SK146599A3

SK146599A3 - Essentially pure or recombinant protein dtlr2-10, a fused protein, a bond substance, a nucleic acid, an expression vector, a host cell and process for their production

Info

Publication number: SK146599A3
Application number: SK1465-99A
Authority: SK
Inventors: Gerard T Hardiman; Fernando L Rock; Fernando J Bazan; Robert A Kastelein
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-07
Publication date: 2000-07-11
Also published as: ATE443139T1; JP2006052232A; DK0980429T3; JP2005120106A; JP2009089713A; EP0980429A2; CN1225555C; EP0980429B1; NZ338073A; EP1798288A2; ES2279572T3; DE69836630D1; EP1988166A1; CA2289912C; NO995458D0; KR20010012323A; NO995458L; CN1263555A; HK1022175A1; EP1925666A1

Description

Vynález sa týka kompozícií a spôsobov, ktoré ovplyvňujú fyziológiu cicavcov, napríklad morfogenézu alebo funkciu imunitného systému. Hlavne sa popisujú nukleové kyseliny, proteíny a protilátky, ktoré regulujú vývoj a/alebo imunitný systém.

Popisuje sa tiež použitie týchto materiálov v diagnostike a terapii.

DoteraiSí stav techniky

Technológie rekombinácie DNA všeobecne popisujú metódy integrácie genetickej informácie pochádzajúcej z donora do vektorov za účelom následného spracovania, ktoré sprostredkováva hostiteľ, do ktorého sú vektory zabudované. Vytvoria sa kópie prenesenej genetickej informácie a/alebo sa genetická informácia v novom prostredí exprimuje. V obyčajnom prípade genetická informácia existuje vo forme komplementárnej DNA (cDNA), ktorá sa odvodila od mediátorovej RNA (mRNA) kódujúcej požadovaný proteínový produkt. Nosičom je často plazmid, ktorý má kapacitu na začlenenie cDNA pre prípad neskoršej replikácie v hostiteľovi a v niektorých prípadoch súčasne riadi expresiu cDNA, a tým riadi priamu syntézu kódovaného produktu v hostiteľovi.

Je známe, že imunitná odpoveď u cicavcov je založená na sériách komplexných bunkových interakciách, ktoré sa nazývajú imunitná sieť. Súčasný výskum umožňuje nový pohľad na vnútornú činnosť tejto siete. Zatiaľčo je jasné, že imunitné odpovede sa v skutočnosti točia okolo interakcií lymfocytov, makrofágov, granulocytov a iných buniek, imunológovia sa teraz prikláňajú k názoru, že rozpustné proteíny, ktoré sú známe ako lymfokiny, cytokiny alebo monokiny hrajú dôležitú úlohu pri riadení týchto bunkových interakcií. Preto je veľký záujem o izoláciu, charakterizáciu a mechanizmy pôsobenia bunkových modulačných faktorov a je potrebné pochopiť, ktoré z nich sú podstatné pri diagnóze a terapii mnohých medicínskych abnormalít, ako sú napríklad poruchy imunitného systému.

Lymfokiny pravdepodobne sprostredkovávajú bunkové aktivity rôznymi spôsobmi. Ukázalo sa, že podporujú proliferáciu, rast a/alebo diferenciáciu mnohých potenciálnych hematopoetických kmeňových buniek veľkého počtu progenitorov, ktoré obsahujú rozmanité bunkové línie, ktoré tvoria komplexný imunitný systém. Správne a rovnovážne interakcie medzi bunkovými komponentami sú v prípade zdravej imunitnej odpovede nevyhnutné. V prípade, že sa lymfokiny aplikujú spolu s inými činidlami, potom často rôzne bunkové línie odpovedajú rôznym spôsobom.

Bunkové línie, ktoré sú zvlášť dôležité pre imunitnú odpoveď, zahŕňajú dve triedy lymfocytov: B-bunky, ktoré môžu produkovať a vylučovať imunoglobulíny (proteíny, ktoré sú schopné rozoznať a naviazať cudzorodé látky, aby sa mohli odstrániť) a T bunky rôznych podtried, ktoré vylučujú lymfokiny a vyvolávajú alebo potláčajú B bunky a rôzne iné bunky (zahrňujúce iné T bunky), ktoré tvoria imunitnú sieť. Tieto lymfokiny reagujú s radom iných bunkových typov.

Iná dôležitá bunková línia sú žírne bunky (ktoré sa vyskytujú u všetkých druhov cicavcov), čo sú bunky spoj ivového tkaniva obsahujúce granuley a nachádzajúce sa v blízkosti kapilár po celom tele. Tieto bunky sa nachádzajú vo zvlášť vysokých koncentráciách v pľúcach, koži a v tráviacej a v genitourinámej sústave. Žírne bunky majú dôležitú úlohu pri poruchách spojených s alergiami, hlavne však s anafylaxiou: keď vybrané antigény sa viažu na jednu triedu imunoglobulínov viazaných na receptory na povrchu žírnych buniek, potom žírne bunky vypúšťajú granuly a uvoľňujú mediátory, ako napríklad histamín, serotonín, heparín a prostaglandíny, ktoré spôsobujú alergické reakcie, napríklad anafylaxiu.

Vážnou prekážkou lepšieho pochopenia a liečby rôznych vážnych porúch imunitného systému je všeobecná neschopnosť udržať bunky imunitného systému in vitro. Imunológovia zistili, že kultiváciu mnohých týchto buniek možno uskutočniť použitím supematantov T buniek a iných buniek, ktoré obsahujú rôzne rastové faktory, medzi ne patrí mnoho lymfokinov.

Proteíny skupiny interleukinu-l zahŕňajú IL-la, IL-Ιβ, IL-1RA a IL-Ιγ (tiež sa označujú ako faktor indukujúci interferón gama (IGIF) ). Táto skupina génov sa zúčastňuje mnohých biologických funkcií (popisuje sa v publikáciách Dinarello (1994) FASEB J. 8: 1314-1325; Dinarello (1991) Blood 77: 1627-1652; Okamura et al. (1995) Náture 378: 88-91).

Navyše existujú rôzne rastové a regulačné faktory, ktoré modulujú morfogénny vývoj. Medzi ne napríklad patria Iigandy ToII, ktoré signalizujú tak, že sa naviažu na receptory a zdieľajú štrukturálnu charakteristiku a charakteristiku mechanizmu a rysov receptorov IL-1 (popisuje sa napríklad v publikáciách Lemaitre et al., (1996) Celí 86: 973-983; Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí. And Devel. Biol. 12: 393-416).

Z predchádzajúceho je jasné, že objav a vývoj nových rozpustných proteínov a ich receptorov, ktoré zahŕňajú tie, ktoré sú podobné lymfokinom, sa môžu podieľať na novej terapii v prípade širokého rozsahu degeneratívnych alebo abnormálnych podmienok, ktoré priamo alebo nepriamo zahŕňajú vývoj, diferenciáciu alebo funkciu napríklad imunitného systému a/alebo hematopoetických buniek. Veľkou výhodou je objav a pochopenie funkcie nových receptorov pre molekuly podobné lymfokinom, ktoré posilňujú alebo potenciujú výhodné aktivity iných lymfokinov. Vynález popisuje nové receptory ligandov, ktoré vykazujú podobnosť s kompozíciami podobnými interleukínu-1 a príbuzných látok a spôsobu ich použitia.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje deväť nových cicavčích receptorov. Sú to ľudské molekulárne štruktúry podobné receptoru Toll, ktoré sa označujú DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 a DTLR10 a ďalej sa popisujú ich biologické aktivity. Vynález zahrňuje nukleové kyseliny kódujúce samotné polypeptidy a spôsoby ich produkcie a použitia. Nukleové kyseliny podľa vynálezu sa charakterizujú čiastočne svojou homológiou s klonovanou komplementárnou sekvenciou DNA (cDNA).

V určitom prevedení vynálezu sa popisuje zloženie látky vybratej zo skupiny zahrňujúcej v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL2 alebo peptid majúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 4; prirodzenú sekvenciu DTRL2 SEQ ID NO: 4; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTRL2; v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL3 alebo peptid vykazujúci DTRL3 SEQ ID NO: 6; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTRL3; v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL4 alebo peptid vykazujúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 26; prirodzenú sekvenciu DTRL4 SEQ ID NO: 26; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTRL4; v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL5 alebo peptid vykazujúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 10; prirodzenú sekvenciu DTRL5 SEQ ID NO: 10; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTRL5.

V inom vyhotovení vynálezu sa popisuje zloženie látky vybraté zo skupiny, ktorá zahrňuje: v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL6 alebo peptid vykazujúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 12; prirodzenú sekvenciu DTRL6 SEQ ID NO: 12; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTLR6; v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL7 alebo peptid vykazujúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 16 alebo 18; prirodzenú sekvenciu DTRL7 SEQ ID NO: 16 alebo 18; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTLR7; v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL8 alebo peptid vykazujúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 32; prirodzenú sekvenciu DTRL8 SEQ ID NO: 32; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTLR8 v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL9 alebo peptid vykazujúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 22; prirodzenú sekvenciu DTRL9 SEQ ID NO: 22; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTLR9; v podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTRL10 alebo peptid vykazujúci aspoň približne 85 % sekvenčnej identity v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 34; prirodzenú sekvenciu DTRL10 SEQ ID NO: 34; fuzovaný proteín obsahujúci sekvenciu DTLR10.

Uprednostňuje sa v podstate čistý alebo izolovaný proteín obsahujúci segment vykazujúci sekvenčnú identitu so zodpovedajúcou časťou DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10, kde homológia je aspoň približne 90 % identity a časť tvorí aspoň približne 9 aminokyselín; homológia je aspoň približne 80 % identity a časť tvorí aspoň približne 17 aminokyselín alebo homológia je aspoň približne 70 % identity a časť tvorí aspoň približne 25 aminokyselín. V špecifickom vyhotovení vynálezu zloženie látky je: DTLR2, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 4; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patern odlišný od prirodzeného DTLR2; DTLR3, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 6; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patern odlišný od prirodzeného DTLR3; DTLR4, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 26; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patem odlišný od prirodzeného DTLR4; DTLR5, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 10; alebo vykazuje posttranslačný modifikačný patem odlišný od prirodzeného DTLR5; DTLR6, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 12; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patem odlišný od prirodzeného DTLR6; DTLR7, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 16 alebo 18; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patem odlišný od prirodzeného DTLR7; DTLR8, ktoiý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 32; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patem odlišný od prirodzeného DTLR8; DTLR9, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 22; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patem odlišný od prirodzeného DTLR9; DTLR10, ktorý obsahuje prirodzenú sekvenciu SEQ ID NO: 34; alebo vykazuje post-translačný modifikačný patem odlišný od prirodzeného DTLR10; alebo môže obsahovať proteín alebo peptid, ktorý: pochádza z teplokrvného zvieraťa vybratého zo skupiny zahrňujúcej primáty ako je človek; obsahuje aspoň jeden segment polypeptidu SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34; obsahuje veľké množstvo častí vykazujúcich uvedenú identitu. Látka je prirodzeným alelovým variantom DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10, má dĺžku aspoň približne 30 aminokyselín, vykazuje aspoň dva neprekrývajúce sa epitopy, ktoré sú špecifické pre DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10 primátov. Ďalej vykazuje sekvenčnú identitu aspoň približne v 90 % v dĺžke aspoň približne 20 aminokyselín z DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6 primátov; vykazuje aspoň dva neprekrývajúce sa epitopy, ktoré sú špecifické pre DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10 primátov alebo vykazujú sekvenčnú identitu aspoň približne v 90 % v dĺžke aspoň približne 20 aminokyselín z DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10 primátov; je gly kozy lovaná; má molekulárnu hmotnosť aspoň 100 000 s prirodzenou gly kozy láciou; je syntetickým polypeptidom; je prichytená na pevný substrát; je spojená s inou chemickou látkou; od prirodzenej sekvencie sa líši 5-násobnou alebo menšou substitúciou, alebo je delečným alebo inzerčným variantom prirodzenej sekvencie.

Iné uskutočnenie vynálezu zahrňuje zloženie obsahujúce: sterilný proteín DTLR2 alebo peptid alebo proteín DTLR2 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu; sterilný proteín DTLR3 alebo peptid alebo proteín DTLR3 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu; sterilný proteín DTLR4 alebo peptid alebo proteín DTLR4 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu; sterilný proteín DTLR5 alebo peptid alebo proteín DTLR5 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu; sterilný proteín DTLR6 alebo peptid alebo proteín DTLR6 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu; sterilný proteín DTLR7 alebo peptid alebo proteín DTLR7 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu; sterilný proteín DTLR8 alebo peptid alebo proteín DTLR8 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodná na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu; sterilný proteín DTLR9 alebo peptid alebo proteín DTLR9 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu alebo sterilný proteín DTLR10 alebo peptid alebo proteín DTLR10 alebo peptid a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, zahrňujúca vodu, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu.

V istom uskutočnení fuzovaného proteínu podľa vynálezu sa popisuje fúzovaný proteín obsahujúci prirodzený proteín o sekvencii SEQ. ID. NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34; tag vhodný na detekciu alebo čistenie, alebo zahrňujúci FLAG, His6 alebo sekvenciu Ig; alebo sekvenciu iného receptorového proteínu. Rôzne uskutočnenia kitu podľa vynálezu popisujú sadu obsahujúcu proteín DTLR alebo peptid a: kompartment obsahujúci proteín alebo polypeptid a/ alebo inštrukcie na použitie alebo likvidáciu činidiel.

Uskutočnenie naviazania látky podľa vynálezu zahrňuje väzobné miesto pre antigén, ktorý pochádza z protilátok špecificky sa viažucich na prirodzený proteín DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10, kde: proteín je proteín primáta; väzobnou látkou je Fv, Fab alebo fragment Fab2; väzobná látka je spojená s inou chemickou látkou; alebo protilátky vytvorené proti peptidovej sekvencii prirodzeného polypetidu SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34, alebo vytvorené proti prirodzenému proteínu DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10, alebo vytvorené proti čistému ľudskému proteínu DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10. Proteín je vybratý na základe imunologických metód, je polyklonálnou protilátkou, viaže sa na denaturovaný proteín DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR 10, vykazuje Kd k antigénu aspoň 30μιη, je zachytený na pevnom substráte, ktorý zahrňuje častice alebo plastovú membránu, je v sterilnom zložení alebo je detekovateľne označený, a to rádioaktívnym alebo fluorescenčným označením. Kit väzobnej kompozície často zahrňuje väzobnú látku a : kompartment obsahujúci väzobnú látku a/ alebo inštrukcie na použitie alebo likvidáciu činidiel. Kit je možné použiť na kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu.

Iné zloženia zahrňujú zloženie obsahujúce väzobnú látku alebo väzobnú látku a nosič, kde nosičom je: látka rozpustná vo vode, fyziologický roztok a/ alebo tlmivý roztok a/ alebo je vhodný na orálnu, rektálnu, nazálnu, povrchovú alebo parenterálnu aplikáciu.

Vyhotovenie nukleových kyselín podľa vynálezu zahrňuje izolovanú alebo rekombinantnú nukleovú kyselinu kódujúcu proteín DTLR2-10 alebo peptid, alebo fúzovaný proteín, kde DTLR pochádza z cicavcov; alebo nukleovú kyselinu, ktorá kóduje antigénny peptid sekvencie SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34; kóduje veľké množstvo antigénnych peptidových sekvencii SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34; vykazuje aspoň približne 80 % zhodu s prirodzenou cDNA kódujúcou uvedený segment; je expresívnym vektorom; ďalej obsahuje počiatok replikácie; pochádza z prirodzeného zdroja; obsahuje detekovateľné označenie; obsahuje syntetickú nukleotidovú sekvenciu; veľkosť je menšia než 6 kb, dáva sa prednosť 3 kb; pochádza z cicavcov, ktoré zahrňujú primáty; obsahuje prirodzenú kódujúcu sekvenciu v celej dĺžke; v prípade génu kódujúceho uvedenú DTLR je hybridizačnou sondou; alebo je primér pre PCR, produkt PCR alebo primér mutagenézy. Vynález ďalej popisuje bunku, tkanivo alebo orgán obsahujúce takúto rekombinantnú nukleovú kyselinu.

Dáva sa prednosť bunke, ktorá je prokaryontná, eukaryontná bunka, bakteriálna bunka, kvasinková bunka, bunka hmyzu, cicavčia bunka, myšacia bunka, bunka primátov alebo ľudská bunka. Vynález popisuje kity obsahujúce takúto nukleovú kyselinu a: kompartment obsahujúci uvedenú nukleovú kyselinu; kompartment ďalej obsahujúci proteín a/alebo polypeptid DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR 10 primátov a/alebo inštrukcie na použitie alebo na likvidáciu činidiel. Kit je často možné použiť na kvalitatívnu alebo kvantitatívnu analýzu.

Iné uskutočnenie vynálezu zahrňuje nukleovú kyselinu, ktorá hybridizuje so SEQ ID NO: 3 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 5 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 25 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 9 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 11 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 15 alebo 17 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 31 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 21 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; hybridizuje so SEQ ID NO: 33 počas premývania pri teplote 30 °C a s koncentráciou solí menšou než 2M; vykazuje aspoň približne 85% identitu s pásikmi v dĺžke aspoň 30 nukleotidov s proteínmi DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10 primátov.

Dáva sa prednosť tomu, aby takáto nukleová kyselina mala nasledujúce vlastnosti: premývanie prebiehajúce pri teplote 45 °C a/ alebo pri koncentrácii solí 500 mM; alebo zhoda je aspoň 90 % a/alebo pásik obsahuje aspoň 55 nukleotidov. Väčšmi sa uprednostňuje premývanie prebiehajúce pri teplote 55 °C a/alebo pri koncentrácii solí 150 mM; alebo aby zhoda bola aspoň 95 % a/alebo pásik obsahoval aspoň 75 nukleotidov.

Vynález ďalej popisuje spôsob úpravy fyziológie alebo vývoj bunkovej alebo tkanivovej kultúry buniek, ktorý zahrňuje kontakt bunky s agonistom alebo antagonistom cicavčieho proteínu DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10.

I. Všeobecné informácie

Vynález popisuje aminokyselinovú sekvenciu a sekvenciu DNA cicavcov, kde molekuly receptorov podobné DNAX Toll primátov (DTLR) majú určité definované biologické a štrukturálne vlastnosti. Tieto molekuly sa tu označujú ako DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 alebo DTLR10 a zvyšujú počet členov receptorovej rodiny podobných ľudskému Toll z jedného na desať.

II

Rôzne cDNA kódujúce tieto molekuly sa získali z cDNA sekvenčnej knižnice primátov, ako je napríklad človek. Môže byť nutný iný primát alebo iný zástupca cicavcov.

Niektoré štandardné spôsoby sa popisujú v publikácii Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed., vols 1-3, CSH Press, NY (1989), Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brooklyn, NY; alebo Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York.

Úplná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia segmentu kódujúceho ľudský DTLR1 je zobrazená v SEQ ID NO 1 a 2 (popisuje sa v publikácii Nomura et al., (1994) DNA Res. 1: 27-35). Úplná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia segmentu kódujúceho ľudský DTLR2 je zobrazená v SEQ ID NO 3 a 4. Úplná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia segmentu kódujúceho ľudský DTLR3 je zobrazená v SEQ ID NO 5 a 6. Úplná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia segmentu kódujúceho ľudský DTLR4 je zobrazená v SEQ ID NO 7 a 8. Alternatívna nukleová kyselina a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia segmentu kódujúceho ľudský DTLR4 je zobrazená v SEQ ID NO 25 a 26. Čiastočná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia segmentu kódujúceho ľudský DTLR5 je zobrazená v SEQ ID NO 9 a 10. Úplná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia segmentu kódujúceho ľudský DTLR6 je zobrazená v SEQ ID NO 11 a 12. A čiastočná sekvencia segmentu kódujúceho myšaciu DTLR6 je zobrazená v SEQ ID NO 13 a 14. Ďalšia myšacia sekvencia DTLR6 je zobrazená v SEQ ID NO: 27 a 29 (nukleotidová sekvencia) a SEQ ID NO: 28 a 30 (aminokyselinová sekvencia). Ďalej sa popisuje čiastočná nukleotidová (SEQ ID NO: 15 a 17) a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO: 16 a 18) kódujúca segment ľudského v

DTLR7. Čiastočná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia kódujúca segment ľudského DTLR8 je uvedená v SEQ ID NO: 19 a 20. Úplnejšia nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia kódujúca segment ľudského DTLR je uvedená v SEQ ID NO: 31 a 32. Čiastočná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia kódujúca segment ľudského DTLR9 je uvedená v SEQ ID NO: 21 a 22. Čiastočná nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia kódujúca segment ľudského DTLR10 je uvedená v SEQ ID NO: 23 a 24. Úplnejšia nukleotidová a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia kódujúca segment ľudského DTLR10 je uvedená v SEQ ID NO: 33 a 34. Čiastočná nukleotidová sekvencia myšacieho DTLR10 kódujúca segment ľudského DTLR10 je uvedená v SEQ ID NO: 35.

Tabuľka č. 1: Porovnanie vnútrobunkových domén ľudského DTLR.

DTLR1 je SEQ ID NO: 2; DTLR2 je SEQ ID NO: 4; DTLR2 je SEQ ID NO: 6; DTLR4 je SEQ ID NO: 8; DTLR5 je SEQ ID NO: 10; DTLR6 je SEQ ID NO: 12; Zvlášť dôležité a konzervatívne sú napríklad zbytky zodpovedajúce SEQ ID NO: 18 zbytkom tyrlO-tyrl3; trp26; cys46; trp52; pro54-gly55; ser69; lys71; trp!34-prol35 aphe!44-trpl45.

DTLR1 QRNLQFHAFISYSGHD---SFWVKNELLPNLEKEG-----MQICLHERNF

DTLR9 KENLQFHAFISYSEHD---SAWVKSELVPYLEKED-----IQICLHERNF

DTLR8 ------------------------NELIPNLEKEDGS---ILICLYESYF

DTLR2 SRNICYDAFVSYSERD---AYWVENLMVQELENFNPP---FKLCLHKRDF

DTLR6 SPDCCYDAFIVYDTKDPAVTEWVLAELVAKLEDPREK—HFNLCLEERDW

DTLR7 TSQTFYDAYISYDTKDASVTDWVINELRYHLEESRDK- - NVLLCLEERDW

DTLR10 EDALPYDAFWFDKTXSAVADWVYNELRGQLEECRGRW-ALRLCLEERDW

DTLR4 RGENIYDAFVIYSSQD---EDWVRNELVKNLEEGVPP---FQLCLHYRDF

DTLR5 PDMYKYDAYLCFSSKD- - - FTWVQNALLKHLDTQYSDQNRFNLCFEERDF

DTLR 3 TEQFEYAAYIIHAYKD---KDWVWEHFSSMEKEDQS----LKFCLEERDF

DTLR1 VPGKSIVENIITC- IEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCH- YELYFAHHNLFHE DTLR9 VPGKSIVENIINC-IEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCH-YELYFAHHNLFHE DTLR 8 DPGKSISENIVSF- IEKSYKSIFVLSPNFVQNEWCH-YEFYFAHHNLFHE DTLR2 IPGKWIIDNIIDS-IEKSHKTVFVLSENFVKSEWCK-YELDFSHFRLFEE DTLR 6 LPGQPVLENLSQS-IQLSKKTVFVMTDKYAKTENFK-IAFYLSHQRLMDE DTLR7 DPGLAIIDNLMQS- INQSKKTVFVLTKKYAKSWNFK-TAFYLXLQRLMGE DTLR10 LPGKTLFENLWAS-VYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLR-AIFLLAQQRLLEDTLR4 IPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVWSQHFIQSRWCI -FEYEIAQTWQFLS DTLR 5 VPGENRIANIQDA-IWNSRKIVCLVSRHFLRDGWCL-EAFSYAQGRCLSD DTLR3 EAGVFELEAIVNS-IKRSRKIIFVITHHLLKDPLCKRFKVHHAVQQAIEQ

DTLR1 GSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWAN DTLR9 GSNNLILILLEPIPQNSIPNKYHKLKALMTQRTYLQWPKEKSKRGLFWADTLR8 NSDHIILILLEPIPFYCIPTRYHKLEALLEKKAYLEWPKDRRKCGLFWAN DTLR2 NNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVN

DTLR 6 KVDVIILIFLEKPFQK---SKFLQLRKRLCGSSVLEWPTNPQAHPYFWQC

DTLR7 NMDVIIFILLEPVLQH—-SPYLRLRQRICKSSILQWPDNPKAERLFWQT

DTLR1O -------------------------------------------------DTLR 4 SRAGIIFIVLQKVEKT-LLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRR DTLP.5 LNSALIMWVGSLSQY-QLMKHQSIRGFVQKQQYLRWPEDLQDVGWFLHK DTLR 3 NLDSIILVFLEEIPDYKLNHALCLRRGMFKSHCI LNWPVQKERIGAFRHK

DTLR1 LRAAINIKLTEQAKK-------------------------DTLR9 ----------------------------------------DTLR8 LRAAVNVNVLATREMYELQTFTELNEESRGSTISLMRTDCL

DTLR2 LRAAIKS---------------------------------DTLR 6 LKNALATDNHVAYSQVFKETV-------------------DTLR7 LXNWLTENDSRYNNMYVDSIKQY----------------DTLR1O ----------------------------------------DTLR4 LRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI-----------DTLR 5 LSQQILKKEKEKKKDNNIPLQTVATIS-------------DTLR3 LQVALGSKNSVH----------------------------14

Termín „receptor 2 podobný DNAX Toll (DTLR2)“ sa používa pri popise proteínu, ktorý obsahuje segment proteínu alebo peptidu, ktorý vykazuje alebo zdieľa aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID NO: 4, alebo jej podstatný fragment. Podobne je tomu u DTLR3 a SEQ ID NO: 6, DTLR4 a SEQ ID NO: 26, DTLR5 a SEQ ID NO: 10, DTLR6 a SEQ ID NO: 12, DTLR7 a SEQ ID NO: 16 a 18, DTLR8 a SEQ ID NO: 32, DTLR9 a SEQ ID NO: 22, DTLR10 a SEQ ID NO: 34.

Vynález ďalej zahŕňa proteínové variácie alel DTLR a ich sekvencie, napríklad muteínový agonista alebo antagonista. V typickom prípade takíto agonisti alebo antagonisti budú vykazovať menej než približne 10 % sekvenčných rozdielov, a tak budú často vykazovať jednu až jedenásť substitúcií, napríklad 2-, 3-, 5-, 7-substitúcií. Vynález taktiež popisuje alelové a iné varianty proteínu, sú to napríklad prirodzené polymorfiié varianty. V typickom prípade sa budú viazať na jeho zodpovedajúci biologický receptor s vysokou afinitou, to znamená napríklad približne 100 nM, obvykle lepší ako približne 30 nM, uprednostňuje sa lepší než približne 10 nM a väčšmi sa uprednostňuje lepší než približne 3 nM. Termín je tiež možné použiť pri charakterizácii príbuzných prirodzene sa vyskytujúcich foriem. Sú to napríklad alely, polymorfhé varianty a metabolické varianty cicavčieho proteínu.

Vynález ďalej popisuje proteíny alebo peptidy, ktoré vykazujú podstatnú zhodu s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 4. Tá bude zahrňovať sekvenčné varianty s relatívne niekoľkými substitúciami. To znamená, napríklad, menej než približne s 3 až 5 substitúciami. Podobné rysy platia aj pre iné sekvencie DTLR uvedené v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34.

Podstatný polypeptidový „fragment“ alebo „segment“ je pruh aminokyselinových zbytkov, ktoré obsahujú aspoň približne 8 aminokyselín, vo všeobecnom prípade aspoň 10 aminokyselín, vo všeobecnejšom prípade aspoň 12 aminokyselín, často aspoň 14 aminokyselín, častejšie aspoň 16 aminokyselín, v typickom prípade aspoň 18 aminokyselín, typickejšie je aspoň 20 aminokyselín, obvykle aspoň 22 aminokyselín, obvyklejšie je aspoň 24 aminokyselín, uprednostňuje sa aspoň 26 aminokyselín, väčšmi sa uprednostňuje aspoň 28 aminokyselín, a vo zvlášť preferovanom vyhotovení je približne aspoň 30 alebo viac aminokyselín. Sekvencie segmentov rôznych r

proteínov sa môžu porovnať s inými segmentami s vhodnou dĺžkou. Homológia aminokyselinovej sekvencie alebo sekvenčná identita sa stanovia optimalizáciou párovania zbytkov, ak je to nevyhnutné, zavedením medzier (popisuje sa napríklad v publikácii Needleham et al., (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-445; Sankoff et al., (1983) kapitola 1 v Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comaparison, Addison-Wesley, Reading, MA a Software od firmy IntelliGenetics, Mountain View, CA a University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Tieto zmeny nastanú, keď dôjde ku konzervatívnym substitúciám v párovaní. Konzervatívna substitúcia v typickom prípade zahrňuje substitúcie obsiahnuté v nasledujúcich skupinách: glycín, alanín, valín, izoleucín, leucín; kyselina asparagová, kyselina glutamová; asparagín, glutamín, serín, treonín; lyzín, arginín; a fenylalanín, tyrozín. Homológne aminokyselinové sekvencie zahrňujú prirodzené alelové a vnútrodruhové variácie v sekvencii cytokinov. Typické homológne proteíny alebo peptidy vykazujú 50 až 100 % homológií (ak zahrňujú konzervatívne substitúcie) so segmentom aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34. Homológia bude približne aspoň 70 %, vo všeobecnom prípade aspoň 76 %, preferuje sa aspoň 81 %, často aspoň 85 %, častejšie 88 %, v typickom prípade aspoň 90 %, preferuje sa aspoň 92 %, obvykle aspoň 94 %, obvyklejšie aspoň 95 %, uprednostňuje sa aspoň 96 % a väčšmi sa uprednostňuje aspoň 97 % a vo zvlášť preferovaných vyhotoveniach je homológia aspoň 98 % a viac. Stupeň homológie kolíše s dĺžkou porovnávaných segmentov. Homológne proteíny alebo peptidy, ako sú alelové varianty, majú väčšinu biologických aktivít s vyhotovením vynálezu popísanom v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12,16, 18, 32,22 alebo 34.

Zvlášť zaujímavé oblasti porovnávania na úrovni aminokyselín a nukleotidov zodpovedajú tým uvedeným v blokoch 1 až 10 alebo v oblastiach vo vnútri blokov, ktoré zodpovedajú oblastiam označeným na obrázku č. 2A.

Termín „biologická aktivita“ popisuje účinky ligandov na zápalové odpovede, prirodzenú imunitu a/alebo morfogénny vývoj. Tieto receptory napríklad by mali podobne ako receptory IL-1 sprostredkovať aktivity fosfatázy a fosforylázy, ktoré sú ľahko merateľné štandardnými postupmi (popisuje sa v publikácii Hardie et al., (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks et al., (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter et al., (1992) Celí 70: 375-388; Lewin (1990) Celol 61: 743-752; Pines et al., (1991) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 56: 449463 a Parker et al., (1993) Náture 363: 736-738. Receptory vykazujú biologické aktivity skôr ako regulovateľné proteíny, ktoré sú regulované naviazaním ligandu. Počet zmenených enzýmov je bližšie enzýmu ako receptorovému komplexu. Počet obsadených receptorov, ktorý je nutný k indukcii takejto enzymatickej aktivity je menší ako väčšina receptorových systémov a ich počet sa blíži k dvanástim na jednu bunku, na rozdiel od väčšiny receptorov, ktoré sa blížia tisícom na jednu bunku. Receptory alebo ich časti sa môžu použiť ako enzýmy označujúce fosfáty k označeniu všeobecných alebo špecifických substrátov.

Termíny ligand, agonista, antagonista a analóg, to znamená napr. DTLR, zahrňuje molekuly, ktoré modulujú charakteristické bunkové odozvy na proteíny podobné ligandom Toll, rovnako ako molekuly vykazujúce štandardné štrukturálne väzobné kompetetívne rysy interakcií ligand-receptor. To znamená napríklad v prípade, že receptorom je prirodzený receptor alebo protilátka. Bunkové odozvy sú pravdepodobne sprostredkované naviazaním rôznych ligandov Toll na bunkové receptory, ktoré sú príbuzné, ale možno odlišné od receptorov IL-1 typu I alebo II (popisuje sa v publikácii Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Dev. Biol. 12: 393-416; Morisato a Anderson (1995) Ann. Rev. Genetics 29: 371-3991 a Hultmarkt (1994) Náture 367: 116-117.

Ligand je tiež molekula, ktorá slúži buď ako prirodzený ligand, na ktorý sa viaže uvedený receptor alebo jeho analóg, alebo je to molekula, ktorá je funkčným analógom prirodzeného ligandu. Funkčným analógom môže byť ligand so štrukturálnymi modifikáciami, alebo to môže byť molekula, ktorá nie je vôbec príbuzná. Táto molekula má tvar molekuly, ktorá interaguje s vhodnými determinantami viažúcimi ligandy. Ligandy môžu slúžiť ako agonisty alebo antagonisty (popisuje sa napríklad v publikácii Goodman et al., (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Base of Therapeutics, Pergamon Press, New York.

Príprava liečiva môže byť založená na štúdiu štrukturálnych tvarov molekuly receptora alebo protilátok a iných efektorov a ligandov. Efektory môžu byť ďalšie proteíny, ktoré sprostredkovávajú iné funkcie pri odozve vyvolanej naviazaním ligandu, alebo iné proteíny, ktoré vzájomne reagujú s receptorom. Jeden spôsob stanovenia miesta interakcie so špecifickým proteínom je stanovenie fyzikálnej štruktúry, napríklad použitím kryštalografie lúčmi X alebo dvojrozmernej metódy NMR. Tie napríklad umožnia zistiť, ktoré aminokyselinové zbytky tvoria oblasti kontaktu molekúl. Popis stanovenia štruktúry proteínu sa uvádza napríklad v publikácii Blundell a Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York.

II. Aktivity

Receptorové proteíny podobné Toll vykazujú rad odlišných biologických aktivít, napríklad metabolizujú fosfáty; je možné ich pridať alebo odstrániť zo špecifických substrátov. V typickom prípade ide o proteíny. To v typickom prípade povedie k úprave zápalovej funkcie, k inej prirodzenej imunitnej odpovedi alebo k morfologickému účinku. Proteíny DTLR2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 alebo 10 sú homologické k iným receptorovým proteínom podobným Toll, ale každý vykazuje rozdiely v štruktúre. Kódujúce sekvencie génu ľudského DTLR2 vykazuje pravdepodobne 70% zhodu s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou myšaciu DTLR2. Na úrovni aminokyselín je to významná zhoda. Biologické aktivity DTLR sa vzťahujú k pridaniu a odstráneniu fosfátov zo substrátu, v typickom prípade špecifickým spôsobom, ale príležitostne tiež nešpecifickým spôsobom. Môžu sa identifikovať substráty, alebo sa môžu testovať štandardnými spôsobmi podmienky vhodné pre aktivitu enzýmov, napríklad ako sa popisuje v publikáciách Hardie et al., (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academic Press, San Diego CA; Hanks et al., (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter et al., (1992) Celí 70: 375-388; Lewin (1990) Celí 61: 743-752; Pines et al., (1991) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 56: 449-463; a Parker et al., (1993) Náture 363: 736-738.

III. Nukleové kyseliny

Vynález popisuje použitie izolovanej nukleovej kyseliny alebo fragmentov, ktoré napríklad kódujú tieto, alebo im blízke príbuzné proteíny alebo ich fragmenty. Môžu napríklad kódovať zodpovedajúce polypeptidy, hlavne ten, ktorý je biologicky aktívny. Vynález navyše popisuje izolovanú alebo rekombinantnú DNA, ktorá kóduje také proteíny alebo polypeptidy, ktoré majú jedinú alebo rad charakteristických sekvencií proteinov DTLR. V typickom prípade nukleová kyselina je schopná hybridizovať za vhodných podmienok so segmentom sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 alebo 33, ale dáva sa prednosť tomu, aby nehybridizovala so zodpovedajúcim segmentom SEQ ID NO: 1. Uvedený r

biologicky aktívny proteín môže byť proteín v celej dĺžke, alebo to môže byť fragment a bude v typickom prípade obsahovať segment aminokyselinovej sekvencie vysoko homologický so sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34. Ďalej tento vynález popisuje použitie izolovanej alebo rekombinantnej nukleovej kyseliny alebo jej fragmentu, ktorý kóduje proteíny obsahujúce fragmenty, ktoré sú ekvivalentné s proteínmi DTLR2-10. Izolované nukleové kyseliny môžu mať regulačné sekvencie v oblastiach lemujúcich 3 - a 5'- koniec. To sú napríklad promótory, zosilovače, poly-A adičné signály a iné, ktoré pochádzajú z prirodzeného génu.

Termín „izolovaná“ nukleová kyselina znamená nukleovú kyselinu, napríklad DNA, RNA alebo zmiešaný polymér, ktorý je v podstate čistý. Môže byť napríklad oddelený od iných komponentov, ktoré prirodzene doprevádzajú prirodzenú sekvenciu, ako sú ribozómy, polymerázy a lemujúce genómové sekvencie pochádzajúce z pôvodných druhov. Termín zahrňuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá sa odstránila z prostredia jej prirodzeného výskytu a zahrňuje rekombinantné alebo klonované izoláty DNA, ktoré sa tým odlišujú od prirodzene sa vyskytujúcich kompozícií, a chemicky syntetizované analógy alebo analógy syntetizované biologickou cestou v heterogénnom systéme. V podstate čistá molekula zahrňuje izolované formy molekuly, ktoré sú buď celkom alebo čiastočne čisté.

Izolovaná nukleová kyselina bude vo všeobecnom prípade homogénnou kompozíciou molekúl, ale bude v niektorých vyhotoveniach vynálezu vykazovať heterogenitu, prednostne minoritnú. Táto heterogenita sa v typickom prípade nachádza na konci polymérov alebo v častiach, ktoré nie sú kritické pre požadovanú biologickú funkciu alebo aktivitu.

Termín „rekombinantná“ nukleová kyselina, je v typickom prípade definovaná spôsobom jej produkcie, produkt vyrobený postupom, pričom uvedený postup využíva metód rekombinácie nukleových kyselín, čo napríklad zahrňuje zásah človeka do nukleotidovej sekvencie. V typickom prípade tento zásah zahrňuje in vitro manipuláciu, hoci za istých okolností môže zahrňovať klasické metódy šľachtenia zvierat. V inom prípade nukleová kyselina môže byť pripravená vytvorením sekvencie obsahujúcej fuziu dvoch fragmentov, ktoré spolu prirodzene nesusedia, ale to znamená, že tým sa vylúčia prirodzené produkty, napríklad prirodzene sa vyskytujúce mutanty, ktoré sa nachádzajú v ich prirodzenom štádiu. Produkty sa môžu napríklad produkovať transformovaním buniek s ľubovoľne neprirodzene sa vyskytujúcim vektorom, čo sú nukleové kyseliny obsahujúce sekvencie získané použitím ľubovoľného syntetického oligonukleotidového postupu. Takýto proces sa vykoná tak, že sa kodón nahradí redundantným kodónom, ktorý kóduje rovnakú alebo konzervatívnu aminokyselinu, kým v typickom prípade zabuduje alebo odstráni sekvenciu, ktorú rozoznáva reštrikčný enzým. V inom prípade sa uskutoční proces, ktorý spojí segmenty nukleovej kyseliny požadovaných funkcií, aby vznikla jedna genetická entita obsahujúca požadovanú kombináciu funkcií, ktoré sa nenachádzajú v bežne dostupných prirodzených formách, napríklad kódujú fuzovaný proteín. Miesta, ktoré rozoznáva reštrikčný enzým sú často cieľom takýchto umelých manipulácií, ale na druhej strane, sa môžu začleniť iné špecifické ciele. Sú to napríklad promótory, miesta replikácie DNA, regulačné sekvencie, riadiace sekvencie alebo iné použiteľné rysy. Podobný koncept je možný v prípade rekombinantného, napríklad fuzovaného polypeptidu. Ten bude zahrňovať dimérovú repetíciu. Špecificky sa zahrňujú syntetické nukleové kyseliny, ktoré redundanciou genetického kódu kódujú polypeptidy ekvivalentné s fragmentárni DTLR2-10 a fúzie sekvencií pochádzajúcich z rôznych odlišných príbuzných molekúl, napríklad z iného člena rodiny receptorov IL1.

Termín „fragment“ v kontexte nukleovej kyseliny je priliehajúci segment, ktorý tvorí aspoň približne 17 nukleotidov, vo všeobecnom prípade aspoň 21 nukleotidov, všeobecnejšie aspoň 25 nukleotidov, v obvyklom prípade aspoň nukleotidov, obvyklejšie je aspoň 35 nukleotidov, často aspoň 39 nukleotidov, častejšie aspoň 45 nukleotidov, v typickom prípade 50 nukleotidov, typickejšie je aspoň 55 nukleotidov, obvykle aspoň 60 nukleotidov, obvyklejšie aspoň 66 nukleotidov, uprednostňuje sa aspoň 72 nukleotidov, väčšmi sa uprednostňuje aspoň 79 nukleotidov a vo zvlášť preferovanom vyhotovení vynálezu ho tvorí aspoň 85 nukleotidov a viac. V typickom prípade fragmenty rôznych genetických sekvencií sa môžu porovnávať jedna s druhou. Zvlášť definované segmenty sú také domény, ktoré sa definujú ďalej v texte.

Nukleová kyselina, ktorá kóduje proteín DTLR2-10 bude zvlášť použiteľná na identifikáciu génov, mRNA a cDNA, ktoré kódujú samotné proteíny alebo ich blízko príbuzné proteíny, rovnako ako pri identifikácii DNA, ktorá kóduje polymorfné, alelové alebo iné genetické varianty, ktoré napríklad pochádzajú z rôznych jedincov alebo príbuzných druhov. Preferovanými sondami vhodnými pre takéto testovanie sú tieto oblasti interleukinu, ktoré sú medzi rôznymi polymorfhými variantami konzervatívne, alebo ktoré obsahujú r

nukleotidy, ktorým chýba špecificita a zahrňujú sekvenciu v celej dĺžke alebo skoro v celej dĺžke. V iných situáciách je použiteľnejší polymorfiiý variant špecifickej sekvencie.

Vynález ďalej popisuje molekuly rekombinantných nukleových kyselín a fragmenty, ktoré majú sekvenciu nukleovej kyseliny rovnakú alebo vysoko homologickú s izolovanou DNA. Sekvencie budú často operatívne spojené so segmentami DNA, ktoré riadia transkripciu, transláciu a DNA replikáciu. Tieto segmenty sa v typickom prípade podieľajú na expresii požadovaného segmentu nukleovej kyseliny.

Homológne alebo vysoko identické sekvencie nukleovej kyseliny, v prípade, že sa porovnávajú jedna s druhou, alebo so sekvenciami uvedenými v SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 alebo 33 vykazujú podstatnú podobnosť. Štandardným postupom v prípade homológie nukleových kyselín je buď stanovenie homológie na základe porovnávania sekvencii alebo v závislosti na podmienkach hybridizácie, ktoré sa všeobecne používa v odbore. Porovnávacie podmienky hybridizácie sa popisujú ďalej v texte.

Podstatná zhoda pri porovnávaní sekvencie nukleových kyselín znamená, že segmenty alebo ich komplementárne reťazce sú identické s vhodnou nukleotidovou inzerciou alebo deléciou aspoň približne v 60 % nukleotidov, vo všeobecnom prípade aspoň v 66 % nukleotidov, obyčajne aspoň v 71 %, často aspoň v 76 %, častejšie aspoň v 80 %, obvykle aspoň v 84 %, obvyklejšie v 88 %, v typickom prípade aspoň v 99 %, väčšmi typická je aspoň 93% zhoda, uprednostňuje sa aspoň približne 95% zhoda, väčšmi sa uprednostňuje aspoň približne 96 až 98% zhoda alebo väčšia. Inzercia alebo delécia zahrňuje napríklad segmenty kódujúce štrukturálne domény, ako sú segmenty popísané ďalej v texte. V inom prípade dochádza k podstatnej zhode, keď budú hybridizovať za selektívnych hybridizačných podmienok s reťazcom alebo s jeho komplementom v typickom prípade použitím sekvencie získanej zo SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 alebo 33. V typickom prípade dôjde k selektívnej hybridizácii, keď existuje aspoň približne 55% homológia v dĺžke pruhu nukleovej kyseliny, ktorý obsahuje aspoň približne 14 nukleotidov. V typickejšom prípade sekvencie musia byť homologické aspoň približne 65 %, uprednostňuje sa aspoň približne 75 % a väčšmi sa uprednostňuje aspoň približne 90 % (čo sa popisuje v publikácii Kanehisa (1994) Nuc. Acids Res. 12: 203-213.

Pruhy sekvencii, ktoré sa porovnávajú, môžu byť dlhé a v istých preferovaných prevedeniach vynálezu sa porovnávajú pruhy obsahujúce aspoň približne 17 nukleotidov, vo všeobecnom prípade aspoň približne 20 nukleotidov, obyčajne aspoň približne 28 nukleotidov, v typickom prípade aspoň približne 40 nukleotidov, uprednostňuje sa aspoň približne 50 nukleotidov a väčšmi sa uprednostňuje aspoň približne 75 až 100 alebo viac nukleotidov.

Prísne podmienky hybridizácie vo vzťahu s homológiou, je kombinácia prísnych podmienok koncentrácie solí, teploty, organických rozpúšťadiel a iných parametrov, ktorou sa v typickom prípade pri hybridizačnej reakcii riadi. Prísne teplotné podmienky hybridizácie obvykle zahrňujú teploty presahujúce približne 30 °C, väčšmi obvyklé sú teploty presahujúce približne 37 °C, v typickom prípade sú to teploty presahujúce približne 45 °C, typickejšie sú teploty presahujúce približne 55 °C, uprednostňujú sa teploty presahujúce približne 65 °C a väčšmi sa uprednostňujú teploty presahujúce približne 70 °C. Prísne podmienky koncentrácie solí znamenajú obvykle koncentráciu nižšiu než približne 500 mM, obvykle znamenajú koncentráciu nižšiu než približne 400 mM, obvyklejšia je koncentrácia nižšia než približne 300 mM, v typickom prípade ide o koncentráciu nižšiu ako približne 200 mM, uprednostňuje sa koncentrácia nižšia ako približne 100 mM a väčšmi sa uprednostňuje koncentrácia nižšia ako približne 80 mM, alebo dokonca nižšia ako približne 20 mM. Kombinácia parametrov je však omnoho dôležitejšia, ako meranie ľubovoľného jediného parametra (popisuje sa v publikácii Wetmur a Davison (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370).

V inom prípade, za účelom porovnávania sekvencií, jedna sekvencia pôsobí ako referenčná sekvencia, s ktorou sa porovnáva testovacia sekvencia. Ak sa použije algoritmus na porovnávanie sekvencie, tak sa testovaná a referenčná sekvencia zadajú do počítača, ak je potrebné, označia sa koordináty subsekvencií, a taktiež sa označia parametre programu sekvenčného algoritmu. Algoritmus porovnávania sekvencií potom vypočíta na základe označených parametrov programu percento zhody sekvencií pre testovanú sekvenciu (e) vzhľadom k referenčnej sekvencii.

Vykoná sa stanovenie optickej orientácie sekvencií vhodné na porovnanie, napríklad algoritmus lokálnej homológie podľa publikácie Smith a Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; algoritmom podľa publikácie Needleman a Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, skúmaním podobnosti metódou podľa publikácie Pearson a Lipman (1988) Proc. Naťl. Acad. Sci. USA 85: 2444, počítačovou implementáciou týchto algoritmov (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA do produktu Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), alebo vizuálnym štúdiom (popisuje sa vo všeobecnej forme v publikácii Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York).

Jedným príkladom použiteľného algoritmu je PILEUP. PILEUP tvorí usporiadanie viacerých sekvencií zo skupiny príbuzných sekvencií použitím progresívneho usporiadania v zmysle párovania za účelom ukázať ich vzťah a percento zhody sekvencií. Výsledkom je taktiež strom alebo dendogram, ktorý ukazuje vzťahy používané pri vytvorení usporiadaní. PILEUP používa zjednodušené progresívne metódy popísané v publikácii Feng a Doolite (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. Používaná metóda je podobná metóde popísanej v publikácii Higgins a Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153. Program môže usporiadať až 300 sekvencií, pričom každá môže mať maximálnu dĺžku 5000 nukleotidov alebo aminokyselín. Pri viacnásobnom postupe usporiadania začína párovým usporiadaním dvoch najviac podobných sekvencií, pričom vzniká klaster dvoch usporiadaných sekvencií. Tento klaster je potom zaradený vedľa najviac príbuzných sekvencií alebo vedľa klastra usporiadaných sekvencií. Dva klastry sekvencií sú nastavené jednoduchým pretiahnutím usporiadania v zmysle párov dvoch jednotlivých sekvencií. Konečné usporiadanie je dosiahnuté sériami progresívneho usporiadania párov. Program potom navrhuje špecifické sekvencie a ich aminokyselinové alebo nukleotidové koordináty pre prípad porovnávania oblastí sekvencií a ďalej navrhuje parametre programu. Referenčná sekvencia sa môže napríklad porovnať s inou testovanou sekvenciou za účelom stanovenia percenta zhody sekvencií použitím nasledujúcich parametrov: štandardná miera významnosti rozdielu (3,00), štandardná miera ŕ

významnosti dĺžky (0,10) a miera významnosti konečných rozdielov.

Iným príkladom algoritmu, ktorý je vhodný na stanovenie percenta zhody sekvencii a podobnosti sekvencii je algoritmus BLAST, ktorý sa popisuje v publikácii Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Software vhodný na vykonanie analýz BLAST je dostupný prostredníctvom inštitúcie National Center for Biotechnology Information (http:WWW.ncbi.nlm.nih.gov/). Tento algoritmus postupuje takto: najskôr sa v testovanej sekvencii identifikujú sekvenčné páry s vysokým počtom (HSP) tým, že sa identifikujú krátke slová o dĺžke W, ktoré sa buď celkom párujú alebo vyhovujú pozitívne hodnotenému prahovému počtu T, ktoré sa v databáze sekvencii usporiadava x

so slovom rovnakej dĺžky. T sa označuje ako prahový počet okolitých slov (popisuje sa v publikácii Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Tieto počiatočné objavy okolitých slov pôsobia ako zrnko počiatočného prieskumu za účelom nájdenia dlhších HSP, ktoré obsahujú uvedené krátke slová. Nájdené slovo sa potom predlžuje v oboch smeroch pozdĺž každej sekvencie tak dlho, až sa môže zvýšiť kumulatívny počet usporiadania. Predlžovanie nájdených slov v každom smere sa zastaví, keď: kumulatívny počet začne klesať zo svojej maximálne dosiahnutej hodnoty, čo je spôsobené množstvom X; kumulatívny počet klesá na nulu alebo nižšie, čo je spôsobené akumuláciou jedného alebo viacerých negatívne skórujúcich usporiadaní zbytkov alebo sa dosiahne koniec ľubovoľnej sekvencie. Parametre algoritmu BLAST, sú to W, T a X, stanovujú citlivosť a rýchlosť usporiadania. Program BLAST používa ako štandardnú dĺžku slova (W) 11, usporiadanie skórovacej matrice BLOSUM62 (B) (popisuje sa v publikácii Henikoff a Henikoff (1989) Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 89: 10915) je 50, pravdepodobnosť (E) je 10, M=5, N=4 a porovnávanie oboch reťazcov.

Mimo počítania percenta sekvenčnej identity algoritmus BLAST tiež umožňuje štatistickú analýzu podobnosti dvoch sekvencii (popisuje sa napríklad v publikácii Karlin a Altschul (1993) Proc. Naťl. Acad. Sci. USA 90: 5837-5787). Jedno stanovenie podobnosti vykonané algoritmom BLAST je najmenší súčet pravdepodobnosti (P(N)), ktorý určuje pravdepodobnosť, pri ktorej dôjde k párovaniu medzi dvoma nukleotidovými alebo aminokyselinovými sekvenciami. Nukleová kyselina sa napríklad považuje za podobnú s referenčnou sekvenciou, ak najmenší súčet pravdepodobnosti pri porovnaní testovanej nukleovej kyseliny s referenčnou nukleovou kyselinou je menší ako približne 0,1, uprednostňuje sa menší ako približne 0,01 a najviac sa preferuje menší ako približne 0,001.

Ďalšie indikácie podstatnej zhodnosti dvoch sekvencií nukleových kyselín je skutočnosť, že polypeptid kódovaný prvou nukleovou kyselinou prekrížené reaguje s polypeptidom kódovaným druhou nukleovou kyselinou, ako sa popisuje ďalej v texte. Polypeptid je v typickom prípade v podstate zhodný s druhým peptidom; napríklad, keď sa dva peptidy líšia len konzervatívnymi substitúciami. Ďalšie označenie dvoch sekvencií nukleových kyselín, ktoré sú v podstate rovnaké je, že molekuly spolu vzájomne hybridizujú za prísnych podmienok, ako sa popisuje ďalej v texte.

