CZ376299A3 - V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DLTR2 2 až 10, fúzní protein, vazebná látka, nukleová kyselina, expresívní vektor, hostitelská buňka a způsob jejich produkce - Google Patents

Abstract

Nukleové kyseliny kódující devět lidských receptorů označené receptory 2-10 podobné DNAX Toll (DTLR2-10), kteréjsou homologní s receptoremToll u Drosophila a s lidským receptoremIL· 1. Dále se popisují čištěné proteiny DTLRa jejich fragmenty, monoklonální a poklonální protilátky proti uvedeným receptorůma způsoby diagnostického nebo terapeutického použití.

Description

Oblast vynálezu

Vynález se týká kompozic a způsobů, které ovlivňují fyziologii savců tedy například morfogenezi nebo funkci imunitního systému. Zvláště se popisují nukleové kyseliny, proteiny a protilátky, které regulují vývoj a/nebo imunitní systém. Popisuje se také použití těchto materiálů při diagnostice a terapii.

Dosavadní stav techniky

Technologie rekombinace DNA obecně popisují metody integrace genetické informace pocházející z donoru do vektorů za účelem následného zpracování, které zprostředkovává hostitel do kterého jsou vektory zavedeny. Vytvoří se kopie přenesené genetické informace a/nebo se genetická informace v novém prostředí exprimuje. V běžném případě genetická informace existuje ve formě komplementární DNA (cDNA), která se odvodila od mediátorové RNA (mRNA) kódující požadovaný proteinový produkt. Nosičem je často plazmid, který má kapacitu pro začlenění cDNA pro případ pozdější replikace v hostiteli a v některých případech současně řídí expresi cDNA a tím řídí přímou syntézu kódovaného produktu v hostiteli.

Je známo, že imunitní odezva u savců je založena na sériích komplexních buněčných interakcích, které se nazývají imunitní siť. Současný výzkum umožňuje nový pohled na vnitřní činnost této sítě. Zatímco zůstává zřejmé, že imunitní odezvy se ve skutečnosti točí kolem interakcí lymfocytů, makrofágů, granulocytů a jiných buněk, imunologové se nyní kloní k názoru, že rozpustné proteiny, které jsou známy jako • · lymfokiny, cytokiny nebo monokiny hrají důležitou úlohu při řízení těchto buněčných interakcí. Proto je velký zájem o izolaci, charakterizaci a mechanizmy působení buněčných modulačních faktorů a je nutné pochopit, které z nich jsou podstatné při diagnóze a terapii řady medicínských abnormalit, jako jsou například poruchy imunitního systému.

Lymfokiny zřejmě zprostředkovávají buněčné aktivity různými způsoby. Ukázalo se, že podporují proliferaci, růst a/nebo diferenciaci mnoha potenciálních hematopoetických kmenových buněk velkého počtu progenitorů, které obsahují rozmanité buněčné linie, jenž tvoří komplexní imunitní systém. Správné a rovnovážné interakce mezi buněčnými komponenty jsou v případě zdravé imunitní odezvy nezbytné. V případě, že se lymfokiny aplikují ve spojení s jinými činidly pak často různé buněčné linie odpovídají různým způsobem.

Buněčné linie, které jsou zvláště důležité pro imunitní odezvu, zahrnují dvě třídy lymfocytů: B-buňky, které mohou produkovat a vylučovat imunoglobuliny (proteiny, které jsou schopny rozeznat a navázat cizorodé látky, aby mohly být odstraněny) a T buňky různých subsad, které vylučují lymfokiny a vyvolávají nebo potlačují B buňky a různé jiné buňky (zahrnující jiné T buňky), jenž tvoří imunitní síť. Tyto lymfokiny reagují s řadou jiných buněčných typů.

Jiná důležitá buněčná linie jsou žírné buňky (které se vyskytují ve všech speciích savců), což jsou buňky pojivové tkáně obsahující granule a nacházející se v blízkosti kapilár po celém těle. Tyto buňky se nacházejí ve zvláště vysokých koncentracích v plicích, kůži a v trávicím a v genitourinárním traktu. Žirné buňky mají důležitou úlohu při poruchách spojených s alergiemi, zvláště pak s anafylaxí: když vybrané antigeny se váží na jednu třídu imunoglobulinů vázaných na receptory na povrchu žírných buněk, pak žírné buňky vypouští granule a uvolňují mediátory, jako například histamin, • · · · · · imunitního systému in kultivace řady těchto serotonin, heparin a prostaglandiny, které způsobují alergické reakce, například anafylaxi.

Vážnou překážkou lepšího porozumění a léčby různých vážných poruch imunitního systému je obecná neschopnost udržet buňky vitro. Imunologové zjistily, že buněk lze uskutečnit použitím supernatantů T buněk a jiných buněk, které obsahují různé růstové faktory, mezi něž patří řada lymfokinů.

Proteiny rodiny interleukinu-1 zahrnují IL-la, IL-Ιβ, IL-1RA a IL-Ιγ (také se označují jako faktor indukující interferon gama (IGIF)). Tato rodina genů se účastní řady biologických funkcí (popisuje se v publikacích Dinarello (1994) FASEB J. 8: 13141325; Dinarello (1991) Blood 77: 1627-1652; Okamura et al. (1995) Nátuře 378: 88-91).

Navíc existují různé růstové a regulační faktory, které modulují morfogenní vývoj. Mezi ně například patří ligandy Toll, které signalizují tak, že se naváží na receptory a sdílí strukturální charakteristiku a charakteristiku mechanizmu a rysů receptorů IL-1 (popisuje se například v publikaci Lemaitre et al., (1996) Cell 86: 973-983; Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell. And Devel. Biol. 12: 393-416).

Z předcházejícího textu je zřejmé, že objev a vývoj nových rozpustných proteinů a jejich receptorů, které zahrnují ty, jenž jsou podobné lymfokinům, se mohou podílet na nové terapii v případě širokého rozsahu degenerativních nebo abnormálních podmínek, které přímo nebo nepřímo zahrnují vývoj, diferenciaci nebo funkci například imunitní systém a/nebo hematopoetických buněk. Velkou výhodou je objev a porozumění funkci nových receptorů pro molekuly podobné lymfokinům, které posilují nebo potenciují výhodné aktivity jiných lymfokinů. Vynález popisuje nové receptory ligandů, které vykazují podobnost s kompozicemi podobnými interleukinu-1 a příbuzných látek a způsobů jejich použití.

• · · ·

Podstata vynálezu

Vynález popisuje devět nových savčích receptorů. Jsou to lidské molekulární struktury podobné receptorů Toll, které se označují DTLR2, DTLR3, DTLR4, TLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9, a DTLR10, a dále se popisují jejich biologické aktivity. Vynález zahrnuje nukleové kyseliny kódující samotné polypeptidy a způsoby jejich produkce a použití. Nukleové kyseliny podle vynálezu se charakterizují z části svou homologii s klonovanou komplementární sekvencí DNA (cDNA).

V jistém provedení vynálezu se popisuje kompozice látky vybrané ze skupiny zahrnující v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL2 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 4; přirozenou sekvenci DTRL2 SEQ ID NO: 4; fúzní protein obsahující sekvenci DTRL2; v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL3 nebo peptid vykazující DTRL3 SEQ ID NO: 6; fúzní protein obsahující sekvenci DTRL3; v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL4 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 26; přirozenou sekvenci DTRL4 SEQ ID NO: 26; fúzní protein obsahující sekvenci DTLR4; v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL5 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 10; přirozenou sekvenci DTRL5 SEQ ID NO: 10; fúzní protein obsahující sekvencí DTLR5.

V jiném provedení vynálezu se popisuje kompozice látky vybrané ze skupiny, která zahrnuje: v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL6 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 12; přirozenou sekvenci DTRL6 SEQ ID NO: 12; fúzní protein obsahující sekvenci DTLR6; v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL7 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce * * alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvenci SEQ ID NO: 16 nebo 18; přirozenou sekvenci DTRL7 SEQ ID NO: 16 nebo 18; fúzní protein obsahující sekvenci DTLR7; v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL8 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 32; přirozenou sekvenci DTRL8 SEQ ID NO: 32; fúzní protein obsahující sekvenci DTLR8 v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL9 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 22; přirozenou sekvenci DTRL9 SEQ ID NO: 22; fúzní protein obsahující sekvenci DTLR9; v podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTRL10 nebo peptid vykazující alespoň přibližně 85 % sekvenční identity v délce alespoň přibližně 12 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 34; přirozenou sekvenci DTRL10 SEQ ID NO: 34; fúzní protein obsahující sekvenci DTLR10.

Upřednostňuje se v podstatě čistý nebo izolovaný protein obsahující segment vykazující sekvenční identitu s odpovídající částí DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10, kde homologie je alespoň přibližně 90 % identity a část tvoří alespoň přibližně 9 aminokyselin; homologie je alespoň přibližně 80 % identity a část tvoří alespoň přibližně 17 aminokyselin nebo homologie je alespoň přibližně 70 % identity a část tvoří alespoň přibližně 25 aminokyselin. Ve specifickém provedení vynálezu složení látky je: DTLR2, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 4; nebo vykazuje post-translační modifikační patern odlišný od přirozeného DTLR2; DTLR3, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 6; nebo vykazuje post-translační modifikační patern odlišný od přirozeného DTLR3; DTLR4, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 26; nebo vykazuje post-translační modifikační patern odlišný od přirozeného DTLR4; DTLR5, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 10; nebo vykazuje post-translační modifikační patern odlišný od přirozeného

DTLR5; DTLR6, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 12; nebo vykazuje post-translačni modifikačni patern odlišný od přirozeného DTLR6; DTLR7, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 16 nebo 18; nebo vykazuje post-translačni modifikačni patern odlišný od přirozeného DTLR7; DTLR8, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 32; nebo vykazuje post-translačni modifikačni patern odlišný od přirozeného DTLR8; DTLR9, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 22; nebo vykazuje post-translačni modifikačni patern odlišný od přirozeného DTLR9; DTLR10, který obsahuje přirozenou sekvenci SEQ ID NO: 34; nebo vykazuje post-translačni modifikačni patern odlišný od přirozeného DTLR10; nebo může obsahovat protein nebo peptid, který: pochází z teplokrevného zvířete vybraného ze skupiny zahrnující primáty, jako je člověk; obsahuje alespoň jeden segment polypeptidů SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34; obsahuje velké množství částí vykazujících uvedenou identitu. Látka je přirozenou alelovou variantou DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10, má délku alespoň přibližně 30 aminokyselin, vykazuje alespoň dva nepřekrývající se epitopy, které jsou specifické pro DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10 primátů. Dále vykazuje sekvenční identitu alespoň přibližně z 90 % v délce alespoň přibližně 20 aminokyselin s DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLT6 primátů; vykazuje alespoň dva nepřekrývající se epitopy, které jsou specifické pro DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10 primátů nebo vykazují sekvenční identitu alespoň přibližně z 90 % v délce alespoň přibližně 20 aminokyselin s DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10 primátů; je glykozylovaná; má molekulární hmotnost alespoň 100 000 s přirozenou glykozylací; je syntetickým polypetidem; je přichycena na pevný substrát; je spojena s jinou chemickou látkou; od přirozené sekvence se • 9 · · · · ♦ · ·· ·· ·· · ···· ··«· • · · »···· liší 5-ti násobnou nebo menší substitucí nebo je deleční nebo inzerční variantou přirozené sekvence.

Jiné provedení vynálezu zahrnuje kompozici obsahující: sterilní protein DTLR2 nebo peptid nebo protein DTLR2 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci; sterilní protein DTLR3 nebo peptid nebo protein DTLR3 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci; sterilní protein DTLR4 nebo peptid nebo protein DTLR4 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci; sterilní protein DTLR5 nebo peptid nebo protein DTLR5 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci; sterilní protein DTLR6 nebo peptid nebo protein DTLR6 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci; sterilní protein DTLR7 nebo peptid nebo protein DTLR7 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci; sterilní protein DTLR8 nebo peptid nebo protein DTLR8 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci; sterilní protein DTLR9 nebo peptid nebo protein DTLR9 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , • · · • · · · · · θ ··· · ....... ·· ·· rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci nebo sterilní protein DTLR10 nebo peptid nebo protein DTLR10 nebo peptid a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální , rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci.

V jistém provedení fúzního proteinu podle vynálezu se popisuje fúzní protein obsahující přirozený protein o sekvenci SEQ. ID. NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34; tag vhodný pro detekci nebo čištění nebo zahrnující FLAG, His6 nebo sekvenci Ig; nebo sekvenci jiného receptorového proteinu.

Různá provedení kitu podle vynálezu popisují sadu obsahující protein DTLR nebo peptid a: kompartment obsahující protein nebo polypeptid a/nebo instrukce pro použití nebo likvidaci činidel.

Provedení navázání látky podle vynálezu zahrnuje vazebné místo pro antigen, které pochází z protilátek specificky se vázajících na přirozený protein DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10, kde: protein je protein primáta; vazebnou látkou je Fv, Fab nebo fragment Fab2; vazebná látka je spojena s jinou chemickou látkou; nebo protilátky vytvořené proti peptidové sekvenci přirozeného polypeptidu SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34 nebo vytvořené proti přirozenému protein DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10 nebo vytvořené proti čištěnému lidskému proteinu DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10. Protein je vybrán na základě imunologických metod, je polyklonální protilátkou, váže se na denaturovaný protein DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10, vykazuje Kd k antigenu alespoň 30 μΜ, je zachycen na pevném susbtrátu, který zahrnuje částice nebo plastovou membránu, je ve sterilní kompozici nebo je detekovatelně značen a to radioaktivním nebo fluorescenčním značení. Kit vazebné kompozice často zahrnuje vazebnou látku a : kompartment obsahující vazebnou látku • · a/nebo instrukce pro použití nebo likvidaci činidel. Kit je možné použít při kvalitativní a kvantitativní analýzu.

Jiné kompozice zahrnují kompozici obsahující vazebnou látku nebo vazebnou látku a nosič, kde nosičem je: vodná látka, zahrnující vodu, fyziologický roztok a/nebo pufr a/nebo je vhodný pro orální, rektální, nasální, povrchovou nebo parenterální aplikaci.

Provedení nukleových kyselin podle vynálezu zahrnuje izolovanou nebo rekombinantní nukleovou kyselinu kódující protein DTLR2-10 nebo peptid nebo fúzní protein, kde DTLR pochází ze savců; nebo nukleovou kyselinu, která kóduje antigenní peptid sekvence SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34; kóduje velké množství antigenních peptidových sekvencí SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34; vykazuje alespoň přibližně 80 % shodu s přirozenou cDNA kódující uvedený segment; je expresívním vektorem; dále obsahuje počátek replikace; pochází z přirozeného zdroje; obsahuje detekovatelné značení; obsahuje syntetickou velikost je menší než 6 kb, pochází ze savců, kteří zahrnují nukleotidovou sekvenci; upřednostňuje se 3 kb;

primáty; obsahuje přirozenou kódující sekvenci v plné délce; v případě genu kódujícího uvedenou DTLR je hybridizačni sondou; nebo je primer pro PCR, produkt PCR nebo primer mutageneze. Vynález dále popisuje buňku, tkáň nebo orgán obsahující takovou rekombinantní nukleovou kyselinu.

v

Upřednostňuje se, aby buňkou byla prokaryontní buňka, eukaryontní buňka, bakteriální buňka, kvasinková buňka, buňka hmyzu, savčí buňka, myší buňka, buňka primátů nebo lidská buňka. Vynález popisuje kity obsahující takovou nukleovou kyselinu a: kompartment obsahující uvedenou nukleovou kyselinu; kompartment dále obsahující protein a/nebo polypeptid DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10 primátů a/nebo instrukce pro použití nebo na likvidace činidel. Kit je často možné použít pro kvalitativní nebo kvantitativní analýzu.

Jiná provedení vynálezu zahrnují nukleovou kyselinu, která hybridizuje se SEQ ID NO: 3 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M ; hybridizuje se SEQ ID NO: 5 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M; hybridizuje se SEQ ID NO: 25 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M; hybridizuje se SEQ ID NO: 9 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M; hybridizuje se SEQ ID NO: 11 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrace solí menší než 2M; hybridizuje se SEQ ID NO: 15 nebo 17 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M; hybridizuje se SEQ ID NO: 31 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M; hybridizuje se SEQ ID NO: 21 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M; hybridizuje se SEQ ID NO: 33 za podmínek promývání při teplotě 30 °C a s koncentrací solí menší než 2M; vykazuje alespoň přibližně 85 % identitu s proužky v délce alespoň 30 nukleotidů s proteiny DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10 primátů.

Upřednostňuje se, aby takové nukleová kyselina měla vlastnosti, že: promývání probíhá při teplotě 45 °C a/nebo při koncentraci solí 500 mM; nebo shoda je alespoň 90 % a/nebo proužek obsahuje alespoň 55 nukleotidů. Více se upřednostňuje, aby promývání probíhalo při teplotě 55 °C a/nebo při koncentraci solí 150 mM; nebo shoda byla alespoň 95 % a/nebo proužek obsahoval alespoň 75 nukleotidů.

Vynález dále popisuje způsob úpravy fyziologie nebo vývoj buněčné nebo tkáňové kultury buněk, který zahrnuje kontakt buňky s agonistou nebo antagonistou savčího proteinu DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10.

• ·

I. Obecné informace

Vynález popisuje aminokyselinovou sekvenci a sekvenci DNA savců, kde molekuly receptorů podobné DNAX Toll primátů (DTLR) máji určité definované biologické a strukturální vlastnosti. Tyto molekuly se zde označují jako DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 nebo DTLR10 a zvyšují počet členů receptorové rodiny podobné lidskému Toll z jednoho na deset. Různé cDNA kódující tyto molekuly se získaly z cDNA sekvenční knihovny primátů, jako je například člověk. Může být nutný jiný primát nebo jiný zástupce savců.

Některé standardní způsoby se popisují v publikaci Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed., vols 1-3, CSH press, NY (1989), Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brooklyn, NY; nebo Ausubel, et el., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York.

Úplná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence segmentu kódujícího lidský DTLRl je zobrazena v SEQ ID NO 1 a 2 (popisuje se v publikaci Nomura, et al. (1994) DNA Res. 1: 27-35. Úplná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence segmentu kódujícího lidský DTLR2 je zobrazena v SEQ ID NO 3 a 4. Úplná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence segmentu kódujícího lidský DTLR3 je zobrazena v SEQ ID NO 5 a 6. Úplná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence segmentu kódujícího lidský DTLR4 je zobrazena v SEQ ID NO 7 a 8. Alternativní nukleová kyselina a odpovídající aminokyselinová sekvence segmentu kódujícího lidský DTLR4 je zobrazena v SEQ ID NO 25 a 26. Částečná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence segmentu kódujícího lidský DTLR5 je zobrazena v SEQ ID NO 9 a 10. Úplná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence segmentu kódujícího lidský DTLR6 je zobrazena v SEQ ID NO 11 a 12. A částečná sekvence segmentu kódujícího myšího DTLR6 je zobrazena v SEQ ID NO 13 a 14. Další myší sekvnce DTLR6 je zobrazen a SEQ ID NO: 27 a 29 (nukleotidová sekvence) a SEQ ID NO: 28 a 30 (aminokyselinová sekvence). Dále se popisuje částečná nukleotidová (SEQ ID NO: 15 a 17) a odpovídající aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 16 a 18) kódující segment lidského DTLR7. Částečná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence kódující segment lidského DTLR8 je uvedena v SEQ ID NO: 19 a 20. Více úplná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence kódující segment lidského DTLR je uvedena v SEQ ID NO: 31 a 32. Částečná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence kódující segment lidského DTLR9 je uvedena v SEQ ID NO: 21 a 22. Částečná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence kódující segment lidského DTLR10 je uvedena v SEQ ID NO: 23 a 24. Více úplná nukleotidová a odpovídající aminokyselinová sekvence kódující segment lidského DTLR10 je uvedena v SEQ ID NO: 33 a 34. Částečná nukleotidová sekvence myšího DTLR10 kódující segment lidského DTLR10 je uvedena v SEQ ID NO: 35.

Tabulka č. 1: Porovnání vnitrobuněčných domén lidského DTLR. DTLR1 je SEQ ID NO: 2; DTLR2 je SEQ ID NO: 4; DTLR2 je SEQ ID NO: 6; DTLR4 je SEQ ID NO: 8; DTLR5 je SEQ ID NO: 10; DTLR6 je SEQ ID NO: 12; Zvláště důležité a konzervativní jsou například zbytky odpovídající SEQ ID NO: 18 zbytkům tyrl0-tyrl3; trp26; cys46; trp52; pro54-gly55; ser69; lys71; trpl34-prol35 a phel44-trpl45.

« · « ·

DTLR1

DTLR9

DTLR8

DTLR2

DTLR6

DTLR7

DTLR10

DTLR4

DTLR5

DTLR3

QRNLQFHAFISYSGHD- - -SFWVKNELLPNLEKEG-----MQICLHERNF

KENLQFHAFISYSEHD---SAWVKSELVPYLEKED-----IQICLHERNF

------------------------NELIPNLEKEDGS---1LICLYESYF

SRNICYDAFVSYSERD---AYWVENLMVQELENFNPP---FKLCLHKRDF

SPDCCYDAFIVYDTKDPAVTEWVLAELVAKLEDPREK--HFNLCLEERDW TSQTFYDAYISYDTKDASVTDWVINELRYHLEESRDK--NVLLCLEERDW EDALPYDAFWFDKTXSAVADWVYNELRGQLEECRGRW-ALRLCLEERDW RGENIYDAFVIYSSQD-—EDWVRNELVKNLEEGVPP- - - FQLCLHYRDF

PDMYKYDAYLCFSSKD---FTWVQNALLKHLDTQYSDQNRFNLCFEERDF

TEQFEYAAYIIHAYKD---KDWVWEHFSSMEKEDQS----LKFCLEERDF

DTLR1

DTLR9

DTLR8

DTLR2

DTLR6

DTLR7

DTLR1O

DTLR4

DTLR5

DTLR3

VPGKSIVENIITC-IEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCH-YELYFAHHNLFHE VPGKSIVENIINC-IEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCH-YELYFAHHNLFHE DPGKSISENIVSF-IEKSYKSIFVLSPNFVQNEWCH-YEFYFAHHNLFHE IPGKWIIDNI IDS-IEKSHKTVFVLSENFVKSEWCK-YELDFSHFRLFEE LPGQPVLENLSQS-IQLSKKTVFVMTDKYAKTENFK-IAFYLSHQRLMDE DPGLAIIDNLMQS-INQSKKTVFVLTKKYAKSWNFK-TAFYLXLQRLMGE LPGKTLFENLWAS-VYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLR-AIFLLAQQRLLEIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVWSQHFIQSRWCI-FEYEIAQTWQFLS VPGENRIANIQDA-IWNSRKIVCLVSRHFLRDGWCL-EAFSYAQGRCLSD EAGVFELEAIVNS-IKRSRKIIFVITHHLLKDPLCKRFKVHHAVQQAIEQ * . **....

DTLRl

DTLR9

DTLR8

DTLR2

DTLR6

DTLR7

DTLRlO

DTLR4

DTLP.5

DTLR3

GSNS LILILLEPIPQYS IPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWAN GSNNLILILLEPIPQNSIPNKYHKLKALMTQRTYLQWPKEKSKRGLFWANSDHIILILLEPIPFYCIPTRYHKLEALLEKKAYLEWPKDRRKCGLFWAN NNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVN

KVDVIILIFLEKPFQK---SKFLQLRKRLCGSSVLEWPTNPQAHPYFWQC

NMDVIIFILLEPVLQH---S PYLRLRQRICKSSILQWPDNPKAERLFWQT

SRAGIIFIVLQKVEKT-LLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRR LNSALIMVWGSLSQY-QLMKHQSIRGFVQKQQYLRWPEDLQDVGWFLHK NLDS11LVF LEEIPDYKLNHALCLRRGMFKSHCILNWPVQKERIGAFRHK

DTLRl

DTLR9

DTLR8

DTLR2

DTLR6

DTLR7

DTLRlO

DTLR4

DTLR5

DTLR3

LRAAINIKLTEQAKK

LRAAVNVNVLATREMYELQTFTELNEESRGSTISLMRTDCL

LRAAIKS---------------------------------LKNALATDNHVAYSQVFKETV-------------------LXNWLTENDS RYNNMYVDSIKQY----------------LRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI LSQQILKKEKEKKKDNNIPLQTVATIS— LQVALGSKNSVH----------------14

Termín „receptor 2 podobný DNAX Toll (DTLR2) se používá při popisu proteinu, který obsahuje segment proteinu nebo peptidu, jenž vykazuje nebo sdílí aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 4 nebo její podstatný fragment. Podobně je tomu u

DTLR3 a	SEQ	ID	NO: 6, DTLR4	a	SEQ	ID	NO: 26, DTLR5	a	SEQ	ID
NO: 10,	DTLR6	a SEQ ID NO:	12	, DTLR7	a SEQ ID NO:	16	a	18,
DTLR8 a	SEQ	ID	NO: 32, DTLR9	a	SEQ	ID	NO: 22, DTLR10	a	SEQ	ID

nebo antagonista. antagonisty budou s vysokou afinitou, to nM, obvykle lepší jak

NO: 34.

Vynález dále zahrnuje proteinové variace alel DTLR a jejich sekvence například muteinový agonista V typickém případě takový agonisty a vykazovat méně než přibližně 10 % sekvenčních rozdílů a tak budou často vykazovat jednu až jedenáct substitucí, například 2-, 3-, 5-, 7-substitucí. Vynález také popisuje alelové a jiné varianty proteinu, jsou to například přirozené polymorfní varianty. V typickém případě se budou vázat na jeho odpovídající biologický receptor znamená například přibližně 100 přibližně 30 nM, upřednostňuje se lepší než přibližně 10 nM a více se upřednostňuje lepší než přibližně 3 nM. Termín je také možné použít při charakterizaci příbuzných přirozeně se vyskytujících forem. Jsou to například alely, polymorfní varianty a metabolické varianty savčího proteinu.

Vynález dále popisuje proteiny nebo peptidy, které vykazují podstatnou shodu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 4. Ta bude zahrnovat sekvenční varianty s relativně několika substitucemi. To znamená například méně než přibližně se 3 až 5 substitucemi. Podobné rysy platí i pro jiné sekvence DTLR uvedené v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34.

Podstatný polypeptidový „fragment nebo „segment je pruh aminokyselinových zbytků, které obsahují alespoň přibližně 8 aminokyselin, v obecném případě alespoň 10 aminokyselin, v obecnějším případě alespoň 12 aminokyselin, často alespoň 14 ·♦ ·· ·« • · · · · • · · · • · · · · · I • · ····· · · · <

aminokyselin, častěji alespoň 16 aminokyselin, v typickém případě alespoň 18 aminokyselin, typičtější je alespoň 20 aminokyselin, obvykle alespoň 22 aminokyselin, obvyklejší je alespoŇ 24 aminokyselin, upřednostňuje se alespoň 26 aminokyselin, více se upřednostňuje alespoň 28 aminokyselin, a ve zvláště preferovaném provedení je přibližně alespoň 30 nebo více aminokyselin. Sekvence segmentů různých proteinů se mohou porovnat s jinými segmenty s vhodnou délkou.

Homologie aminokyselinové sekvence nebo sekvenční identita se stanoví optimalizací párování zbytků, je-li to nezbytné zavedením mezer (popisuje se například v publikaci Needleham, et al., (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-445; Sankoff, et al., (1983) kapitola 1 v Time Macromolecules: The Theory

Warps, String Edits, and and Practice of Sequence

Comaparison, Addison-Wesley, Reading, MA a software od firmy IntelliGenetics, Mountain View, CA a University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Tyto změny nastanou, když dojde ke konzervativním substitucím v párování. Konzeravtivní substituce v typickém případě zahrnují substituce obsažené v následujících skupinách: glycin, alanin, valin, izoleucin, leucin; kyselina aspartová, kyselina glutamová; asparagin, glutamin, serin, treonin; lyzin, arginin; a fenylalanin, tyrozin. Homologní aminokyselinové sekvence zahrnují přirozené alelové a vnitrodruhové variace v sekvenci cytokinů. Typické homologní proteiny nebo peptidy vykazují 50 až 100 % homologii (jestliže zahrnují konzervativní substituce) se segmentem aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34. Homologie bude alespoň přibližně 70 %, v obecném případě alespoň 76%, preferuje se alespoň 81 %, často alespoň 85 častěji 88 alespoň 92 v typickém případě alespoň 90 obvykle alespoň 94 preferuje se obvykleji alespoň 95 %, upřednostňuje se alespoň 96 % a více se upřednostňuje alespoň % a ve zvláště preferovaných provedeních je homologie • · · · • · · · • · · · • « · · • · · « · · · • · • · · · alespoň 98 % a více. Stupeň homologíe kolísá s délkou srovnávaných segmentů. Homologní proteiny nebo peptidy, jako jsou alelové varianty, sdílí většinu biologických aktivit s provedním vynálezu popsaném v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12,

16, 18, 32, 22 nebo 34.

Zvláště zajímavé oblasti srovnání na úrovni aminokyselin a nukleotidů odpovídají těm uvedeným v blocích 1 až 10 nebo v oblastech uvnitř bloků, které odpovídají oblastem označeným na obrázku č. 2A.

Termín „biologická aktivita popisuje účinky ligandů na zánětlivé odezvy, přirozenou imunitu a/nebo morfogenní vývoj. Tyto receptory například by měly podobně jako receptory IL-1 zprostředkovat aktivity fosfatázy a fosforylázy, které jsou snadno měřitelné standardními postupy (popisuje se v publikaci Hardie et al., (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academie Press, San Diego, CA; Hanks, et al., (1991)

Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70: 375388; Lewin (1990) Celol 61: 743-752; Pines et al. (1991) Cold

Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 56: 449-463 a Parker, et al. (1993) Nátuře 363: 736-738. Receptory vykazují biologické aktivity spíše jako regulovatelné proteiny, které jsou regulované navázáním ligandu. Počet změněných enzymů je blíže enzymu než receptorovému komplexu. Počet obsazených receptorů, který je nutný k indukci takové enzymatické aktivity je menší než většina receptorových systémů a jejich počet se blíží ke dvanácti na jednu buňku, na rozdíl od většiny receptorů, které se blíží tisícům na jednu buňku. Receptory nebo jejich části se mohou použít jako enzymy značící fosfáty ke značení obecných nebo specifických substrátů.

Termíny ligand, agonista, antagonista a analog, to znamená např. DTLR, zahrnuje molekuly, které modulují charakteristické buněčné odezvy na proteiny podobné ligandům Toll, stejně jako molekuly vykazující standardní strukturální vazebné kompetitivní rysy interakcí ligand-receptor. To znamená »· • · · · • · Β • · · · · • ·' • * · · · · • · · · • · · například v případě, že receptorem je přirozený receptor nebo protilátka. Buněčné odezvy jsou pravděpodobně zprostředkovány navázáním různých ligandů Toll na buněčné receptory, které jsou příbuzné, ale možná odlišné od receptorů IL-1 typu I nebo II (popisuje se v publikaci Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 393-416; Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genetics 29: 371-3991 a Hultmarkt (1994) Nátuře 367: 116-117.

Ligand je také molekula, která slouží buď jako přirozený ligand, na který se váže uvedený receptor nebo jeho analog, nebo je to molekula, která je funkčním analogem přirozeného ligandu. Funkčním analogem může být ligand se strukturálními modifikacemi nebo to může být molekula, jenž není vůbec příbuzná. Tato molekula má tvar molekuly, který interaguje s vhodnými determinanty vázajícími ligandy. Ligandy mohou sloužit jako agonisty nebo anatgonisty (popisuje se například v publikaci Goodman, et al., (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Base of Therapeutics, Pergamon Press, New Yourk.

Příprava léčiva může být založena na studii strukturových tvarů molekuly receptoru nebo protilátek a jiných efektorů a ligand. Efektory mohou být další proteiny, které zprostředkovávají jiné funkce při odezvě vyvolané navázáním ligandu, nebo jiné proteiny, které vzájemně reagují s receptorem. Jeden způsob stanovení místa interakce se specifickým proteinem je stanovení fyzikální struktury, například použitím krystalografie paprsky X nebo dvou rozměrné metody NMR. Ty umožní například zjistit, které aminokyselinové zbytky tvoří oblasti kontaktu molekul. Popis stanovení struktury proteinu se uvádí například v publikaci Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academie Press, New Yourk.

II Aktivity · · « ·· 99 ·· • · · » · · · ·»*· • · · · · < * · • · · · 4 · ··«*·»· • · · · I» · ₁₈ ··· ·

Receptorové proteiny podobné Toll vykazují řadu odlišných biologických aktivit, například metabolují fosfáty, je možné je přidat nebo odstranit ze specifických substrátů. V typickém případě jde o proteiny. To v typicky povede k úpravě zánětlivé funkce, k jiné přirozené imunitní odezvě nebo k morfologickému účinku. Proteiny DTLR2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 jsou homologní k jiným receptorovým proteinům podobným Toll, ale každý vykazuje rozdíly ve struktuře. Kódující sekvence genu lidského DTLR2 vykazuje pravděpodobně 70 % shodu s nukleotidovou sekvencí kódující myší DTLR2. Což je na úrovni aminokyselin významná shoda.

Biologické aktivity DTLR se vztahují k přidání a odstranění fosfátů ze substrátu v typickém případě specifickým způsobem, ale příležitostně také nespecifickým způsobem. Mohou se identifikovat substráty nebo se mohou standardními způsoby testovat podmínky vhodné pro aktivitu enzymů, například jak se popisuje v publikacích Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase FactBook vols. I and II, Academie Press, San Diego, CA; Hanks et al., (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter et al., (1992) Cell 70: 375-388; Lewin (1990) Cell 61: 743-752; Pines et al., (1991) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 56: 449463; a Parker, et al., (1993) Nátuře 363: 736-738.

III. Nukleové kyseliny

Vynález popisuje použití izolované nukleové kyseliny nebo fragmentů, které například kódují tyto nebo jim blízce příbuzné proteiny nebo jejich fragmenty. Mohou například kódovat odpovídající polypeptidy, přednostně ten, který je biologicky aktivní. Navíc vynález popisuje izolovanou nebo rekombinanntí DNA, která kóduje takové proteiny nebo polypeptidy, které mají jedinou nebo řadu charakteristických sekvencí proteinů DTLR. V typickém případě nukleová kyselina je schopna hybridizovat za vhodných podmínek se segmentem sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, • ·

11, 15, 17, 31, 21 nebo 33, ale upřednostňuje se, aby nehybridizovala s odpovídajícím segmentem SEQ ID NO: 1. Uvedený biologicky aktivní protein může být protein v plné délce nebo to může být fragment a bude v typickém případě obsahovat segment aminokyselinové sekvence vysoce homologní se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34. Dále tento vynález popisuje použití izolované nebo rekombinantní nukleové kyseliny nebo jejího fragmentu, který kóduje proteiny obsahující fragmenty, které jsou ekvivalentní s proteiny DTLR2-10. Izolované nukleové kyseliny mohou mít regulační sekvence v oblastech lemujících 3'- a 5'-konec. To jsou například promotory, zesilovače, poly-A adiční signály a jiné, které pocházejí z přirozeného genu.

Termín „izolovaná nukleová kyselina znamená nukleovou kyselinu, například DNA, RNA nebo smíšený polymér, který je v podstatě čistý. Může být například oddělený od jiných komponentů, které přirozeně doprovázejí přirozenou sekvenci, jako jsou ribozómy, polymerázy a lemující genomové sekvence pocházející z původních druhů. Termín zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny, která se odstranila z prostředí jejího přirozeného výskytu a zahrnuje rekombinantní nebo klonované izoláty DNA, které se tím odlišují od přirozeně se vyskytujících kompozic, a chemicky syntetizované analogy nebo analogy syntetizované bilogickou cestou v heterogenním systém. Podstatně čistá molekula zahrnuje izolované formy molekuly , které jsou buď zcela nebo částečně čisté.

Izolovaná nukleová kyselina bude v obecném případě homogenní kompozice molekul, ale bude v některých provedeních vynálezu vykazovat heterogenitu, přednostně minoritní. Tato heterogenita se v typickém případě nachází na konci polymérů nebo v částech, které nejsou kritické pro požadovanou biologickou funkci nebo aktivitu.

Termín „rekombinantní nukleová kyselina je v typickém případě definována způsobem její produkce, produkt vyrobený postupem, přičemž uvedený postup využívá metod rekombinace nukleových kyselin, což například zahrnuje zásah člověka do nukleotidové sekvence. V typickém případě tento zásah zahrnuje in vitro manipulaci, ačkoli za jistých okolností může zahrnovat klasické metody šlechtění zvířat. V jiném případě nukleová kyselina může být připravena vytvořením sekvence obsahující fúzi dvou fragmentů, které spolu přirozeně nesousedí, ale to znamená, že tím se vyloučí přirozené produkty, například přirozeně se vyskytující mutanty, které se nacházejí v jejich přirozeném stádiu. Produkty se mohou například produkovat transformováním buněk s libovolným nepřirozeně se vyskytujícím vektorem, což jsou nukleové kyseliny obsahující sekvence získané použitím libovolného syntetického oligonukleotidového postupu. Takový proces se provede tím, že se kodon nahradí redundantním kodonem, který kóduje stejnou nebo konzervativní aminokyselinu, zatímco v typickém případě zavede nebo odstraní sekvenci, kterou rozeznává restrikční enzym. V jiném případě se uskuteční proces, který spojí segmenty nukleové kyseliny požadovaných funkcí, aby vznikla jedna genetická entita obsahující požadovanou kombinaci funkcí, které se nenachází v běžně dostupných přirozených formách, například kódují fúzní protein. Místa, která rozeznává restrikční enzym jsou často cílem takových umělých manipulací, ale na druhou stranu se mohou začlenit jiné specifické cíle. Jsou to například promotory, místa replikace DNA, regulační sekvence, řídící sekvence nebo jiné použitelné rysy. Podobný koncept je možný v případě rekombinantního například fúzního polypeptidů. Ten bude zahrnovat dimérovou repetici. Specificky se zahrnují syntetické nukleové kyseliny, které redundancí genetického kódu kódují polypeptidy ekvivalentní s fragmenty DTLR2-10 a fúze sekvencí pocházející z různých odlišných příbuzných molekul, například z jiného člena rodiny receptorů IL-1.

Termín „fragment v kontextu nukleové kyseliny je přiléhající segment, který tvoří alespoň přibližně 17 nukleotidů,

	• 21	• • · • • ·	• · · · • · • · « • ·	• # · · • · · · • · · · · · • · • · · ·
v obecném případě alespoň	21 nukleotidů, obecněji	alespoň	25
nukleotidů, v obvyklém	případě alespoň	30	nukleotidů,
obvyklejší je alespoň 35	nukleotidů, často	však	alespoň	39

nukleotidů, častěji alespoň 45 nukleotidů, v typickém případě 50 nukleotidů, více typické je alespoň 55 nukleotidů, obvykle alespoň 60 nukleotidů, obvykleji alespoň 66 nukleotidů, upřednostňuje se alespoň 72 nukleotidů, více se upřednostňuje alespoň 79 nukleotidů a ve zvláště preferovaném provedení vynálezu ho tvoří alespoň 85 nukleotidů a více. V typickém případě fragmenty různých genetických sekvencí se mohou srovnávat jedna s druhou. Zvláště definované segmenty jsou takové domény, které se definují dále v textu.

Nukleová kyselina, která kóduje protein DTLR2-10 bude zvláště použitelná pro identifikaci genů, mRNA a cDNA, které kódují samotné proteiny nebo jejich blízce příbuzné proteiny, stejně jako při identifikaci DNA, která kóduje polymorfní, alelové nebo jiné genetické varianty, které například pocházejí z různých jedinců nebo příbuzných druhů. Preferovanými sondami vhodnými pro takové testování jsou tyto oblasti interleukinu, které jsou mezi různými polymorfními variantami konzervativní nebo které obsahují nukleotidy, kterým chybí specifita, a zahrnují sekvenci v plné délce nebo skoro v plné délce. V jiných situacích je více použitelná polymorfní varianta specifické sekvence.

Vynález dále popisuje molekuly rekombinantních nukleových kyselin a fragmenty , které mají sekvenci nukleové kyseliny stejnou nebo vysoce homologní s izolovanou DNA. Sekvence budou často operativně spojeny se segmenty DNA, které řídí transkripci, translaci a DNA replikaci. Tyto segmenty se v typickém případě podílejí na expresi požadovaného segmentu nukleové kyseliny.

Homologní nebo vysoce identické sekvence nukleové kyseliny, v případě, že se porovnávají jedna s druhou nebo se sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 nebo • · • · • · · · ·

33, vykazují podstatnou podobnost. Standardním postupem v případě homologie nukleových kyselin je buď stanovení homologie na základě porovnání sekvencí nebo v závislosti na podmínkách hybridizace, které se obecně užívá v oboru. Porovnávací podmínky hybridizace se popisují dále v textu. Podstatná shoda při porovnání sekvence nukleových kyselin znamená buď, že segmenty nebo jejich komplementární řetězce jsou identické s vhodnou nukleotidovou inzercí nebo delecí alespoň přibližně v 60 % nukleotidů, v obecném případě alespoň v 66 % nukleotidů, obyčejně alespoň v 71 %, často alespoň v 76 % častěji alespoň v 80 %, obvykle alespoň V 84 %, obvykleji v 88 %, v typickém případě alespoň v 99 %, více typická je alespoň 93 % shoda, upřednostňuje se alespoň přibližně 95 % shoda, více se upřednostňuje alespoň přibližně 96 až 98 % shoda nebo více. Inzerce nebo delece zahrnují například segmenty kódující strukturní domény, jako jsou segmenty popsané dále v textu. V jiném případě k podstatné shodě dochází, když budou hybridizovat za selektivních hybridizačnich podmínek s řetězcem nebo s jeho komplementem v typickém případě za použití sekvence získané z SEQ ID NO: 3, 5, 25, 9, 11, 15, 17, 31, 21 nebo 33. V typickém případě dojde k selektivní hybridizaci, když existuje alespoň přibližně 55% homologie v délce pruhu nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň přibližně 14 nukleotidů. Ve více typickém případě sekvence musí být homologické alespoň přibližně z 65 %, upřednostňuje se alespoň přibližně ze 75 % a více se upřednostňuje alespoň přibližně z 90 % (což se popisuje v publikaci Kanehisa (1994) Nuc. Acids Res. 12: 203-213.

Pruhy sekvencí, které se porovnávají mohou být dlouhé a v jistých preferovaných provedeních vynálezu se porovnávají pruhy obsahující alespoň přibližně 17 nukleotidů, v obecném případě alespoň přibližně 20 nukleotidů, obyčejně alespoň přibližně 28 nukleotidů, v typickém případě alespoň přibližně 40 nukleotidů, upřednostňuje se alespoň přibližně 50 » · · · nukleotidů a více se upřednostňuje alespoň přibližně 75 až 100 nebo více nukleotidů.

Přísné podmínky hybridizace ve vztahu s homologii je kombinace přísných podmínek koncentrace solí, teploty, organických rozpouštědel a jiných parametrů, které se v typickém případě při hybridizační reakci řídí. Přísné teplotní podmínky hybridizace obvykle zahrnují teploty přesahující přibližně 30 °C, více obvyklé jsou teploty přesahující přibližně 37 °C, v typickém případě jsou to teploty přesahující přibližně 45 °C, více typické jsou teploty přesahující přibližně 55 °C, upřednostňují se teploty přesahující přibližně 65 °C a více se upřednostňují teploty přesahující přibližně 70°C. Přísné podmínky koncentrace solí znamenají obvykle koncentraci nižší než přibližně 500 mM, obvykle znamenají koncentraci nižší než přibližně 400 mM, více obvyklé je koncentrace nižší než přibližně 300 mM, v typickém případě jde o koncentraci nižší než přibližně 200 mM, upřednostňuje se koncentrace nižší než přibližně 100 mM a více se upřednostňuje koncentrace nižší než přibližně 80 mM nebo dokonce nižší než přibližně 20 mM. Kombinace parametrů je však daleko více důležitější než měření libovolného jediného parametru (popisuje se v publikaci Wetmur and Davison (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370).

V jiném případě za účelem porovnání sekvence jedna sekvence působí jako referenční sekvence, se kterou se porovnává testovací sekvence. Když se použije algoritmus pro porovnání sekvence, tak se testovaná a referenční sekvence vnesou do počítače, jestli je třeba, označí se koordináty subsekvencí a a také se označí parametry programu sekvenčního algoritmu. Algoritmus porovnávání sekvencí pak vypočítá na základě označených parametrů programu procento shody sekvencí pro testovanou sekvenci(ím) vzhledem k referenční sekvenci.

Provede se stanovení optické orientace sekvencí vhodné pro porovnání, například algoritmus lokální homologie podle publikace Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482;

• · · algoritmem podle publikace Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48? 443, zkoumáním podobnosti metodou podle publikace Pearson and Lipman (1988) Proč. Naťl. Acad. Sci.USA 85: 2444, počítačovou implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA do produktu Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) nebo vizuálním studiem (popisuje se v obecné formě v publikaci Ausubel, et el., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New Yourk).

Jedním příkladem použitelného algoritmu je PILEUP. PILEUP tvoří uspořádání více sekvencí ze skupiny příbuzných sekvencí za použití progresivního uspořádání ve smyslu párování za účelem ukázat jejich vztah a procento shody sekvencí. Výsledkem je také strom nebo dendogram, který ukazuje vztahy používané při vytvoření uspořádání. PILEUP používá zjednodušené progresivní metody popsané v publikaci Feng and Doolite (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. Používaná metoda je podobná metodě popsané v publikaci Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153. Program může uspořádat až 300 sekvencí, přičemž každá může mít maximální délku 5 000 nukleotidů nebo aminokyselin. Při vícenásobném postupu uspořádání začíná párovým uspořádání dvou nejvíce podobných sekvencí, přičemž vzniká klášter dvou uspořádaných sekvencí. Tento klášter je pak zařazen vedle nejvíce příbuzných sekvencí nebo vedle klastru uspořádaných sekvencí. Dva klastry sekvencí jsou nastaveny jednoduchým protáhnutím uspořádání ve smyslu párů dvou jednotlivých sekvencí. Konečné uspořádání je dosaženo sériemi progresivního uspořádání párů. Program pak navrhuje specifické sekvence a jejich aminokyselinové nebo nukleotidové koordináty pro případ porovnání oblastí sekvencí a dále navrhuje parametry programu. Referenční sekvence se může například porovnat s jinou testovanou sekvencí za účelem stanovení procenta shody sekvencí za použití následujících parametrů: standardní míra významnosti rozdílu (3,00), • · • · · ·

standardní míra významnosti délky (0,10) a míra významnosti konečných rozdílů.

Jiným příkladem algoritmu, který je vhodný pro stanovení procenta shody sekvencí a podobnosti sekvencí je algoritmus BLAST, který se popisuje v publikaci Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Software vhodný pro provedení analýz BLAST je dostupný prostřednictvím instituce National Center for Biotechnology Information (http:WWW.ncbi.nlm.nih.gov/). Tento algoritmus postupuje takto: nejdříve se v dotazované sekvenci identifikují sekvenčních párů s vysokým skórem (HSP) tím, že se identifikují krátká slova o délce W, které se buď zcela párují nebo vyhovují pozitivně hodnocenému prahovému skóre T, které se v databázi sekvencí pořádá se slovem stejné délky. T se označuje jako práhové skóre okolních slov (popisuje se v publikaci Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403410) . Tyto počáteční nálezy okolních slov působí jako sémě počátečního průzkumu za účelem nalezení delších HSP, které obsahují uvedená krátká slova. Nalezené slovo se pak prodlužuje v obou směrech podél každé sekvence tak dlouho až se může zvýšit kumulativní skóre uspořádání. Prodlužování nalezených slov v každém směru se zastaví když: kumulativní skóre začne klesat ze své maximální dosažené hodnoty, což je způsobeno množstvím X; kumulativní skóre klesá na nulu nebo níže, což je způsobeno akumulací jednoho nebo více negativně skórujícího uspořádání zbytků nebo se dosáhne konce libovolné sekvence. Parametry algoritmu BLAST, jsou to W, Ta X, stanovují citlivost a rychlost uspořádání. Program BLAST používá jako standardní délku slova (W) 11, uspořádání skórovací matrice BLOSUM62 (B) (popisuje se v publikaci Henikoff and Henikoff (1989) Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 89: 10915) je 50, pravděpodobnost (E) je 10, M=5, N=4 a porovnání obou řetězců.

• · · · • · · ·

Mimo počítání procenta sekvenční identity algoritmus BLAST také umožňuje statistickou analýzu podobnosti dvou sekvencí (popisuje se například v publikaci Karlin and Altschul (1993) Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 90: 5837-5787). Jedno stanovení podobnosti provedené algoritmem BLAST je nejmenší součet pravděpodobnosti (P(N)), který určuje pravděpodobnost, při které dojde k párování mezi dvěmi nukleotidovýmu nebo aminokyselinovými sekvencemi. Nukleová kyselina se například považuje za podobnou s referenční sekvencí, jestliže nejmenší součet pravděpodobnosti při porovnání testované nukleové kysleiny s referenční nukleovou kyselinou je menší než přibližně 0,1, upřednostňuje se menší než přibližně 0,01 a nejvíce se preferuje menší než přibližně 0,001.

Další indikace podstatné shodnosti dvou sekvencí nukleových kyselin je skutečnost, že polypeptid kódovaný první nukleovou kyselinou skříženě reaguje s polypeptidem kódovaným druhou nukleovou kyselinou, jak se popisuje dále v textu. Polypeptid je v typickém případě v podstatě shodný s druhým peptidem například, když se dva peptidy liší pouze konzervativními substitucemi. Další označení, že dvě sekvence nukleových kyselin jsou v podstatě stejné je, že molekuly spolu vzájemně hubridizují za přísných podmínek, jak se popisuje dále v textu.

Izolovaná DNA se pak může snadno upravovat substitucemi nukleotidů, deleci nukleotidů, inzercí nukleotidů a inverzí pruhů nukleotidů. Tyto modifikace vedou k vytvoření nové sekvence DNA, která kóduje tento protein nebo jeho deriváty. Tyto modifikované sekvence se mohou použít k produkci mutantních proteinů (muteinů) nebo pro zesílení exprese různých druhů. Zesílení exprese může zahrnovat amplifikaci genu, zesílenou transkripci a translaci a jiné mechanizmy. Takové deriváty podobné mutantu DTLR zahrnují předem stanovenou nebo místně specifickou mutaci proteinu nebo jeho fragmentů, zahrnující tiché mutace za použití degenerace • · ·

.........

genetického kódu. Termín „mutantní DTLR znamená polypeptid spadající do definice homologie DTLR, jak se uvádí shora v textu, ale vykazující aminokyselinovou sekvenci, která se liší od sekvence jiných proteinů podobných DTLR, které se nachází v přírodě, čehož se dosáhlo delecí, substitucí nebo iznercí. Termín „místně specifický mutant DTLR znamená protein vykazující podstatnou homologii s proteinem se sekvencí SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34 a v typickém případě sdílí většinu biologických aktivit nebo účinků zde popsaných forem.

Ačkoli místa místně specifické mutace jsou předem určena, mutanti nemusí být místně specifičtí. Mutageneze savčího DTLR se dosáhne provedením inzercemi a delecemi aminokyselin v genu, což se spojuje s expresí. Aby se dospělo ke konečné konstrukci mohou se provést substituce, delece, inzerce nebo libovolné jejich kombinace. Inzerce zahrnují amino- nebo karboxy-terminální fúze. Náhodná mutageneze se provádí v cílovém kodonu a u exprimovaných mutantů savčího DTLR se může testovat jeho požadovaná aktivita. Metody vhodné pro provedení substitučních mutací v předem určených místech v DNA se známými sekvencemi jsou dobře známy v oboru , například M13 primerová mutageneze (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk, a Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brooklyn, NY; nebo Ausubel, et el., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York).

Mutace DNA by v normálním případě neměly umisťovat kódující sekvence mimo čtecí rámce a přednostně nebudou tvořit komplementární oblasti, které by mohly hybridizovat a tak produkovat sekundární strukturu mRNA, jako jsou smyčky nebo vlásenková struktura.

Metoda používající fosforamidit, který se popisuje v publikaci Beaucage and Carruthes (1981) Tetra. Letts. 22:

1859-1862 bude produkovat vhodné syntetické fragmenty DNA. Dvouřetězcový fragment je možné často získat buď syntézou komplementárního řetězce za vhodných podmínek nebo přidáním komplementárního řetězce za použití DNA polymerázy s vhodnou primární sekvencí. Při mutagenezi se často používají metody polymerázových řetězových reakcí (PCR). V jiném případě se jako běžné metody vedoucí k definovaným mutacím v předem určených místech používají mutagenní primery (popisuje se například v publikaci Innis et al., (eds. 1990) PCR protocols: A Guide to Methods and Applications Academie Press, San Diego, CA; a Dieffenbach and Dveksler (1995; eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY.).

