MXPA05003779A - Genes aislados de proteinas de membrana de mamiferos; reactivos relacionados. - Google Patents

Abstract

Se describen acidos nucleicos que codifican diversas proteinas de celulas linfociticas de un primate, los reactivos relacionados con las mismas, que incluye anticuerpos especificos y proteinas purificadas; tambien se proporcionan metodos de uso de dichos reactivos y equipos de diagnostico relacionados.

Description

GENES AISLADOS DE PROTEINAS DE MEMBRANA DE MAMIFEROS: REACTIVOS RELACIONADOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención contempla composiciones relacionadas con genes encontrados en linfocitos, por ejemplo, células que funcionan en el sistema inmune. Estos genes funcionan en e! control del desarrollo, diferenciación y/o fisiología del sistema inmune en mamíferos. En particular, la solicitud proporciona ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos y métodos para utilizarlos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El componente circulatorio del sistema circulatorio de los mamíferos comprende diversos tipos de células, que incluyen a los glóbulos rojos y objetivos de las estirpes celulares eritroide y mieloide. Véase, por ejemplo, las publicaciones de Rapaport (1987) Introduction to Hematoloqy (2da. ed.) Lippincott, Filadelfia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematoloqy, Little, Brown and Co., Boston, MA; y Paul (ed. 1998) Fundamental Immunoloqy (4ta. ed.) Raven Press, N.Y. Las células dendríticas (DC) son células procesadoras de antígenos o presentadoras y se encuentran en todos los tejidos del organismo. Se pueden clasificar en varias categorías, que incluyen células dendnticas intersticiales del corazón, riñon, intestino y pulmón; células de Langerhans de las membranas de la piel y mucosas; células dendríticas interdigitales en la médula tímica y tejido linfoide secundario; y células dendríticas de sangre y linfa. Aunque las células dendríticas en cada uno de estos compartimientos son leucocitos CD45+ que aparentemente se originan en la médula ósea, pueden exhibir diferencias que se relacionan con el estado de madurez y el microambiente. Estas células dendríticas procesan y presentan de manera eficiente los antígenos a, por ejemplo, las células T. Estimulan las respuestas de las células T sencillas y de memoria en el área paracortical de los órganos linfoides secundarios. Existe alguna evidencia de un papel en la inducción de la tolerancia. Los folículos de células B primarias y secundarias, contienen células dendríticas foliculares que atrapan y retienen a antígenos intactos en forma de complejos inmunes durante períodos durante tiempos prolongados. Estas células dendríticas presentan un antígeno nativo a las células B y es posible que estén involucradas en la maduración de la afinidad de los anticuerpos, la generación de la memoria inmune y el mantenimiento de las respuestas inmunes humorales. Los monocitos son células fagocíticas que pertenecen al sistema de los fagocitos mononucleares y residen en la circulación. Véase la publicación de Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego. Estas células se originan en la médula ósea y permanecen únicamente un corto lapso en el compartimiento medular una vez que se diferencian. Posteriormente, ingresan a la circulación y pueden permanecer allí durante un período de tiempo relativamente prolongado, por ejemplo unos cuantos días. Los monocitos pueden ingresar a los tejidos y cavidades del organismo mediante el procedimiento denominado diapédesis, en el cual se diferencian en macrófagos y posiblemente en células dendríticas. En una respuesta inflamatoria, el número de monocitos de la circulación puede duplicarse, y mucha de la cantidad aumentada de los monocitos experimenta diapédesis en el sitio de la inflamación. La presentación de antígenos se refiere a los eventos celulares en los cuales un antígeno proteínico es captado, procesado por células presentadoras de antígenos (APC) y luego reconocido para iniciar una respuesta inmune. Las células presentadoras de antígenos más activas han sido caracterizadas como macrófagos, los cuales son productos del desarrollo directo de monocitos, de células dendríticas y de ciertas células B. Los macrófagos se encuentran en la mayoría de los tejidos y son sumamente activos en la incorporación de una amplia variedad de antígenos proteicos y microorganismos. Estos tienen una actividad endocítica altamente desarrollada y secretan muchos productos importantes en el inicio de una respuesta inmune. Por esta razón, se considera que muchos genes expresados por los monocitos o inducidos por la activación de los monocitos son posiblemente importantes en la captación, procesamiento, presentación de antígenos o en la regulación de la respuesta inmune resultante. Sin embargo, las células dendríticas y los monocitos están escasamente caracterizados, tanto en términos de las proteínas que éstos expresan y muchas de sus funciones y mecanismos de acción, que incluyen sus estados activados. En particular, los procedimientos y mecanismos relacionados con el inicio de una respuesta inmune, que incluye el procesamiento y presentación de antígenos, permanecen sin esclarecer. La ausencia de conocimiento sobre las propiedades estructurales, biológicas y fisiológicas de estas células, limita su comprensión. De este modo, las condiciones médicas en las cuales la regulación, el desarrollo o la fisiología de las células que presentan antígenos es poco común, siguen siendo poco manejables.

DESCRIPCION DE LOS IDENTIFICADORES DE SECUENCIAS SEC. ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del gen de la familia de lectinas C SDCMP3 de primates. SEC. ID NO: 2 es la secuencia de polipéptidos del gen de la familia de lectinas C SDCMP3 de primates. SEC. ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del gen de la familia de lectinas C SDCMP3 de roedores.

SEC. ID NO: 4 es la secuencia de polipéptidos del gen de la familia de lectinas C SDCMP3 de roedores. SEC. ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del gen de la familia de lectinas C largas SDCMP4 de primates. SEC. ID NO: 6 es la secuencia de polipéptidos del gen de la familia de lectinas C largas SDCMP4 de primates. SEC. ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos del gen de la familia de lectinas C cortas SDCMP4 de primates. SEC. ID NO: 8 es la secuencia de polipéptidos del gen de la familia de lectinas C cortas SDCMP4 de primates. SEC. ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos SDCMP3 humana de longitud completa. SEC. ID NO: 10 es la secuencia del polipéptido SDCMP3 humano de longitud completa.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de varios genes de Proteínas de membrana de células dendríticas Schering (SDCMP) en mamíferos. Los datos de distribución indican una distribución celular más amplia y los datos estructurales sugieren alguna función, y están ejemplificados por las modalidades específicas SDC P3 y SDC P4. Las SDCMPs 3 y 4 exhiben similitud con una clase de lectinas y con receptores de asialoglicoproteínas (ASGPR). La invención abarca a ios agonistas y antagonistas de los productos génicos, por ejemplo, mutaciones (muteínas) de las secuencias naturales, proteínas de fusión, miméticos químicos, anticuerpos y otros análogos estructurales o funcionales. La presente invención, también se refiere a genes aislados que codifican las proteínas de la presente invención. También se proporcionan varios usos de estas composiciones de proteínas o ácidos nucleicos diferentes. La presente invención, proporciona una composición de enlace aislada, la cual se une de manera específica a un polipéptido que comprende la SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. En ciertas modalidades, la composición de enlace es un anticuerpo o un fragmento de enlace de anticuerpo del mismo. Normalmente, el fragmento de enlace de anticuerpo es: a) un fragmento Fv; b) un fragmento Fab; ó c) un fragmento Fab2, y el anticuerpo es: a) un anticuerpo policlonal; b) un anticuerpo monoclonal; o c) un anticuerpo humanizado. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método que utiliza la composición de enlace, que comprende poner en contacto la composición de enlace con una muestra que comprende un antígeno para formar una composición de complejo de enlace:antígeno. En modalidades adicionales: la muestra es una muestra biológica, que incluye un fluido corporal; en donde la muestra es humana; el antígeno está en una célula; el antígeno adicionalmente está purificado; o el método proporciona la ubicación o distribución espacial del antígeno.

También se proporciona un equipo de detección que comprende la composición de enlace y: a) material de instrucción para el uso o eliminación de los reactivos del equipo; o b) un compartimiento que proporciona la segregación de la composición de enlace u otros reactivos del equipo. La presente invención abarca un polipéptido sustancialmente puro o aislado, el cual se une de manera específica a la composición de enlace. El polipéptido comprende la SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. También se proporciona un método para utilizar el polipéptido, que comprende poner en contacto el polipéptido con un anticuerpo en condiciones adecuadas para formar un complejo de anticuerpo:polipéptido. Otra modalidad es un equipo de detección que comprende el polipéptido y: a) material de instrucción para el uso o eliminación de los reactivos del equipo; o b) un compartimiento que proporciona la segregación del polipéptido u otros reactivos del equipo. La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que codifica un polipéptido, el cual se une a la composición de enlace. En una modalidad adicional, el ácido nucleico comprende la SEC. ID NO: 1 , 3, 5, 7 ó 9. También se incluye un ácido nucleico aislado o purificado, el cual se hace híbrido bajo condiciones estrictas al ácido nucleico que codifica el polipéptido, el cual se une a la composición de enlace. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de expresión y una célula huésped que comprende este ácido nucleico. Normalmente la célula huésped es: a) una célula de mamífero; b) una célula bacteriana; c) una célula de insecto o d) una célula de levadura. La presente invención adicionalmente comprende un método de producción de un polipéptido, que comprende cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido y purificar el polipéptido. La presente invención proporciona un método para modular la fisiología o función de células dendríticas que comprende un paso de poner en contacto una célula con un agonista o antagonista de la SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. En otra modalidad adicional, el antagonista es un anticuerpo. En otra modalidad, el contacto ocurre en combinación con un antígeno, que incluye un antígeno de superficie celular, MHC de Clase l o MHC Clase II.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Todas las referencias citadas en la presente se incorporan a la presente como referencia en la misma forma que si se indicara cada publicación o solicitud de patente en forma individual para incorporarse de manera específica e individual como referencia en su totalidad para todo propósito.

I. GENERAL La presente invención proporciona secuencias de ADN que codifican proteínas de mamíferos que se expresan en células dendríticas (DC). Para una revisión de células dendríticas, véanse las publicaciones de Steinman (1991) Annual Review of Immunoloqy 9: páginas 271 a 296 y Banchereau y Schmitt (eds. 1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunoloqy Plenum Press, NY. Estas proteínas se denominan proteínas de células dendríticas porque se encuentran en estas células y parecen exhibir alguna especificidad en su expresión. Más adelante se proporcionan modalidades humanas específicas de estas proteínas. Las descripciones que se encuentran a continuación están orientadas con fines de ejemplificación, a genes de DC humanos, pero son igualmente aplicables a modalidades estructuralmente relacionadas, por ejemplo a través de secuencias, de otras fuentes o especies de mamíferos, que incluye variantes polimórficas o individuales. Estas incluirán, por ejemplo, a proteínas, las cuales exhiben relativamente pocos cambios en la secuencia, por ejemplo, un 5%, y en el número, por ejemplo, menos de 20 sustituciones de residuos, normalmente menos de 15, preferentemente, menos de 10, y más preferentemente, menos de 5 sustituciones, que incluye 4, 3, 2 ó 1. Éstas incluirán también versiones, las cuales están truncadas a partir de proteínas de longitud completa, como se describió, y de fusión, que contienen segmentos sustanciales de estas secuencias. ll. DEFINICIONES El término "composición de enlace" se refiere a moléculas que se unen con especificidad a estas proteínas de DC, por ejemplo, en una interacción anticuerpo-antígeno. Otros compuestos, por ejemplo, proteínas, también se pueden asociar de manera específica con la proteína respectiva. Normalmente, la asociación específica será en una interacción proteína-proteína fisiológicamente relevante natural, ya sea covalente o no covalente, y puede incluir a miembros de un complejo multiproteínico, que incluye a compuestos transportadores o compañeros de dimerización. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales o puede ser una molécula totalmente no relacionada, por ejemplo, la cual tenga una forma molecular, la cual interactúa con los determinantes de interacción adecuados. Las variantes pueden servir como agonistas o antagonistas de la proteína; véase, por ejemplo, la publicación de Goodman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics (8va. edición) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y. El término "complejo agente de enlace:proteína de DC", como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un complejo de un agente de enlace y una proteína de DC. El enlace específico del agente de enlace significa que el agente de enlace tiene un sitio de enlace específico que reconoce un sitio sobre la proteína de DC respectiva. Por ejemplo, los anticuerpos cultivados para la proteína de DC y que reconocen un epítope sobre la proteína de DC tienen la capacidad de formar un complejo anticuerpo:proteína de DC mediante la enlace específica. Normalmente, la formación de un complejo agente de enlace:proteína de DC permite la medición de esa proteína de DC en una mezcla de otras proteínas y agentes biológicos. El término "complejo anticuerpo:proteína de DC" se refiere a un complejo de agente de enlace: proteína de DC en el cual, el agente de enlace es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o incluso un fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo, que incluye, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab ó Fab2. Las secuencias de ácidos nucleicos "homologas", cuando se comparan, exhiben una similitud significativa. Los estándares para homología en ácidos nucleicos o son mediciones de homología utilizadas generalmente en el arte por comparación de secuencias y/o relación filogenética o se basan en condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con mayor detalle más adelante. Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN o polímero mezclado, el cual está sustancialmente separado de otros componentes, los cuales acompañan de manera natural a una secuencia nativa, por ejemplo, las proteínas y secuencias genómicas que flanquean las especies de origen. El término abarca a una secuencia de ácido nucleico, la cual se ha removido de su ambiente natural e incluye aislados de ADN recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente o sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. Un ácido nucleico aislado será por lo general una composición homogénea de moléculas, aunque en algunas modalidades, puede contener una heterogeneidad menor. Esta heterogeneidad se encuentra normalmente en los extremos del polímero o en porciones no críticas para una función o actividad biológica deseada. Según se utiliza en la presente descripción, el término "proteína SDCMP3" abarcará, cuando se utiliza en un contexto de proteínas, una proteína que tenga secuencias de aminoácidos como las que se muestran en la SEC. ID NO: 2, 4 ó 10 ó un fragmento significativo de dicha proteína. Esto se refiere a un polipéptido, el cual ¡nteractúa con los componentes específicos de enlace a la proteína SDCMP3 respectivos. Estos componentes de enlace, por ejemplo, anticuerpos, normalmente se unen a la proteína SDCMP3 con alta afinidad, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 100 nM, normalmente mejor que aproximadamente 30 nM, preferentemente mejor que aproximadamente 10 nM y más preferentemente mejor de aproximadamente 3 nM. De manera similar, el uso del término SDCMP4 se aplicará con referencia a la SEC. ID NO: 6 ó 8. El término "polipéptido" o "proteína", como se utiliza en la presente descripción, incluye un fragmento o segmento significativo de la proteína, y abarca una región de residuos de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente por lo menos 10 aminoácidos, más generalmente de por lo menos 12 aminoácidos, con frecuencia de por lo menos 14 aminoácidos, con mayor frecuencia de por lo menos 16 aminoácidos, normalmente por lo menos 18 aminoácidos, más normalmente de por lo menos 20 aminoácidos, usualmente de por lo menos 22 aminoácidos, más usualmente de por lo menos 24 aminoácidos, preferentemente de por lo menos 26 aminoácido, más preferentemente de por lo menos 28 aminoácidos, y, en modalidades particularmente preferidas, de por lo menos aproximadamente 30 ó más aminoácidos, por ejemplo, 35, 40, 45, 50, 60, 70, etc. Un ácido nucleico "recombinante" se define normalmente por su estructura. Este puede ser un ácido nucleico elaborado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos entre sí, pero con el objeto de excluir productos de la naturaleza, por ejemplo, formas mutantes de ocurrencia natural. Ciertas formas se definen mediante un método de producción. Haciendo referencia a éstas, por ejemplo, un producto preparado mediante dicho procedimiento, en donde el procedimiento es el uso de técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, que involucran la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, normalmente la selección o producción. Por consiguiente, la presente invención abarca, por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada utilizando un procedimiento de síntesis de oligonucleótidos y productos elaborados transformando células con un vector que no ocurre de manera natural, el cual codifica estas proteínas. Por lo tanto se hace a menudo para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica al mismo aminoácido o uno conservador, aunque normalmente introduce o elimina un sitio de reconocimiento de secuencia, por ejemplo, para una enzima de restricción. De manera alternativa, esto se realiza para unir segmentos de ácidos nucleicos juntos de funciones deseadas para generar una entidad genética única que comprende una combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son con frecuencia el objetivo de dichas manipulaciones artificiales, aunque pueden incorporarse por diseño otros objetivos con sitios específicos, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control u otras características útiles, por ejemplo, segmentos de cebadores. Un concepto similar se aplica a un polipéptido recombinante, por ejemplo, de fusión. Se incluyen de manera específica ácidos nucleicos sintéticos, los cuales, por redundancia de código genético, codifican polipéptidos similares a fragmentos de estos antígenos y fusiones de secuencias a partir de diversas variantes de especies diferentes. La "solubilidad" se refleja mediante la sedimentación medida en unidades Svedberg, las cuales son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula bajo condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación se realizaba clásicamente en una ultracentrífugadora analítica, aunque actualmente se realiza en una ultracentrífugadora estándar. Véase la publicación de Freifelder (1982) Phvsical Biochemistry (2da. ed.) Freeman and Co., San Francisco, CA; y Cantor y Schimmel (1980) Biohvsical Chemistry, partes 1-3, Freeman and Co., San Francisco, CA. Como una determinación bruta, una muestra que contiene un péptido presuntamente soluble se hace girar en una ultracentrífugadora estándar de tamaño grande a una velocidad de aproximadamente 50.000 r.p.m. durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el supernadante. Una partícula o polipéptido soluble normalmente será menor de aproximadamente 30S, más normalmente menor de aproximadamente 15S, habitualmente menor de aproximadamente 0S, más habitualmente menor de aproximadamente 6S, y, en modalidades particulares, preferentemente menor de aproximadamente 4S y más preferentemente menor de aproximadamente 3S. La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan la solubilidad del polipéptido, incluyendo la temperatura, el ambiente electrolítico, el tamaño y las características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del solvente. Normalmente, la temperatura a la cual se utiliza el polipéptido se encuentra dentro de la escala entre aproximadamente una temperatura de 4°C y aproximadamente una temperatura de 65°C. Habitualmente la temperatura de uso es mayor de aproximadamente 18°C y más habitualmente mayor de aproximadamente 22°C. Para propósitos de diagnóstico, la temperatura será usualmente de aproximadamente temperatura ambiente o más cálida, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes del ensayo. Para propósitos terapéuticos, la temperatura será usualmente la temperatura corporal, normalmente de aproximadamente 37°C para humanos, aunque en ciertas situaciones, la temperatura puede ser elevada o disminuida in situ o in vitro. El tamaño y estructura del polipéptido debe estar por lo general en un estado fisiológicamente activo sustancialmente estable, y habitualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para aportar solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes de una manera que se aproxime a las interacciones naturales de una bicapa de lípido. El solvente será usualmente un regulador de pH biológicamente compatible, de un tipo utilizado para la preservación de las actividades biológicas, y se aproximará usualmente a un solvente fisiológico. Usualmente el solvente tendrá un pH neutro, normalmente entre aproximadamente 5 y 10, y preferentemente de aproximadamente 7.5 En algunas ocasiones, se agregará un detergente, normalmente uno suave y no desnaturalizante, por ejemplo, CHS (colesteril hemisuccinato) ó CHAPS (sulfonato de 3-([3-colamidoprop¡l]dimetilamonio)1-propansulfonato) o en una concentración de detergente suficientemente baja como para evitar una alteración significativa de las propiedades fisiológicas de la proteína. El término "sustancialmente pura" significa normalmente, por ejemplo, en un contexto de proteínas, en donde la proteína es aisla de otras proteínas, ácidos nucleicos u otras biomoléculas contaminantes derivadas del organismo fuente original. La pureza, o "aislamiento", puede probarse mediante métodos estándar, normalmente por peso, y será ordinariamente de por lo menos aproximadamente el 50% de pureza, más comúnmente de por lo menos aproximadamente el 60% de pureza, generalmente de por lo menos aproximadamente el 70% de pureza, más generalmente de por lo menos aproximadamente el 80% de pureza, con frecuencia de por lo menos aproximadamente el 85% de pureza, con mayor frecuencia de por lo menos aproximadamente el 90% de pureza, preferentemente de por lo menos aproximadamente el 95% de pureza, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 98% de pureza, y en las modalidades más preferidas, de por lo menos aproximadamente el 99% de pureza. Con frecuencia se agregarán vehículos o excipientes o la formulación puede ser estéril o comprender componentes reguladores de pH. El término "similitud sustancial" en el contexto de la comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa ya sea que los segmentos o sus hebras complementarias, cuando se les compara, son idénticas cuando se alinean en forma óptima, con inserciones o eliminaciones adecuadas de los nucleótidos, en por lo menos aproximadamente el 50% de los nucleótidos, generalmente en por lo menos el 56%, más generalmente en por lo menos el 59%, comúnmente en por lo menos el 62%, más comúnmente en por lo menos el 65%, a menudo por lo menos el 68%, más a menudo por lo menos el 71%, normalmente por lo menos el 74%, más normalmente por lo menos el 77%, usualmente por lo menos el 80%, más usualmente por lo menos aproximadamente el 85%, preferentemente por lo menos aproximadamente el 90%, más preferentemente por lo menos aproximadamente del 95 al 98% ó más, y en modalidades particulares, tan alto como aproximadamente el 99% ó más de los nucleótidos. De manera alternativa, existe una similitud sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas, a una hebra o a su complemento, utilizando normalmente una secuencia derivada de la SEC. ID NO: 1 , 3 ó 9. Normalmente, ocurrirá la hibridación selectiva cuando exista por lo menos aproximadamente el 55% de similitud a lo largo de un tramo de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferentemente por lo menos aproximadamente el 65% a lo largo de una hebra de por lo menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 75% y más preferentemente de por lo menos aproximadamente el 90% a lo largo de aproximadamente 20 nucleótidos. Véase la publicación de Kanehisa (1984) Nucí. Acids Res. 12: páginas 203-213. La longitud de la comparación de similitud, como se describió, puede ser a lo largo de hebras más largas y en ciertas modalidades será a lo largo de una hebra de por lo menos 17 nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, más normalmente por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferentemente por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos y más preferentemente por lo menos aproximadamente de 75 a 100 ó más nucleótidos. Las medidas de comparación para el SDCMP3 no se reflejan en aquellas mediciones de comparación para el SDC P4. Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia respecto con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en una computadora, se diseñan coordenadas de subsecuencias, de ser necesario, y se diseñan parámetros de programa del algoritmo de secuencias. Luego el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad para la(s) secuencia(s) de prueba relativa a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa diseñado. Puede efectuarse la alineación óptica de secuencias para la comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) Adv. Appl. Math 2: página 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: página 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proa Nat'l Acad. Sci E.U.A. 85: página 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante inspección visual (véase en general Ausubel et al, supra).