Izolovaná DNA sa potom môže ľahko upravovať substitúciami nukleotidov, deléciou nukleotidov, inzerciou nukleotidov a inverziou pruhov nukleotidov. Tieto modifikácie vedú k vytvoreniu novej sekvencie DNA, ktorá kóduje tento proteín alebo jeho deriváty. Tieto modifikované sekvencie sa môžu použiť na produkciu mutantných proteínov (muteínov), alebo na zosilnenie expresie rôznych druhov. Zosilnenie expresie môže zahrňovať amplifikáciu génu, zosilnenú transkripciu a transláciu a iné mechanizmy. Takéto deriváty podobné mutantu DTLR zahrňujú predtým stanovenú alebo miestne špecifickú mutáciu proteínu alebo jeho fragmentov, zahrňujúcu tiché mutácie použitím degenerácie genetického kódu. Termín „mutantné DTLR“ znamená polypeptid patriaci do definície homológie DTLR, ako sa uvádza vyššie v texte, ale vykazujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši od sekvencie iných proteínov podobných DTLR, ktoré sa nachádzajú v prírode, čoho sa dosiahlo deléciou, substitúciou alebo inzerciou. Termín „miestne špecifický mutant DTLR“ znamená proteín vykazujúci podstatnú homológiu s proteínom so sekvenciou SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34 a v typickom prípade zdieľa väčšinu biologických aktivít alebo účinkov tu popísaných foriem.

Hoci miesta miestne špecifickej mutácie sú dopredu určené, mutanty nemusia byť miestne špecifické. Mutagenéza cicavčieho DTLR sa dosiahne vykonaním inzerciami a deléciami aminokyselín v géne, čo sa spája s expresiou. Aby sa dosiahla konečná konštrukcia, môžu sa vykonať substitúcie, delécie, inzercie alebo ich ľubovoľné kombinácie. Inzercie zahrňujú amino- alebo karboxy-terminálne fúzie. Náhodná mutagenéza sa vykonáva v cieľovom kodóne a u exprimovaných mutantov cicavčieho DTLR sa môže testovať jeho požadovaná aktivita. Metódy, vhodné na uskutočnenie substitučných mutácií v dopredu určených miestach v DNA so známymi sekvenciami, sú v odbore dobre známe, napríklad Ml3 primerová mutagenéza (popisuje sa v publikáciách Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk, a Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brooklyn, NY; alebo Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York).

Mutácie DNA by v normálnom prípade nemali umiestňovať kódujúce sekvencie mimo čítacie rámce a prednostne by nemali tvoriť komplementárne oblasti, ktoré by mohli hybridizovať, a tak produkovať sekundárnu štruktúru mRNA, ako sú slučky alebo vlásenková štruktúra.

Metóda používajúca fosforamidit, ktorý sa popisuje v publikácii Beaucage a Carruthes (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, bude produkovať vhodné syntetické fragmenty DNA. Dvojreťazcový fragment je možné často získať buď syntézou komplementárneho reťazca za vhodných podmienok, alebo pridaním komplementárneho reťazca použitím DNA polymerázy s vhodnou primárnou sekvenciou. Pri mutagenéze sa často používajú metódy polymerázových reťazových reakcií (PCR). V inom prípade sa ako bežné metódy vedúce k definovaným mutáciám v dopredu určených miestach používajú mutagénne priméry (popisuje sa napríklad v publikácii Innis et al., (eds. 1990) PCR protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; a Dieffenbach a Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.).

IV. Proteíny, Peptidy

Ako sa popisuje vyššie v texte, vynález popisuje DTLR2-10 primátov, jeho sekvencie sú napríklad uvedené v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34. Vynález taktiež zahrňuje alelové a iné varianty, ako je napríklad kombinovanie sekvencií časťou fuzovaných proteinov s inými nukleovými kyselinami, ktoré zahrňujú epitop tags a funkčné domény.

Vynález ďalej popisuje rekombinantné proteíny, napríklad heterogénne fuzované proteíny získané použitím segmentov z týchto proteinov hlodavcov. Heterogénny fuzovaný proteín je fúzia proteinov alebo segmentov, ktoré v normálnom prípade prirodzene nefuzujú rovnakým spôsobom. Fuzovaný produkt DTLR s receptorom IL-1 je spojená proteínová molekula, ktorá má sekvencie fuzované v typickom peptidovom spojení. V typickom prípade sa pripravuje ako jediný produkt translácie a vykazuje vlastnosti (napríklad sekvenciu alebo antigenicitu) získané z každého zdroja peptidu. Podobný koncept sa aplikuje v prípade heterogénnych sekvencií nukleových kyselín. Navyše sa nové konštrukcie môžu pripraviť kombinovaním podobných funkčných a štrukturálnych domén, ktoré pochádzajú z iných príbuzných proteinov, ktoré zahrňujú varianty druhov. Sú to napríklad receptory IL-1 alebo iné proteíny DTLR. Segmenty viažúce ligandy alebo iné segmenty môžu sa napríklad presúvať medzi rôznymi novými fuzovanými polypeptidmi alebo fragmentárni (popisuje sa napríklad v publikácii Cunningham et al., (1989) Science 243: 1330-1336; a O'Dowd et al., (1988) J. Biol. Chem. 263:

15985-15992). Domény viažúce ligand z iných príbuzných molekúl receptora sa môžu pridať k iným doménam uvedených alebo príbuzných proteínov. Výsledný proteín bude často vykazovať hybridnú funkciu alebo vlastnosti. Fuzovaný proteín môže napríklad zahrňovať cieľové domény, ktoré môžu slúžiť k doručeniu fuzovaného proteínu do určitých subcelulámych oganel. Kandidáti ťuzovaných partnerov a sekvencií sa môžu vybrať z rôznych sekvenčných databáz, napríklad GenBank, c/o IntelliGenetics, Mountain View, C A; a BCG University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI.

Vynález zvlášť popisuje muteíny, ktoré viažu ligandy Toll a/alebo, ktoré spôsobujú signálnu transdukciu. Štrukturálne usporiadanie ľudského DTLR110 s inými členmi rodiny IL-1 vykazuje konzervatívne rysy/zbytky (uvedené na obrázku č. 3A). Usporiadanie sekvencií ľudského DTLR s inými členmi rodiny IL-1 označuje rôzne štrukturálne a funkčné zdieľané rysy (popisuje sa v publikácii Bazan et al., (1996) Náture 379: 591; Lodi et al., (1994) Science 263: 1762-1766; Sayle a Milner-White (1995) TIBS 20: 374-376 a Gronenberg et al., (1991) Protein Engineering 4: 263-269).

Ligandy IL-Ια a IL-1 β sa viažu na receptor IL-1 typ I ako primárny receptor a tento komplex potom tvorí receptorový komplex s vysokou afinitou s receptorom IL-1 typu III. Takéto receptorové podjednotky sú pravdepodobne zdieľané ako noví členovia rodiny IL-1.

Podobné variácie v iných druhoch náprotivkov sekvencií DTLR2-10, napríklad v zodpovedajúcich oblastiach, vykazujú podobné interakcie s ligandom alebo so substrátom. Preferujú sa substitúcie buď s myšacími alebo ľudskými sekvenciami. Naopak, konzervatívne substitúcie mimo oblasti viažúcej ligandy, pravdepodobne budú chrániť väčšinu signálnych aktivít. Termín „deriváty“ DTLR2-10 primátov zahrňujú mutanty aminokyselinových sekvencií, glykozylované varianty, metabolické deriváty a kovalentné alebo agregované konjugáty s inými chemickými látkami. Kovalentné deriváty sa môžu pripraviť spojením funkčností so skupinami, ktoré sa nachádzajú vo vedľajších aminokyselinových reťazcoch DTLR alebo na N- alebo C-konci. Tieto deriváty môžu zahrňovať bez obmedzenia alifatické estery alebo amidy karboxylových koncov alebo zbytky obsahujúce karboxylové postranné reťazce, O-acyl-deriváty zbytkov, ktoré obsahujú hydroxylovú skupinu a Nacyl-deriváty aminokyseliny na N-konci alebo zbytky obsahujúce aminoskupinu, napríklad lyzín alebo arginín. Acylové skupiny sa vybrali zo skupiny alkylových častí, ktorá zahrňuje normálny alkyl s C3 až C18, pričom sa tvoria alkanoylové druhy.

Zvlášť sa zahrňujú zmeny vzniknuté glykozyláciou, vytvorené napríklad upravením glakozylačných patemov polypeptidu počas jeho syntézy a úpravy alebo v iných krokoch úpravy. Zvlášť preferovaný spôsob ako to dosiahnuť, je vystaviť polypeptid glykozylačným enzýmom získaných z buniek, ktoré v normálnom prípade takéto úpravy vykonávajú, napríklad sú to cicavčie glykozylačné enzýmy. Vynález tiež zahrňuje glykozylačné enzýmy. Vynález ďalej popisuje verzie rovnakej primárnej aminokyselinovej sekvencie, ktorá má iné minoritné modifikácie, zahrňujúce fosforylované aminokyselinové zbytky, napríklad fosfotyrozín, fosfoserín alebo fosfotreonín.

Hlavná skupina derivátov sú kovalentne konjugáty receptorov alebo ich fragmentov s inými proteínmi polypeptidov. Tieto deriváty sa môžu syntetizovať v rekombinantnej kultúre, ako je N- alebo C-teminálna fúzia alebo použitím činidiel, ktoré je možné použiť pri sieťovaní proteínov prostredníctvom reaktívnych vedľajších skupín. Preferovanými miestami derivatizácie s činidlami pre sieťovanie sú voľné aminokyseliny, sacharidy a cysteínové zbytky.

Vynález ďalej popisuje fuzované polypeptidy medzi receptormi a inými homológnymi alebo heterogénnymi proteínmi. Homológne polypeptidy môžu byť fuzované medzi rôznymi receptormi, čo vedie napríklad ku vzniku hybridných proteínov, ktoré vykazujú väzobnú špecifickú pre viac odlišných ligandov, alebo receptor, ktorý môže mať rozsiahlu alebo slabú špecificitu pôsobenia substrátu. Podobne sa môžu konštruovať heterogénne fúzie, ktoré vykazujú kombináciu vlastností alebo aktivít derivovaných proteínov. Typickými príkladmi sú fúzie reportného polypeptidu, napríklad luciferázy so segmentom alebo doménou receptoru, napríklad segment viažúci ligand, potom sa dá ľahko stanoviť prítomnosť alebo poloha požadovaného ligandu (popisuje sa napríklad v publikácii Duli et al., US patent č. 4, 859,609). Medzi iných fuzovaných génových partnerov je zahrnutá glutatión-Stransferáza (GST), bakteriálna β-galaktozidáza, trpE, proteín A, β-laktamáza, alfa-amyláza, alkoholdehydrogenáza a kvasinkový alfa faktor kríženia (popisuje sa v publikácii Godowski et al., (1988) Science 241: 812-816). Metóda používajúca fosforamidit, popísaná v publikácii Beaucage a Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, bude produkovať vhodné syntetické fragmenty DNA. Dvojreťazcový fragment je možné často získať buď syntézou komplementárneho reťazca a teplotnou hybridizáciou reťazca spolu za vhodných podmienok, alebo pridaním komplementárneho reťazca použitím DNA polymerázy s vhodnou sekvenciou primeru.

Takéto polypeptidy môžu mať taktiež aminokyselinové zbytky, ktoré sa chemicky upravili fosforyláciou, sulfonáciou, biotinyláciou alebo adíciou, alebo odstránením iných látok, ktoré majú tvar molekúl podobný fosfátovým skupinám. V niektorých vyhotoveniach vynálezu sa úpravy môžu použiť pri označení činidiel alebo slúžia ako ciele čistenia, napríklad afinitné ligandy. Fúzované proteíny sa v typickom prípade pripravujú buď metódami rekombinácie nukleových kyselín alebo metódami syntézy polypeptidov. Postupy manipulácie nukleových kyselín a expresia sa všeobecne popisujú v publikácii Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York a Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Metódy syntézy polypeptidov sa popisujú napríklad v publikácii Merrifield (1963) J. Amer.

Chem. Soc. 85: 2149-2156; Merrifíeld (1986) Science 232: 341-347; a Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. V publikácii Dawson et al., (1994) Science 266: 776-779 sa popisujú metódy prípravy väčších polypeptidov.

Vynález ďalej popisuje použitie derivátov DTLR2-10 iných, ako sú variácie v aminokyselinovej sekvencii alebo glykozylácia. Takéto deriváty môžu zahrňovať kovalentné alebo agregatívne spojenie s chemickými látkami. Tieto deriváty sa všeobecne delia do troch tried: (1) sóle, (2) kovalentná modifikácia bočného reťazca a terminálneho zbytku a (3) adsorbčné komplexy, napríklad s bunkovými membránami. Takéto kovalentné alebo agregatívne deriváty sa môžu použiť ako imunogény, ako činidlá v imunotestoch, alebo pri metódach čistenia, ako je napríklad afinitné čistenie receptora alebo iných viažúcich sa molekúl, napríklad protilátok. Lignad Toll môže byť napríklad imobilizovaný kovalentnou väzbou na pevnom nosiči, ako je sefaróza aktivovaná kyanidom brómnym, metódami, ktoré sú dobre známe v odbore, alebo adsorbciou na povrchu polyolefínov s alebo bez sieťovania s glutaraldehydom za účelom použitia v testoch alebo pri čistení receptora DTLR, protilátok alebo iných podobných molekúl. Ligand je taktiež možné označiť detekovateľnou skupinou, napríklad rádioaktívnym jódom pomocou chloramínu T. Môže sa kovalentne viazať na cheláty vzácnych zemín alebo spájať s inými fluorescenčnými látkami použiteľnými v diagnostických testoch. DTLR podľa vynálezu sa môže použiť ako imunogén na produkciu antiséra alebo špecifických protilátok, ktoré sú napríklad schopné rozlíšiť IL-1 receptor medzi inými členmi rodiny k DTLR alebo rôznym ich fragmentom. Čistené DTLR sa môžu použiť na testovanie monoklonálnych protilátok alebo fragmentov viažúcich antigén, ktoré sa pripravili imunizáciou rôznymi formami nečistých prípravkov obsahujúcich proteín. Termín „protilátky“ taktiež zahrňuje fragmenty prirodzených protilátok viažúcich antigén. Sú to napríklad Fab, Fab2, Fv atď..

Čistený DTLR sa môže taktiež použiť ako činidlo na detekciu protilátok, ktoré sa tvoria ako odpoveď na prítomnosť zosilnenej expresie, alebo imunologických porúch, ktoré vedú k produkcii protilátok voči endogénnemu receptoru. Navyše, fragmenty DTLR taktiež môžu slúžiť, podľa vynálezu, ako imunogény pri produkcii protilátok, ako sa bezprostredne popisuje ďalej v texte. Tento vynález ďalej popisuje protilátky vykazujúce väzobnú afinitu k aminokyselinovým sekvenciám uvedeným v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34 alebo k ich fragmentom alebo rôznym homológnym peptidom. Tento vynález zvlášť popisuje protilátky vykazujúce väzobnú afinitu alebo protilátky, ktoré vznikli k špecifickým fragmentom, o ktorých sa predpokladá, že budú alebo sú vystavené vonkajšiemu proteínovému povrchu prirodzeného DTLR.

Zablokovanie fyziologickej odpovede na receptorové ligandy môže byť výsledkom inhibície naviazania ligandu na receptor, čo sa pravdepodobne deje prostredníctvom kompetetívnej inhibície. Test in vitro podľa vynálezu bude často používať protilátky alebo segmenty viažúce antigény týchto protilátok alebo fragmenty zachytené na pevnom substráte. Tieto testy taktiež umožnia diagnostické stanovenie účinku mutácií alebo modifikácií oblastí viažúcich ligandy alebo iných mutácií alebo modifikácií, ktoré napríklad spôsobujú signálne alebo enzymatické funkcie.

Vynález ďalej zahrňuje použitie orientačných testov kompetetívnych liekov, kde napríklad neutralizačné protilátky voči receptoru alebo fragmentom súťažia s testovanou látkou pri naviazaní na ligand alebo s inou protilátkou. Týmto spôsobom sa môžu použiť neutralizačné protilátky alebo fragmenty na detekciu prítomnosti polypeptidu, ktorý zdieľa jedno alebo viac väzobných miest pre receptor, a môže sa taktiež použiť na obsadenie väzobných miest na receptore, ktorý môže viazať ligand iným spôsobom.

V. Príprava nukleových kyselín a proteínu

DNA, ktorá kóduje proteín alebo jeho fragment, sa môže získať chemickou syntézou, testovaním knižníc cDNA alebo testovaním genómových knižníc pripravených z rôznych bunkových línií alebo tkanivových vzoriek. Prirodzené sekvencie sa môžu izolovať použitím Štandardných metód a tu popísaných sekvencií. Náprotivky iných druhov je možné stanoviť hybridizáciou alebo rôznymi spôsobmi PCR kombinovanými s vyhľadávaním v sekvenčných databázach, napríklad v GenBank.

Táto DNA sa môže exprimovať vo veľkom množstve hostiteľských buniek za účelom syntézy receptora v celej dĺžke alebo fragmentov, ktoré sa naopak napríklad môžu použiť na prípravu polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok; na účely štúdia možnosti väzby; na konštrukciu a expresiu upravených domén viažúcich ligandy alebo kinázové/fosfátové domény a na štúdium štruktúry/funkcie. Varianty alebo fragmenty sa môžu exprimovať v hostiteľských bunkách, ktoré sú transformované alebo transfekované vhodnými expresívnymi vektormi. Tieto molekuly môžu existovať v podstate bez proteínových alebo bunkových kontaminantov, ktoré sú iné, ako tie, získané z rekombinantného hostiteľa, a preto sú zvlášť použiteľné vo farmaceutických kompozíciách, keď sa kombinujú s farmaceutický prijateľným nosičom a/alebo riedidlom. Proteín alebo jeho časti sa môžu exprimovať ako fúzia s inými proteínmi.

Expresívne vektory sú v typickom prípade samostatne sa replikujúce konštrukcie DNA alebo RNA obsahujúce požadovaný gén receptora alebo jeho fragmenty obyčajne operatívne spojené s vhodnými riadiacimi genetickými elementárni, ktoré sa rozoznávajú vo vhodnej hostiteľskej bunke. Tieto riadiace elementy sú schopné ovplyvniť expresiu vo vhodnom hostiteľovi. Špecifický typ riadiacich elementov, nevyhnutný na ovplyvnenie expresie, závisí od použitej hostiteľskej bunky. Vo všeobecnom prípade, riadiace genetické elementy môžu zahrňovať prokaryontný promótorový systém alebo eukaryontný promótorový systém riadiaci expresiu a v typickom prípade, zahrňuje transkripčný promótor, operátor na riadenie transkripcie, zosilovač transkripcie na zosilnenie expresie mRNA, sekvenciu, ktorá kóduje vhodné miesto pre naviazanie ribozómu a sekvencie, ktorá ukončujú transkripciu a transláciu. Expresívne vektory taktiež obyčajne obsahujú počiatok replikácie, ktorý umožňuje vektoru replikáciu nezávisle na hostiteľskej bunke.

Vektory podľa vynálezu zahrňujú tie vektory, ktoré obsahujú DNA kódujúcu opísaný proteín alebo fragment uvedenej DNA kódujúci biologicky aktívny ekvivalentný polypeptid. DNA sa môže riadiť vírusovým promótorom a môže kódovať selekčné označenie. Vynález ďalej popisuje použitie takých expresívnych vektorov, ktoré sú schopné exprimovať eukaryontnú DNA kódujúcu uvedený proteín v prokaryontnom alebo eukaryontnom hostiteľovi, kde vektor je kompatibilný s hostiteľom a kde eukaryontná cDNA kódujúca receptor je začlenená do vektoru tak, že kultivovaný hostiteľ obsahujúci vektor exprimuje uvedenú cDNA. Expresívne vektory sa obyčajne navrhujú tak, aby došlo k ich stabilnej replikách v hostiteľských bunkách, alebo sa amplifikáciou v bunke značne zvýši celkový počet kópií požadovaného génu. Nie je vždy nutné požadovať, aby sa expresívny vektor v hostiteľskej bunke replikoval. Napríklad je možné spôsobiť transientnú expresiu proteínu alebo jeho fragmentov v rôznych hostiteľoch použitím vektorov, ktoré neobsahujú počiatok replikácie rozpoznávaný hostiteľskou bunkou. Je tiež možné použiť vektory, ktoré spôsobujú začlenenie časti DNA kódujúcej proteín alebo jeho fragmenty rekombináciou do DNA hostiteľa.

Vektory, ktoré sa používajú podľa vynálezu, zahrňujú plazmidy, vírusy, bakteriofágy, integrovateľné fragmenty DNA a iné vehikly, ktoré sú schopné sa začleniť do hostiteľského genómu. Expresívne vektory sú špecializované vektory, ktoré obsahujú genetické riadiace elementy, ktoré ovplyvňujú expresiu operatívne spojených génov. Plazmidy sa väčšinou používajú vo forme vektoru, ale podľa vynálezu sú vhodné všetky iné formy vektorov, ktoré majú ekvivalentné funkcie, a ktoré sú alebo sa stávajú známymi v odbore (popisuje sa v publikácii Pouwels et al., Clonning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y. a Rodriquez et al., (eds) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, 1988.

Transformované bunky sú bunky, uprednostňujú sa cicavčie bunky, transformované alebo transfekované receptorovými vektormi, konštruovanými použitím metód rekombinácie DNA. Transformované hostiteľské bunky obyčajne exprimujú požadovaný proteín alebo jeho fragmenty, ale na účely klonovania, amplifikácie a manipulácie DNA nie je expresia proteínu nutná. Vynález ďalej zahrňuje kultiváciu transformovaných buniek v kultivačnom výživnom médiu, ktoré umožňuje hromadenie receptoru v bunkovej membráne. Proteín je možné získať z kultúry, alebo v určitých prípadoch z kultivačného média.

Na účely vynálezu sú nukleové kyseliny v prípade, že sú vzájomne funkčne príbuzné, operatívne spojené jedna s druhou. Pre-sekvencia alebo vedúca sekvencia sekrécie sú operatívne spojené s polypeptidom, ak sa exprimujú ako pre-proteín alebo sa podieľajú na riadení polypeptidu do bunkovej membrány alebo na sekréciu polypeptidu. Promótor je operatívne spojený s kódujúcou sekvenciou, ak riadi transkripciu polypeptidu. Väzobné miesto pre ribozóm je operatívne spojené s kódujúcou sekvenciou, ak je umiestnené tak, aby umožnilo transkripciu. Obyčajne termín „operatívne spojený“ znamená priliehajúci a umiestnený v čítajúcom rámci. Isté genetické elementy, ako sú gény represorov, však nie sú priliehajúce, ale stále sa viažu na sekvenciu operátora, ktorá riadi expresiu.

Vhodné hostiteľské bunky zahrňujú prokaryonty, nižšie eukaryonty a vyššie eukaryonty. Prokaryonty zahrňujú gram-negatívne a gram-pozitívne organizmy, ako je napríklad E. coli a B. subtilis. Nižšie eukaryonty zahrňujú kvasinky, napríklad S. cerevisiae a Pichia a druhy rodu Dictystelium. Vyššie eukaryonty zahrňujú tkanivové kultivačné bunkové línie, odvodené z buniek zvierat, ktoré nepochádzajú (hmyzie a vtáčie bunky), alebo pochádzajú z cicavcov (napríklad človek, primáti a hlodavce).

Prokaryontné systémy hostiteľských vektorov zahrňujú rad vektorov z rôznych druhov. Vo všeobecnom prípade, rovnako ako tu, sa používa baktéria E. coli. Vektorom, vhodným na amplifikáciu DNA je pBR322 alebo rad jeho derivátov. Vektory, ktoré sa môžu použiť na expresiu receptora alebo jeho fragmentov zahrňujú, ale nie sú obmedzené na lac promótor (pUC séria), trp promótor (pBR322-trp), Ipp promótor (pIN-séria), lambda-pP alebo pP promótory (pOTS) alebo hybridné promótory, ako je ptac (pDR540) (popisuje sa v publikácii Brosius et al., (1988) „Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, a Ipp- derived Promotors,“ in Vectors: A Survey of Molecular Clonning Vectors and Their Uses, (eds. Rodriguez a Denhardt), Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp. 205-236).

Nižšie eukaryonty, ako sú napríklad kvasinky a Dictyostelium, sa môžu transformovať vektormi obsahujúcimi sekvenciu DTLR. Za účelom uvedeného vynálezu najbežnejší nižší eukaryontný hostiteľ sú kvasinky na pečenie Saccharomyces cerevisiae. Vo všeobecnom prípade reprezentujú nižšie eukaryonty, hoci sa môže použiť rad iných kmeňov. Kvasinkové vektory v typickom prípade obsahujú počiatok replikácie (iba ak by bol už integrovaný), gén vhodný na selekciu, promótor, DNA kódujúci receptor alebo jeho fragmenty a sekvencie na ukončenie polyadenylácie a transkripcie. Vhodné expresívne vektory pre kvasinky zahrňujú konštitutívne promótory, ako je 3-fosfoglycerátová kináza a rôzne iné promótory génov glykolytických enzýmov, alebo indukovateľné promótory, ako je promótor alkoholovej dehydrogenázy 2 alebo metalotionínový promótor. Vhodné vektory zahrňujú deriváty nasledujúcich typov: samo sa replikujúce s malým počtom kópií (ako sú YRp-série), samo sa replikujúce s vysokým počtom kópií (ako sú YEp38 série), integračné typy (ako je Ylp-série) alebo mini-chromozómy (ako sú Ycp-série).

Za účelom expresie funkčne aktívneho interleukínového proteínu sa v normálnom prípade preferujú bunky tkanivových kultúr vyšších eukaryontov.

V princípe možno použiť ľubovoľné tkanivové bunkové línie vyšších eukaryontov, napríklad expresívne systémy hmyzích bakulovírusov, buď zo zdroja stavovcov alebo bezstavovcov. Preferujú sa však cicavčie bunky. Transformácia alebo transfekcia a propagácia takýchto buniek sa stáva rutinným postupom. Príklady použiteľných bunkových línií zahrňujú bunky HeLa, bunkovú líniu z vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), bunkovú líniu obličiek mláďat potkanov (BRK), bunkovú líniu hmyzu a bunkovú líniu opíc (COS). Expresívne vektory vhodné pre uvedené bunkové línie obyčajne zahrňujú začiatok replikácie, promótor, miesto začiatku translácie, miesta zostrihu RNA (v prípade, že sa používa genómová DNA), polyadenylačné miesto a terminačné miesto transkripcie. Tieto vektory obyčajne obsahujú selekčný alebo amplifikačný gén. Vhodnými expresívnymi vektormi môžu byť plazmidy, vírusy alebo retrovírusy nesúce promótory, získané napríklad z takých zdrojov ako sú adenovírus, SV40, parvovírus, vírus vakcínie. Reprezentatívne príklady vhodných expresívnych vektorov zahrňujú pCDNAl, pCD (popisuje sa v publikácii Okayama et al., (1985) Mol. Celí. Biol. 5: 1136-1142), pMClneo polyA (popisuje sa v publikácii Thomas et al., (1987) Celí 51: 503-512), bakulovírusový vektor, ako je pAC 373 alebo pAC 610.

V prípade sekretovaných proteínov otvorený čítací rámec obyčajne kóduje polypeptid, ktorý obsahuje hotový alebo vylučovaný peptid kovalentne spojený svojím N-koncom k signálnemu peptidu. Signálny peptid sa štiepi skôr, ako dôjde k sekrécii zrelého alebo aktívneho polypeptidu. Miesto štiepenia možno predpovedať na základe empirických pravidiel s vysokým stupňom presnosti (popisuje sa v publikácii von-Heijne (1986) Nucleic Acids

Research 14: 4683-4690). Ďalej je zrejmé, že presné zloženie aminokyselín signálneho peptidu nie je kritické v prípade jeho funkcie (popisuje sa v publikácii Randall et al., (1989) Science 243: 1156-1159; Kaiser et al., (1987) Science 235: 312-317).

Často je nutné exprimovať tieto polypeptidy v systéme, ktorý poskytuje špecifický alebo definovaný glykozylačný patem. V tomto prípade je obvyklým patemom ten, ktorý vzniká v prirodzene expresívnom systéme. Patern je možné upraviť tak, že sa polypeptid, napríklad neglykozylovaná forma, vystaví pôsobeniu vhodných glykozylovaných proteínov zavedených do heterogénneho expresívneho systému. Receptorový gén môže byť transformovaný spolu s jedným alebo viacerými génmi, ktoré kódujú cicavčie alebo iné glykozylačné enzýmy. Použitím uvedeného prístupu isté cicavčie glykozylačné paterny možno dosiahnuť v prokaryontných alebo iných bunkách.

Zdrojom DTLR je eukaryontný alebo prokaryontný hostiteľ, exprimujúci rekombinantnú DTLR, ako sa popisuje vyššie v texte. Zdrojom môže byť tiež bunková línia, ako sú fibroblasty Swiss 3T3, ale v prípade, že je výhodné, aby preferovaná bunková línia bola podľa vynálezu z ľudského zdroja, môžu sa použiť i iné cicavčie bunkové línie.

Teraz, keď sú známe sekvencie, je možné bežným spôsobom syntézy peptidov pripraviť fragmenty proteínov DTLR primátov alebo ich deriváty. Tieto postupy zahrňujú tie, čo sa popisujú v publikácii Stewart a Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky a Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, SpringerVerlag, New York; a Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York.

Môže sa napríklad použiť azidový postup a postup, keď sa použije kyslý chlorid, kyslý anhydrid, postup, používajúci zmes anhydridov, proces s aktívnymi estermi (napríklad p-nitrofenylester, N-hydroxysukcinimidester alebo kyanometylester), postup s použitím karbodiimidazolu, oxidačnoredukčný postup alebo dicyklohexylkarbodiimidový (DCDC)/aditívny postup. Pri všetkých uvedených postupoch je možné aplikovať syntézy v pevnej fáze a v roztoku. Podobné metódy možno použiť s čiastočnými sekvenciami DTLR.

Proteíny DTLR, ich fragmenty alebo deriváty sú vhodné na prípravu v súlade s horeuvedenými postupmi, ktoré sa v typickom prípade používajú pri syntéze peptidov. Vo všeobecnom prípade ide o tzv. stupňovité procesy, ktoré zahrňujú kondenzáciu aminokyseliny s termálnou aminokyselinou jedna za druhou v sekvencií alebo kondenzáciu peptidových fragmentov s terminálnou aminokyselinou. Aminoskupiny, ktoré sa nepoužívajú pri tvorbe peptidovej väzby sa musia v typickom prípade chrániť, aby sa zabránilo vzniku peptidovej väzby na nesprávnom mieste.

Ak sa použije syntéza v pevnej fáze, C-terminálna aminokyselina sa viaže na nerozpustný nosič alebo podklad prostredníctvom svojej karboxylovej skupiny. Nerozpustný nosič nie je zvlášť obmedzený do tej doby, kým má väzobnú kapacitu s reaktívnou karboxylovou skupinou. Príklady takýchto nerozpustných nosičov zahrňujú halometylové živice, také, ako sú chlórometylová, brómometylová, hydroxymetylová a fenolová živica, tertalkyloxykarbonylhydrazidovaná živice a podobne.

Aminokyselina s chránenou aminoskupinou je viazaná na sekvenciu kondenzáciou svojej aktivovanej karboxylovej skupiny a reaktívnej aminoskupiny skôr vytvoreného peptidu alebo reťazca, aby došlo k postupnej syntéze peptidu. Po syntéze celej sekvencie sa peptid oddelí od nerozpustného nosiča za vzniku peptidu. Tento prístup v pevnej fáze sa popisuje v publikácii Merrifield et al., (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156.

Pripravený protein alebo jeho fragmenty sa môžu izolovať a čistiť z reakčnej zmesi spôsobom separácie peptidu, napríklad extrakciou, precipitáciou, elektroforézou, rôznymi formami chromatografie a podobne. Receptory podľa vynálezu možno získať o rôznych stupňoch čistoty v závislosti od v

požadovaného použitia. Čistenie môže byť doprevádzané použitím tu popísanej metódy čistenia proteinov alebo použitím protilátok, ktoré sa popisujú v metódach imunoabsorbčnej afinitnej chromatografie. Imunoabsorbčná afinitná chromatografia prebieha tak, že sa najskôr protilátky naviažu na pevný povrch, a potom prídu do kontaktu s rozpusteným lyzátom vhodných buniek. Lyzáty iných buniek, exprimujúce receptor alebo lyzáty, alebo supematanty buniek produkujúce proteín, sú výsledkom metód manipulácie DNA, ako sa popisuje ďalej v texte.

Vo všeobecnom prípade, čistený proteín, ktorý dosahuje aspoň približne 40 % čistoty, obyčajne aspoň približne 50 % čistoty, obvykle aspoň približne 60 % čistoty, v typickom prípade aspoň 70 % čistoty, typickejšia je aspoň 90% čistota a uprednostňuje sa aspoň 95% čistota a v určitom vyhotovení vynálezu je čistota 97 až 99 % a viac. Čistota sa obvykle vzťahuje k hmotnosti, ale môže sa tiež vztiahnuť k molarite. Ďalej sa môžu podľa potreby aplikovať rôzne testy.

VI. Protilátky

Protilátky sa môžu tvoriť voči rôznym cicavčím proteínom DTLR alebo ich fragmentom, napríklad proteíny primátov, v prirodzene sa vyskytujúcich natívnych formách a v ich rekombinantných formách. Rozdiel je v tom, že protilátky k aktívnemu receptoru pravdepodobnejšie rozoznávajú epitopy, ktoré sú prítomné len v prirodzenej konformácii. Detekcia denaturovaného antigénu sa môže tiež použiť napríklad pri westemovej analýze. Môžu sa tiež použiť anti-idiotypické protilátky, ktoré sa môžu použiť ako agonisty alebo antagonisty prirodzeného receptora alebo protilátok.

Protilátky, zahrňujúce väzobné fragmenty a verzie s jedným reťazcom, ktoré vznikli voči skôr určeným fragmentom proteínu, môžu vznikať imunizáciou zvierat s konjugátmi fragmentov s imunogénnymi proteínmi. Monoklonálne protilátky sa pripravujú z buniek, ktoré vylučujú požadované protilátky. U týchto protilátok je možné testovať schopnosť viazať sa na normálny alebo defektný proteín, alebo agonistickú alebo antagonistickú aktivitu. Tieto monoklonálne protilátky sa obyčajne viažu v prípade, že hodnota K_D je približne 1 mM, obvykle aspoň približne 300 μΜ, v typickom prípade aspoň približne 100 μΜ, v typickejšom prípade aspoň približne 30 μΜ, uprednostňuje sa aspoň približne 10 μΜ a väčšmi sa uprednostňuje aspoň približne 3 μΜ alebo lepšia.

Protilátky, zahrňujúce fragmenty viažúce antigén podľa vynálezu, sú podstatné pri diagnostickom a terapeutickom použití. Môžu byť silnými antagonistami, ktoré sa viažu na receptora a inhibujú naviazanie ligandu, alebo inhibujú schopnosť receptora vyvolať biologickú odpoveď, môžu napríklad pôsobiť na jeho substrát. Môžu sa tiež použiť protilátky, ktoré nie sú neutralizačné a môžu sa spájať s toxínmi alebo rádionukleotidmi, aby sa naviazali na produkčné bunky alebo bunky, ktoré sa nachádzajú pri zdroji interleukínu. Ďalej sa tieto látky môžu spájať s liekmi alebo inými terapeutickými činidlami, buď priamo, alebo nepriamo pomocou linkeru. Protilátky podľa vynálezu sa môžu taktiež použiť pri diagnostických aplikáciách. Záchytné protilátky, alebo protilátky, ktoré nie sú neutralizačné, sa môžu viazať na receptor, pričom neinhibujú naviazanie ligandu alebo substrátu. Neutralizačné protilátky sa môžu použiť v kompetetívnych väzobných testoch. Môžu sa tiež použiť na detekciu a kvantifikáciu ligandov. Môžu sa tiež použiť ako činidlá na analýzu westemovým prenosom alebo na imunoprecipitáciu, alebo imunočistenie proteínu.

Proteínové fragmenty sa môžu spájať s inými materiálmi, zvlášť s polypeptidmi, ako fuzovane alebo kovalentne spojené polypeptidy, ktoré sa používajú ako imunogény. Cicavčie DTLR a iné fragmenty môžu fuzovať alebo sa kovalentne viazať s rôznymi imunogénmi, ako je hemocyanín prísavkových mäkkýšov, albumín bovinného séra, toxoid tetanu, atď.. Príprava polyklonálneho antiséra sa popisuje v publikácii Microbiology, Hoeber Madical Division, Harper a Row, 1969; Landsteiner (1962) Specifity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; a Williams et al., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York. Medzi typické metódy patrí hyperimunizácia zvierat s antigénom. Krv zvierat sa potom hromadí krátko po opakovanej imunizácii a izoluje sa gama-globulín.

V niektorých prípadoch je nutné pripraviť monoklonálne protilátky z rôznych cicavčích hostiteľov, ako sú myši, hlodavce, primáti, ľudia, atď.. Popis metód na prípravu takýchto monoklonálnych protilátok je uvedený napríklad v publikácii Stites et al., (eds) Basic and Cliničal Immunology (4^th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA a Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antobodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, a potom zvlášť v Kohler a Milstein (1975) Náture 256: 495-497. Tieto metódy zahrňujú injekčnú aplikáciu imunogénu zvieratám. Zvieratá sa potom usmrtia a z ich sleziny sa odoberú bunky, ktoré sa spoja s bunkami myelómu. Výsledkom je hybridná bunka alebo hybridom, ktorý je schopný sa reprodukovať in vitro. Populácia hybridómov sa potom testuje za účelom izolácie jednotlivých klonov, kde každý z nich vylučuje jeden druh protilátok proti imunogénu. Týmto spôsobom získané protilátky sú produktom imortalizovaných a klonovaných buniek B jediného druhu, ktoré pochádzajú z imunizovaných zvierat vznikajúcich ako odpoveď na špecifické miesto rozoznávané na imunogénnej látke.

Iné vhodné metódy zahrňujú expozíciu lymfocytov in vitro k antigénnym polypeptidom alebo v inom prípade k výberu knižníc protilátok vo fágových alebo podobných vektoroch (popisuje sa napríklad v publikácii Huse et al., (1989) „Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin

Repertoire in Phage Lambda“ Science 246: 1275-1281 a Ward et al., (1989) Náture 341: 544-546). Polypeptidy a protilátky podľa vynálezu sa môžu použiť s úpravou alebo bez nej, čo zahrňuje chimerické alebo humanizované protilátky. Polypeptidy alebo protilátky sú často označené kovalentným alebo nekovalentným spojením s látkou, ktorá poskytuje detekovateľný signál. Známe je veľké množstvo značiek a konjugačných metód a popisujú sa vo veľkom množstve vedeckej a patentovej literatúry. Vhodné označenie zahrňuje rádionukleotidy, enzýmy, substráty, ko-faktory, inhibítory, fluorescenčné látky, chemoluminiscenčné látky, magnetické partikuly a podobne. Uvedené označovanie sa popisuje v US patentoch č. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 a 4,366,241. Môžu sa taktiež produkovať rekombinantné alebo chimerické imunoglobulíny, čo sa popisuje v publikácii Cabilly, US patent č. 4,816,567, alebo sa môžu pripraviť transgénne myši (popisuje sa v publikácii Mendez et al., (1997) Náture Genetics 15: 146-156).

Protilátky podľa vynálezu je možné taktiež použiť v afmitnej chromatografíi pri izolácii DTLR. Môžu sa použiť kolóny, kde protilátka je naviazaná na pevný podklad, napríklad častice, ako je agaróza, sephadex alebo podobne, kde bunkový lyzát môže prechádzať cez kolónu, kolóna sa premyje, potom sa zvýši koncentrácia slabého denaturačného činidla, pričom sa uvoľní čistený proteín. Proteín sa môže použiť pri čistení protilátok.

Protilátky sa môžu taktiež použiť na testovanie prítomnosti určitých expresívnych produktov v expresívnych knižniciach. Obyčajne protilátky, používané v takýchto postupoch sa označujú látkami, ktoré umožňujú jednoduchú detekciu prítomnosti antigénu tak, že sa naviaže protilátka. Protilátky vytvorené proti DTLR sa môžu tiež použiť pri vytvorení antiidiotypických protilátok. Tie sa môžu použiť pri detekcii alebo diagnostike rôznych imunologických podmienok, ktoré sa vzťahujú k expresii proteínu alebo buniek, ktoré exprimujú proteín. Môžu sa tiež použiť ako agonisty alebo antagonisty ligandov, ktorí môžu byť kompetetívnymi inhibítormi alebo substituentami prirodzene sa vyskytujúcich ligandov.

Proteíny DTLR, ktoré sa špecificky viažu na protilátky, alebo ktoré sú špecificky imunoreaktívne s protilátkami vytvorenými proti definovanému imunogénu, ako je imunogén obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34. V imunologickom teste sa v typickom prípade používa polyklonálne antisérum vytvorené voči napríklad proteínu so sekvenciou SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34. Vybralo sa antisérum, ktoré vykazuje nízku skríženú reaktivitu voči iným členom rodiny IL-1R. Je to napríklad DTLR1, s výhodou pochádzajúce z rovnakých druhov a takáto ľubovoľná skrížená reaktivita je odstránená imunoabsorbciou pred imunologickým testom.

Za účelom produkcie antiséra, použitím v imunologickom teste, sa izoluje proteín so sekvenciou SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34 alebo jej kombinácie spôsobom, ktorý sa popisuje vyššie v texte. Rekombinantný proteín sa môže napríklad produkovať v cicavčej bunkovej línii. Vhodný hostiteľ, napríklad inbredný kmeň myši, ako je balb/c, sa imunizuje vybraným proteínom, v typickom prípade, použitím štandardných adjuvans, ako Freundovo adjuvans a štandardný imunizačný protokol vhodný pre myši (Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antobodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York). V inom prípade sa môže použiť syntetický peptid získaný z tu popísaných sekvencií a spojený s nosičovým proteínom. Zhromaždili sa polyklonálne séra a titrovali sa voči imunogénnemu proteínu v imunologickom teste, napríklad imunologický test na pevnom podklade. Vybrali sa polyklonálne antiséra s titrom 10⁴ alebo vyšším a testuje sa ich skrížená reaktivita voči iným členom rodiny IL-1R, napríklad myšací DTLR alebo ľudský DTLR1, použitím kompetetívneho imunologického testu, ktorý sa popisuje v publikácii Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory

Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antobodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York na stránkach 570-573. Dáva sa prednosť tomu, aby aspoň dvaja členovia rodiny DTLR sa použili pri tomto stanovení, pri krížovom spojení s ľubovoľným alebo s niektorým ľudským DTLR2-10. Títo členovia rodiny IL-1R sa môžu produkovať ako rekombinantné proteíny a môžu sa izolovať použitím metód štandardnej molekulárnej biológie a tu popísaných metód chémie proteínov.

Imunologické testy vo formáte kompetetívneho naviazania sa môžu použiť na stanovenie skríženej reaktivity. Napríklad proteíny so sekvenciou SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34, alebo rôzne ich fragmenty sa môžu imobilizovať na pevnom povrchu. Proteíny pridané do imunologického testu súťažia s naviazaním antiséra na imobilizovaný antigén. Schopnosť horeuvedených proteínov súťažiť s naviazaním antiséra na imobilizovaný proteín sa porovnáva s proteínom so sekvenciou SEQ ID NO: 4,6,26,10,12, 16, 18, 32, 22 alebo 34. Percento skríženej reaktivity horeuvedených proteínov sa vypočítava použitím štandardných výpočtov. Vybrali sa tie antiséra s menej než 10% skríženou reaktivitou s každým v texte horeuvedených proteínov. Skrížené reagujúce protilátky sa potom z antiséra odstránia imunoabsorbciou horeuvedenými proteínmi. Imunologický absorbované antisérum sa potom používa pri imunologickom teste kompetetívneho naviazania, ako sa popisuje vyššie v texte, aby sa porovnal druhý proteín s imunogénnym proteínom (napr. proteín podobný IL-1R so sekvenciou SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34). Za účelom porovnania dvoch proteínov, každý z nich sa testuje v širokom rozmedzí koncentrácií a stanovuje sa množstvo každého proteínu, ktoré je nutné na inhibíciu 50% naviazania antiséra na imobilizovaný proteín. Ak množstvo požadovaného druhého proteínu je menšie ako dvojnásobok množstva vybratého proteínu alebo proteínov, ktoré sú potrebné, potom sa o druhom proteíne hovorí, že sa špecificky viaže na protilátky vytvorené proti imunogénu.

Myslí sa tým, že tieto proteíny DTLR sú členmi rodiny homológnych proteínov, ktoré zahrňujú aspoň 10 identifikovaných génov. V prípade určitého génového produktu, ako je DTLR2-10, termín neznamená len tu popísané aminokyselinové sekvencie, ale tiež iné proteíny, ktoré sú alebo nie sú alely, alebo špecifické varianty. Tiež sa tým myslí, že termíny zahrňujú neprirodzené mutácie zavedené zámernými mutáciami použitím bežných metód rekombinácie, ako sú mutácie na jednom mieste alebo vypustenie krátkych oblastí DNA kódujúcich reprezentatívne proteíny alebo substitúcie nových aminokyselín, alebo pridávanie nových aminokyselín. Takéto minoritné zmeny musia v podstate udržovať imunologickú identitu pôvodnej molekuly a/alebo jej biologickú aktivitu. Tieto zmeny zahrňujú proteíny, ktoré sú špecificky imunoreaktívne s prirodzene sa vyskytujúcim proteínom príbuzným IL-1R, sú to napríklad proteíny DTLR majúce sekvenciu SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 alebo 34. Biologické vlastnosti zmenených proteínov sa môžu stanoviť expresiou proteínu vo vhodnej bunkovej línii a meraním vhodného účinku na lymfocyty. Určité úpravy proteínov budú zahrňovať konzervatívne substitúcie aminokyselín s podobnými chemickými vlastnosťami, ako sa popisuje vyššie v texte pre rodinu IL-1R ako celok. Usporiadaním proteínu optimálne s proteínom DTLR2-10 a použitím bežných tu popísaných imunologických testov sa stanoví imunoidentita a môže sa stanoviť zloženie proteínu podľa vynálezu.

VII. Kity a kvantifikácia

V kitoch a v testoch sa používajú prirodzene sa vyskytujúce formy molekúl podobné IL-1R podľa vynálezu. Tieto metódyje možné tiež aplikovať pri testovaní väzobnej aktivity, napríklad ligandov týchto proteínov. Za posledné roky sa vyvinulo niekoľko metód automatických testov, ktoré umožňujú testovanie desaťtisícov látok za rok (popisuje sa napríklad v publikácii BIOMEK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, Califomia a Fodor et al., (1991) Science 251: 767-773). Neskoršie sa popisujú spôsoby testovania schopnosti viazať sa veľkým množstvom definovaných polymérov syntetizovaných na pevnom substráte. Vývoj vhodných testov na testovanie ligandov agonistických/antagonistických homológnych proteinov možno ľahko dosiahnuť dostupnosťou veľkého množstva čistených rozpustených DTLR v aktívnom štádiu, ako popisuje vynález.

Čistené DTLR môžu priamo potiahnuť doštičky vhodné na použitie horeuvedených metód testovania ligandov. Protilátky, ktoré nie sú neutralizačné pre tieto proteíny, sa môžu použiť ako zachytené protilátky na účely imobilizácie receptora na pevnej fáze, čo možno použiť napríklad pre diagnostické účely.

Vynález ďalej popisuje použitie DTLR 2-10, ich fragmentov, peptidov a ich fuzovaných produktov v rôznych diagnostických kitoch a pri metódach, ktoré detekujú prítomnosť proteínu alebo jeho ligandov.

V inom prípade protilátky voči molekulám sa môžu začleniť do kitov a metód. V typickom prípade kit bude mať oddelenie obsahujúce buď definovaný peptid DTLR alebo segment génu alebo činidlo, ktoré rozoznáva jedno alebo druhé. V typickom prípade rozoznávajúce činidlo v prípade peptidu bude receptorom alebo protilátkou, alebo v inom prípade segmentom génu alebo hybridizačnou sondou.

Preferovaný kit na stanovenie koncentrácie, napríklad DTLR4, vo vzorke v typickom prípade bude obsahovať ako pozitívnu kontrolu označenú látku, napríklad ligand alebo protilátku, ktorá má známu väzobnú afinitu pre DTLR4 (prirodzene sa vyskytujúcu alebo rekombinant) a spôsoby oddelenia viazaných označených látok od voľných. Ide napríklad o pevnú fázu pre imobilizáciu DTLR4 v testovanej vzorke. V normálnom prípade sa pripravujú časti obsahujúce činidlá a inštrukcie.

Protilátky zahrňujúce fragmenty viažúce antigén, ktoré sú špecifické pre cicavčie DTLR, alebo fragment peptidu, alebo receptorové fragmenty sa používajú pri diagnostických aplikáciách na detekciu prítomnosti hodotiteľného množstva ligandov a/alebo ich fragmentov. Diagnostické testy môžu byť homogénne (bez kroku separácie medzi voľným činidlom a komplexom protilátka-antigén) alebo heterogénne (s krokom separácie). Existujú rôzne komerčné testy, také, ako je rádioimunologický test (RIA), test ELISA, enzymatický imunologický test (EIA), enzymatický viacnásobný imunologický test (EMIT), imunologický test s fluorescenčné označeným substrátom (SLFIA) a podobne. Neoznačené protilátky je možné použiť ako druhé protilátky, ktoré sú označené, a ktoré rozoznávajú protilátky proti DTLR4 alebo ich určité fragmenty. Tieto testy sa tiež popisujú v publikácii Harlow a Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., a Coligan (Ed.) (1991) Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New York. Anti-idiotypické protilátky sa môžu používať v podobnom prípade, pričom slúžia ako agonisty alebo antagonisty DTLR4. Za vhodných okolností sa môžu použiť ako terapeutické činidlá.

Činidlá použiteľné pri diagnostických testoch sú zahrnuté v kitoch a slúžia k optimalizácii citlivosti testu. Výber podstaty testu, protokolu, označenia, označených alebo neoznačených protilátok alebo označeného ligandu závisí od povahy subjektu vynálezu. To je obvyklé pri kombinácii s inými doplnkami, ako sú tlmivé roztoky, stabilizátory, materiály nevyhnutné na produkciu signálu, ako sú substráty pre enzýmy a podobne. Dáva sa prednosť tomu, aby kity obsahovali inštrukcie na správne použitie a nástroje na likvidáciu použitého obsahu. V typickom prípade kit má oddelenie na každé používané činidlo a bude obsahovať inštrukcie na správne použitie a likvidáciu činidiel. Ak je to nutné, činidlá sa môžu pripravovať v suchej forme, ako lyofilizovaný prášok, pričom sa činidlá môžu rekonštituovať vo vodnom médiu tak, aby mali vhodnú koncentráciu na test.

Horeuvedené konŠtituenty diagnostických testov sa môžu použiť bez úpravy, alebo sa môžu upravovať rôznymi spôsobmi. Napríklad označenie sa môže dosiahnuť kovalentným alebo nekovalentným pripojením látky, ktorá poskytuje priamo alebo nepriamo detekovateľný signál. V ľubovoľnom z týchto testov, testovaná látka, DTLR alebo protilátky proti DTLR, môžu byť označené buď priamo alebo nepriamo. Možnosti priameho označenia zahrňujú označovacie skupiny: rádioaktívne označenie, ako je napríklad použitie ^l25I, enzýmy (popisuje sa v publikácii US patent č. 3,645,090), ako je napríklad peroxidáza a alkalická fosfatáza, a fluorescenčné označenie (US patent č. 3,940,475), kde sa môžu monitorovať zmeny v intenzite fluorescencie, v posune vlnovej dĺžky alebo v polarizácii fluorescencie. Možnosti nepriameho označenia zahrňujú biotinyláciu jedného konštituenta, potom nasleduje naviazanie na avidín, ktorý je spojený s jednou z vyššie uvedených označovacích skupín.

Existuje tiež rad metód separácie viazaných a voľných ligandov, alebo v inom prípade viazaných a. voľných testovaných látok. DTLR sa môže imobilizovať na rôznych matriciach, a potom nasleduje premývanie. Vhodné matrice zahrňujú plastové doštičky na test ELISA, filtre a guličky. Metódy imobilizácie receptora na matrici zahrňujú bez obmedzenia priamu adhéziu k plastom, použitie protilátok, chemické interakcie a biotín-avidín. Posledný krok v tomto prístupe zahrňuje zrážanie komplexu protilátka/antigén ľubovoľnou z niekoľkých metód, ktoré využívajú organické rozpúšťadlo, ako je polyetylénglykol alebo soľ, ako je síran amónny. Iné vhodné deliace metódy zahrňujú bez obmedzenia metódu využívajúcu magnetizovateľné častice nesúce protilátky značené fluoresceínom, ako sa popisuje v publikácii Rattle et al., (1984) Clin. Chem. 30 (9): 1457-1461 a separáciu dvojitých magnetických partikúl nesúcich protilátky, čo sa popisuje v publikácii US patent č. 4,659,678.

