ES2331622T3 - Proteinas receptoras humanas similares a toll, reactivos y metodos relacionados. - Google Patents

Abstract

Una proteína o péptido de DTLR4 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 92% con SEC ID Nº: 8 a lo largo de su longitud completa, donde dicho polipéptido tiene una actividad de receptor similar a Toll.

Description

Proteínas receptoras humanas similares a Toll, reactivos y métodos relacionados.

Esta solicitud reivindica la prioridad de las Solicitudes de Patente de Estados Unidos USSN 60/044.293, presentada el 7 de mayo de 1997; USSN 60/072.212, presentada el 22 de enero de 1998; y USSN 60/076.947, presentada el 5 de marzo de 1998.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para influir en la fisiología de los mamíferos, incluyendo morfogénesis o función del sistema inmune. En particular, proporciona ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos que regulan el desarrollo y/o el sistema inmune. También se describen los usos de diagnóstico y terapéuticos de estos materiales.

Antecedentes de la invención

La tecnología de ADN recombinante se refiere en general a las técnicas para integrar información genética a partir de una fuente donadora en vectores para procesamiento posterior, tal como a través de la introducción en un hospedador, mediante lo cual la información genética transferida se copia y/o se expresa en el entorno nuevo. Comúnmente, la información genética existe en forma de ADN complementario (ADNc) obtenido del ARN mensajero (ARNm) que codifica un producto de proteína deseado. El portador con frecuencia es un plásmido que tiene la capacidad de incorporar el ADNc para replicación posterior en un hospedador y, en algunos casos, realmente para controlar la expresión del ADNc y, de esa manera, dirigir la síntesis del producto codificado en el hospe-
dador.

Durante algún tiempo, se ha sabido que la respuesta inmune de los mamíferos se basa en una serie de interacciones celulares complejas, denominadas la "red inmune". La investigación reciente ha proporcionado nuevos enfoques en el funcionamiento interno de esta red. Si bien sigue siendo claro que mucha de la respuesta inmune, de hecho, se refiere a las interacciones similares a red de los linfocitos, los macrófagos, los granulocitos y otras células, los inmunólogos ahora sustentan en general la opinión de que las proteínas solubles, conocidas como linfoquinas, citoquinas o monoquinas juegan papeles críticos para controlar estas interacciones celulares. Por tanto, existe interés considerable en el aislamiento, la caracterización y los mecanismos de acción de factores moduladores de células, cuya comprensión conducirá a avances de importancia en el diagnóstico y la terapia de numerosas anormalidades médicas, por ejemplo, trastornos del sistema inmune.

Las linfoquinas aparentemente median las actividades celulares de una diversidad de maneras. Se ha demostrado que apoyan la proliferación, el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas pluripotenciales en un gran número de progenitores que comprenden los diversos linajes celulares, que forman un sistema inmune complejo. Son necesarias interacciones apropiadas y equilibradas entre los componentes celulares para una respuesta inmune sana. Los diferentes linajes celulares con frecuencia responden de diferente manera cuando se administran linfoquinas junto con otros agentes.

Los linajes celulares especialmente importantes para la respuesta inmune incluyen dos clases de linfocitos: las células B, que pueden producir y secretar inmunoglobulinas (proteínas con la capacidad de reconocer y unirse a materia extraña para conseguir su eliminación) y las células T de diversos subgrupos que secretan linfoquinas e inducen o suprimen las células B y diversas células diferentes (incluyendo otras células T) que constituyen la red inmunológica. Estos linfocitos interaccionan con muchos tipos de células diferentes.

Otro linaje celular importante son los mastocitos (que no se han identificado positivamente en todas las especies de mamíferos), que son células de tejido conectivo que contienen gránulos, situados próximos a los capilares en todo el cuerpo. Estas células se encuentran en concentraciones especialmente elevadas en los pulmones, la piel y los tractos gastrointestinal y genitourinario. Los mastocitos juegan un papel central en los trastornos relacionados con alergias, en particular la anafilaxia, de la siguiente manera: cuando se entrecruzan antígenos seleccionados con una clase de inmunoglobulinas unidas a receptores presentes en la superficie de los mastocitos, el mastocito se desgranula y libera mediadores, por ejemplo, histamina, serotonina, heparina y protaglandinas, que provocan reacciones alérgicas, por ejemplo, anafilaxia.

La investigación para comprender mejor y tratar diversos trastornos inmunes ha estado obstaculizada por la incapacidad general de mantener células del sistema inmune in vitro. Los inmunólogos han descubierto que se puede conseguir el cultivo de muchas de estas células a través del uso de sobrenadantes de células T y de otras células, que contengan diversos factores de crecimiento, incluyendo muchas de las linfoquinas.

La familia de proteínas interleuquina-1 incluye IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-1RA y, recientemente la IL-1\gamma (denominada también Factor Inductor de Interferón Gamma, IGIF). Esta familia de genes relacionada ha estado implicada en una gama variedad de funciones biológicas. Véase Dinarello (1994) FASEB J., 8: 1314-1325; Dinarello (1991) Blood, 77: 1627-1652 y Okamura et al. (1995) Nature, 378: 88-91.

Además existen diversos factores de crecimiento y reguladores que modulan el desarrollo morfogenético. Estos incluyen, por ejemplo, los ligandos Toll, que señalizan por medio de unión a receptores que comparten elementos estructurales y mecanísticos, característicos de los receptores IL-1. Véase, por ejemplo, Lemaitre et al. (1996) Cell 86: 973-983 y Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell & Devel. Biol., 12: 393-416.

A partir de lo anterior, es evidente que el descubrimiento y el desarrollo de nuevas proteínas solubles y sus receptores, incluyendo las similares a linfoquinas, debe contribuir a nuevas terapias para una amplia variedad de afecciones degenerativas o anormales que están relacionadas directa o indirectamente con el desarrollo, la diferenciación o la función, por ejemplo, del sistema inmune y/o de células hematopoyéticas. En particular, el descubrimiento y la comprensión de receptores novedosos para moléculas similares a linfoquina que mejoren o potencien las actividades beneficiosas de otras linfoquinas serán altamente provechosos. La presente invención proporciona receptores nuevos para ligandos que muestran similitud con las composiciones similares a interleuquina-1 y compuestos relacionados y métodos para su uso.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una comparación esquemática de las arquitecturas de proteína de los DTLR de Drosophila y humana y su relación con los receptores IL-1 de vertebrados y proteínas vegetales de resistencia a enfermedades. Tres DTLR de Drosophila (Dm) (Toll, 18w, y el fragmento ORF de Mst) (Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genet., 29: 371-399; Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop., 47: 225-239; Mitcham et al. (1996) J. Biol Chem., 271: 6777-5783; y Eldon et al. (1994) Develop., 120: 885-899) están dispuestos al lado de cuatro receptores completos (DTLR 1-4) y un receptor parcial (DTLR5) humanos (Hu). Los LRR individuales en los ectodominios del receptor, que están marcados con PRINTS (Attwood et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25: 212-217) se indican explícitamente mediante recuadros; los grupos "superior" e "inferior" con alto contenido en Cys que flanquean los extremos C- o N- terminal de las series de LRR están dibujados respectivamente mediante semicírculos yuxtapuestos. La pérdida de la región con alto contenido en Cys interna en los DTLR 1-5, representa en gran medida sus ectodominios más pequeños (558, 570, 690 y 652 aminoácidos (aa), respectivamente), en comparación con las extensiones de 784 y 977 aa de Toll y 18w. Las hebras incompletas de DmMst y HuDTLR5 (ectodominios de 519 y 153 aa, respectivamente), están representadas por líneas de puntos. El módulo de señalización intracelular común para los DTLR, los receptores de tipo IL-1 (IL-1R), la proteína intracelular Myd88 y el producto del gen N de resistencia a la enfermedad (DRgN) del tabaco están indicados debajo de la membrana. Véase, por ejemplo, Hardiman et al. (1966) Oncogene (13: 2467-2475); y Rock et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci USA, 95: 588-. Otros dominios incluyen el trío de módulos similares a Ig en IL-1R (bucles enlazados por disulfuro); la proteína DRgN presenta un dominio NTPasa (casilla) y Myd88 tiene un dominio de muerte (óvalo negro).

Las figuras 2A-2B muestran patrones estructurales conservados en los dominios de señalización de los receptores de citoquina similares a Toll y a IL-1, y dos proteínas modulares divergentes. La figura 2A muestra un alineamiento de secuencia del dominio TH común. Los DTLR están marcados como en la Figura 1; los receptores de la familia IL-1 (IL-1R1-6) humano (Hu) o de ratón (Mo) están numerados secuencialmente como se ha propuesto anteriormente (Hardiman et al. (1996), Oncogene 13: 2467-2475); Myd88 y las secuencias de tabaco (To) y de lino, L. usitatissimum (Lu), representan los dominios C- y N- Terminal, respectivamente, de moléculas de multidominio más grandes. Los bloques de secuencia sin huecos (numerados 1-10) están en recuadros. Los triángulos indican mutaciones nocivas, mientras que los truncamientos N-terminal de la flecha eliminan la bioactividad en IL-1R1 humano (Heguy et al. (1992 J. Biol. Chem., 267: 2605-2609). Están marcadas predicciones de estructura secundaria de Proteína PHD (Rost y Sander (1994) Proteins 19: 55-72) y DSC (King y Sternberg (1996) Protein Sci., 5: 2298-2310) de hélice \alpha (H), de hebra \beta (E) o de enrollamiento (L). El esquema de sombreado de aminoácidos ilustra los residuos químicamente similares; hidrófobos, ácidos, básicos, Cys, aromáticos, rompedores de estructura y diminutos. Los patrones de secuencia de diagnóstico para los IL-1R, los DTLR y el alineamiento completa (ALL) se obtuvieron por Consenso a una rigurosidad del 75%. Los símbolos para los subgrupos de aminoácidos son (véase el sitio de internet para detalles): o, alcohol; 1, alifático; cualquier aminoácido; a, aromático; c, cargado; h, hidrófobo; -, negativo; p, polar; +, positivo; s, pequeño; u, diminuto; t, giro. La figura 2B muestra un diagrama de topología del plegamiento de dominio TH \beta/\alpha propuesto. La lámina \beta paralela (con las hebras \beta A-E como triángulos amarillos) se observa en su extremo C-terminal; las hélices \alpha (círculos marcados 1-5) enlazan las hebras \beta; las conexiones de cadena están hacia el frente (visibles) o en la parte posterior (ocultas). Los residuos conservados y cargados en el extremo C de la lámina \beta se indican en gris (Asp) o como un residuo negro solo (Arg) (véase el texto).

La figura 3 muestra la evolución de una superfamilia de dominio de señalización. El alineamiento del módulo de TH múltiple de la figura 2A se usó para obtener un árbol filogenético mediante el método Neighbor-Joining (Thompson et al. (1994), Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680). Las proteínas se marcaron como en el alineamiento; el árbol se formó con TreeView.

Las figuras 4A-4D muestran la cartografía cromosómica FISH de genes de DTLR humanos. Cromosomas desnaturalizados procedente de cultivos sincrónicos de linfocitos humanos se hibridaron a sondas de ADNc de DTLR biotinilado para su localización. La asignación de los datos de cartografía de FISH (izquierda, Figuras 4A, DTLR2; 4B, DTLR3; 4C, DTLR4; 4D, DTLR5) con bandas cromosómicas se consiguió sobreponiendo las señales FISH a los cromosomas con banda DAPI (paneles centrales). Heng y Tsui (1994) Meth. Molec. Biol., 33: 109-122. Los análisis se resumen en forma de ideogramas de cromosoma humano (paneles de la derecha).

Las figuras 5A-5F muestran análisis de transferencia de ARNm de DTLR Humanos. Transferencias de tejidos humanos múltiples (He, corazón; Br, cerebro; Pl, placenta; Lu, pulmón; Li, hígado; Mu, músculo; Ki, riñón; Pn, páncreas; Sp, bazo; Th, timo; Pr, próstata; Te, testículos; Ov, ovarios; SI, intestino delgado; Co, colon; PBL, linfocitos de sangre periférica) y línea de células de cáncer (leucemia promielocítica, HL60, cáncer cervical, HELAS3; leucemia mielógena crónica, K562; leucemia linfoblástica, Molt4; adenocarcinoma colorrectal, SW480; melanoma, G361; Linfoma Raji de Burkitt, Burkitt's; adenocarcinoma colorrectal, SW 480; carcinoma de pulmón, A549) que contenían aproximadamente 2 \mug de ARN poli(A)^{+} por carril se sondearon con los ADNc radiomarcados que codifican DTLR1 (Figuras 5A-5C), DTLR2 (Figura 5D), DTLR3 (Figura 5E) y DTLR4 (Figura 5F), como se ha descrito. Las transferencias se expusieron a una película de rayos X durante 2 días (Figuras 5A-5C) o una semana (Figuras 5D-5F) a -70ºC con pantallas intensificadoras. En algunos carriles aparece una especie anómala de 0,3 kB; los experimentos de hibridación excluyen un mensaje que codifica un fragmento citoplásmico de DTLR.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a proteína o péptido de DTLR4 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia a SEC ID Nº: 8 de al menos el 92% a lo largo de su longitud completa, donde dicho polipéptido tiene actividad receptora similar a Toll.

En este documento se describen nueve receptores de mamífero relacionados, por ejemplo, estructuras moleculares similares a receptor Toll humano, denominadas DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 y DTLR10 y sus actividades biológicas. También se describen ácidos nucleicos que codifican los propios polipéptidos y los métodos para su producción y uso. Los ácidos nucleicos están caracterizados, en parte, por su homología con las secuencias de ADN complementario (ADNc) clonado incluidas en este documento.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición de materia seleccionada entre el grupo de: una proteína o péptido de DTLR2 sustancialmente puro o recombinante, que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85%, en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 4; un DTLR de secuencia natural de SEC ID Nº: 4; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR2; una proteína o péptido de DTLR3 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 6; un DTLR de secuencia natural de SEC ID Nº: 6; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR3; una proteína o péptido de DTLR4 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 26; un DTLR4 de secuencia natural de SEC ID Nº: 26; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR4; una proteína o péptido de DTLR5 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 10; un DTLR de secuencia natural de SEC ID Nº: 10 y una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR5.

En otras realizaciones, la invención proporciona una composición de materia seleccionada entre el grupo de: una proteína o péptido de DTLR6 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 12; un DTLR6 de secuencia natural de SEC ID Nº: 12; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR6; una proteína o péptido de DTLR7 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 16 ó 18 o; un DTLR7 de secuencia natural de SEC ID Nº: 16 ó 18; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR7; una proteína o péptido de DTLR8 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 32; un DTLR8 de secuencia natural de SEC ID Nº: 32; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR8; una proteína o péptido de DTLR9 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85%, en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos, con SEC ID Nº: 22; un DTLR9 de secuencia natural de SEC ID NO 22; y una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR9; una proteína o péptido de DTLR10 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% en una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con SEC ID Nº: 34; un DTLR10 de secuencia natural de SEC ID Nº: 34 y una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR 10.

Preferiblemente, la proteína sustancialmente pura o aislada comprende un segmento que muestra una identidad de secuencia con una porción correspondiente de un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10, donde: la homología es al menos aproximadamente el 90% de identidad y la porción es de al menos aproximadamente 9 aminoácidos; la homología es al menos aproximadamente el 80% de identidad y la porción es de al menos aproximadamente 17 aminoácidos; o la homología es al menos aproximadamente el 70% de identidad y la porción tiene al menos aproximadamente 25 aminoácidos. En realizaciones específicas, la composición de materia: es DTLR2, que comprende una secuencia madura de SEC ID Nº: 4; o muestra un patrón de modificación post-traduccional, distinto de DTLR2 natural; es DTLR3, que comprende una secuencia madura de SEC ID Nº: 6; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR3 natural; es DTLR4, que comprende una secuencia madura de SEC ID Nº: 26; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR4 natural; o es DTLR5, que comprende la secuencia completa de SEC ID Nº: 10; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR5 natural; o es DTLR6 que comprende una secuencia madura de SEC ID Nº: 12; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR6 natural; es DTLR7, que comprende una secuencia madura de SEC ID Nº: 16 ó 18; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR7 natural; es DTLR8, que comprende una secuencia madura de SEC ID Nº: 32; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR8 natural; o es DTLR9, que comprende la secuencia completa de SEC ID Nº: 22; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR9; o es DTLR10, que comprende la secuencia completa de SEC ID Nº: 34; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto de DTLR10; o la composición de materia puede ser una proteína o péptido que; procede de un animal de sangre caliente, seleccionado entre un mamífero, incluyendo un primate, tal como un ser humano; comprende al menos un segmento polipeptídico de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34; muestra una pluralidad de porciones que muestran dicha identidad; es una variante alélica natural de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10; tiene una longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; muestra al menos dos epítopos no solapantes que son específicos para un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 de primate; muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90% en una longitud de al menos aproximadamente 20 aminoácidos con un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6 de primate; muestra al menos dos epítopos no solapantes que son específicos para: un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 de primate; muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90% en una longitud de al menos aproximadamente 20 aminoácidos con un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 de primate; está glicosilada; tiene un peso molecular de al menos 100 kD con glicosilación natural; es un polipéptido sintético; está fijado a un sustrato sólido; está conjugado con otro resto químico; es una sustitución de 5 veces o menos de la secuencia natural; o es una variante por supresión o por inserción de una secuencia natural.

También se describe una composición que comprende: una proteína o péptido de DTLR2 estéril; o la proteína o péptido de DTLR2 y un vehículo; donde el vehículo es: un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR3 estéril; o la proteína o péptido de DTLR3 y un vehículo, donde el vehículo es un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR4 estéril; o la proteína o péptido de DTLR4 y un vehículo, donde el vehículo es: un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR5 estéril; o la proteína o péptido de DTLR5 y un vehículo, donde el vehículo es un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR6 estéril; o la proteína o péptido de DTLR6 y un vehículo, donde el vehículo es un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR7 estéril; o la proteína o péptido de DTLR7 y un vehículo, donde el vehículo es un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR8 estéril; o la proteína o péptido de DTLR8 y un vehículo, donde el vehículo es un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR9 estéril; o la proteína o péptido de DTLR9 y un vehículo, donde el vehículo es un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral; una proteína o péptido de DTLR10 estéril; o la proteína o péptido de DTLR10 y un vehículo, donde el vehículo es un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

También se describe una proteína de fusión que comprende: una secuencia de proteína madura de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34; un marcador de detección o purificación, que incluye una secuencia FLAG, His6 o Ig; o la secuencia de otra proteína receptora.

También se describe un equipo que comprende una proteína o polipéptido de DTLR y: un compartimento que comprende la proteína o polipéptido; y/o instrucciones para uso o desecho de los reactivos en el equipo.

También se describen compuestos de unión que comprenden un sitio de unión a antígeno procedente de un anticuerpo, que se une específicamente a una proteína natural de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10, donde: la proteína es una proteína de primate; el compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab o Fab2; el compuesto de unión está conjugado a otro resto químico; o el anticuerpo se genera contra una secuencia de péptido de un polipéptido maduro de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34; se genera contra un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 maduro; se genera para un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 humano purificado; está inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; se une a un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 desnaturalizado; muestra una Kd para antígeno de al menos 30 \muM; está fijado a un sustrato sólido, que incluye una perla o membrana plástica; está en una composición estéril; o está marcado de manera detectable, incluyendo marcador radiactivo o fluorescente. Un equipo de composición de unión con frecuencia comprende el compuesto de unión y: un compartimento que comprende dicho compuesto de unión; y/o instrucciones para el uso o desecho de los reactivos del equipo. Con frecuencia el equipo es capaz de realizar un análisis cualitativo o cuantitativo.

