ES2340210T3 - Proteinas humanas receptoras de tipo toll, reactivos asociados y metodos. - Google Patents

Abstract

Una proteína o péptido esencialmente puros o recombinantes con actividad de receptor de tipo Toll, donde dicha proteína o péptido muestra una identidad de secuencia de al menos 70% con el SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud.

Description

Proteínas humanas receptoras de tipo Toll, reactivos asociados y métodos.

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Esta solicitud reivindica prioridad sobre las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos USSN 60/044,293, presentada el 7 de Mayo de 1997; USSN 60/072, 212, presentada el 22 de Enero de 1998; y USSN 60/076,947, presentada el 5 de Marzo de 1998, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos que causan efecto en la fisiología de mamíferos, incluyendo la morfogénesis o la función del sistema inmunitario. En particular, proporciona ácidos nucleicos, proteínas, y anticuerpos que regulan el desarrollo y/o el sistema inmunitario. También se describen los usos diagnósticos y terapéuticos de estas sustancias.

Antecedentes de la invención

La tecnología del ADN recombinante hace referencia generalmente a técnicas de integración de información genética de una fuente donadora en vectores para su posterior procesamiento, por ejemplo la introducción en un anfitrión, por medio del cual la información genética transferida es copiada y/o expresada en el nuevo entorno. Comúnmente, la información genética existe en forma de ADN complementario (ADNc) derivado de ARN mensajero (ARNm) que codifica una proteína producto deseada. El portador es frecuentemente un plásmido que tiene la capacidad de incorporar ADNc para su posterior replicación en un anfitrión y, en algunos casos, realmente para controlar la expresión del ADNc y de ese modo dirigir la síntesis del producto codificado en el anfitrión.

Durante algún tiempo, se ha sabido que la respuesta inmunitaria de los mamíferos está basada en una serie de interacciones celulares complejas, denominada "red inmunitaria". La investigación reciente ha proporcionado nuevas percepciones en los funcionamientos internos de esta red. Si bien queda claro que la respuesta inmunitaria, de hecho, gira en torno a interacciones de tipo red de los linfocitos, macrófagos, granulocitos, y otras células, los inmunólogos sostienen ahora en general la opinión de que proteínas solubles, conocidas como linfoquinas, citoquinas, o monoquinas, juegan un papel crítico en el control de estas interacciones celulares. De este modo, existe un considerable interés en el aislamiento, la caracterización, y los mecanismos de acción de los factores moduladores celulares, cuya comprensión conducirá a avances significativos en la diagnosis y terapia de numerosas anomalías médicas, p. ej., trastornos del sistema inmunitario.

Las linfoquinas median aparentemente las actividades celulares de diversas maneras. Se ha demostrado que apoyan la proliferación, el crecimiento, y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas pluripotenciales en un inmenso número de progenitores que comprenden diversos linajes celulares que pueden formar un sistema inmunitario complejo. Son necesarias interacciones apropiadas y equilibradas entre los componentes celulares para una respuesta inmunitaria saludable. Los diferentes linajes celulares a menudo responden de diferente manera cuando se administran junto con otros agentes.

Los linajes celulares especialmente importantes para la respuesta inmunitaria incluyen dos clases de linfocitos: las células B, que pueden producir y secretar inmunoglobulinas (proteínas con la capacidad de reconocer y unirse a una sustancia foránea para llevar a cabo su eliminación), y las células T de diferentes subgrupos que secretan linfoquinas e inducen o suprimen las células B y otras células diferentes (incluyendo otras células T) que forman la red inmunitaria. Estos linfocitos interaccionan con muchos otros tipos de células.

Otro linaje celular importante son los mastocitos (que no han sido identificados positivamente en todas las especies de mamíferos), que son células del tejido conectivo que contiene gránulos localizadas cerca de los capilares por todo el organismo. Estas células se encuentran en concentraciones especialmente elevadas en los pulmones, la piel, y los tractos gastrointestinal y genitourinario. Los mastocitos juegan un papel central en los trastornos relacionados con la alergia, concretamente en la anafilaxis como sigue: cuando los antígenos seleccionados se entrecruzan con una clase de inmunoglobulinas unidas a los receptores de la superficie de los mastocitos, los mastocitos de desgranulan y liberan mediadores, p. ej., histamina, serotonina, heparina, y prostaglandinas, que ocasionan las reacciones alérgicas, p. ej., la anafilaxis.

La investigación para comprender y tratar mejor los diferentes trastornos inmunitarios ha estado impedida por la incapacidad general para mantener las células del sistema inmunitario in vitro. Los inmunólogos han descubierto que se puede llevar a cabo el cultivo de muchas de estas células a través del uso de sobrenadantes de células T y otras células, que contienen diferentes factores de crecimiento, incluyendo muchas de las linfoquinas.

La familia de proteínas de la interleuquina-1 incluye la IL-1\alpha, la IL-1\beta, la IL-1RA, y recientemente la IL-1\gamma (también denominada Factor Inductor de Interferón Gamma, IGIF). Esta familia relacionada de genes ha sido implicada en una amplia gama de funciones biológicas. Véanse Dinarello (1994) FASEB J. 8:1314-1325; Dinarello (1991) Blood 77:1627-1652; y Okamura, et al. (1995) Nature 378:88-91.

Además, existen diferentes factores de crecimiento y reguladores, que modulan el desarrollo morfogenético. Estos incluyen, p. ej., los ligandos Toll, que señalizan a través de la unión a receptores que comparten rasgos característicos estructurales, y mecánicos de los receptores de IL-1. Véanse, p. ej., Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; y Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell & Devel. Biol. 12:393-416.

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A partir de lo anterior, resulta evidente que el descubrimiento y desarrollo de nuevas proteínas solubles y sus receptores, incluyendo aquellas similares a las linfoquinas, deben contribuir a nuevas terapias para una amplia gama de afecciones degenerativas o anómalas que comprometen directamente o indirectamente el desarrollo, la diferenciación, o la función, p. ej., del sistema inmunitario y/o las células hematopoyéticas. En particular, el descubrimiento y la comprensión de receptores novedosos para las moléculas de tipo linfoquina que intensifican o potencian las actividades beneficiosas de otras linfoquinas resultarían muy ventajosos. La presente invención proporciona nuevos receptores para ligandos que muestran similitud con las composiciones de tipo interleuquina-1 y compuestos relacionados, y sus métodos de uso.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una comparación esquemática de las arquitecturas de las proteínas de los DTLR de Drosophila y humanos, y su relación con receptores de IL-1 de vertebrados y proteínas de resistencia a enfermedades de plantas. Se disponen tres DTLR de Drosophila (Dm) (Toll, 18w, y el fragmento Mst ORF) (Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399; Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem, 271:5777-5783; y Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899) al lado de cuatro receptores humanos (Hu) completos (DTLR 1-4) y uno parcial (DTLR5). Los LRR individuales de los ectodominios del receptor que están señalizados mediante PRINTS (Attwood, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:212-217) se indican explícitamente por medio de recuadros; las agrupaciones ricas en Cys "superior" e "inferior" que flanquean los extremos C o N terminales de las matrices de LRR se dibujan respectivamente mediante semicírculos opuestos. La pérdida de la región rica en Cys interna de los DTLR 1-5 representa en gran parte sus ectodominios más pequeños (558, 570, 690, y 652 aa, respectivamente) cuando se comparan con las prolongaciones de 784 y 977 aa de Toll y 18w. Las cadenas incompletas de DmMst y HuDTLR5 (ectodominios de 519 y 153 aa, respectivamente) están representadas por líneas discontinuas. El módulo de señalización intracelular común a los DTLR, receptores de tipo IL-1 (IL-1R), la proteína intracelular Myd88, y el producto génico N de resistencia a las enfermedades del tabaco (DRgN) se indica debajo de la membrana. Véanse, p. ej., Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475; y Rock, et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:588-. Los dominios adicionales incluyen el trío de módulos de tipo Ig de los IL-1R (bucles unidos a disulfuro); la proteína DRgN muestra un dominio NTPasa (recuadro) y Myd88 tiene un dominio de muerte (óvalo negro).

Las Figuras 2A-2B muestran patrones estructurales conservados en los dominios de señalización de los receptores de tipo Toll e IL-1, y dos proteínas modulares divergentes. La Figura 2A muestra un alineamiento de secuencia del dominio TH común. Los DTLR se marcan como en la Figura 1; los receptores de la familia de IL-1 humano (Hu) o ratón (Mo) (IL-1R1-6) se numeran sucesivamente como se ha propuesto antes (Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475); Myd88 y las secuencias de tabaco (To) y lino, L. usitatissimum (Lu), representan dominios C y N terminales, respectivamente, de moléculas multidominio más grandes. Los bloques de secuencias sin espacios (numerados del 1-10) están recuadrados. Los triángulos indican mutaciones deletéreas, mientras los truncamientos N-terminales de la flecha eliminan la bioactividad en el IL-1R1 humano (Heguy, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2605-2609). Se marcan las predicciones de la estructura secundaria de PHD (Rost y Sander (1994) Proteins 19:55-72) y DSC (King y Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310) de una hélice \alpha (H), hebra \beta (E), o bobina (L). El esquema de aminoácidos con sombreado representa restos químicamente similares: hidrófobos, ácidos, alcalinos, Cys, aromáticos, de rotura de la estructura, y pequeños. Los patrones de las secuencias diagnóstico para los IL-1R, DTLR, y el alineamiento completo (ALL) se obtuvieron mediante Consensus con una restricción del 75%. Los símbolos para los subgrupos de aminoácidos son (véase el sitio de internet para más detalle): o, alcohol; 1, alifático; ., cualquier aminoácido; a, aromático; c, cargado; h, hidrófobo; -, negativo; p, polar; +, positivo; s, pequeño; u, diminuto; t, de tipo giro. La Figura 2B muestra un diagrama de topología del pliegue del dominio \beta/\alpha de TH propuesto. La lámina \beta paralela (con hebras \beta A-E en forma de triángulos de color amarillo) se observa en su extremo C terminal; las hélices \alpha (círculos marcados como 1-5) conectan las hebras \beta; las conexiones de la cadena están hacia delante (visibles) o hacia atrás (escondidas). Los restos cargados, conservados en el extremo C de la lámina \beta se indican en color gris (Asp) o como un único resto de color negro (Arg) (véase el texto).

La Figura 3 muestra la evolución de una superfamilia de dominios de señalización. Se utilizó el alineamiento del módulo TH múltiple de la Figura 2A para obtener un árbol filogenético mediante el Método del Vecino más Próximo (Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Las proteínas se marcaron como en el alineamiento; el árbol se presentó con TreeView.

Las Figuras 4A-4D muestran el mapeo cromosómico mediante FISH de los genes de DTLR humanos. Se hibridaron los cromosomas desnaturalizados de los cultivos sincronizados de linfocitos humanos con sondas de ADN de DTLR biotiniladas para su localización. La asignación de los datos del mapeo con FISH (izquierda, Figuras 4A, DTLR2; 4B, DTLR3; 4C, DTLR4; 4D, DTLR5) con bandas cromosómicas se logró superponiendo las señales FISH con los cromosomas que forman bandas en DAPI (paneles centrales). Heng y Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33:109-122. Los análisis se resumen en forma de ideogramas de cromosomas humanos (paneles de la derecha).

Las Figuras 5A-5F muestran análisis de transferencia de ARNm de DTLR Humanos. Se sondearon transferencias de múltiples tejidos humanos (He, corazón; Br, cerebro; Pl, placenta; Lu, pulmón; Li, hígado; Mu, músculo; Ki, riñón; Pn, Páncreas; Sp, bazo; Th, timo; Pr, próstata; Te, testículo; Ov, ovario, SI, intestino delgado; Co, colon; PBL, linfocitos de sangre periférica) y línea de células cancerosas (leucemia promielocítica, HL60; cáncer cervical, HELAS3; leucemia mielógena crónica, K562; leucemia linfoblástica, Molt4; adenocarcinoma colorrectal, SW480; melanoma, G361; Línea celular Raji de linfoma de Burkitt, Burkitt's; adenocarcinoma colorrectal, SW480; carcinoma de pulmón, A549) que contenían aproximadamente 2 \mug de ARN poli(A)+ por calle con ADNc radiomarcados que codificaban DTLR1 (Figuras 5A-5C), DTLR2 (Figura 5D), DTLR3 (Figura 5E), y DTLR4 (Figura 5F) como se ha descrito. Las transferencias se expusieron a una película de rayos X durante 2 días (Figuras 5A-5C) o una semana (Figura 5D-5F) a -70ºC con pantallas intensificadoras. En algunas calles aparece una especie de 0,3 kB anómala; los experimentos de hibridación excluyen un mensaje que codifica un fragmento citoplásmico de DTLR.

Compendio de la invención

La presente invención está dirigida a una proteína o péptido esencialmente puros o recombinantes con actividad de receptor de tipo Toll, donde dicha proteína o péptido muestran una identidad de secuencia de al menos 70% con el SEQ ID NO: 6 en toda su longitud.

En la presente memoria se describen nueve receptores de mamífero relacionados, p. ej., estructuras moleculares de tipo receptor Toll, denominadas DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, y DTLR10, y sus actividades biológicas. Asimismo se describen ácidos nucleicos que codifican los propios polipéptidos y los métodos para su producción y uso. Los ácidos nucleicos están caracterizados, en parte, por su homología con las secuencias de ADN complementario clonado (ADNc) incluidas en la presente memoria.

Asimismo se describe una composición de materia seleccionada del grupo de: una proteína o péptido de n DTLR2 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 4; un DTLR2 de secuencia natural de SEQ ID NO: 4; una proteína de fusión que comprende una secuencia de DTLR2; una proteína o péptido de DTLR3 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 6; un DTLR3 de secuencia natural de SEQ ID NO: 6; una proteína de fusión que comprende una secuencia de DTLR3; una proteína o péptido de DTLR4 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 26; un DTLR4 de secuencia natural de SEQ ID NO: 26; una proteína de fusión que comprende una secuencia de DTLR4; una proteína o péptido de DTLR5 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 10; un DTLR5 de secuencia natural de SEQ ID NO: 10; y una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR5.

Asimismo se describe una composición de materia seleccionada del grupo de: una proteína o péptido de DTLR6 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 12; un DTLR6 de secuencia natural de SEQ ID NO: 12; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR6; una proteína o péptido de DTLR7 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 16 o 18 o; un DTLR7 de secuencia natural de SEQ ID NO: 16 o 18; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR7; una proteína o péptido de DTLR8 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 32; un DTLR8 de secuencia natural de SEQ ID NO: 32; una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR8; una proteína o péptido de DTLR9 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 22; un DTLR9 de secuencia natural de SEQ ID NO: 22; y una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR9; una proteína o péptido de DTLR10 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 34; un DTLR10 de secuencia natural de SEQ ID NO: 34; y una proteína de fusión que comprende la secuencia de DTLR10.

Preferiblemente, la proteína esencialmente pura o aislada comprende un segmento que muestra una identidad de secuencia con una porción correspondiente de un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR 7, DTLR8, DTLR9, o DTLR10, donde: la homología es una identidad de al menos aproximadamente 90% y la porción es de al menos aproximadamente 9 aminoácidos; la homología es una identidad de al menos aproximadamente 80% y la porción es de al menos aproximadamente 17 aminoácidos; o la homología es una identidad de al menos aproximadamente 70% y la porción es de al menos aproximadamente 25 aminoácidos. En realizaciones específicas, la composición de materia: es DTLR2, que comprende una secuencia madura de SEQ ID NO: 4; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR2 natural; es DTLR3, que comprende una secuencia madura de SEQ ID NO: 6; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR3 natural; es DTLR4, que comprende una secuencia madura de SEQ ID NO: 26; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR4 natural; o es DTLR5, que comprende la secuencia completa de SEQ ID NO: 10; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR5 natural; o es DTLR6, que comprende una secuencia madura de SEQ ID NO: 12; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR6 natural; es DTLR7, que comprende una secuencia madura de SEQ ID NO: 16 o 18; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR7 natural; es DTLR8, que comprende una secuencia madura de SEQ ID NO: 32; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR8 natural; o es DTLR9, que comprende la secuencia completa de SEQ ID NO: 22; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR9 natural; o es DTLR10, que comprende la secuencia completa de SEQ ID NO: 34; o muestra un patrón de modificación post-traduccional distinto del de DTLR10 natural; o la composición de materia puede ser una proteína o péptido que es de un animal de sangre caliente seleccionado entre un mamífero, incluyendo un primate, tal como un ser humano; comprende al menos un segmento polipeptídico de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34; muestra una pluralidad de porciones que muestran dicha identidad; es una variante alélica natural de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, o DTLR10; tiene una longitud de al menos aproximadamente 30 aminoácidos; muestra al menos dos epítopos no solapantes que son específicos para un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, o DTLR10 de primate; muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 2 0 aminoácidos con un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLT6 de primate; muestra al menos dos epítopos no solapantes que son específicos para un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR,9, o DTLR10 de primate; muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 20 aminoácidos con un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, o DTLR10 de primate; está glicosilado; tiene un peso molecular de al menos 100 kD con glicosilación natural; es un polipéptido sintético; está anclado a un sustrato sólido; está conjugado con otro radical químico; tiene 5 sustituciones o menos con respecto la secuencia natural; o es una variante por deleción o inserción a partir de una secuencia natural.

Asimismo se describe una composición que comprende: un proteína o péptido de DTLR2 estéril; o la proteína o péptido de DTLR2 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR3 estéril; o la proteína o péptido de DTLR3 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR4 estéril; o la proteína o péptido de DTLR4 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR5 estéril; o la proteína o péptido de DTLR5 estéril y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR6 estéril; o la proteína o péptido de DTLR6 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR7 estéril; o la proteína o péptido de DTLR7 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR8 estéril; o la proteína o péptido de DTLR8 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR9 estéril; o la proteína o péptido de DTLR9 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; una proteína o péptido de DTLR10 estéril; o la proteína o péptido de DTLR10 y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral.

Asimismo se describe una proteína de fusión que comprende la secuencia de la proteína madura de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34; una etiqueta de detección o purificación, incluyendo una secuencia FLAG, His6, o Ig; o la secuencia de otra proteína receptora.

Asimismo se describe un kit que comprende una proteína o polipéptido de DTLR, y: un compartimento que comprende la proteína o polipéptido; y/o instrucciones para su uso o para la eliminación de los reactivos del kit.

Asimismo se describen compuestos de unión que comprenden un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, que se une específicamente a una proteína de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, o DTLR10 natural, donde: la proteína es una proteína de primate; el compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab, o Fab2; el compuesto de unión se conjuga con otro radical químico; o el anticuerpo: se origina contra una secuencia peptídica de un polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34; se origina contra un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 maduro; se origina contra un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 humano purificado; se inmunoselecciona; es un anticuerpo policlonal; se une a un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 desnaturalizado; muestra una Kd para el antígeno de al menos 30 \muM; se ancla a un sustrato sólido, incluyendo una cuenta o membrana de plástico; está en una composición estéril; o está marcado detectablemente, incluyendo una marca radiactiva o fluorescente. Un kit de una composición de unión comprende a menudo el compuesto de unión, y: un compartimento que comprende dicho compuesto de unión; y/o instrucciones para el uso y eliminación de los reactivos del kit. A menudo el kit es capaz de realizar un análisis cualitativo o cuantitativo.

Otras composiciones incluyen una composición que comprende: un compuesto de unión estéril, o el compuesto de unión y un portador, donde el portador es: un compuesto acuoso, incluyendo agua, solución salina, y/o tampón; y/o se formula para la administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral.