Metódy vhodné na naviazanie proteínov alebo fragmentov na rôzne označenie sa popisujú v literatúre a nie je potrebné ich tu uvádzať. Rad metód spojenia zahrňuje použitie aktivovaných karboxylových skupín, buď prostredníctvom použitia karbodiimidu alebo aktívnych esterov za vzniku peptidových väzieb, tvorením tioéterov reakciou merkaptoskupiny s aktivovaným halogénom, ako je chlóroacetyl alebo aktivovaný olefín, ako je maleimid alebo podobne. Pri týchto aplikáciách možno použiť taktiež fuzované proteíny.

Vynález ďalej popisuje použitie oligonukleotidových a polynukleotidových sekvencií získaných zo sekvencie DTLR. Tieto sekvencie sa môžu použiť ako sondy na detekciu množstva DTLR u pacientov, u ktorých sa predpokladá, že majú imunologickú poruchu. V literatúre sa tiež popisuje prítomnosť RNA a DNA nukleotidových sekvencií, označenie sekvencií a preferovaná veľkosť sekvencií. V normálnom prípade oligonukleotidová sonda by mala mať približne 14 nukleotidov, obvykle aspoň približne 18 nukleotidov a polynukleotidové sondy môžu obsahovať až niekoľko kilobáz. Môže sa použiť rad označení, najbežnejšími sú rádionukleotidy, zvlášť však ³²P. Môžu sa tiež použiť iné metódy, ako je použitie nukleotidov upravených biotínom, ktoré sa zabudujú do polynukleotidu. Biotín potom slúži ako miesto na naviazanie avidínu alebo protilátok, ktoré sa môžu označiť veľkým počtom označení, ako sú rádionukleotidy, fluorescenčné činidlá a podobne. V inom prípade sa môžu použiť protilátky, ktoré môžu rozoznať špecifické duplexy zahrňujúce DNA duplexy, RNA duplexy, DNA-RNA hybridné duplexy alebo duplexy DNA-proteín. Naopak, protilátky sa môžu označiť a test môže prebiehať v prípade, že duplex sa viaže na povrch tak, že tvorí na povrchu duplex. Môže sa detekovať prítomnosť protilátok viazaných na duplex. Použitie sond vhodných pre novú antimediátorovú RNA ľubovoľnou bežnou metódou, ako je hybridizácia nukleovej kyseliny, plus a mínus test, rekombinantné testovanie sondami, translácia uvoľnená hybridom (HRT), translácia zastavená hybridom (HART). Môžu sa taktiež použiť amplifikačné techniky, ako je polymerázová reťazová reakcia (PCR).

Vynález ďalej popisuje diagnostické kity, ktoré sa tiež používajú na testovanie kvalitatívnej a kvantitatívnej prítomnosti iných markérov. Diagnóza a prognóza môžu taktiež závisieť na kombinácii viacerých indikácií, ktoré sa používajú ako markery (popisuje sa napríklad v publikácii Viallet et al., (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97).

VIII. Terapeutické využitie

Vynález poskytuje činidlá, ktoré sú podstatné pre terapeutické účely. Proteíny DTLR (prirodzene sa vyskytujúce alebo rekombinantné), ich fragmenty, muteínové receptory a protilátky spolu s látkami, u ktorých sa stanovilo, že vykazujú väzobnú afinitu k receptorom alebo k protilátkam, nachádzajú použitie pri liečbe podmienok vykazujúcich abnormálnu expresiu receptorov ich ligandov. Takéto abnormality sa budú v typickom prípade vyjadrovať ako imunologické poruchy. Navyše tento vynález sa používa pri liečbe rôznych ochorení alebo porúch spojených s abnormálnou expresiou alebo abnormálnym spustením odozvy na ligand. Naznačuje sa, že ligandy Toll sa podieľajú na morfologickom vývine, napríklad na stanovení dorzo-ventrálnej polarity, na imunitných odpovediach, zvlášť na primitívnych vrodených odpovediach (popisuje sa v publikácii Sun et al., (1991) Eur. J. Biochem. 196: 247-254; Hultmark (1994) Náture 367: 116-117.

Rekombinantné proteíny DTLR, muteíny, agonistické alebo antagonistické protilátky proti proteínom sa môžu čistiť a potom aplikovať pacientovi. Tieto činidlá sa môžu kombinovať pri terapeutickom použití s ďalšími aktívnymi ingredienciami, napríklad u bežných farmaceutický prijateľných nosičoch alebo riedidlách spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátormi a ekcipientami. Tieto kombinácie môžu byť sterilné, napríklad filtrované a rozdelené do dávkových foriem, napríklad v lyofílizovanej forme v ampuliach alebo skladované v stabilizovaných vodných prípravkoch. Tento vynález taktiež popisuje použitie protilátok alebo ich väzobných fragmentov, ktoré nie sú celkom naviazané.

Testovanie ligandov použitím DTLR alebo ich fragmentov sa môže uskutočniť na identifikáciu molekúl, ktoré majú väzobnú afinitu na receptory. Nasledujúce biologické testy sa potom môžu využívať na stanovenie, či putatívny ligand môže poskytnúť kompetetívne naviazanie, ktoré môže blokovať podstatnú stimulačnú aktivitu. Fragmenty receptorov sa môžu použiť ako blokátor alebo antagonista tak, že blokujú aktivitu ligandov. Látka vykazujúca podstatnú stimulačnú aktivitu môže aktivovať receptor a je tak agonistom v tom, že stimuluje aktivitu ligandu, napríklad vyvoláva signál. Vynález ďalej zahrňuje použitie protilátok proti DTLR ako antagonistov na terapeutické účely.

Množstvo činidiel nevyhnutných na účinnú terapiu závisí od mnohých rôznych faktorov, ktoré zahrňujú spôsoby aplikácie, cieľové miesto, fyziologické štádium pacienta a iné aplikovateľné lieky. Tak dávky určené na liečbu by sa mali v dôsledku optimalizácie bezpečnosti a účinnosti titrovať. V typickom prípade, dávky užívané in vitro, môžu byť predlohou v prípade aplikácie týchto činidiel in situ. Testovanie účinnej dávky na liečbu zvierat poskytne ďalšiu vopred určenú indikáciu ľudskej dávky. Rôzne úvahy sa popisujú napríklad v publikácii Gilman et al., (eds.) (1990) Goodman a Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8^Λ Ed., Pergamon Press; a Remington's Pharmaceutical Sciences, (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Penn.. Metódy vhodné na aplikáciu, ktoré sa tu uvádzajú, alebo ďalej v texte, sú napríklad orálne, intravenózne, intraperitonálne alebo intramuskulárne aplikácie, transdermálne difúzie alebo iné. Farmaceutický prijateľné nosiče zahrňujú vodu, fyziologický roztok, tlmivé roztoky a iné látky popisované napríklad v publikácii Merck Index,

Merck and Co., Rahway, New Jersey. Vzhľadom k pravdepodobnému naviazaniu s vysokou afinitou alebo vzhľadom k obrátenému počtu medzi putatívnym ligandom a jeho receptormi, sa očakáva, že nízke dávky týchto činidiel budú účinné. Priebeh signalizácie naznačuje, že extrémne nízke množstvo ligandu môže byť účinné. Očakáva sa, že rozmedzie látky je menšie ako koncentrácia 1 mM, v typickom prípade nižšie ako približne 10 μΜ, obvykle nižšie ako približne 100 nM, uprednostňuje sa nižšie ako približne 10 pM (pikomoláme) a najviac sa uprednostňuje menej ako približne 1 fM (femtomoláme) s vhodným nosičom. Za účelom kontinuálenj aplikácie sa využíva pomalé uvoľňovanie formulácií alebo vehiklov umožňujúcich pomalé uvoľňovanie.

Proteíny DTLR, ich fragmenty a protilátky alebo ich fragmenty, antagonisty a agonisty sa môžu aplikovať priamo liečenému hostiteľovi v závislosti od veľkosti látok. Môže byť nutné ich pred aplikáciou spojiť s nosičovými proteínmi, ako sú ovalbumín alebo sérový albumín. Terapeutické formulácie sa môžu aplikovať v ľubovoľnej bežne dávkovanej formulácii. Zatiaľčo v prípade aktívnej zložky je možné ju aplikovať samotnú alebo je výhodné ju prezentovať ako farmaceutickú formuláciu. Formulácia obsahuje aspoň jednu aktívnu ingredienciu, ako sa definuje vyššie v texte, spolu s jedným alebo viacerými prijateľnými nosičmi. Každý nosič musí byť ako farmaceutický, tak fyziologicky prijateľný v tom smere, že je kompatibilný s inými zložkami a neuškodí pacientovi. Formulácie zahrňujú tie, ktoré sú vhodné na orálne, rektálne, nazálne alebo parenterálne (zahrňujúce podkožné, intramuskuláme, intravenózne a intradermálne) aplikácie. Formulácie môžu byť prítomné v jednotkovej dávke a môžu sa pripravovať ľubovoľným spôsobom, ktorý je známy v odbore farmácie (popisuje sa v publikácii Gilman et al., (eds.) (1990) Goodman a Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8°¹Ed., Pergamon Press; a Remington's Pharmaceutical Sciences (súčasné vydanie), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis et al., (eds. 1993)

Pharmaceutical Dosage Form: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman et al., (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Form: Tablets Dekker, NY; a Lieberman et al., (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse System Dekker, NY). Terapia podľa vynálezu sa môže kombinovať alebo použiť v spojení s inými terapeutickými činidlami, zvlášť s agonistami alebo antagonistami iných členov rodiny IL-1.

IX. Ligandy

Popis receptorov Toll poskytuje spôsoby identifikácie ligandov, ako sa popisuje vyššie v texte. Takýto ligand by sa mal viazať špecificky na receptor s významne vysokou afinitou. Možno pripraviť rôzne konštrukcie, ktoré umožňujú označenie receptora za účelom detekcie jeho ligandu. Napríklad priamo označené DTLR, ktoré fuzuje s markermi za účelom sekundárneho označenia, napríklad FLAG alebo iného epitopu tags atď., umožňujú detekciu receptora. To môže taktiež slúžiť ako afinitná metóda pri biochemickom čistení alebo označení, alebo pri výbere pri expresívnom klonovaní. Na prípravu vhodných konštrukcií s dostupnými sekvenciami DTLR sa môže tiež aplikovať dvojhybridný selekčný systém (Fields a Song (1989) Náture 340: 245-246). Vo všeobecnom prípade popis DTLR sa môže analogicky aplikovať na jednotlivé špecifické prevedenia určené pre činidlá a kompozície DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 a /alebo DTLR10.

Prehľad obrázkov na výkrese

Obrázok č. 1 je schématické porovnanie architektúry proteínu DTLR Drosophila a človeka a ich vzťah k IL-1 receptorom stavovcov a proteínov nesúcich rezistenciu voči rastlinným chorobám. Tri DTLR Drosophila (Dm) (Toll, 18w, a Mst ORF fragment) (Morisato a Anderson (1995) Ann. Rev.

Genet. 29: 371.399; Chiang a Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239; Mitcham et aL, (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783; Eldon et al., (1994) Develop. 120: 885-899) sú usporiadané vedľa štyroch celých (DTLR 1 až 4) a jedného čiastočného (DTLR5) ľudského (Hu) receptora. Jednotlivý LRR v receptorovýčh ektodoménach, ktoré sú označené veľkými písmenami (Attwood et al., (1997) Nucleic Acid Res. 25: 212-217) sú explicitne označené rámčekmi; horné a spodné klastry bohaté na Cys, ktoré lemujú C- a N-terminálne konce súborov LRR, sú naznačené vzájomne sa dotýkajúcimi polokruhmi. Strata vnútornej oblasti bohatej na Cys v DTLR 1 až 5 je v prospech ich menších ektodomén (558, 570, 690 a 652 aa) v prípade, že sa porovnávajú s 784 a 977 presiahnutie Toll a 18w. Neúplné reťazce DmMst a HuDTLR5 (ektodomény 519 a 153 aa) reprezentujú čiarkované čiary. Vnútrobunkový signálny modul bežný pre DTLR, receptory typu IL-1 (IL1R), vnútrobunkový proteín Myd88 a produkt génu N nesúceho rezistenciu voči ochoreniu tabaku (DRgN) sú označené pod membránou. Popisuje sa v publikáciách Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475; Rock et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 588. Ďalšie domény zahrňujú v IL-1R (disulfidovým môstikom spojené slučky) tri moduly podobné Ig. Proteín DRgN vykazuje doménu NTPázy (rámček) a Myd88 má mŕtvu doménu (čierny ovál).

Obrázky č. 2A až 2B ukazujú konzervatívne štrukturálne patemy všetkých signálnych domén cytokinových receptorov podobných Toll a IL-1 a dva divergentné modulačné proteíny. Obrázok č. 2A usporiadanie sekvencie bežnej domény TH. Proteíny DTLR sú označené ako na obrázku č. 1; ľudské (Hu) alebo myšacie (Mo) receptory rodiny IL-1 (IL-1R1-6) sú sekvenčne číslované ako sa predtým uvádza v publikácii Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475; Myd88 a sekvencia z rastlín tabaku (To) a ľanu, L. usitatissimum (Lu) reprezentujú C- a N-terminálne domény väčších molekúl, ktoré obsahujú viac domén. Bloky sekvencií sú označené rámčekom, ktoré sú očíslované od 1 do 10. Trojuholníky označujú delečné mutácie, zatiaľčo skrátenie N- konca označené šípkou eliminuje u ľudského IL-1R1 bioaktivitu (Heguy et al., (1992) J. Biol. Chem. 267: 2605-2609). Predpovedané sekundárne štruktúry PHD (popisuje sa v publikácii Rošt a Sander (1994) Proteins 19: 55-72) a DSC (King a Stemberg (1996) Protein Sci. 5: 22982310) sú označené ako α-helix (H), β-reťazec (E) alebo dvojzávitnica (L). Vytieňovaná schéma aminokyselín označuje chemicky podobné zbytky: hydrofóbne, kyslé, bázické, Cys, aromatické, s porušenou štruktúrou a malé. Diagnostické sekvenčné patemy pre IL-1R, DTLR a plné usporiadanie (ALL) sa odvodili dohovorom pri prísnosti 75 %. Symboly sady aminokyselín sú: o označuje alkohol; 1 označuje alifatickú aminokyselinu; · označuje ľubovoľnú aminokyselinu; a označuje aromatickú aminokyselinu; c označuje aminokyselinu nesúcu náboj; h označuje hydrofóbnu aminokyselinu; označuje negatívnu aminokyselinu; p označuje polámu aminokyselinu; + označuje pozitívnu aminokyselinu; s označuje malú aminokyselinu; u označuje maličkú aminokyselinu; t označuje ohyb. Obrázok č. 2B ukazuje diagram topológie navrhnutého zvinutia domény ΤΗ β/α. Paralelný β-list (s β-reťazcami A až E ako žlté trojuholníky) sa pravdepodobne nachádza na Cterminálnom konci; α-helix (krúžky označené 1 až 5) spojené s β-reťazcami; reťazcové spojenia sú z prednej časti (viditeľné) alebo zo zadnej časti (skryté). Konzervatívne nabité zbytky na C-konci β-listu sú označené šedivou (Asp) alebo ako voľný čierny (Arg) zbytok (uvedené v texte).

Obrázok č. 3 ukazuje vývoj signálnej domény super-rodiny. Usporiadanie viacerých TH modulov na obrázku č. 2 sa používa na získanie fylogenetického stromu podľa metódy Neighbor-Joinong (popisuje sa v publikácii Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Obrázok č. 4 zobrazuje mapovanie chromozómu ľudských génov DTLR metódou FISH. Denaturované chromozómy zo synchrónnych kultúr ľudských lymfocytov sa hybridizovali so sondami cDNA DTLR označenými biotínom, na určenie ich polohy. Spojenie údajov FISH mapovania (vľavo, obrázky č. 4A, DTRL2; 4B, DTRL3; 4C, DTRL4; 4D, DTRL5) s chromozomálnymi pruhmi sa dosiahlo skladaním FISH signálov s DAPI pruhmi chromozómov (panely v strede) (popisuje sa v publikácii Heng a Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33: 109-122, Analýzy sú zhrnuté vo forme ideogramov ľudského chromozómu (panely na pravej strane).

Obrázky č. 5A až 5F analýzy prenosu mRNA ľudských DTRL. Ľudské viacnásobné tkanivové bloty (symbol He označuje srdce; Br označuje mozog; Pl označuje placentu; Lu označuje pľúca; Li označuje pečeň; Mu označuje svaly; Ki označuje obličky; Pn označuje pankreas; Te označuje semeníky; Ov označuje vaječníky; SI označuje tenké črevo; Co označuje hrubé črevo; PBL označuje periférne krvné lymfocyty) a rakovinová bunková línia (promyelocytická leukémia, HL60; karcinóm maternicového čapíka, HELAS3; chronická myelogénna leukémia, K562; lymfoblastická leukémia, Molt4; kolorektálny adenokarcinóm, SW480; melanóm, G361; Burkittov lymfóm, Raji; Burkittov kolorektálny adenokarcinóm, SW480; karcinóm pľúc, A549), ktoré obsahujú približne 2 gg poly(A)⁺RNA v jednej dráhe sa testovali sondou, ktorou je rádioaktívne označená cDNA kódujúca DTLR1 (obrázky 5A až C), DTLR2 (obrázok č. 5D), DTLR3 (obrázok č. 5A) a DTLR4 (obrázok č. 5F). Bloty sa exponovali na film počas dvoch dní (obrázky č. 5A až 5C) alebo jeden týždeň (obrázky č. 5D až 5F) pri teplote 70 °C so zosilujúcimi obrazovkami. V niektorých dráhach sa objavili anomálne druhy veľkosti 0,3 kB. Hybridizačné experimenty vylúčili kódy pre cytoplazmatické fragmenty DTLR.

Príklady vyhotovenia vynálezu

I. Všeobecné metódy

Niektoré zo štandardných metód sa popisujú v publikácii Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brooklyn, NY; alebo Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Metódy na čistenie proteínov zahrňujú také metódy, ako je zrážanie síranom amónnym, chromatografia na kolóne, elektroforéza, centrifugácia, kryštalizácia a iné (popisuje sa v publikácii Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; Coligan et al., (ed. 1996) and periodic supplements, Current Protocols In Protein Science Greene/Wiley, New York; Deutscher (1990) „Guide to Protein Purification“ in Methods in Enzymology, vol. 182 a iné diely tejto série, a publikácie výrobcu, ktoré zhrňujú použitie proteínových čistených produktov, napríklad Pharmacia, Piscataway, N. J., alebo Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinovanie rekombinantných metód umožňuje fúziu s vhodnými fragmentárni, napríklad so sekvenciou FLAG alebo s ekvivalentom, ktorý je možné fúzovať prostredníctvom sekvencie, ktorú je možné odstrániť proteázou (popisuje sa v publikácii Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent“ Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plénum Press, N. Y.; a Crowe et al., (1992) OIA express: The High Level Expression and Protein Purification System QUIAGEN, Inc. Chatsworth, CA.

Štandardné imunologické metódy a testy sa popisujú napríklad v publikácii Hertzenberg et al., (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; a Methods in Enzymology, diely 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 a 163.

Testy vaskulámych biologických aktivít sú v odbore dobre známe. Budú pokrývať angiogénne a angiostatické aktivity v nádore alebo v ich tkanivách, napríklad proliferáciu arteriálneho hladkého svalstva (Koyoma et al., (1996) Celí 87: 1069-1078), adhéziu monocytov na vaskulámy epitel (popisuje sa v publikácii McEvoy et al., (1997) J. Exp. Med. 185: 2069-2077; Ross (1993) Náture 362: 801-809; Rekhter a Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147: 668-677; Thyberg et al., (1990) Atherosclerosis 10: 966-990 a Gumbiner (1996) Celí 84: 345-357.

Testy neutrálnych bunkových biologických aktivít sa popisujú napríklad v publikácii Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; a Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. Metodológia vývojových systémov sa popisuje napríklad v publikácii Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; a Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.

Počítačová analýza sekvencie sa vykonala napríklad použitím dostupného programového vybavenia počítača zahrňujúceho programy od inštitúcie GGG (U. Wisconsin) a GenBank. Použili sa tiež verejné sekvenčné databázy, napríklad GenBank, NCBI, EMBO a iné.

Rad metód aplikovateľných na receptory IL-10 sa môže aplikovať tak, ako sa napríklad popisuje v USSN 08/110,683 (receptor IL-10).

II. Nová rodina ľudských receptorov

Skratky: DTLR znamená receptor podobný Toll; IL-1 R znamená receptor interleukín-1; TH znamená homológie Toll; LRR znamená repetície bohaté na leucín; EST znamená exprimované sekvencie tag; STS namiesto sekvencie tagg; FISH fluorescenčná hybridizácia in situ.

Z objavu sekvenčnej homológie medzi cytoplazmatickými doménami Toll mušky Drosophila a receptormi ľudského interleukínu-1 (IL-1) plynie presvedčenie, že obe molekuly spúšťajú príbuzné signálne cesty spojené s jadrovou translokáciou transkripčných faktorov typu Rel. Táto konzervatívna signálna schéma riadi vývoj imunitnej odpovede ako u hmyzu, tak u stavovcov. Popisuje sa klonovanie molekúl novej triedy putatívnych ľudských receptorov s architektúrou proteinov, ktoré sú podobné Toll mušky Drosophila, ako do intracelulámych, tak extracelulámych segmentov. Päť ľudských receptorov podobných Toll označených DTLR 1 až 5 sú pravdepodobne priamymi homológmi uvedených molekúl a ako také, môžu tvoriť u ľudí dôležitý a nerozpoznaný komponent prirodzenej imunity; vývojové nahromadenie proteinov DTLR u stavovcov môže indikovať inú úlohu, ktorá je príbuzná s úlohou Toll pri dorzo-ventralizácii embrya mušky Drosophila. Môžu slúžiť ako regulátory skorého morfogenetického pätému. Rad blotov tkanivovej mRNA indikuje viditeľne odlišné patemy expresie ľudských DTLR. Použitie fluorescencie pri hybridizácii in situ a pri analýze databázy sekvencie s miestom tagg, sa tiež ukázalo, že gény príbuzné DTLR sa vyskytujú na chromozómoch 4 (DTLR 1, 2 a 3), 9 (DTLR4) a 1 (DTLR5). Predpoveď štruktúry domén, ktoré sú homológne s Toll (TH), pochádzajúcich z rôznych hmyzích alebo ľudských DTLR, z receptorov IL-1 stavovcov a z faktorov MyD88 a z proteinov nesúcich rezistenciu voči rastlinným ochoreniam, rozoznávajú paralelné β/α zvinutie s kyslým aktívnym miestom. Podobná štruktúra sa objavuje v triede regulátorov odpovede, ktoré sa u baktérií podieľajú na transdukcii informácií senzorov.

Semená morfogenetického pažeráka, ktoré tak dramaticky oddeľujú muchy od ľudí, sa vnesú do známych zárodočných tvarov a patemov, ale vznikajú veľmi odlišné bunkové komplexy (popisuje sa v publikáciách DeRobertis a Sasai (1996) Náture 380: 37-40; Arendt a Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61: 7-21). Tento rozdielny plán vývoja medzi hmyzom a stavovcami je doprevádzaný viditeľne podobnými signálnymi cestami a konzervatívne proteínové siete a biochemickými mechanizmami pochádzajúcimi z nerovnakého génového repertoáru (popisuje sa v publikáciách Miklos a Rubin (1996) Celí 86: 521-529 a Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33). Použiteľný spôsob, ako zmapovať vývoj týchto regulačných ciest, je prostredníctvom vnútrodruhového porovnania proteínových sekvencií a štruktúr a odhadnutím pravdepodobných molekulových komponentov (a biologickej funkcie) (popisuje sa v publikáciách Miklos a Rubin (1996) Celí 86: 521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33 (3-5) a Banfi et al., (1996) Náture Genet. 13: 167-174). Univerzálny kritický krok v embryonálnom vývine je špecifikácia telových osí, ktoré sa rodia z prirodzenej asymetrie, alebo sa spúšťajú vonkajším popudom (popisuje sa v publikácii DeRobertis a Sasai (1996) Náture 380: 37-40; Arendt a NublerJung (1997) Mech. Develop. 61:7-21). Ako modelový systém sa môže použiť fylogenetická báza a bunkové mechanizmy dorzoventrálnej polarizácie (popisuje sa v publikácii DeRobertis a Sasai (1996) Náture 380: 37-40; Arendt a Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61: 7-21). Prototyp molekulárnej stratégie pre túto transformáciu vyšiel z embrya Drosophila, kde postupné pôsobenie malého počtu génov vedie k ventralizačnému gradientu transkripcie faktora „Dorsal“ (popisuje sa v publikácii St. Johnston a Nusslein-Volhard (1992) Celí 68: 201-219 a Morisato a Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371-399).

Priebeh signálu sa sústredí na Toll, čo je transmembránový receptor, ktorý transdukuje väzbu pôvodne vylučovaného ventrálneho faktora, Spatzle, do cytoplazmatického vstupu, a aktivuje Pelle, čo je SerTľhr kináza, ktorá katalyzuje disociáciu faktora „Dorsal“ od inhibítora Cactus a umožňuje migráciu faktora „Dorsal“ do ventrálneho jadra (Morisato a Anderson (1995)

Ann. Rev. Genet. 29: 371-399; Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Develop. Biol. 12: 393-416). Priebeh Toll taktiež riadi u dospelých múch indukciu silných antimikrobiálnych faktorov (Lemaitre et al., (1996) Celí 86: 973-983). Táto úloha v imunitnej obrane u Drosophila je paralelou mechanizmu priebehu IL-1, ktorý pokrýva imunitu hostiteľa a protizápalové odpovede u stavovcov (popisuje sa v publikácii Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Develop. Biol. 12: 393-416; Wasserman (1993) Molec. Biol. Celí 4: 767-771). Cytoplazmatická doména príbuzná Toll v receptoroch IL-1 riadi väzbu kinázy podobnej Pelle, IRAK a aktiváciu latentného komplexu NF-rB/I-kB, ktorý odzrkadľuje faktory Dorsal a Cactus (popisuje sa v publikácii Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Develop. Biol. 12: 393416; Wasserman (1993) Molec. Biol. Celí 4: 767-771).

Vynález popisuje klonovanie a charakterizáciu štyroch nových molekúl podobných Toll u ľudí, označených DTLR 2 až 5 (popisuje sa v publikácii Chiang a Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239), čo umožnilo objaviť rodinu tesnejšie spätú s homológmi Toll Drosophila, ako s receptormi IL-1 stavovcov. Sekvencie DTLR sa získali z ľudských EST. Tieto čiastočné cDNA sa použili na získanie celých expresívnych profilov v ľudských tkanivách pre päť proteínov DTLR, pri mapovaní chromozomálnych lokácií príbuzných génov a pri zúžení voľby knižníc cDNA na vyhľadávanie cDNA v celej dĺžke. Po preštudovaní publikácií Banfi et al., (1996) Náture Genet. 13: 167-174 a Wang et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 4468-4476) sa skonštruoval biologický systém u ľudí, ktorý je náprotivkom regulačnej schémy u mušky Drosophila. Navyše, biochemický mechanizmus, riadiaci signál Toll je podnietený terciálnym zvinutím domény homológnej s Toll (TH), modul jadra je zdieľaný DTLR, široká rodina receptorov IL-1, cicavčie faktory MyD88 a rastlinné proteíny spôsobujúce rezistenciu voči ochoreniu (popisuje sa v publikácii Mitcham et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 57775783; Hardiman et al., (1966) Oncogene 13: 2467-2475). Vynález predkladá teóriu, že signálna cesta spájajúca morfogenézy a primitívnu imunitu u hmyzu, rastlín a zvierat (popisuje sa v publikácii Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Develop. Biol. 12: 393-416 a Wilson et al., (1997) Curr. Biol. 7: 175-178) môže mať korene v bakteriálnom dvojzložkovom priebehu.

Výpočtová analýza

Ľudské sekvencie príbuzné hmyzím proteínom DTLR sa identifikovali z databázy EST (dbEST) v ústave National Center for Biotechnology Information (NCBI) použitím serveru BLAST (popisuje sa v publikácii Altschul et al., (1994) Náture Genet. 6: 119-129). Pri izolácii signálnych domén rodiny proteínov DTLR, ktorá zdieľa ako proteíny stavovcov, tak proteíny rastlín a nachádza sa v nie príliš veľkých databázach, sa používajú citlivejšie metódy založené na profile alebo pateme (popisuje sa v publikácii Bork a Gibson (1996) Meth. Enzymol. 226: 162-184). Progresívne usporiadanie sekvencií DTLR vnútrobunkových alebo extrabunkových domén prebehlo spôsobom ClustalW (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). Tento program môže taktiež vypočítať stupeň vetvenia usporiadaných sekvencií podľa Naighbor-Joining algoritmu (5000 replikácií poskytuje spoľahlivé hodnoty na rozdelenie do troch skupín).

Konzervatívne usporiadanie patemov, ktoré existujú pri rôznych stupňoch prísnosti, sa navrhli v programe Consensus (internet URL http://www.bork.embl-heidelberg.de/Alignment/consensus.html). Knižnica PRINTS proteínových peptidových máp (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowseZPRINTS/PRINTS.html) (Attwood et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 212-217) identifikovala repetície bohaté na leucín (LRR), ktoré sa nachádzajú v extracelulámych segmetoch DTLR s motívom látky (kód v PRINTS je Leurichrpt), ktorá flexibilne páruje N- a C-terminálne rysy divergentných LRR. Na odvodenie sekundárnej štruktúry usporiadania intracelulámej domény sa použili dva predpokladané algoritmy, ktorých presnosť v troch Štádiách je približne 72% (Fisher et al., (1996 FASEB J. 10: 126-136). Program neurálnej siete PHD (Rošt a Sander (1994) Proteins 19: 55-72), štatistická prognózová metóda DSC (King a Stemberg (1996) Protein Sci. 5: 2298-2310) majú inetnetový server (URL http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/phdpred.html a http://bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc read align.html).

Intraceluláma oblasť kóduje oblasť THD, ktorá sa popisuje napríklad v publikácii Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475 a Rock et al., (1998) Proc. Naťl Acad. Sci. USA 95: 588-593. Táto doména je veľmi dôležitá pri mechanizme signálu receptorov, ktoré prenášajú fosfátovú skupinu do substrátu.

Klonovanie cDNA ľudského DTLR po celej dĺžke

Pri testovaní knižnice cDNA odvodenej od ľudskej erytroleukemickej bunkovej línie TF-1 (Kitamura et al., (1989) Blood 73: 375-380), ktorá vedie k získaniu sekvencie cDNA proteínu DTLR1, sa použili PCR priméry odvodené zo sekvencie Humrsc786 podobné Toll (Genbank prístupový kód D13637) (Nomura et al., (1994) DNA Res. 1: 27-35). Zostávajúce sekvencie DTLR sa získali z dbEST a relevantné klony EST sa získali od konzorcia I.M.A.G.E. (Lennon et al., (1996) Genomics 33: 151-152) prostredníctvom Research Genetics (Huntsville, AL): CloneID# 80633 a 117262 (DTLR2), 144675 (DTLR3), 202057 (DTLR4) a 277229 (DTLR5). cDNA ľudských proteínov DTLR 2 až 4 v celej dĺžke sa klonovala DNA hybridizáciou fágu ÄgtlO do knižníc cDNA 5'-Stretch Plus (Clontech) pochádzajúcich z pľúc a placenty dospelého človeka a z pečene plodu. Sekvencia DTLR5 sa získala z EST ľudských sklerotických plakov. Všetky pozitívne klony sa sekvenovali a usporiadali na identifikáciu otvorených čítacích rámcov (ORF) jednotlivých DTLR: DTLR1 (kloň veľkosti 2 366 bp, 786 aa ORF), DTLR2 (kloň veľkosti

600 bp, 784 aa ORF), DTLR3 (kloň veľkosti 3 029 bp, 904 aa ORF), DTLR4 (kloň veľkosti 3 811 bp, 879 aa ORF) a DTLR5 (kloň veľkosti 1 275 bp, 370 aa ORF). Sondy vhodné na hybridizáciu s DTLR3 a DTLR4 sa pripravili pomocou PCR, kde sa ako templát použila cDNA knižnica z ľudskej placenty (Stratagene) a z pečene dospelého človeka (Clontech). Páry primerov sa odvodili od sekvencií EST. Reakcie PCR sa vykonali použitím DNA polymerázy Taqplus z T. aquaticus (Stratagene) za nasledujúcich podmienok: 1 x (94 °C, 2 min.) 30 x (55 °C, 20 sekúnd; 72 °C 30 sekúnd; 94 °C 20 sekúnd), 1 x (72 °C, 8 min.). Na testovanie celej dĺžky cDNA DTLR2 sa pripravil fragment veľkosti 900bp vytvorený štiepením reštrikčnými enzýmami EcoRI/Xbal prvého klonu EST (ID# 80633), ktorý sa použil ako sonda.

Prenosy mRNA a lokalizácia na chromozóme

Ľudské mnopočetné tkanivo (Kat. # 1, 2) a prenosy bunkovej línie karcinómu (Kat. # 7757-1) obsahujúce v jednej dráhe približne 2 pg poly (A)⁺ RNA sa získali od firmy Clontech (Palo Alto, CA). V prípade DTLR 1 až 4 izolované cDNA slúžili v celej dĺžke ako sondy. V prípade DTLR5 sa použil plazmidový inzert klonu EST (ID č. 277229). Sondy sa označili rádioizotopom [a-³²P] dATP použitím kitu „Rediprime random primer labeling kit“ (RPN1 633) od firmy Amersham).

Pre-hybridizácia a hybridizácia sa uskutočnili pri teplote 65 °C v 0,5 M Na₂HPO₄, 7 % SDS, 0,5 M EDTA (pH 8,0). Všetky premývania sa uskutočnili pri teplote 65 °C, pričom dve počiatočné premývania sa uskutočnili tlmivým roztokom zloženia: 2 x SSC, 0,1 % SDS počas 40 min., potom nasleduje premytie s tlmivým roztokom 0,1 x SSC, 0,1 % SDS 20 minút. Membrány sa potom exponovali na X-ray film (Kodak) pri teplote -70 °C a v prítomnosti clôn na zvýšenie intenzity. Na vybraných klonoch ľudského DTLR, za účelom testovania ich expresie v sub-sadách hemopoietických buniek, sa uskutočnilo podrobnejšie Štúdium pomocou Southemovej analýzy cDNA knižnice.

Mapovanie ľudského chromozómu sa vykonalo fluorescenčnou hybridizáciou in situ (FISH), ako popisuje Heng a Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33: 109122, kde sa ako sondy použili klony cDNA celej dĺžky (DTLR 2 až 4) alebo čiastočné klony cDNA (DTLR5). Tieto analýzy vykonala firma SeeDNA Biotech Inc. (Ontario, Kanada). Hľadanie ľudských syndrómov (alebo myšacích defektov v synténnom mieste na chromozóme), spojené s mapovanými génmi DTLR, sa uskutočnilo v databáze dismorfhej ľudskomyšacej homológie na intemetovom serveri (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/DHMHD/hum chromel.html).

Konzervatívna architektúra ektodomén hmyzieho a ľudského DTLR Rodina Toll u Drosophila obsahuje aspoň štyri odlišné génové produkty: Toll, prototypový receptor, ktorý sa podieľa na dorzoventrálnom pateme embrya mušky (Morisato a Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371-399). Druhým menovaným je „18 Wheeler“ (18w), ktorý sa môže taktiež podieľať na skorom embryonálnom vývine (Chiang a Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239; Eldon et al., (1994) Develop. 120: 885-899). Dva ďalšie receptory sa predpovedajú na základe neúplného ORF podobného Toll, ktorý leží v smere expresie transkripčného lókusu (Mst) špecifického pre mužov (kód v databanke Genbank je X67703), alebo je kódovaný sekvenciou s označeným miestom (STS) Dm2245 (kód v databáze Genbank je G01378) (Mitcham et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783). Extraceluláme segmenty Toll a 18w sú charakteristicky zložené z neúplných motívov LRR obsahujúcich približne 24 aminokyselín (Chiang a Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225239; a Eldon et al., (1994) Develop. 120: 885-899). Podobné tandemové súbory LRR bežne tvoria na povrchu buniek adhezívne anténky rôznych molekúl a predpokladá sa, že ich generická terciálna štruktúra napodobňuje lôžko ribonukleázového inhibítora v tvare podkovy, kde 17 LRR je v podobe opakujúcej sa β/α-vlásenky s motívom 28 zbytkov (Buchanan a Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65: 1-44). Špecifické rozoznávanie Spatzle pomocou Toll môže nasledovať model navrhnutý pre naviazanie glykoproteínových hormónov viacerých LRR ektodomén vlásenkových receptorov použitím konkávnej strany zakriveného β-listu (Kajava et al., (1995) Structure 3: 867-877). Patem cysteínov v Spatzle a v sirotskom ligande Drosophila predpovedá podobnú terciálnu štruktúru cysteínového uzlíka (Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Develop. Biol. 12: 393-416; Casanova et al., (1995) Genes Develop. 9: 2539-2544).

a 31 ektodomén LRR Toll a 18w (fragment ORFMst vykazuje 16 LRR) je na základe sekvenčnej a patemovej analýzy najviac príbuzných s porovnateľnými 18, 19, 24 a 22 LRR súbormi DTLR 1 až 4 (nekompletný reťazec DTLR5 v súčasnej dobe zahrňuje Štyri LRR v blízkosti membrány) (Altschul et al., (1994) Náture Genet. 6: 119-129; Bork a Gibson (1996) Meth. Enzymol. 266: 162-184) (Obrázok č. 1). Rozdielom v reťazcoch ľudských DTLR je bežná strata oblasti zahrňujúcej približne 90 cysteínových zbytkov, ktoré sú pravidelne uložené v ektodoménach Toll, 18w a Mst ORF (sú vzdialené od membránového rozhrania v dĺžke 4, 6 a 2 LRR). Tieto cysteínové klastry sú dvojstranné s rozdielnou hornou (končiaci LRR) a spodný (skladaný na vrchu LRR) polovicou (Chiang a Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239; Eldon et al., (1994) Develop. 120: 885-899; Buchanan a Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65: 1-44). Horný model sa opakuje v ľudských DTLR a v DTLR Drosophila ako konzervatívna juxta membránového medzerníka (obrázok č. 1). Vynález naznačuje, že flexibilne lokalizované cysteínové klastry v receptoroch Drosophila (a v iných proteínoch LRR), keď spojujú hornú a spodnú časť, tvoria kompaktný modul s párovanými koncami, ktoré sa môžu začleniť medzi ľubovoľný pár LRR, pričom sa nemení zvinutie ektodomén DTLR. Analogické vyčnievajúce domény sa nachádzajú v štruktúrach iných proteínov (Russel (1994) Protein Engin. 7: 1407-1410).

Molekulová konštrukcia signálnej domény TH

Porovnanie sekvencií receptorov Toll a IL-1 typ-I (IL-1R1) vykazuje vzdialenú podobu cytoplazmaticke domény obsahujúcej približne 200 aminokyselín, ktoré pravdepodobne sprostredkovávajú signál pomocou podobných transkripčných faktorov typu Rel (Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí. Develop. Biol. 12: 393-416 a Wasserman (1993) Molec. Biol. Celí 4: 767-771). Tento funkčný príklad zahrňuje pár rastlinných proteínov nesúcich rezistenciu voči ochoreniu z rastlín tabaku a ľanu, ktorý vykazuje Nterminálny TH modul nasledovaný naviazaním nukleotidu (NTPáza) a LRR segmenty (Wilson et al., (1997) Curr. Biol. 7: 175-178). Naopak, „mŕtva doména“ predchádza TH reťazec MyD88 a intracelulámy myeloidný diferenciačný marker (Mitcham et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783; Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475) (obrázok č. 1). Nové receptory typu IL-1 zahrňujú IL-1R3, signálnu molekulu a sirotské receptory IL-1R4 (tiež nazývané ST2/Fit-1/Tl), IL-1R5 (proteín príbuzný IL-1R) a IL1R6 (proteín 2 príbuzný IL-1R) (Mitcham et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783; Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475). Na základe sekvencií nových ľudských DTLR vynález poskytuje definíciu evolučnej špirály tým, že sa analyzuje usporiadanie bežného modulu TH: desať blokov konzervatívnej sekvencie obsahujúcej 128 aminokyselín tvorí minimálne zvinutie domény TH. Medzery v usporiadaní označujú pravdepodobnú r

polohu sekvencie a slučiek rôznych dĺžok (obrázok č. 2a).

Dva predpokladané algoritmy, ktoré s výhodou využívajú patemy konzervatívnej a rôznorodej časti usporiadaných sekvencií PHD (Rošt a

Sander (1994) Proteins 19: 55-72) a DSC (King a Stenberg (1996) Proteín Sci. 5: 2298-2310), produkovali silné, korkondantné výsledky pre signálny modul TH (Obrázok č. 2a). Každý blok obsahuje diskrétny sekundárny štrukturálny element: otlačok alternatívnych β-reťazcov (označených A až E) a α-helixov (označených číslami 1 až 5) ukazuje na zvinutie β/α-triedy s ahelixami na oboch stranách paralelného β-listu. Hydrofóbne β-reťazce A, C a D sú určené na vytvorenie vnútorných priečok β-listu, zatiaľčo kratšie amfipatické β-reťazce B a E sa podobajú typickým hraničným jednotkám (obrázok č. 2a). Tento postup je zhodný s usporiadaním reťazcov B-A-C-D-E v jadre β-listu (obrázok č. 2b). Porovnanie zvinutia (mapovania) a rozpoznávacie programy (Fisher et al., (1996) FASEB J. 10: 126-136) silne odrážajú túto dvojito navinutú topológiu β/α. Prekvapivo funkčná predpoveď tejto načrtnutej štruktúry domén TH je, že mnoho konzervatívnych, nabitých zbytkov vo viacnásobnom usporiadaní mapuje C-terminálny koniec β-listu: zbytok Asp 16 (schéma číslovania blokov je uvedené na obrázku č. 2a) na konci βΑ, Arg39 a Asp40 nasleduje po βΒ, Glu75 v prvom závite a3 a voľnejšie konzervatívne zbytky Glu/Asp v slučke βϋ-α4 alebo po βΕ (obrázok č. 2a). Poloha štyroch iných konzervatívnych zbytkov (Asp7, Glu28 a páru Arg57-Arg/Lys58) je kompatibilná so sieťou môstkov solí na opačnom N-terminálnom konci β-listu (obrázok č. 2a).

Signálne funkcie závisia na štruktúrnej integrite domény TH. Neaktívne mutácie alebo delécie na hraniciach modulu (obrázok č. 2a) sa v prípade IL1R1 a Toll zaznamenávajú ( Heguy et al., (1992) J. Biol. Chem. 267: 26052609; Croston et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 16514-16517; Schneider et al., (1991) Genes Develop. 5: 797-807; Norris a Manley (1992) Genes Develop. 6: 1654-1667; Norris a Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Norris a Manley (1996) Genes Develop. 10: 862-872). Reťazce ľudského DTLR1-5 predlžujú minimálnu doménu TH (obsahuje 8, 0, 6, 22 a 18 zbytkov) a sú najviac podobné krátkemu 4 aa „chvostu“ Mst ORF. Toll a 18w vykazujú nepríbuzné chvosty tvorené 102 a 207 zbytkami (obrázok č. 2a), ktoré môžu negatívne regulovať signalizáciu fuzovaných ľudských domén (Norris a Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Norris a Manley (1996) Genes Develop. 10: 862-872.

Vývojový vzťah medzi odlišnými proteínmi, ktoré nesú doménu TH, možno najlepšie pochopiť z fylogenetického stromu odvodeného z viacnásobného usporiadania (obrázok č. 3). Štyri základné vetvy oddeľujú rastlinné proteíny, faktory MyD88, recptory IL-1 a molekuly podobné Toll, neskoršie klastry vetví ľudských DTLR a DTLR Drosophila.

Rozptyl génov ľudských DTLR na chromozóme

Za účelom vyskúmať genetickú väzbu nascentnej rodiny génov ľudského DTLR sa mapovali štyri z piatich génov pomocou metódy FISH (obrázok č. 4). Gén DTLR1 sa zobrazil už skôr v rámci projektu ľudského genómu: lokus STS databázy (dbSTS č. G06709, zodpovedá STS WI-7804 alebo SHGC12827) existuje v prípade cDNA Humrsc786 (Nomura et al., (1994) DNA Res. 1: 27-35) a fixuje gén na chromozóm 4 v intervale D4S1587-D42405 (50-56 cM) približne 4pl4. Tento postup sa podporil analýzou FISH (Taguchi et al., (1996) Genomics 32: 486-488). Vynález spoľahlivo priraďuje zostávajúce gény DTLR k miestam na chromozóme 4q32 (DTLR2), 4q35 (DTLR3), 9q32-33 (DTLR4) a lq33.3 (DTLR5). V priebehu uvedenej práce STS sa vytvoril rodičovský DTLR2 EST (kloň ID č. 80633) (dbSTS č. T57791 pre STS SHGC-33147) a mapoval sa chromozóm 4 interval D4S424D4S1548 (143-153 cM) v 4q32. Na dlhom rameni chromozómu 4 existuje medzi génmi DTLR2 a DTLR3 približne 50 cM medzera.

Gény DTLR sa exprimujú odlišne

Toll a 18w majú komplex priestorového a dočasného pätému expresie u Drosophila, ktorý môže fungovať i cez embryonálne vytváranie vzoru (St. Johnston a Nusslein-Volhard (1992) Celí 68: 201-219, Morisato a Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371-399, Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Develop. Biol. 12: 393-416, Lamaitre et al., (1996) Celí 86: 973-983, Chiang a Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239, Eldon et al., (1994) Develop. 120: 885-899. Testovala sa priestorová distribúcia transkriptov DTLR pomocou analýzy mRNA prenosom rôznych ľudských tkanív a bunkovej línie karcinómu použitím rádioaktívne označených cDNA DTLR (obrázok č. 5). Zistilo sa, že DTLR1 sa exprimuje všade a expresia je silnejšia než u iných receptorov. Podľa predpokladu je prítomná vo vaječníkoch a v slezine (obrázok č. 5, panely A a B), čo odráža alternatívny zostrih, krátku transkripčnú formu, veľkú 3,0 kB a dlhú transkripčnú formu, veľkú 8,0 kB DTLR1. mRNA buniek karcinómu tiež vykazuje prominentnú nadmernú expresiu DTLR1 v bunkovej línii Raji Burkuttovho Iymfómu (obrázok č. 5, panel C). mRNA nie je exprimovaná v tak širokom rozsahu ako DTLR1. Jeho forma o veľkosti 4 kB sa detekovala v pľúcach a transkript o veľkosti 4 kB sa vyskytuje v srdci, mozgu a svaloch. Distribučný patem proteínu DTLR3 ukazuje rovnaké výsledky pre DTLR2 (obrázok č. 5, panel E). Proteín DTLR3 je tiež prítomný ako dva hlavné transkripty o veľkosti 4,0 a 6,0 kB a najsilnejšia expresia sa pozorovala v placente a pankrease. Naopak, mRNA DTLR4 a DTLR5 sa javí ako extrémne tkanivowo špecifická. Proteín DTLR4 sa detekoval len v placente, ako jediný transkript o veľkosti približne 7,0 kB. Slabý signál o veľkosti 4,0 kB sa pozoroval v prípade DTLR5 vo vaječníkoch a v periférnych krvných monocytoch.

Komponenty vývojového regulačného systému

Pôvodné molekulárne návrhy a divergentné osudy signálneho priebehu sa môžu zrekonštruovať na základe porovnávania genómov (Miklos a Rubin (1996) Celí 86: 521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33; Banfi et al., (1996) Náture Genet. 13: 167-174 a Wang et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 4468-4476). Vynález použil túto logiku na identifikáciu emerznej rodiny génov u ľudí. Tieto gény kódujú päť receptorových paralógov označených DTLR 1 až 5, ktoré sú priame vývojové náprotivky génovej rodiny Drosophila vedenej Toll (obrázky č. 1 až 3). Konzervatívna architektúra ľudských a muších DTLR, konzervatívne ektodomény LRR a vnútrobunkové moduly TH (obrázok č. 1) ukazujú, že silný priebeh, spojený s Toll u Drosophila (6, 7), prežíva u stavovcov. Najlepší dôkaz pochádza z opakovaného priebehu: zberači systém IL-1 a jeho repertoár domén TH fuzovaných s receptorom, IRAK, NF-κΒ a homológmi I-_KB (Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí Develop. Biol. 12: 393-416; Waserman (1993) Molec. Biol. Celí 4: 767-771; Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475 a Cao et al., (1996) Science 271: 1128-1131). Taktiež sa charakterizoval faktor podobný Tube. Nie je známe, či DTLR sa môžu produktívne spájať so signálnym vybavením, alebo či sa namiesto nich dá použiť paralelná sada proteínov. Na rozdiel od receptorov II-1, LRR ľudských DTLR je určená na zachovanie afinity k faktorom cystínového uzlíka príbuzného so Spatzle/Trunk. Izoloval sa kandidát ligandov DTLR (nazývaný PEN), ktorý spĺňa túto formu.

Biochemické mechanizmy signálnej transdukcie sa môžu stanoviť pomocou konzervácie zvinutia interakčných proteínov v signálnom priebehu (Miklos a Rubin (1996) Celí 86: 521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33 (3-5) a Banfi et al., (1996) Náture Genet. 13: 167-174). V súčasnosti signálna paradigma Toll zahrňuje molekuly, ktorých úloha je úzko definovaná ich štruktúrou, pôsobením alebo osudom: Pelle je Ser/Thr kináza (fosforylácia), Dorsal je transkripčný faktor podobný NF-_KB (naviazanie DNA) a Cactus je inhibitor opakovania ankirínu (naviazanie faktoru Dorsal, degradácia) (popisuje sa v publikácii Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí. And Devel.Biol. 12: 393-416).

Naopak, funkcie domény TH Toll a Tube neboli zatiaľ odhalené. Podobne ako iné receptory cytokinov (Heldin (1995) Celí 80: 213-223), dimerizácia Toll sprostredkovaná ligandom sa javí ako spúšťací jav: voľné cysteíny v oblasti justamembrány Toll tvoria konštitutívne aktívne receptorové páry (Schneider et al., (1991) Genes Develop. 5: 797-807) a chimerické receptory Torso-Toll signalizujú ako diméry (Galindo et al., (1995) Develop. 121: 2209-2218). Veľké skrátenie alebo hromadná strata ektodomény Toll vedie k promiskuitnému vnútrobunkovému signálu (Norris a Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Winans a Hashimoto (1995) Molec. Biol. Celí 6: 587596), reminiscentné onkogénne receptory s katalytickými doménami (Heldin (1995) Celí 80: 213-223). Tube sa nachádza na membráne, obsadil Nterminálnu (mŕtvu) doménu Pelle a je fosforylovaný. Na základe analýzy dvoch hybridov sa nezaznamenali ani Toll-Tube, ani Toll-Pelle interakcie (Galindo et al., (1995) Develop. 121: 2209-2218 a Grophans et al., (1994) Náture 372: 563-566. Posledný menovaný výsledok naznačuje, že konformačné štádium TH domény Toll nejako ovplyvňuje doplňovanie faktorov (Norris a Manley (1996) Genes Develop. 10: 862-872; Galindo et al., (1995) Develop. 121: 2209-2218).

V centre tohto problému je štrukturálna podstata modulu TH Toll. Za účelom zodpovedania tejto otázky sme výhodne použili vývojovú diverzitu sekvencií TH z hmyzu, rastlín a stavovcov. Začlenenie reťazcov ľudských DTLR a extrahované minimálne konzervatívne proteínové jadro slúžia predpovedaniu štruktúry a rozoznaniu zvinutia (obrázok č. 2). Jasne predpokladané zvinutie domény ΤΗ (β/α)5 s jeho asymetrickým klastrom kyslých zbytkov je topologicky identické so štruktúrami regulátorov odpovede v bakteriálnych priebehoch signálu s dvoma komponentami (Volz (1993) Biochemistry 32:

11741-11753; Parkinson (1993) Celí 73: 857-871) (obrázok č. 2). Prototyp regulátora chemotaxie CheY dočasne viaže divalentný katión v aspartátovom vrecku na C-konci jadra β-listu. Tento katión poskytuje elektrostatickú stabilitu a umožňuje aktívnu fosforyláciu Asp s nulovým stupňom voľnosti (Volz (1993) Biochemistry 32: 11741-11753). Doména TH môže zachytávať kationty v jej kyslom hniezde, ale aktivácia a signál v smere expresie génu mohol závisieť na špecifickom naviazaní negatívne nabitej látky: aniónové Ugandy môžu obísť intenzívne negatívny potenciál väzobného miesta tým, že sa uzatvoria do presnej siete vodíkových väzieb (Ledvina et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6786-6791). Doména TH nemôže jednoducho pôsobiť ako pasívne lešenie na vybudovanie komplexu Tube/Pelle v prípade Toll, alebo homológne systémy u rastlín a stavovcov, ale miesto toho sa aktívne zúčastnia ako skutočné spínače v mechanizme signálnej transdukcie. Možným vysvetlením podmienečného naviazania komplexu Tube/Pelle je, že Toll dimerizácia môže podporiť odmaskovanie chvostov regulačných receptorov (Norris a Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Norris a Manley (1996) Genes Develop. 10: 862-872), alebo naviazanie TH vrecka na aktivátory malých molekúl. Voľné moduly TH vo vnútri bunky (Norris a Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Winans a Hashimoto (1995) Molec. Biol. Celí 6: 587-596) môžu pôsobiť ako katalytické spínače podobné CheY tým, že aktivujú a spájajú potulné komplexy Tube/Pelle.