Otras composiciones incluyen una composición que comprende: un compuesto de unión estéril, o el compuesto de unión y un vehículo; donde el vehículo es: un compuesto acuoso, que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

Los ácidos nucleicos descritos en este documento incluyen un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una proteína o péptido o proteína de fusión de DTLR2-10, donde: DTLR procede de un mamífero; o el ácido nucleico codifica una secuencia de péptido antigénica de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34; codifica una pluralidad de secuencias de péptido antigénicas de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34; muestra una identidad de al menos aproximadamente el 80% con un ADNc natural que codifica dicho segmento; es un vector de expresión; comprende adicionalmente un origen de replicación; procede de fuente natural; comprende un marcador detectable; comprende secuencia de nucleótido sintético; tiene menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb; procede de mamífero, incluyendo un primate; comprende una secuencia codificante natural de longitud completa; es una sonda de hibridación para un gen que codifica dicho DTLR; o es un cebador de PCR, un producto de PCR o un cebador de mutagénesis. También se proporciona una célula, un tejido o un órgano que comprende un ácido nucleico recombinante de este tipo. Preferiblemente, la célula es: una célula procariota, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de mamífero, una célula de ratón, una célula de primate o una célula humana. Se proporcionan equipos que comprenden tales ácidos nucleicos y: un compartimento que comprende dicho ácido nucleico; un compartimento que comprende adicionalmente una proteína o polipéptido de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 de primate; y/o instrucciones para el uso o desecho de los reactivos del equipo. Con frecuencia, el equipo es capaz de realizar un análisis cualitativo o cuantitativo.

También se describe un ácido nucleico que: se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 3; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 5; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 25; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 9; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M, a SEC ID Nº: 11; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 15 ó 17; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 31; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 21; se hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y sal menos de 2 M a SEC ID Nº: 33; muestra una identidad de al menos aproximadamente el 85% en un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos con un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 de primate.

Preferiblemente, tal ácido nucleico tendrá tales propiedades, donde: las condiciones de lavado sean a 45ºC y/o sal 500 mM; o la identidad sea al menos el 90% y/o el tramo sea de al menos 55 nucleótidos. Más preferiblemente, las condiciones de lavado son a 55ºC y/o sal 150 mM; o la identidad es al menos el 95% y el tramo es al menos de 75 nucleótidos.

También se describe un método para modular la fisiología o desarrollo de una célula o células de un cultivo de tejido que comprende poner en contacto la célula con un agonista o antagonista de un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 de mamífero.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. General

En este documento se describe la secuencia de aminoácidos y secuencia de ADN de mamíferos, en este documento moléculas receptoras similares a Toll (DTLR) DNAX de primate que tienen propiedades particulares definidas, tanto estructurales como biológicas. Las mismas se han designado en este documento como DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 y DTLR10, respectivamente, y aumentan el número de miembros de la familia de receptores similares a Toll humanos de 1 a 10. Se obtuvieron diversos ADNc que codifican estas moléculas de bibliotecas de secuencia de ADNc de primates, por ejemplo, de seres humanos. También serían deseables otros homólogos de primates u otros mamíferos.

Algunos de los métodos convencionales aplicables se describen en, o se hace referencia a ellos en, por ejemplo: Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª edición), volúmenes 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brookly, NY; o Ausubel et al. (1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York.

Un nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR1 humano se muestran en SEC ID Nº: 1 y 2. Véase también Nomura et al. (1994) DNA Res., 1: 27-35. En SEC ID Nº: 3 y 4 se muestra un nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR2 humano. En SEC ID Nº: 5 y 6 se muestra un nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR3 humano. En SEC ID Nº: 7 y 8 se muestra un nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR4 humano. En SEC ID Nº: 25 y 26 se proporciona un ácido nucleico alternativo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR4 humano. En SEC ID Nº: 9 y 10 se muestra un nucleótido parcial y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR5 humano. En SEC ID Nº: 11 y 12 se muestra un nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR6 humano y en SEC ID Nº: 13 y 14 se proporciona una secuencia parcial de un DTLR6 de ratón. En SEC ID Nº: 27 y 29 (secuencia de nucleótidos) y en SEC ID Nº: 28 y 30 (secuencia de aminoácidos) se proporciona una secuencia de DTLR6 de ratón adicional. También se proporciona un nucleótido parcial (SEC ID Nº: 15 y 17) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 16 y 18) de un segmento codificante de DTLR7 humano. En SEC ID Nº: 19 y 20 se muestra un nucleótido parcial y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR8 humano. En SEC ID Nº: 31 y 32 se muestra un nucleótido más completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR humano. En SEC ID Nº: 21 y 22 se muestra un nucleótido parcial y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR9 humano. En SEC ID Nº: 23 y 24 se muestra un nucleótido parcial y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR10 humano. En SEC ID Nº: 33 y 34 se muestra un nucleótido más completo y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR10 humano. En SEC ID Nº: 35 Se proporciona una secuencia de nucleótidos parcial para un segmento codificante de DTLR10 de ratón.

TABLA 1 Comparación de dominios intracelulares de dtlr humanos. DTLR1 es SEC ID Nº: 2; DTLR2 es SEC ID Nº: 4; DTLR3 es SEC ID Nº: 6; DTLR4 es SEC ID Nº: 8; DTLR5 es SEC ID Nº: 10; y DTLR6 es SEC ID Nº: 12. Los residuos particularmente importantes y conservados, por ejemplo, los característicos, corresponden, a través de los DTLR, a los residuos tyr10-tyr13; trp26; cys46; trp52; pro54-gly55; ser69; lys71; trp134-pro135; y phe144-trp145 de SEC ID Nº:18

1

2

Como se usa en este documento, la expresión receptor 2 similar a Toll de DNAX (DTLR2) se usará para describir una proteína que comprende un segmento de proteína o de péptido que tiene o que comparte la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 4 o un fragmento sustancial del mismo. De manera similar, con un DTLR3 y SEC ID Nº: 6; DTLR4 y SEC ID Nº: 26; DTLR5 y SEC ID Nº: 10; DTLR6 y SEC ID Nº: 12; DTLR7 y SEC ID Nº: 16 y 18; DTLR8 y SEC ID Nº: 32; DTLR 9 y SEC ID Nº: 22 y DTLR10 y SEC ID Nº: 34.

También se describen variaciones de proteína del alelo de DTLR respectivo, cuya secuencia se proporciona, por ejemplo, un agonista o un antagonista de muteína. Típicamente, tales agonistas o antagonistas mostrarán menos de aproximadamente el 10% de diferencias de secuencia y, por tanto, con frecuencia tendrán sustituciones entre 1 y 11 veces, por ejemplo, 2, 3, 5, 7 veces, y otras. También abarca variantes alélicas y otras variantes, por ejemplo, polimórficas naturales, de la proteína descrita. Típicamente, se unirán a su receptor biológico correspondiente con gran afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 100 nM, habitualmente mejor que aproximadamente 30 nM, preferiblemente mejor que aproximadamente 10 nM y, más preferiblemente mejor que aproximadamente 3 nM. La expresión también se usará en este documento para hacer referencia a formas de origen natural relacionadas, por ejemplo, alelos, variantes polimórficas y variantes metabólicas de la proteína de mamífero.

También se describen proteínas o péptidos que tienen identidad de la secuencia de aminoácidos sustancial con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4. Incluirá variantes de secuencia con relativamente pocas sustituciones, por ejemplo, preferiblemente menos de aproximadamente 3 a 5. Se aplican características similares a las demás secuencias de DTLR provistas en SEC ID Nº: 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 y 34.

Un "fragmento" o "segmento" de polipéptido sustancial es un tramo de residuos de aminoácido de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, por lo general al menos 10 aminoácidos, más en general al menos 12 aminoácidos, con frecuencia al menos 14 aminoácidos, con mayor frecuencia al menos 16 aminoácidos, típicamente al menos 18 aminoácidos, más típicamente al menos 20 aminoácidos, habitualmente al menos 22 aminoácidos, más habitualmente al menos 24 aminoácidos, preferiblemente al menos 26 aminoácidos, más preferiblemente al menos 28 aminoácidos y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos. Se pueden comparar las secuencias de segmentos de proteínas diferentes unas con otras en tramos de longitud apropiada.

Se determina la homología de secuencia de aminoácidos o la identidad de secuencia llevando al punto óptimo las coincidencias de residuos, de ser necesario, introduciendo huecos según sea necesario. Véase, por ejemplo, Needleham et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff et al. (1983) capítulo uno en Time Warps, String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison Wesley, Reading, MA, EE.UU.; y paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, CA y el University of Wisconsin Genetics Computes Group (GCG), Madison, WI, EE.UU.; cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservativas como coincidencias. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanita; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de aminoácidos homólogas tienen por objeto incluir las variaciones alélicas y entre especies naturales, en la secuencia de la citoquina. Las proteínas o péptidos homólogos típicos, tendrán del 50-100% de homología (si se pueden introducir huecos) al 60-100% de homología (si se incluyen las sustituciones conservativas) con un segmento de secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34. Las medidas de homología serán de al menos aproximadamente el 70%, en general al menos el 76%, más en general al menos el 81%, con frecuencia al menos el 85%, con mayor frecuencia al menos el 88%, típicamente al menos el 90%, más típicamente al menos el 92%, habitualmente al menos el 94%, más habitualmente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 96% y, más preferiblemente al menos el 97% y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos el 98% o más. El grado de homología variará con la longitud de los segmentos comparados. Las proteínas o péptidos homólogos, tales como las variantes alélicas, compartirán la mayor parte de las actividades biológicas con las realizaciones descritas en SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34. Las regiones de comparación particularmente interesantes, en los niveles de aminoácido o nucleótido, corresponden a las que están dentro de cada uno de los bloques 1-10, o de las regiones intrabloques, que corresponden a las indicadas en la figura 2ª.

Como se usa en este documento, la expresión "actividad biológica" se usa para describir, sin limitación, los efectos sobre las respuestas inflamatorias, la inmunidad innata y/o el desarrollo morfogénico por los ligandos respectivos. Por ejemplo, estos receptores al igual que los receptores IL-1, deben mediar las actividades de fosfatasa o fosforilasa, actividades que se miden fácilmente mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Hardie et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook, volúmenes I y II, Academic Press, San Diego, CA, EE.UU.; Hanks et al. (1991), Meth. Enzymol., 200: 38-62; Hunter et al. (1992) Cell, 70: 375-388; Lewin (1990) Cell, 61: 743-752; Pines et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 56: 449-463; y Parker et al. (1993) Nature 363: 736-738. Los receptores muestran actividades biológicas muy similares a las enzimas regulables, reguladas por unión a ligando. Sin embargo, el número de renovación de enzima está más cercano a una enzima que a un complejo receptor. Además, los números de receptores ocupados necesarios para inducir tal actividad enzimática son menores que la mayoría de los sistemas receptores y puede llegar muy cerca de docenas por célula, por el contrario a la mayor parte de los receptores, que se desencadenarán a números de miles por célula. Los receptores, o partes de los mismos, pueden ser útiles como enzimas marcadoras de fosfato, para marcar sustratos generales o específicos.

Los términos ligando, agonista, antagonista y análogo, por ejemplo, de DTLR, incluyen moléculas que modulan las respuestas celulares características para proteínas similares al ligando de Toll, así como moléculas que poseen los elementos de competición de unión estructural más convencionales de las interacciones ligando-receptor, por ejemplo, cuando el receptor es un receptor natural o un anticuerpo. Probablemente las respuestas celulares están mediadas a través de la unión de diversos ligandos de Toll a receptores celulares relacionados con, pero posiblemente distintos de, los receptores de IL-1 de tipo I o de tipo II. Véase, por ejemplo, Belvin y Andreson (1996) Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 12: 393-416; Morisato y Anderson (1995); Ann Rev. Genetics, 29: 371-3991 y Hultmark (1994) Nature 367: 116-117.

Además, un ligando es una molécula que sirve ya sea como un ligando natural al que se une dicho receptor, o un análogo del mismo, o como una molécula que es un análogo funcional del ligando natural. El análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula completamente no relacionada, que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión a ligando apropiados. Los ligandos pueden servir como agonistas o como antagonistas; véase, por ejemplo: Goodman et al. (eds) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, Nueva York, EE.UU.

El diseño racional del fármaco también se puede basar en estudios estructurales de las formas moleculares de un receptor o anticuerpo y otros efectores o ligandos. Los efectores pueden ser otras proteínas que medien otras funciones en respuesta a la unión a ligando, u otras proteínas que interaccionan normalmente con el receptor. Un medio para determinar qué sitios interaccionan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo, mediante técnicas de cristalografía de rayos X o de RMN bidimensional. Estas proporcionarán directrices en cuanto a qué residuos de aminoácido forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Crystalography, Academic Press, Nueva York, EE.UU.

II. Actividades

Las proteínas receptoras similares a Toll tendrán varias actividades biológicas diferentes, por ejemplo, en el metabolismo de fosfato, añadiéndolas o retirándolas de sustratos específicos, típicamente de proteínas. Esto generalmente dará como resultado la modulación de una función inflamatoria, diferente de la respuesta innata de inmunidad, o un efecto morfológico. Las proteínas de DTLR2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 son homólogas a otras proteínas receptoras similares a Toll, pero cada una tiene diferencias estructurales. Por ejemplo, una secuencia codificante de gen de DTLR2 humano probablemente tiene una identidad de aproximadamente el 70% con la secuencia codificante de nucleótido del DTLR2 de ratón. Al nivel de aminoácidos, probablemente también hay una identidad razonable.

Las actividades biológicas de los DTLR estarán relacionadas con la adición o con la eliminación de restos de fosfato a sustratos, típicamente de una manera específica, pero ocasionalmente de una manera no específica. Los sustratos se pueden identificar o se pueden ensayar las condiciones para actividad enzimática por medio de métodos convencionales, por ejemplo, como lo describen Hardie et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook, volúmenes I y II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks et al. (1991) Meth. Enzymol., 200: 38-62; Hunter et al. (1992) Cell, 70: 375-388; Lewin (1990) Cell, 61: 743-762; Pines et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 56: 449-463; y Parker et al. (1993) Nature 363: 736-738.

III. Ácidos nucleicos

Esta invención contempla el uso de ácido nucleico aislado o fragmentos aislados, por ejemplo, que codifican estas proteínas o proteínas íntimamente relacionadas, o fragmentos de las mismas, por ejemplo, para codificar un polipéptido correspondiente, preferiblemente uno que sea biológicamente activo. Adicionalmente, esta invención incluye ADN aislado o recombinante que codifica tales proteínas o polipéptidos que tienen secuencias características de los DTLR respectivos, individualmente o como grupo. Típicamente, el ácido nucleico es capaz de hibridarse, en condiciones apropiadas, con un segmento de secuencia de ácido nucleico mostrado en SEC ID Nº: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 ó 33, pero preferiblemente no con un segmento correspondiente de SEC ID Nº: 1. Dicha proteína o dicho polipéptido biológicamente activos pueden ser una proteína de longitud completa o un fragmento, y típicamente tendrán un segmento de secuencia de aminoácidos altamente homólogo con uno mostrado en SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34. Además, esta invención incluye el uso de ácido nucleico aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, que codifican proteínas que tienen fragmentos que son equivalentes a las proteínas de DTLR2-10. Los ácidos nucleicos aislados pueden tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición poli-A y otras del gen natural.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN o un ADN o un polímero mixto, que es sustancialmente puro, por ejemplo, que está separado de otros componentes que acompañan de forma natural a una secuencia nativa, tales como ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas flanqueantes de las especies de origen. El término comprende una secuencia de ácido nucleico que se ha retirado de su entorno de origen natural e incluye aislados de ADN recombinante o clonado que se pueden distinguir, de esa manera, de las composiciones de origen natural y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente mediante sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula, ya sea completamente o sustancialmente puras.

Un ácido nucleico aislado generalmente será una composición homogénea de moléculas, pero en algunas realizaciones, contendrá heterogeneidad, preferiblemente de poca importancia. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o en porciones no críticas para una función o actividad biológicas deseada.

Un ácido nucleico "recombinante" se define típicamente ya sea mediante su método de producción o por su estructura. En referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto elaborado mediante un proceso, el proceso es el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos. Típicamente esta intervención implica la manipulación in vitro, aunque bajo ciertas circunstancias puede implicar técnicas de reproducción animal más clásicas. Como alternativa, puede ser un ácido nucleico elaborado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son contiguos de forma natural, pero tiene por objeto excluir productos de la naturaleza, por ejemplo, los mutantes de origen natural como se encuentran en su estado natural. Por tanto, por ejemplo, se abarcan los productos elaborados transformando células con cualquier vector de origen no natural, como lo están los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia obtenida usando cualquier proceso de oligonucleótido sintético. Dicho proceso con frecuencia se realiza para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, mientras se introduce o retira típicamente un sitio de reconocimiento de secuencia de enzima de restricción. Como alternativa, el proceso se realiza para unir entre sí segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una sola entidad genética que comprenda una combinación deseada de funciones que no se encuentra en las formas naturales disponibles comúnmente, por ejemplo, que codifique una proteína de fusión. Los sitios de reconocimiento de enzima de restricción con frecuencia son la diana de tales manipulaciones artificiales, pero se pueden incorporar mediante diseño otras dianas específicas de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control u otros elementos útiles. Un concepto similar está destinado a un polipéptido recombinante, por ejemplo, de fusión. Este incluirá una repetición dimérica. Están incluidos específicamente los ácidos nucleicos sintéticos que, por redundancia del código genético, codifican polipéptidos equivalentes a fragmentos de DTLR2-10 y fusiones de secuencias de diversas moléculas relacionadas diferentes, por ejemplo, otros miembros de la familia de receptores de IL-1.

Un "fragmento" en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, por lo general al menos 21 nucleótidos, más en general, al menos 25 nucleótidos, por lo común al menos 30 nucleótidos, más por lo común al menos 35 nucleótidos, con frecuencia al menos 39 nucleótidos, con mayor frecuencia al menos 45 nucleótidos, típicamente al menos 50 nucleótidos, más típicamente al menos 55 nucleótidos, habitualmente al menos 60 nucleótidos, más habitualmente al menos 66 nucleótidos, preferiblemente al menos 72 nucleótidos, más preferiblemente, al menos 79 nucleótidos y en las realizaciones particularmente preferidas habrá al menos 85 o más nucleótidos. Típicamente se pueden comparar fragmentos de secuencias genéticas diferentes entre sí en tramos de longitud apropiada, particularmente segmentos definidos tales como los dominios descritos más adelante.

Un ácido nucleico que codifica un DTLR2-10 será particularmente útil para identificar genes, especies de ARNm y ADNc que se codifican a sí mismos o codifican proteínas íntimamente relacionadas, así como los ADN que codifican variantes genéticas polimórficas, alélicas u otras variantes, por ejemplo, de diferentes individuos o de especies relacionadas. Las sondas preferidas para tales selecciones son las regiones de la interleuquina que son conservadas entre variantes polimórficas diferentes o que contienen nucleótidos que carecen de especificidad y, preferiblemente, serán de longitud completa o casi completa. En otras situaciones, serán más útiles las secuencias específicas de variante polimórfica.

Adicionalmente se describen moléculas de ácido nucleico recombinante y fragmentos que tienen una secuencia de ácido nucleico idéntica a, o altamente homóloga con el ADN aislado expuesto en este documento. En particular, las secuencias con frecuencia estarán unidas operativamente a segmentos de ADN que controlan la transcripción, la traducción y la replicación de ADN. Estos segmentos adicionales ayudan típicamente a la expresión del segmento deseado de ácido nucleico.

Las secuencias de ácido nucleico homólogas o altamente idénticas, cuando se comparan entre sí o las secuencias mostradas en SEC ID Nº: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 ó 33, muestran similitud significativa. Las normas para la homología en los ácidos nucleicos son medidas para homología usadas generalmente en la técnica mediante comparación de secuencia o las que se basan en las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación comparativas se describen con mayor detalle más adelante.