Los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria incluyen un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una proteína o péptido de DTLR2-10 o una proteína de fusión, donde: el DTLR es de un mamífero; o el ácido nucleico: codifica una secuencia de un péptido antigénico de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34; codifica un pluralidad de secuencias de péptidos antigénicos de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34; muestra una identidad de al menos aproximadamente 80% con un ADNc natural que codifica dicho segmento; es un vector de expresión; comprende adicionalmente un origen de replicación; es de una fuente natural; comprende una marca detectable; comprende una secuencia de nucleótidos sintética; tiene menos de 6 kb, preferiblemente menos de 3 kb; es de un mamífero, incluyendo un primate; comprende una secuencia codificante completa natural; es una sonda de hibridación para un gen que codifica dicho DTLR; o es un cebador de PCR, un producto de PCR, o un cebador de mutagénesis. Asimismo se proporciona una célula, tejido u órgano que comprende semejante ácido nucleico recombinante. Preferiblemente, la célula es: una célula procariótica; una célula eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de primate; o una célula humana. Se proporcionan kits que comprenden tales ácidos nucleicos, y: un compartimento que comprende dicho ácido nucleico; un compartimento que comprende una proteína o polipéptido de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 o DTLR10 de primate; y/o instrucciones para el uso o eliminación de los reactivos del kit. A menudo, el kit es capaz de realizar un análisis cualitativo o cuantitativo.

Asimismo se describe un ácido nucleico que: hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2M para el SEQ ID NO: 3; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2 M para el SEQ ID NO: 5; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2M para el SEQ ID NO: 25; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2 M para el SEQ ID NO: 9; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2M para el SEQ ID NO: 11; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2 M para el SEQ ID NO: 15 o 17; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2M para el SEQ ID NO: 31; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2 M para el SEQ ID NO: 21; hibrida en condiciones de lavado de 30ºC y concentración de sal menor de 2 M para el SEQ ID NO: 33; muestra una identidad de al menos aproximadamente 85% a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos con un DTLR2, DTLR3, DTLR4, VPLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR,9 o DTLR10 de primate.

Preferiblemente, semejante ácido nucleico tendrá propiedades en las que: condiciones de lavado a 45ºC y/o concentración de sal 500 mM; o la identidad es de al menos 90% y/o el tramo es de al menos 55 nucleótidos. Muy preferiblemente, las condiciones de lavado son a 55ºC y/o concentración de sal 150 mM; o la identidad es de al menos 95% y/o el tramo es de al menos 75 nucleótidos.

Asimismo se describe un método de modulación de la fisiología o desarrollo de una célula o células de un cultivo de tejidos que comprende poner en contacto la célula con un agonista o antagonista de un DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, o DTLR10 de mamífero.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. General

En la presente memoria se describen la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN de mamífero, en la presente memoria las moléculas de receptor de tipo Toll de ADNX de primate (DTLR) tienen propiedades definidas concretas, tanto estructurales como biológicas. Estas han sido denominadas en la presente memoria DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, y DTLR10, respectivamente, y aumentan el número de miembros de la familia de receptores de tipo Toll humanos de 1 a 10. Los diferentes ADNc que codifican estas moléculas fueron obtenidos de primate, p. ej., genotecas de secuencias de ADNC, humanas. También se desearían contrapartes de otros primates u otros mamíferos.

Algunos de los métodos convencionales aplicables son descritos o referidos, p. ej., por Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª ed.), vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York.

En los SEQ ID NO: 1 y 2 se muestran una secuencia de nucleótidos completa y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR1 humano. Véase también Nomura, et al. (1994) DNA Res 1:27-35. En los SEQ ID NO: 3 y 4 se muestran una secuencia de nucleótidos completa y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR2 humano. En los SEQ ID NO: 5 y 6 se muestran una secuencia de nucleótidos completa y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un DTLR3 humano. En los SEQ ID NO: 7 y 8 se muestran una secuencia de nucleótidos completa y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR4 humano. En los SEQ ID NO: 25 y 26 se proporcionan una secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR4 humano. En los SEQ ID NO: 9 y 10 se muestran una secuencia de nucleótidos parcial y la secuencia de aminoácidos correspondiente de un segmento codificante de DTLR5 humano. En los SEQ ID NO: 11 y 12 se muestran una secuencia de nucleótidos completa y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR6 humano y en los SEQ ID NO: 13 y 14 se proporciona una secuencia parcial de un DTLR6 de ratón. En los SEQ ID NO: 27 y 29 se proporciona una secuencia de DTLR6 de ratón adicional (secuencia de nucleótidos) y en los SEQ ID NO: 28 y 30 (secuencias de aminoácidos). También se proporciona una secuencia de nucleótidos parcial (SEQ ID NO: 15 y 17) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16 y 18) de un segmento codificante de DTLR7 humano. En los SEQ ID NO: 19 y 20 se muestran la secuencia de nucleótidos parcial y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR8 humano. En los SEQ ID NO: 31 y 32 se muestran una secuencia de nucleótidos más completa y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR humano. En el SEQ ID NO: 21 se muestran una secuencia de nucleótidos parcial y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR9 humano y en los SEQ ID NO: 23 y 24 se muestran una secuencia de nucleótidos parcial y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR10 humano. En los SEQ ID NO: 33 y 34 se muestra una secuencia de nucleótidos más completa y la correspondiente secuencia de aminoácidos de un segmento codificante de DTLR10 humano. En el SEQ ID NO: 35 se proporciona una secuencia de nucleótidos parcial para un segmento codificante de DTLR10 de ratón.

TABLA 1 Comparación de dominios intracelulares de DTLR humanos. El DTLR1 es el SEQ ID NO: 2; el DTLR2 es el SEQ ID NO: 4; el DTLR3 es el SEQ ID NO: 6; el DTLR4 es el SEQ ID NO: 8; el DTLR5 es el SEQ ID NO: 10; y el DTLR6 es el SEQ ID NO: 12. Los restos particularmente importantes y conservados, p. ej., característicos, corresponden, a través de los DTLR, a los restos del SEQ ID NO: 18 tyr10-tyr13; trp26; cys46; trp52; pro54-gly55; ser69; lys71; trp134-pro135; y phe144-trp145

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Según se utiliza en la presente memoria, receptor 2 de tipo Toll de ADNX (DTLR2) se utilizará para describir una proteína que comprende un segmento de proteína o péptido que tiene o comparte la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 4, o uno de sus fragmentos esenciales. De un modo similar, para el DTLR3 y el SEQ ID NO: 6; el DTLR4 y el SEQ ID NO: 26; el DTLR5 y el SEQ ID NO: 10; el DTLR6 y el SEQ ID NO: 12; el DTLR7 y los SEQ ID NO: 16 y 18; el DTLR8 y el SEQ ID NO: 32; el DTLR9 y SEQ ID NO: 22; y el DTLR10 y el SEQ ID NO: 34.

También se describen variaciones de proteínas del respectivo alelo de DTLR cuya secuencia se proporciona, p. ej., un agonista o antagonista de muteína. Típicamente, tales agonistas o antagonistas mostrarán menos de aproximadamente 10% de diferencias en la secuencia, y de este modo a menudo tienen entre 1 y 11 sustituciones, p. ej., 2, 3, 5, 7, y otras. También abarca variantes alélicas y otras, p. ej., formas polimórficas naturales de la proteína descrita. Típicamente, se unirá a su correspondiente receptor biológico con una alta afinidad, p. ej., al menos aproximadamente 100 nM, normalmente más de aproximadamente 30 nM, preferiblemente más de aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente más de aproximadamente 3 nM. El término también se utilizará en la presente memoria para referirse a formas naturales afines, p. ej., alelos, variantes polimórficas, y variantes metabólicas de la proteína de mamífero.

También se describen proteínas o péptidos que tienen una identidad de aminoácidos sustancial con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4. También incluirá variantes de la secuencia con relativamente pocas sustituciones, p. ej., preferiblemente menos de aproximadamente 3-5. Se aplican características similares a las otras secuencias de DTLR proporcionadas en los SEQ ID NO: 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 y 34.

Un "fragmento" o "segmento" de polipéptido sustancial, es un tramo de restos aminoácido de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente al menos 10 aminoácidos, más generalmente al menos 12 aminoácidos, a menudo al menos 14 aminoácidos, más a menudo al menos 16 aminoácidos, típicamente al menos 18 aminoácidos, más típicamente al menos 20 aminoácidos, normalmente al menos 22 aminoácidos, más normalmente al menos 24 aminoácidos, preferiblemente al menos 26 aminoácidos, más preferiblemente al menos 28 aminoácidos, y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos. Las secuencias de los segmentos de las diferentes proteínas se pueden comparar entre sí a lo largo de tramos de longitud apropiada.

La homología de la secuencia de aminoácidos, o la identidad de la secuencia, se determina optimizando los emparejamientos de restos, si fuera necesario, introduciendo espacios cuando se requiera. Véanse, p. ej., Needleham, et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al., (1983) capítulo uno en Time Warps, String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; y paquetes de soporte lógico de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y the University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI; cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservativas como emparejamientos. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente sustituciones con los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Se pretende que las secuencias de aminoácidos homólogas incluyan variaciones alélicas naturales e interespecie en la secuencia de las citoquinas. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán una homología de 50-100% (si se pueden introducir espacios), a una homología de 60-100% (si se incluyen sustituciones conservativas) con un segmento de la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34. Las mediciones de la homología serán de al menos aproximadamente 70%, generalmente al menos 76%, más generalmente al menos 81%, a menudo al menos 85%, más a menudo al menos 88%, típicamente al menos 90%, más típicamente al menos 92%, normalmente al menos 94%, más normalmente al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, y más preferiblemente al menos 97%, y en realizaciones particularmente preferidas, al menos 98% o más. El grado de homología variará con la longitud de los segmentos comparados. Las proteínas o péptidos homólogos, tales como las variantes alélicas, compartirán la mayoría de las actividades biológicas con las realizaciones descritas en los SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34. Las regiones de comparación particularmente interesantes, a nivel de aminoácidos o nucleótidos, corresponden a aquellas dentro de cada uno de los bloques 1-10, o regiones intrabloque, correspondientes a las indicadas en la Figura 2A.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "actividad biológica" se utiliza para describir, sin limitación, los efectos de las respuestas inflamatorias, la inmunidad innata, y/o el desarrollo morfogénico por los respectivos ligandos. Por ejemplo, estos receptores deben, como los receptores de IL-1, mediar las actividades fosfatasa o fosforilasa, cuyas actividades son medidas fácilmente mediante procedimientos convencionales. Véanse, p. ej., Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I y II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 56:449-463; y Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738. Los receptores muestran actividades biológicas como las de las enzimas regulables, reguladas por la unión al ligando. No obstante, el número de recambio de la enzima está más próximo a una enzima que a un complejo receptor. Por otra parte, el número de receptores ocupados necesario para inducir semejante actividad enzimática es menor que en la mayoría de los sistemas receptores, y puede aproximarse a docenas por célula, en contraste con la mayoría de los receptores que se desencadenarán a un número de miles por célula. Los receptores, o sus porciones, pueden ser útiles como enzimas de marcaje con fosfato para marcar sustratos generales o específicos.

Los términos ligando, agonista, antagonista, y análogo de, p. ej., un DTLR, incluyen moléculas que modulan las respuestas celulares características a las proteínas de tipo ligando Toll, así como moléculas que poseen los rasgos de competición por la unión estructural más convencional de las interacciones ligando-receptor, p. ej., donde el receptor es un receptor natural o un anticuerpo. Las respuestas celulares están mediadas probablemente por la unión de diferentes ligandos Toll a receptores celulares relacionados con, pero posiblemente distintos, de los receptores de IL-1 de tipo I o de tipo II. Véanse, p. ej., Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12:393-416; Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genetics 29:371-3991 y Hultmark (1994) Nature 367:116-117.

Asimismo, un ligando es una molécula que sirve o bien como ligando natural al cual dicho receptor, o uno de sus análogos, se une, o una molécula que es un análogo funcional del ligando natural. El análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula no relacionada en absoluto con los determinantes de unión del ligando apropiado. Los ligandos pueden servir como agonistas o antagonistas, véase, p. ej., Goodman, et al. (eds) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, Nueva York.

El diseño racional de fármacos también puede estar basado en estudios estructurales de las formas moleculares de un receptor o anticuerpo y otros efectores o ligandos. Los efectores pueden ser otras proteínas que median otras funciones en respuesta a la unión al ligando, u otras proteínas que interaccionan normalmente con el receptor. Un método para determinar qué sitios interaccionan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, p. ej., cristalografía de rayos x o técnicas de RMN bidimensional. Estas proporcionarán las pautas en cuanto a qué restos aminoácido forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, p. ej., Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, Nueva York.

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II. Actividades

Las proteínas receptoras de tipo Toll tendrán un número diferente de actividades biológicas, p. ej., en el metabolismo del fosfato, siendo añadidas o separadas de sustratos específicos, típicamente proteínas. Esto dará como resultado generalmente la modulación de una función inflamatoria, otra respuesta inmunitaria innata, o un efecto morfológico. Las proteínas de DTLR2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 son homólogas a otras proteínas receptoras de tipo Toll, pero cada una tiene diferencias estructurales. Por ejemplo, la secuencia codificante del gen de DTLR2 humano tiene probablemente una identidad de aproximadamente 70% con la secuencia de nucleótidos codificante del DTLR2 de ratón. A nivel de aminoácidos, también es probable que haya una identidad razonable.

Las actividades biológicas de los DTLR estarán relacionadas con la adición o eliminación de radicales fosfato de sustratos, típicamente de una manera específica, pero ocasionalmente de una manera no específica. Los sustratos pueden ser identificados, o las condiciones para la actividad enzimática pueden ser analizadas mediante métodos convencionales, p. ej., como describen Hardie, et al. (eds. 1995) en The Protein Kinase FactBook vols. I y II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 56:449-463; y Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738.

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III. Ácidos Nucleicos

Esta invención contempla el uso de ácido nucleico aislado o fragmentos, p. ej., que codifican estas proteínas o proteínas íntimamente relacionadas, o sus fragmentos, p. ej., para codificar el correspondiente polipéptido, preferiblemente uno que sea biológicamente activo. Además, esta invención incluye ADN aislado o recombinante que codifica tales proteínas o polipéptidos que tienen secuencias características de los respectivos DTLR, individualmente o como grupo. Típicamente, el ácido nucleico es capaz de hibridar, en condiciones apropiadas, con un segmento de una secuencia de ácido nucleico mostrado en los SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21, o 33, pero preferiblemente no con un segmento correspondiente del SEQ ID NO: 1. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser una proteína completa, o un fragmento, y tendrá típicamente un segmento de una secuencia de aminoácidos altamente homóloga a la mostrada en los SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34. Adicionalmente, esta invención abarca el uso de un ácido nucleico aislado o recombinante, o sus fragmentos, que codifican proteínas que son equivalentes a las proteínas de DTLR2-10. Los ácidos nucleicos aislados pueden tener las respectivas secuencias reguladoras en los extremos 5' y 3', p. ej., promotores, intensificadores, señales de adición poli-A, y otras del gen natural.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, p. ej., un ARN, ADN, o una mezcla de polímeros, que son esencialmente puros, p. ej., separados de otros componentes que acompañan naturalmente a la secuencia nativa, tales como ribosomas, polimerasas, y secuencias genómicas limítrofes de las especies de origen. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido separada de su entorno natural, e incluye productos aislados de ADN recombinante o clonado, que son distinguibles de ese modo de las composiciones de origen natural, y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula esencialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula, ya sean completamente o esencialmente puras.

Un ácido nucleico aislado será generalmente una composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones, contendrá una heterogeneidad, preferiblemente minoritaria. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o en porciones no críticas para la función o actividad biológica deseada.

Un ácido nucleico "recombinante" se define típicamente por su método de producción o su estructura. En referencia a su método de producción, p. ej., se elabora un producto por medio de un procedimiento, cuyo procedimiento consiste en el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos. Típicamente esta intervención implica la manipulación in vitro, aunque en ciertas circunstancias puede implicar técnicas de cría de animales más clásicas. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico elaborado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos entre sí, pero se pretende excluir productos de la naturaleza, p. ej., mutantes de origen natural encontrados en su estado natural. De este modo, por ejemplo, están incluidos los productos elaborados transformando células con cualquier vector de origen no natural, como los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada utilizando cualquier procedimiento de síntesis de oligonucleótidos. Semejante procedimiento se realiza a menudo para remplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, a la vez que se introduce o se elimina típicamente un sitio de reconocimiento para una secuencia de una enzima de restricción. Alternativamente, el procedimiento se realiza para unir entre sí segmentos de ácido nucleico con funciones deseadas para generar una única entidad genética que comprende una combinación deseada de funciones no encontrada en las formas disponibles en la naturaleza, p. ej., una que codifica una proteína de fusión. Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción son a menudo la diana de semejantes manipulaciones artificiales, pero mediante el diseño se pueden incorporar otras dianas específicas del sitio, p. ej., promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control, u otros rasgos útiles. Se pretende un concepto similar para un polipéptido recombinante, p. ej., de fusión. Esto incluirá una repetición dimérica. Se incluyen específicamente ácidos nucleicos sintéticos que, mediante redundancia del código genético, codifican polipéptidos equivalentes para fragmentos de DTLR2-10 y fusiones de secuencias de diversas moléculas relacionadas diferentes, p. ej., otros miembros de la familia de receptores de IL-1.

Un "fragmento" en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente al menos 21 nucleótidos, más generalmente al menos 25 nucleótidos, normalmente al menos 30 nucleótidos, más normalmente al menos 35 nucleótidos, a menudo al menos 39 nucleótidos, más a menudo al menos 45 nucleótidos, típicamente al menos 50 nucleótidos, más típicamente al menos 55 nucleótidos, normalmente al menos 60 nucleótidos, más normalmente al menos 66 nucleótidos, preferiblemente al menos 72 nucleótidos, más preferiblemente al menos 79 nucleótidos, y en realizaciones particularmente preferidas será de al menos 85 o más nucleótidos. Típicamente, los fragmentos de secuencias genéticas diferentes se pueden comparar entre sí a lo largo de tramos de longitud apropiada, concretamente segmentos definidos tales como los dominios descritos más abajo.

Un ácido nucleico que codifica un DTLR2-10 será particularmente útil para identificar los genes, el ARNm, y las especies de ADNc que codifican el mismo o proteínas íntimamente relacionadas, así como ADN que codifican variantes polimórficas, alélicas, u otras variantes genéticas, p. ej., de diferentes individuos o de especies relacionadas. Las sondas preferidas para tales escrutinios son aquellas regiones de la interleuquina que están conservadas entre las diferentes variantes polimórficas o que contienen nucleótidos que carecen de especificidad, y serán preferiblemente completas o casi. En otras situaciones, las secuencias específicas de las variantes polimórficas serán más útiles.

Adicionalmente se describen moléculas de ácido nucleico recombinante y fragmentos que tienen una secuencia de ácido nucleico idéntica o muy homóloga al grupo de ADN aislados mostrados en la presente memoria. En particular, las secuencias estarán a menudo conectadas operablemente a segmentos de ADN que controlan la transcripción, traducción, y replicación del ADN. Estos segmentos adicionales ayudan típicamente a la expresión del segmento de ácido nucleico deseado.

Las secuencias de ácido nucleico homólogas, o altamente homólogas, cuando se comparan entre sí o las secuencias mostradas en los SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21, o 33 muestran una similitud significativa. Los patrones de homología en los ácidos nucleicos son medidas de la homología utilizadas generalmente en la técnica mediante comparación de secuencias o basándose en las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación comparativas se muestran con mayor detalle más abajo.

