KR100388860B1 - 사람의 Ｔｏｌｌ-유사 수용체 단백질, 관련 시약 및 방법 - Google Patents

사람의 Ｔｏｌｌ-유사 수용체 단백질, 관련 시약 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 드로소필라 Toll 수용체 및 사람의 IL-1 수용체와 상동성인, DNAX Toll-유사 수용체 2-10(DTLR 2-10)으로 표시되는 9개의 사람의 수용체를 암호화하는 핵산, 정제된 DTLR 단백질 및 이의 단편, 이들 수용체에 대한 모노- /폴리클로날 항체, 및 진단 및 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

사람의 Ｔｏｌｌ-유사 수용체 단백질, 관련 시약 및 방법{Human Toll-like receptor proteins, related reagents and methods}
일반적으로 재조합 DNA 기술이란 공급원으로부터의 유전 정보를 벡터에 통합시킨 후, 이를 숙주에 도입시키는 것과 같은 공정을 수행하여, 전달된 유전 정보가 복사되고/되거나 새로운 환경에서 발현되도록 하는 것을 의미한다. 통상적으로, 유전 정보는 목적하는 단백질 생성물을 암호화하는 메신저 RNA (mRNA)로부터 유래된 상보적 DNA (cDNA)의 형태로 존재한다. 통상적으로 운반체는 나중에 숙주에서 복제될 cDNA를 포함하며, 일부 경우에, 당해 cDNA의 발현을 조정하여 숙주에서 암호화된 생성물의 합성을 지시할 수 있는 능력을 갖는 플라스미드이다.
한 동안, 포유동물의 면역 반응은 '면역 네트워크'로 명명된, 일련의 복잡한세포 상호반응을 기본으로 하는 것으로 알려졌었다. 최근의 연구는 상기 네트워크의 내부 작용에 대한 새로운 통찰을 제공하였다. 수 많은 면역 반응이 사실, 임파구, 대식구, 과립구, 및 기타 세포의 네트워크-유사 상호반응과 관련이 있다는 것이 자명하며, 면역학자들은 이제 일반적으로 림포킨, 사이토킨, 또는 모노킨으로 알려진 가용성 단백질이 이들 세포의 상호반응을 조정하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 견해를 갖고 있다. 따라서, 세포 조절 인자의 단리, 특징화, 및 작용 메카니즘에 상당한 관심이 쏠리고 있으며, 이를 이해함으로써 수 많은 의학적 비정상성, 예를 들면, 면역 시스템의 장애의 진단 및 치료에 있어서 확실한 진보가 있을 것이다.
림포킨은 여러가지 방법으로 세포 활성을 명확하게 매개한다. 이들은 다능성 조혈 간세포의 증식, 성장, 및/또는 복합 면역 시스템을 구성하는 다양한 세포 계통을 포함한 수 많은 원종세포(progenitor)로의 분화를 뒷받침하는 것으로 밝혀졌다. 세포 성분간의 적절하고 균형잡힌 상호반응이 건강한 면역 반응에 있어 필수적이다. 상이한 세포 계통은 림포킨을 다른 약제와 함께 투여시 통상 상이한 방법으로 반응한다.
면역 반응에 특히 중요한 세포 계통으로는 다음 두 부류의 임파구가 있다: 면역글로불린 (외부 물질을 제거하기 위해, 이에 대한 인지 및 결합 능력을 갖는 단백질)을 생산하고 분비할 수 있는 B-세포, 및 림포킨을 분비하며 면역 네트워크를 구성하는 B-세포 및 여러가지 기타 세포 (기타 T-세포를 포함)를 유도하거나 억제하는 T-세포의 각종 서브세트. 이들 임파구는 수 많은 다른 세포 타입과 상호반응한다.
다른 중요한 세포 계통은 체내 전체의 모관에 근접하여 위치하는 과립-함유 결합조직 세포인, 비만(mast) 세포 (모든 포유동물종에서 양성인 것으로 확인되어 있지 않음)이다. 이들 세포는 특히 폐, 피부, 및 위장 및 생식관에서 고농도로 발견된다. 비만 세포는 알레르기-관련 질환, 특히 다음과 같은 아나필락시(anaphylaxis)에 있어서 중추적 역할을 한다: 선택된 항원이 비만 세포 표면상의 수용체에 결합된 한 부류의 면역글로불린과 가교결합시, 비만 세포는 탈과립 현상을 일으키고 매개물질, 예를 들어 알레르기 반응(예: 아나필락시)를 유발하는 히스타민, 세로토닌, 헤파린, 및 프로스타글라딘을 방출시킨다.
여러가지 면역 질환을 더욱 잘 이해하고 치료하기 위한 연구는 시험관내 면역 시스템의 세포를 통상 유지할 수 없다는 점으로 방해받아왔다. 면역학자들은 수 많은 이들 세포의 배양을 수 많은 림포킨을 포함하여, 여러가지 성장 인자를 함유하는, T-세포 및 기타 세포 상등물을 사용함으로써 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.
인터류킨-1 족의 단백질로는 IL-1α, IL-1β, IL-1RA, 및 최근의 IL-1γ (인터페론-감마 유도 인자, IGIF로도 표시됨)가 있다. 이와 관련된 족의 유전자는 광범위한 생물학적 기능과 관련이 있다[Dinarello (1994) FASEB J. 8:1314-1325; Dinarello (1991) Blood 77:1627-1652; 및 Okamura, et al. (1995) Nature 378:88-91].
또한, 형태형성 발달을 조절하는 여러가지 성장 및 조절 인자가 있다. 이의예로는, IL-1 수용체의 구조적 및 기계적 특징을 공유하는 수용체로의 결합을 통하여 시그날을 보내는 Toll 리간드가 있다[Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; 및 Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell & Devel. Biol. 12:393-416].
상기로부터, 림포킨과 유사한 것을 포함하여, 새로운 가용성 단백질 및 이들의 수용체를 발견하여 개발하는 것이, 예를 들어 면역 시스템 및/또는 조혈 세포의 발달, 분화, 또는 기능에 직접적으로 또는 간접적으로 연루되는 광범위한 퇴행성 또는 비정상적 질환에 대한 새로운 치료에 기여함은 자명하다. 특히, 다른 림포킨의 유익한 활성을 증강시키거나 강화시키는 림포킨-유사 분자에 대한 신규한 수용체를 발견하고 이해하는 것이 매우 유리할 것이다. 본 발명은 인터류킨-1 유사 조성물 및 관련 화합물과의 유사성을 나타내는 리간드에 대한 신규 수용체, 및 이들의 사용법을 제공한다.
본 발명은 형태발생 또는 면역 시스템 기능을 포함한, 포유동물의 생리에 영향을 주기 위한 조성물 및 방법에 관한 7것이다. 특히, 발생 및/또는 면역 시스템을 조절하는 핵산, 단백질, 및 항체를 제공한다. 이들 물질의 진단 및 치료적 용도가 또한 기술되어 있다.
도 1은 드로소필라와 사람의 DTLR의 단백질 구조의 도식적인 비교, 및 척추동물 IL-1 수용체와 식물 질환 내성 단백질에 대한 이들의 관계를 보여준다. 3종의 드로소필라 (Dm) DTLR (Toll, 18w, 및 Mst ORF 단편) [Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399; Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783; 및 Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899]이 4종의 완전 (DTLR 1-4) 및 부분적 (DTLR5) 사람(Hu)의 수용체 옆에 배열되어 있다. PRINTS [Attwood, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:212-217]로 표지되어 있는 수용체 엑토도메인중 각각의 LRR들은 박스로 명확하게 표시되어 있다; LRR 배열의 C- 또는 N-종결 말단과 접해있는 '상부' 및 '하부' Cys-풍부 클러스터는 각각 병치된 반원으로 도시되어 있다. DTLR 1-5 중 내부 Cys-풍부 영역의 소실은 Toll 및 18w의 784 및 977 aa 연장물과 비교시 이들의 더 작은 엑토도메인 (각각 558, 570, 690, 및 652 aa)의 원인이 된다. DmMst 및 HuDTLR5의 불완전한 쇄 (각각 519 및 153 aa 엑토도메인)는 대시 라인으로 표시되어 있다. DTLR, IL-1-타입 수용체 (IL-1R), 세포내 단백질 Myd88, 및 담배 질병 내성 유전자 N 생성물 (DRgN)에 공통적인 세포내 시그날 전달 모듈은 막 하부에 표시되어 있다 [Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475; 및 Rock et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:588]. 추가 도메인으로는 IL-1R에서 Ig-유사 모듈의 트리오 (디설파이드-결합된 루프)가 있다; DRgN 단백질은 NTPase 도메인 (박스)의 특징을 이루고, Myd88은 사멸 도메인 (흑색 타원형)을 갖는다.
도 2A-2B는 Toll- 및 IL-1-유사 사이토킨 수용체의 시그날전달 도메인중 보존된 구조 패턴, 및 2종의 서로 상이한 모듈 단백질을 나타낸다. 도 2A는 공통의 TH(Toll-homology) 도메인의 서열 배열을 나타낸다. DTLR는 도 1에서와 같이 표지된다; 사람 (Hu) 또는 마우스 (Mo) IL-1 족 수용체 (IL-1R1-6)는 먼저 제안한 바와 같이 일련식으로 번호를 매긴다 [Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475]; 담배 (To) 및 아마, 엘. 우시타티시뭄 (Lu)으로부터의 Myd88 및 서열은 각각 더 큰 멀티도메인 분자의 C- 및 N-말단 도메인을 나타낸다. 서열의 갭이 없는 블록 (1-10번)은 박스로 표시되어 있다. 삼각형은 해로운 돌연변이를 나타내는 반면, 화살표의 N-말단의 절단은 사람의 IL-1R1에서 생물활성을 제거한다 [Heguy, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267; 2605-2609]. α-헬릭스 (H), β-스트랜드 (E), 또는 코일 (L)의 PHD [Rost and Sander (1994) Proteins 19:55-72] 및 DSC [King and Sternberg (1996) Proteins Sci. 5:2298-2310] 2차 구조 예측이 표시되어 있다. 아미노산- 쉐이딩(shading) 도식은 화학적으로 유사한 잔기를 표시한다: 소수성, 산성, 염기성, Cys, 방향족, 구조-파괴, 및 소형. IL-1R들, DTLR들 및 전 배열 (ALL)에 대한 진단 서열 패턴은 75%의 엄격도로 컨센서스(Consensus)에 의해 유래되었다. 아미노산 서브셋에 대한 기호는 다음과 같다 (상세한 것은 인터넷 사이트를 참조할 것): o, 알코올; 1, 지방족; ·, 아미노산; a, 방향족; c, 하전된; h, 소수성; -, 네카티브; p, 극성; +, 포지티브; s, 작은; u, 소형; t, 회전유사. 도 2B는 제안된 TH β/α 도메인 폴드의 위상학 다이아그램을 나타낸다. 황색 삼각형으로 나타낸 β-스트랜드 A-E와 유사한 β-시트가 이의 C-종결 말단에 나타나 있으며; α-헬릭스 (원으로 표지된 1-5)는 β-스트랜드와 연결되고; 쇄 연결부는 전면 (보임) 또는 후면 (숨어있음)에 있다. β-시트의 C-말단중 보존된, 하전된 잔기는 회색 (Asp) 또는 단독 흑색 (Arg) 잔기로 표시되어 있다 (교재 참조).
도 3은 시그날전달 도메인 상위족(superfamily)의 진화를 나타낸다. 도 2A의 여러 TH 모듈 배열물을 사용하여 네이버-연결법 [Neighbor-Joining method; Thompson, et al. (1994) Nuclic Acids Res, 22: 4673-4680]으로 계통수를 추론했다. 배열중에 표지된 단백질; 계통수는 TreeVeiw로 나타냈다.
도 4A-4D는 사람의 DTLR 유전자의 FISH 염색체 지도화(mapping)를 나타낸다.사람 임파구의 동시 배양물로부터의 변성된 염색체를 위치 측정용 비오틴화 DTLR cDNA 프로브에 하이브리드화시킨다. 염색체 밴드에 의한 FISH 지도화 데이타 (좌측, 도 4A, DTLR2; 4B, DTLR3; 4C, DTLR4; 4D, DTLR5)의 지정은 FISH 시그날에 DAPI 밴드 염색체를 겹쳐 놓음으로써 달성된다 (중앙 패널) [Heng and Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33:109-122]. 분석은 사람 염색체 표의문자의 형태로 요약되어 있다 (우측 패널).
도 5A-5F는 사람의 DTLR의 mRNA 블롯을 나타낸다. 사람의 다중 조직 블롯 (He, 심장; Br, 뇌; Pl, 태반; Lu, 폐; Li, 간; Mu, 근육; Ki, 신장; Pn, 췌장; Sp, 비장; Th, 흉선; Pr, 전립선; Te, 정소; Ov, 난소; SI, 소장; Co, 결장; PBL, 모세혈 임파구) 및 레인당 대략 2 ㎍의 폴리(A)+RNA를 함유하는 암세포주 [전골수세포 백혈병, HL60; 경부암, HELAS3; 만성 골수성 백혈병, K562; 임파아구성 백혈병, Molt4; 결장직장성 선암, SW480; 흑색종, G361; 부르킷츠(Burkitt's) 임파종 라지(Raji), 부르킷츠; 결장직장성 선암, SW480; 폐암종, A549]를 기재된 바와 같이 DTLR1 (도 5A-5C), DTLR2 (도 5D), DTLR3 (도 5E), 및 DTLR4 (도 5F)를 암호화하는 방사선표지된 cDNA로 프로브화한다. 블롯을 2일 (도 5A-5C) 또는 1주간 (도 5D-5F) -70 ℃에서 스크린을 증감시키며 X-선 필름에 노출시킨다. 일부 레인에서는 이례적인 0.3 kB 종이 나타난다; 하이브리드화 실험은 DTLR 세포질 단편을 암호화하는 메시지를 배제시킨다.
발명의 요약
본 발명은 9종의 신규한 관련 포유동물의 수용체, 예를 들어, DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 및 DTLR10으로 표시되는, 사람의 Toll 수용체 유사 분자 구조물, 및 이들의 생물학적 활성에 관한 것이다. 본 발명에는 상기 폴리펩타이드 자체에 대해 암호화하는 핵산 및 이들의 제조 방법 및 용도가 포함된다. 본 발명의 핵산은 부분적으로, 본 명세서에 포함된 클로닝된 상보적 DNA (cDNA)에 대한 이들의 상동성으로 특징화된다.
특정 양태로, 본 발명은, 서열 4에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR2 단백질 또는 펩타이드; 서열 4의 천연 서열 DTLR2; DTLR2 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 6에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR3 단백질 또는 펩타이드; 서열 6의 천연 서열 DTLR3; DTLR3 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 26에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR4 단백질 또는 펩타이드; 서열 26의 천연 서열 DTLR4; DTLR4 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 10에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR5 단백질 또는 펩타이드; 서열 10의 천연 서열 DTLR5; DTLR5 서열을 포함하는 융합 단백질의 군으로부터 선택된 물질의 조성물을 제공한다.
다른 양태로, 본 발명은, 서열 12에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합DTLR6 단백질 또는 펩타이드; 서열 12의 천연 서열 DTLR6; DTLR6 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 16 또는 18에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR7 단백질 또는 펩타이드; 서열 16 또는 18의 천연 서열 DTLR7; DTLR7 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 32에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR8 단백질 또는 펩타이드; 서열 32의 천연 서열 DTLR8; DTLR8 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 22에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR9 단백질 또는 펩타이드; 서열 22의 천연 서열 DTLR9; DTLR9 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 34에 대해 약 12개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR10; 서열 34의 천연 서열 DTLR10; 및 DTLR10 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질의 군으로부터 선택된 물질의 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 실질적으로 순수한 또는 단리된 단백질은 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 또는 DTLR10의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 절편을 포함하며, 여기서, 상동성은 약 90% 이상의 동일성이고 상기 부분의 아미노산 길이는 약 9개 이상이거나; 상동성은 약 80% 이상의 동일성이고 상기 부분의 아미노산 길이는 약 17개 이상이거나; 상동성은 약 70% 이상의 동일성이고 상기 부분의 아미노산 길이는 약 25개 이상이다. 구체적인 양태로, 상기 물질의 조성물은 서열 4의 성숙 서열을 포함하는 DTLR2이거나; 천연 DTLR2와 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 6의 성숙 서열을 포함하는 DTLR3이거나; 천연 DTLR3과 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 26의 성숙 서열을 포함하는 DTLR4이거나; 천연 DTLR4와 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 10의 완전 서열을 포함하는 DTLR5이거나; 천연 DTLR5와 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 12의 성숙 서열을 포함하는 DTLR6이거나; 천연 DTLR6과 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 16 또는 18의 성숙 서열을 포함하는 DTLR7이거나; 천연 DTLR7과 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 32의 성숙 서열을 포함하는 DTLR8이거나; 천연 DTLR8과 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 22의 완전 서열을 포함하는 DTLR9이거나; 천연 DTLR9와 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내고; 또는 서열 34의 완전 서열을 포함하는 DTLR10이거나; 천연 DTLR10과 상이한 해독후 변형 패턴을 나타내거나; 상기 물질의 조성물은 사람과 같은 영장류를 포함한, 포유동물로부터 선택된 온혈 동물로부터의 단백질 또는 펩타이드일 수 있으며; 이들은 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 폴리펩타이드 절편 1개 이상을 포함하고; 상기 동일성을 나타내는 부분을 다수 나타내며; DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 또는 DTLR10의 천연 대립유전자 변이체이고; 아미노산 길이는 약 30개 이상이며; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 또는 DTLR10에 대해 특이적인 비-중복 에피토프를 2개 이상 나타내고; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6에 대해 약 20개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 약 90% 이상의 서열 동일성을 나타내며; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 또는 DTLR10에 대해 특이적인 비-중복 에피토프를 2개 이상 나타내고; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 또는 DTLR10에 대해 약 20개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐서 90% 이상의 서열 동일성을 나타내며; 글리코실화되고; 천연 글리코실화를 갖는 100 kD 이상의 분자량을 갖고; 합성 폴리펩타이드이며; 고체 기질에 부착되고; 다른 화학 잔기에 접합되어 있으며; 천연 서열로부터 치환도가 5-배 이하이거나; 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체이다.
다른 양태는 멸균 DTLR2 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR2 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR3 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR3 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR4 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR4 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR5 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR5 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR6 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR6 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구,직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR7 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR7 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR8 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR8 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR9 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR9 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체; 멸균 DTLR10 단백질 또는 펩타이드; 또는 DTLR10 단백질 또는 펩타이드, 및 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구적 투여용으로 제형화되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
특정 융합 단백질 양태로, 본 발명은 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 성숙 단백질 서열; FLAG, His6, 또는 Ig 서열을 포함한, 검출 또는 정제 태그(tag); 또는 다른 수용체 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
여러가지 키트 양태는 DTLR3 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 키트, 및: 상기 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 구획; 및/또는 키트중 시약의 사용 또는 폐기에 대한 지침을 포함한다.
결합 화합물 양태로는 천연 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7,DTLR8, DTLR9, 또는 DTLR10 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 화합물을 예로 들 수 있으며, 여기서 상기 단백질은 영장류 단백질이고; 결합 화합물은 Fv, Fab, 또는 Fab2 단편이며; 결합 화합물은 다른 화학 잔기에 접합되어 있거나; 항체는 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 성숙 폴리펩타이드의 펩타이드 서열에 대해 발생되고; 성숙 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 대해 발생되며; 정제된 사람의 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 대해 발생되고; 면역선택되며; 폴리클로날 항체이고; 변성된 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 결합하며; 30 μM 이상의 항원에 대한 Kd를 나타내고; 비드 또는 플라스틱 막을 포함한 고체 기질에 부착되며; 멸균 조성물이거나; 방사선 또는 형광 표지물 등으로 검출가능하게 표지된다. 결합 조성물 키트는 통상적으로 결합 화합물, 및: 상기 결합 화합물을 포함하는 구획; 및/또는 상기 키트중 시약의 사용 또는 폐기에 대한 지침을 포함한다. 통상적으로 키트는 정성적 또는 정량적 분석을 가능케 한다.
다른 조성물은 멸균 결합 화합물, 또는 결합 화합물과 물, 염수, 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비강, 국소, 또는 비경구 투여용으로 제형화되는 담체를 포함한다.
핵산 양태는 포유동물로부터 기원하는 DTLR2-10 단백질 또는 펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 단리된 또는 재조합 핵산; 또는 다음의 핵산: 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 항원성 펩타이드 서열을 암호화하고; 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 항원성 펩타이드 서열 다수를 암호화하며; 상기 절편을 암호화하는 천연 cDNA에 대해 약 80% 이상의 동일성을 나타내고; 추가로 천연 공급원으로부터의 복제 기원을 포함하며; 검출 가능한 표지물을 포함하고; 합성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 6 kb 미만, 바람직하게는 3 kb 미만이며; 영장류를 포함한 포유동물로부터 기원하고; 천연의 전체 길이의 암호화 서열을 포함하며; 상기 DTLR을 암호화하는 유전자에 대한 하이브리드화 프로브이거나; PCR 프라이머, PCR 생성물, 또는 돌연변이 유발 프라이머인 핵산을 포함한다. 상기와 같은 재조합 핵산을 포함하는 세포, 조직, 또는 기관이 또한 제공된다. 바람직하게는, 상기 세포가 원핵세포; 진핵세포; 세균 세포; 효모 세포; 곤충 세포; 포유동물 세포; 마우스 세포; 영장류 세포; 또는 사람의 세포이다. 상기와 같은 핵산, 및: 상기 핵산을 포함하는 구획; 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10 단백질 또는 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 구획; 및/또는 시약의 사용 또는 폐기에 대한 지침을 포함하는 키트가 제공된다. 통상적으로, 상기 키트는 정성적 또는 정량적 분석을 가능케 한다.