La identidad sustancial en el contexto de la comparación de secuencia de ácido nucleico se refiere a que los segmentos o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando están óptimamente alineados, con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 60% de los nucleótidos, generalmente al menos el 66%, por lo común al menos el 71%, con frecuencia al menos el 76%, con mayor frecuencia al menos el 80%, habitualmente al menos el 84%, más habitualmente al menos el 88%, típicamente al menos el 91%, más típicamente al menos aproximadamente el 93%, preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente del 96 al 98% o más y, en realizaciones particulares, tan alta como aproximadamente el 99% o más de los nucleótidos, incluyendo, por ejemplo, los segmentos que codifican dominios estructurales, tales como los segmentos descritos más adelante. Como alternativa, existirá identidad sustancial cuando los segmentos se hibridarán en condiciones de hibridación selectiva, a una hebra o a su complemento, utilizando típicamente secuencias obtenidas de SEC ID Nº: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 ó 33. Típicamente, ocurrirá hibridación selectiva cuando exista al menos aproximadamente el 55% de homología en un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente el 65%, preferiblemente al menos aproximadamente el 75% y, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%. Véase Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res., 12: 203-213. La longitud de la comparación de homología, como se ha descrito, puede ser en tramos más largos y, en ciertas realizaciones será sobre un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, en general al menos aproximadamente 20 nucleótidos, por lo común al menos aproximadamente 24 nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos y más preferiblemente al menos aproximadamente de 75 a 100 o más nucleótidos.

Las condiciones rigurosas, con referencia a la homología en el contexto de hibridación, serán condiciones combinadas rigurosas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros típicamente controlados en las reacciones de hibridación. Habitualmente las condiciones rigurosas de temperatura incluirán temperaturas de más de aproximadamente 30ºC, más habitualmente superiores a aproximadamente 37ºC, típicamente más de aproximadamente 45ºC, más típicamente de más de aproximadamente 55ºC, preferiblemente de más de aproximadamente 65ºC y, más preferiblemente de más de aproximadamente 70ºC. Las condiciones rigurosas de sal por lo común serán menos de aproximadamente 500 mM, habitualmente menos de aproximadamente 400 mM, más habitualmente menos de aproximadamente 300 mM, típicamente menos de aproximadamente 200 mM, preferiblemente menos de aproximadamente 100 mM y, más preferiblemente menos de aproximadamente 80 mM, incluso menos de aproximadamente 20 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro único. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968), J. Mol. Biol., 31: 349-370.

Como alternativa, para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, se introducen las secuencias de ensayo y referencia en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, según sea necesario, y se designan los parámetros para el programa de algoritmo de secuencia. Después, el algoritmo de comparación de secuencia calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o las secuencias de ensayo con relación a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados.

Se puede realizar el alineamiento óptico de las secuencias que se van a comparar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), Adv. Appl. Nath., 2: 482, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needlman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol., 58: 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, EE.UU.) o mediante inspección visual (véase en general Ausubel et al., anteriormente).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos progresivos en pares, para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de la secuencia. También representa un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupación usadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (1987), J. Mol. Evol., 35: 351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS, 5: 151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una con una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, lo que produce un grupo de dos secuencias alineadas. Después, este grupo se alinea con la siguiente secuencia o grupo más relacionado de secuencias alineadas. Se alinean dos grupos de secuencias mediante una extensión simple del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se consigue mediante una serie de alineamientos progresivos por pares. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia, y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, se puede comparar una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relación de identidad de la secuencia, utilizando los siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) e huecos finales
pesados.

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe por Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol., 215: 403-410. El programa para realizar los análisis de BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar los pares de secuencia de puntuación alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que coincidan con, o satisfagan alguna puntuación T de umbral de valor positivo cuando se las alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se denomina T al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., anteriormente). Estos aciertos en la palabra vecina iniciales actúan como simientes para iniciar búsquedas y encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo decae en una cantidad X de su valor máximo obtenido; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo con puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11; la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89: 10915) alineamientos (B) de 50, expectación (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas hebras.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también efectúa un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad total (P(N)), que proporciona un indicio de la probabilidad de que ocurra aleatoriamente una coincidencia entre dos secuencias de nucleótido o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad total en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01 y lo más preferible es que sea menor que aproximadamente 0,001.

Un indicio adicional de que dos secuencias de ácido nucleico de polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene reactividad cruzada inmunológicamente con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describe más adelante. Por tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente en sustituciones conservativas. Otro indicio de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan mutuamente en condiciones rigurosas, tal como se describe más
adelante.

El ADN aislado se puede modificar fácilmente mediante sustituciones de nucleótido, supresiones de nucleótido, inserciones de nucleótido e inversiones de tramos de nucleótido. Estas modificaciones dan como resultado secuencias novedosas de ADN que codifican esta proteína o sus derivados. Se puede usar estas secuencias modificadas para producir proteínas mutantes (muteínas) o para mejorar la expresión de especies variantes. La expresión mejorada puede implicar la amplificación del gen, transcripción aumentada, traducción aumentada y otros mecanismos. Tales derivados similares a DTLR mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio, de la proteína o de sus fragmentos, incluyendo mutaciones silentes que utilizan la degeneración del código genético. "DTLR mutante", como se usa en este documento, abarca un polipéptido que, por lo demás, está dentro de la definición de homología del DTLR como se ha expuesto anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de otras proteínas similares a DTLR que se encuentran en la naturaleza, ya sea por medio de supresión, sustitución o inserción. En particular, "DTLR mutante específico de sitio" abarca una proteína que tiene homología sustancial con una proteína de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34 y comparte típicamente la mayoría de las actividades o efectos biológicos de las formas descritas en este documento.

Aunque los sitios de mutación específica de sitio están predeterminados, no necesariamente los mutantes deben ser específicos de sitio. Se puede conseguir mutagénesis de DTLR de mamífero realizando inserciones o supresiones de aminoácidos en el gen, acopladas con expresión. Las sustituciones, las supresiones, las inserciones o cualquiera de las combinaciones, se pueden generar para obtener una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxi-terminales. Se puede conducir mutagénesis aleatoria en un codón diana y después los mutantes de DTLR de mamífero expresados se pueden seleccionar en cuanto a la actividad deseada. Los métodos para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados de ADN que tiene una secuencia conocida, son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante mutagénesis con cebador M13. Véase también Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1987 y los suplementos periódicos).

Las mutaciones en el ADN normalmente no deben colocar secuencias codificantes fuera de las fases de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que pudieran hibridarse para producir una estructura de ARNm secundaria, tal como bucles u horquillas.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts., 22: 1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. Con frecuencia se obtendrá un fragmento bicatenario ya sea sintetizando la hebra complementaria e hibridando la hebra entre sí en condiciones apropiadas o bien añadiendo la hebra complementaria mediante el uso de ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

Las técnicas de reacción de cadena de la polimerasa (PCR) con frecuencia se pueden aplicar en la mutagénesis. Como alternativa, los cebadores de mutagénesis son métodos usados comúnmente para generar mutaciones definidas en sitios predeterminados. Véase, por ejemplo, Innis et al. (eds. 1990), PCR Protocols: A guite to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA; y Dieffenbach y Dveksler (1995; eds) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.

IV. Proteínas, Péptidos

Anteriormente se ha descrito DTLR2-10 de primate, por ejemplo, aquellos cuyas secuencias se describen en SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34. También se contemplan las variantes alélicas y otras, incluyendo, por ejemplo, las porciones de combinación de proteínas de fusión de tales secuencias con otras, incluyendo, marcadores de epítopo y dominios funcionales.

También se describen proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas, que utilizan segmentos procedentes de estas proteínas de roedor. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no están fusionados normalmente de la misma manera. Por tanto, el producto de fusión de un DTLR con un receptor de IL-1 es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, hecha típicamente como un producto de traducción único y que muestra propiedades, por ejemplo, secuencia o antigenicidad, derivadas de cada péptido de fuente. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Adicionalmente, se pueden elaborar nuevas construcciones a partir de la combinación de dominios funcionales o estructurales similares procedentes de otras proteínas relacionadas, por ejemplo, receptores de IL-1 u otros DTLR, incluyendo las variantes de especie. Por ejemplo, la unión a ligando u otros segmentos se puede "intercambiar" entre diferentes polipéptidos de fusión o fragmentos nuevos. Véase, por ejemplo, Cunningham et al. (1989) Science, 243: 130-1336; y O'Dowd et al. (1988), J. Biol. Chem., 263: 15985-15992. Por tanto, los nuevos polipéptidos quiméricos que muestran combinaciones nuevas de especificidades serán el resultado del enlace funcional de especificidades de unión a receptor. Por ejemplo, los dominios de unión a ligando de otras moléculas receptoras relacionadas se pueden añadir o sustituir por otros dominios de ésta o de proteínas relacionadas. La proteína resultante con frecuencia tendrá función y propiedades híbridas. Por ejemplo, una proteína de fusión puede incluir un dominio de dirección, que puede servir para proporcionar el secuestro de la proteína de fusión a un organelo subcelular particular.

Los compañeros y secuencias de fusión candidatos se pueden seleccionar a partir de diversas bases de datos de secuencia, por ejemplo, GenBank, a/c IntelliGenetics, Mountain View, CA, EE.UU.; y BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI.

También se describen muteínas que se unen a los ligandos Toll y/o que se afectan en la transducción de señal. El alineamiento estructural de DTLR1-10 humanos con otros miembros de la familia IL-1, muestra elementos/residuos conservados. Véase, por ejemplo, la Figura 3A. El alineamiento de las secuencias de DTLR humano con otros miembros de la familia IL-1 indica diversos elementos estructurales y de funcionalidad compartidos. Véase también, Bazan et al. (1996), Nature 379: 591; Lodi et al. (1994), Science, 263: 1762-1766; Sayle y Milner-White (1995) TIBS, 20: 374-376; y Gronenberg et al. (1991) Protein Engineering, 4: 263-269.

Los ligandos IL-1\alpha e XL-1\beta se unen a un receptor IL-1 de tipo I como el receptor primario y después este complejo forma un complejo receptor de afinidad alta con el receptor IL-1 de tipo III. Tales subunidades receptoras probablemente se comparten con los nuevos miembros de la familia IL-1.

Variaciones similares en otros homólogos de especie de las secuencias de DTLR2-10, por ejemplo, en las regiones correspondientes, deben proporcionar interacciones similares con ligando o sustrato. Las sustituciones ya sea con secuencias de ratón o con secuencias humanas, son particularmente preferidas. Inversamente, las sustituciones conservativas lejos de las regiones de interacción de unión a ligando probablemente preserven la mayoría de las actividades de señalización.

Los "derivados" del DTLR2-10 de primate incluyen mutantes de la secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación, derivados metabólicos y conjugados covalentes o de agregación con otros restos químicos. Se pueden preparar derivados covalentes enlazando las funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de aminoácido de DTLR o en los extremos N o C, por ejemplo, por medios que son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas alifáticos del extremo carboxilo o de residuos que contienen cadenas laterales carboxílicas, derivados O-acilo de residuos que contienen el grupo hidroxilo y derivados N-acílicos del aminoácido del terminal amino, o residuos que contienen grupo amino, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan entre el grupo de restos alquilo que incluyen alquilo normal de C3 a C18, formando de esa manera especies acanoil aroílo.

En particular, están incluidas las alteraciones por glicosilación, por ejemplo, realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento posteriores. Los medios particularmente preferidos para conseguir esto son mediante exposición del polipéptido a enzimas de glicosilación obtenidas de células que normalmente proporcionan tal procesamiento, por ejemplo, enzimas de glicosilación de mamífero. También se contemplan las enzimas de desglicosilación. Están incluidas también las versiones de la misma secuencia de aminoácido primaria que tengan otras modificaciones menores, incluyendo los residuos de aminoácido fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

Un grupo principal de derivados son conjugados covalentes de los receptores o fragmentos de los mismos con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados se pueden sintetizar en cultivo recombinante tal como fusiones N- o C-terminales o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en el entrecruzamiento de proteínas por medio de grupos reactivos laterales. Los sitios de formación de derivados preferidos con agentes de entrecruzamiento están en los grupos amino libres, los restos de carbohidrato y los residuos de cisteína.

También se proporcionan polipéptidos de fusión entre los receptores y otras proteínas homólogas o heterólogas. Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre receptores diferentes, lo que da como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida que muestra especificidad para múltiples ligandos de Toll diferentes, o un receptor que puede tener efecto de especificidad ampliada o debilitada del sustrato. Análogamente, se pueden construir fusiones heterólogas que mostrarían una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Son ejemplos típicos las fusiones de un polipéptido informador, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de un receptor, por ejemplo, un segmento de unión a ligando, de manera que se pueda determinar fácilmente la presencia o emplazamiento de un ligando deseado. Véase, por ejemplo, Dull et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.859.609, que se incorpora por el presente como referencia en este documento. Otros compañeros de fusión de gen incluyen: glutation-S-transferasa (GST), \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, \beta-lactamasa, alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa y el factor de acoplamiento alfa de levadura. Véase, por ejemplo, Godowski et al. (1988), Science, 241: 812-816.

El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981), Tetra. Letts., 22: 1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. Con frecuencia se obtendrá un fragmento bicatenario ya sea sintetizando la hebra complementaria e hibridando las hebras entre sí en condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria mediante el uso de ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada.

Tales polipéptidos también pueden tener residuos de aminoácido que se han modificado químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación o mediante la adición o eliminación de otros restos, en particular los que tengan formas moleculares similares a grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos marcadores útiles o servirán como dianas de purificación, por ejemplo, ligandos de afinidad.

Las proteínas de fusión típicamente se elaborarán mediante métodos de ácido nucleico recombinante o por métodos de polipéptido sintético. Las técnicas para la manipulación y la expresión de ácido nucleico se describen en general, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición), volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; y en Ausubel et al. (eds., 1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York, cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia. Las técnicas para la síntesis de los polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield (1963), J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-2156; Merrifield (1986), Science 232: 341-347; y Atherton et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra; cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia. Véase también Dawson et al. (1994), Science, 266: 776-779, para métodos para preparar polipéptidos más grandes.

También se contempla el uso de los derivados de un DTLR2-10 diferentes a las variaciones en las secuencias de aminoácido o a la glicosilación. Tales derivados pueden implicar la asociación covalente o por agregación con restos químicos. Estos derivados generalmente están dentro de tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes en residuo de cadena lateral y terminal y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas celulares. Tales derivados covalentes o de agregación son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoanálisis o en métodos de purificación, tales como purificación por afinidad de un receptor u otra molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo. Por ejemplo, se puede inmovilizar un ligando de Toll mediante unión covalente a un soporte sólido, tal como Sefarosa activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en la técnica; o mediante adsorción sobre superficies de poliolefina, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para uso en el ensayo o la purificación de un receptor de DTLR, anticuerpos u otras moléculas similares. También se puede marcar el ligando con un grupo detectable, por ejemplo, radioyodado mediante el procedimiento de cloramina T, unido covalentemente a quelatos de tierras raras o conjugado a otro resto fluorescente para uso en ensayos de diagnóstico.

Se puede usar un DTLR de esta invención como un inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos, por ejemplo, capaces de distinguir entre otros miembros de la familia del receptor de IL-1, para los DTLR o diversos fragmentos de los mismos. Se puede usar el DTLR purificado para seleccionar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno preparados mediante inmunización con diversas formas de preparaciones impuras que contienen la proteína. En particular, el término "anticuerpos" comprende también los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos naturales, por ejemplo, Fab, Fab2, Fv, etc. También se puede usar el DTLR purificado como reactivo para detectar los anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles de expresión elevados o trastornos inmunes que conducen a la producción del anticuerpo para el receptor endógeno. Adicionalmente, los fragmentos de DTLR también pueden servir como inmunógenos para producir los anticuerpos de la presente invención, tal como se describe inmediatamente más adelante. Por ejemplo, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión a, o que se generan frente a las secuencias de aminoácido mostradas en SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34, fragmentos de los mismos o diversos péptidos homólogos. En particular, se contemplan anticuerpos que tienen afinidad de unión para, o que se han generado frente a fragmentos específicos que se pronostica que estarán, o que realmente están, expuestos en la superficie exterior de proteína del DTLR nativo.

El bloqueo de la respuesta fisiológica a los ligandos de receptor puede ser el resultado de la inhibición de la unión del ligando al receptor, probablemente a través de inhibición competitiva. Por tanto, los ensayos in vitro con frecuencia usarán anticuerpos o segmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos, o fragmentos fijados a sustratos de fase sólida. Estos ensayos también permitirán la determinación de diagnóstico de los efectos de mutaciones o modificaciones de la región de unión a ligando, o bien de otras mutaciones y modificaciones, por ejemplo, que influyan sobre la función de señalización o enzimática.

También se contempla el uso de ensayos de selección de fármaco competitivos, por ejemplo, donde los anticuerpos neutralizantes para el receptor o los fragmentos compiten con un compuesto de ensayo para unirse a un ligando o a otro anticuerpo. De esa manera, se pueden usar los anticuerpos o fragmentos neutralizantes para detectar la presencia de un polipéptido que comparta uno o más sitios de unión a un receptor y también se puede usar para ocupar sitios de unión en un receptor que, de otra manera, se pueda unir a un ligando.

V. Preparación de ácidos nucleicos y proteínas

Se puede obtener el ADN que codifica la proteína o los fragmentos de la misma mediante síntesis química, selección en bibliotecas de ADNc o mediante selección en bibliotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas de células o muestras de tejido. Se pueden aislar las secuencias naturales usando métodos convencionales y las secuencias proporcionadas en este documento. Se pueden identificar otros homólogos de especie mediante técnicas de hibridación o mediante diversas técnicas de PCR, combinadas con o mediante búsquedas en bases de datos de secuencias, por ejemplo, GenBank.

Este ADN se puede expresar en una amplia variedad de células hospedadoras para la síntesis de un receptor de longitud completa o fragmentos del mismo que, a su vez, por ejemplo, se pueden usar para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para construcción y expresión de dominios de unión a ligando o de quinasa/fosfatasa modificados; y para estudios de estructura/función. Se pueden expresar variantes o fragmentos en células hospedadoras que están transformadas o transfectadas con vectores de expresión apropiados. Estas moléculas pueden estar sustancialmente libres de proteínas o de contaminantes celulares, diferentes a los obtenidos del hospedador recombinante y, por lo tanto, son particularmente útiles en las composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se puede expresar la proteína, o porciones de la misma, como fusiones con otras proteínas.

Los vectores de expresión típicamente son construcciones de ADN o de ARN típicamente de autorreplicación, que contienen el gen de receptor deseado o sus fragmentos, habitualmente unidos operativamente a elementos de control genético adecuados que se reconocen en una célula hospedadora adecuada. Estos elementos de control son capaces de lograr la expresión dentro de un hospedador adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para lograr la expresión dependerá de la célula hospedadora final usada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema de promotor procariota o un sistema de control de expresión de promotor eucariota e incluirán típicamente un promotor de transcripción, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción; potenciadores de transcripción para elevar el nivel de expresión de ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión a ribosoma adecuado y secuencias que terminen la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión también contienen habitualmente un origen de replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula hospedadora.

Los vectores de esta invención incluyen aquellos que contienen ADN que codifica una proteína, como se ha descrito o un fragmento del mismo que codifica un polipéptido equivalente biológicamente activo. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla adicionalmente el uso de tales vectores de expresión que son capaces de expresar ADNc eucariota que codifica una proteína de este tipo en un hospedador procariota o eucariota, donde el vector es compatible con el hospedador y donde el ADNc eucariota que codifica el receptor está insertado en el vector de manera que el crecimiento del hospedador que contiene el vector exprese el ADNc en cuestión. Habitualmente, los vectores de expresión se diseñan para replicación estable en sus células hospedadoras o para la amplificación para aumentar en gran medida el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario el requisito de que un vector de expresión se replique en una célula hospedadora; por ejemplo, es posible lograr la expresión transitoria de la proteína o de sus fragmentos en diversos hospedadores utilizando vectores que no contengan un origen de replicación que se reconozca por la célula hospedadora. También es posible usar vectores que provoquen la integración de la porción codificadora de proteína o sus fragmentos en el ADN hospedador mediante recombinación.