La identidad sustancial en el contexto de la comparación de las secuencias de ácidos nucleicos significa que o bien los segmentos, o bien sus hebras complementarias, cuando se comparan son idénticas cuando se alinean óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente 60% de los nucleótidos, generalmente al menos 66%, normalmente al menos 71%, a menudo al menos 76%, más a menudo al menos 80%, normalmente al menos 84%, más normalmente al menos 88%, típicamente al menos 91%, más típicamente al menos aproximadamente 93%, preferiblemente al menos aproximadamente 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 a 98% o más, y en realizaciones concretas, tanto como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos, incluyendo, p. ej., los segmentos que codifican los dominios estructurales tales como los segmentos descritos más abajo. Alternativamente, existirá una identidad sustancial cuando los segmentos hibriden en condiciones de hibridación selectivas, con una hebra o su complemento, típicamente utilizando una secuencia derivada de los SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21, o 33. Típicamente, la hibridación selectiva se producirá cuando haya una homología de al menos aproximadamente 55% a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 65%, preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90%. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213.

La longitud de la comparación por homología, como se ha descrito, puede ser a lo largo de tramos más largos, y en ciertas realizaciones será a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos, y más preferiblemente al menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos.

Las condiciones restrictivas, en referencia a la homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones restrictivas combinadas de sal, temperatura, disolventes orgánicos, y otros parámetros controlados típicamente en las reacciones de hibridación. Las condiciones restrictivas de temperatura incluirán normalmente temperaturas de más de aproximadamente 30ºC, más normalmente de más de aproximadamente 37ºC, típicamente de más de aproximadamente 45ºC, más típicamente de más de aproximadamente 55ºC, preferiblemente de más de aproximadamente 65ºC, y más preferiblemente de más de aproximadamente 70ºC. Las condiciones restrictivas de sal serán normalmente de menos de aproximadamente 500 mM, normalmente menos de aproximadamente 400 mM, más normalmente menos de aproximadamente 300 mM, típicamente menos de aproximadamente 200 mM, preferiblemente menos de aproximadamente 100 mM, y más preferiblemente menos de aproximadamente 80 mM, incluso bajará a menos de aproximadamente 20 mM. No obstante, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, p. ej., Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370.

Alternativamente, para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de la secuencia, se introducen en un ordenador las secuencias de ensayo y de referencia, se diseñan las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y se diseñan los parámetros del programa del algoritmo de la secuencia. Después el algoritmo de comparación de la secuencia calcula el porcentaje de identidad de la secuencia para la secuencia o las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designado.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needlman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de la similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA del Paquete de Soporte Lógico de Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase generalmente Ausubel et al., supra).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos por pares, progresivos para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de la secuencia. También traza un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El método utilizado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento es alineado después con la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Se alinean dos agrupaciones de secuencias mediante una simple prolongación del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se logra mediante una serie de alineamientos por pares, progresivo. El programa se lleva a cabo diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de la secuencia y diseñando los parámetros del programa. Por ejemplo, se puede comparar una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar la relación del porcentaje de identidad de la secuencia utilizando los siguientes parámetros: ponderación del espacio por defecto (3,00), ponderación de la longitud del espacio por defecto (0,10), y espacios finales ponderados.

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de la secuencia y de similitud de la secuencia es el algoritmo BLAST, que es descrito por Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El soporte lógico para realizar los análisis BLAST es asequible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de puntuación elevada (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que se emparejan o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de la palabra cercana (Altschul, et al., supra). Estos éxitos de la palabra cercana inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los éxitos de las palabras se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda incrementar la puntuación del alineamiento cumulativo. La extensión de los éxitos de las palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación del alineamiento cumulativo cae fuera de la cantidad X de su valor máximo logrado; la puntuación cumulativa se va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cada secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, una esperanza (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

Además de calcular el porcentaje de identidad de la secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico de polipéptidos son esencialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico experimenta reacción inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más abajo. De este modo, un polipéptido es típicamente esencialmente idéntico a un segundo polipéptido, p. ej., cuando los dos péptidos difieren solamente en las sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son esencialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas, como se describe más abajo.

El ADN aislado puede ser fácilmente modificado mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos, e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado secuencias de ADN novedosas que codifican esta proteína o sus derivados. Estas secuencias modificadas se pueden utilizar para producir proteínas mutantes (muteínas) o para intensificar la expresión de especies variantes. La intensificación de la expresión puede implicar amplificación génica, aumento de la transcripción, aumento de la traducción, y otros mecanismos. Tales derivados de tipo DTLR mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas del sitio de la proteína o sus fragmentos, incluyendo mutaciones silenciosas utilizando la degeneración del código genético. "DTLR mutante" según se utiliza en la presente memoria incluye un polipéptido que de otro modo entra en la definición de homología del DTLR como se ha expuesto antes, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de otras proteínas de tipo DTLR encontradas en la naturaleza, ya sea mediante deleción, sustitución, o inserción. En particular, "el DTLR mutante específico del sitio" incluye una proteína que tiene una homología sustancial con una proteína del SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34, y típicamente comparte la mayoría de las actividades o efectos biológicos de las formas descritas en la presente memoria.

Aunque las mutaciones específicas del sitio son predeterminadas, no es necesario que los mutantes sean específicos del sitio. La mutagénesis de los DTLR de mamífero se puede lograr realizando inserciones o deleciones de aminoácidos en el gen, acopladas con la expresión. Se pueden generar sustituciones, deleciones, inserciones, o cualquier combinación para llegar a un constructo final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxi terminales. La mutagénesis al azar se puede llevar a cabo en un codón diana y los mutantes de DTLR de mamífero expresados pueden ser escrutados en busca de la actividad deseada. Los métodos para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante mutagénesis con cebadores de M13. Véase también Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y Suplementos periódicos).

Las mutaciones en el ADN no deben situar normalmente secuencias codificantes fuera de los marcos de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que puedan hibridar para producir estructuras de ARNm secundario tales como bucles u horquillas.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. A menudo se obtendrá un fragmento de doble hebra sintetizando la hebra complementaria y recociendo las hebras juntas en condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria utilizando la ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.

Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a menudo pueden ser aplicadas en la mutagénesis. Alternativamente, los cebadores de mutagénesis son los métodos utilizados comúnmente para generar mutaciones definidas en sitios predeterminados. Véase, p. ej., Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; y Dieffenbach y Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.

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IV. Proteínas, Péptidos

El DTLR-10 de primate, p. ej., cuyas secuencias se describen en los SEQ ID NOS: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34, se ha descrito antes. Asimismo se contemplan las variantes alélicas y otras, incluyendo, p. ej., proteínas de fusión que combinan porciones de tales secuencias con otras, que incluyen etiquetas epitópicas y dominios funcionales.

Asimismo se describen proteínas recombinantes, p. ej., proteínas de fusión heterólogas utilizando segmentos de estas proteínas de roedor. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no se fusionan normalmente de la misma manera. De este modo, el producto de fusión de un DTLR con un receptor de IL-1 es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, típicamente elaborada como un único producto de la traducción y que muestra propiedades, p. ej., la secuencia o la antigenicidad, derivadas de cada péptido de origen. Se aplica un concepto similar a las secuencias de ácido nucleico heterólogas.

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Además, se pueden elaborar nuevos constructos a partir de la combinación de dominios funcionales o estructurales similares de otras proteínas relacionadas, p. ej., receptores de IL-1 u otros DTLR, incluyendo variantes de especie. Por ejemplo, la unión al ligando u otros segmentos puede ser "intercambiada" entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos. Véanse, p. ej., Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992.

De este modo, de la unión funcional de especificidades de unión al receptor, resultarán nuevos polipéptidos quiméricos que muestran nuevas combinaciones de especificidades. Por ejemplo, se pueden añadir los dominios de unión al ligando de otras moléculas receptoras relacionadas o sustituir por otros dominios de esta proteína o proteínas relacionadas. La proteína resultante a menudo tendrá funciones y propiedades híbridas. Por ejemplo, una proteína de fusión puede incluir un dominio de redireccionamiento que puede servir para proporcionar el secuestro de la proteína de fusión por un orgánulo subcelular concreto.

Los patrones y las secuencias de fusión candidato se pueden seleccionar de diferentes bases de datos de secuencias, p. ej., GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, CA; y BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI.

Asimismo se describen muteínas que se unen a ligandos Toll, y/o que son afectadas en la transducción de la señal. El alineamiento estructural de los DTLR1-10 humanos con otros miembros de la familia de IL-1 muestra características/restos conservados. Véase, p. ej., la Figura 3A. El alineamiento de las secuencias de los DTLR humanos con otros miembros de la familia de IL-1 indica diferentes rasgos estructurales y funcionales compartidos. Véase también, Bazan, et al. (1996) Nature 379:591; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle y Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; y Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269.

Los ligandos de IL-1\alpha e IL-1\beta se unen a un receptor de IL-1 de tipo I como receptor primario y este complejo forma después un complejo receptor de alta afinidad con el receptor de IL-1 de tipo III. Tales subunidades del receptor son compartidas probablemente con los nuevos miembros de la familia de IL-1.

Las variaciones similares en otras contrapartes de especies de las secuencias de DTLR2-10, p. ej., en las regiones correspondientes, deben proporcionar interacciones similares con el ligando o el sustrato. Son particularmente preferidas las sustituciones con secuencias de ratón o secuencias humanas. En cambio, las sustituciones conservativas lejos de las regiones de interacción de unión al ligando conservarán probablemente la mayoría de las actividades de señalización.

Los "derivados" de los DTLR-10 de primate incluyen mutantes de la secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación, derivados metabólicos y productos conjugados covalentes o agregativos con otros radicales químicos. Los derivados covalentes se pueden preparar mediante conexión de funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de los aminoácidos de DTLR o en los extremos N o C, p. ej., mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas alifáticos del extremo carboxilo, o de restos que contienen cadenas laterales carboxílicas, derivados O-acilados de restos que contienen grupos hidroxilo, y derivados N-acilados del aminoácido amino terminal o restos que contienen grupos amino, p. ej., lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de radicales alquilo incluyendo alquilo C3 a C18 normal, formando de ese modo especies alcanoil-aroílicas.

En particular, se incluyen las alteraciones de la glicosilación, p. ej., realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas de procesamiento adicionales. Los métodos particularmente preferidos para lograrlo son mediante exposición del polipéptido a enzimas glicosilantes derivadas de células que normalmente proporcionan semejante procesamiento, p. ej., enzimas de glicosilación de mamífero. También se contemplan enzimas de desglicosilación. Asimismo se incluyen las versiones de la misma secuencia de aminoácidos primaria que tienen otras modificaciones menores, incluyendo restos aminoácido fosforilados, p. ej., fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina.

Un grupo principal de derivados son los conjugados covalentes de los receptores o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados se pueden sintetizar en un cultivo recombinante tal como fusiones N o C terminales o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en el entrecruzamiento de proteínas a través de grupos laterales reactivos. Los sitios de derivatización preferidos con agentes de entrecruzamiento están en los grupos amino libres, los radicales carbohidratados, y los restos cisteína.

También se proporcionan los polipéptidos de fusión entre los receptores y otras proteínas homólogas o heterólogas. Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre diferentes receptores, que dan como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida que muestra especificidad de unión para múltiples ligandos Toll diferentes, o un receptor que puede tener una especificidad ampliada o debilitada del efecto del sustrato. Del mismo modo se pueden construir fusiones heterólogas que muestran una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos típicos son las fusiones de un polipéptido informador, p. ej., luciferasa, con un segmento o dominio de un receptor, p. ej., un segmento de unión al ligando, de manera que se pueda determinar fácilmente la presencia o localización de un ligando deseado. Véase, p. ej., Dull, et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.859.609, que se incorpora en la presente memoria como referencia. Otros patrones de fusión génica incluyen glutation-S-transferasa (GST), \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, \beta-lactamasa, alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa, y factor de apareamiento alfa de levadura. Véase, p. ej., Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.

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El método de la fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. A menudo se obtendrá un fragmento de doble hebra sintetizando la hebra complementaria y recociendo las hebras juntas en condiciones apropiadas o añadiendo la hebra complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.

Tales polipéptidos también pueden tener restos aminoácido que han sido modificados químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación, o adición o eliminación de otros radicales, concretamente aquellos que tiene conformaciones moleculares similares a grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos de marcaje útiles, o servirán como dianas de purificación, p. ej., ligandos de afinidad.

Las proteínas de fusión se elaborarán típicamente mediante métodos de ácidos nucleicos recombinantes o mediante métodos con polipéptidos sintéticos. Las técnicas para la manipulación y expresión de ácido nucleico son descritas generalmente, por ejemplo, por Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, y Ausubel, et al. (eds. 1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York, que se incorporan en la presente memoria como referencia. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos son descritas, por ejemplo, por Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; y Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia. Véase también Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779 para los métodos para elaborar polipéptidos más grandes.

Asimismo se contempla el uso de derivados de un DTLR2-10 distintos de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o la glicosilación. Tales derivados pueden implicar la asociación covalente o agregativa con radicales químicos. Estos derivados generalmente se dividen en tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de la cadena lateral y el resto terminal, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo con membranas celulares. Tales derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoanálisis, o en métodos de purificación por ejemplo para la purificación por afinidad de un receptor u otra molécula de unión, p. ej., un anticuerpo. Por ejemplo, un ligando Toll puede ser inmovilizado mediante unión covalente en un soporte sólido tal como Sefarosa activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, o adsorbido sobre superficies de poliolefinas, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para su uso en el análisis o purificación de un receptor DTLR, anticuerpos, u otras moléculas similares. El ligando también puede ser marcado con un grupo detectable, por ejemplo radioyodado mediante el procedimiento de la cloramina T, unido covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugado con otro radical fluorescente para su uso en análisis de diagnóstico.

Se puede utilizar un DTLR de esta invención como inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos, p. ej., capaces de distinguir entre otros miembros de la familia de receptores de IL-1, para los DTLR o sus diferentes fragmentos. El DTLR purificado se puede utilizar para escrutar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno preparados mediante inmunización con diferentes formas de preparaciones impuras que contienen la proteína. En particular, el término "anticuerpos" también incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos naturales, p. ej., Fab, Fab2, Fv, etc. El DTLR purificado también se puede utilizar como reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados de expresión, o trastornos inmunológicos que conducen a la producción de anticuerpo para el receptor endógeno. Adicionalmente, los fragmentos de DTLR también pueden servir como inmunógenos para producir los anticuerpos de la presente invención, descritos inmediatamente más abajo. Por ejemplo, se contemplan anticuerpos que tienen afinidad de unión o que han sido originados contra las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34, sus fragmentos, o diferentes homólogos peptídicos. En particular, se contemplan anticuerpos que tienen afinidad de unión para, o que han sido originados contra, fragmentos específicos que se pronostica que están, o realmente están, expuestos a la superficie exterior de la proteína del DTLR nativo.

El bloqueo de la respuesta fisiológica a los ligandos del receptor puede resultar de la inhibición de la unión del ligando al receptor, probablemente por medio de inhibición competitiva. De este modo, los análisis in vitro a menudo utilizarán anticuerpos o segmentos de unión a antígenos de estos anticuerpos, o fragmentos anclados a sustratos en fase sólida. Estos análisis también permitirán la determinación diagnóstica de los efectos de cualquiera de las mutaciones y modificaciones en la región de unión al ligando, u otras mutaciones y modificaciones, p. ej., que afecten a la señalización o a la función enzimática.

Asimismo se contempla el uso de análisis de escrutinio de fármacos competitivos, p. ej., en los que anticuerpos neutralizadores del receptor o sus fragmentos compiten con un compuesto de ensayo por la unión a un ligando u otro anticuerpo. De esta manera, se pueden utilizar los anticuerpos neutralizadores o fragmentos para detectar la presencia de un polipéptido que comparte uno o más sitios de unión a un receptor y también se pueden utilizar para ocupar sitios de unión sobre un receptor que podría de otro modo unirse a un ligando.

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V. Elaboración de Ácidos Nucleicos y Proteína

El ADN que codifica la proteína o sus fragmentos puede ser obtenido mediante síntesis química, escrutinio de genotecas de ADNc, o escrutinio de genotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de tejidos. Las secuencias naturales pueden ser aisladas utilizando métodos convencionales y las secuencias proporcionadas en la presente memoria. Se pueden identificar otras contrapartes de especies mediante técnicas de hibridación, o mediante diferentes técnicas de PCR, combinadas o mediante búsqueda en bases de datos de secuencias, p. ej., GenBank.

Este ADN puede ser expresado en una amplia variedad de células anfitrionas para la síntesis de un receptor completo o fragmentos que pueden a su vez ser utilizados, por ejemplo para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de dominios de unión a ligandos o quinasa/fosfatasa modificados; y para estudios de estructura/función. Las variantes o fragmentos pueden ser expresados en células anfitrionas que son transformadas o transfectadas con vectores de expresión apropiados. Estas moléculas pueden estar esencialmente libres de contaminantes proteicos o celulares, distintos de los derivados del anfitrión recombinante, y por lo tanto son particularmente útiles en las composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. La proteína, o sus porciones, pueden ser expresadas como fusiones con otras proteínas.

Los vectores de expresión son típicamente constructos de ADN o ARN auto-replicantes que contienen el gen del receptor deseado o sus fragmentos, normalmente conectado operablemente a elementos de control genético adecuados que son reconocidos en una célula anfitriona adecuada. Estos elementos de control son capaces de llevar a cabo la expresión en un anfitrión adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para llevar a cabo la expresión dependerá de la célula anfitriona eventual utilizada. Generalmente, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procariótico o un sistema de control de la expresión de un promotor eucariótico, y típicamente incluyen un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el comienzo de la transcripción, intensificadores de la transcripción para elevar el nivel de expresión del ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma adecuado, y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión también contienen
normalmente un origen de replicación que permite que el vector replique independientemente de la célula anfitriona.

Los vectores de esta invención incluyen aquellos que contienen ADN que codifica una proteína, como se ha descrito, o uno de sus fragmentos que codifican un polipéptido equivalente biológicamente activo. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla adicionalmente el uso de tales vectores de expresión que son capaces de expresar ADNc eucariótico que codifica semejante proteína en un anfitrión procariótico o eucariótico, donde el vector es compatible con el anfitrión y donde el ADNc eucariótico que codifica el receptor está insertado en el vector de manera que el crecimiento del anfitrión que contiene el vector expresa el ADNc en cuestión. Normalmente, se diseñan vectores de expresión para la replicación estable en sus células anfitrionas o para la amplificación para incrementar enormemente el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre se requiere que un vector de expresión replique en una célula anfitriona, p. ej., es posible efectuar la expresión transitoria de la proteína o sus fragmentos en diferentes anfitriones utilizando vectores que no contengan un origen de replicación que sea reconocido por la célula anfitriona. También es posible utilizar vectores que ocasionen la integración de la proteína que codifica la porción o sus fragmentos en el ADN del anfitrión mediante recombinación.

Los vectores, utilizados en la presente memoria, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del anfitrión. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que llevan a cabo la expresión de genes conectados operablemente. Los plásmidos son la forma de vector más comúnmente utilizada pero todas las demás formas de vectores que sirven para una función equivalente y que son, o se vuelven, conocidos en la técnica son adecuados para su uso en la presente memoria. Véanse, p. ej., Pouwels, et al. (1985 y Suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., y Rodriquez, et al. (eds) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, 1988, que se incorporan en la presente memoria como referencia.

Las células transformadas son células, preferiblemente de mamífero, que han sido transformadas o transfectadas con vectores de receptores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante. Las células anfitrionas transformadas expresan normalmente la proteína deseada o sus fragmentos, pero para la clonación, amplificación, y manipulación de su ADN, no se necesita que expresen la proteína sujeto. Esta invención contempla adicionalmente el cultivo de células transformadas en un medio nutriente, permitiendo de ese modo que el receptor se acumule en la membrana celular. La proteína puede ser recuperada, o bien del cultivo o bien, en ciertos casos, del medio de cultivo.