다른 양태는 하기의 핵산: 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 3에 하이브리드화되고; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 5에 하이브리드화되며; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 25에 하이브리드화되고; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 9에 하이브리드화되며; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 11에 하이브리드화되고; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 15 또는 17에 하이브리드화되며; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 31에 하이브리드화되고; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 21에 하이브리드화되며; 30 ℃ 및 2M 미만의 염의 세척 조건하에서 서열 33에 하이브리드화되고; 약 30개 이상의 뉴클레오티드 길이에 걸쳐서 영장류 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 또는 DTLR10에 대해 약 85% 이상의 동일성을 나타내는 핵산을 포함한다.
바람직하게는, 상기와 같은 핵산은 세척 조건이 45 ℃ 및/또는 500 mM 염이거나; 동일성이 90% 이상이고/이거나 상기 뉴클레오티드 길이가 55개 이상인 특성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 세척 조건이 55 ℃ 및/또는 150 mM 염이거나; 동일성이 95% 이상이고/이거나 상기 뉴클레오티드 길이가 75개 이상이다.
본 발명은 또한 세포를 포유동물 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 또는 DTLR10의 효능제 또는 길항제와 접촉시킴을 특징으로하는, 세포 또는 조직 배양 세포의 생리 또는 발달을 조절하는 방법을 제공한다.
I. 일반적 설명
본 발명은 특정하게 정의된, 구조적 및 생물학적 특성을 갖는 영장류 DNAX Toll 유사 수용체 분자 (DTLR)인, 포유동물의 아미노산 및 DNA 서열을 제공한다. 이들은 본 명세서에서 각각 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 및 DTLR10으로 표시되며, 1 내지 10개의 사람의 Toll 유사 수용체 족 일원의 수를 증가시킨다. 이들 분자를 암호화하는 여러가지 cDNA를 영장류, 예를 들면, 사람의 cDNA 서열 라이브러리로부터 수득했다. 다른 영장류 또는 다른 포유동물 대응체도 또한 고려될 수 있다.
적용가능한 표준 방법중 일부가 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있거나 언급되어 있다: Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; 또는 Ausubel, et al. (1987 and Periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; 본 명세서에서 각각이 참조로 인용됨.
사람의 DTLR1 암호화 절편의 완전 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 1 및 2에 나타낸다. 참조: Nomura, et al. (1994) DNA Res 1: 27-35. 사람의 DTLR2 암호화 절편의 완전 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 3 및 4에 나타낸다. 사람의 DTLR3 암호화 절편의 완전 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 5 및 6에 나타낸다. 사람의 DTLR4 암호화 절편의 완전 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 7 및 8에 나타낸다. 사람의 DTLR4 암호화 절편의 또다른 핵산 및 상응하는 아미노산 서열이 서열 25 및 26에 제공된다. 사람의 DTLR5 암호화 절편의 일부 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 9 및 10에 나타낸다. 사람의 DTLR6 암호화 절편의 완전 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 11 및 12에 나타내고 마우스 DTLR6의 일부 서열은 서열 13 및 14에 나타낸다. 추가의 마우스 DTLR6 서열은 서열 27 및 29 (뉴클레오티드 서열) 및 서열 28 및 30 (아미노산 서열)에 나타낸다. 사람의 DTLR7 암호화 절편의 일부 뉴클레오티드 (서열 15 및 17) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 16 및 18)이 또한 제공된다. 사람의 DTLR8 암호화 절편의 일부 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 19 및 20에 나타낸다. 사람의 DTLR8 암호화 절편의 더욱 완전한 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 31 및 32에 나타낸다. 사람의 DTLR9 암호화 절편의 일부 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 21 및 22에 나타낸다. 사람의 DTLR10 암호화 절편의 일부 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 23 및 24에 나타낸다. 사람의 DTLR10 암호화 절편의 더욱 완전한 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열은 서열 33 및 34에 나타낸다. 마우스 DTLR10 암호화 절편에 대한 일부 뉴클레오티드 서열은 서열 35에 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 DNAX Toll 유사 수용체 2 (DTLR2)는 서열 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 공유하는 단백질 또는 펩타이드 절편, 또는 이들의 실질적인 단편을 포함하는 단백질을 기재하는데 사용된다. DTLR3와 서열 6; DTLR4와 서열 확인번호: 26; DTLR5와 서열 10; DTLR6와 서열 12; DTLR7과 서열 16 및 18; DTLR8과 서열 32; DTLR9와 서열 22; 및 DTLR10과 서열 34의 경우에도 유사하게 사용된다.
본 발명은 또한 서열이 제공되는 각 DTLR 대립유전자의 단백질 변이체, 예를 들어, 뮤테인 효능제 또는 길항제를 포함한다. 전형적으로, 상기와 같은 효능제 또는 길항제는 약 10% 미만의 서열 차이를 나타내며, 따라서 통상적으로 1- 내지 11-배 치환도, 예를 들면, 2-, 3-, 5-, 7-배 등의 치환도를 갖는다. 기재되는 단백질의 대립유전자 및 기타 변이체, 예를 들면, 천연 다형성 변이체가 또한 포함된다. 전형적으로, 이는 이의 상응하는 생물학적 수용체에 높은 친화성으로, 예를 들면, 약 100 nM 이상, 통상적으로 약 30 nM 이상, 바람직하게는 약 10 nM 이상, 더욱 바람직하게는 약 3 nM 이상의 친화성으로 결합한다. 상기 용어는 또한 본 명세서에서 관련된 천연 형태, 예를 들어 포유동물 단백질의 대립유전자, 다형성 변이체, 및 대사 변이체를 언급하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 서열 4의 아미노산 서열에 대해 실질적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이에는 상대적으로 약간 치환된, 예를 들어, 바람직하게는 약 3 내지 5 미만의 치환도를 갖는 서열 변이체가 포함된다. 유사한 특징이 서열 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 및 34로 제공되는 다른 DTLR 서열에 적용된다.
실질적인 폴리펩타이드 '단편', 또는 '절편'의 길이는 약 8개 이상의 아미노산의 아미노산 잔기 신장물, 일반적으로 아미노산 10개 이상, 더욱 일반적으로는아미노산 12개 이상, 흔히 아미노산 14개 이상, 더욱 흔히는 아미노산 16개 이상, 전형적으로는 아미노산 18개 이상, 더욱 통상적으로는 아미노산 20개 이상, 통상적으로 아미노산 22개 이상, 더욱 통상적으로는 아미노산 24개 이상, 바람직하게는 아미노산 26개 이상, 더욱 바람직하게는 아미노산 28개 이상, 특히 바람직한 양태에서는, 아미노산 약 30개 이상이다. 상이한 단백질 절편의 서열을 적당한 길이의 아미노산에 대해 서로 비교할 수 있다.
아미노산 서열 상동성, 또는 서열 동일성은 잔기 매치(match)를 최적화시킴으로써, 경우에 따라, 요구되는 바와 같은 갭을 도입시킴으로써 측정된다. 참조: Needleham, et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al., (1983) chapter one in Time Warps. String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; 및 software packages from IntelliGenetics, Mountain View, CA; 및 the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI; 이들은 각각 본 명세서에서 참고로 인용됨. 이는 보존적 치환을 매치로 간주시 변화된다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹간의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 상동성 아미노산 서열은 사이토킨 서열에 있어서의 천연 대립유전자 및 종간 변이를 포함하는 것을 의미한다. 전형적인 상동성 단백질 또는 펩타이드는 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 아미노산 서열 절편과 50-100% 상동성 (갭이 도입될 수 있는 경우) 내지 60-100% 상동성 (보존적 치환이 포함되는 경우)을 갖는다. 상동성 측정치는 약 70% 이상, 일반적으로 76% 이상, 더욱 일반적으로는 81% 이상, 흔히 85% 이상, 더욱 흔히는 88% 이상, 전형적으로는 90% 이상, 더욱 전형적으로는 92% 이상, 통상적으로는 94% 이상, 더욱 통상적으로는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상이고, 특히 바람직한 양태에서는, 98% 이상이다. 상동성의 정도는 비교되는 절편의 길이에 따라 변화된다. 대립유전자 변이체와 같은, 상동성 단백질 또는 펩타이드는 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34에 기재된 양태와 대부분의 생물학적 활성을 공유할 것이다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서, 특히 관심있는 영역의 비교는 도 2A에 표시된 것들에 상응하는, 각각의 블록 1 내지 10내의 것들, 또는 블록간 영역에 상응한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "생물학적 활성"은 제한없이, 염증성 반응, 선천적 면역성 및/또는 형태형성 발생에 대한 각각의 리간드에 의한 영향을 기술하는데 사용된다. 예를 들면, 이들 수용체는 IL-1 수용체와 유사하게, 표준 방법으로 용이하게 측정할 수 있는, 포스파타제 또는 포스포릴라제 활성을 매개하여야 한다. 참조: Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; 및 Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738. 수용체는 리간드 결합에 의해 조절되는, 조절가능한 효소와 매우 유사한, 생물학적 활성을 나타낸다. 그러나, 당해 효소 대사수는 수용체 복합체보다 효소에 더욱 가깝다. 또한, 상기와 같은 효소 활성을 유도시키는데 필수적인 수용된 수용체의 수는 대부분의 수용체 시스템보다 더 적으며, 세포당 수천 단위의 수로 유발하는 대부분의 수용체와 대조적으로, 세포당 수십의 수에 더욱 가까운 수일 수 있다. 수용체, 또는 이들의 부분은 일반적 또는 특이적인 기질을 표지시키기 위한 포스페이트 표지화 효소로서 유용할 수 있다.
예를 들어, DTLR의 리간드, 효능제, 길항제, 및 동족체란 용어는 Toll 리간드 유사 단백질에 대한 특징적인 세포 반응을 조절하는 분자, 뿐만 아니라 예를 들어, 수용체가 천연 수용체 또는 항체인 경우, 리간드-수용체 상호반응의 더욱 표준적인 구조상의 결합 경쟁 특징을 갖는 분자를 포함한다. 아마도, 세포 반응은 타입 I 또는 타입 II IL-1 수용체와 관련이 있지만, 구별이 가능한 세포 수용체에 대한 각종 Toll 리간드의 결합을 통하여 매개된다. 참조: Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12:393-416; Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genetics 29:371-3991 and Hultmark (1994) Nature 367:116-117.
또한, 리간드는 상기 수용체, 또는 이의 동족체가 결합하는 천연 리간드, 또는 천연 리간드의 기능적 동족체인 분자로서 제공되는 분자이다. 기능적 동족체는 구조적으로 변형된 리간드일 수 있거나, 적합한 리간드 결합 결정인자와 상호작용하는 분자 형태를 갖는 전혀 관련이 없는 분자일 수 있다. 상기 리간드는 효능제 또는 길항제로서 제공될 수 있다. 참조: Goodman, et al. (eds) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, NewYork.
합리적인 약물 디자인은 또한 수용체 또는 항체 및 기타 효과인자 또는 리간드의 분자 형태의 구조적 연구를 기초로 할 수 있다. 효과인자는 리간드 결합에 대한 반응에 있어서 다른 기능을 매개하는 다른 단백질, 또는 수용체와 정상적으로 상호작용하는 다른 단백질일 수 있다. 특이적인 다른 단백질과 상호작용하는 부위를 측정하기 위한 방법중 하나는 물리적인 구조 결정법으로, 예를 들면, x-선 결정학 또는 2차원 NMR 기술이 있다. 이들은 분자 접촉 영역을 형성하는 아미노산 잔기에 대한 정보를 제공한다. 단백질 구조 결정법에 대한 상세한 내용은 하기 문헌을 참조한다: Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York, 본 명세서에서 참고로 인용됨.
II. 활성
Toll 유사 수용체 단백질은 수 많은 상이한 생물학적 활성을 갖는데, 예를 들면, 포스페이트 대사에 있어서, 특이적인 기질, 전형적으로 단백질에 부가되거나 이로부터 제거된다. 이는 일반적으로 염증작용, 기타 선천적 면역 반응, 또는 형태학적 영향을 조절할 수 있도록 한다. DTLR2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 단백질은 다른 Toll 유사 수용체 단백질에 대해 상동적이나, 각각 구조적으로 상이하다. 예를 들면, 사람의 DTLR2 유전자 암호화 서열은 마우스 DTLR2의 뉴클레오티드 암호화 서열과 약 70%의 동일성을 가진다. 아미노산 수준에서도, 타당한 동일성이 있을 것이다.
DTLR의 생물학적 활성은 기질에 포스페이트 잔기를 부가 또는 제거하는 것과는 전형적으로 특이적인 방법으로, 때로 비특이적인 방법으로, 관련되어 있다. 기질은 동정될 수 있거나, 효소 활성에 대한 조건은 예를 들어 하기 문헌에 기재된 바와 같은 표준 방법으로 검정될 수 있다: Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Qunat. Biol. 56:449-463; and Parker, et al. (193) Nature 363:736-738.
III. 핵산
본 발명은 상응하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드를 암호화 하기 위한, 예를 들어 이들 또는 밀접하게 관련된 단백질 또는 이들의 단편을 암호화하는 단리된 핵산 또는 단편의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은, 개별적으로 또는 그룹으로서, 각각의 DTLR의 특징적인 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 또는 재조합 DNA를 포함한다. 전형적으로, 핵산은 적합한 조건하에서, 서열 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21, 또는 33에 나타낸 핵산 서열 절편과 하이브리드화될 수 있지만, 서열 1의 상응하는 절편과는 하이브리드화되지 않는 것이 바람직하다. 상기 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩타이드는 전체 길이의 단백질, 또는 단편일 수 있으며, 전형적으로 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34에 나타낸 것 중 하나와 고도로 상동성인 아미노산 서열의 절편을 갖는다. 또한, 본 발명은 DTLR2-10 단백질에 상당하는 단편을 갖는 단백질을 암호화하는, 단리된 또는 재조합 핵산, 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 단리된 핵산은 5' 및 3' 플랭크중에 각각의 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리-A 부가 시그날, 및 기타 천연 유전자를 가질 수 있다.
'단리된' 핵산은 실질적으로 순수한, 예를 들어 리보솜, 폴리머라제, 및 종 발생으로부터의 플랭킹 게놈 서열과 같은, 천연 서열을 자연적으로 수반하는 다른 성분으로부터 분리된 핵산으로, 예로는 RNA, DNA, 또는 혼합된 중합체가 있다. 상기 용어는 이의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 포함하며, 천연 조성물로부터 구별될 수 있는 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물, 및 화학적으로 합성된 동족체 또는 이종성 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 동족체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 완전히 또는 실질적으로 순수한 분자의 단리된 형태를 포함한다.
단리된 핵산은 일반적으로 분자의 균질 조성물이나, 일부 양태에서는, 불균질성을, 바람직하게는 소량 함유한다. 상기 불균질성은 목적하는 생물학적 기능 또는 활성에 있어 중요하지 않은 중합체 말단 또는 부분에서 전형적으로 발견된다.
'재조합' 핵산은 이의 생산 방법 또는 이의 구조에 의해 전형적으로 정의된다. 이의 제조 방법, 예를 들어 생산 방법에 의해 제조된 생성물에 대한 언급에 있어서, 생산 방법은 예를 들어, 뉴클레오티드 서열에 사람이 관여하는 단계를 포함하는, 재조합 핵산 기술을 사용한다. 전형적으로 본 발명은 시험관내 조작 단계를 포함하며, 특정 상황하에서는 더욱 전통적인 동물 육종 기술을 포함할 수 있다. 별도로, 천연적으로 서로 연속하지 않는 단편 2개의 융합체를 포함하는 서열을 발생시킴으로써 제조된 핵산일 수 있지만, 천연 생성물, 예를 들면, 이들의 천연 상태로 발견되는 바와 같은 천연 돌연변이체는 배제됨을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 천연적으로 존재하지 않는 벡터로 세포를 형질전환시켜 제조된 생성물은 합성 올리고뉴클레오티드 공정을 사용함으로써 유도된 서열을 포함하는 핵산으로서 포함된다. 상기와 같은 공정은 통상적으로 동일한 것을 암호화하는 중복 코돈으로 또는 보존성 아미노산으로 코돈을 대체시킴으로써 수행되는데, 전형적으로는 제한 효소 서열 인식 부위를 도입 또는 제거한다. 별도로, 상기 방법은 목적하는 기능의 핵산 절편을 함께 연결하여 통상적으로 입수가능한 천연 형태로 발견되지 않는 목적하는 기능의 조합, 예를 들면 융합 단백질을 암호화하는 기능을 포함하는 단독 유전자 통합체를 발생시킴으로써 수행한다. 제한 효소 인식 부위는 통상적으로 상기와 같은 인공 조작의 표적이지만, 다른 부위 특이적 표적, 예를 들어, 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 조정 서열, 또는 기타 유용한 특징을 디자인하여 도입시킬 수 있다. 재조합(예: 융합) 폴리펩타이드에 대해서도 유사한 개념이 적용된다. 이는 이량체 반복단위를 포함한다. 구체적으로, 유전자 암호 중복에 의해, DTLR2-10의 단편 및 여러가지 상이한 관련 분자, 예를 들면, 기타 IL-1 수용체 족 일원으로부터의 서열의 융합체에 상당하는 폴리펩타이드를 암호화하는 합성 핵산이 포함된다.
핵산에 있어서 '단편'은 약 17개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로는 21개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 일반적으로는 25개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로는 30개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로는 35개 이상의 뉴클레오티드, 흔히는 39개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 흔히는 45개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로는 50개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로는 55개 이상의 뉴클레오티드, 일상적으로는 60개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 일상적으로는 66개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 72개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 79개 이상의 뉴클레오티드의 연속 절편이며, 특히 바람직한 양태에서는 85개 이상의 뉴클레오티드이다. 전형적으로, 상이한 유전자 서열의 단편을 적당한 길이의 서열 단편, 특히 하기한 도메인과 같이 정의된 절편상에 대해 서로 비교할 수 있다.
DTLR2-10에 대해 암호화하는 핵산은 특히 이들 자체 또는 밀접하게 관련된 단백질에 대해 암호화하는 유전자, mRNA, 및 cDNA종, 뿐만 아니라 다형성, 대립유전자, 또는 다른 유전자 변이체, 예를 들어 상이한 개별체 또는 관련 종으로부터의 변이체에 대해 암호화하는 DNA를 확인하는데 특히 유용하다. 상기와 같은 선별에 바람직한 프로브는 상이한 다형성 변이체간에 보존되거나 특이성이 결여되어 있는 뉴클레오티드를 함유하는 인터류킨의 영역이며, 전체 길이의 또는 거의 전체 길이인 것이 바람직하다. 다른 경우에 있어서, 다형성 변이체 특이 서열이 더욱 유용하다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 단리된 DNA와 동일하거나 고도로 상동성인 핵산 서열을 갖는 재조합 핵산 분자 및 단편을 포함한다. 특히, 상기 서열은 통상적으로 전사, 해독, 및 DNA 복제를 조정하는 DNA 절편에 기능적으로 결합되어 있다. 이들 추가의 절편은 전형적으로 목적하는 핵산 절편의 발현에 도움을 준다.
상동성, 또는 고도로 동일한 핵산 서열은, 서로 또는 서열 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21, 또는 33에 나타낸 서열과 비교시 확실한 유사성을 나타낸다. 핵산중 상동성에 대한 기준은 서열 비교에 의해 또는 하이브리드화 조건을 기본으로하는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 상동성에 대한 측정치이다. 비교적인 하이브리드화 조건은 하기에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
핵산 서열 비교에 있어서 실질적인 동일성은 비교시, 절편, 또는 이들의 상보적인 스트랜드가 최적으로 정렬된 경우, 적절합 뉴클레오티드 삽입물 또는 결실물과, 약 60% 이상, 일반적으로는 66% 이상, 일상적으로는 71% 이상, 흔히는 76% 이상, 더욱 흔히는 80% 이상, 통상적으로는 84% 이상, 더욱 통상적으로는 88% 이상, 전형적으로는 91% 이상, 더욱 전형적으로는 약 93% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 약 96 내지 98% 이상의 뉴클레오티드와 동일한 것을 의미하며, 특정 양태에서는, 예를 들어 하기 기재되는 절편과 같은 구조 도메인을 암호화하는 절편을 포함한, 약 99% 이상의 뉴클레오티드와 동일한 것이다. 별도로, 실질적인 동일성은 절편을 선택적인 하이브리드화 조건하에서 스트랜드 또는 이의 상보체에, 전형적으로 서열 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21, 또는 33으로부터 유래된 서열을 사용하여 하이브리드화시킬 경우 나타난다. 전형적으로, 선택적인 하이브리드화는 약 14개 이상의 뉴클레오티드 길이에 걸쳐서 약 55% 이상, 더욱 전형적으로는 약 65% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성이 있는 경우 일어난다. 참조: Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res 12:203-213, 본 명세서에서 참조로 인용됨. 기재된 바와 같은, 상동성 비교의 길이는 더 긴 뉴클레오티드에 걸쳐서 비교할 수 있으며, 특정 양태에서는 약 17개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 일상적으로는 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로는 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로는 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로는 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 75 내지 100개 이상의 뉴클레오티드 신장물에 걸쳐서 비교할 수 있다.
하이브리드화에서 상동성에 대한 언급시, 엄격한 조건은 염, 온도, 유기 용매, 및 하이브리드화 반응에서 전형적으로 조정되는 기타 변수의 엄격한 혼합 조건이다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 약 30 ℃를 초과하는 온도, 더욱 통상적으로는 약 37 ℃를 초과하는 온도, 전형적으로는 약 45 ℃를 초과하는 온도, 더욱 전형적으로는 약 55 ℃를 초과하는 온도, 바람직하게는 약 65 ℃를 초과하는 온도, 더욱 바람직하게는 약 70 ℃를 초과하는 온도를 포함한다. 엄격한 염 조건은 약 일상적으로는 500 mM 미만, 통상적으로는 약 400 mM 미만, 더욱 통상적으로는 약 300 mM 미만, 전형적으로는 약 200 mM 미만, 바람직하게는 약 100 mM 미만, 더욱 바람직하게는 약 80 mM 미만이며, 심지어 약 20 mM 미만으로 저하될 수 있다. 그러나, 변수의 조합은 단일 변수의 측정보다 훨씬 더욱 중요하다. 참조: Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370, 본 명세서에서 참고로 인용됨.