Un ejemplo de algoritmo útil es el PILEUP. El PILEUP crea una alineación se secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones de formación de pares, progresivas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También gráfica un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. El PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: páginas 351 a 360. El método utilizado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5: páginas 151 a 53. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una con una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación que forma pares de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo se alinea luego con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionados. Dos grupos de secuencias se alinean mediante una extensión simple de la alineación que forma pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas y que forman pares. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y diseñando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede compararse con otras secuencias de prueba para determinar la relación de identidad de secuencias porcentual utilizando los siguientes parámetros: peso del intervalo previamente determinado (3.00), peso de longitud del intervalo previamente determinado (0.10) e intervalos de extremos pesados. Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que describen Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: páginas 403 a 410. El software para ejecutar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, los cuales o concuerdan con o satisfacen alguna puntuación del umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabra cercano (Altschul et ai, supra). Estos aciertos de palabras cercanas iniciales actúan como fuente para iniciar las búsquedas para encontrar los HSPs más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden luego en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como la puntuación de alineación acumulativa pueda ser incrementada. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa desciende en la cantidad X a partir de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o por debajo de cero, debido a la acumulación de una o más alineaciones residuales de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como valores previamente determinados una longitud de palabra (W) de 11 , las alineaciones de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase la publicación de Henikoff y Henikoff (1989) Proa Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 89: página 10915) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas hebras. Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencias, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, la publicación de Karlin y Altschul (1993) Proa Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 90: páginas 5873 a 5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría por casualidad una coincidencia entre dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación entre el ácido nucleico de prueba y el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.1 , más preferentemente menor de aproximadamente 0.01 y aún más preferentemente menor de aproximadamente 0.001. Una indicación adicional de que dos secuencias de ácidos nucleicos de polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene reactividad cruzada en forma inmunológica con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. Por lo tanto, un polipéptido es por lo general sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente en las sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe más adelante. El término "condiciones rigurosas", que hace referencia a la homología o a la similitud sustancial en el contexto de la hibridación, se refiere a condiciones combinadas rigurosas de sal, temperatura, solventes orgánicos y otros parámetros, normalmente aquéllos controlados en las reacciones de hibridación. La combinación de parámetros es más importante que la medida de cualquier parámetro único. Véase, por ejemplo, la publicación de Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: páginas 349 a 370. Una prueba de ácido nucleico que se une a un ácido nucleico objetivo en condiciones rigurosas es específica para dicho ácido nucleico objetivo. Dicha prueba tiene normalmente una longitud de más de 11 nucleótidos y es suficientemente idéntica o complementaria de un ácido nucleico objetivo en la región especificada por la secuencia de la prueba para unirse al objetivo en condiciones rigurosas de hibridación. En general una señal positiva exhibirá por lo menos una señal de dos dobleces sobre el fondo, preferentemente de por lo menos 5 dobleces y más preferentemente de por lo menos 15, 25 ó incluso 50 dobleces sobre el fondo.

Las proteínas SDCMP equivalentes de otros mamíferos, por ejemplo, de especies de primates o roedores, pueden clonarse y aislarse por hibridación de especies cruzadas de especies cercanamente relacionadas. Véase, por ejemplo, más adelante. La similitud puede ser relativamente baja entre especies lejanamente relacionadas, y de esta manera resulta aconsejable la hibridación de especies cercanamente relacionadas. En forma alternativa, la elaboración de una preparación de anticuerpos la cual exhibe menor especificidad de especie puede ser útil en métodos de clonación de expresión. La frase "se une específicamente a un anticuerpo" o "específicamente ¡nmunoreactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de enlace, la cual es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. Por lo tanto, en condiciones de inmunoensayo determinadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular y no se unen de manera significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La enlace específica a un anticuerpo bajo dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que sea seleccionado por su especificidad para una proteína en particular. Por ejemplo, los anticuerpos desarrollados para el inmunogen de proteína SDCMP3 humana con la secuencia de aminoácidos indicada en SEC. ID NO: 2 ó 10, pueden seleccionarse para obtener anticuerpos específicamente inmunoreactivos con esa proteína SDCMP y no con otras proteínas. Estos anticuerpos reconocen las proteínas altamente similares a la proteína SDCMP3 humana homologa.

III. ACIDOS NUCLEICOS Estos genes de SDCMP se expresan de manera selectiva en células dendríticas. Las modalidades preferidas, descritas, serán útiles en procedimientos estándar para aislar genes de otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de proteínas relacionadas de individuos, cepas o especies. Se dispone de una cantidad de métodos diferentes para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado tomando como base la información proporcionada en la presente descripción. Los estudios de hibridación por transferencia Southern deben identificar genes homólogos en otras especies bajo las condiciones de hibridación adecuadas. Una proteína purificada o péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante los métodos estándar, como se describe más adelante. Se pueden presentar péptidos sintéticos o proteínas purificadas a un sistema inmune para generar anticuerpos policlonales y monoclonales. Véase, por ejemplo, la publicación de Coligan (1991) Current Protocols in Immunoloqy Wiley/Greene, NY; y la publicación de Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Coid Spring Harbor Press, NY, las cuales se incorporan a la presente descripción a modo de referencia. De manera alternativa, una composición de enlace de antígenos SDCMP puede ser útil como un reactivo de enlace específico y se puede aprovechar su especificidad de enlace, por ejemplo, para la purificación de una proteína SDCMP. La composición de enlace específica puede utilizarse para detectar una biblioteca de expresión elaborada a partir de una línea celular, la cual expresa la proteína SDCMP respectiva. Se dispone de muchos métodos de detección, por ejemplo, la tinción estándar de ligandos expresados en superficie o por lavado. La detección de la expresión intracelular también puede realizarse mediante diversos procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones podrían utilizarse para purificar por afinidad o seleccionar células que expresan al antígeno. El análisis de secuencias sugiere que estas SDCMPs son miembros de la superfamilia lectina/asialoglicoproteína de receptores. Véase también el documento USSN 60/053.080, la cual se incorpora a la presente a modo de referencia. El análisis de la SDCMP3 humana sugiere que la proteína es una proteína de membrana tipo II, con el segmento transmembrana activándose a partir de aproximadamente 22 a 142 residuos de la SEC. ID NO: 2 ó 10. La cola citoplasmática se encontraría en el término N, a partir de los residuos 1 a 21 de la SEC. ID NO: 2 ó 10. Un dominio de lectina tipo C (CRD) corresponde aproximadamente a los residuos 79 a 219 de SEC. ID NO: 10. La CRD caracteriza cuatro residuos de cisteína conservados en las posiciones 107, 176, 94 y 202 de SEC. ID NO: 10. Además la CRD tiene una secuencia ácido glutámico-prolina-asparagina que corresponde a los residuos 168-170 de la SEC. ID NO: 10 la cual predice un sitio de enlace que depende de Ca++ para mañosa, N-acetilglucosamina y otros azúcares relacionados. La proteína humana tiene un peso molecular pronosticado de aproximadamente 18,500 daltons, con un punto isoeléctrico de aproximadamente 6 y una carga desde aproximadamente -2.6 a un pH de 7. El análisis de hidrofilicidad indica tramos significativos de secuencia hidrofílica entre aproximadamente 1-22, 42-63, 94-106 y 142-162. Dichos segmentos serán probablemente más antigénicos. Un análisis similar de la SDCMP3 de ratón sugiere que la proteína también es una proteína de membrana tipo II, con el segmento transmembrana ejecutándose desde aproximadamente la ser20 hasta la thr40. La cola citoplasmática se ejecutaría entonces desde aproximadamente metí hasta trp19; y el dominio de lectina tipo C correspondería desde aproximadamente cys79 hasta por lo menos arg162. Dos presuntos sitios de N-glicosilación corresponden a asn131-ser133 y asn183-ser185. Las regiones antigénicas humanas particularmente identificadas por computadora se ejecutarán desde aproximadamente metl-ser18, tyr43-arg53, Iys72-ser85, ser94-asn106 y ser135-arg162. Véase, por ejemplo, la publicación de Beattie et al. (1992) Eur. J. Biochem. 210: páginas 59 a 66. El análisis de la SDCMP4 humana sugiere que la proteína es una proteína de membrana tipo II. Existen dos formas: la forma larga (SEC. ID NO: 5 y 6) y la forma corta (SEC. ID NO: 7 y 8), la cual corresponde a una supresión de la forma larga, y la cual puede ser resultado de un evento de enlace alternativo. Las variaciones clasificadas en la secuencia pueden reflejar errores de secuencia o variantes alélicas. El segmento transmembrana predicho de la forma larga se ejecuta desde aproximadamente Ieu45 hasta met67. La porción amino próxima de la proteína sería citoplasmática. Las regiones antigénicas humanas particularmente identificadas por computadora se ejecutarán desde aproximadamente met1-arg44; trp70-thr113 y asn139-cys20. Una característica notoria es el motivo de internación (YTQL, residuos 14-17) en el interior del dominio intracitoplásmico. La CRD se ejecutaría desde aproximadamente cys120 hasta met247 de la forma larga, y desde aproximadamente cys74 hasta met201 de la forma corta. La forma larga se estima que tendría un peso molecular de aproximadamente 27.6 kD y la forma corta de aproximadamente 22.5 kD, con un punto isoeléctrico calculado de aproximadamente 4.6 y una carga de -7.8 a un pH de 7. El dominio extracelular de las proteínas SDCMP4 contiene un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) de lectina tipo C (dependiente de Ca++), como lo indica la homología de secuencia significativa con otras lectinas. El prototipo de las lectinas tipo C de transmembrana tipo II es el receptor de asialoglicoproteínas hepático (ASGPR). El CRD del ASGPR hepático exhibe especificidad de enlace para la galactosa. Además, el dominio intracelular del ASGPR contiene un motivo a base de tirosina que permite la internación de ligandos. A diferencia del ASGPR ó el macrófago receptor de mañosa, la secuencia del CRD de SDCMP4 no sugiere tan fuertemente su especificidad de azúcares. Dicha falta de sugerencia es también una característica de otras lectinas tipo C, ejemplificado por los receptores NGK2 de las células NK. Los dominios intracelulares de ambas modalidades SDCMP4 despliegan una secuencia de internación (YTQL) del tipo YXX0, en donde 0 representa un aminoácido hidrófobo. Como referencia, el motivo de internación de la cadena ASGPR-H1 hepática es YQDL De manera notoria, varias lectinas tipo C de transmembrana tipo II (por ejemplo, las NKG2 y DC-IR humanas, Ly49 y NKRP1 de ratón) son miembros del sistema de la superfamilia de los inmunoreceptores (IRS). Algunas formas de estos receptores tienen la capacidad de enviar una señal inhibitoria a través de un motivo intracelular ITIM. En contraste, otras formas carecen de un motivo ITIM y de ese modo no transmiten una señal negativa. Un sello distintivo de dichos miembros de IRS no inhibidores es la presencia de un aminoácido cargado en la región transmembrana. De manera alternativa, las formas truncadas pueden interactuar con moléculas accesorias transmembrana. Véase, por ejemplo, la publicación de Lanier et al. (1998) Nature 391 :página 703 a 707 y el documento USSN 60/069,639, ambas incorporadas a la presente a modo de referencia. La SDCMP4 ni despliega un motivo ITIM en su dominio intracelular ni un residuo transmembrana cargado. Sobre esta base, parece poco probable que la SDCMP4 defina una nueva familia de genes IRS de lectinas tipo C. En su lugar, puede sugerirse que la SDCMP4 está relacionada con el sistema ASGPR de moléculas involucradas en la internación de ligandos. Se han identificado dos formas de SDCMP4 que difieren por la presencia de una inserción de 46 aminoácidos próximos a membrana en el dominio extracelular. Las inserciones de esta región también ocurren en los ASGPRs de macrófagos y de células dendríticas (ETA10). Finalmente, la expresión de SDCMP4 se ha observado mediante RT-PCR en células mieloides (células dendríticas, monocitos y granulocitos). En contraste con la SDCMP3, la expresión de la SDCMP4 no sufre regulación por disminución en DC después de la activación por PMA y por ionomicina. Secuencias cercanas a éstas son las secuencias ETA10. Véase, por ejemplo, la publicación de Suzuki et al. (1996) J. Immunol. 56: páginas 128 a 135 y de Sato et al. (1992) J. Biochem. 111: páginas 331 a 336. El dominio extracelular despliega una cantidad de características indicadoras de dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD) tipo C (dependientes de Ca++). Mientras que el CRD de la forma humana parece truncado en su término carboxilo, el CRD de la homologa de ratón (1469D4) no está truncada y clasifica de manera clara a la lectina como un miembro novedoso de la superfamilia tipo C. El prototipo de las lectinas tipo II transmembrana tipo C es el receptor de asialoglicoproteínas (ASGPR) hepático. El ASGPR, sin embargo, contiene una secuencia de internación de ligandos intracitoplasmática a base de tirosina que no se encuentra ni en la SDCMP3 humana ni de ratón. El gen que codifica la SDCMP3 humana genera un mapa en el cromosoma 12 p12-13, por ejemplo, en el complejo del receptor NK humano. De manera destacada, esta región incluye a los genes NGK2 y el gen CD94, los cuales codifican las lectinas tipo II transmembrana tipo C y representan ejemplos del sistema de la superfamilia de inmunoreceptores (IRS). Por lo tanto, los heterodímeros CD94-NKG2A/B de los receptores inhibidores de células asesinas (KIR) transducen una señal negativa en virtud de un motivo ITIM intracelular a base de tirosina en las secuencias NKG2. Sin embargo, las otras formas de NKG2 carecen de un motivo ITIM y los heterodímeros resultantes con CD94 son no inhibidores. El dominio intracelular de la SDCMP3 humana no contiene un motivo ITIM. Sin embargo, con base en su localización cromosómica, así como también en su significativa homología (36.2%) con el gen DC-IR tipo IRS, se predice que es un miembro de una familia novedosa de lectinas tipo C de genes IRS. Por analogía con otros genes IRS, es probable que la SDCMP3 represente a una familia de genes que comprenderá a varios miembros, tanto con función inhibitoria (ITIM) como no inhibitoria. Por RT-PCR, la expresión de la SDCMP3 de primates está restringida a células mieloides, observándose en las células dendríticas (DC), monocitos y macrófagos. La expresión se observa de manera selectiva en DC derivadas de CD14, en lugar de en DC tipo Langerhans derivadas de CD1a.

Finalmente, la expresión de SDCMP3 es regulada por disminución mediante la activación con PMA con ionomicina. Los segmentos de péptidos también pueden utilizarse para diseñar y producir oligonucleótidos adecuados para rastrear una biblioteca para determinar la presencia de un gen similar, por ejemplo, una variante idéntica o polimórfica, o para identificar una DC. El código genético puede utilizarse para seleccionar los oligonucleótidos adecuados útiles como pruebas para rastreo. En combinación con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles en la selección de clones deseados de una biblioteca. Se utilizarán también secuencias complementarias como pruebas o cebadores. Con base en la identificación del término amino probable, otros péptidos deben ser particularmente útiles, por ejemplo, acoplados con un vector anclado o con técnicas de PCR complementarias de poli-A o con ADN complementario de otros péptidos. Se describen en general técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos de genes que codifican estas proteínas de DC, por ejemplo, la subclonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos en vectores de expresión, etiquetado de pruebas, hibridación de ADN y los similares, en la publicación de Sambrook et al. (1989) Molecular Clonina: A Laboratorv Manual (2da. ed.) Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, la cual se incorpora a la presente descripción a modo de referencia y de aquí en adelante se denomina "Sambrook et al.".

