, vida farmacológica, estado fisiológico del paciente y
otros medicamentos administrados. Por tanto, las dosis de
tratamiento se deben titular para optimizar la seguridad y
eficacia. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden
proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para
administración in situ de estos reactivos. El ensayo de dosis
eficaz en animales para tratamiento de trastornos particulares
proporcionará indicio predictivo adicional de dosis humana. Se
describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman, et
al., (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological
Bases of Therapeutics, 8ª. Ed., Pergamon Press; y Remington's
Pharmaceutical Sciences, 17ª. Ed. (1990) Mack Publishing Co.,
Easton Penn.
Los métodos de administración se describen en
las mismas y más adelante, por ejemplo, para administración oral,
intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica
y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua,
solución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo,
en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Debido a la
unión de afinidad probablemente alta o números de renovación, entre
un ligando putativo y sus receptores, se esperaría inicialmente que
dosis bajas de estos reactivos fueran eficaces. Y la ruta de
señalización sugiere que cantidades extremadamente bajas de ligando
puedan tener efecto. Por tanto, se esperaría en general que los
intervalos de dosis estén en cantidades de concentraciones
inferiores a 1 mM, típicamente concentraciones de menos de
aproximadamente 10 \muM, habitualmente menos de aproximadamente
100 nM, preferiblemente menos de aproximadamente 10 pM (pico molar)
y lo más preferible es que sean menos de 1 fM (femtomolar), con un
vehículo apropiado. Se utilizarán formulaciones de liberación lenta
o aparato de liberación lenta con frecuencia para administración
continua.
Los receptores de citoquina, fragmentos de los
mismos y anticuerpos o sus fragmentos, antagonistas y agonistas se
pueden administrar directamente al hospedador que se tiene que
tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser
deseable conjugarlos a proteínas portadoras tales como ovalbúmina o
albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones
terapéuticas se pueden administrar en muchas formas farmacéuticas
convencionales. Aunque es posible que el ingrediente activo se
administre solo, es preferible presentarlo como una formulación
farmacéutica. Las formulaciones comprenden al menos un ingrediente
activo, como se ha definido anteriormente, junto con uno o más
vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo tiene que ser tanto
farmacéuticamente como fisiológicamente aceptable en el sentido de
que sea compatible con los otros ingredientes y no dañino para el
paciente. Las formulaciones incluyen las adecuadas para
administración oral, rectal, nasal o parenteral (que incluyen
subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las
formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de
dosis unitaria y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la
técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al.,
(eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of
Therapeutics, 8ª Ed. Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical
Science, 17^{a}. Ed. (1990), Mack Publishing, Co., Easton Penn.;
Avis et al., (eds 1993) Pharmaceutical Dosage Forms:
Parenteral Medications Dekker, Nueva York; Lieberman, et
al., (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker,
N.Y., y Lieberman, et al., (eds. 1990). Pharmaceutical
Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, N.Y. La terapia de esta
invención se puede combinar o usar en relación con otros agentes
terapéuticos, particularmente agonistas o antagonistas de otros
miembros de la familia de receptores de citoquina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede realizar la selección de fármacos
usando DCRS2 o fragmentos del mismo para identificar compuestos que
tienen afinidad de unión a la subunidad de receptor, incluyendo
aislamiento de compuestos asociados. Después se pueden usar ensayos
biológicos posteriores para determinar si el compuesto tiene
actividad estimulante intrínseca y por lo tanto es un bloqueante o
antagonista ya que bloquea la actividad del ligando. Análogamente,
un compuesto que tiene actividad estimulante intrínseca puede
activar el receptor y, por tanto, es un agonista ya que estimula la
actividad de un ligando de citoquina. Esta invención contempla
además el uso terapéutico de anticuerpos para el receptor como
agonistas o antagonistas de citoquina.
De manera similar, se pueden usar complejos que
comprenden proteínas múltiples para seleccionar ligandos o
reactivos capaces de reconocer el complejo. La mayoría de los
receptores de citoquina comprenden al menos dos subunidades, que
pueden ser las mismas o distintas. Alternativamente, el receptor de
trasmembrana se puede unir a un complejo que comprende un ligando
similar a citoquina asociado con otra proteína soluble que sirve,
por ejemplo, como una segunda subunidad receptora.
Un método de selección de fármaco utiliza
células hospedadoras eucariotas o procariotas que se transforman de
forma estable con moléculas de ADN recombinante que expresan el
DCRS2 en combinación con otra subunidad de receptor de citoquina.
Se pueden aislar células que expresen un receptor en aislamiento a
partir de otros receptores funcionales. Dichas células en forma
viable o fija, se pueden usar para ensayos de unión de
anticuerpo/antígeno o ligando/receptor convencionales. Véase
también, Parce et al., (1989) Science 246:
243-247 y Owicki, et al., (1990) Proc. Nat'l
Acad. Sci. EE.UU. 87: 4007-4011, que describen
métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Ensayos
competitivos son particularmente útiles, donde las células (fuente
de ligando putativo) se ponen en contacto e incuban con un receptor
o anticuerpo marcado que tiene afinidad de unión conocida al
ligando, tal como ^{125}I-anticuerpo y una muestra
de ensayo cuya afinidad de unión a la composición de unión se esté
midiendo. Después la unión y las composiciones de unión marcadas
libres se separan para evaluar el grado de unión de ligando. La
cantidad de compuesto de ensayo unido es inversamente proporcional a
la cantidad de receptor marcado que se une a la fuente conocida. Se
pueden usar muchas técnicas para separar ligando unido de libre
para evaluar el grado de unión de ligando. Esta etapa de separación
podría implicar típicamente un procedimiento tal como adhesión a
filtros seguido de lavado, adhesión a plástico seguido de lavado o
centrifugación de las membranas celulares. Las células viables
también podrían usarse para seleccionar los efectos de fármacos
sobre funciones mediadas por citoquina, por ejemplo, niveles de
segundo mensajero, por ejemplo, Ca^{++}; proliferación celular;
cambios en reserva de fosfato de inositol y otros. Algunos métodos
de detección permiten la eliminación de una etapa de separación,
por ejemplo, un sistema de detección sensible a proximidad. Los
colorantes sensibles a Calcio serán útiles para detectar niveles de
Ca^{++}, con un fluorímetro o un aparato de separación de células
con fluorescencia.