별도로, 서열 비교의 경우, 전형적으로 서열 하나는 시험 서열을 비교하는, 참고 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 시험 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 서열 좌표를 표시한 다음, 경우에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 변수를 표시한다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 참고 서열과 비교하여 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성%를 표시된 프로그램 변수를 기준으로하여 계산한다.
비교용 서열의 광학적 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국지적 상동성 알고리즘, 문헌[Needlman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 연구, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검사[참조: 일반적으로 Ausubel et al., 상기]로 수행할 수 있다.
유용한 알고리즘의 일례는 PILEUP이다. PILEUP는 누진적인(progressive), 페어식(pairwise) 정렬체를 사용하여 관련된 서열의 군으로부터 다수의 서열 정렬체를 발생시켜 관련성과 서열 동일성%를 밝힌다. 정렬체를 발생시키는데 사용되는 클러스터링 관계를 나타내는 트리 또는 덴도그램을 플로팅한다. PILEUP는 문헌[Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360]의 누진적인 정렬 방법을 단순화시킨 것을 사용한다. 사용되는 방법은 문헌[Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153]에 기재된 방법과 유사하다. 프로그램은 서열을 300개 까지 정렬시킬 수 있으며, 각 서열의 최대 길이는 5,000개의 뉴클레오티드 또는 아미노산이다. 다중 정렬 방법은 2개의 가장 유사한 서열의 페어식 정렬로 시작하여, 2개의 정렬된 서열의 클러스터를 생산한다. 이후 상기 클러스터를 다음번의 가장 연관있는 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터에 정렬시킨다. 2개의 서열 클러스터는 2개의 각 서열의 페어식 정렬을 단순히 연장시켜 정렬시킨다. 최종 정렬은 일련의 누진적인, 페어식 정렬에 의해 수행된다. 상기 프로그램은 서열 비교 영역에 대해 특정 서열 및 이들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고 상기 프로그램 변수를 지정함으로써 수행된다. 예를 들면, 참고 서열을 다른 시험 서열과 비교하여 하기 변수를 사용하여 서열 동일성% 관계를 결정할 수 있다: 디폴트 갭 중량 (3.00), 디폴트 갭 길이 중량 (0.10), 및 칭량된 말단 갭.
서열 동일성 및 서열 유사성%를 결정하는데 적합한 다른 예의 알고리즘은 BLAST 알고리즘으로, 이는 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 다음을 통하여 공개적으로 입수할 수 있다: the National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). 상기 알고리즘은 데이타베이스 서열중 동일한 길이의 워드와 정렬시 일정 포지티브-점수의 역치 스코어 T와 매치되거나 만족시키는, 의심되는 서열중 길이 w의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어 서열 쌍 (HSP: High Scoring sequence Pair)을 1차로 확인하는 단계를 포함한다. T는 이웃하는 워드 스코어 역치를 언급한다[Altschul, et al., 상기]. 이들 초기의 이웃하는 워드의 적중은 추적을 개시하기 위한 인자로서 작용하여 이들을 포함하는 더 긴 HSP를 발견할 수 있다. 이어서 워드 적중을 축적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 두 방향으로 연장시킨다. 각 방향에서의 워드 적중의 연장은 축적 정렬 스코어가 이의 최대 도달 값으로부터 정량 X로 떨어질 때; 축적 스코어가 1개 이상의 네가티브-스코어링 유수 정렬의 축적으로 인하여, 제로 또는 그 이하로 될 때; 또는 각 서열의 말단에 도달하였을 때 중단한다. BLAST 알고리즘 변수 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915] 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=4, 및 두 스트랜드의 비교를 사용한다.
서열 동일성%를 계산하는 것 외에, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다[참조: Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5787]. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 측정치중 하나는 가장 작은 합의 가능성 (P(N))으로, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간의 매치가 발생할 가능성의 지표를 제공한다. 예를 들면, 시험 핵산을 참고 핵산과 비교시 가장 작은 합의 가능성이 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우 핵산이 참고 서열과 유사한 것으로 간주된다.
폴리펩타이드의 핵산 서열 2개가 실질적으로 동일하다는 다른 지표는 하기 기재되는 바와 같이, 제1 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 제2 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 면역학적으로 교차 반응성인 경우이다. 따라서, 폴리펩타이드는 전형적으로 제2 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 것으로, 예를 들면, 2개의 펩타이드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 지표는 하기 기재되는 바와 같이, 2개의 분자가 엄격한 조건하에서 서로 하이브리드화되는 것이다.
단리된 DNA는 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 결실, 뉴클레오티드 삽입, 및 뉴클레오티드 신장물의 역위에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 이들 변형으로 상기 단백질 또는 이의 유도체를 암호화하는 신규한 DNA 서열이 생성된다. 이들 변형된 서열을 사용하여 뮤테인(mutein)을 생산하거나 변이종의 발현을 향상시킬 수 있다. 향상된 발현은 유전자 증폭, 증가된 전사, 증가된 해독, 및 기타 메카니즘을 포함할 수 있다. 상기와 같은 돌연변이 DTLR-유사 유도체는 유전자 암호 축퇴성(degeneracy)을 사용하는 잠재(silent) 돌연변이를 포함하여, 단백질 또는 이의 단편의 미리 결정된 또는 부위-특이적인 돌연변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 '돌연변이 DTLR'은 상기 나타낸 바와 같은 DTLR의 상동성 정의내에 포함되지만, 결실, 치환, 또는 역위법에 의해, 천연에서 발견되는 바와 같은 다른 DTLR-유사 단백질과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 특히, '부위 특이적 돌연변이 DTLR'은 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 단백질과 실질적인 상동성을 갖는 단백질을 포함하며, 전형적으로 본 명세서에 기재된 형태의 생물학적 활성 또는 효과를 대부분 공유한다.
부위 특이적 돌연변이 부위가 미리 결정되어 있지만, 돌연변이체가 부위 특이적일 필요는 없다. 포유동물의 DTLR 돌연변이는 발현과 커플링된, 유전자중 아미노산을 삽입 또는 결실시켜 수행할 수 있다. 치환, 결실, 삽입, 또는 이들이 함께 발생하여 최종 작제물을 발생시킬 수 있다. 삽입은 아미노- 또는 카복시-종결 융합을 포함한다. 랜덤 돌연변이 유발은 표적 코돈에서 수행될 수 있으며 발현된포유동물의 DTLR 돌연변이체를 목적하는 활성에 대해 선별할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA중 미리 결정된 부위에서 치환 돌연변이를 일으키는 방법은 당해 분야에 숙지되어 있으며, 예를 들면 M13 프라이머 돌연변이 유발법이다. 참조: Sambrook, et al. (1989) and Ausubel, et al. (1987 and periodic Supplements).
DNA에서의 돌연변이는 통상적으로 판독 프레임을 벗어난 암호화 서열에서는 발생하지 말아야하며 하이브리드화되어 루프 또는 머리핀과 같은 mRNA 2차 구조를 생성시킬 수 있는 상보적 영역을 발생시키지 않는 것이 바람직하다.
문헌[Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862]에 기재된 포스포르아미다이트법은 적합한 합성 DNA 단편을 생산한다. 상보적인 스트랜드를 합성하고 상기 스트랜드를 함께 적합한 조건하에서 어닐링시키거나 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보적인 스트랜드에 적합한 프라이머 서열을 첨가함으로써 이중 스트랜드 단편이 통상적으로 수득된다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술이 종종 돌연변이 유발에 적용될 수 있다. 별도로, 미리 결정된 부위에서의 정의된 돌연변이를 발생시키기 위한 방법에서는 돌연변이 유발 프라이머가 통상적으로 사용된다. 참조: Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; and Dieffenbach and Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.
IV. 단백질, 펩타이드
상기한 바와 같이, 본 발명은 예를 들어 이의 서열이 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34에 기재되어 있으며, 상기한 바와 같은, 영장류의 DTLR2-10을 포함한다. 예를 들어, 상기 서열의 부분과 에피토프 태그 및 기능성 도메인을 포함한 다른 것을 합한 융합 단백질을 포함하여, 대립유전자 및 기타 변이체가 또한 고려된다.
본 발명은 또한 재조합 단백질, 예를 들면, 이들 설치류 단백질로부터의 절편을 사용한 이종성 융합 단백질을 제공한다. 이종성 융합 단백질은 동일한 방법으로 천연적으로는 통상적으로 융합되지 않는 단백질 또는 절편의 융합체이다. 따라서, DTLR과 IL-1 수용체의 융합 생성물은 전형적으로 단일 해독 생성물로서 제조되며 예를 들어 각 근원의 펩타이드로부터 유래된 서열 또는 항원성과 같은 특성을 나타내는, 전형적인 펩타이드 연결로 융합된 서열을 갖는 연속적인 단백질 분자이다. 유사한 개념이 이종성 핵산 서열에도 적용된다.
또한, 다른 관련된 단백질, 예를 들어 종 변이체를 포함하여, IL-1 수용체 또는 다른 DTLR로부터의 유사한 기능성 또는 구조적 도메인을 합함으로써 신규 작제물을 만들 수 있다. 예를 들면, 리간드-결합 또는 기타 절편을 상이한 신규 융합 폴리펩타이드 또는 단편 사이에서 '스와핑 (swapping)'시킬 수 있다. 참조: Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; and O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15922, 본 명세서에서 참고로 인용됨. 따라서, 신규한 특이성 조합을 나타내는 신규한 키메라성 폴리펩타이드는 수용체-결합 특이성의 기능적 연결로부터 발생한다. 예를 들면, 다른 관련 수용체 분자로부터의 리간드 결합 도메인을 첨가하거나 상기 또는 관련된 단백질의 다른 도메인에 대해 대체시킬 수 있다. 생성된 단백질은 통상적으로 하이브리드 기능 및 특성을 갖는다. 예를 들면, 융합 단백질은 융합 단백질을 특정 아세포 소기관으로 격리시키는데 제공될 수 있는 표적화 도메인을 포함할 수 있다.
후보 융합 파트너 및 서열은 다양한 서열 데이타베이스[예: GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA; and BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI (이들은 본 명세서에서 참고로 인용됨)]로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 특히 Toll 리간드를 결합시키고/시키거나 시그날 전달에 영향을 주는 뮤테인을 제공한다. 사람의 DTLR1-10과 다른 IL-1족 일원과의 구조적 정렬은 보존된 특징/잔기를 나타낸다. 도 3A 참조. 사람의 DTLR 서열과 다른 IL-1 족 일원과의 정렬은 다양한 구조적 및 기능적으로 공유되는 특징을 나타낸다. 참조: Bazan, et al. (1996) Nature 379:591; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; and Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269.
IL-1α 및 IL-1β 리간드는 IL-1 수용체 타입 I을 1차 수용체로서 결합시키며 이어서 상기 복합체는 IL-1 수용체 타입 III와 높은 친화성 수용체 복합체를 형성한다. 상기와 같은 수용체 서브유니트는 아마도 신규한 IL-1 족 일원과 공유될 것이다.
다른 종의 DTLR2-10 서열의 대응체, 예를 들어, 상응하는 영역중에서의 유사한 변화는 리간드 또는 기질과의 유사한 상호반응을 제공하여야 한다. 마우스 서열 또는 사람의 서열로 치환하는 것이 특히 바람직하다. 역으로, 리간드 결합 상호반응 영역으로부터 멀리 떨어진 보존적 치환은 아마도 대부분의 시그날 전달 활성을 유지할 것이다.
영장류 DTLR2-10의 '유도체'로는 아미노산 서열 돌연변이체, 글리코실화 변이체, 대사 유도체 및 다른 화학 잔기와의 공유결합성 또는 집합성 접합체가 있다. 공유결합성 유도체는 DTLR 아미노산 측쇄 또는 N- 또는 C-종결부에서 발견되는 그룹에 작용기를, 예를 들어, 당해 분야에 숙지된 방법으로 연결함으로써 제조될 수 있다. 이들 유도체는 비제한적으로, 카복실 종결기의, 또는 카복실 측쇄를 함유하는 잔기의 지방족 에스테르 또는 아미드, 히드록실기-함유 잔기의 O-아실 유도체, 및 아미노 종결 아미노산 또는 아미노-기 함유 잔기, 예로는 리신 또는 아르기닌의 N-아실 유도체를 포함할 수 있다. 아실기는 C3 내지 C18 정상 알킬을 포함하는 알킬-잔기의 군으로부터 선택되며, 알카노일 아로일 종을 형성한다.
특히, 합성 및 프로세싱중에, 또는 추가 프로세싱 단계중에 폴리펩타이드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 이루어지는 글리코실화 변형이 포함된다. 이를 수행하는데 특히 바람직한 수단은 폴리펩타이드를 통상적으로 상기와 같은 프로세싱을 제공하는 세포로부터 유래된 글리코실화 효소, 예를 들면, 포유동물의 글리코실화 효소에 노출시키는 것이다. 탈글리코실화 효소가 또한 고려된다. 포스포릴화된 아미노산 잔기, 예로는 포스포티로신, 포스포세린, 또는 포스포트레오닌을 포함하여, 다른 소수의 변형을 갖는 동일한 1차 아미노산 서열체가 또한 포함된다.
주요 유도체군은 수용체 또는 이의 단편과 폴리펩타이드의 다른 단백질과의 공유결합성 접합체이다. 이들 유도체는 N- 또는 C-종결 융합체와 같은 재조합 배양으로 또는 반응성 측쇄군을 통한 가교 단백질에서의 이들의 유용성에 대해 당해 분야에 공지된 시약을 사용함으로써 합성할 수 있다. 가교제에 대해 바람직한 유도체화 부위는 유리 아미노기, 탄수화물 잔기, 및 시스테인 잔기이다.
수용체와 기타 상동성 또는 이종성 단백질간의 융합 폴리펩타이드가 또한 제공된다. 상동성 폴리펩타이드는 상이한 수용체간의 융합체일 수 있어, 예를 들면, 다수의 상이한 Toll 리간드, 또는 기질 효과의 확장된 또는 약화된 특이성을 가질 수 있는 수용체에 대한 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 단백질을 발생시킬 수 있다. 마찬가지로, 유도체 단백질의 특성 또는 활성의 조합을 나타내는 이종성 융합체를 작제할 수 있다. 대표적인 예는 리포터 폴리펩타이드, 예를 들면, 루시페라제와 수용체의 절편 또는 도메인, 예를 들면, 리간드-결합 절편과의 융합체이며, 목적하는 리간드의 존재 또는 위치를 용이하게 측정할 수 있다. 참조: Dull, et al., 미국 특허 제4,859,609호, 본 명세서에서 참고로 인용됨. 다른 유전자 융합 파트너로는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 세균성 β-갈락토시다제, tprE, 단백질 A, β-락타마제, 알파 아밀라제, 알코올 데하이로게나제, 및 효모 알파 메이팅 인자가 있다. 참조: Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.
문헌[Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862]에 기재된 포스포르아미다이트법은 적합한 합성 DNA 단편을 생성시킨다. 상보적인 스트랜드를 합성하여 스트랜드를 적절한 조건하에서 서로 어닐링시키거나 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보적인 스트랜드에 적합한 프라이머 서열을 첨가함으로써 이중 스트랜드 단편을 통상적으로 수득한다.
상기와 같은 폴리펩타이드는 또한 포스포릴화, 술폰화, 비오티닐화에 의해, 또는 다른 잔기, 특히 포스페이트기와 유사한 분자 형태를 갖는 것들을 첨가 또는 제거함으로써 화학적으로 변형시킨 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 양태에 있어서, 변형은 유용한 표지화 시약이거나, 정제 표적물, 예를 들면, 친화성 리간드로서 작용한다.
융합 단백질은 전형적으로 재조합 핵산법 또는 합성 폴리펩타이드법으로 제조된다. 핵산 조작 및 발현에 대한 기술은 일반적으로 다음 문헌에 기재되어 있다: Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, and Ausubel, et al. (eds. 1987 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, 본 명세서에서 참고로 인용됨. 폴리펩타이드의 합성에 대한 기술은 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232:341-347; and Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; 이들 각각은 본 명세서에서 참고로 인용됨. 또한 더 큰 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법의 경우 다음 문헌을 참고한다: Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779.
본 발명은 또한 아미노산 서열에서의 변화 또는 글리코실화 이외의 다른 DTLR2-10의 유도체의 용도를 고려한다. 상기와 같은 유도체는 화학적 잔기와의 공유결합성 또는 집합적 결합을 포함할 수 있다. 이들 유도체는 일반적으로 3가지 부류에 속한다: (1) 염, (2) 측쇄 및 종결 잔기 공유결합 변형물, 및 (3) 예를 들어 세포막과의, 흡착 복합체. 상기와 같은 공유결합성 또는 집합성 유도체는 수용체 또는 기타 결합 분자, 예로는 항체의 친화성 정제와 같은 정제법 또는 면역검정법에서의 시약으로서 또는 면역원으로서 유용하다. 예를 들어, Toll 리간드를 시아노겐 브로마이드-활성화된 세파로오스와 같은 고체 지지체에, 당해 분야에 숙지된 방법으로 공유결합시킴으로써 고정화시키거나, DTLR 수용체, 항체, 또는 기타 유사한 분자의 검정 또는 정제에 사용하기 위하여, 폴리올레핀 표면상에 글루타르알데히드 가교-결합을 사용하거나 사용하지 않고 흡착시킬 수 있다. 리간드는 또한 검출가능한 기로 표지시킬 수 있는데, 예를 들면, 클로라민 T 공정에 의하여 방사성요오드화시키고, 희토류 킬레이트에 공유결합식으로 결합시키거나, 진단용 검정법에서 사용하기 위하여 다른 형광 잔기에 접합시킬 수 있다.
본 발명의 DTLR은 예를 들어, 다른 IL-1 수용체 족 일원간에 구별될 수 있는, DTLR 또는 이들의 여러가지 단편에 대해 특이적인 항혈청 또는 항체 생산용 면역원으로서 사용될 수 있다. 정제된 DTLR은 상기 단백질을 함유하는 여러가지 형태의 불순 제제로 면역화시켜 제조된 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편을 선별하는데 사용될 수 있다. 특히, 용어 '항체'는 또한 천연 항체의 항원 결합 단편, 예를 들면, Fab, Fab2, Fv 등을 포함한다. 정제된 DTLR은 또한 상승된 수준의 발현, 또는 내인성 수용체에 대해 항체를 생성시키는 면역 질환의 존재에 대한 반응으로 발생되는 항체를 검출하기 위한 시약으로서 유용하다. 추가로, DTLR 단편은 또한 하기에 바로 기재되는 바와 같은, 본 발명의 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34에 나타낸 아미노산 서열, 이들의 단편, 또는 여러가지 상동성 펩타이드에 대해 결합 친화성을 갖거나, 또는 이에 대해 발생된 항체를 고려한다. 특히, 본 발명은 예측되거나, 천연 DTLR의 외부 단백질 표면에서 실질적으로 노출되는 특정 단편에 대해 결합 친화성을 갖거나, 이에 대해 발생된 항체를 고려한다.
수용체 리간드에 대한 생리학적 반응의 차단은, 경쟁적 억제를 통하여 유사하게 수용체에 리간드가 결합하는 것을 억제시킴으로써 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명의 시험관내 검정법은 통상적으로 항체 또는 이들 항체의 항원 결합 절편, 또는 고체상 기질에 부착된 단편을 종종 사용한다. 이들 검정법은 또한 리간드 결합 영역 돌연변이 및 변형, 또는 예를 들어 시그날 전달 또는 효소 기능에 영향을 주는, 다른 돌연변이 및 변형의 진단 측정을 가능케한다.
본 발명은 또한 예를 들어, 수용체 또는 단편에 대한 중화 항체가 리간드 또는 다른 항체에 결합하는데 있어서 시험 화합물과 경쟁하는, 경쟁적인 약물 선별 검정법의 용도를 고려한다. 상기 방법에서, 중화 항체 또는 단편을 사용하여 수용체에 대한 결합 부위를 1개 이상 공유하는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는데 사용할 수 있으며 또한 달리 리간드와 결합할 수 있는 수용체상의 결합 부위를 점유하는데 사용할 수 있다.
V. 핵산 및 단백질의 제조 방법
단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA는 화학적 합성법, cDNA 라이브러리 선별법으로, 또는 광범위한 세포주 또는 조직 샘플로부터 제조된 게놈성 라이브러리 선별법으로 수득할 수 있다. 천연 서열은 표준 방법 및 본 명세서에 제공되는 서열을 사용하여 단리할 수 있다. 다른 종의 대응체는 하이브리드화 기술로, 또는 조합된, 여러가지 PCR 기술로, 또는 서열 데이타베이스, 예를 들어, GenBank를 조사함으로써 확인할 수 있다.
상기 DNA는 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 발생시키는데 사용될 수 있는 전체 길이의 수용체 또는 단편의 합성; 결합 연구용; 변형된 리간드 결합 또는 키나제/포스파타제 도메인의 작제 및 발현용; 및 구조/기능 연구용으로 여러가지 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 변이체 또는 단편을 적합한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 이들 분자를 재조합 숙주로부터 유래된 것을 제외하고는, 단백질 또는 세포 오염물질이 거의 없을 수 있으며, 따라서 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 혼합시 약제학적 조성물로서 특히 유용하다. 본 발명의 단백질, 또는 이들의 부분은 다른 단백질과의 융합체로서 발현될 수 있다.
발현 벡터는 통상적으로 적합한 숙주 세포에서 인지되는 적합한 유전자 조정 요소에 기능적으로 결합되어 있는, 목적하는 수용체 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 자가-복제 DNA 또는 RNA 작제물이다. 이들 조정 요소는 적합한 숙주내에서 발현을 수행할 수 있다. 발현을 수행하는데 있어서 필수적인 조정 인자의 특정 타입은 사용되는 최종 숙주 세포에 따른다. 일반적으로, 유전자 조정 인자는 원핵세포 프로모터 시스템 또는 진핵 세포 프로모터 발현 조정 시스템일 수 있으며, 전형적으로는 전사 프로모터, 전사 개시를 조정하기 위한 임의의 오퍼레이터, mRNA 발현 수준을 상승시키기 위한 전사 인핸서, 적합한 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독을 종결시키는 서열을 포함한다. 발현 벡터는 또한 통상적으로 숙주 세포와는 독립적으로 벡터가 복제되도록 하는 복제 기원을 함유한다.