Véase también la publicación de Coligan et al. (1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology Green/Wiley, New York, NY, denominado "Coligan et al.". Existen diversos métodos para aislar las secuencias de ADN que codifican estas proteínas de DC. Por ejemplo, se aisla el ADN de una biblioteca genómica o de ADNc utilizando pruebas de oligonucleótidos etiquetadas que tienen secuencias idénticas o complementarias de las secuencias descritas en la presente descripción. Pueden utilizarse pruebas de longitud completa o las pruebas de oligonucleótidos pueden generarse por comparación de las secuencias descritas con otras proteínas y seleccionando cebadores específicos. Dichas pruebas pueden utilizarse directamente en ensayos de hibridación para aislar el ADN que codifica proteínas de DC o se pueden diseñar pruebas para utilizarse en técnicas de amplificación tales como PCR, para el aislamiento del ADN que codifica las proteínas de DC. Para preparar una biblioteca de ADNc, se aisla ARNm a partir de células que expresan la proteína de DC. Se prepara ADNc a partir del ARNm y se liga a un vector recombinante. El vector se transfecta en un huésped recombinante para la propagación, rastreo y clonación. Los métodos para preparar y rastrear bibliotecas de ADNc son bien conocidos. Véase la publicación Gubler y Hoffman (1983) Gene 25: páginas 263 a 269; Sambrook et al.; Coligan et al. Para una biblioteca genómica, el ADN puede extraerse de tejido y agitarse mecánicamente o digerirse enzimáticamente para obtener fragmentos de aproximadamente 12-20 kb. Posteriormente, los fragmentos se separan por centrifugación en gradiente y se clonan en vectores de bacteriófagos lambda. Estos vectores y fagos se empacan in vitro, como se describió anteriormente, por ejemplo en la publicación de Sambrook et al. o de Coligan et al. Los fagos recombinantes se analizan mediante la hibridación en placa como se describió en Benton y Davis (1977) Science 196: páginas 180 a 182. La hibridación en colonias se efectúa como se describió de manera general, por ejemplo, en la publicación de Grunstein et al. ( 975) Proa Nati. Acad. Sci. E.U.A. 72: páginas 3961 a 3965. El ADN que codifica una proteína de DC puede identificarse tanto en bibliotecas de ADNc o genómicas por su capacidad para hibridarse con las pruebas de ácido nucleico descritas en la presente descripción, por ejemplo, en experimentos de hibridación en colonias o en placa. Las regiones del ADN correspondientes se aislan a través de métodos estándar familiares para aquellos expertos en la materia. Véase la publicación de Sambrook et al. También pueden utilizarse diversos métodos de amplificación de secuencias objetivo, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, para preparar ADN que codifica proteínas de DC. La tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar dichas secuencias de ácidos nucleicos directamente a partir del ARNm, del ADNc o de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. Las secuencias aisladas que codifican proteínas de DC también pueden utilizarse como plantillas para la amplificación de PCR.

En las técnicas de PCR, se sintetizan cebadores oligonucleotídicos complementarios de dos regiones 5' en la región del ADN a amplificar. Posteriormente, se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa utilizando a los dos cebadores. Véase la publicación de Innis et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA. Se pueden seleccionar cebadores para amplificar las regiones enteras que codifican una proteína de DC de longitud completa o para amplificar los segmentos de ADN menores, según se desee. En particular, las secuencias que se proporcionaron, proporcionan cebadores de, por ejemplo, 15-30 nucleótidos, los cuales se pueden utilizar para amplificar las secuencias de codificación deseadas o fragmentos de las mismas. Una vez que dichas regiones se amplifican por PCR, pueden secuenciarse y se pueden preparar pruebas oligonucleotídicas a partir de la secuencia obtenida utilizando las técnicas estándar. Estas pruebas pueden utilizarse posteriormente para aislar ADNs que codifican otras formas de las proteínas DC. Los oligonucleótidos para utilizarse como pruebas se sintetizan químicamente de acuerdo con el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage y Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22: páginas 1859 a 1862, o utilizando un sintetizador automático, como se describe en la publicación de Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: páginas 6159 a 6168. La purificación de oligonucleótidos se realiza, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de acrilamida nativa o por HPLC de intercambio aniónico como se describe en la publicación de Pearson y Regnier (1983) J. Chrom. 255: páginas 137 a 149. La secuencia del oligonucleótido sintético puede verificarse utilizando el método de degradación química de Maxam y Gilbert en la publicación de Grossman y Moldave (eds. 1980) Methods in Enzymology 65: páginas 499 a 560 Academic Press, Nueva York. La presente invención, proporciona ADN aislado o fragmentos para codificar una proteína de DC, como se describió anteriormente. Además, la presente invención proporciona ADN aislado o recombinante, el cual codifica una proteína o polipéptido biológicamente activo que tiene la capacidad de hibridarse en las condiciones adecuadas, por ejemplo, de alta rigurosidad, con las secuencias de ADN descritas en la presente descripción. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser una forma de ocurrencia natural o una proteína o fragmento recombinante, y tener una secuencia de aminoácidos como la descrita en SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. Las modalidades preferidas serán aislados naturales de longitud completa, por ejemplo, de un primate. En forma glicosilada, las proteínas deben exhibir tamaños mayores. Además, la presente invención abarca el uso de ADN aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, los cuales codifican proteínas las cuales son homologas de cada proteína de DC respectiva. Los fragmentos de estas SDCMP3 y 4 pueden ser útiles, en combinación con anticuerpos anti-CD3, para co-estimular las células, por ejemplo, células dendríticas o células T. La activación puede ser en combinación con el antígeno. El ADN aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, mejoradores, señales de adición de poli-A y otros. La presente invención abarca secuencias de polinucleótidos de DC que pueden expresarse de manera alterada en comparación con la expresión en una célula normal, por lo tanto, es posible diseñar técnicas terapéuticas o de diagnósticos dirigidas a estas secuencias. Por lo tanto, cuando un trastorno está asociado con la expresión del ácido nucleico de DC, pueden utilizarse las secuencias que interfieran con la expresión de DC a nivel de traducción. Este enfoque utiliza, por ejemplo, ácido nucleico anti-sentido, que incluye la introducción de ARN de dos hebras (dsARN) para interferir genéticamente con la función de los genes, como se describe, por ejemplo, en la publicación de Misquitta et al. (1999) Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 96: páginas 1451 a 1456, y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm de DC específico. Dichos trastornos incluyen trastornos asociados con la desregulación de la expresión. Los ácidos nucleicos anti-sentido son moléculas de ADN ó ARN, por ejemplo, oligodesoxirribonucleótidos, complementarios para por lo menos una porción de una molécula de ARNm específica; véase la publicación de Weintraub (1990) Scientific American 262: páginas 40 a 46. Los oligodesoxirribonucleótidos tienen la capacidad de ingresar a las células de un modo que se puede saturar, independiente de las secuencias y dependiente de las formas de temperatura y energía. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Jaroszewski y Cohén (1991) Advanced Drug Deliverv Reviews 6: páginas 235 a 250; Akhtar et al. (1992) "Pharmaceutical aspects of the biological stability and membrane transport characteristics of antisense oligonucleotides" páginas 133 a 145 en la publicación de Erickson e Izant (eds.) Gene Regulation: Bioloqy of Antisense RNA and DNA Raven Press, Nueva York; y Zhao et al. (1994) Blood 84: página 3660 a 3666. Se ha demostrado que la captación de oligodesoxirribonucleótidos en algunas células inmunológicas, por ejemplo, linfocitos, es regulada por la activación celular. Las células esplénicas estimuladas con el mitógeno LPS de células B ha incrementado dramáticamente la captación de oligodesoxirribonucleótidos en la población de células B, mientras que células esplénicas tratadas con el mitógeno Con A de células T mostraron una captación incrementada de oligodesoxirribonucleótidos por parte de células T pero no por las células B. Véase, por ejemplo, la publicación de Krieg et al. (1991) Antisense Research and Development 1 : páginas 161 a 171. El uso de métodos anti-sentido para inhibir la traducción in vitro de genes es bien conocido en la materia. Véase, por ejemplo, la publicación de Markus-Sakura (1988) Anal. Biochem 172: páginas 289 a 295 y Akhtar (ed. 1995) Deliverv Strateqies for Antisense Oliqonucleotide Therapeutics CRC Press, Inc. Las ribozimas son moléculas de ARN que tienen la capacidad de dividir de manera específica otros ARN de hebra única de una manera análoga a las endonucleasas de restricción del ADN. A través de la modificación de secuencias nucleotídicas que codifican a estos ARNs, es posible desarrollar por ingeniería moléculas que reconocen las secuencias nucleotídicas específicas en una molécula de ARN y la dividirla. Véase, por ejemplo, la publicación de Cech (1988) J. Amer. Med. Assn. 260: páginas 3030 a 3034. Una ventaja principal de este método es que, debido a que son específicos de secuencia, únicamente los ARNms con secuencias particulares son desactivados. Existen principalmente dos tipos básicos de ribozimas: los de tipo tetrahimena y los de tipo "cabeza de martillo". Véase, por ejemplo, la publicación de Haseloff (1988) Nature 334: páginas 585 a 591. Las ribozimas de tipo tetrahimena reconocen secuencias con una longitud de cuatro bases mientras que las ribozimas de tipo "cabeza de martillo" reconocen secuencias de base de 11 a 18 bases de largo. Cuanto más larga la secuencia de reconocimiento, mayor la probabilidad de que la secuencia ocurra de manera exclusiva en la especie de ARNm objetivo. En consecuencia, las ribozimas de tipo cabeza de martillo se prefieren a las ribozimas de tipo tetrahimena para desactivar una especie de ARNm específica y se prefieren secuencias de reconocimiento de 18 bases a secuencias de reconocimiento más cortas.

IV. PREPARACION DE PRODUCTOS DE GEN DE PC Los ADNs que codifican estas proteínas de DC o fragmentos de los mismos pueden obtenerse mediante síntesis química, por rastreo de bibliotecas de ADNc, o por rastreo de bibliotecas genómicas preparadas a partir de una variedad de líneas celulares o muestras de tejido. Estos ADNs pueden expresarse en una amplia variedad de células huésped para la síntesis de una proteína de longitud completa o fragmentos que pueden, por ejemplo, utilizarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales, para estudios de enlace; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada una de estas proteínas de DC o sus fragmentos pueden expresarse en células huésped que estén transformadas o transfectadas con los vectores de expresión adecuados. Estas moléculas pueden purificarse de manera sustancial para liberarlas de contaminantes proteicos o celulares, diferentes de los derivados del huésped recombinante, y por lo tanto son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El antígeno, o porciones del mismo, puede expresarse como fusiones con otras proteínas. Los vectores de expresión normalmente son construcciones de ADN ó ARN auto-replicantes que contienen el gen de DC deseado o sus fragmentos, usualmente unido de forma operativa a elementos de control genético adecuados que son reconocidos en una célula huésped adecuada. Estos elementos de control tienen la capacidad de efectuar la expresión dentro de un huésped adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para efectuar la expresión dependerá de la célula huésped eventual utilizada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema de promotores procarióticos o un sistema de control de expresión de promotores eucarióticos, y normalmente incluyen a un promotor de transcripción, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, reforzadores de transcripción para elevar el nivel de expresión del ARNm, una secuencia que codifica un sitio de enlace a ribosomas adecuado y secuencias que terminen la transcripción y traducción. Los vectores de expresión, también contienen usualmente un origen de replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula huésped. Los vectores de la presente invención contienen ADNs los cuales codifican las diversas proteínas de DC, o un fragmento de las mismas, que normalmente codifican, por ejemplo, un polipéptido biológicamente activo o proteína. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y puede codificar un marcador de selección. La presente invención contempla además el uso de dichos vectores de expresión los cuales tienen la capacidad de expresar ADNc eucariótico que codifica una proteína de DC en un huésped procariótico o eucariótico, en donde el vector es compatible con el huésped y en donde el ADNc eucariótico que codifica la proteína se inserta en el vector de modo que el crecimiento del huésped que contiene el vector expresa al ADNc en cuestión. Habitualmente los vectores de expresión se diseñan para la replicación estable en sus células huésped o para aumentar en gran medida el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una célula huésped, por ejemplo, es posible efectuar la expresión transitoria de la proteína o sus fragmentos en diversos huéspedes utilizando vectores que no contienen un origen de replicación que sea reconocido por la célula huésped. También es posible utilizar vectores que provoquen la integración de un gen de DC o sus fragmentos en el ADN huésped mediante recombinación, o para integrar un promotor el cual controla la expresión de un gen endógeno. Véase, por ejemplo, el documento de Treco et al., W096/29411. Los vectores, como se emplean en la presente invención, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN que se pueden integrar y otros vehículos que permiten la integración de los fragmentos de ADN en el interior del genoma del huésped. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que efectúan la expresión de genes unidos de manera operativa. Los plásmidos son la forma más comúnmente utilizada de vector, aunque todas las otras formas de vectores que sirvan a una función equivalente son adecuadas para usar en la presente invención. Véase, por ejemplo, la publicación de Pouweis et al. (1985 y Suplementos) Cloninq Vectors: A Laboratorv Manual Elsevier, N.Y.; y Rodríguez et al. (eds. 1988) Vectors: A Survev of Molecular Cloninq Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA.

Las células huésped adecuadas incluyen a procarióticas, eucarióticas inferiores y eucarióticas superiores. Las procarióticas incluyen a organismos tanto gram negativos como gram positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Las eucarióticas inferiores incluyen a levaduras, por ejemplo S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Las eucarióticas superiores incluyen líneas celulares de cultivos de tejidos establecidos a partir de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insectos y aves, como de origen mamífero, por ejemplo, de humanos, primates y roedores. Los sistemas de vectores de huéspedes procarióticas incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Como se emplean en la presente, la E. coli y sus vectores se utilizarán genéricamente para incluir a los vectores equivalentes utilizados en otras procarióticas. Un vector representativo para amplificar el ADN es pBR322 ó sus derivados. Los vectores que se pueden utilizar para expresar proteínas de DC ó fragmentos, incluyen, aunque no se limitan, vectores tales como aquellos que contienen el promotor lac (serie pUC), el promotor trp (pBR322-trp), el promotor Ipp (la serie pIN), los promotores lambda-pP o pR (pOTS) o promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase el documento de Brosius et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en la publicación de Rodríguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survev of Molecular Cloninq Vectors and Their Uses 10: páginas 205 a 236 Buttersworth, Boston, MA.

Las eucarióticas inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium, pueden transformarse con vectores que contengan secuencias génicas de DC. Para los propósitos de la presente invención, el huésped eucariótida inferior más común es la levadura de panadería, el Saccharomyces cerevisiae. Se utilizará en forma genérica para representar a las eucarióticas inferiores, aunque también se dispone de una cantidad de otras cepas y especies. Los vectores de levadura consisten normalmente en un origen de replicación (a menos que sea del tipo integrador), un gen de selección, un promotor, ADN que codifique la proteína deseada o sus fragmentos y secuencias para la terminación de la traducción, poliadenilación y terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levaduras incluyen a aquellos promotores constitutivos como el de la 3-fosfoglicerato quinasa y varios otros promotores de genes de enzimas glicolíticas o promotores que se pueden inducir, como el promotor del alcohol dehidrogenasa 2 o el promotor de la metalotionina. Los vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: auto-replicante de número de copias bajo (tal como la serie YRp), auto-replicante de número de copias elevado (tal como la serie YEp); de tipo integrador (tal como la serie Ylp) o mini-cromosomas (tal como la serie YCp). Las células de cultivos de tejidos de eucarióticas superiores son las células huésped preferidas para la expresión de la proteína de DC. En principio, puede utilizarse casi cualquier línea celular de cultivos de tejido de eucarióticas superiores, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus de insectos, ya sea de una fuente invertebrada o vertebrada. Sin embargo, se prefieren células de mamíferos para lograr un procesamiento adecuado, tanto en forma de co-traducción como post-traducción. La transformación o transfección y propagación de dichas células es rutinaria. Las líneas celulares útiles incluyen las células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñon de cría de rata (BRK), líneas celulares de insectos, líneas celulares de aves y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas celulares habitualmente incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de traducción, sitios de enlace de ARN (por ejemplo, si se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de transcripción. Estos vectores pueden también contener un gen de selección o un gen de amplificación. Vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus portadores de promotores derivados, por ejemplo, de fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vacuna o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen a pCDNAl y pCD; véase la publicación de Okayama et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5: páginas 1136 a 1142; pMCIneo Poly-A, véase la publicación de Thomas et al. (1987) Cell 51: páginas 503 a 512; y un vector de baculovirus tal como pAC 373 ó pAC 610. Además, las secuencias no codificadoras de corriente ascendente del gen de DC ó secuencias codificadoras o no codificadoras dentro del gen de DC pueden ser moduladas mediante selección de objetivo de gen, en la cual se crea una unidad de transcripción de DC novedosa que expresa las proteínas de DC. La introducción y designación como objetivo de las secuencias exógenas que modulen la proteína de DC, por ejemplo, incrementando la expresión del gen expresado en una célula, cambiando el patrón de regulación o inducción o reduciendo o eliminando la expresión del gen, se describen, por ejemplo, en el documento de Treco et al. (1998) W096/29411 titulado "Protein Production and Delivery". En ciertos casos, las proteínas de DC no necesitan estar glicosiladas para producir respuestas biológicas en ciertos ensayos. Sin embargo, a menudo será deseable expresar un polipéptido de DC en un sistema que proporciona un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón habitual será el proporcionado de manera natural por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón se podrá modificar exponiendo el polipéptido, por ejemplo, en forma no giicosilada, a las proteínas glicosiiantes adecuadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, un gen de DC puede co-transformarse con uno o más genes que codifican enzimas glicosiiantes de mamífero u otras. Se comprenderá adicionalmente que la sobre-glicosilación puede ser perjudicial para la actividad biológica de la proteína de DC y que un experto puede realizar los ensayos de rutina para optimizar el grado de glicosilación que confiera la actividad biológica óptima. Una proteina de DC, o un fragmento de la misma, puede diseñarse para unirse a una membrana celular a través de fosfatidil inositol (Pl), pero puede removerse de las membranas mediante el tratamiento con una enzima que divide el enlace con el fosfatidil inositol, por ejemplo, la fosfatidil inositol fosfol¡pasa-C. Esto libera al antígeno en una forma biológicamente activa y permite la purificación mediante los procedimientos estándar de la química de proteínas. Véase, por ejemplo, la publicación de Low (1989) Biochem. Biophys. Acta 988: páginas 427 a 454; la publicación de Tse et al. (1985) Science 230: páginas 1003 a 1008; la publicación de Brunner et al. (1991 ) J. Cell Biol. 114: páginas 1275 a 1283; y la publicación de Coligan et al. (Eds.) (1996 y suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science, John Wilew and Sons, Nueva York, NY. Ahora que estas proteínas SDCMP han sido caracterizadas, pueden prepararse fragmentos o derivados de las mismas mediante los procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los descritos en la publicación de Stewart y Young (1984) Solíd Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, IL; la publicación de Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springler-Verlag, Nueva York, NY; y la publicación de Bodanszky (1984) The Principies of Peptide Synthesis Springler-Verlag, Nueva York, NY. Véase también la publicación de Merrifield (1986) Science 232: páginas 341 a 347; y la publicación de Dawson et al. (1994) Science 266: páginas 776 a 779. Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento con azida, un procedimiento con cloruro de ácido, un procedimiento con anhídrido de ácido, un procedimiento con anhídrido mixto, un procedimiento con éster activo (por ejemplo, éster de p-n¡trofenil, éster de N-hidroxisuccinimida o éster de cianometil), un procedimiento con carbodiimidazol, un procedimiento de óxido-reducción o un procedimiento con diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivos. Las síntesis tanto en fase sólida como en fase de solución se pueden aplicar a los procedimientos antes mencionados. La proteína preparada y los fragmentos de la misma pueden aislarse y purificarse de la mezcla de reacción por medio de la separación de péptidos, por ejemplo, por extracción, precipitación, electroforesis y diversas formas de cromatografía, y similares. Las proteínas de DC de la presente invención pueden obtenerse en grados variables de pureza dependiendo del uso deseado. La purificación puede lograrse mediante el uso de técnicas de purificación de proteínas conocidas o mediante el uso de los anticuerpos o parejas de enlace descritas en la presente descripción, por ejemplo, en cromatografía de afinidad por inmuno-absorción. Esta cromatografía de afinidad por inmuno-absorción se realiza uniendo en primer lugar los anticuerpos a un soporte sólido y poniendo en contacto los anticuerpos unidos con lisados solubilizados de células fuente adecuadas, lisados de otras células que expresen la proteína o lisados o supernadantes de células que producen las proteínas como resultado de técnicas de ADN; véase más adelante. Múltiples líneas celulares pueden rastrearse en busca de una que exprese dicha proteína a un nivel alto en comparación con otras células. Diversas líneas celulares, por ejemplo, una línea celular TA4 stromal de timo de ratón, se rastrean y seleccionan por sus propiedades de manipulación favorables. Las proteínas celulares de DC naturales pueden aislarse a partir de fuentes naturales o por expresión a partir de una célula transformada utilizando un vector de expresión adecuado. La purificación de la proteína expresada se consigue mediante los procedimientos estándar o puede combinarse con medios de ingeniería genética para la purificación efectiva con alta eficiencia a partir de lisados o supemadantes celulares. Los segmentos FLAG o His6 pueden utilizarse para dichas características de purificación.