Las descripciones del DCRS2 en este documento
proporcionan medios para identificar ligandos, como se ha descrito
anteriormente. Tal ligando se debe unir específicamente al receptor
respectivo con afinidad razonablemente alta. Se hacen disponibles
diversas construcciones que permiten el marcaje del receptor para
detectar su ligando. Por ejemplo, marcar directamente el receptor
de citoquina, fusionar sobre el mismo marcadores para marcaje
secundario, por ejemplo, FLAG u otras etiquetas de epítopo, etc.,
permitirá la detección de receptor. Este puede ser histológico,
como un método de afinidad para purificación bioquímica o marcaje o
selección en un procedimiento de estudio de clonación de expresión.
También se puede aplicar un sistema de selección de 2 híbridos
preparando construcciones apropiadas con las secuencias de receptor
de citoquina disponibles. Véase, por ejemplo, Fields, y Song (1989)
Nature 340: 245-246.
El amplio alcance de esta invención se entiende
mejor con referencia a los ejemplos siguientes, que no tienen por
objeto limitar las invenciones a las realizaciones específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos de los métodos generales se describen o
se hace referencia a los mismos, por ejemplo, en Maniatis, et
al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et
al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª ed.)
vols. 1-3, CSH Press, NY o Ausubel, et al.
(1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology,
Greene/Wiley, Nueva York. Los métodos para purificación de
proteínas incluyen métodos tales como precipitación de sulfato de
amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación,
cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al.
(1987 y suplementos periódicos); Coligan, et al. (ed. 1996)
y suplementos periódicos, Current Protocols in Protein Science
Greene/Wiley, Nueva York; Deutscher (1990) "Guide to Protein
Purification" en Methods in Enzymology, vol. 182 y otros
volúmenes en esta serie y la bibliografía del fabricante sobre el
uso de productos de purificación de proteínas, por ejemplo,
Pharmacia, Piscataway, N.J. o Bio-Rad, Richmond, CA.
La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a
segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un
equivalente que se puede fusionar mediante una secuencia amovible
con proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1990) "Purification of
Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow
(ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:
87-98, Plenum Press, N.Y. y Crowe, et al.
(1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein
Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
Se realiza análisis de secuencia por ordenador,
por ejemplo, usando programas de software disponibles, que incluyen
los de fuentes de GCG (U. Wisconsin) y GenBank. También se usaron
las bases de datos de secuencia públicas, por ejemplo, de GenBank y
otros.
Se pueden aplicar muchas técnicas aplicables a
receptores IL-10 al DCRS2, como se describe, por
ejemplo, en el documento USSN 08/110.683 (receptor
IL-10).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias humanas relacionadas con
receptores de citoquinas se identificaron a partir de base de datos
de secuencia genómica usando, por ejemplo, el servidor BLAST
(Altschul, et al. (1994) Nature Genet. 6:
119-129). Se pueden usar programas de análisis
convencionales para evaluar la estructura, por ejemplo, PHD (Rost y
Sander (1994) Proteins 19: 55-72) y DSC (King y
Sternberg (1996) Protein Sci. 5: 2298-2310). El
software de comparación convencional incluye, por ejemplo,
Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-10; Waterman (1995) Introduction to
Computational Biology: Maps, Sequences, and Genomes Chapman &
Hall; Lander y Waterman (eds. 1995) Calculating the Secrets of
Life; Applications of the Mathematical Sciences in Molecular Biology
National Academy Press y Speed y Waterman (eds. 1996) Genetic
Mapping and DNA Sequencing (Volúmenes IMA en Mathematics and Its
Applications, Vol 81) Springer Verlag.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan cebadores de PCR obtenidos a partir de
la secuencia de DCRS2 para sondear una genoteca de ADNc humano. Las
secuencias se pueden obtener, por ejemplo, de la Tabla 1,
preferiblemente las adyacentes a los extremos de secuencias. Se
clonan ADNc de longitud completa para DCRS2 de primates, roedores u
otras especies, por ejemplo, mediante selección de hibridación de
ADN del fago \lambdagt10. Las reacciones de PCR se conducen
usando ADN polimerasa Taqplus de T. acuáticos (Stratagene) en
condiciones apropiadas.
Se realizan preparaciones de cromosomas. Se
realiza hibridación in situ sobre preparaciones de cromosomas
obtenidas a partir de linfocitos humanos estimulados con
fitohemaglutinina cultivados durante 72 h. Se añadió
5-bromodeoxiuridina durante las 7 h finales de
cultivo (60 \mug/ml de medio), para asegurar una formación de
bandas cromosómicas de posthibridación de buena calidad.