Morfogenetické receptory a imunitná ochrana

Vývojová väzba medzi hmyzím imunitným systémom a imunitným systémom stawocov je otlačená v DNA: gény kódujúce antimikrobiálne faktory u hmyzu vykazujú motívy podobné elementom odpovede v akútnej fáze, o nich je známe, že u cicavcov viažu NF-_KB transkripčné faktory Hultmark (1993) Trends Genet. 9: 178-183. Faktory Dorsal a dva faktory príbuzné Dorsal Dif a Relish pomáhajú indukovať tieto obranné proteíny po bakteriálnej opakovanej imunizácii (Reichhart et al., (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1218-1224; Ip et al., (1993) Celí 75: 753-763 a Dushay et ak, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10343-10347). Toll alebo iné DTLR modulujú tieto rýchle imunitné odpovede u dospelých mušiek Drosophila (Lemaitre et ak, (1996) Celí 86: 973-983 a Rosetto et ak, (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 111116). Tieto mechanistické paralely k protizápalovej odpovedi IL-1 u stavovcov sú dôkazom funkčnej verzality signálneho priebehu Toll a naznačujú synergiu medzi embryonálnym patemom a prirodzenou imunitou (Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Celí. And Devel. Biol. 12: 393-416; Lemaitre et ak, (1996) Celí 86: 973-983; Wasserman (1993) Molec. Biol. Celí 4: 767-771; Wilson et ak, (1997) Curr. Biol. 7: 175-178; Hultmark (1993) Trends Genet. 9: 178-183; Reichhart et ak, (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1218-1224; Ip et al., (1993) Celí 75: 753-763 a Dushay et ak, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10343-10347; Rosetto et ak, (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 111-116; Medzhitov a Janeway (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 4-9). Užšie homológie hmyzích a ľudských proteínov DTLR povzbudzujú dokonca silnejšie prekrytie biologických funkcií, ktoré čisto nahradia imunitné paralely systémov IL-1 a prepožičajú potencionálne molekulárne regulátory dorzo-ventrálnym a iným transformáciám embryí stavovcov (DeRobertis a Sasai (1996) Náture 380: 37-40 a Arendt a NublerJung (1997) Mech. Develop. 61: 7-21). Vynález popisuje veľkú receptorovú rodinu u ľudí, odrážajúcu súčasný vynález Frizzledových receptorov u stavovcov pre Wnt faktory tvorenia vzorov (Wang et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 4468-4476). Ako mnoho iných receptorových systémov, majú významnú úlohu pri skorom vývine (Lemaire a Kodjabachian (1996) Trends Genet. 12: 525-531). Jasné bunkové súvislosti kompaktných embryí a dospelých jedincov jednoducho vedú k signálnym dráham a k ich difúzovateľným spínačom, ktoré majú v rôznych časoch rôzne biologické výstupy, napríklad morfogénna verzus imunitná odpoveď v prípade proteínov

DTLR. V prípade hmyzích, rastlinných a ľudských systémov, príbuzných s Toll, (Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475; Wilson et al., (1997) Curr. Biol. 7: 175-178) tieto signály pôsobia prostredníctvom regulačnej domény TH, ktorá sa podobá bakteriálnemu transdukčnému motoru (Parkinson (1993) Celí 73: 857-871).

Proteín DTLR6 vykazuje zvlášť štrukturálne rysy, ktoré dokazujú jeho členstvo v rodine. Členovia rodiny sa podieľajú na množstve podstatných vývojových ochorení a fungujú ako prirodzený imunitný systém. DTLR sa zistil na chromozóme X v pozícii, ktorá nie je dôležitá pre hlavné vývojové abnormality (popisuje sa napríklad na webovej stránke The Sanger Center: human x chromozóm; http://gc.bcm.tmc.edu:8088/cgi-bin/seq/home). Prístupové číslo pre uložený PAC je AC003046. Toto prístupové číslo obsahuje sekvenciu z dvoch PAC: RPC-164K3 a RPC-263P4. Tieto dve sekvencie PAC sa mapovali na ľudskom chromozóme Xp22 na mieste web medzi STS markermi DXS704 a DXS7166. Táto oblasť je dôležitá v prípade ťažkých vývojových abnormalít.

III. Amplifikácia fragmentu DTLR pomocou PCR

Vybrali sa dve vhodné sekvencie primérov (uvádzajú sa v tabuľke č. 1 až 10). RT-PCR sa používa u vhodných vzoriek mRNA vybraných na základe prítomnosti mRNA, ktorá produkuje časť alebo celú cDNA, napríklad vzorka, ktorá exprimuje gén (Innis et al., (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; Dieffenbach a Dveksler (1995, eds.) PCR Primér: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY). To umožní stanovenie použiteľnej sekvencie za účelom testovania celého génu v knižnici cDNA. TLR6 je spojovacou sekvenciou v genóme, ktorá môže naznačovať prítomnosť ďalších TLR. PCR genómovej DNA môže vytvoriť spojovaciu sekvenciu v plnej dĺžke a môže sa aplikovať technológia prechádzania chromozómom. V inom prípade sekvenčné databázy budú obsahovať sekvenciu odpovedajúcu oblastiam popísaným vo vyhotovení vynálezu alebo ich príbuzným formám, napríklad alternatívny zostrih, atď. V prípade knižnice cDNA sa môže aplikovať taktiež expresívna klonovacia metóda.

IV. Rozloženie DTLR v tkanivách

Detekovala sa mRNA každého génu kódujúca tieto DTLR (obrázky 5A až 5F). Vhodnou technológiou sa testujú ďalšie bunky a tkanivá (napríklad PCR, imunologické testy, hybridizácia a podobne). Prípravky cDNA tkanív a orgánov sú dostupné napríklad u firmy Contech, Mountain View, CA. Môže sa použiť identifikácia zdrojov prirodzenej expresie.

Soutehemova analýza: DNA (5 pg) z primárnej knižnice amplifikovanej cDNA sa štiepila vhodnými reštrikčnými enzýmami, čím sa uvoľnili inzerty. Potom sa vykonala elektroforéza na 1% agarózovom geli a DNA sa preniesla na nylonovú membránu (Schleicher a Schuell, Keene, NH).

Vzorky na izoláciu ľudskej mRNA v typickom prípade zahrňujú napríklad periférne krvné jednobunkové bunky (monocyty, T bunky, NK bunky, granulocyty, B bunky) v pokojnej fáze (T 100); periférne krvné jednobunkové bunky aktivované anti-CD3 počas 2, 6, 12 hodín (T101); T bunka, ΊΉ0 kloň Mot 72 v pokojnej fáze (T 102); T bunka, THO kloň Mot 72 aktivovaná antiCD28 a anti-CD3 počas 3, 6, 12 hodín (T103); T bunka ΊΉ0 kloň Mot 72, anergicky ošetrená špecifickým peptidom počas 2, 7, 12 hodín (TI04); T bunka, TH1 kloň HY06 v pokojnej forme (T107); T bunka TH1 kloň HY06 aktivovaná anti-CD28 a anti-CD3 počas 3, 6 a 12 hodín (T 108); T bunka, TH1 kloň HY06, anergicky ošetrená špecifickým peptidom počas 2, 6 a 12 hodín (TI09); T bunka TH2 kloň HY935 v pokojnej forme (TI 10); T bunka TH2 kloň HY935 aktivovaná anti-CD28 a anti-CD3 počas 2, 7, 12 hodín (TI 11); T bunky CD4+CD45RO-T bunky polarizované 27 dní pomocou.anti79

CD28, IL-4 a anti IFN-γ, TH2 polarizované, aktivované anti-CD3 a antiCD28 počas 4 hodín (TI 16); línie nádorových T buniek Jurkat a Hut78 v pokojnej forme (TI 17); klony T buniek AD13%.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69 v pokojnej forme (TI 18); T bunka, náhodné klony γδ T bunky, splenocyty v pokojnej forme (B 100); splenocyty aktivované antiCD40 a IL-4 (B 101); EBV línie B buniek WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY v pokojnej forme (B 102); línie B buniek JY aktivovaná PMA a ionomycínom počas 1, 6 hodín (B 103); klony NK 20 v pokojnej forme (K 100); klony NK 20 aktivované PMA a ionomycínom počas 6 hodín (K101); kloň NKL odvodený z periférnej krvi pacienta trpiaceho LGL leukémiou ošetrený IL-2 (K106); NK cytotoxický kloň 640-A30-1, v pokojnej forme (K 107); hematopoietická prekurzorová línia TF1, aktivovaná PMA a ionomycínom počas 1, 6 hodín (C 100); línia premonocytov U937 v pokojnej forme (M 100); línia premonocytov U937 aktivovaná PMA a ionomycínom počas 1, 6 hodín (Ml01); oddelené monocyty aktivované LPS, IFNy, anti-IL-10 počas 1, 2, 6, 12, 24 hodín (M102); oddelené monocyty aktivované LPS, IFNy, IL-10 počas 1, 2, 6, 12, 24 hodín (M 103); oddelené monocyty aktivované LPS, IFNy, anti-IL-10 počas 4 a 16 hodín (M 106); oddelené monocyty aktivované LPS, IFNy, IL-10 počas 4 a 16 hodín (M 107); oddelené monocyty aktivované LPS počas 1 hodiny (M 108); oddelené monocyty aktivované LPS počas 6 hodín (M 109); DC 70 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycínom počas 1 hodiny (D102); DC 70 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycínom počas 6 hodín (D 103); DC 95 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované PMA a ionomycínom počas 1, 6 hodín (D 104); DC 95% CDla+, ex CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované PMA a ionomycínom počas 1, 6 hodín (D 105); DC CDla+, CD86+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované PMA a ionomycínom počas 1, 6 hodín (D 106); DC z monocytov GM-CSF, IL-4 5 dní, v pokojnej forme (D 107); DC z monocytov GM-CSF, IL-4 5 dní, v pokojnej forme (D 108); DC z monocytov GM-CSF, IL-4 5 dní, aktivované LPS počas 4, 16 hodín (D 109); DC z monocytov GM-CSF, IL-4 5 dní, aktivované TNFa počas 4, 16 hodín (Dl 10); benigný nádor leiomyóm Lll (X101); normálny myometrium M5 (0115); maligný leiomyosarkóm GS1 (X103); línia sarkómu pľúcnych fibroblastov MRC5, aktivovaná PMA ionomycínom počas 1, 6 hodín (C 101); bunková línia karcinómu epitelu obličiek CHA aktivovaná PMA a ionomycínom počas 1, 6 hodín (C 102); obličky 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0100); pľúca 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0101); pečeň 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0102); srdce 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0103); mozog 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0104); žlčník 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0106); tenké črevo 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0107); tukové tkanivo 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0108); vaječníky 28 týždňového zárodku ženského pohlavia (0109); maternica 28 týždňového zárodku ženského pohlavia (OllO); semenníky 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (0111); slezina 28 týždňového zárodku mužského pohlavia (Ol 12); placenta dospelého jedinca vo veku 28 týždňov (Ol 13); zapálené mandle 12ročného jedinca (X 100).

Vzorky na izoláciu myšacej mRNA zahrňujú napríklad líniu pokojných fibroblastových L buniek (C200); Braf:ER transfekované bunky (fúzia Braf s estrogénovým receptorom), slúžia ako kontrola (C201); T bunky, TH1 polarizované (Mel 14 jasné, CD4+ bunky zo sleziny polarizované počas 7 dní IFN-γ a anti IL-4; T200); T bunky, TH2 polarizované (Mel 14 jasné, CD4+ bunky zo sleziny polarizované počas 7 dní IFN-γ a anti IL-4 a anti-IFN-γ; T201); T bunky vysoko polarizované TH1 (Opanshaw et al., (1995) J. Exp.

Med. 182: 1357-1367) aktivované anti-CD3 počas 2, 6, 16 hodín; T202); T bunky vysoko polarizované THI (Opanshaw et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1357-1367) aktivované anti-CD3 počas 2, 6, 16 hodín; T203); CD44- CD25+ pre-T bunky získané z týmusu (T204); kloň Dl.l THI T bunky, v pokojnej forme počas 3 týždňov po poslednej stimulácii antigénom (T205); kloň Dl.l THI T bunky stimulované 10 pg/ml ConA počas 15 hodín (T206); kloň CDC35 TH2 T bunky v pokojnej forme počas 3 týždňov po poslednej stimulácii antigénom (T207); kloň CDC35 TH2 T bunky stimulované 10 pg/ml ConA počas 15 hodín (T208); Mell4+ nikdy nepoužitých T buniek zo sleziny v pokojnej forme (T209); Mell4+ T bunky polarizované na Thi s IFN-y/IL-12/anti-IL-4 počas 6, 12, 24 hodín (T210); Mell4+ T bunky polarizované na Th2 s IL-4/anti-IFN-y počas 6, 13, 24 hodín (T211); nestimulovaná bunková línia zrelých B buniek leukémie A20 (B200); nestimulovaná línia B buniek CH 12 (B201); nestimulované veľké B bunky zo sleziny (B202); B bunky z celej sleziny aktivované LPS (B203); metrizamidom obohatené dendritické bunky z celej sleziny v pokojnej forme (D200); dendritické bunky z kostnej drene v pokojnej forme (D201); bunková línia monocytov RAW 264,7 aktivovaná LPS počas 4 hodín (M200); makrofágy kostnej drene získané z GM a M-CSF (M201); bunková línia makrofágov J774 v pokojnej forme (M202); makrofágová bunková línia J774 + LPS + anti-IL-10 počas 0,5, 2, 3, 6, 12 hodín (M203); makrofágová bunková línia J774 + LPS + IL-10 počas 0,5, 1, 3, 5, 12 hodín (M204); aerosólom ošetrené tkanivo myšacích pľúc, Th2 primery, dávky aerosólu OVA sa podávajú počas 7, 14, 23 hodín (Garlisi et al., (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75: 75-83; X206); pľúcne tkanivo infikované Nippostrongulus (Cofíman et al., (1989) Science 245: 308-310; X200); celé normálne pľúca dospelého jedinca (0200); celé pľúca rag-1 (Schwarz et al., (1993) Immunodeficiency 4: 249-252; 0205); IL-10 K.O.

slezina (Kuhn et al., (1991) Celí 75: 263-274; X201); celá normálna slezina dospelého jedinca (0201); celá slezina rag-1 (0207); IL-10 K.O. Peyerove škvrny (0202); celé normálne Peyerove škvrny (0210); IL-10 K.O. mesenterické lymfatické žľazy (X203); celé normálne mesenterické lymfatické žľazy (0211); IL-10 K.O. hrubé črevo (X203); normálne celé črevo (0212); NOD myšací pankreas (Makino et al., (1980) Jikken Dobutsu 29: 1-13; X205); celý týmus, rag-1 (0208); celé obličky rag-1 (0209); celé srdce rag-1 (0202); celý mozog rag-1 (0203); celé semenníky rag-1 (0204); celá pečeň rag-1 (0206); normálne krysie spojivové tkanivo (0300) a krysie artritické spojivové tkanivo (X300).

V. Klonovanie náprotivku DTLR

Za účelom získania náprotivkov uvedených DTLR prednostne z iných primátov sa použili rôzne stratégie. Jednou metódou je krížová hybridizácia použitím sond DNA blízko príbuzných druhov. Inou metódou je použitie špecifických PCR primérov založené na identifikácii blokov, ktoré sú medzi určitými druhmi podobné alebo odlišné, napríklad ľudské gény, oblasti vysoko konzervatívne alebo nekonzervatívne polypeptidové alebo nukleotidové sekvencie. V inom prípade sa pri expresívnom klonovaní môžu použiť protilátky.

VI. Produkcia cicavčieho proteínu DTLR

Vytvorila sa napríklad GST, čo je fuzovaná konštrukcia na expresiu napríklad v baktériách E. coli. Skonštruoval sa myšací IGIF pGex plazmid a transformoval sa do E. coli. Čerstvo transformované bunky sa kultivujú v médiu LB, ktoré obsahuje 50 pg/ml ampicilínu a indukujú sa IPTG (Sigma, St. Louis, MO). Po celonočnej indukcii sa získali baktérie a izolovali sa pelety obsahujúce proteín DTLR. Pelety sa homogenizovali v tlmivom roztoku TE (50 mM Tris-báza pH 8,0, 10 mM EDTA a 2 mM pefabloc) o objeme 2 litre. Tento materiál 3-krát prechádza mikrofluidizér (Microfluidics, Newton, MA). Fluidizovaný supematant sa centrifuguje na rotore Sorvall GS3 1 hodinu pri 13 000 ot./min. Výsledný supematant obsahujúci proteín DTLR sa filtruje a ďalej prechádza cez glutatión-sefarózovú kolónu, ktorá sa uviedla do rovnováhy 50 mM Tris-bázou pH 8,0. Frakcie, obsahujúce fuzovaný proteín DTLR-GST, sa spojili a štiepili trombínom (Enzýme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN). Štiepené frakcie potom prešli Q-sefarózovou kolónou uvedenou do rovnováhy tlmivým roztokom 50 mM Tris-bázy. Frakcie obsahujúce DTLR sa spojili a zriedili studenou destilovanou vodou, znížila sa vodivosť a prešli samotnou kolónou s čerstvou Q-sefarózou alebo za sebou s kolónou s imunoafinitnými protilátkami. Frakcie obsahujúce proteín DTLR sa spojili, rozdelili do alikvótov a skladovali sa pri teplote -70 °C v mrazničke.

Porovnanie CD spektra s proteínom DTLR1 môže naznačovať, že proteín je správne zvinutý (Hazuda et al., (1969) J. Biol. Chem. 264: 1689-1693).

VII. Biologické testy s DTLR

Biologické testy sa vo všeobecnom prípade týkajú schopnosti proteínov viazať ligandy, alebo sa testuje kinázová/fosfatázová aktivita receptora. Aktivita je v typickom prípade reverzibilná, ako je množstvo pôsobení iných enzýmov sprostredkované aktivitou fosfatázy alebo fosforylázy. Tieto aktivity sú ľahko merateľné štandardným postupom (Hardie et al., (eds. 1995) The Protein Kinase Fact Book vols. I and II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks et al., (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter et al., (1992) Celí 70: 375-388; Lewin (1990) Celí 61: 743-752; Pines et al., (1991) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 56: 449-463 a Parker et al., (1993) Náture 363: 736-738.

Rodina interleukínov 1 obsahuje molekuly, ked' každá z nich je dôležitý mediátor zápalového ochorenia (Dinarello (1996) „Biological basis for interleukin-1 in disease“ Blood 87: 2095-2147). Tu sa naznačuje, že rôzne ligandy Toll môžu hrať dôležitú úlohu pri zahájení ochorenia. Nájdenie nových proteínov príbuzných rodine 1L-1 podporuje identifikáciu molekúl, ktoré poskytujú molekulárny základ pre zahájenie ochorenia a umožňuje vývoj terapeutických stratégií väčšieho rozsahu a účinnosti.

VIII. Príprava protilátok špecifických napríklad pre DTLR4

Inbredné myši Balb/c sa imunizovali interperitonálne rekombinantnými formami proteínu, napríklad čistený DTLR4 alebo stabilne transfekované bunky NIH-3T3. Zvieratá sú za účelom ďalšej stimulácie produkcie protilátok imunizované vo vhodnom čase proteínom s ďalším adjuvans alebo bez neho. Zhromaždilo sa sérum alebo hybridomy produkované získanými slezinami.

V alternatívnom prípade sa myši Balb/c imunizovali s bunkami transformovanými génom alebo jeho fragmentom. Ide o endogénne alebo exogénne bunky. Môžu sa taktiež imunizovať izolovanými membránami obohatenými expresiou antigénu. Sérum sa odobralo vo vhodnom čase, v typickom prípade po ďalších aplikáciách. Na produkciu proteínu in situ alebo na vytvorenie imunitnej odpovede sa môžu použiť rôzne metódy génovej terapie.

Môžu sa pripraviť monoklonálne protilátky. Napríklad splenocyty fuzovali s vhodným fuzujúcim partnerom a hybridomy sa vybrali v rastovom médiu štandardnými postupmi. U supematantov hybridomov sa testovala prítomnosť protilátok, ktoré sa viažu na požadovaný DTLR, napríklad testom ELISA alebo iným testom. Môžu sa tiež vybrať a pripraviť protilátky, ktoré špecificky rozoznávajú špecifické vyhotovenie DTLR.

V inom postupe sa syntetické peptidy alebo čistený proteín prezentujú v imunitnom systéme za vzniku monoklonálnych alebo polyklonálnych protilátok (Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene a Harlow a Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor

Press. V správnych situáciách je väzobné miesto buď označené, ako sa popisuje vyššie v texte, napríklad fluorescenčné alebo inak, alebo je imobilizované na substráte. Nukleové kyseliny sa môžu tiež zabudovať do buniek zvierat, aby produkovali antigén, ktorý slúži na vyvolanie imunitnej odpovede (popisuje sa napríklad v publikácii Wang et al., (1993) Proc. Naťl. Acad. Sci. 90: 4156-4160; Barry et al., (1994) BioTechniques 16: 616-619 a Xiang et al., (1995) Immunity 2: 129-135).

IX. Produkcia fuzovaných proteínov, napríklad s DTLR5

S proteínom DTLR5 sa pripravujú rôzne fuzované konštrukcie. Táto časť génu sa fuzuje s epitopom tag, napríklad FLAG tag alebo s konštrukciou dvoch hybridných systémov (popisuje sa napríklad v publikácii Fields a Song (1989) Náture 340: 245-246).

Epitop tag sa môže použiť pri postupe expresívneho klonovania, kde sa k detekcii väzobného partnera používajú protilátky anti-FLAG, napríklad ligand pre proteín DTLR5. Na izoláciu proteínov, ktoré sa môžu špecificky viazať na DTLR5, sa môže tiež použiť dvojhybridný systém.

X. Mapovanie DTLR na chromozóme

Pripraví sa patem chromozómov. Hybridizácia in situ sa uskutočnila s prípravkom chromozómov, získaných z lymfocytov, stimulovaných fytohemaglutinínom, kultivovaných 72 hodín. Pri posledných siedmich hodinách kultivácie sa pridá 5-bromodeoxyuridín (60 pg/ml), aby sa zaistilo posthybridizačné vytvorenie pruhov dobrej kvality.

Vhodný fragment, napríklad fragment vytvorený PCR, amplifikovaný pomocou primérov, kde sa ako templát použije celková cDNA B bunky, sa klonoval do vhodného vektora. Vektor je označený nick-tansláciou ³H. Rádioaktívne označená sonda hybridizuje s metafázovým patemom, ako sa popisuje v publikácii Mattei et al., (1985) Hum. Genet. 69: 327-331.

Po tom, čo sa sklíčka potiahnu jadrovou stopovacou emulziou (KODAK NTB₂), exponujú sa napríklad 18 dní pri teplote 4 °C. Aby sa predišlo skĺznutiu zrniek striebra počas tvorenia pruhov, sú chromozómy najskôr zafarbené tlmivým roztokom Giemsa a metafáza sa vyfotografuje. Potom sa uskutoční R-pruhovanie pomocou metódy fluorochróm-fotolýza-Giemsa (FPG) a metafázy sa pred analýzou fotografovali.

V alternatívnom prípade sa môže vykonať metóda FISH, ako sa popisuje vyššie v texte. Gény DTLR sa nachádzajú na rôznych chromozómoch. DTLR2 a DTLR3 sa nachádzajú na ľudskom chromozóme 4; DTLR4 sa nachádza na ľudskom chromozóme 9 a DTLR5 sa nachádza na ľudskom chromozóme 1 (obrázky 4A až 4D).

XI. Vzťah štrukturálnej aktivity

Informácie o dôležitosti určitých zbytkov sa stanovili použitím štandardných postupov a analýz. Uskutočnila sa štandardná mutagénna analýza, napríklad generovaním mnohých odlišných variantov v stanovených polohách, napríklad vo vyššie v texte uvedených polohách a zhodnotením biologických aktivít variantov. To sa môže uskutočniť za účelom dosiahnutia určujúcich polôh, ktoré upravujú aktivitu, alebo je možné sa zamerať na špecifické polohy na stanovenie zbytkov, ktoré môžu substituovať, zachovať, blokovať, alebo môžu modulovať biologickú aktivitu. V inom prípade, analýza prirodzených variantov môže indikovať, v ktorých polohách sa tolerujú prirodzené mutácie. To môže vyplývať z populačnej analýzy kolísania medzi jednotlivcami, alebo medzi kmeňmi alebo druhmi. Analyzovali sa vzorky z vybratých jednotlivcov, napr. analýzou PCR a sekvenovaním. To umožňuje hodnotenie polymorfizmov v populácii.

XII. Izolácia ligandu pre DTLR

DTLR sa môže použiť ako špecifické väzobné činidlo na identifikáciu jeho väzobných partnerov tak, že využije výhodu jeho špecificity väzby. V tomto prípade sa s najväčšou pravdepodobnosťou použijú protilátky. Viazané činidlo je buď označené, ako sa popisuje vyššie v texte, napríklad fluorescenciou, alebo iným možným spôsobom, alebo je imobilizované na substráte.

Na testovanie expresívnej knižnice, vytvorenej z bunkovej línie, ktorá exprimuje väzobného partnera, napríklad ligand, ktorý je s výhodou spojený s membránou, sa používa väzobná kompozícia, ktorú možno taktiež využiť pri detekcii alebo klasifikácii povrchovo exprimovaných ligandov. Testovanie vnútrobunkovej expresie sa uskutočnilo pomocou rôznych farbení alebo imunofluorescenčnými postupmi (MaMahan et ak, (1991) EMBO J. 10: 2821-2832).

Napríklad v deň 0 sa permanoxné sklíčka s dvoma komôrkami potiahnu lml fibronektínu v koncentrácii 10 ng/ml v PBS, počas 30 minút pri izbovej teplote. Prepláchnu sa jedenkrát s PBS. Potom sa do každej komôrky s 1,5 ml rastového média pridá 2 až 3 x 10⁵ buniek. Inkubujú sa cez noc pri teplote 37 °C.

V deň 1 sa pripraví pre každý roztok 0,5 ml roztoku DEAE-dextranu v koncentrácii 66 gg/ml, 66 μΜ chlorochínu a 4 gg DNA v sére bez DME. Pre každú sadu sa pripravila pozitívna kontrola, je to napríklad cDNA DTLRFLAggG riedené 1 a 1/200 a negatívna kontrola. Bunky sa premyli sérom bez DME. Pridal sa roztok DNA a zmes sa inkubovala 5 hodín pri teplote 37 °C. Kultivačné médium sa odstránilo a pridalo sa 0,5 ml 10% DMSO v DME počas 2,5 min.. Roztok sa odstránil a bunky sa jedenkrát premyli DME. Pridalo sa 1,5 ml rastového média a zmes sa inkubovala cez noc.

V deň 2 sa vymenilo kultivačné médium. V deň 3 alebo 4 sa bunky fixovali a farbili. Bunky sa dvakrát premyli tlmivým fyziologickým roztokom podľa

Hanka (HBSS) a fixovali sa v 4% paraformaldehyde (PFA)/glukóza 5 min. Premyli sa 3x HBSS. Sklíčka sa môžu skladovať pri teplote -80 °C po tom, keď sa odstráni všetok roztok. Pre každú komôrku sa uskutočnila nasledujúca inkubácia v objeme 0,5 ml. Pridá sa HBSS/saponín (0,1%) s 32 μΐ/ml IM NaN₃ na 20 minút. Bunky sa potom premyli lx riedeným roztokom HBSS/saponín. K bunkám sa pridal vhodný proteín DTLR alebo komplex DTLR/protilátky a všetko sa inkubovalo 30 minút. Bunky sa dvakrát premyli HBSS/saponín. Ak je to vhodné, pridajú sa prvé protilátky a zmes sa nechá inkubovať 30 minút. Potom sa pridajú druhé protilátky riedené 1/200 a všetko sa inkubuje 30 minút. Druhými protilátkami sú protilátky proti myšiam. Pripraví sa roztok na test ELISA, je to napríklad roztok vektorovej vybranej ABC chrenovej peroxidázy a uskutoční sa preinkubácia počas 30 min. Môže sa napríklad použiť jedna kvapka roztoku A (avidín) a 1 kvapka roztoku B (biotín) do 2,5 ml HBSS/saponín. Bunky sa dvakrát premyjú HBSS/saponínom. Pridá sa roztok ABC HRP a inkubujú sa 30 minút. Bunky sa premyjú dvakrát s HBSS. Druhé premytie sa robí 2 minúty. Potom sa pridá vektorová diamínbenzoová kyselina (DAB) a všetko sa inkubuje 5 až 10 minút. Na 5 ml destilovanej vody sa použijú 2 kvapky tlmivého roztoku plus 4 kvapky DAB plus 2 kvapky H₂O₂. Opatrne sa odstráni roztok z komôrky a sklíčko sa premyje vodou. Ďalej sa sklíčko suší vzduchom niekoľko minút, a potom sa pridá 1 kvapka kryštalického prekrytia a krycie sklíčko. Preparát sa zohreje pri teplote 85 až 90 °C 5 minút.

Potom sa vyhodnocuje pozitívne sfarbenie jednotlivých génov, ktoré sú zodpovedné za väzbu.

V inom prípade činidlá DTLR sa použijú pri afinitnom čistení, alebo pri oddelení buniek, ktoré exprimujú putatívny ligand (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York alebo Ausubel et al., Biology, Green Publishing

Associates, Brooklyn, NY; alebo Ausubel et al., (1987) Current Protocois in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York.

Ďalšou stratégiou na testovanie receptora naviazaného na membráne je panning. Podľa horeuvedeného popisu sa skonštruuje receptorové cDNA. Ligand sa môže imobilizovať a môže sa použiť k imobilizácii expresívnych buniek. Imobilizácia sa môže dosiahnuť použitím vhodných protilátok, ktoré rozoznávajú napríklad sekvenciu FLAG DTLR fuzovanej konštrukcie, alebo použitím protilátok, vytvorených proti prvým protilátkam. Rekurzívne cykly výberu a amplifikácie vedú k dostupnosti vhodných klonov a k eventuálnej izolácii klonov exprimujúcich receptor.

Pomocou cicavčích DTLR sa testuje fágová expresívna knižnica. Vhodné označovacie metódy, čo sú napríklad protilátky proti FLAG, umožňujú špecifické označenie vhodných klonov.

Sekvenčný protokol (2) Informácie o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2367 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..2358 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: mat_peptid (B) Pozícia: 67 ..2358 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:

ATG ACT Met Thr -22

AGC ATC

TTC Phe

CAT TTT GCC ATT

ATC íle

TTC ATG Phe Met

TTA ATA CTT CAG

48

Ser -20

íle

His

Phe

Ala -15

íle

Leu -10

íle Leu

Gin·

ATC

AGA

ATA

CAA

TTA

TCT

GAA

AGT

GAA

TTT

TTA

GTT

GAT

AGG

TCA

96

íle

Arg

íle

Gin

Leu

Ser

Glu

Ser

Glu

Phe

Leu

Val

Asp

Arg

Ser

-5

1

5

10

AAA

AAC

GGT

CTC

ATC

CAC

GTT

CCT

AAA

GAC

CTA

TCC

CAG

AAA

ACA

144

Lys

Asn

Gly

Leu

íle

His

Val

Pro

Lys

Asp

Leu

Ser

Gin

Lys

Thr

15

20

25

ATC

TTA

AAT

ATA

TCG

CAA

AAT

TAT

ATA

TCT

GAG

CTT

TGG

ACT

TCT

GAC

192

íle

Leu

Asn

íle

Ser

Gin

Asn

Tyr

íle

Ser

Glu

Leu

Trp

Thr

Ser

Asp

30

35

40

ATC

TTA

TCA

CTG

TCA

AAA

CTG

AGG

ATT

TTG

ATA

ATT

TCT

CAT

AAT

AGA

240

íle

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

íle

Leu

íle

Ser

His

Asn

Arg

45

50

55

ATC

CAG

TAT

CTT

GAT

ATC

AGT

GTT

TTC

AAA

TTC

AAC

CAG

GAA

TTG

GAA

288

íle

Gin

Tyr

Leu

Asp

íle

Ser

Val

Phe

Lys

Phe

Asn

Gin

Glu

Leu

Glu

60

65

70

TAC

TTG

GAT

TTG

TCC

CAC

AAC

AAG

TTG

GTG

AAG

ATT

TCT

TGC

CAC

CCT

336

Tyr

Leu

Asp

Leu

Ser

His

Asn

Lys

Leu

Val

Lys

íle

Ser

Cys

His

Pro

75

80

85

90

ACT

GTG

AAC

CTC

AAG

CAC

TTG

GAC

CTG

TCA

TTT

AAT

GCA

TTT

GAT

GCC

384

Thr

Val

Asn

Leu

Lys

His

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Ala

Phe

Asp

Ala

95

100

105

CTG

CCT

ATA

TGC

AAA

GAG

TTT

GGC

AAT

ATG

TCT

CAA

CTA

AAA

TTT

CTG

432

Leu

Pro

íle

Cys

Lys

Glu

Phe

Gly

Asn

Met

Ser

Gin

Leu

Lys

Phe

Leu

110

115

120

GGG

TTG

AGC

ACC

ACA

CAC

TTA

GAA

AAA

TCT

AGT

GTG

CTG

CCA

ATT

GCT

480

Gly

Leu

Ser

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ser

Val

Leu

Pro

íle

Ala

125

130

135

CAT

TTG

AAT

ATC

AGC

AAG

GTC

TTG

CTG

GTC

TTA

GGA

GAG

ACT

TAT

GGG

528

His

Leu

Asn

íle

Ser

Lys

Val

Leu

Val

Leu

Gly

Glu

Thr

Tyr

Gly

140

145

150

GAA

AAA

GAA

GAC

CCT

GAG

GGC

CTT

CAA

GAC

TTT

AAC

ACT

GAG

AGT

CTG

576

Glu

Lys

Glu

Asp

Pro

Glu

Gly

Leu

Gin

Asp

Phe

Asn

Thr

Glu

Ser

Leu

155

160

165

170

CAC

ATT

GTG

TTC

CCC

ACA

AAC

AAA

GAA

TTC

CAT

TTT

ATT

TTG

GAT

GTG

624

His

íle

Val

Phe

Pro

Thr

Asn

Lys

Glu

Phe

His

Phe

íle

Leu

Asp

Val

175

180

185

TCA

GTC

AAG

ACT

GTA

GCA

AAT

CTG

GAA

CTA

TCT

AAT

ATC

AAA

TGT

GTG

672

Ser

Val

Lys

Thr

Val

Ala

Asn

Leu

Glu

Leu

Ser

Asn

íle

Lys

Cys

Val

190

195

200

CTA

GAA

GAT

AAC

AAA

TGT

TCT

TAC

TTC

CTA

AGT

ATT

CTG

GCG

AAA

CTT

720

Leu

Glu

Asp

Asn

Lys

Cys

Ser

Tyr

Phe

Leu

Ser

íle

Leu

Ala

Lys

Leu

205 210 215

CAA Gin

ACA AAT Thr Asn 220

CCA Pro

AAG Lys

TTA TCA AGT CTT ACC TTA AAC AAC ATT GAA ACA

768

Leu

Ser 225

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn 230

Asn

íle

Glu

Thr

ACT

TGG

AAT

TCT

TTC

ATT

AGG

ATC

CTC

CAA

CTA

GTT

TGG

CAT

ACA

ACT

816

Thr

Trp

Asn

Ser

Phe

íle

Arg

íle

Leu

Gin

Leu

Val

Trp

His

Thr

235

240

245

250

GTA

TGG

TAT

TTC

TCA

ATT

TCA

AAC

GTG

AAG

CTA

CAG

GGT

CAG

CTG

GAC

864

Val

Trp

Tyr

Phe

Ser

íle

Ser

Asn

Val

Lys

Leu

Gin

Gly

Gin

Leu

Asp

255

260

265

TTC

AGA

GAT

TTT

GAT

TAT

TCT

GGC

ACT

TCC

TTG

AAG

GCC

TTG

TCT

ATA

912

Phe

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Ser

Gly

Thr

Ser

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

íle

270

275

280

CAC

CAA

GTT

GTC

AGC

GAT

GTG

TTC

GGT

TTT

CCG

CAA

AGT

TAT

ATC

TAT

960

His

Gin

Val

Ser

Asp

Val

Phe

Gly

Phe

Pro

Gin

Ser

Tyr

íle

Tyr

285

290

295

GAA

ATC

TTT

TCG

AAT

ATG

AAC

ATC

AAA

AAT

TTC

ACA

GTG

TCT

GGT

ACA

1008

Glu

íle

Phe

Ser

Asn

Met

Asn

íle

Lys

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Gly

Thr

300

305

310

CGC

ATC

GTC

CAC

ATC

CTT

TCC

CCA

TCC

AAA

ATT

AGC

CCG

TTC

CTG

CAT

1056

Arg

Met

Val

His

Met

Leu

Cys

Pro

Ser

Lys

íle

Ser

Pro

Phe

Leu

His

315

320

325

330

TTC

GAT

TTT

TCC

AAT

CTC

TTA

ACA

GAC

ACG

GTT

TTT

GAA

AAT

TGT

1104

Leu

Asp

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr

Asp

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Cys

335

340

345

GGG

CAC

CTT

ACT

GAG

TTG

GAG

ACA

CTT

ATT

TTA

CAA

ATG

AAT

CAA

TTA

1152

Gly

His

Leu

Thr

Glu

Leu

Glu

Thr

Leu

íle

Leu

Gin

Met

Asn

Gin

Leu

350

355

360

AAA

GAA

CTT

TCA

AAA

ATA

GCT

GAA

ATG

ACT

ACA

CAG

ATG

AAG

TCT

CTG

1200

Lys

Glu

Leu

Ser

Lys

íle

Ala

Glu

Met

Thr

Gin

Met

Lys

Ser

Leu

365

370

375

CAA

TTC

GAT

ATT

AGC

CAG

AAT

TCT

GTA

AGC

TAT

GAT

GAA

AAG

AAA

1248

Gin

Leu

Asp

íle

Ser

Gin

Asn

Ser

Val

Ser

Tyr

Asp

Glu

Lys

380

385

390

GGA

GAC

TGT

TCT

TGG

ACT

AAA

AGT

TTA

AGT

TTA

AAT

ATG

TCT

TCA

1296

Gly

Asp

Cys

Ser

Trp

Thr

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Asn

Met

Ser

395

400

405

410

AAT

ATA

CTT

ACT

GAC

ACT

ATT

TTC

AGA

TGT

TTA

CCT

CCC

AGG

ATC

AAG

1344

Asn

íle

Leu

Thr

Asp

Thr

íle

Phe

Arg

Cys

Leu

Pro

Arg

íle

Lys

415

420

425

GTA

CTT

GAT

CTT

CAC

AGC

AAT

AAA

ATA

AAG

AGC

ATT

CCT

AAA

CAA

GTC

1392

Val

Leu

Asp

Leu

His

Ser

Asn

Lys

íle

Lys

Ser

íle

Pro

Lys

Gin

Val

430

435

440

GTA

AAA

CTG

GAA

GCT

TTG

CAA

GAA

CTC

AAT

GTT

GCT

TTC

AAT

TCT

TTA

1440

Val

Lys

Leu

Glu

Ala

Leu

Gin

Glu

Leu

Asn

Val

Ala

Phe

Asn

Ser

Leu

445 450 455

1488

ACT

GAC

CTT

CCT

GGA

TGT

GGC

AGC

TTT

AGC

CTT

TCT

GTA

TTG

ATC

Thr

Asp 460

Leu

Pro

Gly

Cys

Gly 465

Ser

Phe

Ser

Leu 470

Ser

Val

Leu

íle

ATT

GAT

CAC

AAT

TCA

GTT

TCC

CAC

CCA

TCA

GCT

GAT

TTC

CAG

AGC

Íle 475

Asp

His

Asn

Ser

Val 480

Ser

His

Pro

Ser

Ala 485

Asp

Phe

Gin

Ser 490

TGC

CAG

AAG

ATG

AGG

TCA

ATA

AAA

GCA

GGG

GAC

AAT

CCA

TTC

CAA

TGT

Cys

Gin

Lys

Met

Arg 495

Ser

íle

Lys

Ala

Gly 500

Asp

Asn

Pro

Phe

Gin 505

Cys

ACC

TGT

GAG

CTC

GGA

GAA

TTT

GTC

AAA

AAT

ATA

GAC

CAA

GTA

TCA

AGT

Thr

Cys

Glu

Leu 510

Gly

Glu

Phe

Val

Lys 515

Asn

íle

Asp

Gin

Val 520

Ser

GAA

GTG

TTA

GAG

GGC

TGG

CCT

GAT

TCT

TAT

AAG

TGT

GAC

TAC

CCG

GAA

Glu

Val

Leu 525

Glu

Gly

Trp

Pro

Asp 530

Ser

Tyr

Lys

Cys

Asp 535

Tyr

Pro

Glu

AGT

TAT

AGA

GGA

ACC

CTA

AAG

GAC

TTT

CAC

ATG

TCT

GAA

TTA

TCC

Ser

Tyr 540

Arg

Gly

Thr

Leu

Leu 545

Lys

Asp

Phe

His

Met 550

Ser

Glu

Leu

Ser

TGC

AAC

ATA

ACT

CTG

ATC

GTC

ACC

ATC

GTT

GCC

ACC

ATG

CTG

GTG

Cys 555

Asn

íle

Thr

Leu

Leu 560

íle

Val

Thr

íle

Val 565

Ala

Thr

Met

Leu

Val 570

TTG

GCT

GTG

ACT

GTG

ACC

TCC

CTC

TGC

ATC

TAC

TTG

GAT

CTG

CCC

TGG

Leu

Ala

Val

Thr

Val 575

Thr

Ser

Leu

Cys

íle 580

Tyr

Leu

Asp

Leu

Pro 585

Trp

TAT

CTC

AGG

ATG

GTG

TGC

CAG

TGG

ACC

CAG

ACC

CGG

CGC

AGG

GCC

AGG

Tyr

Leu

Arg

Met 590

Val

Cys

Gin

Trp

Thr 595

Gin

Thr

Arg

Arg 600

Ala

Arg

AAC

ATA

CCC

TTA

GAA

CTC

CAA

AGA

AAT

CTC

CAG

TTT

CAT

GCA

TTT

Asn

íle

Pro 605

Leu

Glu

Leu

Gin 610

Arg

Asn

Leu

Gin

Phe 615

His

Ala

Phe

ATT

TCA

TAT

AGT

GGG

CAC

GAT

TCT

TTC

TGG

GTG

AAG

AAT

GAA

TTA

TTG

íle

Ser 620

Tyr

Ser

Gly

His

Asp 625

Ser

Phe

Trp

Val

Lys 630

Asn

Glu

Leu

CCA

AAC

CTA

GAG

AAA

GAA

GGT

ATG

CAG

ATT

TGC

CTT

CAT

GAG

AGA

AAC

Pro 635

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu 640

Gly

Met

Gin

íle

Cys 645

Leu

His

Glu

Arg

Asn 650

TTT

GTT

CCT

GGC

AAG

AGC

ATT

GTG

GAA

AAT

ATC

ACC

TGC

ATT

GAG

Phe

Val

Pro

Gly

Lys 655

Ser

íle

Val

Glu

Asn 660

íle

Thr

Cys

íle 665

Glu

AAG

AGT

TAC

AAG

TCC

ATC

TTT

GTT

TTG

TCT

CCC

AAC

TTT

GTC

CAG

AGT

Lys

Ser

Tyr

Lys 670

Ser

íle

Phe

Val

Leu 675

Ser

Pro

Asn

Phe

Val 680

Gin

Ser

GAA

TGG

TGC

CAT

TAT

GAA

CTC

TAC

TTT

GCC

CAT

CAC

AAT

CTC

TTT

CAT

Glu

Trp

Cys 685

His

Tyr

Glu

Leu

Tyr 690

Phe

Ala

His

Asn 695

Leu

Phe

His

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968

2016

2064

2112

2160

2208

GAA

GGA

TCT

AAT

AGC

TTA

ATC

CTG

ATC

TTG

CTG

GAA

CCC

ATT

CCG

CAG

Glu

Gly 700

Ser

Asn

Ser

Leu

íle 705

Leu

íle

Leu

Glu 710

Pro

íle

Pro

Gin

TAC

TCC

ATT

CCT

AGC

AGT

TAT

CAC

AAG

CTC

AAA

AGT

CTC

ATG

GCC

AGG

Tyr 715

Ser

íle

Pro

Ser

Ser 720

Tyr

His

Lys

Leu

Lys 725

Ser

Leu

Met

Ala

Arg 730

AGG

ACT

TAT

TTG

GAA

TGG

CCC

AAG

GAA

AAG

AGC

AAA

CGT

GGC

CTT

TTT

Arg

Thr

Tyr

Leu

Glu 735

Trp

Pro

Lys

Glu

Lys 740

Ser

Lys

Arg

Gly

Leu 745

Phe

TGG

GCT

AAC

TTA

AGG

GCA

GCC

ATT

AAT

ATT

AAG

CTG

ACA

GAG

CAA

GCA

Trp

Ala

Asn

Leu 750

Arg

Ala

íle

Asn 755

íle

Lys

Leu

Thr

Glu 760

Gin

Ala

2256

2304

2352

AAG AAA TAGTCTAGA Lys Lys

2367 (1) Informácie k SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 786 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKÚL Y: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 2

Met -22

Thr

Ser -20

íle

Phe

His

Phe

Ala -15

íle

Phe

Met

Leu -10

íle

Leu

Gin

íle

Arg -5

íle

Gin

Leu

Ser

Glu 1

Glu

Ser

Glu

Phe 5

Leu

Val

Asp

Arg

Ser 10

Lys

Asn

Gly

Leu

íle 15

His

Val

Pro

Lys

Asp 20

Leu

Ser

Gin

Lys

Thr 25

Thr

íle

Leu

Asn

íle 30

Ser

Gin

Asn

Tyr

íle 35

Ser

Glu

Leu

Trp

Thr 40

Ser

Asp

íle

Leu

Ser 45

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg 50

íle

Leu

íle

Ser 55

His

Asn

Arg

íle

Gin 60

Tyr

Leu

Asp

íle

Ser 65

Val

Phe

Lys

Phe

Asn 70

Gin

Glu

Leu

Glu

Tyr 75

Leu

Asp

Leu

Ser

His 80

Asn

Lys

Leu

Val

Lys 85

íle

Ser

Cys

His

Pro 90

Thr

Val

Asn

Leu

Lys 95

His

Leu

Asp

Leu

Ser 100

Phe

Asn

Ala

Phe

Asp 105

Ala

Leu

Pro

íle

Cys 110

Lys

Glu

Phe

Gly

Asn 115

Met

Ser

Gin

Leu

Lys 120

Phe

Leu

Gly

Leu

Ser 125

Thr

His

Leu

Glu 130

Lys

Ser

Val

Leu 135

Pro

íle

Ala

His

Leu 140

Asn

íle Ser

Lys

Val 145

Leu

Leu Val

Leu

Gly 150

Glu

Thr

Tyr

Gly

Glu

Lys

Glu

Asp

Pro

Glu

Gly

Leu

Gin

Asp

Phe

Asn

Thr

Glu

Ser

Leu

155

160

165

170

His

íle

Val

Phe

Pro

Thr

Asn

Lys

Glu

Phe

His

Phe

íle

Leu

Asp

Val

175

180

185

Ser

Val

Lys

Thr

Val

Ala

Asn

Leu

Glu

Leu

Ser

Asn

íle

Lys

Cys

Val

190

195

200

Leu

Glu

Asp

Asn

Lys

Cys

Ser

Tyr

Phe

Leu

Ser

íle

Leu

Ala

Lys

Leu

205

210

215

Gin

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn

íle

Glu

Thr

220

225

230

Thr

Trp

Asn

Ser

Phe

íle

Arg

íle

Leu

Gin

Leu

Val

Trp

His

Thr

235

240

245

250

Val

Trp

Tyr

Phe

Ser

íle

Ser

Asn

Val

Lys

Leu

Gin

Gly

Gin

Leu

Asp

255

260

265

Phe

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Ser

Gly

Thr

Ser

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

íle

270

275

280

His

Gin

Val

Ser

Asp

Val

Phe

Gly

Phe

Pro

Gin

Ser

Tyr

íle

Tyr

285

290

295

Glu

íle

Phe

Ser

Asn

Met

Asn

íle

Lys

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Gly

Thr

300

305

310

Arg

Met

Val

His

Met

Leu

Cys

Pro

Ser

Lys

íle

Ser

Pro

Phe

Leu

His

315

320

325

330

Leu

Asp

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr

Asp

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Cys

335

340

345

Gly

His

Leu

Thr

Glu

Leu

Glu

Thr

Leu

íle

Leu

Gin

Met

Asn

Gin

Leu

350

355

360

Lys

Glu

Leu

Ser

Lys

íle

Ala

Glu

Met

Thr

Gin

Met

Lys

Ser

Leu

365

370

375

Gin

Leu

Asp

íle

Ser

Gin

Asn

Ser

Val

Ser

Tyr

Asp

Glu

Lys

380

385

390

Gly

Asp

Cys

Ser

Trp

Thr

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Asn

Met

Ser

395

400

405

410

Asn

íle

Leu

Thr

Asp

Thr

íle

Phe

Arg

Cys

Leu

Pro

Arg

íle

Lys

415

420

425

Val

Leu

Asp

Leu

His

Ser

Asn

Lys

íle

Lys

Ser

íle

Pro

Lys

Gin

Val

430

435

440

Val Lys Leu Glu Ala Leu Gin Glu Leu Asn Val Ala Phe Asn Ser Leu 445 450 455

Thr

Asp

Leu

Pro

Gly

Cys

Gly

Ser

Phe

Ser

Leu

Ser

Val

Leu

íle

460

465

470

íle

Asp

His

Asn

Ser

Val

Ser

His

Pro

Ser

Ala

Asp

Phe

Gin

Ser

475

480

485

490

Cys

Gin

Lys

Met

Arg

Ser

íle

Lys

Ala

Gly

Asp

Asn

Pro

Phe

Gin

Cys

495

500

505

Thr

Cys

Glu

Leu

Gly

Glu

Phe

Val

Lys

Asn

íle

Asp

Gin

Val

Ser

Ser.

