RU2161044C2 - Способ направления (индукции) иммунного ответа, днк, вектор, способ лечения - Google Patents
Способ направления (индукции) иммунного ответа, днк, вектор, способ лечения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2161044C2 RU2161044C2 RU93055035/13A RU93055035A RU2161044C2 RU 2161044 C2 RU2161044 C2 RU 2161044C2 RU 93055035/13 A RU93055035/13 A RU 93055035/13A RU 93055035 A RU93055035 A RU 93055035A RU 2161044 C2 RU2161044 C2 RU 2161044C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- receptor
- cell
- cells
- hiv
- target
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 364
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 69
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 9
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 151
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 151
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 151
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 59
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 48
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 39
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 25
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 25
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 25
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 24
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 23
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 21
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 8
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 8
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 8
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 abstract 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 115
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 59
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 44
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 38
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 36
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 36
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 34
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 34
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 27
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 25
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 24
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 16
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 14
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 102220576709 Hemoglobin subunit mu_D15G_mutation Human genes 0.000 description 12
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 12
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 12
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 11
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 11
- 102220476280 MAP6 domain-containing protein 1_C11G_mutation Human genes 0.000 description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 7
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 5
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- -1 inositol phosphates Chemical class 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 102100027203 B-cell antigen receptor complex-associated protein beta chain Human genes 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 4
- AMHAQOBUZCQMHN-UHFFFAOYSA-N Indo-1 dye Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C=2NC3=CC(=CC=C3C=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 AMHAQOBUZCQMHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 3
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 3
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 3
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 2
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 125000002435 L-phenylalanyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 241001193851 Zeta Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 2
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 2
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102220077168 rs775407864 Human genes 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007988 ADA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000012124 AIDS-related disease Diseases 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 102220467418 Acyl-coenzyme A thioesterase MBLAC2_E61Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100020786 Adenylosuccinate synthetase isozyme 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004652 CD56 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010003639 CD56 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100008049 Caenorhabditis elegans cut-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102220501386 Cytohesin-4_Y62F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical compound C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 102000000587 Glycerolphosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102220533219 Glycophorin-B_Y51F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007996 HEPPS buffer Substances 0.000 description 1
- 108010083930 HIV Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006481 HIV Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010014597 HLA-B44 Antigen Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101100112778 Homo sapiens CD247 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920000426 Microplastic Polymers 0.000 description 1
- DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound NC(=O)CNCCS(O)(=O)=O DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102220520572 Osteoclast-stimulating factor 1_N48S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000009182 Parasitemia Diseases 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 241000233872 Pneumocystis carinii Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100037906 T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Human genes 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091027569 Z-DNA Proteins 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000009172 cell transfer therapy Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013632 covalent dimer Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011266 cytolytic assay Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024389 cytopenia Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000528 effect on cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010044294 eta-kappa antigen T cell receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000001632 homeopathic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003606 oligomerizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000004537 potential cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220026812 rs63750850 Human genes 0.000 description 1
- 102220162066 rs755988042 Human genes 0.000 description 1
- 102220215705 rs759957857 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N sivmac Chemical compound O=C([C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70514—CD4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и медицине и может быть использовано для направления клеточного иммунного ответа на инфекционный агент. Млекопитающему вводят трансформированные иммунные клетки, которые экспрессируют химерный рецептор, содержащий внеклеточную часть, способную распознавать инфекционный агент, внутриклеточную часть, происходящую из полипептида CD3, ζ или η Т - клеточного рецептора, или полипептида В-клеточного рецептора, или полипептида Fc-рецептора, которая обладает способностью передавать клетке сигнал на разрушение. Включение в химерный рецептор внеклеточной части CD4, распознающей и связывающей ВИЧ, и внутриклеточной части, происходящей из полипептида CD3, ζ или η Т - клеточного рецептора, позволяет передавать клетке сигнал на разрушение ВИЧ или ВИЧ-инфицированной клетки. 12 с. и 20 з.п. ф-лы, 45 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к функциональным T клеточным рецепторам, Fc рецепторам или B клеточным рецепторам химер, которые способны менять направление деятельности иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регулированию лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов за счет экспрессии в указанные клетки химер, которые заставляют клетки реагировать на мишени, распознаваемые химерами. Настоящее изобретение относится также к функциональным T клеточным рецепторам, Fc рецепторам или B клеточным рецепторным химерам, которые способны управлять терапевтическими клетками для специфического распознавания и разрушения либо клеток, инфицированных специфическим инфицирующим агентом, самого инфицирующего агента, опухолевой клетки, или автоиммунно-генерированной клетки. Более конкретно, настоящее изобретение относится к продуцированию T клеточных рецепторов или Fc рецепторов химер, способных заставить цитотоксичные T лимфоциты специфически распознать и лизировать клетки, экспрессирующие протеины HIV оболочки. Поэтому настоящее изобретение предоставляет лечение от таких заболеваний, как AIDS /синдром приобретенного иммунодефицита, СПИД/, которое вызывается вирусом HIV.
Предпосылки изобретения
Распознавание T клетками антигена за счет рецептора T клетки является основой иммунологии. T клетки управляют тем, что называется клеточным иммунитетом. Он включает разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существует целый ряд T клеток, включая "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые формируют иммунную реакцию, цитотоксичные /или "киллеры"/ клетки, которые непосредственно убивают ненормальные клетки.
Распознавание T клетками антигена за счет рецептора T клетки является основой иммунологии. T клетки управляют тем, что называется клеточным иммунитетом. Он включает разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существует целый ряд T клеток, включая "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые формируют иммунную реакцию, цитотоксичные /или "киллеры"/ клетки, которые непосредственно убивают ненормальные клетки.
T клетки, которые распознают и связывают уникальные антигены, расположенные на поверхности других клеток, становятся активированными; тогда они могут умножаться, и, если это цитотоксичные клетки, они могут убить связанную клетку.
Автоиммунное заболевание характеризуется продуцированием либо антител, которые реагируют с тканями хозяина, или иммунных эффекторных T клеток, которые являются автореактивными. В некоторых случаях автоантитела могут возникнуть за счет нормальной T- и B-клеточной реакции, активированной чужими веществами или организмами, которые содержат антигены, которые перекрестно реагируют с аналогичными соединениями в тканях организма. Примерами клинических автоантител являются антитела против ацетилхолиновых рецепторов в Myasthenia gravis; и анти-ДНК, анти-эритроцитные и анти-тромбоцитные антитела при системном lupus erythematorus.
HIV и иммунопатогенез
В 1984 г. было обнаружено, что HIV является этиологическим агентом AIDS. С того времени определение СПИД было пересмотрено много раз с точки зрения того, какие критерии должны быть включены в диагноз. Однако, несмотря на флуктуации параметров диагностики, простым общим определителем СПИДа является инфицирование HIV и последующее развитие стойких конституциональных симптомов, и определяемые СПИД заболевания, такие, как вторичные инфекции, неоплазмы и неврологические заболевания. Harrizon's Principles of Internal Medicine 12е изд., Mc. Graw Hill (1991).
В 1984 г. было обнаружено, что HIV является этиологическим агентом AIDS. С того времени определение СПИД было пересмотрено много раз с точки зрения того, какие критерии должны быть включены в диагноз. Однако, несмотря на флуктуации параметров диагностики, простым общим определителем СПИДа является инфицирование HIV и последующее развитие стойких конституциональных симптомов, и определяемые СПИД заболевания, такие, как вторичные инфекции, неоплазмы и неврологические заболевания. Harrizon's Principles of Internal Medicine 12е изд., Mc. Graw Hill (1991).
HIV является ретровирусом человека группы лентивирусов. Четыре распознаваемых ретровируса человека принадлежат к двум различным группам: T лимфотропические /или лейкемия / ретровирусы человека HTLV-1 и HTLV-2, и вирусы иммунодефицита человека, HIV-1 и HIV-2. Первые представляют собой трансформирующиеся вирусы, тогда как последние являются цитопатическими вирусами.
HIV-1 был идентифицирован как наиболее часто вызывающий СПИД во всем мире. Соответствие гомологии между HIV-2 и HIV-1 составляет около 40%, причем HIV-2 более близок к некоторым членам группы вирусов иммунодефицита /SJV/. См. Cuman J. et al. Science 329:1357-1359 /1985/; Wеiss R. et al., Nature, 324:572-575 /1986/.
HIV содержит обычные ретровирусные гены /env, gag и pol/, а также шесть дополнительных генов, вовлеченных в репликацию и другие биологические активности вирусов. Как было указано ранее, общее определение СПИД состоит в глубокой иммунодепрессии, главным образом, клеточного иммунитета. Подавление иммунитета ведет к различным возможным заболеваниям, особенно к некоторым инфекциям и неоплазмам.
Основной причиной иммунодефицита при СПИДЕ, как было обнаружено, является количественный и качественный дефицит субкомплекта лимфоцитов, продуцируемых в тимусе /T/, T4 популяции. Этот субкомплект клеток фенотипически определяется по наличию CD4 поверхностной молекулы, которая как было продемонстрировано, является клеточным рецептором для HIV. Dalgleish et al., Nature, 312: 763 /1984/. Хотя именно T клетки являются основным типом клеток, инфицируемых HIV, важно, что любые клетки человека, которые экспрессируют CD4 молекулу на своей поверхности, способны связываться с HIV и быть инфицированы им.
Традиционно, CD4 + T клеткам была приписана роль хелпера/индуктора, что указывало на функцию в обеспечении активирующего сигнала на B клетки, или индуцируя T лимфоциты, которые несут реципрокный CD8 маркер и становятся цитотоксичными/супрессорными клетками. Peilihess and Schlossman Cell, 19: 821-827 /1980/ Goldstein et al., Immunol, Rev. 68:5-42 /1982/.
HIV связывается специфически и с высоким сродством, за счет участка секвенирования аминокислот в оболочке вируса /gp 120/, с частью VI участка CD4 молекулы, расположенной вблизи ее N-конца. После связывания, вирус сливается с мембраной мишеневой клетки и интернализируется. После интернализации он использует энзим обратной транскриптазы для транскрипции своей геномной РНК в ДНК, которая внедряется в клеточную ДНК, где и существует в течение жизни клетки в качестве "провируса".
Провирус может оставаться латентным или может быть активирован до транскрипции мРНК и геномной РНК, что ведет к синтезу протеинов, сборке, образованию нового вируса и бадингу вируса с поверхности клетки. Хотя точный механизм, за счет которого вирус вызывает гибель клетки, не установлен, по-видимому, основным механизмом является массивный вирусный бадинг с поверхности клетки, который приводит к разрушению плазмы мембраны и в результате к нарушению осмотического равновесия.
Во время инфицирования организм хозяина вырабатывает антитела против протеинов вирусов, включая основные гликопротеины оболочки gp120 и gp 41. Несмотря на этот гуморальный иммунитет, заболевание прогрессирует, что приводит к летальной иммуносуппрессии, которая характеризуется множественными различными инфекциями, паразитемией, слабоумием и смертью. Неспособность анти-вирусных антител хозяина остановить развитие заболевания и представляет один из наиболее тревожных и настораживающих аспектов заболевания и является плохим предзнаменованием для попыток вакцинации на основании обычных приближений.
Два фактора могут играть роль в эффективности гуморальной реакции на вирус иммунодефицита. Во-первых, также как и остальные РНК вирусы /и подобно ретровирусам, в частности/, вирусы иммунодефицита демонстрируют высокую степень мутации в ответ на иммунный контроль хозяина. Во-вторых, сами гликопротеины оболочки являются плохо гликозилируемыми молекулами, представляющими несколько эпитопов, подходящих для связывания с высоко афинными антителами. Плохая антигенная мишень, которую представляют оболочки, предоставляет хозяину мало возможностей для ограничения вирусной инфекции за счет продуцирования специфических антител.
Клетки, инфицированные вирусами HIV, экспрессируют gp 120 гликопротеин на своей поверхности. Gp 120 способствует актам слияния между CD4+ клетками за счет реакции, аналогичной той, с помощью которой вирус проникает в неинфицированные клетки, что приводит к образованию коротко-живущих многоядерных гигантских клеток. Образование синцития от непосредственного взаимодействия gp 120 гликопротеина оболочки с CD4 протеином. Dalgleish et al., Supra Klatrman D. et all Nature 312:763 (1984); Mc Dougal J.S. et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski J. et al., Nature, 322:470 (1986); Zifson J.D. et al., Nature, 323:725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature, 321:412 (1986).
Доказательством того, что CD4-gp 120 связывание ответственно за вирусную инфекцию клеток, несущих CD4 антиген, включает обнаружение того, что между gp120 и CD4 образуется специфический комплекс. Mc Dougal et al., Supra. Другие исследователи показали, что клеточные линии, которые были неинфективны для HIV, были превращены в инфицируемые клеточные линии для HIV, с последующей трансфекцией и экспрессией CD4 кДНК гена человека. Madolon et al. Cell, 46:333-348 /1968/.
Терапевтические программы на основании растворимого CD4 как пассивного агента, который помешал бы вирусной адсорбции и осуществляемой через синцитий клеточной трансмиссии, были предложены и с успехом продемонстрированы in vitro рядом исследовательских групп /Deen at al., 3321:82-84 /1988/; Fisher et al. , Nature, 331: 76-78 /1988/; Hussey et al., Nature 331:78-81 /1988/; Smith et al., Science, 238:1704-1707 /1987/; Franecker et al., Nature, 331: 84-86 /1988 /, а CD4 протеины слияния иммуноглобулина с увеличенным сроком полужизни и умеренной биологической активностью были последовательно разработаны /Nature, 337:525-531/1989/; Fraunecker et al., Nature, 339: 68-70 /1989/; Byrn et al., Nature, 344:667-670 /1990/; Zcttlemeissl at al. , DNA Cell Biol. 9:347-353 /1990/. Хотя конъюгаты CD4 иммунотоксина или протеины слияния демонстрируют потенциальную цитотоксичность для инфицированных in vitro клеток /Chaudhary et al. , Nature, 335:369-372 /1988/; Fill et. al., Science, 242:1166-1168 /1988//, латентность синдрома иммунодефицита делает маловероятным эффективность какой-либо разовой терапии по исключению основы вирусов, а антигенность чужих протеинов слияния, по-видимому, ограничит их применимость при лечении требуемыми повторными дозами. Эксперименты на обезьянах, зараженных SIV, показали, что растворимый CD4, если его вводить животным без видимой CD4 цитопении, может понизить титр SIV и повысить in vitro степень миелоидного потенциала /Watanabe et al., Nature, 337:267-270 /1989 /. Однако, после окончания лечения наблюдалось немедленное повторное появление вируса, что предполагает необходимость пожизненного введения препарата для предотвращения прогрессирующего вырождения иммунной системы.
T клетки и Fc рецепторы
Поверхностная клеточная экспрессия большинства многочисленных форм T клеточного антигенного рецептора /TCR/ требует совместной экспрессии, по крайней мере, 6 различных полипептидных цепей /Weiss et al., J. Exp. Med. 160:1284-1299 /1984/; Orloffhashi et al., Nature 316:606-609 /1985/; Berghout et al., J. Biol. Chem., 263:8528 - 8536 /1988/; Sussman et al., Cell, 54: 85-95 /1988/ /; α / β антиген связывающих цепей, трех полипептидов CD3 комплекса и z. Если отсутствует любая из этих цепей, не происходит стабильной экспрессии остальных членов комплекса. z является лимитирующим полипептидом для поверхностной экспрессии полного комплекса /Suss man et al., Cell, 52: 85-95 /1988/ и, как известно, осуществляет, по крайней мере, часть клеточных активационных программ, которые включаются рецептором распознавания лиганда /Weiss man et al., EMBO J. 8:3651 - 3656 /1989/; Frank et al., Science, 249: 174 - 177 /1990//. 32 кДа типа I интегральный мембранный гомодимер, z /зета/ имеет 9 остаточных внеклеточных доменов, причем нет участков для присоединения I-связанных гликанов, и 112 остатков /мышиных/ или 113 остатков /человеческих/ внутриклеточных доменов /Weiss man et al., Science, 238:1018 - 1020 /1988a/; Weiss man et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9709 - 9713 /1988b//. Изоформа z, называемая η /эта/ /Baniyash et al., J. Biol. Chem., 263: 9874 - 9878 /1988/; Orloff et al., J. Biol. Chem. 264:14812 - 14817 /1989//, которые образуются в результате другого направления иРНК сплайсинга /Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319 - 3323 /1990/, присутствуют в пониженных количествах в клетках, экспрессирущих рецептор антигена. z - η гетеродимеры, как обнаружено, осуществляют образование инозитолфосфатов, а также инициируемую рецепторами запрограммированную гибель клеток, называемую апоптозисом /Mercep et al., Science, 242:571 - 574 /1988/, Mercep et al., Science, 246:1162 - 1165 /1989//.