V. ANTICUERPOS Pueden producirse anticuerpos para las diversas proteínas de DC, que incluye las variantes individuales, polimórficas, alélicas, de cepa o de especie y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas naturales (de longitud completa) como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, se pueden producir anticuerpos para proteínas de DC, ya sea en sus formas activas como en sus formas inactivas. También pueden utilizarse anticuerpos anti-idiotípicos. a. Producción de Anticuerpos Puede utilizarse una cantidad de inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con estas proteínas de DC. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. La proteína de ocurrencia natural también puede utilizarse, ya sea en forma pura o impura. Los péptidos sintéticos preparados utilizando las secuencias de proteínas de DC humanas descritas en la presente descripción, también pueden emplearse como inmunógenos para la producción de anticuerpos para la proteína de DC. La proteína recombinante puede expresarse en células eucarióticas o procarióticas como se describe en la presente descripción y purificarse como se describe. Posteriormente, el producto se inyecta en un animal que tiene la capacidad de producir anticuerpos. Los anticuerpos tanto monoclonales como policlonales pueden generarse para su posterior uso en inmunoensayos para medir la proteína. Los métodos para la producción de anticuerpos policlonales son conocidos por aquellos expertos en la materia. A modo de resumen, un inmunogeno, preferentemente una proteína purificada, se mezcla con un adyuvante y se inmunizan los animales con la mezcla. La respuesta inmune del animal a la preparación del inmunogeno se monitorea tomando muestras de sangre y determinando el título de reactividad para la proteína de DC de interés. Cuando se obtienen títulos adecuadamente altos de anticuerpo para el inmunogeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Puede efectuarse, si se desea, un fraccionamiento posterior de los antisueros para enriquecer los anticuerpos reactivos para la proteína. Véase, por ejemplo, la publicación de Harlow y Lañe. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante diversas técnicas familiares para aquellos expertos en la materia. A modo de resumen, se inmortalizan células esplénicas de un animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente mediante fusión con una célula de mieloma. Véase, por ejemplo, la publicación de Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: páginas 511 a 519, la cual se incorpora a la presente descripción a modo de referencia. Los métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con el Virus Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos conocidos en la materia. Las colonias generadas a partir de células inmortalizadas únicas son rastreadas para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antígeno y la producción de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede mejorarse mediante diversas técnicas, que incluyen la inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. De manera alternativa, se pueden aislar secuencias de ADN que codifiquen un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace del mismo mediante el rastreo de una biblioteca de ADN a partir de células B humanas de acuerdo con el protocolo general señalado en la publicación de Huse et al. (1989) Science 246: páginas 1275 a 1281. Pueden producirse anticuerpos, que incluyen fragmentos de enlace y versiones de cadena única, contra fragmentos previamente determinados de estas proteínas de DC, por inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas transportadoras como se describió anteriormente. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que segregan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden rastrearse para la enlace a proteínas de DC normales o defectuosas, o rastrearse por su actividad agonista o antagonista. Estos anticuerpos monoclonales se unirán habitualmente con una KD de por lo menos aproximadamente 1 mM, más habitualmente con por lo menos aproximadamente 300 µ?, normalmente con por lo menos aproximadamente 10 µ?, más normalmente con por lo menos aproximadamente 30 µ?, preferentemente con por lo menos aproximadamente 10 µ? y más preferentemente con por lo menos aproximadamente 3 µ? o mejor. En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. La descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales puede encontrarse, por ejemplo, en la publicación de Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunoloqy (4ta. ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en la misma; la publicación de Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual CHS Press; la publicación de Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2da. ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y particularmente en la publicación de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: páginas 495 a 497, la cual plantea un método para la generación de anticuerpos monoclonales. Resumido de forma breve, este método implica inyectar a un animal con un inmunógeno para iniciar una respuesta inmune humoral. El animal es entonces sacrificado y se toman células de su bazo, que luego se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que tiene la capacidad de reproducirse ¡n vitro. La población de hibridomas se somete luego a rastreo para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una especie de anticuerpo única para el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de las células B únicas inmortalizadas y clonadas a partir de un animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico reconocido en la sustancia inmunógena. Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase la publicación de Huse et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: páginas 1275 a 1281; y la publicación de Ward et al, (1989) Nature 341 : páginas 544 a 546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse con o sin modificación, que incluye anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos serán etiquetados por enlace, ya sea en forma covalente o no covalente, de una sustancia que proporciona una señal que se puede detectar. Se conoce una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación y se informan extensamente tanto en la literatura científica como de patentes. Las etiquetas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichas etiquetas incluyen a las Patentes de E.U.A. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 y 4,366,241. También pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes.

Véase el documento de Cabilly, la Patente de E.U.A. No. 4,816,567 y la publicación de Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 86: páginas 10029 a 10033. Los anticuerpos de la presente invención, también pueden utilizarse para la cromatografía de afinidad en el aislamiento de cada proteína de DC. Pueden prepararse columnas en donde los anticuerpos se unen a un soporte sólido, por ejemplo, partículas tales como la agarosa, SEPHADEX ó similares, en donde puede pasarse a través de la columna un lisado celular, lavarse la columna, seguido de concentraciones incrementadas de un desnaturalizante moderado, tras lo cual se liberará la proteína de DC purificada. Los anticuerpos también se pueden usar para rastrear bibliotecas de expresión en busca de productos de expresión particulares. Habitualmente los anticuerpos utilizados en dicho procedimiento estarán etiquetados con una porción que permita la fácil detección de presencia de antígeno por enlace del anticuerpo. Los anticuerpos para las proteínas SDCMP pueden utilizarse para el análisis o la identificación de componentes específicos de la población celular que expresan la proteína respectiva. Realizando ensayos de los productos de expresión de células que expresan las proteínas de DC es posible diagnosticar enfermedades, por ejemplo, condiciones comprometidas por él sistema inmune, condiciones con DC suprimidas o sobreproducción de DC.

Los anticuerpos producidos contra cada DC, también serán útiles para producir anticuerpos anti-idiotípicos-anticuerpo. Estos serán útiles en la detección o diagnóstico de varias condiciones inmunológicas relacionadas con la expresión de los antígenos respectivos. b. Humanización El uso de fuentes no humanas puede limitar la eficacia terapéutica de un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos derivados de fuentes murinos u otras fuentes no humanas pueden provocar una respuesta inmune, un débil reclutamiento de la función efectora y rápida eliminación del torrente sanguíneo (Baca et al. (1997) J. Biol. Chem, 272: páginas 10678 a 10684). Por estas razones, puede resultar deseable preparar anticuerpos terapéuticos por humanización (Carpenter et al. (2000) J. Immunol. 165: página 6205; He et al. (1998) J. Immunol. 160: página 1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: páginas 27371 a 27378). Un anticuerpo humanizado contiene las secuencias de aminoácidos de seis regiones determinantes de complemento (CDRs) del anticuerpo de ratón progenitor, las cuales se injertan en un armazón de anticuerpo humano. Para lograr un enlace óptima, el anticuerpo humanizado puede necesitar un ajuste fino, cambiando ciertos aminoácidos del armazón, habitualmente involucrados en el soporte de la conformación de las CDRs, volviendo a los aminoácidos correspondientes descubiertos en el anticuerpo de ratón progenitor.

Una alternativa a la humanización es usar bibliotecas de anticuerpos humanos desplegadas sobre fagos (Vaughan et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: páginas 309 a 314; Barbas (1995) Nature Med. 1 : páginas 837 a 839; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: páginas 18218 a 18230; McCafferty et al. (1990) Nature 348: páginas 552 a 554; Clackson et al. (1991 ) Nature 352: páginas 624 a 628; Marks et al. (1991 ) J. Mol. Biol. 222: páginas 581 a 597), o bibliotecas de anticuerpos humanos contenidas en los ratones transgénicos (Méndez et al. (1997) Nature Genet. 15: páginas 146 a 156). La técnica de despliegue de fagos puede utilizarse para rastrear y para seleccionar anticuerpos con gran afinidad de enlace (Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21 : páginas 371 a 377; Barbas et al. (2001 ) Phaqe Display: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nueva York; Kay et al. (1996) Phaqe Display of Peptides and Proteins: A Laboratorv Manual, Academic Press, San Diego, CA). El uso del método de despliegue de fagos puede proporcionar una secuencia de ADN que proporciona un anticuerpo monovalente de enlace estrecha, desplegado sobre la superficie del fago filamentoso. Con esta secuencia de ADN a mano, el investigador puede construir un anticuerpo bivalente humanizado de enlace estrecha. Una biblioteca de despliegue de fagos puede comprender anticuerpos de cadena única, en donde las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras se fusionan mediante un enlazador en un gen único, o puede comprender cadenas pesadas y ligeras co-expresadas (de Bruin et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: páginas 397 a 399). a. Inmunoensayos Una proteína particular puede medirse mediante una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo en general, véase la publicación de Stites y Terr (eds.) 1991 Basic and Clinical Immunoloqy (7ma. ed.). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden realizarse en una cualquiera de diversas configuraciones, las cuales se revisan en forma extensa en las publicaciones de Maggio (ed. 1980) Enzvme Immunoassay CRC Press, Boca Ratón, Florida; de Tijssen (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Bioloqy, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; y de Harlow y Lañe Antibodies, A Laboratorv Manual, supra, cada una de las cuales se incorpora a la presente descripción a modo de referencia. Véase también la publicación de Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991) Principies and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; y Ngo (ed. 1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY. Los inmunoensayos para medición de estas proteínas de DC pueden realizarse mediante una variedad de métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. A modo de resumen, los inmunoensayos para medir la proteína pueden ser ensayos de enlace competitivos o no competitivos. En los ensayos de enlace competitivos, la muestra a analizar compite con un analito etiquetado para sitios de enlace específicos sobre un agente de captura unido a una superficie sólida. Preferentemente, el agente de captura es un anticuerpo específicamente reactivo con la proteína de DC producido como se describió anteriormente. La concentración de analto etiquetado unido al agente de captura es inversamente proporcional a la cantidad de analito libre presente en la muestra. En un inmunoensayo de enlace competitiva, la proteína de DC presente en la muestra compite con la proteína etiquetada para unirse a un agente de enlace específico, por ejemplo, un anticuerpo específicamente reactivo con la proteína de DC. El agente de enlace puede estar unido a una superficie sólida para efectuar la separación de la proteína etiquetada unida desde la proteína marcada no unida. De manera de manera alternativa, el ensayo de enlace competitivo puede efectuarse en fase líquida y puede utilizarse cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la materia para separar la proteína etiquetada unida a partir de la proteína etiquetada no unida. Después de la separación, se determina la cantidad de proteína etiquetada unida. La cantidad de proteína presente en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de enlace de proteína marcada. De manera alternativa, puede realizarse un inmunoensayo homogéneo en el cual no es necesario un paso de separación. En estos inmunoensayos, la etiqueta de la proteína se altera por al enlace de la proteína a su agente de enlace específico. Esta alteración en la proteína marcada tiene como resultado una disminución o incremento de la señal emitida por la etiqueta, de tal manera que la medición de la etiqueta al final del inmunoensayo permite la detección o cuantificación de la proteína. Estas proteínas de DC, también pueden determinarse en forma cuantitativa mediante una variedad de métodos de inmunoensayo no competitivos. Por ejemplo, puede utilizarse un inmunoensayo emparedado de dos sitios en fase sólida. En este tipo de ensayo, un agente de enlace para la proteína, por ejemplo, un anticuerpo, se anexa a un soporte sólido. Un segundo agente de enlace de la proteína, que también puede ser un anticuerpo, y que se une a la proteína en un sitio diferente, se etiqueta. Después de la enlace en ambos sitios de la proteína, el agente de enlace marcado no unido se elimina y se mide la cantidad de agente de enlace etiquetado unido a la fase sólida. La cantidad de agente de enlace etiquetado unido es directamente proporcional a la cantidad de proteína de la muestra. Se puede utilizar análisis de manchado Western para determinar la presencia de proteínas de DC en una muestra. Se realiza la eiectroforesis, por ejemplo, en una muestra de tejido que se sospecha contiene la proteína. Después de la eiectroforesis para separar las proteínas, y la transferencia de las proteínas a un soporte sólido adecuado, tal como un filtro de nitrocelulosa, el soporte sólido se incuba con un anticuerpo reactivo con la proteína desnaturalizada. Este anticuerpo puede estar etiquetado, o de manera alternativa, puede detectarse mediante la incubación posterior con un segundo anticuerpo etiquetado que se une al anticuerpo primario.

Los formatos de inmunoensayo descritos anteriormente, emplean componentes de ensayo etiquetados. La etiqueta puede encontrarse en una variedad de formas. La etiqueta puede acoplarse directamente o indirectamente al componente deseado del ensayo, de acuerdo con los métodos bien conocidos en la materia. Puede utilizarse una amplia variedad de etiquetas. El componente puede etiquetarse mediante cualquiera de varios métodos. Tradicionalmente se usa una etiqueta radioactiva que incorpora 3H, 125l, 35S, 14C ó 32P. Las etiquetas no radioactivas incluyen ligandos, los cuales se unen a anticuerpos etiquetados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos que pueden servir como miembros de un par de enlace específico para una proteína etiquetada. La elección de la etiqueta depende de la sensibilidad requerida, de la facilidad de conjugación con el compuesto, de requerimientos de estabilidad y del instrumental disponible. Para una revisión de los diversos sistemas de etiquetado o productores de señales que pueden utilizarse, véase la Patente de E.U.A. No. 4,391 ,904, la cual se incorpora a la presente descripción a modo de referencia. Los anticuerpos reactivos con una proteína particular, también pueden medirse mediante una variedad de métodos de inmunoensayo. Para revisiones de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayos que se pueden aplicar a la medición de anticuerpos mediante técnicas de inmunoensayo, véanse, por ejemplo, las publicaciones de Stites y Terr (eds.) Basic and Clinical Immunology (7ma. ed.) supra; Maggio (ed.) Enzvme Immunoassav, supra; y Harlow y Lañe Antibodies, A Laboratory Manual, supra. También puede utilizarse una variedad de formatos de inmunoensayo, técnicas de separación y etiquetas diferentes, similares a aquellos descritos anteriormente para la medición de proteínas específicas.

VI. PROTEINAS SDCMP PURIFICADAS Se proporcionan secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de primates, por ejemplo, de SDCMP3 humana en las SEC. ID NO: 1 , 2; se proporcionan secuencias de roedor SEC. ID NO. 9 y 10; de roedores, por ejemplo, secuencias SDCMP3 de ratón en las SEC. ID NO: 3 y 4. Se proporcionan secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de primates, por ejemplo, de SDCMP4 humano en las SEC. ID NO: 5, 6, 7 y 8. Las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer dichos segmentos, y permiten la preparación de oligonucleótidos, los cuales codifican dichas secuencias. Se dispone de métodos de purificación estándar y la purificación puede seguirse del uso de anticuerpos específicos.