510

515

520

Glu

Val

Leu

Glu

Gly

Trp

Pro

Asp

Ser

Tyr

Lys

Cys

Asp

Tyr

Pro

Glu

525

530

535

Ser

Tyr

Arg

Gly

Thr

Leu

Lys

Asp

Phe

His

Met

Ser

Glu

Leu

Ser

540

545

550

Cys

Asn

íle

Thr

Leu

íle

Val

Thr

íle

Val

Ala

Thr

Met

Leu

Val

555

560

565

570

Leu

Ala

Val

Thr

Val

Thr

Ser

Leu

Cys

íle

Tyr

Leu

Asp

Leu

Pro

Trp

575

580

585

Tyr

Leu

Arg

Met

Val

Cys

Gin

Trp

Thr

Gin

Thr

Arg

Ala

Arg

590

595

600

Asn

íle

Pro

Leu

Glu

Leu

Gin

Arg

Asn

Leu

Gin

Phe

His

Ala

Phe

605

610

615

íle

Ser

Tyr

Ser

Gly

His

Asp

Ser

Phe

Trp

Val

Lys

Asn

Glu

Leu

620

625

630

Pro

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu

Gly

Met

Gin

íle

Cys

Leu

His

Glu

Arg

Asn

635

640

645

650

Phe

Val

Pro

Gly

Lys

Ser

íle

Val

Glu

Asn

íle

Thr

Cys

íle

Glu

655

660

665

Lys

Ser

Tyr

Lys

Ser

íle

Phe

Val

Leu

Ser

Pro

Asn

Phe

Val

Gin

Ser

670

675

680

Glu

Trp

Cys

His

Tyr

Glu

Leu

Tyr

Phe

Ala

His

Asn

Leu

Phe

His

685

690

695

Glu

Gly

Ser

Asn

Ser

Leu

íle

Leu

íle

Leu

Glu

Pro

íle

Pro

Gin

700

705

710

Tyr

Ser

íle

Pro

Ser

Tyr

His

Lys

Leu

Lys

Ser

Leu

Met

Ala

Arg

715

720

725

730

Arg

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Pro

Lys

Glu

Lys

Ser

Lys

Arg

Gly

Leu

Phe

735

740

745

Trp

Ala

Asn

Leu

Arg

Ala

íle

Asn

íle

Lys

Leu

Thr

Glu

Gin

Ala

750

755

760

Lys Lys (2) Informácie o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2355 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..2352 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: mat_peptid (B) Pozícia: 67 ..2352 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3:

ATG

CCA

CAT

ACT

TTG

TGG

ATG

GTG

TGG

GTC

TTG

GGG

GTC

ATC

AGC

Met -22

Pro

His -20

Thr

Leu

Trp

Met

Val -15

Trp

Val

Leu

Gly

Val -10

íle

Ser

CTC

TCC

AAG

GAA

TCC

AAT

CAG

GCT

TCT

CTG

TCT

TGT

GAC

CGC

Leu

Ser -5

Lys

Glu

Ser

Ser 1

Asn

Gin

Ala

Ser 5

Leu

Ser

Cys

Asp

Arg 10

AAT

GGT

ATC

TGC

AAG

GGC

AGC

TCA

GGA

TCT

TTA

AAC

TCC

ATT

CCC

TCA

Asn

Gly

íle

Cys

Lys 15

Gly

Ser

Gly

Ser 20

Leu

Asn

Ser

íle

Pro 25

Ser

GGG

CTC

ACA

GAA

GCT

GTA

AAA

AGC

CTT

GAC

CTG

TCC

AAC

AGG

ATC

Gly

Leu

Thr

Glu 30

Ala

Val

Lys

Ser

Leu 35

Asp

Leu

Ser

Asn

Asn 40

Arg

íle

ACC

TAC

ATT

AGC

AAC

AGT

GAC

CTA

CAG

AGG

TGT

GTG

AAC

CTC

CAG

GCT

Thr

Tyr

íle 45

Ser

Asn

Ser

Asp

Leu 50

Gin

Arg

Cys

Val

Asn 55

Leu

Gin

Ala

CTG

GTG

CTG

ACA

TCC

AAT

GGA

ATT

AAC

ACA

ATA

GAG

GAA

GAT

TCT

TTT

Leu

Val 60

Leu

Thr

Ser

Asn

Gly 65

íle

Asn

Thr

Íle

Glu 70

Glu

Asp

Ser

Phe

TCT

TCC

CTG

GGC

AGT

CTT

GAA

CAT

TTA

GAC

TTA

TCC

TAT

AAT

TAC

TTA

Ser 75

Ser

Leu

Gly

Ser

Leu 80

Glu

His

Leu

Asp

Leu 85

Ser

Tyr

Asn

Tyr

Leu 90

TCT

AAT

TTA

TCG

TCT

TCC

TGG

TTC

AAG

CCC

CTT

TCT

TTA

ACA

TTC

Ser

Asn

Leu

Ser

Ser 95

Ser

Trp

Phe

Lys

Pro 100

Leu

Ser

Leu

Thr 105

Phe

TTA

AAC

TTA

CTG

GGA

AAT

CCT

TAC

AAA

ACC

CTA

GGG

GAA

ACA

TCT

CTT

Leu

Asn

Leu

Leu 110

Gly

Asn

Pro

Tyr

Lys 115

Thr

Leu

Gly

Glu

Thr 120

Ser

Leu

TTT

TCT

CAT

CTC

ACA

AAA

TTG

CAA

ATC

CTG

AGA

GTG

GGA

AAT

ATG

GAC

Phe

Ser

His

Leu

Thr

Lys

Leu

Gin

íle

Leu

Arg

Val

Gly

Asn

Met

Asp

125 130 135

144

192

240

288

336

384

432

480

ACC TTC ACT AAG ATT CAA AGA AAA GAT TTT GCT GGA CTT ACC TTC CTT 528

Thr Phe Thr Lys íle Gin Arg Lys Asp Phe Ala Gly Leu Thr Phe Leu

140 145 150

GAG GAA CTT GAG ATT GAT GCT TCA GAT CTA CAG AGC TAT GAG CCA AAA 576

Glu Glu Leu Glu íle Asp Ala Ser Asp Leu Gin Ser Tyr Glu Pro Lys

155 160 165 170

AGT TTG AAG TCA ATT CAG AAC GTA AGT CAT CTG ATC CTT CAT ATG AAG 624

Ser Leu Lys Ser íle Gin Asn Val Ser His Leu íle Leu His Met Lys

175 180 185

CAG CAT ATT TTA CTG CTG GAG ATT TTT GTA GAT GTT ACA AGT TCC GTG 672

Gin His íle Leu Leu Leu Glu íle Phe Val Asp Val Thr Ser Ser Val

190 195 200

GAA TGT TTG GAA CTG CGA GAT ACT GAT TTG GAC ACT TTC CAT TTT TCA 720

Glu Cys Leu Glu Leu Arg Asp Thr Asp Leu Asp Thr Phe His Phe Ser

205 210 215

GAA CTA TCC ACT GGT GAA ACA AAT TCA TTG ATT AAA AAG TTT ACA TTT 768

Glu Leu Ser Thr Gly Glu Thr Asn Ser Leu íle Lys Lys Phe Thr Phe

220 225 230

AGA AAT GTG AAA ATC ACC GAT GAA AGT TTG TTT CAG GTT ATG AAA CTT 816

Arg Asn Val Lys íle Thr Asp Glu Ser Leu Phe Gin Val Met Lys Leu

235 240 245 250

TTG AAT CAG ATT TCT GGA TTG TTA GAA TTA GAG TTT GAT GAC TGT ACC 864

Leu Asn Gin íle Ser Gly Leu Leu Glu Leu Glu Phe Asp Asp Cys Thr

255 260 265

CTT AAT GGA GTT GGT AAT TTT AGA GCA TCT GAT AAT GAC AGA GTT ATA 912

Leu Asn Gly Val Gly Asn Phe Arg Ala Ser Asp Asn Asp Arg Val íle

270 275 280

GAT CCA GGT AAA GTG GAA ACG TTA ACA ATC CGG AGG CTG CAT ATT CCA 960

Asp Pro Gly Lys Val Glu Thr Leu Thr íle Arg Arg Leu His íle Pro

285 290 295

AGG TTT TAC TTA TTT TAT GAT CTG AGC ACT TTA TAT TCA CTT ACA GAA 1008

Arg Phe Tyr Leu Phe Tyr Asp Leu Ser Thr Leu Tyr Ser Leu Thr Glu

300 305 310

AGA GTT AAA AGA ATC ACA GTA GAA AAC AGT AAA GTT TTT CTG GTT CCT 1056

Arg Val Lys Arg íle Thr Val Glu Asn Ser Lys Val Phe Leu Val Pro

315 320 325 330

TGT TTA CTT TCA CAA CAT TTA AAA TCA TTA GAA TAC TTG GAT CTC AGT 1104

Cys Leu Leu Ser Gin His Leu Lys Ser Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Ser

335 340 345

GAA AAT TTG ATG GTT GAA GAA TAC TTG AAA AAT TCA GCC TGT GAG GAT 1152

Glu Asn Leu Met Val Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Ser Ala Cys Glu Asp

350 355 360

GCC TGG CCC TCT CTA CAA ACT TTA ATT TTA AGG CAA AAT CAT TTG GCA 1200

Ala Trp Pro Ser Leu Gin Thr Leu íle Leu Arg Gin Asn His Leu Ala

365 370 375

TCA TTG GAA AAA ACC GGA GAG ACT TTG CTC ACT CTG AAA AAC TTG ACT 1248

1296

Ser

Leu 380

Glu

Lys

Thr

Gly

Glu 385

Thr

Leu

Thr

Leu 390

Lys

Asn

Leu

Thr

AAC

ATT

GAT

ATC

AGT

AAG

AAT

AGT

TTT

CAT

TCT

ATG

CCT

GAA

ACT

TGT

Asn 395

Íle

Asp

íle

Ser

Lys 400

Asn

Ser

Phe

His

Ser 405

Met

Pro

Glu

Thr

Cys 410

CAG

TGG

CCA

GAA

AAG

ATG

AAA

TAT

TTG

AAC

TTA

TCC

AGC

ACA

CGA

ATA

Gin

Trp

Pro

Glu

Lys 415

Met

Lys

Tyr

Leu

Asn 420

Leu

Ser

Thr

Arg 425

íle

CAC

AGT

GTA

ACA

GGC

TGC

ATT

CCC

AAG

ACA

CTG

GAA

ATT

TTA

GAT

GTT

His

Ser

Val

Thr 430

Gly

Cys

íle

Pro

Lys 435

Thr

Leu

Glu

íle

Leu 440

Asp

Val

AGC

AAC

AAT

CTC

AAT

TTA

TTT

TCT

TTG

AAT

TTG

CCG

CAA

CTC

AAA

Ser

Asn

Asn 445

Asn

Leu

Asn

Leu

Phe 450

Ser

Leu

Asn

Leu

Pro 455

Gin

Leu

Lys

GAA

CTT

TAT

ATT

TCC

AGA

AAT

AAG

TTG

ATG

ACT

CTA

CCA

GAT

GCC

TCC

Glu

Leu 460

Tyr

íle

Ser

Arg

Asn 465

Lys

Leu

Met

Thr

Leu 470

Pro

Asp

Ala

Ser

CTC

TTA

CCC

ATG

TTA

CTA

GTA

TTG

AAA

ATC

AGT

AGG

AAT

GCA

ATA

ACT

Leu 475

Leu

Pro

Met

Leu

Leu 480

Val

Leu

Lys

íle

Ser 485

Arg

Asn

Ala

íle

Thr 490

ACG

TTT

TCT

AAG

GAG

CAA

CTT

GAC

TCA

TTT

CAC

ACA

CTG

AAG

ACT

TTG

Thr

Phe

Ser

Lys

Glu 495

Gin

Leu

Asp

Ser

Phe 500

His

Thr

Leu

Lys

Thr 505

Leu

GAA

GCT

GGT

GGC

AAT

AAC

TTC

ATT

TGC

TCC

TGT

GAA

TTC

CTC

TCC

TTC

Glu

Ala

Gly

Gly 510

Asn

Phe

íle

Cys 515

Ser

Cys

Glu

Phe

Leu 520

Ser

Phe

ACT

CAG

GAG

CAG

CAA

GCA

CTG

GCC

AAA

GTC

TTG

ATT

GAT

TGG

CCA

GCA

Thr

Gin

Glu 525

Gin

Ala

Leu

Ala 530

Lys

Val

Leu

íle

Asp 535

Trp

Pro

Ala

AAT

TAC

CTG

TGT

GAC

TCT

CCA

TCC

CAT

GTG

CGT

GGC

CAG

GTT

CAG

Asn

Tyr 540

Leu

Cys

Asp

Ser

Pro 545

Ser

His

Val

Arg

Gly 550

Gin

Val

Gin

GAT

GTC

CGC

CTC

TCG

GTG

TCG

GAA

TGT

CAC

AGG

ACA

GCA

CTG

GTG

TCT

Asp 555

Val

Arg

Leu

Ser

Val 560

Ser

Glu

Cys

His

Arg 565

Thr

Ala

Leu

Val

Ser 570

GGC

ATG

TGC

TGT

GCT

CTG

TTC

CTG

ATC

CTG

CTC

ACG

GGG

GTC

CTG

Gly

Met

Cys

Ala 575

Leu

Phe

Leu

íle 580

Leu

Thr

Gly

Val 585

Leu

TGC

CAC

CGT

TTC

CAT

GGC

CTG

TGG

TAT

ATG

AAA

ATG

TGG

GCC

TGG

Cys

His

Arg

Phe 590

His

Gly

Leu

Trp

Tyr 595

Met

Lys

Met

Trp 600

Ala

Trp

CTC

CAG

GCC

AAA

AGG

AAG

CCC

AGG

AAA

GCT

CCC

AGC

AGG

AAC

ATC

TGC

Leu

Gin

Ala 605

Lys

Arg

Lys

Pro

Arg 610

Lys

Ala

Pro

Ser

Arg 615

Asn

íle

Cys

TAT

GAT

GCA

TTT

GTT

TCT

TAC

AGT

GAG

CGG

GAT

GCC

TAC

TGG

GTG

GAG

Tyr

Asp

Ala

Phe

Val

Ser

Tyr

Ser

Glu

Arg

Asp

Ala

Tyr

Trp

Val

Glu

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968

100

2016

620 62S 630

AAC

CTT

ATG

GTC

CAG

GAG

CTG

GAG

AAC

TTC

AAT

CCC

TTC

AAG

TTG

Asn 635

Leu

Met

Val

Gin

Glu 640

Leu

Glu

Asn

Phe

Asn 645

Pro

Phe

Lys

Leu 650

TGT

CTT

CAT

AAG

CGG

GAC

TTC

ATT

CCT

GGC

AAG

TGG

ATC

ATT

GAC

AAT

Cys

Leu

His

Lys

Arg 655

Asp

Phe

íle

Pro

Gly 660

Lys

Trp

íle

Asp 665

Asn

ATC

ATT

GAC

TCC

ATT

GAA

AAG

AGC

CAC

AAA

ACT

GTC

TTT

GTG

CTT

TCT

íle

Asp

Ser 670

íle

Glu

Lys

Ser

His 675

Lys

Thr

Val

Phe

Val 680

Leu

Ser

GAA

AAC

TTT

GTG

AAG

AGT

GAG

TGG

TGC

AAG

TAT

GAA

CTG

GAC

TTC

TCC

Glu

Asn

Phe 685

Val

Lys

Ser

Glu

Trp 690

Cys

Lys

Tyr

Glu

Leu 695

Asp

Phe

Ser

CAT

TTC

CGT

CTT

TTT

GAA

GAG

AAC

AAT

GAT

GCT

GCC

ATT

CTC

ATT

CTT

His

Phe 700

Arg

Leu

Phe

Glu

Glu 705

Asn

Asp

Ala

Ala 710

íle

Leu

íle

Leu

CTG

GAG

CCC

ATT

GAG

AAA

GCC

ATT

CCC

CAG

CGC

TTC

TGC

AAG

CTG

Leu 715

Glu

Pro

íle

Glu

Lys 720

Lys

Ala

íle

Pro

Gin 725

Arg

Phe

Cys

Lys

Leu 730

CGG

AAG

ATA

ATG

AAC

ACC

AAG

ACC

TAC

CTG

GAG

TGG

CCC

ATG

GAC

GAG

Arg

Lys

íle

Met

Asn 735

Thr

Lys

Thr

Tyr

Leu 740

Glu

Trp

Pro

Met

Asp 745

Glu

GCT

CAG

CGG

GAA

GGA

TTT

TGG

GTA

AAT

CTG

AGA

GCT

GCG

ATA

AAG

TCC

Ala

Gin

Arg

Glu 750

Gly

Phe

Trp

Val

Asn 755

Leu

Arg

Ala

íle 760

Lys

Ser

2064

2112

2160

2208

2256

2304

2352

TAG (2) Informácie k SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 784 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 4

2355

Met -22

Pro

His -20

Thr

Leu

Trp

Met

Val -15

Trp

Val

Leu

Gly

Val -10

íle

Ser

Leu

Ser -5

Lys

Glu

Ser

Ser 1

Asn

Gin

Ala

Ser 5

Leu

Ser

Cys

Asp

Arg 10

Asn

Gly

íle

Cys

Lys 15

Gly

Ser

Gly

Ser 20

Leu

Asn

Ser

íle

Pro 25

Ser

Gly

Leu

Thr

Glu 30

Ala

Val

Lys

Ser

Leu 35

Asp

Leu

Ser

Asn

Asn 40

Arg

íle

Thr

Tyr

íle

Ser

Asn

Ser

Asp

Leu

Gin

Arg

Cys

Val

Asn

Leu

Gin

Ala

101

45

50

55

Leu

Val

Leu

Thr

Ser

Asn

Gly

íle

Asn

Thr

íle

Glu

Asp

Ser

Phe

60

65

70

Ser

Leu

Gly

Ser

Leu

Glu

His

Leu

Asp

Leu

Ser

Tyr

Asn

Tyr

Leu

75

80

85

90

Ser

Asn

Leu

Ser

Trp

Phe

Lys

Pro

Leu

Ser

Leu

Thr

Phe

95

100

105

Leu

Asn

Leu

Gly

Asn

Pro

Tyr

Lys

Thr

Leu

Gly

Glu

Thr

Ser

Leu

110

115

120

Phe

Ser

His

Leu

Thr

Lys

Leu

Gin

íle

Leu

Arg

Val

Gly

Asn

Met

Asp

125

130

135

Thr

Phe

Thr

Lys

íle

Gin

Arg

Lys

Asp

Phe

Ala

Gly

Leu

Thr

Phe

Leu

140

145

150

Glu

Leu

Glu

íle

Asp

Ala

Ser

Asp

Leu

Gin

Ser

Tyr

Glu

Pro

Lys

155

160

165

170

Ser

Leu

Lys

Ser

íle

Gin

Asn

Val

Ser

His

Leu

íle

Leu

His

Met

Lys

175

180

185

Gin

His

íle

Leu

Glu

íle

Phe

Val

Asp

Val

Thr

Ser

Val

190

195

200

Glu

Cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Asp

Leu

Asp

Thr

Phe

His

Phe

Ser

205

210

215

Glu

Leu

Ser

Thr

Gly

Glu

Thr

Asn

Ser

Leu

íle

Lys

Phe

Thr

Phe

220

225

230

Arg

Asn

Val

Lys

íle

Thr

Asp

Glu

Ser

Leu

Phe

Gin

Val

Met

Lys

Leu

235

240

245

250

Leu

Asn

Gin

íle

Ser

Gly

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Asp

Cys

Thr

255

260

265

Leu

Asn

Gly

Val

Gly

Asn

Phe

Arg

Ala

Ser

Asp

Asn

Asp

Arg

Val

íle

270

275

280

Asp

Pro

Gly

Lys

Val

Glu

Thr

Leu

Thr

íle

Arg

Leu

His

íle

Pro

285

290

295

Arg

Phe

Tyr

Leu

Phe

Tyr

Asp

Leu

Ser

Thr

Leu

Tyr

Ser

Leu

Thr

Glu

300

305

310

Arg

Val

Lys

Arg

íle

Thr

Val

Glu

Asn

Ser

Lys

Val

Phe

Leu

Val

Pro

315

320

325

330

Cys

Leu

Ser

Gin

His

Leu

Lys

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asp

Leu

Ser

335

340

345

Glu

Asn

Leu

Met

Val

Glu

Tyr

Leu

Lys

Asn

Ser

Ala

Cys

Glu

Asp

350

355

360

Ala Trp Pro Ser Leu Gin Thr Leu íle Leu Arg Gin Asn His Leu Ala 365 370 375

102

Ser

Leu 380

Glu

Lys

Thr

Gly

Glu 385

Thr

Leu

Thr

Leu 390

Lys

Asn

Leu

Thr

Asn 395

íle

Asp

íle

Ser

Lys 400

Asn

Ser

Phe

His

Ser 405

Met

Pro

Glu

Thr

Cys 410

Gin

Trp

Pro

Glu

Lys 415

Met

Lys

Tyr

Leu

Asn 420

Leu

Ser

Thr

Arg 425

íle

His

Ser

Val

Thr 430

Gly

Cys

íle

Pro

Lys 435

Thr

Leu

Glu

íle

Leu 440

Asp

Val

Ser

Asn

Asn 445

Asn

Leu

Asn

Leu

Phe 450

Ser

Leu

Asn

Leu

Pro 455

Gin

Leu

Lys

Glu

Leu 460

Tyr

íle

Ser

Arg

Asn 465

Lys

Leu

Met

Thr

Leu 470

Pro

Asp

Ala

Ser

Leu 475

Leu

Pro

Met

Leu

Leu 480

Val

Leu

Lys

íle

Ser 485

Arg

Asn

Ala

íle

Thr 490

Thr

Phe

Ser

Lys

Glu 495

Gin

Leu

Asp

Ser

Phe 500

His

Thr

Leu

Lys

Thr 505

Leu

Glu

Ala

Gly

Gly 510

Asn

Phe

íle

Cys 515

Ser

Cys

Glu

Phe

Leu 520

Ser

Phe

Thr

Gin

Glu 525

Gin

Ala

Leu

Ala 530

Lys

Val

Leu

íle

Asp 535

Trp

Pro

Ala

Asn

Tyr 540

Leu

Cys

Asp

Ser

Pro 545

Ser

His

Val

Arg

Gly 550

Gin

Val

Gin

Asp 555

Val

Arg

Leu

Ser

Val 560

Ser

Glu

Cys

His

Arg 565

Thr

Ala

Leu

Val

Ser 570

Gly

Met

Cys

Ala 575

Leu

Phe

Leu

íle 580

Leu

Thr

Gly

Val 585

Leu

Cys

His

Arg

Phe

His

Gly

Leu

Trp

Tyr

Met

Lys

Met

Trp

Ala

Trp

590 595 600

Leu

Gin

Ala 605

Lys

Arg

Lys

Pro

Arg 610

Lys

Ala

Pro

Ser

Arg 615

Asn

íle

Cys

Tyr

Asp 620

Ala

Phe

Val

Ser

Tyr 625

Ser

Glu

Arg

Asp

Ala 630

Tyr

Trp

Val

Glu

Asn 635

Leu

Met

Val

Gin

Glu 640

Leu

Glu

Asn

Phe

Asn 645

Pro

Phe

Lys

Leu 650

Cys

Leu

His

Lys

Arg 655

Asp

Phe

íle

Pro

Gly 660

Lys

Trp

íle

Asp 665

Asn

íle

Asp

Ser 670

íle

Glu

Lys

Ser

His 675

Lys

Thr

Val

Phe

Val 680

Leu

Ser

Glu

Asn

Phe 685

Val

Lys

Ser

Glu

Trp 690

Cys

Lys

Tyr

Glu

Leu 695

Asp

Phe

Ser

103

His

Phe 700

Arg

Leu

Phe

Glu

Glu 705

Asn

Asp

Ala

Ala 710

íle

Leu

íle

Leu

Leu 715

Glu

Pro

íle

Glu

Lys 720

Lys

Ala

íle

Pro

Gin 725

Arg

Phe

Cys

Lys

Leu 730

Arg

Lys

íle

Met

Asn 735

Thr

Lys

Thr

Tyr

Leu 740

Glu

Trp

Pro

Met

Asp 745

Glu

Ala

Gin

Arg

Glu 750

Gly

Phe

Trp

Val

Asn 755

Leu

Arg

Ala

íle 760

Lys

Ser

2) Informácie o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2715 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..2712 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: mat_peptid (B) Pozícia: 64 ..2712 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 5:

ATG AGA

CAG Gin

ACT Thr

TTG CCT

TGT ATC TAC TTT TGG GGG GGC CTT TTG CCC

48

Met -21

Arg -20

Leu

Pro

Cys -15

íle

Tyr

Phe

Trp Gly -10

Gly

Leu

Pro

TTT

GGG

ATG

CTG

TGT

GCA

TCC

ACC

AAG

TGC

ACT

GTT

AGC

CAT

96

Phe

Gly

Met

Leu

Cys

Ala

Ser

Thr

Lys

Cys

Thr

Val

Ser

His

-5

1

5

10

GAA

GTT

GCT

GAC

TGC

AGC

CAC

CTG

AAG

TTG

ACT

CAG

GTA

CCC

GAT

144

Glu

Val

Ala

Asp

Cys

Ser

His

Leu

Lys

Leu

Thr

Gin

Val

Pro

Asp

15

20

25

CTA

CCC

ACA

AAC

ATA

ACA

GTG

TTG

AAC

CTT

ACC

CAT

AAT

CAA

CTC

AGA

192

Leu

Pro

Thr

Asn

íle

Thr

Val

Leu

Asn

Leu

Thr

His

Asn

Gin

Leu

Arg

30

35

40

AGA

TTA

CCA

GCC

AAC

TTC

ACA

AGG

TAT

AGC

CAG

CTA

ACT

AGC

TTG

240

Arg

Leu

Pro

Ala

Asn

Phe

Thr

Arg

Tyr

Ser

Gin

Leu

Thr

Ser

Leu

45

50

55

GAT

GTA

GGA

TTT

AAC

ACC

ATC

TCA

AAA

CTG

GAG

CCA

GAA

TTG

TGC

CAG

288

Asp

Val

Gly

Phe

Asn

Thr

íle

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Glu

Leu

Cys

Gin

60

65

70

75

104

AAA Lys

CTT Leu

ccc Pro

ATG TTA

AAA GTT TTG AAC CTC CAG CAC AAT GAG

CTA Leu 90

TCT Ser

336

Met

Leu 80

Lys

Val

Leu

Asn

Leu 85

Gin

His

Asn

Glu

CAA

CTT

TCT

GAT

AAA

ACC

TTT

GCC

TTC

TGC

ACG

AAT

TTG

ACT

GAA

CTC

384

Gin

Leu

Ser

Asp 95

Lys

Thr

Phe

Ala

Phe 100

Cys

Thr

Asn

Leu

Thr 105

Glu

Leu

CAT

CTC

ATG

TCC

AAC

TCA

ATC

CAG

AAA

ATT

AAA

AAT

CCC

TTT

GTC

432

His

Leu

Met 110

Ser

Asn

Ser

íle

Gin 115

Lys

íle

Lys

Asn

Asn 120

Pro

Phe

Val

AAG

CAG

AAG

AAT

TTA

ATC

ACA

TTA

GAT

CTG

TCT

CAT

AAT

GGC

TTG

TCA

480

Lys

Gin 125

Lys

Asn

Leu

íle

Thr 130

Leu

Asp

Leu

Ser

His 135

Asn

Gly

Leu

Ser

TCT

ACA

AAA

TTA

GGA

ACT

CAG

GTT

CAG

CTG

GAA

AAT

CTC

CAA

GAG

CTT

528

Ser 140

Thr

Lys

Leu

Gly

Thr 145

Gin

Val

Gin

Leu

Glu 150

Asn

Leu

Gin

Glu

Leu 155

CTA

TTA

TCA

AAC

AAT

AAA

ATT

CAA

GCG

CTA

AAA

AGT

GAA

CTG

GAT

576

Leu

Ser

Asn

Asn 160

Lys

íle

Gin

Ala

Leu 165

Lys

Ser

Glu

Leu 170

Asp

ATC

TTT

GCC

AAT

TCA

TCT

TTA

AAA

TTA

GAG

TTG

TCA

TCG

AAT

CAA

624

íle

Phe

Ala

Asn 175

Ser

Leu

Lys

Lys 180

Leu

Glu

Leu

Ser

Ser 185

Asn

Gin

ATT

AAA

GAG

TTT

TCT

CCA

GGG

TGT

TTT

CAC

GCA

ATT

GGA

AGA

TTA

TTT

672

íle

Lys

Glu 190

Phe

Ser

Pro

Gly

Cys 195

Phe

His

Ala

íle

Gly 200

Arg

Leu

Phe

GGC

CTC

TTT

CTG

AAC

AAT

GTC

CAG

CTG

GGT

CCC

AGC

CTT

ACA

GAG

AAG

720

Gly

Leu 205

Phe

Leu

Asn

Val 210

Gin

Leu

Gly

Pro

Ser 215

Leu

Thr

Glu

Lys

CTA

TGT

TTG

GAA

TTA

GCA

AAC

ACA

AGC

ATT

CGG

AAT

CTG

TCT

CTG

AGT

768

Leu 220

Cys

Leu

Glu

Leu

Ala 225

Asn

Thr

Ser

íle

Arg 230

Asn

Leu

Ser

Leu

Ser 235

AAC

AGC

CAG

CTG

TCC

ACC

AGC

AAT

ACA

ACT

TTC

TTG

GGA

CTA

AAG

816

Asn

Ser

Gin

Leu

Ser 240

Thr

Ser

Asn

Thr 245

Thr

Phe

Leu

Gly

Leu 250

Lys

TGG

ACA

AAT

CTC

ACT

ATG

CTC

GAT

CTT

TCC

TAC

AAC

TTA

AAT

GTG

864

Trp

Thr

Asn

Leu 255

Thr

Met

Leu

Asp

Leu 260

Ser

Tyr

Asn

Leu 265

Asn

Val

GTT

GGT

AAC

GAT

TCC

TTT

GCT

TGG

CTT

CCA

CAA

CTA

GAA

TAT

TTC

912

Val

Gly

Asn 270

Asp

Ser

Phe

Ala

Trp 275

Leu

Pro

Gin

Leu

Glu 280

Tyr

Phe

CTA

GAG

TAT

AAT

ATA

CAG

CAT

TTG

TTT

TCT

CAC

TCT

TTG

CAC

GGG

960

Leu

Glu 285

Tyr

Asn

íle

Gin 290

His

Leu

Phe

Ser

His 295

Ser

Leu

His

Gly

CTT

TTC

AAT

GTG

AGG

TAC

CTG

AAT

TTG

AAA

CGG

TCT

TTT

ACT

AAA

CAA

1008

Leu 300

Phe

Asn

Val

Arg

Tyr 305

Leu

Asn

Leu

Lys

Arg 310

Ser

Phe

Thr

Lys

Gin 315

AGT

ATT

TCC

CTT

GCC

TCA

CTC

CCC

AAG

ATT

GAT

TTT

TCT

TTT

CAG

1056

Ser

íle

Ser

Leu

Ala 320

Ser

Leu

Pro

Lys

íle 325

Asp

Phe

Ser

Phe 330

Gin

105

TGG CTA

AAA Lys

TGT Cys 335

TTG GAG Leu Glu

CAC CTT AAC ATG GAA GAT AAT GAT ATT CCA

1104

Trp

Leu

His

Leu Asn 340

Met

Glu

Asp

Asn

Asp 345

íle

Pro

GGC

ATA

AAA

AGC

AAT

ATG

TTC

ACA

GGA

TTG

ATA

AAC

CTG

AAA

TAC

TTA

1152

Gly

íle

Lys

Ser

Asn

Met

Phe

Thr

Gly

Leu

íle

Asn

Leu

Lys

Tyr

Leu

350

355

360

AGT

CTA

TCC

AAC

TCC

TTT

ACA

AGT

TTG

CGA

ACT

TTG

ACA

AAT

GAA

ACA

1200

Ser

Leu

Ser

Asn

Ser

Phe

Thr

Ser

Leu

Arg

Thr

Leu

Thr

Asn

Glu

Thr

365

370

375

TTT

GTA

TCA

CTT

GCT

CAT

TCT

CCC

TTA

CAC

ATA

CTC

AAC

CTA

ACC

AAG

1248

Phe

Val

Ser

Leu

Ala

His

Ser

Pro

Leu

His

íle

Leu

Asn

Leu

Thr

Lys

380

385

390

395

AAT

AAA

ATC

TCA

AAA

ATA

GAG

AGT

GAT

GCT

TTC

TCT

TGG

TTG

GGC

CAC

1296

Asn

Lys

íle

Ser

Lys

íle

Glu

Ser

Asp

Ala

Phe

Ser

Trp

Leu

Gly

His

400

405

410

CTA

GAA

GTA

CTT

GAC

CTG

GGC

CTT

AAT

GAA

ATT

GGG

CAA

GAA

CTC

ACA

1344

Leu

Glu

Val

Leu

Asp

Leu

Gly

Leu

Asn

Glu

íle

Gly

Gin

Glu

Leu

Thr

415

420

425

GGC

CAG

GAA

TGG

AGA

GGT

CTA

GAA

AAT

ATT

TTC

GAA

ATC

TAT

CTT

TCC

1392

Gly

Gin

Glu

Trp

Arg

Gly

Leu

Glu

Asn

íle

Phe

Glu

íle

Tyr

Leu

Ser

430

435

440

TAC

AAC

AAG

TAC

CTG

CAG

CTG

ACT

AGG

AAC

TCC

TTT

GCC

TTG

GTC

CCA

1440

Tyr

Asn

Lys

Tyr

Leu

Gin

Leu

Thr

Arg

Asn

Ser

Phe

Ala

Leu

Val

Pro

445

450

455

AGC

CTT

CAA

CGA

CTG

ATG

CTC

CGA

AGG

GTG

GCC

CTT

AAA

AAT

GTG

GAT

1488

Ser

Leu

Gin

Arg

Leu

Met

Leu

Arg

Val

Ala

Leu

Lys

Asn

Val

Asp

460

465

470

475

AGC

TCT

CCT

TCA

CCA

TTC

CAG

CCT

CTT

CGT

AAC

TTG

ACC

ATT

CTG

GAT

1536

Ser

Pro

Ser

Pro

Phe

Gin

Pro

Leu

Arg

Asn

Leu

Thr

íle

Leu

Asp

480

485

490

CTA

AGC

AAC

ATA

GCC

AAC

ATA

AAT

GAT

GAC

ATG

TTG

GAG

GGT

1584

Leu

Ser

Asn

íle

Ala

Asn

íle

Asn

Asp

Met

Leu

Glu

Gly

495

500

505

CTT

GAG

AAA

CTA

GAA

ATT

CTC

GAT

TTG

CAG

CAT

AAC

TTA

GCA

CGG

1632

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

íle

Leu

Asp

Leu

Gin

His

Asn

Leu

Ala

Arg

510

515

520

CTC

TGG

AAA

CAC

GCA

AAC

CCT

GGT

CCC

ATT

TAT

TTC

CTA

AAG

GGT

1680

Leu

Trp

Lys

His

Ala

Asn

Pro

Gly

Pro

íle

Tyr

Phe

Leu

Lys

Gly

525

530

535

CTG

TCT

CAC

CTC

CAC

ATC

CTT

AAC

TTG

GAG

TCC

AAC

GGC

TTT

GAC

GAG

1728

Leu

Ser

His

Leu

His

íle

Leu

Asn

Leu

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Asp

Glu

540

545

550

555

ATC

CCA

GTT

GAG

GTC

TTC

AAG

GAT

TTA

TTT

GAA

CTA

AAG

ATC

GAT

1776

íle

Pro

Val

Glu

Val

Phe

Lys

Asp

Leu

Phe

Glu

Leu

Lys

íle

Asp

560

565

570

106

TTA GGA TTG AAT AAT TTA AAC ACA CTT CCA GCA TCT GTC TTT AAT AAT 1824

Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn

575 580 585

CAG GTG TCT CTA AAG TCA TTG AAC CTT CAG AAG AAT CTC ATA ACA TCC 1872

Gin Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gin Lys Asn Leu íle Thr Ser

590 595 600

GTT GAG AAG AAG GTT TTC GGG CCA GCT TTC AGG AAC CTG ACT GAG TTA 1920

Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu

605 610 615

GAT ATG CGC TTT AAT CCC TTT GAT TGC ACG TGT GAA AGT ATT GCC TGG 1968

Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cys Thr Cys Glu Ser íle Ala Trp

620 625 630 635

TTT GTT AAT TGG ATT AAC GAG ACC CAT ACC AAC ATC CCT GAG CTG TCA 2016

Phe Val Asn Trp íle Asn Glu Thr His Thr Asn íle Pro Glu Leu Ser

640 645 650

AGC CAC TAC CTT TGC AAC ACT CCA CCT CAC TAT CAT GGG TTC CCA GTG 2064

Ser His Tyr Leu Cys Asn Thr Pro Pro His Tyr His Gly Phe Pro Val

655 660 665

AGA CTT TTT GAT ACA TCA TCT TGC AAA GAC AGT GCC CCC TTT GAA CTC 2112

Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pro Phe Glu Leu

670 675 680

TTT TTC ATG ATC AAT ACC AGT ATC CTG TTG ATT TTT ATC TTT ATT GTA 2160

Phe Phe Met íle Asn Thr Ser íle Leu Leu íle Phe íle Phe íle Val

685 690 695

CTT CTC ATC CAC TTT GAG GGC TGG AGG ATA TCT TTT TAT TGG AAT GTT 2208

Leu Leu íle His Phe Glu Gly Trp Arg íle Ser Phe Tyr Trp Asn Val

700 705 710 715

TCA GTA CAT CGA GTT CTT GGT TTC AAA GAA ATA GAC AGA CAG ACA GAA 2256

Ser Val His Arg Val Leu Gly Phe Lys Glu íle Asp Arg Gin Thr Glu

720 725 730

CAG TTT GAA TAT GCA GCA TAT ATA ATT CAT GCC TAT AAA GAT AAG GAT 2304

Gin Phe Glu Tyr Ala Ala Tyr íle íle His Ala Tyr Lys Asp Lys Asp

735 740 745

TGG GTC TGG GAA CAT TTC TCT TCA ATG GAA AAG GAA GAC CAA TCT CTC 2352

Trp Val Trp Glu His Phe Ser Ser Met Glu Lys Glu Asp Gin Ser Leu

750 755 760

AAA TTT TGT CTG GAA GAA AGG GAC TTT GAG GCG GGT GTT TTT GAA CTA 2400

Lys Phe Cys Leu Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ala Gly Val Phe Glu Leu

765 770 775

GAA GCA ATT GTT AAC AGC ATC AAA AGA AGC AGA AAA ATT ATT TTT GTT 2448

Glu Ala íle Val Asn Ser íle Lys Arg Ser Arg Lys íle íle Phe Val

780 785 790 795

ATA ACA CAC CAT CTA TTA AAA GAC CCA TTA TGC AAA AGA TTC AAG GTA 2496 íle Thr His His Leu Leu Lys Asp Pro Leu Cys Lys Arg Phe Lys Val

800 805 810

CAT CAT GCA GTT CAA CAA GCT ATT GAA CAA AAT CTG GAT TCC ATT ATA 2544

1ο7

His His Ala Val

Gin Gin Ala íle Glu Gin Asn Leu Asp Ser íle

íle

815

820

825

TTG

GTT

TTC

CTT

GAG

ATT

CCA

GAT

TAT

AAA

CTG

AAC

CAT

GCA

CTC

Leu

Val

Phe

Leu

Glu

íle

Pro

Asp

Tyr

Lys

Leu

Asn

His

Ala

Leu

830

835

840

TGT

TTG

CGA

AGA

GGA

ATG

TTT

AAA

TCT

CAC

TGC

ATC

TTG

AAC

TGG

CCA

Cys

Leu

Arg

Gly

Met

Phe

Lys

Ser

His

Cys

íle

Leu

Asn

Trp

Pro

845

850

855

GTT

CAG

AAA

GAA

CGG

ATA

GGT

GCC

TTT

CGT

CAT

AAA

TTG

CAA

GTA

GCA

Val

Gin

Lys

Glu

Arg

íle

Gly

Ala

Phe

Arg

His

Lys

Leu

Gin

Val

Ala

860

865

870

875

CTT

GGA

TCC

AAA

AAC

TCT

GTA

CAT

TAA

Leu

Gly

Ser

Lys

Asn

Ser

Val

His

880

2592

2640

2688

2715 (2) Informácie k SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 904 aminokyselín

	(ϋ) (xi)	(B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna DRUH MOLEKULY: proteín Popis sekvencie: SEQ ID NO: 6
Met -21	Arg -20	Gin Thr Leu	Pro Cys íle Tyr -15	Phe	Trp	Gly -10	Gly	Leu	Leu	Pro
Phe -5	Gly	Met Leu Cys	Ala Ser Ser Thr 1	Thr 5	Lys	Cys	Thr	Val	Ser 10	His
Glu	Val	Ala Asp Cys 15	Ser His Leu Lys 20	Leu	Thr	Gin	Val	Pro 25	Asp	Asp
Leu	Pro	Thr Asn íle 30	Thr Val Leu Asn 35	Leu	Thr	His	Asn 40	Gin	Leu	Arg
Arg	Leu 45	Pro Ala Ala	Asn Phe Thr Arg 50	Tyr	Ser	Gin 55	Leu	Thr	Ser	Leu
Asp	Val	Gly Phe Asn	Thr íle Ser Lys	Leu	Glu	Pro	Glu	Leu	Cys	Gin

65 · 70 75

Lys Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu Gin His Asn Glu Leu Ser 80 85 90

Gin Leu Ser Asp Lys Thr Phe Ala Phe Cys Thr Asn Leu Thr Glu Leu 95 100 105

His Leu Met Ser Asn Ser íle Gin Lys íle Lys Asn Asn Pro Phe Val 110 115 120

Lys Gin Lys Asn Leu íle Thr Leu Asp Leu Ser His Asn Gly Leu Ser 125 130 135

108

Ser

Thr

Lys

Leu

Gly

Thr

Gin

Val

Gin

Leu

Glu

Asn

Leu

Gin

Glu

Leu

140

145

150

155

Leu

Ser

Asn

Lys

íle

Gin

Ala

Leu

Lys

Ser

Glu

Leu

Asp

160

165

170

íle

Phe

Ala

Asn

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Leu

Ser

Asn

Gin

175

180

185

íle

Lys

Glu

Phe

Ser

Pro

Gly

Cys

Phe

His

Ala

íle

Gly

Arg

Leu

Phe

190

195

200

Gly

Leu

Phe

Leu

Asn

Val

Gin

Leu

Gly

Pro

Ser

Leu

Thr

Glu

Lys

205

210

215

Leu

Cys

Leu

Glu

Leu

Ala

Asn

Thr

Ser

íle

Arg

Asn

Leu

Ser

Leu

Ser

220

225

230

235

Asn

Ser

Gin

Leu

Ser

Thr

Ser

Asn

Thr

Phe

Leu

Gly

Leu

Lys

240

245

250

Trp

Thr

Asn

Leu

Thr

Met

Leu

Asp

Leu

Ser

Tyr

Asn

Leu

Asn

Val

255

260

265

Val

Gly

Asn

Asp

Ser

Phe

Ala

Trp

Leu

Pro

Gin

Leu

Glu

Tyr

Phe

270

275

280

Leu

Glu

Tyr

Asn

íle

Gin

His

Leu

Phe

Ser

His

Ser

Leu

His

Gly

285

290

295

Leu

Phe

Asn

Val

Arg

Tyr

Leu

Asn

Leu

Lys

Arg

Ser

Phe

Thr

Lys

Gin

300

305

310

315

Ser

íle

Ser

Leu

Ala

Ser

Leu

Pro

Lys

íle

Asp

Phe

Ser

Phe

Gin

320

325

330

Trp

Leu

Lys

Cys

Leu

Glu

His

Leu

Asn

Met

Glu

Asp

Asn

Asp

íle

Pro

335

340

345

Gly

íle

Lys

Ser

Asn

Met

Phe

Thr

Gly

Leu

íle

Asn

Leu

Lys

Tyr

Leu

350

355

360

Ser

Leu

Ser

Asn

Ser

Phe

Thr

Ser

Leu

Arg

Thr

Leu

Thr

Asn

Glu

Thr

365

370

375

Phe

Val

Ser

Leu

Ala

His

Ser

Pro

Leu

His

íle

Leu

Asn

Leu

Thr

Lys

380

385

390

395

Asn

Lys

íle

Ser

Lys

íle

Glu

Ser

Asp

Ala

Phe

Ser

Trp

Leu

Gly

His

400

405

410

Leu

Glu

Val

Leu

Asp

Leu

Gly

Leu

Asn

Glu

íle

Gly

Gin

Glu

Leu

Thr

415

420

425

Gly

Gin

Glu

Trp

Arg

Gly

Leu

Glu

Asn

íle

Phe

Glu

íle

Tyr

Leu

Ser

430

435

440

Tyr

Asn

Lys

Tyr

Leu

Gin

Leu

Thr

Arg

Asn

Ser

Phe

Ala

Leu

Val

Pro

445

450

455

Ser Leu Gin Arg Leu Met Leu Arg Arg Val Ala Leu Lys Asn Val Asp

109

460

465

470

475

Ser

Pro

Ser

Pro

Phe

Gin

Pro

Leu

Arg

Asn

Leu

Thr

íle

Leu

Asp

480

485

490

Leu

Ser

Asn

íle

Ala

Asn

íle

Asn

Asp

Met

Leu

Glu

Gly

495

500

505

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

íle

Leu

Asp

Leu

Gin

His

Asn

Leu

Ala

Arg

510

515

520

Leu

Trp

Lys

His

Ala

Asn

Pro

Gly

Pro

íle

Tyr

Phe

Leu

Lys

Gly

525

530

535

Leu

Ser

His

Leu

His

íle

Leu

Asn

Leu

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Asp

Glu

540

545

550

555

íle

Pro

Val

Glu

Val

Phe

Lys

Asp

Leu

Phe

Glu

Leu

Lys

íle

Asp

560

565

570

Leu

Gly

Leu

Asn

Leu

Asn

Thr

Leu

Pro

Ala

Ser

Val

Phe

Asn

575

580

585

Gin

Val

Ser

Leu

Lys

Ser

Leu

Asn

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

íle

Thr

Ser

590

595

600

Val

Glu

Lys

Val

Phe

Gly

Pro

Ala

Phe

Arg

Asn

Leu

Thr

Glu

Leu

605

610

615

Asp

Met

Arg

Phe

Asn

Pro

Phe

Asp

Cys

Thr

Cys

Glu

Ser

íle

Ala

Trp

620

625

630

635

Phe

Val

Asn

Trp

íle

Asn

Glu

Thr

His

Thr

Asn

íle

Pro

Glu

Leu

Ser

640

645

650

Ser

His

Tyr

Leu

Cys

Asn

Thr

Pro

His

Tyr

His

Gly

Phe

Pro

Val

655

660

665

Arg

Leu

Phe

Asp

Thr

Ser

Cys

Lys

Asp

Ser

Ala

Pro

Phe

Glu

Leu

670

675

680

Phe

Met

íle

Asn

Thr

Ser

íle

Leu

íle

Phe

íle

Phe

íle

Val

685

690

695

Leu

íle

His

Phe

Glu

Gly

Trp

Arg

íle

Ser

Phe

Tyr

Trp

Asn

Val

700

705

710

715

Ser

Val

His

Arg

Val

Leu

Gly

Phe

Lys

Glu

íle

Asp

Arg

Gin

Thr

Glu

720

725

730

Gin

Phe

Glu

Tyr

Ala

Tyr

íle

His

Ala

Tyr

Lys

Asp

Lys

Asp

735

740

745

Trp

Val

Trp

Glu

His

Phe

Ser

Met

Glu

Lys

Glu

Asp

Gin

Ser

Leu

750

755

760

Lys

Phe

Cys

Leu

Glu

Arg

Asp

Phe

Glu

Ala

Gly

Val

Phe

Glu

Leu

765

770

775

Glu Ala íle Val Asn Ser íle Lys Arg Ser Arg Lys íle íle Phe Val 780 785 790 795

110

íle

Thr

His

Leu

Lys

Asp

Pro

Leu

Cys

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

800

805

810

His

Ala

Val

Gin

Ala

íle

Glu

Gin

Asn

Leu

Asp

Ser

íle

815

820

825

Leu

Val

Phe

Leu

Glu

íle

Pro

Asp

Tyr

Lys

Leu

Asn

His

Ala

Leu

830

835

840

Cys

Leu

Arg

Gly

Met

Phe

Lys

Ser

His

Cys

íle

Leu

Asn

Trp

Pro

845

850

855

val

Gin

Lys

Glu

Arg

íle

Gly

Ala

Phe

Arg

His

Lys

Leu

Gin

Val

Ala

860

865

870

875

Leu

Gly

Ser

Lys

Asn

Ser

Val

His

880

2) Informácie o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2400 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..2397 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7

ATG Met 1

GAG CTG

AAT TTC TAC

AAA ATC CCC GAC AAC CTC CCC

TTC Phe

TCA Ser 15

ACC Thr

48

Glu

Leu

Asn

Phe Tyr 5

Lys

íle

Pro

Asp 10

Asn

Leu

Pro

AAG

AAC

CTG

GAC

CTG

AGC

TTT

AAT

CCC

CTG

AGG

CAT

TTA

GGC

AGC

TAT

96

Lys

Asn

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Pro

Leu

Arg

His

Leu

Gly

Ser

Tyr

20

25

30

AGC

TTC

AGT

TTC

CCA

GAA

CTG

CAG

GTG

CTG

GAT

TTA

TCC

AGG

TGT

144

Ser

Phe

Ser

Phe

Pro

Glu

Leu

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Cys

35

40

45

GAA

ATC

CAG

ACA

ATT

GAA

GAT

GGG

GCA

TAT

CAG

AGC

CTA

AGC

CAC

CTC

192

Glu

íle

Gin

Thr

íle

Glu

Asp

Gly

Ala

Tyr

Gin

Ser

Leu

Ser

His

Leu

50

55

60

TCT

ACC

TTA

ATA

TTG

ACA

GGA

AAC

CCC

ATC

CAG

AGT

TTA

GCC

CTG

GGA

240

Ser

Thr

Leu

íle

Leu

Thr

Gly

Asn

Pro

íle

Gin

Ser

Leu

Ala

Leu

Gly

65

70

75

80

GCC

TTT

TCT

GGA

CTA

TCA

AGT

TTA

CAG

AAG

CTG

GTG

GCT

GTG

GAG

ACA

288

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Gin

Lys

Leu

Val

Ala

Val

Glu

Thr

85

90

95

lil

AAT CTA Asn Leu

GCA TCT CTA GAG AAC TTC CCC ATT GGA CAT CTC AAA ACT TTG

336

Ala

Ser Leu 100

Glu

Asn

Phe

Pro 105

íle Gly

His

Leu

Lys 110

Thr

Leu

AAA

GAA

CTT

AAT

GTG

GCT

CAC

AAT

CTT

ATC

CAA

TCT

TTC

AAA

TTA

CCT

384

Lys

Glu

Leu

Asn

Val

Ala

His

Asn

Leu

íle

Gin

Ser

Phe

Lys

Leu

Pro

115

120

125

GAG

TAT

TTT

TCT

AAT

CTG

ACC

AAT

CTA

GAG

CAC

TTG

GAC

CTT

TCC

AGC

432

Glu

Tyr

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr

Asn

Leu

Glu

His

Leu

Asp

Leu

Ser

Ser.