Поверхностная клеточная экспрессия большинства многочисленных форм T клеточного антигенного рецептора /TCR/ требует совместной экспрессии, по крайней мере, 6 различных полипептидных цепей /Weiss et al., J. Exp. Med. 160:1284-1299 /1984/; Orloffhashi et al., Nature 316:606-609 /1985/; Berghout et al., J. Biol. Chem., 263:8528 - 8536 /1988/; Sussman et al., Cell, 54: 85-95 /1988/ /; α / β антиген связывающих цепей, трех полипептидов CD3 комплекса и z. Если отсутствует любая из этих цепей, не происходит стабильной экспрессии остальных членов комплекса. z является лимитирующим полипептидом для поверхностной экспрессии полного комплекса /Suss man et al., Cell, 52: 85-95 /1988/ и, как известно, осуществляет, по крайней мере, часть клеточных активационных программ, которые включаются рецептором распознавания лиганда /Weiss man et al., EMBO J. 8:3651 - 3656 /1989/; Frank et al., Science, 249: 174 - 177 /1990//. 32 кДа типа I интегральный мембранный гомодимер, z /зета/ имеет 9 остаточных внеклеточных доменов, причем нет участков для присоединения I-связанных гликанов, и 112 остатков /мышиных/ или 113 остатков /человеческих/ внутриклеточных доменов /Weiss man et al., Science, 238:1018 - 1020 /1988a/; Weiss man et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9709 - 9713 /1988b//. Изоформа z, называемая η /эта/ /Baniyash et al., J. Biol. Chem., 263: 9874 - 9878 /1988/; Orloff et al., J. Biol. Chem. 264:14812 - 14817 /1989//, которые образуются в результате другого направления иРНК сплайсинга /Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319 - 3323 /1990/, присутствуют в пониженных количествах в клетках, экспрессирущих рецептор антигена. z - η гетеродимеры, как обнаружено, осуществляют образование инозитолфосфатов, а также инициируемую рецепторами запрограммированную гибель клеток, называемую апоптозисом /Mercep et al., Science, 242:571 - 574 /1988/, Mercep et al., Science, 246:1162 - 1165 /1989//.
Подобно z и η, связанная с Fc рецептором γ цепь экспрессируется в комплексы клеточной поверхности дополнительными полипептидами, некоторые из которых осуществляют распознавание лиганда, а другие имеют неопределенные функции.
γ /гамма/ имеет гомодимерную структуру и вся ее организация весьма схожа с организацией z, и она является компонентой как маст клетки /базофила с высоким сродством с IgE рецептором Fc ε RI, который состоит из, по крайней мере, трех различных полипептидных цепей /Blank et al., Nature, 337:187 - 189 /1989/; Ra et al., Nature, 241:752 - 754 /1989//, так и одного из рецепторов с низким сродством к IgG, представленным у мышей Fc γ RII α /Ra et al., J. Biol. Chem J. Biol. Chem. 264:1523 - 1527 /1989//, и у человека CD16 субтипом экспрессии макрофагов и природных киллерных клеток, CD6TM /CD16 трансмембрана/ /Zanier et al., Nature, 342:803 - 805 /1989/; Andersonet al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:2274 - 2278 /1990//, и с полипептидом неидентифицированной функции /Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2274-2278 /1990/. Недавно сообщалось, что γ экспрессируют T клеточные линии мышей, CTL, в которых он образует гомодимеры, также, как γ - z и γ - η гетеродимеры /Orloff et al., Nature, 347:189 - 191 /1990//.
Fc рецепторы определяют патоцитолиз иммунных комплексов, трансцитолиз и зависимую от антител клеточную цитотоксичность /АДСС/ /Pavetch and Kinet Annu. Rev. Immunol. 9:457 - 492 /1991/; Unkeless et al., Annu, Rev. Immunol. 6: 251 - 281 /1988/; and Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 /1988/. Недавно было показано, что одна из изоформ мышиных с низким сродством Fc рецепторов /Fc R γ IIIBI/ определяет интернализацию Ig-покрытых мишеней в покрытые клатрином литы, и что другой рецептор с низким сродством /Fc γ IIA/ осуществляет ADCC за счет ассоциации с одной или более из мембран небольшого семейства "триггерных молекул" /Miettineu et al., Cell 58:317-327. /1989/; и Hunziker and Mellman J. Cell, Biol. 109:3291 - 3302 /1989/. Эти триггерные молекулы, T клеточный рецептор /TCR/ z цепи, TCR η цепи и Fc рецептор γ цепи, взаимодействуют с доменами распознавания лиганда различных рецепторов иммунных систем и могут автономно инициировать клеточные эффекторные программы, включая цитолиз, с последующей аггрегацией /Samelson et al., Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al., Science 239:1018-1020 (1988): Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990); Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342:805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246:1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:2274-2278 (1990); and Irving and Weiss, Cell 64:891-901 (1991).
Проводя параллели между семействами Fc рецепторов с низким сродством мышей и людей, однако, стало очевидным, что Fc γ IIA и C изоформы человека не содержат мышиных дубликатов. Отчасти из-за этого их функции до сих пор не определены.
Благодаря тому, что гуморальные агенты на основе CD4 могут иметь ограниченное применение in vivo, авторы изобретения начали использовать возможность придания клеточного иммунитета HIV. В результате они сообщают о получении протеиновых химер, в которых внеклеточный домен CD4 слит с трансмембранным и/или внутриклеточным доменами T клеточного рецептора, J gG Fc рецептора, или B клеточного рецепторного трансдукторного сигнального элемента. Цитолитические T клетки, экспрессирующие химеры, которые включают внеклеточный CD4 домен, демонстрируют потенциальное MHC-независящее разрушение клеточных мишеней, экспрессирующих протеины оболочки HIV. Крайне важный и новый компонент этого приближения состоит в идентификации одиночного T клеточного рецептора, или Fc рецептора, и B клеточного рецептора цепей, аггрегации которых достаточно для инициирования клеточной реакции.
Одним из особенно ценных применений этого приближения было изобретение химер между CD4 и Z, η или γ, которые заставляют цитолитические T лимфоциты распознавать и убивать клетки, экспрессирующие HIV gp120.
Краткое содержание изобретения
Хотя нативные T клетки, В клетки и Fc рецепторы являются, или могут быть, весьма сложными многомерными структурами, не позволяющими проводить с ними обычные манипуляции, настоящее изобретение демонстрирует легкость создания химер между внутриклеточным доменом любой из многочисленных молекул, которые способны выполнять задачу распознавания мишени. В частности, создание химер, состоящих из внутриклеточной части T клетки/ Fc рецепторных зета, эта или гамма цепей, присоединенных к внеклеточной части подходящим образом сконструированных молекул антител, позволяет специфически изменить направление мишеневого потенциала распознавания клеток иммунной системы на распознавание антигена за счет внеклеточного участка антитела. Таким образом, имея участки антител, способные распознавать некоторые детерминанты на поверхности патогенов, клетки иммунной системы, снабженные химерами, будут реагировать на патоген с эффекторной программой соответствующей им линии дифференцировки, например, хелперные T лимфоциты будут реагировать цитотоксичной активностью против мишени, а В лимфоциты будут активизированы на синтез антител. Макрофаги и гранулоциты будут осуществлять свод эффекторные программы, включая выделение цитокина, фагоцитов и вырабатывая реакционноспособный кислород. Аналогично, имея участок антител, способный распознавать опухолевые клетки, реакция иммунной системы на опухоль будет с выгодой усилена. Имея антитела, способные распознавать иммунные клетки, обладающие вредной реакционной способностью с самодетерминантами, автореактивные клетки могут селективно направляться на разрушение. Хотя эти примеры, описывающие использование химер антител в качестве удобного описательного инструмента, настоящее изобретение не ограничивается объемом химер антител, и, естественно, использование специфических неантительных внеклеточных доменов может дать важные преимущества. Так, например, внеклеточная часть, то есть рецептор для вируса, бактерии или паразита, клетки, снабженные химерами, будут специфически поражать клетки, экспрессирующие вирусные, бактериальные или паразитические детерминанты. Выгода такого приближения по сравнению с антителами состоит в том, что нативный рецептор для патогена может иметь уникально высокую селективность или сродство с патогеном, обеспечивая большую степень точности в получении иммунной реакции. Аналогично, для исключения клеток иммунной системы, с неправильными реакциями с самим антигеном, может оказаться достаточным соединить антиген /или его интактный протеин в случае терапии делеции B клеток/ с внутриклеточными зета, эта или гамма цепями, и за счет этого обеспечить специфическое поражение клеток, неправильно реагирующих на свои детерминанты.
Хотя нативные T клетки, В клетки и Fc рецепторы являются, или могут быть, весьма сложными многомерными структурами, не позволяющими проводить с ними обычные манипуляции, настоящее изобретение демонстрирует легкость создания химер между внутриклеточным доменом любой из многочисленных молекул, которые способны выполнять задачу распознавания мишени. В частности, создание химер, состоящих из внутриклеточной части T клетки/ Fc рецепторных зета, эта или гамма цепей, присоединенных к внеклеточной части подходящим образом сконструированных молекул антител, позволяет специфически изменить направление мишеневого потенциала распознавания клеток иммунной системы на распознавание антигена за счет внеклеточного участка антитела. Таким образом, имея участки антител, способные распознавать некоторые детерминанты на поверхности патогенов, клетки иммунной системы, снабженные химерами, будут реагировать на патоген с эффекторной программой соответствующей им линии дифференцировки, например, хелперные T лимфоциты будут реагировать цитотоксичной активностью против мишени, а В лимфоциты будут активизированы на синтез антител. Макрофаги и гранулоциты будут осуществлять свод эффекторные программы, включая выделение цитокина, фагоцитов и вырабатывая реакционноспособный кислород. Аналогично, имея участок антител, способный распознавать опухолевые клетки, реакция иммунной системы на опухоль будет с выгодой усилена. Имея антитела, способные распознавать иммунные клетки, обладающие вредной реакционной способностью с самодетерминантами, автореактивные клетки могут селективно направляться на разрушение. Хотя эти примеры, описывающие использование химер антител в качестве удобного описательного инструмента, настоящее изобретение не ограничивается объемом химер антител, и, естественно, использование специфических неантительных внеклеточных доменов может дать важные преимущества. Так, например, внеклеточная часть, то есть рецептор для вируса, бактерии или паразита, клетки, снабженные химерами, будут специфически поражать клетки, экспрессирующие вирусные, бактериальные или паразитические детерминанты. Выгода такого приближения по сравнению с антителами состоит в том, что нативный рецептор для патогена может иметь уникально высокую селективность или сродство с патогеном, обеспечивая большую степень точности в получении иммунной реакции. Аналогично, для исключения клеток иммунной системы, с неправильными реакциями с самим антигеном, может оказаться достаточным соединить антиген /или его интактный протеин в случае терапии делеции B клеток/ с внутриклеточными зета, эта или гамма цепями, и за счет этого обеспечить специфическое поражение клеток, неправильно реагирующих на свои детерминанты.
Другим применением химер является контроль за популяциями клеток in vivo, следующими за другими формами генетического конструирования. Так, например, использование опухолевых инфильтрующих лимфоцитов или природных киллерных клеток для переноса цитотоксинов в определенные участки опухоли, было предложено. Настоящее изобретение обеспечивает удобные средства для регулирования количества и активности таких лимфоцитов и клеток, не удаляя их из организма пациента для амплификации in vivo. Так, благодаря тому, что внутриклеточные домены химерических рецепторов осуществляют пролиферативные реакции клеток, координирование внеклеточных доменов за счет различных стимулов аггрегации, специфичных для внеклеточных доменов /например, антител, специфичных для внеклеточных доменов/ приведет к пролиферации клеток, несущих химеры.
Хотя конкретные варианты настоящего изобретения включают химеры между зета, эта и гамма цепями или их активными фрагментами /например, описываемыми далее/, любая рецепторная цепь с аналогичными функциями к этим молекулам, например, гранулоцитам или B лимфоцитам, может быть использована для раскрытых здесь целей. Отличительные характеристики целевых иммунных триггерных молекул включают способность быть автономно экспрессированными /например, как отдельная цепь/, способность сливаться с внеклеточным доменом так, чтобы полученная химера присутствовала на поверхности терапевтической клетки, и способность инактивировать клеточные эффекторные программы после аггрегации после столкновения с мишеневым лигандом.
В настоящее время наиболее удобным способом доставки химер в иммунную клеточную систему является способ, включающий некоторые формы генетической терапии. Однако, реконструирование клеток иммунной системы химерическими рецепторами за счет смешения клеток с подходящим солюбилизированным очищенным химерическим протеином также привело бы в результате к образованию популяций сконструированных клеток, способных реагировать на мишени, распознаваемые внеклеточными доменами химер. Аналогичное приближение можно использовать, например, для введения интактного HIV рецептора, CD4, в эритроциты с терапевтическими целями. В этом случае сконструированные клетки не будут способны к самообновлению.
Настоящее изобретение относится к функционально упрощенным T клеточным рецепторным, B клеточным рецепторным и Fc клеточным рецепторным химерам, которые способны изменять направление действия иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регулированию лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов за счет экспрессии в указанные клетки химер, которые вызывают клеточную реакцию на мишени, распознаваемые химерами. Настоящее изобретение относится также к способу направления клеточной реакции на инфицирующий агент, опухолевые или канцерогенные клетки, или на клетки, вырабатываемые автоиммунно. Способ управления клеточной реакцией у млекопитающих включает введение эффективного количества терапевтических клеток указанному млекопитающему, причем указанные клетки способны распознавать и разрушать указанный инфицирующий агент, опухолевые, раковые клетки или автоиммунно генерированные клетки.
В другом варианте способ направления клеточной реакцией на инфицирующие клетки включает введение терапевтических клеток, которые способны распознавать и разрушать указанный агент, причем агентом является специфический вирус, бактерия, простейшее или грибок. Еще более конкретно, способ направлен против таких агентов, как HIV и Pneumocystis carinii.
Специфически настоящее изобретение предлагает способ направления клеточной реакции на клетки, инфицированные HIV.
Способ включает введение пациенту эффективного количества цитотоксичных T лимфоцитов, причем указанные лимфоциты способны специфически распознавать и подвергать лизису клетки, инфицированные HIV.
Таким образом, в одном из вариантов, настоящее изобретение представляет способ направления клеточной реакции на клетки, инфицированные HIV, включающий введение пациенту эффективного количества цитотоксичных T лимфоцитов, которые способны специфически распознавать и подвергать лизису клетки, инфицированные HIV.
В еще одном варианте изобретения предложены химерические рецепторные протеины, которые направляют цитотоксичные T лимфоциты на распознавание и лизис клеток, инфицированных HIV. Еще один вариант изобретения включает клетки хозяина, трансформированные вектором, содержащим химерические рецепторы.
В еще одном варианте настоящее изобретение предлагает антитела против химерических рецепторов настоящего изобретения.
Для получения цитотоксичных T лимфоцитов, которые специфически связывают и разрушают клетки, инфицированные HIV, авторы изобретения испробовали рецепторные химеры. Эти химерические рецепторы функционально активны и обладают экстраординарной способностью специфически связывать и разрушать клетки, экспрессирующие gp120.
Еще одной целью настоящего изобретения стало создание способа лечения индивидуумов, инфицированных HIV. В настоящем изобретении предложен ряд важных достижений в лечении СПИДа.
Эти и другие нелимитирующие варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам из последующего подробного описания изобретения.
В нижеследующем подробном описании будут сделаны ссылки на различные методологии, известные специалистам в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, представленные далее для таких методик, на которые сделаны ссылки, включены сюда по ссылкам на их содержание.
Стандартные работы, в которых суммированы общие принципы технологии рекомбинантных ДНК, включают:
Watson, J. D, et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Bеnjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J. E. et al., Molecular Cell Biology. Scientific American Books, Inc. , Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y, (1985); Old, R.W., et al,. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T. , et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).
Watson, J. D, et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Bеnjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J. E. et al., Molecular Cell Biology. Scientific American Books, Inc. , Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y, (1985); Old, R.W., et al,. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T. , et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).
Определения
Под "клонированием" подразумевают in vitro рекомбинантную методику включения конкретного гена или другой ДНК последовательности в векторную молекулу. Для успешного клонирования целевого гена, необходимо использовать способы создания ДНК фрагментов для соединения этих фрагментов с векторной молекулой, для введения композитной ДНК молекулы в клетки хозяина, в которых они могут реплицироваться, и для отбора клона, содержащего мишеневый ген из реципиентных клеток хозяина.
Под "клонированием" подразумевают in vitro рекомбинантную методику включения конкретного гена или другой ДНК последовательности в векторную молекулу. Для успешного клонирования целевого гена, необходимо использовать способы создания ДНК фрагментов для соединения этих фрагментов с векторной молекулой, для введения композитной ДНК молекулы в клетки хозяина, в которых они могут реплицироваться, и для отбора клона, содержащего мишеневый ген из реципиентных клеток хозяина.
Под "кДНК" подразумевают комплемент или копию ДНК, полученную из РНК темплата под действием РНК зависимой ДНК полимеразы /обратной транскриптазы/. Так, "кДНК клон" означает дуплексную ДНК последовательность, комплементарную РНК молекуле вставки, содержащей клонирующий вектор.
Под "кДНК библиотекой" подразумевают коллекцию рекомбинантных ДНК молекул, содержащих кДНК вставки, которые содержат ДНК копии иРНК, которые были экспрессированы клеткой во время создания кДНК библиотеки. Такую кДНК библиотеку можно получить способами, известными специалистам и описанными, например, в Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual supra. Обычно РНК вначале выделяют из клеток организма, из генома которого предстоит клонировать конкретный ген. Предпочтительными для целей настоящего изобретения являются клеточные линии лимфоцитов млекопитающих и особенно человека. Предпочтительным вектором для этой цели является штамм вакцины вируса WR.