VIL VARIANTES FISICAS La presente invención, también abarca proteínas o péptidos que tienen una similitud sustancial en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácido de una SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. Las variantes que exhiben sustituciones, por ejemplo, de 20 ó menos, preferentemente de 10 ó menos, y más preferentemente de 5 ó menos sustituciones, también se permiten. En los casos en que las sustituciones son sustituciones conservadoras, las variantes compartirán similitud inmunogénica o antigénica o reactividad cruzada con una proteína de secuencia natural correspondiente. Las variantes naturales incluyen variantes individuales, alélicas, polimórficas, de cepa o de especie. La similitud en la secuencia de aminoácidos, o identidad de secuencia, se determina optimizando las coincidencias de residuos, de ser necesario, introduciendo brechas según se requiera. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservadoras como coincidencias. Las sustituciones conservadoras normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de aminoácidos homologas incluyen variaciones naturales alélicas e interespecies en cada secuencia de proteína respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán una similitud del 50 al 100% (si pueden introducirse brechas), hasta del 75 al 100% de similitud (si se incluyen sustituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de la proteína de DC relevante. Las medidas de identidad serán de por lo menos aproximadamente el 50%, generalmente de por lo menos el 60%, más generalmente por lo menos el 65%, habitualmente por lo menos el 70%, más habitualmente por lo menos el 75%, preferentemente de por lo menos el 80% y más preferentemente de por lo menos el 80%, y en modalidades particularmente preferidas por lo menos el 85% ó más. Véase también las publicaciones de Needleham et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: páginas 443 a 453; Sankoff et al. (1983) Time Warps. String Edits, and Macromolecules: The Theorv and Practice of Sequence Comparison, Capítulo Uno, Addison-Wesley, Reading, MA; y paquetes de software del NCBI en el NIH; y Grupo de Computación Genética (GCG) de la Universidad de Wisconsin, Madison, Wl. Los ácidos nucleicos que codifican las correspondientes proteínas de DC de mamíferos se hibridan a porciones codificadoras la de SEC. ID NO: 1 , 3, 5, 7 ó 9 en condiciones rigurosas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de DC respectivas se hibridarán normalmente al ácido nucleico de la SEC. ID NO: 1 , 3, 5, 7 ó 9 en condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo, proporcionando una señal por lo menos 2X respecto del fondo, preferentemente 5X, 15X ó 25X respecto del fondo, proporcionando al mismo tiempo pocas señales de hibridación falsas positivas. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para estar en aproximadamente una temperatura de 10°C por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia a la que se híbrida a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo se híbrida para una prueba perfectamente coincidente. Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sales en el lavado sea de aproximadamente 0.02 molar a un pH de 7 y la temperatura sea de por lo menos aproximadamente 50°C. Otros factores pueden afectar de manera significativa la rigurosidad de la hibridación, que incluye, entre otros, la composición base y el tamaño de las hebras complementarias, la presencia de solventes orgánicos tales como la formamida y el grado de falta de concordancia de base. Una modalidad preferida incluirá ácidos nucleicos que se unirán a las secuencias descritas en formamida al 50% y 20-50 mM de NaCI a una temperatura de 42°C. Un ADN del gen de DC aislado puede modificarse fácilmente mediante sustituciones de nucleótidos, eliminaciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de regiones de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado secuencias de ADN novedosas que codifican estos antígenos de DC, sus derivados, o proteínas que tienen actividad fisiológica, inmunogénica o antigénica sumamente similar. Las secuencias modificadas pueden utilizarse para producir antígenos mutantes o para mejorar la expresión. La expresión mejorada puede involucrar la amplificación de genes, la transcripción incrementada, la traducción incrementada y otros mecanismos. Tales derivados de proteínas de DC mutantes incluyen mutaciones específicas del sitio o previamente determinadas de la proteína respectiva o sus fragmentos. La "proteína de DC muíante" abarca un polipéptido que de lo contrario se encuentra dentro de la definición de homología de la proteína de DC como se estableció anteriormente, aunque tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de la proteína de DC como se encuentra en la naturaleza, ya sea por causa de eliminación, sustitución o inserción. En particular, una "proteína de DC mutante específica del sitio" por lo general incluye a proteínas que tienen una similitud significativa con una proteína que tiene una secuencia, por ejemplo, la SEC. ID NO: 2 ó 10. Por lo general, la variante compartirá muchas actividades fisicoquímicas y biológicas, por ejemplo, antigénicas o inmunogénicas, con aquellas secuencias, y en las modalidades preferidas, contendrá la mayor parte de o toda la secuencia descrita. Conceptos similares se aplican a estas diversas proteínas de DC, en particular aquellas que se encuentran en varios animales de sangre caliente, por ejemplo, primates y mamíferos. Aunque los sitios de mutación específica del sitio están previamente determinados, los mutantes no necesitan ser específicos del sitio. La mutagénesis de la proteína de DC puede realizarse haciendo inserciones o eliminaciones de aminoácidos. Pueden generarse sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualesquiera combinaciones para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones de terminal amino o carboxilo. La mutagénesis aleatoria puede realizarse en un codón objetivo y los mutantes expresados pueden entonces rastrearse en busca de la actividad deseada. Son bien conocidos en la materia los métodos para realizar mutaciones por sustitución en sitios previamente determinados en el ADN que tiene una secuencia conocida, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis con cebador M13 ó reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase también las publicaciones de Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1987 y Suplementos). Las mutaciones en el ADN normalmente no deberían colocar secuencias codificadoras fuera de marcos de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que podrían hibridarse para producir una estructura de ARNm secundaria tal como lazos u horquillas. La presente invención, también proporciona proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas que utilizan segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que normalmente no están fusionadas de la misma manera. Por lo tanto, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de DC respectivo es una molécula proteica continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, normalmente elaborado como producto único de traducción y que exhibe propiedades derivadas de cada péptido de origen. Un concepto similar se aplica a secuencias de ácidos nucleicos heterólogos. Además, pueden prepararse nuevas construcciones a partir de la combinación de dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, pueden "intercambiarse" dominios u otros segmentos entre polipéptidos de fusión o fragmentos nuevos diferentes, normalmente con proteínas relacionadas, por ejemplo, con las familias de las lectinas o asialoglicoproteínas. Preferentemente, se utilizarán dominios estructurales intactos, por ejemplo, porciones intactas de Ig. Véase, por ejemplo, las publicaciones de Cunningham et al (1989) Science 243: páginas 1330 a 1336 y O'Dowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: páginas 15985 a 15992. Por lo tanto, los polipéptidos quiméricos nuevos que exhiben combinaciones nuevas de especificidades darán como resultado el enlace funcional de especificidades de enlace a proteínas y de otros dominios funcionales. Asimismo, puede aplicarse la mutagénesis de barrido de alanina, preferentemente a residuos que estructuralmente son exteriores a la estructura secundaria, que evitarán la mayor parte de los residuos críticos que generalmente interrumpen la estructura terciaria. Los "derivados" de estas proteínas de DC incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos, variantes de glicosilación y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes pueden prepararse mediante el enlace de funcionalidades a grupos que se encuentran en éstas cadenas laterales o en los términos N- o C- de proteínas de DC, por medios que son bien conocidos en la materia. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas alifáticos del término carboxilo, o de residuos que contienen cadenas laterales carboxilos, derivados O-acilo de grupos hidroxilo que contienen residuos y derivados N-acil de la terminal amino del aminoácido o grupos amino que contienen residuos, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de porciones alquilo que incluyen a alquilo normal de 03 a C18, formando por lo tanto especies alcanoíl aroílo. La enlace covalente a proteínas transportadoras puede ser importante cuando las porciones inmunogénicas son haptenos.

En particular, se incluyen alteraciones de glicosilación, por ejemplo, realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en pasos de procesamiento posteriores. Los medios particularmente preferidos para lograr esto son exponer el polipéptido a enzimas de glicosilación derivadas de células que normalmente proporcionan dicho procesamiento, por ejemplo, enzimas de glicosilación de mamíferos. También se contemplan enzimas desglicosilantes. También se abarcan versiones de la misma secuencia primaria de aminoácidos que tiene otras modificaciones menores, que incluye residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina, u otras porciones, que incluyen grupos ribosilo o reactivos de enlace cruzado. También, se incluyen proteínas que comprenden sustituciones, que deben retener una inmunogenicidad sustancial, para producir anticuerpos que reconozcan a una proteína, por ejemplo, la SEC. ID NO: 2 ó 10. Normalmente, estas proteínas contendrán menos de 20 sustituciones de residuos a partir de la secuencia descrita, más normalmente menos de 10 sustituciones, preferentemente menos de 5 y más preferentemente menos de tres. De manera alternativa, las proteínas que comienzan y terminan en dominios estructurales retendrán habituaimente la antigenicidad e inmunogenicidad cruzada. Un grupo principal de derivados son conjugados covalentes de las proteínas de DC o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados pueden sintetizarse en un cultivo recombinante, tal como las fusiones de término N- ó C o mediante el uso de agentes conocidos en la materia por su utilidad en el enlace cruzado de las proteínas a través de grupos laterales reactivos. Los sitios de derivación de proteínas preferidos con agentes de enlace cruzado se encuentran en grupos amino libres, porciones de carbohidratos y residuos de cisteína. También se proporcionan polipéptidos de fusión entre estas proteínas de DC y otras proteínas homologas o heterólogas. Los polipéptidos heterólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores de superficie, que dan como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida. De manera similar, pueden construirse fusiones heterólogas que exhibirían una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido informador, por ejemplo, la luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo, un segmento de enlace a receptor, de modo que la presencia o localización de ia proteína de fusión puedan determinarse fácilmente. Véase, por ejemplo, el documento de Dull et al., Patente de E.U.A. No. 4,859,609. Otras parientes de fusión génica incluyen a la ß-galactosídasa bacterial, trpE, Proteína A, ß-lactamasa, alfa amilasa, alcohol dehidrogenasa y factor de concordancia alfa de levaduras. Véase, por ejemplo, la publicación de Godowski et al. (1988) Science 241: páginas 812 a 816. Dichos polipéptidos pueden tener también residuos de aminoácidos que han sido modificados químicamente por fosforilación, sulfonación, biotin ilación, o la adición o eliminación de otras porciones, particularmente aquellas que tienen formas moleculares similares a grupos fosfato. En algunas modalidades, las modificaciones serán los reactivos de etiquetado útiles o servirán como objetivos de purificación, por ejemplo, ligandos de afinidad. La presente invención, también contempla el uso de derivados de estas proteínas de DC diferentes de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o glicosilación. Dichos derivados pueden involucrar la asociación covalente o por agregado con porciones químicas. Estos derivados por lo general se encuentran dentro de tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de residuos de cadena lateral y terminal y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas celulares. Dichos derivados covalentes o por agregación son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en métodos de purificación tales como para purificación por afinidad de ligandos u otros ligandos de enlace. Por ejemplo, un antígeno de proteína de DC puede inmovilizarse por enlace covalente a un soporte sólido, tal como la Sefarosa activada por bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en la materia, o ser adsorbidos a superficies de poliolefinas, con o sin enlace cruzado con glutaraldehído, para utilizarse en el ensayo o purificación de anticuerpos anti-proteínas de DC. Las proteínas de DC también pueden etiquetarse con un grupo que se puede detectar, por ejemplo, radioyodinado por el procedimiento de la cloramina T, unirse en forma covalente a quelatos de tierras raras, o conjugarse a otra porción fluorescente para utilizarse en ensayos de diagnóstico. La purificación de estas proteínas SDCMP puede efectuarse mediante anticuerpos inmovilizados. Los genes aislados de proteínas de DC permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de una proteína de DC correspondiente, por ejemplo, tanto tipos de especies como de células que carecen de las proteínas correspondientes y exhiben actividad de fondo negativa. La expresión de los genes transformados permitirá el aislamiento de las líneas celulares antigénicamente puras, con variantes de especie, tanto definidas como únicas. Este método permitirá una detección y discriminación más sensibles de los efectos fisiológicos de estas proteínas de DC. Pueden aislarse y utilizarse fragmentos subcelulares, por ejemplo, citoplastos o fragmentos de membrana.

VIII: COMPLEJOS AGENTE DE UNION:P OTEINA DE DC Una proteína de DC que se une de manera específica a o que es inmunorreactiva de manera específica con un anticuerpo generado contra un inmunógeno definido, por ejemplo, un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2 ó 10, se determina en un inmunoensayo. El inmunoensayo utiliza un antisuero policlonal que se produjo para la proteína de la SEC. ID NO: 2 ó 10. Este antisuero se selecciona para tener baja reactividad cruzada contra otros miembros de las familias relacionadas, y cualquier reactividad cruzada semejante se elimina mediante la inmunoabsorción antes de ser utilizado en el inmunoensayo.

Con el objeto de producir antisueros para usar en un inmunoensayo, por ejemplo, la proteína de la SEC. ID NO: 2 ó 10, se aisla como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, puede producirse una proteína recombinante en una línea celular de mamífero. Una cepa congénita de ratones tal como BALB/c se inmuniza con la proteína adecuada utilizando un adyuvante estándar, tal como el adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratones estándar. (Véase Harlow y Lañe, supra). De manera alternativa, puede utilizarse como inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente descripción y conjugado a una proteína transportadora. Los sueros policlonales se recolectan y titulan contra la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Se seleccionan y prueban antisueros policlonales con un título de 104 o mayor para su reactividad cruzada contra otras proteínas relacionadas, que utilizan un inmunoensayo de enlace competitiva, tal como el descrito en la publicación de Harlow y Lañe, supra, en las páginas 570 a 573. Preferentemente, se utilizan dos proteínas relacionadas diferentes en esta determinación en conjunto con una proteína de DC determinada. Por ejemplo, con la proteína de lectina, se utilizan por lo menos otros dos miembros de la familia para absorber los epítopes compartidos. En conjunto con el miembro de la familia SDCMP3, se utilizan otros dos miembros de la familia. Estos otros miembros de la familia pueden producirse como proteínas recombinantes y aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular y química de proteínas como se describieron en la presente invención. Pueden utilizarse inmunoensayos en el formato de enlace competitiva para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína de la SEC. ID NO: 2 ó 10, puede inmovilizarse a un soporte sólido. Las proteínas agregadas al ensayo compiten con la enlace de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas mencionadas anteriormente para competir con la enlace de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la proteína de la SEC. ID NO: 2. Se calcula la reactividad cruzada porcentual para las proteínas mencionadas anteriormente utilizando cálculos estándar. Aquellos antisueros con menos del 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas enumeradas anteriormente se seleccionan y combinan. Posteriormente, los anticuerpos con reactividad cruzada se eliminan de los antisueros combinados mediante inmunoabsorción con las proteínas enumeradas anteriormente. Los sueros inmunoabsorbidos y combinados se usan posteriormente en un inmunoensayo de enlace competitiva como se describió anteriormente para comparar una segunda proteína con la proteína inmunogénica (por ejemplo, la proteína SDCMP3 de la SEC. ID NO: 2 6 10). Con el objeto de realizar esta comparación, se ensaya cada una de las dos proteínas a una escala amplia de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína que se requiere para inhibir el 50% de la enlace de los antisueros para la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína que se requiere es menor que dos veces la cantidad que se requiere de la proteína de la SEC. ID NO: 2 ó 10, entonces la segunda proteína es aquella que se une de manera específica a un anticuerpo generado para el inmunógeno. Se debe comprender que las proteínas de DC son probablemente una familia de proteínas homologas que comprenden dos o más genes. Para un producto génico particular, tal como la proteína del miembro de la familia de las Ig humanas, la presente invención abarca, no únicamente las secuencias de aminoácidos descritas en la presente descripción, sino también otras proteínas que son alélicas, poiimórficas, no alélicas o de especie variante. También se debe comprender que el término "proteína de DC humana" incluye mutaciones no naturales introducidas por mutación deliberada utilizando tecnología recombinante convencional, tal como la mutación de punto único, o cortando secciones cortas de ADN que codifican estas proteínas o variantes de empalme del gen, o por sustitución o adición de cantidades pequeñas de aminoácidos nuevos. Dichas alteraciones menores deben mantener sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. Por lo tanto, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con una proteína SDCMP respectiva de ocurrencia natural designada, por ejemplo, la proteína SDCMP4 humana que exhibe la SEC. ID NO: 6 ú 8. Las modificaciones de las proteínas particulares consideradas menores incluirían la sustitución conservadora de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se describió anteriormente para cada familia de proteínas como una totalidad. Alineando una proteína en forma óptima con la proteína de la SEC. ID NO: 2 ó 10 y utilizando los inmunoensayos convencionales descritos en la presente descripción para determinar la inmunoidentidad, se pueden determinar las composiciones de proteínas de la presente invención.

IX. USOS La presente invención proporciona reactivos que se encontrarán útiles en aplicaciones de diagnóstico como se describe en otra parte de la presente descripción, por ejemplo, en la descripción general para anormalidades de desarrollo o más adelante en la descripción de equipos para diagnóstico. Los genes de DC, por ejemplo, ADN ó ARN, pueden utilizarse como un componente de un ensayo forense. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos proporcionadas pueden etiquetarse utilizando, por ejemplo, 32P ó biotina y utilizarse para probar el manchado de polimorfismos de fragmentos de restricción estándar, proporcionando un carácter que se puede medir para ayudar a distinguir entre individuos. Dichas pruebas pueden utilizarse en las técnicas forenses bien conocidas tales como la impresión digital genética. Además, pruebas nucleóticas realizadas a partir de secuencias DC pueden utilizarse en ensayos ¡n situ para detectar las anormalidades cromosómicas. Los anticuerpos y otros agentes de enlace dirigidos hacia las proteínas o ácidos nucleicos de DC pueden utilizarse para purificar la molécula de proteína de DC correspondiente. Como se describe en los ejemplos que se encuentran más adelante, la purificación con anticuerpos de proteínas de DC es tanto posible como practicable. Los anticuerpos y otros agentes de enlace, también pueden utilizarse en forma de diagnóstico para determinar si los componentes de DC están presentes en una muestra de tejido o población de células, utilizando las técnicas bien conocidas descritas en la presente descripción. La capacidad para enlazar un agente de enlace a una proteína de DC proporciona un medio para diagnosticar trastornos asociados con la regulación deficiente de la expresión. Los anticuerpos y otros agentes de enlace a proteínas de DC pueden ser también útiles como marcadores histológicos o reactivos de purificación. Como se describe en los ejemplos más adelante, la expresión de cada una de estas proteínas está limitada a los tipos específicos de tejido. Dirigiendo una prueba, tal como un anticuerpo o ácido nucleico, a la proteína de DC respectiva, es posible utilizar la prueba para distinguir tipos de tejido y células ¡n situ o ¡n vitro. Además, puede utilizarse el antígeno purificado para eliminar de una preparación de antisuero de aquellos anticuerpos que se unen con selectividad para el antígeno. Por lo tanto, por ejemplo, la SDCMP3 de ratón puede utilizarse para eliminar un antisuero producido para la SDC P4 humana los componentes que pueden reaccionar en forma cruzada con la SDCMP3 de ratón. De manera alternativa, la SDC P3 puede utilizarse para purificar aquellos componentes de un antisuero que se unen con afinidad al antígeno respectivo.

La SDCMP4 comparte una cantidad de características con la ASGPR hepática, el ejemplo mejor conocido de lectinas tipo C de transmembrana tipo II. La ASGPR hepática despliega especificidad de enlace por residuos de galactosa, y su dominio intracelular contiene un motivo de tirosina para la internación del ligando. Estas características permiten a la ASGPR hepática unirse a glicoproteínas plasmáticas desialiladas que expresan residuos de galactosa y proporcionan eliminación subsecuente para el despeje del plasma de esas proteínas. La especificidad por ligandos de la SDCMP4 no puede inferirse en absoluto a partir de su secuencia CRD. Sin embargo, la expresión de SDCMP4 en DC es una indicación de que los constituyentes potencialmente antigénicos, tales como los encontrados en microorganismos, podrían representar a ligandos naturales de la SDCMP4. En este contexto, el receptor de mañosa, otra lectina tipo C hallada en DC y macrófagos, tiene la capacidad de unirse e internarse, por ejemplo, partículas de levadura después del reconocimiento de los residuos de mañosa de su pared celular. La presencia de un motivo de internación a base de tirosina en SDCMP4 anticipa que la molécula desempeña un papel en la endocitosis por DC mediada por receptores. Puede sugerirse que la SDCMP4 funciona como un "receptor de antígenos" en DC, para internar ligandos que posteriormente se dirigirán a una trayectoria de procesamiento intracelular que tenga como resultado la presentación de antígenos y la iniciación o promoción de una respuesta inmune.