130

135

140

AAC

AAG

ATT

CAA

AGT

ATT

TAT

TGC

ACA

GAC

TTG

CGG

GTT

CTA

CAT

CAA

480

Asn

Lys

íle

Gin

Ser

íle

Tyr

Cys

Thr

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

His

Gin

145

150

155

160

ATG

CCC

CTA

CTC

AAT

CTC

TCT

TTA

GAC

CTG

TCC

CTG

AAC

CCT

ATG

AAC

528

Met

Pro

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu

Asn

Pro

Met

Asn

165

170

175

TTT

ATC

CAA

CCA

GGT

GCA

TTT

AAA

GAA

ATT

AGG

CTT

CAT

AAG

CTG

ACT

576

Phe

íle

Gin

Pro

Gly

Ala

Phe

Lys

Glu

íle

Arg

Leu

His

Lys

Leu

Thr

180

185

190

TTA

AGA

AAT

TTT

GAT

AGT

TTA

AAT

GTA

ATG

AAA

ACT

TGT

ATT

CAA

624

Leu

Arg

Asn

Phe

Asp

Ser

Leu

Asn

Val

Met

Lys

Thr

Cys

íle

Gin

195

200

205

GGT

CTG

GCT

GGT

TTA

GAA

GTC

CAT

CGT

TTG

GTT

CTG

GGA

GAA

TTT

AGA

672

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Val

His

Arg

Leu

Val

Leu

Gly

Glu

Phe

Arg

210

215

220

AAT

GAA

GGA

AAC

TTG

GAA

AAG

TTT

GAC

AAA

TCT

GCT

CTA

GAG

GGC

CTG

720

Asn

Glu

Gly

Asn

Leu

Glu

Lys

Phe

Asp

Lys

Ser

Ala

Leu

Glu

Gly

Leu

225

230

235

240

TGC

AAT

TTG

ACC

ATT

GAA

TTC

CGA

TTA

GCA

TAC

TTA

GAC

TAC

768

Cys

Asn

Leu

Thr

íle

Glu

Phe

Arg

Leu

Ala

Tyr

Leu

Asp

Tyr

245

250

255

CTC

GAT

ATT

GAC

TTA

TTT

AAT

TGT

TTG

ACA

AAT

GTT

TCT

TCA

816

Leu

Asp

íle

Asp

Leu

Phe

Asn

Cys

Leu

Thr

Asn

Val

Ser

260

265

270

TTT

TCC

CTG

GTG

AGT

GTG

ACT

ATT

GAA

AGG

GTA

AAA

GAC

TTT

TCT

TAT

864

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Val

Thr

íle

Glu

Arg

Val

Lys

Asp

Phe

Ser

Tyr

275

280

285

AAT

TTC

GGA

TGG

CAA

CAT

TTA

GAA

TTA

GTT

AAC

TGT

AAA

TTT

GGA

CAG

912

Asn

Phe

Gly

Trp

Gin

His

Leu

Glu

Leu

Val

Asn

Cys

Lys

Phe

Gly

Gin

290

295

300

TTT

CCC

ACA

TTG

AAA

CTC

AAA

TCT

CTC

AAA

AGG

CTT

ACT

TTC

ACT

TCC

960

Phe

Pro

Thr

Leu

Lys

Leu

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Thr

Phe

Thr

Ser

305

310

315

320

AAC

AAA

GGT

GGG

AAT

GCT

TTT

TCA

GAA

GTT

GAT

CTA

CCA

AGC

CTT

GAG

1008

Asn

Lys

Gly

Asn

Ala

Phe

Ser

Glu

Val

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Glu

325

330

335

TTT

CTA

GAT

CTC

AGT

AGA

AAT

GGC

TTG

AGT

TTC

AAA

GGT

TGC

TGT

TCT

1056

112

1104

Phe

Leu

Asp

Leu 340

Ser

Arg

Asn

Gly

Leu 345

Ser

Phe

Lys

Gly

Cys 350

Cys

Ser

CAA

AGT

GAT

TTT

GGG

ACA

ACC

AGC

CTA

AAG

TAT

TTA

GAT

CTG

AGC

TTC

Gin

Ser

Asp 355

Phe

Gly

Thr

Ser 360

Leu

Lys

Tyr

Leu

Asp 365

Leu

Ser

Phe

AAT

GGT

GTT

ATT

ACC

ATG

AGT

TCA

AAC

TTC

TTG

GGC

TTA

GAA

CAA

CTA

Asn

Gly 370

Val

íle

Thr

Met

Ser 375

Ser

Asn

Phe

Leu

Gly 380

Leu

Glu

Gin

Leu

GAA

CAT

CTG

GAT

TTC

CAG

CAT

TCC

AAT

TTG

AAA

CAA

ATG

AGT

GAG

TTT

Glu 385

His

Leu

Asp

Phe

Gin 390

His

Ser

Asn

Leu

Lys 395

Gin

Met

Ser

Glu

Phe 400

TCA

GTA

TTC

CTA

TCA

CTC

AGA

AAC

CTC

ATT

TAC

CTT

GAC

ATT

TCT

CAT

Ser

Val

Phe

Leu

Ser 405

Leu

Arg

Asn

Leu

íle 410

Tyr

Leu

Asp

íle

Ser 415

His

ACT

CAC

ACC

AGA

GTT

GCT

TTC

AAT

GGC

ATC

TTC

AAT

GGC

TTG

TCC

AGT

Thr

His

Thr

Arg 420

Val

Ala

Phe

Asn

Gly 425

íle

Phe

Asn

Gly

Leu 430

Ser

CTC

GAA

GTC

TTG

AAA

ATG

GCT

GGC

AAT

TCT

TTC

CAG

GAA

AAC

TTC

CTT

Leu

Glu

Val 435

Leu

Lys

Met

Ala

Gly 440

Asn

Ser

Phe

Gin

Glu 445

Asn

Phe

Leu

CCA

GAT

ATC

TTC

ACA

GAG

CTG

AGA

AAC

TTG

ACC

TTC

CTG

GAC

CTC

TCT

Pro

Asp 450

íle

Phe

Thr

Glu

Leu 455

Arg

Asn

Leu

Thr

Phe 460

Leu

Asp

Leu

Ser

CAG

TGT

CAA

CTG

GAG

CAG

TTG

TCT

CCA

ACA

GCA

TTT

AAC

TCA

CTC

TCC

Gin 465

Cys

Gin

Leu

Glu

Gin 470

Leu

Ser

Pro

Thr

Ala 475

Phe

Asn

Ser

Leu

Ser 480

AGT

CTT

CAG

GTA

CTA

AAT

ATG

AGC

CAC

AAC

TTC

TTT

TCA

TTG

GAT

Ser

Leu

Gin

Val

Leu 485

Asn

Met

Ser

His

Asn 490

Asn

Phe

Ser

Leu 495

Asp

ACG

TTT

CCT

TAT

AAG

TGT

CTG

AAC

TCC

CTC

CAG

GTT

CTT

GAT

TAC

AGT

Thr

Phe

Pro

Tyr 500

Lys

Cys

Leu

Asn

Ser 505

Leu

Gin

Val

Leu

Asp 510

Tyr

Ser

CTC

AAT

CAC

ATA

ATG

ACT

TCC

AAA

CAG

GAA

CTA

CAG

CAT

TTT

CCA

Leu

Asn

His 515

íle

Met

Thr

Ser

Lys 520

Lys

Gin

Glu

Leu

Gin 525

His

Phe

Pro

AGT

CTA

GCT

TTC

TTA

AAT

CTT

ACT

CAG

AAT

GAC

TTT

GCT

TGT

ACT

Ser

Ser 530

Leu

Ala

Phe

Leu

Asn 535

Leu

Thr

Gin

Asn

Asp 540

Phe

Ala

Cys

Thr

TGT

GAA

CAC

CAG

AGT

TTC

CTG

CAA

TGG

ATC

AAG

GAC

CAG

AGG

CAG

CTC

Cys 545

Glu

His

Gin

Ser

Phe 550

Leu

Gin

Trp

íle

Lys 555

Asp

Gin

Arg

Gin

Leu 560

TTG

GTG

GAA

GTT

GAA

CGA

ATG

GAA

TGT

GCA

ACA

CCT

TCA

GAT

AAG

CAG

Leu

Val

Glu

Val

Glu 565

Arg

Met

Glu

Cys

Ala 570

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys 575

Gin

GGC

ATG

CCT

GTG

CTG

AGT

TTG

AAT

ATC

ACC

TGT

CAG

ATG

AAT

AAG

ACC

Gly

Met

Pro

Val

Leu

Ser

Leu

Asn

íle

Thr

Cys

Gin

Met

Asn

Lys

Thr

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

113

580

585

590

ATC

ATT

GGT

GTG

TCG

GTC

CTC

AGT

GTG

CTT

GTA

TCT

GTT

GTA

GCA

1824

íle

Gly 595

Val

Ser

Val

Leu

Ser 600

Val

Leu

Val

Ser 605

Val

Ala

GTT

CTG

GTC

TAT

AAG

TTC

TAT

TTT

CAC

CTG

ATG

CTT

GCT

GGC

TGC

1872

Val

Leu 610

Val

Tyr

Lys

Phe

Tyr 615

Phe

His

Leu

Met

Leu 620

Leu

Ala

Gly

Cys

ATA

AAG

TAT

GGT

AGA

GGT

GAA

AAC

ATC

TAT

GAT

GCC

TTT

GTT

ATC

TAC

1920

íle 625

Lys

Tyr

Gly

Arg

Gly 630

Glu

Asn

íle

Tyr

Asp 635

Ala

Phe

Val

íle

Tyr 640

TCA

AGC

CAG

GAT

GAG

GAC

TGG

GTA

AGG

AAT

GAG

CTA

GTA

AAG

AAT

TTA

1968

Ser

Gin

Asp

Glu 645

Asp

Trp

Val

Arg

Asn 650

Glu

Leu

Val

Lys

Asn 655

Leu

GAA

GGG

GTG

CCT

CCA

TTT

CAG

CTC

TGC

CTT

CAC

TAC

AGA

GAC

TTT

2016

Glu

Gly

Val 660

Pro

Phe

Gin

Leu 665

Cys

Leu

His

Tyr

Arg 670

Asp

Phe

ATT

CCC

GGT

GTG

GCC

ATT

GCT

GCC

AAC

ATC

CAT

GAA

GGT

TTC

CAT

2064

íle

Pro

Gly 675

Val

Ala

íle

Ala

Ala 680

Asn

íle

His

Glu 685

Gly

Phe

His

AAA

AGC

CGA

AAG

GTG

ATT

GTT

GTG

TCC

CAG

CAC

TTC

ATC

CAG

AGC

2112

Lys

Ser 690

Arg

Lys

Val

íle

Val 695

Val

Ser

Gin

His 700

Phe

íle

Gin

Ser

CGC

TGG

TGT

ATC

TTT

GAA

TAT

GAG

ATT

GCT

CAG

ACC

TGG

CAG

TTT

CTG

2160

Arg 705

Trp

Cys

íle

Phe

Glu 710

Tyr

Glu

íle

Ala

Gin 715

Thr

Trp

Gin

Phe

Leu 720

AGC

AGT

CGT

GCT

GGT

ATC

TTC

ATT

GTC

CTG

CAG

AAG

GTG

GAG

AAG

2208

Ser

Arg

Ala

Gly 725

íle

Phe

íle

Val 730

Leu

Gin

Lys

Val

Glu 735

Lys

ACC

CTG

CTC

AGG

CAG

GTG

GAG

CTG

TAC

CGC

CTT

CTC

AGC

AGG

AAC

2256

Thr

Leu

Arg 740

Gin

Val

Glu

Leu 745

Tyr

Arg

Leu

Ser 750

Arg

Asn

ACT

TAC

CTG

GAG

TGG

GAG

GAC

AGT

GTC

CTG

GGG

CGG

CAC

ATC

TTC

TGG

2304

Thr

Tyr

Leu 755

Glu

Trp

Glu

Asp

Ser 760

Val

Leu

Gly

Arg

His 765

íle

Phe

Trp

AGA

CGA

CTC

AGA

AAA

GCC

CTG

GAT

GGT

AAA

TCA

TGG

AAT

CCA

GAA

2352

Arg

Arg 770

Leu

Arg

Lys

Ala

Leu 775

Leu

Asp

Gly

Lys

Ser 780

Trp

Asn

Pro

Glu

GGA Gly

ACA Thr

GTG Val

GGT Gly

ACA Thr

GGA Gly

TGC Cys

AAT Asn

TGG Trp

CAG Gin

GAA Glu

GCA Ala

ACA Thr

TCT Ser

ATC íle

2397

785 790 795

TGA 2400

2) Informácie k SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 799 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina

114 (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 8:

Met 1

Glu

Leu

Asn

Phe 5

Tyr

Lys

íle

Pro

Asp 10

Asn

Leu

Pro

Phe

Ser 15

Thr

Lys

Asn

Leu

Asp 20

Leu

Ser

Phe

Asn

Pro 25

Leu

Arg

His

Leu

Gly 30

Ser

Tyr

Ser

Phe

Phe 35

Ser

Phe

Pro

Glu

Leu 40

Gin

Val

Leu

Asp

Leu 45

Ser

Arg

Cys

Glu

íle 50

Gin

Thr

íle

Glu

Asp 55

Gly

Ala

Tyr

Gin

Ser 60

Leu

Ser

His

Leu

Ser 65

Thr

Leu

íle

Leu

Thr 70

Gly

Asn

Pro

íle

Gin 75

Ser

Leu

Ala

Leu

Gly 80

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu 85

Ser

Leu

Gin

Lys 90

Leu

Val

Ala

Val

Glu 95

Thr

Asn

Leu

Ala

Ser 100

Leu

Glu

Asn

Phe

Pro 105

íle

Gly

His

Leu

Lys 110

Thr

Leu

Lys

Glu

Leu 115

Asn

Val

Ala

His

Asn 120

Leu

íle

Gin

Ser

Phe 125

Lys

Leu

Pro

Glu

Tyr 130

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr 135

Asn

Leu

Glu

His

Leu 140

Asp

Leu

Ser

Asn 145

Lys

íle

Gin

Ser

íle 150

Tyr

Cys

Thr

Asp

Leu 155

Arg

Val

Leu

His

Gin 160

Met

Pro

Leu

Asn 165

Leu

Ser

Leu

Asp

Leu 170

Ser

Leu

Asn

Pro

Met 175

Asn

Phe

íle

Gin

Pro 180

Gly

Ala

Phe

Lys

Glu 185

íle

Arg

Leu

His

Lys 190

Leu

Thr

Leu

Arg

Asn 195

Asn

Phe

Asp

Ser

Leu 200

Asn

Val

Met

Lys

Thr 205

Cys

íle

Gin

Gly

Leu 210

Ala

Gly

Leu

Glu

Val 215

His

Arg

Leu

Val

Leu 220

Gly

Glu

Phe

Arg

Asn 225

Glu

Gly

Asn

Leu

Glu 230

Lys

Phe

Asp

Lys

Ser 235

Ala

Leu

Glu

Gly

Leu 240

Cys

Asn

Leu

Thr

íle 245

Glu

Phe

Arg

Leu 250

Ala

Tyr

Leu

Asp

Tyr 255

Tyr

Leu

Asp

íle 260

íle

Asp

Leu

Phe

Asn 265

Cys

Leu

Thr

Asn

Val 270

Ser

Phe

Ser

Leu 275

Val

Ser

Val

Thr

íle 280

Glu

Arg

Val

Lys

Asp 285

Phe

Ser

Tyr

115

Asn Phe Gly Trp Gin His Leu Glu Leu Val Asn Cys Lys Phe Gly Gin 290 295 300

Phe Pro Thr Leu Lys Leu Lys Ser Leu Lys Arg Leu Thr Phe Thr Ser

305

310

315

320

Asn Lys Gly Gly Asn Ala Phe Ser Glu Val Asp Leu Pro Ser Leu Glu

325

330

335

Phe Leu Asp Leu Ser Arg Asn Gly Leu Ser Phe Lys Gly Cys Cys Ser. 340 345 350

Gin Ser Asp Phe Gly Thr Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Asp Leu Ser Phe 355 360 365

Asn Gly Val íle Thr Met Ser Ser Asn Phe Leu Gly Leu Glu Gin Leu 370 375 380

Glu His Leu Asp Phe Gin His Ser Asn Leu Lys Gin Met Ser Glu Phe

385 390 395 400

Ser Val Phe Leu Ser Leu Arg Asn Leu íle Tyr Leu Asp íle Ser His

405 410 415

Thr His Thr Arg Val Ala Phe Asn Gly íle Phe Asn Gly Leu Ser Ser 420 425 430

Leu Glu Val Leu Lys Met Ala Gly Asn Ser Phe Gin Glu Asn Phe Leu 435 440 445

Pro Asp íle Phe Thr Glu Leu Arg Asn Leu Thr Phe Leu Asp Leu Ser 450 455 460

Gin Cys Gin Leu Glu Gin Leu Ser Pro Thr Ala Phe Asn Ser Leu Ser

465

470

475

480

Ser Leu Gin Val Leu Asn Met Ser His Asn Asn Phe Phe Ser Leu Asp 485 490 49S

Thr Phe Pro Tyr Lys Cys Leu Asn Ser Leu Gin Val Leu Asp Tyr Ser 500 505 510

Leu Asn His íle Met Thr Ser Lys Lys Gin Glu Leu Gin His Phe Pro 515 520 525

Ser Ser Leu Ala Phe Leu Asn Leu Thr Gin Asn Asp Phe Ala Cys Thr 530 535 540

Cys Glu His Gin Ser Phe Leu Gin Trp íle Lys Asp Gin Arg Gin Leu

545 550 555 560

Leu Val Glu Val Glu Arg Met Glu Cys Ala Thr Pro Ser Asp Lys Gin

565 570 575

Gly Met Pro Val Leu Ser Leu Asn íle Thr Cys Gin Met Asn Lys Thr 580 585 590 íle íle Gly Val Ser Val Leu Ser Val Leu Val Val Ser Val Val Ala 595 600 605

Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe His Leu Met Leu Leu Ala Gly Cys ±16

610 615 620

íle 625

Lys

Tyr

Gly

Arg

Gly 630

Glu

Asn

íle

Tyr

Asp 635

Ala

Phe

Val

íle

Tyr 640

Ser

Gin

Asp

Glu 645

Asp

Trp

Val

Arg

Asn 650

Glu

Leu

Val

Lys

Asn 655

Leu

Glu

Gly

Val 660

Pro

Phe

Gin

Leu 665

Cys

Leu

His

Tyr

Arg 670

Asp

Phe

íle

Pro

Gly 675

Val

Ala

íle

Ala

Ala 680

Asn

íle

His

Glu 685

Gly

Phe

His

Lys

Ser 690

Arg

Lys

Val

íle

Val 695

Val

Ser

Gin

His 700

Phe

íle

Gin

Ser

Arg 705

Trp

Cys

íle

Phe

Glu 710

Tyr

Glu

íle

Ala

Gin 715

Thr

Trp

Gin

Phe

Leu 720

Ser

Arg

Ala

Gly 725

íle

Phe

íle

Val 730

Leu

Gin

Lys

Val

Glu 735

Lys

Thr

Leu

Arg 740

Gin

Val

Glu

Leu 745

Tyr

Arg

Leu

Ser 750

Arg

Asn

Thr

Tyr

Leu 755

Glu

Trp

Glu

Asp

Ser 760

Val

Leu

Gly

Arg

His 765

íle

Phe

Trp

Arg

Arg 770

Leu

Arg

Lys

Ala

Leu 775

Leu

Asp

Gly

Lys

Ser 780

Trp

Asn

Pro

Glu

Gly 785

Thr

Val

Gly

Thr

Gly 790

Cys

Asn

Trp

Gin

Glu 795

Ala

Thr

Ser

íle

2) Informácie o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1275 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..1095 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 9

117

ACT

GCA

TTA

AGG

GGA

CTA

AGC

CTC

AAC

TCC

AAC

AGG

CTG

ACA

GTT

CTT

144

Thr

Ala

Leu

Arg

Gly

Leu

Ser

Leu

Asn

Ser

Asn

Arg

Leu

Thr

Val

Leu

35

40

45

TCT

CAC

AAT

GAT

TTA

CCT

GCT

AAT

TTA

GAG

ATC

CTG

GAC

ATA

TCC

AGG

192

Ser

His

Asn

Asp

Leu

Pro

Ala

Asn

Leu

Glu

íle

Leu

Asp

íle

Ser

Arg

50

55

60

AAC

CAG

CTC

CTA

GCT

CCT

AAT

CCT

GAT

GTA

TTT

GTA

TCA

CTT

AGT

GTC

240

Asn

Gin

Leu

Ala

Pro

Asn

Pro

Asp

Val

Phe

Val

Ser

Leu

Ser

Val

65

70

75

80

TTG

GAT

ATA

ACT

CAT

AAC

AAG

TTC

ATT

TGT

GAA

TGT

GAA

CTT

AGC

ACT

288

Leu

Asp

íle

Thr

His

Asn

Lys

Phe

íle

Cys

Glu

Cys

Glu

Leu

Ser

Thr

85

90

95

TTT

ATC

AAT

TGG

CTT

AAT

CAC

ACC

AAT

GTC

ACT

ATA

GCT

GGG

CCT

336

Phe

íle

Asn

Trp

Leu

Asn

His

Thr

Asn

Val

Thr

íle

Ala

Gly

Pro

100

105

110

GCA

GAC

ATA

TAT

TGT

GTG

TAC

CCT

GAC

TCG

TTC

TCT

GGG

GTT

TCC

CTC

384

Ala

Asp

íle

Tyr

Cys

Val

Tyr

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Val

Ser

Leu

115

120

125

TTC

TCT

CTT

TCC

ACG

GAA

GGT

TGT

GAT

GAA

GAG

GAA

GTC

TTA

AAG

TCC

432

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Glu

Gly

Cys

Asp

Glu

Val

Leu

Lys

Ser

130

135

140

CTA

AAG

TTC

TCC

CTT

TTC

ATT

GTA

TGC

ACT

GTC

ACT

CTG

ACT

CTG

TTC

480

Leu

Lys

Phe

Ser

Leu

Phe

íle

Val

Cys

Thr

Val

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

145

150

155

160

CTC

ATG

ACC

ATC

CTC

ACA

GTC

ACA

AAG

TTC

CGG

GGC

TTC

TGT

TTT

ATC

528

Leu

Met

Thr

íle

Leu

Thr

Val

Thr

Lys

Phe

Arg

Gly

Phe

Cys

Phe

íle

165

170

175

TGT

TAT

AAG

ACA

GCC

CAG

AGA

CTG

GTG

TTC

AAG

GAC

CAT

CCC

CAG

GGC

576

Cys

Tyr

Lys

Thr

Ala

Gin

Arg

Leu

Val

Phe

Lys

Asp

His

Pro

Gin

Gly

180

185

190

ACA

GAA

CCT

GAT

ATG

TAC

AAA

TAT

GAT

GCC

TAT

TTG

TGC

TTC

AGC

624

Thr

Glu

Pro

Asp

Met

Tyr

Lys

Tyr

Asp

Ala

Tyr

Leu

Cys

Phe

Ser

195

200

205

AAA

GAC

TTC

ACA

TGG

GTG

CAG

AAT

GCT

TTG

CTC

AAA

CAC

CTG

GAC

ACT '

672

Lys

Asp

Phe

Thr

Trp

Val

Gin

Asn

Ala

Leu

Lys

His

Leu

Asp

Thr

210

215

220

CAA

TAC

AGT

GAC

CAA

AAC

AGA

TTC

AAC

CTG

TGC

TTT

GAA

AGA

GAC

720

Gin

Tyr

Ser

Asp

Gin

Asn

Arg

Phe

Asn

Leu

Cys

Phe

Glu

Arg

Asp

225

230

235

240

TTT

GTC

CCA

GGA

GAA

AAC

CGC

ATT

GCC

AAT

ATC

CAG

GAT

GCC

ATC

TGG

768

Phe

Val

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

íle

Ala

Asn

íle

Gin

Asp

Ala

íle

Trp

245

250

255

AAC

AGT

AGA

AAG

ATC

GTT

TGT

CTT

GTG

AGC

AGA

CAC

TTC

CTT

AGA

GAT

816

Asn

Ser

Arg

Lys

íle

Val

Cys

Leu

Val

Ser

Arg

His

Phe

Leu

Arg

Asp

260

265

270

GGC

TGG

TGC

CTT

GAA

GCC

TTC

AGT

TAT

GCC

CAG

GGC

AGG

TGC

TTA

TCT

864

118

Gly

Trp

Cys 275

Leu

Glu

Ala

Phe

Ser 280

Tyr

Ala

Gin

Gly Arg 285

Cys

Leu

Ser

GAC

CTT

AAC

AGT

GCT

CTC

ATC

ATG

GTG

GTT

GGG

TCC

TTG

TCC

CAG

912

Asp

Leu 290

Asn

Ser

Ala

Leu

íle 295

Met

Val

Gly 300

Ser

Leu

Ser

Gin

TAC

CAG

TTG

ATG

AAA

CAT

CAA

TCC

ATC

AGA

GGC

TTT

GTA

CAG

AAA

CAG

960

Tyr 305

Gin

Leu

Met

Lys

His 310

Gin

Ser

íle

Arg

Gly 315

Phe

Val

Gin

Lys

Gin 320-

CAG

TAT

TTG

AGG

TGG

CCT

GAG

GAT

CTC

CAG

GAT

GTT

GGC

TGG

TTT

CTT

1008

Gin

Tyr

Leu

Arg

Trp 325

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin 330

Asp

Val

Gly

Trp

Phe 335

Leu

CAT

AAA

CTC

TCT

CAA

CAG

ATA

CTA

AAG

AAA

GAA

AAG

GAA

AAG

AAA

1056

His

Lys

Leu

Ser 340

Gin

íle

Leu

Lys 345

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys 350

Lys

GAC Asp

AAT Asn

AAC Asn

ATT íle

CCG Pro

TTG Leu

CAA Gin

ACT Thr

GTA Val

GCA Ala

ACC Thr

ATC íle

TCC Ser

TAATCAAAGG

1105

355 360 365

AGCAATTTCC	AACTTATCTC	AAGCCACAAA	TAACTCTTCA	CTTTGTATTT	GCACCAAGTT	1165
ATCATTTTGG	GGTCCTCTCT	GGAGGTTTTT	TTTTTCTTTT	TGCTACTATG	AAAACAACAT	1225
AAATCTCTCA	ATTTTCGTAT	CAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	TGGCGGCCGC		1275

2) Informácie k SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 365 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 10:

Cys 1

Trp

Asp

Val

Phe 5

Glu

Gly

Leu

Ser

His 10

Leu

Gin

Val

Leu

Tyr 15

Leu

Asn

His

Asn

Tyr 20

Leu

Asn

Ser

Leu

Pro 25

Pro

Gly

Val

Phe

Ser 30

His

Leu

Thr

Ala

Leu 35

Arg

Gly

Leu

Ser

Leu 40

Asn

Ser

Asn

Arg

Leu 45

Thr

Val

Leu

Ser

His 50

Asn

Asp

Leu

Pro

Ala 55

Asn

Leu

Glu

íle

Leu 60

Asp

íle

Ser

Arg

Asn 65

Gin

Leu

Ala

Pro 70

Asn

Pro

Asp

Val

Phe 75

Val

Ser

Leu

Ser

Val 80

Leu

Asp

íle

Thr

His 85

Asn

Lys

Phe

íle

Cys 90

Glu

Cys

Glu

Leu

Ser 95

Thr

Phe

íle

Asn

Trp 100

Leu

Asn

His

Thr

Asn 105

Val

Thr

íle

Ala

Gly 110

Pro

119

Ala	Asp íle Tyr Cys Val Tyr Pro Asp Ser Phe Ser Gly	Val	Ser	Leu
115	120	125
Phe	Ser Leu	Ser Thr Glu Gly Cys	Asp Glu Glu Glu Val	Leu	Lys	Ser
	130	135	140
Leu	Lys Phe	Ser Leu Phe íle Val	Cys Thr Val Thr Leu	Thr	Leu	Phe
145		150	155			160
Leu	Met Thr	íle Leu Thr Val Thr	Lys Phe Arg Gly Phe	Cys	Phe	íle
		165	170		175
Cys	Tyr Lys	Thr Ala Gin Arg Leu	Val Phe Lys Asp His	Pro	Gin	Gly
		180	185	190
Thr	Glu Pro	Asp Met Tyr Lys Tyr	Asp Ala Tyr Leu Cys	Phe	Ser	Ser
	195	200	205
Lys	Asp Phe	Thr Trp Val Gin Asn	Ala Leu Leu Lys His	Leu	Asp	Thr
	210	215	220
Gin	Tyr Ser	Asp Gin Asn Arg Phe	Asn Leu Cys Phe Glu	Glu	Arg	Asp
225		230	235			240
Phe	Val Pro	Gly Glu Asn Arg íle	Ala Asn íle Gin Asp	Ala	íle	Trp
		245	250		255
Asn	Ser Arg	Lys íle Val Cys Leu	Val Ser Arg His Phe	Leu	Arg	Asp
		260	265	270
Gly	Trp Cys	Leu Glu Ala Phe Ser	Tyr Ala Gin Gly Arg	Cys	Leu	Ser
	275	280	285
Asp	Leu Asn	Ser Ala Leu íle Met	Val Val Val Gly Ser	Leu	Ser	Gin
	290	295	300
Tyr	Gin Leu	Met Lys His Gin Ser	íle Arg Gly Phe Val	Gin	Lys	Gin
305		310	315			320
Gin	Tyr Leu	Arg Trp Pro Glu Asp	Leu Gin Asp Val Gly	Trp	Phe	Leu
		325	330		335
His	Lys Leu	Ser Gin Gin íle Leu	Lys Lys Glu Lys Glu	Lys	Lys	Lys
		340	345	350
Asp	Asn Asn	íle Pro Leu Gin Thr	Val Ala Thr íle Ser
	355	360	365
2)	Informácie o SEQ ID NO: 11:
	(i) '	CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 3138 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina

120 (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..3135 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: mat_peptid (B) Pozícia: 67 ..3135 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 11:

ATG TGG ACA CTG AAG AGA

CTA ATT CTT ATC CTT TTT AAC ATA ATC CTA

48

Met Trp Thr Leu Lys

Arg

Leu

íle -15

Leu

íle

Leu Phe

Asn -10

íle

íle Leu

-22

-20

ATT

TCC

AAA

CTC

CTT

GGG

GCT

AGA

TGG

TTT

CCT

AAA

ACT

CTG

CCC

TGT

96

íle

Ser

Lys

Leu

Gly

Ala

Arg

Trp

Phe

Pro

Lys

Thr

Leu

Pro

Cys

-5

1

5

10

GAT

GTC

ACT

CTG

GAT

GTT

CCA

AAG

AAC

CAT

GTG

ATC

GTG

GAC

TGC

ACA

144

Asp

Val

Thr

Leu

Asp

Val

Pro

Lys

Asn

His

Val

íle

Val

Asp

Cys

Thr

15

20

25

GAC

AAG

CAT

TTG

ACA

GAA

ATT

CCT

GGA

GGT

ATT

CCC

ACG

AAC

ACC

ACG

192

Asp

Lys

His

Leu

Thr

Glu

íle

Pro

Gly

íle

Pro

Thr

Asn

Thr

30

35

40

AAC

CTC

ACC

CTC

ACC

ATT

AAC

CAC

ATA

CCA

GAC

ATC

TCC

CCA

GCG

TCC

240

Asn

Leu

Thr

Leu

Thr

íle

Asn

His

íle

Pro

Asp

íle

Ser

Pro

Ala

Ser

45

50

55

TTT

CAC

AGA

CTG

GAC

CAT

CTG

GTA

GAG

ATC

GAT

TTC

AGA

TGC

AAC

TGT

288

Phe

His

Arg

Leu

Asp

His

Leu

Val

Glu

íle

Asp

Phe

Arg

Cys

Asn

Cys

60

65

70

GTA

CCT

ATT

CCA

CTG

GGG

TCA

AAA

AAC

ATG

TGC

ATC

AAG

AGG

CTG

336

Val

Pro

Zle

Pro

Leu

Gly

Ser

Lys

Asn

Met

Cys

íle

Lys

Arg

Leu

75

80

85

90

CAG

ATT

AAA

CCC

AGA

AGC

TTT

AGT

GGA

CTC

ACT

TAT

TTA

AAA

TCC

CTT

384

Gin

Zle

Lys

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gly

Leu

Thr

Tyr

Leu

Lys

Ser

Leu

95

100

105

TAC

CTG

GAT

GGA

AAC

CAG

CTA

GAG

ATA

CCG

CAG

GGC

CTC

CCG

CCT

432

Tyr

Leu

Asp

Gly

Asn

Gin

Leu

Glu

íle

Pro

Gin

Gly

Leu

Pro

110

115

120

AGC

TTA

CAG

CTT

CTC

AGC

CTT

GAG

GCC

AAC

ATC

TTT

TCC

ATC

AGA

480

Ser

Leu

Gin

Leu

Ser

Leu

Glu

Ala

Asn

íle

Phe

Ser

íle

Arg

125

130

135

AAA

GAG

AAT

CTA

ACA

GAA

CTG

GCC

AAC

ATA

GAA

ATA

CTC

TAC

CTG

GGC

528

Lys

Glu

Asn

Leu

Thr

Glu

Leu

Ala

Asn

íle

Glu

íle

Leu

Tyr

Leu

Gly

140

145

150

CAA

AAC

TGT

TAT

CGA

AAT

CCT

TGT

TAT

GTT

TCA

TAT

TCA

ATA

GAG

576

Gin

Asn

Cys

Tyr

Arg

Asn

Pro

Cys

Tyr

Val

Ser

Tyr

Ser

íle

Glu

155

160

165

170

AAA

GAT

GCC

TTC

CTA

AAC

TTG

ACA

AAG

TTA

AAA

GTG

CTC

TCC

CTG

AAA

624

Lys

Asp

Ala

Phe

Leu

Asn

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys

Val

Leu

Ser

Leu

Lys

175 180 185

121

672

GAT

AAC

AAT

GTC

ACA

GCC

GTC

CCT

ACT

GTT

TTG

CCA

TCT

ACT

TTA

ACA

Asp

Asn

Val 190

Thr

Ala

Val

Pro

Thr 195

Val

Leu

Pro

Ser

Thr 200

Leu

Thr

GAA

CTA

TAT

CTC

TAC

AAC

ATG

ATT

GCA

AAA

ATC

CAA

GAA

GAT

Glu

Leu

Tyr 205

Leu

Tyr

Asn

Met 210

íle

Ala

Lys

íle

Gin 215

Glu

Asp

TTT

AAT

AAC

CTC

AAC

CAA

TTA

CAA

ATT

CTT

GAC

CTA

AGT

GGA

AAT

TGC.

Phe

Asn 220

Asn

Leu

Asn

Gin

Leu 225

Gin

íle

Leu

Asp

Leu 230

Ser

Gly

Asn

Cys

CCT

CGT

TGT

TAT

AAT

GCC

CCA

TTT

CCT

TGT

GCG

CCG

TGT

AAA

AAT

Pro 235

Arg

Cys

Tyr

Asn

Ala 240

Pro

Phe

Pro

Cys

Ala 245

Pro

Cys

Lys

Asn

Asn 250

TCT

CCC

CTA

CAG

ATC

CCT

GTA

AAT

GCT

TTT

GAT

GCG

CTG

ACA

GAA

TTA

Ser

Pro

Leu

Gin

íle 255

Pro

Val

Asn

Ala

Phe 260

Asp

Ala

Leu

Thr

Glu 265

Leu

AAA

GTT

TTA

CGT

CTA

CAC

AGT

AAC

TCT

CTT

CAG

CAT

GTG

CCC

CCA

AGA

Lys

Val

Leu

Arg 270

Leu

His

Ser

Asn

Ser 275

Leu

Gin

His

Val

Pro 280

Pro

Arg

TGG

TTT

AAG

AAC

ATC

AAC

AAA

CTC

CAG

GAA

CTG

GAT

CTG

TCC

CAA

AAC

Trp

Phe

Lys 285

Asn

íle

Asn

Lys

Leu 290

Gin

Glu

Leu

Asp

Leu 295

Ser

Gin

Asn

TTC

TTG

GCC

AAA

GAA

ATT

GGG

GAT

GCT

AAA

TTT

CTG

CAT

TTT

CTC

CCC

Phe

Leu 300

Ala

Lys

Glu

íle

Gly 305

Asp

Ala

Lys

Phe

Leu 310

His

Phe

Leu

Pro

AGC

CTC

ATC

CAA

TTG

GAT

CTG

TCT

TTC

AAT

TTT

GAA

CTT

CAG

GTC

TAT

Ser 315

Leu

íle

Gin

Leu

Asp 320

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe 325

Glu

Leu

Gin

Val

Tyr 330

CGT

GCA

TCT

ATG

AAT

CTA

TCA

CAA

GCA

TTT

TCT

TCA

CTG

AAA

AGC

CTG

Arg

Ala

Ser

Met

Asn 335

Leu

Ser

Gin

Ala

Phe 340

Ser

Leu

Lys

Ser 345

Leu

AAA

ATT

CTG

CGG

ATC

AGA

GGA

TAT

GTC

TTT

AAA

GAG

TTG

AAA

AGC

TTT

Lys

íle

Leu

Arg 350

íle

Arg

Gly

Tyr

Val 355

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys 360

Ser

Phe

AAC

CTC

TCG

CCA

TTA

CAT

AAT

CTT

CAA

AAT

CTT

GAA

GTT

CTT

GAT

CTT

Asn

Leu

Ser 365

Pro

Leu

His

Asn

Leu 370

Gin

Asn

Leu

Glu

Val 375

Leu

Asp

Leu

GGC

ACT

AAC

TTT

ATA

AAA

ATT

GCT

AAC

CTC

AGC

ATG

TTT

AAA

CAA

TTT

Gly

Thr 380

Asn

Phe

íle

Lys

íle 385

Ala

Asn

Leu

Ser

Met 390

Phe

Lys

Gin

Phe

AAA

AGA

CTG

AAA

GTC

ATA

GAT

CTT

TCA

GTG

AAT

AAA

ATA

TCA

CCT

TCA

Lys 395

Arg

Leu

Lys

Val

íle 400

Asp

Leu

Ser

Val

Asn 405

Lys

íle

Ser

Pro

Ser 410

GGA

GAT

TCA

AGT

GAA

GTT

GGC

TTC

TGC

TCA

AAT

GCC

AGA

ACT

TCT

GTA

Gly

Asp

Ser

Glu 415

Val

Gly

Phe

Cys

Ser 420

Asn

Ala

Arg

Thr

Ser 425

Val

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

122

CAG GTC CTG GAA Gin Val Leu Glu 435

AGT TGC AGA TTC Ser Cys Arg Phe 450

AGC TGC TAC AAG Ser Cys Tyr Lys 465

TTT TTT GTC AAG Phe Phe Val Lys 480

CTG AAT CTG TCA Leu Asn Leu Ser

GAA AGT TAT GAA CCC Glu Ser Tyr Glu Pro 430

GAT AAG TAT GCA AGG Asp Lys Tyr Ala Arg 445

ATG TCT GTT AAT GAA Met Ser Val Asn Glu 460

AGT AAA AAT AGT ATA Ser Lys Asn Ser íle 475

TCT TTC CTC AAA TGC Ser Phe Leu Lys Cys 495

CTT AAT GGC AGT GAA Leu Asn Gly Ser Glu

510

TTC TCC AAC AAC CGG Phe Ser Asn Asn Arg 525

CTT CAC AAA CTG GAA Leu His Lys Leu Glu

540

CAA TCA GAA GGA ATT Gin Ser Glu Gly íle 555

GTT CTG CAG AAA CTG Val Leu Gin Lys Leu

575

AGC AGG ACC ATG GAG Ser Arg Thr Met Glu

590

AAT CAC TTA GAT GTT Asn His Leu Asp Val 605

TTA TTC AAG AAT CTG Leu Phe Lys Asn Leu

620

TCC CTA AGT TTC TTG Ser Leu Ser Phe Leu 635

CTA AAG AAT CTC TCT Leu Lys Asn Leu Ser

655

AAG AAA CTC CAG TGT

AGT GAG TCT CTT Ser Glu Ser Leu

595

TTA TGG AGA GAA Leu Trp Arg Glu

610

CTA AAA TTA GAG Leu Lys Leu Glu

625

CCT TCT GGA GTT Pro Ser Gly Val 640

TTG GCC AAA AAT Leu Ala Lys Asn

CTA AAG AAC CTG

TTC CAA CCT TTA Phe Gin Pro Leu

515

CTT GAT TTA CTC Leu Asp Leu Leu

530

GTT CTG GAT ATA Val Leu Asp íle

545

ACT CAT ATG CTA Thr His Met Leu 560

ATG ATG AAC GAC Met Met Asn Asp

CAA TTA CAT TAT TTC Gin Leu His Tyr Phe

440

AAA AAC AAA GAG GCT Lys Asn Lys Glu Ala

455

TAT GGG CAG ACC TTG Tyr Gly Gin Thr Leu 470

TCC TCT GAT TTT CAG Ser Ser Asp Phe Gin

485

GGA AAT CTC ATT AGC Gly Asn Leu íle Ser 500

GCA GAG CTG AGA TAT Ala Glu Leu Arg Tyr

520

CAT TCA ACA GCA TTT His Ser Thr Ala Phe

535

AGC AGT AAT AGC CAT Ser Ser Asn Ser His 550

AAC TTT ACC AAG AAC Asn Phe Thr Lys Asn

565

AAT GAC ATC TCT TCC Asn Asp íle Ser Ser 580

AGA ACT CTG GAA TTC Arg Thr Leu Glu Phe

600

GGT GAT AAC AGA TAC Gly Asp Asn Arg Tyr

615

GAA TTA GAC ATC TCT Glu Leu Asp íle Ser 630

TTT GAT GGT ATG CCT Phe Asp Gly Met Pro

645

GGG CTC AAA TCT TTC Gly Leu Lys Ser Phe 660

GAA ACT TTG GAC CTC

AGA TAT 1392

Arg Tyr

TCT TTC 1440

Ser Phe

GAT CTA 1488

Asp Leu CAT CTT 1536

His Leu

490

CAA ACT 1584

Gin Thr

505

TTG GAC 1632

Leu Asp

GAA GAG 1680

Glu Glu

TAT TTT 1728

Tyr Phe

CTA AAG 1776

Leu Lys

570

TCC ACC 1824

Ser Thr

585

AGA GGA 1872

Arg Gly

TTA CAA 1920

Leu Gin

AAA AAT 1968

Lys Asn

CCA AAT 2016

Pro Asn

650

AGT TGG 2064

Ser Trp

665

AGC CAC 2112

123

Lys

Leu

Gin 670

Cys

Leu

Lys

Asn

Leu 675

Glu

Thr

Leu

Asp

Leu 680

Ser

His

AAC

CAA

CTG

ACC

ACT

GTC

CCT

GAG

AGA

TTA

TCC

AAC

TGT

TCC

AGA

AGC

2160

Asn

Gin

Leu 685

Thr

Val

Pro

Glu 690

Arg

Leu

Ser

Asn

Cys 695

Ser

Arg

Ser

CTC

AAG

AAT

CTG

ATT

CTT

AAG

AAT

CAA

ATC

AGG

AGT

CTG

ACG

AAG

2208

Leu

Lys 700

Asn

Leu

íle

Leu

Lys 705

Asn

Gin

íle

Arg 710

Ser

Leu

Thr

Lys

TAT

TTT

CTA

CAA

GAT

GCC

TTC

CAG

TTG

CGA

TAT

CTG

GAT

CTC

AGC

TCA

2256

Tyr 715

Phe

Leu

Gin

Asp

Ala 720

Phe

Gin

Leu

Arg

Tyr 725

Leu

Asp

Leu

Ser

Ser 730

AAT

AAA

ATC

CAG

ATG

ATC

CAA

AAG

ACC

AGC

TTC

CCA

GAA

AAT

GTC

CTC

2304

Asn

Lys

íle

Gin

Met 735

íle

Gin

Lys

Thr

Ser 740

Phe

Pro

Glu

Asn

Val 745

Leu

AAC

AAT

CTG

AAG

ATG

TTG

CTT

TTG

CAT

AAT

CGG

TTT

CTG

TGC

ACC

2352

Asn

Leu

Lys 750

Met

Leu

His 755

His

Asn

Arg

Phe

Leu 760

Cys

Thr

TGT

GAT

GCT

GTG

TGG

TTT

GTC

TGG

GTT

AAC

CAT

ACG

GAG

GTG

ACT

2400

Cys

Asp

Ala 765

Val

Trp

Phe

Val

Trp 770

Trp

Val

Asn

His

Thr 775

Glu

Val

Thr

ATT

CCT

TAC

CTG

GCC

ACA

GAT

GTG

ACT

TGT

GTG

GGG

CCA

GGA

GCA

CAC

2448

Íle

Pro 780

Tyr

Leu

Ala

Thr

Asp 785

Val

Thr

Cys

Val

Gly 790

Pro

Gly

Ala

His

AAG

GGC

CAA

AGT

GTG

ATC

TCC

CTG

GAT

CTG

TAC

ACC

TGT

GAG

TTA

GAT

2496

Lys 795

Gly

Gin

Ser

Val

íle 800

Ser

Leu

Asp

Leu

Tyr 805

Thr

Cys

Glu

Leu

Asp 810

CTG

ACT

AAC

CTG

ATT

CTG

TTC

TCA

CTT

TCC

ATA

TCT

GTA

TCT

CTC

TTT

2544

Leu

Thr

Asn

Leu

íle 815

Leu

Phe

Ser

Leu

Ser 820

íle

Ser

Val

Ser

Leu 825

Phe

CTC

ATG

GTG

ATG

ACA

GCA

AGT

CAC

CTC

TAT

TTC

TGG

GAT

GTG

TGG

2592

Leu

Met

Val

Met 830

Met

Thr

Ala

Ser

His 835

Leu

Tyr

Phe

Trp

Asp 840

Val

Trp

TAT

ATT

TAC

CAT

TTC

TGT

AAG

GCC

AAG

ATA

AAG

GGG

TAT

CAG

CGT

CTA

2640

Tyr

íle

Tyr 845

His

Phe

Cys

Lys

Ala 850

Lys

íle

Lys

Gly

Tyr 855

Gin

Arg

Leu

ATA

TCA

CCA

GAC

TGT

TGC

TAT

GAT

GCT

TTT

ATT

GTG

TAT

GAC

ACT

AAA

2688

íle

Ser 860

Pro

Asp

Cys

Tyr 865

Asp

Ala

Phe

íle

Val 870

Tyr

Asp

Thr

Lys

GAC

CCA

GCT

GTG

ACC

GAG

TGG

GTT

TTG

GCT

GAG

CTG

GTG

GCC

AAA

CTG

2736

Asp 875

Pro

Ala

Val

Thr

Glu 880

Trp

Val

Leu

Ala

Glu 885

Leu

Val

Ala

Lys

Leu 890

GAA

GAC

CCA

AGA

GAG

AAA

CAT

TTT

AAT

TTA

TGT

CTC

GAG

GAA

AGG

GAC

2784

Glu

Asp

Pro

Arg

Glu 895

Lys

His

Phe

Asn

Leu 900

Cys

Leu

Glu

Arg 905

Asp

TGG

TTA

CCA

GGG

CAG

CCA

GTT

CTG

GAA

AAC

CTT

TCC

CAG

AGC

ATA

CAG

2832

Trp

Leu

Pro

Gly

Gin

Pro

Val

Leu

Glu

Asn

Leu

Ser

Gin

Ser

íle

Gin

124

910

915

920

CTT

AGC

AAA

AAG

ACA

GTG

TTT

GTG

ATG

ACA

GAC

AAG

TAT

GCA

AAG

ACT

2880

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Met

Thr

Asp

Lys

Tyr

Ala

Lys

Thr

925

930

935

GAA

AAT

TTT

AAG

ATA

GCA

TTT

TAC

TTG

TCC

CAT

CAG

AGG

CTC

ATG

GAT

2928

Glu

Asn

Phe

Lys

íle

Ala

Phe

Tyr

Leu

Ser

His

Gin

Arg

Leu

Met

Asp

940

945

950

GAA

AAA

GTT

GAT

GTG

ATT

ATC

TTG

ATA

TTT

CTT

GAG

AAG

CCC

TTT

CAG

2976

Glu

Lys

Val

Asp

Val

íle

Leu

íle

Phe

Leu

Glu

Lys

Pro

Phe

Gin

955

960

965

970

AAG

TCC

AAG

TTC

CTC

CAG

CTC

CGG

AAA

AGG

CTC

TGT

GGG

AGT

TCT

GTC

3024

Lys

Ser

Lys

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Lys

Arg

Leu

Cys

Gly

Ser

Val

975

980

985

CTT

GAG

TGG

CCA

ACA

AAC

CCG

CAA

GCT

CAC

CCA

TAC

TTC

TGG

CAG

TGT

3072

Leu

Glu

Trp

Pro

Thr

Asn

Pro

Gin

Ala

His

Pro

Tyr

Phe

Trp

Gin

Cys

990

995

1000

CTA

AAG

AAC

GCC

CTG

GCC

ACA

GAC

AAT

CAT

GTG

GCC

TAT

AGT

CAG

GTG

3120

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Ala

Thr

Asp

Asn

His

Val

Ala

Tyr

Ser

Gin

Val

1005

1010

1015

TTC

AAG

GAA

ACG

GTC

TAG

3138

Phe

Lys

Glu

Thr

Val

1020

2)	Informácie k SEQ ID NO: 12:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
		(A)	DĹŽKA: 1045 aminokyselín
		(B)	TYP: aminokyselina
		(D)	TOPOLÓGIA: lineárna
	(ii)	DRUH MOLEKULY: proteín
	(xi)	POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:	12:
Met	Trp Thr	Leu	Lys Arg Leu íle Leu íle	Leu	Phe	Asn	íle	íle	Leu
-22	-20		-15			-10
íle	Ser Lys	Leu	Leu Gly Ala Arg Trp Phe	Pro	Lys	Thr	Leu	Pro	Cys
	-5		1	5					10
Asp	Val Thr	Leu	Asp Val Pro Lys Asn His	Val	íle	Val	Asp	Cys	Thr
			15 20					25
Asp	Lys His	Leu	Thr Glu íle Pro Gly Gly	íle	Pro	Thr	Asn	Thr	Thr
		30	35				40
Asn	Leu Thr	Leu	Thr íle Asn His íle Pro	Asp	íle	Ser	Pro	Ala	Ser
	45		50			55
Phe	His Arg	Leu	Asp His Leu Val Glu íle	Asp	Phe	Arg	Cys	Asn	Cys
	60		65		70
Val	Pro íle	Pro	Leu Gly Ser Lys Asn Asn	Met	Cys	íle	Lys	Arg	Leu

χ25

80 85

Gin

íle

Lys

Pro

Arg 95

Ser

Phe

Ser

Gly

Leu 100

Thr

Tyr

Leu

Lys

Tyr

Leu

Asp

Gly 110

Asn

Gin

Leu

Glu 115

íle

Pro

Gin

Gly

Leu 120

Ser

Leu

Gin 125

Leu

Ser

Leu

Glu 130

Ala

Asn

Íle

Phe 135

Ser

Lys

Glu 140

Asn

Leu

Thr

Glu

Leu 145

Ala

Asn

íle

Glu

íle 150

Leu

Tyr

Gin 155

Asn

Cys

Tyr

Arg 160

Asn

Pro

Cys

Tyr

Val 165

Ser

Tyr

Ser

Lys

Asp

Ala

Phe

Leu 175

Asn

Leu

Thr

Lys

Leu 180

Lys

Val

Leu

Ser

Asp

Asn

Val 190

Thr

Ala

Val

Pro

Thr 195

Val

Leu

Pro

Ser

Thr 200

Glu

Leu

Tyr 205

Leu

Tyr

Asn

Met 210

íle

Ala

Lys

íle

Gin 215

Glu

Phe

Asn 220

Asn

Leu

Asn

Gin

Leu 225

Gin

íle

Leu

Asp

Leu 230

Ser

Gly

Pro 235

Arg

Cys

Tyr

Asn

Ala 240

Pro

Phe

Pro

Cys

Ala 245

Pro

Cys

Lys

Ser

Pro

Leu

Gin

íle 255

Pro

Val

Asn

Ala

Phe 260

Asp

Ala

Leu

Thr

Lys

Val

Leu

Arg 270

Leu

His

Ser

Asn

Ser 275

Leu

Gin

His

Val

Pro 280

Trp

Phe

Lys 285

Asn

íle

Asn

Lys

Leu 290

Gin

Glu

Leu

Asp

Leu 295

Ser

Phe

Leu 300

Ala

Lys

Glu

íle

Gly 305

Asp

Ala

Lys

Phe

Leu 310

His

Phe

Ser 315

Leu

íle

Gin

Leu

Asp 320

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe 325

Glu

Leu

Gin

Arg

Ala

Ser

Met

Asn 335

Leu

Ser

Gin

Ala

Phe 340

Ser

Leu

Lys

íle

Leu

Arg 350

íle

Arg

Gly

Tyr

Val 355

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys 360

Asn

Leu

Ser 365

Pro

Leu

His

Asn

Leu 370

Gin

Asn

Leu

Glu

Val 375

Leu

Gly

Thr 380

Asn

Phe

íle

Lys

íle 385

Ala

Asn

Leu

Ser

Met 390

Phe

Lys

Lys 395

Arg

Leu

Lys

Val

íle 400

Asp

Leu

Ser

Val

Asn 405

Lys

íle

Ser

	90
Ser 105	Leu
Pro	Pro
íle	Arg
Leu	Gly
íle	Glu 170
Leu 185	Lys
Leu	Thr
Asp	Asp
Asn	Cys
Asn	Asn 250
Glu 265	Leu
Pro	Arg
Gin	Asn
Leu	Pro
Val	Tyr 330
Ser 345	Leu
Ser	Phe
Asp	Leu
Gin	Phe
Pro	Ser

410

126

Gly

Asp

Ser

Glu 415

Val

Gly

Phe

Cys

Ser 420

Asn

Ala

Arg

Thr

Ser 425

Val

Glu

Ser

Tyr

Glu 430

Pro

Gin

Val

Leu

Glu 435

Gin

Leu

His

Tyr

Phe 440

Arg

Tyr

Asp

Lys

Tyr 445

Ala

Arg

Ser

Cys

Arg 450

Phe

Lys

Asn

Lys

Glu 455

Ala

Ser

Phe

Met

Ser 460

Val

Asn

Glu

Ser

Cys 465

Tyr

Lys

Tyr

Gly

Gin 470

Thr

Leu

Asp

Leu

Ser 475

Lys

Asn

Ser

íle

Phe 480

Phe

Val

Lys

Ser

Ser 485

Asp

Phe

Gin

His

Leu 490

Ser

Phe

Leu

Lys

Cys 495

Leu

Asn

Leu

Ser

Gly 500

Asn

Leu

íle

Ser

Gin 505

Thr

Leu

Asn

Gly

Ser 510

Glu

Phe

Gin

Pro

Leu 515

Ala

Glu

Leu

Arg

Tyr 520

Leu

Asp

Phe

Ser

Asn 525

Asn

Arg

Leu

Asp

Leu 530

Leu

His

Ser

Thr

Ala 535

Phe

Glu

Leu

His 540

Lys

Leu

Glu

Val

Leu 545

Asp

íle

Ser

Asn 550

Ser

His

Tyr

Phe

Gin 555

Ser

Glu

Gly

íle

Thr 560

His

Met

Leu

Asn

Phe 565

Thr

Lys

Asn

Leu

Lys 570

Val

Leu

Gin

Lys

Leu 575

Met

Asn

Asp

Asn 580

Asp

íle

Ser

Ser 585

Thr

Ser

Arg

Thr

Met 590

Glu

Ser

Glu

Ser

Leu 595

Arg

Thr

Leu

Glu

Phe 600

Arg

Gly

Asn

His

Leu 605

Asp

Val

Leu

Trp

Arg 610

Glu

Gly

Asp

Asn

Arg 615

Tyr

Leu

Gin

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Lys

Leu

Glu

Leu

Asp

íle

Ser

Lys

Asn

620 625 630

Ser 635

Leu

Ser

Phe

Leu

Pro 640

Ser

Gly

Val

Phe

Asp 645

Gly

Met

Pro

Asn 650

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser 655

Leu

Ala

Lys

Asn

Gly 660

Leu

Lys

Ser

Phe

Ser 665

Trp

Lys

Leu

Gin 670

Cys

Leu

Lys

Asn

Leu 675

Glu

Thr

Leu

Asp

Leu 680

Ser

His

Asn

Gin

Leu 685

Thr

Val

Pro

Glu 690

Arg

Leu

Ser

Asn

Cys 695

Ser

Arg

Ser

Leu

Lys 700

Asn

Leu

íle

Leu

Lys 705

Asn

Gin

íle

Arg 710

Ser

Leu

Thr

Lys

Tyr Phe Leu Gin Asp Ala Phe Gin Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Ser Ser 715 720 725 730