Los vectores, como se usa en este documento, comprenden: plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos que posibilitan la integración de los fragmentos de ADN en el genoma del hospedador. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que efectúan la expresión de genes unidos operativamente. Los plásmidos son la forma más comúnmente usada de vector pero todas las demás formas de vectores que cumplen una función equivalente y que se conozcan en la técnica o que lleguen a serlo, son adecuadas para uso en este documento. Véase, por ejemplo, Pouwels et al. (1985 y suplementos), Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y., EE.UU., y Rodríguez et al. (eds), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, 1988, los cuales se incorporan en este documento como referencia.

Las células transformadas son células, preferiblemente de mamífero, que se han transformado o transfectado con vectores receptores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Habitualmente las células hospedadoras transformadas expresan la proteína deseada o sus fragmentos, pero para propósitos de clonación, amplificación y manipulación de su ADN no necesitan expresar la proteína objeto. Esta invención contempla adicionalmente cultivar células transformadas en un medio nutriente, permitiendo de ese modo que el receptor se acumule en la membrana celular. Se puede recuperar la proteína ya sea del cultivo o, en determinados casos, del medio de cultivo.

Para los propósitos de esta invención, las secuencias nucleicas están unidas operativamente cuando están relacionadas funcionalmente unas con otras. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder de secreción está unido operativamente a un polipéptido si se expresa como una preproteína o participa en la dirección del polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el mismo controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si el mismo colocado para permitir la traducción. Habitualmente, unido operativamente significa contiguo y en fase de lectura, sin embargo, determinados elementos genéticos tales como genes represores no están enlazados contiguamente pero se unen a secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión.

Las células hospedadoras adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Los procariotas incluyen tanto organismos gram negativos como gram positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Los eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los eucariotas superiores incluyen líneas establecidas de células de cultivo de tejido procedentes de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insectos y de aves, como de origen mamífero, por ejemplo, seres humanos, primates y roedores.

Los sistemas hospedador-vector procariotas incluyen una amplia variedad de vectores de muchas especies diferentes. Como se usa en este documento, E. coli y sus vectores se usarán genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden usar para expresar el receptor o sus fragmentos incluyen, pero sin limitación, vectores tales como los que contienen el promotor lac (serie pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp (la serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos, tales como ptac (pDR540). Véase Brosius et al. (1988): Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac- and Ipp-derived Promotors, en Vectors: A survey of Molecular Clonning Vectors and Their Uses, (eds. Rodríguez y Denhardt), Buttersworth, Boston, EE.UU., Capítulo 10, páginas 205-236.

Los eucariotas inferiores, por ejemplo, las levaduras y Dictyostelium se pueden transformar con vectores que contengan la secuencia de DTLR. Para los propósitos de esta invención, el hospedador eucariota inferior más común es la levadura del pan Saccharomyces cerevisiae. La misma se usará para representar genéricamente los eucariotas inferiores, aunque también están disponibles varias de otras cepas y especies. Los vectores de levadura consisten típicamente en un origen de replicación (menos del tipo integrador), un gen de selección, un promotor, ADN que codifica el receptor o sus fragmentos y las secuencias para terminación de traducción, poliadenilación y terminación de transcripción. Los vectores de expresión adecuados para la levadura incluyen promotores constitutivos tales como 3-fosfoglicerato quinasa y otros diversos promotores de gen de enzima glicolítica o promotores inducibles tales como el promotor de alcohol deshidrogenada 2 o el promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen los derivados de los siguientes tipos: número bajo de copia de auto-replicación (tales como las series YRp), número alto de copia de auto-replicación (tales como la serie YEp), tipos integradores (tales como la serie YIp) o minicromosomas (tales como la serie YCp).

Las células de cultivo de tejido eucariotas superiores normalmente son las células hospedadoras preferidas para la expresión de la proteína interleuquina funcionalmente activa. En principio, se puede trabajar cualquier línea de célula de cultivo de tejido eucariota superior, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus en insecto, ya sea de fuente invertebrada o vertebrada. Sin embargo, se prefieren las células de mamífero. La transformación o transfección y la propagación de tales células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas de células útiles incluyen las células HeLa, las líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), las líneas de células de riñón de rata joven (BRK), las líneas de células de insectos, las líneas de células de ave y las líneas de células de mono (COS). Los vectores expresión para tales líneas de células habitualmente incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de inicio de traducción, sitios de empalme de ARN (si se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de transcripción. Estos vectores también contienen habitualmente un gen de selección o un gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que porten promotores obtenidos, por ejemplo, a partir de fuentes tales como de adenovirus, SV40, parvovirus, virus vaccinia o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen: pCDNA1; pCD, véase Okayama et al. (1985) Mol. Cell Biol., 5: 1136-1142; Poli A de pMC1neo, véase Thomas et al. (1987), Cell, 51: 503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610.

Para proteínas secretadas, una fase de lectura abierta habitualmente codifica un polipéptido que consiste en un producto maduro o secretado enlazado covalentemente en su extremo N a un péptido señal. El péptido señal se escinde antes de la secreción del polipéptido maduro o activo. Se puede predecir el sitio de escisión con un grado elevado de precisión a partir de reglas empíricas, por ejemplo, von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 15: 4683-4690, y la composición precisa de aminoácidos del péptido señal no parece ser crítica para su función; por ejemplo, Randall et al. (1989), Science, 243: 1156-1159; Kaiser et al. (1987) Science, 235: 312-317.

Con frecuencia será conveniente expresar estos polipéptidos en un sistema que proporcione un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso el patrón habitual será el proporcionado naturalmente por el sistema de expresión. Sin embargo el patrón será modificable exponiendo el polipéptido, por ejemplo, una forma no glicosilada, a proteínas de glicosilación apropiadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, se puede cotransformar el gen receptor con uno o más genes que codifican enzimas de mamífero u otras enzimas de glicosilación. Utilizando este enfoque, se podrán obtener ciertos patrones de glicosilación de mamífero en procariotas u otras células.

La fuente de DTLR puede ser un hospedador eucariota o procariota que exprese DTLR recombinante, tal como se ha descrito anteriormente. La fuente puede ser también una línea de células, tal como fibroblastos de ratón Swiss 3T3, pero también se contemplan en esta invención otras líneas de células de mamíferos, siendo la línea de células preferida de la especie humana.

Ahora que se conocen las secuencias, se pueden preparar los DTLR de primate, fragmentos o derivados de los mismos, mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos como los descritos en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, EE.UU.; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York, EE.UU.; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; todos los cuales se incorporan en este documento como referencia. Por ejemplo, se puede usar un proceso de azida, un proceso de cloruro de ácido, un proceso de anhídrido de ácido, un proceso de anhídrido mixto, un proceso de éster activo (por ejemplo, p-nitrofenil éster, N-hidroxisuccinimida éster o cianometil éster), un proceso de carbodiimidazol, un proceso de oxidación-reducción o un proceso de diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Son aplicables para los procedimientos precedentes las síntesis en fase sólida y en fase de solución. Se pueden utilizar técnicas similares con secuencias de DTLR parciales.

Las proteínas, fragmentos o derivados de DTLR se preparan adecuadamente de acuerdo con los procesos anteriores como se emplean típicamente en la síntesis de péptidos, generalmente ya sea mediante un denominado proceso por etapas, que comprende condensar un aminoácido al aminoácido terminal, uno por uno en secuencia o acoplando fragmentos de péptido al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se usan en la reacción de acoplamiento típicamente se deben proteger para evitar el acoplamiento en un sitio incorrecto.

Si se adopta una síntesis en fase sólida, el aminoácido C-terminal se une a un vehículo o soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El vehículo insoluble no está limitado particularmente, siempre y cuando tenga una capacidad para unirse a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de tales vehículos insolubles incluyen las resinas de halometilo, tales como la resina de clorometilo o la resina de bromometilo, las resinas de hidroximetilo, las resinas de fenol, las resinas terc-alquiloxicarbonilhidrazidadas y similares.

Un aminoácido protegido en el grupo amino se une en secuencia a través de condensación de su grupo carboxilo activado y el grupo amino reactivo del péptido o la cadena formados previamente, para sintetizar el péptido etapa por etapa. Después de sintetizar la secuencia completa, se desprende el péptido del vehículo insoluble para producir el péptido. Este enfoque de fase sólida se describe en general por Merrifield et al. (1963) en J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156, que se incorpora en este documento como referencia.

La proteína preparada y fragmentos de la misma se pueden aislar y purificar a partir de la mezcla de reacción por medio de separación de péptidos, por ejemplo, mediante extracción, precipitación, electroforesis, diversas formas de cromatografía y similares. Se pueden obtener los receptores de esta invención en grados variables de pureza dependiendo de los usos deseados. La purificación se puede conseguir mediante el uso de técnicas de purificación de proteína descritas en este documento, véase más adelante, o mediante el uso de anticuerpos descritos en este documento en métodos de cromatografía por afinidad inmunoabsorbente. Esta cromatografía por afinidad inmunoabsorbente se realiza enlazando en primer lugar los anticuerpos a un soporte sólido y después poniendo en contacto los anticuerpos enlazados con lisados solubilizados de células apropiadas, lisados de otras células que expresen el receptor o lisados o sobrenadantes de células que produzcan la proteína como resultado de técnicas de ADN, véase más adelante.

En general, la proteína purificada tendrá una pureza de al menos aproximadamente el 40%, por lo común al menos aproximadamente el 50%, habitualmente al menos aproximadamente el 60%, típicamente al menos aproximadamente el 70%, más típicamente al menos aproximadamente el 80%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% y, en realizaciones particulares, una pureza del 97% al 99% o más. La pureza habitualmente será en una base en peso, pero también puede ser en una base molar. Se aplicarán ensayos diferentes según sea apropiado.

VI. Anticuerpos

Se pueden generar anticuerpos para las diversas proteínas de DTLR de mamífero, por ejemplo, de primate y fragmentos de las mismas, tanto en formas nativas de origen natural como en sus formas recombinantes, siendo la diferencia que los anticuerpos para el receptor activo son más susceptibles de reconocer los epítopos que están presentes únicamente en las conformaciones nativas. También puede ser útil la detección de antígeno desnaturalizado, por ejemplo, en el análisis de Western. También se contemplan los anticuerpos anti-idiotípicos, que serían útiles como agonistas o antagonistas de un receptor natural o de un anticuerpo.

Los anticuerpos, que incluyen los fragmentos de unión y las versiones de cadena única, frente a fragmentos predeterminados de la proteína se pueden generar mediante inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunógenas. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden seleccionar en cuanto a su unión a una proteína normal o defectuosa, o seleccionarse por su actividad agonista o antagonista. Estos anticuerpos monoclonales habitualmente se unirán con al menos una K_{D} de aproximadamente 1 mM, más habitualmente al menos aproximadamente de 300 \muM, típicamente al menos aproximadamente de 100 \muM, más típicamente al menos aproximadamente de 30 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente de 10 \muM y más preferiblemente al menos aproximadamente de 3 \muM o mejor.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión a antígeno, de esta invención pueden tener valor significativo de diagnóstico o terapéutico. Estos pueden ser antagonistas potentes que se unen al receptor e inhiben la unión a ligando o inhiben la capacidad del receptor de provocar una respuesta biológica, por ejemplo, actuar sobre su sustrato. Estos también pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y se pueden acoplar a toxinas o radionúclidos para unirse a células productoras o células localizadas en la fuente de la interleuquina. Adicionalmente, se pueden conjugar estos anticuerpos a fármacos u otros agentes terapéuticos, ya sea directa o indirectamente, por medio de un
enlazador.

Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, estos podrían unirse al receptor sin inhibir la unión a ligando o al sustrato. Como anticuerpos neutralizantes, estos pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También serán útiles para detectar o cuantificar el ligando. Se pueden usar como reactivos para análisis de transferencia de Western o para inmunoprecipitación o inmunopurificación de la proteína respectiva.

Se pueden unir fragmentos de proteína a otros materiales, en particular polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente, para usarse como inmunógenos. DTLR de mamífero y sus fragmentos se pueden fusionar o enlazar covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como la hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero bovino, toxoide del tétanos, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, Nueva York, EE.UU.; y Williams et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, volumen 1, Academic Press, Nueva York, EE.UU.; cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia, para descripciones de los métodos para preparar antisueros policlonales. Un método típico implica la hiperinmunización de un animal con un antígeno. Después se recoge la sangre del animal poco después de las inmunizaciones repetidas y se aísla la gamma-globulina.

En algunos casos, es conveniente preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se puede encontrar, por ejemplo, en Stites et al. (eds) Basic and Clinical Immunology (4ª edición), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, EE.UU., y las referencias citadas en el mismo; Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª edición) Academic Press, Nueva York, EE.UU.; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature, 256: 495-497, que describe un método para generar anticuerpos monoclonales. Cada una de estas referencias se incorpora en este documento como referencia. En pocas palabras, este método implica inyectar a un animal un inmunógeno. Después se sacrifica el animal y se recogen las células del bazo, que se fusionan después con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. Se selecciona después la población de hibridomas para aislar los clones individuales, cada uno de los cuales secreta una especie de anticuerpo única para el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpo individual obtenidas son los productos de células B únicas inmortalizadas y clonadas procedentes del animal inmune, generadas en respuesta a un sitio específico reconocido en la sustancia inmunógena.

Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o, como alternativa, a la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase Huse et al. (1989), Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, en Science, 246: 1275-1281; y Ward et al. (1989), Nature 341: 554: 546, cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo los anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y los anticuerpos se marcarán mediante unión, ya sea covalente o no covalentemente, con una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de etiquetas y de técnicas de conjugación y se presentan exhaustivamente tanto en la literatura científica como en la de patentes. Las etiquetas adecuadas incluyen: radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que describen el uso de dichas etiquetas incluyen las Patentes de Estados Unidos Nº 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 y 4.366.241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes o quiméricas, véase Cabilly, Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; o se las puede preparar en ratones transgénicos, véase Méndez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156. Estas referencias se incorporan en este documento como referencia.

Los anticuerpos de esta invención también se pueden usar para cromatografía por afinidad en el aislamiento de los DTLR. Se pueden preparar las columnas donde los anticuerpos se enlazan a un soporte sólido, por ejemplo, partículas, tales como agarosa, Sephadex o similares, donde un lisado de células se puede pasar a través de la columna, se lava la columna, seguido de concentraciones cada vez mayores de un desnaturalizante suave, con lo que se liberará la proteína purificada. Se puede usar la proteína para purificar el anticuerpo.

También se pueden usar los anticuerpos para seleccionar bibliotecas de expresión para productos de expresión particulares. Habitualmente los anticuerpos usados en un procedimiento de este tipo se marcarán con un resto que permite la fácil detección de la presencia del antígeno mediante unión al anticuerpo.

Los anticuerpos generados frente a un DTLR también se usarán para generar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles para detectar o diagnosticar diversas afecciones inmunológicas relacionadas con la expresión de la proteína o las células que expresan la proteína. Estos también serán útiles como agonistas o antagonistas del ligando, que pueden ser inhibidores competitivos o sustitutos de ligandos de origen natural.

En un inmunoensayo se determina típicamente una proteína de DTLR que se une específicamente a o que es específicamente inmunorreactiva con un anticuerpo generado frente a un inmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34. El inmunoensayo usa típicamente un antisuero policlonal que se generó, por ejemplo, para una proteína de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34. Se selecciona este antisuero para que tenga reactividad cruzada baja frente a otros miembros de la familia IL-1R, por ejemplo, DTLR1, preferiblemente de la misma especie y se elimina cualquier reactividad cruzada de este tipo mediante inmunoabsorción antes de usarlo en el inmunoensayo.

A fin de producir antisueros para uso en un inmunoensayo, se aísla la proteína de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34 o una combinación de las mismas, tal como se ha descrito en este documento. Por ejemplo, se puede producir proteína recombinante en una línea de células de mamífero. Un hospedador apropiado, por ejemplo, una cepa endogámica de ratones tales como balb/c, se inmuniza con la proteína seleccionada, usando típicamente un adyuvante convencional, tal como un adyuvante de Freund y un protocolo convencional de inmunización de ratón (véase Harlow y Lane, anteriormente). Como alternativa, se puede usar como inmunógeno un péptido sintético obtenido de las secuencias descritas en este documento y conjugado a una proteína portadora. Se recogen los sueros policlonales y se titulan frente a la proteína inmunógena en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida, con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Se seleccionan los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayor y se ensayan para determinar su reactividad cruzada frente a otros miembros de la familia IL-1R, por ejemplo, DTLR de ratón o DTLR1 humano, utilizando un inmunoensayo de unión competitiva, tal como el descrito en Harlow y Lane, anteriormente, en las páginas 570-573. Preferiblemente se usan al menos dos miembros de la familia DTLR en esta determinación junto con cualquiera o alguno de los DTLR2-10 humanos. Estos miembros de la familia IL-1R se pueden producir como proteínas recombinantes y aislarse utilizando técnicas convencionales de biología molecular y de química de las proteínas, como se ha descrito en el presente documento.

Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva se pueden usar para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, las proteínas de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34 o diversos fragmentos de las mismas, se pueden inmovilizar en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores de competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la proteína de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 y/o 34. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores usando cálculos convencionales. Se seleccionan los antisueros con menos del 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas enumeradas anteriormente y se combinan. Después, los anticuerpos de reactividad cruzada se retiran de los antisueros combinados mediante inmunoabsorción con las proteínas enumeradas anteriormente.

Después, los antisueros inmunoabsorbidos y combinados se usan en un inmunoensayo de unión competitiva como se ha descrito anteriormente para comparar una segunda proteína con la proteína inmunógena (por ejemplo, la proteína similar a IL-1R de SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 y/o 34). A fin de realizar esta comparación, cada una de las dos proteínas se ensaya en una amplia variedad de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína necesaria para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína necesaria es menor que el doble de la cantidad de proteína de la proteína o de las proteínas seleccionadas que se necesita, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.

Se aprecia que esas proteínas de DTLR son miembros de una familia de proteínas homólogas que comprenden al menos 10 genes identificados hasta ahora. Para un producto genético particular, tal como los DTLR2-10, el término no se refiere únicamente a las secuencias de aminoácido descritas en este documento, sino también a otras proteínas que son variantes alélicas, no alélicas o de especie. También se aprecia que los términos incluyen mutaciones no naturales introducidas por mutación deliberada usando tecnología recombinante convencional, tal como la mutación de sitio único o extirpando secciones cortas del ADN que codifican las proteínas respectivas o sustituyendo aminoácidos nuevos, o añadiendo aminoácidos nuevos. Tales alteraciones menores deben mantener sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. Por tanto, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con una proteína relacionada con IL-1R de origen natural indicada, por ejemplo, las proteínas de DTLR mostradas en SEC ID Nº: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 ó 34. Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas se pueden determinar expresando la proteína en una línea de células apropiada y midiendo el efecto apropiado sobre los linfocitos. Las modificaciones particulares de proteína consideradas de poca importancia incluirían sustitución conservativa de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se ha descrito anteriormente para la familia IL-1R en su totalidad. Alineando una proteína óptimamente con la proteína de DTLR2-10 y utilizando los inmunoensayos convencionales descritos en este documento para determinar la inmunoidentidad, se pueden determinar las composiciones de proteína de la invención.