Dicha función de internación mediada por SDCMP4 hace de este receptor un objetivo potencial para dirigir antígenos al interior de DC, por ejemplo, para mejorar la presentación para células T, y la posterior activación de la inmunidad específica. Por lo tanto, la SDCMP4 podría representar un receptor para el suministro de antígeno en protocolos de vacunación, apuntando por ello el antígeno a las células adecuadas para la iniciación de una respuesta a la vacuna. La significancia terapéutica de dicha estrategia podría ser de relevancia particular en la inmunoterapia del cáncer, en donde los antígenos asociados a tumores (TAA) podrían acoplarse a reactivos que reconozcan de manera específica a SDCMP4 para el envío selectivo a las DC. La presente invención, también proporciona reactivos que pueden exhibir un valor terapéutico significativo. Las proteínas de DC (de ocurrencia natural o recombinantes), sus fragmentos y los anticuerpos para las mismas, junto con compuestos identificados como poseedores de afinidad de enlace a la proteína de DC, pueden ser útiles en el tratamiento de condiciones asociadas con la fisiología o desarrollo anormales, que incluyen la proliferación anormal, por ejemplo, condiciones cancerosas o condiciones degenerativas. La proliferación, regeneración, degeneración y atrofia anormales pueden ser moduladas mediante el tratamiento terapéutico adecuado utilizando las composiciones que se proporcionan en la presente descripción. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anormal o la señalización anormal mediante una DC, por ejemplo, una célula que presenta antígenos, es un objetivo para un agonista o antagonista de la proteína. Las proteínas probablemente desempeñan un papel en la regulación o desarrollo de las células hematopoyéticas, por ejemplo, las células linfoides, que afectan las respuestas inmunológicas, por ejemplo, la presentación de antígenos y las funciones efectoras resultantes. Se considera que el bloqueo de la interacción de estas SDCMPs puede bloquear la señalización. De esta manera, por ejemplo, el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales seleccionados contra las proteínas puede afectar las respuestas inmunes, por ejemplo, la MLR. De manera alternativa, los fragmentos extracelulares solubles pueden bloquear la interacción con un contra-receptor, bloqueando por lo tanto también dicha reacción. Debido a que la MLR es un diagnóstico de la iniciación o mantenimiento de una respuesta inmune, estos reactivos pueden ser útiles en la modulación de la iniciación y mantenimiento de respuestas inmunes. Otras condiciones de desarrollo anormal se conocen en los tipos de células que han mostrado poseen ARNm de proteínas de DC mediante el análisis de manchado northern. Véase las publicaciones de Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Merck and Co., Rahway, NJ; y Thorn et al, Harrison's Principies of Interna! Medicine. McGraw-Hill, NY. Las anormalidades de desarrollo o funcionales, por ejemplo, del sistema inmune, producen anormalidades y condiciones médicas significativas que pueden ser susceptibles a la prevención o tratamiento utilizando las composiciones que se proporcionan en la presente descripción.

Las proteínas de DC o anticuerpos recombinantes podrían purificarse y luego administrarse a un paciente. Estos reactivos pueden combinarse para el uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. En particular, éstos pueden ser útiles en un contexto de vacunas, en donde el antígeno se combina con una de estas versiones terapéuticas de agonistas o antagonistas. Estas combinaciones pueden filtrarse en condiciones estériles y colocarse en formas de dosificación como por liofilización en frascos de dosificación o almacenarse en preparaciones acuosas estabilizadas. La presente invención, también contempla el uso de anticuerpos o fragmentos de enlace de los mismos, que incluye formas que no se unen a complementos. El rastreo de fármacos utilizando anticuerpos o receptores o fragmentos de los mismos puede identificar compuestos que tengan afinidad de enlace con estas proteínas de DC, que incluye el aislamiento de los componentes asociados. Los ensayos biológicos posteriores pueden utilizarse entonces para determinar si el compuesto tiene una actividad estimulante intrínseca y es, por lo tanto, un bloqueador o antagonista en el sentido que bloquea la actividad de la proteína. De modo similar, un compuesto que tenga actividad estimuladora intrínseca podría activar la célula a través de la proteína y es, de este modo, un agonista en el sentido que estimula a la célula. La presente invención, contempla además el uso terapéutico de anticuerpos para las proteínas como antagonistas. Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia efectiva dependerán de muchos factores diferentes, que incluyen medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por lo tanto, las dosis de tratamiento deben titularse para optimizar la seguridad y la eficacia. Normalmente, las dosis utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. Los ensayos con animales de las dosis efectivas para el tratamiento de trastornos particulares proporcionarán indicación adicional para pronosticar la dosis para humanos. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en las publicaciones de Gilman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8va. ed.) Pergamon Press; y (1990) Reminqton's Pharmaceutical Sciences (17ma. ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Se discuten en la presente descripción y más adelante los métodos para administración, por ejemplo, para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, reguladores de pH y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el Merck Index, Merck and Co., Rahway, NJ. Las escalas de dosificación se esperaría comúnmente que estuvieran en proporciones por debajo de las concentraciones de 1mM, normalmente menores que concentraciones de aproximadamente 10 µ?, habitualmente menores que aproximadamente 100 nM, preferentemente menores que aproximadamente 10 p (picomolar) y por sobre todo, más preferentemente menores que 1 fM (femtomolar), con un vehículo adecuado. Las formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta, se utilizarán a menudo para la administración continua. Las proteínas de DC, sus fragmentos, y anticuerpos para éstas o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, podrían administrarse directamente al huésped a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos a proteínas transportadoras tales como ovoalbúmina o albúmina sérica antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en muchas formulaciones de dosificación convencionales. Aunque es posible que el ingrediente activo se administre solo, es preferible presentarlo como formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden normalmente por lo menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo. Cada vehículo debe ser aceptable, tanto farmacéutica como fisiológicamente en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no ser nocivo para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellos adecuados para la administración oral, rectal, nasal o parenteral (que incluye administración subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la materia farmacéutica. Véase, por ejemplo, las publicaciones de Gilman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics (8va. ed.) Pergamon Press; y (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17ma. ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman et al. (eds) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; y Lieberman et al. (eds) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La terapia de la presente invención puede combinarse con o utilizarse en asociación con otros agentes quimioterapéuticos o quimiopreventivos. Tanto la forma de ocurrencia natural como la recombinante de las proteínas de DC de la presente invención son particularmente útiles en equipos y métodos de ensayo que tienen la capacidad de rastrear compuestos para determinar la actividad de enlace a las proteínas. Varios métodos de automatización de ensayos se han desarrollado en años recientes para permitir el rastreo de decenas de miles de compuestos en un breve período de tiempo. Véase, por ejemplo, la publicación de Fodor et al. (1991) Science 251: páginas 767 a 773 y otras descripciones de bibliotecas de diversidad química, que describen medios para probar la afinidad de enlace mediante una pluralidad de compuestos. El desarrollo de ensayos adecuados se facilita enormemente por la disponibilidad de grandes cantidades de proteína de DC purificada, por ejemplo, en versiones solubles de proteínas como las que se proporcionan en la presente descripción.

Por ejemplo, los antagonistas pueden encontrarse a menudo una vez que la proteína ha sido estructuralmente definida. El ensayo de análogos potenciales de proteínas es ahora posible a partir del desarrollo de métodos de análisis altamente automatizados que utilizan una proteína de superficie purificada. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas utilizando las técnicas de rastreo descritas en la presente descripción. Son de particular importancia los compuestos en los que se encontró que tienen una afinidad de enlace combinada para antígenos de superficie celular relacionada múltiple, por ejemplo, los compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especie de una proteína de DC. La presente invención es particularmente útil para rastrear compuestos utilizando una proteína de DC recombinante en una variedad de técnicas de rastreo de fármacos. Las ventajas de utilizar una proteína recombinante en el rastreo para ligandos específicos incluyen: (a) una fuente renovable mejorada de la proteína a partir de una fuente específica; (b) un número potencialmente mayor de antígenos por célula que proporcionan una mejor proporción de señal a ruido en los ensayos; y (c) la especificidad de variantes por especie (teóricamente proporcionando mayor especificidad biológica y por enfermedad). Un método de rastreo de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman de manera estable con moléculas de ADN recombinante que expresan una proteína de DC. Pueden aislarse células que expresen esa proteína en aislamiento de cualesquiera otras. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, pueden utilizarse para ensayos estándar de enlace a proteínas de superficie. Véase también las publicaciones de Parce et al. (1989) Science 246: páginas 243 a 247; y Owicki et al. (1990) Proc. Nati Acad. Sci E.U.A 87: páginas 4007 a 4011 , las cuales describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Son particularmente útiles los ensayos competitivos, en los cuales las células (fuente de proteína de DC) se ponen en contacto y se incuban con un anticuerpo que tiene una afinidad conocida para el antígeno, tal como un anticuerpo 125l, y una muestra de prueba cuya afinidad de enlace para la composición de enlace se está midiendo. Posteriormente se separan las composiciones de enlace etiquetadas como enlazada y libre, para evaluar el índice de enlace a proteína. La cantidad de compuesto de prueba enlazada es inversamente proporcional a la cantidad de enlace del anticuerpo etiquetado para la fuente conocida. Muchas técnicas pueden utilizarse para separar el reactivo enlazado del libre para evaluar el grado de enlace. Este paso de separación podría involucrar normalmente un procedimiento tal como la adhesión a filtros seguida por lavado, adhesión a plástico seguida de lavado, o centrifugación de las membranas celulares. Las células viables podrían utilizarse también para rastrear los efectos de los fármacos en estas funciones mediadas por proteínas de DC, por ejemplo, la presentación de antígenos o la función de ayuda. Otro método utiliza membranas de células huésped eucarióticas o procarióticas como la fuente de una proteína de DC. Estas células se transforman en forma estable con vectores de ADN que dirigen la expresión de la proteína adecuada, por ejemplo, una forma enlazada a la membrana obtenida por ingeniería. Esencialmente, las membranas se prepararían a partir de las células y se utilizarían en ensayos de enlace, tales como el ensayo competitivo descrito anteriormente. Otro enfoque más es utilizar proteína solubilizada de DC, no purificada o solubilizada, purificada proveniente de células huésped eucarióticas o procarióticas transformadas. Esto permite un ensayo de enlace "molecular" con las ventajas de especificidad incrementada, la capacidad de automatizar y alto rendimiento del ensayo de fármacos. Otra técnica para el rastreo de fármacos implica un método que proporciona un rastreo de alto rendimiento para compuestos que tienen una afinidad de enlace adecuada para la proteína de DC respectiva y se describe de manera detallada en el documento de Geysen, Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de Septiembre de 1984. Primero, se sintetiza un gran número de compuestos de ensayo diferentes de péptidos pequeños, sobre un sustrato sólido, por ejemplo, puntas de plástico o alguna otra superficie adecuada; véase Fodor et al., supra. Posteriormente, todas las puntas se hacen reaccionar con proteína de DC solubilizada no purificada o solubilizada purificada, y se lava. El paso siguiente implica detectar el reactivo enlazado, por ejemplo, un anticuerpo. Un medio para determinar qué sitios interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos X o técnicas de RMN bidimensionales. Éstas proporcionarán una guía en el sentido de qué residuos de aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, por ejemplo, la publicación de Blundell y Johnson (1976) Protein Crvstallographv Academic Press, NY.

X. EQUIPOS La presente invención, también contempla el uso de estas proteínas de DC, fragmentos de las mismas, péptidos y sus productos de fusión, en una variedad de equipos de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de una proteína de DC o mensaje. Normalmente, el equipo tendrá un compartimiento que contiene, ya sea un péptido de DC o un segmento de gen definido o un reactivo que reconoce a uno u otro, por ejemplo, anticuerpos. Un equipo para determinar la afinidad de enlace de un compuesto de prueba para la proteína de DC respectiva comprendería normalmente un compuesto de prueba; un compuesto etiquetado, por ejemplo, un anticuerpo que tenga una afinidad de enlace conocida para la proteína; una fuente de la proteína de DC (de ocurrencia natural o recombinante); y un medio para separar el compuesto etiquetado de enlace libre, tal como una fase sólida para inmovilizar la proteína de DC. Una vez que los compuestos se han rastreado, aquellos que tengan una afinidad de enlace adecuada para la proteína pueden evaluarse en ensayos biológicos adecuados, como se conoce bien en la materia, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas para regular la función de DC. La disponibilidad de polipéptidos de DC recombinantes, también proporciona estándares bien definidos para calibrar dichos ensayos. Un equipo preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una proteína de DC en una muestra, comprendería normalmente un compuesto etiquetado, por ejemplo, un anticuerpo que tenga una afinidad de enlace conocida por la proteína de DC; una fuente de la proteína de DC (de ocurrencia natural o recombinante) y un medio para separar el compuesto etiquetado de enlace libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar la proteína de DC. Normalmente, se proporcionarán compartimientos que contienen reactivos e instrucciones. Los anticuerpos, que incluye fragmentos de enlace al antígeno, específicos para la respectiva DC o sus fragmentos, son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de la proteína y/o sus fragmentos. Dichos ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas, células fijas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales y además pueden implicar la detección de antígenos en suero, o similares. Los ensayos diagnósticos pueden ser homogéneos (sin un paso de separación entre el reactivo libre y complejo antígeno-proteína de DC) o heterogéneos (con un paso de separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunosorción enlazado por enzimas (ELISA), ¡nmunoensayo enzimático (EIA), técnica de inmunoensayo multiplicada por enzimas (EMIT), inmunoensayo fluorescente etiquetado por sustrato (SLFIA) y similares. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos no etiquetados utilizando un segundo anticuerpo que esté etiquetado y que reconozca el anticuerpo contra la proteína de DC o para un fragmento particular de la misma. También, se han discutido de forma extensa ensayos similares en la literatura. Véase, por ejemplo, las publicaciones de Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual CSH Press, NY; Chan (ed. 1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds. 1991) Principies and Practice of Immunoassavs Stockton Press, NY; y Ngo (ed. 1988) Nonisotopic Immunoassay Plenum Press, NY. En particular, los reactivos pueden ser útiles para diagnosticar poblaciones de DC en muestras biológicas, ya sea para detectar un exceso o una deficiencia de DC en una muestra. El ensayo puede estar dirigido al análisis histológico de una biopsia o a la evaluación del número de DC en una muestra de sangre o tejido. Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra una proteína de DC, de tal modo que los mismos pueden ser diagnósticos de diversos estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de la proteína de DC puede dar lugar a diversas reacciones inmunológicas que pueden ser diagnósticas de estados fisiológicos anormales, particularmente en condiciones celulares proliferativas, tales como cáncer o diferenciación anormal.

Con frecuencia, los reactivos para ensayos de diagnóstico se proporcionan en forma de equipos, para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para el objeto de la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, el protocolo, y la etiqueta, se proporcionan un anticuerpo o receptor etiquetado o no etiquetado, o proteína de DC etiquetada. Esto está habitualmente en conjunto con otros aditivos, tales como reguladores de pH, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de señales tales como sustratos para enzimas y similares. Preferentemente, el equipo también contiene instrucciones para el uso y eliminación adecuados del contenido después del uso. Normalmente el equipo tiene compartimientos para cada reactivo útil. Es deseable que los reactivos se proporcionen en forma de polvo liofilizado seco, con lo cual los reactivos pueden reconstituirse en un medio acuoso proporcionando las concentraciones adecuadas de los reactivos para realizar el ensayo. Muchos de los constituyentes mencionados anteriormente de los ensayos de rastreo de fármacos y de diagnóstico pueden utilizarse sin modificación o pueden modificarse en una variedad de formas. Por ejemplo, el etiquetado puede efectuarse mediante la unión covalente o no covalente de una porción que proporcione directa o indirectamente una señal que se puede detectar. En muchos de estos ensayos, la proteína, el compuesto de prueba, la proteína de DC o los anticuerpos de la misma, pueden etiquetarse ya sea directa o indirectamente. Las posibilidades para el etiquetado directo incluyen los grupos marcadores: etiquetas radioactivas tales como 125l, enzimas (Patente de E.U.A. No. 3,645,090) tales como la peroxidasa y fosfatasa alcalina y etiquetas fluorescentes (Patente de E.U.A. No. 3,940,475) tienen la capacidad de monitorear el cambio en la intensidad de la fluorescencia, cambio de longitud de onda o polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el etiquetado indirecto incluyen la biotinilación de un constituyente seguido por el enlace a la avidina acoplado a uno de los grupos de etiquetas nombrados. Existen también numerosos métodos de separación de la proteína enlazada libre, o de manera alternativa el enlace del compuesto de prueba libre. La proteína de DC puede inmovilizarse en diversas matrices seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plásticos tales como una placa para ELISA, filtros y perlas. Los métodos de inmovilización de la proteína de DC para una matriz incluyen, sin limitación, adhesión directa a plástico, uso de un anticuerpo de captura, acoplamiento químico y biotina-avidina. El último paso de este método implica la precipitación del complejo proteína/anticuerpo mediante uno de varios métodos que incluyen aquellos que utilizan, por ejemplo, un solvente orgánico tal como un polietilenglicol o una sal como el sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de las partículas que se pueden magnetizar de anticuerpo con fluoresceína descrito en la publicación de Rattle et al. (1984) Clin. Chem. 30: páginas 1457 a 1461 , y la separación de partículas magnéticas dobles de anticuerpos descrita en la Patente de E.U.A. No. 4,659,678.

Los métodos para enlazar proteínas o sus fragmentos a las diversas etiquetas han sido reportados en forma extensa en la literatura y no requieren un planteamiento detallado en la presente descripción. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados ya sea a través del uso de carbodiimida o de ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante la reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado, tal como cloroacetilo o una olefina activada, tal como la maleimida, para la enlace, o similares. Las proteínas de fusión también encontrarán un uso en estas aplicaciones. Otro aspecto diagnóstico de la presente invención implica el uso de secuencias de oligonucleotidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de una proteína de DC respectiva. Estas secuencias pueden utilizarse como pruebas para detectar niveles del mensaje en muestras de pacientes que se sospecha padecen una condición anormal, por ejemplo, cáncer o un problema inmune. La preparación de secuencias nucleotídicas tanto de ARN como de ADN, el etiquetado de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido amplia descripción y discusión en la literatura. Normalmente una prueba de oligonucleótido debe tener por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, habitualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos y las pruebas de polinucleótido pueden tener hasta varias kilobases. Pueden emplearse diversas etiquetas, más comúnmente radionúclidos, particularmente 32P. Sin embargo, pueden utilizarse también otras técnicas, tales como usar nucleótidos modificados con biotina para su introducción dentro de un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para enlace a la avidina o a anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia variedad de etiquetas, tales como radionúclidos, fluoróforos, enzimas o similares. De manera alternativa, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer especies dobles específicas, que incluye ADNs dobles, ASRNs dobles, híbridos deADN-ARN dobles o de ADN-proteína dobles. Los anticuerpos a su vez pueden etiquetarse y efectuarse el ensayo en el cual la especie doble esté unida a una superficie, de modo que después de la formación de la especie doble en la superficie, pueda detectarse la presencia de anticuerpo enlazado a la especie bicatenaria. El uso de pruebas al nuevo ARN anti-sentido puede realizarse en cualquier técnica convencional tal como la hibridación de ácidos nucleicos, rastreo más y menos, pruebas de recombinación, traducción liberada de híbridos (HRT) y traducción con híbridos suspendidos (HART). Esto también incluye técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También se contemplan equipos diagnósticos que también determinan la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagnóstico o pronóstico puede depender de la combinación de múltiples indicaciones usadas como marcadores. Por lo tanto, los equipos pueden probar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, la publicación de Viallet et al. (1989) Proqress in Growth Factor Res. 1 : páginas 89 a 97.