Un fragmento de PCR, amplificado con la ayuda de
cebadores, se clona en un vector apropiado. El vector se marca
mediante translación de mella con ^{3}H. La sonda radiomarcada se
hibrida a preparaciones de metafase a concentración final de 200
ng/ml de solución de hibridación como se ha descrito en Mattei,
et al. (1985) Hum. Genet. 69: 327-331.
Después de recubrirse con emulsión de rastreo
nuclear (KODAK NTB_{2}), los portaobjetos se exponen. Para evitar
cualquier deslizamiento de granos de plata durante el procedimiento
de formación de bandas, las preparaciones de cromosomas primero se
tiñen con solución de Giemsa tamponada y se fotografían en metafase.
Después se realiza la formación de bandas R se realiza por el
método de
fluorocromo-fotólisis-Giemsa (FPG) y
se vuelven a fotografiar las metafases antes del análisis.
Se usan métodos apropiados similares para otras
especies.
\vskip1.000000\baselineskip
Tejido múltiple humano (Nº de Cat 1, 2) y
manchas de líneas celulares de cáncer (Nº de Cat
7757-1), que contienen aproximadamente 2 \mug de
ARN de poly(A)+ por carril, se adquieren en Clontech (Palo
Alto, CA). Las sondas se marcan radiactivamente con
[\alpha-^{32}p] dATP, por ejemplo, usando el
equipo de marcaje de cebador aleatorio Amersham Rediprime
(RPN1633). Se realizan prehibridación e hibridaciones, por ejemplo,
a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 0,5 M (pH 8,0).
Se realizan lavados de alta rigurosidad, por ejemplo, a 65ºC con
dos lavados iniciales en 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 40 minutos
seguido de un lavado posterior en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% durante 20
minutos. Después las membranas se exponen a -70ºC a película de
rayos X (Kodak) en presencia de tamices intensificadores. Se llevan
a cabo estudios más detallados realizados por Southern de genoteca
de ADNc con clones seleccionados de DCRS2 humano apropiados para
examinar su expresión en subconjuntos de células hematopoyéticas u
otras células.
Alternativamente, se seleccionan dos cebadores
apropiados a partir de la Tabla 1. Se usa RT-PCR en
una muestra de ARNm apropiada seleccionada para la presencia de
mensaje para producir un ADNc, por ejemplo, una muestra que expresa
el gen.
Los clones de longitud completa se pueden aislar
por hibridación de genotecas de ADNc a partir de tejidos apropiados
preseleccionados por señal de PCR. Se pueden realizar transferencia
de Nothern.
El mensaje para genes que codifican DCRS2 se
ensayará mediante tecnología apropiada, por ejemplo, PCR,
inmunoensayo, hibridación u otras. Preparaciones de ADNc de tejidos
y órganos están disponibles, por ejemplo, en Clontech, Mountain
View, CA. Es útil la identificación de fuentes de expresión natural,
como se ha descrito. Y la identificación de apareamientos de
subunidades de receptor funcionales permitirán la predicción de qué
células expresan la combinación de subunidades de receptor que
darán como resultado una sensibilidad fisiológica a cada uno de los
ligandos de citoquina.
Para distribución en ratón, por ejemplo, se
puede realizar análisis de Southern: ADN (5 \mug) de una genoteca
de ADNc amplificado primario se digirió con enzimas de restricción
apropiadas para liberar los insertos, se desarrolló en un gel de
agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de nylon (Schleicher y
Schuell, Keene, NH).
Muestras para aislamiento de ARNm de ratón
pueden incluir: líneas de células L fibroblásticas de ratón en
reposo (C200); células transfectadas de Braf: ER (fusión de Braf a
receptor de estrógeno), control (C201); células T, polarizadas con
TH1 (Mel14 brillante, células CD4+ de bazo, polarizadas durante 7
días con IFN-\gamma y anti IL-4;
T200); células T, polarizadas con TH2 (Mel14 brillante, células CD4+
de bazo, polarizadas durante 7 días con IL-4 y
anti-IFN-\gamma; T201); células T,
altamente polarizadas con TH1 (véase Openshaw, et al. (1995)
J. Exp. Med. 182: 1357-1367; activadas con
anti-CD3 durante 2, 6, 16 h agrupadas; T202);
células T, altamente polarizadas con TH2 (véase Openshaw, et
al. (1995) J. Exp. Med. 182: 1357-1367;
activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 h
agrupadas; T203); células pre T CD44- CD25+, seleccionadas del timo
(T204); clon de células T TH1 D1.1, en reposo durante 3 semanas
después de la última estimulación con antígeno (T205); clon de
células T TH1 D1.1, estimulada con 10 \mug/ml de ConA durante 15
h (T206); clon de células T TH2 CDC35, en reposo durante 3 semanas
después de la última estimulación con antígeno (T207); clon de
células T TH2 CDC35, estimulada con 10 \mug/ml de ConA durante 15
h (T208); células T intactas Mel14+ de bazo, en reposo (T209);
células T Mel14+, polarizadas a TH1 con
IFN-\gamma/IL-12/anti-IL-4
durante 6, 12, 24 h agrupadas (T210); células T Mel14+, polarizadas
a TH2 con
IL-4/anti-IFN-\gamma
durante 6, 13, 24 h agrupadas (T211); líneas celulares de leucemia
de células B maduras no estimuladas A20 (B200); líneas celulares B
no estimuladas CH12 (B201); células B grandes no estimuladas de
bazo (B202); células B de bazo total, activadas con LPS (B203);
células dendríticas enriquecidas con metrizamida de bazo, en reposo
(D200); células dendríticas de médula ósea, en reposo (D201); línea
celular de monocitos RAW 264.7 activada con LPS durante 4 h (M200);
macrófagos de médula ósea obtenidos con GM y M-CSF
(M201); línea celular de macrófagos J774, en reposo (M202); línea
celular de macrófagos J774 + LPS +
anti-IL-10 a 0,5, 1, 3, 6, 12 h
agrupadas (M203); línea celular de macrófagos J774 + LPS +
IL-10 a 0,5, 1, 3, 5, 12 h agrupadas (M204); tejido
pulmonar de ratón expuesto a aerosol, cebadores Th2, OVA expuestas
a aerosol 7, 14, 23 h agrupadas, (véase, Garlisi, et al.