VII. Equipos y cuantificación

Tanto las formas de origen natural como las formas recombinantes de las moléculas similares a IL-1R de esta invención son particularmente útiles en equipos y en métodos de ensayo. Por ejemplo, estos métodos se aplicarían también a la selección para la actividad de unión, por ejemplo, los ligandos para estas proteínas. Se han desarrollado varios métodos de ensayos automáticos en los últimos años a fin de permitir la selección de decenas de miles de compuestos por año. Véase, por ejemplo, una estación de trabajo automática BIOMEK, Beckman Instruments, Palo Alto, California, EE.UU., y Fodor et al. (1991) Science 251: 767-773, que se incorporan en este documento como referencia. Este último describe medios para ensayar la unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados en un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados para seleccionar un ligando o proteínas homólogas agonistas/antagonistas se puede facilitar en gran medida por la disponibilidad de cantidades grandes de DTLR solubles purificados en estado activo tal como se proporciona por esta invención.

Los DTLR purificados se pueden aplicar como recubrimiento directamente sobre placas para uso en las técnicas de selección de ligando mencionadas anteriormente. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes para esas proteínas se pueden usar como anticuerpos de captura para inmovilizar el receptor respectivo sobre la fase sólida, útil, por ejemplo, en usos de diagnóstico.

También se contempla el uso de DTLR2-10, fragmentos de los mismos, péptidos y sus productos de fusión en una diversidad de equipos y métodos de diagnóstico para detectar la presencia de la proteína o su ligando. Como alternativa, o de manera adicional, se pueden incorporar anticuerpos frente a las moléculas en los equipos y métodos. Típicamente, el equipo tendrá un compartimento que contiene un péptido de DTLR definido o un segmento de gen o un reactivo que reconoce uno u otro. Típicamente, los reactivos de reconocimiento, en el caso del péptido, serían un receptor o anticuerpo o en el caso de un segmento de gen, habitualmente sería una sonda de hibridación.

Un equipo preferido para determinar la concentración, por ejemplo, de DTLR4, una muestra comprendería típicamente un compuesto marcado, por ejemplo, un ligando o un anticuerpo, que tiene afinidad de unión conocida para DTLR4, una fuente de DTLR4 (de origen natural o recombinante) como un control positivo y un medio para separar el compuesto unido del compuesto marcado libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar el DTLR4 presente en la muestra de ensayo. Normalmente se proporcionarán compartimentos que contengan los reactivos, así como instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión a antígeno, específicos para el DTLR de mamífero o un fragmento peptídico, o fragmentos receptores, son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de ligandos y/o sus fragmentos. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo de anticuerpo-antígeno) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), técnica de inmunoensayo multiplicado por enzima (EMIT), inmunoensayo fluorescente con sustrato marcado (SLFIA) y similares. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos no marcados usando un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo para DTLR4 o para un fragmento particular del mismo. Estos análisis también se han tratado exhaustivamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., y Coligan (Ed.) (1991) y los suplementos periódicos Current Protocols in Immunology Greene/Wiley, Nueva York, EE.UU.

Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener uso similar para servir como agonistas o antagonistas de DTLR4. Estos serían útiles como reactivos terapéuticos en circunstancias apropiadas.

Con frecuencia, los reactivos para ensayos de diagnóstico se suministran en equipos, a fin de optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la invención objeto, dependiendo de la naturaleza del ensayo, se proporciona el protocolo y el marcador, ya sea un anticuerpo marcado o no marcado, o un ligando marcado. Habitualmente esto va junto con otros aditivos, como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de señal tales como sustratos para enzimas y similares. Preferiblemente, el equipo también contendrá instrucciones para uso apropiado y desecho apropiado de los contenidos después del uso. Típicamente el equipo tiene compartimentos para cada reactivo útil y contendrá instrucciones para uso y desecho apropiado de los reactivos. Convenientemente, los reactivos se proporcionan como un polvo seco liofilizado, donde los reactivos se pueden reconstituir en un medio acuoso que tiene concentraciones apropiadas para realizar el ensayo.

Los constituyentes de los ensayos de diagnóstico mencionados anteriormente se pueden usar sin modificación o se pueden modificar de una diversidad de maneras. Por ejemplo, se puede conseguir el marcaje mediante unión covalente o no covalente de un resto que proporcione directa o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, se pueden marcar directa o indirectamente un compuesto de ensayo, DTLR, o anticuerpos para el mismo. Las posibilidades para marcaje directo incluyen grupos de marcadores: radiomarcadores tales como ^{125}I, enzimas (Patente de Estados Unidos Nº 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina y marcadores fluorescentes (Patente de Estados Unidos Nº 3.940.475) capaces de controlar el cambio en la intensidad de la fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda o la polarización de la fluorescencia. Ambas patentes se incorporan en este documento como referencia. Las posibilidades para el marcaje indirecto incluyen biotinilación de un constituyente seguido de unión a avidina acoplada a uno de los grupos de marcadores anteriores.

También existen numerosos métodos para separar el ligando unido del ligando libre, o como alternativa, el compuesto de ensayo unido del compuesto de ensayo libre. Se puede inmovilizar el DTLR sobre diversas matrices seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen las plásticas tales como una placa para ELISA, los filtros y las perlas. Los métodos para inmovilizar el receptor a una matriz incluyen, sin limitación, adhesión directa al plástico, uso de un anticuerpo de captura, acoplamiento químico y biotina-avidina. La última etapa en este enfoque implica la precipitación de un complejo anticuerpo/antígeno mediante cualquiera de varios métodos incluyendo aquellos que utilizan, por ejemplo, un disolvente orgánico tal como polietilenglicol o una sal tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partícula magnetizable de fluoresceína y anticuerpo, descrito en Rattle et al. (1984) Clin. Chem., 30(9):1457-1461, y la separación de partícula magnética de doble anticuerpo como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.659.678.

Los métodos para enlazar proteína o fragmentos a diversos marcadores se han presentado exhaustivamente en la literatura y no requieren de mayor descripción detallada en este documento. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados ya sea mediante el uso de carbodiimida o de ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para enlace o similares. Las proteínas de fusión también tendrán uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico de esta invención implica el uso de de secuencias de oligonucleótido o polinucleótido tomadas a partir de la secuencia de un DTLR. Estas secuencias se pueden usar como sondas para detectar niveles del DTLR respectivo en pacientes en los que se sospecha que tienen un trastorno inmunológico. La preparación de las secuencias de nucleótido tanto de ARN como de ADN, el marcaje de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias han tenido descripción y discusión amplia en la literatura. Normalmente una sonda de oligonucleótido tendría al menos aproximadamente 14 nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos y las sondas de polinucleótido pueden estar constituidas hasta por varias kilobases. Se pueden emplear diversos marcadores, más comúnmente radionúclidos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, también se pueden emplear otras técnicas, tales como el uso de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que puede estar marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como radionúclidos, compuestos fluorescentes, enzimas o similares. Como alternativa, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer los dúplex específicos, incluyendo los dúplex de ADN, los dúplex de ARN, los dúplex híbridos de ADN-ARN o los dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, se pueden marcar y se puede realizar el ensayo donde el dúplex está unido a una superficie, de modo que tras la formación del dúplex sobre la superficie, se pueda detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex. El uso de sondas para el ARN anti-sentido novedoso se puede realizar en cualquier técnica convencional tal como la hibridación de ácido nucleico, la selección más y menos, el sondeo de recombinación, la traducción liberada por híbrido (HRT) y la traducción detenida por híbrido (HART). Esto incluye también técnicas de amplificación, tales como la reacción de cadena de polimerasa (PCR).

También se contemplan los equipos de diagnóstico que también ensayan la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagnóstico o pronóstico puede depender de la combinación de indicaciones múltiples usadas como marcadores. Por tanto, los equipos pueden ensayar las combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet et al. (1989) Progress in Growth Factor Res., 1: 89-97.

VIII. Utilidad Terapéutica

Esta invención proporciona reactivos con valor terapéutico significativo. Los DTLR (de origen natural o recombinante), fragmentos de los mismos, receptores de muteína y anticuerpos, junto con los compuestos que se ha identificado que tienen afinidad de unión para los receptores o anticuerpos, deben ser útiles en el tratamiento de afecciones que muestran expresión anormal de los receptores de sus ligandos. Tal anormalidad se manifestará típicamente por trastornos inmunes. Adicionalmente, esta invención debe proporcionar valor terapéutico en diversas enfermedades o trastornos asociados con la expresión anormal o desencadenamiento anormal de la respuesta al ligando. Se ha sugerido que los ligandos de Toll están involucrados en el desarrollo morfológico, por ejemplo, la determinación de polaridad dorso-ventral y las respuestas inmunes, en particular, las respuestas innatas primitivas. Véase, por ejemplo, Sun et al. (1991), Eur. J. Biochem., 196: 247-254; Hultmark (1994) Nature, 367: 116-117.

Los DTLR recombinantes, las muteínas, los anticuerpos agonistas o antagonistas para los mismos o los anticuerpos, se pueden purificar y después administrar a un paciente. Estos reactivos se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes activos adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes convencionales farmacéuticamente aceptables, junto con estabilizantes y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones se pueden esterilizar, por ejemplo, filtrarse y colocarse en formas farmacéuticas mediante liofilización en viales de dosis o almacenarse en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que no son unión de complemento.

La selección de ligando utilizando DTLR o fragmentos de los mismos se pueden efectuar para identificar moléculas que tengan afinidad de unión con los receptores. Después se pueden utilizar ensayos biológicos posteriores para determinar si un ligando putativo puede proporcionar unión competitiva, que puede bloquear la actividad estimulante intrínseca. Se pueden usar fragmentos receptores como un bloqueante o antagonista por cuanto bloquea la actividad del ligando. De igual manera un compuesto que tenga actividad estimulante intrínseca puede activar el receptor y, por tanto, es un agonista ya que estimula la actividad del ligando, por ejemplo, induciendo la señalización.

Adicionalmente se contempla el uso terapéutico de los anticuerpos para los DTLR como antagonistas.

Las cantidades de reactivos necesarias para la terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por tanto, las dosis de tratamiento se deben titular para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente las dosis usadas in vitro pueden proporcionar guía útil en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. Los ensayos en animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares, proporcionarán indicio predictivo adicional de dosis para humanos. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman et al. (eds) (1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª edición, Pergamon Press; y en Remington's Pharmaceutical Sciences, (edición actual) Mack Publishing Co., Easton, PA, EE.UU.; cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia. Los métodos de administración se abordan en las mismas y más adelante, por ejemplo, para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular; difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, Nueva Jersey, EE.UU. Debido a la unión por afinidad probablemente elevada o los números de renovación, entre un ligando putativo y sus receptores, las dosis bajas de estos reactivos inicialmente sería de esperar que fuesen eficaces. Y la ruta de señalización sugiere que cantidades extremadamente bajas de ligando pueden tener efecto. Por tanto, los intervalos de dosis por lo común sería de esperar que estuvieran en cantidades inferiores a concentraciones de 1 mM, típicamente menos de concentraciones de aproximadamente 10 \muM, habitualmente menos de concentraciones de aproximadamente 100 nM, preferiblemente menos de aproximadamente 10 pM (picomolar) y lo más preferible es que sea menos de aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un vehículo apropiado. Las formulaciones de liberación lenta o un aparato de liberación lenta con frecuencia se utilizan para la administración continua.

Los DTLR, fragmentos de los mismos y los anticuerpos o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, se pueden administrar directamente al hospedador que se tiene que tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser conveniente conjugarlos a proteínas portadoras tales como ovoalbúmina o albúmina sérica antes de su administración. Se pueden administrar formulaciones terapéuticas en cualquier formulación de dosis convencional. Si bien es posible que el ingrediente activo se administre solo, se prefiere presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden al menos un ingrediente activo, como se ha definido anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo debe ser tanto farmacéutica como fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes y no ser dañino para el paciente. Las formulaciones incluyen las que son adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª edición, Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences (edición actual), Mack Publishing Co., Easton, PA, EE.UU.; Avis et al. (eds, 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY, EE.UU., Lieberman et al. (eds, 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY, EE.UU. y Lieberman et al. (eds, 1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY, EE.UU. La terapia de esta invención se puede combinar con, o usarse en asociación con otros agentes terapéuticos, en particular agonistas o antagonistas de otros miembros de la familia IL-1.

IX. Ligandos

La descripción de los receptores de Toll en este documento proporciona medios para identificar los ligandos, como se ha descrito anteriormente. Tales ligandos deben unirse específicamente al receptor respectivo con afinidad razonablemente elevada. Están disponibles diversas construcciones que permiten marcar el receptor para detectar su ligando. Por ejemplo, marcar directamente el DTLR, fusionando en el mismo marcadores para marcaje secundario, por ejemplo, con marcadores FLAG o de otros epítopos, etc., permitirá la detección del receptor. Este puede ser histológico, como un método de afinidad para purificación bioquímica o marcaje o selección en un enfoque de clonación por expresión. También se puede aplicar un sistema de selección de dos híbridos, preparando las construcciones apropiadas con las secuencias de DTLR disponibles. Véase, por ejemplo, Fields y Song (1989) Nature, 340: 245-246.

En general, las descripciones de los DTLR serán análogamente aplicables a realizaciones individuales específicas dirigidas a reactivos y composiciones de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8 DTLR9 y/o DTLR10.

El alcance amplio de esta invención se apreciará mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no tienen por objeto limitar la invención a las realizaciones específicas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos I. Métodos Generales

Algunos de los métodos convencionales se describen en, o se hace referencia a los mismos en, por ejemplo, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición) volúmenes 1-3, CSH Press, NY, EE.UU.; Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel et al. (1987 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, NY, EE.UU. Los métodos para la purificación de la proteína incluyen métodos tales como la precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otras. Véase, por ejemplo, Ausubel et al. (1987 y suplementos periódicos); Coligan et al. (ed. 1996) y suplementos periódicos, Current Protocols In Protein Science, Greene/Wiley, New York; Deutsche (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology, volumen 182, y otros volúmenes de esa serie; y en la literatura del fabricante, en el uso de los productos para purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, EE.UU., o Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a los segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente que se pueden fusionar a través de una secuencia retirable con proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989), Chemische Industrie, 12: 69-70; Hochuli (1990) Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent, en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods, 12: 87-98, Plenum Press, NY, EE.UU. y Crowe et al. (1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System, QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Las técnicas y los ensayos inmunológicos convencionales se describen, por ejemplo, en Herzenberg et al. (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, volúmenes 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology, volúmenes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 y 163.

Los ensayos para actividades biológicas vasculares son bien conocidos en la técnica. Los mismos incluirán las actividades angiogénicas y angiostáticas en tumores u otros tejidos, por ejemplo, en la proliferación del músculo liso arterial (véase, por ejemplo, Koyoma et al. (1996) Cell, 87: 1069-1078), adherencia de monocitos al epitelio vascular (véase McEvoy et al. (1997) J. Exp. Med., 185: 2069-2077), etc. Véase también Ross (1993) Nature 362: 801-809; Thyberg et al. (1990) Atherosclerosis, 10: 966-990; y Gumbiner (1996) Cell 84: 345-357.

Los ensayos para actividades biológicas de células neurales se describen, por ejemplo, en Wouterlood (ed. 1995), Neuroscience Protocols, módulo 10, Elsevier; Methods in Neurosciences, Academic Press; y Neuromethods, Humana Press, Totowa, NJ, EE.UU. La metodología de los sistemas de desarrollo se describe, por ejemplo, en Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology, CRC Press; y Chrispeels (ed.), Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology, Interscience.

El análisis de secuencia por ordenador se realiza, por ejemplo, utilizando los programas de software disponibles, incluyendo los de las fuentes de GCG (Universidad de Wisconsin) y GenBank. También se usaron bases de datos de secuencias públicas, por ejemplo, de GenBank, NCBI, EMBO y otras.

Muchas técnicas aplicables a receptores IL-10 se pueden aplicar a los DTLR, como se describe, por ejemplo, en el documento USSN 08/110.683 (receptor IL-10), que se incorpora en este documento como referencia para todos los propósitos.

II. Familia Novedosa de Receptores Humanos

Abreviaturas: DTLR, receptor similar a Toll; IL-1R, receptor de interleuquina-1; TH, homología con Toll; LRR, repetición con alto contenido de leucina; EST, marcador de secuencia expresada; STS, sitio de secuencia marcada; FISH, hibridación in situ con fluorescencia.

El descubrimiento de la homología de secuencias entre los dominios citoplásmicos de los receptores de Toll e interleuquina-1 (IL-1) humana de Drosophila ha sembrado la convicción de que ambas moléculas desencadenan rutas de señalización relacionadas unidas a la translocación nuclear de los factores de transcripción de tipo Rel. Este esquema de señalización conservado rige una respuesta inmune evolutivamente antigua, tanto en insectos como en vertebrados. Se presenta la clonación molecular de una clase novedosa de receptores humanos putativos con una arquitectura proteínica que es altamente similar a Toll de Drosophila tanto en los segmentos intracelulares como en los extracelulares. Cinco receptores humanos similares a Toll, designados DTLR 1-5, son probablemente los homólogos directos de la molécula de mosca y como tales, podrían constituir un componente importante y no reconocido de inmunidad innata en seres humanos; curiosamente, la retención evolutiva de los DTLR en vertebrados puede indicar otro papel, análogo a Toll en la dorso-ventralización del embrión de Drosophila, como reguladores de patrones morfogenéticos precoces. Las transferencias de ARNm de tejidos múltiples indican patrones notablemente diferentes de expresión para los DTLR humanos. Usando fluorescencia en la hibridación in situ y análisis por bases de datos del Sitio Marcado de la Secuencia, también se ha demostrado que los genes de DTLR afines residen en los cromosomas 4 (DTLR 1, 2 y 3), 9 (DTLR 4) y 1 (DTLR 5). La predicción estructural de los dominios de homología con Toll (TH) alineados procedentes de DTLR variados de insectos y de humanos, de receptores de IL-1 de vertebrado y de factores MyD88 y las proteínas de resistencia a enfermedades en plantas, reconoce un pliegue \beta/\alpha paralelo con un sitio activo ácido; una estructura similar en particular se repite en una clase de reguladores de respuesta involucrados ampliamente en transducir la información sensorial en las bacterias.

Las simientes del golfo morfogenético que separa tan espectacularmente las moscas de los seres humanos, están plantadas en formas y patrones embrionarios familiares, pero dan origen a complejidades de célula muy diferentes. DeRobertis y Sasai (1996) Nature, 380: 37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997), Mech. Develop., 61: 7-21. Esta divergencia de los planos de desarrollo entre los insectos y los vertebrados está coreografiada por rutas de señalización extraordinariamente similares, que subrayan una conservación mayor de las redes proteínicas y de los mecanismos bioquímicos a partir de repertorios genéticos desiguales. Miklos y Rubin (1996) Cell, 86: 521-529 y Chothia (1994), Develop., suplemento de 1994, 27-33. Una manera poderosa de graficar el diseño evolutivo de estas rutas de regulación es mediante la deducción de sus componentes moleculares probables (y sus funciones biológicas) mediante comparaciones entre especies de las secuencias y las estructuras de proteína. Miklos y Rubin (1995) Cell, 86: 521-529; Chothia (1994), Develop., suplemento de 1995, 27-33 (3-5); y Banfi et al. (1996) Nature Genet., 13: 167-174.

Una etapa universalmente crítica en el desarrollo embrionario es la especificación de los ejes del cuerpo, ya sea originados de asimetrías innatas o desencadenados por señales externas. DeRobertis y Sasai (1996) Nature, 380: 37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997) Mech. Develop., 61: 7-21. Como un sistema modelo, se ha enfocado la atención en particular sobre la base filogenética y los mecanismos celulares de la polarización dorso-ventral. DeRobertis y Sasai (1996), Nature 380: 37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997), Mech. Develop. 61: 7-21. Un prototipo de estrategia molecular para esta transformación ha surgido del embrión de Drosophila, donde la acción secuencial de un número pequeño de genes da como resultado un gradiente de ventralización del factor de transcripción Dorsal. St. Johnston y Nüsslein-Volhard (1992) Cell, 68: 201-219; y Morisato y Anderson (1995), Ann. Rev. Genet., 29: 371-399.