Para los fines de esta invención, las secuencias de ácido nucleico están conectadas operablemente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretor está conectado operablemente a un polipéptido si éste es expresado en forma de preproteína o participa en el direccionamiento del polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está conectado operablemente a una secuencia codificante si controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión al ribosoma está conectado operablemente a una secuencia codificante si está situado para permitir la traducción. Normalmente, conectado operablemente significa contiguo y en el marco de lectura, no obstante, ciertos elementos genéticos tales como los genes represores no están conectados de manera contigua pero todavía se unen a secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión.

Las células anfitrionas adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores, y eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos tanto gram negativos como gram positivos, p. ej., E. coli y B. subtilis. Los eucarioras inferiores incluyen levaduras, p. ej., S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los eucariotas superiores incluyen líneas celulares de cultivos de tejido establecidas de células de animales, tanto de origen no mamífero, p. ej., células de insecto, y aves, como de origen mamífero, p. ej., seres humanos, primates, y roedores.

Los sistemas anfitrión procariótico-vector incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Según se utiliza en la presente memoria, se utilizarán genéricamente E. coli y sus vectores para incluir vectores equivalentes utilizados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden utilizar para expresar el receptor o sus fragmentos incluyen, pero no están limitados a, vectores tales como aquellos que contienen el promotor lac (serie pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor Ipp (la serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, (eds. Rodriguez y Denhardt), Buttersworth, Boston, Capítulo 10, págs. 205-236.

Los eucariotas inferiores, p. ej., levaduras y Dictyostelium, pueden ser transformados con vectores que contienen la secuencia de DTLR. Para los fines de esta invención, el anfitrión eucariótico inferior más común es la levadura panadera, Saccharomyces cerevisiae. Ésta se utilizará para representar genéricamente eucariotas inferiores aunque también se encuentran disponibles otras numerosas cepas y especies. Los vectores de levadura consisten típicamente en un origen de replicación (excepto el tipo integrante), un gen de selección, un promotor, un ADN que codifica el receptor o sus fragmentos, y secuencias para la terminación de la traducción, poliadenilación, y terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levadura incluyen promotores constitutivos tales como el de la 3-fosfoglicerato quinasa y otros promotores de genes de enzimas glicolíticas diferentes o promotores inducibles tales como el promotor de la alcohol deshidrogenasa 2 o el promotor de la metalotioneína. Los vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: de bajo número de copias auto-replicante (tal como la serie YRp), de elevado número de copias auto-replicante (tal como la serie YEp); de tipo integrante (tal como la serie YIp), o mini-cromosomas (tal como la serie YCp).

Las células de cultivos de tejidos eucarióticos superiores son normalmente las células anfitrionas preferidas para la expresión de la proteína interleuquina funcionalmente activa. En principio, es factible cualquier línea celular de cultivo de tejido eucariótico superior, p. ej., sistemas de expresión de baculovirus en insectos, ya sean de origen invertebrado o vertebrado. No obstante, se prefieren células de mamífero. La transformación o transfección y propagación de tales células se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de las líneas celulares útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO), líneas celulares de riñón de cría rata (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de aves, y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para tales líneas celulares incluyen normalmente un origen de replicación, un promotor, un sitio de inicio de la traducción, sitios de empalme del ARN (si se utiliza ADN genómico), un sitio de poliadenilación, un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también contienen normalmente un gen de selección o un gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus, o retrovirus que portan promotores derivados, p. ej., de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus vaccinia, o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen pADNC1; pCD, véase Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMC1neo PolyA, véase Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610.

Para las proteínas secretadas, un marco de lectura abierto codifica normalmente un polipéptido que consiste en un producto maduro o secretado unido covalentemente en su extremo N a un péptido señal. El péptido señal es escindido antes de la secreción, del polipéptido maduro, o activo. El sitio de escisión puede ser pronosticado con un grado elevado de exactitud a partir de las reglas empíricas, p. ej., von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14:4683-4690, y la composición de aminoácidos precisa del péptido señal no parece ser crítica para su función, p. ej., Randall, et al. (1989) Science 243:1156-1159; Kaiser et al. (1987) Science 235:312-317.

A menudo se deseará expresar estos polipéptidos en un sistema que proporcione un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón habitual será aquél proporcionado naturalmente por el sistema de expresión. No obstante, el patrón será modificable exponiendo el polipéptido, p. ej., una forma no glicosilada, a proteínas glicosilantes adecuadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen receptor puede ser co-transformado con uno o más genes que codifiquen enzimas de glicosilación de mamífero u otras enzimas de glicosilación. Utilizando este enfoque, serán alcanzables ciertos patrones de glicosilación de mamíferos en células procariotas u otras células.

La fuente de DTLR puede ser un anfitrión eucariótico o procariótico que exprese un DTLR recombinante, tal como se ha descrito antes. La fuente también puede ser una línea celular tal como fibroblastos Swiss 3T3 de ratón, pero también se pueden contemplar otras líneas celulares de mamífero en esta invención, siendo la línea celular preferida de la especie humana.

Ahora que se conocen las secuencias, se pueden preparar DTLR de primate, sus fragmentos, o derivados mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los descritos por Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; todas las cuales se incorporan en la presente memoria como referencia. Por ejemplo, se puede utilizar el procedimiento con azida, el procedimiento con cloruro de ácido, el procedimiento con anhídrido de ácido, a el procedimiento del anhídrido mixto, el procedimiento del éster activo (p. ej., éster p-nitrofenílico, éster N-hidroxisuccinimídico, o éster cianometílico), el procedimiento del carbodiimidazol, el procedimiento oxidativo-reductivo, o el procedimiento de la diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Las síntesis en fase sólida y en solución son aplicables ambas a los procedimientos anteriores. Se pueden utilizar técnicas similares con secuencias de DTLR parciales.

Las proteínas de DTLR, los fragmentos, o derivados se preparan adecuadamente de acuerdo con los procedimientos anteriores empleados típicamente en la síntesis de péptidos, generalmente mediante el denominado procedimiento por etapas que comprende condensar un aminoácido al aminoácido terminal, uno por uno en la secuencia, o acoplando los fragmentos peptídicos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no están siendo utilizados en la reacción de acoplamiento deben ser protegidos típicamente para evitar el acoplamiento en una localización incorrecta.

Si se adopta una síntesis en fase sólida, el aminoácido C-terminal es unido a un portador o soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El portador insoluble no está particularmente limitado con tal que tenga capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de tales portadores insolubles incluyen resinas halometiladas, tales como resina clorometilada o resina bromometilada, resinas hidroximetiladas, resinas fenólicas, resinas de t-alquiloxicarbonilhidrazida, y similares.

Se une por orden un aminoácido con el grupo amino protegido a través de la condensación de su grupo carboxilo activado y el grupo amino reactivo del péptido o cadena formados previamente, para sintetizar el péptido etapa por etapa. Después de sintetizar la secuencia completa, el péptido se escinde del portador insoluble para producir el péptido. Este enfoque en fase sólida es descrito generalmente por Merrifield, et al. (1963) en J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, que se incorpora en la presente memoria como referencia.

La proteína preparada y sus fragmentos pueden ser aislados y purificados de la mezcla de reacción por medio de separación de péptidos, por ejemplo, mediante extracción, precipitación, electroforesis, diferentes formas de cromatografía, y similares. Los receptores de esta invención pueden ser obtenidos con grados variables de pureza dependiendo de los usos deseados. La purificación se puede completar mediante el uso de las técnicas de purificación de proteínas descritas en la presente memoria, véase más abajo, o mediante el uso de los anticuerpos de la presente memoria descritos en los métodos de cromatografía de afinidad por inmunoabsorción. Esta cromatografía de afinidad por inmunoabsorción se lleva a cabo conectando primero los anticuerpos a un soporte sólido y poniendo en contacto después los anticuerpos conectados con productos lisados solubilizados de las células apropiadas, productos lisados de otras células que expresan el receptor, o productos lisados o sobrenadantes de células que producen la proteína como resultado de las técnicas de ADN, véase más abajo.

Generalmente, la proteína purificada tendrá una pureza de al menos aproximadamente 40%, habitualmente una pureza de al menos aproximadamente 50%, normalmente una pureza de al menos aproximadamente 60%, típicamente una pureza de al menos aproximadamente 70%, más típicamente una pureza de al menos aproximadamente 80%, preferiblemente una pureza de al menos aproximadamente 90% y más preferiblemente una pureza de al menos aproximadamente 95%, y en realizaciones concretas, de 97%-99% o más. La pureza será normalmente en peso, pero también puede ser sobre una base molar. Se aplicarán diferentes análisis según sea apropiado.

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VI. Anticuerpos

Se pueden originar anticuerpos contra diferentes proteínas de DTLR de mamífero, p. ej., primate y sus fragmentos, tanto en forma nativa natural como en forma recombinante, estando la diferencia en que es más probable que los anticuerpos para el receptor activo reconozcan los epítopos que están presentes solamente en las conformaciones nativas. La detección del antígeno desnaturalizado también puede ser útil, p. ej., en el análisis Western. Asimismo se contemplan los anticuerpos anti-idiotípicos, que serían útiles como agonistas o antagonistas de un receptor natural o un anticuerpo.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y las versiones de una sola cadena, contra fragmentos predeterminados de la proteína pueden ser originados mediante inmunización de animales con productos conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser escrutados en busca de su unión a la proteína normal o defectuosa, o escrutados en busca de actividad agonística o antagónica. Estos anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con una K_{D} de al menos aproximadamente 1 mM, más normalmente al menos aproximadamente 300 \muM, típicamente al menos aproximadamente 100 \muM, más típicamente al menos aproximadamente 30 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente 10 \muM, y más preferiblemente al menos aproximadamente 3 \muM o más.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, de esta invención pueden tener un valor diagnóstico o terapéutico significativo. Pueden ser potentes antagonistas que se unen al receptor e inhiben la unión al ligando o inhiben la capacidad del receptor para lograr una respuesta biológica, p. ej., actuar sobre su sustrato. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizadores y pueden ser acoplados a toxinas o radionúclidos para unirse a las células productoras, o a células localizadas como fuente de la interleuquina. Adicionalmente, estos anticuerpos se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos, directamente o indirectamente por medio de un conector.

Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizadores, se podrían unir al receptor sin inhibir la unión al ligando o sustrato. Como anticuerpos neutralizadores, pueden ser útiles en análisis de unión competitiva. También serán útiles en la detección o cuantificación del ligando. Se pueden utilizar como reactivos para el análisis de transferencia Western, o para la inmunoprecipitación o inmunopurificación de la respectiva proteína.

Los fragmentos de proteína se pueden unir a otros materiales, concretamente polipéptidos, en forma de polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para ser utilizados como inmunógenos. Los DTLR de mamífero y sus fragmentos pueden ser fusionados o unidos convalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina de lapa ojo de cerradura, albúmina de suero bovino, toxoide del tétanos, etc. Véanse Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publicaciones, Nueva York; y Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, Nueva York; cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia, para las descripciones de los métodos de preparación de antisueros policlonales. Un método típico implica la hiperinmunización de un animal con un antígeno. Después se recoge la sangre del animal poco después de las inmunizaciones repetidas y se aísla la gamma-globulina.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diferentes anfitriones mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de las técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se puede encontrar, p. ej., en Stites, et al. (eds) Basic and Clinical Immunology (4^{a} ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias allí citadas; Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2^{a} ed) Academic Press, Nueva York; y concretamente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256: 495-497, que comenta un método para generar anticuerpos monoclonales. Cada una de estas referencias se incorpora en la presente memoria como referencia. Brevemente resumido, este método implica inyectar al animal un inmunógeno. Después el animal es sacrificado y se recogen las células de su bazo, que después se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas es escrutada después para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una única especie de anticuerpo para el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de células B individuales inmortalizadas y clonadas a partir del animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas implican la exposición de linfocitos in vitro a los polipéptidos antigénicos o alternativamente a la selección de genotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véanse, Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 24 6:1275-12 81; y Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniendo, covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporcione una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y son referidas extensamente en la literatura tanto científica como de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, radicales fluorescentes, radicales quimioluminescentes, partículas magnéticas, y similares. Las patentes, que ilustran el uso de tales marcas incluyen las Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Asimismo, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes o quiméricas, véase Cabilly, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; o elaborar en ratones transgénicos, véase Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156. Estas referencias se incorporan en la presente memoria como referencia.

Los anticuerpos de esta invención también se pueden utilizar para la cromatografía de afinidad en el aislamiento de los DTLR. Se pueden preparar columnas en las que los anticuerpos están unidos a un soporte sólido, p. ej., partículas, tales como agarosa, Sephadex, o similar, donde un producto lisado celular se puede hacer pasar a través de la columna, lavar la columna, seguido de concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, por medio de lo cual se liberará la proteína purificada. Se puede utilizar la proteína para purificar anticuerpos.

Los anticuerpos también se pueden utilizar para escrutar genotecas de expresión en busca de productos de expresión concretos. Normalmente los anticuerpos utilizados en semejante procedimiento estarán marcados con un radical que permita la fácil detección de la presencia del antígeno por la unión al anticuerpo.

Los anticuerpos originados contra un DTLR también se utilizarán para originar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles en la detección o diagnosis de diferentes afecciones inmunológicas relacionadas con la expresión de la proteína o de células que expresan la proteína. También serán útiles como agonistas o antagonistas del ligando, que pueden ser inhibidores competitivos o sustitutos de los ligandos de origen natural.

Una proteína de DTLR que se une específicamente a, o que es específicamente inmunorreactiva con un anticuerpo generado contra un inmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34, es determinada típicamente en un inmunoanálisis. El inmunoanálisis utiliza típicamente un antisuero policlonal que es originado, p. ej., para una proteína de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34. Este antisuero se selecciona para que tenga una reactividad cruzada baja frente a otros miembros de la familia de IL-1R, p. ej., DTLR1, preferiblemente de la misma especie, y se elimina cualquiera de tales reactividades cruzadas mediante inmunoabsorción antes de su uso en el inmunoanálisis.

Con el fin de producir antisueros para su uso en un inmunoanálisis, se aísla la proteína del SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34, o una de sus combinaciones, como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, se puede producir la proteína recombinante en una línea celular de mamífero. En un anfitrión apropiado, p. ej., una cepa endogámica de ratones tal como balb/c, es inmunizada con la proteína seleccionada, utilizando típicamente un coadyuvante convencional, tal como coadyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratón convencional (véase Harlow y Lane, supra). Alternativamente, se puede utilizar como inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente memoria y conjugado con una proteína portadora. Los sueros policlonales se recogen y se titulan frente a la proteína inmunogénica en un inmunoanálisis, p. ej., un inmunoanálisis en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Se seleccionan los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayor y se someten a ensayo en busca de su reactividad cruzada frente a otros miembros de la familia de IL-1R, p. ej., DTLR de ratón o DTLR1 humano, utilizando un inmunoanálisis de unión competitiva tal como el descrito por Harlow y Lane, supra, en las páginas 570-573. Preferiblemente se utilizan al menos dos miembros de la familia de DTLR en esta determinación junto con cualquiera o alguno de los DTLR2-10 humanos. Estos miembros de la familia de IL-1R pueden ser producidos como proteínas recombinantes y aislados utilizando técnicas de biología molecular y de química de proteínas convencionales como las descritas en la presente memoria.

Se pueden utilizar inmunoanálisis en formato de unión competitiva para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, las proteínas de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34, o sus diferentes fragmentos, pueden ser inmovilizadas en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al análisis compiten con la unión del antisuero al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión del antisuero a la proteína inmovilizada se compara con la proteína de SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 y/o 34. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores utilizando cálculos convencionales. Se seleccionan y reúnen los antisueros con una reactividad cruzada menor del 10% con cada una de las proteínas enumeradas antes. Los anticuerpos que presentan reactividad cruzada se separan después de los antisueros reunidos mediante inmunoabsorción con las proteínas enumeradas antes.

Los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos se utilizan después en un inmunoanálisis de unión competitiva como se ha descrito antes para comparar una segunda proteína con la proteína inmunogénica (p. ej., la proteína de tipo IL-1R del SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 y/o 34). Con el fin de realizar esta comparación, se analiza cada una de las dos proteínas a un intervalo de concentraciones muy amplio y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50% de la unión del antisuero a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es menos de dos veces la cantidad de la proteína de la proteína o las proteínas seleccionadas, se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.

Se entiende que estas proteínas de DTLR son miembros de una familia de proteínas homólogas que comprenden al menos 10 genes identificados hasta ahora. Para un producto génico concreto, tal como el DTLR2-10, el término hace referencia no solamente a las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, si no también a otras proteínas que son variantes alélicas, no alélicas o de especie. También se entiende que los términos incluyen mutaciones no naturales introducidas mediante mutación deliberada utilizando la tecnología recombinante convencional tal como la mutación en un único sitio, o eliminando secciones cortas de ADN que codifica las respectivas proteínas, o sustituyendo nuevos aminoácidos, o añadiendo nuevos aminoácidos. Tales alteraciones minoritarias deben mantener esencialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. De este modo, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con una proteína relacionada con IL-1R de origen natural designada, por ejemplo, las proteínas de DTLR mostradas en los SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 o 34. Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas pueden ser determinadas expresando la proteína en una línea celular apropiada y midiendo el efecto apropiado sobre los linfocitos. Las modificaciones de las proteínas concretas consideradas minoritarias incluirían la sustitución conservativa de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se ha descrito antes para la familia de IL-1R en su totalidad. Alineando una proteína óptimamente con la proteína de DTLR2-10 y utilizando los inmunoanálisis convencionales descritos en la presente memoria para determinar la inmunoidentidad, se pueden determinar las composiciones de las proteínas de la invención.

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VII. Kits y cuantificación

Las formas tanto naturales como recombinantes de las moléculas de tipo IL-1R de esta invención son particularmente útiles en kits y métodos de análisis. Por ejemplo, estos métodos también se aplicarían al escrutinio en busca de actividad de unión, p. ej., ligandos para estas proteínas. En los últimos años se han desarrollado varios métodos de análisis automático con el fin de permitir el escrutinio de decenas de miles de compuestos por año. Véase, p. ej., una estación de trabajo automatizada BIOMEK, Beckman Instruments, Palo Alto, California, y Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773, que se incorpora en la presente memoria como referencia. La última describe métodos para someter a ensayo la unión de una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de análisis adecuados para escrutar en busca de un ligando o proteínas homólogas agonísticas/antagónicas puede resultar muy facilitado por la disponibilidad de grandes cantidades de DTLR solubles, purificados en un estado activo como el proporcionado por esta invención.

El DTLR purificado puede ser aplicado como recubrimiento directamente sobre placas para su uso en las técnicas de escrutinio de ligandos anteriormente mencionadas. No obstante, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizadores para estas proteínas como anticuerpos de captura para inmovilizar el respectivo receptor sobre la fase sólida, útiles, p. ej., en usos de diagnóstico.

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Asimismo se contempla el uso de DTLR2-10, sus fragmentos, péptidos, y sus productos de fusión en una variedad de kits de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de la proteína o su ligando. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden incorporar anticuerpos contra las moléculas a los kits y métodos. Típicamente el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido o segmento génico de DTLR definido, o un reactivo que reconoce el uno o el otro. Típicamente, el reactivo de reconocimiento, en el caso del péptido, sería un receptor o anticuerpo, o en el caso de un segmento génico, sería normalmente una sonda de hibridación.