본 발명의 벡터는 상기한 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA, 또는 생물학적으로 활성이 등가인 폴리펩타이드를 암호화하는 이들의 단편을 함유하는 것들을 포함한다. 상기 DNA는 바이러스성 프로모터의 조정하에 있을 수 있으며 선별 마커를 암호화할 수 있다. 본 발명은 또한 벡터가 숙주에 적합하며, 수용체를 암호화하는 진핵세포 cDNA가 벡터중에 삽입되어 상기 벡터를 함유하는 숙주의 성장으로 당해 cDNA가 발현되는, 원핵세포 또는 진핵세포 숙주중에서 상기와 같은 단백질을 암호화하는 진핵세포 cDNA를 발현시킬 수 있는 발현 벡터의 용도를 고려한다. 통상적으로, 발현 벡터는 이들의 숙주 세포에서의 안정한 복제용으로 또는 세포당 바람직한 유전자의 총 카피수를 크게 증가시키기 위한 증폭용으로 디자인된다. 발현 벡터가 숙주 세포중에서 복제되는 것이 항상 필수적인 것은 아닌데, 예를 들어, 숙주 세포에 의해 인지되는 복제 기원을 함유하지 않는 벡터를 사용하여 여러가지 숙주중에서 단백질 또는 이의 단편의 일시적 발현을 수행할 수 있다. 또한 단백질 암호화 부분 또는 이의 단편을 숙주 DNA중으로 재조합에 의해 통합시키는 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같은 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 통합가능한 DNA 단편, 및 숙주의 게놈중으로 DNA 단편을 통합시킬 수 있는 기타 비히클을 포함한다. 발현 벡터는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 수행하는 유전자 조정 요소를 함유하는 특화된 벡터이다. 플라스미드는 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이지만 등가의 기능을 제공하며, 당해 분야에 공지되어 있거나, 공지되기 시작한 다른 모든 형태의 벡터도 본 발명에 사용하기에 적합하다. 참조: Pouwels, et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., and Rodriquez, et al. (eds) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, 1988, 본 명세서에서 참조로 인용됨.
형질전환된 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제된 수용체 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 세포, 바람직하게는 포유동물의 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 통상적으로 목적하는 단백질 또는 이의 단편을 발현시키지만, 클로닝, 증폭, 및 이의 DNA 조작을 목적으로하는 경우, 대상 단백질을 발현시킬 필요가 없다. 본 발명은 또한 영양 배지중에서 형질전환된 세포를 배양시켜, 세포막중에 수용체가 축적되는 것을 고려한다. 상기 단백질은 배양물로부터, 또는 특정예로, 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 목적에 있어서, 핵산 서열은 이들이 서로 기능상 관련된 경우 작동적으로 연결되어 있다. 예를 들면, 프리서열(presequence)에 대한 DNA 또는 분비 리더는 프리단백질로서 발현되거나 폴리펩타이드를 세포막으로 지시하거나 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 경우 폴리펩타이드에 작동적으로 연결된다. 프로모터는 폴리펩타이드의 전사를 조정하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결되고; 리보솜 결합 부위는 해독이 가능하도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 통상적으로, 작동적으로 연결된 것은 연속적이고 판독 프레임내에 있는 것을 의미하나, 억제인자 유전자와 같은 특정 유전 요소는 연속적으로 연결되어 있지는 않지만 발현을 조정하는 오퍼레이터 서열에 여전히 결합되어 있다.
적합한 숙주 세포로는 원핵세포, 하등 진핵세포, 및 고등 진핵세포가 있다. 원핵세포로는 그램 음성 및 그램 양성 미생물을 모두 포함하며, 예를 들어, 이. 콜리 및 비. 서브틸리스 (B. subtilis)가 있다. 하등 진핵세포로는 효모, 예로는 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 및 피키아 (Pichia), 및 딕티로스텔륨 (Dictyostelium)속의 종이 있다. 고등 진핵세포로는 비-포유동물 기원 (예, 곤충 세포, 및 조류), 및 포유동물 기원 (예, 사람, 영장류, 및 설치류) 둘다의, 동물 세포로부터의 확립된 조직 배양 세포주가 있다.
원핵세포 숙주-벡터 시스템은 수 많은 상이한 종에 대해 다양한 벡터를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이. 콜리 및 이의 벡터는 다른 원핵세포에서 사용되는 등가의 벡터를 포함하는 것으로 총칭하여 사용된다. DNA 증폭용으로 대표적인 벡터는 pBR322 또는 수 많은 이의 유도체이다. 수용체 또는 이의 단편을 발현시키는데 사용할 수 있는 벡터로는, 비제한적으로, lac 프로모터 (pUC-시리즈); trp 프로모터 (pBR322-trp); Ipp 프로모터 (pIN-시리즈); 람다-pP 또는 pR 프로모터 (pOTS); 또는 ptac와 같은 하이브리드 프로모터 (pDR540)를 포함하는 것들과 같은 벡터가 있다. 참조: Brosius, et al. (1988) 'Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters', in Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds. Rodriguez and Denharkt), Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp. 205-236, 본 명세서에서 참고로 인용됨.
하등 진핵세포, 예를 들어, 효모 및 딕티오스텔륨은 DTLR 서열-포함 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명의 목적을 위한, 가장 통상적인 하등 진핵세포 숙주는 제빵용 효모, 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)이다. 수 많은 다른 균주와 종을 또한 입수할 수 있지만 하등 진핵세포를 총칭하여 나타내는데 사용된다. 효모 벡터는 전형적으로 복제 기원 (통합 타입이 아닌한), 선택 유전자, 프로모터, 수용체 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA, 및 해독 종결, 폴리아데닐화, 및 전사 종결용 서열로 이루어져 있다. 효모에 대해 적합한 발현 벡터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 여러가지 다른 당분해 효소 유전자 프로모터와 같은 구성적 프로모터 또는 알코올 데하이드로게나제 2 프로모터 또는 메탈로티오닌 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 포함한다. 적합한 벡터는 다음 타입의 유도체를 포함한다: 자가-복제 저 카피수 (예: YRp-시리즈), 자가-복제 고 카피수 (예: YEp-시리즈); 통합 타입 (예: YIp-시리즈), 또는 미니-염색체 (예: YCp-시리즈).
고등 진핵세포 조직 배양 세포는 통상적으로 기능적으로 활성인 인터류킨 단백질의 발현에 바람직한 숙주 세포이다. 원칙적으로, 고등 진핵세포 조직 배양 세포주는 작업가능한, 무척추 또는 척추동물 공급원으로부터의 것으로, 예를 들면, 곤충 바쿨로바이러스 발현 시스템이다. 그러나, 포유동물 세포가 바람직하다. 상기와 같은 세포의 형질전환 또는 형질감염 및 번식이 통상적인 방법이 되고 있다. 유용한 세포주의 예로는 HeLa 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 새끼쥐 신장 (BRK) 세포주, 곤충 세포주, 조류 세포주, 및 원숭이 (COS) 세포주가 있다. 상기와 같은 세포주에 대한 발현 벡터는 통상적으로 복제 기원, 프로모터, 해독 개시 부위, RNA 스플라이스 부위 (게놈성 DNA가 사용되는 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위를 포함한다. 이들 벡터는 또한 통상적으로 선별 유전자 또는 증폭 유전자를 함유한다. 적합한 발현 벡터는 예를 들어 아데노바이러스, SV40, 파보바이러스, 왁시니아 바이러스, 또는 사이토메갈로바이러스와 같은 공급원으로부터 유래된 프로모터를 포함하는 플라스미드, 바이러스, 또는 레트로바이러스일 수 있다. 적합한 발현 벡터의 대표적인 예로는 pCDNA1; pCD (참조: Okayama, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1136-1142); pMC1neo PolyA (참조: Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512); 및 pAC 373 또는 pAC 610와 같은 바쿨로바이러스 벡터가 있다.
분비되는 단백질의 경우, 개방 판독 프레임은 통상적으로 N-종결부에서 시그날 펩타이드에 공유결합식으로 연결된 성숙 또는 분비되는 생성물로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화한다. 시그날 펩타이드는 성숙, 또는 활성, 폴리펩타이드의 분비전에 분리된다. 분리 부위는 경험적 규칙 (예를 들어, von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14:4683-4690)으로부터 높은 정확도로 예측할 수 있으며, 시그날 펩타이드의 정확한 아미노산 조성은 이의 기능에 대해 중요하지 않은 것으로 밝혀졌다 (예, Randall, et al. (1989) Science 243:1156-1159; Kaiser et al. (1987) Science 235:312-317).
특이적 또는 정의된 글리코실화 패턴을 제공하는 시스템에서 이들 폴리펩타이드를 발현시키는 것이 통상적으로 바람직하다. 이 경우, 통상의 패턴은 발현 시스템에 의해 천연적으로 제공되는 것이다. 그러나, 상기 패턴은 폴리펩타이드, 예를 들어, 비글리코실화된 형태의 폴리펩타이드를 이종성 발현 시스템중으로 도입된 적합한 글리코실화 단백질에 노출시킴으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, 수용체 유전자는 포유동물 또는 기타 글리코실화 효소를 암호화하는 1개 이상의 유전자로 동시-형질감염시킬 수 있다. 상기 방식을 사용하여, 특정의 포유동물 글리코실화 패턴을 원핵세포 또는 다른 세포에서 수득할 수 있다.
DTLR의 공급원은 상기한 바와 같은, 진핵세포 또는 원핵세포 숙주 발현 재조합 DTLR일 수 있다. 상기 공급원은 또한 마우스 스위스(Swiss) 3T3 섬유아세포와 같은 세포주일 수 있지만, 다른 포유동물 세포주가 또한 본 발명에서 고려되며, 바람직한 세포주는 사람으로부터의 것이다.
이제 서열이 공지되어 있으므로, 영장류 DTLR, 단편, 또는 이의 유도체는 펩타이드를 합성하는데 있어서 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 이들 방법으로는 문헌[Stewart and Youg (1984) Solid Phage Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; and Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; 본 명세서에서 모두 참고로 인용됨]에 기재된 바와 같은 방법이 있다. 예를 들면, 아지드 공정, 산 클로라이드 공정, 산 무수물 공정, 혼합된 무수물 공정, 활성 에스테르 공정 (예: p-니트로페닐 에스테르, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 또는 시아노메틸 에스테르), 카보디이미다졸 공정, 산화-환원 공정, 또는 디사이클로헥실카보디이미드 (DCCD)/부가 공정을 사용할 수 있다. 고체상 및 용액상 합성법 모두를 전술한 공정에 적용시킬 수 있다. 유사한 기술을 부분적인 DTLR 서열에 대해 사용할 수 있다.
DTLR 단백질, 단편, 또는 유도체는 펩타이드 합성에서 전형적으로 사용되는 상기 공정에 따라서, 일반적으로 서열중에 하나씩 아미노산을 종결 아미노산에 축합시킴을 특징으로 하는 소위 단계식 공정으로, 또는 펩타이드 단편을 종결 아미노산에 커플링시킴으로써 적당히 제조된다. 커플링 반응에서 사용되지 않는 아미노기는 부정확한 위치에서의 커플링을 방지하기 위하여 전형적으로 보호하여야 한다.
고체상 합성법이 채택되는 경우, C-종결 아미노산을 불용성 담체 또는 지지체에 이의 카복실기를 통하여 결합시킨다. 상기 불용성 담체는 반응성 카복실기에 대한 결합능을 갖는한 특정하게 제한되지 않는다. 상기와 같은 불용성 담체의 예로는 할로메틸 수지, 예로서 클로로메틸 수지 또는 브로모메틸 수지, 히드록시메틸 수지, 페놀 수지, 3급-알킬옥시카보닐하이드라지데이트화 수지 등이 있다.
아미노기-보호된 아미노산은 이의 활성화 카복실기와 이미 전기 형성된 펩타이드 또는 쇄의 반응성 아미노기와의 축합을 통하여 일열로 결합되어, 단계식으로 펩타이드가 합성된다. 완전한 서열을 합성한 후, 펩타이드를 불용성 담체로부터 분리시켜 펩타이드를 생산한다. 상기 고체상 방법은 하기 문헌에 일반적으로 기재되어 있다: Merrifiedl, et al. (1963) in J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 본 명세서에서 참고로 인용됨.
상기 제조된 단백질 또는 이들의 단편은 반응 혼합물로부터 펩타이드 분리 방법, 예를 들면, 추출, 침전, 전기영동, 여러가지 형태의 크로마토그래피 등으로 단리시켜 정제할 수 있다. 본 발명의 수용체는 목적하는 용도에 따라서 다양한 정도의 순도로 수득될 수 있다. 정제는 본 명세서에 기재된 단백질 정제 기술 (하기 참조)을 사용하거나, 면역흡착성 친화성 크로마토그래피 방법에 기재된 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 면역흡착성 친화성 크로마토그래피는, 항체를 먼저 고체 지지체에 결합시킨 다음 결합된 항체를 적절한 세포의 가용화된 용해물, 수용체를 발현시키는 다른 세포의 용해물, 또는 DNA 기술의 결과로서 단백질을 생산하는 세포의 용해물 또는 상등액과 접촉시키는 방식으로 수행된다.
일반적으로, 정제된 단백질은 순도가 약 40% 이상, 일상적으로는 약 50% 이상, 통상적으로 약 60% 이상, 전형적으로 약 70% 이상, 더욱 전형적으로 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95%이며, 특정 양태에서는, 97 내지 99% 이상이다. 순도는 통상적으로 중량 기준이지만, 몰 기준일 수 도 있다. 경우에 따라 다른 검정법을 사용한다.
VI. 항체
여러가지 포유동물, 예를 들어 영장류의, 천연 형태 및 이들의 재조합 형태의 DTLR 단백질 및 이의 단편에 대해 항체를 발생시킬 수 있으며, 차이점은 활성 수용체에 대한 항체가 천연 배위로만 존재하는 에피토프를 더욱 잘 인지할 것 같다는 것이다. 변성된 항원 검출은 예를 들어 웨스턴 분석에 있어서 유용할 수 있다. 항-이디오타입형 항체가 또한 고려되며, 이는 천연 수용체 또는 항체의 효능제 또는 길항제로서 유용하다.
단백질의 예정된 단편에 대한, 결합 단편 및 단일쇄 형태를 포함한 항체는 상기 단편과 면역원성 단백질과의 접합체로 동물을 면역시킴으로써 발생될 수 있다. 모노클로날 항체는 목적하는 항체를 분비하는 세포로부터 제조한다. 이들 항체는 정상 또는 결손 단백질에 대한 결합에 대해 선별할 수 있거나, 효능성 또는 길항성에 대해 선별할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 통상적으로 약 300 μM 이상, 전형적으로 약 100 μM 이상, 더욱 전형적으로는 약 30 μM 이상, 바람직하게는 약 10 μM 이상, 더욱 바람직하게는 약 3 μM 이상 결합한다.
본 발명의, 항원 결합 단편을 포함한, 항체는 확실한 진단 또는 치료적 가치를 가질 수 있다. 이들은 수용체에 결합하여 리간드에 대한 결합을 억제하거나 수용체가 생물학적 반응을 도출시킬 수 있는 능력, 예를 들어 이의 기질상에서 작용하는 능력을 억제하는 강력한 길항제일 수 있다. 이들은 또한 비-중화 항체로서 유용할 수 있으며, 독소 또는 방사선핵종에 커플링시켜 생산 세포, 또는 인터류킨 공급원에 편재된 세포에 결합시킬 수 있다. 또한 이들 항체는 약물 또는 다른 치료제에 직접적으로 또는 링커를 사용하여 간접적으로 접합시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 진단용으로 유용할 수 있다. 포획 또는 비-중화 항체로서, 이들은 리간드 또는 기질 결합을 억제하지 않고 수용체에 결합할 수 있다. 중화 항체로서, 이들은 경쟁적 결합 검정법에 있어서 유용하다. 이들은 또한 리간드의 검출 또는 정량에 유용하다. 이들은 웨스턴 블롯 분석용, 또는 각 단백질의 면역침전 또는 면역정제용 시약으로서 사용될 수 있다.
단백질 단편을 다른 물질, 특히 면역원으로 사용될 융합되거나 공유결합식으로 연결된 폴리펩타이드로서의 폴리펩타이드에 연결시킬 수 있다. 포유동물의 DTLR 및 이의 단편을 키홀 림펫 헤모시아닌, 소혈청 알부민, 파상풍 독소 등과 같은 여러가지 면역원에 융합 또는 공유결합식으로 결합시킬 수 있다. 참조: Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; and Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York; 각각 본 명세서에서 폴리클로날 항혈청 제조 방법의 설명용 참고로 인용됨. 전형적인 방법은 동물을 항원으로 과면역시키는 것이다. 이어서 반복 면역시킨후 즉시 동물의 혈액을 수집하여 감마 글로불린을 단리시킨다.
일부 예에서, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등과 같은 여러가지 포유동물 숙주로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 모노클로날 항체의 제조 기술에 대한 설명은 다음 문헌을 참고할 수 있다: Stites, et al. (eds) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 본 명세서에서 참고로 인용; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; 및 특히 Kohler and Milstein (1975) in Nature 256:495-497, 모노클로날 항체 발생 방법중 하나로 논의됨. 이들 각각의 참고 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용된다. 간략하게 요약하면, 본 방법은 동물에 면역원을 주사하는 단계를 포함한다. 이어서 동물을 희생시킨 다음 이의 비장으로부터 세포를 채취하고, 이를 골수종 세포와 융합시킨다. 결과 시험관내에서 복제할 수 있는 하이브리드 세포 또는 '하이브리도마'가 발생된다. 이어서 하이브리도마 집단을 선별하여 면역원에 대한 단일 항체종을 분비하는 각각의 클론을 단리시킨다. 이 방법에서, 수득한 각각의 항체종은 면역원성 물질상에서 인지된 특정 부위에 대한 반응으로 발생된 면역 동물로부터 불멸화되고 클로닝된 단일 B 세포 생성물이다.
다른 적합한 기술은 항원성 폴리펩타이드에 임파구를 시험관내 노출시키거나 파아지 또는 유사한 벡터중 항체의 라이브러리를 선택하는 단계를 포함한다. 참조: Huse, et al. (1989) 'Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, 'Science 246:1275-1281; and Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546, 각각 본 명세서에서 참고로 인용됨. 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체는 키메라성 또는 사람화된 항체를 포함하여, 변형시키거나/시키지 않고 사용할 수 있다. 종종, 폴리펩타이드 및 항체를 공유 결합식으로 또는 비-공유결합식으로, 검출가능한 시그날을 제공하는 물질에 연결시켜 표지시킨다. 여러가지 표지물 및 접합 기술이 공지되어 있으며 과학 및 특허 문헌에 모두 상세하게 보고되어 있다. 적합한 표지물로는 방사선핵종, 효소, 기질, 조인자, 억제제, 형광 잔기, 화학발광 잔기, 자성 입자 등이 있다. 상기와 같은 표지물의 용도를 교시하는 특허로는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호가 있다. 또한, 재조합 또는 키메라성 면역글로불린을 생산할 수 있거나[참조: Cabilly, 미국 특허 제4,816,567호]; 유전자전이된(transgenic) 마우스로 만들 수 있다[참조: Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156]. 이들 참고 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용된다.
본 발명의 항체는 또한 DTLR를 단리시키는데 있어서 친화성 크로마토그래피용으로 사용할 수 있다. 고체 지지체, 예를 들면 아가로오스, 세파덱스 등과 같은, 고체 지지체에 항체가 결합되어 있고, 세포 용해물이 통과할 수 있는 컬럼을 제조하여, 상기 컬럼을 세척한 다음, 약한 변성제의 농도를 증가시켜, 정제된 단백질을 방출시킨다. 상기 단백질을 사용하여 항체를 정제할 수 있다.
항체는 또한 특정 발현 생성물에 대한 발현 라이브러리를 선별하는데 사용될 수 있다. 통상적으로 상기와 같은 공정에 사용되는 항체를, 항체 결합에 의해 항원의 존재가 용이하게 검출될 수 있도록 하는 잔기로 표지시킨다.
DTLR에 대해 발생된 항체는 또한 항-이디오타입 항체를 발생시키는데 사용된다. 이들은 단백질의 발현 또는 상기 단백질을 발현시키는 세포와 관련된 여러가지 면역 질환의 검출 또는 진단에 유용하다. 이들은 또한 경쟁적 억제제일 수 있거나 천연 리간드를 대체하는, 리단드의 효능제 또는 길항제로서 유용하다.
서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 아미노산 서열로 이루어진 면역원과 같이, 정의된 면역원에 대해 발생된 항체에 특이적으로 결합하거나 이에 대해 특이적으로 면역반응성인 DTLR 단백질은 전형적으로 면역검정법으로 측정한다. 면역검정법은 전형적으로 예를 들어, 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34에 대해 발생된 폴리클로날 항혈청을 사용한다. 상기 항혈청은, 바람직하게는 동일종으로부터의 다른 IL-1R 족 일원, 예를 들면, DTLR1에 대해 낮은 교차반응성을 갖도록 선택하고, 이러한 교차반응성은 면역검정법에 사용하기전에 면역흡착법으로 제거한다.
면역검정법에서 사용하기 위한 항혈청을 생산하기 위하여, 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 단백질, 또는 이들의 배합물을 본 명세서에 기재된 바와 같이 단리시킨다. 예를 들면, 재조합 단백질을 포유동물 세포주에서 생산할 수 있다. 적합한 숙주, 예를 들어, balb/c와 같은 순계주 마우스를 선택된 단백질로, 전형적으로 프로인트(Freund) 애주번트와 같은 표준 애주번트, 및 표준 마우스 면역 프로토콜을 사용하여 면역시킨다 (참조: Harlow and Lane, 상기). 별법으로, 본 명세서에 기재된 서열로부터 유래되고 담체 단백질에 접합된 합성 펩타이드를 면역원으로 사용할 수 있다. 폴리클로날 혈청을 수집하여 면역검정법, 예를 들면, 고체 지지체상에 고정화된 면역원을 사용하는 고체상 면역검정법으로 면역원 단백질에 대해 역가를 측정한다. 역가가 104이상인 폴리클로날 항혈청을 선택하여 이들의 다른 IL-1R 족 일원, 예를 들면, 마우스 DTLR 또는 사람의 DTLR1에 대한 이들의 교차 반응성에 대해, 문헌[Harlow and Lane, 상기 570-573면]에 기재된 것과 같은 경쟁적 결합 면역검정법을 사용하여 시험한다. DTLR 족 일원의 2종 이상을 사람의 DTLR2-10중 하나 또는 일부와 함께 상기 측정에 사용하는 것이 바람직하다. 이들 IL-1R 족 일원을 재조합 단백질로서 생산하여 표준 분자 생물학 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 화학 기술을 사용하여 단리시킬 수 있다.