(1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75:
75-83; X206); tejido pulmonar infectado con
Nippostrongulus (véase Coffman, et al. (1989) Science 245:
308-310; X200); pulmón de adulto total, normal
(0200); pulmón total, rag-1 (véase Schwarz, et
al. (1993) Immunodeficiency 4: 249-252; 0205);
IL-10 de bazo de K.O. (véase Kuhn, et al.
(1991) Cell 75: 263-274; X201); bazo de adulto
total, normal (O201); bazo total, rag-1 (O207);
IL-10 de parches de Peyer de K.O. (O202); parches
de Peyer total, normal (O210); IL-10 de nódulos
linfáticos mesentéricos de K.O. (X203); nódulos linfáticos
mesentéricos totales, normales (O211); IL-10 de
colon de K.O. (X203); colon total, normal (O212); páncreas de ratón
NOD (véase Makino, et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:
1-13; X205); timo total, rag-1
(O208); riñón total, rag-1 (O209); corazón total,
rag-1 (O202); cerebro total, rag-1
(O203); testículos total, rag-1 (O204); hígado
total, rag-1 (O206); tejido de articulación normal
de rata (O300) y tejido de articulación artrítica de rata
(X300).
Las muestras para aislamiento de ARNm humano
pueden incluir: células mononucleares de sangre periférica
(monocitos, células T, células NK, granulocitos, células B), en
reposo (T100); células mononucleares de sangre periférica,
activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 12 h agrupadas
(T101); célula T, clon de THO Mot 72, en reposo (T102); células T,
clon de THO Mot 72, activado con anti-CD28 y
anti-CD3 durante 3, 6, 12 h agrupadas (T103); célula
T, clon de THO Mot 72, anérgico tratado con péptido específico
durante 2, 7, 12 h agrupadas (T104); célula T, clon de TH1 HY06, en
reposo (T107); célula T, clon de TH1 HY06, activado con
anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6,
12 h agrupadas (T108); célula T, clon de TH1 HY06, anérgico tratado
con péptido específico durante 2, 6, 12 h agrupadas (T109); célula
T, clon de TH2 HY935, en reposo (t110); célula T, clon de TH2 HY935,
activado con anti-CD28 y anti-CD3
durante 2, 7, 12 h agrupadas (T111); células T CD4+CD45RO- células T
polarizadas 27 días en anti-CD28,
IL-4 y anti IFN-\gamma,
polarizadas con TH2, activadas con anti-CD3 y
anti-CD28 durante 4 h (T116); líneas de tumor de
células T Jurkat y Hut78, en reposo (T117); clones de células T,
agrupados AD130,2, Tc783,12, Tc783,13, Tc783,58, Tc782,69, en
reposo (T118); clones de células T \gamma\delta aleatorios de
células T, en reposo (T119); esplenocitos, en reposo (B100);
esplenocitos, activados con anti-CD40 e
IL-4 (B101); líneas de EBV de células B agrupadas
WT49, RSB, JY, CVIR, 721,221, RM3, HSY, en reposo (B102); línea de
células B JY, activadas con PMA e ionomicina durante 1, 6 h
agrupadas (B103); clones NK 20 agrupados, en reposo (K100); clones
NK 20 agrupados, activados con PMA e ionomicina durante 6 h (K101);
clon NKL, obtenido de sangre periférica de un paciente con leucemia
LGL, tratado con IL-2 (K106); clon citotóxico NK
640-A30-1, en reposo (K107); línea
de precursor hematopoyético TF1, activado con PMA e ionomicina
durante 1, 6 h agrupados (C100); línea premonocítica U937, en
reposo (M100); línea premonocítica U937, activada con PMA e
ionomicina durante 1, 6 h agrupadas (M101); monocitos elutriados,
activados con LPS, IFN\gamma,
anti-IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24
h agrupados (M102); monocitos elutriados, activados con LPS,
IFN\gamma, IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h
agrupados (M103); monocitos elutriados, activados con LPS,
IFN\gamma, IL-10 durante 4, 16 h agrupados
(M106); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma,
IL-10 durante 4, 16 h agrupados (M107); monocitos
elutriados, activados con LPS durante 1 hora (M108); monocitos
elutriados, activados con LPS durante 6 h (M109); DC al 70% CD1a+,
de CD34+ GM-CSF, FNT\alpha 12 días, en reposo
(D101); DC al 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF,
FNT\alpha 12 días, activado con PMA e ionomicina durante 1 hora
(D102); DC al 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF,
FNT\alpha 12 días, activado con PMA e ionomicina durante 6 h
(D103); DC al 95% CD1a+, de CD34+ GM-CSF,
FNT\alpha 12 días clasificado por FACS, activado con PMA e
ionomicina durante 1, 6 h agrupado (D104); DC al 95% CD14+, ex
CD34+ GM-CSF, FNT\alpha 12 días clasificado por
FACS, activado con PMA e ionomicina 1, 6 h agrupado (D105); DC
CD1a+ CD86+, de CD34+ GM-CSF, FNT\alpha 12 días
clasificado por FACS, activado con PMA e ionomicina durante 1, 6 h
agrupado (D106); DC de monocitos GM-CSF,
IL-4 5 días, en reposo (D107); DC de monocitos
GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo
(D108); DC de monocitos GM-CSF, IL-4
5 días, activado con LPS durante 4, 16 h agrupados (D109); DC de