Esta ruta de señalización se centra en Toll, un receptor de transmembrana que transduce la unión de un factor ventral maternalmente secretado, Spätzle, en el acoplamiento citoplásmico de Tube, una molécula accesoria y la activación de Pelle, una Ser/Thr-quinasa que cataliza la disociación de Dorsal a partir del inhibidor Cactus y permite la migración de Dorsal a núcleos ventrales (Morisato y Anderson (1995), Ann. Rev. Genet., 29: 371-399; y Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416). La ruta de Toll controla también la inducción de factores antimicrobianos potentes en la mosca adulta (Lemaitre et al. (1996) Cell, 86: 972-983); este papel en la defensa inmune de Drosophila refuerza las paralelas mecanísticas para las rutas de IL-1 que rigen un hospedador de respuestas inmunes e inflamatorias en los vertebrados. Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; y Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell, 4: 767-771. Un dominio citoplásmico relacionado con Toll en los receptores IL-1 dirige la unión de una quinasa similar a Pelle, IRAK y la activación de un complejo NF-\kappaB/I-\kappaB latente que refleja la fusión de Dorsal y Cactus. Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; y Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell, 4: 767-771.

Se describe la clonación y la caracterización molecular de cuatro nuevas moléculas similares a Toll en seres humanos, designadas DTLR 2-5 (de acuerdo con Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop., 47: 225-239), que ponen de manifiesto una familia de receptores más íntimamente ligada a los homólogos de Toll de Drosophila que los receptores IL-1 de vertebrado. Las secuencias de DTLR son obtienen de EST humanos; estos ADNc parciales se usaron para dibujar los perfiles de expresión completos en tejidos humanos para los cinco DTLR, cartografiar los emplazamientos cromosómicos de los genes afines y estrechar la elección de las bibliotecas de ADNc para la recuperación de ADNc de longitud completa. Animados por otros esfuerzos (Banfi et al. (1996), Nature Genet., 13: 167-174; y Wang et al. (1996) J. Biol. Chem., 271: 4468-4476), los inventores están ensamblando, mediante conservación estructural y parsimonia molecular, un sistema biológico en seres humanos que sea la contraparte de un esquema regulador convincente en Drosophila. Adicionalmente, se sugiere un mecanismo bioquímico que acciona la señalización de Toll, mediante el plegamiento terciario propuesto del dominio de homología de Toll (TH), un módulo de núcleo compartido por los DTLR, una familia amplia de receptores de IL-1, factores MyD88 de mamífero y proteínas de resistencia a las enfermedades de las plantas. Mitcham et al. (1996) J. Biol. Chem., 271: 5777-5783; y Hardiman et al. (1996) Oncogene 13: 2467-2475. Los inventores proponen que una morfogénesis de acoplamiento de ruta de señalización y la inmunidad primitiva en insectos, plantas y animales (Belvin y Anderson (1996), Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; y Wilson et al. (1997) Curr. Biol., 7: 175-178) pueden tener raíces en las rutas de dos componentes bacterianas.

Análisis Computacional

Se identificaron secuencias humanas relacionadas con los DTLR de insecto a partir de la base de datos EST (dbEST), en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando el servidor BLAST (Altschul et al. (1994), Nature Genet., 6: 119-129). Se usaron métodos más sensibles, basados en el patrón y en el perfil (Bork y Gibson (1996) Meth. Enzymol., 266: 162-184) para aislar los dominios de señalización de la familia DTLR que se comparten con las proteínas de vertebrados y de plantas presentes en las bases de datos no redundantes. El alineamiento progresivo de las secuencias del dominio intra o extracelular de DTLR se realizó mediante Clusta1W (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680); este programa también calculó el orden de ramificación de las secuencias alineadas mediante el algoritmo de Neighbor-Joining (5.000 duplicaciones de muestreo repetitivo proporcionaron valores de confianza para los agrupamientos de árbol).

Se dibujaron los patrones de alineamiento conservados, discernidos a diversos grados de rigurosidad, mediante el programa Consensus (URL de internet: http://www.bork.embl-heidelberg-de/Alignment/consensus.html). La biblioteca PRINTS de huellas de proteína (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRINTS.html) (Attwood et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25: 212-217), identificó fiablemente la miríada de repeticiones con alto contenido de leucina (LRR) presentes en los segmentos extracelulares de los DTLR, con un motivo de compuesto (PRINTS, código Leurichrpt) que coincide flexiblemente con los elementos N terminal y C terminal de los LRR divergentes. Se usaron dos algoritmos de predicción cuya precisión de tres estados está por encima del 72%, para obtener una estructura secundaria de consenso para el alineamiento del dominio intracelular, como un puente para doblar los esfuerzos de reconocimiento (Fischer et al. (1996) FASEB J., 10: 126-136). Tanto el programa de red neural PHD (Rost y Sander (1994), Proteins 19: 55-72) como el método de predicción estadística DSC (King y Sternberg (1996) Protein Sci., 5: 2298-2310) tienen servidores en internet (sus URL son http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/phd_pred.html y http://bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc_read_align.html, respectiva-mente). La región intracelular codifica la región THD descrita, por ejemplo, en Hardiman et al. (1996) Oncogene 13: 2467-2475; y Rock et al. (1998), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 558-593, cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia. Este dominio es muy importante en el mecanismo de señalización por los receptores, que transfieren un grupo fosfato a un sustrato.

Clonación de ADNc de DTLR humanos de longitud completa

Se usaron cebadores de PCR obtenidos de la secuencia Humrsc786, similar a Toll (código de acceso a Genbank D13637) (Nomura et al. (1994) DNA Res., 1: 27-34), para sondear una biblioteca de ADNc obtenido de la línea de células TF-1 eritroleucémicas humanas (Kitamura et al. (1989), Blood 73: 375-380) para producir la secuencia de ADNc de DTLR1. Las secuencias restantes de DTLR señalaron a partir de dbEST y los clones de EST pertinentes se obtuvieron del consorcio I.M.A.G.E. (Lennon et al. (1996) Genomics 33: 151-152) mediante Research Genetics (Huntsville, AL, EE.UU.): ClonID# 80633 y 117262 (DTLR2), 144675 (DTLR3), 202057 (DTLR4) y 277229 (DTLR5). Los ADNc de longitud completa para los DTLR humanos 2-4 se clonaron mediante selección de hibridación de ADN de bibliotecas de ADNc 5'-Stretch Plus del fago \lambdagt10, de pulmón adulto humano, de placenta y de hígado fetal (Clontech), respectivamente; la secuencia de DTLR5 se obtiene de una placa EST humana de esclerosis múltiple. Todos los clones positivos se secuenciaron y se alinearon para identificar los ORF de DTLR individuales: DTLR1 (clon de 2366 pares de bases (pb), ORF de 786 aminoácidos (aa)), DTLR2 (2.600 pb, 784 aa), DTLR3 (3029 pb, 904 aa), DTLR4 (3811 pb, 879 aa) y DTLR5 (1275 pb, 370 aa). Se generaron sondas para hibridaciones de DTLR3 y DTLR4 mediante PCR, utilizando bibliotecas de ADNc de placenta humana (Stratagene) e hígado de adulto (Clontech) como moldes, respectivamente; se obtuvieron pares de cebadores a partir de las secuencias EST respectivas. Las reacciones de PCR se condujeron usando ADN polimerasa Taqplus de T. aquaticus (Stratagene) en las siguientes condiciones (1 x (94ºC, 2 min), 30 x (55ºC, 20 s; 72ºC, 30 s; 94ºC, 20 s); 1 x (72ºC, 8 min). Para selección del ADNc de longitud completa de DTLR2, se usó como sonda un fragmento de 900 pb generado por digestión con EcoRI/XbaI del primer clon EST (ID# 80633).

Transferencias y localización cromosómica de ARNm

Se adquirieron transferencias de tejido humano múltiple (Nº de catálogo 1, 2) y de línea de células cancerosas (Nº de catálogo 7757-1), que contenían aproximadamente 2 \mug de poli(A)^{+} ARN por carril, de Clotech (Palo Alto, CA, EE.UU.). Para los DTLR 1-4, los ADNc de longitud completa aislados sirvieron como sondas; para DTLR5 se usó el inserto de plásmido del clon EST (ID#277229). En resumen, las sondas se radiomarcaron con [\alpha-^{32}P] dATP usando el equipo de marcaje de cebador aleatorio Amersham Rediprime (RPN1633). La prehibridación y las hibridaciones se realizaron a 65ºC en de Na_{2}HPO_{4} 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 0,5 M (pH 8,0). Todos los lavados de rigurosidad se realizaron a 65ºC con dos lavados iniciales en 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 40 min seguidos por un lavado posterior en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% durante 20 min. Después las membranas se expusieron a -70ºC a película de rayos X (Kodak) en presencia de pantallas intensificadoras. Se realizaron estudios más detallados mediante Southerns (14) de la biblioteca de ADNc, con clones de DTLR humano seleccionados para examinar su expresión en subgrupos de células hematopoyéticas.

Se llevó a cabo la cartografía cromosómica humana mediante el método de hibridación in situ fluorescente (FISH) tal como se describe en Heng y Tsui (1994), Meth. Molec. Biol., 33: 109-122, utilizando como sondas los diversos clones de ADNc de longitud completa (DTLR 2-4) o parcial (DTLR5). Estos análisis se realizaron como un servicio de SeeDNA Biotech Inc. (Ontario, Canadá). Se efectuó una búsqueda de síndromes humanos (o defectos en ratones, en loci sintéticos) asociados con los genes de DTLR cartografiados en la Base de Datos de Homología Humana-Ratón Dysmorphic, mediante el servidor de internet (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/DHMHD/hum_chrome1.html).

Arquitectura conservada de ectodominios de DTLR de insecto y humanos

La familia Toll en Drosophila comprende al menos cuatro productos genéticos distintos: Toll, el prototipo de receptor implicado en la formación del patrón dorsoventral del embrión de la mosca (Morisato y Anderson (1995), Ann. Rev. Genet., 29: 371-399) y un segundo, denominado "18 Wheeler" (18w), que también puede estar implicado en el desarrollo embrionario temprano (Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop., 47: 225-239; Eldon et al. (1994) Develop. 120: 885-899); se predicen dos receptores adicionales por los ORF similares a Toll incompletos, cadena abajo del locus de transcrito específico para el macho (Mst) (código de Genbank X67703) o se codifican por el "sitio marcado de secuencia" (STS) Dm2245 (código Genbank G01378) (Mitcham et al. (1996), J. Biol. Chem., 271: 5777-5783). Los segmentos extracelulares de Toll y de 18w están compuestos claramente de motivos LRR imperfectos de aproximadamente 24 aminoácidos (Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop, 47: 225-239; y Eldon et al. (1994) Deelop., 120: 885-899). Formaciones en tándem similares de los LRR forman comúnmente las antenas adhesivas de diversas moléculas de la superficie de la célula y se presume que su estructura terciaria genérica imita la cuna en forma de herradura de un pliegue inhibidor de ribonucleasa, en donde diecisiete LRR muestran un motivo de 28 residuos de repetición de horquilla \beta/\alpha (Buchannan y Gay (1996), Prog. Biophys. Molec. Biol., 65: 1-44). El reconocimiento específico de Spätzle por Toll puede seguir un modelo propuesto por la unión de las hormonas de glicoproteína de pliegue de nudo de cistina mediante los ectodominios multi-LRR de los receptores de serpentina, utilizando el lado cóncavo de la lámina \beta curvada (Kajava et al. (1995), Structure, 3: 867-877); curiosamente, el patrón de las cisteínas en Spätzle y un ligando huérfano de Drosophila, Trunk, predicen una estructura terciaria de nudo de cistina similar (Belvin y Anderson (1996), Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; y Casanova et al. (1995), Genes Develop., 9: 2539-2544).

Los ectodominios de 22 y 31 LRR de Toll y 18w, respectivamente (el fragmento ORF de Mst muestra 16 LRR), están relacionados más íntimamente con las formaciones comparables de 18, 19, 24 y 22 LRR de los DTLR 1-4 (la cadena incompleta de DTLR5 actualmente incluye cuatro LRR proximales de membrana) mediante análisis de secuencia y de patrón (Altschul et al. (1994), Nature Genet., 6: 119-129; y Bork y Gibson (1996), Meth. Enzymol., 266: 162-184) (figura 1). Sin embargo, una diferencia sorprendente en las cadenas de DTLR humano es la pérdida común de una región con alto contenido en cisteína de aproximadamente 90 residuos, que está incrustada de forma variable en los ectodominios de Toll, 18w y el ORF de Mst (a una distancia de cuatro, seis y dos LRR, respectivamente, del límite de membrana). Estos grupos de cisteína son bipartidos, con mitades "superior" (que termina en un LRR) e "inferior" (apilada encima de un LRR) distintas (Chiang y Beachy (1994), Mech. Develop., 47: 225-239; Eldon et al. (1994), Develop., 120: 885-899; y Buchanan y Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol., 65: 1-44); el módulo "superior" recurre tanto en los DTLR de Drosophila como humanos, como un separador de yuxtamembrana conservado (Figura 1). Los inventores sugieren que los grupos de cisteína situados flexiblemente en los receptores de Drosophila (y otras proteínas LRR), cuando forman pareja "superior" con "inferior", forman un módulo compacto con extremos apareados que se pueden insertar entre cualquier par de LRR, sin alterar el pliegue global de los ectodominios de DTLR; dominios "extruidos" análogos decoran las estructuras de otras proteínas (Russell (1994), Protein Engin., 7: 1407-1410).

Diseño molecular del dominio de señalización TH

La comparación de secuencias de los receptores de Toll y de IL-1 tipo I (IL-1R1) ha descrito un parecido distante de un dominio citoplásmico de aproximadamente 200 aminoácidos, que media presumiblemente la señalización mediante factores de transcripción del tipo ReI similares. Belvin y Anderson (1996), Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; y Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell, 4: 767-771). Adiciones más recientes a este paradigma funcional incluyen un par de proteínas de resistencia a la enfermedad de las plantas, procedentes de tabaco y de lino que presentan un módulo de TH N-terminal, seguido por segmentos de unión a nucleótido (NTPasa) y LRR (Wilson et al. (1997), Curr. Biol., 7: 175-178); por el contrario, un "dominio de muerte" precede a la cadena TH de MyD88, un marcador de diferenciación mieloide intracelular (Mitcham et al. (1996), J. Biol. Chem., 271: 5777-5783; y Hardiman et al. (1996), Oncogene, 13: 2467-2475) (Figura 1). Los nuevos receptores IL de tipo 1 incluyen IL-1R3, una molécula de señalización accesoria y los receptores huérfanos IL-1R4 (denominados también ST2/Fit-1/T1), IL-1R5 (proteína relacionada con IL-1R) e IL-1R6 (proteína 2 relacionada con IL-1R) (Mitcham et al. (1996), J. Biol. Chem., 271: 5777-5783; Hardiman et al. (1996), Oncogene, 13: 2467-2475). Con las nuevas secuencias de DTLR humano, se ha buscado una definición estructural de este hilo evolutivo analizando la conformación del módulo de TH común: diez bloques de secuencia conservada que comprenden 128 aminoácidos forman el pliegue de dominio TH mínimo; los huecos en el alineamiento marcan el emplazamiento probable de la secuencia y los bucles de longitud variable (Figura 2a).

Dos algoritmos de predicción que aprovechan los patrones de conservación y variación en secuencias múltiplemente alineadas, PHD (Rost y Sander (1994), Proteins, 19: 55-72) y DSC (King y Sternberg (1996) Protein Sci., 5: 2298-2310), produjeron resultados marcados concordantes para el módulo de señalización de TH (Figura 2a). Cada bloque contiene un elemento estructural secundario específico: la impresión de las hebras \beta alternas (marcadas A-E) y las hélices \alpha (numeradas 1-5) es el diagnóstico de un pliegue de clase \beta/\alpha con hélices \alpha en ambas caras de una lámina \beta paralela. Se predice que las hebras \beta hidrófobas A, C y D forman sostenes "interiores" en la lámina \beta, mientras que las hebras \beta más cortas anfipáticas B y E parecen unidades típicas "de borde" (Figura 2a). Esta asignación es coherente con un orden de hebra de B-A-C-D-E en la lámina \beta de núcleo (Figura 2b); los programas de comparación de pliegue ("cartografía") y de reconocimiento ("reconocimiento de plegamiento") (Fischer et al., (1996) FASEB J, 10: 126-136) restituyen de forma marcada esta topología de doble enrollamiento \beta/\alpha. Una predicción funcional sorprendente de esta estructura de trazo para el dominio TH es que muchos de los residuos cargados conservados, en el mapa de múltiples alineamientos del extremo C-terminal de la lámina \beta: el residuo Asp16 (esquema de numeración de bloques - Figura 2a) en el extremo de \betaA, Arg 39 y Asp40 a continuación de \betaB, Glu75 en la primera espira de \alpha3 y los residuos Glu/Asp más ligeramente conservados en el bucle \betaD-\alpha4 o después de betaE (figura 2a). El emplazamiento de los otros cuatro residuos conservados (Asp7, Glu28 y el par Arg57-Arg/Lys58) es compatible con una red de puente de sal en el extremo N-terminal opuesto, de la lámina \beta (Figura 2a).

La función de señalización depende de la integridad estructural del dominio TH. Se han catalogado las mutaciones o supresiones inactivadoras dentro de los límites del módulo (Figura 2a) para IL-1R1 y Toll. Heguy et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 2605-2609; Croston et al. (1995) J. Biol. Chem., 270: 16514-16517; Schneider et al. (1991) Genes Develop., 5: 797-807; Norris y Manley, (1992) Genes Develop., 6: 1654-1667; Norris y Manley (1995) Genes Develop., 9: 358-369; y Norris y Manley (1996) Genes Develop., 10: 862-872. Las cadenas de DTLR1-5 humanos que se extienden más allá del dominio mínimo TH (8, 0, 6, 22 y 18 residuos de longitud, respectivamente), son estrechamente similares a la "cola" de 4 aa achaparrada, del ORF de Mst. Toll y 18w muestran colas no relacionadas de 102 y 207 residuos (Figura 2a), que pueden regular negativamente la señalización de los dominios de TH fusionados. Norris y Manley (1995) Genes Develop., 9: 358-369; y Norris y Manley (1996) Genes Develop., 10: 862-872.

La relación evolutiva entre las proteínas dispares que portan el dominio TH se puede discernir mejor mediante un árbol filogenético obtenido del alineamiento múltiple (Figura 3). Cuatro principales ramificaciones segregan las proteínas de planta, los factores MyD88, los receptores de IL-1 y las moléculas similares a Toll; esta última ramificación agrupa los DTLR de Drosophila y humanos.

Dispersión cromosómica de genes de DTLR humanos

A fin de investigar el ligamiento genético de la familia de genes de DTLR humana naciente, se han cartografiado los loci de cuatro de los cinco genes mediante FISH (Figura 4). El gen de DTLR1 se había representado previamente mediante el proyecto de genoma humano: existe un locus de base de datos STS (número de acceso a dbSTS G06709, que corresponde a STS WI-7804 o SHGC-12827) para el ADNc de Humrsc786 (Nomura et al. (1994), DNA Res., 1: 27-35) y fija el gen al intervalo marcador D4S1587-D42405 (50-56 cm) del cromosoma 4 hacia 4p14. Esta asignación se ha corroborado recientemente mediante análisis FISH. Taguchi et al. (1996) Genomics, 32: 486-488. En el presente trabajo, se asignan con precisión los genes de DTLR restantes a los loci en el cromosoma 4q32 (DTLR2), 4q35 (DTLR3), 9q32-33 (DTLR4) y 1q33.3 (DTLR5). Durante el desarrollo de este trabajo, se ha generado un STS para el DTLR2 EST parental (ID de clon # 80633) (número de acceso dbSTS T57791 para STS SHGC-33147) y mapas para el intervalo marcador D4S424-D4S1548 (143-153 cm) del cromosoma 4 en 4q32, de acuerdo con los hallazgos en este documento. Hay un hueco de aproximadamente 50 cm entre los genes de DTLR2 y DTLR3 en el brazo largo del cromosoma 4.