Un kit preferido para determinar la concentración, p. ej., de DTLR4, de una muestra comprendería típicamente un compuesto marcado, p. ej., ligando o anticuerpo, con una afinidad de unión a DTLR4 conocida, una fuente de DTLR4 (de origen natural o recombinante) como control positivo, y un método para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo una fase sólida para inmovilizar el DTLR4 de la muestra de ensayo. Normalmente se proporcionarán los compartimentos que contengan los reactivos, y las instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, específicos para el DTLR de mamífero o uno de sus fragmentos peptídicos, o fragmentos receptores son útiles en las aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de ligando y/o sus fragmentos. Los análisis de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo anticuerpo-antígeno) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diferentes análisis comerciales, tales como el radioinmunoanálisis (RIA), el análisis de absorción con enzima ligada (ELISA), el inmunoanálisis enzimático (EIA), la técnica de inmunoanálisis multiplicado por enzimas (EMIT), el inmunoanálisis fluorescente con sustrato marcado (SLFIA) y similares. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos no marcados utilizando un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo para DTLR4 o uno de sus fragmentos concretos. Estos análisis también han sido extensamente comentados en la literatura. Véanse, p. ej., Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., y Coligan (Ed.) (1991) y suplementos periódicos, Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, Nueva York.

Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener un uso similar para servir como agonistas o antagonistas de DTLR4. Estos deben ser útiles como reactivos terapéuticos en circunstancias apropiadas.

Frecuentemente, los reactivos para los análisis diagnósticos son proporcionados en kits, con el fin de optimizar la sensibilidad del análisis. Para la invención sujeto, dependiendo de la naturaleza del análisis, del protocolo, y de la marca, se proporciona un anticuerpo marcado o no marcado, o un ligando marcado. Esto se encuentra normalmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de la señal tales como sustratos para enzimas, y similares. Preferiblemente, el kit también contendrá instrucciones para el uso y la eliminación apropiados de los contenidos después de su uso. Típicamente el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil, y contendrá instrucciones para el uso y la eliminación apropiados de los reactivos. Deseablemente, los reactivos se proporcionan en forma de polvo liofilizado seco, donde los reactivos pueden ser reconstituidos en un medio acuoso que tenga concentraciones apropiadas para realizar el análisis.

Los constituyentes mencionados antes de los análisis diagnósticos pueden ser utilizados sin modificación o pueden ser modificados de diferentes maneras. Por ejemplo, se puede lograr el marcaje uniendo covalentemente o no covalentemente un radical que proporcione directamente o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos análisis, el compuesto de ensayo, el DTLR, o los anticuerpos para éste pueden estar marcados directamente o indirectamente. Las posibilidades para el marcaje directo incluyen grupos marcadores: radiomarcas tales como I^{125}, enzimas (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcas fluorescentes (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.940.475) capaces de verificar el cambio en la intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda, o la polarización de la fluorescencia. Ambas patentes se incorporan en la presente memoria como referencia. Las posibilidades de marcaje indirecto incluyen biotinilación de un constituyente seguido de unión a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores.

También existen numerosos métodos de separación del ligando unido del libre, o alternativamente el compuesto de ensayo unido del libre. El DTLR puede ser inmovilizado sobre diferentes matrices seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plásticos tal como una placa de ELISA, filtros, y cuentas. Los métodos de inmovilización del receptor a la matriz incluyen, sin limitación, la adherencia directa al plástico, el uso de un anticuerpo de captura, el acoplamiento químico, y biotina-avidina. La última etapa de este enfoque implica la precipitación del complejo anticuerpo/antígeno mediante cualquiera de los diferentes métodos incluyendo aquellos que utilizan, p. ej., un disolvente orgánico tal como polietilenglicol o una sal tal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de las partículas imantables de anticuerpo con fluoresceína descrito por Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30(9):1457-14 61, y la separación de partículas magnéticas con doble anticuerpo como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.659.678.

Los métodos para conectar proteínas o fragmentos a diferentes marcas han sido referidos extensamente en la literatura y no requieren aquí un estudio detallado. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados por medio de la utilización de carbodiimida o ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para la conexión, o similar. Las proteínas de fusión también encontrarán uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto diagnóstico implica el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de un DTLR. Estas secuencias pueden ser utilizadas como sondas para detectar niveles de los respectivos DTLR en pacientes que se sospecha que tienen un trastorno inmunológico. La preparación de secuencias de nucleótidos de ARN y ADN, el marcaje de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias han recibido una amplia descripción y discusión en la literatura. Normalmente una sonda oligonucleotídica debe tener al menos aproximadamente 14 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas polinucleotídicas pueden tener hasta varias kilobases. Se pueden emplear diferentes marcas, muy comúnmente radionúclidos, concretamente P^{32}. Sin embargo, también se pueden emplear otras técnicas, por ejemplo el uso de nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina sirve después como sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos, sustancias fluorescentes, enzimas, o similares. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex híbridos de ADN-ARN, o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar marcados y se puede llevar a cabo un análisis en el que el dúplex está unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex sobre la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex. El uso de sondas para el ARN anti-sentido novedoso se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica convencional tal como la hibridación de ácido nucleico, el escrutinio más y menos, el sondeo recombinatorio, la traducción de híbridos liberados (HRT), y la traducción de híbridos detenidos (HART). Esto también incluye las técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Asimismo se contemplan los kits diagnósticos que también someten a ensayo la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. La diagnosis o la prognosis pueden depender de la combinación de múltiples indicaciones utilizadas como marcadores. De este modo, los kits pueden someter a ensayo las combinaciones de marcadores. Véase, p. ej., Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97.

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VIII. Utilidad terapéutica

Esta invención proporciona reactivos con un valor terapéutico significativo. Los DTLR (de origen natural o recombinantes), sus fragmentos, los receptores de muteína, y los anticuerpos, junto con los compuestos identificados por tener afinidad de unión para los receptores o anticuerpos, deben ser útiles en el tratamiento de afecciones que muestran una expresión anormal de los receptores de sus ligandos. Semejante anomalía se manifestará típicamente mediante trastornos inmunológicos. Adicionalmente, esta invención debe proporcionar valor terapéutico en diferentes enfermedades o trastornos asociados con la expresión anormal o el desencadenamiento anormal de la respuesta al ligando. Se ha sugerido que los ligandos Toll están implicados en el desarrollo morfológico, p. ej., la determinación de la polaridad dorso-ventral, y en las respuestas inmunitarias, concretamente las respuestas innatas primitivas. Véase, p. ej., Sun, et al. (1991) Eur. J. Biochem, 196:247-254; Hultmark (1994) Nature 367:116-117.

Las muteínas de DTLR recombinantes, los anticuerpos agonísticos o antagónicos para estas, o los anticuerpos pueden ser purificados y después administrados a un paciente. Estos reactivos pueden ser combinados para su uso terapéutico con ingredientes activos adicionales, p. ej., en portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser estériles, p. ej., filtradas, y colocadas en formas de dosificación mediante liofilización en viales de dosificación o almacenadas en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión que no se unen al complemento.

Se puede realizar el escrutinio de ligandos utilizando DTLR o sus fragmentos para identificar las moléculas que tienen afinidad de unión con los receptores. Después se pueden utilizar análisis biológicos para determinar si un supuesto ligando puede proporcionar una unión competitiva, que pueda bloquear la actividad estimuladora intrínseca. Se pueden utilizar fragmentos receptores como bloqueador o antagonista ya que éste bloquea la actividad del ligando. Del mismo modo, un compuesto que tiene actividad estimuladora intrínseca puede activar el receptor y de este modo es un agonista ya que estimula la actividad del ligando, p. ej., induciendo la señalización.

Adicionalmente se contempla el uso terapéutico de anticuerpos para los DTLR como antagonistas.

Las cantidades de reactivos necesarias para la terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo los métodos de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. De este modo, las dosis de tratamiento deben ser tituladas para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar unas pautas útiles en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo en animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos concretos proporcionará una indicación predictiva adicional de la dosificación en seres humanos. Se describen diferentes consideraciones, p. ej., Gilman, et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8^{a} Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, (edición actual), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia. Los métodos para la administración son discutidos allí y más abajo, p. ej., para la administración oral, intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular, la difusión transdérmica, y otros. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones, y otros compuestos descritos, p. ej., en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, Nueva Jersey. Debido a la afinidad de unión probablemente elevada, o a los números de recambio, entre un supuesto ligando y sus receptores, se esperaría inicialmente que fueran eficaces dosis bajas de estos reactivos. Y la ruta de señalización sugiere que pueden tener efecto cantidades extremadamente bajas de ligando. De este modo, cabría esperar normalmente que los intervalos de dosificación estuvieran en cantidades menores que concentraciones 1 mM, típicamente concentraciones menores de aproximadamente 10 \muM, normalmente menores de aproximadamente 100 nM, preferiblemente menores de aproximadamente 10 pM (picomolar), y muy preferiblemente menores de aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un portador apropiado. A menudo se utilizarán formulaciones de liberación lenta, o aparatos de liberación lenta para la administración continua.

Los DTLR, sus fragmentos, y los anticuerpos o sus fragmentos, antagonistas, y agonistas, pueden ser administrados directamente al anfitrión que se va a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos con proteínas portadoras tales como ovoalbúmina o albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en cualquier formulación de dosificación convencional. Si bien es posible administrar solo el ingrediente activo, es preferible presentarlo en forma de una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden al menos un ingrediente activo, como se ha definido antes, junto con uno o más portadores aceptables del mismo. Cada portador debe ser farmacéuticamente y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden ser convenientemente presentadas en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Véase, p. ej., Gilman, et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences (edición actual), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; y Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La terapia de esta invención puede ser combinada o utilizada asociada con otros agentes terapéuticos, concretamente agonistas o antagonistas de otros miembros de la familia de IL-1.

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IX. Ligandos

La descripción de los receptores Toll en la presente memoria proporciona medios para identificar ligandos, como se ha descrito antes. Semejante ligando se debería unir específicamente al respectivo receptor con una afinidad razonablemente elevada. Se encuentran disponibles diferentes constructos que permiten cualquier marcaje del receptor para detectar su ligando. Por ejemplo, el marcaje directo de DTLR, fusionando sobre él marcadores para el marcaje secundario, p. ej., FLAG u otras etiquetas epitópicas, etc., permitirá la detección del receptor. Este puede ser histológico, como un método de afinidad para la purificación bioquímica, o un marcaje o selección en un enfoque de clonación de la expresión. También se puede aplicar un sistema de selección de dos híbridos elaborando los constructos apropiados con las secuencias de DTLR disponibles. Véase, p. ej., Fields y Song (1989) Nature 340:245-246.

Generalmente, las descripciones de los DTLR serán aplicables análogamente a realizaciones específicas individuales dirigidas a reactivos y composiciones de DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, y/o DTLR10.

El amplio alcance de esta invención se comprende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten las invenciones a las realizaciones específicas.

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Ejemplos I. Métodos Generales

Algunos de los métodos convencionales son descritos o referidos, p. ej., por Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2^{a} ed.), vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York. Los métodos para la purificación de proteína incluyen métodos tales como la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía en columna, la electroforesis, la centrifugación, la cristalización, y otros. Véanse, p. ej., Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Coligan, et al. (ed. 1996) y suplementos periódicos, Current Protocols In Protein Science Greene/Wiley, Nueva York; Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes de esta serie; y las publicaciones de los fabricantes sobre el uso de los productos de purificación de proteínas, p. ej., Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión con segmentos apropiados, p. ej., a una secuencia FLAG o una equivalente que puede ser fusionada a través de una secuencia separable con proteasa. Véase, p. ej., Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, et al. (1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Las técnicas y análisis inmunológicos convencionales son descritos, p. ej., por Hertzenberg, et al. (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology volúmenes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, y 163.

Los análisis de las actividades biológicas vasculares son bien conocidos en la técnica. Abarcan tanto las actividades angiogénicas como angiostáticas en tumores, u otros tejidos, p. ej., proliferación de la musculatura lisa arterial (véase, p. ej., Koyoma, et al. (1996) Cell 87:1069-1078), la adherencia de monocitos al epitelio vascular (véase McEvoy, et al. (1997) J. Exp. Med. 185:2069-2077), etc. Véanse también Ross (1993) Nature 362:801-809; Rekhter y Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147:668-677; Thyberg, et al. (1990) Atherosclerosis 10:966-990; y Gumbiner (1996) Cell 84:345-357.

Los análisis de las actividades biológicas de las células neurales son descritas, p. ej., por Wouterlood (ed. 1995) en Neuroscience Protocols Modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; y Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. La metodología de los sistemas evolutivos son descritos, p. ej., por Meisami (ed.) en Handbook of Human Growth and Developmental iology CRC Press; y Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.

El análisis de secuencias por ordenador se realiza, p. ej., utilizando los programas de soporte lógico disponibles, incluyendo los de GCG (U. Wisconsin) y las fuentes de GenBank. Asimismo se utilizaron bases de datos de secuencias públicas, p. ej., de GenBank, NCBI, EMBO, y otras.

Muchas técnicas aplicables a los receptores de IL-10 pueden ser aplicadas a los DTLR, como se describe, p. ej., en el documento USSN 08/110.683 (receptor de IL-10), que se incorpora en la presente memoria como referencia para todos los fines.

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II. Familia Novedosa de Receptores Humanos

Abreviaturas: DTLR, receptor de tipo Toll; IL-1R, receptor de interleuquina-1; TH, homología Toll; LRR, repetición rica en leucina; EST, etiqueta de secuencia expresada; STS, sitio de secuencia etiquetada; FISH, hibridación fluorescente in situ.

El descubrimiento de la homología de secuencia entre los dominios citoplásmicos de los receptores Toll de Drosophila y de interleuquina-1 (IL-1) humana ha sembrado la convicción de que ambas moléculas desencadenan rutas de señalización relacionadas vinculadas a la translocación nuclear de los factores de transcripción de tipo Rel. Este esquema de señalización conservado determina una respuesta inmunitaria evolutivamente ancestral tanto en insectos como en vertebrados. Los autores de la presente invención informan sobre la clonación molecular de una clase novedosa de supuestos receptores humanos con una arquitectura proteica que es muy similar a Toll de Drosophila tanto en segmentos intra- como extra-celulares. Cinco receptores de tipo Toll humanos, denominados DTLR 1-5, son probablemente los homólogos directos de la molécula de la mosca, y como tales constituyen un componente importante y no reconocido de la inmunidad innata en seres humanos; fascinantemente, la conservación evolutiva de los DTLR en vertebrados puede indicar otro papel, semejante al de Toll en la dorso-ventralización del embrión de Drosophila, como reguladores de la formación de patrones morfogenéticos tempranos. Las transferencias de ARNm de múltiples tejidos indican patrones de expresión marcadamente diferentes para los DTLR humanos. Utilizando los análisis las bases de datos de hibridación fluorescente in situ y del Sitio de Secuencia Etiquetada, los autores de la presente invención también demuestran que los genes de DTLR cognados residen en los cromosomas 4 (DTLR 1, 2, y 3), 9 (DTLR4), y 1 (DTLR5). La predicción de la estructura de los dominios de homología Toll (TH) alineados de DTLR de insectos variados y seres humanos, receptores de IL-1 de vertebrados, y factores MyD88, y proteínas de resistencia a enfermedades de plantas, reconoce un plegamiento \beta/\alpha paralelo con un sitio activo ácido; una estructura notablemente similar se repite en una clase de reguladores de la respuesta ampliamente implicados en la transducción de la información sensorial en bacterias.

Las semillas del abismo morfogenético que separa de manera espectacular las moscas de los seres humanos están plantadas en las formas y patrones embrionarios familiares, pero dan lugar a complejidades celulares muy diferentes. DeRobertis y Sasai (1996) Nature 380:37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21. Esta divergencia de planes evolutivos entre insectos y vertebrados está coreografiada por rutas de señalización extraordinariamente similares, subrayando una mayor conservación de las redes de proteínas y de los mecanismos bioquímicos de repertorios génicos desiguales. Miklos y Rubin (1996) Cell 86:521-529; y Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33. Un modo potente de registrar gráficamente el diseño evolutivo de estas rutas reguladoras es deduciendo sus componentes moleculares probables (y funciones biológicas) por medio de la comparación interespecie de las secuencias y las estructuras de las proteínas. Miklos y Rubin (1996) Cell 86:521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33 (3-5); y Banfi, et al. (1996) Nature Genet. 13:167-174.

Una etapa universalmente crítica en el desarrollo embrionario es la especificación de los ejes corporales, ya sea procedentes de asimetrías innatas ya sea desencadenados por indicaciones externas. DeRobertis y Sasai (1996) Nature 380:37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21. Como sistema modelo, se ha centrado una atención particular sobre la base filogenética y los mecanismos celulares de polarización dorsoventral. DeRobertis y Sasai (1996) Nature 380:37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21. Ha surgido una estrategia molecular prototipo para esta transformación del embrión de Drosophila, donde la acción sucesiva de un pequeño número de genes da como resultado un gradiente de ventralización del factor de transcripción Dorsal. St. Johnston y Nüsslein-Volhard (19.92) Cell 68:201-219; y Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399.

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Esta ruta de señalización se centra en Toll, un receptor transmembrana que transduce la unión de un factor ventral secretado maternamente, Spätzle, al engranaje citoplásmico de Tube, una molécula accesoria, y la activación de Pelle, una Ser/Thr quinasa que cataliza la disociación de Dorsal desde el Cactus inhibidor y permite la migración de Dorsal a los núcleos ventrales (Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399; y Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416. La ruta de Toll también controla la inducción de factores antimicrobianos potentes en la mosca adulta (Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983); este papel en la defensa inmunitaria de Drosophila fortalece los paralelismos mecánicos con las rutas de la IL-1 que determinan una gran cantidad de respuestas inmunitarias e inflamatorias en vertebrados. Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; y Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771. Un dominio citoplásmico relacionado con Toll en los receptores de IL-1 dirige la unión de una quinasa de tipo Pelle, IRAK, y la activación de un complejo NF-\kappaB/I-\kappaB latente que refleja el abrazo de Dorsal y Cactus. Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; y Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771.

Los autores de la presente invención describen la clonación y la caracterización molecular de cuatro nuevas moléculas de tipo Toll en seres humanos, denominadas DTLR 2-5 (siguiendo Chiang & Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239), que revelan una familia de receptores más íntimamente vinculada a homólogos Toll de Drosophila que a receptores de IL-1 de vertebrados. Las secuencias de DTLR derivan de EST humanas; estos ADNc parciales fueron utilizados para dibujar los perfiles de expresión completos en tejidos humanos para los cinco DTLR, mapear las localizaciones cromosómicas de genes cognados, y restringir la elección de genotecas de ADNc para recuperaciones de ADNc completos. Espoleados por otros esfuerzos (Banfi, et al. (1996) Nature Genet. 13:167-174; y Wang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4468-4476), los autores de la presente invención están recopilando, mediante conservación estructural y parquedad molecular, un sistema biológico en seres humanos que es la contraparte de un esquema regulador convincente en Drosophila. Además, se sugiere un mecanismo bioquímico que hace funcionar la señalización Toll por medio del plegamiento terciario propuesto del dominio de homología Toll (TH), un módulo central compartido por los DTLR, una amplia familia de receptores de IL-1, factores MyD88 de mamífero y proteínas de resistencia a enfermedades de plantas. Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783; y Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475. Los autores de la presente invención proponen que una ruta de señalización que acopla la morfogénesis y la inmunidad primitiva en insectos, plantas, y animales (Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; y Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178) puede tener raíces en rutas bacterianas de dos componentes.

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Análisis Computacional

Las secuencias humanas relacionadas con los DTLR de insecto fueron identificadas a partir de la base de datos de EST (dbEST) en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando el servidor BLAST (Altschul, et al. (1994) Nature Genet. 6:119-129). Se utilizaron métodos basados en patrones y perfiles más sensibles (Bork y Gibson (1996) Meth. Enzymol. 266:162-184) para aislar los dominios de señalización de la familia de DTLR que son compartidos con proteínas de vertebrados y plantas en bases de datos no redundantes. El alineamiento progresivo de las secuencias de los dominios intra- o extracelulares de DTLR se llevó a cabo por medio de ClustalW (Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680); este programa también calculó el orden de ramificación de las secuencias alineadas mediante el algoritmo Neighbor-Joining algorithm (5000 replicaciones "bootstrap" proporcionaron valores de confianza para los tres agrupamientos).