127

Asn	Lys	íle	Gin Met 735	íle Gin Lys Thr Ser Phe Pro Glu Asn Val	Leu
740	745
Asn	Asn	Leu	Lys Met 750	Leu Leu Leu His His 755	Asn Arg Phe Leu Cys 760	Thr
Cys	Asp	Ala 765	Val Trp	Phe Val Trp Trp Val 770	Asn His Thr Glu Val 775	Thr
íle	Pro 780	Tyr	Leu Ala	Thr Asp Val Thr Cys 785	Val Gly Pro Gly Ala 790	His.
Lys 795	Gly	Gin	Ser Val	íle Ser Leu Asp Leu 800	Tyr Thr Cys Glu Leu 805	Asp 810
Leu	Thr	Asn	Leu íle 815	Leu Phe Ser Leu Ser 820	íle Ser Val Ser Leu 825	Phe
Leu	Met	Val	Met Met 830	Thr Ala Ser His Leu 835	Tyr Phe Trp Asp Val 840	Trp
Tyr	íle	Tyr 845	His Phe	Cys Lys Ala Lys íle 850	Lys Gly Tyr Gin Arg 855	Leu
íle	Ser 860	Pro	Asp Cys	Cys Tyr Asp Ala Phe 865	íle Val Tyr Asp Thr 870	Lys
Asp 875	Pro	Ala	Val Thr	Glu Trp Val Leu Ala 880	Glu Leu Val Ala Lys 885	Leu 890
Glu	Asp	Pro	Arg Glu 895	Lys His Phe Asn Leu 900	Cys Leu Glu Glu Arg 905	Asp
Trp	Leu	Pro	Gly Gin 910	Pro Val Leu Glu Asn 915	Leu Ser Gin Ser íle 920	Gin
Leu	Ser	Lys 925	Lys Thr	Val Phe Val Met Thr 930	Asp Lys Tyr Ala Lys 935	Thr
Glu	Asn 940	Phe	Lys íle	Ala Phe Tyr Leu Ser 945	His Gin Arg Leu Met 950	Asp
Glu 955	Lys	Val	Asp Val	íle íle Leu íle Phe 960	Leu Glu Lys Pro Phe 965	Gin 970
Lys	Ser	Lys	Phe Leu 975	Gin Leu Arg Lys Arg 980	Leu Cys Gly Ser Ser 985	Val
Leu	Glu	Trp	Pro Thr 990	Asn Pro Gin Ala His 995	Pro Tyr Phe Trp Gin 1000	Cys
Leu	Lys	Asn Ala Leu 1005	Ala Thr Asp Asn His 1010	Val Ala Tyr Ser Gin 1015	Val

Phe Lys Glu Thr Val 1020

2) Informácie k SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 180 párov báz

128 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..177 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 13:

CTT GGA AAA

CCT Pro

CTT CAG AAG TCT AAG TTT CTT CAG CTC AGG AAG AGA

Leu Gly 1

Lys

Leu 5

Gin

Lys

Ser

Lys

Phe 10

Leu

Gin

Leu Arg

Lys 15

Arg

CTC

TGC

AGG

AGC

TCT

GTC

CTT

GAG

TGG

CCT

GCA

AAT

CCA

CAG

GCT

CAC

Leu

Cys

Arg

Ser

Val

Leu

Glu

Trp

Pro

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

His

20

25

30

CCA

TAC

TTC

TGG

CAG

TGC

CTG

AAA

AAT

GCC

CTG

ACC

ACA

GAC

AAT

CAT

Pro

Tyr

Phe

Trp

Gin

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Thr

Asp

Asn

His

35

40

45

GTG

GCT

TAT

AGT

CAA

ATG

TTC

AAG

GAA

ACA

GTC

TAG

Val

Ala

Tyr

Ser

Gin

Met

Phe

Lys

Glu

Thr

Val

50

55

144

180

2) Informácie k SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 59 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 14:

Leu 1

Gly

Lys

Pro

Leu 5

Gin

Lys

Ser

Lys

Phe 10

Leu

Gin

Leu

Arg

Lys 15

Arg

Leu

Cys

Arg

Ser 20

Ser

Val

Leu

Glu

Trp 25

Pro

Ala

Asn

Pro

Gin 30

Ala

His

Pro

Tyr

Phe 35

Trp

Gin

Cys

Leu

Lys 40

Asn

Ala

Leu

Thr

Thr 45

Asp

Asn

His

Val Ala Tyr Ser Gin Met Phe Lys Glu Thr Val 50 55

129

2) Informácie k SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 990 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 2 ..988 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 15:

G AAT TCC AGA CTT ATA AAC TTG AAA AAT CTC TAT TTG GCC TGG AAC 46

Asn Ser Arg Leu íle Asn Leu Lys Asn Leu Tyr Leu Ala Trp Asn

10 15

TGC

TAT

TTT

AAC

AAA

GTT

TGC

GAG

AAA

ACT

AAC

ATA

GAA

GAT

GGA

GTA

94

Cys

Tyr

Phe

Asn

Lys 20

Val

Cys

Glu

Lys

Thr 25

Asn

íle

Glu

Asp

Gly 30

Val

TTT

GAA

ACG

CTG

ACA

AAT

TTG

GAG

TTG

CTA

TCA

CTA

TCT

TTC

AAT

TCT

142

Phe

Glu

Thr

Leu 35

Thr

Asn

Leu

Glu

Leu 40

Leu

Ser

Leu

Ser

Phe 45

Asn

Ser

CTT

TCA

CAT

GTG

CCA

CCC

AAA

CTG

CCA

AGC

TCC

CTA

CGC

AAA

CTT

TTT

190

Leu

Ser

His 50

Val

Pro

Lys

Leu 55

Pro

Ser

Leu

Arg 60

Lys

Leu

Phe

CTG

AGC

AAC

ACC

CAG

ATC

AAA

TAC

ATT

AGT

GAA

GAT

TTC

AAG

GGA

238

Leu

Ser 65

Asn

Thr

Gin

íle

Lys 70

Tyr

íle

Ser

Glu

Glu 75

Asp

Phe

Lys

Gly

TTG

ATA

AAT

TTA

ACA

TTA

CTA

GAT

TTA

AGC

GGG

AAC

TGT

CCG

AGG

TGC

286

Leu 80

íle

Asn

Leu

Thr

Leu 85

Leu

Asp

Leu

Ser

Gly 90

Asn

Cys

Pro

Arg

Cys 95

TTC

AAT

GCC

CCA

TTT

CCA

TGC

GTG

CCT

TGT

GAT

GGT

GCT

TCA

ATT

334

Phe

Asn

Ala

Pro

Phe 100

Pro

Cys

Val

Pro

Cys 105

Asp

Gly

Ala

Ser 110

íle

AAT

ATA

GAT

CGT

TTT

GCT

TTT

CAA

AAC

TTG

ACC

CAA

CTT

CGA

TAC

CTA

382

Asn

íle

Asp

Arg 115

Phe

Ala

Phe

Gin

Asn 120

Leu

Thr

Gin

Leu

Arg 125

Tyr

Leu

AAC

CTC

TCT

AGC

ACT

TCC

CTC

AGG

AAG

ATT

AAT

GCT

GCC

TGG

TTT

AAA

430

Asn

Leu

Ser 130

Ser

Thr

Ser

Leu

Arg 135

Lys

íle

Asn

Ala

Ala 140

Trp

Phe

Lys

AAT

ATG

CCT

CAT

CTG

AAG

GTG

CTG

GAT

CTT

GAA

TTC

AAC

TAT

TTA

GTG

478

Asn

Met 145

Pro

His

Leu

Lys

Val 150

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe 155

Asn

Tyr

Leu

Val

GGA

GAA

ATA

GCC

TCT

GGG

GCA

TTT

TTA

ACG

ATG

CTG

CCC

CGC

TTA

GAA

526

Gly 160

Glu

íle

Ala

Ser

Gly 165

Ala

Phe

Leu

Thr

Met 170

Leu

Pro

Arg

Leu

Glu 175

130

ΑΤΑ CTT GAC TTG

TCT TTT AAC TAT

ATA AAG

GGG AGT TAT CCA CAG

CAT His

574

íle

Leu

Asp

Leu

Ser 180

Phe

Asn

Tyr

íle

Lys 185

Gly Ser

Tyr

Pro

Gin 190

ATT

AAT

ATT

TCC

AGA

AAC

TTC

TCT

AAA

CTT

TTG TCT

CTA

CGG

GCA

TTG

622

íle

Asn

íle

Ser

Arg

Asn

Phe

Ser

Lys

Leu

Leu Ser

Leu

Arg

Ala

Leu

195

200

205

CAT

TTA

AGA

GGT

TAT

GTG

TTC

CAG

GAA

CTC

AGA

GAA

GAT

TTC

CAG

670

His

Leu

Arg

Gly

Tyr

Val

Phe

Gin

Glu

Leu

Arg

Glu

Asp

Phe

Gin

210

215

220

CCC

CTG

ATG

CAG

CTT

CCA

AAC

TTA

TCG

ACT

ATC

AAC

TTG

GGT

ATT

AAT

718

Pro

Leu

Met

Gin

Leu

Pro

Asn

Leu

Ser

Thr

íle

Asn

Leu

Gly

íle

Asn

225

230

235

TTT

ATT

AAG

CAA

ATC

GAT

TTC

AAA

CTT

TTC

CAA

AAT

TTC

TCC

AAT

CTG

766

Phe

íle

Lys

Gin

íle

Asp

Phe

Lys

Leu

Phe

Gin

Asn

Phe

Ser

Asn

Leu

240

245

250

255

GAA

ATT

TAC

TTG

TCA

GAA

AAC

AGA

ATA

TCA

CCG

TTG

GTA

AAA

GAT

814

Glu

íle

Tyr

Leu

Ser

Glu

Asn

Arg

íle

Ser

Pro

Leu

Val

Lys

Asp

260

265

270

ACC

CGG

CAG

AGT

TAT

GCA

AAT

AGT

TCC

TCT

TTT

CAA

CGT

CAT

ATC

CGG

862

Thr

Arg

Gin

Ser

Tyr

Ala

Asn

Ser

Phe

Gin

Arg

His

íle

Arg

275

280

285

AAA

CGA

CGC

TCA

ACA

GAT

TTT

GAG

TTT

GAC

CCA

CAT

TCG

AAC

TTT

TAT

910

Lys

Arg

Ser

Thr

Asp

Phe

Glu

Phe

Asp

Pro

His

Ser

Asn

Phe

Tyr

290

295

300

CAT

TTC

ACC

CGT

CCT

TTA

ATA

AAG

CCA

CAA

TGT

GCT

TAT

GGA

AAA

958

His

Phe

Thr

Arg

Pro

Leu

íle

Lys

Pro

Gin

Cys

Ala

Tyr

Gly

Lys

305

310

315

GCC

TTA

GAT

TTA

AGC

CTC

AAC

AGT

ATT

TTC

TT

990

Ala

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu

Asn

Ser

íle

Phe

320

325

131

2) Informácie k SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 329 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKÚL Y: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 16:

Asn 1

Ser

Arg

Leu

íle 5

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu 10

Tyr

Leu

Ala

Trp

Asn 15

Cys

Tyr

Phe

Asn

Lys 20

Val

Cys

Glu

Lys

Thr 25

Asn

íle

Glu

Asp

Gly 30

Val

Phe

Glu

Thr

Leu 35

Thr

Asn

Leu

Glu

Leu 40

Leu

Ser

Leu

Ser

Phe 45

Asn

Ser

Leu

Ser

His 50

Val

Pro

Lys

Leu 55

Pro

Ser

Leu

Arg 60

Lys

Leu

Phe

Leu

Ser 65

Asn

Thr

Gin

íle

Lys 70

Tyr

íle

Ser

Glu

Glu 75

Asp

Phe

Lys

Gly

Leu 80

íle

Asn

Leu

Thr

Leu 85

Leu

Asp

Leu

Ser

Gly 90

Asn

Cys

Pro

Arg

Cys 95

Phe

Asn

Ala

Pro

Phe 100

Pro

Cys

Val

Pro

Cys 105

Asp

Gly

Ala

Ser 110

íle

Asn

íle

Asp

Arg 115

Phe

Ala

Phe

Gin

Asn 120

Leu

Thr

Gin

Leu

Arg 125

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser 130

Ser

Thr

Ser

Leu

Arg 135

Lys

íle

Asn

Ala

Ala 140

Trp

Phe

Lys

Asn.

Met 145

Pro

His

Leu

Lys

Val 150

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe 155

Asn

Tyr

Leu

Val

Gly 160

Glu

íle

Ala

Ser

Gly 165

Ala

Phe

Leu

Thr

Met ' 170

Leu

Pro

Arg

Leu

Glu 175

íle

Leu

Asp

Leu

Ser 180

Phe

Asn

Tyr

íle

Lys 185

Gly

Ser

Tyr

Pro

Gin 190

His

íle

Asn

íle

Ser 195

Arg

Asn

Phe

Ser

Lys 200

Leu

Ser

Leu

Arg 205

Ala

Leu

His

Leu

Arg 210

Gly

Tyr

Val

Phe

Gin 215

Glu

Leu

Arg

Glu

Asp 220

Asp

Phe

Gin

Pro

Leu 225

Met

Gin

Leu

Pro

Asn 230

Leu

Ser

Thr

íle

Asn 235

Leu

Gly

íle

Asn

Phe 240

íle

Lys

Gin

íle

Asp 245

Phe

Lys

Leu

Phe

Gin 250

Asn

Phe

Ser

Asn

Leu 255

Glu

132

íle

Tyr

Leu 260

Ser

Glu

Asn

Arg

íle 265

Ser

Pro

Leu

Val

Lys 270

Asp

Thr

Arg

Gin

Ser 275

Tyr

Ala

Asn

Ser

Ser 280

Ser

Phe

Gin

Arg

His 285

íle

Arg

Lys

Arg

Arg 290

Ser

Thr

Asp

Phe

Glu 295

Phe

Asp

Pro

His

Ser 300

Asn

Phe

Tyr

His

Phe 305

Thr

Arg

Pro

Leu

íle 310

Lys

Pro

Gin

Cys

Ala 315

Ala

Tyr

Gly

Lys

Ala 320

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu 325

Asn

Ser

íle

Phe

2) Informácie o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1557 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..513 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 278 (D) Iné informácie: (poznámka=nukleotid 278 označený G, môže byť G alebo C) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 445 (D) Iné informácie: (poznámka=nukleotid 445 označený A, môže byť A alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: miscfeature (B) Pozícia: 572

133 (D) Iné informácie: (poznámka=nukleotidy 572, 593, 600, 607, 617, 622, 625, 631, 640, 646, 653, 719, 775 a 861 sú označené C, každý môže byť A, C, G alebo T) (xii) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 17:

CAG TCT CTT TCC ACA TCC CAA ACT TTC TAT GAT GCT TAC ATT TCT TAT Gin Ser Leu Ser Thr Ser Gin Thr Phe Tyr Asp Ala Tyr íle Ser Tyr

48

1

5

10

15

GAC

ACC

AAA

GAT

GCC

TCT

GTT

ACT

GAC

TGG

GTG

ATA

AAT

GAG

CTG

CGC

96

Asp

Thr

Lys

Asp

Ala

Ser

Val

Thr

Asp

Trp

Val

íle

Asn

Glu

Leu

Arg

20

25

30

TAC

CAC

CTT

GAA

GAG

AGC

CGA

GAC

AAA

AAC

GTT

CTC

CTT

TGT

CTA

GAG

144

Tyr

His

Leu

.Glu

Glu

Ser

Arg

Asp

Lys

Asn

Val

Leu

Cys

Leu

Glu

35

40

45

GAG

AGG

GAT

TGG

GAC

CCG

GGA

TTG

GCC

ATC

GAC

AAC

CTC

ATG

CAG

192

Glu

Arg

Asp

Trp

Asp

Pro

Gly

Leu

Ala

íle

Asp

Asn

Leu

Met

Gin

50

55

60

AGC

ATC

AAC

CAA

AGC

AAG

AAA

ACA

GTA

TTT

GTT

TTA

ACC

AAA

TAT

240

Ser

íle

Asn

Gin

Ser

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Leu

Thr

Lys

Tyr

65

70

75

80

GCA

AAA

AGC

TGG

AAC

TTT

AAA

ACA

GCT

TTT

TAC

TTG

GGC

TTG

CAG

AGG

288

Ala

Lys

Ser

Trp

Asn

Phe

Lys

Thr

Ala

Phe

Tyr

Leu

Gly

Leu

Gin

Arg

85

90

95

CTA

ATG

GGT

GAG

AAC

ATG

GAT

GTG

ATT

ATA

TTT

ATC

CTG

GAG

CCA

336

Leu

Met

Gly

Glu

Asn

Met

Asp

Val

íle

Phe

íle

Leu

Glu

Pro

100

105

110

GTG

TTA

CAG

CAT

TCT

CCG

TAT

TTG

AGG

CTA

CGG

CAG

CGG

ATC

TGT

AAG

384

Val

Leu

Gin

His

Ser

Pro

Tyr

Leu

Arg

Leu

Arg

Gin

Arg

íle

Cys

Lys

115

120

125

AGC

TCC

ATC

CTC

CAG

TGG

CCT

GAC

AAC

CCG

AAG

GCA

GAA

AGG

TTG

TTT

432

Ser

íle

Leu

Gin

Trp

Pro

Asp

Asn

Pro

Lys

Ala

Glu

Arg

Leu

Phe

130

135

140

TGG

CAA

ACT

CTG

AGA

AAT

GTG

GTC

TTG

ACT

GAA

AAT

GAT

TCA

CGG

TAT

480

134

Trp Gin Thr Leu Arg Asn Val Val Leu Thr Glu Asn Asp Ser Arg Tyr

145 150 155 160

AAC AAT ATG TAT GTC GAT TCC ATT AAG CAA TAC TAACTGACGT TAAGTCATGA 533

Asn Asn Met Tyr Val Asp Ser íle Lys Gin Tyr

165 170

TTTCGCGCCA	TAATAAAGAT	GCAAAGGAAT	GACATTTCCG	TATTAGTTAT	CTATTGCTAC	593
GGTAACCAAA	TTACTCCCAA	AAACCTTACG	TCGGTTTCAA	AACAACCACA	TTCTGCTGGC	653
CCCACAGTTT	TTGAGGGTCA	GGAGTCCAGG	CCCAGCATAA	CTGGGTCTTC	TGCTTCAGGG	713
TGTCTCCAGA	GGCTGCAATG	TAGGTGTTCA	CCAGAGACAT	AGGCATCACT	GGGGTCACAC	773
TCCATGTGGT	TGTTTTCTGG	ATTCAATTCC	TCCTGGGCTA	TTGGCCAAAG	GCTATACTCA	833
TGTAAGCCAT	GCGAGCCTAT	CCCACAACGG	CAGCTTGCTT	CATCAGAGCT	AGCAAAAAAG	893
AGAGGTTGCT	AGCAAGATGA	AGTCACAATC	TTTTGTAATC	GAATCAAAAA	AGTGATATCT	953
CATCACTTTG	GCCATATTCT	ATTTGTTAGA	AGTAAACCAC	AGGTCCCACC	AGCTCCATGG	1013
GAGTGACCAC	CTCAGTCCAG	GGAAAACAGC	TGAAGACCAA	GATGGTGAGC	TCTGATTGCT	1073
TCAGTTGGTC	ATCAACTATT	TTCCCTTGAC	TGCTGTCCTG	GGATGGCCGG	CTATCTTGAT	1133
GGATAGATTG	TGAATATCAG	GAGGCCAGGG	ATCACTGTGG	ACCATCTTAG	CAGTTGACCT	1193
AACACATCTT	CTTTTCAATA	TCTAAGAACT	TTTGCCACTG	TGACTAATGG	TCCTAATATT	1253
AAGCTGTTGT	TTATATTTAT	CATATATCTA	TGGCTACATG	GTTATATTAT	GCTGTGGTTG	1313
CGTTCGGTTT	TATTTACAGT	TGCTTTTACA	AATATTTGCT	GTAACATTTG	ACTTCTAAGG	1373
TTTAGATGCC	ATTTAAGAAC	TGAGATGGAT	AGCTTTTAAA	GCATCTTTTA	CTTCTTACCA	1433
TTTTTTAAAA	GTATGCAGCT	AAATTCGAAG	CTTTTGGTCT	ATATTGTTAA	TTGCCATTGC	1493
TGTAAATCTT	AAAATGAATG	AATAAAAATG	TTTCATTTTA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	1553

AAAA 1557

2) Informácie k SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 171 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna

(ii)	DRUH MOLEKULY:	proteín
(xi)	POPIS SEKVENCIE:	SEQIDNO: 18

Gin Ser Leu Ser Thr Ser Gin Thr Phe Tyr Asp Ala Tyr íle Ser Tyr 15 10 15

Asp Thr Lys Asp Ala Šer Val Thr Asp Trp Val íle Asn Glu Leu Arg 20 25 30

13ο

Tyr

His

Leu 35

Glu

Ser

Arg

Asp 40

Lys

Asn

Val

Leu

Leu 45

Cys

Leu

Glu

Arg 50

Asp

Trp

Asp

Pro

Gly 55

Leu

Ala

íle

Asp 60

Asn

Leu

Met

Gin

Ser 65

íle

Asn

Gin

Ser

Lys 70

Lys

Thr

Val

Phe

Val 75

Leu

Thr

Lys

Tyr 80

Ala

Lys

Ser

Trp

Asn 85

Phe

Lys

Thr

Ala

Phe 90

Tyr

Leu

Gly

Leu

Gin 95

Arg

Leu

Met

Gly

Glu 100

Asn

Met

Asp

Val

íle 105

íle

Phe

íle

Leu

Leu 110

Glu

Pro

Val

Leu

Gin 115

His

Ser

Pro

Tyr

Leu 120

Arg

Leu

Arg

Gin

Arg 125

íle

Cys

Lys

Ser

Ser 130

íle

Leu

Gin

Trp

Pro 135

Asp

Asn

Pro

Lys

Ala 140

Glu

Arg

Leu

Phe

Trp 145

Gin

Thr

Leu

Arg

Asn 150

Val

Leu

Thr

Glu 155

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr 160

Asn

Met

Tyr

Val

Asp

Ser

íle

Lys

Gin

Tyr

165 170

2) Informácie ο SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 629 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..486 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 144 (D) Iné informácie: (poznámka=nukleotid 144 a 225 označené C môžu byť C alebo T) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 19:

136

AAT GAA TTG ATC CCC AAT CTA GAG

AAG Lys

GAA GAT GGT

TCT ATC

TTG Leu 15

ATT íle

48

Asn 1

Glu

Leu

íle

Pro 5

Asn

Leu

Glu

Glu 10

Asp

Gly

Ser

íle

TGC

CTT

TAT

GAA

AGC

TAC

TTT

GAC

CCT

GGC

AAA

AGC

ATT

AGT

GAA

AAT

96

Cys

Leu

Tyr

Glu 20

Ser

Tyr

Phe

Asp

Pro 25

Gly

Lys

Ser

íle

Ser 30

Glu

Asn

ATT

GTA

AGC

TTC

ATT

GAG

AAA

AGC

TAT

AAG

TCC

ATC

TTT

GTT

TTG

TCC

144

íle

Val

Ser 35

Phe

íle

Glu

Lys

Ser 40

Tyr

Lys

Ser

íle

Phe 45

Val

Leu

Ser

CCC

AAC

TTT

GTC

CAG

AAT

GAG

TGG

TGC

CAT

TAT

GAA

TTC

TAC

TTT

GCC

192

Pro

Asn 50

Phe

Val

Gin

Asn

Glu 55

Trp

Cys

His

Tyr

Glu 60

Phe

Tyr

Phe

Ala

CAC

AAT

CTC

TTC

CAT

GAA

AAT

TCT

GAT

CAC

ATA

ATT

CTT

ATC

TTA

240

His 65

His

Asn

Leu

Phe

His 70

Glu

Asn

Ser

Asp

His 75

íle

Leu

íle

Leu 80

CTG

GAA

CCC

ATT

CCA

TTC

TAT

TGC

ATT

CCC

ACC

AGG

TAT

CAT

AAA

CTG

288

Leu

Glu

Pro

íle

Pro 85

Phe

Tyr

Cys

íle

Pro 90

Thr

Arg

Tyr

His

Lys 95

Leu

GAA

GCT

CTC

CTG

GAA

AAA

GCA

TAC

TTG

GAA

TGG

CCC

AAG

GAT

AGG

336

Glu

Ala

Leu

Leu 100

Glu

Lys

Ala

Tyr 105

Leu

Glu

Trp

Pro

Lys 110

Asp

Arg

CGT

AAA

TGT

GGG

CTT

TTC

TGG

GCA

AAC

CTT

CGA

GCT

GTT

AAT

GTT

384

Arg

Lys

Cys 115

Gly

Leu

Phe

Trp

Ala 120

Asn

Leu

Arg

Ala

Ala 125

Val

Asn

Val

AAT

GTA

TTA

GCC

ACC

AGA

GAA

ATG

TAT

GAA

CTG

CAG

ACA

TTC

ACA

GAG

432

Asn

Val 130

Leu

Ala

Thr

Arg

Glu 135

Met

Tyr

Glu

Leu

Gin 140

Thr

Phe

Thr

Glu

TTA

AAT

GAA

GAG

TCT

CGA

GGT

TCT

ACA

ATC

TCT

CTG

ATG

AGA

ACA

GAC

480

Leu 145

Asn

Glu

Ser

Arg 150

Gly

Ser

Thr

íle

Ser 155

Leu

Met

Arg

Thr

Asp 160

TGT CTA TAAAATCCCA CAGTCCTTGG GAAGTTGGGG ACCACATACA CTGTTGGGAT 536

Cys Leu

GTACATTGAT ACAACCTTTA TGATGGCAAT TTGACAATAT TTATTAAAAT AAAAAATGGT 596

TATTCCCTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA

629

137

2) Informácie k SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 162 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

Asn 1	Glu	Leu	íle	Pro 5	Asn	Leu	Glu
Cys	Leu	Tyr	Glu 20	Ser	Tyr	Phe	Asp
íle	Val	Ser 35	Phe	íle	Glu	Lys	Ser 40
Pro	Asn 50	Phe	Val	Gin	Asn	Glu 55	Trp
His 65	His	Asn	Leu	Phe	His 70	Glu	Asn
Leu	Glu	Pro	íle	Pro 85	Phe	Tyr	Cys
Glu	Ala	Leu	Leu 100	Glu	Lys	Lys	Ala
Arg	Lys	Cys 115	Gly	Leu	Phe	Trp	Ala 120
Asn	Val 130	Leu	Ala	Thr	Arg	Glu 135	Met
Leu 145	Asn	Glu	Glu	Ser	Arg 150	Gly	Ser

Cys Leu

proteín SEQ ID NO:	20:
Lys	Glu 10	Asp	Gly	Ser	íle	Leu 15	íle
Pro 25	Gly	Lys	Ser	Íle	Ser 30	Glu	Asn
Tyr	Lys	Ser	íle	Phe 45	Val	Leu	Ser
Cys	His	Tyr	Glu 60	Phe	Tyr	Phe	Ala
Ser	Asp	His 75	íle	íle	Leu	íle	Leu 80
íle	Pro 90	Thr	Arg	Tyr	His	Lys 95	Leu
Tyr 105	Leu	Glu	Trp	Pro	Lys 110	Asp	Arg
Asn	Leu	Arg	Ala	Ala 125	Val	Asn	Val
Tyr	Glu	Leu	Gin 140	Thr	Phe	Thr	Glu
Thr	íle	Ser 155	Leu	Met	Arg	Thr	Asp 160

138

2) Informácie o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 427 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..426 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 21:

AAG Lys 1

AAC TCC

AAA GAA

AAC CTC

CAG TTT CAT GCT TTT ATT TCA TAT

AGT Ser

Asn

Ser

Lys

Glu 5

Asn

Leu

Gin

Phe

His 10

Ala

Phe

íle

Ser

Tyr 15

GAA

CAT

GAT

TCT

GCC

TGG

GTG

AAA

AGT

GAA

TTG

GTA

CCT

TAC

CTA

GAA

Glu

His

Asp

Ser

Ala

Trp

Val

Lys

Ser

Glu

Leu

Val

Pro

Tyr

Leu

Glu

20

25

30

AAA

GAA

GAT

ATA

CAG

ATT

TGT

CTT

CAT

GAG

AGA

AAC

TTT

GTC

CCT

GGC

Lys

Glu

Asp

íle

Gin

íle

Cys

Leu

His

Glu

Arg

Asn

Phe

Val

Pro

Gly

35

40

45

AAG

AGC

ATT

GTG

GAA

AAT

ATC

AAC

TGC

ATT

GAG

AAG

AGT

TAC

AAG

Lys

Ser

Íle

Val

Glu

Asn

íle

Asn

Cys

íle

Glu

Lys

Ser

Tyr

Lys

50

55

60

TCC

ATC

TTT

GTT

TTG

TCT

CCC

AAC

TTT

GTC

CAG

AGT

GAG

TGG

TGC

CAT

Ser

Íle

Phe

Val

Leu

Ser

Pro

Asn

Phe

Val

Gin

Ser

Glu

Trp

Cys

His

65

70

75

80

TAC

GAA

CTC

TAT

TTT

GCC

CAT

CAC

AAT

CTC

TTT

CAT

GAA

GGA

TCT

AAT

144

192

240

288

Tyr

Glu

Leu Tyr

Phe 85

Ala His

His

Asn

Leu Phe His Glu 90

Gly

Ser 95

Asn

AAC

TTA

ATC

CTC

ATC

TTA

CTG

GAA

CCC

ATT

CCA

CAG

AAC

AGC

ATT

CCC

Asn

Leu

íle

Leu

íle

Leu

Glu

Pro

íle

Pro

Gin

Asn

Ser

íle

Pro

100

105

110

AAC

AAG

TAC

CAC

AAG

CTG

AAG

GCT

CTC

ATG

ACG

CAG

CGG

ACT

TAT

TTG

Asn

Lys

Tyr

His

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Met

Thr

Gin

Arg

Thr

Tyr

Leu

115

120

125

CAG

TGG

CCC

AAG

GAG

AAA

AGC

AAA

CGT

GGG

CTC

TTT

TGG

GCT

Gin

Trp

Pro

Lys

Glu

Lys

Ser

Lys

Arg

Gly

Leu

Phe

Trp

Ala

130

135

140

A

336

384

426

427

139

2) Informácie k SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 142 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 22:

Lys 1

Asn

Ser

Lys

Glu 5

Asn

Leu

Gin

Phe

His 10

Ala

Phe

íle

Ser

Tyr 15

Ser

Glu

His

Asp

Ser 20

Ala

Trp

Val

Lys

Ser 25

Glu

Leu

Val

Pro

Tyr 30

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp 35

íle

Gin

íle

Cys

Leu 40

His

Glu

Arg

Asn

Phe 45

Val

Pro

Gly

Lys

Ser 50

íle

Val

Glu

Asn

íle 55

íle

Asn

Cys

íle

Glu 60

Lys

Ser

Tyr

Lys

Ser 65

íle

Phe

Val

Leu

Ser 70

Pro

Asn

Phe

Val

Gin 75

Ser

Glu

Trp

Cys

His 80

Tyr

Glu

Leu

Tyr

Phe 85

Ala

His

Asn

Leu 90

Phe

His

Glu

Gly

Ser 95

Asn

Leu

íle

Leu 100

íle

Leu

Glu

Pro 105

íle

Pro

Gin

Asn

Ser 110

íle

Pro

Asn

Lys

Tyr

His

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Met

Thr

Gin

Arg

Thr

Tyr

Leu

115 120 125

Gin Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala 130 135 140

1-χΟ

2) Informácie ο SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 662 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..627 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 54 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 54 a 103 a 345 sú označené C; každý môže byť A, C, G alebo T) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 23:

GCT Ala 1

TCC ACC TGT

GCC TGG CCT GGC

TTC CCT GGC GGG GGC GGC AAA GTG

48

Ser

Thr Cys

Ala 5

Trp

Pro Gly

Phe

Pro 10

Gly Gly

Gly

Lys 15

Val

GGC

GAA

ATG

AGG

ATG

CCC

TGC

CCT

ACG

ATG

CCT

TCG

TGG

TCT

TCG

ACA

96

Gly

Glu

Met

Arg

Met

Pro

Cys

Pro

Thr

Met

Pro

Ser

Trp

Ser

Thr

20

25

30

AAA

CGC

AGA

GCG

CAG

TGG

CAG

ACT

GGG

TGT

ACA

ACG

AGC

TTC

GGG

GGC

144

Lys

Arg

Ala

Gin

Trp

Gin

Thr

Gly

Cys

Thr

Ser

Phe

Gly

35

40

45

AGC

TGG

AGG

AGT

GCC

GTG

GGC

GCT

GGG

CAC

TCC

GCC

TGT

GCC

TGG

AGG

192

Ser

Trp

Arg

Ser

Ala

Val

Gly

Ala

Gly

His

Ser

Ala

Cys

Ala

Trp

Arg

50

55

60

AAC

GCG

ACT

GGC

TGC

CTG

GCA

AAA

CCC

TCT

TTG

AGA

ACC

TGT

GGG

CCT

240

Asn

Ala

Thr

Gly

Cys

Leu

Ala

Lys

Pro

Ser

Leu

Arg

Thr

Cys

Gly

Pro

65

70

75

80

CGG

TCT

ATG

GCA

GCC

GCA

AGA

CGC

TGT

TTG

TGC

TGG

CCC

ACA

CGG

ACC

288

Arg

Ser

Met

Ala

Arg

Cys

Leu

Cys

Trp

Pro

Thr

Arg

Thr

85

90

95

GGG

TCA

GTG

GTC

TCT

TGC

GCG

CCA

GTT

CTC

CTG

GCC

CAG

CGC

336

Gly

Ser

Val

Ser

Cys

Ala

Pro

Val

Leu

Ala

Gin

Arg

100

105

110

CTG

GAA

GAC

CGC

AAG

GAC

GTC

GTG

CTG

GTG

ATC

CTA

ACG

CCT

384

Leu

Glu

Asp

Arg

Lys

Asp

Val

Leu

Val

íle

Leu

Thr

Pro

l«il

115 120 125

GAC

GGC

CAA

GCC

TCC

CGA

CTA

CCC

GAT

GCG

CTG

ACC

AGC

GCC

TCT

GCC

Asp

Gly 130

Gin

Ala

Ser

Arg

Leu 135

Pro

Asp

Ala

Leu

Thr 140

Ser

Ala

Ser

Ala

GCC

AGA

GTG

TCC

TCT

GGC

CCC

ACC

AGC

CCA

GTG

GTC

GCG

CAG

CTT

Ala 145

Arg

Val

Ser

Ser 150

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro 155

Val

Ala

Gin

Leu 160

CTG

AGG

CCA

GCA

TGC

ATG

GCC

CTG

ACC

AGG

GAC

AAC

CAC

TTC

TAT

Leu

Arg

Pro

Ala

Cys 165

Met

Ala·

Leu

Thr

Arg 170

Asp

Asn

His

Phe 175

Tyr

AAC

CGG

AAC

TTC

TGC

CAG

GGA

ACC

CAC

GGC

CGA

ATA

GCC

GTG

AGC

CGG

Asn

Arg

Asn

Phe 180

Cys

Gin

Gly

Thr

His 185

Gly

Arg

íle

Ala

Val 190

Ser

Arg

AAT

CCT

GCA

CGG

TGC

CAC

CTC

CAC

ACA

CAC

CTA

ACA

TAT

GCC

TGC

CTG

Asn

Pro

Ala 195

Arg

Cys

His

Leu

His 200

Thr

His

Leu

Thr

Tyr 205

Ala

Cys

Leu

432

480

528

576

624

ATC TGACCAACAC ATGCTCGCCA CCCTCACCAC ACACC íle

662

142

2) Informácie k SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 209 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 24:

Ala 1	Ser	Thr	Cys	Ala 5	Trp	Pro	Gly
Gly	Glu	Met	Arg 20	Met	Pro	Cys	Pro
Lys	Arg	Arg 35	Ala	Gin	Trp	Gin	Thr 40
Ser	Trp 50	Arg	Ser	Ala	Val	Gly 55	Ala
Asn 65	Ala	Thr	Gly	Cys	Leu 70	Ala	Lys
Arg	Ser	Met	Ala	Ala 85	Ala	Arg	Arg
Gly	Ser	Val	Val 100	Ser	Cys	Ala	Pro
Leu	Leu	Glu 115	Asp	Arg	Lys	Asp	Val 120
Asp	Gly 130	Gin	Ala	Ser	Arg	Leu 135	Pro
Ala 145	Arg	Val	Ser	Ser	Ser 150	Gly	Pro
Leu	Arg	Pro	Ala	Cys 165	Met	Ala	Leu
Asn	Arg	Asn	Phe 180	Cys	Gin	Gly	Thr
Asn	Pro	Ala	Arg	Cys	His	Leu	His

195 200

Phe Pro Gly Gly Gly Gly Lys Val 10 15

Thr Met Pro Ser Trp Ser Ser Thr 25 30

Gly Cys Thr Thr Ser Phe Gly Gly 45

Gly His Ser Ala Cys Ala Trp Arg 60

Pro Ser Leu Arg Thr Cys Gly Pro 75 80

Cys Leu Cys Trp Pro Thr Arg Thr 90 95

Val Leu Leu Leu Ala Gin Gin Arg 105 110

Val Val Leu Val íle Leu Thr Pro 125

Asp Ala Leu Thr Ser Ala Ser Ala 140

Thr Ser Pro Val Val Ala Gin Leu 155 160

Thr Arg Asp Asn His His Phe Tyr 170 175

His Gly Arg íle Ala Val Ser Arg 185 190

Thr His Leu Thr Tyr Ala Cys Leu 205 íle

143 (2) Informácie o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 4865 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 107 ..2617 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: mat_peptid (B) Pozícia: 173 ..2617 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 81 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 81, 3144, 3205 a 3563 sú označené A; každý môže byť A, C, G alebo T) (ix) ZNAKY:

3563 sú (ix) môže byť C (ix) (A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 81 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 81, 3144, 3205 a označené A; každý môže byť A, C, G alebo T)

ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 84 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotid 84 je označený C; alebo G)

ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 739

144 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotid 739 je označený C; môže byť C alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 3132 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 3132, 3532, 3538 a 3553 sú označené G; každý môže byť G alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 3638 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotid 3638 je označený A; každý môže byť A alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: miscfeature (B) Pozícia: 3677 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 3677, 3685, 3736 sú označené C; každý môže byť A alebo C) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 25:

AAAATACTCC CTTGCCTCAA AAACTGCTCG GTCAAACGGT GATAGCAAAC CACGCATTCA 60

CAGGGCCACT GCTGCTCACA AAACCAGTGA GGATGATGCC AGGATG ATG TCT GCC 115

Met Ser Ala -22 -20

TCG CGC CTG GCT GGG

ACT Thr

CTG ATC Leu Íle

CCA GCC ATG GCC TTC CTC

TCC Ser -5

TGC Cys

163

Ser Arg Leu Ala

Gly -15

Pro

Ala -10

Met

Ala

Phe

Leu

GTG

AGA

CCA

GAA

AGC

TGG

GAG

CCC

TGC

GTG

GAG

GTT

CCT

AAT

ATT

ACT

211

Val

Arg

Pro

Glu

Ser

Trp

Glu

Pro

Cys

Val

Glu

Val

Pro

Asn

íle

Thr

1

5

10

TAT

CAA

TGC

ATG

GAG

CTG

AAT

TTC

TAC

AAA

ATC

CCC

GAC

AAC

CTC

CCC

259

Tyr

Gin

Cys

Met

Glu

Leu

Asn

Phe

Tyr

Lys

íle

Pro

Asp

Asn

Leu

Pro

15

20

25

TTC

TCA

ACC

AAG

AAC

CTG

GAC

CTG

AGC

TTT

AAT

CCC

CTG

AGG

CAT

TTA

307

Phe

Ser

Thr

Lys

Asn

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Pro

Leu

Arg

His

Leu

30

35

40

45

GGC

AGC

TAT

AGC

TTC

AGT

TTC

CCA

GAA

CTG

CAG

GTG

CTG

GAT

TTA

355

Gly

Ser

Tyr

Ser

Phe

Ser

Phe

Pro

Glu

Leu

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

50

55

60

TCC

AGG

TGT

GAA

ATC

CAG

ACA

ATT

GAA

GAT

GGG

GCA

TAT

CAG

AGC

CTA

403

Ser

Arg

Cys

Glu

Íle

Gin

Thr

íle

Glu

Asp

Gly

Ala

Tyr

Gin

Ser

Leu

65

70

75

AGC

CAC

CTC

TCT

ACC

TTA

ATA

TTG

ACA

GGA

AAC

CCC

ATC

CAG

AGT

TTA

451

Ser

His

Leu

Ser

Thr

Leu

íle

Leu

Thr

Gly

Asn

Pro

íle

Gin

Ser

Leu

85 90

145

GCC CTG

GGA GCC Gly Ala

TTT Phe

TCT GGA CTA TCA AGT TTA CAG AAG

CTG Leu

GTG Val

GCT Ala

499

Ala

Leu 95

Ser Gly 100

Leu

Ser

Leu

Gin 105

Lys

GTG

GAG

ACA

AAT

CTA

GCA

TCT

CTA

GAG

AAC

TTC

CCC

ATT

GGA

CAT

CTC

547

Val

Glu

Thr

Asn

Leu

Ala

Ser

Leu

Glu

Asn

Phe

Pro

íle

Gly

His

Leu

110

115

120

125

AAA

ACT

TTG

AAA

GAA

CTT

AAT

GTG

GCT

CAC

AAT

CTT

ATC

CAA

TCT

TTC

595

Lys

Thr

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Val

Ala

His

Asn

Leu

íle

Gin

Ser

Phe

130

135

140

AAA

TTA

CCT

GAG

TAT

TTT

TCT

AAT

CTG

ACC

AAT

CTA

GAG

CAC

TTG

GAC

643

Lys

Leu

Pro

Glu

Tyr

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr

Asn

Leu

Glu

His

Leu

Asp

145

150

155

CTT

TCC

AGC

AAC

AAG

ATT

CAA

AGT

ATT

TAT

TGC

ACA

GAC

TTG

CGG

GTT

691

Leu

Ser

Asn

Lys

íle

Gin

Ser

íle

Tyr

Cys

Thr

Asp

Leu

Arg

Val

160

165

170

CTA

CAT

CAA

ATG

CCC

CTA

CTC

AAT

CTC

TCT

TTA

GAC

CTG

TCC

CTG

AAC-

739

Leu

His

Gin

Met

Pro

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu

Asn

175

180

185

CCT

ATG

AAC

TTT

ATC

CAA

CCA

GGT

GCA

TTT

AAA

GAA

ATT

AGG

CTT

CAT

787

Pro

Met

Asn

Phe

íle

Gin

Pro

Gly

Ala

Phe

Lys

Glu

íle

Arg

Leu

His

190

195

200

205

AAG

CTG

ACT

TTA

AGA

AAT

TTT

GAT

AGT

TTA

AAT

GTA

ATG

AAA

ACT

835

Lys

Leu

Thr

Leu

Arg

Asn

Phe

Asp

Ser

Leu

Asn

Val

Met

Lys

Thr

210

215

220

TGT

ATT

CAA

GGT

CTG

GCT

GGT

TTA

GAA

GTC

CAT

CGT

TTG

GTT

CTG

GGA

883

Cys

íle

Gin

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Val

His

Arg

Leu

Val

Leu

Gly

225

230

235

GAA

TTT

AGA

AAT

GAA

GGA

AAC

TTG

GAA

AAG

TTT

GAC

AAA

TCT

GCT

CTA

931

Glu

Phe

Arg

Asn

Glu

Gly

Asn

Leu

Glu

Lys

Phe

Asp

Lys

Ser

Ala

Leu

240

245

250

GAG

GGC

CTG

TGC

AAT

TTG

ACC

ATT

GAA

TTC

CGA

TTA

GCA

TAC

TTA

979

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Leu

Thr

íle

Glu

Phe

Arg

Leu

Ala

Tyr

Leu

255

260

265

GAC

TAC

CTC

GAT

ATT

GAC

TTA

TTT

AAT

TGT

TTG

ACA

AAT

1027

Asp

Tyr

Leu

Asp

íle

Asp

Leu

Phe

Asn

Cys

Leu

Thr

Asn

270

275

280

285

GTT

TCT

TCA

TTT

TCC

CTG

GTG

AGT

GTG

ACT

ATT

GAA

AGG

GTA

AAA

GAC

1075

Val

Ser

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Val

Thr

íle

Glu

Arg

Val

Lys

Asp

290

295

300

TTT

TCT

TAT

AAT

TTC

GGA

TGG

CAA

CAT

TTA

GAA

TTA

GTT

AAC

TGT

AAA

1123

Phe

Ser

Tyr

Asn

Phe

Gly

Trp

Gin

His

Leu

Glu

Leu

Val

Asn

Cys

Lys

305

310

315

TTT

GGA

CAG

TTT

CCC

ACA

TTG

AAA

CTC

AAA

TCT

CTC

AAA

AGG

CTT

ACT

1171

Phe

Gly

Gin

Phe

Pro

Thr

Leu

Lys

Leu

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Thr

320

325

330

TTC

ACT

TCC

AAC

AAA

GGT

GGG

AAT

GCT

TTT

TCA

GAA

GTT

GAT

CTA

CCA

1219

Phe

Thr

Ser

Asn

Lys

Gly

Asn

Ala

Phe

Ser

Glu

Val

Asp

Leu

Pro

335

340

345

AGC

CTT

GAG

TTT

CTA

GAT

CTC

AGT

AGA

AAT

GGC

TTG

AGT

TTC

AAA

GGT

1267

Ser

Leu

Glu

Phe

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Asn

Gly

Leu

Ser

Phe

Lys

Gly

350

355

360

365

146

TGC TGT TCT CAA AGT GAT TTT GGG ACA ACC AGC CTA AAG TAT TTA GAT Cys Cys Ser Gin Ser Asp Phe Gly Thr Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Asp

370 375 380

CTG

AGC

TTC

AAT

GGT

GTT

ATT

ACC

ATG

AGT

TCA

AAC

TTC

TTG

GGC

TTA

Leu

Ser

Phe

Asn 385

Gly

Val

íle

Thr

Met 390

Ser

Asn

Phe

Leu 395

Gly

Leu

GAA

CAA

CTA

GAA

CAT

CTG

GAT

TTC

CAG

CAT

TCC

AAT

TTG

AAA

CAA

ATG

Glu

Gin

Leu 400

Glu

His

Leu

Asp

Phe 405

Gin

His

Ser

Asn

Leu 410

Lys

Gin

Met

AGT

GAG

TTT

TCA

GTA

TTC

CTA

TCA

CTC

AGA

AAC

CTC

ATT

TAC

CTT

GAC

Ser

Glu 415

Phe

Ser

Val

Phe

Leu 420

Ser

Leu

Arg

Asn

Leu 425

íle

Tyr

Leu

Asp

ATT

TCT

CAT

ACT

CAC

ACC

AGA

GTT

GCT

TTC

AAT

GGC

ATC

TTC

AAT

GGC

íle 430

Ser

His

Thr

His

Thr 435

Arg

Val

Ala

Phe

Asn 440

Gly

íle

Phe

Asn

Gly 445

TTG

TCC

AGT

CTC

GAA

GTC

TTG

AAA

ATG

GCT

GGC

AAT

TCT

TTC

CAG

GAA

Leu

Ser

Leu

Glu 450

Val

Leu

Lys

Met

Ala 455

Gly

Asn

Ser

Phe

Gin 460

Glu

AAC

TTC

CTT

CCA

GAT

ATC

TTC

ACA

GAG

CTG

AGA

AAC

TTG

ACC

TTC

CTG

Asn

Phe

Leu

Pro 465

Asp

íle

Phe

Thr

Glu 470

Leu

Arg

Asn

Leu

Thr 475

Phe

Leu

GAC

CTC

TCT

CAG

TGT

CAA

CTG

GAG

CAG

TTG

TCT

CCA

ACA

GCA

TTT

AAC

Asp

Leu

Ser 480

Gin

Cys

Gin

Leu

Glu 485

Gin

Leu

Ser

Pro

Thr 490

Ala

Phe

Asn

TCA

CTC

TCC

AGT

CTT

CAG

GTA

CTA

AAT

ATG

AGC

CAC

AAC

TTC

TTT

Ser

Leu 495

Ser

Leu

Gin

Val 500

Leu

Asn

Met

Ser

His 505

Asn

Phe

TCA

TTG

GAT

ACG

TTT

CCT

TAT

AAG

TGT

CTG

AAC

TCC

CTC

CAG

GTT

CTT

Ser 510

Leu

Asp

Thr

Phe

Pro 515

Tyr

Lys

Cys

Leu

Asn 520

Ser

Leu

Gin

Val

Leu 525

GAT

TAC

AGT

CTC

AAT

CAC

ATA

ATG

ACT

TCC

AAA

CAG

GAA

CTA

CAG

Asp

Tyr

Ser

Leu

Asn 530

His

íle

Met

Thr

Ser 535

Lys

Gin

Glu

Leu 540

Gin

CAT

TTT

CCA

AGT

CTA

GCT

TTC

TTA

AAT

CTT

ACT

CAG

AAT

GAC

TTT

His

Phe

Pro

Ser 545

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu 550

Asn

Leu

Thr

Gin

Asn 555

Asp

Phe

GCT

TGT

ACT

TGT

GAA

CAC

CAG

AGT

TTC

CTG

CAA

TGG

ATC

AAG

GAC

CAG

Ala

Cys

Thr 560

Cys

Glu

His

Gin

Ser 565

Phe

Leu

Gin

Trp

íle 570

Lys

Asp

Gin

AGG

CAG

CTC

TTG

GTG

GAA

GTT

GAA

CGA

ATG

GAA

TGT

GCA

ACA

CCT

TCA

Arg

Gin 575

Leu

Val

Glu

Val 580

Glu

Arg

Met

Glu

Cys 585

Ala

Thr

Pro

Ser

GAT

AAG

CAG

GGC

ATG

CCT

GTG

CTG

AGT

TTG

AAT

ATC

ACC

TGT

CAG

ATG

Asp 590

Lys

Gin

Gly

Met

Pro 595

Val

Leu

Ser

Leu

Asn 600

íle

Thr

Cys

Gin

Met 605

AAT

AAG

ACC

ATC

ATT

GGT

GTG

TCG

GTC

CTC

AGT

GTG

CTT

GTA

TCT

Asn

Lys

Thr

íle

íle 610

Gly

Val

Ser

Val

Leu 615

Ser

Val

Leu

Val

Val 620

Ser

GTT

GTA

GCA

GTT

CTG

GTC

TAT

AAG

TTC

TAT

TTT

CAC

CTG

ATG

CTT

1315

1363

1411

1459

1507

1555

1603

1651

1699

1747

1795

1843

1891

1939

1987

2035

2083

147

Val

Ala

Val 625

Leu

Val

Tyr

Lys

Phe 630

Tyr

Phe

His

Leu

Met 635

Leu

GCT

GGC

TGC

ATA

AAG

TAT

GGT

AGA

GGT

GAA

AAC

ATC

TAT

GAT

GCC

TTT

2131

Ala

Gly

Cys 640

íle

Lys

Tyr

Gly

Arg 645

Gly

Glu

Asn

íle

Tyr 650

Asp

Ala

Phe

GTT

ATC

TAC

TCA

AGC

CAG

GAT

GAG

GAC

TGG

GTA

AGG

AAT

GAG

CTA

GTA

2179

Val

íle 655

Tyr

Ser

Gin

Asp 660

Glu

Asp

Trp

Val

Arg 665

Asn

Glu

Leu

Val

AAG

AAT

TTA

GAA

GGG

GTG

CCT

CCA

TTT

CAG

CTC

TGC

CTT

CAC

TAC

2227

Lys 670

Asn

Leu

Glu

Gly 675

Val

Pro

Phe

Gin 680

Leu

Cys

Leu

His

Tyr 685

AGA

GAC

TTT

ATT

CCC

GGT

GTG

GCC

ATT

GCT

GCC

AAC

ATC

CAT

GAA

2275

Arg

Asp

Phe

íle

Pro 690

Gly

Val

Ala

íle

Ala 695

Ala

Asn

íle

His 700

Glu

GGT

TTC

CAT

AAA

AGC

CGA

AAG

GTG

ATT

GTT

GTG

TCC

CAG

CAC

TTC

2323

Gly

Phe

His

Lys 705

Ser

Arg

Lys

Val

íle 710

Val

Ser

Gin 715

His

Phe

ATC

CAG

AGC

CGC

TGG

TGT

ATC

TTT

GAA

TAT

GAG

ATT

GCT

CAG

ACC

TGG

2371

íle

Gin

Ser 720

Arg

Trp

Cys

Íle

Phe 725

Glu

Tyr

Glu

íle

Ala 730

Gin

Thr

Trp

CAG

TTT

CTG

AGC

AGT

CGT

GCT

GGT

ATC

TTC

ATT

GTC

CTG

CAG

AAG

2419

Gin

Phe 735

Leu

Ser

Arg

Ala 740

Gly

íle

Phe

íle 745

Val

Leu

Gin

Lys

GTG

GAG

AAG

ACC

CTG

CTC

AGG

CAG

GTG

GAG

CTG

TAC

CGC

CTT

CTC

2467

Val 750

Glu

Lys

Thr

Leu

Leu 755

Arg

Gin

Val

Glu 760

Leu

Tyr

Arg

Leu

Leu 765

AGC

AGG

AAC

ACT

TAC

CTG

GAG

TGG

GAG

GAC

AGT

GTC

CTG

GGG

CGG

CAC

2515

Ser

Arg

Asn

Thr

Tyr 770

Leu

Glu

Trp

Glu

Asp 775

Ser

Val

Leu

Gly

Arg 780

His

ATC

TTC

TGG

AGA

CGA

CTC

AGA

AAA

GCC

CTG

GAT

GGT

AAA

TCA

TGG

2563

íle

Phe

Trp

Arg 785

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala 790

Leu

Asp

Gly

Lys 795

Ser

Trp

AAT

CCA

GAA

GGA

ACA

GTG

GGT

ACA

GGA

TGC

AAT

TGG

CAG

GAA

GCA

ACA

2611

Asn

Pro

Glu 800

Gly

Thr

Val

Gly

Thr 805

Gly

Cys

Asn

Trp

Gin 810

Glu

Ala

Thr

TCT

ATC

TGAAGAGGAA .