Под "вектором" подразумевают молекулу ДНК, полученную, например, из плазмид, бактериофагов или вирусов человека или насекомых, в которую можно включить или клонировать фрагменты ДНК. Вектор должен содержать один или более из рестрикционных сайтов и может быть способен автономно реплицироваться в определенном организме хозяина или носителя, таким образом, чтобы клонированная последовательность была репродуцируема. Так, под термином "вектор экспрессии ДНК" подразумевают автономный элемент, способный направлять синтез рекомбинантных пептидов. Такие ДНК векторы экспрессии ДНК включают бактериальные плазмиды и плазмиды и вирусы млекопитающих и насекомых.
Под "практически чистым" понимают соединение, например, протеин, полипептид или антитела, которые практически не содержат компонентов, которые в природе их сопровождают. Обычно соединение называют практически чистым, если, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 75%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% всего материала составляет представляющее интерес соединение. Чистоту определяют соответствующими способами, например, с помощью хроматографии на колоннах, электрофореза в полиакриламидном геле или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии /HPLC = ВЖХ/. Если это касается нуклеиновых кислот, термин "практически чистый" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, сегменту ее или фрагменту, который не содержит генов, который фланкирует ее в ее природно-встречающемся состоянии /например, не содержит последовательностей, которые фланкируют нуклеиновую кислоту в ее нативном геномном положении/. Под "функциональным производным" подразумевают "фрагменты", "варианты", "аналоги" или "химические производные" молекулы. "Фрагмент" молекулы, например, кДНК последовательности настоящего изобретения, означают, что этот термин относится к любому нуклеотидному субсету молекулы. "Вариант" такой молекулы относится к природно встречающейся молекуле, практически аналогичной либо целой молекуле, либо ее фрагменту, "Аналог" молекулы относится к не-активной молекуле, практически аналогичной либо всей молекуле, либо ее фрагменту. Говорят, что молекула "практически аналогична" другой молекуле, если последовательность аминокислот в обеих молекулах практически одинакова. Практически аналогичные молекулы аминокислот будут обладать аналогичными биологическими активностями. Так, при условии, что две молекулы обладают аналогичными активностями, их считают вариантами, так как этот термин используют даже, если одна молекула содержит дополнительно /или меньше/ аминокислотные остатки, которые не найдены в другой, или если последовательность аминокислотных остатков не идентична. В том смысле, как здесь использовано, говорят, что молекула является "химическим производным" другой молекулы, если она содержит дополнительные химические фрагменты, которые обычно не составляют части этой молекулы. Такие фрагменты могут повысить растворимость молекул, адсорбцию, биологическую полужизнь и т.д. Эти фрагменты в другом варианте могут снизить токсичность молекулы, исключить или ослабить любые нежелательные побочные эффекты молекулы и т.д. Фрагменты, способные осуществить такие эффекты, раскрыты, например, в Reminston's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. Mack Publishing Co., Easton, Peuu (1980).
Аналогично, "функциональное производное" рецептора химеры настоящего изобретения подразумевает "фрагменты", "варианты" или "аналоги" гена, который может быть "практически аналогичен" нуклеотидной последовательности и который кодирует молекулу, обладающую аналогичной активностью с, например, T клеточными, B клеточными или Fc рецепторными химерами.
Так, в том смысле, как здесь использовано, T клеточные, B клеточные или Fc рецепторные химерические протеины также включают любые функциональные производные, варианты, аналоги или химические производные, которые могут быть существенно аналогичны "дикого типа" химерам и которые обладают аналогичной активностью, то есть, наиболее предпочтительно 90%, более предпочтительно 70%, предпочтительно 40% или, по крайней мере, 10% активности дикого типа рецепторных химер. Активность функциональных химерических рецепторных производных включает специфическое связывание /с их внеклеточной частью/ с мишеневым агентом и в результате разрушение /направляемое его внутриклеточной или трансмембранной частью/ агента или клетки; причем такую активность можно определить, используя любые аналитические способы, описанные далее.
ДНК последовательность, кодирующую T клеточные, B клеточные или Fc рецепторные химеры настоящего изобретения, или их функциональные производные, можно рекомбинировать вектором ДНК в соответствия с обычными способами, включая тупые концы или болтающиеся концы для лигирования, расщепления рестрикционным энзимом до получения соответствующих концов, заполняя их липкими концами соответствующим образом, обрабатывая щелочной фосфатазой во избежание нежелательных присоединений, и лигирования соответствующей лигазой. Методики таких манипуляций раскрыты Maniatis T., et al: supra, и хорошо известны специалистам.
Говорят, что молекулы нуклеиновых кислот, такие как ДНК, "способны к экспрессии" полипептида, если они содержат нуклеотидную последовательность, которая содержит транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, и такие последовательности являются "операбельно связанными" с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют полипептид. Операбельной связью является такая связь, в которой регуляторные ДНК последовательности и ДНК последовательности, которые нужно экспрессировать, связаны таким образом, чтобы обеспечить экспрессию гена. Точная природа регуляторных участков, необходимых для экспрессии гена, может меняться от организма к организму, но должна, вообще, включать промоторный участок, который, у прокариотов, содержит оба промотора /которые руководят инициированием РНК транскрипции/, а также ДНК последовательности, которые будучи транскрибированы в РНК, дадут сигнал начала синтеза протеина, такие участки обычно включают те 5'-некодирующие последовательности, которые связаны с инициированием транскрипции и трансляции, такие как TATA, CAAT последовательности и т.п.
При желании, некодирующий 3'-участок генной последовательности, кодирующий протеин, можно получить вышеописанными способами. Этот участок можно сохранить для его трансляционной терминационной регуляторной последовательности, например, для терминации и полиаденилирования. Так, сохраняя 3'-участок, смежный с ДНК последовательностью, кодирующей протеин, можно получить сигналы окончания транскрипции. Если сигналы окончания транскрипции функционируют недостаточно при экспрессии клеток хозяев, тогда 3'-участок, функциональный в клетках хозяина, можно заменить.
Считают, что две ДНК последовательности /такие как последовательность промотерного участка и T клеточный рецептор, B клеточный рецептор или Fc рецепторная химера, кодирующая последовательность/ операбельно связаны, если природа связи между двумя ДНК последовательностями /1/ не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, /2/ не мешает способности промотерного участка последовательности управлять транскрипцией рецепторной химерической генной последовательности, или /3/ не мешает способности рецепторной химерической генной последовательности быть транскрибированной промотерным участком последовательности. Промотерный участок должен быть операбельно связан с ДНК последовательностью, если промотер был способен осуществлять транскрипцию ДНК последовательности. Таким образом, для того чтобы осуществить экспрессию протеина, необходимы транскрипционный и трансляционные сигналы, распознаваемые соответствующим хозяином.
Настоящее изобретение охватывает экспрессию T клеточного рецептора, B клеточного рецептора или Fc рецепторного химерического протеина /или их функциональных производных/ либо в прокариотические, либо в эукариотические клетки, хотя предпочтительна экспрессия в эукариотические /и особенно, лимфоцитов человека/ клетки.
Антитела по способу настоящего изобретения можно получить любым из множества различных способов. Так, например, клетки, экспрессирующие рецепторный химерический протеин, или его функциональные производные, можно ввести животным для того, чтобы вызвать продуцирование сыворотки, содержащей поликлональные антитела, которые способны связывать химеры.
В предпочтительном способе изобретения, антитела являются моноклональными антителами. Такие моноклональные антитела можно получить, используя технологию гибридом /Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur J. Immunol, 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.J. p. 563-684 (1981)/. Вообще, такие процедуры включают иммунизацию животного T клеточным рецепторным, B клеточным рецепторным или Fc рецепторным химерическим антигеном. Спленоциты таких животных экстрагируют и сливают с подходящей миеломной клеточной линией. В способе настоящего изобретения можно использовать любые подходящие клеточные линии миелом. После слияния полученные гибридомные клетки селективно сохраняют в HAT среде, а затем клонируют ограниченным разбавлением, как описано у Wands J.R. et al. /Gastroehterology 80: 225 - 232 /1981//. Гибридомные клетки, полученные после такой селекции, затем анализируют для идентификации клонов, которые выделяют антитела, способные связывать химеры.
Антитела по способу настоящего изобретения также могут быть поликлональными или, предпочтительно, региоспецифическими поликлональными антителами.
Антитела против T клеточных рецепторов, B клеточных рецепторов или Fc рецепторов химер по способу настоящего изобретения можно использовать для слежения за количеством химерических рецепторов /или химерические рецепторы содержащих клеток/ у пациента. Такие антитела прекрасно приспособлены для использования в стандартном иммунодиагностическом анализе, известны специалистам, включают такие иммунометрические или "сэндвичевые" анализы, как опережающий сэндвичевый, обратный сэндвичевый и одновременный сэндвичевый анализы. Антитела можно использовать в любой из их комбинаций, которые могут определить специалисты, без ненужных экспериментов для осуществления иммуноанализа приемлемой специфичности, чувствительности и точности.
Стандартные работы, в которых изложены общие принципы иммунологии, включают: 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984); Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York (1982); and Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, New York (1980). Roitt, I., Essential Immunology, Sixth Ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford (1988); Kimball, J. W., Introduction to Immunology, Second Ed. , Macmillan Publishing Co. , Publisher, New York (1986); Roitt. I., et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd,, Publisher, London, (1985); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology", in, Burdon, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular, Biology, Volume.
Под "детектированием" подразумевают определение наличия или отсутствия вещества или количественное определение его содержания. Этот термин относится к использованию материалов, композиций и способов настоящего изобретения для качественных и количественных определений.
Выделение других гибридом, секретирующих моноклональные антитела той же специфичности, что и у описанных ранее, можно осуществить методами анти-идиотинического скринирования /Potocmjak. et al., Science 215:1637 /1982//. Коротко, анти-идиотипическое антитело это такое антитело, которое распознает уникальные детерминанты, присутствующие на антителах, продуцируемых представляющим интерес клоном. Анти-идиотипические антитела получают за счет иммунизации животного тем же штаммом, который был использован в качестве источника моноклональных антител, моноклональными антителами, представляющими интерес. Иммунизованное животное будет распознавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующих антител выработкой антител против этих идиотипических детерминант /анти-идиотипические антитела/.
Для репликации гибридные клетки можно культивировать как in vitro, так и in vivo. Высокая продуктивность in vivo делает этот способ предпочтительным способом культивирования. Короче, клетки из отдельных гибридных штаммов вводят внутрибрюшинно мыши pristane - primed BALB/с для получения асцитной жидкости, содержащей высокие концентрации целевых моноклональных антител. Моноклональные антитела изотипов IgM или IgG можно очистить из надосадочной жидкости культуры, используя хроматографические способы, хорошо известные специалистам.
Антитела по способу настоящего изобретения особенно пригодны для использования в иммуноанализах, где их можно использовать в жидкой фазе, или связанными с твердой фазой носителя. Кроме того, антитела в этих иммуноанализах можно детектируемо метить различными способами.
Существует множество меток и способов мечения, известных специалистам. Примеры такого типа меток, которые можно использовать в способе настоящего изобретения, включают, хотя и не ограничиваются ими, ферменты, радиоизотопы, флюоресцирующие соединения, хемилюминесцирующие соединения, биолюминесцирующие соединения и халаты металлов. Специалистам известны и другие возможные метки для связывания с антителами, или можно определить то же самое с использованием рутинных экспериментов. Более того, связывание таких меток с антителами можно осуществить, используя стандартные методики, обычно известные специалистам.
Одним из таких способов настоящего изобретения, с помощью которого можно детектируемо пометить антитело, является способ связывания его с энзимом. Этот энзим, в свою очередь, будучи позднее экспонирован субстрату, будет реагировать с субстратом таким образом, что приведет к образованию химического фрагмента, который можно детектировать, например, спектроскопическими или флуорометрическими способами. Примеры энзимов, которые можно использовать для детектируемой метки антител, включают малатдегидрогеназу, стафилококкалнуклеазу, дельта- γ -стероидизомеразу, дрожжевую спиртовую дегидрогеназу, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозфосфатизомеразу, биотинавидинпероксидазу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу,
глюкозо-VI-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.
глюкозо-VI-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.
Наличие детектируемо меченых антител можно также определить, пометив антитела радиоактивными изотопами, которые затем определяют с помощью гамма-счетчиков или сцинтилляционных счетчиков. Изотопы, наиболее пригодные для целей настоящего изобретения: 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe и 75Se.
Возможно также определять связывание детектируемо меченых антител путем введения метки флуоресцентного соединения в антитело. Если флуоресцентно меченое антитело экспонируют свету соответствующей длины волны, его присутствие можно определить за счет флуоресценции красителя. Среди наиболее часто используемых флуоресцентно меченых соединений находятся флуоресцин, изотиоциан, родамин, фикоэретрин, фикоцианин, аллофикоцианин орто-фтальдегид и флуоресцамин.
Антитела настоящего изобретения можно также детектируемо пометить, используя такие флуоресцирующие металлы, как 152Eu, или другие лантаноиды. Эти металлы можно присоединить к антителам, используя такие хелатирующие группы, как диэтилэнтериаминпентауксусная кислота /DTPA/ или этилендиаминтетрауксусная кислота /EDTA/.
Антитела можно также детектируемо пометить, соединяя их с хемилюминесцентными соединениями. Наличие хемилюминесцентных антител определяют затем, детектируя наличие люминесценции, возникающей в процессе химической реакции. Примеры наиболее подходящих хемилюминесцентных метящих соединений включают люминал, изолюминол, сложный эфир тероматикакридиния, имидазол, соли акридиния, сложный оксалатный эфир и диоксэтан.
Аналогично, для того чтобы пометить антитела по способу настоящего изобретения, можно использовать биолюминесцентные соединения. Биолюминесценция представляет собой тип хемилюминесценции, возникающей в биологических системах, в которых каталитический протеин повышает эффективность реакции хемилюминесценции. Наличие биолюминесцентных антител определяют, детектируя наличие люминесценции. Важные биолюминесцентные соединения для целей введения меток включают люциферин, люциферин, люциферазаекворин.
Антитела и практически очищенные антигены настоящего изобретения идеально подходят для приготовления набора. Такой набор может содержать контейнер, разделенный на отделения, для размещения ампул, трубок и т.п., причем каждый контейнер содержит отдельные элементы, которые используют при анализах.
Типы анализов, для которых можно использовать этот набор, включают, например, конкурентный и неконкурентный анализы. Типичные примеры анализов, в которых можно использовать антитела настоящего изобретения, включают радиоиммуноанализ /RIA/, энзимативный иммуноанализ /EIA /, иммуносорбентный со связанным энзимом анализ /ELISA/ и иммунометрический, или сэндвичевый иммуноанализ.
Под термином "иммунометрический анализ" или "сэндвичевый иммуноанализ" подразумевают, что он одновременно включает сэндвичевый, опережающий сэндвичевый и обратный сэндвичевый иммуноанализы. Эти термины хорошо знакомы специалистам. Специалистам понятно также, что антитела по способу настоящего изобретения будут полезны в различных вариантах и формах анализов, которые уже известны или которые можно разработать в будущем. Они также включены в объем изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления анализа важно, чтобы в инкубируемой среде присутствовали определенные "блокеры" /которые обычно добавляют с меченым растворимым антителом/. Такие "блокеры" добавляют для того, чтобы неспецифические протеины, протеазы или антитела человека к мышиным иммуноглобулинам, присутствующим в экспериментальном образце, не сшивали или не разрушали антитела на твердой фазе носителя или радиомеченные индикаторные антитела, и не давали бы неверные положительные или неверные отрицательные результаты. Поэтому выбор "блокеров" существенно добавляет специфичности к анализам, рассматриваемым в настоящем изобретении.
Было обнаружено, что ряд нерелевантных /то есть, неспецифичных/ антител того же класса или подкласса /изотипа/, что и те, которые используют в анализе /например, IgG1, IgG2, IgM и т. д./, можно использовать в качестве "блокеров". Концентрация "блокеров" /обычно 1 - 100 мкг/мл/ важна для поддержания соответствующей чувствительности, и все еще ингибирует любые нежелательные вмешательства за счет обычно встречающихся перекрестно-реакционноспособных протеинов в сыворотке человека. Кроме того, буферная система, содержащая "блокеры", нуждается в оптимизации. Предпочтительными буферам являются буфера на основе органических кислот, такие как имидазол, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS и тому подобные в интервале физиологических значений pH. Несколько менее предпочтительными буферами являются такие неорганические буферы, как фосфаты, бораты или карбонаты, и наконец, известные ингибиторы протеазы необходимо добавить /обычно 0,01 - 10 мкг/мл/ к буферу, который содержит "блокеры".
Существует множество иммуноадсорбентов, которые можно использовать и которые можно применить в способе настоящего изобретения. Хорошо известные иммуноадсорбенты включают стекло, полистирол, полипропилен, декстран, найлон или другие материалы в форме трубочек, шариков и микропластиков, изготовленных из или покрытых такими материалами и т.п. Иммобилизованные антитела можно либо ковалентно либо физически связать с твердой фазой иммуноадсорбента методиками, известными, например, ковалентным связыванием через амидную или сложноэфирную связь, или адсорбцией. Специалистам известно множество других подходящих твердофазных адсорбентов и способов иммобилизации на них антител, или они могут выполнить таковые, используя всего лишь рутинные эксперименты.