IV. Proteiny, Peptidy

Jak se popisuje shora v textu, vynález popisuje DTLR2-10 primátů, jehož sekvence jsou například uvedeny v SEQ ID NO: 4,

6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34 alelové a jiné varianty, jako je fúzních sekvencí

Vynález také zahrnuje například kombinování s jinými nukleovými proteinu kyselinami, které zahrnují epitop tags a funkční domény.

Vynález dále popisuje rekombinantní proteiny, například heterogenní fúzní proteiny za použití segmentů s těchto proteinů hlodavců. Heterogenní fúzní protein je fúze proteinů nebo segmentů, které se v normálním případě přirozeně nefúzují stejným způsobem. Fúzní produkt DTLR s receptorem IL-1 je spojená proteinová molekula, která má sekvence v typickém peptidovém spojení. V typickém jako jediný produkt translace například sekvenci nebo antigenicitu) zdroje peptidu. Podobný koncept se částí připravuje vlastnosti( z každého fúzované případě se a vykazuje záskané aplikuje v případě heterogenních sekvencí nukleových kyselin.

Navíc se nové konstrukce mohou připravit kombinováním podobných funkčních a strukturních domén, které pochází z jiných příbuzných proteinů, které zahrnují varianty druhů.

• ·

Jsou to například receptory IL-1 nebo jiné proteiny DTLR. Segmenty vázající ligandy nebo jiné segmenty mohou například přesunovat mezi různými novými fúzními polypeptidy nebo fragmenty (popisuje se například v publikaci Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1330-1336; a 0'Dowd, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992). Domény vázající ligand z jiných příbuzných molekul receptorů se mohou přidat k jiným doménám uvedených nebo příbuzných proteinů. Výsledný protein bude často vykazovat hybridní funkci nebo vlastnosti. Fúzní protein může například zahrnovat cílové domény, které mohou sloužit fúzního proteinu do určitých subcelulárních k doručení organel. Kandidáti z různých mohou vybrat GenBank, c/o fúzních partnerů a sekvencí se sekvenčních databází, například IntelliGenetics, Mountain View, CA; a BCG University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI.

Vynález zvláště popisuje muteiny, které vážou ligandy Toll a/nebo které způsobují signální transdukci. Strukturní uspořádání lidského DTLR1-10 s jinými členy rodiny IL-1 vykazují konzervativní rysy/zbytky (uvedeno na obrázku č. 3A) . Uspořádání sekvencí lidského DTLR s jinými členy rodiny IL-1 označuje různé strukturální a funkční sdílené rysy (popisuje se v publikaci Bazan et al., (1996) Nátuře 379: 591; Lodi et al., (1994) Science 263: 1762-1766; Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20: 374-376 a Gronenberg et al., (1991) Protein

Engineering 4: 263-269).

Ligandy IL-Ία a IL-Ιβ se váží na receptor IL-1 typ I jako primární receptor a tento komplex pak tvoří receptorový komplex s vysokou afinitou s receptorem IL-1 typu III. Takové receptorové podjednotky jsou pravděpodobně sdíleny novými členy rodiny IL-1.

Podobné variace v jiných druzích protějšků sekvencí DTLR2-10, například v odpovídajících oblastech, vykazují podobné interakce s ligandem nebo se substrátem. Preferují se • « * · substituce buď s myšími nebo lidskými sekvencemi. Naopak konzervativní substituce mimo oblasti vázající ligandy pravděpodobně budou chránit většinu signálních aktivit.

Termín „deriváty aminokyselinových metabolické deriváty

DTLR2-10 primátů zahrnují mutanty sekvencí, glykozylované varianty, a kovalentní nebo agregované konjugáty s jinými chemickými látkami. Kovalentní deriváty se mohou připravit spojením funkčností se skupinami, které se nacházejí ve vedlejších aminokyselinových řetězcích DTLR nebo v na Nnebo C-konci. Tyto deriváty mohou zahrnovat bez omezení alifatické estery nebo amidy karboxylových konců nebo zbytky obsahující karboxylové postranní řetězce, O-acyl-deriváty zbytků, které obsahují hydroxylovou skupinu a N-acyl-deriváty aminokyselinay na N-konci nebo zbytků obsahujících aminoskupinu, například lyzin nebo arginin. Acylové skupiny se vybraly ze skupiny alkylových částí, která zahrnuje normální alkyl s C3 až C18, přičemž se tvoří alaknoylové specie.

Zvláště se zahrnují změny vzniklé glykosylací, vytvořené například upravením glykosylačních paternů polypetidu během jeho syntézy a úpravy nebo v jiných krocích úpravy. Zvláště preferovaný způsob, jak toho dosáhnout, je vystavit polypeptid glykosylačním enzymům získaných z buněk, které v normálním případě takové úpravy provádějí, například to jsou savčí glykosylační enzymy. Vynález také zahrnuje glykosylační enzymy. Vynález dále popisuje verze stejné primární aminokyselinové sekvence, která má jiné minoritní modifikace, zahrnující fosforylovamé aminokyselinové zbytky, například fosfotyrozin, fosfoserin nebo fosfotreonin.

Hlavní skupina derivátů jsou kovalentní konjugáty receptorů nebo jejich fragmentů s jinými proteiny polypeptidů. Tyto deriváty se mohou syntetizovat v rekombinantní kultuře, jako je N- nebo C-terminální fúze nebo použitím činidel, které je možné použít při síťování proteinů prostřednictvím reaktivních bočních skupin. Preferovanými místy derivatizace s činidly pro • · · · • ♦ · · síťování jsou volné aminokyseliny, sacharidy a cysteinové zbytky.

Vynález dále popisuje fúzní polypeptidy mezi receptory a jinými homologními nebo heterogenními proteiny. Homologní polypeptidy mohou být fúzí mezi různými receptory, což vede například ke vzniku hybridních proteinů, které vykazují vazebnou specifitu pro více odlišných ligandů, nebo receptor, který může mít rozsáhlou nebo slabou specifitu působení substrátu. Podobně se mohou konstruovat heterogenní fúze, které vykazují kombinaci vlastností nebo aktivit derivoaných proteinů. Typickými příklady jsou fúze reportního polypeptidu, například luciferáza se segmentem nebo doménou receptoru, například segment vázající ligand, Pak se dá snadno stanovit přítomnost nebo poloha požadovaného ligandu.(popisuje se například v publikaci Duli et al., US patent č. 4,859,609). Jiné fúzní genové partnery zahrnují glutathion-S-transferáz (GST), bakteriální β-galaktozidáza, trpE, protein A, βlaktamáza, alfa-amyláza, dehydrogenáza alkoholu a kvasinkový alfa faktor křížení (popisuje se v publikaci Godowski et al., (1988) Science 241: 812-816).

Metoda používající fosforamidit popsaná v publikaci Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862 bude produkovat vhodné syntetické fragmenty DNA. Dvouřetězcový fragment je možné často získat buď syntézou komplementárního řetězce a teplotní hybridizací řetězce dohromady za vhodných podmínek nebo přidáním komplementárního řetězce za použití DNA polymerázy s vhodnou sekvencí primerů.

Takové polypeptidy mohou také mít aminokyselinové zbytky, které se chemicky upravily fosforylaci, sulfonací, biotinylací nebo adicí nebo odstraněním jiných látek, které mají tvar molekul podobný fosfátovým skupinám. V některých provedeních vynálezu se úpravy mohou použít při značení činidel nebo slouží jako cíle čištění, například afinitní ligandy.

• · · ·· · · · · • · · · · · · · · • · · · * * · • 9 » · 999999

Fúzní proteiny se v typickém případě připravují buď metodami rekombinace nukleových kyselin nebo metodami syntézy polypeptidů. Postupy manipulace nukleových kyselin a exprese se obecně popisují v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk a Ausubel, et el., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New Yourk. Metody syntézy polypetidů se popisují například v publikaci Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; a Atherton, et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approuch, IRL Press, Oxford. V publikaci Dawson, et al., (1994) Science 266: 776-779 se popisují metody přípravy větších polypeptidů.

Vynález dále popisuje použití derivátů DTLR2-10 jiných než jsou variace v aminokyselinové sekvenci nebo glykosylace. Takové deriváty mohou zahrnovat kovalentní nebo agregativní spojení s chemickými látkami. Tyto deriváty se obecně dělí do tří tříd: (1) sole, (2) kovalentní modifikace bočního řetězce a terminálního zbytku a (3) adsorpční komplexy například s buněčnými membránami. Takové kovalentní nebo agregativní deriváty se mohou použít jako imunogeny, jako činidla v imunotetstech nebo při metodách čištění, jako je například afinitní čištění receptoru nebo jiných vázajících se molekul, například protilátek. Ligand Toll může být například imobilizován kovalentní vazbou na pevném nosiči, jako je sefaróza aktivovaná kyanidem bromným, metodami, které jsou dobře známy v oboru, nebo adsorbcí na povrchu polyolefinů s nebo bez síťování s glutaraldehydem za účelem použití v testech nebo při čištění receptoru DTLR, protilátek nebo jiných podobných molekul. Ligand je také možné značit detekovatelnou skupinou, například radioaktivním jódem za použití chloraminu T. Může se kovalentně vázat na cheláty vzácných zemin nebo spojovat se s jinými fluorescenčními látkami za účelem použití v diagnostických testech. DTLR podle • ·· <

• · « ···· ···· • · · ··*·· • · · · ········ • · · · · · ·’* * ..........

vynálezu se může použít jako imunogen při produkci antiséra nebo specifických protilátek, které jsou například schopny rozlišit IL-1 receptor mezi jinými členy rodiny, proti DTLR nebo různým jejich fragmentů. Čištěné DTLR se mohou použít pro testování monoklonálních protilátek nebo fragmentů vázajících antigen, které se připravily imunizací různými formami nečistých přípravků obsahujících protein. Termín „protilátky také zahrnuje fragmenty přirozených protilátek vázajících antigen. Jsou to například Fab, Fab2, Fv atd.. Čištěný DTLR se může také použít jako činidlo pro detekci protilátek, které se tvoří jako odezva na přítomnost zesílené exprese, nebo imunologických poruch, které vedou k produkci protilátek proti endogennímu receptorů. Navíc fragmenty DTLR mohou také sloužit jako imunogeny při produkci protilátek podle vynálezu, jak se popisuje bezprostředně dále v textu. Tento vynález dále popisuje protilátky vykazující vazebnou afinitu aminokyselinovým sekvencím uvedených v SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34 nebo k jejich fragmentům nebo různým homologním peptidům. Tento vynález zvláště popisuje protilátky vykazující vazebnou afinitu nebo protilátky, které vznikly proti specifickým fragmentům, o kterých se předpokládá, že budou nebo jsou vystaveny vnějšímu proteinovému povrchu přirozeného DTLR.

Zablokování fyziologické odezvy na receptorové ligandy může být výsledkem inhibice navázání ligandu na receptor, což se pravděpodobně děje prostřednictvím kompetetivní inhibice. Test in vitro podle vynálezu bude často používat protilátky nebo segmenty vázající antigeny těchto protilátek nebo fragmenty zachycené na pevném substrátu. Tyto testy také umožní diagnostické stanovení účinků mutací a modifikací oblastí vázajících ligandy nebo jiných mutací nebo modifikací, které například způsobují signální nebo enzymatické funkce.

Vynález dále zahrnuje použití orientačních testů kompetetivních léků, kde například neutralizační protilátky ··· ·

proti receptorů nebo fragmentům soutěží s testovanou látkou při navázání na ligand nebo s jinou protilátku. Tímto způsobem se mohou použít neutralizační protilátky nebo fragmenty pro detekci přítomnosti polypeptidu, který sdílí jedno nebo více vazebných míst pro receptor, a může se také použít pro obsazení vazebných míst na receptorů, který může vázat ligand jiným způsobem.

V. Příprava nukleových kyselin a proteinu

DNA, která kóduje protein nebo jeho fragment, se může získat chemickou syntézou, testováním knihoven cDNA nebo testováním genomových knihoven připravených z různých buněčných linií nebo tkáňových vzorků. Přirozené sekvence se mohou izolovat za použití standardních metod a zde popsaných sekvencí. Protějšky jiných specií je možné stanovit hybridizaci nebo různými způsoby PCR kombinovanými s vyhledáváním v sekvenčních databázích, například v GenBank.

Tato DNA se může exprimovat ve velké řadě hostitelských buněk za účelem syntézy receptorů v plné délce nebo fragmentů, které se naopak například mohou použít k přípravě polyklonálních nebo monoklonálních protilátek; pro účely studia možnosti vazby; pro konstrukci a expresi upravených domén vázajících ligand nebo kinázových/fosfatázových domén a pro studie struktury/funkce. Varianty nebo fragmenty se mohou exprimovat v hostitelských buňkách, které jsou transformovány nebo transfekovány vhodnými expresívními vektory. Tyto molekuly mohou existovat v podstatě bez proteinových nebo buněčných kontaminant, které jsou jiné než ty získané z rekombinanntího hostitele, a proto jsou zvláště použitelné ve farmaceutických kompozicích, když se kombinují s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo ředidlem. Protein nebo jeho části se mohou exprimovat jako fúze s jinými proteiny.

Expresívní vektory jsou v typickém případě samostatně se replikující konstrukce DNA nebo RNA obsahující požadovaný gen ·

• · · · • · · · · ♦ » · · * · · • · J ··· ··· receptorů nebo jeho fragmenty obvykle operativně spojené s vhodnými řídícími genetickými elementy, které se rozeznávají ve vhodné hostitelské buňce. Tyto řídící elementy jsou schopny ovlivnit expresi ve vhodném hostiteli. Specifický typ řídících elementů nezbytný pro ovlivnění exprese závisí na použité hostitelské buňce. V obecném případě řídící genetické elementy mohou zahrnovat prokaryontní promotorový systém nebo eukaryontní promotorový systém řídící expresi a v typickém případě zahrnuje transkripční promotor, operátor pro řízení transkripce, zesilovač transkripce pro zesílení exprese mRNA, sekvenci, která kóduje vhodné místo pro navázání ribozómu a sekvence, které ukončují transkripci a translaci. Expresívní vektory také obvykle obsahují počátek replikace, který umožňuje vektoru replikaci nezávisle na hostitelské buňce. Vektory podle vynálezu zahrnují ty vektory, které obsahují DNA kódující popsaný protein nebo fragment uvedené DNA kódující biologicky aktivní ekvivalentní polypeptid. DNA se může řídit virovým promotorem a může kódovat selekční značení. Vynález dále popisuje použití takových expresívních vektorů, které jsou schopny exprimovat eukaryontní DNA kódující uvedený protein v prokaryontním nebo eukaryontním hostiteli, kde vektor je kompatibilní s hostitelem a kde eukaryontní cDNA kódující receptor je začleněna do vektoru tak, že kultivovaný hostitel obsahující vektor exprimuje uvedenou cDNA. Expresívní vektory se obvykle navrhují tak, aby došlo k jejich stabilní replikaci v hostitelských buňkách, nebo se amplifikací v buňce značně zvýší celkový počet kopií požadovaného genu. Není vždy nutné požadovat, aby se expresívní vektor v hostitelské buňce replikoval. Například je možné způsobit transientní expresi proteinu nebo jeho fragmentů v různých hostitelích za použití vektorů, kteří neobsahují počátek replikace rozeznávaný hostitelskou buňkou. Je také možné použít vektory, které způsobují začlenění části DNA kódující protein nebo jeho fragmenty rekombinací do DNA hostitele.

« · • · · · • · · · • · · • · · · • · · « > · · · · · · • · • · · ·

Vektory, které se používají podle vynálezu zahrnují plazmidy, viry , bakteriofágy, integrovatelné fragmenty DNA a jiné vehikly , které jsou schopny se začlenit do hostitelského genomu. Expresívní vektory jsou specializované vektory, které obsahují genetické řídící elementy, které ovlivňují expresi operativně spojených genů. Plazmidy se většinou používají ve formě vektoru , ale podle vynálezu jsou vhodné všechny jiné formy vektorů, které mají ekvivalentní funkce a které jsou nebo se stávají známými v oboru (popisuje se v publikaci Pouwels et al., Clonning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Ν. Y. and Rodriquez, et al. (eds) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, 1988.

Transformované buňky jsou buňky, upřednostňují se savčí buňky, transformované nebo transfekované receptorovými vektory konstruovanými za použití metod rekombinace DNA. Transformované hostitelské buňky obvykle exprimuji požadovaný protein nebo jeho fragmenty, ale pro účely klonování, amplifikace a manipulace DNA není exprese proteinu nutná. Vynález dále zahrnuje kultivaci transformovaných buněk v kultivačním nutričním médiu, které umožňuje hromadění receptorů v buněčné membráně. Protein je možné získat z kultury nebo v určitých případech z kultivačního média.

Pro účely vynálezu jsou nukleové kyseliny v případě, že jsou vzájemně funkčně příbuzné, operativně spojeny jedna s druhou. Pre-sekvence nebo vedoucí sekvence sekrece jsou operativně spojené s polypeptidem, jestliže se exprimuji jako pre-protein nebo se podílejí na řízení polypeptidů do buněnčné membrány nebo na sekreci polypeptidů. Promotor je operativně spojen s kódující sekvencí, jestliže řídí transkripci polypeptidů. Vazebné místo pro ribozóm je operativně spojeno s kódující sekvencí, jestliže je umístěno tak, aby umožnilo transkripci. Obvykle termín „operativně spojen znamená přilehající a umístěný v čtecím rámci. Jisté genetické elementy, jako jsou • · geny represorů, však nejsou přiléhající, ale stále se vážou na sekvenci operátora, která řídí expresi.

Vhodné hostitelské buňky zahrnují prokaryonty, nižší eukaryonty a vyšší eukaryonty. Prokaryonty zahrnují gramnegativní a gram-pozitivní organizmy, jako je například E. coli a B. subtilis. Nižší eukaryonty zahrnují kvasinky například S. cerevisíae a Pichia a druhy rodu Dictystelium. Vyšší eukaryonty zahrnují tkáňové kultivační buněčné linie odvozené z buněk zvířat, které nepocházejí (hmyzí a ptačí buňky) nebo pocházejí ze savců (například člověk, primáti a hlodavci).

Prokaryontní systémy hostitelských vektorů zahrnují řadu vektorů z různých druhů. V obecném případě, stejně jako zde, se používá bakterie E. coli. Vektorem vhodným pro amplifikaci DNA je pBR322 nebo,řada jeho derivátů. Vektory, které se mohou použít pro expresi receptorů nebo jeho fragmentů zahrnují, ale nejsou omezeny na lac promotor (pUC série), trp promotor (pBR322-trp), Ipp promotor (pIN-série), lambda-pP nebo pP promotory (pOTS) nebo hybridní promotory, jako je ptač (pDR540) (popisuje se v publikaci Brosius, et al. (1988) „Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, a Ippderived Promotors, in Vectros: A Survey of Molecular Clonning Vectors and Their Uses, (eds. Rodriguez and Denhardt), Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp. 205-236).

Nižší eukaryonti, jako jsou například kvasinky a Dictyostelium, se mohou transformovat vektory obsahujícími sekvenci DTLR. Za účelem uvedeného vynálezu nejběžnější nižší eukaryontní hostitel jsou kvasinky do pečení Saccharomyces cerevisíae. V obecném případě reprezentují nižší eukaryonty, ačkoli se může použít řada jiných kmenů. Kvasinkové vektory v typickém případě obsahují počátek replikace (ledaže by byl už integrován), gen vhodný pro selekci, promotor, DNA kódující receptor nebo jeho fragmenty a sekvence pro ukončení polyadenylace a transkripce. Vhodné expresivní vektory pro • · kvasinky zahrnují konstitutivní promotory , jako je 3fosfoglycerátová kináza, a různé jiné promotory genů glykolytických enzymů nebo indukovatelné promotory, jako je promotor alkoholové dehydrogenázy 2 nebo metalothioninový promotor. Vhodné vektory zahrnují deriváty následujících typů: samo se replikující s malým počtem kopií (jako jsou YRpsérie), samo se replikující s vysokým počtem kopií (jako jsou YEp-série), integrační typy (jako je Ylp-série) nebo minichromozómy (jako jsou YCp-série).

Za účelem exprese funkčně aktivního interleukinového proteinu se v normálním případě preferují buňky tkáňových kultur vyšších eukaryont. V principu lze použít libovolné tkáňové buněčné linie vyšších eukaryont, například expresivní systémy hmyzích bakulovirů buď ze zdroje obratlovců nebo neobratlích. Preferují se však savčí buňky. Transformace nebo transfekce a propagace takových buněk se stává rutinním postupem. Příklady použitelných buněčných linií zahrnují buňky HeLa, buněčnou linii z vaječníků čínského křečka (CHO), buněčnou linii ledvin mláďat krys (BRK), buněčnou linii hmyzu a buněčnou linii opic (COS) . Expresivní vektory vhodné pro uvedené buněčné linie obvykla zahrnují počátek replikace, promotor, místo počátku translace, místa sestřihu RNA (v případě, že se používá genomová DNA), polyadenylační místo a terminační místo transkripce. Tyto vektory obvykle obsahují selekční nebo amplifikační gen. λ/hodnými expresívními vektory mohou být plazmidy, viry nebo retroviry nesoucí například z takových zdrojů jako jsou parvovirus, virus vakcínie. Reprezentativní příklady vhodných expresívních vektorů zahrnují pCDNAl, pCD (popisuje se v publikaci Okayama, et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 11361142), pMClneo PolyA (popisuje se v publikaci Thomas et al., (1987) Cell 51: 503-512), bakulovirový vektor, jako je pAC 373 nebo pAC 610.

promotory získané adenovirus, SA/40, • · · · • · · • · « • · ·

V případě sekretovaných proteinů otevřený čtecí rámec obvykle kóduje polypeptid, který obsahuje hotový nebo vylučovaný peptid kovalentně spojený svým N-koncem k signálnímu peptidu. Signální peptid se štěpí dříve než dojde k sekreci zralého nebo aktivního polypeptidů. Místo štěpení lze předpovědět na základě empirických pravidel s vysokým stupněm přesnosti (popisuje se v publikaci von-Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14: 4683-4690). Dále je zřejmé, že přesné složení aminokyselin signálního peptidu se nejeví být kritické v případě jeho funkce (popisuje se v publikaci Randall et al., (1989) Science 243: 1156-1159; Kaiser et al. (1987) Science 235: 312-317).

Často je nutné exprimovat tyto polypeptidy v systému, který poskytuje specifický nebo definovaný glykosylační patern.

V tomto případě je obvyklým paternem ten, který vzniká v přirozeně expresívním systému. Patern je možné upravit tím, že se polypeptid, například neglykosylovaná forma, vystaví působení vhodných glykosylovaných proteinů zavedených do heterogenního expresívního systému. Receptorový gen může být transformován spolu s jedním nebo více geny, které kódují savčí nebo jiné glykosylační enzymy. Za použití uvedeného přístupu jistý savčí glykosylační paterny lze dosáhnout v prokaryontních nebo jiných buňkách.

Zdrojem DTLR eukaryontní nebo prokaryontní hostitel exprimující rekombinantní DTLR, jako se popisuje shora v textu. Zdrojem může být také buněčná linie, jako jsou fibroblasty Swiss 3T3, ale v případě, že je výhodné, aby preferovaná buněčná linie byla podle vynálezu z lidského zdroje, mohou se použít i jiné savčí buněčné linie.

Nyní, když jsou známy sekvence, je možné běžným způsobem syntézy peptidů připravit fragmenty proteinů DTLR primátů nebo jejich deriváty. Tyto postupy zahrnují ty, co se popisují v publikaci Stewart and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and • · · • ··« * · · · • · · · · «

Bodanszky (1984) The practice of Peptide Synthesis, SpringerVerlag, New Yourk; a Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York.

Může se například použít azidový postup a postup za použití kyselého chloridu, kyselého anhydridu, postup používající směs anhydridů, proces s aktivními estery (například pnitrofenylester, N-hydroxysukcinimidester nebo kyanometylester), postup za použití karbodiimidazolu, oxidačně redukční postup nebo dicyklohexylkarbodiimidový (DCDC)/aditivní postup. U všech uvedených postupech je možné aplikovat syntézy na pevné fázi a v roztoku. Podobné metody lze použít s částečnými sekvencemi DTLR.

Proteiny DTLR, jejich fragmenty nebo deriváty jsou vhodné pro přípravu v souladu se shora uvedenými postupy, které se v typickém případě používají při syntéze peptidů. V obecném případě jde o tzv. stupňovité procesy, které zahrnují kondenzaci aminokyseliny s terminální aminokyselinou jedna po druhé v sekvenci nebo kondenzaci peptidových fragmentů s terminální aminokyselinou. Aminoskupiny, které se nepoužívají při tvorbě peptidové vazby se musí v typickém případě chránit, aby se zabránilo vzniku peptidové vazby na nesprávném místě.

Jestliže se použije syntéza na pevné fázi C-terminální aminokyselina se váže na nerozpustný nosič nebo podklad prostřednictvím své karboxylové skupiny. Nerozpustný nosič není zvláště omezen do té doby pokud má vazebnou kapacitu s reaktivní karboxylovou skupinou. Příklady takových nerozpustných nosičů zahrnují halometylové pryskyřice, takové jako jsou chlorometylová nebo bromometylová, hydroxymetylová a fenolová pryskyřice, tert-alkyloxykarbonylhydrazidované pryskyřice a podobně.

Aminokyselina s chráněnou aminoskupinou je vázána na sekvenci kondenzací své aktivované karboxylové skupiny a reaktivní aminoskupiny dříve vytvořeného peptidů nebo řetězce, aby došlo • · · ·

k postupné syntéze peptidu. Po syntéze celé sekvence se peptid oddělí od nerozpustného nosiče za vzniku peptidu. Tento přístup na pevné fázi se popisuje v publikaci Merrifield, et al. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156.

Připravený protein nebo jeho fragmenty se mohou izolovat a čistit z reakční směsi způsobem separace peptidu, například extrakcí, precipitací, elektroforézou, různými formami chromatografie a podobně. Receptory podle vynálezu lze získat v různých stupních čistoty v závislosti na požadovaném použití. Čištění může být doprovázeno použitím zde popsané metody čištění proteinů nebo použitím protilátek, které se popisují v metodách imunoabsorbční afinitní chromatografie. Imunoabsorbční afinitní chromatografie probíhá tak, že se nejdříve protilátky navážou na pevný povrch a pak přijdou do kontaktu z rozpuštěným lyzátem vhodných buněk. Lyzáty jiných buněk exprimující receptor nebo lyzáty nebo supernatanty buněk produkující protein jsou výsledkem metod manipulace DNA, jak se popisuje dále v textu.

V obecném případě čištěný protein, který dosahuje alespoň přibližně 40 % čistoty , obyčejně alespoň přibližně 50 % čistoty, obvykle alespoň přibližně 60 % čistoty, v typickém případě alespoň 70 % čistoty, více typické je alespoň 90 % čistota a upřednostňuje se alespoň 95 % čistota a v určitém provedení vynálezu je čistota 97 až 99 % a více. Čistota se obvykle vztahuje na hmotnost, ale může se také vztáhnout na molaritu. Dále se mohou aplikovat různé testy podle potřeby.

VI. Protilátky

Protilátky se mohou tvořit proti různým savčím proteinům DTLR nebo jejich fragmentům, například proteiny primátů, v přirozeně se vyskytujících nativních formách a v jejich rekombinantních formách. Rozdíl je, že protilátky k aktivnímu receptorů pravděpodobněji rozeznávají epitopy, které jsou pouze přítomny v přirozené konformaci. Detekce denaturovaného antigenu se může také použít například při westernově analýze. Mohou se také použít anti-idiotypické protilátky, které se mohou použít jako agoništy nebo antagonisty přirozeného receptorů nebo protilátek.

Protilátky zahrnující vazebné fragmenty a verze s jedním řetězcem, které vznikly proti předem určeným fragmentům proteinu, mohou vznikat imunizací zvířat s konjugáty fragmentů s imunogenními proteiny. Monoklonální protilátky se připravují z buněk, které vylučují požadované protilátky. U těchto protilátek je možné testovat schopnost vázat se na normální nebo defektní protein nebo agonistickou nebo antagonistickou aktivitu. Tyto monoklonální protilátky se obvykle vážou v případě, že hodnota K_D je přibližně 1 mM, obvykle alespoň přibližně 300 μΜ, v typickém případě alespoň přibližně 100 μΜ, ve více typickém případě alespoň přibližně 30 μΜ, upřednostňuje se alespoň přibližně 10 μΜ a více se upřednostňuje alespoň přibližně 3 μΜ nebo lepší.

Protilátky zahrnující fragmenty vázající antigen podle vynálezu jsou podstatné při diagnostickém a terapeutickém použití. Mohou být silnými antagonisty, který se vážou na receptor a inhibují navázání ligandu nebo inhibují schopnost receptorů vyvolat biologickou odezvu, mohou například působit na jeho substrát. Mohou se také použít protilátky, které nejsou neutralizační a mohou se spojovat s toxiny nebo radionukleotidy, aby se navázaly na produkční buňky nebo buňky, které se nacházejí u zdroje interleukinu. Dále se tyto látky mohou spojovat s léky nebo jinými terapeutickými činidly, buď přímo nebo nepřímo pomocí linkeru.

Protilátky podle vynálezu se mohou také použít při diagnostických aplikacích. Záchytné protilátky nebo protilátky, které nejsou neutralizační, se mohou vázat na receptor aniž inhibují Neutralizační protilátky navázání ligandu se mohou použít vazebných testech. Mohou se také použít nebo substrátu, v kompetetivních při detekci a

New York. Mezi s antigenem. Krev kvantifikaci ligandů. Mohou se také použít jako činidla pro ananlýzu westernovým přenosem nebo při imunoprecipitaci nebo imunočištění proteinu.

Proteinové fragmenty se mohou spojovat s jinými materiály , zvláště s polypeptidy, jako fúzní nebo kovalentně spojené polypeptidy, které se používají jako imunogeny. Savčí DTLR a jiné fragmenty se mohou fúzovat nebo se kovalentně vázat s různými imunogeny, jako je hemocyanin přílipkovitých plžů, albumin bovinního séra, toxoid tetanu atd.. Příprava polyklonálního antiséra se popisuje v publikaci Microbiology , Hoeber Madical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specifity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; a Williams et al., (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academie Press, typické metody patři hyperimunizace zvířat zvířat se pak hromadí krátce po opakované imunizaci a izoluje se gama-globulin.

V některých případech je nutné připravit monoklonální protilátky z různých savčích hostitelů, jak jsou myši, hlodavci, primáti, lidé atd.. Popis metod pro přípravu takových monoklonálních protilátek je uveden například v publikaci Stites et al., (eds) Basic and Clinical immunology (4^th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA a Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antobodies: Principles and Practice (2d ed.) Academie Press, New York, a zvláště pak v Kohler and Milstein (1975) Nátuře 256: 495-497. Tyto metody zahrnují injekční aplikaci imunogenu zvířatům. Zvířata se pak usmrtí a z jejich sleziny se odeberou buňky, které se spojí s buňkami myelomu. Výsledkem je hybridní buňka nebo hybridom, který je schopný se reprodukovat in vitro. Populace hybridomů se pak testuje za účelem izolace jednotlivých klonů, kdy každý z nich vylučuje jeden druh protilátek proti imunogenu. Tímto způsobem získané protilátky jsou produktem imortalizovaných a * · · · « · · · · • · · · · enzymy, látky, podobně klonovaných buněk B jediného druhu, které pochází z imunizovaných zvířat vznikajících jako odezva na specifické místo rozeznávané na imunogenní látce.

Jiné vhodné metody zahrnují expozici lymfocytů in vitro k antigenním polypeptidům nebo v jiném případě k výběru knihoven protilátek ve fágových nebo podobných vektorech (popisuje se například v publikaci Huse et al. (1989) „Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science 246: 12751281 a Ward, et al., (1989) Nátuře 341: 544-546). Polypeptidy a protilátky podle vynálezu se mohou použít s úpravou nebo bez ní, což zahrnuje chimérické nebo humanizované protilátky. Polypeptidy nebo protilátky jsou často značeny kovalentním nebo nekovalentním spojením s látkou, která poskytuje detekovatelný signál. Je známo velké množství značek a konjugačních metod a popisují se ve velkém množství vědecké a patentové literatury. Vhodné značení zahrnuje radionukleotidy, substráty, ko-faktory, inhibitory, fluorescenční chemoluminiscenční látky, magnetické partikule a Uvedená značení se popisují v US patentech č.

3,817,837; 3,850,752; 3,9397350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 a 4,366,241. Mohou se také produkovat rekombinanntí nebo chimérické imunoglobuliny, což se popisuje v publikaci Cabilly, US patent č. 4,816,567, nebo se mohou připravit transgenní myši (popisuje se v publikaci Mendez et al., (1997) Nátuře Genetics 15: 146-156).

Protilátky proti vynálezu je možné také použít v afinitní chromatogarfii při izolaci DTLR. Mohou se použít kolony, kde protilátka je navázána na pevný podklad, například částice, jako je agaróza, sephadex nebo podobně, kde buněčný lyzát může procházet skrz kolonou, kolona se promyje, pak se zvýší koncentrace slabého denaturačního činidla, přičemž se uvolní čištěný protein. Protein se může použít při čištění protilátek.

* ·

Protilátky se mohou také použít k testování přítomnosti ♦

určitých expresívních produktů v expresívních knihovnách. Obvykle protilátky používané v takových postupech se značí látkami, které umožňují jednoduchou detekci přítomnosti antigenů tak, že se naváže protilátka.

Protilátky vytvořené proti DTLR se mohou také použít při vytvoření anti-idiotypických protilátek. Ty se mohou použít při detekci nebo diagnostice různých imunologických podmínek, které se vztahují k expresi proteinu nebo buněk, které exprimují protein. Mohou se také použít jako agonisté nebo antagonisté ligandu, které mohou být kompetitivními inhibitory nebo substituenty přirozeně se vyskytujících ligandů.

Proteiny DTLR, které se specificky vážou na protilátky nebo které jsou specificky imunoreaktivní s protilátkami vytvořenými proti definovanému imunogenu, jako je imunogen obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34. V imunologickém testu se v typickém případě používají polyklonální antisérum vytvořené proti například proteinu se sekvencí SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34. Vybralo se antisérum, které vykazuje nízkou zkříženou reaktivitu proti jiným členům rodiny IL-1R. Je to například DTLR1, s výhodou pocházející ze stejných specií, a libovolná taková zkřížená reaktivita je odstraněna před imunologickým testem imunoabsorbcí.

Za účelem produkce antiséra při použití v imunologickém testu se izoluje protein se sekvencí SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34 nebo její kombinace způsobem, který se popisuje shora v textu. Rekombinantní protein se může například produkovat v savčí buněčné linii. Vhodný hostitel například inbrední kmen myši, jako je balb/c, se imunizuje vybraným proteinem v typickém případě za použití standardních adjuvans, jako Freundovo adjuvans a standardní imunizačni protokol vhodný pro myši {Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal

Antobodies: Principles and Practice (2d ed.) Academie Press, New York). V jiném případě se může použít syntetický peptid získaný ze zde popsaných sekvencí a spojený s nosičovým proteinem. Shromáždila se polyklonální séra a titrovala se proti imunogennímu proteinu v imunologickém testu, například imunologický test na pevném podkladu. Vybrala se polyklonální antiséra s titrem 10⁴ nebo vyšším a testuje se jejich zkřížená reaktivita proti jiným členům rodiny IL-1R, například myšší DTLR nebo lidský DTLRl, za použití kompetitivního imunologického testu, který se popisuje v publikaci Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antobodies: Principles and Practice (2d ed.) Academie Press, New York na stránkách 570-573. Upřednostňuje se, aby alespoň dva členové rodiny DTLR se použily při tomto stanovení při křížovém spojení s libovolným nebo s některým lidským DTLR2-10. Tyto členové rodiny IL-1R se mohou produkovat jako rekombinantní proteiny a mohou se izolovat za použití metod standardní molekulární biologie a zde popsaných metod chemie proteinů.

Imunologické testy ve formátu kompetitivního navázání se může použít při stanovení zkřížené reaktivity. Například proteiny se sekvencí SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34 nebo různé jejich fragmenty se mohou imobilizovat na pevném povrchu. Proteiny přidané do imunologického testu soutěží s navázáním antiséra na imobilizovaný antigen. Schopnost shora uvedených proteinů soutěžit s navázáním antiséra na imobilizovaný protein se porovnává s proteinem se sekvencí SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34. Procento zkřížené reaktivity shora uvedených proteinů se vypočítá za použití standardních výpočtů. Vybrala se ta antiséra s méně než 10 % zkříženou reaktivitou s každým se shora v textu uvedených proteinů. Zkříženě reagující protilátky se pak z antiséra odstraní imunoabsorbcí shora uvedenými proteiny.

Imunologicky absorbované antisérum se pak používá při imunologickém testu kompetitivního navázání, jak se popisuje shora v textu, aby se porovnal druhý protein s imunogenním proteinem (např. protein podobný IL-1R se sekvencí SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34). Za účelem porovnat dva proteiny, se každý z nich testuje v širokém rozmezí koncentrací a stanovuje se množství každého proteinu, které je nutné pro inhibici 50 % navázání antiséra na imobilizovaný protein. Jestliže množství požadovaného druhého proteinu je menší než dvojnásobek množství vybraného proteinu nebo proteinů, které jsou nutné, pak se o druhém proteinu říká, že se specificky váže na protilátky vytvořené proti inmunogenu. Rozumí se, že tyto proteiny DTLR jsou členy rodiny homologních proteinů, které zahrnují alespoň 10 identifikovaných genů. V případě určitého genového produktu, jako je DTLR2-10, termín neznamená pouze zde popsané aminokyselinové sekvence, ale také jiné proteiny, které jsou nebo nejsou alely nebo specifické varianty. Také se rozumí, že termíny zahrnují nepřirozené mutace zavedené záměrnými mutacemi za použití běžných metod rekombinace, jako jsou mutace v jednom místě nebo vypuštění krátkých oblastí DNA kódující reprezentativní proteiny nebo substituce nových aminokyselin nebo přidání nových aminokyselin. Takové minoritní změny musí v podstatě udržovat imunologickou identitu původní molekuly a/nebo její biologickou aktivitu. Tyto změny zahrnují proteiny, které jsou specificky imunoreaktivní s přirozeně se vyskytujícím proteinem příbuzným IL-1R , jsou to například proteiny DTLR mající sekvenci SEQ ID NO: 4, 6, 26, 10, 12, 16, 18, 32, 22 nebo 34. Biologické vlastnosti změněných proteinů se mohou stanovit expresí proteinu ve vhodné buněčné linii a měřením vhodného účinku na lymfocyty. Určité úpravy proteinů budou zahrnovat konzervativní substituce aminokyselin s podobnými chemickými vlastnostmi, jak se popisuje shora v textu pro rodinu IL-1R jako celek. Uspořádáním proteinu optimálně • · s proteinem DTRL2-10 a použitím běžných zde popsaných imunologických testů se stanoví imunoidentita a může se stanovit složení proteinu podle vynálezu.

VII. Kity a kvantifikace

V křtech a v testech se používají přirozeně se vyskytující a rekombinantní formy molekul podobné IL-1R podle vynálezu. Tyto metody je možné také aplikovat při testování vazebné aktivity například ligandů těchto proteinů. Za poslední roky se vyvinulo několik metod automatických testů, které umožňují testování desetitisíců látek za rok {popisuje se například v publikaci BIOMEK automated workstation, Beckman Instruments, Palo Alto, California a Fodor, et al., (1991) Science 251: 767-773) . Později se popisují způsoby testování schopnosti vázat se velkým množstvím definovaných polymérů syntetizovaných na pevném substrátu. Vývoj vhodných testů pro testování ligandů agonistických/antagonistických homologních proteinů lze snadno dosáhnout dostupností velkého množství čištěných rozpuštěných DTLR v aktivním stádiu, jak popisuje vynález.

Čištěné DTLR mohou přímo potáhnout destičky vhodné pro použití shora zmiňovaných metod testování ligandů. Protilátky, které nejsou neutralizační pro tyto proteiny se mohou použít jako zachycené protilátky pro účely imobilizace receptoru na pevné fázi, což lze použít například pro diagnostické účely.

Vynález dále popisuje použití DTLR 2-10, jejich fragmentů, peptidů a jejich fúzních produktů v různých diagnostických křtech a při metodách, které detekují přítomnost proteinu nebo jeho ligandů.

V jiném případě nebo navíc protilátky proti molekulám se mohou začlenit do kitů a metod. V typickém případě kit bude mít oddělení obsahující buď definovaný peptid DTLR nebo segment genu nebo činidlo, které rozeznává jedno nebo druhé.

V typickém případě rozeznávající činidlo v případě peptidu • · · «

Existují různé rádioimunologický bude receptorem nebo protilátkou nebo v jiném případě segmentem genu nebo hybridizačni sondou.

Preferovaný kit pro stanovení koncentrace, například DTLR4, ve vzorku v typickém případě bude obsahovat jako pozitivní kontrolu značenou látku, například ligand nebo protilátku, která má známou vazebnou afinitu pro DTLR4 (přirozeně se vyskytující nebo rekombinant) a způsoby oddělení vázaných značených látek od volných. Jde například o pevnou fázi pro imobilizaci DTLR4 v testovaném vzorku. V normálním případě se připravují části obsahující činidla a instrukce.

Protilátky zahrnující fragmenty vázající antigen, které jsou specifické pro savčí DTLR nebo fragment peptidu nebo receptorové fragmenty se používají při diagnostických aplikacích pro detekci přítomnosti hodnotitelného množství ligand a/nebo jeho fragmentů. Diagnostické testy mohou být homogenní (bez kroku separace mezi volným činidlem a komplexem protilátka-antigen) nebo heterogenní (s krokem separace).

komerční testy, takové jako je test (RIA), test ELISA, enzymatický imunologický test (EIA), enzymatický vícenásobný imunologický test (EMIT), imunologický test s fluorescenčně značeným substrátem (SLFIA) a podobně. Neznačené protilátky použít jako druhé protilátky, které jsou značené rozeznávají protilátky proti DTLR4 nebo fragmenty. Tyto testy se také popisují v publikaci Harlow and Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH., a Coligan (Ed.) (1991) Current Protocols In Immunology Greene/Wiley, New je mozne a které jejich určité

York.

Anti-idiotypické protilátky se mohou používat v podobném případě, přičemž slouží jako agonisty nebo antagonisty DTLR4. Za vhodných okolností se mohou použít jako terapeutická činidla.

Činidla použitelná při diagnostických testech jsou zahrnuta v křtech a slouží k optimalizaci citlivosti testu. Výběr • · · ·

podstaty testu, protokolu, značení, značených nebo neznačených protilátek nebo značeného ligandu závisí na povaze subjektu vynálezu. To je obvyklé při kombinaci s jinými doplňky, jako jsou pufry, stabilizátory, materiály nezbytné pro produkci signálu , jako jsou substráty pro enzymy a podobně. Upřednostňuje se, aby kity obsahovaly instrukce pro správné použití a nástroje pro likvidaci použitého obsahu. V typickém případě kit má oddělení pro každé používané činidlo a bude obsahovat instrukce pro správné použití a likvidaci činidel. Je-li to nutné, činidla se mohou připravovat v suché formě, jako lyofilizovaný prášek, přičemž se činidla mohou rekonstituovat ve vodném médiu tak, aby měly vhodnou koncentraci pro test.

Shora uvedené konstituenty diagnostických testů se mohou použít bez úpravy nebo se mohou upravovat různými způsoby. Například značení se může dosáhnout kovalentním nebo nekovalentním připojením látky, která poskytuje přímo nebo nepřímo detekovatelný signál. V libovolném z těchto testů testovaná látka, DTLR nebo protilátky proti DTLR mohou být značeny buď přímo nebo nepřímo. Možnosti přímého značení zahrnují značící skupiny: radioaktivní značení, jako je například použitím ¹²⁵I, enzymy (popisuje se v publikaci US patent č. 3,645,090), jako je například peroxídáza a alkalická fosfatáza, a fluorescenční značení (US patent č. 3,940,475), kde se mohou monitorovat změny v intenzitě fluorescence, v posunu vlnové délky nebo v polarizaci fluorescence. Možnosti nepřímého značení zahrnují biotinylaci jednoho konstituentu, pak následuje navázání na avidin, který je spojený s jednou se shora uvedených značících skupin.

Existuje také řada metod separace vázaných a volných ligandů nebo v jiném případě vázaných a volných testovaných látek. DTLR se může imobilizovat na různých matricích a pak následuje promýváni. Vhodné matrice zahrnují plastové destičky pro test ELISA, filtry a kuličky. Metody imobilizace receptoru na • · to · ·« ·· toto to · · · » • •to · toto· ···· toto ·* matrici zahrnují bez omezení přímou adhezi k plastům, použití protilátek, chemické interakce a biotin-avidin. Poslední krok v tomto přístupu zahrnuje srážení komplexu protilátka/antigen libovolnou z několika metod, které využívají organické rozpouštědlo, jako je polyetylenglykol nebo sůl, jako je síran amonný. Jiné vhodné dělící metody zahrnují bez omezení metodu využívající magnetizovatelné částice nesoucí protilátky značené fluoresceinem jak se popisuje v publikaci Rattle te al., (1984) Clin. Chem. 30(9): 1457-1461 a separaci dvojích magnetických partikulí nesoucí protilátky, což se popisuje v publikaci US patent č. 4, 659,678.

Metody vhodné pro navázání proteinů nebo fragmentů na různé značení se popisují v literatuře a není třeba je zde uvádět. Řada metod spojení zahrnuje použití aktivovaných karboxylových skupin buď prostřednictvím použitím karbodiimidu nebo aktivních esterů za vzniku peptidových vazeb, tvořením thioeterů reakcí merkaptoskupiny s aktivovaným halogenem, jako je chloroacetyl nebo aktivovaný olefin, jako je maleimid nebo podobně. Při těchto aplikacích lze použít také fúzní proteiny. Vynález dále popisuje použití oligonukleotidových a polynukleotidových sekvencí získaných ze sekvence DTLR. Tyto sekvence se mohou použít jako sondy při detekci množství DTLR u pacientů, u kterých se předpokládá, že mají imunologickou poruchu. V literatuře se také popisuje přítomnost RNA a DNA nukleotidových sekvencí, značení sekvencí a preferovaná velikost sekvencí. V normálním případě oligonukleotidová sonda by měla mít přibližně 14 nukleotidů, obvykle alespoň přibližně 18 nukleotidů a polynukleotidové sondy mohou obsahovat až několik kilobází. Může se použít řada značení, nejběžnějšími jsou radionukleotidy zvláště pak ³²P. Mohou se také použít jiné metody, jako je použití nukleotidů upravených biotinem, které se zavedou do polynukleotidu. Biotin pak slouží jako místo pro navázání avidinu nebo protilátek, které se mohou značit velkým počtem značek, jako jsou radionukleotidy, fluorescenční

• 9 9 · činidla a podobně. V jiném případě se mohou použít protilátky, které mohou rozeznat specifické duplexy zahrnující DNA duplexy, RNA duplexy, DNA-RNA hybridní duplexy nebo duplexy DNA-protein. Naopak protilátky se mohou značit a test může probíhat v případě, že duplex se váže na povrch tak, že tvoří na povrchu duplex. Může se detekovat přítomnost protilátek vázaných na duplex. Použití sond vhodnou pro novou antimediátorovou RNA libovolnou běžnou metodou, jako je hybridizace nukleové kyseliny, plus a mínus test, rekombinatní testování sondami, translace uvolněná hybridem (HRT), translace zastavená hybridem (HART). Mohou se také použít amplifikační techniky, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR).

Vynález dále popisuje diagnostické kity, které se také používají při testování kvalitativní a kvantitativní přítomnosti jiných markérů. Diagnóza a prognóza může také záviset na kombinaci více indikací, které se používají jako markéry (popisuje se například v publikaci Viallet, et al (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97).

VIII. Terapeutické využití

Vynález poskytuje činidla, které jsou podstatná pro terapeutické účely. Proteiny DTLR (přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní), jejich fragmenty, muteinové receptory a protilátky spolu s látkami, u kterých se stanovilo, že vykazují vazebnou afinitu k receptorúm nebo k protilátkám, nacházejí použití při léčbě podmínek vykazujících abnormální expresi receptorů jejich ligandů. Takové abnormality se budou v typickém případě vyjadřovat jako imunologické poruchy. Navíc tento vynález se používá při léčbě různých onemocnění nebo poruch spojených s abnormální expresí nebo abnormálním spuštěním odezvy na ligand. Naznačuje se, že ligandy Toll se podílejí na morfologickém vývoji, například na stanovení dorzo-ventrální polarity, na imunitních odezvách, zvláště na • · · · • · · · v lyofilizované stabilizovaných primitivních vrozených odezvách (popisuje se v publikaci Sun et al., (1991) Eur. J. Biochem. 196: 247-254; Hultmark (1994) Nátuře 367: 116-117.

Rekombinantní proteiny DTLR, muteiny, agonistické nebo antagonistické protilátky proti proteinům se mohou čistit a pak aplikovat pacientovi. Tato činidla se mohou kombinovat pro terapeutické použití s dalšími aktivními ingrediencemi, například v běžných farmaceuticky přijatelných nosičích nebo ředidlech spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátory a ekcipienty. Tyto kombinace mohou být sterilní, například filtrované a rozdělené do dávkových forem například formě v ampulích nebo skladovat ve vodných přípravcích. Tento vynález také popisuje použití protilátek nebo jejich vazebných fragmentů, které nejsou zcela navázané.

Testování ligandů za použití DTLR nebo jejich fragmentů se může uskutečnit pro identifikaci molekul, které mají vazebnou afinitu na receptory. Následující biologické testy se pak mohou využívat ke stanovení, zda putativní ligand může poskytnout kompetitivní navázání, které může blokovat podstatnou stimulační aktivitu. Fragmenty receptorů se mohou použít jako blokátor nebo antagonista v tom, že blokuje aktivitu ligandu. Látka vykazující podstatnou stimulační aktivitu může aktivovat receptor a je tak agonistou v tom, že stimuluje aktivitu ligandu, například vyvolává signál. Vynález dále zahrnuje použití protilátek proti DTLR jako antagonistů pro terapeutické účely.

Množství činidel nezbytných pro účinnou terapii závisí na mnoho různých faktorů, které zahrnují způsoby aplikace, cílové místo, fyziologické stádium pacienta a jiné aplikovatelné léky. Tak dávky určené k léčbě by optimalizace bezpečnosti a účinnosti případě dávky užívané in vitro mohou být předlohou v případě in šitu aplikace těchto činidel. Testování účinné dávky pro se měly za účelem titrovat. V typickém • · · · léčbu na zvířat poskytne další předem určenou indikaci lidské dávky. Různé úvahy se popisují například v publikaci Gilman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8^th Ed., Pergamon Press; a Remington's Pharmaceutical Sciences , (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Penn.. Metody vhodné pro aplikaci, které se uvádějí zde nebo dále v textu, jsou například orální, intravenózní, intraperitonální nebo intramuskulární aplikace,

Farmaceuticky přijatelné transdermální difúze nebo jiné. nosiče zahrnují vodu, fyziologický roztok, pufry a jiné látky popisované například v publikaci Merck Index, Merck and Co., Rahway, New Jersey. Vzhledem k pravděpodobnému navázání s vysokou afinitou nebo vzhledem k obrácenému počtu mezi putativním ligandem a jeho receptory, se očekává, že nízké dávky těchto činidel budou účinné. Průběh signalizace naznačuje, že extrémně nízké množství ligandu může být účinné. Očekává se, že rozmezí dávky je menší než koncentrace 1 mM, v typickém případě nižší než přibližně 10 μΜ, obvykle nižší než přibližně 100 nM, upřednostňuje se nižší než přibližně 10 pM (pikomolární) a nejvíce se upřednostňuje méně než přibližně 1 fM (femtomolární) s vhodným nosičem. Za účelem kontinuální aplikace se využívá pomalé uvolňování formulací nebo vehikl umožňující pomalé uvolňování.

Proteiny DTLR, jeho fragmenty a protilátky nebo jejich fragmenty, antagonisty a agonisty se mohou aplikovat přímo léčenému hostiteli v závislosti na velikosti látek. Může být nutné je před jejich aplikací spojit s nosičovými proteiny, jako jsou ovalbumin nebo sérový albumin. Terapeutické formulace se mohou aplikovat v libovolné běžně dávkované Zatímco v případě aktivní složky je možné ji samotnou nebo je výhodné ji prezentovat jako Formulace obsahuje alespoň jednu aktivní ingredienci, jak se definuje shora v textu spolu s jedním nebo více přijatelnými nosiči. Každý nosič musí být formulaci aplikovat farmaceutickou formulaci.