Los genes de DTLR se expresan de forma diferencial

Tanto Toll como 18w tienen patrones de expresión espaciales y temporales complejos en Drosophila que pueden señalar funciones más allá de la constitución del patrón embrionario. St. Johnston y Nüsslein-Volhard (1992) Cell, 68: 201-219; Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genet., 29: 371-399; Belvin y Anderson (1996), Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; Lemaitre et al. (1996) Cell, 86: 973-983; Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop., 47: 225-239; y Eldon et al. (1994) Develop., 120: 885-899. Se ha examinado la distribución espacial de los transcritos de DTLR mediante análisis de transferencia de ARNm con líneas de células de tejido y de cáncer humanas variadas, utilizando ADNc de DTLR radiomarcados (Figura 5). Se encuentra que DTLR1 se expresa ubicuamente y a niveles más altos que los otros receptores. Reflejando presumiblemente empalme alternativo, están presentes formas de transcrito "corta" de 3,0 kB y "larga" de 8,0 kB de DTLR1 en los ovarios y en el bazo, respectivamente (Figura 5, paneles A y B). Un panel de ARNm de célula cancerosa también muestra la sobreexpresión marcada de DTLR1 en una línea de células Raji del linfoma de Burkitt (Figura 5, panel C). El ARNm de DTLR2 se expresa menos ampliamente que DTLR1 con una especie de 4,0 kB detectada en el pulmón y un transcrito de 4,4 kB evidente en el corazón, el cerebro y el músculo. El patrón de distribución de tejido de DTLR3 reproduce el de DTLR2 (Figura 5, panel E). DTLR3 también está presente como dos transcritos principales de aproximadamente 4,0 y 6,0 kB de tamaño, y se observan los máximos niveles de expresión en la placenta y en el páncreas. Por el contrario, los mensajes de DTLR4 y DTLR5 parecen ser extremadamente específicos de tejido. DTLR4 se ha detectado únicamente en la placenta como un transcrito único de aproximadamente -7,0 kB de tamaño. Se observó una señal débil de 4,0 kB para DTLR5 en los ovarios y en monocitos de sangre periférica.

Componentes de un sistema regulador evolutivamente antiguo

Se pueden reconstruir los planos moleculares originales y los destinos divergentes de las rutas de señalización mediante enfoques genómicos comparativos. Miklos y Rubin (1996) Cell 86: 521-529; Chothia (1994) Develop., 13: 167-174; y Wang et al. (1996) J. Biol. Chem., 271: 4468-4476. Se ha usado esta lógica para identificar una familia de genes emergente en seres humanos, que codifica cinco parálogos receptores en la actualidad, los DTLR 1-5, que son los equivalentes evolutivos directos de una familia de genes de Drosophila encabezada por Toll (Figuras 1-3). La arquitectura conservada de los DTLR humano y de mosca, los ectodominios LRR conservados y los módulos de TH intracelulares (Figura 1), dan a entender que la ruta sólida acoplada a Toll en Drosophila (6, 7) sobrevive en los vertebrados. La mejor evidencia surge de una ruta reiterada: el sistema IL-1 múltiple y su repertorio de dominios TH fusionados al receptor, IRAK, los homólogos NF-\kappaB e I-\kappaB (Belvin y Anderson (1996), Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell, 4: 767-771; Hardiman et al. (1996), Oncogene, 13: 2467-2475; y Cao et al., (1996) Science, 271-1128-1131); también se ha caracterizado un factor similar a Tube. No se sabe si los DTLR pueden acoplarse productivamente a la maquinaria de señalización de IL-1R o si, más bien, se usa una serie paralela de proteínas. A diferencia de los receptores IL-1, la cuna LRR de los DTLR humanos se predice que conserva una afinidad por los factores de nudo de cistina relacionados con Spätzle/Trunk; se han aislado ligandos de DTLR candidatos (denominados PEN) que se ajustan a este molde.

Los mecanismos bioquímicos de transducción de señal se pueden calibrar mediante la conservación de pliegues de proteína de interacción en una ruta. Miklos y Rubin (1996) Cell 86: 521-529; Chothia (1994) Develop., suplemento de 1994, 27-33. En la actualidad un paradigma de señalización de Toll implica algunas moléculas cuyos papeles están definidos estrechamente por sus estructuras, acciones o destinos: Pelle es una Ser/Thr quinasa (fosforilación); Dorsal es un factor de transcripción similar a NF-\kappaB (que se une a ADN) y Cactus es un inhibidor de repetición de anquirina (unión a Dorsal, degradación). Belvin y Anderson (1996), Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416. Por el contrario, las funciones del dominio TH de Toll y Tube siguen siendo enigmáticas. Al igual que otros receptores de citoquina (Heldin (1995) Cell, 80: 213-223), la dimerización de Toll mediada por ligando, parece ser el acontecimiento desencadenante: las cisteínas libres en la región de yuxtamembrana de Toll crean los pares de receptores constitutivamente activos (Schneider et al. (1991), Genes Develop., 5: 797-807) y los receptores quiméricos Torso-Toll señalan como dímeros (Galindo et al. (1995) Develop., 121: 2209-2218); sin embargo, varios truncamientos o la pérdida total del ectodominio de Toll da como resultado señalización intracelular promiscua (Norris y Manley (1995), Genes Develop., 9: 358-369; y Winans y Hashimoto (1995) Molec. Biol. Cell, 6: 587-596), que recuerda receptores oncogénicos con dominios catalíticos (Heldin (1995) Cell, 80: 213.223). Tube se localiza en la membrana, se acopla al dominio N-terminal (muerte) de Pelle y está fosforilado, pero no se registran interacciones Toll-Tube ni Toll-Pelle en los análisis de dos híbridos (Galindo et al. (1995) Develop., 121: 2209-2218; y Grosshans et al. (1994) Nature, 372: 563-566); este último resultado sugiere que el "estado" de conformación del dominio TH de Toll influye en el reclutamiento de factor. Norris y Manley (1996) Genes Develop., 10: 862-872; y Galindo et al. (1995), Develop., 121: 2209-2218.

En el corazón de estos asuntos complejos está la naturaleza estructural del módulo de TH de Toll. Para abordar esta cuestión, se ha aprovechado la diversidad evolutiva de las secuencias TH de insectos, plantas y vertebrados, incorporando las cadenas de DTLR humano y extrayendo el núcleo proteínico mínimo conservado, para predicción estructural y reconocimiento de pliegue (Figura 2). El pliegue de dominio TH (\beta/\alpha)_{5} marcadamente pronosticado con su grupo asimétrico de residuos ácidos es topológicamente idéntico a las estructuras de los reguladores de respuesta en las rutas de señalización de dos componentes bacterianas (Volz (1993) Biochemistry, 32: 11741-11753; y Parkinson (1993) Cell, 73: 857-871) (Figura 2). El regulador de quimiotaxis prototípico CheY se une transitoriamente a un catión divalente en un "receptáculo de aspartato" en el extremo C de la lámina \beta de núcleo; este catión proporciona estabilidad electrostática y facilita la fosforilación activadora de una Asp no variante. Volz (1993) Biochemistry, 32: 11741-11753. De igual manera, el dominio TH puede capturar cationes en su nido ácido, pero la activación y la señalización cadena abajo podrían depender de la unión específica de un resto cargado negativamente: los ligandos aniónicos pueden superar los potenciales intensamente negativos del sitio de unión, asegurándose en las redes precisas de enlaces de hidrógeno. Ledvina et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6786-6791. Sorprendentemente, el dominio TH no puede actuar simplemente como un peldaño pasivo para el ensamblaje de un complejo Tube/Pelle para Toll o sistemas homólogos en plantas y vertebrados, sino que participa activamente más bien como un accionador conformacional verdadero en la maquinaria transductora de señal. Quizás para explicar la unión condicional de un complejo Tube/Pelle, la dimerización de Toll podría promover el desenmascaramiento, por las colas receptoras reguladoras (Norris y Manley (1995) Genes Develop., 9: 358-369; Norris y Manley (1996) Genes Develop., 10: 862-872) o la unión por activadores de molécula pequeña del receptáculo de TH. Sin embargo, los módulos de TH "libres" dentro de la célula (Norris y Manley (1995) Genes Develop., 9: 358-369; Winans y Hashimoto (1995), Molec. Biol. Cell, 6: 587-596) podrían actuar como accionadores catalíticos similares a CheY, mediante activación y acoplamiento con los complejos errantes Tube/Pelle.

Receptores morfogenéticos y defensa inmune

El enlace evolutivo entre los sistemas inmunes de insectos y de vertebrados está estampado en el ADN: los genes que codifican los factores antimicrobianos en insectos presentan motivos cadena arriba similares a los elementos de respuesta en fase aguda, que se sabe se unen a factores de transcripción NF-\kappaB en mamíferos. Hultmark (1993) Trends Genet., 9: 178-183. Dorsal y dos factores relacionados con Dorsal, Dif y Relish, ayudan a inducir estas proteínas de defensa después del desafío bacteriano (Reichhart et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris, 316: 1218-1224; Ip et al. (1993) Cell 75: 753-763; y Dushay et al. (1996) Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 10343-10347); Toll u otros DTLR, probablemente modulan estas respuestas inmunes rápidas en Drosophila adultas (Lemaitre et al. (1996) Cell, 86: 973-983; y Rosetto et al. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun., 209: 111-116). Estas paralelas mecanísticas a la respuesta inflamatoria de IL-1 en los vertebrados son evidencia de la versatilidad funcional de la ruta de señalización de Toll y sugieren una sinergia antigua entre la formación de patrón embrionario y la inmunidad innata (Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol., 12: 393-416; Lemaitre et al. (1996) Cell, 86: 973-983; Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell, 4: 767-771; Wilson et al. (1997) Curr. Biol., 7: 175-178; Hultmark (1993) Trends Genet., 9: 178-183; Reichhart et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris, 316: 1218-1224; Ip et al. (1993) Cell 75: 753-763; Dushay et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10343-10347; Rosetto et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 209: 111-116; Medzhitov y Janeway (1997) Curr. Opin. Immunol., 9: 4-9). La homología más cercana de las proteínas de DTLR de insecto y humanas invita a un solapamiento todavía más fuerte de las funciones biológicas, que sobrepasa a las paralelas puramente inmunes de los sistemas IL-1 y presta reguladores moleculares potenciales para las transformaciones dorso-ventrales y otras, de los embriones de vertebrados. DeRobertis y Sasai (1996) Nature, 380: 37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997) Mech. Develop., 61: 7-21.

La presente descripción de una familia de receptor sólida emergente en seres humanos, refleja el descubrimiento reciente de los receptores de Frizzled en vertebrados para los factores de formación de patrón Wnt. Wang et al. (1996), J. Biol. Chem., 271: 4468-4476. Como muchos otros sistemas de citoquina-receptor tienen papeles en el desarrollo temprano (Lemaire y Kodjabachian (1996) Trends Genet., 12: 525-531), quizás los contextos celulares distintos de embriones compactos y adultos gangliosos simplemente den como resultado rutas de señalización familiares y sus accionadores difusibles que tienen efectos biológicos diferentes en diferentes momentos, por ejemplo, morfogénesis frente a defensa inmune para los DTLR. Para sistemas relacionados con Toll en insectos, plantas y seres humanos (Hardiman et al. (1996) Oncogene, 13: 2467-2475; Wilson et al. (1997), Curr. Biol., 7: 175-178), estas señales transcurren a través de un dominio TH regulador que sorprendentemente se parece a un motor transductor bacteriano (Parkinson (1993) Cell, 73: 857-871).

En particular, DTLR6 muestra elementos estructurales que establecen su membresía en la familia. Además, los miembros de la familia han estado implicados en varias patologías del desarrollo significativas y con función del sistema inmune innato. En particular, el DTLR6 se ha cartografiado para el cromosoma X hasta un emplazamiento que es un punto caliente para las principales anormalidades de desarrollo. Véase, por ejemplo, The Sanger Center: human X chromosome website http://www.sanger.ac.uk/HGP/ChrX/index.shtm1; y el sitio web del Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing, http://gc.bcm.tmc.edu:8088/cgi-bin/seq/home.

El número de acceso para el PAC depositado es AC003046. Este número de acceso contiene la secuencia de dos PAC: RPC-164K3 y RPC-263P4. Estas dos secuencias PAC cartografiadas en el cromosoma humano Xp22 en el sitio web de Baylor, entre los marcadores STS DXS704 y DXS7166. Esta región es un "punto caliente" para diversas anormalidades de desarrollo.

III. Amplificación de fragmento de DTLR mediante PCR

Se seleccionan dos secuencias de cebador apropiadas (véanse las Tablas 1 a 10). Se usa RT-PCR en una muestra de ARNm apropiada seleccionada por la presencia del mensaje para producir un ADNc de longitud parcial o completa, por ejemplo, una muestra que exprese el gen. Véase, por ejemplo, Innis et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA; y Dieffenbach y Dveksler (1995, eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, CSH, NY. Esto permitirá la determinación de una secuencia útil para sondear un gen de longitud completa en una biblioteca de ADNc. El TLR6 es una secuencia contigua en el genoma, lo que puede sugerir que los demás TLR también lo son. Por tanto, la PCR sobre el ADN genómico puede producir una secuencia contigua de longitud completa y entonces sería aplicable la metodología de desplazamiento de cromosoma. Como alternativa, las bases de datos de secuencia contendrán una secuencia correspondiente a porciones de las realizaciones descritas o formas íntimamente relacionadas, por ejemplo, empalmes alternativos, etc. También se pueden aplicar técnicas de clonación de expresión sobre las bibliotecas de ADNc.

IV. Distribución en tejido de DTLR

Se ha detectado el mensaje para cada gen que codifica estos DTLR. Véanse las Figuras 5A-5F. Se ensayarán otras células y tejidos con tecnología apropiada, por ejemplo, PCR, inmunoensayo, hibridación o de otro tipo. Las preparaciones de ADNc de tejido y de órgano se pueden obtener, por ejemplo, de Clontech, Mountain View, CA. La identificación de fuentes de expresión natural es útiles, como se ha descrito.

Análisis de Southern: Se digiere ADN (5 \mug) procedente de una biblioteca de ADNc primaria amplificada con enzimas de restricción apropiadas para liberar los insertos, se desarrolla en un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nylon (Schleicher y Schuell, Keene, NH, EE.UU.).

Las muestras para aislamiento de ARNm humano incluirían típicamente, por ejemplo: células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T, células NK, granulocitos y células B), células en reposo (T100); células mononucleares de sangre periférica, activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 12 h (T101) agrupadas; células T, clon TH0 Mot 72, en reposo (T102); células T, clon TH0 Mot 72, activado con anti-CD28 y anti-CD3, durante 3, 6, 12 h agrupadas (T103); célula T, clon TH0 Mot 72, anérgico tratado con péptido específico durante 2, 7, 12 h agrupado (T104), célula T, clon HY06 de TH1, en reposo (T107); célula T, clon HY06 de TH1, activado con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 h agrupado (T108); célula T, clon HY06 de TH1, anérgico tratado con péptido específico durante 2, 6, 12 h agrupado (T109); célula T, clon HY935 de TH2, en reposo (T110); célula T, clon HY935 de TH2, activado con anti-CD28 y anti-CD3 durante 2, 7, 12 h agrupado (T111); células T CD4 + células T CD45RO, polarizadas durante 27 días en anti-CD28, IL-4 y anti-IFN-\gamma, TH2 polarizadas, activadas con anti-CD3 y anti-CD28, 4 h (T116), líneas de tumor de célula T Jurkat y Hut 78, en reposo (T117); clones de célula T, agrupados AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, en reposo (T118); clones de célula T \gamma\delta aleatorios, de célula T, en reposo (T119); esplenocitos, en reposo (B100); esplenocitos activados con anti-CD40 e IL-4 (B101); líneas EBV de célula B agrupadas, WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, en reposo (B102); línea JY de célula B, activada con PMA y yonomicina durante 1, 6 h agrupada (B103); clones NK 20 agrupados, en reposo (K100); clones NK20 agrupados, activados con PMA y yonomicina durante 6 h (K101); clon NKL, obtenido de sangre periférica de paciente leucémico LGL, tratado con IL-2 (K106); clon 650-A30-1 citotóxico de NK, en reposo (K107); línea TF1 precursora hematopoyética, activada con PMA y yonomicina durante 1, 6 h agrupada (C100); línea premonocítica U937, en reposo (M100); línea premonocítica U937, activada con PMA y yonomicina durante 1, 6 h agrupada (M101); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h agrupados (M102); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h agrupados (M103); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, anti-IL-10 durante 4, 16 h agrupados (M106); monocitos elutriados, activados con LPS, IFN\gamma, IL-10 durante 4, 16 h agrupados (M107); monocitos elutriados, activados con LPS durante 1 h (M108), monocitos elutriados, activados con LPS durante 6 h (M109); DC al 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, FNT\alpha, 12 días, en reposo (D101); DC al 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, FNT\alpha, 12 días, activado con PMA y yonomicina durante 1 h (D102); DC al 70% CD1a+, de CD34+, GM-CSF, FNT\alpha, 12 días, activado con PMA y yonomicina durante 6 h (D103); DC al 95% Cd1a+, de CD34+ GM-CSF, FNT\alpha 12 días, clasificado por FACS, activado con PMA y yonomicina durante 1, 6 h agrupado (D104); DC al 95% CD14, ex CD34+ GM-CSF, FNT\alpha 12 días clasificado por FACS, activado con PMA y yonomicina durante 1, 6 h (D105); DC CD1a+, CD86+, de CD34+ GM-CSF, FNT\alpha 12 días, clasificado por FACS, activado con PMA y yonomicina durante 1, 6 h (D106); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo (D107); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo (D108); DC de monocitos GM-CSF, IL4 5 días, activado con LPS durante 4, 16 h agrupado (D109); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, activado con FNT\alpha, monocito supe agrupado durante 4, 16 h (D110); tumor benigno LII leiomioma (X101); miometrio M5 normal (0115); leiomiosarcoma maligno GS1 (X103); línea MRC5 de sarcoma de fibroblasto pulmonar, activada con PMA y yonomicina, durante 1, 6 h agrupada (C101); línea de células CHA de carcinoma epitelial de riñón, activado con PMA y yonomicina durante 1, 6 h agrupado (C102); riñón fetal masculino de 28 semanas (O100); pulmón fetal masculino de 28 semanas (O101); hígado fetal masculino de 28 semanas (O102); corazón fetal masculino de 28 semanas (O103); cerebro fetal masculino de 28 semanas (O104); vesícula biliar fetal masculina de 28 semanas (O106); intestino delgado fetal masculino de 28 semanas (O107); tejido adiposo fetal masculino de 28 semanas (O108); ovarios fetales femeninos de 25 semanas (O109); útero fetal femenino de 25 semanas (O110); testículos fetales masculinos de 28 semanas, (O111); bazo fetal masculino de 28 semanas (O112); placenta adulta de 28 semanas (O113); y amígdalas inflamadas, de 12 años de edad (X100).