monocitos GM-CSF, IL-4 5 días,
FNT\alpha activado, monocito supe durante 4, 16 h agrupados
(D110); tumor benigno L11 de leiomioma (X101); M5 de miometrio
normal (O115); GS1 de leiomiosarcoma maligno (X103); línea de
sarcoma de fibroblasto de pulmón MRC5, activado con PMA e ionomicina
durante 1, 6 h agrupadas (C101); línea de células de carcinoma
epitelial de riñón CHA, activadas con PMA e ionomicina durante 1, 6
h agrupadas (C102); riñón fetal de macho de 28 semanas (O100);
pulmón fetal de macho de 28 semanas (O101); hígado fetal de macho
de 28 semanas (O102); corazón fetal de macho de 28 semanas (O103);
cerebro fetal de macho de 28 semanas (O104); vesícula biliar fetal
de macho de 28 semanas (O106); intestino delgado fetal de macho de
28 semanas (O107); tejido adiposo fetal de macho de 28 semanas
(O108); ovario fetal de hembra de 25 semanas (O109); útero fetal de
hembra de 25 semanas (O110); testículos fetales de macho de 28
semanas (O111); bazo fetal de macho de 28 semanas (O112); placenta
de adulto de 28 semanas (O113) y amígdalas inflamadas, de 12 años
de edad (X100).
Se pueden aislar muestras similares en otras
especies para evaluación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan diversas estrategias para obtener
homólogos de especies del DCRS2, preferiblemente de otros primates
o roedores. Un método es por hibridación cruzada usando sondas de
ADN de especies estrechamente relacionadas. Puede ser útil ir a
especies evolutivamente similares como etapas intermedias. Otro
método es usando cebadores de PCR específicos basándose en la
identificación de bloques de similitud o diferencia entre genes, por
ejemplo, áreas de secuencias de polipéptido o nucleótido altamente
conservadas o no conservadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una construcción de fusión apropiada, por
ejemplo, GST, se somete a manipulación genética para expresión, por
ejemplo, en E. coli. Por ejemplo, se construye un plásmido
IGIF pGex de ratón y se transforma en E. coli. Se cultivan
células recién transformadas, por ejemplo, en medio LB que contiene
50 \mug/ml de ampicilina e inducido con IPTG (Sigma, St. Louis,
MO). Después de inducción durante toda la noche, las bacterias se
recogen y los gránulos que contienen la proteína DCRS2 se aíslan.
Los gránulos se homogenizan, por ejemplo, en tampón TE
(tris-base 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM y pefabloc 2 mM)
en 2 litros. Este material se hace pasar a través de un
microfluidizador (Microfluidics, Newton, MA) tres veces. El
sobrenadante fluidizado se centrifuga en un rotor Sorvall
GS-3 durante 1 hora a 13.000 rpm. El sobrenadante
resultante que contiene la proteína de receptor de citoquina se
filtra y se hace pasar sobre una columna de
glutatión-SEFAROSA equilibrada en
Tris-base 50 mM pH 8,0. Las fracciones que
contienen la proteína de fusión DCRS2-GST se agrupan
y se escinden, por ejemplo, con trombina (Enzyme Research
Laboratories, Inc., South Bend, IN). Después la agrupación escindida
se hace pasar sobre una columna de Q-SEFAROSA
equilibrada en Tris-base 50 mM. Las fracciones que
contienen DCRS2 se agrupan y se diluyen en H_{2}O destilada fría,
para disminuir la conductividad y se hacen pasar de nuevo sobre una
columna de Q-Sefarosa fresca, sola o en sucesión con
una columna de anticuerpo de inmunoafinidad. Las fracciones que
contienen la proteína DCRS2 se agrupan, se forman alícuotas con las
mismas y se almacenan en el congelador de -70ºC.
Una comparación del espectro de CD con proteína
de receptor de citoquina puede sugerir que la proteína está plegada
correctamente. Véase Hazuda, et al. (1969) J. Biol. Chem.
264: 1689-1693.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones Balb/c endogámicos se inmunizan por vía
intraperitoneal con formas recombinantes de la proteína, por
ejemplo, DCRS2 purificado o células NIH-3T3
transfectadas estables. Los animales se estimulan en momentos
apropiados con proteína, con o sin adyuvante adicional, para
estimular adicionalmente la producción de anticuerpo. Se recoge
suero o hibridomas producidos con bazos recolectados.
Alternativamente, ratones Balb/c se inmunizan
con células transformadas con el gen o fragmentos del mismo,
células endógenas o exógenas o con membranas aisladas enriquecidas
para expresión del antígeno. El suero se recoge en el momento
apropiado, típicamente después de numerosas administraciones
adicionales. Pueden ser útiles diversas técnicas de terapia génica,
por ejemplo, para producir proteína in situ, para generar
una respuesta inmune. Las preparaciones de suero o anticuerpo se
pueden absorber de forma cruzada o inmunoseleccionar para preparar
anticuerpos sustancialmente purificados de especificidad definida y
afinidad alta.