Для диагнозов in vivo, in vitro или in situ метки, такие как радионуклиды, можно связать с антителами по способу настоящего изобретения либо непосредственно, либо используя промежуточные функциональные группы. Промежуточной группой, которую часто используют для связывания радиоизотопов, которые существуют в виде катионов металлов, с антителами, является диэтилентриаминпентауксусная кислота /DTPA/. Типичные примеры катионов металлов, которые связывают таким образом, включают 99мTc, 123I, 111In, 131I, 9797Ru, 67Cu, 67Ga и 68Ga. Антитела настоящего изобретения можно также метить нерадиоактивными изотопами для диагностических целей. Элементы, которые наиболее подходят в таком случае: 157Gd, 55Mn, 162Dy, 53Cr и 5656Fe.
Антиген настоящего изобретения можно выделить в практически чистом виде, используя антитела по способу настоящего изобретения. Так, в одном из вариантов настоящего изобретения, предложенном для практически чистых T клеточного рецептора, B клеточного рецептора или Fc рецептора химеры, указанный антиген, отличающийся тем, что его распознают и связывают антитела настоящего изобретения. В другом варианте настоящее изобретение обеспечивает способ выделения или очистки рецепторного химерического антигена за счет образования комплекса указанного антигена с одним или более из антител, направленных против рецепторной химеры.
Практически чистые антигены T клеточного рецептора, B клеточного рецептора или Fc рецептора химеры настоящего изобретения можно, в свою очередь, использовать для определения или измерения антител к химерам в образце, например, в сыворотке или в моче. Таким образом, один из вариантов настоящего изобретения включает способ определения наличия или количества антител к рецепторному химерическому антигену в образце, который включает контактирование образца, содержащего антитела, к химерическому антигену, с детектируемо меченной рецепторной химерой, и детектирование указанной метки. Следует учитывать, что иммунореактивные фракции и иммунореактивные аналоги химер также можно использовать. Под термином "иммунореактивные фракции" подразумевают любую часть химерического антигена, которая демонстрирует эквивалентную иммунную реакцию на антитела, направленные против рецепторных химер. Под термином "иммунореактивные аналоги" подразумевают протеины, которые отличаются от протеинов рецепторных химер одной или более аминокислотами, но которые демонстрируют эквивалентную иммунную реакцию на антитела настоящего изобретения.
Под выражением "специфически распознают и связывают" подразумевают антитела, которые распознают и связывают химерический рецепторный полипептид, но которые практически не распознают и не связывают другие молекулы в образце, например, в биологическом образце, который включает рецепторный полипептид.
Под выражением "автоиммунно-генерированная клетка" подразумевают клетки, продуцирующие антитела, которые реагируют с тканями хозяина или иммуноэффекторные клетки, которые являются автореактивными; такие клетки включают антитела против ацетилхолиновых рецепторов /ведущих, например, к myasthehia gravis/ или анти-ДНК, анти-эритроцит и анти-тромбоцитные антитела /ведущие, например, к lupus erythematosus/.
Под термином "терапевтические клетки" подразумевают клетки, которые были трансформированы химерами настоящего изобретения таким образом, что они способны распознавать и разрушать специфический инфицирующий агент, клетки, инфицированные специфическим агентом, опухолевые или канцерогенные клетки, или автоиммунно-генерированные клетки; предпочтительно такими терапевтическими клетками являются клетки системы гомепоэза /кроветворные/.
Под термином "внеклеточный" подразумевают содержащий, по крайней мере, часть молекулы, экспонированной на поверхности клетки. Под термином "внутриклеточный" подразумевают содержащий, по крайней мере, часть молекулы, экспонированной терапевтическим клеткам цитоплазмы. Под термином "трансмембранный" подразумевают содержащий, по крайней мере, часть молекулы, пронизывающей плазму мембраны. "Внеклеточная часть" и "внутриклеточная часть" и также "трансмембранная часть" в том смысле как здесь использованы, могут включать фланкирующие аминокислотные последовательности, которые простираются в прилегающие отделы клетки.
Под термином "олигомеризованный" подразумевают комплекс с другими протеинами с образованием димеров, тримеров, тетрамеров или других высших олигомеров. Такие олигомеры могут быть гомо-олигомерами или гетероолигомерами. Олигомеризующий участок представляет собой тот участок молекулы, который управляет образованием комплекса /то есть, олигомера/.
Под термином "цитолитический" подразумевают способный разрушить клетку /например, клетку, инфицированную патогеном, опухолевую или канцерогенную клетку, или автоиммуно-генерированную/ или способный разрушить инфицирующий агент /например, вирус/.
Под "вирусом иммунодефицита" подразумевают ретровирусы, которые в форме дикого типа способны инфицировать T клетки хозяина-примата, и обладают вирусным морфогенезом и морфологическими характеристиками подсемейства лентивирусов. Этот термин включает, без ограничений, все варианты HIV и SIV, включая HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVSmm, SIVman, SIVmand и SIVcpz.
Под термином "МНС-зависимый" подразумевают, что клеточная цитолитическая реакция не требует присутствия какого-либо МНС класса II антигена на поверхности мишеневой клетки.
Под термином "функциональное цитолитическое сигнально-трансдукторное производное" подразумевают функциональное производное /как было определено ранее/, которое способно управлять, по крайней мере, 10%, предпочтительно, 40%, более предпочтительно, 70%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% биологической активности дикого типа молекулы. В том смысле, как здесь использован, "функциональное цитолитическое сигнал-трансдукторное производное" может посылать непосредственно сигнал терапевтической клетке разрушить связанный с рецептором агент или клетку /например, в случае внутриклеточной химерической рецепторной части/ или может действовать косвенно, промотируя олигомеризацию цитолитического сигнального трансдукторного протеина терапевтической клетки /например, в случае трансмембранного домена/. Такие производные можно тестировать на эффективность, например, используя in vitro анализ, описанный здесь.
Под "функциональным производным связывающим оболочку HIV" подразумевают функциональное производное /как определено ранее/, которое способно связывать любой протеин оболочки HIV. Функциональные производные можно идентифицировать, используя например, in vitro анализ, описанный здесь.
Терапевтическое введение
Трансформированные клетки настоящего изобретения можно использовать для лечения ряда заболеваний. Текущие способы введения таких трансформированных клеток включают адаптационную иммунотерапию или терапию переноса клеток. Эти способы позволяют вернуть иммунотрансформированные системы клеток в поток крови. Roseuberg, S.A. Scientific Amerian, 62 (May 1990); Roseuberg, et al., The New Englang Journal of Medicine, 323 (9): 570 (1990).
Трансформированные клетки настоящего изобретения можно использовать для лечения ряда заболеваний. Текущие способы введения таких трансформированных клеток включают адаптационную иммунотерапию или терапию переноса клеток. Эти способы позволяют вернуть иммунотрансформированные системы клеток в поток крови. Roseuberg, S.A. Scientific Amerian, 62 (May 1990); Roseuberg, et al., The New Englang Journal of Medicine, 323 (9): 570 (1990).
Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить любому животному, которое может извлечь благоприятное воздействие от соединений настоящего изобретения. Прежде всего, среди животных следует назвать человека, хотя настоящее изобретение этим не ограничивается.
Клинические данные Cell Genesys по первоначальным испытаниям фазы II, в ходе которых исследовали пациентов с определяемым, несмотря на проводимую противоретровирусную лекарственную терапию содержанием ВИЧ в крови, свидетельствуют о безопасности проводимого лечения и сохранности генетически модифицированных T-клеток в циркуляторном русле, по крайней мере, в течение 100 суток после введения клеток. Были отмечены предварительные признаки противовирусной активности с тенденцией к снижению содержания ВИЧ в лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта, основного резервуара ВИЧ-инфицированных клеток, у четырех из пяти исследуемых пациентов".
Впоследствии та же рабочая группа сообщила о дальнейших проведенных клинических испытаниях Фазы II. В указанных последующих испытаниях участвовали 40 пациентов. 20 из них получали лечение в виде однократного введения экспрессирующих химерный рецептор T-клеток, а 20 контрольным пациентам вводили немодифицированные T-клетки. Результаты оценивали спустя 6 месяцев. В результате данных исследований выяснилось, что рецидив заболевания наблюдался лишь у 5 из 20 пациентов, которым вводили экспрессирующие химерный рецептор T-клетки, по сравнению с 10 из 20 в контрольной группе. Далее, у пациентов, получавших лечение в виде однократного введения экспрессирующих химерный рецептор T-клеток, по прошествии 6 месяцев наблюдалось как среднее 0,4 log отрицательное отклонение количества ВИЧ, высылаемого из циркулирующих клеток крови, от контрольных значений (p=0,02), так и среднее log отрицательное отклонение содержания ДНК ВИЧ, определяемой в биоптатах прямой кишки (p= 0,007), от контрольных значений. У пациентов, получавших контрольные немодифицированные T-клетки, существенные отклонения от контрольных значений в обоих исследованиях не наблюдались.
Подробное описание изобретения
Вначале описывается содержание чертежей.
Вначале описывается содержание чертежей.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 Характеристика CD4 химер. На фиг. 1A представлена аминокислотная последовательность вокруг сайта слияния между CD4 /остатки 1-369/ и различными рецепторными цепями. Подчеркнутая последовательность показывает положение аминокислот, закодированных внутри BamHI сайта, использованного для конструкции слияния. Начало трансмембранного домена отмечено вертикальной чертой. η последовательность идентична Z последовательности у аминоконца, но расходится у карбоксильного конца /Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319 - 3323 /1990//. На фиг. 1B представлены данные цитометрического анализа в потоке поверхностной экспрессии CD4, CD4:Z, CD4: γ и CD4 η в CVI клетках. Клетки были инфицированы вирусом, экспрессирующим CD4 химеры или CD16PI, инкубированы в течение 9 часов при 37oC и окрашены фикоэритрин-конъюгированными анти-CD4 Mab Leu 3A. На фиг. 1C представлено иммуноосаждение меченых CD4:Z, CD4: η , или нативных CD4, экспрессированных в CVI клетки. Опыты проводили со снижением /R/ или без снижения /R/ агента. Молекулярные массы стандартно выражены в кД и указаны слева.
Фиг. 1 Характеристика CD4 химер. На фиг. 1A представлена аминокислотная последовательность вокруг сайта слияния между CD4 /остатки 1-369/ и различными рецепторными цепями. Подчеркнутая последовательность показывает положение аминокислот, закодированных внутри BamHI сайта, использованного для конструкции слияния. Начало трансмембранного домена отмечено вертикальной чертой. η последовательность идентична Z последовательности у аминоконца, но расходится у карбоксильного конца /Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319 - 3323 /1990//. На фиг. 1B представлены данные цитометрического анализа в потоке поверхностной экспрессии CD4, CD4:Z, CD4: γ и CD4 η в CVI клетках. Клетки были инфицированы вирусом, экспрессирующим CD4 химеры или CD16PI, инкубированы в течение 9 часов при 37oC и окрашены фикоэритрин-конъюгированными анти-CD4 Mab Leu 3A. На фиг. 1C представлено иммуноосаждение меченых CD4:Z, CD4: η , или нативных CD4, экспрессированных в CVI клетки. Опыты проводили со снижением /R/ или без снижения /R/ агента. Молекулярные массы стандартно выражены в кД и указаны слева.
Фиг. 2 Поверхностная экспрессия CD16TM с последующей коинфекцией CD16TM отдельно /пунктир/ или совместной инфекцией с вирусом, экспрессирующим CD4: γ /штрихи/ или CD4 Z /сплошная линия/. Раздельные точки-клетки, инфицированные CD4: Z /отдельно, окрашенные 3G8/ Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3275 - 3279 /1982 / /анти-CD16 Mab/.
Фиг. 3 Мутант CD4:Z химерического рецептора без ZASp-15 не поддерживает совместную экспрессию CD16TM. Фиг. 3A представляет собой авторадиограмму иммуноосажденных химер, обработанных электрофорезом либо с восстановлением /R/, либо без восстановления /NR/. Фиг. 3B детализирует поверхностную экспрессию CD16ТМ с последующим совместным инфицированием вирусом, экспрессирующим CD16TM и последующими Z химерами: CD4:Z (жирная линия) СД4:Z C11G /сплошная линия/, CD4: Z /пунктирная линия/, CD4:Z C11G /D15G /жирные точки/, без коинфицирования /CD16TM отдельно, редкие точки/. Клетки инкубируют с анти-CD16 Mab 3G8 и полиэритрин-конъюгированными Fab'2 козлиными антителами к мышиному IgG. Уровень экспрессии Z химер практически идентичен для различных анализированных мутантов, и коинфицирование клеток вирусами, экспрессирующими CD16TM, и химерами заметно не изменяет поверхностную экспрессию химер /не показано/.
Фиг. 4 Повышению внеклеточных свободных ионов кальция соответствует сшивка мутантных Z химер в T клеточной линии. Jurkat E6 клетки /Weiss et al. , J. Immunol 133:123-128 /1984/ /были идентифицированы с рекомбинантными вирусами вакцины и проанализированы с помощью цитометрии в потоке. Полученные результаты представлены для открытой CD4+ популяции, так что только клетки, экспрессирующие соответствующий химерический протеин, были анализированы. Среднее отношение фиолетовой к синей Индо-1 флуоресценции отражает внеклеточные концентрации свободного кальция в популяции как целом, а процент соответствующих клеток отражает долю клеток, которые превышают заранее определенное пороговое отношение /установленное таким образом, что положительными оказываются 10% непрореагировавших клеток/. Фиг. 4A и 4B изображают Jurkat клетки, экспрессирующие CD4: Z /сплошная линия/ или CD16:Z /пунктирная линия/, которые были экспонированы анти-CD4 Mab Leu3a /фикоэритриновый конъюгат/ с последующей сшивкой с козлиными антителами к мышиному IgG. Пунктирная линия показывает реакцию неинициированных клеток на анти-CD3 Mab OKT3. Фиг. 4C и 4D показывают Jurkat клетки, экспрессирующие CD4:Z D15G /сплошная линия; CD4: Z C11G /D15G /пунктир/; или CD4:Z C11G /точки/, которые были обработаны и проанализированы как на фиг. 4A и 4B.
Фиг. 5 CD4: Z, CD4: η и CD4: γ рецепторы позволяют цитолитическим T лимфоцитам /CTL/ убивать мишени, экспрессирующие HIV-1 gp120/41. Фиг. 5a: сплошные кружочки, CTL, экспрессирующие CD4:Z, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; пустые кружочки, CTZ экспрессирующие CD4:Z, инкубированные с неинфицированными клетками HeLa, сплошные квадраты, неинфицированные CTL, инкубированные с клетками HеLa, экспрессирующими gp120/41; пустые квадраты, неинфицированные CTL, инкубированные с неинфицированными клетками HeLa. Фиг. 5B: сплошные кружочки, CTL экспрессирующие CD4: η , инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; пустые кружочки, CTL экспрессирующие CD4: γ, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; пустые квадраты, CTL экспрессирующие C 11G/D15G двойной мутант CD4: Z химера, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41, Фиг. 5C: Цитометрический анализ в потоке CD4 экспрессии за счет CTL, использованных на фиг. 5B. Для исправления мишени до эффекторных отношений процент клеток, экспрессирующих CD4 химеры, был определен вычитанием отрицательных /неинфицированных/ популяций наложением гистограмм; для сравнения на фиг. 5С неинфицированные клетки были приписаны предполагаемому пороговому значению, что дало приблизительно ту же часть, положительную для других клеточных популяций, что и на вычитании гистограмм.
Фиг. 6 Специфичность цитолиза под управлением CD4:Z. Фиг. 6A: сплошные кружочки CTL экспрессирующие CD4:Z, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими CD16PI; пустые кружочки, CTL экспрессирующие CD4, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120; сплошные квадраты, CTL, экспрессирующие CD: Z, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; пустые квадраты, CTL экспрессирующие CD16PI инкубированные с HeLa клетками, экспрессирующими gp120/41. Фиг. 6B: сплошные кружки, CTL экспрессирующие CD4: Z, инкубированные с Raji /МНС класс II+/ клетками; пустые кружки, неинфицированные CTL клетки, инкубированные с RJ 2.2.5 /МНС класс II- Raji мутант/ клетками; сплошные квадраты, неинфицированные CTL, инкубированные с Raji /МНС класс II+/ клетками; пустые квадраты, CTL экспрессирующие CD4:Z, инкубированные с RJ 2,2,5 /МНС класс II-/ клетками. Шкала ординат расширена.