경쟁적 결합 방식의 면역검정법을 교차 반응성 측정용으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34의 단백질, 또는 이들의 여러가지 단편을 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 검정에 첨가된 단백질은 고정화된 항원에 대한 항혈청의 결합과 경쟁한다. 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합에 대해 경쟁하는 상기 단백질의 능력을 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 및/또는 34의 단백질과 비교한다. 상기 단백질에 대한 교차 반응성%는 표준 계산법을 사용하여 계산한다. 상기한 단백질 각각에 대한 교차 반응성이 10% 미만인 항혈청을 선택하고 푸울링한다. 이어서, 교차-반응성 항체를 상기 열거한 단백질을 사용한 면역흡착법으로 푸울된 항혈청으로부터 제거한다.
이어서 면역흡착되고 푸울된 항혈청을 상기한 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정법에 사용하여 제2의 단백질을 면역원 단백질 (예를 들어, 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 및/또는 34의 IL-1R 유사 단백질)과 비교한다. 비교하기 위하여, 단백질 2종을 각각 광범위한 농도로 검정하여 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합을 50% 억제하는데 필요한 각 단백질의 양을 측정한다. 필요한 제2의 단백질의 양이 필요한 것으로 선택된 단백질 또는 단백질들의 단백질 양보다 2배 미만일 경우, 상기 제2의 단백질이 면역원에 대해 발생된 항체에 특이적으로 결합한다고 할 수 있다.
이들 DTLR 단백질은 지금까지 확인된 유전자를 10개 이상 포함하는 상동성 단백질족의 일원임을 이해하여야 한다. DTLR2-10과 같은, 특정 유전자 생성물의 경우, 상기 용어가 본 명세서에 기재된 아미노산 서열만을 의미하는 것은 아니며, 대립유전자, 비-대립유전자 또는 변이종인 다른 단백질도 의미한다. 상기 용어는, 단일 부위 돌연변이와 같은 통상의 재조합 기술을 사용하는 계획적 돌연변이에 의해, 또는 각 단백질을 암호화하는 DNA의 짧은 절편을 절제시킴으로써, 또는 신규 아미노산으로 대체, 또는 신규 아미노산을 첨가함으로써 도입된 비자연적 돌연변이를 포함하는 것으로 이해된다. 상기와 같은 부수적인 변형물 고유 분자의 면역동일성 및/또는 이의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하여야 한다. 따라서, 이들 변형물은 천연의 IL-1R 관련 단백질, 예를 들어 서열 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 또는 34에 나타낸 DTLR 단백질에 대해 특이적으로 면역반응성인 단백질을 포함한다. 변형된 단백질의 생물학적 특성은 상기 단백질을 적합한 세포주에서 발현시켜 임파구에 대한 적절한 효과를 측정함으로써 결정될 수 있다. 부수적인 것으로 간주되는 특정한 단백질 변형물은 전체적으로 IL-1R 족에 대해 상기한 바와 같이, 유사한 화학적 특성을 갖는 아미노산의 보존적 치환을 포함한다. 단백질을 DTLR2-10의 단백질과 최적으로 정렬시켜 본 명세서에 기재된 통상의 면역검정법을 사용하여 면역동일성을 측정함으로써, 본 발명의 단백질 조성을 결정할 수 있다.
VII. 키트 및 정량화
천연 및 재조합 형태의, 본 발명의 IL-1R 유사 분자는 키트 및 검정법에 있어서 특히 유용하다. 예를 들면, 이들 방법물 또한 예를 들어 상기 단백질에 대한 리간드를 결합 활성에 대해 선별하는데 적용시킨다. 여러가지 방법의 자동화 검정법이 최근에 개발되어 매년 수천개의 화합물중 수십개를 선별할 수 있다. 참조: BIOMEK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, California, and Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773, 본 명세서에서 참고로 인용됨. 후자 문헌에는 고체 기판상에 합성된 다수의 정의된 중합체에 의한 결합을 시험하기 위한 수단이 기재되어 있다. 리간드 또는 효능제/길항제 상동성 단백질에 대한 선별에 적합한 검정법의 개발은 본 발명에 의해 제공되는 것과 같이 활성 상태의 다량의 정제된, 가용성 DTLR의 입수가능성에 의해 크기 용이해질 수 있다.
정제된 DTLR은 상기 언급한 리간드 선별 기술에 사용하기 위하여 플레이트상에 직접 피복시킬 수 있다. 그러나, 이들 단백질에 대한 비-중화 항체는 예를 들어 진단용으로 유용한, 고체상에 각 수용체를 고정화시키기 위한 포획 항체로서 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 여러가지 진단 키트 및 단백질 또는 이의 리간드의 존재를 검출하는 방법에 있어서 DTLR2-10, 이의 단편, 펩타이드, 및 이들의 융합 생성물의 용도를 고려한다. 별법으로, 또는 추가로, 상기 분자에 대한 항체를 키트 및 방법에 포함시킬 수 있다. 전형적으로 키트는 정의된 DTLR 펩타이드 또는 유전자 절편 또는 이들중 하나 또는 다른 것을 인지하는 시약을 함유하는 구획을 갖는다. 전형적으로, 인지 시약은, 펩타이드의 경우, 수용체 또는 항체이거나, 유전자 절편의 경우, 통상적으로 하이브리드화 프로브이다.
예를 들어 DTLR4의 농도 측정에 바람직한 키트 샘플은 전형적으로 DTLR4에 대해 공지된 결합 친화성을 갖는 표지된 화합물(예: 리간드 또는 항체), 포지티브 대조군으로서 DTLR4 공급원 (천연 또는 재조합 형태), 및 표지시킨 유리 화합물과 결합된 화합물을 분리시키기 위한 수단, 예를 들면, 시험 샘플중에 DTLR4를 고정화시키기 위한 고체상을 포함한다. 시약을 함유하는 구획, 및 지침이 통상적으로 제공된다.
포유동물 DTLR 또는 펩타이드 단편에 대해 특이적인 항원 결합 단편, 또는 수용체 단편을 포함한 항체는 상승된 수준의 리간드 및/또는 이의 단편의 존재를 검출하기 위한 진단 용도에 있어서 유용하다. 진단 검정법은 균질 (유리 시약과 항체-항원 복합체간의 분리 단계가 없음) 또는 비균질 (분리 단계 있음)일 수 있다. 방사선면역검정법 (RIA), 효소-연계된 면역흡착 검정법 (ELISA), 효소 면역검정법 (EIA), 효소-배가된 면역검정 기술 (EMIT), 기질-표지된 형광 면역검정법 (SLFIA) 등과 같은 여러가지 상업적 검정법이 있다. 예를 들어, 비표지된 항체는, 표지되고, DTLR4 또는 이들의 특정 단편에 대한 항체를 인식하는 제2의 항체를 사용함으로써 이용될 수 있다. 이들 검정법은 또한 하기 문헌에 상세하게 논의되어 있다. 참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., and Coligan (Ed.) (1991) and periodic supplements, Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New York.
항-이디오타입 항체는 DTLR4의 효능제 또는 길항제로서 작용하는 것과 유사한 용도를 가질 수 있다. 이들은 적절한 상황하에서 치료제로서 유용하다.
종종, 진단 검정용 시약을 키트에 공급하여, 검정의 감응성을 최적화시킨다. 본 발명의 경우, 검정법의 특성, 프로토콜, 및 표지물에 따라서, 표지되거나 비표지된 항체, 또는 표지된 리간드가 제공된다. 이는 통상적으로 완충제, 안정화제, 효소에 대한 기질과 같은 시그날 생산에 필수적인 물질 등과 같은 기타 첨가제와 함께 사용된다. 키트가 또한 적절한 사용 및 사용후 내용물의 폐기에 대한 지침을 포함하는 것이 바람직하다. 전형적으로 키트는 각각의 유용한 시약에 대한 구획을 가지며, 적절한 사용 및 시약의 폐기에 대한 지침을 포함한다. 검정을 수행하기에 적합한 농도로 시약을 수성 매질에서 재구성될 수 있도록, 시약을 무수 동결건조 분말로 제공하는 것이 바람직하다.
상기 언급한 진단 검정의 구성분은 변형시키지 않고 사용할 수 있거나 여러가지 방법으로 변형시켜 사용할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 시그날을 직접 또는 간접적으로 제공하는 잔기를 공유결합식으로 또는 비-공유결합식으로 결합시켜 표지시킬 수 있다. 이들 검정법중 하나에서는, 시험 화합물, DTLR, 또는 이에 대한 항체를 직접 또는 간접적으로 표지시킬 수 있다. 직접적인 표지화에 대한 가능성은 표지물 그룹: 방사선표지물, 예:125I, 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제와 같은 효소 (미국 특허 제3,645,090호) 및 형광 강도, 파장 이동치, 또는 형광 편극화에서의 변화를 모니터할 수 있는 형광 표지물 (미국 특허 제3,940,475호)을 포함한다. 상기 특허는 모두 본 명세서에서 참고로 인용된다. 간접적 표지화 가능성은 구성분중 하나를 비오티닐화한 다음 상기 표지물 군중 하나에 커플링된 아비딘에 결합시키는 것을 포함한다.
유리 리간드와 결합된 것, 또는 별법으로 유리 시험 화합물과 결합된 것을 분리하는 수 많은 방법이 또한 있다. DTLR은 여러가지 매트릭스상에 고정화시킨 다음 세척할 수 있다. 적합한 매트릭스는 플라스틱, 예를 들면 ELISA 플레이트, 필터, 및 비드를 포함한다. 수용체를 매트릭스에 고정시키는 방법으로는 비제한적으로, 플라스틱에 직접 접착시키는 방법, 포획 항체, 화학적 커플링 및 비오틴-아비딘을 사용하는 방법이 있다. 상기 방법에 있어서 최종 단계는 항체/항원 복합체를 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 용매 또는 황산암모늄과 같은 염을 이용하는 방법을 포함한 여러가지 방법으로 침전시키는 것이다. 다른 적합한 분리 기술로는 비제한적으로, 문헌[Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30(9):1457-1461]에 기재된 플루오레세인 항체 자기화가능 입자법, 및 미국 특허 제4,659,678호에 기재된 바와 같은 이중 항체 자성 입자 분리법이 있으며, 상기 언급된 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용된다.
단백질 또는 단편을 여러가지 표지물에 결합시키는 방법은 상기 문헌에 상세하게 보고되어 있으므로 본 명세서에서 상세하게 논의할 필요는 없다. 수 많은 기술들이 펩타이드 결합을 형성시키기 위하여 카보디이미드 또는 활성 에스테르의 사용을 통하여 활성화 카복실기를 사용하는 단계, 연결을 위하여, 머캅토기를 클로로아세틸과 같은 활성화 할로겐, 또는 말레이미드와 같은 활성화 올레핀과 반응시켜 티오에테르를 형성시키는 단계 등을 포함한다. 융합 단백질이 또한 이들 용도로사용된다.
본 발명의 다른 진단 양태는 DTLR의 서열로부터 취득한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하는 것이다. 이들 서열은 면역 질환을 앓고 있는 것으로 의심되는 환자에 있어서 각 DTLR의 검출 수준에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. RNA 및 DNA 뉴클레오티드 서열의 제조, 상기 서열의 표지화, 및 상기 서열의 바람직한 크기는 상기 문헌에 풍부하게 기재 및 논의되어 있다. 정상적으로 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는 뉴클레오티드 약 14개 이상이어야 하며, 통상적으로는 뉴클레오티드 약 18개 이상이며, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 수 킬로베이스 이하일 수 있다. 여러가지 표지물이 사용될 수 있으며, 가장 통상적으로는 방사선핵종, 특히32P이다. 그러나, 폴리뉴클레오티드중으로 도입시키기 위하여 비오틴 변형된 뉴클레오티드를 사용하는 것과 같이, 다른 기술이 또한 이용될 수 있다. 이후 비오틴은 아비딘 또는 항체에 대한 결합 부위로서 제공되며, 이는 방사선핵종, 형광단, 효소 등과 같은 여러가지 표지물로 표지시킬 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄, DNA-RNA 하이브리드 이중쇄, 또는 DNA-단백질 이중쇄를 포함한, 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 상기 항체 또한 표지시킬 수 있으며 이중쇄가 표면에 결합하여, 표면상에 이중쇄 형성시, 이중쇄에 결합하는 항체의 존재를 검출할 수 있는 검정법을 수행할 수 있다. 신규한 안티-센스 RNA에 대한 프로브를 사용하는 것은 핵산 하이브리드화, 플러스 및 마이너스 선별법, 재조합적 프로브화, 하이브리드 방출된 해독 (HRT: Hybrid Released Translation), 및 하이브리드 정지된 해독 (HART: Hybrid Arrested Translation)과 같은 통상의 기술로 수행할 수 있다. 이는 또한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)과 같은 증폭 기술을 포함한다.
다른 마커의 존재를 정성적 또는 정량적으로 시험하는 진단 키트가 또한 고려된다. 진단 또는 예후는 마커로서 사용되는 다수의 지표의 조합에 따를 수 있다. 따라서, 키트를 마커의 조합에 대해 시험할 수 있다. 참조: Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97.
VIII. 치료적 용도
본 발명은 확실한 치료적 가치가 있는 시약을 제공한다. DTLR (천연 또는 재조합 형태), 이들의 단편, 뮤테인 수용체, 및 항체는 상기 수용체 또는 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 것으로 확인된 화합물과 함께, 이들의 리간드의 수용체를 비정상적으로 발현시키는 병리 상태의 치료에 유용하다. 상기와 같은 비정상성은 전형적으로 면역질환으로 나타날 것이다. 추가로, 본 발명은 비정상적인 발현 또는 리간드에 대한 반응의 비정상적 촉진과 관련된 여러가지 질병 또는 질환에 있어서 치료 가치를 제공한다. Toll 리간드는 형태 발생, 예를 들어, 배복 극성 결정, 및 면역 반응, 특히 초기의 선천적 반응에 관여하는 것으로 제시된 바 있다. 참조: Sun, et al. (1991) Eur. J. Biochem. 196:247-254; Hultmark (1994) Nature 367:116-117.
재조합 DTLR, 뮤테인, 이에 대한 효능제 또는 길항제 항체, 또는 항체를 정제한 다음 환자에게 투여할 수 있다. 이들 시약은 추가의 활성 성분과 함께, 예를 들어 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제중에, 생리학적으로 무독성인 안정화제 및 부형제와 함께, 치료용으로 배합될 수 있다. 이들 배합물은 멸균, 예를 들어, 여과하여 투여량 바이알중에 동결건조시킴으로써 투여형으로 또는 안정화된 수성 제제의 형태로 보관할 수 있다. 본 발명은 또한 보체 결합이 아닌 항체 또는 이의 결합 단편의 용도를 고려한다.
DTLR 또는 이들의 단편을 사용한 리간드 선별을 수행하여 수용체에 대한 결합 친화성을 갖는 분자를 동정할 수 있다. 이후 후속의 생물학적 검정법을 이용하여 추정되는 리간드가 고유의 자극 활성을 차단할 수 있는, 경쟁적 결합을 제공할 수 있는지 측정할 수 있다. 유사하게, 고유의 자극 활성을 갖는 화합물은 수용체를 활성화시킬 수 있어 리간드의 활성을 자극하는, 예를 들어, 시그날 전달을 유발시키는 효능제이다. 본 발명은 또한 길항제로서 DTLR에 대한 항체의 치료적 용도를 고려한다.
효과적인 치료에 필수적인 시약의 양은 투여 방식, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 및 투여되는 다른 의약을 포함한, 수 많은 상이한 인자에 따른다. 따라서, 치료 투여량은 안전성과 효과를 최적화하도록 적정하여야 한다. 전형적으로, 시험관내로 사용되는 투여량은 이들 시약의 동일계 투여에 대해 유용한 양에 있어서 유용한 지침을 제공할 수 있다. 특정 질환의 치료에 있어서 유효 투여량의 동물 시험은 또한 사람의 투여량의 예측 지표를 제공한다. 여러가지 고려할 사항이 다음 문헌에 기재되어 있다: Gilman, et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Science, (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; 각각 본 명세서에서 참고로 인용됨. 투여 방법은 본원에서 이후 논의되는데, 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내, 또는 근육내 투여, 경피적 주입 등이 있다. 약제학적으로 허용되는 담체로는 물, 염수, 완충제, 및 문헌[Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey]에 기재된 기타 화합물이 있다. 추정되는 리간드와 이의 수용체간, 유사하게 높은 친화성 결합, 또는 대사회수 때문에, 이들 시약의 낮은 투여량이 초기에는 효과적인 것으로 예측된다. 시그날 전달 경로는 극히 적은 양의 리간드가 효과적일 수 있음을 제시하고 있다. 따라서, 투여량 범위는 일상적으로 1mM 농도 이하, 전형적으로 약 10μM 미만, 통상적으로 약 100nM 미만, 바람직하게는 약 10pM (피코몰) 미만, 가장 바람직하게는 약 1fM(펨토몰) 미만으로, 적합한 담체와 함께 존재할 것으로 기대된다. 서방성 제형, 또는 서방성 장치가 연속적인 투여용으로 종종 이용된다.
DTLR, 이들의 단편, 및 항체 또는 이의 단편, 길항제, 및 효능제를 치료할 숙주에게 직접 투여할 수 있거나, 화합물의 크기에 따라서, 투여전에 이들을 난알부민 또는 혈청 알부민과 같은 담체 단백질에 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 치료용 제제는 통상의 투여량 제형으로 투여할 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여할 수 있지만, 약제학적 제형으로 제공하는 것이 바람직하다. 제형은 상기 정의된 바와 같은, 활성 성분 1종 이상을, 허용되는 담체 1종 이상과 함께 포함한다. 각 담체는 다른 성분과의 적합성면에서 약제학적 및 생리학적으로 모두 허용가능하며 환자에게 유해해서는 안된다. 제형에는 경구, 직장, 비강, 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 피하내) 투여에 적합한 것들이 있다. 제형은 단위 투여형으로 편리하게 제공할 수 있으며 약제 분야에 숙지된 방법으로 제조될 수 있다. 참조: Gilman, et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences (current edtion), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; and Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systerms Dekker, NY. 본 발명의 치료법은 다른 치료제, 특히 다른 IL-1 족 일원의 효능제 또는 길항제와 함께 조합되거나 이들과 함께 사용될 수 있다.
IX. 리간드
본 발명의 Toll 수용체에 대한 설명은 상기한 바와 같은, 리간드를 동정하기 위한 수단을 제공한다. 상기와 같은 리간드는 각각의 수용체에 타당하게 높은 친화성으로 특이적으로 결합하여야 한다. 수용체를 표지시켜 이의 리간드를 검출할 수 있는 여러가지 작제물을 이용할 수 있다. 예를 들면, 2차 표지용 마커, 예를 들어, FLAG 또는 기타 에피토프 태그 등을 리간드에 융합시키는 것과 같이 DTLR을 직접 표지시키는 방법으로 수용체를 검출할 수 있다. 이는 생화학적 정제용 친화성 방법, 또는 발현 클로닝 방법에서의 표지화 또는 선택법에서와 같이 조직학적일 수 있다. 2종-하이브리드 선택 시스템을 또한 입수가능한 DTLR 서열을 갖는 적합한 작제물의 제조에 적용시킬 수 있다. 참조: Fields and Song (1989) Nature 340:245-246.
일반적으로, DTLR의 설명은 DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, 및/또는 DTLR10 시약 및 조성물에 관한 각각의 특정 양태에 유사하게 적용시킬 수 있다.
본 발명의 광범위한 범주는 하기 실시예를 참고로하여 가장 잘 이해되며, 실시예는 본 발명을 특정 양태로 제한하고자함이 아니다.
I. 일반적인 방법
표준 방법의 일부가 하기 문헌에 설명되거나 언급되어 있다: Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; 또는 Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. 단백질 정제법으로는 황산암모늄 정제법, 컬럼 크로마토그래피, 전기영동법, 원심분리법, 결정화법 등이 있다. 참조: Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements); Coligan, et al. (ed. 1996) and periodic supplements, Current Protocols In Protein Science Greene/Wiley, New York; Deutscher (1990) 'Guide to Protein Purification' in Methods in Enzymology,vol. 182, and other volumes in this series; 및 단백질 정제 생성물의 사용에 대한 제조업자의 문헌, 예를 들면, Pharmacia, Piscataway, N.J., 또는 Bio-Rad, Richmond, CA. 재조합 기술을 혼합 사용하여 적절한 절편, 예를 들면 FLAG 서열 또는 프로테아제-제거가능한 서열을 통하여 융합시킬 수 있는 등가물에 융합시킬 수 있다. 참조: Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) 'Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent' in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; and Crowe, et al. (1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
표준 면역학적 기술 및 검정법은 다음 문헌에 기재되어 있다: Hertzenberg, et al. (eds. 1996) Weir's Handbook of Exprimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; and Methods in Enzymology volumes. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, and 163.
혈관 생물학적 활성에 대한 검정법은 당해 분야에 숙지되어 있다. 이들은 종양, 또는 기타 조직중에서의 맥관형성 및 지혈 활성을 포괄하는데, 예를 들어, 동맥 평활근 증식 (참조: Koyoma, et al. (1996) Cell 87:1069-1078), 혈관 상피로의 단핵구 접착 (참조: McEvoy, et al. (1997) J. Exp. Med. 185:2069-2077) 등이 있다. 참조: Ross (1993) Nature 362:801-809; Rekhter and Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147:668-677; Thyberg, et al. (1990) Atherosclerosis 10:966-990; andGumbiner (1996) Cell 84:345-357.