Los patrones de alineamiento conservados, distinguidos a diferentes grados de restricción, fueron dibujados por el programa Consensus (internet URL http://www.bork.embl-heidelberg.de/Alignment/consensus.html). La genoteca PRINTS de huellas de proteínas (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRINTS.html) (Attwood, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:212-217) identificaron de forma fidedigna la miríada de repeticiones ricas en leucina (LRR) presentes en los segmentos extracelulares de los DTLR con un motivo compuesto (PRINTS codifica Leurichrpt) que empareja flexiblemente los rasgos N- y C-terminales de las LRR divergentes. Se utilizaron dos algoritmos de predicción cuya precisión en tres estados está por encima de 72% para obtener una estructura secundaria consenso para el alineamiento de dominios intracelulares, como puente para los esfuerzos de reconocimiento del plegamiento (Fischer, et al. (1996) FASEB J. 10:126-136). Tanto el programa de la red neural PHD (Rost y Sander (1994) Proteins 19:55-72) como el método de predicción estadística DSC (King y Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310) tienen servidores de internet (URLs http://www.embl-heidelberg.de/predictproteína/phd_pred.html y http://bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc_read_align.html, respectivamente). La región intracelular codifica la región THD comentada, p. ej., por Hardiman, et al. (1996) en Oncogene 13:2467-2475; y Rock, et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:588-593, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia. Este dominio es muy importante en el mecanismo de señalización por los receptores, que transfiere un grupo fosfato a un sustrato.

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Clonación de ADNc de DTLR humanos completos

Se utilizaron los cebadores de PCR obtenidos de la secuencia Humrsc786 de tipo Toll (código de acceso Genbank D13637) (Nomura, et al. (1994) DNA Res 1:27-35) para sondear una genoteca de ADNc derivado de la línea celular TF-1 eritroleucémica humana (Kitamura, et al. (1989) Blood 73:375-380) para proporcionar la secuencia de ADNc de DTLR1. Las secuencias de DTLR restantes se marcaron a partir de dbEST, y se obtuvieron los clones EST relevantes del consorcio I.M.A.G.E. (Lennon, et al. (1996) Genomics 33:151-152) por medio de Research Genetics (Huntsville, AL): Núms. ID Clones 80633 y 117262 (DTLR2), 144675 (DTLR3), 202057 (DTLR4) y 277229 (DTLR5). Los ADNc completos para los DTLR 2-4 humanos se clonaron mediante escrutinio por hibridación de ADN de genotecas 5'-Stretch Plus (Clontech) del fago \lambdagt10, de pulmón adulto humano, de placenta, y de hígado fetal, respectivamente; la secuencia de DTLR5 se obtiene de una EST de una placa de esclerosis múltiple humana. Todos los clones positivos se secuenciaron y se alinearon para identificar los ORF de los DTLR individuales: DTLR1 (clon de 2366 pb, 786 aa ORF), DTLR2 (2600 pb, 784 aa), DTLR3 (3029 pb, 904 aa), DTLR4 (3811 pb, 879 aa) y DTLR5 (1275 pb, 370 aa). Las sondas para las hibridaciones de DTLR3 y DTLR4 fueron generadas mediante PCR utilizando genotecas de ADNc de placenta humana (Stratagene) e hígado adulto (Clontech) como moldes, respectivamente; los pares de cebadores se obtuvieron de las respectivas secuencias de EST. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando ADN polimerasa Taqplus de T. aquaticus (Stratagene) en las siguientes condiciones: 1 x (94ºC, 2 min) 30 x (55ºC, 20 seg; 72ºC 30 seg; 94ºC 20 seg), 1 x (72ºC, 8 min). Para el escrutinio de ADNc completo de DTLR2, se utilizó un fragmento de 900 pb generado mediante digestión con EcoRI/XbaI del primer clon EST (Núm. ID 80633) como sonda.

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Transferencias de ARNm y localización cromosómica

Se adquirieron tejido múltiple humano (Núm. Cat. 1, 2) y transferencias de líneas celulares cancerosas (Núm. Cat. 7757-1), que contenían aproximadamente 2 \mug de ARN poli(A)^{+} por calle, de Clontech (Palo Alto, CA). Para los DTLR 1-4, los ADNc completos aislados sirvieron como sondas, para DTLR5 se utilizó el inserto del plásmido del clon EST (Núm. ID 277229). En resumen, las sondas fueron radiomarcadas con dATP [\alpha-P^{32}] utilizando el kit de marcaje de cebadores al azar Amersham Rediprime (RPN1633). Se realizaron la prehibridación y las hibridaciones a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,5M, SDS al 7%, EDTA 0,5 M (pH 8,0). Todos los lavados restrictivos se realizaron a 65ºC con dos lavados iniciales en 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 40 min seguido de un lavado posterior en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% durante 20 min. Después las membranas se expusieron a -70ºC a película de Rayos X (Kodak) en presencia de pantallas intensificadoras. Se realizaron estudios más detallados mediante método Southern de genotecas de ADNc (14) con clones de DTLR humanos seleccionados para examinar su expresión en subgrupos de células hematopoyéticas.

El mapeo cromosómico humano se llevó a cabo mediante el método de hibridación fluorescente in situ (FISH) como describen Heng y Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33:109-122, utilizando diferentes clones de ADNc completos (DTLR 2-4) o parciales (DTLR5) como sondas. Estos análisis se realizaron como un servicio por SeeDNA Biotech Inc. (Ontario, Canadá). Se realizó una búsqueda de síndromes humanos (o defectos en ratones en loci sinténicos) asociados con los genes DTLR mapeados en la Dysmorphic Human-Mouse Homology Database mediante el servidor de internet (http://www.hgmp.mrc.ac:uk/DHMHD/hum_chrome1.htm1).

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Arquitectura conservada de ectodominios de DTLR de insectos y seres humanos

La familia Toll en Drosophila comprende al menos cuatro productos génicos distintos: Toll, el receptor prototipo implicado en la formación de patrones dorsoventrales del embrión de la mosca (Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399) y un segundo denominado "18 Wheeler" (18w) que también puede estar implicado en el desarrollo embrionario temprano (Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899); dos receptores adicionales son pronosticados por los ORF de tipo Toll, incompletos aguas abajo del locus del transcrito específico del macho (Mst) (código Genbank X67703) o codificados por el "sitio de secuencia etiquetada" (STS) Dm2245 (código Genbank G01378) (Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783). Los segmentos extracelulares de Toll y 18w están compuestos inconfundiblemente por motivos LRR de \sim24 aminoácidos, imperfectos (Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; y Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899). Disposiciones similares en tándem de las LRR forman comúnmente las antenas adherentes de moléculas de la superficie celular variadas y se presume que su estructura terciaria genérica imita un armazón en forma de herradura de un plegamiento inhibidor de la ribonucleasa, donde diecisiete LRR muestran un motivo de 28 restos, en horquilla \beta/\alpha repetitiva (Buchanan y Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65:1-44). El reconocimiento específico de Spätzle por Toll puede seguir un modelo propuesto para la unión de hormonas de glicoproteína con un plegamiento en nudo de cistina por ectodominios multi-LRR de receptores de serpentina, utilizando el lado cóncavo de la lámina \beta curvada (Kaj ava, et al. (1995) Structure 3:867-877); fascinantemente, el patrón de cisteínas en Spätzle, y un ligando orfano de Drosophila, Trunk, pronostica una estructura terciaria en nudo de cistina similar (Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; y Casanova, et al. (1995) Genes Develop. 9:2539-2544).

Los ectodominios 22 y 31 LRR de Toll y 18w, respectivamente (el fragmento ORF de Mst presenta 16 LRR), están muy íntimamente relacionados con las disposiciones de 18, 19, 24, y 22 LRR comparables de los DTLR 1-4 (la cadena de DTLR5 incompleta incluye en este momento cuatro LRR próximos a la membrana) mediante análisis de la secuencia y del patrón (Altschul, et al. (1994) Nature Genet. 6:119-129; y Bork y Gibson (1996) Meth. Enzymol. 266:162-184) (Fig. 1). No obstante, una diferencia sorprendente en las cadenas de los DTLR humanos es la pérdida común de una región rica en cisteína de \sim90 restos que está embebida variablemente en los ectodominios de Toll, 18w y el ORF de Mst (distanciado cuatro, seis y dos LRR, respectivamente, del límite de la membrana). Estas agrupaciones de cisteína son bipartitas, con mitades "superior" (terminando una LRR) e "inferior" (apiladas en lo alto de una LRR) distintas (Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899; y Buchanan y Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65:1-44); el módulo "superior" se repite en los DTLR de Drosophila y de ser humano en forma de espaciador yuxtamembrana conservado (Fig. 1). Los autores de la presente invención sugieren que las agrupaciones de cisteína localizadas flexiblemente en los receptores de Drosophila (y otras proteínas con LRR), cuando se igualan la parte "superior" con la "inferior", forman un módulo compacto con extremos emparejados que puede ser insertado entre cualquier par de LRR sin alterar el plegamiento global de los ectodominios de DTLR; dominios "extrudidos" análogos decoran las estructuras de otras proteínas (Russell (1994) Protein Engin. 7:1407-1410).

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Diseño molecular del dominio de señalización TH

La comparación de la secuencia de los receptores Toll e IL-1 de tipo I (IL-1R1) ha descrito una semejanza distante de un dominio citoplásmico de \sim200 aminoácidos que presumiblemente media la señalización por los factores de transcripción de tipo Rel similares. Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; y (Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol, 12:393-416; y Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771). Las adiciones más recientes a este paradigma funcional incluyen un par de proteínas de resistencia a enfermedades de plantas de tabaco y lino que muestran un módulo TH N-terminal seguido de segmentos de unión a nucleótidos (NTPasa) y LRR (Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178); en contraste, un "dominio de muerte" precede a la cadena TH de MyD88, un marcador de diferenciación mieloide intracelular (Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783; y Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475) (Fig. 1). Los nuevos receptores de tipo IL-1 incluyen IL-1R3, una molécula de señalización accesoria, y receptores de orfano IL-1R4 (también denominados ST2/Fit-1/T1), IL-1R5 (proteína relacionada con IL-1R), e IL-1R6 (proteína 2 relacionada con IL-1R) (Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:5777-5783; Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475). Con las nuevas secuencias de los DTLR humanos, los autores de la presente invención han tratado de encontrar una definición estructural de hilo evolutivo analizando la conformación del módulo TH común: diez bloques de secuencia conservada que comprende 128 aminoácidos forman el pliegue del dominio TH mínimo; los espacios en el alineamiento marcan la localización probable de la secuencia y los bucles de longitud variable (Fig. 2a).

Dos algoritmos de predicción que sacan ventaja de los patrones de conservación y variación en secuencias de alineamiento múltiple, PHD (Rost y Sander (1994) Proteins 19:55-72) y DSC (King y Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310), produjeron resultados fuertemente concordantes para el módulo de señalización TH (Fig. 2a). Cada bloque contiene un elemento estructural secundario discreto: la huella de hebras \beta alternantes (marcadas como A-E) y hélices \alpha (numeradas de 1-5) es el diagnóstico de un plegamiento de clase \beta/\alpha con hélices \alpha en ambas caras de una lámina \beta paralela. Se prevé que las hebras \beta hidrofóbicas A, C y D forman duelas "interiores" en la lámina \beta, mientras las hebras \beta anfipáticas B y E, más cortas se asemejan a unidades "borde" típicas (Fig. 2a). Esta asignación coincide con un orden de hebras B-A-C-D-E en la lámina \beta núcleo (Fig. 2b); los programas de comparación del pliegue ("mapeo") y reconocimiento ("enhebrado") (Fischer, et al. (1996) FASEB J. 10:126-136) devuelven fuertemente esta topología \beta/\alpha doblemente enrollada. Una predicción funcional, sorprendente de esta estructura esbozada para el dominio TH es que muchos de los restos cargados, conservados en el alineamiento múltiple se mapean en el extremo C-terminal de la lámina \beta: resto Asp16 (esquema de numeración de bloques - Fig. 2a) en el extremo de \betaA, Arg39 y Asp40 siguientes a \betaB, Glu75 en la primera vuelta de \alpha3, y los restos Glu/Asp conservados más libremente en el bucle \betaD-\alpha4, o después de \betaE (Fig. 2a). La localización de otros cuatro restos conservados (Asp7, Glu28, y el par Arg57-Arg/Lys58) es compatible con una red de puentes salinos en el extremo N-terminal opuesto de la lámina \beta (Fig. 2a).

La función de señalización depende de la integridad estructural del dominio TH. Se han catalogado mutaciones o deleciones inactivantes en los límites del módulo (Fig. 2a) para IL-1R1 y Toll. Heguy, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2605-2609; Croston, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:16514-16517; Schneider, et al. (1991) Genes Develop. 5:797-807; Norris y Manley. (1992) Genes Develop. 6:1654-1667; Norris y Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; y Norris y Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872. Las cadenas de los DTLR 1-5 humanos que se extienden más allá del dominio TH mínimo (longitudes de 8, 0, 6, 22 y 18 restos, respectivamente) son muy similares a la "cola" de 4 aa, roma del ORF de Mst. Toll y 18w presentan colas de 102 y 207 restos no relacionadas (Fig. 2a) que pueden regular negativamente la señalización de los dominios TH fusionados. Norris y Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; y Norris y Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872.

La relación evolutiva entre las proteínas dispares que portan el dominio TH puede ser discernida mejor por medio del árbol filogenético derivado del alineamiento múltiple (Fig. 3). Cuatro ramas principales segregan las proteínas de plantas, los factores MyD88, los receptores de IL-1 y las moléculas de tipo Toll; la última rama agrupa los DTLR de Drosophila y humanos.

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Dispersión cromosómica de genes de DTLR humanos

Con el fin de investigar la conexión genética de la familia de genes de los DTLR humanos naciente, los autores de la presente invención mapearon los loci cromosómicos de cuatro de los cinco genes mediante FISH (Fig. 4). El gen de DTLR1 ha sido previamente registrado gráficamente mediante el proyecto genoma humano: existe un locus de la base de datos STS (número de acceso dbSTS G06709, correspondiente a STS WI-7804 o SHGC-12827) para el ADNc Humrsc786 (Nomura, et al. (1994) DNA Res 1:27-35) y fija el gen en el intervalo del marcador del cromosoma 4 D4S1587-D42405 (50-56 cM) hacia 4p14. Esta asignación ha sido corroborada recientemente mediante análisis FISH. Taguchi, et al. (1996) Genomics 32:486-488. En el presente trabajo, los autores de la presente invención asignan los genes de DTLR restantes a loci sobre el cromosoma 4q32 (DTLR2), 4q35 (DTLR3), 9q32-33 (DTLR4) y 1q33.3 (DTLR5). Durante el transcurso de este trabajo, se ha generado una STS para la EST de DTLR2 de origen (Núm. ID clon 80633) (número de acceso dbSTS T57791 para STS SHGC-33147) y se mapea en el intervalo del marcador del cromosoma 4 D4S424-D4S1548 (143-153 cM) en 4q32 - de acuerdo con los descubrimientos de los autores de la presente invención. Existe un espacio de \sim50 cM entre los genes DTLR2 y DTLR3 sobre el brazo largo del cromosoma 4.

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Los genes DTLR son expresados diferencialmente

Tanto Toll como 18w tienen patrones de expresión espaciales y temporales complejos en Drosophila que pueden apuntar a funciones más allá de la formación de patrones embrionarios. St. Johnston y Nusslein-Volhard (1992) Cell 68:201-219; Morisato y Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29:371-399; Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; Chiang y Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239; y Eldon, et al. (1994) Develop. 120:885-899. Los autores de la presente invención han examinado la distribución espacial de los transcritos de DTLR mediante análisis de transferencia de ARNm que variaban las líneas celulares de tejidos humanos y cancerosas utilizando ADNc radiomarcados (Fig. 5). Se ha encontrado que DTLR1 es expresado ubicuamente, y a niveles más altos que los otros receptores. Reflejando presumiblemente el empalme alternativo, las formas del transcrito de DTLR1 "cortas" 3,0 kB y "largas" 8,0 kB están presentes en ovario y bazo, respectivamente (Fig. 5, paneles A y B). Un panel de ARNm de células cancerosas también muestra una expresión al alza destacada en una línea celular Raji de Linfoma de Burkitt (Fig. 5, panel C). El ARNm de DTLR2 es expresado menos ampliamente que el de DTLR1, con una especie de 4,0 kB detectada en pulmón y un transcrito de 4,4 kB evidente en corazón, cerebro y músculo. El patrón de distribución en el tejido de DTLR3 repite el de DTLR2 (Fig. 5, panel E). El DTLR3 también está presente en forma de dos transcritos principales de un tamaño de aproximadamente 4,0 y 6,0 kB, y los niveles más altos de expresión se observan en placenta y páncreas. En contraste, los mensajes de DTLR4 y DTLR5 parecen ser extremadamente específicos del tejido. Se detectó DTLR4 solamente en placenta como un único transcrito de un tamaño de -7,0 kB. Se observó una señal débil de 4,0 kB para DTLR5 en ovario y monocitos de sangre periférica.

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Componentes de un sistema regulador evolutivamente ancestral

Los planos moleculares originales y los destinos divergentes de las rutas de señalización pueden ser reconstruidos mediante enfoques genómicos comparativos. Miklos y Rubin (1996) Cell 86:521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33; Banfi, et al. (1996) Nature Genet. 13:167-174; y Wang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4468-4476. Los autores de la presente invención han utilizado esta lógica para identificar una familia de genes emergentes en seres humanos, que codifican, en este momento cinco parálogos de receptores, los DTLR 1-5, que son contrapartes evolutivas directas de una familia de genes de Drosophila encabezada por Toll (Figs. 1-3). La arquitectura conservada de los DTLR humanos y de mosca, los ectodominios LRR conservados y los módulos TH intracelulares (Fig. 1), da a entender que la ruta robusta acoplada a Toll en Drosophila (6, 7) sobrevive en vertebrados. La mejor evidencia se toma prestada de una ruta reiterada: el sistema de la IL-1 múltiple y su repertorio de dominios TH fusionados a receptores, IRAK, NF-\kappaB y homólogos de I-\kappaB (Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771; Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475; y Cao, et al. (1996) Science 271:1128-1131); también se ha caracterizado un factor de tipo Tube. No se sabe si los DTLR se pueden acoplar productivamente a la maquinaria de señalización de IL-1R, o en lugar de eso, se utiliza un grupo paralelo de proteínas. A diferencia de los receptores de IL-1, se prevé que el armazón de LRR de los DTLR humanos conserve una afinidad para los factores con nudo de cistina relacionados con Spätzle/Trunk; se han aislado ligandos de DTLR candidato (denominados PEN) que se ajustan a este molde.