• · · · • · • · jak farmaceuticky tak fyziologicky přijatelný ve smyslu, že je kompatibilní s jinými složkami a neuškodí pacientovi. Formulace zahrnují ty, které jsou vhodné pro orální, rektální, nasální nebo parenterální (zahrnující podkožní, intramuskulární, intravenózní a intradermální) aplikace. Formulace mohou být s výhodou přítomny v jednotkové dávce a mohou se připravovat libovolným způsobem, který je znám v oboru farmacie (popisuje se v publikaci Gilman et al., (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8^th Ed., Pergamon Press; a Remington 's Pharmaceutical Sciences (současné vydání), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; a Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY) . Terapie podle vynálezu se může kombinovat nebo použít ve spojení s jinými terapeutickými činidly, zvláště s agonisty nebo antagonisty jiných členů rodiny IL-1.

IX. Ligandy

Popis receptorů Toll poskytuje způsoby identifikace ligandu, jak se popisuje shora v textu. Takový ligand by se měl vázat specificky na receptor s významně vysokou afinitou. Je možné připravit různé konstrukce, které umožňují buď značení receptorů za účelem detekce jeho ligandu. Například přímo značené DTLR, které fúzují s markéry za účelem sekundárního značení například FLAG nebo jiného epitopu tags atd., umožňují detekci receptorů. To může také sloužit jako afinitní metoda pro biochemickém čištění nebo značení nebo při výběru při expresívním klonování. Pro přípravu vhodných konstrukcí s dostupnými sekvencemi DTLR se může také aplikovat dvou hybridní selekční systém (Fields and Song (1989) Nátuře 340: 245-246).

V obecném případě popis DTLR se může analogicky aplikovat na jednotlivá specifická provedení určená pro činidla a kompozice DTLR2, DTLR3, DTLR4, DTLR5, DTLR6, DTLR7, DTLR8, DTLR9 a /nebo DTRL10.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 je schématické porovnání architektury proteinu DTLR Drosophila a člověka a jejich vztah k IL-1 receptorům obratlovců a proteinů nesoucích rezistenci proti rostlinným nemocem. Tři DTLR Drosophila (Dm) (Toll, 18w, a Mst ORF fragment) (Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371.399; Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239; Mitcham, et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783; Eldon et al., (1994) Develop. 120: 885-899) jsou uspořádány vedle čtyř celých (DTLR 1 až 4) a jednoho částečného (DTLR5) lidského (Hu) receptoru. Jednotlivý LRR v receptorových ektodoménách, které jsou označeny velkými písmeny (Attwood, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 212-217) jsou explicitně označeny rámečky; horní a spodní klastry bohaté na Cys, které lemují C- a N.terminální konce souborů LRR, jsou naznačeny vzájemně se dotýkajícími polokruhy. Ztráta vnitřní oblasti bohaté na Cys v DTLR 1 až 5 je ve prospěch jejich menších ektodomén (558, 570, 690 a 652 aa) v případě, že se porovnávají s 784 a 977 přesahy Toll a 18w. Neúplné řetězce DmMst a HuDTLR5 (ektodomény 519 a 153 aa) reprezentují čárkované čáry. Vnitrobuněčný signální modul běžný pro DTLR, receptory typu IL-1 (IL-1R), vnitrobuněčný protein Myd88 a produkt genu N nesoucího rezistenci proti onemocnění tabáku (DRgN) jsou označeny pod membránou. Popisuje se v publikacích Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475; Rock et al., (1998) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95: 588. Další domény zahrnují v IL-1R (disulfidovým můstkem spojené smyčky) tři moduly podobné Ig. Protein DRgN vykazuje doménu NTPázy (rámeček) a Myd88 má mrtvou doménu (černý ovál).

• ·

Obrázky č. 2A až 2B ukazují konzervativní strukturální paterny všech signálních domén cytokinových receptorů podobných Toll a IL-1 a dva divergentní modulační proteiny. Obrázek č. 2A uspořádání sekvence běžné domény TH. Proteiny DTLR jsou označeny jako na obrázku č. 1; lidské (Hu) nebo myší (Mo) receptory rodiny IL-1 (IL-1R1-6) jsou sekvenčně číslovány jak se dříve uvádí v publikacích Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13: 2467-2475); Myd88 a sekvence z rostlin tabáku (To) a lnu , L. usitatissimum (Lu) reprezentují C- a N-terminální domény větších molekul, které obsahují více domén. Bloky sekvencí jsou označeny rámečkem, které jsou očíslovány od 1 do 10. Trojúhelníky označují deleční mutace , zatímco zkrácení Nkonce označené šipkou eliminuje u lidského IL-lRl bioaktivitu (Heguy, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267: 2605-2609). Předpovězené sekundární struktury PHD (popisuje se v publikaci Rošt and Sander (1994) Proteins 19: 55-72) a DSC (King and Sternberg (1996) Protein Sci. 5: 2298-2310) jsou označeny jako α-helix (Η), β-řetězec (E) nebo dvoušroubovice (L). Vystínované schéma aminokyselin označuje chemicky podobné zbytky: hydrofóbní, kyselé, bazické, Cys, aromatické, s porušenou strukturou a malé.

Diagnostické sekvenční paterny pro IL-1R, DTLR a plné uspořádání (ALL) se odvodily úmluvou při přísnosti 75 %. Symboly sad aminokyselin jsou: o značí alkohol; 1 značí alifatickou aminokyselinu; · značí libovolnou aminokyselinu; a značí aromatickou aminokyselinu; c značí aminokyselinu nesoucí náboj; h značí hydrofóbní aminokyselinu; - značí negativní aminokyselinu; p značí polární aminokyselinu; + značí pozitivní aminokyselinu; s značí malou aminokyselinu; u značí malinkou aminokyselinu; t značí ohyb. Obrázek č. 2B ukazuje diagram topologie navrženého svinutí domény ΤΗ β/α. Paralelní β-list (s β-řetězci A až E jako žluté trojúhelníky) se pravděpodobně nachází na C-terminálním konci; α-helix (kroužky • · · · • · · · · · označené 1 až 5 ) spojené s β-řetězci; 5etězcová spojení jsou s přední částí (viditelná) nebo se zadní částí (skryté). Konzervativní nabité zbytky na C-konci β-listu jsou označeny šedivou (Asp) nebo jako volný černý (Arg) zbytek (uvedeno v textu).

Obrázek č. 3 ukazuje vývoj signální domény super-rodiny. Uspořádání více TH modulů na obrázku č. 2 se používá pro získání fylogenetického stromu podle metody Neighbor-Joinong (popisuje se v publikaci Thompson, et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680).

Obrázek č. 4 zobrazuje mapování chromozomu lidských genů DTLR metodou FISH. Denaturované chromozomy ze synchronních kultur lidských lymfocytů se hybridizovaly se sondami cDNA DTLR značenými biotinem, aby se určila jejich poloha. Spojení dat FISH mapování (nalevo, Obrázky č. 4A, DTRL2; 4B, DTRL3; 4C, DTRL4; 4D, DTRL5) s chromozomálními pruhy se dosáhlo skládáním FISH signálů s DAPI pruhy chromozomů (panely ve středu) (popisuje se v publikaci Heng and Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33: 109-122. Analýzy jsou shrnuty do formy ideogramů lidského chromozomu (panely na pravé straně).

Obrázky č. 5A až 5F analýzy přenosu mRNA lidských DTRL. Lidské vícenásobné tkáňové bloty (symbol He značí srdce; Br značí mozek; Pl značí placentu; Lu značí plíce; Li značí játra; Mu značí svaly; Ki značí ledviny; Pn značí pankreas; Te značí varle; Ov značí vaječníky;SI značí tenké střevo; Co značí tlusté střevo; PBL značí periferní krevní lymfocyty) a rakovinová buněčná linie (promyelocytická leukémie, HL60; karcinom děložního čípku, HELAS3; chronická myelogenní leukémie, K562; lymfoblastická leukémie, Molt4; kolorektální adenokarcinom, SW480; melanom, G361; Burkittův lymfom, Ráji; Burkittův kolorektální adenokarcinom, SW480; karcinom plic, A549), které obsahují přibližně 2 pg poly(A)⁺RNA v jedné dráze se testovaly sondou, kterou je radioaktivně značená cDNA kódující DTLR1 (Obrázky 5A až 5C) , DTLR2 (Obrázek č. 5D) , • · · · • · · ·

DTLR3 (obrázek č. 5A) a DTLR4 (obrázek č. 5F) . Bloty se exponovaly na film po dobu dvou dnů (obrázky č. 5A až 5C) nebo jeden týden (obrázky č. 5D až 5F) při teplotě -70 °C se zesilujícími obrazovkami. V některých drahách se objevily anomální specie o velikosti 0,3 kB. Hybridizační experimenty vyloučily kódy pro cytoplazmatické fragmenty DTLR.

Příklady provedení vynálezu

I. Obecné metody

Některé ze standardních metod se popisují v publikaci Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brooklyn, NY; nebo Ausubel, et el., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Metody pro čištění proteinů zahrnují takové metody jako je srážení síranem amonným, kolonová chromatografie, elektroforéza, centrifugace, krystalizace a jiné (popisuje se v publikaci Ausubel, et el., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; Coligan, et al. (ed. 1996) and periodic supplements, Current Protocols In Protein Science Greene/Wiley, New York; Deutscher (1990) „Guide to Protein Purification in Methods in Enzymology, vol. 182 a jiné díly této série a publikace výrobce, které shrnují použití proteinových čištěných produktů, například Pharmacia, Piscataway, N.J., nebo Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinování rekombinantních metod umožňuje fúzi s vhodnými fragmenty, například se sekvencí FLAG nebo s ekvivalentem, který je možné fúzovat prostřednictvím sekvence, kterou je možné odstranit proteázou (popisuje se v publikaci Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent

Setlow (ed.) Genetic Engineering,

Principle and Methods 12: 87-98, Plenům Press, N.Y.; a Crowe, et al. (1992) OIA express: The High Level Expression and Protein Purification System QUIAGEN, lne. Chatsworth, CA.

Standardní imunologické metody a testy se popisují například v publikaci Hertzenberg, et al., (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; a Methods in Enzymology díly 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 a 163.

Testy vaskulárních biologických aktivit jsou dobře známy v oboru. Budou pokrývat angiogenní a angiostatické aktivity v nádoru nebo v jejich tkáních, například proliferaci arteriálního hladkého svalstva (Koyoma, et al. (1996) Cell 87: 1069-1078), adheze monocytů na vaskulární epitel (popisuje se v publikaci McEvoy, et al. (1997) J. Exp. Med. 185: 2069-2077; Ross (1993) Nátuře 362: 801-809; Rekhter and Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147: 668-677; Thyberg, et al. (1990) Atherosclerosis 10: 966-990 a Gumbiner (1996) Cell 84: 345357 .

aktivit se (ed. 1995) Methods in

Testy neurálních buněčných biologických popisují například v publikaci Wouterlood Neuroscience Prorocols modules 10, Elsevier;

Neurosciences Academie Press; a Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. Metodologie vývojových systémů se popisuje v například v publikaci Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; a Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.

Počítačová analýza sekvence se provedla například za použití dostupného programového vybavení počítače zahrnující programy od instituce GGG (U. Wisconsin) a GenBank. Použily se také veřejné sekvenční databáze například GenBank, NCBI, EMBO a jiné.

» · *> · • · · ·

Řada metod aplikovatelných na receptory IL-10 se mohou aplikovat, jak se popisuje například v USSN 08/110,683 (receptor IL-10).

II. Nová rodina lidských receptorů

Zkratka: DTLR znamená receptor podobný Toll; IL-1R znamená receptor interleukin-1; TH znamená homologie Toll; LRR znamená repetice bohatá na leucin; EST znamená exprimovaná sekvence tag; STS místo sekvence tagg; FISH fluorescenční hybridizace in šitu.

Z objevu sekvenční homologie mezi cytoplazmatickými doménami Toll mušky Drosophila a receptorů lidského interleukinu-1 (IL1) plyne přesvědčení, že obě molekuly spouští příbuzné signální cesty spojené s jadernou translokací transkripčních faktorů typu Rel. Toto konzervativní signální schéma řídí vývoj imunitní odezvy jak u hmyzu tak u obratlovců. Popisuje se klonování molekul nové třídy putativních lidských receptorů s architekturou proteinů, které jsou podobné Toll mušky Drosophila, jak do intracelulárních tak extracelulárních segmentů. Pět lidských receptorů podobných Toll označených DTLR 1 až 5 jsou pravděpodobně přímými homology uvedených molekul a jako takové mohou tvořit u lidí důležitý a nerozeznaný komponent přirozené imunity; vývojové nahromadění protinů DTLR u obratlovců může indikovat jinou úlohu, která je příbuzná s úlohou Toll při dorzo-ventralizaci embrya mušky Drosophila. Mohou sloužit jako regulátory časného morfogenetického paternu. Řada blotů tkáňové mRNA indikuje znatelně odlišné paterny exprese lidských DTLR. Použití fluorescence při hybridizaci in šitu a při analýze databáze sekvence s místem tagg, se také ukázalo, že geny příbuzné DTLR se vyskytují na chromozómech 4 (DTLR 1, 2 a 3) , 9 (DTLR4) a 1 (DTLR5). Předpověď struktury domén, které jsou homologní s Toll (ΤΗ), pocházejících z různých hmyzích nebo lidských DTLR , z receptorů IL-1 obratlovců a z faktorů MyD88 a z proteinů nesoucích rezistenci vůči rostlinným, onemocněním, rozeznávají paralelní β/α svinutí s kyselým aktivním místem. Podobná struktura se objevuje ve třídě regulátorů odezvy, které se u bakterií podílejí na transdukci informací senzorů. Semena morfogenetického jícnu, které tak dramaticky oddělují mouchy od lidí se vnesou do známých zárodečných tvarů a paternů, ale vznikají velmi odlišné buněčné komplexy (popisuje se v publikacích DeRobertis and Sasai (1996) Nátuře 380: 3740; Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61: 7-21).

Tento rozdílný plán vývoje mezi hmyzem a obratlovci je provázen znatelně podobnými signálními cestami a konzervativní proteinové sítě a biochemickými mechanizmy pocházejícími z nestejného genového repertoáru (popisuje se v publikacích Miklos and Rubin (1996) Cell 86: 521-520 a Chothia (1994)

Develop. 1994 Suppl., 27-33). Použitelný způsob, jak zmapovat vývoj těchto regulačních cest je prostřednictvím vnitrodruhového porovnání proteinových sekvencí a struktur a odhadnutím pravděpodobných molekulových komponentů (a biologické funkce) (popisuje se v publikacích Miklos and Rubin (1996) Cell 86: 521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl.,

27-33 (3-5) a Banfi, et al. (1996) Nátuře Genet. 13: 167-174). Univerzální kritický krok v embryonálním vývoji je specifikace tělních os, které se rodí z přirozené asymetrie nebo se spouští vnějším popudem (popisuje se v publikaci DeRobertis and Sasai (1996) Nátuře 380: 37-40; Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61: 7-21). Jako modelový systém se může použít fylogenetické báze a buněčné mechanizmy dorzoventrální polarizace (popisuje se v publikaci DeRobertis and Sasai (1996) Nátuře 380: 37-40; Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech.

Develop. 61: 7-21). Prototyp molekulární strategie pro tuto transformaci vyšla z embrya Drosophila, kde postupné působení malého počtu genů vede k ventralizačnímu gradientu transkripce faktoru „Dorsal (popisuje se v publikaci St. Johnston and • ·

I · · 4 » · · 4

Nusslein-Volhard (1992) Cell 68: 201-219 a Morisato and

Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371-399).

Průběh signálu se soustředí na Toll, což je transmembránový receptor, který transdukuje vazbu původně vylučovaného ventrálního faktoru, Spatzle, do cytoplazmatického vstupu, a aktivuje Pelle, což je Ser/Thr kináza, která katalyzuje disociaci faktoru „Dorsal od inhibitoru Cactus a umožňuje migraci faktoru „Dorsal do ventrálního jádra (Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371-399; Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12: 393-416).

Průběh Toll také řídí u dospělých much indukci silných antimikrobiálních faktorů (Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:

973-983). Tato úloha v imunitní obraně u Drosophila je paralelou mechanizmu průběhu IL-1, který pokrývá imunitu hostitele a protizánětlivé odezvy u obratlovců (popisuje se v publikaci Belvin a Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12: 393-416; Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4: 767771) . Cytoplazmatická doména příbuzná Toll v receptorech IL-1 řídí vazbu kinázy podobné Pelle, IRÁK a aktivaci latentního komplexu NF-κΒ/Ι-κΒ, který zrcadlí faktory Dorsal a Cactus (popisuje se v publikaci Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12: 393-416; Wasserman (1993) Molec. Biol.

Cell 4: 767-771). Vynález popisuje nových až 5 Mech.

klonování a charakterizaci čtyř molekul podobných Toll u lidí, označených DTLR 2 (popisuje se v publikaci Chiang and Beachy (1994)

Develop. 47: 225-239), což umožnilo objevit rodinu těsněji spjatou s homology Toll Drosophila, než s receptory IL-1 obratlovců. Sekvence DTLR se získaly z lidských EST. Tyto částečné cDNA se použily pro získání celých expresívních profilů v lidských tkáních pro pět proteinů DTLR, při mapování chromozornálnich lokací příbuzných genů a při zúžení volby knihoven cDNA při vyhledávání cDNA v plné délce. Po prostudování publikací Banfi, et al., (1996) Nátuře Genet. 13;

·« ·> 00

0 · · 0 0 · ···· • 0 · 0 0·*· • · · · · · ······ · · · 0 ·

...............

167-174 a Wang, et al. {1996) J. Biol. Chem. 271: 4468-4476) se zkonstruoval biologický systém u lidí, který je protějškem regulačního schématu u mušky Drosophila. Navíc biochemický mechanizmus řídící signál Toll je podnícen terciálním svinutím domény homologní s Toll (ΤΗ), modul jádra je sdílen DTLR, široká rodina receptorů IL-1, savčí faktory MyD88 a rostlinné proteiny způsobující rezistenci proti onemocnění (popisuje se v publikaci Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 57775783; Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13: 2467-2475). Vynález předkládá teorii, že signální cesta spojující morfogenezy a primitivní imunitu u hmyzu, rostlin a zvířat { popisuje se v publikaci Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12: 393-416 a Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7: 175178) může mít kořeny v bakteriálním dvou složkovém průběhu.

Výpočetní analýza

Lidské sekvence příbuzné k hmyzím proteinům DTRL se identifikovaly z databáze EST (dbEST) v instituci National Center for Biotechnology Information (NCBI) za použití serveru BLAST (popisuje se v publikaci Altschul, et al. (1994) Nátuře

Genet. 6:119-129). Při izolaci signálních domén rodiny proteinů DTLR, která sdílí jak proteiny obratlovců tak proteiny rostlin a nachází se v ne příliš velkých databázích, se používají více citlivé metody založené na profilu nebo paternu (popisuje se v publikaci Bork and Gibson (1996) Meth. Enzymol. 226: 162-184). Progresivní uspořádání sekvencí DTLR vnitrobuněčných nebo extrabuněčných domén proběhlo způsobem ClustalW (Thompson, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 46734680). Tento program může také vypočítat stupeň větvení uspořádaných sekvencí podle Naighbor-Joining algoritmu (5000 replikací poskytuje spolehlivé hodnoty pro rozdělení do tří skupin).

Konzervativní uspořádání paternů, které existují při různých stupních přísnosti, se navrhly v programu Consensus (internet • t • ·

» ·»· » ·· * • v • · · · • · · 9 9 9

9 • ♦ 9 9

URL http://www.bork.eroblheidelberg.de/Alignment/consensus.html). Knihovna PRINTS proteinových peptidových map (http:Z/www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowse/PRINTS/PRINTS.html) (Attwood, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:212-217) identifikovala repetice bohaté na leucin (LRR), které se nacházejí v extracelulárních segmentech DTLR s motivem látky (kód v PRINTS je Leurichrpt) , která flexibilně páruje N- a Cterminální rysy divergentních LRR. Pro odvození sekundární struktury uspořádání intracelulámí domény se použily dva předpokládané algoritmy, jejichž přesnost ve třech stádiích je přibližně 72 % (Fisher, et al. (1996) FASEB J. 10: 126-136).

Program neurální sítě PHD (Rošt and Sander (1994) Proteins 19: 55-72), statistická prognózová metoda DSC (King and Sternberg (1996) Protein Sci. 5: 2298-2310) mají internetový server (URL http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/phd pred.html a http://bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc read align.html). Intracelulámí oblast kóduje oblast THD, která se popisuje například v publikaci Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13: 2467-2475 a Rock, et al. (1998) Proč. Nat'1 Acad. Sci. USA 95: 588-593. Tato doména je velmi důležitá při mechanizmu signálu receptorů, které přenášejí fosfátovou skupinu do susbtrátu.

Klonování cDNA lidského DTLR v celé délce

Při testování knihovny cDNA odvozené od lidské erytroleukemické buněčné linie TF-1 (Kitamura, et al. (1989)

Blood 73:375-380), které vede k získání sekvence cDNA proteinu DTLR1, se použily PCR primery odvozené ze sekvence Humrsc786 podobné Toll (Genbank přístupový kód D13637) (Nomura, et al. (1994) DNA Res 1:27-35). Zbývající sekvence DTLR se získaly z dbEST a relevantní klony EST se získaly od konzorcia I.M.A.G.E. (Lennon, et al. (1996) Genomics 33:151-152) prostřednictvím Research Genetics (Huntsville, AL) : CloneiD# 80633 a 117262 (DTRL2), 144675 (DTLR3), 202057 (DTLR4) a

277229 (DTLR5) . cDNA lidských proteinů DTLR 2 až 4 v celé délce se klonovala DNA hybridizaci fágu XgtlO do knihoven cDNA 5'-Stretch Plus (Clontech) pocházejících z plic a placenty dospělého člověka a z jater plodu. Sekvence DTLR5 se získala z EST lidských sklerotických plaků. Všechny pozitivní klony se sekvenovaly a uspořádaly se pro identifikaci otevřených čtecích rámců (ORF) jednotlivých DTLR: DTLR1 (klon o velikosti 2 366 bp, 786 aa ORF), DTLR2 (klon o velikosti 2 600 bp, 784 aa ORF), DTLR3 (klon o velikosti 3 029 bp, 904 aa ORF), DTLR4 (klon o velikosti 3 811 bp, 879 aa ORF) a DTLR5 (klon o velikosti 1 275 bp, 370 aa ORF). Sondy vhodné pro hybridizaci s DTLR3 a DTLR4 se připravily pomocí PCR, kde se jako templát použila cDNA kinhovna z lidské placenty (Stratagene) a z jater dospělého člověka (Clontech). Páry primerů se odvodily od sekvencí EST. Reakce PCR se provedly za použití DNA polymerázy Taqplus z T. aquaticus (Stratagene) za následujících podmínek 1 x (94°C, 2 min.) 30 x (55°C, 20 vteřin; 72 °C 30 vteřin; 94 °C 20 vteřin), 1 x (72 °C, 8 min.). Při testování celé délky cDNA DTLR2 se připravil fragment o velikosti 900 bp vytvořený štěpením restrikčními enzymy EcoRI/Xbal prvního klonu EST (ID# 80633), který se použil jako sonda.

Přenosy mRNA a lokalizace na chromozómu

Lidská mnohotná tkáň (Kat. #1, 2) a přenosy buněčné linie karcinomu (Kat. # 7757-1) obsahující v jedné dráze přibližně 2 gg póly(A)⁺ RNA se zíksly od firmy Clontech (Palo Alto, CA). V případě DTLR 1 až 4 izolované cDNA v plné délce sloužily jako sondy. V případě DTLR5 se použil plazmidový inzert klonu EST (ID č. 277229) . Sondy se značily radioizotopem [a-³²P] dATP za použití kitu „Rediprime random primer labeling kit (RPN1633) od firmy Amersham).

Pre-hybridizace a hybridizace se provedly při teplotě 65 °C v 0,5 M Na₂HPO₄, 7 % SDS, 0, 5 M

EDTA (pH 8,0). Všechny promývání • · · · se provedly při teplotě 65 °C, přičemž dvě počáteční promytí se uskutečnily s pufrem o složení 2 x SSC, 0,1 % SDS po dobu 40 min., pak následuje promytí s pufrem 0,1 x SSC, 0,1 % SDS po dobu 20 minut. Membrány se pak exponovaly na X-Ray film (Kodak) při teplotě -70 °C a v přítomnosti clon pro zvýšení intenzity. Na vybraných klonech lidského DTLR za účelem testování jejich exprese v sub-sadách hemopoietických buněk se uskutečnila podrobnější studie pomocí Southernovy analýzy cDNA knihovny.

Mapování lidského chromozómu se provedlo způsobem fluorescenční hybridizací in sítu (FISH), jak popisuje Heng and Tsui (1994) Meth. Molec. Biol. 33: 109-122, kde se jako sondy použily klony cDNA v celé délce (DTLR 2 až 4) nebo částečné klony cDNA (DTLR5). Tyto analýzy provedla firma SeeDNA Biotech lne. (Ontario, Canada). Hledání lidských syndromů (nebo myších defektů v synténním místě na chromozómu) spojené s mapovanými geny DTLR s provedlo v databázi dysmorfní lidské-myší homologie na internetovém serveru (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/DHMHD/hum chromé1.html).

Konzervativní architektura ektodomén hmyzího a lidského DTLR Rodina Toll v Drosophila obsahuje alespoň čtyři odlišné genové produkty: Toll, prototypový receptor, který se podílí na dorzoventrálním paternu embrya mušky (Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371-399). Druhým jmenovaným je „18 Wheeler (18w), který se může také podílet na časném embryonálním vývoji (Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239; Eldon, et al. (1994) Develop. 120: 885-899). Dva další receptory se předpovídají na základě neúplného ORF podobného Toll, který leží po směru exprese transkripčního lokusu (Mst) specifického pro muže (kód v databance Genbank je X67703), nebo je kódován sekvencí s označeným místem (STS) Dm2245 (kód v databázi Genbank je G01378) (Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783). Extracelulární segmenty

Toll a 18w jsou charakteristicky složeny z neúplných motivů LRR obsahující přibližně 24 aminokyselin (Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239; a Eldon, et al. (1994) Develop. 120: 885-899). Podobné tandemové soubory LRR běžně tvoří na povrchu buněk adhezivní anténky různých molekul a předpokládá se, že jejich generická terciální struktura napodobuje lůžko ribonukleázového inhibitoru ve tvaru podkovy, kde 17 LRR je v podobě opakující se β/α-vlásenky s motivem 28 zbytků (Buchanan and Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65: 1-44). Specifické rozeznávání Spatzle pomocí Toll může následovat model navržený pro navázání glykoproteinových hormonů více LRR ektodomén vlásenkových receptorů za použití konkávní strany zakřiveného β-listu (Kajava, et al. (1995) Structure 3: 867-877). Patern cysteinů ve Spatzle a v sirotčím ligandu Drosophila předpovídá podobnou terciální strukturu cysteinového uzlíku (Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12: 393-416; Casanova, et al. (1995) Genes Develop. 9: 2539-2544).

a 31 ektodomén LRR Toll a 18w (fragment ORFMst vykazuje 16 LRR) je na základě sekvenční a paternové analýzy nejvíce příbuzných s porovnatelnými 18, 19, 24 a 22 LRR soubory DTLR 1 až 4 (nekompletní řetězec DTLR5 v současné době zahrnuje čtyři LRR blízko membráně) (Altschul, et al. (1994) Nátuře Genet. 6: 119-129; Bork and Gibson (1996) Meth. Enzymol. 266: 162-184) (Obrázek č. 1). Rozdílem v řetězcích lidských DTLR je běžná ztráta oblasti zahrnující přibližně 90 cysteinových zbytků, které jsou pravidelně uloženy v ektodoménách Toll, 18w a Mst ORF (jsou vzdáleny od membránového rozhraní v délce 4, 6 a 2 LRR) . Tyto cysteinové klastry jsou dvoustranné s rozdílnou horní (končící LRR) a spodní (skládaný na vrchu LRR) polovinou (Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47: 225-239; Eldon, et al. (1994) Develop. 120: 885-899; Buchanan and Gay (1996) Prog. Biophys. Molec. Biol. 65: 1-44). Horní model se opakuje v lidských DTLR a v DTLR Drosophila, jako konzervativní • · · · • · · juxtamembránového mezerníku (Obrázek č. 1) . Vynález naznačuje, že flexibilně lokalizované cysteinové klastry v receptorech Drosophila (a v jiných proteinech LRR), když spojují horní spodní část, tvoří kompaktní modul s párovanými konci, které se mohou začlenit mezi libovolný pár LRR, aniž se mění svinutí ektodomén DTLR. Analogické vyčnívající domény se nacházejí v strukturách jiných proteinů (Russel (1994) Protein Engin. 7: 1407-1410).

přibližně 200 zprostředkovávaj i

Molekulová konstrukce signální domény TH

Porovnání sekvencí receptorů Toll a IL-1 typ-I (IL-1R1) vykazuje vzdálenou podobu cytoplazmatické domény obsahující aminokyselin, které pravděpodobně signál pomocí podobných transcripčních faktorů typu Rel (Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell. Develop. Biol. 12: 393-416a Wasserman (1993) Molec. Biol. Cell 4: 767-771). Tento funkční příklad zahrnuje pár rostliných proteinů nesoucích rezistenci proti onemocnění z rostlin tabáku a lnu, který vykazují N-terminální TH modul následovaný navázáním nukleotidu (NTPáza) a LRR segmenty (Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178). Naopak „mrtvá doména předchází TH řetězec MyD88 a intracelulární myeloidní diferenciační markér (Mitcham, et. al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783; hardiman, et al. (1996) 0ncogenel3: 2467-2475) (obrázek č. 1).

Nové receptory typu IL-1 zahrnují I1-1R3, signální molekulu a sirotčí receptory IL-1R4 (také nazývané ST2/Fit-1/Tl), IL-1R5 (protein příbuzný IL-1R) a IL-1R6 (protein 2 příbuzný IL-1R) (Mitcham, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5777-5783;

Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13: 2467-2475). Na základě sekvencí nových lidských DTLR vynález poskytuje definici evoluční spirály tím, že se analyzuje uspořádání běžného modulu TH: deset bloků konzervativní sekvence obsahující 128 aminokyselin tvoří minimální svinutí domény TH. Mezery « · · v uspořádání značí pravděpodobnou polohu sekvence a smyček různých délek (obrázek č. 2a).

Dva předpokládané algoritmy, které s výhodou využívají paterny konzervativní a různorodé části uspořádaných sekvencí PHD (Rošt and Sander (1994) Proteins 19: 55-72) a DSC (King and Stenberg (1996) Protein Sci. 5: 2298-2310), produkovaly silné, korkondantní výsledky pro signální modul TH (obrázek č. 2a) . Každý blok obsahuje diskrétní sekundární strukturální element: otisk alternativních β-řetězců (označených A až E) a a-helixů (označených čísly 1 až 5) ukazuje na svinutí β/α-třídy s ahelixy na obou stranách paralelního β-listu. Hydrofobní βřetězce A, C a D jsou určeny k vytvoření vnitřních příček βlistu, zatímco kratší amfipatické β-řetězce B a E se podobají typickým hraničním jednotkám (obrázek č. 2a) . Tento postup je shodný s uspořádáním řetězců B-A-C-D-E v jádru β-listu (obrázek č. 2b) . Porovnání svinutí (mapování) a rozeznávací programy /Fisher, et al. (1996) FASEB J. 10: 126-136) silně odráží tuto dvojitě navinutou topologii β/α. Překvapivě funkční předpověď této načrtnuté struktury domén TH mnoho ze konzervativních, nabitých zbytků ve vícenásobném uspořádání mapuje C-terminální konec β-listu: zbytek Aspl6 (schéma číslování bloků je uvedeno na obrázku č. 2a) na konci βΑ, Arg39 a Asp40 následuje po βΒ, Glu75 v prvním závitu a.3 a volněji konzervativní zbytky Glu/Asp ve smyčce βϋ-α4 nebo po βΕ (obrázek č. 2a). Poloha čtyř jiných konzervativních zbytků (Asp7, Glu28 a páru Arg57-Arg/Lys58) je kompatibilní se sítí můstků solí na opačném N-terminálním konci β-listu (obrázek č. 2a) .

Signální funkce závisí na strukturní integritě domény TH.

Neaktivní mutace nebo delece na hranicích modulu (obrázek č.

2a) se v případě Il-lRla Toll zaznamenávají (Heguy, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2605-2609; Croston, et al. (1995)

J. Biol. Chem. 270: 16514.16517; Schneider, et al. (1991) • · · ♦

Genes Develop. 5: 797-807; Norris and Manley, (1992) Genes Develop. 6: 1654-1667; Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Norris and Manley (1996) Genes Develop. 10: 862872). Řetězce lidského DTLR1-5 prodlužují minimální doménu TH (obsahuje 8, 0, 6, 22 a 18 zbytků) jsou nejvíce podobné krátkému 4 aa „ocasu Mst ORF. Toll a 18w vykazuje nepříbuzné ocasy tvořené 102 a 207 zbytky (obrázek č. 2a), které mohou negativně regulovat signalizaci fúzovaných lidských domén (norris and Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Norris and Manley (1996) Genes Develop. 10: 862-872).

Vývojový vztah mezi odlišnými proteiny, které nesou doménu TH, lze nejlépe pochopit s fylogenního stromu odvozeného s vícenásobného uspořádání (obrázek č. 3) . Čtyři základní větve oddělují rostlinné proteiny, faktory MyD88, receptory II—1 a molekuly podobné Toll, pozdější klastry větví lidských DTLR a DTLR Drosophila.

Rozptyl genů lidských DTLR na chromozomu

Za účelem vyzkoumat genetickou vazbu nascentní rodiny genů lidského DTLR se mapovaly loci čtyř z pěti genů pomocí metody FISH (obrázek č. 4) . Gen DTLR1 se zobrazil už dříve v rámci projektu lidského genomu: lokus STS databáze (dbSTS č. G06709, odpovídá STS WI-7804 nebo SHGC-12827) existuje v případě cDNA Humrsc786 (Nomura, et al. (1994) DNA Res. 1:27-35) a fixuje gen na chromozom 4 v intervalu D4S1587-D42405 (50-56 cM) přibližně 4pl4. Tento postup se podpořil analýzou FISH (Taguchi, et al. (1996) Genomics 32: 486-488). Vynález spolehlivě přiřazuje zbývající geny DTLR k místům na chromozómu 4q32 (DTLR2, 4q35 (DTLR3), 9q32-33 (DTLR4) a lq33.3 (DTLR5). Během průběhu uvedené práce STS se vytvořil rodičovského DTRL2 EST (klon ID č. 80633) (dbSTS č. T57791 pro STS SHGC-33147) a mapoval se chromozóm 4 interval D4S424D4S1548 (143-153 cM) v 4q32. Na dlohém rameni chromozómu 4 existuje mezi geny DTLR2 a DTLR3 přibližně 50 cM mezera.

« ·

Ύ 2 ···· ······· ··

Geny DTLR se exprimují odlišně

Toll a 18 w má komplex prostorového a dočasného paternu exprese v Drosophila, který může fungovat i přes embryonální vytváření vzoru (St. Johnston and Nusslein-Volhard (1992) Cell 68: 201-219, Morisato and Anderson (1995) Ann. Rev. Genet. 29: 371-399, Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12: 393-416, Lamaitre, et al. (1996) Cell 86: 973-983,

Chiang and Beachy (1994) Mech. Develop. 47:225-239, Eldon et al., (1994) Develop. 120:885-899. Testovala se prostorová distribuce transkriptů DTLR pomocí analýzy mRNA přenosem různých lidských tkání a buněčné linie karcinomu za použití radioaktivně značených cDNA DTLR (obrázek č. 5) . Zjistilo se, že DTLR1 se exprimuje všude a exprese je silnější než u jiných receptorů. Podle předpokladu je přítomna ve vaječníkách a ve slezině (obrázek č. 5, panely A a Β) , což odráží alternativní sestřih, krátkou transkripční formu o velikosti 3,0 kB a dlouhou transkripční formu o velikosti 8,0 kB DTLR1. mRNA buněk karcinomu také vykazuje prominentní nadměrnou expresi DTLR1 v buněčné linii Ráji Burkuttova lymfomu (obrázek č. 5, panel C) . mRNA DTLR2 není exprimována v tak širokém rozsahu jako DTRL1. Jeho forma o velikosti 4 kb se detekovala v plicích a transkript o velikosti 4 kB se vyskytuje v srdci, mozku a ve svalech. Distribuční patern proteinu DTLR3 ukazuje stejné výsledky pro DTLR2 (obrázek č. 5, panel E) . Protein DTLR3 je také přítomen jako dva hlavní transcripty o velikosti 4,0 a 6, 0 kB a nejsilnější exprese se pozorovala v placentě a pankreasu. Naopak mRNA DTLR4 a DTLR5 se jeví být extrémně tkáňově specifická. Protein DTLR4 se detekoval pouze v placentě, jako jediný transkript o velikosti přibližně 7,0 kB. Slabý signál o velikosti 4,0 kB se pozoroval v případě DTRL5 ve vaječníkách a v periférních krevních monocytech. Komponenty vývojového regulačního systému

Původní molekulární návrhy a divergentní osudy signálního průběhu se mohou zrekonstruovat na základě porovnání genomů

(Miklos	and Rubin (	;i996) Cell	86:521-529, Chothia	(1994)
Develop.	1994	Suppl.	, 27-33, Banfi,	et al.	(1996)	Nátuře
Genet.	13:167-	174 a	Wang et	al.	(1996)	J.	Biol.	Chem.
271:4468	-4476).	Vynález použil	tuto	logiku	pro	identifikaci
emerzní	rodinu	genů u	lidí. Tyto	geny	kóduj i	pět	receptorových

paralogů označených DTLR 1 až 5, které jsou přímé vývojové protějšky genové rodiny Drosophila vedené Toll (obrázky č. 1 až 3) . Konzervativní architektura lidských a muších DTLR, konzervativní ektodomény LRR a vnitrobuněčné moduly TH (obrázek č. 1) ukazují, že silný průběh spojený s Toll v Drosophila (6, 7) přežívá v obratlovcích. Nej lepší důkaz pochází z opakovaného průběhu: sběrný systém IL-1 a jeho repertoár domén TH fúzovaných s receptorem, IRÁK, NF-κΒ a homology I-κΒ (Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell Develop. Biol. 12:393-416, Waserman (1993) Molec. Biol. Cell 4: 767-771, Hardiman, et al. (1996) Oncogene 13: 2467-2475 a

Cao, et al- (1996) Science 271: 1128-1131). Také se charakterizoval faktor podobný Tube. Není známo, zda DTLR se mohou produktivně spojovat se signálním vybavením nebo zda se místo nich dají použít paralelní sada proteinů. Na rozdíl od receptorů IL-1 LRR lidských DTLR je určena pro zachování afinity k faktorům cystinového uzlíku příbuzného s Spatzle/Trunk. Izoloval se kandidát ligandu DTLR (nazývaný PEN), který splňuje tuto formu.

Biochemické mechanizmy signální trandukce se mohou stanovit pomocí konzervace svinutí interakčních proteinů v signálním průběhu (Miklos and Rubín (1996) Cell 86: 521-529; Chothia (1994) Develop. 1994 Suppl., 27-33 (3-5) a Banfi, et al.

(1996) Nátuře Genet. 13: 167-174) . V současnosti signální paradigma Toll zahrnuje molekukuly, jejichž role je úzce definována jejich strukturou, působením nebo osudem: Pelle je Ser/Thr kináza (fosforylace), Dorsal je transkribční faktor • ·

Ί4 podobný NF-κΒ (navázání DNA) a Cactus je inhibitor opakování ankirinu (navázání faktoru Dorsal, degradace) (popisuje se v publikaci Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell. And Devel. Biol. 12: 393-416).

Naopak funkce domény TH Toll a Tube nebyly zatím odhaleny. Podobně jako jiné receptory cytokinů (Heldin (1995) Cell 80: 213-223) dimerizace Toll zprostředkovaná ligandem se jeví být spouštěcí jev: volné cysteiny v oblasti justamembrány Toll tvoří konstitutivně aktivní receptorové páry (Schneider, et al. (1991( Genes Develop. 5:797-807) a chimérické receptory Torso-Toll signalizují jako diméry (Galindo, et al. (1995) Develop. 121:2209-2218). Velké zkrácení nebo hromadná ztráta ektodomény Toll vede k promiskuitnímu vnitrobuněčnému signálu (Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Winans and Hashimoto (1995) Molec. Biol. Cell 6: 587-596), reminiscentní onkogenní receptory s katalytickými doménami (Heldin (1995) Cell 80: 213-223). Tube se nachází na membráně, obsadil N-terminální (mrtvou) doménu Pelle a je fosforylován. Na základě analýzy dvou hybridů se nezaznamenaly ani Toll-Tube ani Toll-Pelle interakce (Galindo, et al. (1995) Develop. 121:2209-2218 a GroPhans, et al. (1994) nátuře 372:563-566. Poslední jmenovaný výsledek naznačuje, že konformační stádium TH domény Toll nějak ovlivňuje doplňování faktorů (Norris and Manley (1996) Genes Develop. 10: 862-872, Galindo, et al·.

(1995) Develop. 121:2209-2218).

V centru tohoto problému je strukturní podstata modulu TH Toll. Za účelem zodpovězení této otázky jsme s výhodou použily vývojové diversity sekvencí TH z hmyzu, rostlin a obratlovců Začlenění řetězců lidských DTLR a extrahované minimální konzervativní proteinové jádro slouží předpovězení struktury a rozeznání svinití (obrázek č. 2) . Jasně předpokládané svinutí domény ΤΗ (β/α)5 s jeho asymetrickým klastrem kyselých zbytků je topologicky identické se strukturami regulátorů odezvy v bakteriálních průbězích signálu s dvěma komponenty (Volz • · (1993) Biochemistry 32: 11741-11753, Parkinson (1993) Cell

73:857-871) (obrázek č. 2). Prototyp regulátoru chemotaxe CheY dočasně váže divalentní kationt v aspartátové kapse na C-konci jádra β-listu. Tento kation poskytuje elektrostatickou stabilitu a umožňuje aktivní fosforylací Asp s nulovým stupněm volnosti (Volz (1993) Biochemistry 32: 11741-11753). Doména TH může zachytávat kationty v jejím kyselém hnízdě, ale aktivace a signál po směru exprese genu mohl záviset na specifikem navázání negativně nabité látky: aniontové ligandy mohou obejít intenzivně negativní potenciál vazebného místa tím, že se uzavřou do přesné sítě vodíkových vazeb (Ledvina et al. (1996) Proč, Nati. Acad. Sci. USA 93:6786-6791). Doména TH nemůže jednoduše působit jako pasivní lešení pro vystavění komplexu Tube/Pelle v případě Toll nebo homologní systémy u rostlin a obratlovců, ale místo toho se aktivně účastní jako opravdoví konformační spínače v mechanizmu signální transdukce. Možným vysvětlením podmínečného navázání komplexu Tube/Pelle je, že Toll dimerizace může podpořit odmaskování ocasů regulačních receptorů (Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Norris and Manley (1996) Genes Develop.

10: 862-872) nebo navázání TH kapsy na aktivátory malých molekul. Volné moduly TH uvnitř buňky (Norris and Manley (1995) Genes Develop. 9: 358-369; Winans and Hashimoto (1995) Molec. Biol. Cell 6:587-596) mohou působit jako katalytické spínače podobné CheY tím, že aktivují a spojují potulné komplexy Tube/Pelle.

Morfogenetické receptory a imunitní ochrana

Vývojová vazba mezi hmyzím imunitním systémem a imunitním systémem obratlovců je otisknuta v DNA: geny kódující antimikrobiální faktory v hmyzu vykazují motivy podobné elementům odezvy v akutní fázi, o nichž je známo, že u savců váží NF-κΒ transkripční faktory Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183. Faktory Dorsal a dva faktory příbuzné Dorsal Dif a • · • · · · «

Ϊ1995) Biochem. Biophys. mechanistické paralely

Ip et al Nati. Acad. Sci

Biochem.

Janeway

Relish pomáhají indukovat tyto obranné proteiny po bakteriální opakované imunizaci (Reichhart, et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316:1218-1224, Ip et al. (1993) Cell 75:753-763 a Dushay, et al. (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:1034310347) . Toll nebo jiné DTLR modulují tyto rychlé imunitní odezvy u dospělých mušek Drosophila (Lemaitre, et al. (1996) Cell 86:973-983 a Rosetto, et al.

Res. Commun. 209:111-116). Tyto k protizánětlivé odezvě IL-1 u obratlovců jsou důkazem funkční verzatility signálního průběhu Toll a naznačují synergii mezi ebryonálním paternem a přirozenou imunitou (Belvin and Anderson (1996) Ann. Rev. Cell. And Devel. Biol. 12: 393-416; Lemaitre et al., (1996) Cell 86: 973-983, Wasserman (1993)

Molec. Biol. Cell 4: 767-771, Wilson, et al. (1997) Curr.

Biol. 7: 175-178, Hultmark (1993) Trends Genet. 9:178-183,

Reichhart, et al. (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316:1218-1224,

1993) Cell 75:753-763 a Dushay, et al. (1996) Proč.

USA 93:10343-10347, Rosetto, et al. (1995)

Biophys. Res. Commun. 209:111-116, Medzhitov and 1997) Curr. Opin. Immunol. 9:4-9). Užší homologie hmyzích a lidských proteinů DTLR povzbuzuje dokonce silnější překryv biologických funkcí, které nahradí čistě imunitní paralely systémů IL-1 a porpůjčí potencionální molekulární regulátory dorso-ventrálním a jiným transformacím embryí obratlovců (DeRobertis and Sasai (1996) Nátuře 380:37-40 a Arendt and Nubler-Jung (1997) Mech. Develop. 61:7-21). Vynález popisuje velkou receptorovou rodinu u lidí odrážející současný vynález Frizzledových receptorů u obratlovců pro Wnt faktory tvoření vzorů (Wang, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:44684476). Jako řada jiných receptorových systémů mají významnou úlohu při časném vývoji (Lemaire and Kodjabachian (1996) Trends Genet. 12:525-531). Jasné buněčné souvislosti kompaktních embryí a dospělých jedinců jednoduše vedou k signálním drahám a k jejich difúzovatelných spínačům, které mají v různých časech různé biologické výstupy, například morfogenní verzus imunitní odezva v případě protrinů DTLR. V případě hmyzích, rostlinných a lidských systémů příbuzných s Toll (Hardiman et al., (1996) Oncogene 13: 2467-2475; Wilson, et al. (1997) Curr. Biol. 7:175-178) tyto signály působí prostřednictvím regulační domény TH, která se podobá bakteriálnímu transdukčnímu motoru (Parkinson (1993) Cell 73: 857-871).

Protein DTLR6 zvláště vykazuje strukturní rysy, které prokazují jeho členství v rodině. Členi rodiny se podílejí na řadě podstatných vývojových onemocněních a fungují jako přirozený imunitní systém. DTLR se zjistil na chromozomu X v pozici, která není důležitá pro hlavní vývojové abnormality (Popisuje se například na webové stránce The Sanger Center: human X chromozóm; http://gc.bcm.tmc.edu:8088/cgibin/seq/home).

Přístupové číslo pro uložený PAC je AC003046. Toto přístupové číslo obsahuje sekvenci ze dvou PAC: RPC-164K3 a RPC-263P4. Tyto dvě sekvence PAC se mapovaly na lidském chromozómu Xp22 na místě web mezi STS markéry DXS704 a DXS7166. Tato oblast je důležitá v případě těžkých vývojových abnormalit.

III. Amplifikace fragmentu DTLR pomocí PCR

Vybraly se dvě vhodné sekvence primerů (uvádějí se v tabulce č. 1 až 10). RT-PCR se používá u vhodných vzorků mRNA vybraných na základě přítomnosti mRNA, která produkuje část nebo celou cDNA, například vzorek, který exprimuje gen (Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academie Press, San Diego, CA; Dieffenbach and Dveksler (1995, eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY) . To umožní stanovení použitelné sekvence za účelem testování celého genu v knihovně cDNA. TLR6 je styčnou sekvencí v genomu, která může naznačovat přítomnost dalších TLR. PCR genomové DNA může vytvořit styčnou sekvenci v plné délce a může se aplikovat technologie procházení chromozómem. V jiném přépadě sekvenční databáze budou obsahovat sekvenci odpovídající oblastem popsaných provedení vynálezu nebo jejím příbuzným formám, například alternativní sestřih atd. V případě knihovny cDNA se může aplikovat také expresivní klonovací metoda.

IV. Rozložení DTLR v tkáních

Detekovala se mRNA každého genu kódující tyto DTLR (obrázky 5A až 5F) . Vhodnou technologií se testují další buňky a tkáně (například PCR, imunologické testy, hybridizace a podobně). Přípravky cDNA tkání a orgánů jsou dostupné například u firmy Contech, Mountain View, CA. Může se použít identifikace zdrojů přirozené exprese.

Soutehernova analýza: DNA (5 gg) z primární knihovny amplifikované cDNA se štěpila vhodnými restrikčnímy enzymy, čímž se uvolnily inzerty. Pak se provedla elektroforéza na 1 % agarózovém gelu a DNA se přenesla na nylonovou membránu (Schleicher and Schuell, Keene, NH).

Vzorky pro izolaci lidské mRNA v typickém případě zahrnují například periferní krevní jednobuněčné buňky (monocyty, T buňky, NK buňky, granulocyty, B buňky) v klidové fázi (T100); periferní krevní jednobuněčné buňky aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 12 hodin (T101) ; T buňka, THO klón Mot 72 v klidové fázi (T102) ; T buňka, THO klón Mot 72 aktivovaná anti-CD28 a anti-CD3 po dobu 3, 6, 12 hodin (T103) ; T buňka, THO klón Mot 72, anergicky ošetřena specifickým peptidem po dobu 2, 7, 12 hodin (T104); T buňka, THI klón HY06 v klidové formě (T107); T buňka THI klón HY06 aktivovaná anti-CD28 a anti-CD3 po dobu 3, 6 a 12 hodin (T108); T buňka, THI klón HY06, anergicky ošetřena specifickým peptidem po dobu 2, 6 a 12 hodin (T109) , T buňka TH2 klón HY935 v klidové formě (T110); T buňka TH2 klón HY935 aktivovaná anti-CD28 a anti-CD3 po dobu 2, 7, 12 hodin (Tlil); T buňky CD4+CD45RO-T buňky polarizované 27 dní • · · · pomocí anti-CD28, IL-4 a anti IFN-γ, TH2 polarizované, aktivované anti-CD3 a anti-CD28 po dobu 4 hodin (T116); linie nádorových T buněk Jurkat a Hut78 v klidové formě (T117); klony T buněk AD13%.2, Tc783.12, Tc783.13, Tc783.58, Tc782.69 v klidové formě (T118) ; T buňka, náhodné klony γδ T buňky, splenocyty v klidové formě (B100); splenocyty aktivované antiCD40 a IL-4 (B101); EBV linie B buněk WT49, RSB, JY, CVIR, 721.221, RM3, HSY, v klidové formě (B102) ; líni B buněk JY aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (B103) ; klňy

NK 20 v klidové formě (K100) ; klony NK 20 aktivované PMA. a ionomycinem po dobu 6 hodin (K101); klon NKL odvozený periferní krve pacienta trpícího LGL leukémií ošetřené IL-2 (K106), NK cytotoxický klon 640-A30-1, v klidové formě (K107); hematopoietická prekurzorová linie TF1, aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (C100); linie premonocytů U937 v klidové formě (M100); linie premonocytů U937 aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (M101), oddělené monocyty aktivované LPS, IFNy, anti-IL-10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 hodin (M102); oddělené monocyty aktivované LPS, IFNy, IL-10 po dobu 1, 2, 6, 12, 24 hodin (M103); oddělené monocyty aktivované

LPS, IFNy, anti-IL-10 po dobu 4 a 16 hodin (M106) ; oddělené monocyty aktivované LPS, IFNy, IL-10 po dobu 4 a 16 hodin (Ml07); oddělené monocyty aktivované LPS po dobu 1 hodiny (M108); oddělené monocyty aktivované LPS po dobu 6 hodin (M109); DC 70% CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1 hodiny (Dl02) ; DC 7 0 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1 hodiny (D102) ; DC 70% , z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 6 hodiny (D103) ; DC 95 % CDla+, z CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (D104); DC 95 % CDla+, ex CD34+ GM-CSF, TNFa 12 dní FACS, aktivované PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (D105) ; DC CDla+, CD86+, z CD34+ GM-CSF, • · · ·

TNFa	12 dní FACS,	aktivované	PMA a ionomycinem po	dobu 1, 6
hodin	(D106); DC	z monocytů	GM-CSF, IL-4 5	dní,	v klidové
formě	(D107); DC	z monocytů	GM-CSF, IL-4 5	dní,	v klidové
formě	(D108); DC z	monocytů CM-	-CSF, IL-4 5 dní,	aktivované LPS

po dobu 4, 16 hodin (D109); DC z monocytů GM-CSF, IL-4 5 dní, aktivované TNFa po dobu 4, 16 hodin (DUO); benigní nádor leiomyom Lil (X101); normální myometrium M5 (0115); maligní leiomyosarkom GS1 (X103); linie sarkomu plicních fibroblastů MRC5, aktivovaná PMA ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (C101) ; buněčná linie karcinomu epitelu ledvin CHA aktivovaná PMA a ionomycinem po dobu 1, 6 hodin (Cl02); ledviný zárodku

mužského	pohlaví	ve	stáří	28	týdnů	(0100);	plíce	zárodku
mužského	pohlaví	ve	stáří	28	týdnů	(0101);	játra	zárodku
mužského	pohlaví	ve	stáří	28	týdnů	(0102);	srdce	zárodku
mužského	pohlaví	ve	stáří	28	týdnů	(0103);	mozek	zárodku
mužského	pohlaví	ve	stáří	28	týdnů	(0104);	žlučník	zárodku
mužského	pohlaví	ve	stáří	28	týdnů	(0106)	; tenké	střevo

zárodku mužského pohlaví ve stáří 28 týdnů (0107); tuková tkáň zárodku mužského pohlaví ve stáří 28 týdnů (0108); vaječníky zárodku ženského pohlaví ve stáří 28 týdnů (0109); děloha zárodku ženského pohlaví ve stáří 28 týdnů (0110); varle zárodku mužského pohlaví ve stáří 28 týdnů (0111); slezina zárodku mužského pohlaví ve stáří 28 týdnů (0112); placenta dospělého jedince ve stáří 28 týdnů (0113); zanícené mandle z 12 ti letého jedince (X100).