신경 세포 생물학적 활성에 대한 검정법은 하기 문헌에 기재되어 있다: Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; and Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. 발생 시스템의 방법론은 다음 문헌에 기재되어 있다: Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; and Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.
예를 들어, GCG (U. Wisconsin) 및 GenBank 공급원으로부터의 것들을 포함한, 입수가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 컴퓨터 서열 분석을 수행한다. 공지된 서열 데이타베이스, 예를 들어, GenBank, NCBI, EMBO 등으로부터의 데이타베이스를 또한 사용했다.
IL-10 수용체에 적용가능한 수 많은 기술을 예를 들어, USSN 08/110,683 (IL-10 수용체; 본 명세서에서 모든 목적에 대해 참고로 인용됨)에 기재된 바와 같이 DTLR에 적용시킬 수 있다.
II. 사람 수용체의 신규 족
약어: DTLR, Toll-유사 수용체; IL-1R, 인터류킨-1 수용체; TH, Toll 상동성; LRR, 류신-풍부 반복단위; EST, 발현된 서열 태그; STS, 서열 태그된 부위; FISH(fluoresence in situ hybridization), 형광 원위치(in situ) 하이브리드화.
드로소필라 Toll 및 사람의 인터류킨-1 (IL-1) 수용체의 세포질성 도메인 사이의 서열 상동성의 발견은 상기 분자 둘다 Rel-타입 전사 인자의 핵 전위에 연결되어 있는 관련 시그날 전달 경로를 개시한다는 확신을 나타낸다. 상기 보존된 시그날 전달 방식은 곤충 및 척추동물 둘다에서 진화적으로 오래된 면역 반응을 지시한다. 본 발명자들은 세포내- 및 세포외 절편 모두에서 드로소필라 Toll과 매우 유사한 단백질 구조를 갖는, 신규한 부류의 추정적인 사람의 수용체의 분자 클로닝을 보고한다. DTLR 1-5로 표시된, 5종의 사람의 Toll-유사 수용체는 파리 분자의 직접적인 동족체일 것이며, 사람에서의 선천적인 면역성의 중요하고 인지되지 않은 성분을 구성할 수 있는 것과 같이, 흥미롭게도, 척추동물에 있어서 DTLR의 진화적 보유는 초기 형태발생 패턴화의 조절자로서, 드로소필라 배의 배-복측화에 있어서 Toll과 유사한 또다른 역할을 나타낼 수 있다. 다수의 조직 mRNA 블롯은 사람의 DTLR의 경우 확실히 상이한 발현 패턴을 나타낸다. 형광 원위치 하이브리드화 및 서열-태그된 부위 데이타베이스 분석법을 이용하여, 본 발명자들은 또한 동족 DTLR 유전자가 염색체 4 (DTLR 1, 2, 및 3), 9 (DTLR4), 및 1 (DTLR5)상에 존재함을 밝혀냈다. 다양한 곤충 및 사람의 DTLR, 척추동물의 IL-1 수용체, 및 MyD88 인자, 및 식물 질병 내성 단백질로부터의 정렬된 Toll-상동성 (TH) 도메인의 구조 예측은 산성 활성 부위를 갖는 평행한 β/α 폴드(fold)를 인식하며; 유사한 구조가 세균에서의 감각 정보의 변환에 광범위하게 연루되어 있는 반응 조절자 부류에서 명백하게 나타난다.
사람과 파리의 것을 극적으로 분리시키는 형태발생성 걸프의 씨드는 친숙한 배 형태 및 패턴으로 이식되지만, 매우 상이한 세포 복잡성(complexity)을 일으킨다. 참조: DeRobertis and Sasai (1996) Nature 380:37-40; and Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21. 곤충과 척추동물간의 발생 과정의 분기가 확실하게 유사한 시그날 전달 경로에 의해 나타날 수 있으며, 동일하지 않은 유전자 레퍼토리로부터 단백질 네트워크와 생화학적 메카니즘이 상당히 유지됨이 강조된다. 참조: Miklos and Rubin (1996) Cell 86:521-529; 및 Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33. 이들 조절 경로의 진화 디자인을 챠트화하는데 있어서 강력한 방법은 이들의 유사한 분자 성분 (및 생물학적 기능)을 단백질 서열 및 구조의 종간 비교를 통하여 추측하는 것이다. 참조: Miklos and Rubin (1996) Cell 86:521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33 (3-5); 및 Banfi, et al. (1996) Nature Genet. 13:167-174.
배 발생에 있어서 보편적으로 중요한 단계는 선천적 비대칭으로부터 발생되거나 외부 자극에 의해 개시되는, 몸체 축의 특정화이다. 참조: DeRobertis and Sasai (1996) Nature 380:37-40; 및 Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21. 모델 시스템으로서, 배복축 편극화의 계통발생적 기준과 세포 메카니즘에 특히 관심이 집중되고 있다. 참고: DeRobertis and Sasai (1996) Nature 380:37-40; 및 Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21. 상기 변형에 대한 프로토타입 분자 전략이 드로소필라 배로부터 알려졌는데, 여기서는 소수의 유전자의 순차적 작용으로 전사 인자 Dorsal의 복측화 구배가 발생된다. 참조: St. Johnston and Nusslein-Volhard (1992) Cell 68:201-219; 및 Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399.
상기 시그날 전달 경로는, 모계-분비된 복측 인자인 Spatzle가 부속 분자인 Tube의 세포질 회합중으로 결합하는 것을 전달하고, 억제제 Cactus로부터 Dorsal이 해리되는 것을 촉매하여 Dorsal이 배측 핵으로 이동하도록 하는 Ser/Thr 키나제인 Pelle의 활성화를 전달하는 막관통 수용체인 Toll에 중심을 두고 있다 (참조: Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399; 및 Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416). Toll 경로는 또한 성체 파리에서 강력한 항미생물 인자의 유도를 조정하며[Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983]; 드로소필라 면역 방어에 있어서 상기 역할은 척추동물에서 숙주의 면역 및 염증 반응을 지배하는 IL-1 경로에 대해 메카니즘적으로 유사한 경로를 강화시킨다. 참조: Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; 및 Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771. IL-1 수용체중 Toll-관련 세포질 도메인은 Pelle-유사 키나제인, IRAK의 결합, 및 Dorsal 및 Cactus의 결합을 반영하는 잠재적 NF-κB/I-κB 복합체의 활성화를 지시한다. 참조: Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; 및 Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771.
본 발명자들은 DTLR 2-5로 표시된, 사람에서의 신규한 4종의 Toll-유사 분자의 클로닝 및 분자 특징화를 기술하였는데 (Chiang Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239에 따름), 이들은 척추동물 IL-1 수용체보다 드로소필라 Toll 동족체에 더욱 밀접한 수용체 족임이 밝혀졌다. DTLR 서열은 사람의 EST로부터 유래되며; 이들 부분적인 cDNA를 사용하여 5종의 DTLR에 대한 사람 조직에서의 완전한 발현 프로필을 도시화하고, 동족 유전자의 염색체 위치를 지도화하고, 전체 길이의 cDNA 복구용 cDNA 라이브러리의 선택폭을 좁힐 수 있었다. 다른 노력[Banfi, et al. (1996) Nature Genet. 13:167-174; 및 Wang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4468-4476]에 자극되어, 본 발명자들은 구조적 보존 및 분자 파시모니 (parsimony)에 의해, 드로소필라에서의 강제적인 조절 방식의 대응체인 사람에서의 생물학적 시스템을 구축하고 있다. 또한, Toll 시그날 전달을 지시하는 생화학적 메카니즘이 DTLR, 광범위한 족의 IL-1 수용체, 포유동물 MyD88 인자 및 식물 질병 내성 단백질에 의해 공유되는 코어 모듈인 Toll-상동성 (TH) 도메인의 제안된 3차 폴드에 의해 제시된다. 참조: Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783; 및 Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475. 본 발명자들은 곤충, 식물, 및 동물에 있어서 형태발생과 초기 면역성을 커플링시키는 시그날 전달 경로[Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; 및 Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178]가 세균의 2-성분 경로를 기초로 할 수 있다고 제안한다.
컴퓨터 분석
곤충 DTLR와 관련있는 사람의 서열이 BLAST 서버[Altschul, et al. (1994) Nature Genet. 6:119-129]를 사용하는 기관[National Center for Biotechnology Information (NCBI)]에서의 EST 데이타베이스 (dbEST)로부터 확인되었다. 더욱 감응성인 패턴- 및 프로필-에 의거한 방법[Bork and Gibson (1996) Meth. Enzymol. 266:162-184]을 사용하여 비중복적인 데이타베이스중에 존재하는 척추동물과 식물 단백질과 공유하는 DTLR 족의 시그날 도메인을 단리시켰다. DTLR 세포내 또는 세포외 도메인 서열의 점진적인 정렬을 ClustalW[Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680]로 수행했는데; 상기 프로그램은 또한 Neighbor-Joining 알고리즘 (5000 부트스트랩 반복은 3개 그룹화에 대한 신뢰도 수치를 제공한다)을 이용하여 정렬된 서열의 분지 순서를 계산했다.
수개의 엄격도로 식별된, 보존된 정렬 패턴이 컨센서스 프로그램 (internet URL http://www.bork.emblheidelberg.de/Alignment/consensus.html)에 의해 도식화되었다. 단백질 핑거프린트의 PRINTS 라이브러리 (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRINTS.html) (Attwood, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:212-217)가 분기성 LRR의 N- 및 C-종결 특징과 유연하게 매치하는 화합물 모티브 (PRINTS code Leurichrpt)를 갖는 DTLR의 세포외 절편에 존재하는 무수한 류신-풍부 반복단위 (LRR)를 신뢰할 수 있도록 확인하였다. 3개-상 정확도가 72% 이상인 2개의 예측 알고리즘을 사용하여 인식 작용력을 배가시키기 위한 가교로서, 세포내 도메인 정렬에 대한 컨센서스 2차 구조를 유도했다 (Fischer, et al. (1996) FASEB J. 10:126-136). 신경 네트워크 프로그램 PHD (Rost and Sander (1994) Proteins 19:55-72) 및 통계학적 예측법 DSC (King and Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310)은 둘다 인터넷 서버를 갖고 있다 (각각 URLS http://www.emblheidelberg.de/predictprotein/phd_pred.html 및 http://bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc_read_align.html). 세포내 영역은 예를 들어, 문헌[Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475; 및 Rock, et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:588-593 (본 명세서에서 각각 참고로 인용됨)]에 논의된 THD 영역을 암호화한다. 상기 도메인은 포스페이트기를 기질에 전달하는, 수용체에 의한 시그날 전달 메카니즘에 있어서 매우 중요하다.
전장 사람 DTLR cDNA의 클로닝
Toll-유사 Humrsc786 서열 (Genbank 수탁 암호 D13637)[Nomura, et al. (1994) DNA Res 1:27-35)]로부터 유래된 PCR 프라이머를 사용하여 사람의 적백혈병, TF-1 세포주-유래 cDNA 라이브러리[Kitamura, et al., (1989) Blood 73: 375-380]를 프로브검사하여 DTLR1 cDNA 서열을 수득했다. 나머지 DTLR 서열은 dbEST로부터 표시되었고, Reserch Genetics (Huntsville, AL)를 통하여 I.M.A.G.E. 콘소르티움[Lennon, et al. (1996) Genomics 33:151-152]로부터 관련 EST 클론을 수득했다: CloneID#'s 80633 및 117262 (DTLR2), 144675 (DTLR3), 202057 (DTLR4) 및 277229 (DTLR5). 사람의 DTLR2-4에 대한 전장 cDNA를 각각 λgt10 파아지, 성인의 폐, 태반, 및 태아의 간 5'-신장물 + cDNA 라이브러리 (Clontech)의 DNA 하이브리드화 선별법에 의해 클로닝했고; DTLR5 서열을 사람의 다발성-경화증 플라크 EST로부터 유도시킨다. 포지티브 클론을 모두 서열화하고 정렬하여 각각의 DTLR ORF를 확인했다: DTLR1 (2366 bp 클론, 786 aa ORF), DTLR2 (2600 bp, 784 aa), DTLR3 (3029 bp, 904 aa), DTLR4 (3811 bp, 879 aa) 및 DTLR5 (1275 bp, 370 aa). DTLR3 및 DTLR4 하이브리드화용 프로브는 각각 주형으로서 사람의 태반 (Stratagene) 및 성인의 간 (Clontech) cDNA 라이브러리를 사용한 PCR에 의해 제조했고; 프라이머 쌍은 각각의 EST 서열로부터 유도했다. PCR 반응은 티. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus) Taqplus DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하여 다음 조건하에서 수행했다: 1 x (94 ℃, 2분) 30 x (55 ℃, 20초; 72 ℃ 30초; 94 ℃ 20초), 1 x (72 ℃, 8분). DTLR2 전체 길이의 cDNA 선별의 경우, 제1 EST 클론 (ID# 80633)의 EcoRI/XbaI 분해에 의해 발생된 900 bp 단편을 프로브로서 사용했다.
mRNA 블롯 및 염색체 위치 측정
레인당 대략 2 ㎍의 폴리(A)+ RNA를 함유하는, 사람의 다수 조직 (Cat# 1, 2) 및 암 세포주 블롯 (Cat# 7757-1)을 Clontech (Palo Alto, CA)로부터 구입했다. DTLR 1-4의 경우, 단리된 전장 cDNA가 프로브로서 제공되었고, DTLR5의 경우 EST 클론 (ID# 277229) 플라스미드 삽입물을 사용했다. 요약하면, 프로브를 Amersham Rediprime 랜덤 프라이머 표지화 키트 (RPN1633)를 사용하여 [α-32P] dATP로 방사선표지시켰다. 예비하이브리드화 및 하이브리드화는 0.5 M Na2HPO4, 7% SDS, 0.5 M EDTA (pH 8.0)중 65 ℃에서 수행했다. 모든 엄격도 세척을 65 ℃에서 수행했는데 2 x SSC, 0.1% SDS중에서 40분간 초기 세척을 2회 수행한 다음 0.1 x SSC, 0.1% SDS중에서 20분간 후속의 세척을 수행했다. 이후 막을 -70 ℃에서 증강 스크린의 존재하에서 X-선 필름에 노출시켰다. 선택된 사람의 DTLR 클론에 대해 cDNA 라이브러리 서던 (14)에 의해 더욱 상세하게 연구를 수행하여 조혈 세포 서브셋중에서 이들의 발현을 조사했다.
문헌[Heng and Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33:109-122]에 기재된 바와 같은 형광 원위치 하이브리드화 (FISH) 방법으로, 프로브로서 여러가지 전장 (DTLR 2-4) 또는 부분적 (DTLR5) cDNA 클론을 사용하여 사람의 염색체 지도화를 수행했다. 이들 분석은 SeeDNA Biotech Inc. (Ontario, Canada)에 의한 노력으로써 수행되었다. 지도화된 DTLR 유전자와 관련된 사람의 증상 (또는 신테닉 좌중 마우스 결함)에 대한 연구는 인터넷 서버(http://www.hgmp.mrc.ac.uk/DHMHD/hum_chrome1.html)에 의해 Dysmorphic Human-Mouse Homology Database에서 수행되었다.
곤충 및 사람의 DTLR 엑토도메인의 보존된 구조
드로소필라의 Toll 족은 4개 이상의 특정한 유전자 생성물을 포함한다: Toll, 파리 배의 배복측 패턴화에 관련된 프로토타입 수용체[Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399] 및 초기 배 발생에 연루될 수 있는 2차로 언급되는 '18 Wheeler' (18w)[Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899]; 2개의 추가 수용체가 웅성-특이적-전사물 (Mst) 좌의 불완전한, Toll-유사 ORF 다운스트림 (Genbank code X67703)에 의해 예측되거나 '서열-태그-부위' (STS) Dm2245 (Genbank code G01378)[Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783]에 의해 암호화된다. Toll과 18w의 세포외 절편은 불완전한, 대략 24개의 아미노산 LRR 모티브로 특이하게 구성되어 있다[Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; and Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899]. LRR의 유사한 반복 배열체는 통상적으로 여러가지의 세포 표면 분자의 접착성 안테나를 형성하며 이들의 일반적인 3차 구조는 리보뉴클레아제 억제제 폴드의 U자형 크레이들(horseshoe-shaped cradle)을 취하는 것으로 추정되며, 이때, 17개의 LRR는 반복되는 β/α-헤어핀, 28개 잔기 모티브를 나타낸다 (Buchanan and Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65:1-44). 굴곡진 β-시트의 오목한 면 (Kajava, et al. (1995) Structure 3:867-877)을 사용하는 세르펜틴 수용체의 다중-LRR 엑토도메인에 의한 시스틴-노트(knot) 폴드 당단백질 호르몬의 결합에 대한 모델이 제안된 후 Toll에 의한 Spatzle의 특이적 인식이 따랐으며; 흥미롭게는, Spatzle 및 오르판(orphan) 드로소필라 리간드인, Trunk중 시스테인의 패턴으로 유사한 시스틴-노트 3차 구조를 예측할 수 있다 (Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; 및 Casanova, et al. (1995) Genes Develop. 9:2539-2544).
Toll과 18w의 22 및 31개 LRR 엑토도메인은 각각 (Mst ORF 단편을 16개의 LRR를 나타냄) 서열 및 패턴 분석에 의해 DTLR 1-4의 유사한 18, 19, 24, 및 22 LRR 배열체 (이제, 불완전한 DTLR5 쇄는 4개의 막-인접 LRR를 포함한다)와 가장 밀접하게 관련이 있다 (Altschul, et al. (1994) Nature Genet. 6:119-129; 및 Bork and Gibson (1996) Meth. Enzymol. 266:162-184) (도 1). 그러나, 사람의 DTLR쇄에 있어서 현저한 차이는 Toll, 18w 및 Mst ORF(각각 막 경계로부터 4개, 6개 및 2개의 LRR가 떨어져 있음)의 엑토도메인중에 가변적으로 매몰되어 있는 대략 90개 잔기의 시스테인-풍부 영역의 공통되는 소실이다. 이들 시스테인 클러스터는 명확한 '상단' (LRR을 종결함) 및 '하단' (LRR 정상에 축적) 절반을 갖는 두 부분으로 된 것이며 (Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899; and Buchanan and Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65:1-44); '상단' 모듈은 드로소필라 및 사람의 DTLR 둘다에서 보존된 막인접(juxtamembrane) 스페이서로서 나타난다 (도 1). 본 발명자들은 드로소필라 수용체 (및 기타 LRR 단백질)중에 유동적으로 위치하는 시스테인 클러스터는, '상단'을 '하단'과 짝지을 경우, DTLR 엑토도메인의 전체적인 폴드를 변형시키지 않고 LRR의 쌍 사이에 삽입될 수 있는 한쌍의 종결부를 갖는 콤팩트한 모듈을 형성하며; 유사한 '돌출된' 도메인은 다른 단백질의 구조를 이루게 된다(Russell (1994) Protein Engin. 7:1407-1410)고 제안한다.
TH 시그날 전달 도메인의 분자 디자인
Toll 및 IL-1 타입 I (IL-1Ra) 수용체의 서열 비교는 유사한 Rel-타입 전사 인자에 의해 시그날 전달을 매개할 것으로 생각되는 대략 200개의 아미노산 세포질 도메인의 명확한 유사성을 설명한다. 참조: Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12: 393-416 및 Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771. 상기 기능적 패러다임에 더욱 최근에 첨가된 것은 N-종결 TH 모듈에 이은 뉴클레오티드-결합 (NTPase) 및 LRR 절편을 특징으로 하는 담배 및 아마로부터의 식물 질병 내성 단백질 한쌍이며[Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178]; 대조적으로, '사멸 도메인'이 세포내 골수 분화 마커인 MyD88의 TH 쇄보다 앞선다 (Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783; 및 Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475) (도 1). 신규한 IL-1-타입 수용체로는 IL-1R3, 부속 시그날 전달 분자, 및 오르판 수용체 IL-1R4 (ST2/Fit-1/T1으로도 명명됨), IL-1R5 (IL-1R-관련 단백질), 및 IL-1R6 (IR-1R-관련 단백질-2)가 있다 (Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783; Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475). 신규한 사람의 DTLR 서열의 경우, 본 발명자들은 공통되는 TH 모듈의 형태를 분석함으로써 상기 진화 세류의 구조적 정의를 추구하였다: 128개의 아미노산을 포함하는 보존된 서열의 블록 10개는 최소의 TH 도메인 폴드를 형성하며; 정렬체중의 갭은 서열의 위치와 길이-가변성 루프의 위치를 표시한다 (도 2a).
다중식으로 정렬된 서열, PHD (Rost and Sander (1994) Proteins 19:55-72) 및 DSC (King and Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310)에 있어서 보존 및 변화 패턴을 이용한 예측 알고리즘 2개는 TH 시그날 전달 모듈에 대해 강력하고 일치하는 결과를 나타낸다 (도 2A). 각 블록은 별개의 2차 구조 요소를 포함한다: 교대적인 β-스트랜드 (A-E로 표지)와 α-헬릭스 (1-5번)의 모습은 평행하는 β-시트의 두면상에 α-헬릭스를 갖는 β/α-부류 폴드의 특징을 나타낸다. 소수성 β-스트랜드 A, C 및 D는 β-시트중 '내부' 단(stave)을 형성할 것으로 예측되는 반면, 길이가 더 짧은, 양쪽성 β-스트랜드 B 및 E는 전형적인 '모서리' 유니트를 닮았다 (도 2A). 이런 지적은 코어 β-시트중 B-A-C-D-E의 스트랜드 순서와 일치한다 (도 2B); 폴드 비교 ('지도화') 및 인식 ('트레딩 (threading)') 프로그램 [Fischer, et al. (1996) FASEB J. 10:126-136]은 상기 이중으로 감긴 β/α 형상을 강력하게 다시 제시한다. TH 도메인에 대한 상기 개략적인 구조의 놀라운, 기능상의 예측은 다중 정렬체중 수 많은 보존된, 하전 잔기가 β-시트의 C-종결부에 지도화된다는 것이다: βA의 말단에서 잔기 Asp16 (블록 번호도 - 도 2A), Arg39 및 Asp40에 이어서 βB, α3의 제1 턴중 Glu75, 및 βD-α4 루프중에, 또는 βE 후에 더욱 느슨하게 보존된 Glu/Asp 잔기 (도 2A). 4개의 다른 보존된 잔기 (Asp7, Glu28, 및 Arg57-Arg/Lys58 쌍)의 위치는 β-시트의 반대편, N-종결 말단에서의 염 가교 네트워크와 양립할 수 있다 (도 2A).