Фиг. 7 Характеристика CD16:Z химерического рецептора. Фиг. 7A является схематической диаграммой CD16: Z слитого протеина. Внеклеточная часть фосфатидилинозитол-связанной формы мономерной CD16 была соединена с димерным Z как раз снаружи трансмембранного домена. Протеиновая последовательность в месте слияния представлена внизу. Фиг. 7B представляет цитометрический анализ в потоке мобилизации кальция с последующей сшивкой CD16:Z химеры с либо TCR или TCR отрицательной клеточной линией. Представлено среднее отношение фиолетовой к синей флуоресценции /мера относительной концентрации ионов кальция /среди клеточной популяции, обработанной антителами в момент времени 0. Сплошные квадраты, реакция Jurkat клеток на анти-CD3 Mab OKT3 оплошные треугольники, реакция CD16:Z на анти-CD16 Mab 3G8, сшивающие в REX33A TCR- мутант; пустые квадраты, реакция на CD16:Z сшивающие в Jurkat TCR- мутант линии PT3. T3.5; пустые треугольники, реакция на CD16:Z сшивающие Jurkat клетки; крестики, реакция на нехимерические CD16 в Jurkat клетках и точки, реакция на нехимерические CD16 в REX33A TCR- линии клеток.
Фиг. 8. Делеционный анализ цитолитического потенциала. Фиг. 8A показывает расположение конечных точек Z делеции. Здесь и всюду мутанты в Z представлены исходным остатком-расположением-мутантным остатком, так что D66*, например, обозначает замену ASp-66 терминационным кодоном. На фиг. 8B представлен цитолитический анализ в результате не подвергавшейся делеции CD16:Z и выступающей Z делеции. Гибридомные клетки, экспрессирующие поверхностные антитела к CD16, были загружены 51Cr и инкубированы с повышающимся числом цитолитичеcких лимфоцитов человека /CTL/, инфицированных вакциной рекомбинантных экспрессирующих CD16:Z химеры. Процент 51Cr, который высвобождается, откладывают как функцию клеточного отношения эффектора /CTL/ к мишени /гибридоме/е/т/. Сплошные кружки, цитолиз посредством клеток, экспрессирующих CD16:Z /mfi 18,7/; сплошные квадраты, цитолиз посредством клеток, экспрессирующих CD16:Z ASp66* /mfi/ 940,2/; пустые квадраты, цитолиз посредством клеток, экспрессирующих CD16: Z Glu60* /mfi 16,0/; пустые кружки, цитолиз посредством клеток, экспрессирующих CD16: Z Tyr51* /mfi 17,4 /; сплошные треугольники, цитолиз посредством клеток, экспрессирующих CD16:Z Phe34* /mfi 17,8/; и пустые треугольники, цитолиз, осуществляемый за счет клеток, экспрессирующих нехимерические CD16 /mfi 591/. Хотя в этих экспериментах экспрессия CD16: Z ASp66* не была такой же, как для других слитых протеинов, цитолиз клетками, экспрессирующими CD16:Z при одинаковых уровнях в тех же самых экспериментах дал результаты, практически идентичные тем, которые демонстрируют клетки, экспрессирующие CD16:Z ASp66* /не показано/.
Фиг. 9. Исключение потенциала для трансмембранного взаимодействия выявляет короткий сегмент, способный быть медиатором цитолиза. Фиг. 9A представляет схему мономерных химер, состоящих из двух или трех частей. Наверху представлен CD16:Z, усеченный по остатку 65 и не содержащий трансмембранных Cys и Asp остатков. Ниже представлены CD16:CD5:Z и CD16:CD7:Z конструкции и родственные контроли. Пептидные последовательности внутриклеточных доменов представлены ниже. На фиг. 9B представлена цитолитическая активность мономерных химерических мутантов делеции. Цитолитическая активность клеток, экспрессирующих CD16: Z /сплошные кружки; mfi 495/ сравнивается с активностью клеток, экспрессирующих CD16:Z Asp66* /сплошные квадраты; mfi 527/ или мутантов CD16: Z Cys11Gly /Asp66*, /пустые квадраты, mfi 338/ и CD16:Z Cys11Gly /Asp15-Gly/Glu60* /сплошные треугольники; mfi 259/. На фиг. 9C представлена цитолитическая активность через посредство слитых протеинов, состоящих из трех частей. Сплошные треугольники, CD16:Z Asp66*, пустые квадраты, CD16:5:Z /48 - 65/, сплошные квадраты CD16:7:Z /48 - 65/, пустые треугольники, CD16: 7: Z /48-59/, пустые кружки CD16:5, сплошные кружки, CD16:7. На фиг. 9 представлена мобилизация кальция мутантом и тройными химерами в TCR негативной Jurkat JRT3. T3.5. мутантной клеточной линии. Пустые кружки соответствуют клеточной экспрессии димерной CD16:Z Asp66*, сплошные квадраты соответствуют клеткам, экспрессирующим CD16:Z Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66*, пустые квадраты, реакция клеток, экспрессирующих CD16:Z Cys11Gly/Asp15Gly/Glu60*, сплошные треугольники, реакция клеток, экспрессирующих CD16:7:Z /48-65/, и пустые треугольники, реакция клеток, экспрессирующих CD16:Z /48-59/.
Фиг. 10 Вклад отдельных аминокислот в активность цитолитического передающего сигнал фрагмента из 18 остатков. Фиг. 10A и 10B показывают цитолитическую активность, а фиг. 10c показывает мобилизацию ионов кальция посредством химер, несущих точечные мутации вблизи карбоксильного терминального тирозина /V62/. Фиг. 10A и 10B представляют данные, полученные на клетках, экспрессирующих низкие и высокие количества, соответственно, CD16:Z протеинов слияния. Идентичные символы использованы для анализов по мобилизации кальция и цитолиза и представлены в однобуквенном коде справа. Сплошные кружки, клетки, экспрессирующие CD16:Z /mfi в A,21, B,376/; сплошные квадраты, клетки, экспрессирующие CD16:7:Z /48-65/ /mif A,31, B,82/, пустые квадраты CD16:7:Z /48-65/ GL60Gн /mfi A,33; B,92/, крестики, CD16:7:Z /48-65/ Asp63A н /mfi A, 30; B,74/, сплошные треугольники CD16:7:Z /48-65 /Tyr62Phe /mfi A,24, B,88/, пустые кружки, CD16: 7:Z /48-65/Gl61GIн /mfi A, 20, B, 62/, и пустые треугольники. CD16: 7:Z /48-65/ Tyr62 Serr /mfi B, 64/. Фиг. 10D и 10E демонстрируют цитолитическую активность, а на фиг. 10F показана мобилизация ионов кальция химерами, несущими точечные мутации вблизи аминотерминального тирозина /V51/. Идентичные символы использованы для анализов по мобилизации кальция и цитолизу и представлены справа. Сплошные кружки, клетки, экспрессирующие CD16: Z /mfi в D,21,2. в E, 672/, сплошные квадраты, клетки, экспрессирующие CD16: 7: Z /48-65/ /mfi D,31,3, E, 179/, оплошные треугольники, CD16: 7:Z /48-65/ /Asn48Ser /mfi D, 22,4, E, 209/, пустые квадраты, CD16:7:Z /48-65/ Leu50Ser/ D, 26,0, E, 142/ и пустые треугольники, CD16:7:Z /48-65/ Tyr51Phe /mfi D, 32,3, Е, 294/.
Фиг. 11 Соответствие внутренних повторов Z, и сравнение их способности поддерживать цитолиз. Фиг. 11A представляет схематическую диаграмму химер, полученных делением Z внутриклеточного домена на трети и присоединения их к трансмембранному домену CD16: 7 химер. Последовательности внутриклеточных доменов показаны ниже, причем нужные остатки заключены в прямоугольники, а родственные остатки помечены звездочками. Фиг. 11B показывает цитолитическую способность трех Z субдоменов. Сплошные кружки, клетки, экспрессирующие CD16: Z /mfi 476/, сплошные квадраты, CD16:7:Z /33-65/ /mfi 68/, пустые квадраты, CD16: 7: Z /71-104/ /mfi 114/ и сплошные треугольники, CD16:7:Z /104-138/ /mfi 104/.
Фиг. 12 представляет схематическую диаграмму химер CD16:FcR γ 11.
Фиг. 13. Мобилизация кальция с последующей сшивкой CD4:FcR γ 11 и CD16: FcR γ 11 химер. Фиг. 13A представляет отношение фиолетовой к синей флуоресценции, испускаемой клетками, загруженными чувствительным к кальцию флуорофор Indo-1, представленное как функция времени с последующей сшивкой CD16 внеклеточного домена с антителами. Фиг. 13B показывает аналогичный анализ повышения отношения фиолетовой к синей флуоресценции клеток, несущих CD4:FcR γ 11 химеры, с последующей сшивкой с антителами.
Фиг. 14. Цитолитический анализ CD4:FcR γ 11 и CD16:FcR γ 11 химер. Фиг. 14A показывает процент 51Cr высвобождаемого из анти-CD16 гибридомных /мишеневых/ клеток, когда эти клетки экспонируют возрастающему количеству цитолитических T лимфоцитов, экспрессирующих CD16:FcR γ 11 химеры /эффекторные клетки/. Фиг. 14B показывает аналогичный анализ цитотоксичности через посредство CD4:FcR γ 11 химер против мишеневых клеток, экспрессирующих гликопротеины оболочки HIV.
Фиг. 15. Идентификация остатков в FcR γ 11A хвосте, который важен для цитолиза, фиг. 15A представляет собой схематическую диаграмму делеций конструкций. Фиг. 15B и 15C демонстрируют мобилизацию кальция и цитолиз за счет карбоксил-терминальных делеций вариантов CD16:FcR γ 11A. Фиг. 15D и 15E показывают мобилизацию кальция и цитолиз химерами, состоящими из трех частей, содержащими прогрессивно меньше аминоконцов внутриклеточного хвоста CD16:FcR γ 11A.
Фиг. 16. /SEQ ID N0:24/ изображает аминокислотную последовательность CD3 дельта рецепторного протеина; в рамке последовательность, которая представляет предпочтительную часть цитолитического сигнала трансдукции.
Фиг. 17 /SEQ ID N0:24/ представляет аминокислотную последовательность T3 гамма рецепторного протеина; заключенная в рамку последовательность представляет предпочтительную часть цитолитического сигнала трансдукции.
Фиг. 18 /SEQ ID N0:26/ представляет аминокислотную последовательность mbl рецепторного протеина; заключенная в рамку последовательность представляет предпочтительную часть цитолитического сигнала трансдукции.
Фиг. 19 /SEQ ID N0:27/ представляет аминокислотную последовательность B29 рецепторного протеина; заключенная в рамку последовательность представляет предпочтительную часть цитолитического сигнала трансдукции.
Пример 1
Конструирование IgG1 человека: рецепторные химеры
Получают тяжелые цепные последовательности человеческого IgG1, соединяя последовательности в CH3 домене с кДНК фрагментом, полученным из 3' конца трансмембранной формы иРНК антител. 3' концевой фрагмент получают в цепной полимеразной реакции, используя библиотеку кДНК из миндалин в качестве субстрата, и олигонуклеотиды, с последовательностями:
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTC GGC /SEQ ID N0:7/ и
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCC CGT CCT GGG CCT CA /SEQ ID N0: 8/, соответствующие 5' и 3' концам целевых фрагментов ДНК, соответственно. 5' олигокомплементарен сайту в CHI домене человеческого IgC1, а 3' комплементарен сайту 5' последовательности, кодирующей мембранный спанинговый домен. PCR продукт переваривают с BStXI и BamHI и лигируют между CStXI и BamHI сайтами полусинтетического гена антитела IgG1, несущего переменные и постоянные участки. После включения фрагмента BStXI до BamHI, амплифицирующую часть конструкции заменяют вплоть до Smal сайта в CH3 рестрикционным фрагментом взаимообмена, так, что только участок между Smal сайтом и 3' олиго получают из PCR реакции.
Конструирование IgG1 человека: рецепторные химеры
Получают тяжелые цепные последовательности человеческого IgG1, соединяя последовательности в CH3 домене с кДНК фрагментом, полученным из 3' конца трансмембранной формы иРНК антител. 3' концевой фрагмент получают в цепной полимеразной реакции, используя библиотеку кДНК из миндалин в качестве субстрата, и олигонуклеотиды, с последовательностями:
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTC GGC /SEQ ID N0:7/ и
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCC CGT CCT GGG CCT CA /SEQ ID N0: 8/, соответствующие 5' и 3' концам целевых фрагментов ДНК, соответственно. 5' олигокомплементарен сайту в CHI домене человеческого IgC1, а 3' комплементарен сайту 5' последовательности, кодирующей мембранный спанинговый домен. PCR продукт переваривают с BStXI и BamHI и лигируют между CStXI и BamHI сайтами полусинтетического гена антитела IgG1, несущего переменные и постоянные участки. После включения фрагмента BStXI до BamHI, амплифицирующую часть конструкции заменяют вплоть до Smal сайта в CH3 рестрикционным фрагментом взаимообмена, так, что только участок между Smal сайтом и 3' олиго получают из PCR реакции.
Для создания человеческого IgC1: η химерического рецептора тяжелый цепной ген, оканчивающийся в ВамHI сайте, соединяют с ВамHI сайтом описанной далее химеры η , так что последовательность антител образует внеклеточную часть. Цитометрия в потоке COS клеток, трансфектированных плазмидой, кодирующей химеру, показывает высокий уровень экспрессии детерминант антител, если плазмида экспрессии, кодирующая легкие цепи кДНК, котрансфектируется, и умеренную экспрессию детерминант антител, если плазмида экспрессии легкой цепи отсутствует.
Аналогичные химеры, включая человеческий IgG1 слитый с η или γ /см. далее/, или любой сигнальный-трансдукторный участок T клеточного рецептора или Fc рецепторного протеина, можно конструировать обычно, как описано ранее, используя стандартные методики молекулярной биологии.
Для создания отдельной транскрипционной единицы, которая позволила бы экспрессировать как тяжелую, так и легкую цепи, из единого промотера, создают плазмиду, кодирующую bicistronic иРНК из последовательностей, кодирующих тяжелые и легкие цепи, и 5' нетрансляционной части иРНК, кодирующей 78 кД глюкозо регуляторный протеин, известный иначе как grp78, или BiP. grp78 последовательность получают за счет PCR человеческой геномной ДНК, используя праймеры, имеющие последовательности:
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC /SEQ ID N0:9/ и
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAC CAG /SEQ ID N0:10/
по 5' и 3' концам, соответственно. Полимеразные цепные реакции с этими олигомерами проводят в присутствии 10% диметилсульфоксида. Фрагмент, полученный за счет PCR, переваривают с Wotl и Hincll и включают между Notl и Hpal сайтами после последовательности, кодирующей IgG1 человека. Последовательности, кодирующие кДНК легкой цепи IgG1 каппа человека, включают затем после grp78 лидера, используя Hincll сайт и другие сайты в векторе. Плазмида экспрессии, полученная в результате этих манипуляций, состоит из синтетического гена тяжелой цепи с последующей grp78 лидерной последовательностью, с последующей последовательностью кДНК легкой цепи каппа, с последующими сигналами полиаденилирования, полученными из SV40 ДНК фрагмента. Трансфекция COS клеток экспрессионной плазмидой дает заметно повышенную экспрессию детерминант тяжелой цепи, по сравнению с трансфекцией плазмид, кодирующих только детерминанты тяжелой цепи.
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC /SEQ ID N0:9/ и
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAC CAG /SEQ ID N0:10/
по 5' и 3' концам, соответственно. Полимеразные цепные реакции с этими олигомерами проводят в присутствии 10% диметилсульфоксида. Фрагмент, полученный за счет PCR, переваривают с Wotl и Hincll и включают между Notl и Hpal сайтами после последовательности, кодирующей IgG1 человека. Последовательности, кодирующие кДНК легкой цепи IgG1 каппа человека, включают затем после grp78 лидера, используя Hincll сайт и другие сайты в векторе. Плазмида экспрессии, полученная в результате этих манипуляций, состоит из синтетического гена тяжелой цепи с последующей grp78 лидерной последовательностью, с последующей последовательностью кДНК легкой цепи каппа, с последующими сигналами полиаденилирования, полученными из SV40 ДНК фрагмента. Трансфекция COS клеток экспрессионной плазмидой дает заметно повышенную экспрессию детерминант тяжелой цепи, по сравнению с трансфекцией плазмид, кодирующих только детерминанты тяжелой цепи.
Для создания bicistronic гена, содержащего тяжелую цепь/рецепторную химеру, и легкую цепь, расположенные ранее, последовательности тяжелой цепи можно заменить любым химерическим тяжелая цепь/рецепторным геном, здесь описанным.
Пример 2
Конструирование CD4 рецепторных химер
Человеческие Z (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9709-9713 (1998b)) и η (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265: 6448-6452 (1990).
Конструирование CD4 рецепторных химер
Человеческие Z (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9709-9713 (1998b)) и η (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265: 6448-6452 (1990).