Las muestras para el aislamiento del ARNm de ratón pueden incluir, por ejemplo: la línea de células L fibroblásticas de ratón en reposo (C200); células transfectadas Braf:ER (fusión de Braf a receptor de estrógeno), control (C201); células T polarizadas con TH1(células CD4+ de bazo Mel14 brillante, polarizadas durante 7 días con IFN-\gamma y anti IL-4; T200); células T, polarizadas con TH2 (células CD4+ de bazo Mel14 brillante, polarizadas durante 7 días con IL-4 y anti-IFN-\gamma; T201), células T, altamente polarizadas con TH1 (véase Openshaw et al. J. Exp. Med., 182: 1357-1367, activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 horas agrupadas; T202); células T altamente polarizadas con TH2 (véase Openshaw et al. (1995) J. Exp. Med., 182: 1357-1367, activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 h agrupadas; T203); células pre-T CD44- CD25+, clasificadas a partir de timo (T204); clon D1.1 de célula T TH1, en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T205); clon D1.1 de célula T TH1, estimulado con 10 \mug/ml de ConA durante 15 h (T206); clon CDC35 de célula T TH2, en reposo durante tres semanas después de la última estimulación con antígeno (T207); clon CDC35 de célula T TH2, estimulado durante 15 h con 10 \mug/ml de ConA (T208); células T sin tratar Mel14+ de bazo, en reposo (T209); células T Mel14+, polarizadas a Th1 con IFN-\gamma/IL-12/anti-IL-4, durante 6, 12, 24 h agrupadas (T210); células T Mel14+, polarizadas a Th2 con IL-4/anti-IFN-\gamma, durante 6, 13, 24 h agrupadas (T211); línea de células A20 de leucemia de células B maduras sin estimular (B200); línea de células CH12 de células B sin estimular (B201); células B grandes sin estimular del bazo (B202); células B de bazo total, activadas con LPS (B203); células dendríticas de bazo enriquecidas con metrizamida, en reposo (D200); células dendríticas de médula ósea, en reposo (D201); línea de células monocíticas RAW 264.7, activadas con LPS 4 h (M200); macrófagos de médula ósea derivados con GM y M-CSF (M201); línea de células de macrófago J774, en reposo (M202); línea de células de macrófago J774 + LPS + anti-IL-10 a 0,5, 1, 3, 6, 12 h agrupadas (M203); línea de células de macrófago J774 + LPS + IL-10 a 0,5, 1, 3, 5 12 h agrupadas (M204); tejido pulmonar de ratón, expuesto a atomizador, cebadores Th2, desafío OVA con atomizador a 7, 14, 23 h agrupado (véase Garlisi et al. (1995) Clinical Immunology and Immunopathology, 75: 75-83; X206); tejido pulmonar infectado con Nippostrongulus (véase Coffman et al. (1989) Science, 245: 308-310; X200); pulmón adulto total, normal (O200); pulmón total, rag-1 (véase Schwarz et al. (1993), Immunodeficiency, 4: 249-252; O205); bazo K.O. para IL-10 (véase Kuhn et al. (1991), Cell 75: 263-274; X201); bazo adulto total, normal (O201); bazo total, rag-1 (O207); parches de Peyer K.O. para IL-10 (O202); parches de Peyer totales, normales (O210); nodos linfáticos mesentéricos K.O. para IL-10 (X203); nodos linfáticos mesentéricos totales, normales (O211); colon K.O. para IL-10 (X203); colon total, normal (O212); páncreas de ratón NOD (véase Makino et al. (1980), Jikken Dobutsu 29: 1-13; X205); timo total, rag-1 (O.208); riñón total, rag-1 (O209); corazón total, rag-1 (O202); cerebro total, rag-1 (O203); testículo total, rag-1 (O204); hígado total, rag-1 (O206); tejido articular normal de rata (O300) y tejido articular artrítico de rata (X300).

V. Clonación de homólogos de especie de DTLR

Se usan diversas estrategias para obtener homólogos de especie de estos DTLR, preferiblemente de otros primates. Un método es mediante hibridación cruzada, utilizando sondas de ADN de especies íntimamente relacionadas. Puede ser útil entrar en especies evolutivamente similares, como etapas intermedias. Otro método es mediante el uso de cebadores de PCR específicos basándose en la identificación de bloques de similitud o diferencia entre especies particulares, por ejemplo, seres humanos, genes, por ejemplo, áreas de secuencia de polipéptido o nucleótidos altamente conservadas o no conservadas. Como alternativa se pueden usar anticuerpos para la clonación por expresión.

VI. Producción de proteína de DTLR de mamífero

Una construcción de fusión apropiada, por ejemplo, GST, se modifica por ingeniería genética para expresión, por ejemplo, en E. coli. Por ejemplo, se construye un plásmido IGIF pGex de ratón y se transforma en E. coli. Células recién transformadas se cultivan en medio LB que contiene 50 \mug/ml de ampicilina y se inducen con IPTG (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Después de inducción durante una noche, las bacterias se recogen y se aíslan los sedimentos que contienen la proteína de DTLR. Los sedimentos se homogenizan en tampón TE (Tris-base 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM y pefabloc 2 mM) en 2 litros. Se hace pasar este material tres veces a través de un microfluidizador (Microfluidics, Newton, MA, EE.UU.). Se centrifuga el sobrenadante fluidizado en un rotor Sorvall GS-3 durante 1 hora a 13.000 rpm. Se filtra el sobrenadante resultante que contiene la proteína DTLR y se hace pasar sobre una columna de glutation-SEPHAROSE equilibrada en Tris-base 50 mM, pH 8,0. Las fracciones que contienen la proteína de fusión DTLR-GST se combinan y se escinden con trombina (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN, EE.UU.). Después se hace pasar la combinación escindida sobre una columna de Q-SEPHAROSE equilibrada en Tris base 50 mM. Las fracciones que contienen DTLR se combinan y diluyen en agua destilada fría, para reducir la conductividad y se hacen pasar nuevamente sobre una columna nueva de Q-Sepharose, sola o en sucesión con una columna de anticuerpo por inmunoafinidad. Las fracciones que contienen la proteína DTLR se combinan, se forman alícuotas y se almacenan en el congelador a -70ºC.

La comparación del espectro de CD con la proteína DTLR1 puede sugerir que la proteína está correctamente plegada. Véase Hazuda et al. (1969) J. Biol. Chem., 264: 1689-1693.

VII. Ensayos Biológicos con DTLR

Los ensayos biológicos por lo general se dirigirán a la característica de unión a ligando de la proteína o a la actividad de quinasa/fosfatasa del receptor. La actividad típicamente será reversible, al igual que otras muchas actividades de fosfatasa o fosforilasa mediadas por acciones enzimáticas, actividades que se miden fácilmente mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Hardie et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook, volúmenes I y II, Academic Press, San Diego, CA, EE.UU.; Hanks et al. (1991) Meth. Enzymol., 200: 38-62; Hunter et al. (1992) Cell, 70: 375-388; Lewin (1990) Cell (61: 743-752; Pines et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 56: 449-463; y Parker et al. (1993) Nature, 363: 736-738.

La familia de interleuquina 1 contiene moléculas, cada una de las cuales es un mediador importante de las enfermedades inflamatorias. Para una revisión exhaustiva véase Dinarello (1996) Biologic basis for interleukin-1 in disease, en Blood 87: 2095-2147. Hay sugerencias de que diversos ligandos Toll pueden jugar papeles importantes en el inicio de la enfermedad, en particular en respuestas inflamatorias. El hallazgo de proteínas novedosas relacionadas con la familia IL-1 promueve la identificación de moléculas que proporcionan la base molecular para el inicio de la enfermedad y permite el desarrollo de estrategias terapéuticas de alcance y eficacia aumentados.

VIII. Preparación de anticuerpos específicos para, por ejemplo, DTLR4

Se inmunizan por vía intraperitoneal ratones Balb/c endogámicos con formas recombinantes de la proteína, por ejemplo, DTLR4 purificado o células NIH-3T3 transfectadas estables. Los animales se refuerzan en puntos de tiempo apropiados con proteína, con o sin adyuvante adicional, para estimular adicionalmente la producción de anticuerpos. Se recoge el suero o los hibridomas producidos con bazos recogidos.

Como alternativa, se inmunizan los ratones Balb/c con células transformadas con el gen o fragmentos del mismo, ya sea células endógenas o exógenas, o con membranas aisladas enriquecidas para expresión del antígeno. Se recoge el suero en el momento apropiado, típicamente después de numerosas administraciones adicionales. Pueden ser útiles diversas técnicas de terapia génica, por ejemplo, para producir proteína in situ, para generar una respuesta inmune.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se fusionan esplenocitos con un compañero de fusión apropiado y se seleccionan hibridomas en el medio de cultivo mediante procedimientos convencionales. Se seleccionan los sobrenadantes de hibridoma para determinar la presencia de anticuerpos que se unan al DTLR deseado, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo. También se pueden seleccionar o preparar anticuerpos que reconozcan específicamente realizaciones específicas de DTLR.

En otro método, se presentan péptidos sintéticos o proteína purificada a un sistema inmune para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology (Wiley/Greene; y Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. En situaciones apropiadas, se marca el reactivo de unión como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, mediante fluorescencia o de otra manera; o bien, se inmoviliza a un sustrato para métodos de tratamiento en bandeja. También se pueden introducir ácidos nucleicos en células de un animal para producir el antígeno, lo cual sirve para provocar una respuesta inmune. Véase, por ejemplo, Wang et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci., 90: 4156-4160; Barry et al. (1994) BioTechniques, 16: 616-619; y Xiang et al. (1995) Immunity, 2: 129-135.

IX. Producción de proteínas de fusión con, por ejemplo, DTLR5

Se preparan diversas construcciones de fusión con DTLR5. Esta porción del gen se fusiona a un marcador de epítopo, por ejemplo, un marcador FLAG o a una construcción de sistema de dos híbridos. Véase, por ejemplo, Fields y Song (1989) Nature 340: 245-246.

Se puede usar el marcador de epítopo en un procedimiento de clonación por expresión con detección con anticuerpos anti-FLAG para detectar un compañero de unión, por ejemplo, un ligando, para el DTLR5 respectivo. También se puede usar un sistema de dos híbridos para aislar las proteínas que se unen específicamente a DTLR5.

X. Cartografía cromosómica de DTLR

Se prepara una capa extendida de cromosomas. Se lleva a cabo la hibridación in situ en preparaciones cromosómicas obtenidas de linfocitos estimulados con fitohemaglutinina cultivados durante 72 horas. Se añade 5-bromodesoxiuridina durante las siete horas finales de cultivo (60 \mug/ml de medio) para garantizar una formación de bandas cromosómicas de buena calidad después de la hibridación.

Se clona un fragmento apropiado, por ejemplo, un fragmento de PCR, amplificado con ayuda de cebadores sobre plantilla de ADNc de célula B total, en un vector apropiado. Se marca el vector mediante traslación de mella con ^{3}H. Se hibrida la sonda radiomarcada a capas extendidas de metafase, tal como se ha descrito en Mattei et al. (1985) Hum. Genet., 69: 327-331.

Después de recubrir con emulsión de rastreo nuclear (KODAK NTB_{2}) se exponen diapositivas, por ejemplo, durante 18 días a 4ºC. Para evitar cualquier deslizamiento de los granos de plata durante el procedimiento de formación de bandas, las capas extendidas de cromosomas se tiñen en primer lugar con solución Giemsa tamponada y se fotografía la metafase. Después se lleva a cabo la formación de bandas R mediante el método Giemsa de fotólisis con fluorocromo y se vuelven a fotografiar las metafases antes del análisis.

Como alternativa se pueden efectuar FISH, tal como se ha descrito anteriormente. Los genes de DTLR se localizan sobre cromosomas diferentes. DTLR2 y DTLR3 se localizan en el cromosoma humano 4; DTLR4 se localiza en el cromosoma humano 9; y DTLR5 se localiza en el cromosoma humano 1. Véanse las Figuras 4A-4D.

\vskip1.000000\baselineskip

XI. Relación de estructura actividad

Se determina la información sobre la trascendencia de residuos particulares utilizando procedimientos y análisis convencionales. Se lleva a cabo el análisis de mutagénesis convencional, por ejemplo, generando muchas variantes diferentes en posiciones determinadas, por ejemplo, en las posiciones identificadas anteriormente y evaluando las actividades biológicas de las variantes. Esto se puede realizar hasta el grado de determinar las posiciones que modifiquen la actividad, o para enfocarse sobre posiciones específicas para determinar los residuos que pueden sustituirse para retener, bloquear o modular la actividad biológica.

Como alternativa, el análisis de variantes naturales puede indicar qué posiciones toleran las mutaciones naturales. Esto puede ser el resultado de análisis poblacionales de variación entre individuos o a través de cepas o especies. Se analizan muestras de individuos seleccionados, por ejemplo, mediante análisis de PCR y secuenciación. Esto permite la evaluación de polimorfismos de población.

\vskip1.000000\baselineskip

XI. Aislamiento de un ligando para un DTLR

Se puede usar un DTLR como un reactivo de unión específica para identificar su compañero de unión, aprovechando su especificidad de unión, de manera muy similar a como se usaría un anticuerpo. Se marca un reactivo de unión tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, mediante fluorescencia o de otra manera o bien se inmoviliza a un sustrato para métodos de tratamiento en bandeja.

La composición de unión se usa para seleccionar una biblioteca de expresión preparada a partir de una línea de células que expresa un compañero de unión, es decir, un ligando, preferiblemente asociado a membrana. Se usan técnicas de tinción convencionales para detectar o clasificar el ligando expresado en la superficie, o se seleccionan por tratamiento en bandeja las células transformadas que expresan en la superficie. Se lleva a cabo la selección de la expresión intracelular mediante diversos procedimientos de tinción o de inmunofluorescencia. Véase también McMahan et al. (1991) EMBO J., 10: 2821-2832.

Por ejemplo, el día 0, pre-recubrir portaobjetos Permanox de dos cámaras con 1 ml por cámara de fibronectina, 10 ng/ml de PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar una vez con PBS. Después sembrar en placas células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara, en 1,5 ml de medio de cultivo. Incubar durante una noche a 37ºC.

El día 1 para cada muestra, preparar 0,5 ml de una solución de 66 \mug/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 66 \muM y 4 \mug de ADN en DME sin suero. Para cada serie se prepara un control positivo, por ejemplo, ADNc de DTLR-FLAG a dilución de 1 y 1/200 y un falso negativo. Enjuagar las células con DME sin suero. Añadir la solución de ADN e incubar durante 5 h a 37ºC. Retirar el medio y añadir 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 minutos. Retirar y lavar una vez con DME. Añadir 1,5 ml de medio de cultivo e incubar durante una noche.

El día 2, cambiar el medio. Los días 3 y 4, las células se fijan y se tiñen. Enjuagar las células dos veces con Solución Salina Tamponada de Hank (HBSS) y fijar en paraformaldehído al 4% (PFA)/glucosa durante 5 minutos. Lavar tres veces con HBSS. Los portaobjetos se pueden almacenar a -80ºC después de que se ha retirado todo el líquido. Para cada cámara, se realizan incubaciones de 0,5 ml de la siguiente manera. Añadir HBSS/saponina (al 0.1%) con 32 \mul/ml de NaN_{3} 1 M durante 20 min. Después se lavan las células 1X con HBSS/saponina. Añadir el DTLR o el complejo de DTLR/anticuerpo apropiado a las células e incubar durante 30 min. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. De ser apropiado añadir en primer lugar anticuerpo durante 30 min. Añadir el segundo anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo anti-ratón de vector, a diluciones de 1/200 e incubar durante 30 min. Preparar solución de ELISA, por ejemplo, una solución de peroxidasa de rábano picante Vector Elite ABC y preincubar durante 30 min. Usar, por ejemplo, una gota de solución A (avidina) y una gota de solución B (biotina) por 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavar dos veces las células con HBSS/saponina. Añadir la solución de ABC HRP e incubar durante 30 min. Lavar dos veces las células con HBSS, el segundo lavado durante dos min, lo que cierra las células. Después añadir ácido diaminobenzoico (DAB) Vector durante 5 a 10 min. Usar dos gotas de tampón más 4 gotas de DAB más dos gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml de agua destilada en vidrio. Retirar cuidadosamente la cámara y enjuagar el portaobjetos en agua. Secar al aire durante unos cuantos minutos, después añadir una gota de Crystal Mount y un cubreobjetos. Hornear durante cinco minutos a 85-90ºC.

Evaluar la tinción positiva de los grupos y subclonar progresivamente para aislamiento de los genes únicos responsables de la unión.

Como alternativa, se usan reactivos de DTLR para purificar por afinidad o clasificar las células que expresan un ligando putativo. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., o Asusubel et al..

Otra estrategia es seleccionar un receptor unido a membrana mediante tratamiento en bandeja. Se construye el ADNc de receptor tal como se ha descrito anteriormente. El ligando se puede inmovilizar y usarse para inmovilizar células de expresión. Se puede conseguir la inmovilización mediante el uso de anticuerpos apropiados que reconozcan, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de DTLR o mediante el uso de anticuerpos generados frente a los primeros anticuerpos. Los ciclos recursivos de selección y amplificación conducen al enriquecimiento de los clones apropiados y al aislamiento final de los clones que expresan el receptor.

Se pueden seleccionar bibliotecas de expresión de fago mediante los DTLR de mamífero. Las técnicas apropiadas de marcaje, por ejemplo, con anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcaje específico de los clones apropiados.

Las realizaciones específicas descritas en este documento se proporcionan únicamente a modo de ejemplo.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Schering Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Kenilworth

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Nueva Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

CÓDIGO POSTAL: 07033

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (908) 298-4000

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (908) 298-5388

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS RECEPTORAS HUMANAS, REACTIVOS Y MÉTODOS {}\hskip4.6cm RELACIONADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Macintosh Power PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: 8.0

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Microsoft Word 6.0

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/044.293

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-MAYO-1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/072.212

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-ENERO-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: USSN 60/076.947

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-MARZO-1998

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2367 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2358

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..2358

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 786 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2355 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2352

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..2352

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 784 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2715 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2712

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 64..2712

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5

18

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 904 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6

23

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2400 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2397

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7

27

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 799 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8

31

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1275 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1095

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9

34

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 365 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3138 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..3135

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..3135

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11

39

40

41

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1045 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12

44

45

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 180 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..177

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 59 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 990 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..988

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 329 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1557 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..513

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 278

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 278 designado G, puede ser G o C"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 445

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 445 designado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 572

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 572, 593, 600, 607, 617, 622, 625, 631, 640, 646, 653, 719, 775 y 861 se designan C, cada uno puede ser A, C, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 629 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..486

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 144

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 144 y 255 designados C, pueden ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 162 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 427 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..426

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 662 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..627

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 54

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 54, 103 y 345 son designados A, cada uno pueden ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 313

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 313 designado G, puede ser G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 316

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 316, 380, 407 y 408 designados C, cada uno puede ser A, C, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 209 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4865 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 107..2617

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 173..2617

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 81

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 81, 3144, 3205 y 3563 designados A, cada uno puede ser A, C, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 84

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótidos 84 designado C, puede ser C o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 739

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 739 designado C, puede ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3132

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 3132, 3532, 3538 y 3553 designados G, cada uno puede ser G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3638

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 3638 designado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3677

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 3677, 3685 y 3736 designados C, cada uno puede ser A o C"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25

63

64

65

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 837 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26

69

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 300 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..300

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 186

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 186, 196, 217, 276 y 300 designados C, cada uno puede ser A, C, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1756 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1182

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1643

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 1643 designado A, puede ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1664

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 1664 designado C, puede ser A, C, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1680

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 1680 y 1735 designados G, pueden ser G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1719

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 1719 designado C, puede ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1727

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 1727 designado A, puede ser A, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 394 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 999 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..847

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 4 y 23 designados C, cada uno puede ser A, C, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 650

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 650 designado G, puede ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 715

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 715, 825 y 845 designados C, cada uno puede ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 282 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32

\vskip1.000000\baselineskip

80

800

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1173 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1008

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 854

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "el nucleótido 854 designado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1171

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "los nucleótidos 1171 y 1172 designado C, cada uno puede ser A, C, G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 336 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34

84

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 497 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35

86

Claims (9)

1. Una proteína o péptido de DTLR4 sustancialmente puro o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 92% con SEC ID Nº: 8 a lo largo de su longitud completa, donde dicho polipéptido tiene una actividad de receptor similar a Toll.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicho polipéptido muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 95% con SEC ID Nº: 8.

3. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 8.

4. Un a proteína de fusión que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 7.

9. Un proceso para producir de forma recombinante un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 8 en condiciones en las cuales se expresa el polipéptido.