Vzorky pro izolaci myší mRNA zahrnují například linii klidových fibroblastových L buněk (C200); Braf:ER transfekované buňky (fúze Braf s estrogenovým receptorem), slouží jako kontrola (C201); T buňky, THI polarizované (Mell4 jasné, CD4+ buňky ze sleziny polarizované po dobu 7 dní IFN-γ a anti IL-4; T200); T buňky, TH2 polarizované (Mell4 jasné, CD4+ buňky ze sleziny polarizované po dobu 7 dní IFN-γ a anti IL-4 a anti-IFN-γ; T201); T buňky vysoce polarizované THI (Opanshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367) aktivované anti-CD3 • · * • · · · • · · · · • · · · · po dobu 2, 6, 16 hodin; T202); T buňky vysoce polarizované THI (Opanshaw, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1357-1367) aktivované anti-CD3 po dobu 2, 6, 16 hodin; T203) ; CD44CD25+ pre-T buňky získané s thymusu (T204); klon Dl. 1 THI T buňky, v klidové formě po dobu 3 týdnů po poslední stimulaci antigenem (T 205); klon Dl.l THI T buňky stimulované 10 gg/ml ConA po dobu 15 hodin (T206); klon CDC35 TH2 T buňky v klidové formě po dobu 3 týdnů po poslední stimulaci antigenem (T207); klon CDC35 TH2 T buňky stimulované 10 gg/ml ConA po dobu 15 hodin (T208); Mell4+ nikdy nepoužitých T buněk ze sleziny v klidové formě (T209); Mell4+ T buňky polarizované na Thi s IFN-y/IL-12/anti-IL-4 po dobu 6, 12, 24 hodin (T210); Mell4+ T buňky polarizované na Th2 s IL-4/anti-IFN-y po dobu 6, 13, 24 hodin (T211); nestimulovaná buněčná linie zralých B buněk leukémie A20 (B200); nestimulovaná linie B buněk CH12 (B201);

nestimulované	velké	B	buňky	ze sleziny	(B202);	B buňky	z celé
sleziny aktivované		LPS	(B203); metrizamidem obohacené
dendritické	buňký	z	celé	sleziny v	klidové	formě	(D200);
dendritické	buňky	z	kostní	dřeně v	klidové	formě	(D201);

buněčná linie monocytů RAW 264,7aktivovaná LPS po dobu 4 hodin (M200); makrofágy kotní dřeně získané z GM a M-CSF (M201); buněčná linie makrofágů J774 v klidové formě (M202); makrofágová buněčná linie J774 + LPS + anti-IL-10 po dobu 0,5, 2, 3, 6, 12 hodin (M203); makrofágová buněčná linie J774 + LPS + IL-10 po dobu 0,5, 1, 3, 5, 12 hodin (M204); aerosolem ošetřená tkáň myších plic, Th2 primery, dávky aerosolu OVA se podávají po dobu 7, 14, 23 hodin (Garlisi, et al. (1995) Clinical Immunology and Immunopathology 75:75-83; X206);

plicní tkáň infikovaná Nippostrongulus (Coffman, et al. (1989) Science 245: 308-310; X200); celé normální plíce dospělého jedince (0200); celé plíce rag-1 (Schwarz, et al. (1993) Immunodeficiency 4: 249-252; 0205); IL-10 K.O. slezina (Kuhn, et al. (1991) Cell 75:263-274; X201); celá normální slezina dospělého jedince (0201); celá slezina rag-1 (0207); IL-10 • · ·» • *· · • « « * • 9 9 ··· 9

K.O. Peyerovy skvrny (0202); celé normální Peyerovy skvrny (0210); IL-10 K.O. mesenterické lymfatické žlázy (X203); celé normální mesenterické lymfatické žlázy (0211); IL-10 K.O tlusté střevo (X203); normální celé střevo (0212); NOD myší pankreas (Makino, et al. (1980) Jikken Dobutsu 29:1-13; X205); celý brzlík, rag-1 (0208); celé ledviny rag-1 (0209); celé srdce rag-1 (0202); celý mozek rag-1 (0203); celá varlata rag1 (0204); celá játra rag-1 (0206); normální krysí pojivová tkáň (0300) a krysí artritická pojivová tkáň (X300).

V. Klonování protějšků DTLR

Za účelem získání protějšků uvedených DTLR přednostně z jiných primátů se použily různé strategie. Jednou metodou je zkřížená hybridizace za použití sond DNA blízce příbuzných specií. Jinou metodou je použití specifických PCR primerů založených na identifikaci bloků, které jsou mezi určitými druhy podobné nebo odlišné, například lidské geny, oblasti vysoce konzervativní nebo nekonzervativní polypeptidové nebo nukleotidové sekvence. V jiném případě se při expresívním klonování mohou použít protilátky.

VI. Produkce savčího proteinu DTLR

Vytvořila se například GST, což je fúzní konstrukce pro expresi například v bakteriích E. coli. Zkonstruoval se myší IGIF pGex plazmid a transformoval se do E. coli. Čerstvě transformované buňky se kultivují v médiu LB, které obsahuje 50 gg/ml ampicilinu a indukují se IPTG (Sigma, St. Louis, MO). Po celonoční indukci se sklízely bakterie a izolovaly se pelety obsahující protein DTLR. Pelety se homogenizovaly v pufru TE (50 mM Tris-báze pH8,0, 10 mM EDTA a 2 mM pefabloc) o objemu 2 litry. Tento materiál 3 krát prochází mikrofluidizér (Microfluidics, Newton, MA) . Fluidizovaný supernatant se stočí na rotoru Sorvall GS-3 po dobu 1 hodiny při 13 000 ot./min.. Výsledný supernatant obsahující protein • · • · * · · · ♦ * · • · · · · * · • · · · ♦ ······

DTLR se filtruje a dále prochází skrz glutathion-sepharózovou kolonu, která se uvedla do rovnováhy 50 mM Tris-bází pH 8,0. Shromáždily se frakce obsahující fúzní protein DTLR-GST a štěpily se trombinem (Enzyme Research Laboratories, lne., South Bend, IN). Štěpené frakce pak prošly Q-sefarózovou kolonou uvedenou do rovnováhy pufrem 50 mM Tris-báze. Shromáždily se frakce obsahující DTLR a naředily se studenou destilovanou vodou, snížila se vodivost a prošly samotnou kolonou s čerstvou Q-sefarózou nebo ve sledu s kolonou s imunoafinitními protilátkami. Shromáždily se frakce obsahující protein DTLR, rozdělily se do alikvotů a skladovaly se při teplotě -70 °C v mrazáku.

Porovnání CD spektra s proteinem DTLR1 může naznačovat, že protein je správně svinut (Hazuda, et al. (1969) J. Biol. Chem. 264:1689-1693).

VII. Biologické testy s DTLR

Biologické testy se v obecném případě týkají schopnosti proteinů vázat ligand nebo se testuje kinázová/fosfatázová aktivita receptorů. Aktivita je v typickém případě reverzibilní, jako je řada působení jiných enzymů zprostředkované aktivitou fosfatázy nebo fosforylázy. Tyto aktivity jsou snadno měřitelné standardním postupem (Hardie, et al. (eds. 1995) The Protein Kinase Fact Book vols. I and II, Academie Press, San Diego, CA; Hanks, et al. (1991) Meth. Enzymol. 200:38-62; Hunter, et al. (1992) Cell 70: 375-388; Lewin (1990) Cell 61: 743-752; Pines, et al. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 56: 449-463 a Parker, et al. (1993) Nátuře 363:736-738.

Rodina interleukinů 1 obsahuje molekuly, kdy každá z nich je důležitý mediátor zánětlivého onemocnění (Dinarello (1996) „Biological basis for interleukin-1 in disease Blood 87: 2095-2147). Zde se naznačuje, že různé ligandy Toll mohou hrát důležitou úlohu při zahájení onemocnění. Nalezení nových • · • · proteinů příbuzných rodině IL-1 podporuje identifikaci molekul, které poskytují molekulární základ pro zahájení onemocnění a umožňuje vývoj terapeutických strategií většího rozsahu a účinnosti.

VIII. Příprava protilátek specifických například pro DTLR4

Inbrední myši Balb/c se imunizovaly interperitonálně rekombinanntími formami proteinu, například čištěný DTLR4 nebo stabilně transfekované buňky NIH-3T3. Zvířata jsou za účelem další stimulace produkce protilátek imunizována ve vhodném čase proteinem s dalším adjuvans nebo bez něho. Shromáždilo se sérum nebo hybridomy produkované získanými slezinami.

V alternativním případě se myši Balb/c imunizovaly s buňkami transformovanými genem nebo jeho fragmentem. Jde buď o endogenní nebo exogenní buňky. Mohou se také imunizovat izolovanými mebránami obohacenými expresí antigenů. Sérum se sebralo ve vhodném čase, v typickém případě po řadě dalších aplikací. Při produkci proteinu in šitu nebo při vytvoření imunitní odezvy se mohou použít různé metody genové terapie. Mohou se připravit monoklonální protilátky. Například splenocyty fúzovaly s vhodným fúzním partnerem a hybridomy se vybraly v růstovém médiu standardními postupy. U supernatantů hybridomů se testovala přítomnost protilátek, které se vážou na požadovaný DTLR, například testem ELISA nebo jiným testem. Mohou se také vybrat a připravit protilátky, které specificky rozeznávají specifická provedení DTLR.

V jiném postupu se syntetické peptidy nebo čištěný protein prezentuje v imunitnímu systému za vzniku monoklonálních nebo polyklonálních protilátek (Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene a Harlow and Lané (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Ve správných situacích je vazebné činidlo buď značeno, jak se popisuje shora v textu, například fluorescenčně nebo jinak nebo je imobilizováno na substrátu. Nukleové kyseliny se mohou také • ·

zavést do buněk zvířat, aby produkovaly antigen, který slouží k vyvolání imunitní odezvy (popisuje se například v publikaci Wang, et al. (1993) Proč. Naťl. Acad. Sci. 90: 4156-4160; Barry et al. (1994) BioTechniques 16: 616-619 a Xiang, et al. (1995) Immunity 2: 129-135).

IX. Produkce fúzních proteinů například s DTLR5

S proteinem DTLR5 se připravují různé fúzní konstrukce. Tato část genu se fúzuje s epitopem tag, například FLAG tag nebo s konstruktem dvou hybridních systémů (popisuje se například v publikaci Fields and Song (1989) Nátuře 340: 245-246).

Epitop tag se může použít při postupu expresívního klonování, kde se k detekci vazebného partnera používají protlátky antiFLAG, například ligand pro protein DTLR5. Pro izolaci proteinů, který se může specificky vázat na DTLR5, se může také použít dvouhybridní systém.

X. Mapování DTLR na chromozómu

Připraví se patern chromozomů. Hybridizace in šitu se uskutečnila s přípravkem chromozómů získaných z lymfocytů stimulovaných fytohemaglutininem kultivovaných po dobu 72 hodin. Při posledních sedmi hodinách kultivace se přidá 5bromodeoxyuridin (60 gg/ml), aby se zajistilo posthybridizační vytvoření pruhů dobré kvality.

Vhodný fragment, například fragment vytvořený PCR amplifikovaný za pomoci primerů, kde se jako templát použije celková cDNA B buňky, se klonoval do vhodného vektoru. Vektor je značen nick-translací ³H. Radioaktivně značená sonda hybridizuje s metafázovým paternem, jak se popisuje v publikaci Mattei, et al. (1985) Hum. Genet. 69:327-331.

Po té, co se sklíčka potáhnou jadernou stopovací emulzí (KODAK NTB2) exponuji se například 18 dní při teplotě 4 °C . Tiby se předešlo sklouznutí zrnek stříbra během tvoření pruhů, jsou chromozomy nejdříve obarveny pufrovaným roztokem Giemsa a ’ φ , · ········ • · · · · · ··» · ··' ···· ·· ·· metafáze se vyfotografuje. Pak se uskuteční R-pruhování pomocí metody fluorochrom-fotolýza-Giemsa (FPG) a metafáze se před analýzou fotografovaly.

V alternativním případě se může provést metoda FISH, jak se popisuje shora v textu. Geny DTLR se nacházejí na různých chromozómech. DTLR2 a DTLR3 se nacházejí na lidském chromozómu 4; DTLR4 se nachází na lidském chromozómu 9 a DTLR5 se nachází na lidském chromozómu 1 (obrázky 4A až 4D).

XI. Vztah strukturní aktivity

Informace o důležitosti určitých zbytků se stanovily za použití standardních postupů a analýz. Provedla se standardní mutagenní analýza, například generováním mnoha odlišných variant ve stanovených polohách, například ve shora v textu uvedených polohách a zhodnocením biologických aktivit variant. To se může uskutečnit za účelem dosažení určujících poloh, které upravují aktivitu nebo je možné se zaměřit na specifické polohy pro stanovení zbytků, které mohou substituovat, zachovat , blokovat nebo mohou modulovat biologickou aktivitu.

V jiném případě analýza přirozených variant může indikovat , v kterých polohách se tolerují přirozené mutace. To může vyplývat z populační analýzy kolísání mezi jednotlivci nebo mezi kmeny nebo druhy. Analyzovaly se vzorky z vybraných jednotlivců, např. analýzou PCR a sekvenováním. To umožňuje hodnocení polymorfizmů v populaci.

XII. Izolace ligandu pro DTLR

DTLR se může použít jako specifické vazebné činidlo pro identifikaci jeho vazebných partnerů tím, že využije výhodu jeho specifity vazby. V tomto případě se s největší pravděpodobností použijí protilátky. Vázané činidlo je buď značeno, jak se popisuje shora v textu, například fluorescencí nebo jiným možným způsobem nebo je imobilizováno na substrát.

θ ···· ······· ·· ··

Pro testování expresivní knihovny vytvořené z buněčné linie , která exprimuje vazebného partnera například ligand, který je s výhodou spojen s membránou, se používá vazebná kompozice, kterou lze také využít při detekci nebo klasifikaci povrchově exprimovaných ligand. Testování vnitrobuněčné exprese se uskutečnilo provedením různých barvení nebo imunofluorescenčními postupy (MaMahan, et al. (1991) EMBO J. 10: 2821-2832).

Například v den 0 se permanoxní sklíčka se dvěmi komůrkami potáhnou 1 ml fibronektinu v koncentraci 10 ng/ml v PBS, po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Propláchnou se jedenkrát s PBS. Pak se do každé komůrky s 1,5 ml růstového média vnese 2 až 3 χ 10⁵ buněk. Inkubují se přes noc při teplotě 37 °C.

V den 1 se pro každý roztok připraví 0,5 ml roztoku DEAEdextran v koncentraci 66 gg/ml, 66 μΜ chlorochin a 4 pg DNA v séru bez DME. Pro každou sadu se připravila pozitivní kontrola, je to například cDNA DTLR-FLApgG v ředění 1 a 1/200 a negativní kontrola. Buňky se promyly sérem bez DME. Přidal se roztok DNA a směs se inkubovala 5 hodin při teplotě 37 °C.

Kultivační médium se odstranilo a přidal se 0,5 ml 10 % DMSO v DME po dobu 2,5 min.. Roztok se odstranil a buňky se jedenkrát promyly DME. Přidalo se 1,5 ml růstového média a směs se inkubovala přes noc.

V den 2 se vyměnilo kultivační médium. V den 3 nebo 4 se buňky fixovaly a barvily. Buňky se dvakrát promyly pufrovaným fyziologickým roztokem podle Hanka (HBSS) a fixovaly se ve 4 % paraformaldehydu (PFA)/glukóza po dobu 5 min. Promyly se 3X HBSS. Sklíčka se mohou skladovat při teplotě -80 °C po té, co se odstraní veškerý roztok. Pro každou komůrku se uskutečnila následující inkubace v objemu 0,5 ml. Přidá se HBSS/saponin (0,1%) s 32 μΙ/ml IM NaN₃ po dobu 20 minut. Buňky se pak promyly IX ředěným roztokem HBSS/saponin. K buňkám se přidal vhodný protein DTLR nebo komplex DTLR/protilátky a vše se inkubovalo po dobu 30 minut. Buňky se dvakrát promyly • »

HBSS/saponin. Jestliže je to vhodné přidají se první portilátky a směs se nechá inkubovat po dobu 30 minut. Pak se přidají druhé protilátky v ředění 1/200 a vše se inkubuje po dobu 30 min. Druhými protilátkami jsou protilátky proti myším. Připraví se roztoku pro test ELISA, je to například roztok vektorové vybrané ABC křenové peroxidázy a provede se preinkubace po dobu 30 min. Může se například použít jedna kapka roztoku A (avidin) a 1 kapka roztoku B (biotin) do 2,5 ml HBSS/saponin. Buňky se dvakrát promyjí HBSS/saponinem. Přidá se roztok ABC HRP a provede se inkubace po dobu 30 minut. Buňky se promyjí dvakrát s HBSS. Druhé promytí se provádí po dobu 2 minut. Pak se přidá vektorová diaminbenzoová kyselina (DAB) a vše se inkubuje po dobu 5 až 10 minut. Na 5 ml ve skle destilované vody se použijí 2 kapky pufru plus 4 kapky DAB plus 2 kapky H₂O₂. Opatrně se odstraní roztok z komůrky a sklíčko se promyje vodou. Dále se sklíčko suší vzduchem po dobu několika minut a pak se přidá 1 kapka krystalického překrytí a krycí sklíčko. Preparát se zapeče při teplotě 85 až 90 °C po dobu 5 minut.

Pak se vyhodnocuje pozitivní zbarvení jednotlivých genů, které zodpovídají za vazbu.

V jiném případě činidla DTLR se použijí při afinitním čištění nebo při oddělení buněk, které exprimují putativní ligand (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York nebo Ausubel et al., Biology, Green Publishing Associates, Brooklyn, NY; nebo Ausubel, et el., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New Yourk.

Další strategií pro testování receptorů navázaného na membráně je panning. Podle popisu shora v textu se zkonstruuje receptorová cDNA. Ligand se může imobilizovat může se použít k imobilizaci expresívních buněk. Imobilizace se může dosáhnout použitím vhodných protilátek, které rozeznávají například sekvenci FLAG DTLR fúzní konstrukce, nebo použitím • · · · protilátek vytvořených proti prvním protilátkám. Rekurzivní cykly výběru a amplifikace vedou k dostupnosti vhodných klonů a k eventuální izolaci klonů exprimujících receptor.

Pomocí savčích DTLR se testuje fágová expresíbní knihovna. Vhodné značící metody, což jsou například protilátky proti FLAG, umožňují specifické značení vhodných klonů.

Sekvenční protokol (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2367 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..2358 (ix) ZNAKY:

(A) (B)

Název/klíč: mat_peptid Pozice: 67 . .2358 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

• · · • · · ·

91

• · · ·

ATG

ACT

AGC

ATC

TTC

CAT

TTT

GCC

ATT

ATC

TTC

ATG

TTA

ATA

CTT

CAG

48

Met -22

Thr

Ser -20

Ile

Phe

His

Phe

Ala -15

Ile

Ile

Phe

Met

Leu -10

Ile

Leu

Gin·

ATC

AGA

ATA

CAA

TTA

TCT

GAA

GAA

AGT

GAA

TTT

TTA

GTT

GAT

AGG

TCA

96

Ile

Arg -5

Ile

Gin

Leu

Ser

Glu 1

Glu

Ser

Glu

Phe 5

Leu

Val

Asp

Arg

Ser 10.

AAA

AAC

GGT

CTC

ATC

CAC

GTT

CCT

AAA

GAC

CTA

TCC

CAG

AAA

ACA

ACA

144

Lys

Asn

Gly

Leu

Ile 15

His

Val

Pro

Lys

Asp 20

Leu

Ser

Gin

Lys

Thr 25

Thr

ATC

TTA

AAT

ATA

TCG

CAA

AAT

TAT

ATA

TCT

GAG

CTT

TGG

ACT

TCT

GAC

192

Ile

Leu

Asn

Ile 30

Ser

Gin

Asn

Tyr

Ile 35

Ser

Glu

Leu

Trp

Thr 40

Ser

Asp

ATC

TTA

TCA

CTG

TCA

AAA

CTG

AGG

ATT

TTG

ATA

ATT

TCT

CAT

AAT

AGA

240

Ile

Leu

Ser 45

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg 50

Ile

Leu

Ile

Ile

Ser 55

His

Asn

Arg

ATC

CAG

TAT

CTT

GAT

ATC

AGT

GTT

TTC

AAA

TTC

AAC

CAG

GAA

TTG

GAA

288

Ile

Gin 60

Tyr

Leu

Asp

Ile

Ser 65

Val

Phe

Lys

Phe

Asn 70

Gin

Glu

Leu

Glu

TAC

TTG

GAT

TTG

TCC

CAC

AAC

AAG

TTG

GTG

AAG

ATT

TCT

TGC

CAC

CCT

336

Tyr 75

Leu

Asp

Leu

Ser

His 80

Asn

Lys

Leu

Val

Lys 85

Ile

Ser

Cys

His

Pro 90

ACT

GTG

AAC

CTC

AAG

CAC

TTG

GAC

CTG

TCA

TTT

AAT

GCA

TTT

GAT

GCC

384

Thr

Val

Asn

Leu

Lys 95

His

Leu

Asp

Leu

Ser 100

Phe

Asn

Ala

Phe

Asp 105

Ala

CTG

CCT

ATA

TGC

AAA

GAG

TTT

GGC

AAT

ATG

TCT

CAA

CTA

AAA

TTT

CTG

432

Leu

Pro

Ile

Cys 110

Lys

Glu

Phe

Gly

Asn 115

Met

Ser

Gin

Leu

Lys 120

Phe

Leu

GGG

TTG

AGC

ACC

ACA

CAC

TTA

GAA

AAA

TCT

AGT

GTG

CTG

CCA

ATT

GCT

480

Gly

Leu

Ser 125

Thr

Thr

His

Leu

Glu 130

Lys

Ser

Ser

Val

Leu 135

Pro

Ile

Ala

CAT

TTG

AAT

ATC

AGC

AAG

GTC

TTG

CTG

GTC

TTA

GGA

GAG

ACT

TAT

GGG

528

His

Leu 140

Asn

Ile

Ser

Lys

Val 145

Leu

Leu

Val

Leu

Gly 150

Glu

Thr

Tyr

Gly

GAA

AAA

GAA

GAC

CCT

GAG

GGC

CTT

CAA

GAC

TTT

AAC

ACT

GAG

AGT

CTG

576

Glu 155

Lys

Glu

Asp

Pro

Glu 160

Gly

Leu

Gin

Asp

Phe 165

Asn

Thr

Glu

Ser

Leu 170

CAC

ATT

GTG

TTC

CCC

ACA

AAC

AAA

GAA

TTC

CAT

TTT

ATT

TTG

GAT

GTG

624

His

Ile

Val

Phe

Pro 175

Thr

Asn

Lys

Glu

Phe 180

His

Phe

Ile

Leu

Asp 185

Val

TCA

GTC

AAG

ACT

GTA

GCA

AAT

CTG

GAA

CTA

TCT

AAT

ATC

AAA

TGT

GTG

672

Ser

Val

Lys

Thr 190

Val

Ala

Asn

Leu

Glu 195

Leu

Ser

Asn

Ile

Lys 200

Cys

Val

ČTA

GAA

GAT

AAC

AAA

TGT

TCT

TAC

TTC

CTA

AGT

ATT

CTG

GCG

AAA

CTT

720

Leu

Glu

Asp

Asn

Lys

Cys

Ser

Tyr

Phe

Leu

Ser

Ile

Leu

Ala

Lys

Leu

• ·

768

205 210 215

CAA Gin

ACA AAT

CCA AAG

TTA TCA AGT CTT ACC TTA AAC AAC ATT GAA ACA

Thr 220

Asn

Pro

Lys

Leu Ser 225

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn 230

Asn

Ile

Glu

Thr

ACT

TGG

AAT

TCT

TTC

ATT AGG

ATC

CTC

CAA

CTA

GTT

TGG

CAT

ACA

ACT

Thr

Trp

Asn

Ser

Phe

Ile Arg

Ile

Leu

Gin

Leu

Val

Trp

His

Thr

Thr

235

240

245

250

GTA

TGG

TAT

TTC

TCA

ATT TCA

AAC

GTG

AAG

CTA

CAG

GGT

CAG

CTG

GAC

Val

Trp

Tyr

Phe

Ser

Ile Ser

Asn

Val

Lys

Leu

Gin

Gly

Gin

Leu

Asp

255

260

265

TTC

AGA

GAT

TTT

GAT

TAT TCT

GGC

ACT

TCC

TTG

AAG

GCC

TTG

TCT

ATA

Phe

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr Ser

Gly

Thr

Ser

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Ile

270

275

280

CAC

CAA

GTT

GTC

AGC

GAT GTG

TTC

GGT

TTT

CCG

CAA

AGT

TAT

ATC

TAT

His

Gin

Val

Val

Ser

Asp Val

Phe

Gly

Phe

Pro

Gin

Ser

Tyr

Ile

Tyr

285

290

295

GAA

ATC

TTT

TCG

AAT

ATG AAC

ATC

AAA

AAT

TTC

ACA

GTG

TCT

GGT

ACA

Glu

Ile

Phe

Ser

Asn

Met Asn

Ile

Lys

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Gly

Thr

300

305

310

CGC

ATG

GTC

CAC

ATG

CTT TGC

CCA

TCC

AAA

ATT

AGC

CCG

TTC

CTG

CAT

Arg

Met

Val

His

Met

Leu Cys

Pro

Ser

Lys

Ile

Ser

Pro

Phe

Leu

His

315

320

325

330

TTG

GAT

TTT

TCC

AAT

AAT CTC

TTA

ACA

GAC

ACG

GTT

TTT

GAA

AAT

TGT

Leu

Asp

Phe

Ser

Asn

Asn Leu

Leu

Thr

Asp

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Cys

335

340

345

GGG

CAC

CTT

ACT

GAG

TTG GAG

ACA

CTT

ATT

TTA

CAA

ATG

AAT

CAA

TTA

Gly

His

Leu

Thr

Glu

Leu Glu

Thr

Leu

Ile

Leu

Gin

Met

Asn

Gin

Leu

350

355

360

AAA

GAA

CTT

TCA

AAA

ATA GCT

GAA

ATG

ACT

ACA

CAG

ATG

AAG

TCT

CTG

Lys

Glu

Leu

Ser

Lys

Ile Ala

Glu

Met

Thr

Thr

Gin

Met

Lys

Ser

Leu

365

370

375

CAA

CAA

TTG

GAT

ATT

AGC CAG

AAT

TCT

GTA

AGC

TAT

GAT

GAA

AAG

AAA

Gin

Gin

Leu

Asp

Ile

Ser Gin

Asn

Ser

Val

Ser

Tyr

Asp

Glu

Lys

Lys

380

385

390

GGA

GAC

TGT

TCT

TGG

ACT AAA

AGT

TTA

TTA

AGT

TTA

AAT

ATG

TCT

TCA

Gly

Asp

Cys

Ser

Trp

Thr Lys

Ser

Leu

Leu

Ser

Leu

Asn

Met

Ser

Ser

395

400

405

410

AAT

ATA

CTT

ACT

GAC

ACT ATT

TTC

AGA

TGT

TTA

CCT

CCC

AGG

ATC

AAG

Asn

Ile

Leu

Thr

Asp

Thr Ile

Phe

Arg

Cys

Leu

Pro

Pro

Arg

Ile

Lys

415

420

425

GTA

CTT

GAT

CTT

CAC

AGC AAT

AAA

ATA

AAG

AGC

ATT

CCT

AAA

CAA

GTC

Val

Leu

Asp

Leu

His

Ser Asn

Lys

Ile

Lys

Ser

Ile

Pro

Lys

Gin

Val

430

435

440

GTA

AAA

CTG

GAA

GCT

TTG CAA

GAA

CTC

AAT

GTT

GCT

TTC

AAT

TCT

TTA

Val

Lys

Leu

Glu

Ala

Leu Gin

Glu

Leu

Asn

Val

Ala

Phe

Asn

Ser

Leu

445

450

455

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1440 • ·

ACT Thr

GAC Asp 460

CTT CCT

GGA Gly

TGT GGC AGC TTT

AGC Ser

AGC Ser

CTT Leu 470

TCT Ser

GTA Val

TTG Leu

ATC Ile

1488

Leu

Pro

Cys

Gly 465

Ser

Phe

ATT

GAT

CAC

AAT

TCA

GTT

TCC

CAC

CCA

TCA

GCT

GAT

TTC

TTC

CAG

AGC

1536

Ile 475

Asp

His

Asn

Ser

Val 480

Ser

His

Pro

Ser

Ala 485

Asp

Phe

Phe

Gin

Ser 490

TGC

CAG

AAG

ATG

AGG

TCA

ATA

AAA

GCA

GGG

GAC

AAT

CCA

TTC

CAA

TGT-

1584

Cys

Gin

Lys

Met

Arg 495

Ser

Ile

Lys

Ala

Gly 500

Asp

Asn

Pro

Phe

Gin 505

Cys

ACC

TGT

GAG

CTC

GGA

GAA

TTT

GTC

AAA

AAT

ATA

GAC

CAA

GTA

TCA

AGT

1632

Thr

Cys

Glu

Leu 510

Gly

Glu

Phe

Val

Lys 515

Asn

Ile

Asp

Gin

Val 520

Ser

Ser

GAA

GTG

TTA

GAG

GGC

TGG

CCT

GAT

TCT

TAT

AAG

TGT

GAC

TAC

CCG

GAA

1680

Glu

Val

Leu 525

Glu

Gly

Trp

Pro

Asp 530

Ser

Tyr

Lys

Cys

Asp 535

Tyr

Pro

Glu

AGT

TAT

AGA

GGA

ACC

CTA

CTA

AAG

GAC

TTT

CAC

ATG

TCT

GAA

TTA

TCC

1728

Ser

Tyr 540

Arg

Gly

Thr

Leu

Leu 545

Lys

Asp

Phe

His

Met 550

Ser

Glu

Leu

Ser

TGC

AAC

ATA

ACT

CTG

CTG

ATC

GTC

ACC

ATC

GTT

GCC

ACC

ATG

CTG

GTG

1776

Cys 555

Asn

Ile

Thr

Leu

Leu 560

Ile

Val

Thr

Ile

Val 565

Ala

Thr

Met

Leu

Val 570

TTG

GCT

GTG

ACT

GTG

ACC

TCC

CTC

TGC

ATC

TAC

TTG

GAT

CTG

CCC

TGG

1824

Leu

Ala

Val

Thr

Val 575

Thr

Ser

Leu

Cys

Ile 580

Tyr

Leu

Asp

Leu

Pro 585

Trp

TAT

CTC

AGG

ATG

GTG

TGC

CAG

TGG

ACC

CAG

ACC

CGG

CGC

AGG

GCC

AGG

1872

Tyr

Leu

Arg

Met 590

Val

Cys

Gin

Trp

Thr 595

Gin

Thr

Arg

Arg

Arg 600

Ala

Arg

AAC

ATA

CCC

TTA

GAA

GAA

CTC

CAA

AGA

AAT

CTC

CAG

TTT

CAT

GCA

TTT

1920

Asn

Ile

Pro 605

Leu

Glu

Glu

Leu

Gin 610

Arg

Asn

Leu

Gin

Phe 615

His

Ala

Phe

ATT

TCA

TAT

AGT

GGG

CAC

GAT

TCT

TTC

TGG

GTG

AAG

AAT

GAA

TTA

TTG

1968

Ile

Ser 620

Tyr

Ser

Gly

His

Asp 625

Ser

Phe

Trp

Val

Lys 630

Asn

Glu

Leu

Leu

CCA

AAC

CTA

GAG

AAA

GAA

GGT

ATG

CAG

ATT

TGC

CTT

CAT

GAG

AGA

AAC

2016

Pro 635

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu 640

Gly

Met

Gin

Ile

Cys 645

Leu

His

Glu

Arg

Asn 650

TTT

GTT

CCT

GGC

AAG

AGC

ATT

GTG

GAA

AAT

ATC

ATC

ACC

TGC

ATT

GAG

2064

Phe

Val

Pro

Gly

Lys 655

Ser

Ile

Val

Glu

Asn 660

Ile

Ile

Thr

Cys

Ile 665

Glu

AAG

AGT

TAC

AAG

TCC

ATC

TTT

GTT

TTG

TCT

CCC

AAC

TTT

GTC

CAG

AGT

2112

Lys

Ser

Tyr

Lys 670

Ser

Ile

Phe

Val

Leu 675

Ser

Pro

Asn

Phe

Val 680

Gin

Ser

GAA

TGG

TGC

CAT

TAT

GAA

CTC

TAC

TTT

GCC

CAT

CAC

AAT

CTC

TTT

CAT

2160

Glu

Trp

Cys 685

His

Tyr

Glu

Leu

Tyr 690

Phe

Ala

His

His

Asn 695

Leu

Phe

His

GAA Glu

GGA Gly 700

TCT Ser

AAT AGC TTA

ATC Ile 705

CTG Leu

ATC TTG CTG GAA CCC ATT CCG CAG

2208

Asn

Ser

Leu

Ile

Leu

Leu

Glu 710

Pro

Ile

Pro

Gin

TAC

TCC

ATT

CCT

AGC

AGT

TAT

CAC

AAG

CTC

AAA

AGT

CTC

ATG

GCC

AGG

2256

Tyr

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Tyr

His

Lys

Leu

Lys

Ser

Leu

Met

Ala

Arg

715

720

725

730

AGG

ACT

TAT

TTG

GAA

TGG

CCC

AAG

GAA

AAG

AGC

AAA

CGT

GGC

CTT

TTT

2304

Arg

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Pro

Lys

Glu

Lys

Ser

Lys

Arg

Gly

Leu

Phe

735

740

745

TGG

GCT

AAC

TTA

AGG

GCA

GCC

ATT

AAT

ATT

AAG

CTG

ACA

GAG

CAA

GCA

2352

Trp

Ala

Asn

Leu

Arg

Ala

Ala

Ile

Asn

Ile

Lys

Leu

Thr

Glu

Gin

Ala

750

755

760

AAG

AAA

TAGTCTAGA

2367

Lys Lys (1) Informace k SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 786 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 2

Met -22

Thr

Ser -20

Ile

Phe

His

Phe

Ala -15

Ile

Ile

Phe

Met

Leu -10

Ile

Leu

Gin

Ile

Arg -5

Ile

Gin

Leu

Ser

Glu 1

Glu

Ser

Glu

Phe 5

Leu

Val

Asp

Arg

Ser 10

Lys

Asn

Gly

Leu

Ile 15

His

Val

Pro

Lys

Asp 20

Leu

Ser

Gin

Lys

Thr 25

Thr

Ile

Leu

Asn

Ile 30

Ser

Gin

Asn

Tyr

Ile 35

Ser

Glu

Leu

Trp

Thr 40

Ser

Asp

Iie

Leu

Ser 45

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg 50

Ile

Leu

Ile

Ile

Ser 55

His

Asn

Arg

Ile

Gin 60

Tyr

Leu

Asp

Ile

Ser 65

Val

Phe

Lys

Phe

Asn 70

Gin

Glu

Leu

Glu

Tyr 75

Leu

Asp

Leu

Ser

His 80

Asn

Lys

Leu

Val

Lys 85

Ile

Ser

Cys

His

Pro 90

Thr

Val

Asn

Leu

Lys 95

His

Leu

Asp

Leu

Ser 100

Phe

Asn

Ala

Phe

Asp 105

Ala

Leu

Pro

Ile

Cys 110

Lys

Glu

Phe

Gly

Asn 115

Met

Ser

Gin

Leu

Lys 120

Phe

Leu

Gly

Leu

Ser 125

Thr

Thr

His

Leu

Glu 130

Lys

Ser

Ser

Val

Leu 135

Pro

Ile

Ala

• · · ·

His

Leu 140

Asn Ile

Ser

Lys

Val 145

Leu Leu Val

Leu

Gly Glu Thr Tyr Gly 150

Glu

Lys

Glu

Asp

Pro

Glu

Gly

Leu

Gin

Asp

Phe

Asn

Thr

Glu

Ser

Leu

155

160

165

170

His

Ile

Val

Phe

Pro

Thr

Asn

Lys

Glu

Phe

His

Phe

Ile

Leu

Asp

Val

175

180

185

Ser

Val

Lys

Thr

Val

Ala

Asn

Leu

Glu

Leu

Ser

Asn

Ile

Lys

Cys

Val

190

195

200

Leu

Glu

Asp

Asn

Lys

Cys

Ser

Tyr

Phe

Leu

Ser

Ile

Leu

Ala

Lys

Leu

205

210

215

Gin

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Leu

Asn

Asn

Ile

Glu

Thr

220

225

230

Thr

Trp

Asn

Ser

Phe

Ile

Arg

Ile

Leu

Gin

Leu

Val

Trp

His

Thr

Thr

235

240

245

250

Val

Trp

Tyr

Phe

Ser

Ile

Ser

Asn

Val

Lys

Leu

Gin

Gly

Gin

Leu

Asp

255

260

265

Phe

Arg

Asp

Phe

Asp

Tyr

Ser

Gly

Thr

Ser

Leu

Lys

Ala

Leu

Ser

Ile

270

275

280

His

Gin

Val

Val

Ser

Asp

Val

Phe

Gly

Phe

Pro

Gin

Ser

Tyr

Ile

Tyr

285

290

295

Glu

Ile

Phe

Ser

Asn

Met

Asn

Ile

Lys

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Gly

Thr

300

305

310

Arg

Met

Val

His

Met

Leu

Cys

Pro

Ser

Lys

Ile

Ser

Pro

Phe

Leu

His

315

320

325

330

Leu

Asp

Phe

Ser

Asn

Asn

Leu

Leu

Thr

Asp

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Cys

335

340

345

Gly

His

Leu

Thr

Glu

Leu

Glu

Thr

Leu

Ile

Leu

Gin

Met

Asn

Gin

Leu

350

355

360

Lys

Glu

Leu

Ser

Lys

Ile

Ala

Glu

Met

Thr

Thr

Gin

Met

Lys

Ser

Leu

365

370

375

Gin

Gin

Leu

Asp

Ile

Ser

Gin

Asn

Ser

Val

Ser

Tyr

Asp

Glu

Lys

Lys

380

385

390

Gly

Asp

Cys

Ser

Trp

Thr

Lys

Ser

Leu

Leu

Ser

Leu

Asn

Met

Ser

Ser

395

400

405

410

Asn

Ile

Leu

Thr

Asp

Thr

Ile

Phe

Arg

Cys

Leu

Pro

Pro

Arg

Ile

Lys

415

420

425

Val

Leu

Asp

Leu

His

Ser

Asn

Lys

Ile

Lys

Ser

Ile

Pro

Lys

Gin

Val

430 435 440

Val Lys Leu Glu Ala Leu Gin Glu Leu Asn Val Ala Phe Asn Ser Leu 445 450 455 • « · · • · ·

Thr

Asp 460

Leu

Pro

Gly

Cys

Gly 465

Ser

Phe

Ser

Ser

Leu 470

Ser

Val

Leu

Ile

Ile 475

Asp

His

Asn

Ser

Val 480

Ser

His

Pro

Ser

Ala 485

Asp

Phe

Phe

Gin

Ser 490

Cys

Gin

Lys

Met

Arg 495

Ser

Ile

Lys

Ala

Gly 500

Asp

Asn

Pro

Phe

Gin 505

Cys

Thr

Cys

Glu

Leu 510

Gly

Glu

Phe

Val

Lys 515

Asn

Ile

Asp

Gin

Val 520

Ser

Ser.

Glu

Val

Leu 525

Glu

Gly

Trp

Pro

Asp 530

Ser

Tyr

Lys

Cys

Asp 535

Tyr

Pro

Glu

Ser

Tyr 540

Arg

Gly

Thr

Leu

Leu 545

Lys

Asp

Phe

His

Met 550

Ser

Glu

Leu

Ser

Cys 555

Asn

Ile

Thr

Leu

Leu 560

Ile

Val

Thr

Ile

Val 565

Ala

Thr

Met

Leu

Val 570

Leu

Ala

Val

Thr

Val 575

Thr

Ser

Leu

Cys

Ile 580

Tyr

Leu

Asp

Leu

Pro 585

Trp

Tyr

Leu

Arg

Met 590

Val

Cys

Gin

Trp

Thr 595

Gin

Thr

Arg

Arg

Arg 600

Ala

Arg

Asn

Ile

Pro 605

Leu

Glu

Glu

Leu

Gin 610

Arg

Asn

Leu

Gin

Phe 615

His

Ala

Phe

Ile

Ser 620

Tyr

Ser

Gly

His

Asp 625

Ser

Phe

Trp

Val

Lys 630

Asn

Glu

Leu

Leu

Pro 635

Asn

Leu

Glu

Lys

Glu 640

Gly

Met

Gin

Ile

Cys 645

Leu

His

Glu

Arg

Asn 650

Phe

Val

Pro

Gly

Lys 655

Ser

Ile

Val

Glu

Asn 660

Ile

Ile

Thr

Cys

Ile 665

Glu

Lys

Ser

Tyr

Lys 670

Ser

Ile

Phe

Val

Leu 675

Ser

Pro

Asn

Phe

Val 680

Gin

Ser

Glu

Trp

Cys 685

His

Tyr

Glu

Leu

Tyr 690

Phe

Ala

His

His

Asn 695

Leu

Phe

His

Glu

Gly 700

Ser

Asn

Ser

Leu

Ile 705

Leu

Ile

Leu

Leu

Glu 710

Pro

Ile

Pro

Gin

Tyr 715

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser 720

Tyr

His

Lys

Leu

Lys 725

Ser

Leu

Met

Ala

Arg 730

Arg

Thr

Tyr

Leu

Glu 735

Trp

Pro

Lys

Glu

Lys 740

Ser

Lys

Arg

Gly

Leu 745

Phe

Trp

Ala

Asn

Leu

Arg

Ala

Ala

Ile

Asn

Ile

Lys

Leu

Thr

Glu

Gin

Ala

Lys Lys

750 755 760 • · » • · • · · ·

		97 ··· ·
Informace o	SEQ ID NO: 3:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 2355 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

ix)	ZNAKY:
	(A) Název/klíč:	CDS
	(B) Pozice: 1 .	.2352
ix)	ZNAKY:
	(A) Název/klíč:	mat peptid
	(B) Pozice: 67	..2352

(xi)

POPIS

SEKVENCE:

SEC

! ID

NO:

: 3:

ATG

CCA

CAT

ACT

TTG

TGG

ATG

GTG

TGG

GTC

TTG

GGG

GTC

ATC

ATC

AGC

48

Met -22

Pro

His -20

Thr

Leu

Trp

Met

Val -15

Trp

Val

Leu

Gly

Val -10

Ile

Ile

Ser

CTC

TCC

AAG

GAA

GAA

TCC

TCC

AAT

CAG

GCT

TCT

CTG

TCT

TGT

GAC

CGC

96

Leu

Ser -5

Lys

Glu

Glu

Ser

Ser 1

Asn

Gin

Ala

Ser 5

Leu

Ser

Cys

Asp

Arg 10

AAT

GGT

ATC

TGC

AAG

GGC

AGC

TCA

GGA

TCT

TTA

AAC

TCC

ATT

CCC

TCA

144

Asn

Gly

Ile

Cys

Lys 15

Gly

Ser

Ser

Gly

Ser 20

Leu

Asn

Ser

Ile

Pro 25

Ser

GGG

CTC

ACA

GAA

GCT

GTA

AAA

AGC

CTT

GAC

CTG

TCC

AAC

AAC

AGG

ATC

192

Gly

Leu

Thr

Glu 30

Ala

Val

Lys

Ser

Leu 35

Asp

Leu

Ser

Asn

Asn 40

Arg

Ile

ACC

TAC

ATT

AGC

AAC

AGT

GAC

CTA

CAG

AGG

TGT

GTG

AAC

CTC

CAG

GCT

240

Thr

Tyr

Ile 45

Ser

Asn

Ser

Asp

Leu 50

Gin

Arg

Cys

Val

Asn 55

Leu

Gin

Ala

CTG

GTG

CTG

ACA

TCC

AAT

GGA

ATT

AAC

ACA

ATA

GAG

GAA

GAT

TCT

TTT

288

Leu

Val 60

Leu

Thr

Ser

Asn

Gly 65

Ile

Asn

Thr

Ile

Glu 70

Glu

Asp

Ser

Phe

TCT

TCC

CTG

GGC

AGT

CTT

GAA

CAT

TTA

GAC

TTA

TCC

TAT

AAT

TAC

TTA

336

Ser 75

Ser

Leu

Gly

Ser

Leu 80

Glu

His

Leu

Asp

Leu 85

Ser

Tyr

Asn

Tyr

Leu 90

TCT

AAT

TTA

TCG

TCT

TCC

TGG

TTC

AAG

CCC

CTT

TCT

TCT

TTA

ACA

TTC

384

Ser

Asn

Leu

Ser

Ser 95

Ser

Trp

Phe

Lys

Pro 100

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr 105

Phe

TTA

AAC

TTA

CTG

GGA

AAT

CCT

TAC

AAA

ACC

CTA

GGG

GAA

ACA

TCT

CTT

432

Leu

Asn

Leu

Leu 110

Gly

Asn

Pro

Tyr

Lys 115

Thr

Leu

Gly

Glu

Thr 120

Ser

Leu

TTT

TCT

CAT

CTC

ACA

AAA

TTG

CAA

ATC

CTG

AGA

GTG

GGA

AAT

ATG

GAC

480

Phe

Ser

His 125

Leu

Thr

Lys

Leu

Gin 130

Ile

Leu

Arg

Val

Gly 135

Asn

Met

Asp

• »· · • « ··· ···

98

• · ·

• CTT Leu

• ACC Thr

• · · · · · ·

* · 528

ACC TTC ACT AAG ATT

CAA AGA

AAA GAT TTT

GCT Ala

GGA Gly 150

TTC Phe

CTT Leu

Thr

Phe 140

Thr

Lys

Ile

Gin

Arg 145

Lys

Asp

Phe

GAG

GAA

CTT

GAG

ATT

GAT

GCT

TCA

GAT

CTA

CAG

AGC

TAT

GAG

CCA

AAA

576

Glu 155

Glu

Leu

Glu

Ile

Asp 160

Ala

Ser

Asp

Leu

Gin 165

Ser

Tyr

Glu

Pro

Lys 170

AGT

TTG

AAG

TCA

ATT

CAG

AAC

GTA

AGT

CAT

CTG

ATC

CTT

CAT

ATG

AAG

624

Ser

Leu

Lys

Ser

Ile 175

Gin

Asn

Val

Ser

His 180

Leu

Ile

Leu

His

Met 185

Lys ·

CAG

CAT

ATT

TTA

CTG

CTG

GAG

ATT

TTT

GTA

GAT

GTT

ACA

AGT

TCC

GTG

672

Gin

His

Ile

Leu 190

Leu

Leu

Glu

Ile

Phe 195

Val

Asp

Val

Thr

Ser 200

Ser

Val

GAA

TGT

TTG

GAA

CTG

CGA

GAT

ACT

GAT

TTG

GAC

ACT

TTC

CAT

TTT

TCA

720

Glu

Cys

Leu 205

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr 210

Asp

Leu

Asp

Thr

Phe 215

His

Phe

Ser

GAA

CTA

TCC

ACT

GGT

GAA

ACA

AAT

TCA

TTG

ATT

AAA

AAG

TTT

ACA

TTT

768

Glu

Leu 220

Ser

Thr

Gly

Glu

Thr 225

Asn

Ser

Leu

Ile

Lys 230

Lys

Phe

Thr

Phe

AGA

AAT

GTG

AAA

ATC

ACC

GAT

GAA

AGT

TTG

TTT

CAG

GTT

ATG

AAA

CTT

816

Arg 235

Asn

Val

Lys

Ile

Thr 240

Asp

Glu

Ser

Leu

Phe 245

Gin

Val

Met

Lys

Leu 250

TTG

AAT

CAG

ATT

TCT

GGA

TTG

TTA

GAA

TTA

GAG

TTT

GAT

GAC

TGT

ACC

864

Leu

Asn

Gin

Ile

Ser 255

Gly

Leu

Leu

Glu

Leu 260

Glu

Phe

Asp

Asp

Cys 265

Thr

CTT

AAT

GGA

GTT

GGT

AAT

TTT

AGA

GCA

TCT

GAT

AAT

GAC

AGA

GTT

ATA

912

Leu

Asn

Gly

Val 27 0

Gly

Asn

Phe

Arg

Ala 275

Ser

Asp

Asn

Asp

Arg 280

Val

Ile

GAT

CCA

GGT

AAA

GTG

GAA

ACG

TTA

ACA

ATC

CGG

AGG

CTG

CAT

ATT

CCA

960

Asp

Pro

Gly 285

Lys

Val

Glu

Thr

Leu 290

Thr

Ile

Arg

Arg

Leu 295

His

Ile

Pro

AGG

TTT

TAC

TTA

TTT

TAT

GAT

CTG

AGC

ACT

TTA

TAT

TCA

CTT

ACA

GAA

1008

Arg

Phe 300

Tyr

Leu

Phe

Tyr

Asp 305

Leu

Ser

Thr

Leu

Tyr 310

Ser

Leu

Thr

Glu

AGA

GTT

AAA

AGA

ATC

ACA

GTA

GAA

AAC

AGT

AAA

GTT

TTT

CTG

GTT

CCT

1056

Arg 315

Val

Lys

Arg

Ile

Thr 320

Val

Glu

Asn

Ser

Lys 325

Val

Phe

Leu

Val

Pro 330

TGT

TTA

CTT

TCA

CAA

CAT

TTA

AAA

TCA

TTA

GAA

TAC

TTG

GAT

CTC

AGT

1104

Cys

Leu

Leu

Ser

Gin 335

His

Leu

Lys

Ser

Leu 340

Glu

Tyr

Leu

Asp

Leu 345

Ser

GAA

AAT

TTG

ATG

GTT

GAA

GAA

TAC

TTG

AAA

AAT

TCA

GCC

TGT

GAG

GAT

1152

Glu

Asn

Leu

Met

Val

Glu

Glu

Tyr

Leu

Lys

Asn

Ser

Ala

Cys

Glu

Asp

350 355 360

GCC TGG CCC TCT CTA CAA ACT TTA ATT TTA AGG CAA AAT CAT TTG GCA 1200

Ala Trp Pro Ser Leu Gin Thr Leu Ile Leu Arg Gin Asn His Leu Ala

365 370 375

TCA TTG GAA AAA ACC GGA GAG ACT TTG CTC ACT CTG AAA AAC TTG ACT 1248 • ·· *

• ·« · · • · · · t • · * * · * · ·« ' · · * » · • e ·« ··

Ser

Leu 380

Glu

Lys

Thr

Gly

Glu 385

Thr

Leu

Leu

Thr

Leu 390

Lys

Asn

Leu

Thr

AAC

ATT

GAT

ATC

AGT

AAG

AAT

AGT

TTT

CAT

TCT

ATG

CCT

GAA

ACT

TGT

1296

Asn 395

Ile

Asp

Ile

Ser

Lys 400

Asn

Ser

Phe

His

Ser 405

Met

Pro

Glu

Thr

Cys 410

CAG

TGG

CCA

GAA

AAG

ATG

AAA

TAT

TTG

AAC

TTA

TCC

AGC

ACA

CGA

ATA

1344

Gin

Trp

Pro

Glu

Lys 415

Met

Lys

Tyr

Leu

Asn 420

Leu

Ser

Ser

Thr

Arg 425

Ile

CAC

AGT

GTA

ACA

GGC

TGC

ATT

CCC

AAG

ACA

CTG

GAA

ATT

TTA

GAT

GTT

1392

His

Ser

Val

Thr 430

Gly

Cys

Ile

Pro

Lys 435

Thr

Leu

Glu

Ile

Leu 440

Asp

Val

AGC

AAC

AAC

AAT

CTC

AAT

TTA

TTT

TCT

TTG

AAT

TTG

CCG

CAA

CTC

AAA

1440

Ser

Asn

Asn 445

Asn

Leu

Asn

Leu

Phe 450

Ser

Leu

Asn

Leu

Pro 455

Gin

Leu

Lys

GAA

CTT

TAT

ATT

TCC

AGA

AAT

AAG

TTG

ATG

ACT

CTA

CCA

GAT

GCC

TCC

1488

Glu

Leu 460

Tyr

Ile

Ser

Arg

Asn 465

Lys

Leu

Met

Thr

Leu 470

Pro

Asp

Ala

Ser

CTC

TTA

CCC

ATG

TTA

CTA

GTA

TTG

AAA

ATC

AGT

AGG

AAT

GCA

ATA

ACT

1536

Leu 475

Leu

Pro

Met

Leu

Leu 480

Val

Leu

Lys

Ile

Ser 485

Arg

Asn

Ala

Ile

Thr 490

ACG

TTT

TCT

AAG

GAG

CAA

CTT

GAC

TCA

TTT

CAC

ACA

CTG

AAG

ACT

TTG

1584

Thr

Phe

Ser

Lys

Glu 495

Gin

Leu

Asp

Ser

Phe 500

His

Thr

Leu

Lys

Thr 505

Leu

GAA

GCT

GGT

GGC

AAT

AAC

TTC

ATT

TGC

TCC

TGT

GAA

TTC

CTC

TCC

TTC

1632

Glu

Ala

Gly

Gly 510

Asn

Asn

Phe

Ile

Cys 515

Ser

Cys

Glu

Phe

Leu 520

Ser

Phe

ACT

CAG

GAG

CAG

CAA

GCA

CTG

GCC

AAA

GTC

TTG

ATT

GAT

TGG

CCA

GCA

1680

Thr

Gin

Glu 525

Gin

Gin

Ala

Leu

Ala 530

Lys

Val

Leu

Ile

Asp 535

Trp

Pro

Ala

AAT

TAC

CTG

TGT

GAC

TCT

CCA

TCC

CAT

GTG

CGT

GGC

CAG

CAG

GTT

CAG

1728

Asn

Tyr 540

Leu

Cys

Asp

Ser

Pro 545

Ser

His

Val

Arg

Gly 550

Gin

Gin

Val

Gin

GAT

GTC

CGC

CTC

TCG

GTG

TCG

GAA

TGT

CAC

AGG

ACA

GCA

CTG

GTG

TCT

1776

Asp 555

Val

Arg

Leu

Ser

Val 560

Ser

Glu

Cys

His

Arg 565

Thr

Ala

Leu

Val

Ser 570

GGC

ATG

TGC

TGT

GCT

CTG

TTC

CTG

CTG

ATC

CTG

CTC

ACG

GGG

GTC

CTG

1824

Gly

Met

Cys

Cys

Ala 575

Leu

Phe

Leu

Leu

Ile 580

Leu

Leu

Thr

Gly

Val 585

Leu

TGC

CAC

CGT

TTC

CAT

GGC

CTG

TGG

TAT

ATG

AAA

ATG

ATG

TGG

GCC

TGG

1872

Cys

His

Arg

Phe 590

His

Gly

Leu

Trp

Tyr 595

Met

Lys

Met

Met

Trp 600

Ala

Trp

CTC

CAG

GCC

AAA

AGG

AAG

CCC

AGG

AAA

GCT

CCC

AGC

AGG

AAC

ATC

TGC

1920

Leu

Gin

Ala 605

Lys

Arg

Lys

Pro

Arg 610

Lys

Ala

Pro

Ser

Arg 615

Asn

Ile

Cys

TAT

GAT

GCA

TTT

GTT

TCT

TAC

AGT

GAG

CGG

GAT

GCC

TAC

TGG

GTG

GAG

1968

Tyr

Asp

Ala

Phe

Val

Ser

Tyr

Ser

Glu

Arg

Asp

Ala

Tyr

Trp

Val

Glu

100

620 625 630

AAC Asn 635

CTT ATG GTC CAG GAG

CTG GAG AAC TTC AAT CCC

CCC Pro

TTC Phe

AAG TTG

2016

Leu

Met Val Gin

Glu 640

Leu

Glu

Asn

Phe

Asn 645

Pro

Lys

Leu 650

TGT

CTT

CAT AAG CGG

GAC

TTC

ATT

CCT

GGC

AAG

TGG

ATC

ATT

GAC

AAT

2064

Cys

Leu

His Lys Arg 655

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly 660

Lys

Trp

Ile

Ile

Asp 665

Asn

ATC

ATT

GAC TCC ATT

GAA

AAG

AGC

CAC

AAA

ACT

GTC

TTT

GTG

CTT

TCT

2112

Ile

Ile

Asp Ser Ile 670

Glu

Lys

Ser

His 675

Lys

Thr

Val

Phe

Val 680

Leu

Ser

GAA

AAC

TTT GTG AAG

AGT

GAG

TGG

TGC

AAG

TAT

GAA

CTG

GAC

TTC

TCC

2160

Glu

Asn

Phe Val Lys 685

Ser

Glu

Trp 690

Cys

Lys

Tyr

Glu

Leu 695

Asp

Phe

Ser

CAT

TTC

CGT CTT TTT

GAA

GAG

AAC

AAT

GAT

GCT

GCC

ATT

CTC

ATT

CTT

2208

His

Phe 700

Arg Leu Phe

Glu

Glu 705

Asn

Asn

Asp

Ala

Ala 710

Ile

Leu

Ile

Leu

CTG

GAG

CCC ATT GAG

AAA

AAA

GCC

ATT

CCC

CAG

CGC

TTC

TGC

AAG

CTG

2256

Leu 715

Glu

Pro Ile Glu

Lys 720

Lys

Ala

Ile

Pro

Gin 725

Arg

Phe

Cys

Lys

Leu 730

CGG

AAG

ATA ATG AAC

ACC

AAG

ACC

TAC

CTG

GAG

TGG

CCC

ATG

GAC

GAG

2304

Arg

Lys

Ile Met Asn 735

Thr

Lys

Thr

Tyr

Leu 740

Glu

Trp

Pro

Met

Asp 745

Glu

GCT

CAG

CGG GAA GGA

TTT

TGG

GTA

AAT

CTG

AGA

GCT

GCG

ATA

AAG

TCC

2352

Ala

Gin

Arg Glu Gly 750

Phe

Trp

Val

Asn 755

Leu

Arg

Ala

Ala

Ile 760

Lys

Ser

^TAG 2355

2) Informace k SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 784 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4