кДНК выделяют в реакции полимеразной цепи из библиотеки, полученной из клеточной линии HPB-ALL опухоли /Aruffo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 /1987// и из природных киллерных клеток человека, тогда как η ДНК /Jin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319 - 3323 /1990// выделяют из библиотеки тимоцитов мышей, Z, η и γ кДНК соединяют с внеклеточным доменом сконструированной формы CD4, содержащей BamHI сайт сразу перед мембранным спанинговым доменом /Aruffo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573 - 8577 /1987/; Zeltlmeissl et al. DNA Cell Biol. 9347 - 353 /1990//, который присоединяют к BamHI сайту, природно встречающемуся в Z и η кДНК в аналогичном положении на несколько остатков ранее мембранного спанингового домена /SEQ ID NOS: 1, 3, 4 и 6/. Для получения слияния протеина с γ BamHI сайт включают в последовательность в том же самом /приблизительно/ месте /фиг. 1/ последовательности SEQ ID N0: 2 и 5/. Слитые гены вводят в вирус вакцины, экспрессирующий плазмиду, несущую E.coli gpt ген в качестве селектируемого маркера /M. Amiot and B.S., неопубликовано/ и включают в геном штамма WP вакцины за счет гомологической рекомбинации и отбора по росту в микофенолевой кислоте /Falkner et al., J. virol 62:1849 - 1854 /1988/, Boyle et al., Gene, 65:123 - 128 /1988/ /. Цитометрический анализ в потоке показывает, что рекомбинанты вакцины управляют обильным продуцированием CD4:Z и CD4 γ протеинами слияния на поверхности клеток, тогда как экспрессия CD4: η существенно ниже /фиг. 1/. Последнее открытие согласуется с недавним сообщением о том, что трансфекция η кДНК экспрессирующей плазмиды в гибридомную клеточную линию мышей дает существенно более низкую экспрессию, нежели трансфекция сравнимой Z экспрессионной плазмиды /Clayton et al. J. Exp. Med. 172:1243 - 1253 /1990//. Иммуноосаждение клеток, инфицированных рекомбинантами вакцины, показывает, что слитые протеины образуют ковалентные димеры, в отличие от природно встречающихся CD4 антигенов /фиг. 1/. Молекулярные массы мономерных CD4: Z и CD4: γ протеинов слияния и нативных CD4 оказались 63, 55 и 53 кД, соответственно. Более крупные массы протеинов слияния приблизительно соответствуют большей длине внеклеточной части, которая превышает нативные CD4 на 75 /CD4:Z/ или на 5 /CD4 γ / остатков.
Пример III
CD4 химеры можно ассоциировать с другими рецепторными цепями
Клеточная поверхностная экспрессия макрофаг /природная киллерная клеточная форма Fc γ RIII /CD16TM/ человека на трансфектанты облегчается за счет котрансфекции с мышиным /Kurosaki et al., Nature, 342:805 - 807 /1989// или человеческим /Hibbs et al., Science, 246: 1608 - 1611 /1989/, а также с человеческим /Lauier et al., Nature, 342:803 - 805 /1989//.
CD4 химеры можно ассоциировать с другими рецепторными цепями
Клеточная поверхностная экспрессия макрофаг /природная киллерная клеточная форма Fc γ RIII /CD16TM/ человека на трансфектанты облегчается за счет котрансфекции с мышиным /Kurosaki et al., Nature, 342:805 - 807 /1989// или человеческим /Hibbs et al., Science, 246: 1608 - 1611 /1989/, а также с человеческим /Lauier et al., Nature, 342:803 - 805 /1989//.
В согласии с этими сообщениями экспрессия химерами также обеспечивает поверхностную экспрессию /CD16TM/, если подается на мишеневые клетки либо за счет котрансфекции или за счет коинфекции рекомбинантными вирусами вакцины /фиг. 2/. Промотирование /CD16TM/ поверхностной экспрессии за счет Z более выражено, нежели промотирование за счет γ /фиг. 2/ в исследованных клеточных линиях, тогда как нативные CD4 /данные не приведены/ не превышают CD16TM поверхностной экспрессии.
Пример IV
Asp Z мутанты не ассоциируются совместно с Fc рецептором
Для создания химер, которые не ассоциировались бы с существующими антигенами или Fc рецепторами, мутантный Z слитый протеин, который не содержит ни внутримембранного Asp, ни внутримембранного Cys остатка, был получен. Цитометрия в потоке показывает, что интенсивность экспрессии клеточной поверхности за счет различных мутантных химер заметно не отличается от не мутантов-предшественников /данные не приведены/, а эксперименты по иммуноосаждению показали, что полная экспрессия за счет химер была такой же /фиг. 3/. Как и ожидалось, мутантные химеры, не содержащие трансмембранного остатка цистеина, как было обнаружено, не образуют димеров с дисульфидной связью /фиг. 3/. Две мутантные химеры, не содержащие Asp, были неспособны поддержать поверхностную экспрессию CD16, тогда как мономерные химеры, не содержащие Cys, но несущие Asp, обеспечили совместную экспрессию CD16TM, но с более низкой эффективностью, нежели родительский димер /фиг. 3/.
Asp Z мутанты не ассоциируются совместно с Fc рецептором
Для создания химер, которые не ассоциировались бы с существующими антигенами или Fc рецепторами, мутантный Z слитый протеин, который не содержит ни внутримембранного Asp, ни внутримембранного Cys остатка, был получен. Цитометрия в потоке показывает, что интенсивность экспрессии клеточной поверхности за счет различных мутантных химер заметно не отличается от не мутантов-предшественников /данные не приведены/, а эксперименты по иммуноосаждению показали, что полная экспрессия за счет химер была такой же /фиг. 3/. Как и ожидалось, мутантные химеры, не содержащие трансмембранного остатка цистеина, как было обнаружено, не образуют димеров с дисульфидной связью /фиг. 3/. Две мутантные химеры, не содержащие Asp, были неспособны поддержать поверхностную экспрессию CD16, тогда как мономерные химеры, не содержащие Cys, но несущие Asp, обеспечили совместную экспрессию CD16TM, но с более низкой эффективностью, нежели родительский димер /фиг. 3/.
Пример V
Мутантные рецепторы сохраняют способность инициировать реакцию кальция
Для того чтобы определить, позволит ли сшивка слитых протеинов обеспечить аккумуляцию внутриклеточного кальция таким же образом, который известен для T клеточных антигенных рецепторов, клетки линии T клеточной лейкемии человека, Jurkat E6 3ATCC Access or Number TIB 152, American Tyрe Culture Collection, Rockviell, MD/, инфицировали рекомбинантами вакцины, и измеряли относительную концентрацию кальция в цитоплазме после сшивки внеклеточного домена с антителами. Осуществляли цитометрические измерения в потоке на клетках, с введенным чувствительным к кальцию красителем lnoo-1 /Grynkievich et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 /1985/; Rabinovitch et al., J. Immunol, 137: 952 - 961 /1986/ /. На фиг. 4 представлены результаты по кальцию в экспериментах в потоке с клетками, инфицированными CD4:Z и Asp- и Gys- мутантами Z.
Мутантные рецепторы сохраняют способность инициировать реакцию кальция
Для того чтобы определить, позволит ли сшивка слитых протеинов обеспечить аккумуляцию внутриклеточного кальция таким же образом, который известен для T клеточных антигенных рецепторов, клетки линии T клеточной лейкемии человека, Jurkat E6 3ATCC Access or Number TIB 152, American Tyрe Culture Collection, Rockviell, MD/, инфицировали рекомбинантами вакцины, и измеряли относительную концентрацию кальция в цитоплазме после сшивки внеклеточного домена с антителами. Осуществляли цитометрические измерения в потоке на клетках, с введенным чувствительным к кальцию красителем lnoo-1 /Grynkievich et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 /1985/; Rabinovitch et al., J. Immunol, 137: 952 - 961 /1986/ /. На фиг. 4 представлены результаты по кальцию в экспериментах в потоке с клетками, инфицированными CD4:Z и Asp- и Gys- мутантами Z.
Сшивка химер воспроизводимо повышает внутриклеточный кальций. CD4: η и CD4: γ аналогичным образом позволяют аккумулировать внутриклеточный кальций в инфицированных клетках /данные не приведены/, Jurkat клетки экспрессируют низкие уровни CD4 на поверхности клеток, однако, сшивка нативных CD4 в присутствии или без CD16: Z /C. R. и B.S., не опубликовано/ /фиг. 4 и не приведенные данные/ не влияет на уровни содержания внутриклеточного кальция.
Пример VI
CD4: Z, η и γ химеры - посредники цитолиза мишеней, экспрессирующих HIV gp120/41
Для определения того факта, будут ли химерические рецепторы включать цитолитическую эффекторную программу, была создана модель мишень:эффекторная система на основе CD4 распознавания комплекса HIV оболочка gp120/gp41. HeLa клетки были инфицированы рекомбинантными вирусами вакцины, экспрессирующими gp120/gp41 /Chakrobarti et al., Nature 320:535 - 537/1986/; Earl et al., J. Virol, 64:2449 - 2451 /1990/ и помечены 51Cr. Меченые клетки инкубировали с клетками человеческой аллоспецифической /CD8+, CD4-/ клеточной линии цитотоксических T лимфоцитов, которые были инфицированы рекомбинантами вакцины, экспрессирующими CD4: Z, CD4: η , или CD4: γ химеры, или CD4:Z Gys11Gly: Asp15Gly двойными мутантными химерами. На фиг. 5 показано, что HeLa клетки, экспрессирующие gp120/41, были специфически разрушены цитотоксичными T лимфоцитами /CTL/, экспрессирующими CD4 химеры. Неинфицированные HeLa клетки не были поражены CTL, снабженными CD4:Z химерами, а HeLa клетки, экспрессирующие gp120/41, не были распознаны неинфицированными CTL. Для сравнения эффективности различных химер внесли поправку в отношения эффектор/мишень на долю CTL, экспрессирующих CD4 химеры, и на долю HeLa клеток, экспрессирующих gp120/41 по данным цитометрии в потоке. На фиг. 5C показаны данные цитометрического анализа CD4 экспрессии CTL, использованных в цитолитических экспериментах, представлены на фиг. 4A и 4B. Хотя средняя плотность поверхностных CD4: Z значительно превышает среднюю плотность CD4: η , цитолитическая эффективность клеток, экспрессирующих любую из форм, была одинакова. Поправки на долю мишеней, экспрессирующих gp120, эффективность цитолиза посредством CD4: Z и CD4: η протеинов по сравнению с наивысшей эффективностью, известной для специфических T клеточных рецепторных пар мишень : эффектор /среднее отношение эффектор: мишень для 50% высвобождения T клетками, экспрессирующими CD4: Z, составило 1,9 ± 0,99, н=10/. CD4: γ слияния были менее активны по сравнению с CD4:Z слияниями, в которых отсутствовали трансмембранные Asp и Cys остатки. Однако, в обоих случаях наблюдался значительный цитолиз /фиг. 5/.
CD4: Z, η и γ химеры - посредники цитолиза мишеней, экспрессирующих HIV gp120/41
Для определения того факта, будут ли химерические рецепторы включать цитолитическую эффекторную программу, была создана модель мишень:эффекторная система на основе CD4 распознавания комплекса HIV оболочка gp120/gp41. HeLa клетки были инфицированы рекомбинантными вирусами вакцины, экспрессирующими gp120/gp41 /Chakrobarti et al., Nature 320:535 - 537/1986/; Earl et al., J. Virol, 64:2449 - 2451 /1990/ и помечены 51Cr. Меченые клетки инкубировали с клетками человеческой аллоспецифической /CD8+, CD4-/ клеточной линии цитотоксических T лимфоцитов, которые были инфицированы рекомбинантами вакцины, экспрессирующими CD4: Z, CD4: η , или CD4: γ химеры, или CD4:Z Gys11Gly: Asp15Gly двойными мутантными химерами. На фиг. 5 показано, что HeLa клетки, экспрессирующие gp120/41, были специфически разрушены цитотоксичными T лимфоцитами /CTL/, экспрессирующими CD4 химеры. Неинфицированные HeLa клетки не были поражены CTL, снабженными CD4:Z химерами, а HeLa клетки, экспрессирующие gp120/41, не были распознаны неинфицированными CTL. Для сравнения эффективности различных химер внесли поправку в отношения эффектор/мишень на долю CTL, экспрессирующих CD4 химеры, и на долю HeLa клеток, экспрессирующих gp120/41 по данным цитометрии в потоке. На фиг. 5C показаны данные цитометрического анализа CD4 экспрессии CTL, использованных в цитолитических экспериментах, представлены на фиг. 4A и 4B. Хотя средняя плотность поверхностных CD4: Z значительно превышает среднюю плотность CD4: η , цитолитическая эффективность клеток, экспрессирующих любую из форм, была одинакова. Поправки на долю мишеней, экспрессирующих gp120, эффективность цитолиза посредством CD4: Z и CD4: η протеинов по сравнению с наивысшей эффективностью, известной для специфических T клеточных рецепторных пар мишень : эффектор /среднее отношение эффектор: мишень для 50% высвобождения T клетками, экспрессирующими CD4: Z, составило 1,9 ± 0,99, н=10/. CD4: γ слияния были менее активны по сравнению с CD4:Z слияниями, в которых отсутствовали трансмембранные Asp и Cys остатки. Однако, в обоих случаях наблюдался значительный цитолиз /фиг. 5/.
Для того чтобы проконтролировать возможность того, что заражение вакциной может промотировать артефактуальное распознавание за счет CTL, были проведены аналогичные эксперименты по цитолизу с мишеневыми клетками, инфицированными рекомбинантами вакцины, экспрессирующими фосфатидилинозитольную связанную форму CD16 /CD16PI/ и меченые 51Cr, и с CTL инфицированными контрольными рекомбинантами, экспрессирующими либо CD16PI, либо CD16:Z. Фиг. 16 показывает, что T клетки, экспрессирующие не CD4 химеры, не распознают нативные HeLa клетки или HeLa клетки, экспрессирующие gp120/41, и аналогично, что T клетки, экспрессирующие CD4 химеры, не распознают HeLa клетки, экспрессирующие другие закодированные вакциной поверхностные протеины. Кроме того, CTL, экспрессирующие не химерические CD4, заметно не разрушают HeLa клетки, экспрессирующие gp120/41 /фиг. 6A/.
Пример VII
Клетки, содержащие МНС, класс II, не поражаются химерами
Известно, что CD4 взаимодействует с неполиморфной последовательностью, экспрессируемой антигеном МНС класса II /Gay et al., Nature, 328:626 - 629 /1987/, Sfeckman et al., Nature, 328:351 - 353 /1987//. Хотя специфическое взаимодействие между CD4 и антигеном класса II никогда не было подтверждено на очищенных протеинах, в некоторых условиях адгезия между клетками, экспрессирующими CD4, и клетками, экспрессирующими молекулы класса II, может быть продемонстрирована /Doyle et al., Nature 330:256 - 259 /1987/; Claybou et al., J. Exp. Med. 172-1243 - 1253 /1990/; Lamarre et al. Science 245:743 - 746 /1989//. Следующими исследованиями были исследования вопроса, можно ли детектировать убийство клеток, несущих класс II. На фиг. 6B показано, что нет специфического цитолиза направляемого CD4: η против Raji B клеточной линии, которая экспрессирует обильно антиген класса II. Хотя наблюдается умеренный /около 5%/ цитолиз, негативный мутант класса II Raji, RJ 2.2.5 /Accolla, P. S. J. Exp. Med. 157:1053 - 1058 /1983/ доказывает аналогичную подверженность, что и Raji клетки, инкубированные с неинфицированными T клетками.
Клетки, содержащие МНС, класс II, не поражаются химерами
Известно, что CD4 взаимодействует с неполиморфной последовательностью, экспрессируемой антигеном МНС класса II /Gay et al., Nature, 328:626 - 629 /1987/, Sfeckman et al., Nature, 328:351 - 353 /1987//. Хотя специфическое взаимодействие между CD4 и антигеном класса II никогда не было подтверждено на очищенных протеинах, в некоторых условиях адгезия между клетками, экспрессирующими CD4, и клетками, экспрессирующими молекулы класса II, может быть продемонстрирована /Doyle et al., Nature 330:256 - 259 /1987/; Claybou et al., J. Exp. Med. 172-1243 - 1253 /1990/; Lamarre et al. Science 245:743 - 746 /1989//. Следующими исследованиями были исследования вопроса, можно ли детектировать убийство клеток, несущих класс II. На фиг. 6B показано, что нет специфического цитолиза направляемого CD4: η против Raji B клеточной линии, которая экспрессирует обильно антиген класса II. Хотя наблюдается умеренный /около 5%/ цитолиз, негативный мутант класса II Raji, RJ 2.2.5 /Accolla, P. S. J. Exp. Med. 157:1053 - 1058 /1983/ доказывает аналогичную подверженность, что и Raji клетки, инкубированные с неинфицированными T клетками.
Пример VIII
Требования последовательности для индукции цитолиза T клеточным антигеном/Fc рецептором зета цепи
Хотя химеры между CD4 и Z можно снабдить цитотоксичными T лимфоцитами /CTL/ для убийства мишеневых клеток, экспрессирующих HIV gp120, ищут альтернативу CD4 для однозначного сравнения свойств зета химер, введенных в T клеточные линии человека. Такие линии могут экспрессировать CD4, затрудняя специфическое определение связи между
типом или степенью мобилизации кальция и цитотоксическим потенциалом различных химер. Для осуществления этого, создают химеры между Z и CD16, в которых внеклеточный домен CD16 присоединен к трансмембранной и внутриклеточной последовательности Z /фиг. 7A/. Слитые гены вводят в вирус вакцины, экспрессирующий плазмиду, несущую ген E.coli gpt в качестве селектируемого маркера, и включают в геном вакцины штамма WR путем гомологической рекомбинации и селекции по росту в микофенолевой кислоте /Falkner and Moss, J. Virol, 62:1849 /1988/; Boyle and Coupar, Cene 65:123 /1988//.