Se pueden preparar anticuerpos monoclonales. Por
ejemplo, los esplenocitos se fusionan con una pareja apropiada de
fusión y los hibridomas se seleccionan en el medio de cultivo
mediante procedimientos convencionales. Los sobrenadantes de
hibridoma se seleccionan para determinar la presencia de
anticuerpos, que se unen al DCRS2, por ejemplo, por ELISA u otro
ensayo. Los anticuerpos que reconocen específicamente realizaciones
de DCRS2 específicas también se pueden seleccionar o preparar.
En otro método, se presentan péptidos sintéticos
o proteína purificada a un sistema inmune para generar anticuerpos
monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, (ed. 1991) Current
Protocols in Inmunology Wiley/Greene y Harlow y Lane (1989)
Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. En
situaciones apropiadas, el reactivo de unión se marca como se ha
descrito anteriormente, por ejemplo, fluorescencia o de otra manera
o se inmoviliza a un sustrato para métodos de separación. Los ácidos
nucleicos también se pueden introducir en células en un animal para
producir el antígeno, que sirve para inducir una respuesta inmune.
Véase, por ejemplo, Wang, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad.
Sci. 90: 4156-4160; Barry, et al. (1994)
BioTechniques 16: 616-619 y Xiang, et al.
(1995) Immunity 2: 129-135.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan diversas construcciones de fusión
con DCRS2. Una parte del gen apropiado se fusiona a una etiqueta de
epítopo, por ejemplo, una etiqueta FLAG o a una construcción de
sistema de dos híbridos. Véase, por ejemplo, Fields y Song (1989)
Nature 340: 245-246.
La etiqueta de epítopo se puede usar en un
procedimiento de clonación de expresión con defección con
anticuerpos anti-FLAG para detectar una pareja de
unión, por ejemplo, un ligando para el receptor de citoquina
respectivo. El sistema de dos híbridos también se puede usar para
aislar proteínas que se unen específicamente a DCRS2.
\vskip1.000000\baselineskip
Información sobre la importancia de los residuos
particulares se determina usando procedimientos y análisis
convencionales. El análisis de mutagénesis convencional se realiza,
por ejemplo, generando muchas variantes diferentes en posiciones
determinadas, por ejemplo, en las posiciones identificadas
anteriormente y evaluando actividades biológicas de las variantes.
Esto se puede realizar hasta el alcance de determinar posiciones
que modifican la actividad o para enfocarse en posiciones
específicas para determinar los residuos que se puedan sustituir
para retener, bloquear o modular la actividad biológica.
Alternativamente, el análisis de variantes
naturales puede indicar qué posiciones toleran mutaciones naturales.
Esto puede ser el resultado del análisis poblacional de variación
entre individuos o a través de cepas o especies. Las muestras de
individuos seleccionados se analizan, por ejemplo, por análisis de
PCR y secuenciación. Esto permite la evaluación de polimorfismos de
población.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede usar un receptor de citoquina como un
reactivo de unión específico para identificar su pareja de unión,
tomando ventaja de su especificidad de unión, como se usaría un
anticuerpo. El receptor de unión puede ser un heterodímero de
subunidades de receptor o puede implicar, por ejemplo, un complejo
del DCRS2 con otra subunidad. Un reactivo de unión se marca como se
ha descrito anteriormente, por ejemplo, fluorescencia o de otra
manera o se puede inmovilizar a un sustrato para métodos de
separación.
La composición de unión se usa para seleccionar
una genoteca de expresión preparada a partir de una línea celular
que expresa una pareja de unión, es decir, ligando, preferiblemente
asociado a membrana. Se usan técnicas de tinción convencionales
para detectar o clasificar ligandos expresados en superficie o se
seleccionan células transformadas que se expresan en superficie
mediante separación. La selección de expresión intracelular se
realiza por diversos procedimientos de tinción o
inmunofluorescencia. Véase también McMahan, et al. (1991)
EMBO J. 10: 2821-2832.
Por ejemplo, el día 0, se recubren previamente
portaobjetos permanox de 2 cámaras con 1 ml por cámara de
fibronectina, 10 ng/ml en PBS, durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Se enjuagan una vez con PBS. Después de siembran en
placas células COS a 2-3 x 10^{5} células por
cámara en 1,5 ml de medio de crecimiento. Se incuban durante toda la
noche a 37ºC.
El día 1 para cada muestra, se preparan 0,5 ml
de una solución de 66 \mug/ml de DEASE-dextrano,
cloroquina 66 \muM y 4 \mug de ADN en DME sin suero. Para cada
conjunto, se prepara un control positivo, por ejemplo, ADNc de
DCRS2-FLAG a una dilución de 1 y 1/200 y un
simulador negativo. Se enjuagan las células con DME sin suero. Se
añade la solución de ADN y se incuba 5 h a 37ºC. Se retira el medio
y se añaden 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 minutos. Se
retira y se lava una vez con DME. Se añaden 1,5 ml de medio de
cultivo y se incuba durante toda la noche.