Met -22

Pro

His -20

Thr

Leu

Trp

Met

Val -15

Trp

Val

Leu

Gly

Val -10

Ile

Ile

Ser

Leu

Ser -5

Lys

Glu

Glu

Ser

Ser 1

Asn

Gin

Ala

Ser 5

Leu

Ser

Cys

Asp

Arg 10

Asn

Gly

Ile

Cys

Lys 15

Gly

Ser

Ser

Gly

Ser 20

Leu

Asn

Ser

Ile

Pro 25

Ser

Gly

Leu

Thr

Glu 30

Ala

Val

Lys

Ser

Leu 35

Asp

Leu

Ser

Asn

Asn 40

Arg

Ile

Thr

Tyr

Ile

Ser

Asn

Ser

Asp

Leu

Gin

Arg

Cys

Val

Asn

Leu

Gin

Ala

• · · ·

101

50 55

Leu Val 60

Leu

Thr

Ser Asn Gly 65

Ile Asn Thr

Ile

Glu 70

Glu

Asp

Ser

Phe

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser

Leu

Glu

His

Leu

Asp

Leu

Ser

Tyr

Asn

Tyr

Leu

75

80

85

90

Ser

Asn

Leu

Ser

Ser

Ser

Trp

Phe

Lys

Pro

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Phe

95

100

105

Leu

Asn

Leu

Leu

Gly

Asn

Pro

Tyr

Lys

Thr

Leu

Gly

Glu

Thr

Ser

Leu

110

115

120

Phe

Ser

His

Leu

Thr

Lys

Leu

Gin

Ile

Leu

Arg

Val

Gly

Asn

Met

Asp

125

130

135

Thr

Phe

Thr

Lys

Ile

Gin

Arg

Lys

Asp

Phe

Ala

Gly

Leu

Thr

Phe

Leu

140

145

150

Glu

Glu

Leu

Glu

Ile

Asp

Ala

Ser

Asp

Leu

Gin

Ser

Tyr

Glu

Pro

Lys

155

160

165

170

Ser

Leu

Lys

Ser

Ile

Gin

Asn

Val

Ser

His

Leu

Ile

Leu

His

Met

Lys

175

180

185

Gin

His

Ile

Leu

Leu

Leu

Glu

Ile

Phe

Val

Asp

Val

Thr

Ser

Ser

Val

190

195

200

Glu

Cys

Leu

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Asp

Leu

Asp

Thr

Phe

His

Phe

Ser

205

210

215

Glu

Leu

Ser

Thr

Gly

Glu

Thr

Asn

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys

Phe

Thr

Phe

220

225

230

Arg

Asn

Val

Lys

Ile

Thr

Asp

Glu

Ser

Leu

Phe

Gin

Val

Met

Lys

Leu

235

240

245

250

Leu

Asn

Gin

Ile

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Asp

Asp

Cys

Thr

255

260

265

Leu

Asn

Gly

Val

Gly

Asn

Phe

Arg

Ala

Ser

Asp

Asn

Asp

Arg

Val

Ile

270

275

280

Asp

Pro

Gly

Lys

Val

Glu

Thr

Leu

Thr

Ile

Arg

Arg

Leu

His

Ile

Pro

285

290

295

Arg

Phe

Tyr

Leu

Phe

Tyr

Asp

Leu

Ser

Thr

Leu

Tyr

Ser

Leu

Thr

Glu

300

305

310

Arg

Val

Lys

Arg

Ile

Thr

Val

Glu

Asn

Ser

Lys

Val

Phe

Leu

Val

Pro

315

320

325

330

Cys

Leu

Leu

Ser

Gin

His

Leu

Lys

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asp

Leu

Ser

335

340

345

Glu

Asn

Leu

Met

Val

Glu

Glu

Tyr

Leu

Lys

Asn

Ser

Ala

Cys

Glu

Asp

350 355 360

Ala Trp Pro Ser Leu Gin Thr Leu Ile Leu Arg Gin Asn His Leu Ala 365 370 375

Ser

Leu 380

Glu

Lys

Thr

Gly

Glu 385

Thr

Leu

Leu

Thr

Leu 390

Lys

Asn

Leu

Thr

Asn 395

Ile

Asp

Ile

Ser

Lys 400

Asn

Ser

Phe

His

Ser 405

Met

Pro

Glu

Thr

Cys 410

Gin

Trp

Pro

Glu

Lys 415

Met

Lys

Tyr

Leu

Asn 420

Leu

Ser

Ser

Thr

Arg 425

Ile

His

Ser

Val

Thr 430

Gly

Cys

Ile

Pro

Lys 435

Thr

Leu

Glu

Ile

Leu 440

Asp

Val

Ser

Asn

Asn 445

Asn

Leu

Asn

Leu

Phe 450

Ser

Leu

Asn

Leu

Pro 455

Gin

Leu

Lys

Glu

Leu 460

Tyr

Ile

Ser

Arg

Asn 465

Lys

Leu

Met

Thr

Leu 470

Pro

Asp

Ala

Ser

Leu 475

Leu

Pro

Met

Leu

Leu 480

Val

Leu

Lys

Ile

Ser 485

Arg

Asn

Ala

Ile

Thr 490

Thr

Phe

Ser

Lys

Glu 495

Gin

Leu

Asp

Ser

Phe 500

His

Thr

Leu

Lys

Thr 505

Leu

Glu

Ala

Gly

Gly 510

Asn

Asn

Phe

Ile

Cys 515

Ser

Cys

Glu

Phe

Leu 520

Ser

Phe

Thr

Gin

Glu 525

Gin

Gin

Ala

Leu

Ala 530

Lys

Val

Leu

Ile

Asp 535

Trp

Pro

Ala

Asn

Tyr 540

Leu

Cys

Asp

Ser

Pro 545

Ser

His

Val

Arg

Gly 550

Gin

Gin

Val

Gin

Asp 555

Val

Arg

Leu

Ser

Val 560

Ser

Glu

Cys

His

Arg 565

Thr

Ala

Leu

Val

Ser 570

Gly

Met

cys

Cys

Ala 575

Leu

Phe

Leu

Leu

Ile 580

Leu

Leu

Thr

Gly

Val 585

Leu

Cys

His

Arg

Phe 590

His

Gly

Leu

Trp

Tyr 595

Met

Lys

Met

Met

Trp 600

Ala

Trp

Leu

Gin

Ala 605

Lys

Arg

Lys

Pro

Arg 610

Lys

Ala

Pro

Ser

Arg 615

Asn

Ile

Cys

Tyr

Asp 620

Ala

Phe

Val

Ser

Tyr 625

Ser

Glu

Arg

Asp

Ala 630

Tyr

Trp

Val

Glu

Asn 635

Leu

Met

Val

Gin

Glu 640

Leu

Glu

Asn

Phe

Asn 645

Pro

Pro

Phe

Lys

Leu 650

Cys

Leu

His

Lys

Arg 655

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly 660

Lys

Trp

Ile

Ile

Asp 665

Asn

Ile

Ile

Asp

Ser

Ile

Glu

Lys

Ser

His

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Leu

Ser

Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp Phe Ser 685 690 695

670 675 680 • · · ·

His

Phe 700

Arg

Leu

Phe

Glu

Glu 705

Asn

Asn

Asp

Ala

Ala 710

Ile

Leu

Ile

Leu

Leu 715

Glu

Pro

Ile

Glu

Lys 720

Lys

Ala

Ile

Pro

Gin 725

Arg

Phe

Cys

Lys

Leu 730

Arg

Lys

Ile

Met

Asn 735

Thr

Lys

Thr

Tyr

Leu 740

Glu

Trp

Pro

Met

Asp 745

Glu

Ala

Gin

Arg

Glu 750

Gly

Phe

Trp

Val

Asn 755

Leu

Arg

Ala

Ala

Ile 760

Lys

Ser

2)	Informace o SEQ ID NO: 5:
	(i)	CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
		(A)	DÉLKA: 2715 párů baží
		(B)	TYP: nukleová kyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetě
		(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..2712 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: mat_peptid (B) Pozice: 64 ..2712 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

ATG Met -21

AGA Arg -20

CAG Gin

ACT Thr

TTG Leu

CCT TGT Pro Cys -15

ATC Ile

TAC Tyr

TTT TGG GGG

GGC Gly

CTT Leu

TTG Leu

CCC Pro

Phe

Trp

Gly -10

TTT

GGG

ATG

CTG

TGT

GCA TCC

TCC

ACC

ACC

AAG

TGC

ACT

GTT

AGC

CAT

Phe

Gly

Met

Leu

Cys

Ala Ser

Ser

Thr

Thr

Lys

Cys

Thr

Val

Ser

His

-5

1

5

10

GAA

GTT

GCT

GAC

TGC

AGC CAC

CTG

AAG

TTG

ACT

CAG

GTA

CCC

GAT

GAT

Glu

Val

Ala

Asp

Cys

Ser His

Leu

Lys

Leu

Thr

Gin

Val

Pro

Asp

Asp

15

20

25

CTA

CCC

ACA

AAC

ATA

ACA GTG

TTG

AAC

CTT

ACC

CAT

AAT

CAA

CTC

AGA

Leu

Pro

Thr

Asn

Ile

Thr Val

Leu

Asn

Leu

Thr

His

Asn

Gin

Leu

Arg

30

35

40

AGA

TTA

CCA

GCC

GCC

AAC TTC

ACA

AGG

TAT

AGC

CAG

CTA

ACT

AGC

TTG

Arg

Leu

Pro

Ala

Ala

Asn Phe

Thr

Arg

Tyr

Ser

Gin

Leu

Thr

Ser

Leu

45

50

55

GAT

GTA

GGA

TTT

AAC

ACC ATC

TCA

AAA

CTG

GAG

CCA

GAA

TTG

TGC

CAG

Asp

Val

Gly

Phe

Asn

Thr Ile

Ser

Lys

Leu

Glu

Pro

Glu

Leu

Cys

Gin

60

65

70

75

144

192

240

288 • · · ·

104

AAA Lys

CTT Leu

CCC Pro

ATG TTA AAA

GTT TTG

AAC Asn

CTC Leu 85

CAG CAC

AAT GAG CTA TCT

336

Met

Leu 80

Lys

Val

Leu

Gin

His

Asn

Glu

Leu 90

Ser

CAA

CTT

TCT

GAT

AAA

ACC

TTT

GCC

TTC

TGC

ACG

AAT

TTG

ACT

GAA

CTC

384

Gin

Leu

Ser

Asp 95

Lys

Thr

Phe

Ala

Phe 100

Cys

Thr

Asn

Leu

Thr 105

Glu

Leu

CAT

CTC

ATG

TCC

AAC

TCA

ATC

CAG

AAA

ATT

AAA

AAT

AAT

CCC

TTT

GTC

432

His

Leu

Met 110

Ser

Asn

Ser

Ile

Gin 115

Lys

Ile

Lys

Asn

Asn 120

Pro

Phe

Val

AAG

CAG

AAG

AAT

TTA

ATC

ACA

TTA

GAT

CTG

TCT

CAT

AAT

GGC

TTG

TCA

480

Lys

Gin 125

Lys

Asn

Leu

Ile

Thr· 130

Leu

Asp

Leu

Ser

His 135

Asn

Gly

Leu

Ser

TCT

ACA

AAA

TTA

GGA

ACT

CAG

GTT

CAG

CTG

GAA

AAT

CTC

CAA

GAG

CTT

528

Ser 140

Thr

Lys

Leu

Gly

Thr 145

Gin

Val

Gin

Leu

Glu 150

Asn

Leu

Gin

Glu

Leu 155

CTA

TTA

TCA

AAC

AAT

AAA

ATT

CAA

GCG

CTA

AAA

AGT

GAA

GAA

CTG

GAT

576

Leu

Leu

Ser

Asn

Asn 160

Lys

Ile

Gin

Ala

Leu 165

Lys

Ser

Glu

Glu

Leu 170

Asp

ATC

TTT

GCC

AAT

TCA

TCT

TTA

AAA

AAA

TTA

GAG

TTG

TCA

TCG

AAT

CAA

624

Ile

Phe

Ala

Asn 175

Ser

Ser

Leu

Lys

Lys 180

Leu

Glu

Leu

Ser

Ser 185

Asn

Gin

ATT

AAA

GAG

TTT

TCT

CCA

GGG

TGT

TTT

CAC

GCA

ATT

GGA

AGA

TTA

TTT

672

Ile

Lys

Glu 190

Phe

Ser

Pro

Gly

Cys 195

Phe

His

Ala

Ile

Gly 200

Arg

Leu

Phe

GGC

CTC

TTT

CTG

AAC

AAT

GTC

CAG

CTG

GGT

CCC

AGC

CTT

ACA

GAG

AAG

720

Gly

Leu 205

Phe

Leu

Asn

Asn

Val 210

Gin

Leu

Gly

Pro

Ser 215

Leu

Thr

Glu

Lys

CTA

TGT

TTG

GAA

TTA

GCA

AAC

ACA

AGC

ATT

CGG

AAT

CTG

TCT

CTG

AGT

768

Leu 220

Cys

Leu

Glu

Leu

Ala 225

Asn

Thr

Ser

Ile

Arg 230

Asn

Leu

Ser

Leu

Ser 235

AAC

AGC

CAG

CTG

TCC

ACC

ACC

AGC

AAT

ACA

ACT

TTC

TTG

GGA

CTA

AAG

816

Asn

Ser

Gin

Leu

Ser 240

Thr

Thr

Ser

Asn

Thr 245

Thr

Phe

Leu

Gly

Leu 250

Lys

TGG

ACA

AAT

CTC

ACT

ATG

CTC

GAT

CTT

TCC

TAC

AAC

AAC

TTA

AAT

GTG

864

Trp

Thr

Asn

Leu 255

Thr

Met

Leu

Asp

Leu 260

Ser

Tyr

Asn

Asn

Leu 265

Asn

Val

GTT

GGT

AAC

GAT

TCC

TTT

GCT

TGG

CTT

CCA

CAA

CTA

GAA

TAT

TTC

TTC

912

Val

Gly

Asn 270

Asp

Ser

Phe

Ala

Trp 275

Leu

Pro

Gin

Leu

Glu 280

Tyr

Phe

Phe

CTA

GAG

TAT

AAT

AAT

ATA

CAG

CAT

TTG

TTT

TCT

CAC

TCT

TTG

CAC

GGG

960

Leu

Glu 285

Tyr

Asn

Asn

Ile

Gin 290

His

Leu

Phe

Ser

His 295

Ser

Leu

His

Gly

CTT

TTC

AAT

GTG

AGG

TAC

CTG

AAT

TTG

AAA

CGG

TCT

TTT

ACT

AAA

CAA

1008

Leu 300

Phe

Asn

Val

Arg

Tyr 305

Leu

Asn

Leu

Lys

Arg 310

Ser

Phe

Thr

Lys

Gin 315

AGT

ATT

TCC

CTT

GCC

TCA

CTC

CCC

AAG

ATT

GAT

GAT

TTT

TCT

TTT

CAG

1056

Ser

Ile

Ser

Leu

Ala 320

Ser

Leu

Pro

Lys

Ile 325

Asp

Asp

Phe

Ser

Phe 330

Gin

105

• •

• · · • · • · • · ·

• · • • •

• • · • • •

• « » · • • · •

• · · · • · · · • · · · · · • · • · · ·

TGG

CTA

AAA

TGT

TTG

GAG

CAC

CTT AAC

ATG

GAA

GAT

AAT

GAT

ATT

CCA

1104

Trp

Leu

Lys

Cys 335

Leu

Glu

His

Leu Asn 340

Met

Glu

Asp

Asn

Asp 345

Ile

Pro

GGC

ATA

AAA

AGC

AAT

ATG

TTC

ACA GGA

TTG

ATA

AAC

CTG

AAA

TAC

TTA

1152

Gly

Ile

Lys 350

Ser

Asn

Met

Phe

Thr Gly 355

Leu

Ile

Asn

Leu 360

Lys

Tyr

Leu

AGT

CTA

TCC

AAC

TCC

TTT

ACA

AGT TTG

CGA

ACT

TTG

ACA

AAT

GAA

ACA

1200

Ser

Leu 365

Ser

Asn

Ser

Phe

Thr 370

Ser Leu

Arg

Thr

Leu 375

Thr

Asn

Glu

Thr

TTT

GTA

TCA

CTT

GCT

CAT

TCT

CCC TTA

CAC

ATA

CTC

AAC

CTA

ACC

AAG

1248

Phe 380

Val

Ser

Leu

Ala

His 385

Ser

Pro Leu

His

Ile 390

Leu

Asn

Leu

Thr

Lys 395

AAT

AAA

ATC

TCA

AAA

ATA

GAG

AGT GAT

GCT

TTC

TCT

TGG

TTG

GGC

CAC

1296

Asn

Lys

Ile

Ser

Lys 400

Ile

Glu

Ser Asp

Ala 405

Phe

Ser

Trp

Leu

Gly 410

His

CTA

GAA

GTA

CTT

GAC

CTG

GGC

CTT AAT

GAA

ATT

GGG

CAA

GAA

CTC

ACA

1344

Leu

Glu

Val

Leu 415

Asp

Leu

Gly

Leu Asn 420

Glu

Ile

Gly

Gin

Glu 425

Leu

Thr

GGC

CAG

GAA

TGG

AGA

GGT

CTA

GAA AAT

ATT

TTC

GAA

ATC

TAT

CTT

TCC

1392

Gly

Gin

Glu 430

Trp

Arg

Gly

Leu

Glu Asn 435

Ile

Phe

Glu

Ile 440

Tyr

Leu

Ser

TAC

AAC

AAG

TAC

CTG

CAG

CTG

ACT AGG

AAC

TCC

TTT

GCC

TTG

GTC

CCA

1440

Tyr

Asn 445

Lys

Tyr

Leu

Gin

Leu 450

Thr Arg

Asn

Ser

Phe 455

Ala

Leu

Val

Pro

AGC

CTT

CAA

CGA

CTG

ATG

CTC

CGA AGG

GTG

GCC

CTT

AAA

AAT

GTG

GAT

1488

Ser 460

Leu

Gin

Arg

Leu

Met 465

Leu

Arg Arg

Val

Ala 470

Leu

Lys

Asn

Val

Asp 475

AGC

TCT

CCT

TCA

CCA

TTC

CAG

CCT CTT

CGT

AAC

TTG

ACC

ATT

CTG

GAT

1536

Ser

Ser

Pro

Ser

Pro 480

Phe

Gin

Pro Leu

Arg 485

Asn

Leu

Thr

Ile

Leu 490

Asp

CTA

AGC

AAC

AAC

AAC

ATA

GCC

AAC ATA

AAT

GAT

GAC

ATG

TTG

GAG

GGT

1584

Leu

Ser

Asn

Asn 495

Asn

Ile

Ala

Asn Ile 500

Asn

Asp

Asp

Met

Leu 505

Glu

Gly

CTT

GAG

AAA

CTA

GAA

ATT

CTC

GAT TTG

CAG

CAT

AAC

AAC

TTA

GCA

CGG

1632

Leu

Glu

Lys 510

Leu

Glu

Ile

Leu

Asp Leu 515

Gin

His

Asn

Asn 520

Leu

Ala

Arg

CTC

TGG

AAA

CAC

GCA

AAC

CCT

GGT GGT

CCC

ATT

TAT

TTC

CTA

AAG

GGT

1680

Leu

Trp 525

Lys

His

Ala

Asn

Pro 530

Gly Gly

Pro

Ile

Tyr 535

Phe

Leu

Lys

Gly

CTG

TCT

CAC

CTC

CAC

ATC

CTT

AAC TTG

GAG

TCC

AAC

GGC

TTT

GAC

GAG

1728

Leu 540

Ser

His

Leu

His

Ile 545

Leu

Asn Leu

Glu

Ser 550

Asn

Gly

Phe

Asp

Glu 555

ATC

CCA

GTT

GAG

GTC

TTC

AAG

GAT TTA

TTT

GAA

CTA

AAG

ATC

ATC

GAT

1776

Ile

Pro

Val

Glu

Val 560

Phe

Lys

Asp Leu

Phe 565

Glu

Leu

Lys

Ile

Ile 570

Asp

106	• ···: .1 ...... *· * * ··*·· • * . * · · ······ : : J · ·
9 · · · ·······

TTA GGA TTG

AAT AAT TTA AAC ACA CTT CCA GCA TCT GTC TTT AAT AAT

1824

Leu

Gly

Leu

Asn 575

Asn

Leu

Asn

Thr

Leu 580

Pro

Ala Ser

Val

Phe 585

Asn

Asn

CAG

GTG

TCT

CTA

AAG

TCA

TTG

AAC

CTT

CAG

AAG

AAT

CTC

ATA

ACA

TCC

1872

Gin

Val

Ser

Leu

Lys

Ser

Leu

Asn

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Ile

Thr

Ser

590

595

600

GTT

GAG

AAG

AAG

GTT

TTC

GGG

CCA

GCT

TTC

AGG

AAC

CTG

ACT

GAG

TTA

1920

Val

Glu

Lys

Lys

Val

Phe

Gly

Pro

Ala

Phe

Arg

Asn

Leu

Thr

Glu

Leu-

605

610

615

GAT

ATG

CGC

TTT

AAT

CCC

TTT

GAT

TGC

ACG

TGT

GAA

AGT

ATT

GCC

TGG

1968

Asp

Met

Arg

Phe

Asn

Pro

Phe

Asp

Cys

Thr

Cys

Glu

Ser

Ile

Ala

Trp

620

625

630

635

TTT

GTT

AAT

TGG

ATT

AAC

GAG

ACC

CAT

ACC

AAC

ATC

CCT

GAG

CTG

TCA

2016

Phe

Val

Asn

Trp

Ile

Asn

Glu

Thr

His

Thr

Asn

Ile

Pro

Glu

Leu

Ser

640

645

650

AGC

CAC

TAC

CTT

TGC

AAC

ACT

CCA

CCT

CAC

TAT

CAT

GGG

TTC

CCA

GTG

2064

Ser

His

Tyr

Leu

Cys

Asn

Thr

Pro

Pro

His

Tyr

His

Gly

Phe

Pro

Val

655

660

665

AGA

CTT

TTT

GAT

ACA

TCA

TCT

TGC

AAA

GAC

AGT

GCC

CCC

TTT

GAA

CTC

2112

Arg

Leu

Phe

Asp

Thr

Ser

Ser

Cys

Lys

Asp

Ser

Ala

Pro

Phe

Glu

Leu

670

675

680

TTT

TTC

ATG

ATC

AAT

ACC

AGT

ATC

CTG

TTG

ATT

TTT

ATC

TTT

ATT

GTA

2160

Phe

Phe

Met

Ile

Asn

Thr

Ser

Ile

Leu

Leu

Ile

Phe

Ile

Phe

Ile

Val

685

690

695

CTT

CTC

ATC

CAC

TTT

GAG

GGC

TGG

AGG

ATA

TCT

TTT

TAT

TGG

AAT

GTT

2208

Leu

Leu

Ile

His

Phe

Glu

Gly

Trp

Arg

Ile

Ser

Phe

Tyr

Trp

Asn

Val

700

705

710

715

TCA

GTA

CAT

CGA

GTT

CTT

GGT

TTC

AAA

GAA

ATA

GAC

AGA

CAG

ACA

GAA

2256

Ser

Val

His

Arg

Val

Leu

Gly

Phe

Lys

Glu

Ile

Asp

Arg

Gin

Thr

Glu

720

725

730

CAG

TTT

GAA

TAT

GCA

GCA

TAT

ATA

ATT

CAT

GCC

TAT

AAA

GAT

AAG

GAT

2304

Gin

Phe

Glu

Tyr

Ala

Ala

Tyr

Ile

Ile

His

Ala

Tyr

Lys

Asp

Lys

Asp

735

740

745

TGG

GTC

TGG

GAA

CAT

TTC

TCT

TCA

ATG

GAA

AAG

GAA

GAC

CAA

TCT

CTC

2352

Trp

Val

Trp

Glu

His

Phe

Ser

Ser

Met

Glu

Lys

Glu

Asp

Gin

Ser

Leu

750

755

760

AAA

TTT

TGT

CTG

GAA

GAA

AGG

GAC

TTT

GAG

GCG

GGT

GTT

TTT

GAA

CTA

2400

Lys

Phe

Cys

Leu

Glu

Glu

Arg

Asp

Phe

Glu

Ala

Gly

Val

Phe

Glu

Leu

765

770

775

GAA

GCA

ATT

GTT

AAC

AGC

ATC

AAA

AGA

AGC

AGA

AAA

ATT

ATT

TTT

GTT

2448

Glu

Ala

Ile

Val

Asn

Ser

Ile

Lys

Arg

Ser

Arg

Lys

Ile

Ile

Phe

Val

780

785

790

795

ATA

ACA

CAC

CAT

CTA

TTA

AAA

GAC

CCA

TTA

TGC

AAA

AGA

TTC

AAG

GTA

2496

Ile

Thr

His

His

Leu

Leu

Lys

Asp

Pro

Leu

Cys

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

800

805

810

CAT

CAT

GCA

GTT

CAA

CAA

GCT

ATT

GAA

CAA

AAT

CTG

GAT

TCC

ATT

ATA

2544

107

2592

His His Ala Val Gin Gin Ala Ile Glu Gin Asn Leu Asp Ser Ile	Ile
	815	820	825
TTG	GTT TTC CTT GAG	GAG ATT CCA GAT TAT	AAA CTG AAC CAT GCA	CTC
Leu	Val Phe Leu Glu	Glu Ile Pro Asp Tyr	Lys Leu Asn His Ala	Leu
	830	835	840
TGT	TTG CGA AGA GGA	ATG TTT AAA TCT CAC	TGC ATC TTG AAC TGG	CCA
Cys	Leu Arg Arg Gly	Met Phe Lys Ser His	Cys Ile Leu Asn Trp	Pro
	845	850	855
GTT	CAG AAA GAA CGG	ATA GGT GCC TTT CGT	CAT AAA TTG CAA GTA	GCA
Val	Gin Lys Glu Arg	Ile Gly Ala Phe Arg	His Lys Leu Gin Val	Ala
860		865	870	875
CTT	GGA TCC AAA AAC	TCT GTA CAT TAA
Leu	Gly Ser Lys Asn	Ser Val His
	880
Informace k SEQ	ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
	(A) DÉLKA: 904 aminokyselin
	(B) TYP: aminokyselina
	(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: protein
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6

2640

2688

2715

Met -21

Arg -20

Gin

Thr

Leu

Pro

Cys -15

Ile

Tyr

Phe

Trp

Gly -10

Gly

Leu

Leu

Pro

Phe -5

Gly

Met

Leu

Cys

Ala 1

Ser

Ser

Thr

Thr 5

Lys

Cys

Thr

Val

Ser 10

His

Glu

Val

Ala

Asp 15

Cys

Ser

His

Leu

Lys 20

Leu

Thr

Gin

Val

Pro 25

Asp

Asp

Leu

Pro

Thr 30

Asn

Ile

Thr

Val

Leu 35

Asn

Leu

Thr

His

Asn 40

Gin

Leu

Arg

Arg

Leu 45

Pro

Ala

Ala

Asn

Phe 50

Thr

Arg

Tyr

Ser

Gin 55

Leu

Thr

Ser

Leu

Asp 60

Val

Gly

Phe

Asn

Thr 65

Ile

Ser

Lys

Leu

Glu 70

Pro

Glu

Leu

Cys

Gin 75

Lys

Leu

Pro

Met

Leu 80

Lys

Val

Leu

Asn

Leu 85

Gin

His

Asn

Glu

Leu 90

Ser

Gin

Leu

Ser

Asp 95

Lys

Thr

Phe

Ala

Phe 100

Cys

Thr

Asn

Leu

Thr 105

Glu

Leu

His

Leu

Met 110

Ser

Asn

Ser

Ile

Gin 115

Lys

Ile

Lys

Asn

Asn 120

Pro

Phe

Val

Lys

Gin 125

Lys

Asn

Leu

Ile

Thr 130

Leu

Asp

Leu

Ser

His 135

Asn

Gly

Leu

Ser

• · · · · • · · · · • · * · · • · ··* · · · • ·

108

Ser Thr Lys Leu Gly Thr Gin Val Gin 140 145

Leu Leu Ser Asn Asn Lys Ile Gin Ala 160

Ile Phe Ala Asn Ser Ser Leu Lys Lys 175 180

Ile Lys Glu Phe Ser Pro Gly Cys Phe 190 195

Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val Gin Leu 205 210

Leu Cys Leu Glu Leu Ala Asn Thr Ser 220 225

Asn Ser Gin Leu Ser Thr Thr Ser Asn 240

Trp Thr Asn Leu Thr Met Leu Asp Leu 255 260

Val Gly Asn Asp Ser Phe Ala Trp Leu 270 275

Leu Glu Tyr Asn Asn Ile Gin His Leu 285 290

Leu Phe Asn Val Arg Tyr Leu Asn Leu 300 305

Ser Ile Ser Leu Ala Ser Leu Pro Lys 320

Trp Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Asn 335 340

Gly Ile Lys Ser Asn Met Phe Thr Gly 350 355

Ser Leu Ser Asn Ser Phe Thr Ser Leu 365 370

Phe Val Ser Leu Ala His Ser Pro Leu 380 385

Asn Lys Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp 400

Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Leu Asn 415 420

Gly Gin Glu Trp Arg Gly Leu Glu Asn 430 435

Tyr Asn Lys Tyr Leu Gin Leu Thr Arg 445 450

Leu Glu Asn Leu Gin Glu Leu

150 155

Leu Lys Ser Glu Glu Leu Asp 165 170

Leu Glu Leu Ser Ser Asn Gin 185

His Ala Ile Gly Arg Leu Phe. 200

Gly Pro Ser Leu Thr Glu Lys 215

Ile Arg Asn Leu Ser Leu Ser 230 235

Thr Thr Phe Leu Gly Leu Lys 245 250

Ser Tyr Asn Asn Leu Asn Val 265

Pro Gin Leu Glu Tyr Phe Phe 280

Phe Ser His Ser Leu His Gly 295

Lys Arg Ser Phe Thr Lys Gin 310 315

Ile Asp Asp Phe Ser Phe Gin 325 330

Met Glu Asp Asn Asp Ile Pro 345

Leu Ile Asn Leu Lys Tyr Leu 360

Arg Thr Leu Thr Asn Glu Thr 375

His Ile Leu Asn Leu Thr Lys 390 395

Ala Phe Ser Trp Leu Gly His 405 410

Glu Ile Gly Gin Glu Leu Thr 425

Ile Phe Glu Ile Tyr Leu Ser 440

Asn Ser Phe Ala Leu Val Pro 455

Ser Leu Gin Arg Leu Met Leu Arg Arg Val Ala Leu Lys Asn Val Asp • · · ·

109

460

465

470

475

Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gin Pro Leu Arg Asn Leu Thr Ile Leu Asp 480 485 490

Leu Ser Asn Asn Asn Ile Ala Asn Ile Asn Asp Asp Met Leu Glu Gly 495 500 505

Leu Glu Lys Leu Glu Ile Leu Asp Leu Gin His Asn Asn Leu Ala Arg

510

515

520

Leu Trp Lys His Ala Asn Pro Gly Gly Pro Ile Tyr Phe Leu Lys Gly

525

530

535

Leu Ser His Leu His Ile Leu Asn Leu Glu Ser Asn Gly Phe Asp Glu

540

545

550

555

Ile Pro Val Glu Val Phe Lys Asp Leu Phe Glu Leu Lys Ile Ile Asp 560 565 570

Leu Gly Leu Asn Asn Leu Asn Thr Leu Pro Ala Ser Val Phe Asn Asn 575 580 585

Gin Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Leu Gin Lys Asn Leu Ile Thr Ser 590 595 600

Val Glu Lys Lys Val Phe Gly Pro Ala Phe Arg Asn Leu Thr Glu Leu 605 610 615

Asp Met Arg Phe Asn Pro Phe Asp Cys Thr Cys Glu Ser Ile Ala Trp

620 625 630 635

Phe Val Asn Trp Ile Asn Glu Thr His Thr Asn Ile Pro Glu Leu Ser

640 645 650

Ser His Tyr Leu Cys Asn Thr Pro Pro His Tyr His Gly Phe Pro Val 655 660 665

Arg Leu Phe Asp Thr Ser Ser Cys Lys Asp Ser Ala Pro Phe Glu Leu 670 675 680

Phe Phe Met Ile Asn Thr Ser Ile Leu Leu Ile Phe Ile Phe Ile Val 685 690 695

Leu Leu Ile His Phe Glu Gly Trp Arg Ile Ser Phe Tyr Trp Asn Val

700 705 710 715

Ser Val His Arg Val Leu Gly Phe Lys Glu Ile Asp Arg Gin Thr Glu

720 725 730

Gin Phe Glu Tyr Ala Ala Tyr Ile Ile His Ala Tyr Lys Asp Lys Asp 735 740 745

Trp Val Trp Glu His Phe Ser Ser Met Glu Lys Glu Asp Gin Ser Leu 750 755 760

Lys Phe Cys Leu Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ala Gly Val Phe Glu Leu 765 770 775

Glu Ala Ile Val Asn Ser Ile Lys Arg Ser Arg Lys Ile Ile Phe Val 780 785 790 795 • · · ·

110

Ile

Thr

His

His

Leu

Leu

Lys

Asp

Pro

Leu

Cys

Lys

Arg

Phe

Lys

Val

800

805

810

His

His

Ala

Val

Gin

Gin

Ala

Ile

Glu

Gin

Asn

Leu

Asp

Ser

Ile

Ile

815

820

825

Leu

Val

Phe

Leu

Glu

Glu

Ile

Pro

Asp

Tyr

Lys

Leu

Asn

His

Ala

Leu

830

835

840

Cys

Leu

Arg

Arg

Gly

Met

Phe

Lys

Ser

His

Cys

Ile

Leu

Asn

Trp

Pro

845

850

855

Val

Gin

Lys

Glu

Arg

Ile

Gly

Ala

Phe

Arg

His

Lys

Leu

Gin

Val

Ala

860

865

870

875

Leu

Gly

Ser

Lys

Asn

Ser

Val

His

880 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2400 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (iii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..2397

(Xi)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

7

ATG

GAG

CTG

AAT

TTC

TAC

AAA

ATC

CCC

GAC

AAC

CTC

CCC

TTC

TCA

ACC

48

Met

Glu

Leu

Asn

Phe

Tyr

Lys

Ile

Pro

Asp

Asn

Leu

Pro

Phe

Ser

Thr

Ί X

5

10

15

AAG

AAC

CTG

GAC

CTG

AGC

TTT

AAT

CCC

CTG

AGG

CAT

TTA

GGC

AGC

TAT

96

Lys

Asn

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Pro

Leu

Arg

His

Leu

Gly

Ser

Tyr

20

25

30

AGC

TTC

TTC

AGT

TTC

CCA

GAA

CTG

CAG

GTG

CTG

GAT

TTA

TCC

AGG

TGT

144

Ser

Phe

Phe

Ser

Phe

Pro

Glu

Leu

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Cys

35

40

45

GAA

ATC

CAG

ACA

ATT

GAA

GAT

GGG

GCA

TAT

CAG

AGC

CTA

AGC

CAC

CTC

192

Glu

Ile

Gin

Thr

Ile

Glu

Asp

Gly

Ala

Tyr

Gin

Ser

Leu

Ser

His

Leu

50

55

60

TCT

ACC

TTA

ATA

TTG

ACA

GGA

AAC

CCC

ATC

CAG

AGT

TTA

GCC

CTG

GGA

240

Ser

Thr

Leu

Ile

Leu

Thr

Gly

Asn

Pro

Ile

Gin

Ser

Leu

Ala

Leu

Gly

65

70

75

80

GCC

TTT

TCT

GGA

CTA

TCA

AGT

TTA

CAG

AAG

CTG

GTG

GCT

GTG

GAG

ACA

288

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Ser

Ser

Leu

Gin

Lys

Leu

Val

Ala

Val

Glu

Thr

85

90

95

• · * • · ·

111 • · · ·

AAT	CTA	GCA	TCT	CTA	GAG	AAC	TTC	CCC	ATT
Asn	Leu	Ala	Ser 100	Leu	Glu	Asn	Phe	Pro 105	Ile
AAA	GAA	CTT	AAT	GTG	GCT	CAC	AAT	CTT	ATC
Lys	Glu	Leu 115	Asn	Val	Ala	His	Asn 120	Leu	Ile
GAG	TAT	TTT	TCT	AAT	CTG	ACC	AAT	CTA	GAG
Glu	Tyr 130	Phe	Ser	Asn	Leu	Thr 135	Asn	Leu	Glu
AAC	AAG	ATT	CAA	AGT	ATT	TAT	TGC	ACA	GAC
Asn 145	Lys	Ile	Gin	Ser	Ile 150	Tyr	Cys	Thr	Asp
ATG	CCC	CTA	CTC	AAT	CTC	TCT	TTA	GAC	CTG
Met	Pro	Leu	Leu	Asn 165	Leu	Ser	Leu	Asp	Leu 170
TTT	ATC	CAA	CCA	GGT	GCA	TTT	AAA	GAA	ATT
Phe	Ile	Gin	Pro 180	Gly	Ala	Phe	Lys	Glu 185	Ile
TTA	AGA	AAT	AAT	TTT	GAT	AGT	TTA	AAT	GTA
Leu	Arg	Asn 195	Asn	Phe	Asp	Ser	Leu 200	Asn	Val
GGT	CTG	GCT	GGT	TTA	GAA	GTC	CAT	CGT	TTG
Gly	Leu 210	Ala	Gly	Leu	Glu	Val 215	His	Arg	Leu
AAT	GAA	GGA	AAC	TTG	GAA	AAG	TTT	GAC	AAA
Asn 225	Glu	Gly	Asn	Leu	Glu 230	Lys	Phe	Asp	Lys
TGC	AAT	TTG	ACC	ATT	GAA	GAA	TTC	CGA	TTA
Cys	Asn	Leu	Thr	Ile 245	Glu	Glu	Phe	Arg	Leu 250
CTC	GAT	GAT	ATT	ATT	GAC	TTA	TTT	AAT	TGT
Leu	Asp	Asp	Ile 260	Ile	Asp	Leu	Phe	Asn 265	Cys
TTT	TCC	CTG	GTG	AGT	GTG	ACT	ATT	GAA	AGG
Phe	Ser	Leu 275	Val	Ser	Val	Thr	Ile 280	Glu	Arg
AAT	TTC	GGA	TGG	CAA	CAT	TTA	GAA	TTA	GTT
Asn	Phe 290	Gly	Trp	Gin	His	Leu 295	Glu	Leu	Val
TTT	CCC	ACA	TTG	AAA	CTC	AAA	TCT	CTC	AAA
Phe 305	Pro	Thr	Leu	Lys	Leu 310	Lys	Ser	Leu	Lys
AAC	AAA	GGT	GGG	AAT	GCT	TTT	TCA	GAA	GTT
Asn	Lys	Gly	Gly	Asn 325	Ala	Phe	Ser	Glu	Val 330
TTT	CTA	GAT	CTC	AGT	AGA	AAT	GGC	TTG	AGT

GGA CAT CTC AAA ACT TTG 336

Gly His Leu Lys Thr Leu

110

CAA TCT TTC AAA TTA CCT 384

Gin Ser Phe Lys Leu Pro

125

CAC TTG GAC CTT TCC AGC 432

His Leu Asp Leu Ser Ser.