XI. AISLAMIENTO DE FAMILIARES DE ENLACE Habiendo aislado un miembro de una familia de enlace de una interacción específica, existen métodos para aislar al pariente contrario. Véase la publicación de Gearing et al. (1989) EMBO J. 8: páginas 3667 a 3676. Por ejemplo, pueden determinarse medios para etiquetar una proteína de superficie de DC sin interferir con el enlace a su receptor. Por ejemplo, una etiqueta de afinidad puede fusionarse tanto al término amino como carboxilo del ligando. Puede rastrearse una biblioteca de expresión para determinar el enlace específico para la proteína de DC, por ejemplo, mediante la selección de células, u otro rastreo para detectar las subpoblaciones que expresen dicho componente de enlace. Véase, por ejemplo, la publicación de Ho et al. (1993) Proa Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 90: páginas 11267 a 1 271. De manera alternativa, puede utilizarse un método de lavado. Véase, por ejemplo, la publicación de Seed y Asruffo ( 987) Proa Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 84: páginas 3365 a 3369. Puede aplicarse también un sistema de selección de dos híbridos realizando las construcciones adecuadas con las secuencias de proteínas de DC disponibles. Véase, por ejemplo, la publicación de Fields y Song (1989) Nature 340: páginas 245 a 246. Pueden aplicarse técnicas de enlace cruzado de proteínas con etiqueta para aislar parientes de enlace de una proteína de DC. Esto permitiría la identificación de proteínas que interactúan de manera específica con la proteína de DC adecuada.

El amplio alcance de la presente invención se comprende mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no tienen la intención de limitar la presente invención a modalidades específicas.

EJEMPLOS I. METODOS GENERALES Muchos de los métodos estándar que se dan a continuación están descritos o referenciados, por ejemplo, en las publicaciones de Maniatis et al. (1982) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual (2da. ed.) Vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; ó Ausubel et al. (1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis et al. (eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, por ejemplo, las publicaciones de Ausubel et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purif ¡catión", Methods in Enzynology vol. 182 y otros volúmenes de esta serie; Coligan et al. (1996 y Suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY; y la literatura del fabricante sobre del uso de productos para purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión de los segmentos adecuados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o una equivalente que pueda fusionarse por medio de una secuencia que se puede remover por proteasa. Véase, por ejemplo, la publicación de Hochuli (1989) Chenische Industrie 12: páginas 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineerinq. Principie and Methods 12: páginas 87 a 98, Plenum Press, NY; y Crowe et al. (1992) QIAexpress: The Hiqh Level Expression and Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Se describen métodos para determinar la función inmunológica, por ejemplo, en la publicación e Hertzenberg et al. (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunoloqy vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan et al. (1992 y Suplementos periódicos) Current Protocole in Immunoloqy Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymoloqy volúmenes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121 , 132, 150, 162 y 163. Véase también, por ejemplo, la publicación de Paul (ed.) (1993) Fundamental Immunoloqy (3ra. ed.) Raven Press, NY. Se describen las funciones particularmente útiles de las células dendríticas, por ejemplo, en la publicación de Steinman (1991) Annual Review of Immunoloqy 9: páginas 271 a 296; y Banchereau y Schmitt (eds. 1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunoloqy Plenum Press, NY.

Los análisis FACS se describen en la publicación de elamed et al. (1990) Flow Cvtometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cvtometry Liss, Nueva York, NY; y Robinson et al. (1993) Handbook of Flow Cvtometry Methods Wiley-Liss, Nueva York, NY.

II. GENERACION DE CELULAS DENDRITICAS Se obtuvieron células CD34+ humanas de la siguiente manera. Véase, por ejemplo, el documento de Caux et al. (1995) páginas 1 a 5 en la publicación de Banchereau y Schmitt Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenum Press, NY. Se cultivaron células de sangre periférica o del cordón, a veces con CD34+ seleccionado, en la presencia de Factor de Células Madre (SCF), GM-CSF y TNF- en medio RPMI 1640 libre de endotoxinas (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con suero fetal bovino 10% (v/v) inactivado por calor (FBS; Flow Laboratories, Irvine, CA), HEPES 10 mM, 2 mM de L-glutamina, 5 X 10"5 M de 2-mercaptoetanol, penicilina (100 µg/ml). Esto se denomina medio completo. Las células CD34+ se sembraron para la expansión en matraces de 25 a 75 cm2 (Corning, NY) a razón de 2 x 104 células/ml. Las condiciones óptimas se mantuvieron dividiendo estos cultivos los días 5 y 10 con medio que contenía GM-CSF y TNF-a frescos (concentración celular: 1-3 x 05 células/ml). En ciertos casos, las células se seleccionan mediante FACS para la expresión de CD1a aproximadamente el día 6.

En ciertas situaciones, las células se recolectaron en forma rutinaria después del día 12 de cultivo, finalmente las células adheridas se recuperaron utilizando una solución de EDTA 5mM. En otras situaciones, las célula CD1a+ se activó por resuspensión en medio completo a razón de 5 x 106 células/ml y se activó durante el tiempo adecuado (por ejemplo 1 ó 6 horas) con 1 µg/ml de 2-miristato 13-acetato de forbol (PMA, Sigma) y 00 ng/ml de ionomicina (Calbiochem, La Jolla, CA). Estas células se expandieron durante otros 6 días, y se aisló el ARN para la preparación de una biblioteca de ADNc.

III. AISLAMIENTO DE ARN Y CONSTRUCCION DE LA BIBLIOTECA El ARN total se aisla utilizando, por ejemplo, el procedimiento del gradiente de tiocianato de guanidina/CsCI según se describe en la publicación de Chirgwin et al. (1978) Biochem. 18: páginas 5294 a 5299. De manera alternativa, se aisla poli(A)+ ARN utilizando el equipo de aislamiento de ARNm OLIGOTEX (QIAGEN). Se generan ADNc de dos hebras utilizando, por ejemplo, el sistema de plásmidos SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos. El ADNc de hebra doble resultante se clona en forma unidireccional, por ejemplo, en sSportl y se transfecta mediante electroporación a Células ELECTRO AX DH10BTM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

IV. SECUENCIACION El ADN aislado de clones elegidos al azar, o después de una hibridación sustractiva utilizando células no activadas, se sometieron a análisis de secuencia de nucleótidos utilizando las técnicas estándar. Puede utilizarse un equipo de secuenciación por ciclos Taq DiDeoxy Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los fragmentos de ADN etiquetados se separan utilizando un gel de secuenciación de ADN de un secuenciador automático adecuado. De manera alternativa, el clon aislado se secuencia como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de Maniatis et al (1982) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (2da. ed.) Vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology Greene Publishing Associates, Brookiyn, NY; o Ausubel et al (1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, Nueva York. También están disponibles los métodos químicos de secuenciación, por ejemplo, utilizando las técnicas de secuenciación de Maxam y Gilbert.

V. CONSTRUCCION DEL GEN PC RECOMBINANTE Se aisla el poli(A)+ ARN de poblaciones celulares adecuadas utilizando, por ejemplo, el equipo de ARNm FastTrack (Invitrogen, San Diego, CA). Las muestras se someten a electroforesis, por ejemplo, en un gel de agarosa al 1% que contiene formaldehído y se transfiere a una membrana GebeScreen (NEN Research Products, Boston, MA). Se realiza la hibridación, por ejemplo, a una temperatura de 65°C en 0.5 M de Na2HP0 de pH 7.2, SDS al 7%, 1 mM de EDTA y BSA al 1% (fracción V) con ADNc del gen DC etiquetado con 32P-dCTP a 107 cpm/ml. Después de la hibridación, los filtros se lavan tres veces a una temperatura de de 50°C en SSC 0.2X, SDS al 0.1%, por ejemplo, durante 30 minutos y se expone a la película durante 24 horas. Una señal positiva normalmente será de 2X sobre el valor de base, preferentemente de 5-25X. La construcción del gen recombinante puede utilizarse para generar una prueba para detectar el mensaje. El inserto puede recortarse y utilizarse en los métodos de detección descritos anteriormente. Son bien conocidos en la materia diversos métodos estándar para la hibridación de especies cruzadas y lavados. Véase, por ejemplo, la publicación de Sambrook et al. y Ausubel.

VI. EXPRESION DE PROTEINAS DEL GEN DC EN E, COLI Se utiliza un PCR para preparar una construcción que comprende el marco de lectura abierto, preferentemente en asociación de operación con secuencias promotoras, de selección y reguladoras adecuadas. El plásmido de expresión resultante se transforma en una cepa de E. coli adecuada, por ejemplo, la Topp5. (Stratagene, La Jolla, CA). Se cultivan transformantés resistentes a la ampicilina (50 µg/ml) en Luria Broth (Gibco) a una temperatura de 37°C hasta que la densidad óptica a 550 nm es de 0.7. La proteína recombinante se induce con 0.4 mM de isopropil-pD-tiogalacto- piranósido (Sigma, St. Luouis, MO) y la incubación de las células se continúa a una temperatura de 20°C durante otras 18 horas. Las células de un cultivo de 1 litro se cosechan por centrifugación y se resuspenden, por ejemplo, en 200 mi de sacarosa al 30%, 50 mM de Tris HCI de pH 8.0 y ácido etilendiaminotetraacético 1 mM enfriados con hielo. Después de permanecer 10 minutos sobre hielo, se agrega agua helada hasta alcanzar un volumen total de 2 litros. Después de permanecer 20 minutos sobre hielo, las células se eliminan por centrifugación y el supernadante se clarifica por filtración por medio de 5 µ? de Millipak 60 (Millipore Corp., Bedford, MA). La proteína recombinante se purifica mediante los métodos de purificación estándar, por ejemplo, los diversos métodos de cromatografía de intercambio iónico. También se pueden utilizar métodos de inmunoafinidad utilizando los anticuerpos descritos más adelante. Los métodos de afinidad pueden utilizarse cuando se incorpora mediante ingeniería genética una etiqueta de epitope en una construcción de expresión. Se utilizan métodos similares para preparar construcciones y células de expresión en células eucarióticas. Pueden producirse promotores y vectores de expresión eucarióticos como se describió anteriormente.

Vil. MAPEO DE GENES PC HUMANOS Se efectúa el aislamiento de ADN, la digestión con enzimas de restricción, la electroforesis en gel de agarosa, el manchado de Southern y la hibridación, de acuerdo con las técnicas estándar. Véase la publicación de Jenkins et al. (1982) J. Virol. 43: páginas 26 a 36. Los manchados se preparan con membrana de nylon Hybond-N (Amersham). La prueba se etiqueta con 32P-dCTP; el lavado se realiza hasta una rigurosidad final, por ejemplo, de 0.1X SSC, SDS al 0.1%, a una temperatura de 65°C. De manera alternativa, puede combinarse un panel híbrido de células somáticas de ratón de BIOS Laboratories (New Haven, CT) con los métodos PCR. Véase la publicación de Fan et al. (1996) Immunoqenetics 44: páginas 97 a 103. El gen SDCMP3 humano se localiza en el cromosoma 12 p12-13 (complejo de receptores NK humanos), como se determina por mapeo de híbridos por radiación con cebadores de PCR.

VIII. ANALISIS DE VARIACION INDIVIDUAL A partir de los datos de distribución, se selecciona un tipo celular abundante fácilmente accesible para muestreo de individuos. Utilizando las técnicas PCR, se analiza una gran población de individuos para este gen. Se utiliza el ADNc u otros métodos de PCR para secuenciar el gen correspondiente en los diferentes individuos, por ejemplo, cepas de ratón heterogéneas, y se comparan sus secuencias. Esto indica tanto el grado de divergencia entre poblaciones raciales como de otro tipo, así como también permite determinar qué residuos se pueden modificar sin efectos dramáticos en la función.

IX. PREPARACION DE ANTICUERPOS Se generan proteínas de DC recombinantes mediante expresión en E. coli como se mostró anteriormente y se realizan ensayos para evaluar su actividad biológica. De manera alternativa, pueden utilizarse fuentes de proteínas naturales con los métodos de purificación disponibles. Pueden utilizarse reactivos de anticuerpos en inmunopurificación o para monitorear métodos de separación. Pueden utilizarse proteínas activas o desnaturalizadas para la inmunización de mamíferos adecuados tanto para la producción de suero policlonal como para la producción de anticuerpos mococlonales.

X. AISLAMIENTO DE GENES CONTRAPARTES DE DC Se utilizan como pruebas los clones de ADNc humanos que codifican estos genes, o para diseñar los cebadores de PCR, para encontrar las contrapartes en diversas especies de primates, por ejemplo, chimpancés. Otros pueden identificarse a partir de otros animales, por ejemplo, especies de animales de granja o mascotas domésticas.

XI. USO DE REACTIVOS PARA ANALIZAR POBLACIONES DE CELULAS La detección del nivel de células dendríticas presentes en una muestra, es importante para el diagnóstico de condiciones de enfermedad aberrantes. Por ejemplo, un incremento en el número de células dendríticas en un tejido o sistema linfático puede ser indicativo de la presencia de una hiperplasia de DC o de rechazo de tejido o injerto. Una baja población de DC puede indicar una reacción anormal frente a, por ejemplo, una infección bacterial o viral, que puede requerir el tratamiento adecuado para normalizar la respuesta de DC. El análisis FACS que utiliza un agente de enlace etiquetado específico para una proteína de DC de superficie celular, véase, por ejemplo, las publicaciones de Melamed et al. (1990) Flow Cytometrv and Sortinq Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometrv Liss, Nueva York, NY; y Robinson et al. (1993) Handbook of Flow Cytometrv Methods Wiley-Liss, Nueva York, NY, se utiliza para la determinación del número de DCs presentes en una mezcla celular, por ejemplo, PBMCs, células adherentes, etc. El agente de enlace también se utiliza para el análisis histológico de muestras de tejidos, ya sean frescas o fijas, para analizar la infiltración de DC. Pueden evaluarse también diversas poblaciones celulares, tanto en un ensayo de destrucción celular como en ciertos ensayos en los cuales las células retienen viabilidad. De manera alternativa, pueden utilizarse métodos de fijación de tejidos o células. Los niveles de transcriptos de DC se cuantifican, por ejemplo, utilizando PCR semicuantitativa como se describe en la publicación de Murphy et al (1993) J. Immunol. Methods 162: páginas 211 a 223. Se diseñan cebadores u otros métodos de modo que el ADN genómico no se detecte.

XII. ELABORACION DE PREPARACIONES DE ENLACE INMUNOSELECTIVAS Se preparó antisuero policlonal, por ejemplo, como se describió anteriormente. Los otros receptores de asialoglicoprotelnas se utilizan para eliminar los componentes que se enlazan de manera específica a ellos, dejando los componentes que se enlazan a las SDCMP3 y SDCMP4 deseadas. Dichos sueros agotados pueden enlazarse a un sustrato sólido, por ejemplo, y utilizarse para inmunoseleccionar el antígeno a partir de una fuente no pura. El antígeno inmunoseleccionado puede someterse a purificación adicional mediante los procedimientos estándar de purificación de proteínas, por ejemplo, precipitaciones con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico o de otro tipo, HPLC, etc. El suero específico puede utilizarse para seguir la purificación, por ejemplo, determinando qué fracciones las parciones de proteína deseadas.

XIII. DISTRIBUCION DE LA EXPRESION La distribución de la SDCMP3 de primate se detectó en DC preparadas a partir de progenitoras CD34+ cultivadas 12 días en GM-CSF y TNFa, activadas de 1 a 6 horas con PMA, ionomicina; TF1 (línea celular mieloide temprana); y U937 (línea celular mielomonocítica) activada con PMA y ionomicina. La expresión también se detectó en células dendríticas de monocitos y derivadas de monocitos y en células dendríticas CD11c+ de amígdalas. No se detectó señal alguna en las líneas celulares Jurkat no activadas, CHA, MRD5, JY, en células dendríticas CD11c- plasmacitoides (activadas o no activadas) de amígdalas, en linfocitos B, en linfocitos T ni en granulocitos (activados o no activados). Estos datos identifican de forma clara la SDCMP3 humana como un objetivo para la intervención sobre células dendríticas mieloides o como diagnóstico potencial en enfermedades infecciosas y cáncer. La evaluación de los subgrupos de DC: las progenitoras CD34+ se cultivaron durante 6 días con GM-CSF y TNFa, y se seleccionaron mediante FACS en poblaciones de CD1a+ y CD14+. Los subgrupos seleccionados se cultivaron durante 6 días más en GM-CSF y TNFa, y se activaron con PMA y ¡onomicina durante 1 hora ó 6 horas. Se detectó expresión en DC derivadas de CD14 pero no en DC derivadas de CD1 y la expresión fue regulada en forma descendente mediante activación con Pl. Se detectó una señal mucho menor en monocitos activados con PMA y ¡onomicina, y se detectaron señales muy débiles en PBL, tanto no activadas como activadas y PMA, ¡onomicina activada. No se detectó señal en varias células activadas con PMA y ¡onomicina: células T, granulocitos o células B. Se evaluó la expresión en macrófagos y se detectaron señales en los monocitos activados con PMA, ¡onomicina; y en PBL (no activados o activados con PMA y ¡onomicina). No se detectó expresión de SDCMP3 mediante RT-PCR en los siguientes tipos celulares: células de Langerhans, DC de sangre periférica y CD1 c+ o CD11c- negativas de amígdala (con o sin activación con PMA y ¡onomicina, o IL-3 y anti-CD40), células B (con o sin activación con PMA y ionomicina, o IL-3 y anti-CD40), células T (con o sin activación con PMA y ionomicina, o anti-CD3 y antii-CD28 mABs). Por expresión de secuencia en bases de datos de ADNc, se ha detectado la secuencia en biliotecas de DC, en monocitos activados y en tumor de testículo. El homólogo de murina (1469D4) de SDCMP3 incluye un motivo de reconocimiento de mañosa (EPN) en su CRD. Además, la lectina de ratón tiene la secuencia WND de consenso característica de las proteínas que se enlazan a azúcares. En consecuencia, puede esperarse que la 1469D4 tendrá la capacidad de enlazarse a mañosa. Conforme las paredes celulares de los microorganismos son ricas en mañosa, es posible que las células presentadoras de antígenos (DC) puedan utilizar la lectina para atrapar y posteriormente degradar los antígenos microbianos a través de la actividad enzimática extracelular. Por analogía con otras lectinas de tipo C que existen en formas cercanamente relacionadas, puede predecirse que una forma de enlace a la mañosa de la SDCMP3 será identificada en células humanas. Dicha actividad de enlace a mañosa en células dendríticas representaría un objetivo para sobreregular un beneficio potencial en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Otra posible función de la SDCMP3 podría ser servir como molécula de adhesión entre las DC y otros tipos celulares que expresan un ligando, por ejemplo, las células T, modulando por lo tanto la respuesta inmune. La homología de secuencia y la localización cromosómica de SDCMP3 sugieren fuertemente que es un miembro de una familia nueva de lectinas tipo C de genes IRS. La secuencia de SDCMP3 será útil para identificar a otros miembros de la familia, mediante bioinformática y tecnología de PCR. Por analogía con otras moléculas IRS, se pronostica que SDCMP3 se asocia con la superficie celular en un complejo de receptores de señales. Con base en su expresión restringida en DC y células monocíticas, SDCMP3 representaría un objetivo selectivo para la intervención terapéutica para modular la activación de las DC. Dependiendo de la asociación demostrada con una trayectoria de señalización de IRS de inhibición (ITIM) o activación (ITAM), la movilización de SDCMP3 podría tanto suprimir como reforzar las respuestas inmunes. Además, la expresión restringida de SDCMP3 sugiere la posibilidad de administración selectiva de fármacos a las células dendríticas y a células de la serie de los monocitos/macrófagos. La distribución de la SDC P3 de ratón se evaluó mediante manchado de Southern de bibliotecas de ADNc de diversas fuentes. Se digirió ADN (5 µg) de una biblioteca primaria de ADNc amplificada con enzimas de restricción adecuadas para liberar los insertos, se ejecutó en gel de agarosa al 1% y se tansfirió a una membrana de nylon (Schleicher y Schuell, Keene, NH).