El día 2, se cambia el medio. Los días 3 ó 4,
las células se fijan y se tiñen. Se enjuagan las células dos veces
con Solución Salina tamponada de Hank (HBSS) y se fijan en
paraformaldehído (PFA) al 4%/glucosa durante 5 min. Se lavan tres
veces con HBSS. Los portaobjetos se pueden almacenar a -80ºC después
de que se ha retirado todo el líquido. Para cada cámara, se
realizan incubaciones de 0,5 ml de la siguiente manera. Se añade
HBSS/saponina (al 0.1%) con 32 \mul/ml de NaN_{3} 1 M durante
20 min. Después las células se lavan con HBSS/saponina una vez. Se
añade DCRS2 o complejo de DCRS2/anticuerpo apropiado a las células y
se incuba durante 30 min. Se lavan las células dos veces con
HBSS/saponina. Si es apropiado, se añade el primer anticuerpo
durante 30 min. Se añade el segundo anticuerpo, por ejemplo,
anticuerpo anti-ratón del vector, en una dilución de
1/200 y se incuba durante 30 min. Se prepara solución de ELISA, por
ejemplo, solución de peroxidasa de rábano picante de Vector Elite
ABC y se preincuba durante 30 min. Se usa, por ejemplo, 1 gota de
solución A (avidina) y 1 gota de solución B (biotina) por 2,5 ml de
HBSS/saponina. Se lavan las células dos veces con HBSS/saponina. Se
añade solución de ABC HRP y se incuba durante 30 min. Se lavan las
células dos veces con HBSS, segundo lavado durante 2 min lo cual
cierra las células. Después se añade ácido diaminobenzoico (DAB) de
Vector durante 5 a 10 minutos. Se usan 2 gotas de tampón más 4
gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml de agua
destilada en vidrio. Se retira cuidadosamente la cámara y se enjuaga
el portaobjetos en agua. Se seca al aire durante unos cuantos
minutos y después se añade 1 gota de Crystal Mount y un
cubreobjetos. Se hornea durante 5 min a 85-90ºC.
Se evalúa la tinción positiva de las
agrupaciones y se subclona progresivamente para aislamiento de genes
únicos responsables de la unión.
Alternativamente, se usan reactivos de receptor
para purificar por afinidad o clasificar células que expresan un
ligando putativo. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. O
Ausubel, et al.
Otra estrategia consiste en seleccionar un
receptor de unión de membrana mediante separación. El ADNc de
receptor se construye como se ha descrito anteriormente. La
inmovilización se puede conseguir mediante el uso de anticuerpos
apropiados que reconocen, por ejemplo, una secuencia FLAG de una
construcción de fusión de DCRS2 o mediante el uso de anticuerpos
generados contra los primeros anticuerpos. Ciclos recursivos de
selección y amplificación conducen al enriquecimiento de clones
apropiados y al aislamiento final de clones de expresión de
receptor.
Se pueden seleccionar genotecas de expresión de
fago mediante DCRS2 de mamífero. Las técnicas de marcaje apropiadas,
por ejemplo, anticuerpos anti-FLAG, permitirán el
marcaje específico de clones apropiados.
\newpage
Matriz: BLOSUM62
Penalizaciones de Hueco: Existencia: 11,
Extensión: 1
Número de Secuencias: 1
Número de Solicitudes a BD: 2080
Número de extensiones: 1142
Número de extensiones satisfactorias: 1
Número de secuencias mejores que 10,0: 1
Número de HSP mejores que 10,0 sin huecos: 1
Número de HSP incompletos: 1
Número de HSP incompletos satisfactoriamente:
1
Número de extensiones adicionales incompletas
para HSP superiores a 10,0: 0
Longitud de problema: 629
Longitud de base de datos: 1, 113, 347, 412
Longitud de ajuste: 139
Longitud eficaz de problema: 490
Longitud eficaz de base de datos: 1, 113, 347,
273
Espacio de búsqueda eficaz: 545540163770
Espacio de búsqueda eficaz usado:
545540163770
Umbral de palabras vecinas: 9
Ventana para solicitudes múltiples: 0
X1: 16 (7,3 bits)
X2: 129 (49,7 bits)
X3: 129 (49,7 bits)
S1: 41 (21,7 bits)
S2: 81 (35,8 bits)
\global\parskip0.000000\baselineskip
SEC ID Nº: 1 es secuencia de nucleótido DCRS2 de primate. |
SEC ID Nº: 2 es secuencia de polipéptido DCRS2 de primate. |
SEC ID Nº: 3 es secuencia de traducción inversa DCRS2 de primate. |
SEC ID Nº: 4 es secuencia de polipéptido NR6 de primate. |
SEC ID Nº: 5 es secuencia de polipéptido NR6 de roedor. |
SEC ID Nº: 6 es secuencia de polipéptido p40 de primate. |
SEC ID Nº: 7 es secuencia de polipéptido p40 de roedor. |
SEC ID Nº: 8 es secuencia de polipéptido Ebi3 de roedor. |
SEC ID Nº: 9 es secuencia de polipéptido Ebi3 de primate. |
SEC ID Nº: 10 secuencia de polipéptido de subunidad alfa de receptor IL-11 de roedor. |
SEC ID Nº: 11 secuencia de polipéptido de subunidad alfa de receptor IL-11 de primate. |
SEC ID Nº: 12 secuencia de polipéptido de subunidad alfa de receptor IL-6 de primate. |
SEC ID Nº: 13 secuencia de polipéptido de subunidad alfa de receptor IL-6 de roedor. |
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<110> Schering Corporation
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<120> Proteínas Receptoras de Mamíferos;
Reactivos y Métodos Relacionados
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<130> DX0992 PCT
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/322.913
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
01-06-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1155
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1152)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>péptido mat
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (70)..(1152)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> primate
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<212> ADN
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<213> primate
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<212> PRT
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<213> primate
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<400> 4
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<212> PRT
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<213> roedor
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<212> PRT
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<213> primate
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<213> roedor
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<400> 13
Claims (33)
1. Un polipéptido aislado que comprende una
homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% a la
secuencia de aminoácidos madura (residuos 1-361) de
SEC ID Nº: 2.