140

TTG CGG GTT CTA CAT CAA 480

Leu Arg Val Leu His Gin 155 160

TCC CTG AAC CCT ATG AAC 528

Ser Leu Asn Pro Met Asn

175

AGG CTT CAT AAG CTG ACT 576

Arg Leu His Lys Leu Thr

190

ATG AAA ACT TGT ATT CAA 624

Met Lys Thr Cys Ile Gin

205

GTT CTG GGA GAA TTT AGA 672

Val Leu Gly Glu Phe Arg

220

TCT GCT CTA GAG GGC CTG 720

Ser Ala Leu Glu Gly Leu 235 240

GCA TAC TTA GAC TAC TAC 768

Ala Tyr Leu Asp Tyr Tyr

255

TTG ACA AAT GTT TCT TCA 816

Leu Thr Asn Val Ser Ser

270

GTA AAA GAC TTT TCT TAT 864

Val Lys Asp Phe Ser Tyr

285

AAC TGT AAA TTT GGA CAG 912

Asn Cys Lys Phe Gly Gin

300

AGG CTT ACT TTC ACT TCC 960

Arg Leu Thr Phe Thr Ser 315 320

GAT CTA CCA AGC CTT GAG 1008

Asp Leu Pro Ser Leu Glu

335

TTC AAA GGT TGC TGT TCT 1056 ··· *

Phe

Leu

Asp

Leu 340

Ser

Arg

Asn

Gly

Leu 345

Ser

Phe

Lys

Gly

Cys 350

Cys

Ser

CAA

AGT

GAT

TTT

GGG

ACA

ACC

AGC

CTA

AAG

TAT

TTA

GAT

CTG

AGC

TTC

1104

Gin

Ser

Asp 355

Phe

Gly

Thr

Thr

Ser 360

Leu

Lys

Tyr

Leu

Asp 365

Leu

Ser

Phe

AAT

GGT

GTT

ATT

ACC

ATG

AGT

TCA

AAC

TTC

TTG

GGC

TTA

GAA

CAA

CTA

1152

Asn

Gly 370

Val

Ile

Thr

Met

Ser 375

Ser

Asn

Phe

Leu

Gly 380

Leu

Glu

Gin

Leu

GAA

CAT

CTG

GAT

TTC

CAG

CAT

TCC

AAT

TTG

AAA

CAA

ATG

AGT

GAG

TTT

1200

Glu 385

His

Leu

Asp

Phe

Gin 390

His

Ser

Asn

Leu

Lys 395

Gin

Met

Ser

Glu

Phe 400

TCA

GTA

TTC

CTA

TCA

CTC

AGA

AAC

CTC

ATT

TAC

CTT

GAC

ATT

TCT

CAT

1248

Ser

Val

Phe

Leu

Ser 405

Leu

Arg

Asn

Leu

Ile 410

Tyr

Leu

Asp

Ile

Ser 415

His

ACT

CAC

ACC

AGA

GTT

GCT

TTC

AAT

GGC

ATC

TTC

AAT

GGC

TTG

TCC

AGT

1296

Thr

His

Thr

Arg 420

Val

Ala

Phe

Asn

Gly 425

Ile

Phe

Asn

Gly

Leu 430

Ser

Ser

CTC

GAA

GTC

TTG

AAA

ATG

GCT

GGC

AAT

TCT

TTC

CAG

GAA

AAC

TTC

CTT

1344

Leu

Glu

Val 435

Leu

Lys

Met

Ala

Gly 440

Asn

Ser

Phe

Gin

Glu 445

Asn

Phe

Leu

CCA

GAT

ATC

TTC

ACA

GAG

CTG

AGA

AAC

TTG

ACC

TTC

CTG

GAC

CTC

TCT

1392

Pro

Asp 450

Ile

Phe

Thr

Glu

Leu 455

Arg

Asn

Leu

Thr

Phe 460

Leu

Asp

Leu

Ser

CAG

TGT

CAA

CTG

GAG

CAG

TTG

TCT

CCA

ACA

GCA

TTT

AAC

TCA

CTC

TCC

1440

Gin 465

Cys

Gin

Leu

Glu

Gin 470

Leu

Ser

Pro

Thr

Ala 475

Phe

Asn

Ser

Leu

Ser 480

AGT

CTT

CAG

GTA

CTA

AAT

ATG

AGC

CAC

AAC

AAC

TTC

TTT

TCA

TTG

GAT

1488

Ser

Leu

Gin

Val

Leu 485

Asn

Met

Ser

His

Asn 490

Asn

Phe

Phe

Ser

Leu 495

Asp

ACG

TTT

CCT

TAT

AAG

TGT

CTG

AAC

TCC

CTC

CAG

GTT

CTT

GAT

TAC

AGT

1536

Thr

Phe

Pro

Tyr 500

Lys

Cys

Leu

Asn

Ser 505

Leu

Gin

Val

Leu

Asp 510

Tyr

Ser

CTC

AAT

CAC

ATA

ATG

ACT

TCC

AAA

AAA

CAG

GAA

CTA

CAG

CAT

TTT

CCA

1584

Leu

Asn

His 515

Ile

Met

Thr

Ser

Lys 520

Lys

Gin

Glu

Leu

Gin 525

His

Phe

Pro

AGT

AGT

CTA

GCT

TTC

TTA

AAT

CTT

ACT

CAG

AAT

GAC

TTT

GCT

TGT

ACT

1632

Ser

Ser 530

Leu

Ala

Phe

Leu

Asn 535

Leu

Thr

Gin

Asn

Asp 540

Phe

Ala

Cys

Thr

TGT

GAA

CAC

CAG

AGT

TTC

CTG

CAA

TGG

ATC

AAG

GAC

CAG

AGG

CAG

CTC

1680

Cys 545

Glu

His

Gin

Ser

Phe 550

Leu

Gin

Trp

Ile

Lys 555

Asp

Gin

Arg

Gin

Leu 560

TTG

GTG

GAA

GTT

GAA

CGA

ATG

GAA

TGT

GCA

ACA

CCT

TCA

GAT

AAG

CAG

1728

Leu

Val

Glu

Val

Glu 565

Arg

Met

Glu

Cys

Ala 570

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys 575

Gin

GGC

ATG

CCT

GTG

CTG

AGT

TTG

AAT

ATC

ACC

TGT

CAG

ATG

AAT

AAG

ACC

1776

Gly

Met

Pro

Val

Leu

Ser

Leu

Asn

Ile

Thr

Cys

Gin

Met

Asn

Lys

Thr

• · · · • · ·

113

580

585

590

ATC

ATT

GGT

GTG

TCG

GTC

CTC

AGT

GTG

CTT

GTA

GTA

TCT

GTT

GTA

GCA

1824

Ile

Ile

Gly 595

Val

Ser

Val

Leu

Ser 600

Val

Leu

Val

Val

Ser 605

Val

Val

Ala

GTT

CTG

GTC

TAT

AAG

TTC

TAT

TTT

CAC

CTG

ATG

CTT

CTT

GCT

GGC

TGC

1872

Val

Leu 610

Val

Tyr

Lys

Phe

Tyr 615

Phe

His

Leu

Met

Leu 620

Leu

Ala

Gly

Cys

ATA

AAG

TAT

GGT

AGA

GGT

GAA

AAC

ATC

TAT

GAT

GCC

TTT

GTT

ATC

TAC

1920

Ile 625

Lys

Tyr

Gly

Arg

Gly 630

Glu

Asn

Ile

Tyr

Asp 635

Ala

Phe

Val

Ile

Tyr 640

TCA

AGC

CAG

GAT

GAG

GAC

TGG

GTA

AGG

AAT

GAG

CTA

GTA

AAG

AAT

TTA

1968

Ser

Ser

Gin

Asp

Glu 645

Asp

Trp

Val

Arg

Asn 650

Glu

Leu

Val

Lys

Asn 655

Leu

GAA

GAA

GGG

GTG

CCT

CCA

TTT

CAG

CTC

TGC

CTT

CAC

TAC

AGA

GAC

TTT

2016

Glu

Glu

Gly

Val 660

Pro

Pro

Phe

Gin

Leu 665

Cys

Leu

His

Tyr

Arg 670

Asp

Phe

ATT

CCC

GGT

GTG

GCC

ATT

GCT

GCC

AAC

ATC

ATC

CAT

GAA

GGT

TTC

CAT

2064

Ile

Pro

Gly 675

Val

Ala

Ile

Ala

Ala 680

Asn

Ile

Ile

His

Glu 685

Gly

Phe

His

AAA

AGC

CGA

AAG

GTG

ATT

GTT

GTG

GTG

TCC

CAG

CAC

TTC

ATC

CAG

AGC

2112

Lys

Ser 690

Arg

Lys

Val

Ile

Val 695

Val

Val

Ser

Gin

His 700

Phe

Ile

Gin

Ser

CGC

TGG

TGT

ATC

TTT

GAA

TAT

GAG

ATT

GCT

CAG

ACC

TGG

CAG

TTT

CTG

2160

Arg 705

Trp

Cys

Ile

Phe

Glu 710

Tyr

Glu

Ile

Ala

Gin 715

Thr

Trp

Gin

Phe

Leu 720

AGC

AGT

CGT

GCT

GGT

ATC

ATC

TTC

ATT

GTC

CTG

CAG

AAG

GTG

GAG

AAG

2208

Ser

Ser

Arg

Ala

Gly 725

Ile

Ile

Phe

Ile

Val 730

Leu

Gin

Lys

Val

Glu 735

Lys

ACC

CTG

CTC

AGG

CAG

CAG

GTG

GAG

CTG

TAC

CGC

CTT

CTC

AGC

AGG

AAC

2256

Thr

Leu

Leu

Arg 740

Gin

Gin

Val

Glu

Leu 745

Tyr

Arg

Leu

Leu

Ser 750

Arg

Asn

ACT

TAC

CTG

GAG

TGG

GAG

GAC

AGT

GTC

CTG

GGG

CGG

CAC

ATC

TTC

TGG

2304

Thr

Tyr

Leu 755

Glu

Trp

Glu

Asp

Ser 760

Val

Leu

Gly

Arg

His 765

Ile

Phe

Trp

AGA

CGA

CTC

AGA

AAA

GCC

CTG

CTG

GAT

GGT

AAA

TCA

TGG

AAT

CCA

GAA

2352

Arg

Arg 770

Leu

Arg

Lys

Ala

Leu 775

Leu

Asp

Gly

Lys

Ser 780

Trp

Asn

Pro

Glu

GGA Gly

ACA Thr

GTG Val

GGT Gly

ACA Thr

GGA Gly

TGC Cys

AAT Asn

TGG Trp

CAG Gin

GAA Glu

GCA Ala

ACA Thr

TCT Ser

ATC Ile

2397

785 790 795

TGA 2400 (2) Informace k SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 799 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina • *

114

(D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) (xi)	DRUH MOLEKULY: protein
Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	8:
Met Glu 1	Leu Asn	Phe Tyr Lys 5	Ile	Pro	Asp 10	Asn Leu Pro Phe Ser Thr 15
Lys Asn	Leu Asp 20	Leu Ser Phe	Asn	Pro 25	Leu	Arg His Leu Gly Ser Tyr 30
Ser Phe	Phe Ser 35	Phe Pro Glu	Leu 40	Gin	Val	Leu Asp Leu Ser Arg Cys 45
Glu Ile 50	Gin Thr	Ile Glu Asp 55	Gly	Ala	Tyr	Gin Ser Leu Ser His Leu 60
Ser Thr 65	Leu Ile	Leu Thr Gly 70	Asn	Pro	Ile	Gin Ser Leu Ala Leu Gly 75 80
Ala Phe	Ser Gly	Leu Ser Ser 85	Leu	Gin	Lys 90	Leu Val Ala Val Glu Thr 95
Asn Leu	Ala Ser 100	Leu Glu Asn	Phe	Pro 105	Ile	Gly His Leu Lys Thr Leu 110
Lys Glu	Leu Asn 115	Val Ala His	Asn 120	Leu	Ile	Gin Ser Phe Lys Leu Pro 125
Glu Tyr 130	Phe Ser	Asn Leu Thr 135	Asn	Leu	Glu	His Leu Asp Leu Ser Ser 140
Asn Lys 145	Ile Gin	Ser Ile Tyr 150	Cys	Thr	Asp	Leu Arg Val Leu His Gin 155 160
Met Pro	Leu Leu	Asn Leu Ser 165	Leu	Asp	Leu 170	Ser Leu Asn Pro Met Asn 175
Phe Ile	Gin Pro 180	Gly Ala Phe	Lys	Glu 185	Ile	Arg Leu His Lys Leu Thr 190
Leu Arg	Asn Asn 195	Phe Asp Ser	Leu 200	Asn	Val	Met Lys Thr Cys Ile Gin 205
Gly Leu 210	Ala Gly	Leu Glu Val 215	His	Arg	Leu	Val Leu Gly Glu Phe Arg 220
Asn Glu 225	Gly Asn	Leu Glu Lys 230	Phe	Asp	Lys	Ser Ala Leu Glu Gly Leu 235 240
Cys Asn	Leu Thr	Ile Glu Glu 245	Phe	Arg	Leu 250	Ala Tyr Leu Asp Tyr Tyr 255
Leu Asp	Asp Ile 260	Ile Asp Leu	Phe	Asn 265	Cys	Leu Thr Asn Val Ser Ser 270
Phe Ser	Leu Val 275	Ser Val Thr	Ile 280	Glu	Arg	Val Lys Asp Phe Ser Tyr 285

• · · ·

115

Asn

Phe 290

Gly

Trp

Gin

His

Leu 295

Glu

Leu

Val

Asn

Cys 300

Lys

Phe

Gly

Gin

Phe 305

Pro

Thr

Leu

Lys

Leu 310

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg 315

Leu

Thr

Phe

Thr

Ser 320

Asn

Lys

Gly

Gly

Asn 325

Ala

Phe

Ser

Glu

Val 330

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu 335

Glu

Phe

Leu

Asp

Leu 340

Ser

Arg

Asn

Gly

Leu 345

Ser

Phe

Lys

Gly

Cys 350

Cys

Ser.

Gin

Ser

Asp 355

Phe

Gly

Thr

Thr

Ser 360

Leu

Lys

Tyr

Leu

Asp 365

Leu

Ser

Phe

Asn

Gly 370

Val

Ile

Thr

Met

Ser 375

Ser

Asn

Phe

Leu

Gly 380

Leu

Glu

Gin

Leu

Glu 385

His

Leu

Asp

Phe

Gin 390

His

Ser

Asn

Leu

Lys 395

Gin

Met

Ser

Glu

Phe 400

Ser

Val

Phe

Leu

Ser 405

Leu

Arg

Asn

Leu

Ile 410

Tyr

Leu

Asp

Ile

Ser 415

His

Thr

His

Thr

Arg 420

Val

Ala

Phe

Asn

Gly 425

Ile

Phe

Asn

Gly

Leu 430

Ser

Ser

Leu

Glu

Val 435

Leu

Lys

Met

Ala

Gly 440

Asn

Ser

Phe

Gin

Glu 445

Asn

Phe

Leu

Pro

Asp 450

Ile

Phe

Thr

Glu

Leu 455

Arg

Asn

Leu

Thr

Phe 460

Leu

Asp

Leu

Ser

Gin 465

Cys

Gin

Leu

Glu

Gin 470

Leu

Ser

Pro

Thr

Ala 475

Phe

Asn

Ser

Leu

Ser 480

Ser

Leu

Gin

Val

Leu 485

Asn

Met

Ser

His

Asn 490

Asn

Phe

Phe

Ser

Leu 495

Asp

Thr

Phe

Pro

Tyr 500

Lys

Cys

Leu

Asn

Ser 505

Leu

Gin

Val

Leu

Asp 510

Tyr

Ser

Leu

Asn

His 515

Ile

Met

Thr

Ser

Lys 520

Lys

Gin

Glu

Leu

Gin 525

His

Phe

Pro

Ser

Ser 530

Leu

Ala

Phe

Leu

Asn 535

Leu

Thr

Gin

Asn

Asp 540

Phe

Ala

Cys

Thr

Cys 545

Glu

His

Gin

Ser

Phe 550

Leu

Gin

Trp

Ile

Lys 555

Asp

Gin

Arg

Gin

Leu 560

Leu

Val

Glu

Val

Glu 565

Arg

Met

Glu

Cys

Ala 570

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys 575

Gin

Gly

Met

Pro

Val 580

Leu

Ser

Leu

Asn

Ile 585

Thr

Cys

Gin

Met

Asn 590

Lys

Thr

Ile

Ile

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Val

Val

Ser

Val

Val

Ala

595 600 605

Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe His Leu Met Leu Leu Ala Gly Cys

116

610

615

620

Ile 625

Lys

Tyr

Gly

Arg

Gly 630

Glu

Asn

Ile

Tyr

Asp 635

Ala

Phe

Val

Ile

Tyr 640

Ser

Ser

Gin

Asp

Glu 645

Asp

Trp

Val

Arg

Asn 650

Glu

Leu

Val

Lys

Asn 655

Leu

Glu

Glu

Gly

Val 660

Pro

Pro

Phe

Gin

Leu 665

Cys

Leu

His

Tyr

Arg 670

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly 675

Val

Ala

Ile

Ala

Ala 680

Asn

Ile

Ile

His

Glu 685

Gly

Phe

His

Lys

Ser 690

Arg

Lys

Val

Ile

Val 695

Val

Val

Ser

Gin

His 700

Phe

Ile

Gin

Ser

Arg 705

Trp

Cys

Ile

Phe

Glu 710

Tyr

Glu

Ile

Ala

Gin 715

Thr

Trp

Gin

Phe

Leu 720

Ser

Ser

Arg

Ala

Gly 725

Ile

Ile

Phe

Ile

Val 730

Leu

Gin

Lys

Val

Glu 735

Lys

Thr

Leu

Leu

Arg 740

Gin

Gin

Val

Glu

Leu 745

Tyr

Arg

Leu

Leu

Ser 750

Arg

Asn

Thr

Tyr

Leu 755

Glu

Trp

Glu

Asp

Ser 760

Val

Leu

Gly

Arg

His 765

Ile

Phe

Trp

Arg

Arg 770

Leu

Arg

Lys

Ala

Leu 775

Leu

Asp

Gly

Lys

Ser 780

Trp

Asn

Pro

Glu

Gly 785

Thr

Val

Gly

Thr

Gly 790

Cys

Asn

Trp

Gin

Glu 795

Ala

Thr

Ser

Ile

2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(ii) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1275 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..1095 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9

117

ACT

GCA

TTA

AGG

GGA

CTA

AGC

CTC

AAC

TCC

AAC

AGG

CTG

ACA

GTT

CTT

144

Thr

Ala

Leu 35

Arg

Gly

Leu

Ser

Leu 40

Asn

Ser

Asn

Arg

Leu 45

Thr

Val

Leu

TCT

CAC

AAT

GAT

TTA

CCT

GCT

AAT

TTA

GAG

ATC

CTG

GAC

ATA

TCC

AGG

192

Ser

His 50

Asn

Asp

Leu

Pro

Ala 55

Asn

Leu

Glu

Ile

Leu 60

Asp

Ile

Ser

Arg

AAC

CAG

CTC

CTA

GCT

CCT

AAT

CCT

GAT

GTA

TTT

GTA

TCA

CTT

AGT

GTC

240

Asn 65

Gin

Leu

Leu

Ala

Pro 70

Asn

Pro

Asp

Val

Phe 75

Val

Ser

Leu

Ser

Val 80

TTG

GAT

ATA

ACT

CAT

AAC

AAG

TTC

ATT

TGT

GAA

TGT

GAA

CTT

AGC

ACT

288

Leu

Asp

Ile

Thr

His 85

Asn

Lys

Phe

Ile

Cys 90

Glu

Cys

Glu

Leu

Ser 95

Thr

TTT

ATC

AAT

TGG

CTT

AAT

CAC

ACC

AAT

GTC

ACT

ATA

GCT

GGG

CCT

CCT

336

Phe

Ile

Asn

Trp 100

Leu

Asn

His

Thr

Asn 105

Val

Thr

Ile

Ala

Gly 110

Pro

Pro

GCA

GAC

ATA

TAT

TGT

GTG

TAC

CCT

GAC

TCG

TTC

TCT

GGG

GTT

TCC

CTC

384

Ala

Asp

Ile 115

Tyr

Cys

Val

Tyr

Pro 120

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly 125

Val

Ser

Leu

TTC

TCT

CTT

TCC

ACG

GAA

GGT

TGT

GAT

GAA

GAG

GAA

GTC

TTA

AAG

TCC

432

Phe

Ser 130

Leu

Ser

Thr

Glu

Gly 135

Cys

Asp

Glu

Glu

Glu 140

Val

Leu

Lys

Ser

CTA

AAG

TTC

TCC

CTT

TTC

ATT

GTA

TGC

ACT

GTC

ACT

CTG

ACT

CTG

TTC

480

Leu 145

Lys

Phe

Ser

Leu

Phe 150

Ile

Val

Cys

Thr

Val 155

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe 160

CTC

ATG

ACC

ATC

CTC

ACA

GTC

ACA

AAG

TTC

CGG

GGC

TTC

TGT

TTT

ATC

528

Leu

Met

Thr

Ile

Leu 165

Thr

Val

Thr

Lys

Phe 170

Arg

Gly

Phe

Cys

Phe 175

Ile

TGT

TAT

AAG

ACA

GCC

CAG

AGA

CTG

GTG

TTC

AAG

GAC

CAT

CCC

CAG

GGC

576

Cys

Tyr

Lys

Thr 180

Ala

Gin

Arg

Leu

Val 185

Phe

Lys

Asp

His

Pro 190

Gin

Gly

ACA

GAA

CCT

GAT

ATG

TAC

AAA

TAT

GAT

GCC

TAT

TTG

TGC

TTC

AGC

AGC

624

Thr

Glu

Pro 195

Asp

Met

Tyr

Lys

Tyr 200

Asp

Ala

Tyr

Leu

Cys 205

Phe

Ser

Ser

AAA

GAC

TTC

ACA

TGG

GTG

CAG

AAT

GCT

TTG

CTC

AAA

CAC

CTG

GAC

ACT

672

Lys

Asp 210

Phe

Thr

Trp

Val

Gin 215

Asn

Ala

Leu

Leu

Lys 220

His

Leu

Asp

Thr

CAA

TAC

AGT

GAC

CAA

AAC

AGA

TTC

AAC

CTG

TGC

TTT

GAA

GAA

AGA

GAC

720

Gin 225

Tyr

Ser

Asp

Gin

Asn 230

Arg

Phe

Asn

Leu

Cys 235

Phe

Glu

Glu

Arg

Asp 240

TTT

GTC

CCA

GGA

GAA

AAC

CGC

ATT

GCC

AAT

ATC

CAG

GAT

GCC

ATC

TGG

768

Phe

Val

Pro

Gly

Glu 245

Asn

Arg

Ile

Ala

Asn 250

Ile

Gin

Asp

Ala

Ile 255

Trp

AAC

AGT

AGA

AAG

ATC

GTT

TGT

CTT

GTG

AGC

AGA

CAC

TTC

CTT

AGA

GAT

816

Asn

Ser

Arg

Lys 260

Ile

Val

Cys

Leu

Val 265

Ser

Arg

His

Phe

Leu 270

Arg

Asp

GGC

TGG

TGC

CTT

GAA

GCC

TTC

AGT

TAT

GCC

CAG

GGC

AGG

TGC

TTA

TCT

864

118

Gly Trp

Cys 275

Leu

Glu

Ala Phe Ser Tyr Ala Gin Gly Arg

Cys

Leu

Ser

280

285

GAC

CTT

AAC

AGT

GCT

CTC

ATC

ATG

GTG

GTG

GTT

GGG

TCC

TTG

TCC

CAG

912

Asp

Leu

Asn

Ser

Ala

Leu

Ile

Met

Val

Val

Val

Gly

Ser

Leu

Ser

Gin

290

295

300

TAC

CAG

TTG

ATG

AAA

CAT

CAA

TCC

ATC

AGA

GGC

TTT

GTA

CAG

AAA

CAG

960

Tyr

Gin

Leu

Met

Lys

His

Gin

Ser

Ile

Arg

Gly

Phe

Val

Gin

Lys

Gin

305

310

315

320-

CAG

TAT

TTG

AGG

TGG

CCT

GAG

GAT

CTC

CAG

GAT

GTT

GGC

TGG

TTT

CTT

1008

Gin

Tyr

Leu

Arg

Trp

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Asp

Val

Gly

Trp

Phe

Leu

325

330

335

CAT

AAA

CTC

TCT

CAA

CAG

ATA

CTA

AAG

AAA

GAA

AAG

GAA

AAG

AAG

AAA

1056

His

Lys

Leu

Ser

Gin

Gin

Ile

Leu

Lys

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Lys

Lys

340

345

350

GAC

AAT

AAC

ATT

CCG

TTG

CAA

ACT

GTA

GCA

ACC

ATC

TCC

TAATCAAAGG

1105

Asp

Asn

Asn

Ile

Pro

Leu

Gin

Thr

Val

Ala

Thr

Ile

Ser

355

360

365

AGCAATTTCC AACTTATCTC AAGCCACAAA TAACTCTTCA CTTTGTATTT GCACCAAGTT 1165 ATCATTTTGG GGTCCTCTCT GGAGGTTTTT TTTTTCTTTT TGCTACTATG AAAACAACAT 1225 AAATCTCTCA ATTTTCGTAT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA TGGCGGCCGC 1275

2) Informace k SEQ ID NO: 10:

(	i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A) DÉLKA: 365 aminokyselin
		(B) TYP: aminokyselina
		(D) TOPOLOGIE: lineární
(	ii)	DRUH MOLEKULY: protein
(	xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 10
Cys	Trp	Asp Val Phe Glu Gly Leu Ser His Leu	Gin	Val	Leu	Tyr	Leu
1		5 10				15
Asn	His	Asn Tyr Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gly	Val	Phe	Ser	His	Leu
		20 25			30
Thr	Ala	Leu Arg Gly Leu Ser Leu Asn Ser Asn	Arg	Leu	Thr	Val	Leu
		35 40		45
Ser	His	Asn Asp Leu Pro Ala Asn Leu Glu Ile	Leu	Asp	Ile	Ser	Arg
	50	55	60
Asn	Gin	Leu Leu Ala Pro Asn Pro Asp Val Phe	Val	Ser	Leu	Ser	Val
65		70 75					80
Leu	Asp	Ile Thr His Asn Lys Phe Ile Cys Glu	Cys	Glu	Leu	Ser	Thr
		85 90				95

Phe Ile Asn Trp Leu Asn His Thr Asn Val Thr Ile Ala Gly Pro Pro 100 105 11° • ·

Ala

Asp

Ile 115

Tyr Cys Val

Tyr Pro Asp Ser Phe Ser Gly Val

Ser

Leu

120

125

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Glu

Gly

Cys

Asp

Glu

Glu

Glu

Val

Leu

Lys

Ser

130

135

140

Leu

Lys

Phe

Ser

Leu

Phe

Ile

Val

Cys

Thr

Val

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

145

150

155

160

Leu

Met

Thr

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Lys

Phe

Arg

Gly

Phe

Cys

Phe

Ile

165

170

175

Cys

Tyr

Lys

Thr

Ala

Gin

Arg

Leu

Val

Phe

Lys

Asp

His

Pro

Gin

Gly

180

185

190

Thr

Glu

Pro

Asp

Met

Tyr

Lys

Tyr

Asp

Ala

Tyr

Leu

Cys

Phe

Ser

Ser

195

200

205

Lys

Asp

Phe

Thr

Trp

Val

Gin

Asn

Ala

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Asp

Thr

210

215

220

Gin

Tyr

Ser

Asp

Gin

Asn

Arg

Phe

Asn

Leu

Cys

Phe

Glu

Glu

Arg

Asp

225

230

235

240

Phe

Val

Pro

Gly

Glu

Asn

Arg

Ile

Ala

Asn

Ile

Gin

Asp

Ala

Ile

Trp

245

250

255

Asn

Ser

Arg

Lys

Ile

Val

Cys

Leu

Val

Ser

Arg

His

Phe

Leu

Arg

Asp

260

265

270

Gly

Trp

Cys

Leu

Glu

Ala

Phe

Ser

Tyr

Ala

Gin

Gly

Arg

Cys

Leu

Ser

275

280

285

Asp

Leu

Asn

Ser

Ala

Leu

Ile

Met

Val

Val

Val

Gly

Ser

Leu

Ser

Gin

290

295

300

Tyr

Gin

Leu

Met

Lys

His

Gin

Ser

Ile

Arg

Gly

Phe

Val

Gin

Lys

Gin

305

310

315

320

Gin

Tyr

Leu

Arg

Trp

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Asp

Val

Gly

Trp

Phe

Leu

325

330

335

His

Lys

Leu

Ser

Gin

Gin

Ile

Leu

Lys

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Lys

Lys

340

345

350

Asp

Asn

Asn

Ile

Pro

Leu

Gin

Thr

Val

Ala

Thr

Ile

Ser

355

360

365

(2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3138 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · · ·

120

	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jědnořetězcová
	<D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA

(ix)	ZNAKY:
	(A) Název/klíč:	CDS
	(B) Pozice: 1 .	.3135
(ix)	ZNAKY:
	(A) Název/klíč:	mat peptid
	(B) Pozice: 67	..3135
(xi)	i Popis sekvence:	SEQ ID NO:

ATG TGG ACA

CTG AAG

AGA Arg

CTA ATT CTT ATC

CTT Leu

TTT AAC Phe Asn -10

ATA Ile

ATC Ile

CTA Leu

48

Met -22

Trp

Thr -20

Leu

Lys

Leu

Ile -15

Leu

Ile

ATT

TCC

AAA

CTC

CTT

GGG

GCT

AGA

TGG

TTT

CCT

AAA

ACT

CTG

CCC

TGT

96

Ile

Ser

Lys

Leu

Leu

Gly

Ala

Arg

Trp

Phe

Pro

Lys

Thr

Leu

Pro

Cys

-5

1

5

10

GAT

GTC

ACT

CTG

GAT

GTT

CCA

AAG

AAC

CAT

GTG

ATC

GTG

GAC

TGC

ACA

144

Asp

Val

Thr

Leu

Asp

Val

Pro

Lys

Asn

His

Val

Ile

Val

Asp

Cys

Thr

15

20

25

GAC

AAG

CAT

TTG

ACA

GAA

ATT

CCT

GGA

GGT

ATT

CCC

ACG

AAC

ACC

ACG

192

Asp

Lys

His

Leu

Thr

Glu

Ile

Pro

Gly

Gly

Ile

Pro

Thr

Asn

Thr

Thr

30

35

40

AAC

CTC

ACC

CTC

ACC

ATT

AAC

CAC

ATA

CCA

GAC

ATC

TCC

CCA

GCG

TCC

240

Asn

Leu

Thr

Leu

Thr

Ile

Asn

His

Ile

Pro

Asp

Ile

Ser

Pro

Ala

Ser

45

50

55

TTT

CAC

AGA

CTG

GAC

CAT

CTG

GTA

GAG

ATC

GAT

TTC

AGA

TGC

AAC

TGT

288

Phe

His

Arg

Leu

Asp

His

Leu

Val

Glu

Ile

Asp

Phe

Arg

Cys

Asn

Cys

60

65

70

GTA

CCT

ATT

CCA

CTG

GGG

TCA

AAA

AAC

AAC

ATG

TGC

ATC

AAG

AGG

CTG

336

Val

Pro

Ile

Pro

Leu

Gly

Ser

Lys

Asn

Asn

Met

Cys

Ile

Lys

Arg

Leu

75

80

85

90

CAG

ATT

AAA

CCC

AGA

AGC

TTT

AGT

GGA

CTC

ACT

TAT

TTA

AAA

TCC

CTT

384

Gin

Ile

Lys

Pro

Arg

Ser

Phe

Ser

Gly

Leu

Thr

Tyr

Leu

Lys

Ser

Leu

95

100

105

TAC

CTG

GAT

GGA

AAC

CAG

CTA

CTA

GAG

ATA

CCG

CAG

GGC

CTC

CCG

CCT

432

Tyr

Leu

Asp

Gly

Asn

Gin

Leu

Leu

Glu

Ile

Pro

Gin

Gly

Leu

Pro

Pro

110

115

120

AGC

TTA

CAG

CTT

CTC

AGC

CTT

GAG

GCC

AAC

AAC

ATC

TTT

TCC

ATC

AGA

480

Ser

Leu

Gin

Leu

Leu

Ser

Leu

Glu

Ala

Asn

Asn

Ile

Phe

Ser

Ile

Arg

125

130

135

AAA

GAG

AAT

CTA

ACA

GAA

CTG

GCC

AAC

ATA

GAA

ATA

CTC

TAC

CTG

GGC

528

Lys

Glu

Asn

Leu

Thr

Glu

Leu

Ala

Asn

Ile

Glu

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gly

140

145

150

CAA

AAC

TGT

TAT

TAT

CGA

AAT

CCT

TGT

TAT

GTT

TCA

TAT

TCA

ATA

GAG

576

Gin

Asn

Cys

Tyr

Tyr

Arg

Asn

Pro

Cys

Tyr

Val

Ser

Tyr

Ser

Ile

Glu

155

160

165

170

AAA

GAT

GCC

TTC

CTA

AAC

TTG

ACA

AAG

TTA

AAA

GTG

CTC

TCC

CTG

AAA

624

121 • · • · · »

GAT Asp

AAC AAT

GTC ACA GCC GTC CCT ACT GTT

TTG CCA TCT

ACT Thr 200

TTA Leu

ACA Thr

672

Asn

Asn

Val 190

Thr Ala

Val

Pro

Thr 195

Val

Leu

Pro

Ser

GAA

CTA

TAT

CTC

TAC

AAC

AAC

ATG

ATT

GCA

AAA

ATC

CAA

GAA

GAT

GAT

720

Glu

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asn

Met

Ile

Ala

Lys

Ile

Gin

Glu

Asp

Asp

205

210

215

TTT

AAT

AAC

CTC

AAC

CAA

TTA

CAA

ATT

CTT

GAC

CTA

AGT

GGA

AAT

TGC.

768

Phe

Asn

Asn

Leu

Asn

Gin

Leu

Gin

Ile

Leu

Asp

Leu

Ser

Gly

Asn

Cys

220

225

230

CCT

CGT

TGT

TAT

AAT

GCC

CCA

TTT

CCT

TGT

GCG

CCG

TGT

AAA

AAT

AAT

816

Pro

Arg

Cys

Tyr

Asn

Ala

Pro

Phe

Pro

Cys

Ala

Pro

Cys

Lys

Asn

Asn

235

240

245

250

TCT

CCC

CTA

CAG

ATC

CCT

GTA

AAT

GCT

TTT

GAT

GCG

CTG

ACA

GAA

TTA

864

Ser

Pro

Leu

Gin

Ile

Pro

Val

Asn

Ala

Phe

Asp

Ala

Leu

Thr

Glu

Leu

255

260

265

AAA

GTT

TTA

CGT

CTA

CAC

AGT

AAC

TCT

CTT

CAG

CAT

GTG

CCC

CCA

AGA

912

Lys

Val

Leu

Arg

Leu

His

Ser

Asn

Ser

Leu

Gin

His

Val

Pro

Pro

Arg

270

275

280

TGG

TTT

AAG

AAC

ATC

AAC

AAA

CTC

CAG

GAA

CTG

GAT

CTG

TCC

CAA

AAC

960

Trp

Phe

Lys

Asn

Ile

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Leu

Asp

Leu

Ser

Gin

Asn

285

290

295

TTC

TTG

GCC

AAA

GAA

ATT

GGG

GAT

GCT

AAA

TTT

CTG

CAT

TTT

CTC

CCC

1008

Phe

Leu

Ala

Lys

Glu

Ile

Gly

Asp

Ala

Lys

Phe

Leu

His

Phe

Leu

Pro

300

305

310

AGC

CTC

ATC

CAA

TTG

GAT

CTG

TCT

TTC

AAT

TTT

GAA

CTT

CAG

GTC

TAT

1056

Ser

Leu

Ile

Gin

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe

Glu

Leu

Gin

Val

Tyr

315

320

325

330

CGT

GCA

TCT

ATG

AAT

CTA

TCA

CAA

GCA

TTT

TCT

TCA

CTG

AAA

AGC

CTG

1104

Arg

Ala

Ser

Met

Asn

Leu

Ser

Gin

Ala

Phe

Ser

Ser

Leu

Lys

Ser

Leu

335

340

345

AAA

ATT

CTG

CGG

ATC

AGA

GGA

TAT

GTC

TTT

AAA

GAG

TTG

AAA

AGC

TTT

1152

Lys

Ile

Leu

Arg

Ile

Arg

Gly

Tyr

Val

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys

Ser

Phe

350

355

360

AAC

CTC

TCG

CCA

TTA

CAT

AAT

CTT

CAA

AAT

CTT

GAA

GTT

CTT

GAT

CTT

1200

Asn

Leu

Ser

Pro

Leu

His

Asn

Leu

Gin

Asn

Leu

Glu

Val

Leu

Asp

Leu

365

370

375

GGC

ACT

AAC

TTT

ATA

AAA

ATT

GCT

AAC

CTC

AGC

ATG

TTT

AAA

CAA

TTT

1248

Gly

Thr

Asn

Phe

Ile

Lys

Ile

Ala

Asn

Leu

Ser

Met

Phe

Lys

Gin

Phe

380

385

390

AAA

AGA

CTG

AAA

GTC

ATA

GAT

CTT

TCA

GTG

AAT

AAA

ATA

TCA

CCT

TCA

1296

Lys

Arg

Leu

Lys

Val

Ile

Asp

Leu

Ser

Val

Asn

Lys

Ile

Ser

Pro

Ser

395

400

405

410

GGA

GAT

TCA

AGT

GAA

GTT

GGC

TTC

TGC

TCA

AAT

GCC

AGA

ACT

TCT

GTA

1344

Gly

Asp

Ser

Ser

Glu

Val

Gly

Phe

Cys

Ser

Asn

Ala

Arg

Thr

Ser

Val

415 420 425

122

1392

GAA Glu

AGT TAT GAA CCC CAG GTC CTG GAA CAA TTA CAT TAT TTC

AGA Arg

TAT Tyr

Ser

Tyr

Glu 430

Pro Gin

Val

Leu

Glu 435

Gin

Leu

His

Tyr

Phe 440

GAT

AAG

TAT

GCA

AGG AGT

TGC

AGA

TTC

AAA

AAC

AAA

GAG

GCT

TCT

TTC

Asp

Lys

Tyr

Ala

Arg Ser

Cys

Arg

Phe

Lys

Asn

Lys

Glu

Ala

Ser

Phe

445

450

455

ATG

TCT

GTT

AAT

GAA AGC

TGC

TAC

AAG

TAT

GGG

CAG

ACC

TTG

GAT

CTA

Met

Ser

Val

Asn

Glu Ser

Cys

Tyr

Lys

Tyr

Gly

Gin

Thr

Leu

Asp

Leu

460

465

470

AGT

AAA

AAT

AGT

ATA TTT

TTT

GTC

AAG

TCC

TCT

GAT

TTT

CAG

CAT

CTT

Ser

Lys

Asn

Ser

Ile Phe

Phe

Val

Lys

Ser

Ser

Asp

Phe

Gin

His

Leu

475

480

485

490

TCT

TTC

CTC

AAA

TGC CTG

AAT

CTG

TCA

GGA

AAT

CTC

ATT

AGC

CAA

ACT

Ser

Phe

Leu

Lys

Cys Leu

Asn

Leu

Ser

Gly

Asn

Leu

Ile

Ser

Gin

Thr

495

500

505

CTT

AAT

GGC

AGT

GAA TTC

CAA

CCT

TTA

GCA

GAG

CTG

AGA

TAT

TTG

GAC

Leu

Asn

Gly

Ser

Glu Phe

Gin

Pro

Leu

Ala

Glu

Leu

Arg

Tyr

Leu

Asp

510

515

520

TTC

TCC

AAC

AAC

CGG CTT

GAT

TTA

CTC

CAT

TCA

ACA

GCA

TTT

GAA

GAG

Phe

Ser

Asn

Asn

Arg Leu

Asp

Leu

Leu

His

Ser

Thr

Ala

Phe

Glu

Glu

525

530

535

CTT

CAC

AAA

CTG

GAA GTT

CTG

GAT

ATA

AGC

AGT

AAT

AGC

CAT

TAT

TTT

Leu

His

Lys

Leu

Glu Val

Leu

Asp

Ile

Ser

Ser

Asn

Ser

His

Tyr

Phe

540

545

550

CAA

TCA

GAA

GGA

ATT ACT

CAT

ATG

CTA

AAC

TTT

ACC

AAG

AAC

CTA

AAG

Gin

Ser

Glu

Gly

Ile Thr

His

Met

Leu

Asn

Phe

Thr

Lys

Asn

Leu

Lys

555

560

565

570

GTT

CTG

CAG

AAA

CTG ATG

ATG

AAC

GAC

AAT

GAC

ATC

TCT

TCC

TCC

ACC

Val

Leu

Gin

Lys

Leu Met

Met

Asn

Asp

Asn

Asp

Ile

Ser

Ser

Ser

Thr

575

580

585

AGC

AGG

ACC

ATG

GAG AGT

GAG

TCT

CTT

AGA

ACT

CTG

GAA

TTC

AGA

GGA

Ser

Arg

Thr

Met

Glu Ser

Glu

Ser

Leu

Arg

Thr

Leu

Glu

Phe

Arg

Gly

590

595

600

AAT

CAC

TTA

GAT

GTT TTA

TGG

AGA

GAA

GGT

GAT

AAC

AGA

TAC

TTA

CAA

Asn

His

Leu

Asp

Val Leu

Trp

Arg

Glu

Gly

Asp

Asn

Arg

Tyr

Leu

Gin

605

610

615

TTA

TTC

AAG

AAT

CTG CTA

AAA

TTA

GAG

GAA

TTA

GAC

ATC

TCT

AAA

AAT

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu Leu

Lys

Leu

Glu

Glu

Leu

Asp

Ile

Ser

Lys

Asn

620

625

630

TCC

CTA

AGT

TTC

TTG CCT

TCT

GGA

GTT

TTT

GAT

GGT

ATG

CCT

CCA

AAT

Ser

Leu

Ser

Phe

Leu Pro

Ser

Gly

Val

Phe

Asp

Gly

Met

Pro

Pro

Asn

635

640

645

650

CTA

AAG

AAT

CTC

TCT TTG

GCC

AAA

AAT

GGG

CTC

AAA

TCT

TTC

AGT

TGG

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser Leu

Ala

Lys

Asn

Gly

Leu

Lys

Ser

Phe

Ser

Trp

655

660

665

AAG

AAA

CTC

CAG

TGT CTA

AAG

AAC

CTG

GAA

ACT

TTG

GAC

CTC

AGC

CAC

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968

2016

2064

2112 » · · · · «

123

Lys

Lys

Leu

Gin 670

Cys

Leu

Lys

Asn

Leu 675

Glu

Thr

Leu

Asp

Leu 680

Ser

His

AAC

CAA

CTG

ACC

ACT

GTC

CCT

GAG

AGA

TTA

TCC

AAC

TGT

TCC

AGA

AGC

2160

Asn

Gin

Leu 685

Thr

Thr

Val

Pro

Glu 690

Arg

Leu

Ser

Asn

Cys 695

Ser

Arg

Ser

CTC

AAG

AAT

CTG

ATT

CTT

AAG

AAT

AAT

CAA

ATC

AGG

AGT

CTG

ACG

AAG

2208

Leu

Lys 700

Asn

Leu

Ile

Leu

Lys 705

Asn

Asn

Gin

Ile

Arg 710

Ser

Leu

Thr

Lys

TAT

TTT

CTA

CAA

GAT

GCC

TTC

CAG

TTG

CGA

TAT

CTG

GAT

CTC

AGC

TCA

2256

Tyr 715

Phe

Leu

Gin

Asp

Ala 720

Phe

Gin

Leu

Arg

Tyr 725

Leu

Asp

Leu

Ser

Ser 730

AAT

AAA

ATC

CAG

ATG

ATC

CAA

AAG

ACC

AGC

TTC

CCA

GAA

AAT

GTC

CTC

2304

Asn

Lys

Ile

Gin

Met 735

Ile

Gin

Lys

Thr

Ser 740

Phe

Pro

Glu

Asn

Val 745

Leu

AAC

AAT

CTG

AAG

ATG

TTG

CTT

TTG

CAT

CAT

AAT

CGG

TTT

CTG

TGC

ACC

2352

Asn

Asn

Leu

Lys 750

Met

Leu

Leu

Leu

His 755

His

Asn

Arg

Phe

Leu 760

Cys

Thr

TGT

GAT

GCT

GTG

TGG

TTT

GTC

TGG

TGG

GTT

AAC

CAT

ACG

GAG

GTG

ACT

2400

Cys

Asp

Ala 765

Val

Trp

Phe

Val

Trp 770

Trp

Val

Asn

His

Thr 775

Glu

Val

Thr

ATT

CCT

TAC

CTG

GCC

ACA

GAT

GTG

ACT

TGT

GTG

GGG

CCA

GGA

GCA

CAC

2448

Ile

Pro 780

Tyr

Leu

Ala

Thr

Asp 785

Val

Thr

Cys

Val

Gly 790

Pro

Gly

Ala

His

AAG

GGC

CAA

AGT

GTG

ATC

TCC

CTG

GAT

CTG

TAC

ACC

TGT

GAG

TTA

GAT

2496

Lys 795

Gly

Gin

Ser

Val

Xle 800

Ser

Leu

Asp

Leu

Tyr 805

Thr

Cys

Glu

Leu

Asp 810

CTG

ACT

AAC

CTG

ATT

CTG

TTC

TCA

CTT

TCC

ATA

TCT

GTA

TCT

CTC

TTT

2544

Leu

Thr

Asn

Leu

Ile 815

Leu

Phe

Ser

Leu

Ser 820

Ile

Ser

Val

Ser

Leu 825

Phe

CTC

ATG

GTG

ATG

ATG

ACA

GCA

AGT

CAC

CTC

TAT

TTC

TGG

GAT

GTG

TGG

2592

Leu

Met

Val

Met 830

Met

Thr

Ala

Ser

His 835

Leu

Tyr

Phe

Trp

Asp 840

Val

Trp

TAT

ATT

TAC

CAT

TTC

TGT

AAG

GCC

AAG

ATA

AAG

GGG

TAT

CAG

CGT

CTA

2640

Tyr

Ile

Tyr 845

His

Phe

Cys

Lys

Ala 850

Lys

Ile

Lys

Gly

Tyr 855

Gin

Arg

Leu

ATA

TCA

CCA

GAC

TGT

TGC

TAT

GAT

GCT

TTT

ATT

GTG

TAT

GAC

ACT

AAA

2688

Ile

Ser 860

Pro

Asp

Cys

Cys

Tyr 865

Asp

Ala

Phe

Ile

Val 870

Tyr

Asp

Thr

Lys

GAC

CCA

GCT

GTG

ACC

GAG

TGG

GTT

TTG

GCT

GAG

CTG

GTG

GCC

AAA

CTG

2736

Asp 875

Pro

Ala

Val

Thr

Glu 880

Trp

Val

Leu

Ala

Glu 885

Leu

Val

Ala

Lys

Leu 890

GAA

GAC

CCA

AGA

GAG

AAA

CAT

TTT

AAT

TTA

TGT

CTC

GAG

GAA

AGG

GAC

2784

Glu

Asp

Pro

Arg

Glu 895

Lys

His

Phe

Asn

Leu 900

Cys

Leu

Glu

Glu

Arg 905

Asp

TGG

TTA

CCA

GGG

CAG

CCA

GTT

CTG

GAA

AAC

CTT

TCC

CAG

AGC

ATA

CAG

2832

Trp

Leu

Pro

Gly

Gin

Pro

Val

Leu

Glu

Asn

Leu

Ser

Gin

Ser

Ile

Gin

• ·

124

2880

910

915

920

CTT

AGC

AAA

AAG

ACA

GTG

TTT

GTG

ATG

ACA

GAC

AAG

TAT

GCA

AAG

ACT

Leu

Ser

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Met

Thr

Asp

Lys

Tyr

Ala

Lys

Thr

925

930

935

GAA

AAT

TTT

AAG

ATA

GCA

TTT

TAC

TTG

TCC

CAT

CAG

AGG

CTC

ATG

GAT

Glu

Asn

Phe

Lys

Ile

Ala

Phe

Tyr

Leu

Ser

His

Gin

Arg

Leu

Met

Asp

940

945

950

GAA

AAA

GTT

GAT

GTG

ATT

ATC

TTG

ATA

TTT

CTT

GAG

AAG

CCC

TTT

CAG

Glu

Lys

Val

Asp

Val

Ile

Ile

Leu

Ile

Phe

Leu

Glu

Lys

Pro

Phe

Gin

955

960

965

970

AAG

TCC

AAG

TTC

CTC

CAG

CTC

CGG

AAA

AGG

CTC

TGT

GGG

AGT

TCT

GTC

Lys

Ser

Lys

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Lys

Arg

Leu

Cys

Gly

Ser

Ser

Val

975

980

985

CTT

GAG

TGG

CCA

ACA

AAC

CCG

CAA

GCT

CAC

CCA

TAC

TTC

TGG

CAG

TGT

Leu

Glu

Trp

Pro

Thr

Asn

Pro

Gin

Ala

His

Pro

Tyr

Phe

Trp

Gin

Cys

990

995

1000

CTA

AAG

AAC

GCC

CTG

GCC

ACA

GAC

AAT

CAT

GTG

GCC

TAT

AGT

CAG

GTG

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Ala

Thr

Asp

Asn

His

Val

Ala

Tyr

Ser

Gin

Val

1005

1010

1015

TTC

AAG

GAA

ACG

GTC

TAG

Phe

Lys

Glu

Thr

Val

1020

2928

2976

3024

3072

3120

3138

2) Informace k SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1045 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Met -22

Trp

Thr -20

Leu

Lys

Arg

Leu

Ile -15

Leu

Ile

Leu

Phe

Asn -10

Ile

Ile

Leu

Ile

Ser -5

Lys

Leu

Leu

Gly

Ala 1

Arg

Trp

Phe

Pro 5

Lys

Thr

Leu

Pro

Cys 10

Asp

Val

Thr

Leu

Asp 15

Val

Pro

Lys

Asn

His 20

Val

Ile

Val

Asp

Cys 25

Thr

Asp

Lys

His

Leu 30

Thr

Glu

Ile

Pro

Gly 35

Gly

Ile

Pro

Thr

Asn 40

Thr

Thr

Asn

Leu

Thr 45

Leu

Thr

Ile

Asn

His 50

Ile

Pro

Asp

Ile

Ser 55

Pro

Ala

Ser

Phe

His 60

Arg

Leu

Asp

His

Leu 65

Val

Glu

Ile

Asp

Phe 70

Arg

Cys

Asn

Cys

Val Pro Ile Pro Leu Gly Ser Lys Asn Asn Met Cys Ile Lys Arg Leu • · • · • ·

125

Gin

Ile

Lys

Pro

Arg 95

Ser

Phe

Ser

Gly

Leu 100

Thr

Tyr

Leu

Lys

Ser 105

Leu

Tyr

Leu

Asp

Gly 110

Asn

Gin

Leu

Leu

Glu 115

Ile

Pro

Gin

Gly

Leu 120

Pro

Pro

Ser

Leu

Gin 125

Leu

Leu

Ser

Leu

Glu 130

Ala

Asn

Asn

Ile

Phe 135

Ser

Ile

Arg

Lys

Glu 140

Asn

Leu

Thr

Glu

Leu 145

Ala

Asn

Ile

Glu

Ile 150

Leu

Tyr

Leu

Gly

Gin 155

Asn

Cys

Tyr

Tyr

Arg 160

Asn

Pro

Cys

Tyr

Val 165

Ser

Tyr

Ser

Ile

Glu 170

Lys

Asp

Ala

Phe

Leu 175

Asn

Leu

Thr

Lys

Leu 180

Lys

Val

Leu

Ser

Leu 185

Lys

Asp

Asn

Asn

Val 190

Thr

Ala

Val

Pro

Thr 195

Val

Leu

Pro

Ser

Thr 200

Leu

Thr

Glu

Leu

Tyr 205

Leu

Tyr

Asn

Asn

Met 210

Ile

Ala

Lys

Ile

Gin 215

Glu

Asp

Asp

Phe

Asn 220

Asn

Leu

Asn

Gin

Leu 225

Gin

Ile

Leu

Asp

Leu 230

Ser

Gly

Asn

Cys

Pro 235

Arg

Cys

Tyr

Asn

Ala 240

Pro

Phe

Pro

Cys

Ala 245

Pro

Cys

Lys

Asn

Asn 250

Ser

Pro

Leu

Gin

Ile 255

Pro

Val

Asn

Ala

Phe 260

Asp

Ala

Leu

Thr

Glu 265

Leu

Lys

Val

Leu

Arg 270

Leu

His

Ser

Asn

Ser 275

Leu

Gin

His

Val

Pro 280

Pro

Arg

Trp

Phe

Lys 285

Asn

Ile

Asn

Lys

Leu 290

Gin

Glu

Leu

Asp

Leu 295

Ser

Gin

Asn

Phe

Leu 300

Ala

Lys

Glu

Ile

Gly 305

Asp

Ala

Lys

Phe

Leu 310

His

Phe

Leu

Pro

Ser 315

Leu

Ile

Gin

Leu

Asp 320

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe 325

Glu

Leu

Gin

Val

Tyr 330

Arg

Ala

Ser

Met

Asn 335

Leu

Ser

Gin

Ala

Phe 340

Ser

Ser

Leu

Lys

Ser 345

Leu

Lys

Ile

Leu

Arg 350

Ile

Arg

Gly

Tyr

Val 355

Phe

Lys

Glu

Leu

Lys 360

Ser

Phe

Asn

Leu

Ser 365

Pro

Leu

His

Asn

Leu 370

Gin

Asn

Leu

Glu

Val 375

Leu

Asp

Leu

Gly

Thr

Asn

Phe

Ile

Lys

Ile

Ala

Asn

Leu

Ser

Met

Phe

Lys

Gin

Phe

380 385 390

Lys Arg Leu Lys Val Ile Asp Leu Ser Val Asn Lys Ile Ser Pro Ser 395 400 405 410

126

Gly

Asp

Ser

Ser

Glu 415

Val

Gly

Phe

Cys

Ser 420

Asn

Ala

Arg

Thr

Ser 425

Val

Glu

Ser

Tyr

Glu 430

Pro

Gin

Val

Leu

Glu 435

Gin

Leu

His

Tyr

Phe 440

Arg

Tyr

Asp

Lys

Tyr 445

Ala

Arg

Ser

Cys

Arg 450

Phe

Lys

Asn

Lys

Glu 455

Ala

Ser

Phe

Met

Ser 460

Val

Asn

Glu

Ser

Cys 465

Tyr

Lys

Tyr

Gly

Gin 470

Thr

Leu

Asp

Leu

Ser 475

Lys

Asn

Ser

Ile

Phe 480

Phe

Val

Lys

Ser

Ser 485

Asp

Phe

Gin

His

Leu 490

Ser

Phe

Leu

Lys

Cys 495

Leu

Asn

Leu

Ser

Gly 500

Asn

Leu

Ile

Ser

Gin 505

Thr

Leu

Asn

Gly

Ser 510

Glu

Phe

Gin

Pro

Leu 515

Ala

Glu

Leu

Arg

Tyr 520

Leu

Asp

Phe

Ser

Asn 525

Asn

Arg

Leu

Asp

Leu 530

Leu

His

Ser

Thr

Ala 535

Phe

Glu

Glu

Leu

His 540

Lys

Leu

Glu

Val

Leu 545

Asp

Ile

Ser

Ser

Asn 550

Ser

His

Tyr

Phe

Gin 555

Ser

Glu

Gly

Ile

Thr 560

His

Met

Leu

Asn

Phe 565

Thr

Lys

Asn

Leu

Lys 570

Val

Leu

Gin

Lys

Leu 575

Met

Met

Asn

Asp

Asn 580

Asp

Ile

Ser

Ser

Ser 585

Thr

Ser

Arg

Thr

Met 590

Glu

Ser

Glu

Ser

Leu 595

Arg

Thr

Leu

Glu

Phe 600

Arg

Gly

Asn

His

Leu 605

Asp

Val

Leu

Trp

Arg 610

Glu

Gly

Asp

Asn

Arg 615

Tyr

Leu

Gin

Leu

Phe 620

Lys

Asn

Leu

Leu

Lys 625

Leu

Glu

Glu

Leu

Asp 630

Ile

Ser

Lys

Asn

Ser 635

Leu

Ser

Phe

Leu

Pro 640

Ser

Gly

Val

Phe

Asp 645

Gly

Met

Pro

Pro

Asn 650

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser 655

Leu

Ala

Lys

Asn

Gly 660

Leu

Lys

Ser

Phe

Ser 665

Trp

Lys

Lys

Leu

Gin 670

Cys

Leu

Lys

Asn

Leu 675

Glu

Thr

Leu

Asp

Leu 680

Ser

His

Asn

Gin

Leu 685

Thr

Thr

Val

Pro

Glu 690

Arg

Leu

Ser

Asn

Cys 695

Ser

Arg

Ser

Leu

Lys

Asn

Leu

Ile

Leu

Lys

Asn

Asn

Gin

Ile

Arg

Ser

Leu

Thr

Lys

700 705 710

Tyr Phe Leu Gin Asp Ala Phe Gin Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Ser Ser 715 720 725 730 • · · ·

Asn

Lys

Ile

Gin

Met 735

Ile

Gin

Lys

Thr

Ser 740

Phe

Pro

Glu

Asn

Val 745

Leu

Asn

Asn

Leu

Lys 750

Met

Leu

Leu

Leu

His 755

His

Asn

Arg

Phe

Leu 760

Cys

Thr

Cys

Asp

Ala 765

Val

Trp

Phe

Val

Trp 770

Trp

Val

Asn

His

Thr 775

Glu

Val

Thr

Ile

Pro 780

Tyr

Leu

Ala

Thr

Asp 785

Val

Thr

Cys

Val

Gly 790

Pro

Gly

Ala

His.