Требования последовательности для индукции цитолиза T клеточным антигеном/Fc рецептором зета цепи
Хотя химеры между CD4 и Z можно снабдить цитотоксичными T лимфоцитами /CTL/ для убийства мишеневых клеток, экспрессирующих HIV gp120, ищут альтернативу CD4 для однозначного сравнения свойств зета химер, введенных в T клеточные линии человека. Такие линии могут экспрессировать CD4, затрудняя специфическое определение связи между
типом или степенью мобилизации кальция и цитотоксическим потенциалом различных химер. Для осуществления этого, создают химеры между Z и CD16, в которых внеклеточный домен CD16 присоединен к трансмембранной и внутриклеточной последовательности Z /фиг. 7A/. Слитые гены вводят в вирус вакцины, экспрессирующий плазмиду, несущую ген E.coli gpt в качестве селектируемого маркера, и включают в геном вакцины штамма WR путем гомологической рекомбинации и селекции по росту в микофенолевой кислоте /Falkner and Moss, J. Virol, 62:1849 /1988/; Boyle and Coupar, Cene 65:123 /1988//.
T клеточную линию инфицируют рекомбинантами вакцины, и определяют относительную концентрацию цитоплазмически свободных ионов кальция с последующей сшивкой внеклеточных доменов с антителами. Были проведены как спектрофотометрические /объем популяции/, так и цитометрические в потоке /одиночное клетки/ измерения с клетками, меченными красителем Indo-1 (Grynkiewicz et al. , J. Biol. Chem. 260:3440 /1985/; Rabinovitch et al., J. Immunol 37:952 /1986//. На фиг. 7B представлены результаты анализа данных, полученных для клеток линии Jurkat Т клеток лейкемии человека, инфицированными рекомбинантами вакцины, экспрессирующими CD16: η протеины слияния. Сшивка химер воспроизводимо повышает содержание внутриклеточного кальция, хотя аналогичная обработка клеток, экспрессирующих нехимерические CD16, не оказывает влияния, или оно мало. Если химера была экспрессирована в мутантную клеточную линию без рецептора антигена, либо PEX33A /Breitmeyer et al., J. Immunol 138:726 /1987/; Sauco et al., J. Biol. Chem. 264:20760 /1989/ либо Jurkat мутанта JRT3, T3.5 /Wess et al., J. Immunol. 135:123 /1984/; наблюдается сильная реакция на сшивку CD16 антител. Аналогичные данные были получены на REX20A /Breitmeyer et al., supra., 1987; Blumbery et al., J. Biol. Chem. 265:14036 /1990// мутантной клеточной линии и на CD3/Ti негативном мутанте Jurkat клеточной линии, установленной в этой лаборатории /данные не представлены/. Заражение рекомбинантами, экспрессирующими CD16:Z, не сохраняет реакцию на анти-CD3 антитела, что показывает, что слитый протеин не действует, освобождая внутриклеточные CD3 комплексные цепи /данные не приведены/.
Для оценки способности химер изменять направление иммунитета через клетки-медиаторы, CTL были инфицированы рекомбинантами вакцины, экспрессирующими CD16 химеры, и использованы для специфически разрушенных гибридомных клеток, экспрессирущих связанные с мембраной анти-CD16 антитела /см. далее/. Этот анализ является продолжением анализа цитотоксичности гибридомы, вначале разработанный для анализа эффекторного механизма клеток, несущих Fc рецепторы /Craziano and Fanger, J. Immunol, 138:945, /1987/; Graziano and Fanger, J. Immunol, 139: 35 - 36 /1987/ Shem et al., Mol. Immunol 26:959 /1989/; Fauger et al. , Immunol Today 10:92 /1989/. На фиг. 8B показано, что экспрессия CD16:Z в цитотоксические T лимфоциты позволяет снабдить CTL для убийства 3G8 /анти-CD16, Fleit et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3275 /1982/ гибридомных клеток, тогда как CTL, экспрессирующие связанную фоcфатидилинозитолом форму CD16, являются неактивными. CTL, снабженная CD16:Z, также не убивает гибридомные клетки, экспрессирующие не интересующие антитела /данные не приведены/.
Для идентификации минимальной Z последовательности, необходимой для цитолиза, приготовили серии делеционных мутантов, в которых последовательно была удалена большая часть Z внутриклеточного домена с карбоксильного конца /фиг. 8A/. Большую часть внутриклеточного домена затем можно удалить с незначительными последствиями для цитолитического потенциала, химера полной длины CD16: Z была практически равна по эффективности химере с делецией до остатка 65, CD16:Z Asp66* /фиг. 8B/. Существенное снижение цитотоксичности наблюдали при делеции до Z остатка 59 /химера CD16:Z Glu60*/, а дальнейшая делеция до остатка 50 приводит к несколько меньшей активности. Однако, полной потери активности не наблюдалось, даже когда внутриклеточный домен был сокращен до трех остатков трансмембранного якоря /фиг. 8B/.
Так как Z является дисульфидно связанным димером, единственным объяснением сохранения цитолитической активности оказался тот факт, что эндогенный Z формировал гетеродимер с химерической Z делецией, за счет чего восстановил активность. Для проверки этой идеи, Z остатки 11 и 15 заменили в Asp и Gys соответственно на Gly/Gys11Gly/Asp15Gly/ и иммуноосаждение провели следующим образом. Приблизительно 2 • 106 CVI клеток инфицировали в течение одного часа в DME среде, не содержащей сыворотки, рекомбинантной вакциной при коэффициенте инфекции /moi/, по крайней мере 10. Спустя 6-8 часов после инфицирования, клетки смыли с пластин PBS/1 мМ EDTA и поверхностно пометили 0,2 мк Кюри 125I на 2 • 106 клеток, используя лактопероксидазу и H2O2 по способу Clark and Einfeld /Zeukocyte Typing 11 pp 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986/. Меченые клетки собрали центрифугированием и подвергли лизису в 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 М NaCl, 0,05 М Трис, pH 8,0, 5 мМ MgCl2, 5 мM KCl, 0,2 М иодацетамида и 1 мМ PMSF. Ядра удалили центрифугированием, а CD16 протеины иммуноосадили антителами 3G8 /Fleit, Sypra 1982, Medarex/ и анти-мышиной IgG агарозой /Cappel, Durham, NC/. Образцы обрабатывали электрофорезом через 8% полиакриламид/SDS гель в невоccтановительных условиях, или через 10% гель в восстановительных условиях. Эти иммуноосаждения подтвердили, что CD16:Z Cys11-Gly/Asp15Gly химера не образует димерные структуры с дисульфидной связью.
Была проверена также цитолитическая активность мутантных рецепторов. Провели делецию мутантной химеры до остатка 65 /CD15:Z Gys11Gly/Asp66*/, и она оказалась в зависимости от условий анализа в 2 - 8 раз менее активной в цитолитическом анализе, нежели сравнимая не подвергшаяся мутации химера /CD16: Z Asp66*/, которая имеет обычно коэффициент 2 или неразличима в активности от CD16:Z /фиг. 9B/. Снижение активности у мутантных химер сравнимо со снижением, которое наблюдают для CD4 химер аналогичной структуры /см. выше /, и наиболее вероятно связано с более низкой эффективностью Z мономеров по сравнению c димерами. Напротив Asp-, Cys- подвергшиеся мутации химеры, усеченные до остатка 59, не обладают цитолитической активностью /фиг. 9B/, что подтверждает гипотезу о том, что ассоциация с другими цепями, осуществляемая трансмембранным Cys и/или Asp остатками, ответственна за слабое проявление цитолитической активности в делеции скорее аминотерминала, нежели остатка 65.
Цитометрические исследования в потоке показывают, что делеционные мутанты, не содержащие трансмембранных Asp и Gys остатков, все еще могут промотировать повышение содержания ионов свободного внутриклеточного кальция в ответ на антитела, сшивающие в TCR- мутант Jurkat клеточную линию /фиг. 9D/. Аналогичные результаты были получены для химер, экспрессированных в родительскую Jurkat клеточную линию /не показано/. В случае CD16:Z Gys11Gly/Asp15Gly/Glu60* эти данные демонстрируют то, что способность передавать отвечаемость кальция можно мутационно отделить от способности поддерживать цитолиз.
Для определенного исключения возможного вклада Z трансмембранных остатков трансмембрану и первые 17 цитоплазмических, остатков Z заменили последовательностью, кодирующей мембранный спанинг, и первыми 14 или первыми 17 цитоплазмическими остатками CD5 или CD7 антигена, соответственно /фиг. 9A/. Полученные слитые из трех частей протеины CD16:5:Z /48 - 65/ и CD16:7:Z /48 - 65/ не образуют димеров с дисульфидной связью как более простые CD16:Z химеры, так как у них нет цистеинового остатка в Z трансмембранном домене. Обе состоящие из трех частей химеры были способны мобилизовать кальций в Jurkat и TCR негативных клеточных линиях /фиг. 9D/ и увеличить цитолитическую реакцию в CTL /фиг. 9C и не представленные данные/. Однако, усечение Z части до остатка 59 в химере CD16:7:Z /48 - 59/ аннулирует способность тройного слияния управлять отвечаемостью кальция в TCR позитивных или негативных Jurkat клетках или цитолизом в зрелых CTL /фиг. 9C и 9D и не представленные данные/.
Для определения вклада отдельных остатков в 18-остаточный фрагмент, приготовили ряд мутантных вариантов за счет направленного в сайты мутагенеза, и оценили их способность посредничать в направляемом рецепторами киллинге в условиях низкой /фиг. 10A и 10D /или высокой /фиг. 10B и 10E/ экспрессии химерических рецепторов. Фиг. 10 показывает, что хотя ряд относительно консервативных замещений /то есть замена кислотных остатков их родственными амидами, или тирозина фенилаланином/, которые соединяют остатки 59 - 63, приводит к умеренному компромиссу цитолитической эффективности, обычно варианты сохраняют способность к мобилизации кальция. Однако, коллективно, эти остатки содержат важный субфрагмент, постольку поскольку их делеция исключает цитолитическую активность. Превращение Tyr62 либо в Phe, либо в Ser исключает как цитотоксичность, так и кальциевую реакцию. На аминокислотном конце сегмента из 18 остатков замена Tyr51 на Phe упраздняет как мобилизацию кальция, так и цитолитическую активность, тогда как замена Leu на Ser в положении 50 исключает реакцию кальция, но лишь частично влияет на цитолиз. Не связывая себя с определенной гипотезой, можно предположить, что неспособность Leu50Ser мутанта мобилизовывать кальций в кратковременном цитометрическом анализе в потоке, полностью не отражает его способность вызывать существенное повышение количества ионов свободного внутриклеточного кальция в более длительном цитолитическом анализе. Однако, как сообщалось, не чувствительная к кальцию цитолитическая активность для некоторых цитолитических клеточных линий и возможность того, что аналогичное явление подчеркивает описанные здесь результаты, не следует отбрасывать. Замена Asn48 на Ser частично придает цитотоксичность в некоторых экспериментах, хотя и оказывает мало влияния в других.
Для определения возможной роли излишней последовательности элементов, внутриклеточный домен Z разделяли на три сегмента, соединяя остатки 33 - 65, 71 до 104 и 104 до 138. Каждый из этих сегментов был присоединен к CD16:CD7 химере с помощью Mlu1 сайта, введенного как раз на периферию основной мембранной якорной последовательности внутриклеточного домена CD7 /см. далее, фиг. 11A/. Сравнение цитолитической эффективности трех элементов показало, что они практически обладают одинаковой эффективностью /фиг. 11B/. Сравнение последовательностей /фиг. 11A/ показало, что второй фрагмент несет 11 остатков между тирозинами, тогда как первый и третий содержат только десять.
Хотя точный учет процесса T клеточной активации и не был проделан, очевидно, что аггрегация антигенного рецептора и рецептора химер, которые содержат Z внутриклеточную последовательность, включает мобилизацию кальция, высвобождение цитокина и гранул и появление маркеров активации клеточной поверхности. Активный сайт Z, короткая линейная пептидная последовательность, вероятно, слишком мала, чтобы обладать собственной энзимативной активностью, по-видимому взаимодействует с одним или более из нескольких протеинов для создания клеточной активации. Ясно также, что одной только мобилизации свободного кальция недостаточно для клеточной активации, так как способность вызывать цитолиз можно мутационным способом отделить от способности вызывать накопление кальция.
Как было показано, добавление 18 остатков из внутриклеточного домена Z к трансмембранному и внутриклеточному доменам двух неродственных протеинов позволяет полученным химерам изменять направление цитолитической активности против мишеневых клеток, которые связаны с внеклеточной частью слитых протеинов. Хотя химеры, содержащие фрагмент из 18 остатков, приблизительно в восемь раз менее активны, нежели химеры, основанные на полной длине Z, пониженную активность можно приписать потере трансмембранного взаимодействия, которое обычно позволяет дикому типу Z образовывать димеры с дисульфидной связью. То есть, Z делеционные конструкции, которые имеют те же самые карбоксильные концы, что и фрагмент, и не имеют трансмембранных Gys и Asp остатков, обычно демонстрируют несколько меньшую активность, нежели химеры, содержащие только фрагмент из 18 остатков.
Элемент цитолитической компетентности, на котором мы сосредоточили внимание, имеет два тирозина и не содержит серина или треонина, что ограничивает возможный вклад в активность фосфорилирования. Мутация любого тирозина нарушает активность, однако, хотя предварительные эксперименты и не указали на существенное тирозиновое фосфорилирование с последующей сшивкой химерических поверхностных антигенов, содержащих фрагмент из 18 остатков; возможное участие такого фосфорилирования при низких уровнях нельзя исключить. Кроме указанных эффектов, отмеченных для двух тирозиновых остатков, ряд замен аминокислот у аминокислотного и карбоксильного концов фрагмента ослабляет активность в условиях низкой плотности рецепторов.
Последовательности, аналогичные Z активному фрагменту, можно найти в цитоплазмических доменах некоторых других трансмембранных протеинов, включая CD3 δ и γ молекулы, поверхностные IgM связанные протеины mbl и B29, а также β и γ цепи высокой афинности IgE рецепторы, Fc ε R1 /Ret, Nature, 338:383, 1989/. Хотя функции этих последовательностей не определены, если они эффективно экспрессированы, каждая может быть способна к автономной T клеточной активации, и также активности можно объяснить остаточной TCR отвечаемостью, которую можно наблюдать в зета-негативной мутантной клеточной линии /Sucsman et al., Cell, 52:85, 1988/.
Сам Z содержит три последовательности, приблизительно равной величины, и примерно три секции внутриклеточного домена показывают, что каждый способен инициировать цитолитическую реакцию Z, сплайс изоформа Z /Jin et al., supra, 1990; Clayton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202, 1991/ не содержит карбоксильной половины третьего фрагмента. Так как удаление карбоксильной половины первого фрагмента уничтожает активность, можно предположить, что основная биологическая эффективность Z может быть приписана первым двум фрагментам. Хотя при различных измерениях Z столь же активно как Z в промотировании осуществляемого антигеном высвобождения цитокина /Bauer et al., Proc. Natl, Acad. Sсi. USA, 88:384, 1991/ или в изменении направления цитолиза /см, выше/, Z не фосфорилируется в ответ на рецепторную стимуляцию /Bauer et al. , Supra, 1991/. Таким образом, либо наличие всех трех фрагментов необходимо для фосфорилирования, либо третий фрагмент представляет благоприятный субстрат для неидентифицированной тирозинкиназы.
Пример IX
Трансдукция цитолитического сигнала Fc рецептором человека
Для оценки действий различных человеческих Fc рецепторных субтипов, были созданы химерические молекулы, в которых внеклеточный домен антигенов человека CD4, CD5 или CD16 был соединен с трансмембранными и внутриклеточными доменами FcR11 γ A, B1, B2 и C субтипов /номенклатура Ravetchand kinet, Ann, Rev, Immunol. 9: 457, 1991/. Специфически, кДНК последовательности, соответствующие трансмембранным и цитоплазмическим доменам ранее описанных FcR11A, B1 и B2 изоформ, были амплифицированы из предшественника клона PC23 или из библиотеки кДНК миндалин человека /сконструированной по стандартным методикам/, используя олигонуклеотидные праймеры.
Трансдукция цитолитического сигнала Fc рецептором человека
Для оценки действий различных человеческих Fc рецепторных субтипов, были созданы химерические молекулы, в которых внеклеточный домен антигенов человека CD4, CD5 или CD16 был соединен с трансмембранными и внутриклеточными доменами FcR11 γ A, B1, B2 и C субтипов /номенклатура Ravetchand kinet, Ann, Rev, Immunol. 9: 457, 1991/. Специфически, кДНК последовательности, соответствующие трансмембранным и цитоплазмическим доменам ранее описанных FcR11A, B1 и B2 изоформ, были амплифицированы из предшественника клона PC23 или из библиотеки кДНК миндалин человека /сконструированной по стандартным методикам/, используя олигонуклеотидные праймеры.
CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID N0: 18; FcRIIA forward)
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID N0: 19; FcR11A reverse);
GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID N0: 20; FcR11B1 and FcR11B2 forward); and
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID N0: 21; FcR11B1 and FcR11B2 reverse).
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID N0: 19; FcR11A reverse);
GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID N0: 20; FcR11B1 and FcR11B2 forward); and
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID N0: 21; FcR11B1 and FcR11B2 reverse).