Los mecanismos bioquímicos de transducción de la señal pueden ser evaluados mediante la conservación de los pliegues de la proteína interaccionante en una ruta. Miklos y Rubin (1996) Cell 86:521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33. En este momento, el paradigma de la señalización Toll implica algunas moléculas cuyos papeles están estrechamente definidos por sus estructuras, acciones o destinos: Pelle es una Ser/Thr quinasa (fosforilación), Dorsal es un factor de transcripción de tipo NF-\kappaB (unión al ADN) y Cactus es un inhibidor de la repetición de ankirina (unión a Dorsal, degradación). Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416. En contraste, las funciones del dominio TH y Tube de Toll siguen siendo un enigma. Como otros receptores de citoquina (Heldin (1995) Cell 80:213-223), la dimerización mediada por ligando de Toll parece ser un evento desencadenante: las cisteínas libres en la región de la yuxtamembrana de Toll crean pares de receptores constitutivamente activos (Schneider, et al. (1991) Genes Develop. 5:797-807), y los receptores Torso-Toll quiméricos señalizan en forma de dímeros (Galindo, et al. (1995) Develop. 121:2209-2218); con todo, los truncamientos severos o la pérdida al por mayor del ectodominio Toll producen una señalización intracelular promiscua (Norris y Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; y Winans y Hashimoto (1995) Molec. Biol, Cell 6:587-596), reminiscente de los receptores oncogénicos con dominios catalíticos (Heldin (1995) Cell 80:213-223). Tube está localizado en la membrana, participa en el dominio N-terminal (muerte) de Pelle y está fosforilado, pero ninguna de las interacciones Toll-Tube o Toll-Pelle son registradas por el análisis de dos híbridos (Galindo, et al. (1995) Develop. 12.1:2209-2218; y Großhans, et al. (1994) Nature 372:563-566); esto último sugiere que el "estado" conformacional del dominio TH de Toll afecta de algún modo al reclutamiento del factor. Norris y Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872; y Galindo, et al. (1995) Develop. 121:2209-2218.

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En el corazón de estas desconcertantes cuestiones está la naturaleza estructural del módulo TH de Toll. Para estudiar esta cuestión, los autores de la presente invención se han aprovechado de la diversidad evolutiva de las secuencias de TH de insectos, plantas y vertebrados, que incorporan las cadenas de DTLR humanas, y han extraído el núcleo de la proteína conservada, mínima para la predicción de la estructura y el reconocimiento del plegamiento (Fig. 2). El plegamiento del dominio TH (\beta/\alpha)_{5} fuertemente pronosticado con su agrupación asimétrica de restos ácidos es topológicamente idéntico a las estructuras de los reguladores de la respuesta en las rutas de señalización bacteriana de dos componentes (Volz (1993) Biochemistry 32:11741-11753; y Parkinson (1993) Cell 73:857-871) (Fig. 2). El regulador de la quimiotaxis prototipo CheY se une transitoriamente a un catión divalente en un "bolsillo de aspartato" en el extremo C de la lámina \beta núcleo; este catión proporciona estabilidad electrostática y facilita la fosforilación activadora de un Asp invariante. Volz (1993) Biochemistry 32:11741-11753. Del mismo modo, el dominio TH puede capturar cationes en su nido ácido, pero la activación, y la señalización aguas abajo, podría depender de la unión específica de un radical cargado negativamente: los ligandos aniónicos pueden superar potenciales en el sitio de unión intensamente negativos encerrándose en redes de enlaces de hidrógeno precisas. Ledvina, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6786-6791. Fascinantemente, el dominio DH puede no actuar simplemente como andamiaje pasivo para el ensamblaje de un complejo Tube/Pelle para Toll, o sistemas homólogos en plantas y vertebrados, en lugar de ello participa activamente como un verdadero disparador conformacional en la maquinaria de transducción de la señal. Quizás explicando la unión condicional de un complejo Tube/Pelle, la dimerización de Toll podría promover el desenmascaramiento, por medio de colas de receptores reguladores (Norris y Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; Norris y Manley (1996) Genes Develop. 10:862-872), o la unión por medio de activadores de molécula pequeña del bolsillo TH. No obstante, los módulos TH "libres" dentro de la célula (Norris y Manley (1995) Genes Develop. 9:358-369; Winans y Hashimoto (1995) Molec. Biol. Cell 6:587-596) podrían actuar como disparadores de tipo CheY catalíticos activando y acoplándose con complejos Tube/Pelle errantes.

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Receptores Morfogenéticos y defensa inmunitaria

La conexión evolutiva entre los sistemas inmunitarios de insectos y vertebrados está impresa en el ADN: los genes que codifican los factores antimicrobianos en insectos presentan motivos aguas arriba similares a los elementos de respuesta en fase aguda que se sabe que se unen a los factores de transcripción NF-\kappaB en mamíferos. Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183. Dorsal, y dos factores relacionados con Dorsal, Dif y Relish, ayudan a inducir estas proteínas de defensa después de la sensibilización bacteriana (Reichhart, et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316:1218-1224; Ip, et al. (1993) Cell 75:753-763; y Dushay, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10343-10347); Toll, u otros DTLR, modulan de un modo similar estas respuestas inmunitarias rápidas en Drosophila adulta (Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; y Rosetto, et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:111-116). Estos paralelismos mecánicos con la respuesta inflamatoria de IL-1 en vertebrados son la evidencia de la versatilidad funcional de la ruta de señalización de Toll, y sugieren una sinergia ancestral entre la formación del patrón embrionario y la inmunidad innata (Belvin y Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416; Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983; Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4:767-771; Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178; Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183; Reichhart, et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316:1218-1224; Ip, et al. (1993) Cell 75:753-763; Dushay, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10343-10347; Rosetto, et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Common. 209:111-116; Medzhitov y Janeway (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:4-9; y Medzhitov y Janeway (1997) Curr, Opin. Immunol. 9:4-9). La homología más próxima de las proteínas DTLR de insectos y humanas sugiere un solapamiento aún más fuerte de las funciones biológicas que remplaza los paralelismos puramente inmunitarios para los sistemas de IL-1, y presta reguladores moleculares potenciales para las transformaciones dorso-ventrales y otras de los embriones de
vertebrados. DeRobertis y Sasai (1996) Nature 380:37-40; y Arendt y Nübler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21.

La presente descripción de una familia de receptores robusta, emergente en seres humanos refleja el reciente descubrimiento de los receptores Frizzled de vertebrados para los factores de formación de patrones Wnt. Wang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4468-4476. Puesto que otros numerosos sistemas receptores de citoquina juegan papeles en el desarrollo temprano (Lemaire y Kodjabachian (1996) Trends Genet. 12:525-531), quizás los distintos contextos celulares de los embriones compactos y los adultos desgarbados simplemente dan como resultado rutas de señalización familiares y sus disparadores difundibles tienen diferentes resultados biológicos en diferentes momentos, p. ej., morfogénesis versus defensa inmunitaria para los DTLR. Para los sistemas relacionados con Toll de insectos, plantas, y seres humanos (Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13:2467-2475; Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178), estas señales cursan a través de un dominio TH regulador que se asemeja fascinantemente a una máquina de transducción bacteriana (Parkinson (1993) Cell 73:857-871).

En particular, el DTLR6 muestra rasgos estructurales que establecen su pertenencia a la familia. Por otra parte, los miembros de la familia han sido implicados en numerosas enfermedades evolutivas significativas y con función del sistema inmunitario innato. En particular, el DTLR6 ha sido mapeado en el cromosoma X en una localización que es un punto caliente para las principales anomalías evolutivas. Véase, p. ej., The Sanger Center: sitio en la red para el cromosoma X humano http://www.sanger-ac.uk/HGP/ChrX/index.shtml; y el sitio de la red Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing http://gc.bcm.tmc.edu:8088/cgi-bin/seq/home.

El número de acceso para el PAC depositado es AC003046. Este número de acceso contiene la secuencia de dos PAC: RPC-164K3 y RPC-263P4. Estas dos secuencias PAC se mapearon en el cromosoma Xp22 humano en el sitio de la red entre los marcadores STS DXS704 y DXS7166. Esta región es un "punto caliente" para las anomalías evolutivas graves.

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III. Amplificación del fragmento DTLR mediante PCR

Se seleccionan dos secuencias de cebadores apropiados (véanse las Tablas 1 a 10). Se utiliza la RT-PCR sobre una muestra de ARNm apropiada seleccionada en busca de la presencia de mensaje para producir un ADNc parcial o completo, p. ej., una muestra que exprese el gen. Véase, p. ej., Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; y Dieffenbach y Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY. Esto permitirá la determinación de una secuencia útil para sondear un gen completo en una genoteca de ADNc. El TLR6 es una secuencia contigua en el genoma, que puede sugerir que otros TLR también lo son. De este modo, la PCR en un ADN genómico puede producir una secuencia contigua completa, y en ese caso sería aplicable la metodología del paseo cromosómico. Alternativamente, las bases de datos de secuencias contendrán la secuencia correspondiente a las porciones de las realizaciones descritas, o formas íntimamente relacionadas, p. ej., empalme alternativo, etc. Las técnicas de clonación de la expresión también se pueden aplicar a genotecas de ADNc.

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IV. Distribución tisular de los DTLR

Ha sido detectado el mensaje para cada gen que codifica estos DTLR. Véanse las Figuras 5A-5F. Otras células y tejidos serán analizados mediante la tecnología apropiada, p. ej., PCR, inmunoanálisis, hibridación, o de otro modo. Las preparaciones de ADNc de tejidos y órganos se encuentran disponibles, p. ej., en Clontech, Mountain View, CA. La identificación de las fuentes de expresión natural es útil, como se ha descrito.

Análisis Southern: se digiere ADN (5 \mug) de una genoteca de ADNc amplificada primaria con las enzimas de restricción apropiadas para liberar los insertos, se hacen correr sobre un gel de agarosa al 1% y se transfieren a una membrana de nailon (Schleicher y Schuell, Keene, NH).

Las muestras para el aislamiento del ARNm humano incluirían típicamente, p. ej. : células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T, células NK, granulocitos, células B), en reposo (T100); células mononucleares de sangre periférica, activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 12 h reunidas (T101); células T, clon TH0 Mot 72, en reposo (T102); células T, clon TH0 Mot 72, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 h reunidas (T103); células T, clon TH0 Mot 72, anérgicas tratadas con péptido específico durante 2, 7, 12 h reunidas (T104); células T, clon TH1 HY06, en reposo (T107); células T, clon TH1 HY06, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 3, 6, 12 h reunidas (T108); células T, clon TH1 HY06, anérgicas tratadas con péptido específico durante 2, 6, 12 h reunidas (T109); células T, clon TH2 HY935, en reposo (T110); células T, clon TH2 HY935, activadas con anti-CD28 y anti-CD3 durante 2, 7, 12 h reunidas (T111); células T CD4+células T CD4 5RO-polarizadas 27 días en anti-CD28, IL-4, y anti IFN-\gamma, TH2 polarizadas, activadas con anti-CD3 y anti-CD28 4 h (T116); líneas tumorales de células T Jurkat y Hut78, en reposo (T117); clones de células T, reunidas AD130.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69, en reposo (T118); clones de células T y\delta de células T al azar, en reposo (T119); Esplenocitos, en reposo (B100); Esplenocitos, activados con anti-CD40 y IL-4 (B101); líneas de células EBV de células B reunidas WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, en reposo (B102); línea de células B JY, activadas con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunidas (B103); clones NK 20 reunidos, en reposo (K100); clones NK 20 reunidos, activados con PMA e ionomicina durante 6 h (K101); clon NKL, derivado de sangre periférica de pacientes con leucemia LGL, tratado con IL-2 (K106); clon citotóxico NK 64 0-A3 0-1, en reposo (K107); línea precursora hematopoyética TF1, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunidas (C100); línea premonocícitica U937, en reposo (M100); línea premonocítica U937, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunidas (M101); monocitos elutriados, activados con LPS, IFNy, anti-IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h reunidos (M102); monocitos elutriados, activados con LPS, IFFy, IL-10 durante 1, 2, 6, 12, 24 h reunidos (M103); monocitos elutriados, activados con LPS, IFNy, anti-IL-10 durante 4, 16 h reunidos (M106); monocitos elutriados, activados con LPS, IFNy, IL-10 durante 4, 16 h reunidos (M107); monocitos elutriados, activados con LPS durante 1 h (M108); monocitos elutriados, activados con LPS durante 6 h (M109); DC 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días, en reposo (D101); DC 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días, activadas con PMA e ionomicina durante 1 hr (D102); DC 70% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días, activadas con PMA e ionomicina durante 6 hr (D103); DC 95% CD1a+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días clasificado mediante FACS, activadas con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunidas (D104); DC 95% CD14 +, ex CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días clasificadas mediante FACS, activadas con PMA e ionomicina 1, 6 hr reunidas (D105); DC CD1a+ CD86+, de CD34+ GM-CSF, TNF\alpha 12 días clasificadas mediante FACS, activadas con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunidas (D106); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo (D107); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, en reposo (D108); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, activadas con LPS 4, 16 h reunidas (D109); DC de monocitos GM-CSF, IL-4 5 días, activadas con TNF\alpha, monocito "supe" durante 4, 16 h reunidas (D110); tumor benigno de leiomioma L11 (X101); miometrio normal M5 (0115); leiomiosarcoma GS1 maligno (X103); línea de sarcoma de fibroblastos de pulmón MRC5, activados con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunidos (C101); línea de células de carcinoma epitelial de riñón CHA, activada con PMA e ionomicina durante 1, 6 h reunida (C102); riñón fetal 28 wk masculino (0100); pulmón fetal 28 wk masculino (0101); hígado fetal 28 wk masculino (0102); corazón fetal 28 wk masculino (0103); cerebro fetal 28 wk masculino (0104); vesícula biliar fetal 28 wk masculina (0106); intestino delgado fetal 28 wk masculino (0107); tejido adiposo fetal 28 wk masculino (0108); ovario fetal 25 wk femenino (0109); útero fetal 25 wk femenino (0110); testículo fetal 28 wk masculino (0111); bazo fetal 28 wk masculino (0112); placenta adulta 28 wk (0113); y tonsila inflamada, de 12 años de edad (X100).

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Las muestras para el aislamiento de ARNm de ratón pueden incluir, p. ej.: línea celular fibroblástica L de ratón en reposo (C200); células tranfectadas Braf:ER (fusión Braf a receptor de estrógeno), control (C201); células T, polarizadas con TH1 (Me114 brillante, células T CD4+ de bazo, polarizadas durante 7 días con IFN-\gamma y anti IL-4; T200); células T, polarizadas con TH2 (Me114 brillante, células CD4+ de bazo, polarizadas durante 7 días con IL-4 y anti-IFN-\gamma; T201); células T, altamente polarizadas con TH1 (véase Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 h reunidas; T202); células T, altamente polarizadas con TH2 (véase Openshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 h reunidas; T203); células pre T CD44- CD25+, clasificadas de timo (T204); clon de células T TH1 D1.1, en reposo durante 3 después de la última estimulación con antígeno (T205); clon de células T TH1 D1.1, estimuladas con 10 \mug/ml ConA 15 h (T206); clon de células T TH2 CDC35, en reposo durante 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T207); clon de células T TH2 CDC35, estimuladas con 10 \mug/ml ConA 15 h (T208); células T no sometidas a tratamiento previo Me114+ de bazo, en reposo (T209); células T Me114+, polarizadas para Th1 con IFN-\gamma/IL-12/anti-IL-4 durante 6, 12, 24 h reunidas (T210); células T Me114+, polarizadas para Th2 con IL-4/anti-IFN-\gamma durante 6, 13, 24 h reunidas (T211); línea celular de leucemia de células B maduras no estimulada A20 (B200); línea de células B no estimuladas CH12 (B201); células B grandes no estimuladas de bazo (B202); células B de bazo total, activadas con LPS (B203); células dendríticas enriquecidas con metrizamida de bazo, en reposo (D200); células dendríticas de médula ósea, en reposo (D201); línea celular de mocnocitos RAW 264.7 activada con LPS 4 h (M200); macrófagos de médula ósea derivados con GM y M-CSF (M201); línea celular de macrófagos J774, en reposo (M202); línea celular de macrófagos J774 + LPS + anti-IL-10 a 0,5, 1, 3, 6, 12 h reunidos (M203); línea celular de macrófagos J774 + LPS + IL-10 a 0,5, 1, 3, 5, 12 h reunidos (M204); tejido de pulmón de ratón sensibilizado con aerosol, cebadores Th2, sensibilización con OVA en aerosol 7, 14, 23 h reunido (véase Garlisi, et al. (1995) Clinical Immunology and immunopathology 75:75-83; X206); tejido de pulmón infectado con Nippostrongulus (véase Coffman, et al. (1989) Science 245:308-310; X200); pulmón adulto total, normal (0200); pulmón total, rag-1 (véase Schwarz, et al. (1993) Immunodeficiency 4:249-252; 0205); bazo IL-10 K.O. (véase Kuhn, et al. (1991) Cell 75:263-274; X201); bazo adulto total, normal (0201); bazo total, rag-1 (0207); placas de Peyer IL-10 K.O. (0202); placas de Peyer totales, normales (0210); nódulos linfáticos mesentéricos IL-10 K.O. (X203); nódulos linfáticos mesentéricos totales, normales (0211); colon IL-10 K.O. (X203); colon total, normal (0212); páncreas de ratón NOD (véase Makino, et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:1-13; X205); timo total, rag-1 (0208); riñón total, rag-1 (0209); corazón total, rag-1 (0202); cerebro total, rag-1 (0203); testículo total, rag-1 (0204);
hígado total, rag-1 (0206); tejido articular normal de rata (0300); y tejido articular artrítico de rata (X300).

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V. Clonación de contrapartes de especies de DTLR

Se utilizan diferentes estrategias para obtener contrapartes de especies de estos DTLR, preferiblemente de otros primates. Un método consiste en la hibridación por cruzamiento utilizando sondas de ADN de especies íntimamente relacionadas. Puede resultar útil entrar en especies evolutivamente similares como etapas intermedias. Otro método consiste en utilizar sondas para PCR específicas basadas en la identificación de bloques de similitud o diferencia entre especies concretas, p. ej., genes, humanos, p. ej., zonas de secuencia polipeptídica o nucleotídica altamente conservadas o no conservadas. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos para la clonación de la expresión.

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VI. Producción de proteína DTLR de mamífero

Se diseña un constructo de fusión apropiado, p. ej., GST, para la expresión, p. ej., en E. coli. Por ejemplo, se construye un plásmido IGIF pGex de ratón y se transforma en E. coli. Las células recién transformadas se hacen crecer en medio LB que contiene 50 \mug/ml de ampicilina y se inducen con IPTG (Sigma, St. Louis, MO). Después de una inducción durante la noche, las bacterias se recogen y los sedimentos que contienen la proteína DTLR se aíslan. Los sedimentos se homogeneizan en tampón TE (Tris-base 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM y pefabloc 2 mM) en 2 litros. Este material se hace pasar a través de un microfluidificador (Microfluidics, Newton, MA) tres veces. El sobrenadante fluidificado se centrifuga en un rotor Sorvall GS-3 durante 1 h a 13.000 rpm. El sobrenadante resultante que contiene la proteína DTLR se filtra y se hace pasar por una columna de glutation-SEFAROSA equilibrada en Tris-base 50 mM pH 8,0. Las fracciones que contienen la proteína de fusión DTLR-GST se reúnen y se escinden con trombina (Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). La reserva escindida se hace pasar después a través de una columna Q-SEFAROSA equilibrada en Tris-base 50 mM. Las fracciones que contienen DTLR se reúnen y se diluyen en H2O destilada fría, para disminuir la conductividad, y se vuelven a pasar por una nueva columna Q-Sefarosa, sola o de manera sucesiva con una columna de anticuerpo de inmunoafinidad. Las fracciones que contienen la proteína DTLR se reúnen, se toman alícuotas de las mismas, y se almacenan en el congelador a -70ºC.

La comparación del espectro CD con la proteína DTLR1 puede sugerir que la proteína está correctamente plegada. Véase Hazuda, et al. (1969) J. Biol. Chem. 264:1689-1693.

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VII. Análisis Biológicos con DTLR

Los análisis biológicos estarán dirigidos generalmente a la característica de unión al ligando de la proteína o a la actividad quinasa/fosfatasa del receptor. La actividad será típicamente reversible, como lo son muchas otras acciones enzimáticas, actividades mediadas por fosfatasa o fosforilasa, cuyas actividades son medidas fácilmente mediante procedimientos convencionales. Véanse, p. ej., Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I y II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70:375-388; Lewin (1990) Cell 61:743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56:449-463; y Parker, et al. (1993) Nature 363:736-738.