Lys 795

Gly

Gin

Ser

Val

Ile 800

Ser

Leu

Asp

Leu

Tyr 805

Thr

Cys

Glu

Leu

Asp 810

Leu

Thr

Asn

Leu

Ile 815

Leu

Phe

Ser

Leu

Ser 820

Ile

Ser

Val

Ser

Leu 825

Phe

Leu

Met

Val

Met 830

Met

Thr

Ala

Ser

His 835

Leu

Tyr

Phe

Tip

Asp 840

Val

Trp

Tyr

Ile

Tyr 845

His

Phe

Cys

Lys

Ala 850

Lys

Ile

Lys

Gly

Tyr 855

Gin

Arg

Leu

Ile

Ser 860

Pro

Asp

Cys

Cys

Tyr 865

Asp

Ala

Phe

Ile

Val 870

Tyr

Asp

Thr

Lys

Asp 875

Pro

Ala

Val

Thr

Glu 880

Trp

Val

Leu

Ala

Glu 885

Leu

Val

Ala

Lys

Leu 890

Glu

Asp

Pro

Arg

Glu 895

Lys

His

Phe

Asn

Leu 900

Cys

Leu

Glu

Glu

Arg 905

Asp

Trp

Leu

Pro

Gly 910

Gin

Pro

Val

Leu

Glu 915

Asn

Leu

Ser

Gin

Ser 920

Ile

Gin

Leu

Ser

Lys 925

Lys

Thr

Val

Phe

Val 930

Met

Thr

Asp

Lys

Tyr 935

Ala

Lys

Thr

Glu

Asn 940

Phe

Lys

Ile

Ala

Phe 945

Tyr

Leu

Ser

His

Gin 950

Arg

Leu

Met

Asp

Glu 955

Lys

Val

Asp

Val

Ile 960

Ile

Leu

Ile

Phe

Leu 965

Glu

Lys

Pro

Phe

Gin 970

Lys

Ser

Lys

Phe

Leu 975

Gin

Leu

Arg

Lys

Arg 980

Leu

Cys

Gly

Ser

Ser 985

Val

Leu

Glu

Trp

Pro 990

Thr

Asn

Pro

Gin

Ala 995

His

Pro

Tyr

Phe

Trp Gin 1000

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Ala

Thr

Asp

Asn

His

Val

Ala

Tyr

Ser

Gin

Val

1005 1010 1015

Phe Lys Glu Thr Val 1020 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 180 párů baží ·«·· « *

128 • · <1 « «

(B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..177 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

CTT Leu 1

GGA Gly

AAA Lys

CCT Pro

CTT CAG AAG TCT AAG TTT CTT CAG CTC AGG AAG AGA

48

Leu Gin Lys 5

Ser Lys

Phe Leu 10

Gin

Leu

Arg

Lys Arg 15

CTC

TGC

AGG

AGC

TCT

GTC

CTT

GAG

TGG

CCT

GCA

AAT

CCA

CAG

GCT

CAC

96

Leu

Cys

Arg

Ser

Ser

Val

Leu

Glu

Trp

Pro

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

His

20

25

30

CCA

TAC

TTC

TGG

CAG

TGC

CTG

AAA

AAT

GCC

CTG

ACC

ACA

GAC

AAT

CAT

144

Pro

Tyr

Phe

Trp

Gin

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Thr

Thr

Asp

Asn

His

35

40

45

GTG

GCT

TAT

AGT

CAA

ATG

TTC

AAG

GAA

ACA

GTC

TAG

180

Val

Ala

Tyr

Ser

Gin

Met

Phe

Lys

Glu

Thr

Val

55

Informace k SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

	(ii) (xi)	DRUH MOLEKULY:	protein SEQ ID	NO	: 14
Popis	sekvence:
Leu	Gly	Lys Pro	Leu Gin Lys	Ser Lys	Phe	Leu	Gin	Leu	Arg	Lys	Arg
1			5		10					15
Leu	Cys	Arg Ser	Ser Val Leu	Glu Trp	Pro	Ala	Asn	Pro	Gin	Ala	His
		20		25					30
Pro	Tyr	Phe Trp	Gin Cys Leu	Lys Asn	Ala	Leu	Thr	Thr	Asp	Asn	His
		35		40				45

Val Ala Tyr Ser Gin Met Phe Lys Glu Thr Val 50 55 • · · · • · · <

► · · • · · · · '

129 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 990 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: CDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 2 ..988 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

G AAT TCC AGA CTT ATA AAC TTG AAA AAT CTC TAT TTG GCC TGG AAC 46

Asn Ser Arg Leu Ile Asn Leu Lys Asn Leu Tyr Leu Ala Trp Asn

10 15

TGC TAT TTT AAC

AAA Lys 20

GTT TGC

GAG Glu

AAA Lys

ACT AAC ATA GAA GAT

GGA GTA

94

Cys

Tyr

Phe

Asn

Val

Cys

Thr 25

Asn

Ile

Glu

Asp

Gly 30

Val

TTT

GAA

ACG

CTG

ACA

AAT

TTG

GAG

TTG

CTA

TCA

CTA

TCT

TTC

AAT

TCT

142

Phe

Glu

Thr

Leu 35

Thr

Asn

Leu

Glu

Leu 40

Leu

Ser

Leu

Ser

Phe 45

Asn

Ser

CTT

TCA

CAT

GTG

CCA

CCC

AAA

CTG

CCA

AGC

TCC

CTA

CGC

AAA

CTT

TTT

190

Leu

Ser

His 50

Val

Pro

Pro

Lys

Leu 55

Pro

Ser

Ser

Leu

Arg 60

Lys

Leu

Phe

CTG

AGC

AAC

ACC

CAG

ATC

AAA

TAC

ATT

AGT

GAA

GAA

GAT

TTC

AAG

GGA

238

Leu

Ser 65

Asn

Thr

Gin

Ile

Lys 70

Tyr

Ile

Ser

Glu

Glu 75

Asp

Phe

Lys

Gly

TTG

ATA

AAT

TTA

ACA

TTA

CTA

GAT

TTA

AGC

GGG

AAC

TGT

CCG

AGG

TGC

286

Leu 80

Ile

Asn

Leu

Thr

Leu 85

Leu

Asp

Leu

Ser

Gly 90

Asn

Cys

Pro

Arg

Cys 95

TTC

AAT

GCC

CCA

TTT

CCA

TGC

GTG

CCT

TGT

GAT

GGT

GGT

GCT

TCA

ATT

334

Phe

Asn

Ala

Pro

Phe 100

Pro

Cys

Val

Pro

Cys 105

Asp

Gly

Gly

Ala

Ser 110

Ile

AAT

ATA

GAT

CGT

TTT

GCT

TTT

CAA

AAC

TTG

ACC

CAA

CTT

CGA

TAC

CTA

382

Asn

Ile

Asp

Arg 115

Phe

Ala

Phe

Gin

Asn 120

Leu

Thr

Gin

Leu

Arg 125

Tyr

Leu

AAC

CTC

TCT

AGC

ACT

TCC

CTC

AGG

AAG

ATT

AAT

GCT

GCC

TGG

TTT

AAA

430

Asn

Leu

Ser 130

Ser

Thr

Ser

Leu

Arg 135

Lys

Ile

Asn

Ala

Ala 140

Trp

Phe

Lys

AAT

ATG

CCT

CAT

CTG

AAG

GTG

CTG

GAT

CTT

GAA

TTC

AAC

TAT

TTA

GTG

478

Asn

Met 145

Pro

His

Leu

Lys

Val 150

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe 155

Asn

Tyr

Leu

Val

GGA

GAA

ATA

GCC

TCT

GGG

GCA

TTT

TTA

ACG

ATG

CTG

CCC

CGC

TTA

GAA

526

Gly 160

Glu

Ile

Ala

Ser

Gly 165

Ala

Phe

Leu

Thr

Met 170

Leu

Pro

Arg

Leu

Glu 175

130

ΑΤΑ

CTT

GAC

TTG

TCT

TTT

AAC

TAT

ATA

AAG

GGG

AGT

TAT

CCA

CAG

CAT

Ile

Leu

Asp

Leu

Ser 180

Phe

Asn

Tyr

Ile

Lys 185

Gly

Ser

Tyr

Pro

Gin 190

His

ATT

AAT

ATT

TCC

AGA

AAC

TTC

TCT

AAA

CTT

TTG

TCT

CTA

CGG

GCA

TTG

Ile

Asn

Ile

Ser

Arg

Asn

Phe

Ser

Lys

Leu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ala

Leu

195 200 205

CAT His

TTA Leu

AGA GGT TAT

GTG TTC

CAG GAA CTC AGA GAA GAT GAT TTC CAG

670

Arg Gly 210

Tyr

Val

Phe

Gin 215

Glu Leu

Arg

Glu Asp Asp 220

Phe Gin

CCC

CTG

ATG

CAG

CTT

CCA

AAC

TTA

TCG

ACT

ATC

AAC

TTG

GGT

ATT

AAT

718

Pro

Leu

Met

Gin

Leu

Pro

Asn

Leu

Ser

Thr

Ile

Asn

Leu

Gly

Ile

Asn

225

230

235

TTT

ATT

AAG

CAA

ATC

GAT

TTC

AAA

CTT

TTC

CAA

AAT

TTC

TCC

AAT

CTG

766

Phe

Ile

Lys

Gin

Ile

Asp

Phe

Lys

Leu

Phe

Gin

Asn

Phe

Ser

Asn

Leu

240

245

250

255

GAA

ATT

ATT

TAC

TTG

TCA

GAA

AAC

AGA

ATA

TCA

CCG

TTG

GTA

AAA

GAT

814

Glu

Ile

Ile

Tyr

Leu

Ser

Glu

Asn

Arg

Ile

Ser

Pro

Leu

Val

Lys

Asp

260

265

270

ACC

CGG

CAG

AGT

TAT

GCA

AAT

AGT

TCC

TCT

TTT

CAA

CGT

CAT

ATC

CGG

862

Thr

Arg

Gin

Ser

Tyr

Ala

Asn

Ser

Ser

Ser

Phe

Gin

Arg

His

Ile

Arg

275

280

285

AAA

CGA

CGC

TCA

ACA

GAT

TTT

GAG

TTT

GAC

CCA

CAT

TCG

AAC

TTT

TAT

910

Lys

Arg

Arg

Ser

Thr

Asp

Phe

Glu

Phe

Asp

Pro

His

Ser

Asn

Phe

Tyr

290

295

300

CAT

TTC

ACC

CGT

CCT

TTA

ATA

AAG

CCA

CAA

TGT

GCT

GCT

TAT

GGA

AAA

958

His

Phe

Thr

Arg

Pro

Leu

Ile

Lys

Pro

Gin

Cys

Ala

Ala

Tyr

Gly

Lys

305

310

315

GCC

TTA

GAT

TTA

AGC

CTC

AAC

AGT

ATT

TTC

TT

990

Ala

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu

Asn

Ser

Ile

Phe

320 325 • · · · • · • β

131 (2) Informace k SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 329 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16

Asn 1

Ser

Arg

Leu

Ile 5

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu 10

Tyr

Leu

Ala

Trp

Asn 15

Cys

Tyr

Phe

Asn

Lys 20

Val

Cys

Glu

Lys

Thr 25

Asn

Ile

Glu

Asp

Gly 30

Val

Phe

Glu

Thr

Leu 35

Thr

Asn

Leu

Glu

Leu 40

Leu

Ser

Leu

Ser

Phe 45

Asn

Ser

Leu

Ser

His 50

Val

Pro

Pro

Lys

Leu 55

Pro

Ser

Ser

Leu

Arg 60

Lys

Leu

Phe

Leu

Ser 65

Asn

Thr

Gin

Ile

Lys 70

Tyr

Ile

Ser

Glu

Glu 75

Asp

Phe

Lys

Gly

Leu 80

Ile

Asn

Leu

Thr

Leu 85

Leu

Asp

Leu

Ser

Gly 90

Asn

Cys

Pro

Arg

Cys 95

Phe

Asn

Ala

Pro

Phe 100

Pro

Cys

Val

Pro

Cys 105

Asp

Gly

Gly

Ala

Ser 110

Ile

Asn

Ile

Asp

Arg 115

Phe

Ala

Phe

Gin

Asn 120

Leu

Thr

Gin

Leu

Arg 125

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser 130

Ser

Thr

Ser

Leu

Arg 135

Lys

Ile

Asn

Ala

Ala 140

Trp

Phe

Lys

Asn.

Met 145

Pro

His

Leu

Lys

Val 150

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe 155

Asn

Tyr

Leu

Val

Gly 160

Glu

Ile

Ala

Ser

Gly 165

Ala

Phe

Leu

Thr

Met 170

Leu

Pro

Arg

Leu

Glu 175

Ile

Leu

Asp

Leu

Ser 180

Phe

Asn

Tyr

Ile

Lys 185

Gly

Ser

Tyr

Pro

Gin 190

His

Ile

Asn

Ile

Ser 195

Arg

Asn

Phe

Ser

Lys 200

Leu

Leu

Ser

Leu

Arg 205

Ala

Leu

His

Leu

Arg 210

Gly

Tyr

Val

Phe

Gin 215

Glu

Leu

Arg

Glu

Asp 220

Asp

Phe

Gin

Pro

Leu 225

Met

Gin

Leu

Pro

Asn 230

Leu

Ser

Thr

Ile

Asn 235

Leu

Gly

Ile

Asn

Phe 240

Ile

Lys

Gin

Ile

Asp 245

Phe

Lys

Leu

Phe

Gin 250

Asn

Phe

Ser

Asn

Leu 255

Glu

« · fr ·

132 ··* ’

Ile

Ile

Tyr

Leu 260

Ser

Glu

Asn

Arg

Ile 265

Ser

Pro

Leu

Val

Lys 270

Arg

Gin

Ser 275

Tyr

Ala

Asn

Ser

Ser 280

Ser

Phe

Gin

Arg

His 285

Ile

Arg

Arg 290

Ser

Thr

Asp

Phe

Glu 295

Phe

Asp

Pro

His

Ser 300

Asn

Phe

Phe 305

Thr

Arg

Pro

Leu

Ile 310

Lys

Pro

Gin

Cys

Ala 315

Ala

Tyr

Gly

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu 325

Asn

Ser

Ile

Phe

• ·

Asp Thr

Arg Lys

Tyr His

Lys Ala 320

2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1557 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..513 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 278 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 278 označený G, může být G nebo C) (íx) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 445 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 445 označený A, může být A nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 572

133 (D) Jiné informace: (poznámka^ nukleotidy 572, 593,

600, 607, 617, 622, 625, 631, 640, 646, 653, 719, 775 a 861 jsou označeny C, každý může být A, C, G nebo T) (xii) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

CAG

TCT

CTT

TCC

ACA

TCC

CAA

ACT

TTC

TAT

GAT

GCT

TAC

ATT

TCT

TAT

Gin 1

Ser

Leu

Ser

Thr 5

Ser

Gin

Thr

Phe

Tyr 10

Asp

Ala

Tyr

Ile

Ser 15

Tyr

GAC

ACC

AAA

GAT

GCC

TCT

GTT

ACT

GAC

TGG

GTG

ATA

AAT

GAG

CTG

CGC

Asp

Thr

Lys

Asp 20

Ala

Ser

Val

Thr

Asp 25

Trp

Val

Ile

Asn

Glu 30

Leu

Arg

TAC

CAC

CTT

GAA

GAG

AGC

CGA

GAC

AAA

AAC

GTT

CTC

CTT

TGT

CTA

GAG

Tyr

His

Leu 35

.Glu

Glu

Ser

Arg

Asp 40

Lys

Asn

Val

Leu

Leu 45

Cys

Leu

Glu

GAG

AGG

GAT

TGG

GAC

CCG

GGA

TTG

GCC

ATC

ATC

GAC

AAC

CTC

ATG

CAG

Glu

Arg 50

Asp

Trp

Asp

Pro

Gly 55

Leu

Ala

Ile

Ile

Asp 60

Asn

Leu

Met

Gin

AGC

ATC

AAC

CAA

AGC

AAG

AAA

ACA

GTA

TTT

GTT

TTA

ACC

AAA

AAA

TAT

Ser 65

Ile

Asn

Gin

Ser

Lys 70

Lys

Thr

Val

Phe

Val 75

Leu

Thr

Lys

Lys

Tyr 80

GCA

AAA

AGC

TGG

AAC

TTT

AAA

ACA

GCT

TTT

TAC

TTG

GGC

TTG

CAG

AGG

Ala

Lys

Ser

Trp

Asn 85

Phe

Lys

Thr

Ala

Phe 90

Tyr

Leu

Gly

Leu

Gin 95

Arg

CTA

ATG

GGT

GAG

AAC

ATG

GAT

GTG

ATT

ATA

TTT

ATC

CTG

CTG

GAG

CCA

Leu

Met

Gly

Glu 100

Asn

Met

Asp

Val

Ile 105

Ile

Phe

Ile

Leu

Leu 110

Glu

Pro

GTG

TTA

CAG

CAT

TCT

CCG

TAT

TTG

AGG

CTA

CGG

CAG

CGG

ATC

TGT

AAG

Val

Leu

Gin 115

His

Ser

Pro

Tyr

Leu 120

Arg

Leu

Arg

Gin

Arg 125

Ile

Cys

Lys

AGC

TCC

ATC

CTC

CAG

TGG

CCT

GAC

AAC

CCG

AAG

GCA

GAA

AGG

TTG

TTT

Ser

Ser 130

Ile

Leu

Gin

Trp

Pro 135

Asp

Asn

Pro

Lys

Ala 140

Glu

Arg

Leu

Phe

TGG

CAA

ACT

CTG

AGA

AAT

GTG

GTC

TTG

ACT

GAA

AAT

GAT

TCA

CGG

TAT

144

192

240

288

336

384

432

480 • ·

134

Trp 145	Gin	Thr	Leu	Arg	Asn 150	Val	Val	Leu	Thr	Glu 155	Asn Asp Ser Arg Tyr 160
AAC	AAT	ATG	TAT	GTC	GAT	TCC	ATT	AAG	CAA	TAC	TAACTGACGT TAAGTCATGA
Asn	Asn	Met	Tyr	Val 165	Asp	Ser	Ile	Lys	Gin 170	Tyr

TTTCGCGCCA TAATAAAGAT GCAAAGGAAT GACATTTCCG TATTAGTTAT CTATTGCTAC

GGTAACCAAA TTACTCCCAA AAACCTTACG TCGGTTTCAA AACAACCACA TTCTGCTGGC

CCCACAGTTT TTGAGGGTCA GGAGTCCAGG CCCAGCATAA CTGGGTCTTC TGCTTCAGGG

TGTCTCCAGA GGCTGCAATG TAGGTGTTCA CCAGAGACAT AGGCATCACT GGGGTCACAC

TCCATGTGGT TGTTTTCTGG ATTCAATTCC TCCTGGGCTA TTGGCCAAAG GCTATACTCA

TGTAAGCCAT GCGAGCCTAT CCCACAACGG CAGCTTGCTT CATCAGAGCT AGCAAAAAAG

AGAGGTTGCT AGCAAGATGA AGTCACAATC TTTTGTAATC GAATCAAAAA AGTGATATCT

CATCACTTTG GCCATATTCT ATTTGTTAGA AGTAAACCAC AGGTCCCACC AGCTCCATGG

GAGTGACCAC CTCAGTCCAG GGAAAACAGC TGAAGACCAA GATGGTGAGC TCTGATTGCT

TCAGTTGGTC ATCAACTATT TTCCCTTGAC TGCTGTCCTG GGATGGCCGG CTATCTTGAT

GGATAGATTG TGAATATCAG GAGGCCAGGG ATCACTGTGG ACCATCTTAG CAGTTGACCT

AACACATCTT CTTTTCAATA TCTAAGAACT TTTGCCACTG TGACTAATGG TCCTAATATT

AAGCTGTTGT TTATATTTAT CATATATCTA TGGCTACATG GTTATATTAT GCTGTGGTTG

CGTTCGGTTT TATTTACAGT TGCTTTTACA AATATTTGCT GTAACATTTG ACTTCTAAGG

TTTAGATGCC ATTTAAGAAC TGAGATGGAT AGCTTTTAAA GCATCTTTTA CTTCTTACCA

TTTTTTAAAA GTATGCAGCT AAATTCGAAG CTTTTGGTCT ATATTGTTAA TTGCCATTGC

TGTAAATCTT AAAATGAATG AATAAAAATG TTTCATTTTA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ

AAAA (2) Informace k SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 171 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Gin Ser Leu Ser Thr Ser Gin Thr Phe Tyr Asp Ala Tyr Ile Ser Tyr 1 5 10 15

533

593

653

713

773

833

893

953

1013

1073

1133

1193

1253

1313

1373

1433

1493

1553

1557

Asp Thr Lys Asp Ala Šer Val Thr Asp Trp Val Ile Asn Glu Leu Arg 20 25 30 • ·

135

Tyr

His

Leu 35

Glu

Glu

Ser

Arg

Asp 40

Lys

Asn

Val

Leu

Leu 45

Cys

Leu

Glu

Glu

Arg 50

Asp

Trp

Asp

Pro

Gly 55

Leu

Ala

Ile

Ile

Asp 60

Asn

Leu

Met

Gin

Ser 65

Ile

Asn

Gin

Ser

Lys 70

Lys

Thr

Val

Phe

Val 75

Leu

Thr

Lys

Lys

Tyr 80

Ala

Lys

Ser

Trp

Asn 85

Phe

Lys

Thr

Ala

Phe 90

Tyr

Leu

Gly

Leu

Gin 95

Arg

Leu

Met

Gly

Glu 100

Asn

Met

Asp

Val

Ile 105

Ile

Phe

Ile

Leu

Leu 110

Glu

Pro

Val

Leu

Gin 115

His

Ser

Pro

Tyr

Leu 120

Arg

Leu

Arg

Gin

Arg 125

Ile

Cys

Lys

Ser

Ser 130

Ile

Leu

Gin

Trp

Pro 135

Asp

Asn

Pro

Lys

Ala 140

Glu

Arg

Leu

Phe

Trp 145

Gin

Thr

Leu

Arg

Asn 150

Val

Val

Leu

Thr

Glu 155

Asn

Asp

Ser

Arg

Tyr 160

Asn

Asn

Met

Tyr

Val 165

Asp

Ser

Ile

Lys

Gin 170

Tyr

(2)

Informace

i O

SEQ

ID

NO:

19

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 629 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..486 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: mísc_feature (B) Pozice: 144 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 144 a 225 označený C; může být C nebo T) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

• ·

136

AAT GAA TTG ATC CCC AAT CTA GAG AAG GAA GAT GGT TCT ATC TTG ATT

48

Asn 1

Glu

Leu

Ile

Pro Asn 5

Leu Glu

Lys

Glu 10

Asp

Gly

Ser

Ile

Leu 15

Ile

TGC

CTT

TAT

GAA

AGC

TAC

TTT

GAC

CCT

GGC

AAA

AGC

ATT

AGT

GAA

AAT

96

Cys

Leu

Tyr

Glu

Ser

Tyr

Phe

Asp

Pro

Gly

Lys

Ser

Ile

Ser

Glu

Asn

20

25

30

ATT

GTA

AGC

TTC

ATT

GAG

AAA

AGC

TAT

AAG

TCC

ATC

TTT

GTT

TTG

TCC

144

Ile

Val

Ser

Phe

Ile

Glu

Lys

Ser

Tyr

Lys

Ser

Ile

Phe

Val

Leu

Ser

35

40

45

CCC

AAC

TTT

GTC

CAG

AAT

GAG

TGG

TGC

CAT

TAT

GAA

TTC

TAC

TTT

GCC

192

Pro

Asn

Phe

Val

Gin

Asn

Glu

Trp

Cys

His

Tyr

Glu

Phe

Tyr

Phe

Ala

50

55

60

CAC

CAC

AAT

CTC

TTC

CAT

GAA

AAT

TCT

GAT

CAC

ATA

ATT

CTT

ATC

TTA

240

His

His

Asn

Leu

Phe

His

Glu

Asn

Ser

Asp

His

Ile

Ile

Leu

Ile

Leu

65

•

70

75

80

CTG

GAA

CCC

ATT

CCA

TTC

TAT

TGC

ATT

CCC

ACC

AGG

TAT

CAT

AAA

CTG

288

Leu

Glu

Pro

Ile

Pro

Phe

Tyr

Cys

Ile

Pro

Thr

Arg

Tyr

His

Lys

Leu

85

90

95

GAA

GCT

CTC

CTG

GAA

AAA

AAA

GCA

TAC

TTG

GAA

TGG

CCC

AAG

GAT

AGG

336

Glu

Ala

Leu

Leu

Glu

Lys

Lys

Ala

Tyr

Leu

Glu

Trp

Pro

Lys

Asp

Arg

100

105

110

CGT

AAA

TGT

GGG

CTT

TTC

TGG

GCA

AAC

CTT

CGA

GCT

GCT

GTT

AAT

GTT

384

Arg

Lys

Cys

Gly

Leu

Phe

Trp

Ala

Asn

Leu

Arg

Ala

Ala

Val

Asn

Val

115

120

125

AAT

GTA

TTA

GCC

ACC

AGA

GAA

ATG

TAT

GAA

CTG

CAG

ACA

TTC

ACA

GAG

432

Asn

Val

Leu

Ala

Thr

Arg

Glu

Met

Tyr

Glu

Leu

Gin

Thr

Phe

Thr

Glu

130

135

140

TTA

AAT

GAA

GAG

TCT

CGA

GGT

TCT

ACA

ATC

TCT

CTG

ATG

AGA

ACA

GAC

480

Leu

Asn

Glu

Glu

Ser

Arg

Gly

Ser

Thr

Ile

Ser

Leu

Met

Arg

Thr

Asp

145

150

155

160

TGT CTA TAAAATCCCA CAGTCCTTGG GAAGTTGGGG ACCACATACA CTGTTGGGAT 536

Cys Leu

GTACATTGAT ACAACCTTTA TGATGGCAAT TTGACAATAT TTATTAAAAT AAAAAATGGT 596

TATTCCCTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA

629 • · · ·

	137
(2) Informace k SEQ ID NO: 20: (i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 162 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
Asn Glu Leu Ile Pro Asn Leu 1 5	Glu Lys Glu Asp Gly 10	Ser Ile Leu Ile 15
Cys Leu Tyr Glu Ser Tyr Phe 20	Asp Pro Gly Lys Ser 25	Ile Ser Glu Asn 30
Ile Val Ser Phe Ile Glu Lys 35	Ser Tyr Lys Ser Ile 40	Phe Val Leu Ser 45
Pro Asn Phe Val Gin Asn Glu 50 55	Trp Cys His Tyr Glu 60	Phe Tyr Phe Ala
His His Asn Leu Phe His Glu 65 70	Asn Ser Asp His Ile 75	Ile Leu Ile Leu 80
Leu Glu Pro Ile Pro Phe Tyr 85	Cys Ile Pro Thr Arg 90	Tyr His Lys Leu 95
Glu Ala Leu Leu Glu Lys Lys 100	Ala Tyr Leu Glu Trp 105	Pro Lys Asp Arg 110
Arg Lys Cys Gly Leu Phe Trp 115	Ala Asn Leu Arg Ala 120	Ala Val Asn Val 125
Asn Val Leu Ala Thr Arg Glu 130 135	Met Tyr Glu Leu Gin 140	Thr Phe Thr Glu
Leu Asn Glu Glu Ser Arg Gly 145 150	Ser Thr Ile Ser Leu 155	Met Arg Thr Asp 160

Cys Leu • · · · • · · • · • · • · ·

138

Informace o SEQ ID NO: 21:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 427 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..426

(xi) Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	21:
AAG AAC TCC	AAA	GAA	AAC	CTC	CAG	TTT	CAT	GCT TTT ATT TCA TAT AGT	48
Lys Asn Ser 1	Lys	Glu 5	Asn	Leu	Gin	Phe	His 10	Ala Phe Ile Ser Tyr Ser 15
GAA CAT GAT	TCT	GCC	TGG	GTG	AAA	AGT	GAA	TTG GTA CCT TAC CTA GAA	96
Glu His Asp	Ser 20	Ala	Trp	Val	Lys	Ser 25	Glu	Leu Val Pro Tyr Leu Glu 30
AAA GAA GAT	ATA	CAG	ATT	TGT	CTT	CAT	GAG	AGA AAC TTT GTC CCT GGC	144
Lys Glu Asp 35	Ile	Gin	Ile	Cys	Leu 40	His	Glu	Arg Asn Phe Val Pro Gly 45
AAG AGC ATT	GTG	GAA	AAT	ATC	ATC	TLAČ	TGC	ATT GAG AAG AGT TAC AAG	192
Lys Ser Ile 50	Val	Glu	Asn	Ile 55	Ile	Asn	Cys	Ile Glu Lys Ser Tyr Lys 60
TCC ATC TTT	GTT	TTG	TCT	CCC	AAC	TTT	GTC	CAG AGT GAG TGG TGC CAT	240
Ser Ile Phe 65	Val	Leu	Ser 70	Pro	Asn	Phe	Val	Gin Ser Glu Trp Cys His 75 80
TAC GAA CTC	TAT	TTT	GCC	CAT	CAC	AAT	CTC	TTT CAT GAA GGA TCT AAT	288
Tyr Glu Leu	Tyr	Phe 85	Ala	His	His	Asn	Leu 90	Phe His Glu Gly Ser Asn 95
AAC TTA ATC	CTC	ATC	TTA	CTG	GAA	CCC	ATT	CCA CAG AAC AGC ATT CCC	336
Asn Leu Ile	Leu 100	Ile	Leu	Leu	Glu	Pro 105	Ile	Pro Gin Asn Ser Ile Pro 110
AAC AAG TAC	CAC	AAG	CTG	AAG	GCT	CTC	ATG	ACG CAG CGG ACT TAT TTG	• 384
Asn Lys Tyr 115	His	Lys	Leu	Lys	Ala 120	Leu	Met	Thr Gin Arg Thr Tyr Leu 125
CAG TGG CCC	AAG	GAG	AAA	AGC	AAA	CGT	GGG	CTC TTT TGG GCT	426
Gin Trp Pro 130	Lys	Glu	Lys	Ser 135	Lys	Arg	Gly	Leu Phe Trp Ala 140

427

A

		139
Informace k	SEQ ID NO: 22:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
	(A)	DÉLKA: 142 aminokys
	(B)	TYP: aminokyselina

• · · · • · • « • ·

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

Lys 1

Asn

Ser

Lys

Glu 5

Asn

Leu

Gin

Phe

His 10

Ala

Phe

Ile

Ser

Tyr 15

Ser

Glu

His

Asp

Ser 20

Ala

Trp

Val

Lys

Ser 25

Glu

Leu

Val

Pro

Tyr 30

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp 35

Ile

Gin

Ile

Cys

Leu 40

His

Glu

Arg

Asn

Phe 45

Val

Pro

Gly

Lys

Ser 50

Ile

Val

Glu

Asn

Ile 55

Ile

Asn

Cys

Ile

Glu 60

Lys

Ser

Tyr

Lys

Ser 65

Ile

Phe

Val

Leu

Ser 70

Pro

Asn

Phe

Val

Gin 75

Ser

Glu

Trp

Cys

His 80

Tyr

Glu

Leu

Tyr

Phe 85

Ala

His

His

Asn

Leu 90

Phe

His

Glu

Gly

Ser 95

Asn

Asn

Leu

Ile

Leu 100

Ile

Leu

Leu

Glu

Pro 105

Ile

Pro

Gin

Asn

Ser 110

Ile

Pro

Asn

Lys

Tyr

His

Lys

Leu

Lys

Ala

Leu

Met

Thr

Gin

Arg

Thr

Tyr

Leu

115 120 125

Gin Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala 130 135 140 • ·

140

Informace o	SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 662 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..627 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 54 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotidy 54 a 103 a 345 jsou označen C; každý může být A, C, G nebo T) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

GCT TCC ACC TGT GCC TGG CCT GGC TTC CCT GGC GGG GGC GGC AAA GTG 48

Ala Ser Thr Cys Ala Trp Pro Gly Phe Pro Gly Gly Gly Gly Lys Val

10 15

GGC GAA ATG AGG ATG CCC TGC CCT ACG ATG CCT TCG TGG TCT TCG ACA 96

Gly Glu Met Arg Met Pro Cys Pro Thr Met Pro Ser Trp Ser Ser Thr

25 30

AAA CGC AGA GCG CAG TGG CAG ACT GGG TGT ACA ACG AGC TTC GGG GGC 144

Lys Arg Arg Ala Gin Trp Gin Thr Gly Cys Thr Thr Ser Phe Gly Gly

40 45

AGC TGG AGG AGT GCC GTG GGC GCT GGG CAC TCC GCC TGT GCC TGG AGG 192

Ser Trp Arg Ser Ala Val Gly Ala Gly His Ser Ala Cys Ala Trp Arg

55 60

AAC GCG ACT GGC TGC CTG GCA AAA CCC TCT TTG AGA ACC TGT GGG CCT 240

Asn Ala Thr Gly Cys Leu Ala Lys Pro Ser Leu Arg Thr Cys Gly Pro

70 75 80

CGG TCT ATG GCA GCC GCA AGA CGC TGT TTG TGC TGG CCC ACA CGG ACC 288

Arg Ser Met Ala Ala Ala Arg Arg Cys Leu Cys Trp Pro Thr Arg Thr

90 95

GGG TCA GTG GTC TCT TGC GCG CCA GTT CTC CTG CTG GCC CAG CAG CGC 336

Gly Ser Val Val Ser Cys Ala Pro Val Leu Leu Leu Ala Gin Gin Arg

100 105 110

CTG CTG GAA GAC CGC AAG GAC GTC GTG GTG CTG GTG ATC CTA ACG CCT 384

Leu Leu Glu Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu Val Ile Leu Thr Pro • * · ·

141 > · · ► · · • · · « • · 4

115 120 125

GAC GGC Asp Gly

CAA Gin

GCC Ala

TCC Ser

CGA CTA CCC GAT GCG CTG ACC AGC

GCC TCT GCC Ala Ser Ala

432

Arg Leu 135

Pro

Asp

Ala

Leu

Thr 140

Ser

130

GCC

AGA

GTG

TCC

TCC

TCT GGC

CCC

ACC

AGC

CCA

GTG

GTC

GCG CAG CTT

480

Ala

Arg

Val

Ser

Ser

Ser Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

Val

Val

Ala Gin Leu

145

150

155

160

CTG

AGG

CCA

GCA

TGC

ATG GCC

CTG

ACC

AGG

GAC

AAC

CAC

CAC TTC TAT

528

Leu

Arg

Pro

Ala

Cys

Met Ala·

Leu

Thr

Arg

Asp

Asn

His

His Phe Tyr

165

170

175

AAC

CGG

AAC

TTC

TGC

CAG GGA

ACC

CAC

GGC

CGA

ATA

GCC

GTG AGC CGG

576

Asn

Arg

Asn

Phe

Cys

Gin Gly

Thr

His

Gly

Arg

Ile

Ala

Val Ser Arg

180

185

190

AAT

CCT

GCA

CGG

TGC

CAC CTC

CAC

ACA

CAC

CTA

ACA

TAT

GCC TGC CTG

624

Asn

Pro

Ala

Arg

Cys

His Leu

His

Thr

His

Leu

Thr

Tyr

Ala Cys Leu

195

200

205

662

ATC TGACCAACAC ATGCTCGCCA CCCTCACCAC ACACC Ile • · · · • · · *··· · · · · • · · · · · · · • · · · · · ······

		142
Informace k	SEQ ID NO: 24:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 209 aminokysel
	(B)	TYP: aminokyselina
	(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Ala 1

Ser

Thr

Cys

Ala 5

Trp

Pro

Gly

Phe

Pro 10

Gly

Gly

Gly

Gly

Lys 15

Val

Gly

Glu

Met

Arg 20

Met

Pro

Cys

Pro

Thr 25

Met

Pro

Ser

Trp

Ser 30

Ser

Thr

Lys

Arg

Arg 35

Ala

Gin

Trp

Gin

Thr 40

Gly

Cys

Thr

Thr

Ser 45

Phe

Gly

Gly

Ser

Trp 50

Arg

Ser

Ala

Val

Gly 55

Ala

Gly

His

Ser

Ala 60

Cys

Ala

Trp

Arg

Asn 65

Ala

Thr

Gly

Cys

Leu 70

Ala

Lys

Pro

Ser

Leu 75

Arg

Thr

Cys

Gly

Pro 80

Arg

Ser

Met

Ala

Ala 85

Ala

Arg

Arg

Cys

Leu 90

Cys

Trp

Pro

Thr

Arg 95

Thr

Gly

Ser

Val

Val 100

Ser

Cys

Ala

Pro

Val 105

Leu

Leu

Leu

Ala

Gin 110

Gin

Arg

Leu

Leu

Glu 115

Asp

Arg

Lys

Asp

Val 120

Val

Val

Leu

Val

Ile 125

Leu

Thr

Pro

Asp

Gly 130

Gin

Ala

Ser

Arg

Leu 135

Pro

Asp

Ala

Leu

Thr 140

Ser

Ala

Ser

Ala

Ala 145

Arg

Val

Ser

Ser

Ser 150

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro 155

Val

Val

Ala

Gin

Leu 160

Leu

Arg

Pro

Ala

Cys 165

Met

Ala

Leu

Thr

Arg 170

Asp

Asn

His

His

Phe 175

Tyr

Asn

Arg

Asn

Phe 180

Cys

Gin

Gly

Thr

His 185

Gly

Arg

Ile

Ala

Val 190

Ser

Arg

Asn

Pro

Ala 195

Arg

Cys

His

Leu

His 200

Thr

His

Leu

Thr

Tyr 205

Ala

Cys

Leu

Ile • 4 · ·

143 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4865 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A)	Název/klíč:	CDS
(B)	Pozice: 107	..2617
ZNAKY
(A)	Název/klíč:	mat peptid
(B)	Pozice: 173.	. ..2617
ZNAKY
(A)	Název/klíč:	mise feature
(B)	Pozice: 81
(D)	Jiné informace: (poznámka= nukleotidy	81,
3205	a 3563 jsou	označeny A; každý	může být	A
nebo	T)
ZNAKY
(A)	Název/klíč:	mise feature
(B)	Pozice: 81
(D)	Jiné informace: (poznámka= nukleotidy	81,
3205	a 3563 jsou	označeny A; každý	může být	A,
nebo	T)
ZNAKY
(A)	Název/klíč:	mise feature
(B)	Pozice: 84
(D)	Jiné informace: (poznámka=	nukleotid

je označený C; může být C nebo G) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 739 «·» ·

144 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotidy 739 je označen C; každý může být C nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 3132 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotidy 3132, 3532, 3538 a 3553 jsou označen G; každý může být G nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 3638 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 3638 je označen A; každý může být A nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 3677 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotidy 3677, 3685, 3736 jsou označeny C; každý může být A nebo C) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

AAAATACTCC CTTGCCTCAA AAACTGCTCG GTCAAACGGT GATAGCAAAC CACGCATTCA 60

CAGGGCCACT GCTGCTCACA AAACCAGTGA GGATGATGCC AGGATG ATG TCT GCC 115

Met Ser Ala -22 -20

TCG Ser

CGC Arg

CTG GCT

GGG Gly -15

ACT Thr

CTG Leu

ATC Ile

CCA Pro

GCC Ala -10

ATG Met

GCC Ala

TTC Phe

CTC Leu

TCC Ser -5

TGC Cys

163

Leu

Ala

GTG

AGA

CCA

GAA

AGC

TGG

GAG

CCC

TGC

GTG

GAG

GTT

CCT

AAT

ATT

ACT

211

Val

Arg

Pro

Glu

Ser

Trp

Glu

Pro

Cys

Val

Glu

Val

Pro

Asn

Ile

Thr

1

5

10

TAT

CAA

TGC

ATG

GAG

CTG

AAT

TTC

TAC

AAA

ATC

CCC

GAC

AAC

CTC

CCC

259

Tyr

Gin

Cys

Met

Glu

Leu

Asn

Phe

Tyr

Lys

Ile

Pro

Asp

Asn

Leu

Pro

15

20

25

TTC

TCA

ACC

AAG

AAC

CTG

GAC

CTG

AGC

TTT

AAT

CCC

CTG

AGG

CAT

TTA

307

Phe

Ser

Thr

Lys

Asn

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Pro

Leu

Arg

His

Leu

30

35

40

45

GGC

AGC

TAT

AGC

TTC

TTC

AGT

TTC

CCA

GAA

CTG

CAG

GTG

CTG

GAT

TTA

355

Gly

Ser

Tyr

Ser

Phe

Phe

Ser

Phe

Pro

Glu

Leu

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

50

55

60

TCC

AGG

TGT

GAA

ATC

CAG

ACA

ATT

GAA

GAT

GGG

GCA

TAT

CAG

AGC

CTA

403

Ser

Arg

Cys

Glu

Ile

Gin

Thr

Ile

Glu

Asp

Gly

Ala

Tyr

Gin

Ser

Leu

65

70

75

AGC

CAC

CTC

TCT

ACC

TTA

ATA

TTG

ACA

GGA

AAC

CCC

ATC

CAG

AGT

TTA

451

Ser

His

Leu

Ser

Thr

Leu

Ile

Leu

Thr

Gly

Asn

Pro

Ile

Gin

Ser

Leu

80

85

90

• · · ·

145

GCC Ala

CTG GGA GCC

TTT Phe

TCT Ser

GGA Gly 100

CTA Leu

TCA Ser

AGT Ser

TTA Leu

CAG Gin 105

AAG Lys

CTG Leu

GTG Val

GCT Ala

499

Leu 95

Gly Ala

GTG

GAG

ACA

AAT

CTA

GCA

TCT

CTA

GAG

AAC

TTC

CCC

ATT

GGA

CAT

CTC

547

Val

Glu

Thr

Asn

Leu

Ala

Ser

Leu

Glu

Asn

Phe

Pro

Ile

Gly

His

Leu

110

115

120

125

AAA

ACT

TTG

AAA

GAA

CTT

AAT

GTG

GCT

CAC

AAT

CTT

ATC

CAA

TCT

TTC

595

Lys

Thr

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Val

Ala

His

Asn

Leu

Ile

Gin

Ser

Phe

130

135

140

AAA

TTA

CCT

GAG

TAT

TTT

TCT

AAT

CTG

ACC

AAT

CTA

GAG

CAC

TTG

GAC

643

Lys

Leu

Pro

Glu

Tyr

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr

Asn

Leu

Glu

His

Leu

Asp

145

150

155

CTT

TCC

AGC

AAC

AAG

ATT

CAA

AGT

ATT

TAT

TGC

ACA

GAC

TTG

CGG

GTT

691

Leu

Ser

Ser

Asn

Lys

Ile

Gin

Ser

Ile

Tyr

Cys

Thr

Asp

Leu

Arg

Val

160

165

170

CTA

CAT

CAA

ATG

CCC

CTA

CTC

AAT

CTC

TCT

TTA

GAC

CTG

TCC

CTG

AAC-

739

Leu

His

Gin

Met

Pro

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu

Asn

175

180

185

CCT

ATG

AAC

TTT

ATC

CAA

CCA

GGT

GCA

TTT

AAA

GAA

ATT

AGG

CTT

CAT

787

Pro

Met

Asn

Phe

Ile

Gin

Pro

Gly

Ala

Phe

Lys

Glu

Ile

Arg

Leu

His

190

195

200

205

AAG

CTG

ACT

TTA

AGA

AAT

AAT

TTT

GAT

AGT

TTA

AAT

GTA

ATG

AAA

ACT

835

Lys

Leu

Thr

Leu

Arg

Asn

Asn

Phe

Asp

Ser

Leu

Asn

Val

Met

Lys

Thr

210

215

220

TGT

ATT

CAA

GGT

CTG

GCT

GGT

TTA

GAA

GTC

CAT

CGT

TTG

GTT

CTG

GGA

883

Cys

Ile

Gin

Gly

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Val

His

Arg

Leu

Val

Leu

Gly

225

230

235

GAA

TTT

AGA

AAT

GAA

GGA

AAC

TTG

GAA

AAG

TTT

GAC

AAA

TCT

GCT

CTA

931

Glu

Phe

Arg

Asn

Glu

Gly

Asn

Leu

Glu

Lys

Phe

Asp

Lys

Ser

Ala

Leu

240

245

250

GAG

GGC

CTG

TGC

AAT

TTG

ACC

ATT

GAA

GAA

TTC

CGA

TTA

GCA

TAC

TTA

979

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Leu

Thr

Ile

Glu

Glu

Phe

Arg

Leu

Ala

Tyr

Leu

255

260

265

GAC

TAC

TAC

CTC

GAT

GAT

ATT

ATT

GAC

TTA

TTT

AAT

TGT

TTG

ACA

AAT

1027

Asp

Tyr

Tyr

Leu

Asp

Asp

Ile

Ile

Asp

Leu

Phe

Asn

Cys

Leu

Thr

Asn

270

275

280

285

GTT

TCT

TCA

TTT

TCC

CTG

GTG

AGT

GTG

ACT

ATT

GAA

AGG

GTA

AAA

GAC

1075

Val

Ser

Ser

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Val

Thr

Ile

Glu

Arg

Val

Lys

Asp

290

295

300

TTT

TCT

TAT

AAT

TTC

GGA

TGG

CAA

CAT

TTA

GAA

TTA

GTT

AAC

TGT

AAA

1123

Phe

Ser

Tyr

Asn

Phe

Gly

Trp

Gin

His

Leu

Glu

Leu

Val

Asn

Cys

Lys

305

310

315

TTT

GGA

CAG

TTT

CCC

ACA

TTG

AAA

CTC

AAA

TCT

CTC

AAA

AGG

CTT

ACT

1171

Phe

Gly

Gin

Phe

Pro

Thr

Leu

Lys

Leu

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Thr

320

325

330

TTC

ACT

TCC

AAC

AAA

GGT

GGG

AAT

GCT

TTT

TCA

GAA

GTT

GAT

CTA

CCA

1219

Phe

Thr

Ser

Asn

Lys

Gly

Gly

Asn

Ala

Phe

Ser

Glu

Val

Asp

Leu

Pro

335

340

345

AGC

CTT

GAG

TTT

CTA

GAT

CTC

AGT

AGA

AAT

GGC

TTG

AGT

TTC

AAA

GGT

1267

Ser

Leu

Glu

Phe

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Asn

Gly

Leu

Ser

Phe

Lys

Gly

350

355

360

36.5

• · • · · ·

146

1315

TGC TGT TCT CAA AGT GAT TTT GGG ACA ACC AGC CTA AAG TAT TTA GAT

Cys Cys Ser Gin Ser Asp Phe Gly Thr Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Asp

370 375 380

CTG

AGC

TTC

AAT

GGT

GTT

ATT

ACC

ATG

AGT

TCA

AAC

TTC

TTG

GGC

TTA

1363

Leu

Ser

Phe

Asn

Gly

Val

Ile

Thr

Met

Ser

Ser

Asn

Phe

Leu

Gly

Leu

385

390

395

GAA

CAA

CTA

GAA

CAT

CTG

GAT

TTC

CAG

CAT

TCC

AAT

TTG

AAA

CAA

ATG

1411

Glu

Gin

Leu

Glu

His

Leu

Asp

Phe

Gin

His

Ser

Asn

Leu

Lys

Gin

Met

400

405

410

AGT

GAG

TTT

TCA

GTA

TTC

CTA

TCA

CTC

AGA

AAC

CTC

ATT

TAC

CTT

GAC

1459

Ser

Glu

Phe

Ser

Val

Phe

Leu

Ser

Leu

Arg

Asn

Leu

Ile

Tyr

Leu

Asp

415

420

425

ATT

TCT

CAT

ACT

CAC

ACC

AGA

GTT

GCT

TTC

AAT

GGC

ATC

TTC

AAT

GGC

1507

Ile

Ser

His

Thr

His

Thr

Arg

Val

Ala

Phe

Asn

Gly

Ile

Phe

Asn

Gly

430

435

440

445

TTG

TCC

AGT

CTC

GAA

GTC

TTG

AAA

ATG

GCT

GGC

AAT

TCT

TTC

CAG

GAA

1555

Leu

Ser

Ser

Leu

Glu

Val

Leu

Lys

Met

Ala

Gly

Asn

Ser

Phe

Gin

Glu

450

455

460

AAC

TTC

CTT

CCA

GAT

ATC

TTC

ACA

GAG

CTG

AGA

AAC

TTG

ACC

TTC

CTG

1603

Asn

Phe

Leu

Pro

Asp

Ile

Phe

Thr

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

Thr

Phe

Leu

465

470

475

GAC

CTC

TCT

CAG

TGT

CAA

CTG

GAG

CAG

TTG

TCT

CCA

ACA

GCA

TTT

AAC

1651

Asp

Leu

Ser

Gin

Cys

Gin

Leu

Glu

Gin

Leu

Ser

Pro

Thr

Ala

Phe

Asn

480

485

490

TCA

CTC

TCC

AGT

CTT

CAG

GTA

CTA

AAT

ATG

AGC

CAC

AAC

AAC

TTC

TTT

1699

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Gin

Val

Leu

Asn

Met

Ser

His

Asn

Asn

Phe

Phe

495

500

505

TCA

TTG

GAT

ACG

TTT

CCT

TAT

AAG

TGT

CTG

AAC

TCC

CTC

CAG

GTT

CTT

1747

Ser

Leu

Asp

Thr

Phe

Pro

Tyr

Lys

Cys

Leu

Asn

Ser

Leu

Gin

Val

Leu

510

515

520

525

GAT

TAC

AGT

CTC

AAT

CAC

ATA

ATG

ACT

TCC

AAA

AAA

CAG

GAA

CTA

CAG

1795

Asp

Tyr

Ser

Leu

Asn

His

Ile

Met

Thr

Ser

Lys

Lys

Gin

Glu

Leu

Gin

530

535

540

CAT

TTT

CCA

AGT

AGT

CTA

GCT

TTC

TTA

AAT

CTT

ACT

CAG

AAT

GAC

TTT

1843

His

Phe

Pro

Ser

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Asn

Leu

Thr

Gin

Asn

Asp

Phe

545

550

555

GCT

TGT

ACT

TGT

GAA

CAC

CAG

AGT

TTC

CTG

CAA

TGG

ATC

AAG

GAC

CAG

1891

Ala

Cys

Thr

Cys

Glu

His

Gin

Ser

Phe

Leu

Gin

Trp

Ile

Lys

Asp

Gin

560

565

570

AGG

CAG

CTC

TTG

GTG

GAA

GTT

GAA

CGA

ATG

GAA

TGT

GCA

ACA

CCT

TCA

1939

Arg

Gin

Leu

Leu

Val

Glu

Val

Glu

Arg

Met

Glu

Cys

Ala

Thr

Pro

Ser

575

580

585

GAT

AAG

CAG

GGC

ATG

CCT

GTG

CTG

AGT

TTG

AAT

ATC

ACC

TGT

CAG

ATG

1987

Asp

Lys

Gin

Gly

Met

Pro

Val

Leu

Ser

Leu

Asn

Ile

Thr

Cys

Gin

Met

590

595

600

605

AAT

AAG

ACC

ATC

ATT

GGT

GTG

TCG

GTC

CTC

AGT

GTG

CTT

GTA

GTA

TCT

2035

Asn

Lys

Thr

Ile

Ile

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Ser

Val

Leu

Val

Val

Ser

610

615

620

GTT

GTA

GCA

GTT

CTG

GTC

TAT

AAG

TTC

TAT

TTT

CAC

CTG

ATG

CTT

1 CTT

2083

• · · · • ·

147

Val

Val

Ala

Val 625

Leu

Val

Tyr

Lys

Phe 630

Tyr

Phe

His

Leu

Met 635

Leu

Leu

GCT

GGC

TGC

ATA

AAG

TAT

GGT

AGA

GGT

GAA

AAC

ATC

TAT

GAT

GCC

TTT

2131

Ala

Gly

Cys 640

Ile

Lys

Tyr

Gly

Arg 645

Gly

Glu

Asn

Ile

Tyr 650

Asp

Ala

Phe

GTT

ATC

TAC

TCA

AGC

CAG

GAT

GAG

GAC

TGG

GTA

AGG

AAT

GAG

CTA

GTA

2179

Val

Ile 655

Tyr

Ser

Ser

Gin

Asp 660

Glu

Asp

Trp

Val

Arg 665

Asn

Glu

Leu

Val

AAG

AAT

TTA

GAA

GAA

GGG

GTG

CCT

CCA

TTT

CAG

CTC

TGC

CTT

CAC

TAC

2227

Lys 670

Asn

Leu

Glu

Glu

Gly 675

Val

Pro

Pro

Phe

Gin 680

Leu

Cys

Leu

His

Tyr 685

AGA

GAC

TTT

ATT

CCC

GGT

GTG

GCC

ATT

GCT

GCC

AAC

ATC

ATC

CAT

GAA

2275

Arg

Asp

Phe

Ile

Pro 690

Gly

Val

Ala

Ile

Ala 695

Ala

Asn

Ile

Ile

His 700

Glu

GGT

TTC

CAT

AAA

AGC

CGA

AAG

GTG

ATT

GTT

GTG

GTG

TCC

CAG

CAC

TTC

2323

Gly

Phe

His

Lys 705

Ser

Arg

Lys

Val

Ile 710

Val

Val

Val

Ser

Gin 715

His

Phe

ATC

CAG

AGC

CGC

TGG

TGT

ATC

TTT

GAA

TAT

GAG

ATT

GCT

CAG

ACC

TGG

2371

Ile

Gin

Ser 720

Arg

Trp

Cys

Ile

Phe 725

Glu

Tyr

Glu

Ile

Ala 730

Gin

Thr

Trp

CAG

TTT

CTG

AGC

AGT

CGT

GCT

GGT

ATC

ATC

TTC

ATT

GTC

CTG

CAG

AAG

2419

Gin

Phe 735

Leu

Ser

Ser

Arg

Ala 740

Gly

Ile

Ile

Phe

Ile 745

Val

Leu

Gin

Lys

GTG

GAG

AAG

ACC

CTG

CTC

AGG

CAG

CAG

GTG

GAG

CTG

TAC

CGC

CTT

CTC

2467

Val 750

Glu

Lys

Thr

Leu

Leu 755

Arg

Gin

Gin

Val

Glu 760

Leu

Tyr

Arg

Leu

Leu 765

AGC

AGG

AAC

ACT

TAC

CTG

GAG

TGG

GAG

GAC

AGT

GTC

CTG

GGG

CGG

CAC

2515

Ser

Arg

Asn

Thr

Tyr 770

Leu

Glu

Trp

Glu

Asp 775

Ser

Val

Leu

Gly

Arg 780

His

ATC

TTC

TGG

AGA

CGA

CTC

AGA

AAA

GCC

CTG

CTG

GAT

GGT

AAA

TCA

TGG

2563

Ile

Phe

Trp

Arg 785

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala 790

Leu

Leu

Asp

Gly

Lys 795

Ser

Trp

AAT

CCA

GAA

GGA

ACA

GTG

GGT

ACA

GGA

TGC

AAT

TGG

CAG

GAA

GCA

ACA

2611

Asn

Pro

Glu 800

Gly

Thr

Val

Gly

Thr 805

Gly

Cys

Asn

Trp

Gin 810

Glu

Ala

Thr

TCT ATC TGAAGAGGAA AAATAAAAAC CTCCTGAGGC ATTTCTTGCC CAGCTGGGTC 2667

Ser Ile

815

CAACACTTGT TCAGTTAATA AGTATTAAAT GCTGCCACAT GTCAGGCCTT ATGCTAAGGG 2727

TGAGTAATTC CATGGTGCAC TAGATATGCA GGGCTGCTAA TCTCAAGGAG CTTCCAGTGC 2787

AGAGGGAATA AATGCTAGAC TAAAATACAG AGTCTTCCAG GTGGGCATTT CAACCAACTC 2847

AGTCAAGGAA CCCATGACAA AGAAAGTCAT TTCAACTCTT ACCTCATCAA GTTGAATAAA 2907

GACAGAGAAA ACAGAAAGAG ACATTGTTCT TTTCCTGAGT CTTTTGAATG GAAATTGTAT 2967

148

TATGTTATAG	CCATCATAAA	ACCATTTTGG	TAGTTTTGAC	TGAACTGGGT	GTTCACTTTT	3027
TCCTTTTTGA	TTGAATACAA	TTTAAATTCT	ACTTGATGAC	TGCAGTCGTC	AAGGGGCTCC	3087
TGATGCAAGA	TGCCCCTTCC	ATTTTAAGTC	TGTCTCCTTA	CAGAGGTTAA	AGTCTAATGG	3147
CTAATTCCTA	AGGAAACCTG	ATTAACACAT	GCTCACAACC	ATCCTGGTCA	TTCTCGAACA	3207
TGTTCTATTT	TTTAACTAAT	CACCCCTGAT	atatttttat	TTTTATATAT	CCAGTTTTCA	3267
TTTTTTTACG	TCTTGCCTAT	AAGCTAATAT	CATAAATAAG	gttgtttaag	ACGTGCTTCA	3327
AATATCCATA	TTAACCACTA	TTTTTCAAGG	AAGTATGGAA	AAGTACACTC	TGTCACTTTG	3387
TCACTCGATG	TCATTCCAAA	GTTATTGCCT	ACTAAGTAAT	GACTGTCATG	AAAGCAGCAT	3447
TGAAATAATT	TGTTTAAAGG	GGGCACTCTT	TTAAACGGGA	AGAAAATTTC	CGCTTCCTGG	3507
TCTTATCATG	GACAATTTGG	GCTAGAGGCA	GGAAGGAAGT	GGGATGACCT	CAGGAAGTCA	3567
CCTTTTCTTG	ATTCCAGAAA	CATATGGGCT	GATAAACCCG	GGGTGACCTC	ATGAAATGAG	3627
TTGCAGCAGA	AGTTTATTTT	TTTCAGAACA	AGTGATGTTT	GATGGACCTC	TGAATCTCTT	3687
TAGGGAGACA	CAGATGGCTG	GGATCCCTCC	CCTGTACCCT	TCTCACTGCC	AGGAGAACTA	3747
CGTGTGAAGG	TATTCAAGGC	AGGGAGTATA	CATTGCTGTT	TCCTGTTGGG	CAATGCTCCT	3807
TGACCACATT	TTGGGAAGAG	TGGATGTTAT	CATTGAGAAA	ACAATGTGTC	TGGAATTAAT	3867
GGGGTTCTTA	TAAAGAAGGT	TCCCAGAAAA	GAATGTTCAT	TCCAGCTTCT	TCAGGAAACA	3927
GGAACATTCA	AGGAAAAGGA	CAATCAGGAT	GTCATCAGGG	AAATGAAAAT	AAAAACCACA	3987
ATGAGATATC	ACCTTATACC	AGGTAGATGG	CTACTATAAA	AAAATGAAGT	GTCATCAAGG	4047
ATATAGAGAA	ATTGGAACCC	TTCTTCACTG	CTGGAGGGAA	TGGAAAATGG	TGTAGCCGTT	4107
ATGAAAAACA	GTACGGAGGT	TTCTCAAAAA	TTAAAAATAG	AACTGCTATA	TGATCCAGCA	4167
atctcacttc	TGTATATATA	CCCAAAATAA	TTGAAATCAG	AATTTCAAGA	AAATATTTAC	• 4227
ACTCCCATGT	TCATTGTGGC	ACTCTTCACA	ATCACTGTTT	CCAAAGTTAT	GGAAACAACC	4287
CAAATTTCCA	TTGGAAAATA	AATGGACAAA	GGAAATGTGC	ATATAACGTA	CAATGGGGAT	4347
ATTATTCAGC	CTAAAAAAAG	GGGGGATCCT	GTTATTTATG	ACAACATGAA	TAAACCCGGA	4407
GGCCATTATG	CTATGTAAAA	TGAGCAAGTA	ACAGAAAGAC	AAATACTGCC	TGATTTCATT	4467
TATATGAGGT	TCTAAAATAG	TCAAACTCAT	AGAAGCAGAG	AATAGAACAG	TGGTTCCTAG	4527
GGAAAAGGAG	GAAGGGAGAA	ATGAGGAAAT	AGGGAGTTGT	CTAATTGGTA	TAAAATTATA	4587
GTATGCAAGA	TGAATTAGCT	CTAAAGATCA	GCTGTATAGC	AGAGTTCGTA	TAATGAACAA	4647
TACTGTATTA	TGCACTTAAC	ATTTTGTTAA	GAGGGTACCT	CTCATGTTAA	GTGTTCTTAC	4707
CATATACATA	TACACAAGGA	AGCTTTTGGA	GGTGATGGAT	ATATTTATTA	CCTTGATTGT	4767
GGTGATGGTT	TGACAGGTAT	GTGACTATGT	CTAAACTCAT	CAAATTGTAT	ACATTAAATA	4827
TATGCAGTTT	TATAATATCA	aaaaaaaaaa	aaaaaaaa			4865