2. El polipéptido de la reivindicación 1 en el
que el polipéptido comprende una homología de secuencia de
aminoácidos de al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos madura
(residuos 1-361) de SEC ID Nº: 2.
3. El polipéptido de la reivindicación 2 en el
que el polipéptido comprende una homología de secuencia de
aminoácidos de al menos el 98% a la secuencia de aminoácidos madura
(residuos 1-361) de SEC ID Nº: 2.
4. El polipéptido de la reivindicación 3 en el
que el polipéptido comprende la secuencia de residuos
1-361 de SEC ID Nº: 2.
5. El polipéptido de la reivindicación 1 en el
que el polipéptido comprende una homología de secuencia de
aminoácidos de al menos el 70% a la secuencia de aminoácidos de SEC
ID Nº: 2.
6. El polipéptido de la reivindicación 5 en el
que el polipéptido comprende una homología de secuencia de
aminoácidos de al menos el 90% a la secuencia de aminoácidos de SEC
ID Nº: 2.
7. El polipéptido de la reivindicación 6 en el
que el polipéptido comprende la secuencia de SEC ID Nº: 2.
8. Una formulación farmacéutica que
comprende:
- a)
- el polipéptido de la reivindicación 1 y
- b)
- un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
9. Una composición de materia que comprende una
proteína de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación
1 y una etiqueta de detección o purificación.
10. Un ácido nucleico aislado o recombinante que
codifica el péptido de la reivindicación 1.
11. El ácido nucleico de la reivindicación 10
que comprende la secuencia de residuos 70-1152 de
SEC ID Nº: 1.
12. Un vector de expresión que comprende el
ácido nucleico de la reivindicación 10.
13. Una célula que comprende el vector de
expresión de la reivindicación 12.
14. La célula de la reivindicación 13, donde
dicha célula es:
- a)
- una célula bacteriana;
- b)
- una célula de levadura;
- c)
- una célula de insecto o
- d)
- una célula de mamífero.
15. El ácido nucleico de la reivindicación 10
que comprende un marcador detectable.
16. Un ácido nucleico que hibrida en condiciones
de lavado de 30 minutos a 45ºC y sal 500 mM a la porción
codificante de SEC ID Nº: 1.
17. El ácido nucleico de la reivindicación 16,
en el que dichas condiciones de lavado son 30 minutos a 55ºC y sal
150 mM.
18. Un ácido nucleico que comprende una
homología de secuencia de nucleótidos de al menos el 71% con la
parte codificante (residuos 1-1152) de SEC ID Nº:
1.
19. El ácido nucleico de la reivindicación 18
que comprende una homología de secuencia de al menos el 80% con
parte codificante (residuos 1-1152) de SEC ID Nº:
1.
20. El ácido nucleico de la reivindicación 19
que comprende una homología de secuencia de al menos el 95% con
parte codificante (residuos 1-1152) de SEC ID Nº:
1.
\newpage
21. El ácido nucleico de la reivindicación 20
que comprende la parte codificante (residuos 1-1152)
de SEC ID Nº: 1.
22. Un compuesto de unión que comprende un sitio
de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos madura
(residuos 1-361) de SEC ID Nº: 2.
23. Un compuesto de unión que comprende un sitio
de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a
un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos madura
(residuos 1-361) de SEC ID Nº: 2.
24. El compuesto de unión de la reivindicación
22 o reivindicación 23 que comprende un fragmento de anticuerpo
seleccionado entre el grupo que consiste en un fragmento Fv, un
fragmento Fab y un fragmento Fab2.
25. El compuesto de unión de la reivindicación
22 o reivindicación 23 en el que el compuesto de unión está marcado
de forma detectable.
26. Una formulación farmacéutica que
comprende:
- a)
- el compuesto de unión de la reivindicación 22 o la reivindicación 23 y
- b)
- un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable,
en el que el compuesto de unión es
un anticuerpo que tiene actividad agonista o
antagonista.
27. Un método in vitro para producir un
complejo antígeno:anticuerpo, que comprende:
- a)
- poner en contacto el polipéptido de la reivindicación 1 con el compuesto de unión de la reivindicación 22 o reivindicación 23 y
- b)
- permitir que se forme dicho complejo.
28. Un complejo que comprende:
- a)
- el polipéptido de la reivindicación 1 y
- b)
- el compuesto de unión de la reivindicación 22 o reivindicación 23.
29. El compuesto de unión de la reivindicación
22 o reivindicación 23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
quimérico.
30. El compuesto de unión de la reivindicación
22 o reivindicación 23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
humanizado.
31. El compuesto de unión de la reivindicación
22 o reivindicación 23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
humano.
32. Uso del compuesto de unión de la
reivindicación 22 o reivindicación 23 en la preparación de un
medicamento, en el que el compuesto de unión es un anticuerpo que
tiene actividad agonista o antagonista.
33. Una composición que comprende el compuesto
de unión de la reivindicación 22 o reivindicación 23 para uso como
un medicamento, en la que el compuesto de unión es un anticuerpo que
tiene actividad agonista o antagonista.
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