AAATAAAAAC CTCCTGAGGC ATTTCTTGCC

CAGCTGGGTC

2667

Ser íle 815

CAACACTTGT TCAGTTAATA AGTATTAAAT GCTGCCACAT GTCAGGCCTT ATGCTAAGGG 2727

TGAGTAATTC CATGGTGCAC TAGATATGCA GGGCTGCTAA TCTCAAGGAG CTTCCAGTGC 2787

AGAGGGAATA AATGCTAGAC TAAAATACAG AGTCTTCCAG GTGGGCATTT CAACCAACTC 2847

AGTCAAGGAA CCCATGACAA AGAAAGTCAT TTCAACTCTT ACCTCATCAA GTTGAATAAA 2907

GACAGAGAAA ACAGAAAGAG ACATTGTTCT TTTCCTGAGT CTTTTGAATG GAAATTGTAT 2967

148

TATGTTATAG	CCATCATAAA	ACCATTTTGG	TAGTTTTGAC	TGAACTGGGT	GTTCACTTTT	3027
TCCTTTTTGA	TTGAATACAA	TTTAAATTCT	ACTTGATGAC	TGCAGTCGTC	AAGGGGCTCC	3087
TGATGCAAGA	TGCCCCTTCC	attttaagtc	TGTCTCCTTA	CAGAGGTTAA	AGTCTAATGG	3147
CTAATTCCTA	AGGAAACCTG	ATTAACACAT	GCTCACAACC	ATCCTGGTCA	TTCTCGAACA	3207
TGTTCTATTT	TTTAACTAAT	CACCCCTGAT	ATATTTTTAT	TTTTATATAT	CCAGTTTTCA	3267
TTTTTTTACG	TCTTGCCTAT	AAGCTAATAT	CATAAATAAG	GTTGTTTAAG	ACGTGCTTCA	3327
AATATCCATA	TTAACCACTA	TTTTTCAAGG	AAGTATGGAA	AAGTACACTC	TGTCACTTTG	3387
TCACTCGATG	TCATTCCAAA	gttattgcct	ACTAAGTAAT	GACTGTCATG	AAAGCAGCAT	3447
TGAAATAATT	TGTTTAAAGG	GGGCACTCTT	TTAAACGGGA	AGAAAATTTC	CGCTTCCTGG	3507
TCTTATCATG	GACAATTTGG	GCTAGAGGCA	GGAAGGAAGT	GGGATGACCT	CAGGAAGTCA	3567
CCTTTTCTTG	ATTCCAGAAA	CATATGGGCT	GATAAACCCG	GGGTGACCTC	ATGAAATGAG	3627
TTGCAGCAGA	AGTTTATTTT	TTTCAGAACA	AGTGATGTTT	GATGGACCTC	TGAATCTCTT	3687
TAGGGAGACA	CAGATGGCTG	GGATCCCTCC	CCTGTACCCT	TCTCACTGCC	AGGAGAACTA	3747
CGTGTGAAGG	TATTCAAGGC	AGGGAGTATA	CATTGCTGTT	TCCTGTTGGG	CAATGCTCCT	3807
TGACCACATT	TTGGGAAGAG	TGGATGTTAT	CATTGAGAAA	ACAATGTGTC	TGGAATTAAT	3867
GGGGTTCTTA	TAAAGAAGGT	TCCCAGAAAA	GAATGTTCAT	TCCAGCTTCT	TCAGGAAACA	3927
GGAACATTCA	AGGAAAAGGA	CAATCAGGAT	GTCATCAGGG	AAATGAAAAT	AAAAACCACA	3987
ATGAGATATC	ACCTTATACC	AGGTAGATGG	CTACTATAAA	AAAATGAAGT	GTCATCAAGG	4047
ATATAGAGAA	ATTGGAACCC	TTCTTCACTG	CTGGAGGGAA	TGGAAAATGG	TGTAGCCGTT	4107
ATGAAAAACA	GTACGGAGGT	TTCTCAAAAA	TTAAAAATAG	AACTGCTATA	TGATCCAGCA	4167
ATCTCACTTC	TGTATATATA	CCCAAAATAA	TTGAAATCAG	AATTTCAAGA	AAATATTTAC	4227
ACTCCCATGT	TCATTGTGGC	ACTCTTCACA	ATCACTGTTT	CCAAAGTTAT	GGAAACAACC	4287
CAAATTTCCA	TTGGAAAATA	AATGGACAAA	GGAAATGTGC	ATATAACGTA	CAATGGGGAT	4347
ATTATTCAGC	CTAAAAAAAG	GGGGGATCCT	GTTATTTATG	ACAACATGAA	TAAACCCGGA	4407
GGCCATTATG	CTATGTAAAA	TGAGCAAGTA	ACAGAAAGAC	AAATACTGCC	TGATTTCATT	4467
TATATGAGGT	TCTAAAATAG	TCAAACTCAT	AGAAGCAGAG	AATAGAACAG	TGGTTCCTAG	4527
GGAAAAGGAG	GAAGGGAGAA	ATGAGGAAAT	AGGGAGTTGT	CTAATTGGTA	TAAAATTATA	4587
GTATGCAAGA	TGAATTAGCT	CTAAAGATCA	GCTGTATAGC	AGAGTTCGTA	TAATGAACAA	4647
TACTGTATTA	TGCACTTAAC	ATTTTGTTAA	GAGGGTACCT	CTCATGTTAA	GTGTTCTTAC	4707
CATATACATA	TACACAAGGA	AGCTTTTGGA	GGTGATGGAT	ATATTTATTA	CCTTGATTGT	4767
GGTGATGGTT TATGCAGTTT	TGACAGGTAT TATAATATCA	GTGACTATGT aaaaaaaaaa	CTAAACTCAT ΑΑΑΑΑΑΑΑ	CAAATTGTAT	ACATTAAATA	4827 4865

149

2) Informácie k SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 837 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 26:

Met -22

Ser Ala Ser Arg Leu Ala Gly Thr Leu

íle

Pro

Ala -10

Met

Ala

Phe

-20

-15

Leu

Ser

Cys

Val

Arg

Pro

Glu

Ser

Trp

Glu

Pro

Cys

Val

Glu

Val

Pro

-5

1

5

10

Asn

íle

Thr

Tyr

Gin

Cys

Met

Glu

Leu

Asn

Phe

Tyr

Lys

íle

Pro

Asp

15

20

25

Asn

Leu

Pro

Phe

Ser

Thr

Lys

Asn

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Pro

Leu

30

35

40

Arg

His

Leu

Gly

Ser

Tyr

Ser

Phe

Ser

Phe

Pro

Glu

Leu

Gin

Val

45

50

55

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Cys

Glu

íle

Gin

Thr

íle

Glu

Asp

Gly

Ala

Tyr

60

65

70

Gin

Ser

Leu

Ser

His

Leu

Ser

Thr

Leu

íle

Leu

Thr

Gly

Asn

Pro

íle

75

80

85

90

Gin

Ser

Leu

Ala

Leu

Gly

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Gin

Lys

95

100

105

Leu

Val

Ala

Val

Glu

Thr

Asn

Leu

Ala

Ser

Leu

Glu

Asn

Phe

Pro

íle

110

115

120

Gly

His

Leu

Lys

Thr

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Val

Ala

His

Asn

Leu

íle

125

130

135

Gin

Ser

Phe

Lys

Leu

Pro

Glu

Tyr

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr

Asn

Leu

Glu

140

145

150

His

Leu

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

íle

Gin

Ser

íle

Tyr

Cys

Thr

Asp

155

160

165

170

Leu

Arg

Val

Leu

His

Gin

Met

Pro

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Asp

Leu

175

180

185

Ser

Leu

Asn

Pro

Met

Asn

Phe

íle

Gin

Pro

Gly

Ala

Phe

Lys

Glu

íle

190

195

200

Arg

Leu

His

Lys

Leu

Thr

Leu

Arg

Asn

Phe

Asp

Ser

Leu

Asn

Val

205

210

215

Met Lys Thr Cys íle Gin Gly Leu Ala Gly Leu Glu Val His Arg Leu

150

220

225

230

Val

Leu

Gly

Glu

Phe

Arg

Asn

Glu

Gly

Asn

Leu

Glu

Lys

Phe

Asp

Lys

235

240

245

250

Ser

Ala

Leu

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Leu

Thr

íle

Glu

Phe

Arg

Leu

255

260

265

Ala

Tyr

Leu

Asp

Tyr

Leu

Asp

íle

Asp

Leu

Phe

Asn

Cys

270

275

280

Leu

Thr

Asn

Val

Ser

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Val

Thr

íle

Glu

Arg

285

290

295

Val

Lys

Asp

Phe

Ser

Tyr

Asn

Phe

Gly

Trp

Gin

His

Leu

Glu

Leu

Val

300

305

310

Asn

Cys

Lys

Phe

Gly

Gin

Phe

Pro

Thr

Leu

Lys

Leu

Lys

Ser

Leu

Lys

315

320

325

330

Arg

Leu

Thr

Phe

Thr

Ser

Asn

Lys

Gly

Asn

Ala

Phe

Ser

Glu

Val

335

340

345

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Glu

Phe

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Asn

Gly

Leu

Ser

350

355

360

Phe

Lys

Gly

Cys

Ser

Gin

Ser

Asp

Phe

Gly

Thr

Ser

Leu

Lys

365

370

375

Tyr

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Gly

Val

íle

Thr

Met

Ser

Asn

Phe

380

385

390

Leu

Gly

Leu

Glu

Gin

Leu

Glu

His

Leu

Asp

Phe

Gin

His

Ser

Asn

Leu

395

400

405

410

Lys

Gin

Met

Ser

Glu

Phe

Ser

Val

Phe

Leu

Ser

Leu

Arg

Asn

Leu

íle

415

420

425

Tyr

Leu

Asp

íle

Ser

His

Thr

His

Thr

Arg

Val

Ala

Phe

Asn

Gly

íle

430

435

440

Phe

Asn

Gly

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Leu

Lys

Met

Ala

Gly

Asn

Ser

445

450

455

Phe

Gin

Glu

Asn

Phe

Leu

Pro

Asp

íle

Phe

Thr

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

460

465

470

Thr

Phe

Leu

Asp

Leu

Ser

Gin

Cys

Gin

Leu

Glu

Gin

Leu

Ser

Pro

Thr

475

480

485

490

Ala

Phe

Asn

Ser

Leu

Ser

Leu

Gin

Val

Leu

Asn

Met

Ser

His

Asn

495

500

505

Asn

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Phe

Pro

Tyr

Lys

Cys

Leu

Asn

Ser

Leu

510

515

520

Gin

Val

Leu

Asp

Tyr

Ser

Leu

Asn

His

íle

Met

Thr

Ser

Lys

Gin

525

530

535

Glu

Leu

Gin

His

Phe

Pro

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Asn

Leu

Thr

Gin

540

545

550

151

Asn 555

Asp

Phe

Ala

Cys

Thr 560

Cys

Glu

His

Gin

Ser 565

Phe

Leu

Gin

Trp

íle 570

Lys

Asp

Gin

Arg

Gin 575

Leu

Val

Glu

Val 580

Glu

Arg

Met

Glu

Cys 585

Ala

Thr

Pro

Ser

Asp 590

Lys

Gin

Gly

Met

Pro 595

Val

Leu

Ser

Leu

Asn 600

íle

Thr

Cys

Gin

Met 605

Asn

Lys

Thr

íle

íle 610

Gly

Val

Ser

Val

Leu 615

Ser

Val

Leu

Val

Val 620

Ser

Val

Ala

Val 625

Leu

Val

Tyr

Lys

Phe 630

Tyr

Phe

His

Leu

Met 635

Leu

Ala

Gly

Cys 640

íle

Lys

Tyr

Gly

Arg 645

Gly

Glu

Asn

íle

Tyr 650

Asp

Ala

Phe

Val

íle 655

Tyr

Ser

Gin

Asp 660

Glu

Asp

Trp

Val

Arg 665

Asn

Glu

Leu

Val

Lys 670

Asn

Leu

Glu

Gly 675

Val

Pro

Phe

Gin 680

Leu

Cys

Leu

His

Tyr 685

Arg

Asp

Phe

íle

Pro 690

Gly

Val

Ala

íle

Ala 695

Ala

Asn

íle

His

Glu

Gly

Phe

His

Lys

Ser

Arg

Lys

Val

íle

Val

Ser

700 705 710

Gin 715

His

Phe

íle

Gin

Ser 720

Arg

Trp

Cys

íle

Phe 725

Glu

Tyr

Glu

íle

Ala 730

Gin

Thr

Trp

Gin

Phe 735

Leu

Ser

Arg

Ala 740

Gly

íle

Phe

íle 745

Val

Leu

Gin

Lys

Val 750

Glu

Lys

Thr

Leu

Leu 755

Arg

Gin

Val

Glu 760

Leu

Tyr

Arg

Leu

Leu 765

Ser

Arg

Asn

Thr

Tyr 770

Leu

Glu

Trp

Glu

Asp 775

Ser

Val

Leu

Gly

Arg 780

His

íle

Phe

Trp

Arg 785

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala 790

Leu

Asp

Gly

Lys

Ser

Trp

Asn

Pro

Glu

Gly

Thr

Val

Gly

Thr

Gly

Cys

Asn

Trp

Gin

795

800

805

810

Glu Ala Thr Ser íle 815

152

2) Informácie o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 300 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..300 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 186 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 186, 196, 217, 276 a 300 sú označené C; každý môže byť A, C, G alebo T) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 27:

TCC TAT

TCT ATG

GAA Glu 5

AAA GAT GCT TTC CTA TTT

ATG AGA AAT TTG AAG

48

Ser 1

Tyr

Ser

Met

Lys

Asp

Ala

Phe Leu Phe 10

Met

Arg

Asn

Leu 15

Lys

GTT

CTC

TCA

CTA

AAA

GAT

AAC

AAT

GTC

ACA

GCT

GTC

CCC

ACC

ACT

TTG

96

Val

Leu

Ser

Leu

Lys

Asp

Asn

Val

Thr

Ala

Val

Pro

Thr

Leu

20

25

30

CCA

CCT

AAT

TTA

CTA

GAG

CTC

TAT

CTT

TAT

AAC

ÄAT

ATC

ATT

AAG

AAA

144

Pro

Asn

Leu

Glu

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Asn

íle

Lys

35

40

45

ATC

CAA

GAA

AAT

GAT

TTC

AAT

AAC

CTC

AAT

GAG

TTG

CAA

GTC

CTT

GAC

192

Íle

Gin

Glu

Asn

Asp

Phe

Asn

Leu

Asn

Glu

Leu

Gin

Val

Leu

Asp

50

55

60

CTA

CGT

GGA

AAT

TGC

CCT

CGA

TGT

CAT

AAT

GTC

CCA

TAT

CCG

TGT

ACA

240

Leu

Arg

Gly

Asn

Cys

Pro

Arg

Cys

His

Asn

Val

Pro

Tyr

Pro

Cys

Thr

65

70

75

80

CCG

TGT

GAA

AAT

TCC

CCC

TTA

CAG

ATC

CAT

GAC

AAT

GCT

TTC

AAT

288

Pro

Cys

Glu

Asn

Ser

Pro

Leu

Gin

íle

His

Asp

Asn

Ala

Phe

Asn

90 95

TCA TCG ACA GAC Ser Ser Thr Asp

100

300

153

2) Informácie k SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 100 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: (xi) POPIS SEKVENCIE:

proteín

Ser 1	Tyr	Ser	Met	Glu 5	Lys	Asp	Ala
Val	Leu	Ser	Leu 20	Lys	Asp	Asn	Asn
Pro	Pro	Asn 35	Leu	Leu	Glu	Leu	Tyr 40
íle	Gin 50	Glu	Asn	Asp	Phe	Asn 55	Asn
Leu 65	Arg	Gly	Asn	Cys	Pro 70	Arg	Cys
Pro	Cys	Glu	Asn	Asn 85	Ser	Pro	Leu

SEQ ID NO:	28:
Phe	Leu 10	Phe	Met	Arg	Asn	Leu 15	Lys
Val 25	Thr	Ala	Val	Pro	Thr 30	Thr	Leu
Leu	Tyr	Asn	Asn	íle 45	íle	Lys	Lys
Leu	Asn	Glu	Leu 60	Gin	Val	Leu	Asp
His	Asn	Val 75	Pro	Tyr	Pro	Cys	Thr 80
Gin	íle 90	His	Asp	Asn	Ala	Phe 95	Asn

Ser

Ser Thr Asp 100

2) Informácie o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1756 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina

154 (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..1182 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 1643 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotid 1643 je označený A; môže byť A alebo G) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 1664 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotid 1664 je označený C; môže byť A, C, G alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 1680 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 1680 a 1735 sú označené G; môže byť G alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 1719 (D) Iné informácie: (poznámka^ nukleotid 1719 je označený C; môže byť C alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 1727 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotid 1727 je označený A; môže byť A, G alebo T) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 29:

155

TCT

CCA

GAA

ATT

CCC

TGG

AAT

TCC

TTG

CCT

GAG

GTT

TTT

GAG

GGT

48

Ser

Pro

Glu

íle

Pro

Trp

Asn

Ser

Leu

Pro

Glu

Val

Phe

Glu

Gly

1

5

10

15

ATG

CCG

CCA

AAT

CTA

AAG

AAT

CTC

TCC

TTG

GCC

AAA

AAT

GGG

CTC

AAA

96

Met

Pro

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ala

Lys

Asn

Gly

Leu

Lys

20

25

30

TCT

TTC

TTT

TGG

GAC

AGA

CTC

CAG

TTA

CTG

AAG

CAT

TTG

GAA

ATT

TTG

144

Ser

Phe

Trp

Asp

Arg

Leu

Gin

Leu

Lys

His

Leu

Glu

íle

Leu

35

40

45

GAC

CTC

AGC

CAT

AAC

CAG

CTG

ACA

AAA

GTA

CCT

GAG

AGA

TTG

GCC

AAC

192

Asp

Leu

Ser

His

Asn

Gin

Leu

Thr

Lys

Val

Pro

Glu

Arg

Leu

Ala

Asn

50

55

60

TGT

TCC

AAA

AGT

CTC

ACA

CTG

ATT

CTT

AAG

CAT

AAT

CAA

ATC

AGG

240

Cys

Ser

Lys

Ser

Leu

Thr

Leu

íle

Leu

Lys

His

Asn

Gin

íle

Arg

65

70

75

80

CAA

TTG

ACA

AAA

TAT

TTT

CTA

GAA

GAT

GCT

TTG

CAA

TTG

CGC

TAT

CTA

288

Gin

Leu

Thr

Lys

Tyr

Phe

Leu

Glu

Asp

Ala

Leu

Gin

Leu

Arg

Tyr

Leu

85

90

95

GAC

ATC

AGT

TCA

AAT

AAA

ATC

CAG

GTC

ATT

CAG

AAG

ACT

AGC

TTC

CCA

336

Asp

íle

Ser

Asn

Lys

íle

Gin

Val

íle

Gin

Lys

Thr

Ser

Phe

Pro

100

105

110

GAA

AAT

GTC

CTC

AAC

AAT

CTG

GAG

ATG

TTG

GTT

TTA

CAT

CAC

AAT

CGC

384

Glu

Asn

Val

Leu

Asn

Leu

Glu

Met

Leu

Val

Leu

His

Asn

Arg

115

120

125

TTT

CTT

TGC

AAC

TGT

GAT

GCT

GTG

TGG

TTT

GTC

TGG

GTT

AAC

CAT

432

Phe

Leu

Cys

Asn

Cys

Asp

Ala

Val

Trp

Phe

Val

Trp

Val

Asn

His

130

135

140

ACA

GAT

GTT

ACT

ATT

CCA

TAC

CTG

GCC

ACT

GAT

GTG

ACT

TGT

GTA

GGT

480

Thr

Asp

Val

Thr

íle

Pro

Tyr

Leu

Ala

Thr

Asp

Val

Thr

Cys

Val

Gly

145

150

155

160

CCA

GGA

GCA

CAC

AAA

GGT

CAA

AGT

GTC

ATA

TCC

CTT

GAT

CTG

TAT

ACG

528

Pro

Gly

Ala

His

Lys

Gly

Gin

Ser

Val

íle

Ser

Leu

Asp

Leu

Tyr

Thr

165

170

175

TGT

GAG

TTA

GAT

CTC

ACA

AAC

CTG

ATT

CTG

TTC

TCA

GTT

TCC

ATA

TCA

576

Cys

Glu

Leu

Asp

Leu

Thr

Asn

Leu

íle

Leu

Phe

Ser

Val

Ser

íle

Ser

180

185

190

TCA

GTC

CTC

TTT

CTT

ATG

GTA

GTT

ATG

ACA

AGT

CAC

CTC

TTT

TTC

624

Ser

Val

Leu

Phe

Leu

Met

Val

Met

Thr

Ser

His

Leu

Phe

195

200

205

TGG

GAT

ATG

TGG

TAC

ATT

TAT

TTT

TGG

AAA

GCA

AAG

ATA

AAG

GGG

672

Trp

Asp

Met

Trp

Tyr

íle

Tyr

Phe

Trp

Lys

Ala

Lys

íle

Lys

Gly

210

215

220

TAT

CCA

GCA

TCT

GCA

ATC

CCA

TGG

AGT

CCT

TGT

TAT

GAT

GCT

TTT

ATT

720

Tyr

Pro

Ala

Ser

Ala

íle

Pro

Trp

Ser

Pro

Cys

Tyr

Asp

Ala

Phe

íle

225

230

235

240

156

GTG TAT GAC ACT AAA	AAC TCA Asn Ser	GCT GTG ACA GAA TGG GTT TTG CAG	GAG Glu	768
Val	Tyr Asp Thr	Lys 245	Ala	Val	Thr Glu 250	Trp Val	Leu Gin 255
CTG	GTG GCA AAA	TTG	GAA GAT	CCA	AGA	GAA AAA	CAC TTC	AAT TTG	TGT	816
Leu	Val Ala Lys	Leu	Glu Asp	Pro	Arg	Glu Lys	His Phe	Asn Leu	Cys
	260				265			270
CTA	GAA GAA AGA	GAC	TGG CTA	CCA	GGA	CAG CCA	GTT CTA	GAA AAC	CTT.	864
Leu	Glu Glu Arg	Asp	Trp Leu	Pro	Gly	Gin Pro	Val Leu	Glu Asn	Leu
	275			'280			285
TCC	CAG AGC ATA	CAG	CTC AGC	AAA	AAG	ACA GTG	TTT GTG	ATG ACA	CAG	912
Ser	Gin Ser íle	Gin	Leu Ser	Lys	Lys	Thr Val	Phe Val	Met Thr	Gin
	290		295				300
AAA	TAT GCT AAG	ACT	GAG AGT	TTT	AAG	ATG GCA	TTT TAT	TTG TCT	CAT	960
Lys	Tyr Ala Lys	Thr	Glu Ser	Phe	Lys	Met Ala	Phe Tyr	Leu Ser	His
305			310			315			320
CAG	AGG CTC CTG	GAT	GAA AAA	GTG	GAT	GTG ATT	ATC TTG	ATA TTC	TTG	1008
Gin	Arg Leu Leu	Asp	Glu Lys	Val	Asp	Val íle	íle Leu	íle Phe	Leu
		325				330		335
GAA	AGA CCT CTT	CAG	AAG TCT	AAG	TTT	CTT CAG	CTC AGG	AAG AGA	CTC	1056
Glu	Arg Pro Leu	Gin	Lys Ser	Lys	Phe	Leu Gin	Leu Arg	Lys Arg	Leu
	340				345			350
TGC	AGG AGC TCT	GTC	CTT GAG	TGG	CCT	GCA AAT	CCA CAG	GCT CAC	CCA	1104
Cys	Arg Ser Ser	Val	Leu Glu	Trp	Pro	Ala Asn	Pro Gin	Ala His	Pro
	355			360			365
TAC	TTC TGG CAG	TGC	CTG AAA	AAT	GCC	CTG ACC	ACA GAC	AAT CAT	GTG	1152
Tyr	Phe Trp Gin	Cys	Leu Lys	Asn	Ala	Leu Thr	Thr Asp	Asn His	Val
	370		375				380
GCT	TAT AGT CAA	ATG	TTC AAG	GAA	ACA	GTC TAGCTCTCTG AAGAATGTCA	1202
Ala	Tyr Ser Gin	Met	Phe Lys	Glu	Thr	Val

385 390

CCACCTAGGA	CATGCCTTGG	TACCTGAAGT	TTTCATAAAG	GTTTCCATAA	ATGAAGGTCT	1262
GAATTTTTCC	TAACAGTTGT	CATGGCTCAG	ATTGGTGGGA	AATCATCAAT	ATATGGCTAA	1322
GAAATTAAGA	AGGGGAGACT	GATAGAAGAT	AATTTCTTTC	TTCATGTGCC	ATGCTCAGTT	1382
AAATATTTCC	CCTAGCTCAA	ATCTGAAAAA	CTGTGCCTAG	GAGACAACAC	AAGGCTTTGA	1442
TTTATCTGCA	TACAATTGAT	AAGAGCCACA	CATCTGCCCT	GAAGAAGTAC	TAGTAGTTTT	1502
AGTAGTAGGG	TAAAAATTAC	ACAAGCTTTC	TCTCTCTCTG	ATACTGAACT	GTACCAGAGT	1562
TCAATGAAAT	AAAAGCCCAG	AGAACTTCTC	AGTAAATGGT	TTCATTATCA	TGTAGTATCC	1622
ACCATGCAAT	ATGCCACAAA	ACCGCTACTG	GTACAGGACA	GCTGGTAGCT	GCTTCAAGGC	1682
CTCTTATCAT	TTTCTTGGGG	CCCATGGAGG	GGTTCTCTGG	GAAAAAGGGA	AGGTTTTTTT	1742

TGGCCATCCA TGAA

1756

157

2) Informácie k SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 349 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 30:

Ser 1

Pro

Glu

íle

Pro 5

Trp

Asn

Ser

Leu

Pro 10

Pro

Glu

Val

Phe

Glu 15

Gly

Met

Pro

Asn 20

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser 25

Leu

Ala

Lys

Asn

Gly 30

Leu

Lys

Ser

Phe

Phe 35

Trp

Asp

Arg

Leu

Gin 40

Leu

Lys

His

Leu 45

Glu

íle

Leu

Asp

Leu 50

Ser

His

Asn

Gin

Leu 55

Thr

Lys

Val

Pro

Glu 60

Arg

Leu

Ala

Asn

Cys 65

Ser

Lys

Ser

Leu

Thr 70

Thr

Leu

íle

Leu

Lys 75

His

Asn

Gin

íle

Arg 80

Gin

Leu

Thr

Lys

Tyr 85

Phe

Leu

Glu

Asp

Ala 90

Leu

Gin

Leu

Arg

Tyr 95

Leu

Asp

íle

Ser

Ser 100

Asn

Lys

íle

Gin

Val 105

íle

Gin

Lys

Thr

Ser 110

Phe

Pro

Glu

Asn

Val 115

Leu

Asn

Leu

Glu 120

Met

Leu

Val

Leu

His 125

His

Asn

Arg

Phe

Leu 130

Cys

Asn

Cys

Asp

Ala 135

Val

Trp

Phe

Val

Trp 140

Trp

Val

Asn

His

Thr 145

Asp

Val

Thr

íle

Pro 150

Tyr

Leu

Ala

Thr

Asp 155

Val

Thr

Cys

Val

Gly 160

Pro

Gly

Ala

His

Lys 165

Gly

Gin

Ser

Val

íle 170

Ser

Leu

Asp

Leu

Tyr 175

Thr

Cys

Glu

Leu

Asp 180

Leu

Thr

Asn

Leu

íle 185

Leu

Phe

Ser

Val

Ser 190

íle

Ser

Val

Leu 195

Phe

Leu

Met

Val

Val 200

Met

Thr

Ser

His 205

Leu

Phe

Trp

Asp 210

Met

Trp

Tyr

íle

Tyr 215

Tyr

Phe

Trp

Lys

Ala 220

Lys

íle

Lys

Gly

Tyr 225

Pro

Ala

Ser

Ala

íle 230

Pro

Trp

Ser

Pro

Cys 235

Tyr

Asp

Ala

Phe

íle 240

Val

Tyr

Asp

Thr

Lys 245

Asn

Ser

Ala

Val

Thr 250

Glu

Trp

Val

Leu

Gin 255

Glu

Leu Val Ala Lys Leu Glu Asp Pro Arg Glu Lys His Phe Asn Leu Cys

158

260 265 270

Leu Glu Glu Arg Asp Trp Leu Pro Gly Gin Pro Val Leu Glu Asn Leu

275

280

285

Ser

Gin

Ser

íle

Gin

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Met

Thr

Gin

290

295

300

Lys

Tyr

Ala

Lys

Thr

Glu

Ser

Phe

Lys

Met

Ala

Phe

Tyr

Leu

Ser

His

305

310

315

320

Gin

Arg

Leu

Asp

Glu

Lys

Val

Asp

Val

íle

Leu

íle

Phe

Leu

325

330

335

Glu

Arg

Pro

Leu

Gin

Lys

Ser

Lys

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Lys

Arg

Leu

340

345

350

Cys

Arg

Ser

Val

Leu

Glu

Trp

Pro

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

His

Pro

355

360

365

Tyr

Phe

Trp

Gin

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Thr

Asp

Asn

His

Val

370

375

380

Ala

Tyr

Ser

Gin

Met

Phe

Lys

Glu

Thr

Val

385 390

2) Informácie o SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 999 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 2 ..847 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 4 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 4 a 23 sú označené C; každý môže byť A, C, G alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: miscfeature (B) Pozícia: 650

159 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotidy 715, 825 a 845 sú označené C; každý môže byť C alebo T) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 31:

C TCC GAT GCC AAG ATT CGG CAC CAG GCA TAT TCA GAG GTC ATG ATG 46

Ser Asp Ala Lys íle Arg His Gin Ala Tyr Ser Glu Val Met Met

5 10 15

GTT GGA TGG

TCA GAT TCA TAC ACC

TGT GAA TAC CCT TTA AAC CTA AGG

94

Val

Gly Trp

Ser

Asp 20

Ser Tyr Thr

Cys

Glu 25

Tyr

Pro

Leu

Asn

Leu 30

Arg

GGA

ACT

AGG

TTA

AAA

GAC

GTT

CAT

CTC

CAC

GAA

TTA

TCT

TGC

AAC

ACA

142

Gly

Thr

Arg

Leu

Lys

Asp

Val

His

Leu

His

Glu

Leu

Ser

Cys

Asn

Thr

35

40

45

GCT

CTG

TTG

ATT

GTC

ACC

ATT

GTG

GTT

ATT

ATG

CTA

GTT

CTG

GGG

TTG

190

Ala

Leu

íle

Val

Thr

íle

Val

íle

Met

Leu

Val

Leu

Gly

Leu

50

55

60

GCT

GTG

GCC

TTC

TGC

TGT

CTC

CAC

TTT

GAT

CTG

CCC

TGG

TAT

CTC

AGG

238

Ala

Val

Ala

Phe

Cys

Leu

His

Phe

Asp

Leu

Pro

Trp

Tyr

Leu

Arg

65

70

75

ATG

CTA

GGT

CAA

TGC

ACA

CAA

ACA

TGG

CAC

AGG

GTT

AGG

AAA

ACA

ACC

286

Met

Leu

Gly

Gin

Cys

Thr

Gin

Thr

Trp

His

Arg

Val

Arg

Lys

Thr

80

85

90

95

CAA

GAA

CAA

CTC

AAG

AGA

AAT

GTC

CGA

TTC

CAC

GCA

TTT

ATT

TCA

TAC

334

Gin

Glu

Gin

Leu

Lys

Arg

Asn

Val

Arg

Phe

His

Ala

Phe

íle

Ser

Tyr

100

105

110

AGT

GAA

CAT

GAT

TCT

CTG

TGG

GTG

AAG

AAT

GAA

TTG

ATC

CCC

AAT

CTA

382

Ser

Glu

His

Asp

Ser

Leu

Trp

Val

Lys

Asn

Glu

Leu

íle

Pro

Asn

Leu

115

120

125

GAG

AAG

GAA

GAT

GGT

TCT

ATC

TTG

ATT

TGC

CTT

TAT

GAA

AGC

TAC

TTT

430

Glu

Lys

Glu

Asp

Gly

Ser

íle

Leu

íle

Cys

Leu

Tyr

Glu

Ser

Tyr

Phe

130

135

140

GAC

CCT

GGC

AAA

AGC

ATT

AGT

GAA

AAT

ATT

GTA

AGC

TTC

ATT

GAG

AAA

478

Asp

Pro

Gly

Lys

Ser

íle

Ser

Glu

Asn

íle

Val

Ser

Phe

íle

Glu

Lys

145

150

155

AGC

TAT

AAG

TCC

ATC

TTT

GTT

TTG

TCT

CCC

AAC

TTT

GTC

CAG

AAT

GAG

526

Ser

Tyr

Lys

Ser

íle

Phe

Val

Leu

Ser

Pro

Asn

Phe

Val

Gin

Asn

Glu

160

165

170

175

TGG

TGC

CAT

TAT

GAA

TTC

TAC

TTT

GCC

CAC

AAT

CTC

TTC

CAT

GAA

574

Trp

Cys

His

Tyr

Glu

Phe

Tyr

Phe

Ala

His

Asn

Leu

Phe

His

Glu

180

185

190

AAT

TCT

GAT

CAC

ATA

ATT

CTT

ATC

TTA

CTG

GAA

CCC

ATT

CCA

TTC

TAT

622

Asn

Ser

Asp

His

íle

Leu

íle

Leu

Glu

Pro

íle

Pro

Phe

Tyr

195 200 205

160

TGC ATT

CCC ACC AGG

TAT Tyr CCC Pro

CAT AAA CTG GAA GCT CTC CTG GAA AAA AAA

670 718

Cys GCA Ala

íle TAC Tyr 225

Pro 210 TTG Leu

Thr Arg GAA TGG Glu Trp

His AAG Lys 230

Lys 215 GAT Asp

Leu AGG Arg

Glu Ala Leu Leu Glu Lys 220

Lys TGG Trp

CGT Arg

AAA TGT GGG CTT TTC

Lys

Cys 235

Gly

Leu

Phe

GCA

AAC

CTT

CGA GCT

GCT

GTT

AAT

GTT

AAT

GTA

TTA

GCC

ACC

AGA

GAA

766

Ala

Asn

Leu

Arg Ala

Ala

Val

Asn

Val

Asn

Val

Leu

Ala

Thr

Arg

Glu

240

245

250

255

ATG

TAT

GAA

CTG CAG

ACA

TTC

ACA

GAG

TTA

AAT

GAA

GAG

TCT

CGA

GGT

814

Met

Tyr

Glu

Leu Gin

Thr

Phe

Thr

Glu

Leu

Asn

Glu

Ser

Arg

Gly

260

265

270

TCT

ACA

ATC

TCT CTG

ATG

AGA

ACA

GAC

TGT

CTA

TAAAATCCCA CAGTCCTTGG

867

Ser

Thr

íle

Ser Leu

Met

Arg

Thr

Asp

Cys

Leu

275

280

GAAGTTGGGG ACCACATACA CTGTTGGGAT GTACATTGAT

ACAACCTTTA TGATGGCAAT

927

TTGACAATAT TTATTAAAAT AAAAAATGGT TATTCCCTTC

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

987

AAAAAAAAAA AA

999

161

2) Informácie k SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 282 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 32:

Ser 1

Asp

Ala

Lys

íle 5

Arg

His

Gin

Ala

Tyr 10

Ser

Glu

Val

Met

Met 15

Val

Gly

Trp

Ser

Asp 20

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu 25

Tyr

Pro

Leu

Asn

Leu 30

Arg

Gly

Thr

Arg

Leu 35

Lys

Asp

Val

His

Leu 40

His

Glu

Leu

Ser

Cys 45

Asn

Thr

Ala

Leu

Leu 50

íle

Val

Thr

íle

Val 55

Val

íle

Met

Leu

Val 60

Leu

Gly

Leu

Ala

Val 65

Ala

Phe

Cys

Leu 70

His

Phe

Asp

Leu

Pro 75

Trp

Tyr

Leu

Arg

Met 80

Leu

Gly

Gin

Cys

Thr 85

Gin

Thr

Trp

His

Arg 90

Val

Arg

Lys

Thr

Thr 95

Gin

Glu

Gin

Leu

Lys 100

Arg

Asn

Val

Arg

Phe 105

His

Ala

Phe

íle

Ser 110

Tyr

Ser

Glu

His

Asp 115

Ser

Leu

Trp

Val

Lys 120

Asn

Glu

Leu

íle

Pro 125

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu 130

Asp

Gly

Ser

íle

Leu 135

íle

Cys

Leu

Tyr

Glu 140

Ser

Tyr

Phe

Asp

Pro 145

Gly

Lys

Ser

íle

Ser 150

Glu

Asn

íle

Val

Ser 155

Phe

íle

Glu

Lys

Ser 160

Tyr Lys Ser íle Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gin Asn Glu Trp

162

165 170 175

Cys

His

Tyr

Glu

Phe

Tyr

Phe

Ala

His

Asn

Leu

Phe

His

Glu

Asn

180

185

190

Ser

Asp

His

íle

Leu

íle

Leu

Glu

Pro

íle

Pro

Phe

Tyr

Cys

195

200

205

Íle

Pro

Thr

Arg

Tyr

His

Lys

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Lys

Ala

210

215

220

Tyr

Leu

Glu

Trp

Pro

Lys

Asp

Arg

Lys

Cys

Gly

Leu

Phe

Trp

Ala

225

230

235

240

Asn

Leu

Arg

Ala

Val

Asn

Val

Asn

Val

Leu

Ala

Thr

Arg

Glu

Met

245

250

255

Tyr

Glu

Leu

Gin

Thr

Phe

Thr

Glu

Leu

Asn

Glu

Ser

Arg

Gly

Ser

260

265

270

Thr

íle

Ser

Leu

Met

Arg

Thr

Asp

Cys

Leu

275 280

163

2) Informácie o SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1173 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: j ednoreťazco vá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Pozícia: 1 ..1008 (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 854 (D) Iné informácie: (poznámka= nukleotid 854 je označený A; môže byť A alebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Názov/kľúč: misc_feature (B) Pozícia: 1171 (D) Iné informácie: (poznámka= núkleotidy 1171, 1172 sú označené C; každý môže byť A, C, G alebo T) (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 33:

CTG Leu 1

CCT Pro

GCT Ala

GGC Gly

ACC Thr 5

CGG Arg

CTC Leu

CGG Arg

AGG Arg

CTG Leu 10

GAT Asp

GTC Val

AGC Ser

TGC Cys

AAC Asn 15

AGC Ser

ATC íle

AGC Ser

TTC Phe

GTG Val 20

GCC Ala

CCC Pro

GGC Gly

TTC Phe

TTT Phe 25

TCC Ser

AAG Lys

GCC Ala

AAG Lys

GAG Glu 30

CTG Leu

CGA Arg

164

GAG	CTC	AAC	CTT	AGC	GCC	AAC
Glu	Leu	Asn 35	Leu	Ser	Ala	Asn
TTT	GGG	CCC	CTG	GCG	AGT	GCC
Phe	Gly 50	Pro	Leu	Ala	Ser	Ala 55
CCT	CTG	CAC	TGC	GCC	TGT	GGG
Pro 65	Leu	His	Cys	Ala	Cys 70	Gly
GTG	CAG	GCT	GCC	GTG	CCC	GGT
Val	Gin	Ala	Ala	Val 35	Pro	Gly
CCG	GGC	CAG	CTC	CAG	GGC	CTC
Pro	Gly	Gin	Leu 100	Gin	Gly	Leu
TGC	CTG	GAT	GAG	GCC	CTC	TCC
Cys	Leu	Asp 115	Glu	Ala	Leu	Ser
GCT	GTG	GCT	CTG	GGC	CTG	GGT
Ala	Val 130	Ala	Leu	Gly	Leu	Gly 135
TGG	GAC	CTC	TGG	TAC	TGC	TTC
Trp 145	Asp	Leu	Trp	Tyr	Cys 150	Phe
CGG	GGG	CGG	CAA	AGT	GGG	CGA
Arg	Gly	Arg	Gin	Ser 165	Gly	Arg
TTC	GTG	GTC	TTC	GAC	AAA	ACG
Phe	Val	Val	Phe 180	Asp	Lys	Thr
AAC	GAG	CTT	CGG	GGG	CAG	CTG

195

CGC	CTG	TGC	CTG	GAG	GAA	CGC
Arg	Leu 210	Cys	Leu	Glu	Glu	Arg 215
GAG	AAC	CTG	TGG	GCC	TCG	GTC
Glu 225	Asn	Leu	Trp	Ala	Ser 230	Val
CTG	GCC	CAC	ACG	GAC	CGG	GTC
Leu	Ala	His	Thr	Asp 245	Arg	Val
CTG	GCC	CAG	CAG	CGC	CTG	CTG
Leu	Ala	Gin	Gin 260	Arg	Leu	Leu
GTG	ATC	CTG	AGC	CCT	GAC	GGC

CTC AAG ACA GTG GAC CAC TCC TGG 144

Leu Lys Thr Val Asp His Ser Trp 45

CAA ATA CTA GAT GTA AGC GCC AAC 192

Gin íle Leu Asp Val Ser Ala Asn 60

GCC TTT ATG GAC TTC CTG CTG GAG 240

Ala Phe Met Asp Phe Leu Leu Glu75 80

CCC AGC CGG GTG AAG TGT GGC AGT 288

Pro Ser Arg Val Lys Cys Gly Ser 90 95

ATC TTT GCA CAG GAC CTG CGC CTC 336 íle Phe Ala Gin Asp Leu Arg Leu 105 110

GAC TGT TTC GCC CTC TCG CTG CTG 384

Asp Cys Phe Ala Leu Ser Leu Leu 125

CCC ATG CTG CAT CAC CTC TGT GGC 432

Pro Met Leu His His Leu Cys Gly 140

CTG TGC CTG GCC TGG CTT CCC TGG 480

Leu Cys Leu Ala Trp Leu Pro Trp 155 160

GAG GAT GCC CTG CCC TAC GAT GCC 528

Glu Asp Ala Leu Pro Tyr Asp Ala 170 175

AGC GCA GTG GCA GAC TGG GTG TAC 576

Ser Ala Val Ala Asp Trp Val Tyr 185 190

GAG TGC CGT GGG CGC TGG GCA CTC 624

Glu Cys Arg Gly Arg Trp Ala Leu 205

TGG CTG CCT GGC AAA ACC CTC TTT 672

Trp Leu Pro Gly Lys Thr Leu Phe 220

GGC AGC CGC AAG ACG CTG TTT GTG 720

Gly Ser Arg Lys Thr Leu Phe Val 235 240

GGT CTC TTG CGC GCC AGC TTC CTG 768

Gly Leu Leu Arg Ala Ser Phe Leu 250 255

GAC CGC AAG GAC GTC GTG GTG CTG 816

Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu 265 270

CGC TCC CGC TAC GAG CGG CTG CGC 864

165

Val

íle

Leu 275

Ser

Pro

Asp

Gly

Arg 280

Arg

Ser

Arg

Tyr

Glu 285

Arg

Leu

Arg

CAG

CGC

CTC

TGC

CGC

CAG

AGT

GTC

CTC

TGG

CCC

CAC

CAG

CCC

AGT

912

Gin

Arg 290

Leu

Cys

Arg

Gin

Ser 295

Val

Leu

Trp

Pro 300

His

Gin

Pro

Ser

GGT

CAG

CGC

AGC

TTC

TGG

GCC

CAG

CTG

GGC

ATG

GCC

CTG

ACC

AGG

GAC

960

Gly 305

Gin

Arg

Ser

Phe

Trp 310

Ala

Gin

Leu

Gly

Met 315

Ala

Leu

Thr

Arg

Asp 320·

AAC

CAC

TTC

TAT

AAC

CGG

AAC

TTC

TGC

CAG

GGA

CCC

ACG

GCC

GAA

1008

Asn

His

Phe

Tyr 325

Asn

Arg

Asn

Phe

Cys 330

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala 335

Glu

TAGCCGTGAG CCGGAATCCT GCACGGTGCC ACCTCCACAC TCACCTCACC TCTGCCTGCC 1068

TGGTCTGACC CTCCCCTGCT CGCCTCCCTC ACCCCACACC TGACACAGAG CAGGCACTCA 1128

ATAAATGCTA CCGAAGGCTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCA 1173

2) Informácie k SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 336 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 34:

Leu 1

Pro

Ala

Gly

Thr 5

Arg

Leu

Arg

Leu 10

Asp

Val

Ser

Cys

Asn 15

Ser

íle

Ser

Phe

Val 20

Ala

Pro

Gly

Phe

Phe 25

Ser

Lys

Ala

Lys

Glu 30

Leu

Arg

Glu

Leu

Asn 35

Leu

Ser

Ala

Asn

Ala 40

Leu

Lys

Thr

Val

Asp 45

His

Ser

Trp

Phe

Gly 50

Pro

Leu

Ala

Ser

Ala 55

Leu

Gin

íle

Leu

Asp 60

Val

Ser

Ala

Asn

Pro 65

Leu

His

Cys

Ala

Cys 70

Gly

Ala

Phe

Met 75

Asp

Phe

Leu

Glu 80

Val

Gin

Ala

Val 85

Pro

Gly

Leu

Pro

Ser 90

Arg

Val

Lys

Cys

Gly 95

Ser

Pro

Gly

Gin

Leu 100

Gin

Gly

Leu

Ser

íle 105

Phe

Ala

Gin

Asp

Leu 110

Arg

Leu

Cys

Leu

Asp 115

Glu

Ala

Leu

Ser

Trp 120

Asp

Cys

Phe

Ala

Leu 125

Ser

Leu

Ala

Val 130

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly 135

Val

Pro

Met

Leu

His 140

His

Leu

Cys

Gly

Trp Asp Leu Trp Tyr Cys Phe His Leu Cys Leu Ala Trp Leu Pro Trp

16b

145 150 155 160

Arg

Gly

Arg

Gin

Ser 165

Gly

Arg

Asp

Glu

Asp 170

Ala

Leu

Pro

Tyr

Asp 175

Ala

Phe

Val

Phe 180

Asp

Lys

Thr

Gin

Ser 185

Ala

Val

Ala

Asp

Trp 190

Val

Tyr

Asn

Glu

Leu 195

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu 200

Glu

Cys

Arg

Gly

Arg 205

Trp

Ala

Leu

Arg

Leu 210

Cys

Leu

Glu

Arg 215

Asp

Trp

Leu

Pro

Gly 220

Lys

Thr

Leu

Phe

Glu 225

Asn

Leu

Trp

Ala

Ser 230

Val

Tyr

Gly

Ser

Arg 235

Lys

Thr

Leu

Phe

Val 240

Leu

Ala

His

Thr

Asp 245

Arg

Val

Ser

Gly

Leu 250

Leu

Arg

Ala

Ser

Phe 255

Leu

Ala

Gin

Gin 260

Arg

Leu

Glu

Asp 265

Arg

Lys

Asp

Val

Val 270

Val

Leu

Val

íle

Leu 275

Ser

Pro

Asp

Gly

Arg 280

Arg

Ser

Arg

Tyr

Glu 285

Arg

Leu

Arg

Gin

Arg 290

Leu

Cys

Arg

Gin

Ser 295

Val

Leu

Trp

Pro 300

His

Gin

Pro

Ser

Gly 305

Gin

Arg

Ser

Phe

Trp 310

Ala

Gin

Leu

Gly

Met 315

Ala

Leu

Thr

Arg

Asp 320

Asn

His

Phe

Tyr 325

Asn

Arg

Asn

Phe

Cys 330

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala 335

Glu

2) Informácie o SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 497 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQIDNO: 35:

167

TGGCCCACAC	GGACCGCGTC	AGTGGCCTCC	TGCGCACCAG	CTTCCTGCTG	GCTCAGCAGC	60
GCCTGTTGGA	AGACCGCAAG	GACGTGGTGG	TGTTGGTGAT	CCTGCGTCCG	GATGCCCCAC	120
CGTCCCGCTA	TGTGCGACTG	CGCCAGCGTC	TCTGCCGCCA	GAGTGTGCTC	TTCTGGCCCC	180
AGCGACCCAA	CGGGCAGGGG	GGCTTCTGGG	CCCAGCTGAG	TACAGCCCTG	ACTAGGGACA	240
ACCGCCACTT	CTATAACCAG	aacttctgcc	GGGGACCTAC	AGCAGAATAG	CTCAGAGCAA	300
CAGCTGGAAA	CAGCTGCATC	TTCATGTCTG	GTTCCCGAGT	TGCTCTGCCT	GCCTTGCTCT	360
GTCTTACTAC	ACCGCTATTT	GGCAAGTGCG	CAATATATGC	TACCAAGCCA	CCAGGCCCAC	420
GGAGCAAAGG	TTGGCTGTAA	AGGGTAGTTT	TCTTCCCATG	CATCTTTCAG	GAGAGTGAAG	480
ATAGACACCA	AACCCAC					497

y Zr- 99

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR2 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 4.
2. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR3 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 6.
3. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR4 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 26.
4. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR5 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 10.
5. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR6 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 12.
6. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR7 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 16 alebo 18.
7. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR8 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 32.
8. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR9 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 22.
9. V podstate čistý alebo rekombinantný proteín DTLR10 alebo peptid, ktorý vykazuje aspoň približne 85% sekvenčnú zhodu v dĺžke aspoň približne 12 aminokyselín so sekvenciou SEQ ID NO: 34.

169
10. Fuzovaný proteín obsahujúci proteín alebo peptid podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 9.
11. Väzobná látka, ktorá sa špecificky viaže na proteín alebo peptid podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 9.
12. Väzobná látka podľa nároku 11, ktorou je protilátka alebo fragment protilátky.
13. Nukleová kyselina kódujúca proteín alebo peptid podľa nárokov 1 až 9.
14. Expresívny vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 13.
15. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že obsahuje vektor podľa nároku 14.

ló.Spôsob rekombinantne produkujúci polypeptid, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 15 za podmienok, pri ktorých sa polypeptid exprimuje.