149

2) Informace k SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 837 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

(

xi)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

26:

Met

Ser

Ala

Ser

Arg

Leu

Ala

Gly

Thr

Leu

Ile

Pro

Ala

Met

Ala

Phe

-22

-20

-15

-10

Leu

Ser

Cys

Val

Arg

Pro

Glu

Ser

Trp

Glu

Pro

Cys

Val

Glu

Val

Pro

-5

1

5

10

Asn

Ile

Thr

Tyr

Gin

Cys

Met

Glu

Leu

Asn

Phe

Tyr

Lys

Ile

Pro

Asp

15

20

25

Asn

Leu

Pro

Phe

Ser

Thr

Lys

Asn

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Pro

Leu

30

35

40

Arg

His

Leu

Gly

Ser

Tyr

Ser

Phe

Phe

Ser

Phe

Pro

Glu

Leu

Gin

Val

45

50

55

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Cys

Glu

Ile

Gin

Thr

Ile

Glu

Asp

Gly

Ala

Tyr

60

65

70

Gin

Ser

Leu

Ser

His

Leu

Ser

Thr

Leu

Ile

Leu

Thr

Gly

Asn

Pro

Ile

75

80

85

90

Gin

Ser

Leu

Ala

Leu

Gly

Ala

Phe

Ser

Gly

Leu

Ser

Ser

Leu

Gin

Lys

95

100

105

Leu

Val

Ala

Val

Glu

Thr

Asn

Leu

Ala

Ser

Leu

Glu

Asn

Phe

Pro

Ile

110

115

120

Gly

His

Leu

Lys

Thr

Leu

Lys

Glu

Leu

Asn

Val

Ala

His

Asn

Leu

Ile

125

130

135

Gin

Ser

Phe

Lys

Leu

Pro

Glu

Tyr

Phe

Ser

Asn

Leu

Thr

Asn

Leu

Glu

140

145

150

His

Leu

Asp

Leu

Ser

Ser

Asn

Lys

Ile

Gin

Ser

Ile

Tyr

Cys

Thr

Asp

155

160

165

170

Leu

Arg

Val

Leu

His

Gin

Met

Pro

Leu

Leu

Asn

Leu

Ser

Leu

Asp

Leu

175

180

185

Ser

Leu

Asn

Pro

Met

Asn

Phe

Ile

Gin

Pro

Gly

Ala

Phe

Lys

Glu

Ile

190

195

200

Arg

Leu

His

Lys

Leu

Thr

Leu

Arg

Asn

Asn

Phe

Asp

Ser

Leu

Asn

Val

205

210

215

Met Lys Thr Cys Ile Gin Gly Leu Ala Gly Leu Glu Val His Arg Leu * · · · • · · ’ • · · · · ' • 4

150

220

225

230

Val

Leu

Gly

Glu

Phe

Arg

Asn

Glu

Gly

Asn

Leu

Glu

Lys

Phe

Asp

Lys

235

240

245

250

Ser

Ala

Leu

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Leu

Thr

Ile

Glu

Glu

Phe

Arg

Leu

255

260

265

Ala

Tyr

Leu

Asp

Tyr

Tyr

Leu

Asp

Asp

Ile

Ile

Asp

Leu

Phe

Asn

Cys

270

275

280

Leu

Thr

Asn

Val

Ser

Ser

Phe

Ser

Leu

Val

Ser

Val

Thr

Ile

Glu

Arg

285

290

295

Val

Lys

Asp

Phe

Ser

Tyr

Asn

Phe

Gly

Trp

Gin

His

Leu

Glu

Leu

Val

300

305

310

Asn

Cys

Lys

Phe

Gly

Gin

Phe

Pro

Thr

Leu

Lys

Leu

Lys

Ser

Leu

Lys

315

320

325

330

Arg

Leu

Thr

Phe

Thr

Ser

Asn

Lys

Gly

Gly

Asn

Ala

Phe

Ser

Glu

Val

335

340

345

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Glu

Phe

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Asn

Gly

Leu

Ser

350

355

360

Phe

Lys

Gly

Cys

Cys

Ser

Gin

Ser

Asp

Phe

Gly

Thr

Thr

Ser

Leu

Lys

365

370

375

Tyr

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asn

Gly

Val

Ile

Thr

Met

Ser

Ser

Asn

Phe

380

385

390

Leu

Gly

Leu

Glu

Gin

Leu

Glu

His

Leu

Asp

Phe

Gin

His

Ser

Asn

Leu

395

400

405

410

Lys

Gin

Met

Ser

Glu

Phe

Ser

Val

Phe

Leu

Ser

Leu

Arg

Asn

Leu

Ile

415

420

425

Tyr

Leu

Asp

Ile

Ser

His

Thr

His

Thr

Arg

Val

Ala

Phe

Asn

Gly

Ile

430

435

440

Phe

Asn

Gly

Leu

Ser

Ser

Leu

Glu

Val

Leu

Lys

Met

Ala

Gly

Asn

Ser

445

450

455

Phe

Gin

Glu

Asn

Phe

Leu

Pro

Asp

Ile

Phe

Thr

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

460

465

470

Thr

Phe

Leu

Asp

Leu

Ser

Gin

Cys

Gin

Leu

Glu

Gin

Leu

Ser

Pro

Thr

475

480

485

490

Ala

Phe

Asn

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Gin

Val

Leu

Asn

Met

Ser

His

Asn

495

500

505

Asn

Phe

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Phe

Pro

Tyr

Lys

Cys

Leu

Asn

Ser

Leu

510

515

520

Gin

Val

Leu

Asp

Tyr

Ser

Leu

Asn

His

Ile

Met

Thr

Ser

Lys

Lys

Gin

525 530 535

Glu Leu Gin His Phe Pro Ser Ser Leu Ala Phe Leu Asn Leu Thr Gin 540 545 550 • ·

151

Asn Asp 555

Phe Ala Cys

Thr Cys Glu His Gin Ser Phe

Leu

Gin

Trp

Ile 570

560

565

Lys

Asp

Gin

Arg

Gin

Leu

Leu

Val

Glu

Val

Glu

Arg

Met

Glu

Cys

Ala

575

580

585

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Gin

Gly

Met

Pro

Val

Leu

Ser

Leu

Asn

Ile

Thr

590

595

600

Cys

Gin

Met

Asn

Lys

Thr

Ile

Ile

Gly

Val

Ser

Val

Leu

Ser

Val

Leu

605

610

615

Val

Val

Ser

Val

Val

Ala

Val

Leu

Val

Tyr

Lys

Phe

Tyr

Phe

His

Leu

620

625

630

Met

Leu

Leu

Ala

Gly

Cys

Ile

Lys

Tyr

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Ile

Tyr

635

640

645

650

Asp

Ala

Phe

Val

Ile

Tyr

Ser

Ser

Gin

Asp

Glu

Asp

Trp

Val

Arg

Asn

655

660

665

Glu

Leu

Val

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

Gly

Val

Pro

Pro

Phe

Gin

Leu

Cys

670

675

680

Leu

His

Tyr

Arg

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Val

Ala

Ile

Ala

Ala

Asn

Ile

685

690

695

Ile

His

Glu

Gly

Phe

His

Lys

Ser

Arg

Lys

Val

Ile

Val

Val

Val

Ser

700

705

710

Gin

His

Phe

Ile

Gin

Ser

Arg

Trp

Cys

Ile

Phe

Glu

Tyr

Glu

Ile

Ala

715

720

725

730

Gin

Thr

Trp

Gin

Phe

Leu

Ser

Ser

Arg

Ala

Gly

Ile

Ile

Phe

Ile

Val

735

740

745

Leu

Gin

Lys

Val

Glu

Lys

Thr

Leu

Leu

Arg

Gin

Gin

Val

Glu

Leu

Tyr

750

755

760

Arg

Leu

Leu

Ser

Arg

Asn

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Glu

Asp

Ser

Val

Leu

765

770

775

Gly

Arg

His

Ile

Phe

Trp

Arg

Arg

Leu

Arg

Lys

Ala

Leu

Leu

Asp

Gly

780

785

790

Lys

Ser

Trp

Asn

Pro

Glu

Gly

Thr

Val

Gly

Thr

Gly

Cys

Asn

Trp

Gin

795

800

805

810

Glu

Ala

Thr

Ser

Ile

815 • · · ·

152 ...........

(2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 300 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..300 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 186 (D) Jiné informace: (poznámka^ nukleotidy 186, 196,

217, 276 a 300 jsou označeny C; každý může být A, C, G nebo T) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

TCC Ser 1

TAT Tyr

TCT ATG GAA

AAA GAT GCT

TTC CTA

TTT Phe

ATG Met

AGA Arg

AAT TTG AAG Asn Leu Lys 15

48

Ser

Met

Glu 5

Lys

Asp Ala

Phe

Leu 10

GTT

CTC

TCA

CTA

AAA

GAT

AAC

AAT

GTC

ACA

GCT

GTC

CCC

ACC

ACT

TTG

96

Val

Leu

Ser

Leu

Lys

Asp

Asn

Asn

Val

Thr

Ala

Val

Pro

Thr

Thr

Leu

20

25

30

CCA

CCT

AAT

TTA

CTA

GAG

CTC

TAT

CTT

TAT

AAC

ÁAT

ATC

ATT

AAG

AAA

144

Pro

Pro

Asn

Leu

Leu

Glu

Leu

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asn

Ile

Ile

Lys

Lys

35

40

45

ATC

CAA

GAA

AAT

GAT

TTC

AAT

AAC

CTC

AAT

GAG

TTG

CAA

GTC

CTT

GAC

192

Ile

Gin

Glu

Asn

Asp

Phe

Asn

Asn

Leu

Asn

Glu

Leu

Gin

Val

Leu

Asp

50

55

60

CTA

CGT

GGA

AAT

TGC

CCT

CGA

TGT

CAT

AAT

GTC

CCA

TAT

CCG

TGT

ACA

240

Leu

Arg

Gly

Asn

Cys

Pro

Arg

Cys

His

Asn

Val

Pro

Tyr

Pro

Cys

Thr

65

70

75

80

CCG

TGT

GAA

AAT

AAT

TCC

CCC

TTA

CAG

ATC

CAT

GAC

AAT

GCT

TTC

AAT

288

Pro

Cys

Glu

Asn

Asn

Ser

Pro

Leu

Gin

Ile

His

Asp

Asn

Ala

Phe

Asn

90 95

TCA TCG ACA GAC Ser Ser Thr Asp

100 • · · · • ·

	153
Informace	k SEQ ID NO: 28:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 100 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: protein

	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	28:
Ser 1	Tyr	Ser Met	Glu Lys Asp 5	Ala	Phe	Leu 10	Phe Met Arg Asn Leu Lys 15
Val	Leu	Ser Leu 20	Lys Asp Asn	Asn	Val 25	Thr	Ala Val Pro Thr Thr Leu 30
Pro	Pro	Asn Leu 35	Leu Glu Leu	Tyr 40	Leu	Tyr	Asn Asn Ile Ile Lys Lys 45
Ile	Gin 50	Glu Asn	Asp Phe Asn 55	Asn	Leu	Asn	Glu Leu Gin Val Leu Asp 60
Leu 65	Arg	Gly Asn	Cys Pro Arg 70	Cys	His	Asn	Val Pro Tyr Pro Cys Thr 75 80
Pro	Cys	Glu Asn	Asn Ser Pro 85	Leu	Gin	Ile 90	His Asp Asn Ala Phe Asn 95

Ser Ser Thr Asp 100 (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1756 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina

154 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězeová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..1182 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1643 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 1643 je označen A; může být A nebo G) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1664 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 1664 je označen C; může být A, C, G nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1680 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotidy 1680 a 1735 jsou označeny G; každý může být G nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1719 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 1719 je označen C; může být C nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1727 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 1727 je označen A; může být A, G nebo T) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

• ·

155

TCT Ser 1

CCA Pro

GAA Glu

ATT CCC

TGG AAT TCC TTG CCT CCT GAG

GTT Val

TTT Phe

GAG Glu 15

GGT Gly

48

Ile

Pro 5

Trp Asn

Ser Leu

Pro 10

Pro

Glu

ATG

CCG

CCA

AAT

CTA

AAG

AAT

CTC

TCC

TTG

GCC

AAA

AAT

GGG

CTC

AAA

96

Met

Pro

Pro

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ala

Lys

Asn

Gly

Leu

Lys

20

25

30

TCT

TTC

TTT

TGG

GAC

AGA

CTC

CAG

TTA

CTG

AAG

CAT

TTG

GAA

ATT

TTG

144

Ser

Phe

Phe

Trp

Asp

Arg

Leu

Gin

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Glu

Ile

Leu

35

40

45

GAC

CTC

AGC

CAT

AAC

CAG

CTG

ACA

AAA

GTA

CCT

GAG

AGA

TTG

GCC

AAC

192

Asp

Leu

Ser

His

Asn

Gin

Leu

Thr

Lys

Val

Pro

Glu

Arg

Leu

Ala

Asn

50

55

60

TGT

TCC

AAA

AGT

CTC

ACA

ACA

CTG

ATT

CTT

AAG

CAT

AAT

CAA

ATC

AGG

240

Cys

Ser

Lys

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu

Ile

Leu

Lys

His

Asn

Gin

Ile

Arg

65

70

75

80

CAA

TTG

ACA

AAA

TAT

TTT

CTA

GAA

GAT

GCT

TTG

CAA

TTG

CGC

TAT

CTA

288

Gin

Leu

Thr

Lys

Tyr

Phe

Leu

Glu

Asp

Ala

Leu

Gin

Leu

Arg

Tyr

Leu

85

90

95

GAC

ATC

AGT

TCA

AAT

AAA

ATC

CAG

GTC

ATT

CAG

AAG

ACT

AGC

TTC

CCA

336

Asp

Ile

Ser

Ser

Asn

Lys

Ile

Gin

Val

Ile

Gin

Lys

Thr

Ser

Phe

Pro

100

105

110

GAA

AAT

GTC

CTC

AAC

AAT

CTG

GAG

ATG

TTG

GTT

TTA

CAT

CAC

AAT

CGC

384

Glu

Asn

Val

Leu

Asn

Asn

Leu

Glu

Met

Leu

Val

Leu

His

His

Asn

Arg

115

120

125

TTT

CTT

TGC

AAC

TGT

GAT

GCT

GTG

TGG

TTT

GTC

TGG

TGG

GTT

AAC

CAT

432

Phe

Leu

Cys

Asn

Cys

Asp

Ala

Val

Trp

Phe

Val

Trp

Trp

Val

Asn

His

130

135

140

ACA

GAT

GTT

ACT

ATT

CCA

TAC

CTG

GCC

ACT

GAT

GTG

ACT

TGT

GTA

GGT

480

Thr

Asp

Val

Thr

Ile

Pro

Tyr

Leu

Ala

Thr

Asp

Val

Thr

Cys

Val

Gly

145

150

155

160

CCA

GGA

GCA

CAC

AAA

GGT

CAA

AGT

GTC

ATA

TCC

CTT

GAT

CTG

TAT

ACG

528

Pro

Gly

Ala

His

Lys

Gly

Gin

Ser

Val

Ile

Ser

Leu

Asp

Leu

Tyr

Thr

165

170

175

TGT

GAG

TTA

GAT

CTC

ACA

AAC

CTG

ATT

CTG

TTC

TCA

GTT

TCC

ATA

TCA

576

Cys

Glu

Leu

Asp

Leu

Thr

Asn

Leu

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Ser

Ile

Ser

180

185

190

TCA

GTC

CTC

TTT

CTT

ATG

GTA

GTT

ATG

ACA

ACA

AGT

CAC

CTC

TTT

TTC

624

Ser

Val

Leu

Phe

Leu

Met

Val

Val

Met

Thr

Thr

Ser

His

Leu

Phe

Phe

195

200

205

TGG

GAT

ATG

TGG

TAC

ATT

TAT

TAT

TTT

TGG

AAA

GCA

AAG

ATA

AAG

GGG

672

Trp

Asp

Met

Trp

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Trp

Lys

Ala

Lys

Ile

Lys

Gly

210

215

220

TAT

CCA

GCA

TCT

GCA

ATC

CCA

TGG

AGT

CCT

TGT

TAT

GAT

GCT

TTT

ATT

720

Tyr

Pro

Ala

Ser

Ala

Ile

Pro

Trp

Ser

Pro

Cys

Tyr

Asp

Ala

Phe

Ile

225

230

235

240

156 • »

GTG TAT GAC ACT AAA

AAC TCA Asn Ser

GCT GTG ACA GAA TGG

GTT Val

TTG CAG Leu Gin 255

GAG Glu

768

Val

Tyr Asp Thr

Lys 245

Ala

Val

Thr Glu 250

Trp

CTG

GTG

GCA

AAA

TTG

GAA

GAT

CCA

AGA

GAA

AAA

CAC

TTC

AAT

TTG

TGT

816

Leu

Val

Ala

Lys

Leu

Glu

Asp

Pro

Arg

Glu

Lys

His

Phe

Asn

Leu

Cys

260

265

270

CTA

GAA

GAA

AGA

GAC

TGG

CTA

CCA

GGA

CAG

CCA

GTT

CTA

GAA

AAC

CTT.

864

Leu

Glu

Glu

Arg

Asp

Trp

Leu

Pro

Gly

Gin

Pro

Val

Leu

Glu

Asn

Leu

275

280

285

TCC

CAG

AGC

ATA

CAG

CTC

AGC

AAA

AAG

ACA

GTG

TTT

GTG

ATG

ACA

CAG

912

Ser

Gin

Ser

Ile

Gin

Leu

Ser

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Met

Thr

Gin

290

295

300

AAA

TAT

GCT

AAG

ACT

GAG

AGT

TTT

AAG

ATG

GCA

TTT

TAT

TTG

TCT

CAT

960

Lys

Tyr

Ala

Lys

Thr

Glu

Ser

Phe

Lys

Met

Ala

Phe

Tyr

Leu

Ser

His

305

310

315

320

CAG

AGG

CTC

CTG

GAT

GAA

AAA

GTG

GAT

GTG

ATT

ATC

TTG

ATA

TTC

TTG

' 1008

Gin

Arg

Leu

Leu

Asp

Glu

Lys

Val

Asp

Val

Ile

Ile

Leu

Ile

Phe

Leu

325

330

335

GAA

AGA

CCT

CTT

CAG

AAG

TCT

AAG

TTT

CTT

CAG

CTC

AGG

AAG

AGA

CTC

1056

Glu

Arg

Pro

Leu

Gin

Lys

Ser

Lys

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Lys

Arg

Leu

340

345

350

TGC

AGG

AGC

TCT

GTC

CTT

GAG

TGG

CCT

GCA

AAT

CCA

CAG

GCT

CAC

CCA

1104

Cys

Arg

Ser

Ser

Val

Leu

Glu

Trp

Pro

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

His

Pro

355

360

365

TAC

TTC

TGG

CAG

TGC

CTG

AAA

AAT

GCC

CTG

ACC

ACA

GAC

AAT

CAT

GTG

1152

Tyr

Phe

Trp

Gin

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Thr

Thr

Asp

Asn

His

Val

370

375

380

GCT

TAT

AGT

CAA

ATG

TTC

AAG

GAA

ACA

GTC

TAGCTCTCTG AAGAATGTCA

1202

Ala

Tyr

Ser

Gin

Met

Phe

Lys

Glu

Thr

Val

385 390

CCACCTAGGA	CATGCCTTGG	TACCTGAAGT	TTTCATAAAG	GTTTCCATAA	ATGAAGGTCT	1262
GAATTTTTCC	TAACAGTTGT	CATGGCTCAG	ATTGGTGGGA	AATCATCAAT	ATATGGCTAA	1322
GAAATTAAGA	AGGGGAGACT	GATAGAAGAT	AATTTCTTTC	TTCATGTGCC	ATGCTCAGTT	1382
AAATATTTCC	CCTAGCTCAA	ATCTGAAAAA	CTGTGCCTAG	GAGACAACAC	AAGGCTTTGA	1442
TTTATCTGCA	TACAATTGAT	AAGAGCCACA	CATCTGCCCT	GAAGAAGTAC	TAGTAGTTTT	1502
AGTAGTAGGG	TAAAAATTAC	ACAAGCTTTC	TCTCTCTCTG	ATACTGAACT	GTACCAGAGT	1562
TCAATGAAAT	AAAAGCCCAG	AGAACTTCTC	AGTAAATGGT	TTCATTATCA	TGTAGTATCC	1622
ACCATGCAAT	ATGCCACAAA	ACCGCTACTG	GTACAGGACA	GCTGGTAGCT	GCTTCAAGGC	1682
CTCTTATCAT	TTTCTTGGGG	CCCATGGAGG	GGTTCTCTGG	GAAAAAGGGA	AGGTTTTTTT	1742

TGGCCATCCA TGAA

1756

2) Informace k SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 349 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

Ser 1

Pro Glu

Ile

Pro Trp Asn Ser 5

Leu

Pro 10

Pro

Glu

Val

Phe

Glu 15

Gly

Met

Pro

Pro

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ala

Lys

Asn

Gly

Leu

Lys

20

25

30

Ser

Phe

Phe

Trp

Asp

Arg

Leu

Gin

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Glu

Ile

Leu

35

40

45

Asp

Leu

Ser

His

Asn

Gin

Leu

Thr

Lys

Val

Pro

Glu

Arg

Leu

Ala

Asn

50

55

60

Cys

Ser

Lys

Ser

Leu

Thr

Thr

Leu

Ile

Leu

Lys

His

Asn

Gin

Ile

Arg

65

70

75

80

Gin

Leu

Thr

Lys

Tyr

Phe

Leu

Glu

Asp

Ala

Leu

Gin

Leu

Arg

Tyr

Leu

85

90

95

Asp

Ile

Ser

Ser

Asn

Lys

Ile

Gin

Val

Ile

Gin

Lys

Thr

Ser

Phe

Pro

100

105

110

Glu

Asn

Val

Leu

Asn

Asn

Leu

Glu

Met

Leu

Val

Leu

His

His

Asn

Arg

115

120

125

Phe

Leu

Cys

Asn

Cys

Asp

Ala

Val

Trp

Phe

Val

Trp

Trp

Val

Asn

His

130

135

140

Thr

Asp

Val

Thr

Ile

Pro

Tyr

Leu

Ala

Thr

Asp

Val

Thr

Cys

Val

Gly

145

150

155

160

Pro

Gly

Ala

His

Lys

Gly

Gin

Ser

Val

Ile

Ser

Leu

Asp

Leu

Tyr

Thr

165

170

175

Cys

Glu

Leu

Asp

Leu

Thr

Asn

Leu

Ile

Leu

Phe

Ser

Val

Ser

Ile

Ser

180

185

190

Ser

Val

Leu

Phe

Leu

Met

Val

Val

Met

Thr

Thr

Ser

His

Leu

Phe

Phe

195

200

205

Trp

Asp

Met

Trp

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Trp

Lys

Ala

Lys

Ile

Lys

Gly

210

215

220

Tyr

Pro

Ala

Ser

Ala

Ile

Pro

Trp

Ser

Pro

Cys

Tyr

Asp

Ala

Phe

Ile

225

230

235

240

Val

Tyr

Asp

Thr

Lys

Asn

Ser

Ala

Val

Thr

Glu

Trp

Val

Leu

Gin

Glu

Leu Val Ala Lys Leu Glu Asp Pro Arg Glu Lys His Phe Asn Leu Cys

245 250 255 • · » ·

158

260

265

270

Leu

Glu

Glu

Arg

Asp

Trp

Leu

Pro

Gly

Gin

Pro

Val

Leu

Glu

Asn

Leu

275

280

285

Ser

Gin

Ser

Ile

Gin

Leu

Ser

Lys

Lys

Thr

Val

Phe

Val

Met

Thr

Gin

290

295

300

Lys

Tyr

Ala

Lys

Thr

Glu

Ser

Phe

Lys

Met

Ala

Phe

Tyr

Leu

Ser

His

305

310

315

320-

Gin

Arg

Leu

Leu

Asp

Glu

Lys

Val

Asp

Val

Ile

Ile

Leu

Ile

Phe

Leu

325

330

335

Glu

Arg

Pro

Leu

Gin

Lys

Ser

Lys

Phe

Leu

Gin

Leu

Arg

Lys

Arg

Leu

340

345

350

Cys

Arg

Ser

Ser

Val

Leu

Glu

Trp

Pro

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

His

Pro

355

360

365

Tyr

Phe

Trp

Gin

Cys

Leu

Lys

Asn

Ala

Leu

Thr

Thr

Asp

Asn

His

Val

370

375

380

Ala

Tyr

Ser

Gin

Met

Phe

Lys

Glu

Thr

Val

385

390

(2) Informace o SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 999 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 2 ..847 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 4 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotid 4 a 23 je označen C; každý může být A, C, G nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 650 • · (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotidy 715, 825 a

845 jsou označeny C; každý může být C nebo T) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

C TCC GAT GCC AAG ATT CGG CAC CAG GCA TAT TCA GAG GTC ATG ATG 46

Ser Asp Ala Lys Ile Arg His Gin Ala Tyr Ser Glu Val Met Met

10 15

GTT GGA TGG

TCA GAT TCA TAC ACC TGT GAA TAC CCT TTA AAC CTA AGG

94

Val

Gly Trp

Ser

Asp 20

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu 25

Tyr

Pro

Leu

Asn

Leu 30

Arg

GGA

ACT

AGG

TTA

AAA

GAC

GTT

CAT

CTC

CAC

GAA

TTA

TCT

TGC

AAC

ACA

142

Gly

Thr

Arg

Leu

Lys

Asp

Val

His

Leu

His

Glu

Leu

Ser

Cys

Asn

Thr

35

40

45

GCT

CTG

TTG

ATT

GTC

ACC

ATT

GTG

GTT

ATT

ATG

CTA

GTT

CTG

GGG

TTG

190

Ala

Leu

Leu

Ile

Val

Thr

Ile

Val

Val

Ile

Met

Leu

Val

Leu

Gly

Leu

50

55

60

GCT

GTG

GCC

TTC

TGC

TGT

CTC

CAC

TTT

GAT

CTG

CCC

TGG

TAT

CTC

AGG

238

Ala

Val

Ala

Phe

Cys

Cys

Leu

His

Phe

Asp

Leu

Pro

Trp

Tyr

Leu

Arg

65

70

75

ATG

CTA

GGT

CAA

TGC

ACA

CAA

ACA

TGG

CAC

AGG

GTT

AGG

AAA

ACA

ACC

286

Met

Leu

Gly

Gin

Cys

Thr

Gin

Thr

Trp

His

Arg

Val

Arg

Lys

Thr

Thr

80

85

90

95

CAA

GAA

CAA

CTC

AAG

AGA

AAT

GTC

CGA

TTC

CAC

GCA

TTT

ATT

TCA

TAC

334

Gin

Glu

Gin

Leu

Lys

Arg

Asn

Val

Arg

Phe

His

Ala

Phe

Ile

Ser

Tyr

100

105

110

AGT

GAA

CAT

GAT

TCT

CTG

TGG

GTG

AAG

AAT

GAA

TTG

ATC

CCC

AAT

CTA

382

Ser

Glu

His

Asp

Ser

Leu

Trp

Val

Lys

Asn

Glu

Leu

Ile

Pro

Asn

Leu

115

120

125

GAG

AAG

GAA

GAT

GGT

TCT

ATC

TTG

ATT

TGC

CTT

TAT

GAA

AGC

TAC

TTT

430

Glu

Lys

Glu

Asp

Gly

Ser

Ile

Leu

Ile

Cys

Leu

Tyr

Glu

Ser

Tyr

Phe

130

135

140

GAC

CCT

GGC

AAA

AGC

ATT

AGT

GAA

AAT

ATT

GTA

AGC

TTC

ATT

GAG

AAA

478

Asp

Pro

Gly

Lys

Ser

Ile

Ser

Glu

Asn

Ile

Val

Ser

Phe

Ile

Glu

Lys

145

150

155

AGC

TAT

AAG

TCC

ATC

TTT

GTT

TTG

TCT

CCC

AAC

TTT

GTC

CAG

AAT

GAG

526

Ser

Tyr

Lys

Ser

Ile

Phe

Val

Leu

Ser

Pro

Asn

Phe

Val

Gin

Asn

Glu

160

165

170

175

TGG

TGC

CAT

TAT

GAA

TTC

TAC

TTT

GCC

CAC

CAC

AAT

CTC

TTC

CAT

GAA

574

Trp

Cys

His

Tyr

Glu

Phe

Tyr

Phe

Ala

His

His

Asn

Leu

Phe

His

Glu

180

185

190

AAT

TCT

GAT

CAC

ATA

ATT

CTT

ATC

TTA

CTG

GAA

CCC

ATT

CCA

TTC

TAT

622

Asn

Ser

Asp

His

Ile

Ile

Leu

Ile

Leu

Leu

Glu

Pro

Ile

Pro

Phe

Tyr

195

200

205

99 9 • *

9

160

9 · t » « * » «- « 1 • 9 9·* 9 9» · « » ** » 9 · *»

TGC

ATT

CCC

ACC

AGG

TAT

CAT

AAA

CTG

GAA

GCT

CTC

CTG

GAA

AAA

AAA

cys

Ile

Pro 210

Thr

Arg

Tyr

His

Lys 215

Leu

Glu

Ala

Leu

Leu 220

Glu

Lys

Lys

GCA

TAC

TTG

GAA

TGG

CCC

AAG

GAT

AGG

CGT

AAA

TGT

GGG

CTT

TTC

TGG

Ala

Tyr 225

Leu

Glu

Trp

Pro

Lys 230

Asp

Arg

Arg

Lys

Cys 235

Gly

Leu

Phe

Trp

GCA Ala 240

AAC CTT Asn Leu

CGA GCT Arg Ala

GCT GTT AAT GTT AAT GTA TTA GCC ACC AGA GAA

Ala 245

Val

Asn

Val

Asn Val 250

Leu

Ala Thr Arg Glu 255

ATG

TAT

GAA

CTG

CAG

ACA

TTC

ACA

GAG

TTA

AAT

GAA

GAG

TCT

CGA

GGT

Met

Tyr

Glu

Leu

Gin

Thr

Phe

Thr

Glu

Leu

Asn

Glu

Glu

Ser

Arg

Gly

260

265

270

TCT

ACA

ATC

TCT

CTG

ATG

AGA

ACA

GAC

TGT

CTA

TAAAATCCCA l

CAGTCCTTGG

Ser

Thr

Ile

Ser

Leu

Met

Arg

Thr

Asp

Cys

Leu

275 280

GAAGTTGGGG

TTGACAATAT

ACCACATACA CTGTTGGGAT GTACATTGAT ACAACCTTTA TGATGGCAAT

TTATTAAAAT AAAAAATGGT TATTCCCTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

670

718

766

814

867

927

987

AAAAAAAAAA AA

999 • · · · * ·

2) Informace k SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 282 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	32
Ser Asp 1	Ala Lys	Ile Arg His 5	Gin	Ala	Tyr 10	Ser	Glu Val Met Met Val 15
Gly Trp	Ser Asp 20	Ser Tyr Thr	Cys	Glu 25	Tyr	Pro	Leu Asn Leu Arg Gly 30
Thr Arg	Leu Lys 35	Asp Val His	Leu 40	His	Glu	Leu	Ser Cys Asn Thr Ala 45
Leu Leu 50	Ile Val	Thr Ile Val 55	Val	Xle	Met	Leu	Val Leu Gly Leu Ala 60
Val Ala 65	Phe Cys	Cys Leu His 70	Phe	Asp	Leu	Pro 75	Trp Tyr Leu Arg Met 80
Leu Gly	Gin Cys	Thr Gin Thr 85	Trp	His	Arg 90	Val	Arg Lys Thr Thr Gin 95
Glu Gin	Leu Lys 100	Arg Asn Val	Arg	Phe 105	His	Ala	Phe Ile Ser Tyr Ser 110
Glu His	Asp Ser 115	Leu Trp Val	Lys 120	Asn	Glu	Leu	Ile Pro Asn Leu Glu 125
Lys Glu 130	Asp Gly	Ser Ile Leu 135	Ile	Cys	Leu	Tyr	Glu Ser Tyr Phe Asp 140
Pro Gly 145	Lys Ser	Ile Ser Glu 150	Asn	Ile	Val	Ser 155	Phe Ile Glu Lys Ser 160

Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gin Asn Glu Trp • · • · · • ·

162

165

Cys His Tyr Glu Phe Tyr Phe Ala 180

Ser Asp His Ile Ile Leu Ile Leu 195 200

Ile Pro Thr Arg Tyr His Lys Leu 210 215

Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Asp Arg 225 230

Asn Leu Arg Ala 7x1a Val Asn Val 245

Tyr Glu Leu Gin Thr Phe Thr Glu 260

Thr Ile Ser Leu Met Arg Thr Asp 275 280

170 175

His His Asn Leu Phe His Glu Asn 185 190

Leu Glu Pro Ile Pro Phe Tyr Cys 205

Glu Ala Leu Leu Glu Lys Lys Ala 220

Arg Lys Cys Gly Leu Phe Trp Ala 235 240

Asn Val Leu Ala Thr Arg Glu Met 250 255

Leu Asn Glu Glu Ser Arg Gly Ser 265 270

Cys Leu • · · · • · • · · · 4 ·

163 (2) Informace o SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1173 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..1008 (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 854 (D) Jiné informace: (poznámka^ nukleotid 854 je označen A; může být A nebo T) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1171 (D) Jiné informace: (poznámka= nukleotidy 1171, 1172 jsou označeny C; každý může být A, C, G nebo T) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:

CTG Leu 1

CCT Pro

GCT Ala

GGC Gly

ACC Thr 5

CGG Arg

CTC Leu

CGG Arg

AGG Arg

CTG Leu 10

GAT Asp

GTC Val

AGC Ser

TGC Cys

AAC Asn 15

AGC Ser

ATC Ile

AGC Ser

TTC Phe

GTG Val 20

GCC Ala

CCC Pro

GGC Gly

TTC Phe

TTT Phe 25

TCC Ser

AAG Lys

GCC Ala

AAG Lys

GAG Glu 30

CTG Leu

CGA Arg

164 • · · « • · <

• · · · · ' • · · ·

GAG

CTC

AAC

CTT

AGC

GCC

AAC

GCC

CTC

AAG

ACA

GTG

GAC

CAC

TCC

TGG

144

Glu

Leu

Asn

Leu

Ser

Ala

Asn

Ala

Leu

Lys

Thr

Val

Asp

His

Ser

Trp

35

40

45

TTT

GGG

CCC

CTG

GCG

AGT

GCC

CTG

CAA

ATA

CTA

GAT

GTA

AGC

GCC

AAC

192

Phe

Gly

Pro

Leu

Ala

Ser

Ala

Leu

Gin

Ile

Leu

Asp

Val

Ser

Ala

Asn

50

55

60

CCT

CTG

CAC

TGC

GCC

TGT

GGG

GCG

GCC

TTT

ATG

GAC

TTC

CTG

CTG

GAG

240

Pro

Leu

His

Cys

Ala

Cys

Gly

Ala

Ala

Phe

Met

Asp

Phe

Leu

Leu

Glu-

65

70

75

80

GTG

CAG

GCT

GCC

GTG

CCC

GGT

CTG

CCC

AGC

CGG

GTG

AAG

TGT

GGC

AGT

288

Val

Gin

Ala

Ala

Val

Pro

Gly

Leu

Pro

Ser

Arg

Val

Lys

Cys

Gly

Ser

35

90

95

CCG

GGC

CAG

CTC

CAG

GGC

CTC

AGC

ATC

TTT

GCA

CAG

GAC

CTG

CGC

CTC

336

Pro

Gly

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Ser

Ile

Phe

Ala

Gin

Asp

Leu

Arg

Leu

100

105

110

TGC

CTG

GAT

GAG

GCC

CTC

TCC

TGG

GAC

TGT

TTC

GCC

CTC

TCG

CTG

CTG

384

Cys

Leu

Asp

Glu

Ala

Leu

Ser

Trp

Asp

Cys

Phe

Ala

Leu

Ser

Leu

Leu

115

120

125

GCT

GTG

GCT

CTG

GGC

CTG

GGT

GTG

CCC

ATG

CTG

CAT

CAC

CTC

TGT

GGC

432

Ala

Val

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Pro

Met

Leu

His

His

Leu

Cys

Gly

130

135

140

TGG

GAC

CTC

TGG

TAC

TGC

TTC

CAC

CTG

TGC

CTG

GCC

TGG

CTT

CCC

TGG

480

Trp

Asp

Leu

Trp

Tyr

Cys

Phe

His

Leu

Cys

Leu

Ala

Trp

Leu

Pro

Trp

145

150

155

160

CGG

GGG

CGG

CAA

AGT

GGG

CGA

GAT

GAG

GAT

GCC

CTG

CCC

TAC

GAT

GCC

528

Arg

Gly

Arg

Gin

Ser

Gly

Arg

Asp

Glu

Asp

Ala

Leu

Pro

Tyr

Asp

Ala

165

170

175

TTC

GTG

GTC

TTC

GAC

AAA

ACG

CAG

AGC

GCA

GTG

GCA

GAC

TGG

GTG

TAC

576

Phe

Val

Val

Phe

Asp

Lys

Thr

Gin

Ser

Ala

Val

Ala

Asp

Trp

Val

Tyr

180

185

190

AAC

GAG

CTT

CGG

GGG

CAG

CTG

GAG

GAG

TGC

CGT

GGG

CGC

TGG

GCA

CTC

624

Asn

Glu

Leu

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Glu

Cys

Arg

Gly

Arg

Trp

Ala

Leu

195

200

205

CGC

CTG

TGC

CTG

GAG

GAA

CGC

GAC

TGG

CTG

CCT

GGC

AAA

ACC

CTC

TTT

672

Arg

Leu

Cys

Leu

Glu

Glu

Arg

Asp

Trp

Leu

Pro

Gly

Lys

Thr

Leu

Phe

210

215

220

GAG

AAC

CTG

TGG

GCC

TCG

GTC

TAT

GGC

AGC

CGC

AAG

ACG

CTG

TTT

GTG

720

Glu

Asn

Leu

Trp

Ala

Ser

Val

Tyr

Gly

Ser

Arg

Lys

Thr

Leu

Phe

Val

225

230

235

240

CTG

GCC

CAC

ACG

GAC

CGG

GTC

AGT

GGT

CTC

TTG

CGC

GCC

AGC

TTC

CTG

768

Leu

Ala

His

Thr

Asp

Arg

Val

Ser

Gly

Leu

Leu

Arg

Ala

Ser

Phe

Leu

245

250

255

CTG

GCC

CAG

CAG

CGC

CTG

CTG

GAG

GAC

CGC

AAG

GAC

GTC

GTG

GTG

CTG

816

Leu

Ala

Gin

Gin

Arg

Leu

Leu

Glu

Asp

Arg

Lys

Asp

Val

Val

Val

Leu

260

265

270

GTG

ATC

CTG

AGC

CCT

GAC

GGC

CGC

CGC

TCC

CGC

TAC

GAG

CGG

CTG

CGC

864

• · • · · · ········ • · · · · * .·· · ··· ........

165

Val

Ile

Leu 275

Ser

Pro

Asp

Gly

Arg 280

Arg

Ser

Arg

Tyr

Glu 285

Arg

Leu

Arg

CAG

CGC

CTC

TGC

CGC

CAG

AGT

GTC

CTC

CTC

TGG

CCC

CAC

CAG

CCC

AGT

912

Gin

Arg 290

Leu

Cys

Arg

Gin

Ser 295

Val

Leu

Leu

Trp

Pro 300

His

Gin

Pro

Ser

GGT

CAG

CGC

AGC

TTC

TGG

GCC

CAG

CTG

GGC

ATG

GCC

CTG

ACC

AGG

GAC

960

Gly 305

Gin

Arg

Ser

Phe

Trp 310

Ala

Gin

Leu

Gly

Met 315

Ala

Leu

Thr

Arg

Asp 320

AAC

CAC

CAC

TTC

TAT

AAC

CGG

AAC

TTC

TGC

CAG

GGA

CCC

ACG

GCC

GAA

1008

Asn

His

His

Phe

Tyr

Asn

Arg

Asn

Phe

Cys

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Glu

325 330 335

TAGCCGTGAG	CCGGAATCCT	GCACGGTGCC	ACCTCCACAC	TCACCTCACC	TCTGCCTGCC	1068
TGGTCTGACC	CTCCCCTGCT	CGCCTCCCTC	ACCCCACACC	TGACACAGAG	CAGGCACTCA	1128
ATAAATGCTA	CCGAAGGCTA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AACCA		1173

2) Informace k SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 336 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

(xi)

Popis

sekvence:

SEQ Arg

ID Arg

NO: Leu 10

34 Asp

Val

Ser

Cys

Asn 15

Ser

Leu 1

Pro

Ala

Gly

Thr 5

Arg

Leu

Ile

Ser

Phe

Val 20

Ala

Pro

Gly

Phe

Phe 25

Ser

Lys

Ala

Lys

Glu 30

Leu

Arg

Glu

Leu

Asn 35

Leu

Ser

Ala

Asn

Ala 40

Leu

Lys

Thr

Val

Asp 45

His

Ser

Trp

Phe

Gly 50

Pro

Leu

Ala

Ser

Ala 55

Leu

Gin

Ile

Leu

Asp 60

Val

Ser

Ala

Asn

Pro 65

Leu

His

Cys

Ala

Cys 70

Gly

Ala

Ala

Phe

Met 75

Asp

Phe

Leu

Leu

Glu 80

Val

Gin

Ala

Ala

Val 85

Pro

Gly

Leu

Pro

Ser 90

Arg

Val

Lys

Cys

Gly 95

Ser

Pro

Gly

Gin

Leu 100

Gin

Gly

Leu

Ser

Ile 105

Phe

Ala

Gin

Asp

Leu 110

Arg

Leu

Cys

Leu

Asp 115

Glu

Ala

Leu

Ser

Trp 120

Asp

Cys

Phe

Ala

Leu 125

Ser

Leu

Leu

Ala

Val 130

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly 135

Val

Pro

Met

Leu

His 140

His

Leu

Cys

Gly

Trp Asp Leu Trp Tyr Cys Phe His Leu Cys Leu Ala Trp Leu Pro Trp • ·

166

145 150 155 160

Arg

Gly

Arg

Gin

Ser 165

Gly

Arg

Asp

Glu

Asp 170

Ala

Leu

Pro

Tyr

Asp 175

Ala

Phe

Val

Val

Phe 180

Asp

Lys

Thr

Gin

Ser 185

Ala

Val

Ala

Asp

Trp 190

Val

Tyr

Asn

Glu

Leu 195

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu 200

Glu

Cys

Arg

Gly

Arg 205

Trp

Ala

Leu

Arg

Leu 210

Cys

Leu

Glu

Glu

Arg 215

Asp

Trp

Leu

Pro

Gly 220

Lys

Thr

Leu

Phe

Glu 225

Asn

Leu

Trp

Ala

Ser 230

Val

Tyr

Gly

Ser

Arg 235

Lys

Thr

Leu

Phe

Val 240

Leu

Ala

His

Thr

Asp 245

Arg

Val

Ser

Gly

Leu 250

Leu

Arg

Ala

Ser

Phe 255

Leu

Leu

Ala

Gin

Gin 260

Arg

Leu

Leu

Glu

Asp 265

Arg

Lys

Asp

Val

Val 270

Val

Leu

Val

Ile

Leu 275

Ser

Pro

Asp

Gly

Arg 280

Arg

Ser

Arg

Tyr

Glu 285

Arg

Leu

Arg

Gin

Arg 290

Leu

Cys

Arg

Gin

Ser 295

Val

Leu

Leu

Trp

Pro 300

His

Gin

Pro

Ser

Gly 305

Gin

Arg

Ser

Phe

Trp 310

Ala

Gin

Leu

Gly

Met 315

Ala

Leu

Thr

Arg

Asp 320

Asn

His

His

Phe

Tyr

Asn

Arg

Asn

Phe

Cys

Gin

Gly

Pro

Thr

Ala

Glu

325 330 335

Informace o	SEQ ID NO: 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 497 párů baží
• (B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární

(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 35:

• *

			167	• • · ·	• · · • ·······	• • ·
TGGCCCACAC	GGACCGCGTC	AGTGGCCTCC	TGCGCACCAG	CTTCCTGCTG	GCTCAGCAGC	60
GCCTGTTGGA	AGACCGCAAG	GACGTGGTGG	TGTTGGTGAT	CCTGCGTCCG	GATGCCCCAC	120
CGTCCCGCTA	TGTGCGACTG	CGCCAGCGTC	TCTGCCGCCA	GAGTGTGCTC	TTCTGGCCCC	180
AGCGACCCAA	CGGGCAGGGG	GGCTTCTGGG	CCCAGCTGAG	TACAGCCCTG	ACTAGGGACA	240
ACCGCCACTT	CTATAACCAG	aacttctgcc	GGGGACCTAC	AGCAGAATAG	CTCAGAGCAA	300
CAGCTGGAAA	CAGCTGCATC	TTCATGTCTG	GTTCCCGAGT	TGCTCTGCCT	GCCTTGCTCT	360
GTCTTACTAC	ACCGCTATTT	GGCAAGTGCG	CAATATATGC	TACCAAGCCA	CCAGGCCCAC	420
GGAGCAAAGG	TTGGCTGTAA	AGGGTAGTTT	TCTTCCCATG	CATCTTTCAG	GAGAGTGAAG	480

ATAGACACCA AACCCAC

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR2 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO:

   4.
2. 2. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR3 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvenci SEQ ID NO:

   6.
3. 3. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR5 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 10.
4. 4. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR6 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 12.
5. 5. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR7 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 16 nebo 18.
6. 6. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR8 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO:

   32.

   • · · · • · · ·

   169
7. 7. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR9 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 22.
8. 8. V podstatě čistý nebo rekombinantní protein DTLR10 nebo peptid, který obsahuje velké množství nepřekrývajících se oblastí, které vykazují alespoň přibližně 90 % sekvenční shodu v délce alespoň 20 aminokyselin se sekvencí SEQ ID NO: 34.
9. 9. Polypeptid vybraný ze skupiny obsahující SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:22 a SEQ ID NO:24.
10. 10. Fúzní protein vyznačující se tím, že obsahuje protein nebo peptid podle libovolného z nároků 1 až 9.
11. 11. Protilátka nebo fragment protilátky, který se specificky váže na protein nebo peptid podle libovolného z nároků 1 až

    9.
12. 12. Nukleová kyselina kódující protein nebo peptid podle libovolného z nároků 1 až 9.
13. 13. Expresívní vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 12.
14. 14. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 13.
15. 15. Způsob rekombinantně produkující polypeptid, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 14 za podmínek, při kterých se polypeptid exprimuje.