시그날 전달 기능은 TH 도메인의 구조적 완전성에 따른다. 모듈 경계면내에서의 불활성화 돌연변이 또는 결실 (도 2A)이 IL-1Ra 및 Toll에 대해 목록화되어 있다. Heguy, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2605-2609; Croston, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:16514-16517; Schneider, et al. (1991) Genes Develop. 5:797-807; Norris and Manley (1992) Genes Develop. 6:1654-1667; Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; 및 Norris and Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872. 최소 TH 도메인을 지나 연장되는 사람의 DTLR1-5 쇄 (각각 잔기 길이가 8, 0, 6, 22 및 18개)는 Mst ORF의 뭉뚱한, 4 aa '테일(tail)'과 가장 유사하다. Toll 및 18w는 융합된 TH 도메인의 시그날 전달을 네가티브식으로 조절할 수 있는 관련없는 102 및 207개 잔기 테일 (도 2A)을 나타낸다. Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; 및 Norris and Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872.
TH 도메인을 포함하는 서로 다른 단백질간의 진화적 관계는 다중 정렬로부터 유도된 계통수에 의해 가장 잘 구분될 수 있다 (도 3). 4개의 주요 분지는 식물 단백질, MyD88 인자, IL-1 수용체 및 Toll-유사 분자로 분리되며; 이후의 분지 무리는 드로소필라와 사람의 DTLR로 분리된다.
사람의 DTLR 유전자의 염색체 분산
발생초기의 사람 DTLR 유전자족의 유전적 연관성을 연구할 목적으로, 본 발명자들은 FISH에 의해 5개의 유전자중 4개의 염색체좌를 지도화하였다 (도 4). DTLR1 유전자는 먼저 사람 게놈 프로젝트에 의해 챠트화되었다: STS 데이타베이스 좌 (STS WI-7804 또는 SHGC-12827에 상응하는, dbSTS 수탁번호 G06709)는 Humrsc786 cDNA에 대해서도 존재하며 (Nomura, et al. (1994) DNA Res 1:27-35) 상기 유전자를 염색체 4 마커 간격 D4S1587-D42405 (50-56 cM) circa 4p14에 고정시킨다. 이러한 제안은 최근에 FISH 분석에 의해 확증되었다[Taguchi, et al. (1996) Genomics 32:486-488]. 본 연구에서, 본 발명자들은 신뢰할 수 있도록 나머지 DTLR 유전자를 염색체 4q32 (DTLR2), 4q35 (DTLR3), 9q32-33 (DTLR4) 및 1q33.3 (DTLR5)상의 유전자 좌에 부여하였다. 본 연구 과정중, 부모 DTLR2 EST에 대한 STS (클론ID #80633)가 발생되었으며 (STS SHGC-33147에 대한 dbSTS 수탁번호 T57791) 본 발명자들의 발견과 일치하도록 - 4q32에서 염색체 4 마커 간격 D4S424-D4S1548 (1430153 cM)에 지도화시켰다. 염색체 4의 길이가 긴 암 (arm)상 DTLR2와 DTLR3 유전자 사이에 대략 50 cM의 갭이 존재한다.
DTLR 유전자는 차별적으로 발현됨
Toll과 18w는 둘다 배 패턴화 이외의 기능을 암시할 수 있는 드로소필라에서의 복잡한 공간 및 시간적 발현 패턴을 갖는다[St. Johnston and Nusslein-Volhard (1992) Cell 68:201-219; Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399; Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; 및 Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899]. 본 발명자들은 다양한 사람 조직과 암 세포주에 대해 방사선표지된 DTLR cDNA를 사용하여 mRNA 블럿 분석에 의해 DTLR 전사물의 공간적 분포를 조사하였다 (도 5). DTLR1은 어디에서나 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 다른 수용체보다 더 높은 수준으로 발현되었다. 별개의 스플라이싱을 반영하는 것으로 추정되는, '짧은' 3.0 kB 및 '긴' 8.0 kB DTLR1 전사물 형태가 각각 난소 및 비장에 존재하였다 (도 5, 패널 A B). 암세포 mRNA 패널은 또한 Burkitt's 임파종 Raji 세포주에서 DTLR1의 현저한 과발현을 나타냈다 (도 5, 패널 C). DTLR2 mRNA는 DTLR1보다 덜 광범위하게 발현되었으며, 4.0 kB 종이 폐에서 검출되었으며 4.4 kB 전사물은 심장, 뇌 및 근육에서 현저하였다. DTLR3의 조직 분포 패턴은 DTLR2의 것을 따른다 (도 5, 패널 E). DTLR3은 또한 크기가 대략 4.0 및 6.0 kB인 2개의 주요 전사물로서 존재하며, 최대 수준의 발현은 태반 및 췌장에서 관찰되었다. 대조적으로, DTLR4 및 DTLR5 메시지는 극히 조직-특이적인 것으로 나타났다. DTLR4는 크기가 대략 7.0 kB인 단일 전사물로서 태반에서만 검출되었다. 약한 4.0 kB 시그날이 난소 및 모세혈 단핵구에서 DTLR5에 대해 관찰되었다.
진화적으로 오래된 조절 시스템의 성분
원래의 분자 블루프린트와 시그날 전달 경로의 상이한 운명은 비교식 게놈 방식으로 재구성될 수 있다[Miklos and Rubin (1996) Cell 86:521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33; Banfi, et al. (1996) Nature Genet. 13:167-174; 및 Wang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4468-4476]. 본 발명자들은 상기 논리를 사용하여 Toll에 의해 발원되는 드로소필라 유전자 족의 직접적인 진화적 대응체인, 현재의 5개의 수용체 위추체 (paralog), DTLR 1-5를 암호화하는, 사람에서 나타나는 유전자 족을 확인하였다 (도 1-3). 사람 및 파리의 DTLR의 보존된 구조, 보존된 LRR 엑토도메인 및 세포내 TH 모듈 (도 1)은 드로소필라의 Toll (6, 7)에 커플링된 튼튼한 경로가 척추동물에서도 존재함을 암시한다. 최상의 증거는 반복되는 경로로부터 도입되었다: 수용체-융합된 TH 도메인, IRAK, NF-κB 및 I-κB 동족체의 다양한 IL-1 시스템 및 이의 레퍼토리 (Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell. Develop. Biol. 12:393-416; Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771; Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475; and Cao, et al (1996) Science 271:1128-1131); Tube-유사 인자가 또한 특징화되었다. DTLR가 IL-1R 시그날 전달 기관에 생산적으로 커플링될 수 있는지, 대신, 유사한 단백질 세트가 사용되는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다. IL-1 수용체와는 상이하게, 사람의 DTLR의 LRR 크레이들(cradle)은 Spatzle/Trunk-관련 시스틴-노트 인자에 대한 친화성을 보유하는 것으로 예측되며; 상기 몰드에 적합한 후보 DTLR 리간드 (PEN으로 명명)가 단리되었다.
시그날 전달의 생화학적 메카니즘은 경로에서 상호반응하는 단백질 폴드의 보존에 의해 평가될 수 있다[Miklos and Rubin (1996) Cell 86:521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33]. 현재, Toll 시그날 전달 패러다임은 분자의 구조, 작용 또는 운명에 의해 역할이 협소하게 정의되는 일부 분자를 포함한다: Pelle는 Ser/Thr 키나제 (포스포릴화)이고, Dorsal는 NF-κB-유사 전사 인자 (DNA-결합)이며, Cactus는 안키린-반복 억제제 (Dorsal 결합, 분해)이다[Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416]. 대조적으로, Toll TH 도메인과 Tube의 기능은 불가사이한 상태로 남아있다. 다른 사이토킨 수용체[Heldin (1995) Cell 80:213-223]와 같이, Toll의 리간드-매개된 이합체화가 개시 사건인 것으로 나타났다: Toll의 막인접 영역중 유리 시스테인은 구성적으로 활성인 수용체 쌍[Schneider, et al. (1991) Genes Develop. 5:797-807], 및 이량체로서 키메라성 Torso-Toll 수용체 시그날[Galindo, et al. (1995) Develop. 121:2209-2218]을 발생시키며; 또한, Toll 엑토도메인의 심한 절단 또는 전체적인 소실은 촉매적 도메인을 갖는 발암성 수용체 (Heldin (1995) Cell 80:213-223)를 연상케하는, 무차별의 세포내 시그날 전달[Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; 및 Winans and Hashimoto (1995) Molec. Biol. Cell 6:587-596]을 일으킨다. Tube는 막-편재되어 있으며, Pelle의 N-종결 (사멸) 도메인에 관여하고 포스포릴화되어 있지만, Toll-Tube 또는 Toll-Pelle 상호반응은 어느것도 2개종-하이브리드 분석에 의해 기록되지 않는다 (Galindo, et al. (1995) Develop. 121:2209-2218; 및 Grosshans, et al. (1994) Nature 372:563-566); 이런 결과는 Toll TH 도메인의 구조 '상태'가 어떤식으로든 인자 보충에 영향을 준다는 것을 제시한다[Norris and Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872; 및 Galindo, et al. (1995) Develop. 121:2209-2218].
이들 중 가장 논쟁이 되는 문제는 Toll TH 모듈의 구조적 특성이다. 이런 의문을 풀기 위하여, 본 발명자들은 사람의 DTLR 쇄를 포함시켜, 곤충, 식물 및 척추동물로부터 TH 서열의 진화적 다양성을 이용하여, 구조 예측 및 폴드 인식을 위한 최소의 보존된 단백질 코어를 추출하였다 (도 2). 산성 잔기의 비대칭 클러스터를 갖는, 강력하게 예측되는 (β/α)5TH 도메인 폴드는 세균의 2-성분 시그날 전달 경로에서의 반응 조절자의 구조와 위상학적으로 동일하다[Volz (1993) Biochemistry 32:11741-11735; 및 Parkinson (1993) Cell 73:857-871) (도 2). 프로토타입 주화성 조절자 CheY는 코어 β-시트의 C-말단에서 '아스파르테이트 포켓'중의 2가 양이온에 일시적으로 결합한다; 상기 양이온은 정전기적 안정성을 제공하며 불변 Asp의 포스포릴화 활성화를 촉진한다[Volz (1993) Biochemistry 32:11741-11753]. 마찬가지로, TH 도메인은 이의 산성 부위에 양이온을 포획할 수 있지만, 활성화 및 다운스트림 시그날 전달은 네가티브로 하전된 잔기의 특이적 결합에 따를 수 있다: 음이온성 리간드는 정확한 수소-결합 네트워크중에 갇힘으로써 강력한 네가티브 결합-부위 퍼텐셜을 극복할 수 있다[Ledvina, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6786-6791]. 흥미롭게도, TH 도메인은 Toll에 대한 Tube/Pelle 복합체, 또는 식물 및 척추동물에서의 상동성 시스템의 어셈블리를 위한 단순한 골격으로서 단순하게 작용하는 것이 아니라, 시그날 전달 기관중에서 진정한 형태 유발자로서 활성적으로 관여할 수 있다. 아마도 Tube/Pelle 복합체의 조건적 결합을 해석해 보면, Toll 이량체화는 조절 수용체 테일[Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; Norris and Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872]에 의한 차폐물제거, 또는 TH 포켓의 작은 분자 활성화제에 의한 결합을 촉진시킬 것이다. 그러나, 세포 내부의 '유리' TH 모듈[Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369); Winans and Hashimoto (1995) Molec. Biol. Cell 6:587-596]은 잘못된 Tube/Pelle 복합체로 인한 활성화 및 도킹에 의한 촉매적, CheY-유사 유발자로서 작용할 수 있을 것이다.
형태발생적 수용체 및 면역 방어
곤충과 척추동물 면역 시스템 사이에 진화적인 연결이 DNA에 나타나며, 곤충에 있어서 항미생물 인자를 암호화하는 유전자는 포유동물에서 NF-κB 전사 인자를 결합시키는 것으로 공지된 급성 상 반응 요소와 유사한 업스트림 모티브를 나타낸다[Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183]. Dorsal, 및 2개의 Dorsal-관련 인자인, Dif와 Relish는 세균 투여후 이들 방어 단백질의 유도를 도우며[Reichhart, et al. (1993) C.R. Acad. Sci. Paris 316:1218-1224; Ip, et al. (1993) Cell 75:753-763; 및 Dushay, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10343-10347]; Toll, 또는 다른 DTLR도 성충 드로소필라에서 신속한 면역 반응을 마찬가지로 조절한다[Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; 및 Rosetto, et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:111-116]. 척추동물에서의 IL-1 염증 반응에 대한 이들 메카니즘의 유사성은 Toll 시그날 전달 경로의 기능적 다양성의 증거이며 배 패턴화와 선천적 면역성간의 오래된 협력작용을 제시한다[Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771; Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178; Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183; Reichhart, et al. (1993) C.R. Acad. Sci. Paris 316:1218-1224; Ip, et al. (1993) Cell 75:753-763; Dushay, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10343-10347; Rosetto, et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:111-116; Medzhitov and Janeway (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:4-9; 및 Medzhitov and Janeway (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:4-9]. 곤충과 사람의 DTLR 단백질의 더욱 밀접한 상동성은 IL-1 시스템에 대한 순수한 면역 대등물을 대신하며, 척추동물 배의 배-복 및 다른 변형에 잠재적 분자 조절자를 제공하는 생물학적 기능의 더더욱 강력한 중복을 초래한다[DeRobertis and Sasai (1996) Nature 380:37-40; 및 Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21].
사람에서 나타나는, 강력한 수용체 족에 대한 본 설명은 최근 Wnt 패턴화 인자에 대한 척추동물 Frizzled 수용체의 발견을 반영하는 것이다[Wang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4468-4476]. 수 많은 다른 사이토킨-수용체 시스템이 초기 발생에 있어서 역할을 하기 때문에[Lemaire and Kodjabachian (1996) Trends Genet. 12:525-531], 아마도 콤팩트한 배와 홀쭉한 성체의 구분되는 세포 환경은 익숙한 시그날 전달 경로가 되도록하고 상이한 시간에 상이한 생물학적 산출량을 갖는 이들의 확산성 유발자, 예를 들면, 형태발생 대 DTLR에 대한 면역 방어 기작을 일으킬 것이다. 곤충, 식물, 및 사람의 Toll-관련 시스템의 경우[Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475; Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178], 조절성 TH 도메인을 통한 이들 시그날 코스는 세균 형질도입 엔진과 흥미롭게도 유사하다[Parkinson (1993) Cell 73:857-871].
특히, DTLR6는 상기 족에 있어서 이의 멤버쉽을 정립시키는 구조적 특징을 나타낸다. 또한, 상기 족 일원은 수 많은 현저한 발생 질환에 연루되어 있으며 선천적 면역 시스템의 기능을 갖고 있다. 특히, DTLR6는 주요 발생 이상에 대한 "핫-스팟 (hot-spot)"인 좌로 X 염색체에 지도화되어 있다. 참조: The Sanger Center: human X chromosome website; http://www.sanger.ac.uk/HGP/ChrX/index.shtml; 및 the Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing website: http://gc.bcm.tmc.edu:8088/cgi-bin/seq/home.
기탁된 PAC에 대한 수탁번호는 AC003046이다. 상기 수탁 번호는 2개의 PACs RPC-164K3 및 RPC-263p4로부터의 서열을 포함한다. 2개의 PAC 서열은 STS 마커 DXS704 및 DXS7166 사이에 Baylor 웹 사이트에서 사람의 염색체 Xp22상에 지도화되어 있다. 상기 영역은 심각한 발생 이상에 대한 "핫-스팟"이다.
III. PCR에 의한 DTLR 단편의 증폭
2개의 적합한 프라이머 서열을 선택한다 (표 1 내지 10 참고). RT-PCR을 메시지의 존재에 대해 선택된 적합한 mRNA 샘플상에서 사용하여 부분적인 또는 전체 길이의 cDNA, 예를 들면, 상기 유전자를 발현시키는 샘플을 생산한다. 참조: Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; and Dieffenbach and Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY. 상기와 같은 공정으로 cDNA 라이브러리중에서 전체 길이의 유전자를 프로브화하는데 유용한 서열을 결정할 수 있다. TLR6은 게놈중의 연속 서열로, 이는 다른 TLR이 또한 존재함을 제시할 수 있다. 따라서, 게놈 DNA상에서의 PCR로 전체 길이의 연속 서열을 수득할 수 있으며, 이후 염색체 워킹 방법을 적용시킬 수 있다. 별법으로, 서열 데이타베이스가 상기한 양태의 부분에 상응하는 서열, 또는 밀접하게 관련있는 형태, 예를 들면, 별도의 스플라이싱 등을 함유한다. 발현 클로닝 기술을 또한 cDNA 라이브러리에 적용시킬 수 있다.
IV. DTLR의 조직 분포
이들 DTLR를 암호화하는 각 유전자에 대한 메시지를 검사했다. 참조: 도 5A-5F. 다른 세포 및 조직을 적합한 방법으로, 예를 들면, PCR, 면역검정법, 하이브리드화 등으로 검정한다. 조직 및 기관 cDNA 제제는 예를 들어, Clontech, Mountain View, CA로부터 입수할 수 있다. 상기한 바와 같이, 천연 발현 공급원을 확인하는 것이 유용하다.
서던 분석: 1차 증폭시킨 cDNA 라이브러리로부터의 DNA (5 ㎍)을 적합한 제한 효소로 분해하여 삽입물을 방출시키고, 1% 아가로스 겔상에서 수행하여 나일론 막 (Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 옮긴다.
사람의 mRNA 단리용 샘플은 전형적으로 다음예를 포함한다: 휴지기의 모세혈 단핵 세포 (단핵구, T 세포, NK 세포, 과립구, B 세포) (T100); 2, 6, 12시간 동안 항-CD3으로 활성화시키고 푸울시킨 모세혈 단핵 세포 (T101); 휴지기의 T 세포, TH0 클론 Mot 72 (T102); 3, 6, 12시간 동안 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화시키고 푸울시킨 T 세포, TH0 클론 Mot 72 (T103); 2, 7, 12시간 동안 특정 펩타이드로 처리하고 푸울시킨, 아네르기성 T 세포, TH0 클론 Mot 72 (T104); 휴지기의 T 세포, TH1 클론 HY06 (T107); 3, 6, 12시간 동안 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화시키고 푸울시킨 T 세포, TH1 클론 HY06 (T108); 2, 6, 12시간 동안 특정 펩타이드로 처리하고 푸울시킨, 아네르기성 T 세포, TH1 클론 HY06 (T109); 휴지기의 T 세포, TH2 클론 HY935 (T110); 2, 7, 12시간 동안 항-CD28 및 항-CD3으로 활성화시키고 푸울시킨 T 세포, TH2 클론 HY935 (T111); 항-CD28, IL-4중에서 27일간 편극시키고, 항-CD3 및 항-CD28로 4시간 동안 활성화시킨, 항 IFN-γ, TH2 편극시킨 T 세포 CD4+CD45RO-T 세포 (T116); 휴지기의 T 세포 종양 세포주 Jurkat 및 Hut78 (T117); 휴지기의 푸울시킨 AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69인 T 세포 클론 (T118); 휴지기의 T 세포 랜덤 γδ T 세포 클론 (T119); 휴지기의 비세포 B100); 항-CD40 및 IL-4로 활성화된 비세포 (B101); 휴지기의 푸울된 WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY인 B 세포주 EBV (B102); 1, 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화시키고 푸울시킨 B 세포주 JY (B103); 휴지기의 푸울시킨 NK 20 클론 (K100); 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화시키고 푸울시킨 NK 20 클론 (K101); LGL 백혈병 환자의 모세혈로부터 유래된, IL-2 처리된 NKL 클론 (K106); 휴지기의 NK 세포독성 클론 640-A30-1 (K107); 1, 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화시키고 푸울시킨, 조혈 전구체 세포주 TF1 (C100); 휴지기의 U937 전단구 세포주 (M100); 1, 6시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 활성화시키고 푸울시킨, U937 전단구 세포주 (M101); 1, 2, 6, 12, 24시간 동안 LPS, IFNγ, 항-IL-10으로 활성화시키고, 푸울시킨, 정화된 단핵구 (M102); 1, 2, 6, 12, 24시간 동안 LPS, IFNγ, IL-10으로 활성화시키고, 푸울시킨, 정화된 단핵구 (M103); 4, 16시간 동안 LPS, IFNγ, 항-IL-10으로 활성화시키고, 푸울시킨, 정화된 단핵구 (M106); 4, 16시간 동안 LPS, IFNγ, IL-10으로 활성화시키고, 푸울시킨, 정화된 단핵구 (M107); LPS로 1시간 동안 활성화시킨, 정화된 단핵구 (M108); LPS로 6시간 동안 활성화시킨, 정화된 단핵구 (M109); 휴지기의, CD34+ GM-CSF, TNFα 12일로부터 DC 70% CD1a+ (D101); PMA 및 이오노마이신으로 1시간 동안 활성화시킨, CD34+ GM-CSF, TNFα 12일로부터 DC 70% CD1a+ (D102); PMA 및 이오노마이신으로 6시간 동안 활성화시킨, CD34+ GM-CSF, TNFα 12일로부터 DC 70% CD1a+ (D103); FACS 분류되고, PMA 및 이오노마이신으로 1, 6시간 동안 활성화시키고, 푸울시킨 CD34+ GM-CSF, TNFα 12일로부터의, DC 95% CD1a+ (D104); FACS 분류되고, PMA 및 이오노마이신으로 1, 6시간 동안 활성화시키고, 푸울시킨 CD34+ GM-CSF, TNFα 12일으로부터의, DC 95% CD14+ (D105); FACS 분류되고, PMA 및 이오노마이신으로 1, 6시간 동안 활성화시키고, 푸울시킨 CD34+ GM-CSF, TNFα 12일로부터의, DC CD1a+ CD86+ (D106); 휴지기의, 단핵구 GM-CSF, IL-4 5일로부터의 DC (D107); 휴지기의, 단핵구 GM-CSF, IL-4 5일로부터의 DC (D108); 4, 16시간 동안 LPS로 활성화시키고 푸울시킨 단핵구 GM-CSF, IL-4 5일로부터의 DC (D109); 4, 16시간 동안 TNFα 단핵구 슈퍼로 활성화시키고 푸울시킨 단핵구 GM-CSF, IL-4 5일로부터의 DC(D110); 평활근종 L11 양성 종양 (X101); 정상적인 자궁근층 M5 (O115); 악성 평활근종 GS1 (X103); PMA 및 이오노마이신으로 1, 6시간 동안 활성화시키고 푸울시킨, 폐 섬유아세포 육종 세포주 MRC5(C101); PMA 및 이오노마이신으로 1, 6시간 동안 활성화시키고 푸울시킨 신장 상피암 세포주 CHA(C102); 28주 남성 태아 신장 (O100); 28주 남성 태아 폐 (O101); 28주 남성 태아 간 (O102); 28주 남성 태아 심장 (O103); 28주 남성 태아 뇌(O104); 28주 남성 태아 남성 (O106); 28주 남성 태아 (O107); 28주 남성 태아 지방 조직; 25주 여성 태아 난소 (O109); 25주 여성 태아 자궁 (O110); 28주 수것 남성 태아 정소 (O111); 28주 남성 태아 비장 (O112); 28주 성인 태반 (O113); 및 12세의 염증이 있는 편도 (X100).