Las muestras para el aislamiento de ARNm de ratón incluyen: línea celular L fibroblástica de ratón en reposo (C200); células transfretadas Braf:ER (fusión Braf a receptor de estrógenos), control (C201); células T, polarizadas con TH1 (células CD4+ esplénicas con Me 14 brillante, polarizadas durante 7 días con IFN-? y anti-IL-4; T200); células T, polarizadas con TH2 (células CD4+ esplénicas con Me114 brillante, polarizadas durante 7 días con IL-4 y anti-IFN-?; T201), células T, altamente polarizadas con TH1 (véase la publicación de Openshaw et al. (1995) J. Exp. Med. 182: páginas 1357 a 1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 horas, combinadas; T202); células T, altamente polarizadas con TH2 (véase la publicación de Openshaw et al. (1995) J. Exp. Med. 182: páginas 357 a 1367; activadas con anti-CD3 durante 2, 6, 16 horas, combinadas; T203); células pre T CD-44-CD25+, seleccionadas del timo (T204); clon de células T TH1 D1.1, con reposo de 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T205); clon de células T TH1D1.1 , estimuladas durante 15 horas con 10 µg ml de ConA (T206); clon de células T TH2 CD35, con reposo de 3 semanas después de la última estimulación con antígeno (T207); clon de células T TH2 CDC35 D1.1, estimuladas durante 15 horas con 10 µg/ml de ConA (T208); células T simples Me114+ esplénicas, en reposo (T209); células T Me114+, polarizadas a Th1 con IFN-y/IL-12/anti-IL-4 durante 6, 12, 24 horas, combinadas (T210); células T Me114+, polarizadas a Th2 con IL-4/anti-IFN-y durante 6, 13, 24 horas, combinadas (T211); línea celular A20 de leucemia de células B maduras no estimuladas (B200); línea celular CH12 de células B no estimuladas (B201); células B grandes esplénicas no estimuladas (B202); células B de bazo total, activadas con LPS (B203); células dendríticas de bazo enriquecidas con metrizamida, en reposo (D200); células dendríticas de médula ósea, en reposo (D201); línea celular de monocitos RAW 264.7 activada con LPS 4 horas (M200); macrófagos de médula ósea derivados con GM y M-CSF (M201); línea celular de macrófagos J774, en reposo (M202); línea celular de macrófagos J774 + LPS + anti-IL-10 a 0.5, 1, 3, 6, 12 horas, combinadas (M203); línea celular de macrófagos J774 + LPS + IL-10 a 0.5, 1, 3, 5, 12 horas, combinadas (M204); tejido de pulmón de ratón emplazado con aerosol, cebadores Th2, emplazado con aerosol OVA 7, 14, 23 horas, combinados (véase la publicación de Garlisi et al. (1995) Clinical Immunoloqy and Immunopathology 75: páginas 75 a 83; (X206); tejido pulmonar infectado con Nippostrongulus (véase la publicación de Coffman et al. (1989) Science 245: páginas 308 a 310; X200) pulmón de adulto total, normal (O200); pulmón total, rag-1 (véase la publicación de Schwarz et al. (1993) Immunodeficiencv 4: páginas 249 a 252; O205); bazo con IL-10 suprimido (véase la publicación de Kuhn et al. (1991) CeJI 75: páginas 263 a 274; X201); bazo de adulto total, normal (O201); bazo total, rag-1 (O207); parches de Peyer con IL-10 suprimido (O202); parches de Peyer totales, normal (0210); nodulos linfáticos de mesenterio, con IL-10 suprimido (X203); nodulos linfáticos mesentéricos totales, normales (0211 ); colon con IL-10 suprimido (X203); colon total, normal (0212); páncreas de ratón NOD (véase la publicación de Makino et al. (1980) Jikken Dobutsu 29: páginas 1 a 13; X205); timo total, rag-1 (O208); riñon total, rag-1 (O209); corazón total, rag-1 (O202); cerebro total, rag-1 (O203); testículo total, rag-1 (O204), hígado total, rag-1 (O206); tejido articular normal de rata (O300); y tejido articular artrítico de rata (X300). Se detectaron señales positivas intensas en: células dendríticas de médula ósea, en reposo (D201); y en macrófagos de médula ósea derivados de GM y M-CSF (?20?). Se detectaron señales bajas en timo total, rag-1 (O208) y bazo total, rag-1 (O207). Se detectaron señales apenas perceptibles en los nodulos linfáticos mesentéricos con IL-10 K.O. (X203); pulmón de adulto total, normal (O200) y pulmón total, rag-1 (véase la publicación de Schwarz et al. (1993) Immunodeficiency 4: páginas 249 a 252; O205). Otras no dieron señal detectable alguna. Las señales intensas sugieren que el marcador puede ser útil para distinguir o caracterizar poblaciones o subpoblaciones de células dendríticas y/o macrófago. La distribucoón de SDCMP4 por PCR: señales positivas en: Células Dendríticas tratadas con GM-CSF y TNFa; monocitos activados con PMA y ionomicina; los granulocitos activados con PMA y ionomicina; y PBL; no se detectaron señales en: líneas celulares TF1, Jurkat, MRC5, JY, U937, CHA; en células T activadas ni en células B activadas. Se detecta SDCMP4 en DC (de progenitoras CD34+ cultivadas 12 días en GM-CSF y TNFa), ya sea no activadas como activadas con PMA y ionomicina. También se detectaron señales en monocitos, granulocitos y PBL (ya sea no activados como activados con PMA y ionomicina).

Las bases de datos de secuencias muestran secuencias de SDCMP4 en células dendríticas primarias (frecuentes); médula ósea (una); eosinófilos (una); placenta retirada (una); y en linfoma de células T (dos). Los genes de SDCMP3 y SDCMP4 despliegan una homología considerable con su contraparte murina del ASGPR de monocitos humanos (M-ASGPR). La homología es significativa en el dominio de reconocimiento de carbohidratos, lo que le confiere especificidad al ASGPR de monocitos murinos para la galactosa y la N-acetilgalactosamina (GalNAc). Véase la publicación de Sato et al (1992) J. Biochem. 11: páginas 331 a 336. Además, el ASGPR de monocitos murino tiene una señal YENL de internación en su dominio citosólico. Un dendrograma de secuencias de CRD sugiere una relación más cercana de las SDCMP3s de ratón y humana con la SDCMP2 que con la SDCMP4. Estas CRDs parecen estar más íntimamente relacionadas entre sí que con la CRD del ASGPR hepático. El M-ASGPR murino funciona como un receptor para la endocitosis de glicoproteínas galactosiladas (Ozaki et al (1992) J. Biol. Chem. 267: páginas 9229 a 9235) y permite el reconocimiento de células malignas por macrófagos tumoricidas (Kawakami et al. (1994) Jpn. J Cáncer Res. 85: páginas 744 a 749). En este contexto, se descubrió que el M-ASGPR murino se expresa dentro de nodulos metastásicos de pulmón de ratones portadores de células de tumor de ovario metastásico OV2944-HM-1 (Imai et al. (1995) Immunol. 86: páginas 591 a 598). Resulta interesante que el M-ASGPR humano manifiesta una especificidad que se puede destacar para el antígeno Tn (Suzuki et al (1996) J, Immunol. 156: páginas 128 a 135), que contiene un grupo de GalNAc terminal enlazada a serina o treonina y está asociado con los carcinomas humanos (Springer (1989) Mol. Immunol. 26: páginas 1 a 5; y Orntoft et al, (1990) Int. J. Cáncer 45: páginas 666 a 672). Con base en la homología de secuencia, puede predecirse que las SDCMPs también funcionan como un receptor endocítico para glicoproteínas galactosiladas. Además, la internación de ligandos por medio del receptor de mañosa, otra lectina endocítica transmembrana tipo C, tiene como resultado una presentación de antígenos altamente eficiente por DC a través de la trayectoria de clase I de la MHC. Celia et al. (1997) Current Opinión Immunol. 9: páginas 10 a 16. Por analogía, es posible que las SDCMPs desempeñen un papel similar para orientar los ligandos intenados a una trayectoria de presentación de antígenos. Por lo tanto, la SDCMP4 podría ser un objetivo potencial de alta eficiencia para cargar los antígenos en las DC para mejorar la presentación para las células T en terapia adyuvante basada en inmunidad. Esto podría aproximarse enviando pulsos de DC in vitro ya sea con una forma galactosilada del antígeno o con mABs anti-SDCMP4 acoplados al antígeno. La eficiencia in vitro de la presentación podría ensayarse mediante la activación de células T específicas de antígeno. Esto se enfocaría en la presentación de antígenos asociados con tumores (TAA) debido a las perspectivas terapéuticas inherentes de dicho método. De particular interés son los TAA asociados con el melanoma maligno.

Además, la especificidad del M-ASGPR humano por el antígeno Tn convierte a los TAA de este carcinoma en candidatos de elección para seleccionar como objetivo a la SDCMP. Como se ha demostrado recientemente, un antígeno exógeno puede ser procesado y presentado en la trayectoria de clase I de MHC. Véanse las publicaciones de Porgador y Gilboa (1995) J. Exp. Med. 182: páginas 255 a 260; y Paglia et al. (1996) J. Exp. Med. 183: páginas 317 a 322. Es probable que los receptores especializados realicen dicha función en DC. Se pueden seleccionar como objetivo estos receptores de DC para que ayuden a producir células T citotóxicas (CTL) específicas de TAA, con potencial terapéutico significativo, ya que las CTL parecen estar involucradas en la inducción del rechazo a los tumores.

XV. AISLAMIENTO DE UNA CONTRAPARTE DE ENLACE Una proteína de DC puede utilizarse como reactivo de enlace específico, aprovechando su especificidad de enlace, de modo muy similar a como se utilizaría un anticuerpo. Un reactivo de enlace se etiqueta como se describió anteriormente, por ejemplo, por fluorescencia o de otro modo, o se inmoviliza a un sustrato para métodos de lavado. La proteína de DC se utiliza para rastrear una línea celular que exhibe enlace. Se usan técnicas estándar de tinción para detectar o seleccionar un ligando expresado a nivel intracelular o superficial, o se rastrean células transformadas que se expresan en superficie por lavado. El rastreo de la expresión intracelular se realiza por varios procedimientos de tinción o inmuno-fluorescencia. Véase, también la publicación de McMahan et al. (1991) EMBO J. 10: páginas 2821 a 2832. Por ejemplo: en el día 0 el recubrimiento previo de portaobjetos de permanox de 2 cámaras con 1 mi por cámara de fibronectina, con 10 ng/ml de PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar una vez con PBS. Posteriormente, colocar en placas las células COS a razón de 2-3 x 105 células por cámara en 1.5 mi de medio de cultivo. Incubar durante toda la noche a una temperatura de 37°C. Durante el día 1 para cada muestra preparar 0.5 mi de una solución de 66 mg/ml de DEAE-dextrano, 66 mM en cloroquina y con 4 mg de ADN en DME libre de suero. Para cada grupo se prepara un control positivo, por ejemplo, de ADNc del receptor FLAG humano a 1 y 1/200 de dilución, y un control negativo. Enjuagar las células con DME libre de suero. Agregar la solución de ADN e incubar durante 5 horas a una temperatura de 37°C. Retirar el medio y agregar 0.5 mi de DMSO al 10% en DME durante 2.5 minutos. Retirar y lavar una vez con DME. Agregar 1.5 mi de medio de cultivo e incubar durante toda la noche. Durante el día 2, cambiar el medio. En los días 3 ó 4, las células se fijan y tiñen. Enjuagar las células dos veces con solución salina regulada de Hank (HBSS) y fijar en paraformaldehído (PFA)/glucosa al 4% durante 5 minutos. Lavar 3 veces con HBSS. Los portaobjetos pueden almacenarse a una temperatura de -80°C después que todo el líquido se haya eliminado.

Para cada cámara, se realizan incubaciones de 0.5 mi de la siguiente manera. Agregar HBSS/saponina (0,1%) con 32 ml/ml de aN3 1M durante 20 minutos. Las células se lavan luego con HBSS/saponina 1 vez. Agregar proteína o complejo proteína/anticuerpo a las células e incubar durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Si es adecuado, agregar el primer anticuerpo durante 30 minutos. Agregar el segundo anticuerpo, por ejemplo, un vector de anticuerpo anti-ratón, a una dilución 1/200, e incubar durante 30 minutos. Preparar la solución de ELISA, por ejemplo, vector de solución de peroxidasa de rábano picante Elite ABC, e incubar previamente durante 30 minutos. Utilizar, por ejemplo, 1 gota de solución A (avidina) y 1 gota de solución B (biotina) por cada 2.5 mi de HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Agregar solución de ABC HRP e incubar durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS, el segundo lavado durante 2 minutos, lo cual cierra las células. Luego agregar el vector de ácido diaminobenzoico (DAB) durante 5 a 10 minutos. Utilizar 2 gotas de regulador de pH más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H202 por cada 5 mi de agua destilada. Retirar cuidadosamente la cámara y enjuagar el portaobjeto en agua. Secar al aire por unos minutos, luego agregar 1 gota de Crystal Mount y una cubierta de portaobjetos. Hornear durante 5 minutos a una temperatura de 85 a 90°C. De manera alternativa, se utilizan otros reactivos de enlace específico para proteínas de monocitos para purificar por afinidad o seleccionar células que expresan un receptor. Véase, por ejemplo, la publicación Sambrook et al., o de Ausubel et al. Otra estrategia es rastrear un receptor enlazado a una membrana mediante lavado. El receptor ADNc se construye como se describió anteriormente. El ligando puede inmovilizarse y utilizarse para inmovilizar las células de expresión. La inmovilización puede lograrse mediante el uso de anticuerpos adecuados que reconocen, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de proteína de monocito o mediante el uso de anticuerpos producidos contra los primeros anticuerpos. Los ciclos recursivos de selección y amplificación conducen al enriquecimiento de los clones adecuados y al aislamiento eventual de los clones que expresan el ligando. Pueden rastrearse bibliotecas de expresión de fagos en busca de proteínas de monocitos. Técnicas de etiquetado adecuadas, por ejemplo, anticuerpos anti-FLAG, permitirán el etiquetado específico de los clones adecuados. Pueden hacerse muchas modificaciones y variaciones de la presente invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como resultará evidente para los expertos en la materia. Las modalidades específicas descritas en la presente descripción se ofrecen únicamente como ejemplo, y la presente invención estará limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes para los están denominadas dichas reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS <¿10> Scaeriag Corporation •ii?,Qs Genes aislados de Proteínas de Membrana de Mamíferos; Reactivos Relacionados *12 ?> SP0BO2 QK I \50> US 10/278,470 <151> 2002-10-11 <aee> Patenttn versión 3.1 <210> 1 <21I> 950 ADN <213> Homo sapiens <22(h> <221> CDS <2S2» (108) . , (593) <223> gtccctgagc tetagettet ttaaatgaag ctgagtcccc gggcaacafcc tttagggaga gaggtacaaa aggttcctgg sccttctcaa cacagggagc ctgeata a-g atg caá Met Me" Gla gag eag caá cct caá agt acá gag aaa aga ggc tgg ttg tcc ctg aga 164 Gl« T?? 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Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de enlace aislado que se enlaza de manera específica a un polipéptido que comprende la SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10.

2. El compuesto de enlace de conformidad con la Reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto de enlace es un anticuerpo o un fragmento de enlace de anticuerpo del mismo.

3. El compuesto de enlace de conformidad con la Reivindicación 2, caracterizado además porque el fragmento de enlace de anticuerpo es: a) un fragmento Fv; b) un fragmento Fab; o c) un fragmento Fab2.

4. El compuesto de enlace de conformidad con la Reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo es: a) un anticuerpo policlonal; b) un anticuerpo monoclonal; o c) un anticuerpo humanizado.

5. Un método para utilizar el compuesto de enlace que se reclama en la Reivindicación 1 , el método comprende poner en contacto el compuesto de enlace con una muestra que comprende un antígeno para formar un complejo de compuesto de enlace:antígeno.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque: a) la muestra es una muestra biológica, que incluye un fluido corporal; b) la muestra es humana; c) el antígeno está en una célula; d) el antígeno además está purificado; o e) el método proporciona la localización o distribución espacial de dicho antígeno.

7. Un equipo de detección que comprende el compuesto de enlace que se reclama en la Reivindicación 1 y: a) material instructivo para el uso o eliminación de los reactivos de dicho equipo; o b) un compartimiento que proporciona la separación del compuesto de enlace u otros reactivos de dicho equipo.

8. Un polipéptido sustancialmente puro o aislado que se une de manera específica al compuesto de enlace que se reclama en la Reivindicación 1.

9. El polipéptido de conformidad con la Reivindicación 8, caracterizado además porque el polipéptido comprende la SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10.

10. Un método para utilizar el polipéptido que se reclama en la Reivindicación 8, el método comprende poner en contacto dicho polipéptido con un anticuerpo bajo las condiciones adecuadas para formar un complejo anticuerporpolipéptido.

11. Un equipo de detección que comprende dicho polipéptido que se reclama en la Reivindicación 8, y: a) material instructivo para el uso o eliminación de los reactivos de dicho equipo; o b) un compartimiento que proporciona la separación del polipéptido u otros reactivos de dicho equipo.

12. Un ácido nucleico aislado o purificado que codifica el polipéptido que se reclama en la Reivindicación 8.

13. El ácido nucleico de conformidad con la Reivindicación 12, caracterizado además porque comprende la SEC. ID NO: 1 , 3, 5, 7 ó 9.

14. Un ácido nucleico aislado o purificado que se híbrida en condiciones rigurosas para el ácido nucleico que se reclama en la Reivindicación 12.

15. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que se reclama en la Reivindicación 12.

16. Una célula huésped que comprende el vector de expresión que se reclama en la Reivindicación 15.

17. La célula huésped de conformidad con la Reivindicación 16, caracterizada además porque el huésped es: a) una célula de mamífero; b) una célula bacterial; c) una célula de insecto; o d) una célula de levadura.

18. Un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula huésped que se reclama en la Reivindicación 16 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y purificar el polipéptido.

19. Un método para modular la fisiología o función de células dendríticas, que comprende un paso de poner en contacto una célula con un agonista o antagonista de la SEC. ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10.

20. El método de conformidad con la Reivindicación 19, caracterizado además porque el antagonista es un anticuerpo.

21. El método de conformidad con la Reivindicación 19, caracterizado además porque el contacto es en combinación con un antígeno, que incluye un antígeno de superficie celular, MHC Clase I ó MHC Clase II.