La familia de interleuquinas 1 contiene moléculas, cada una de las cuales es un importante mediador de la enfermedad inflamatoria. Para una revisión comprensiva, véase Dinarello (1996) "Biologic basis for interleukin-1 in disease" Blood 87:2095-2147. Existen indicios de que los diferentes ligandos Toll pueden jugar papeles importantes en el inicio de la enfermedad, concretamente respuestas inflamatorias. El descubrimiento de proteínas novedosas relacionadas con la familia de IL-1 ofrece la identificación de moléculas que proporcionan la base molecular para el inicio de la enfermedad y permite el desarrollo de estrategias terapéuticas de una gama y una eficacia mejoradas.

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VIII. Preparación de anticuerpos específicos, p. ej., para DTLR4

Se inmunizan ratones Balb/c endogámicos intraperitonealmente con formas recombinantes de la proteína, p. ej., DTLR4 purificado o células NIH-3T3 transfectadas estables. Los animales se refuerzan en momentos puntuales apropiados con proteína, con o sin coadyuvante adicional, para estimular adicionalmente la producción de anticuerpo. Se recoge el suero, o se producen hibridomas con los bazos recogidos.

Alternativamente, se inmunizan los ratones Balb/c con células transformadas con el gen o sus fragmentos, células endógenas o exógenas, o con membranas aisladas enriquecidas para la expresión del antígeno. Se recoge el suero en el momento apropiado, típicamente después de numerosas administraciones adicionales. Las diferentes técnicas de terapia génica pueden ser útiles, p. ej., en la producción de proteína in situ, para generar una respuesta inmunitaria.

Se pueden elaborar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se fusionan esplenocitos con un compañero de fusión apropiado y se seleccionan los hibridomas en medio de crecimiento mediante procedimientos convencionales. Los sobrenadantes del hibridoma se escrutan en busca de la presencia de anticuerpos que se unen al DTLR deseado, p. ej., mediante ELISA u otro análisis. También se pueden seleccionar o preparar anticuerpos que reconocen específicamente las realizaciones de DTLR específicas.

En otro método, se presentan los péptidos sintéticos o la proteína purificada a un sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véanse, p. ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. En situaciones apropiadas, el reactivo de unión se marca como se ha descrito antes, p. ej., mediante fluorescencia o de otro modo, o se inmoviliza en un sustrato para métodos de selección repetitiva. Los ácidos nucleicos también pueden ser introducidos en células de un animal para producir el antígeno, lo que sirve para lograr una respuesta inmunitaria, véanse, p. ej., Wang, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:4156-4160; Barry, et al. (1994) Bioechniques 16:616-619; y Xiang, et al. (1995) Immunity 2: 129-135.

\vskip1.000000\baselineskip

IX. Producción de proteínas de fusión, p. ej., con DTLR5

Se elaboran diferentes constructos de fusión con DTLR5. Esta porción del gen se fusiona con una etiqueta epitópica, p. ej., una etiqueta FLAG, o con un constructo de un sistema de dos híbridos. Véase, p. ej., Fields y Song (1989) Nature 340:245-246.

La etiqueta epitópica se puede utilizar en un procedimiento de clonación de la expresión con detección con anticuerpos anti-FLAG para detectar un compañero de unión, p. ej., un ligando para el DTLR5 respectivo. El sistema de dos híbridos también se puede utilizar para aislar proteínas que se unen específicamente a DTLR5.

\vskip1.000000\baselineskip

X. Mapeo cromosómico de los DTLR

Se preparan dispersiones cromosómicas. Se realiza la hibridación in situ sobre preparaciones de cromosoma obtenidas de linfocitos estimulados con fitohemaglutinina cultivados durante 72 h. Se añade 5-bromodesoxiuridina durante las siete horas finales de cultivo (60 \mug/ml de medio), para asegurar un bandeo cromosómico post-hibridación de buena calidad.

Un fragmento apropiado, p. ej., un fragmento de PCR, amplificado con la ayuda de cebadores sobre un molde de ADNc de células B total, se clona en un vector apropiado. El vector se marca mediante traslado de cortes con H^{3}. La sonda radiomarcada se hibrida con las dispersiones en metafase como describen Mattei, et al. (1985) Hum. Genet. 69:327-331.

Después de recubrir con emulsión Nuclear Track (KODAK NTB_{2}), los portas se exponen, p. ej., durante 18 días a 4ºC. Para evitar cualquier corrimiento de los granos de plata durante el procedimiento de bandeo, las dispersiones de cromosomas se tiñen primero con solución Giemsa tamponada y se fotografía la metafase. Después se realiza el bandeo R mediante el método del fluorocromo-fotolisis-Giemsa (FPG) y las metafases se vuelven a fotografiar antes del análisis.

Alternativamente, se puede realizar FISH, como se ha descrito antes. Los genes de DTLR se localizan sobre diferentes cromosomas. DTLR2 y DTLR3 están localizados en el cromosoma 4 humano; DTLR4 está localizado en el cromosoma 9 humano, y DTLR5 está localizado en el cromosoma 1 humano. Véanse las Figuras 4A-4D.

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XI. Relación estructura actividad

La información sobre el carácter crítico de los restos concretos se determina utilizando procedimientos y análisis convencionales. El análisis de mutagénesis convencional se realiza, por ejemplo, generando muchas variantes diferentes en posiciones determinadas, p. ej., en las posiciones identificadas antes, y evaluando las actividades biológicas de las variantes. Esto se puede realizar hasta el punto de determinar las posiciones que modifican la actividad, o de centrarse en posiciones específicas para determinar los restos que pueden ser sustituidos para conservar, bloquear, o modular la actividad biológica.

Alternativamente, el análisis de las variantes naturales puede indicar qué posiciones toleran las mutaciones naturales. Esto puede resultar del análisis poblacional de la variación entre individuos, o a través de cepas o especies. Las muestras de los individuos seleccionados se analizan, p. ej., mediante análisis PCR y secuenciación. Esto permite la evaluación de los polimorfismos de la población.

\vskip1.000000\baselineskip

XI. Aislamiento de un ligando para un DTLR

Se puede utilizar un DTLR como reactivo de unión específico para identificar su compañero de unión, sacando ventaja de su especificidad de unión, muy probablemente se utilizaría un anticuerpo. Un reactivo de unión se marca como se ha descrito antes, p. ej., mediante fluorescencia o de otro modo, o se inmoviliza en un sustrato para los métodos de selección repetitiva.

La composición de unión se utiliza para escrutar una genoteca de expresión formada por una línea celular que expresa un compañero de unión, esto es, ligando, preferiblemente asociado a la membrana. Se utilizan técnicas de tinción convencionales para detectar o clasificar el ligando expresado en la superficie, o se escrutan mediante selección repetitiva las células transformadas que se expresan en la superficie. El escrutinio de la expresión intracelular se realiza mediante diferentes procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Véase también McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10:2821-2832.

Por ejemplo, el día 0, se recubren previamente 2 portas Permanox de 2 cámaras con 1 ml por cámara de fibronectina, 10 ng/ml en PBS, durante 30 min a la temperatura ambiente. Se enjuaga una vez con PBS. Después se cultivan en placa células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio de crecimiento. Se incuban durante la noche a 37ºC.

El día 1 para cada muestra, se preparan 0,5 ml de una solución de 66 \mug/ml de DEAE-dextrano, 66 \muM de cloroquina, y 4 \mug de ADN en DME sin de suero. Para cada grupo, se prepara un control positivo, p. ej., de ADNc DTLR-FLAG a una dilución 1 y 1/200, y un supuesto negativo. Se enjuagan las células con DME sin de suero. Se añade la solución de ADN y se incuba 5 hr a 37ºC. Se separa el medio y se añaden 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 min. Se separa y se lava una vez con DME. Se añaden 1,5 ml de medio de crecimiento y se incuba durante la noche.

El día 2, se cambia el medio. Los días 3 o 4, las células se fijan y se tiñen. Se enjuagan las células dos veces con Solución Salina Tamponada de Hank (HBSS) y se fija en paraformaldehído al 4% (PFA)/glucosa durante 5 min. Se lava 3X con HBSS. Los portas se pueden almacenar a -80ºC después de separar todo el líquido. Para cada cámara, se realizan incubaciones de 0,5 ml como sigue. Se añade HBSS/saponina (0,1%) con 32 \mul/ml de NaN_{3} 1 M durante 20 min. Después se lavan las células con HBSS/saponina 1X. Se añade el DTLR o el complejo DTLR/anticuerpo apropiado a las células y se incuban durante 30 min. Se lavan las células dos veces con HBSS/saponina. Si resulta apropiado, se añade primero el anticuerpo durante 30 minutos. Se añade el segundo anticuerpo, p. ej., anticuerpo anti-ratón Vector, a una dilución 1/200, y se incuba durante 30 min. Se prepara la solución de ELISA, p. ej., solución de peroxidasa de rábano picante Vector Elite ABC, y se preincuba durante 30 min. Se utilizan, p. ej., 1 gota de solución A (avidina) y 1 gota de solución B (biotina) por 2,5 ml de HBSS/saponina. Se lavan las células dos veces con HBSS/saponina. Se añade solución ABC HRP y se incuba durante 30 min. Se lavan las células dos veces con HBSS, el segundo lavado durante 2 min, que cierra las células. Después se añade ácido diaminobenzoico Vector (DAB) durante 5 a 10 min. Se utilizan 2 gotas de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml de agua destilada en vidrio. Se separa cuidadosamente la cámara y se enjuaga el porta en agua. Se seca al aire durante unos minutos, después se añade 1 gota de Crystal Mount y un cubre. Se cuece durante 5 min a 85-90ºC.

Se evalúa la tinción positiva de las reservas y se subclonan progresivamente para el aislamiento de los genes individuales responsables de la unión.

Alternativamente, se utilizan los reactivos de DTLR para purificar por afinidad o clasificar las células que expresan un supuesto ligando. Véase, p. ej., Sambrook, et al. o Ausubel, et al.

Otra estrategia consiste en escrutar un receptor unido a membrana mediante selección repetitiva. El ADNc del receptor se construye como se ha descrito antes. El ligando se puede inmovilizar y utilizar para inmovilizar las células de expresión. La inmovilización se puede lograr mediante el uso de anticuerpos apropiados que reconocen, p. ej., una secuencia FLAG de un constructo de fusión con DTLR, o mediante el uso de anticuerpos originados contra los primeros anticuerpos. Los ciclos recurrentes de selección y amplificación conducen al enriquecimiento de los clones apropiados y al aislamiento eventual de los clones que expresan el receptor.

Las genotecas de expresión de fagos pueden ser escrutadas en busca de DTLR de mamífero. Las técnicas de marcaje apropiadas, p. ej., anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcaje específico de los clones apropiados.

Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se ofrecen a modo de ejemplo solamente.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Schering Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Kenilworth

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: New Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 07033

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELEFONO: (908) 298-4000

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (908) 298-5388

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS RECEPTORAS HUMANAS; REACTIVOS Y MÉTODOS RELACIONADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disco Flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Macintosh Power PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: 8.0

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: Microsoft Word 6.0

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚM. DE SOLICITUD.: USSN 60/044,293

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-MAY-1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚM. DE SOLICITUD.: USSN 60/072,212

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-ENERO-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚM. DE SOLICITUD.: USSN 60/076,947

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-MAR-1998

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2367 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2358

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..2358

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 786 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2355 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2352

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..2352

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO.:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 784 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2715 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2712

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 64..2712

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 904 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2400 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2397

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 799 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:8:

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1275 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1095

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 365 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3138 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..3135

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..3135

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1045 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 180 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..177

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 59 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 990 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..988

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 329 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1557 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..513

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 27 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 278 denominado G, puede ser G o C"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 445

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 445 denominado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 572

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 572, 593, 600, 607, 617, 622, 625, 631, 640, 646, 653, 719, 775, y 861 denominados C; pueden ser cada A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 629 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..486

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 144

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 144 y 225 denominados C; pueden ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 162 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:20:

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 427 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..426

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:21:

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:22:

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 662 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..627

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 54

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 54, 103, y 345 son denominados A; cada uno puede ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 313

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 313 denominado G, puede ser G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 316

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 316, 380, 407, y 408 denominados C; pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 209 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:24:

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4865 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 107..2617

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 173..2617

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 81

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 81, 3144, 3205, y 3563 denominados A, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 84

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 84 denominado C, puede ser C o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 739

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 739 denominado C, puede ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3132

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 3132, 3532, 3538, y 3553 denominados G, pueden ser cada uno G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3638

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 3638 denominado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3677

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 3677, 3685, y 3736 denominados C, pueden ser cada uno A o C"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:25:

63

64

65

66

67

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:26.

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 837 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 300 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..300

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 186

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 186, 196,.217, 276, y 300 denominados C, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

72

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1756 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1182

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1643

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1643 denominado A, puede ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1664

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1664 denominado C, puede ser A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1680

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 1680 y 1735 denominados G, pueden ser G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1719

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1719 denominado C, puede ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1727

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1727 denominado A, puede ser A, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:29:

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 394 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 999 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..847

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 4 y 23 denominados C, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 650

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 650 denominado G, puede ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 715

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 715, 825, y 845 denominados C, pueden ser cada uno C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:31:

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 282 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1173 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1008

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 854

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 854 denominado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1171

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 1171 y 1172 denominados C, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 336 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 97 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

87

\newpage

La invención también proporciona las siguientes realizaciones definidas en las cláusulas de más abajo:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C1.

Una proteína o péptido de DTLR2 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 4.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C2.

Una proteína o péptido de DTLR3 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 6.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C3:

Una proteína o péptido de DTLR4 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 26.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C4.

Una proteína o péptido de DTLR5 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 10.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C5.

Una proteína o péptido de DTLR6 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 12.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C6.

Una proteína o péptido de DTLR7 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 16 o 18.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C7.

Una proteína o péptido de DTLR8 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 32.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C8.

Una proteína o péptido de DTLR9 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 22.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C9.

Una proteína o péptido de DTLR10 esencialmente pura o recombinante que muestra una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% a lo largo de una longitud de al menos aproximadamente 12 aminoácidos con el SEQ ID NO: 34.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C10.

Una proteína de fusión que comprende la proteína o péptido de cualquiera de C1 a 9.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C11.

Un compuesto de unión que se une específicamente a la proteína o péptido de cualquiera de C1 a 9.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C12.

El compuesto de unión de C11 que es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C13.

Un ácido nucleico que codifica la proteína o péptido de cualquiera de C1 a 9.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C14.

Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de C13.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C15.

Una célula anfitriona que comprende el vector de C14.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

C16.

Un procedimiento para producir recombinantemente un polipéptido que comprende cultivar la célula anfitriona de C15 en condiciones en las que se expresa el polipéptido.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Propuesta de secuencias

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR1 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR1 primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 3 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR2 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 4 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR2 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 5 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR3 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 6 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR3 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 7 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR4 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 8 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR4 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 9 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR5 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR5 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 11 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR6 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR6 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 13 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR6 de roedor.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 14 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR6 de roedor.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 15 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR7 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 16 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR7 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 17 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR7 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 18 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR7 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 19 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR8 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 20 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR8 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 21 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR9 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 22 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR9 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 23 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR10 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 24 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR10 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 25 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR4 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 26 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR4 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 27 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR6 de roedor.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 28 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR6 de roedor.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 29 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR6 de roedor.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 30 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR6 de roedor.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 31 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR8 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 32 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR8 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 33 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR10 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 34 proporciona la secuencia de polipéptidos de DTLR10 de primate.

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 35 proporciona la secuencia de nucleótidos de DTLR10 de roedor.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Hardiman, Gerard T.

\hskip4cm

Rock, Fernando L.

\hskip4cm

Bazan, J. Fernando

\hskip4cm

Kastelein, Robert A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS RECEPTORAS HUMANAS; REACTIVOS Y MÉTODOS RELACIONADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DESTINATARIO DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: DNAX Research Institute

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 901 California Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Palo Alto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 94304-1104

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release núm. 1.0, Versión núm. 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Ching, Edwin P.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34,090

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ABOGADO: DX0724X

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFROMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 650-852-9196

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650-496-1200

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2367 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2358

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..2358

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

89

90

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 786 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2355 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2352

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..2352

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

96

97

98

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 784 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

99

100

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2715 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2712

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 64..2712

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

102

103

104

105

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 904 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

106

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2400 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2397

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

109

110

111

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 799 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

112

113

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1275 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1095

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

115

116

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 365 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

118

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3138 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..3135

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 67..3135

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

120

121

122

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1045 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

125

126

127

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 180 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..177

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 59 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 990 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..988

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:15:

131

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 329 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1557 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..513

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 278

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 278 denominado G, puede ser G o C"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 445

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 445 denominado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 572

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 572, 593, 600, 607, 617, 622, 625, 631, 640, 646, 653, 719, 775, y 861 denominados C; pueden ser A, C, G, o T"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

135

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 629 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..486

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 144

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 144 y 225 denominado C; puede ser C o T"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 162 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:20:

140

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 427 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..426

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:21:

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

142

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 662 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..627

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 54

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 54, 103, y 345 se denominan A; pueden ser cada uno A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 313

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 313 denominado G, puede ser G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 316

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN /nota= "los nucleótidos 316, 380, 407, y 408 denominados C; pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:23:

143

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 209 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:24:

144

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4865 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 107..2617

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 173..2617

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 81

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 81, 3144, 3205, y 3563 denominados A, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 84

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 84 denominado C, puede ser C o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 739

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 739 denominado C, puede ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3132

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 3132, 3532, 3538, y 3553 denominados G, pueden ser cada uno G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3638

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 3638 denominado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 3677

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 3677, 3685, y 3736 denominados C, pueden ser cada uno A o C"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

145

146

147

148

149

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 837 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:26:

150

151

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 300 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..300

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 186

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 186, 196, 217, 276, y 300 denominados C, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:27:

153

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

154

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1756 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1182

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1643

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1643 denominado A, puede ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1664

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1664 denominado C, puede ser A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1680

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 1680 y 1735 denominado G, puede ser G o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1719

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1719 denominado C, puede ser C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1727

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 1727 denominado A, puede ser A, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:29:

155

156

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 394 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

157

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 999 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..847

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 4 y 23 denominados C, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 650

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 650 denominado G, puede ser A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 715

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 715, 825, y 845 denominados C, pueden ser cada uno C o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

159

160

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 282 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

161

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1173 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1008

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 854

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "el nucleótido 854 denominado A, puede ser A o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1171

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "los nucleótidos 1171 y 1172 denominados C, pueden ser cada uno A, C, G, o T"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

163

164

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 336 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:34:

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 97 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNC

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

167

Claims (9)

1. Una proteína o péptido esencialmente puros o recombinantes con actividad de receptor de tipo Toll, donde dicha proteína o péptido muestra una identidad de secuencia de al menos 70% con el SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud.

2. Un polipéptido esencialmente puro o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6.

3. Una proteína de fusión que comprende la proteína o péptido de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2.

4. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la proteína o péptido de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2.

5. Un ácido nucleico que codifica la proteína o péptido de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

6. Un ácido nucleico que muestra una identidad de al menos 80% con un ADNc que codifica el SEQ ID NO: 6 a lo largo de toda su longitud.

7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la Reivindicación 5 o la Reivindicación 6.

8. Una célula anfitriona que comprende el vector de la Reivindicación 7.

9. Un procedimiento para producir recombinantemente un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 que comprende cultivar la célula anfitriona de la Reivindicación 8 en condiciones en las que se expresa el polipéptido.