마우스 mRNA 단리용 샘플의 예로는 다음과 같은 것들이 있다: 휴지기의 마우스 섬유아세포성 L 세포주 (C200); Braf:ER (Braf 융합 대 에스트로겐 수용체) 형질감염된 세포, 대조군 (C201); TH1 편극된 T 세포 (IFN-γ 및 항 IL-4로 7일간 편극시킨, 비장으로부터의 Me114 브라이트, CD4+ 세포; T200); TH2 편극된 T 세포 (IL-4 및 항-IFN-γ으로 7일간 편극시킨, 비장으로부터의 Me114 브라이트, CD4+ 세포; T201); 고도로 TH1 편극된 T 세포[참조: Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; 항-CD3으로 2, 6, 16시간 동안 활성화시키고 푸울시킴; T202]; 고도로 TH2 편극된 T 세포[참조: Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; 항-CD3으로 2, 6, 16시간 동안 활성화시키고 푸울시킴; T203]; 흉선으로부터 분류된, CD44- CD25+ pre T 세포 (T204); 항원으로 최종 자극후 3주간 휴지기의 TH1 T 세포 클론 D1.1 (T205); 15시간 동안 10 ㎍/㎖ ConA로 자극시킨 TH1 T 세포 클론 D1.1 (T206); 항원으로 최종 자극후 3주간 휴지기의 TH2 T 세포 클론 CDC35 (T207); 15시간 동안 10 ㎍/㎖ ConA 자극시킨 TH2 T 세포 클론 CDC35 (T208); 휴지기의, 비장으로부터의 Me114+ 천연의 T 세포 (T209); 6, 12, 24시간 동안 IFN-γ/IL-12/항-IL-4로 Th1으로 편극시키고 푸울시킨 Me114+ T 세포 (T210); 6, 13, 24시간 동안 IL-4/항-IFN-γ로 Th2로 편극시키고 푸울시킨 Me114+ T 세포 (T211); 자극되지 않은 성숙 B 세포 백혈병 세포주 A20 (B200); 자극되지 않은 성숙 B 세포주 CH12 (B201); 비장으로부터의, 자극되지 않은 거대한 B 세포 (B202); LPS 활성화된, 전체 비장으로부터의 B 세포 (B203); 휴지기의, 비장으로부터의 메트리자미드 강화된 수지상 세포 (D200); 휴지기의, 골수로부터의 수지상 세포 (D201); LPS로 4시간 동안 활성화시킨, 단핵구 세포주 RAW 264.7 (M200); GM 및 M-CSF로 유도시킨 골수 대식구 (M201); 휴지기의 대식구 세포주 J774 (M202); 대식구 세포주 J774 + LPS + 항-IL-10, 0.5, 1, 3, 6, 12시간 동안 푸울시킨 것 (M203); 0.5, 1, 3, 5, 12시간에 푸울시킨 대식구 세포주 J774 + LPS + IL-10 (M204); 7, 14, 24시간 동안 Th2 프라이머, 에어로졸 OVA 투여하고, 푸울시킨 에어로졸 투여된 마우스 폐 조직[참조: Garlisi, et al. (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75:75-83; X206]; 니포스트롱굴러스-감염된 폐 조직 [참조: Coffman, et al. (1989) Science 245:308-310; X200]; 전체 성인의 폐, 정상 (O200); 전체 폐, rag-1[참조: Schwarz, et al. (1993) Immunodeficiency 4:249-252; O205]; IL-10 K.O. 비장[참조: Kuhn, et al. (1991) Cell 75:263-274; X201]; 전체 성인의 비장, 정상 (O201); 전체 비장, rag-1 (O207); IL-10 K.O. Peyer's 패치 (O202); 전체 Peyer's 패치, 정상 (O210); IL-10 K.O. 장간막의 림프절 (X203); 전체 장간막의 림프절, 정상 (O211); IL-10 K.O. 결장 (X203); 전체 결장, 정상 (O212); NOD 마우스 췌장 [참조: Makino, et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:1-13; X205]; 전체 흉선, rag-1 (O208); 전체 신장, rag-1 (O209); 전체 심장, rag-1 (O202); 전체 뇌, rag-1 (O203); 전체 정소, rag-1 (O204); 전체 간, rag-1 (O206); 래트 정상적인 결합조직 (O300); 및 래트 관절 결합조직 (X300).
V. DTLR의 종 대응체의 클로닝
여러가지 방법을 사용하여 바람직하게는 다른 영장류로부터 이들 DTLR의 종 대응체를 수득한다. 한가지 방법은 밀접한 관계가 있는 종의 DNA 프로브를 사용하여 교차 하이브리드화시키는 것이다. 중간 단계로서 진화적으로 유사한 종에 대해 수행할 때 유용할 수 있다. 다른 방법은 특정 종, 예를 들어 사람의 유전자 사이의 유사성 또는 상이성의 블록, 예를 들면, 고도로 보존된 또는 보존되지 않은 폴리펩타이드 또는 뉴클레오티드 서열의 영역의 확인을 기본으로하는 특이적 PCR 프라이머를 사용하는 것이다. 별법으로, 항체를 발현 클로닝용으로 사용할 수 있다.
VI. 포유동물 DTLR 단백질의 생산
적합한, 예를 들어, GST, 융합 작제물을 발현용으로, 예를 들면, 이. 콜리에서 조작한다. 예를 들면, 마우스 IGIF pGex 플라스미드를 작제하여 이. 콜리를 형질전환시킨다. 방금 형질전환된 세포를 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 배지중에서 성장시키고 IPTG로 유도시킨다[Sigma, St. Louis, MO]. 밤새 유도시킨후, 세균을 수거하고 DTLR 단백질을 함유하는 펠릿을 단리시킨다. 상기 펠릿을 2 리터의 TE 완충액 (50 mM 트리스-염기 pH 8.0, 10 mM EDTA 및 2 mM pefabloc)중에서 균질화시킨다. 상기 물질을 미세유동화기 (Microfluidics, Newton, MA)를 통하여 3회 통과시킨다. 유동화시킨 상등액을 Sorvall GS-3 로터상에서 1시간 동안 13,000 rpm에서 회전시킨다. DTLR 단백질을 함유하는 생성된 상등액을 여과하고 50 mM 트리스-염기 pH 8.0에서 평형시킨 글루타티온-SEPHAROSE 컬럼상에 통과시킨다. DTLR-GST 융합 단백질을 함유하는 분획을 푸울하여 트롬빈으로 분해시킨다(Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). 이어서 분해시킨 푸울을 50 mM 트리스-염기중에서 평형시킨 Q-SEPHAROSE 컬럼상에 통과시킨다. DTLR을 함유하는 분획을 푸울하고 차가운 증류수중에 희석시켜 전도성을 저하시키고, 신선한 Q-세파로오스 컬럼, 단독으로 또는 면역친화성 항체 컬럼과 연속식으로 통과시킨다. DTLR 단백질을 함유하는 분획을 푸울하고, 분취하여 -70 ℃ 냉동기에 보관한다.
CD 스펙트럼을 DTLR1 단백질과 비교함으로써 상기 단백질이 정확하게 폴딩되었음을 제시할 수 있다. 참조: Hazuda, et al. (1969) J. Biol. Chem. 264:1689-1693.
VII. DTLR을 이용한 생물학적 검정
생물학적 검정은 일반적으로 단백질의 리간드 결합 특징 또는 수용체의 키나제/포스파타제 활성에 대한 것이다. 상기 활성은 전형적으로 수 많은 다른 효소 활성과 같이 가역적이며, 포스파타제 또는 포스포릴라제 활성을 매개하는데, 이 활성은 표준 방법으로 용이하게 측정된다. 참조: Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I 및 II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Qunat. Biol. 56:449-463; 및 Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738.
인터류킨-1 족은 염증 질환의 중요한 매개체인 분자를 함유한다. 포괄적인 검토를 위하여, 다음을 참고하라: Dinarello (1996) "Biologic basis for interleukin-1 in disease" Blood 87:2095-2147. 여러가지 Toll 리간드가 질병, 특히 염증 반응을 개시하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다고 제시되어 있다. IL-1 족과 관련된 신규 단백질의 발견은 질병의 개시에 대한 분자 기준을 제공하고 증가된 범위 및 효과의 치료 작전을 개발하도록 하는 분자의 동정을 촉진시킨다.
VIII. 예를 들어 DTLR4에 대해 특이적인 항체의 제조
순계 Balb/c 마우스를 재조합 형태의 단백질, 예를 들면 정제된 DTLR4 또는 안정한 형질감염된 NIH-3T3 세포로 복강내 면역시킨다. 동물을 적절한 시점에서 단백질로, 추가의 애주번트를 사용하거나 사용하지 않고 부스팅시켜, 항체 생산을 더욱 자극한다. 혈청을 수집하거나, 수거된 비장으로 하이브리도마를 생산한다.
별법으로, Balb/c 마우스를 상기 유전자 또는 이의 단편으로 형질전환시킨, 내인성 또는 외인성 세포로, 또는 항원 발현용으로 강화시킨 단리된 막으로 면역시킨다. 혈청을 적절한 시간에, 전형적으로 수회 추가 투여후 수집한다. 다양한 유전자 치료 기술이 면역 반응을 일으키는데 있어서, 예를 들어 동일계(in situ) 단백질 생산에 있어서 유용할 수 있다.
모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 비세포를 적절한 융합 파트너와 융합시키고 하이브리도마를 성장 배지중에서 표준 방법으로 선택한다. 하이브리도마 상등액을 목적하는 DTLR에 결합하는 항체의 존재에 대해, 예를 들어 ELISA 또는 다른 검정법으로 선별한다. 특이적 DTLR 양태를 특이적으로 인지하는 항체를 또한 선택하거나 제조할 수 있다.
다른 방법으로, 합성 펩타이드 또는 정제된 단백질을 면역 시스템에 제공하여 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 발생시킨다. 참조: Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; 및 Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. 적절한 경우, 결합 시약을 상기한 바와 같이, 예를 들면 형광 등으로 표지시키거나 패닝 방법을 위한 기판에 고정화시킬 수 있다. 핵산을 또한 동물중의 세포중으로 도입시켜, 면역 반응을 일으키는 항원을 생산할 수 있다. 참조: Wang, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:4156-4160; Barry, et al. (1994) BioTechniques 16:616-619; 및 Xiang, et al. (1995) Immunity 2: 129-135.
IX. 예를 들어, DTLR5와의 융합 단백질의 제조
DTLR5를 사용하여 여러가지 융합 작제물을 만든다. 상기 유전자의 상기 부분을 에피토프 태그, 예를 들면, FLAG tag, 또는 2종 하이브리드 시스템 작제물에 융합시킨다. 참조: Fields and Song (1989) Nature 340:245-246.
상기 에피토프 태그를, 항-FLAG 항체에 의한 검출 단계를 갖는 발현 클로닝 공정에 사용하여 결합 파트너, 예를 들면 각각의 DTLR5에 대한 리간드를 검출할 수 있다. 2종 하이브리드 시스템은 또한 DTLR5에 특이적으로 결합하는 단백질을 단리하는데 사용될 수 있다.
X. DTLR의 염색체 지도화
염색체 스프레드(spread)를 제조한다. 72시간 동안 배양시킨 식물성혈구응집소-자극된 임파구로부터 수득한 염색체 제제에 대해 원위치 하이브리드화를 수행한다. 최종 7시간의 배양중에 5-브로모데옥시우리딘 (60 ㎍/㎖ 배지)을 가하여, 양호한 품질의 하이브리드화후 염색체 밴드가 확실히 나타나도록한다.
전체 B 세포 cDNA 주형상에 프라이머를 사용하여 증폭시킨, 적절한 단편, 예를 들면, PCR 단편을 적절한 벡터중으로 클로닝시킨다. 상기 벡터를3H로 니크 (nick)-해독시켜 표지시킨다. 방사선표지시킨 프로브를 문헌[Mattei, et al. (1985) Hum. Genet. 69:327-331]에 기재된 바와 같이 메타상 스프레드에 하이브리드화시킨다.
핵 트랙 유액 (KODAK NTB2)으로 피복시킨후, 슬라이드를 예를 들면 18일간 4 ℃에서 노출시킨다. 밴드 형성 과정중 미량의 은이 슬리핑되는 것을 방지하기 위하여, 먼저 염색체 스프레드를 완충시킨 Giemsa 용액으로 염색시키고 메타상 사진을 찍는다. 이어서 플루오로크롬-광분해-Giemsa (FPG: Fluorochome-Photolysis Giemsa) 방법으로 R-밴드를 형성시키고 분석전에 메타상 사진을 다시 찍는다.
별법으로, 상기한 바와 같이 FISH를 수행할 수 있다. DTLR 유전자가 상이한 염색체상에 위치하게 된다. DTLR2 및 DTLR3은 사람의 염색체 4에 편재되고; DTLR4는 사람의 염색체 9에 편재되며, DTLR5는 사람의 염색체 1에 편재된다. 참조: 도 4A-4D.
XI. 구조 활성 관계
특정 잔기의 중요성에 대한 정보를 표준 공정 및 분석법을 사용하여 측정한다. 예를 들어, 수 많은 상이한 변이체를 소정 위치에서, 예를 들면, 상기 확인된 위치에서 발생시키고, 상기 변이체의 생물학적 활성을 평가하는 방법으로 표준 돌연변이 분석을 수행한다. 이는 활성을 변형시키는 위치를 결정하는 정도로, 또는 생물학적 활성을 보유, 차단 또는 조절하기 위하여 치환시킬 수 있는 잔기를 결정하는 특정 위치에 촛점을 맞추여 수행할 수 있다.
별법으로, 천연 변이체의 분석은 위치가 천연 돌연변이를 감내하는지를 표시할 수 있다. 이는 개체간, 또는 균주 또는 종 전반에 걸친 변이의 집단 분석으로부터 얻어질 수 있다. 선택된 개체로부터의 샘플을 예를 들면, PCR 분석 및 서열화로 분석한다. 이로써 집단 다형성이 평가된다.
XI. DTLR에 대한 리간드의 단리
DTLR을 특이적 결합 시약으로서 사용하여, 항체를 사용하는 것과 같이, 이의 결합 특이성을 이용함으로써, 결합 파트너를 동정할 수 있다. 결합 시약은 상기한 바와 같이, 예를 들어, 형광 등으로 표지시키거나, 패닝 방법을 위한 기판에 고정화시킨다.
결합 조성물을 사용하여 결합 파트너, 즉, 리간드, 바람직하게는 관련된 막을 발현하는 세포주로부터 만들어진 발현 라이브러리를 선별한다. 표준 염색 기술을 사용하여 표면 발현된 리간드를 검출하거나 분류하고, 표면 발현성 형질전환 세포를 패닝법으로 선별한다. 세포내 발현의 선별을 여러가지 염색법 또는 면역형광법으로 수행한다. 참조: McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10:2821-2832.
예를 들면, 0일째에, 2개-챔버 페르마녹스 슬라이드를, PBS 중 10ng/ml의 피브로넥틴 챔버당 1㎖로 실온에서 30분간 예비피복시킨다. PBS로 1회 세정한다. 이후 COS 세포를 챔버당 2-3 x 105개 세포로 성장 배지 1.5 ㎖중에서 플레이팅시킨다. 37 ℃에서 밤새 배양시킨다.
각 샘플에 대해 1일째에, 66 ㎍/㎖ DEAE-덱스트란, 66 μM 클로로퀸 및 혈청 무함유 배지 1.5 ㎖중 4 ㎍ DNA의 용액 0.5 ㎖를 제조한다. 각 세트에 대해, 1 및 1/200 희석비로 DTLR-FLAG cDNA의 포지티브 대조군, 및 네가티브 모사품을 제조한다. 세포를 혈청 무함유 DME로 세정한다. 상기 DNA 용액을 가하고 5시간 동안 37 ℃에서 배양시킨다. 배지를 제거하고 DME중 10% DMSO 0.5 ㎖를 2.5분간 가한다. 제거하고 DME로 1회 세척한다. 성장 배지 1.5 ㎖를 가하고 밤새 배양시킨다.
2일재에, 배지를 교환한다. 3일 또는 4일째에, 세포를 고정시켜 염색한다. 세포를 행크스 완충 염수액 (HBSS: Hank's Buffered Saline Solution)로 2회 세정하고 4% 파라포름알데히드 (PFA)/글루코오스중에 5분간 고정시킨다. HBSS로 3회 세척한다. 액체를 모두 제거한 후 슬라이드를 -80 ℃에서 보관할 수 있다. 각 챔버에 대해, 다음과 같이 0.5 ㎖ 배양을 수행한다. HBSS/32 ㎕/1M NaN3㎖를 갖는 사포닌 (0.1%)을 20분간 가한다. 이어서 세포를 HBSS/사포닌으로 1회 세척한다. 세포에 적절한 DTLR 또는 DTLR/항체 복합체를 가하여 30분간 배양시킨다. 세포를 HBSS/사포닌으로 2회 세척한다. 경우에 따라, 제1 항체를 30분간 가한다. 제2 항체, 예를 들면 벡터 항-마우스 항체를 1/200 희석비로 가하고, 30분간 배양시킨다. ELISA 용액, 예를 들면, Vector Elite ABC 서양고추냉이 퍼옥시다제 용액을 제조하여 30분간 예비배양시킨다. 예를 들어, HBSS/사포닌 2.5 ㎖당 용액 A (아비딘) 1 방울과 용액 B (비오틴) 1 방울을 사용한다. 세포를 HBSS/사포닌으로 2회 세척한다. ABC HRP 용액을 가하여 30분간 배양시킨다. 세포를 HBSS로 2회 세척하고, 2분간 2회 세척하여 세포를 폐쇄시킨다. 이후 벡터 디아미노벤조산 (DAB)를 5 내지 10분간 가한다. 유리 증류수 5 ㎖당 완충액 2 방울 + DAB 4 방울 + H2O22 방울을 사용한다. 챔버를 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 수중에서 세정시킨다. 수분간 공기 건조시킨 다음, Crystal Mount 1 방울을 가하고 커버를 덮는다. 5분간 85 내지 90 ℃에서 베이킹시킨다.
포지티브 염색 푸울을 평가하여 점진적으로 서브클로닝하여 결합에 관계된 단일 유전자를 단리시킨다.
별법으로, DTLR 시약을 사용하여 추정상의 리간드를 발현시키는 세포를 친화성 정제하거나 분류한다. 참조: Sambrook, et al. 또는 Ausubel, et al.
다른 방법은 패닝시켜 막 결합 수용체를 선별하는 것이다. 수용체 cDNA를 상기한 바와 같이 작제한다. 리간드를 고정시켜 사용함으로써 발현 세포를 고정시킬 수 있다. 고정화는 예를 들어 DTLR 융합 작제물의 FLAG 서열을 인식하는 적합한 항체를 사용하거나, 제1 항체에 대해 발생된 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 선택 및 증폭의 반복 사이클로 적절한 클론이 강화되며 마침내 수용체 발현 클론이 단리된다.
파아지 발현 라이브러리는 포유동물 DTLR로 선별될 수 있다. 적절한 표지 기술, 예를 들면, 항-FLAG 항체는 적절한 클론의 특이적 표지화를 가능케한다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌은 각 공보 또는 특허원이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용한다고 표시하는 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로 인용된다.
당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 정신 및 범주로부터벗어나지 않게 본 발명을 다양하게 개량 및 변화시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 양태는 실시예로만 제공되는 것이며, 본 발명은 특허청구의 범위에 부여되는 것의 범주의 등가물과 함께, 첨부되는 특허청구의 범위로만 제한되며, 본 발명은 실시예로 본 명세서에서 제시된 특정 양태로 제한되지 않는다.

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  17. 서열번호 4의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR2 단백질.
  18. 서열번호 6의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR3 단백질.
  19. 서열번호 10의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR5 단백질.
  20. 서열번호 12의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR6 단백질.
  21. 서열번호 16 또는 18의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR7 단백질.
  22. 서열번호 32의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR8 단백질.
  23. 서열번호 22의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR9 단백질.
  24. 서열번호 34의 아미노산 서열과 약 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 또는 재조합 DTLR10 단백질.
  25. 서열번호 4, 6, 10, 12, 16, 18, 32, 22 및 24로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리펩타이드.
  26. 제17항 내지 25항 중 어느 한항의 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  27. 제17항 내지 25항 중 어느 한항의 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  28. 제17항 내지 25항 중 어느 한항의 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  29. 제28항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  30. 제29항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. 제30항의 숙주 세포를 폴리펩타이드가 발현되는 조건하에서 배양함을 포함하여, 폴리펩타이드를 재조합식으로 생산하는 방법.
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