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID N0: 22) and
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID N0: 23).
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID N0: 23).
Эти праймеры содержат сайты расщепления для энзимов BamHI и Notl, соответственно, отступив на 6 остатков от 5' конца. Сайт Notl следует сразу за противосмысловым стоп кодоном либо CTA, либо TTA. Все праймеры содержат 18 или более остатков, комплементарных 5' концу и 3' концу целевого фрагмента. кДНК фрагмент, соответствующий FcR11 γ C цитоплазмическому домену, который отличается от 11A изоформы только одним аминокислотным остатком /Z для P у остатка 268/, создается за счет управляемого сайтом мутагенеза за счет перекрывания PGR, используя праймерные последовательности:
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A /SEQ ID N0: 22/ и
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A /SEQ ID N0: 23/.
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A /SEQ ID N0: 22/ и
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A /SEQ ID N0: 23/.
PCR фрагменты были включены в векторы экспрессии вируса вакцины, которые содержали CD16 или CD4 внеклеточные домены, соответственно, а затем были включены в дикого типа вакцину за счет рекомбинации по тимидинкиназному локусу, с использованием селекции по коинтеграции E.coli gpt для облегчения идентификации целевых рекомбинант. Идентификация всех изоформ /представлены на фиг. 12/ была подтверждена дидеоксисеквенированием.
Получение химерических рецепторных протеинов было далее подтверждено исследованиями иммуноосаждения. Приблизительно 107 JRT3.T3.5 клеток было инфицировано в течение одного часа в среде IMDM не содержащей сыворотки, рекомбинантной вакциной при умножаемости инфекции, по крайней мере, 10. Спустя 12 часов после заражения, клетки собрали, и поверхности пометили 0,5 мКюри 125I на 107 клеток, используя способ лектопероксидаза /глюкозооксидаза /Clark and Einfeld, supra/. Меченые клетки собрали центрифугированием и лизировали 1% NP-40, 0,1 мM MgCl2, 5 мМ KCl, 0,2 М иодоацетамида и 1 мМ PMSF. Ядра удалили центрифугированием, а CD16 слитые протеины иммуноосадили антителами 4G8 и анти-мышиной IgG агарозой. Образцы обработали электрофоретически при мягких условиях. Все иммуноосажденные химерические рецепторные молекулы были ожидаемой молекулярной массы.
Для проверки способности химерических рецепторов осуществлять повышение содержания цитоплазмических свободных ионов кальция, использовали рекомбинантные вирусы для заражения TCR- мутантной Jurkat клеточной линии JRT3.T3-5 /как показано далее/, и содержание цитоплазмического свободного иона кальция определяли в клетках /как здесь описано/ с последующей сшивкой рецепторных внеклеточных доменов с моноклональными антителами 3G8 или Leu-3A /как здесь описано/.
Эти эксперименты показали, что внутриклеточные домены FcR γ 11A и C были способны осуществлять повышение содержания цитоплазмических свободных ионов кальция после сшивки внеклеточных доменов, тогда как внутриклеточные домены FcR γ 11B1 и B2 были неактивны в аналогичных условиях /фиг. 13A и 13B/. CD4, CD5 и CD16 гибриды FcR γ 11A демонстрируют практически равную способность промотировать реакцию кальция /фиг. 13 и не представление данные/. Другие клеточные линии как моноцитного так и лимфоцитного происхождения, оказались способны реагировать на сигналы, инициируемые сшивкой внеклеточных доменов /данные не представлены/.
Для изучения вовлечения различных FcR γ 11 внутриклеточных доменов в цитолиз, цитотоксические T лимфоциты человека /CTL/ были инфицированы рекомбинантами вакцины, экспрессирующими CD16:FcR γ 11A, B1, B2 и C химеры. Инфицированные клетки затем совместно культивировали с гибридомными клетками с 51Cr /то есть 3G8 10 - 2 клетки/, которые экспрессировали клеточную поверхность антител к CD16. В этом анализе CTL содержащие CD16 химеры, убитые гибридомными мишеневыми клетками /что позволило высвободиться 51Cr/, если CD16 внеклеточный домен химеры был соединен с внутриклеточным сегментом, способным активировать лимфоцитную эффекторную программу; этот цитолиз-анализ подробно описан далее. Фиг. 14A показывает, что CTL снабженная CD16:FcR γ 11A и C, но не FcR γ 11 B1 или B2, способны к лизису мишеневых клеток, экспрессирующих клеточную поверхность анти-CD16-антитела.
Для исключения возможности того, чтобы специфический цитолиз каким-либо образом был связан с взаимодействием с CD16 фрагментом, проводили эксперименты по цитолизу, в которых FcR11 внутриклеточные домены были присоединены к CD4 внеклеточным доменам. В этом случае мишеневыми клетками были HeLa клетки, экспрессирующие протеины gp120/41 оболочки HIV /специфично, клетки HeLa, инфицированные вектором VPE16 вакцины /доступны от National Institute of Aplergy and Infection Disease AIDS Depository, Bethesda, MD/. Как и в CD16 системе, мишеневые клетки, экспрессирующие оболочку HIV, подвергали лизису T клетками, экспрессирующими CD4:FcR γ 11A химеры, но не FcR γ 11B1 или B2 /фиг. 14B/.
Внутриклеточные домены FcR γ 11A и C не образовывали никаких подходящих последовательностей, гомологичных с любым другим протеином, включая члены расширенного семейства FcR γ /TCRZ. Для определения последовательности элементов, ответственных за возбуждение цитолиза, 5' и 3' делеции последовательностей, кодирующих внутриклеточный домен /описанные далее и представленные на фиг. 15A/, получили и оценили на эффективность мобилизации кальция и в цитолитическом анализе /как здесь описано/. В тех экспериментах, в которых аминотерминальная часть внутриклеточного домена была удалена, трансмембранный домен FcR γ 11 был заменен трансмембранным доменом неродственного CD7 антигена для исключения возможного вклада взаимодействий за счет связанного с мембраной домена.
На фиг. 15B и 15C показано удаление 14 карбокси-терминальных остатков, включая тирозин 298, что привело к полной потере цитолитической способности и существенному снижению потенциала мобилизации кальция. Дальнейшая делеция непосредственно тирозином 282 дает идентичный фенотип /фиг. 15B и 15C/. Делеция с N-конца внутриклеточного домена до остатка 268 не оказывает существенного действия ни на кальциевый профиль, ни на цитолитическую способность, тогда как делеция до остатка 275 заметно увеличивает высвобождение кальция, но оказывает слабое воздействие на цитолиз /фиг. 15D и 15E/. Дальнейшая делеция до остатка 282 дает FcR γ 11 хвосты, которые не обладают способностью ни к мобилизации кальция, ни к включению цитолиза /фиг. 15D и 15E/. "Активный элемент", определенный этими грубыми измерениями, относительно велик /36 аминокислот/ и содержит два тирозина, разделенные 16 остатками.
Пример X
Другие внутриклеточные и трансмембранные сигнальные домены трансдукции по способу настоящего изобретения можно получить из протеинов T клеточных рецепторов, CD3 дельта и T3 гамма, и протеинов B клеточных рецепторов, mb1 и B29.
Другие внутриклеточные и трансмембранные сигнальные домены трансдукции по способу настоящего изобретения можно получить из протеинов T клеточных рецепторов, CD3 дельта и T3 гамма, и протеинов B клеточных рецепторов, mb1 и B29.
Аминокислотные последовательности этих протеинов представлены на фиг. 16 /CD3 дельта, SEQ ID N0:24/, фиг. 17 /T3 гамма, SEQ ID N0:25/, фиг. 18 /mb1, SEQ ID N0: 26/ и фиг. 19 /B29, SEQ ID N0: 27/. Участки последовательностей, достаточные для трансдукции цитолитического сигнала /и поэтому, предпочтительно, включенные в химерический рецептор настоящего изобретения/, представлены в рамках. Химерические рецепторы, которые включают эти протеиновые домены, сконструированы и использованы в способе лечения настоящего изобретения, как описано ранее.
Пример XI
Экспериментальные методы
Инфицирование вакциной и радиоиммуноосаждение
Приблизительно 5 • 106 CVI клеток инфицировали в течение часа в DME среде не содержащей сыворотки, с рекомбинантной вакциной с умножением инфекции /moi/, по крайней мере, 10 /титр, измеренный на CVI клетках/. Клетки помещают в свежую среду после того, как они инфицированы и метаболически мечены 200 мк Кюри/мл 35S-метионин плюс цистеином /Тган 35S-метка, ICN, Costo Mesa CA/ в метионине, и не содержащем цистеина DMEM /Gibco, Grand Island, NY/ в течение 6 часов. Меченые клетки отделили PBS, содержащим 1 мМ EDTA, собрали центрифугированием и провели лизис в 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 М NaCl, 0,05 М Tris pH 8.0, 5 мМ EDTA и 1 мМ PMSF. Ядра удалили центрифугированием, а CD4 протеины иммуноосадили OKT4 антителами и анти-мышь IgG агарозой /Cappel, Durham, NC/. Образцы обработали электрофоретически на 8% полиакриламид /SDS гелях в невосстанавливающих /NR/ и в восстанавливающих /R/ условиях. Гели, содержащие 35S-меченые образцы, были пропитаны En3 Hance /New England Nuclear, Boston, MA/ перед авторадиографией. Облегченная экспрессия трансмембранной формы CD16, CD16TM, была измерена по сравнению с ее экспрессией в CVI клетки, просто инфицированные CD16TM, с экспрессией в клетки коинфицированных вирусами, кодирующими CD16TM и Z или γ химеры. После инфицирования и инкубирования в течение 6 часов или более, клетки удалили с пластин PBS, 1 мМ EDTA и определили экспрессию CD16TM или зимер по данным косвенной иммунофлуоресценции и цитометрии в потоке.
Экспериментальные методы
Инфицирование вакциной и радиоиммуноосаждение
Приблизительно 5 • 106 CVI клеток инфицировали в течение часа в DME среде не содержащей сыворотки, с рекомбинантной вакциной с умножением инфекции /moi/, по крайней мере, 10 /титр, измеренный на CVI клетках/. Клетки помещают в свежую среду после того, как они инфицированы и метаболически мечены 200 мк Кюри/мл 35S-метионин плюс цистеином /Тган 35S-метка, ICN, Costo Mesa CA/ в метионине, и не содержащем цистеина DMEM /Gibco, Grand Island, NY/ в течение 6 часов. Меченые клетки отделили PBS, содержащим 1 мМ EDTA, собрали центрифугированием и провели лизис в 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 М NaCl, 0,05 М Tris pH 8.0, 5 мМ EDTA и 1 мМ PMSF. Ядра удалили центрифугированием, а CD4 протеины иммуноосадили OKT4 антителами и анти-мышь IgG агарозой /Cappel, Durham, NC/. Образцы обработали электрофоретически на 8% полиакриламид /SDS гелях в невосстанавливающих /NR/ и в восстанавливающих /R/ условиях. Гели, содержащие 35S-меченые образцы, были пропитаны En3 Hance /New England Nuclear, Boston, MA/ перед авторадиографией. Облегченная экспрессия трансмембранной формы CD16, CD16TM, была измерена по сравнению с ее экспрессией в CVI клетки, просто инфицированные CD16TM, с экспрессией в клетки коинфицированных вирусами, кодирующими CD16TM и Z или γ химеры. После инфицирования и инкубирования в течение 6 часов или более, клетки удалили с пластин PBS, 1 мМ EDTA и определили экспрессию CD16TM или зимер по данным косвенной иммунофлуоресценции и цитометрии в потоке.
FI х анализ кальция
Клетки сублинии Jurkat E6 /Weiss et al., J. Immunol, 133:123-128 /1984// инфицировали рекомбинантными вирусами вакцины в течение одного часа в не содержащей сыворотки среде IMDM при moi = 10, и инкубировали в течение 3-9 часов в IMDM, 10% FBS. Клетки собирали центрифугированием и повторно суспендировали при 3 • 106 клеток/мл в полной среде, содержащей 1 мМ Indo-1 ацетометоксиэфира /Grynkiewier et al., J. Biol. Chem. 260:3440-3450 /1985/ /Molecular Probes/, и инкубировали при 37oC в течение 45 минут. Клетки с введенным Indo-I таблетировали и повторно суспендировали при 1 • 106 мл в не содержащей сыворотки IMDM, и хранили при комнатной температуре в темноте. Клетки анализировали на содержание свободных ионов кальция при одновременном измерении фиолетовой с синей флюоресценции с помощью цитометрии в потоке /Rabinovitch et al. , J. Immunol, 137:952 - 961 /1986//. Для инициирования истечения кальция либо фикоэритрин /PE/-конъюгированный Leu-3A /анти-CD4/ /Beston Dickinson, Lincoln Park NY/ при 1 мкг/мл добавляли к клеточной суспензии, с последующим добавлением 10 мкг/мл неконъюгированного козлиного анти-мышиного IgG во время 0, или неконъюгированные 3G8 /анти-CD16/ моноклональные антитела добавляли к клеточной суспензии при 1 мкг/мл с последующим добавлением 10 мкг/мл PE-конъюгированного Fab2 козлиного анти-мышиного IgG в момент времени 0. Гистограммы отношения фиолетовой/синей эмиссии снимали для популяции РЕ позитивных /инфицированных/ клеток, которые обычно составляли 40 - 80% от всех клеток. Реакцию рецептора T клеточного антигена в неинфицированных клетках включали антителами OKTЗ, без сшивки. Для экспериментов, включавших CD16 химерические рецепторы, образцы, у которых был дрейф базовой линии относительно низшего внутриклеточного кальция /без антител/, исключали из анализа. Затем данные гистограммы анализировали, превращая бинарные данные в ASCII, используя программы Writl Hand Man /Cooper City, FL/, с последующим анализом в коллекции программ FORTRAN. Отношение эмиссий фиолетовой/синей перед добавлением реагентов второго антитела использовали для установления нормального начального отношения, приравнивали его к единице, а остальное пороговое отношение устанавливали таким образом, чтобы 10% оставшейся популяции превышало бы порог.
Клетки сублинии Jurkat E6 /Weiss et al., J. Immunol, 133:123-128 /1984// инфицировали рекомбинантными вирусами вакцины в течение одного часа в не содержащей сыворотки среде IMDM при moi = 10, и инкубировали в течение 3-9 часов в IMDM, 10% FBS. Клетки собирали центрифугированием и повторно суспендировали при 3 • 106 клеток/мл в полной среде, содержащей 1 мМ Indo-1 ацетометоксиэфира /Grynkiewier et al., J. Biol. Chem. 260:3440-3450 /1985/ /Molecular Probes/, и инкубировали при 37oC в течение 45 минут. Клетки с введенным Indo-I таблетировали и повторно суспендировали при 1 • 106 мл в не содержащей сыворотки IMDM, и хранили при комнатной температуре в темноте. Клетки анализировали на содержание свободных ионов кальция при одновременном измерении фиолетовой с синей флюоресценции с помощью цитометрии в потоке /Rabinovitch et al. , J. Immunol, 137:952 - 961 /1986//. Для инициирования истечения кальция либо фикоэритрин /PE/-конъюгированный Leu-3A /анти-CD4/ /Beston Dickinson, Lincoln Park NY/ при 1 мкг/мл добавляли к клеточной суспензии, с последующим добавлением 10 мкг/мл неконъюгированного козлиного анти-мышиного IgG во время 0, или неконъюгированные 3G8 /анти-CD16/ моноклональные антитела добавляли к клеточной суспензии при 1 мкг/мл с последующим добавлением 10 мкг/мл PE-конъюгированного Fab2 козлиного анти-мышиного IgG в момент времени 0. Гистограммы отношения фиолетовой/синей эмиссии снимали для популяции РЕ позитивных /инфицированных/ клеток, которые обычно составляли 40 - 80% от всех клеток. Реакцию рецептора T клеточного антигена в неинфицированных клетках включали антителами OKTЗ, без сшивки. Для экспериментов, включавших CD16 химерические рецепторы, образцы, у которых был дрейф базовой линии относительно низшего внутриклеточного кальция /без антител/, исключали из анализа. Затем данные гистограммы анализировали, превращая бинарные данные в ASCII, используя программы Writl Hand Man /Cooper City, FL/, с последующим анализом в коллекции программ FORTRAN. Отношение эмиссий фиолетовой/синей перед добавлением реагентов второго антитела использовали для установления нормального начального отношения, приравнивали его к единице, а остальное пороговое отношение устанавливали таким образом, чтобы 10% оставшейся популяции превышало бы порог.
Анализ цитолиза
T Клеточную линию WH3 человека, CD8+, CD4- HLA B44 рестриктированную цитолитическую линию выдерживали в IMDM, 10% сыворотке человека со 100U/мл IL-2, и периодически стимулировали либо неспецифически, облученными /1000 рад/ HLA несовместимыми лимфоцитами периферической крови и 1 мкг/мл фитогемагглютинина, либо специфически, облученными B44-содержащими моноядерными клетками. Спустя один день неспецифической стимуляции, PHA разбавляют до 0,5 мкг/мл, добавляя свежую среду, и спустя три дня среду меняют. Клетки выращивают в течение, по крайней мере, 10 дней с последующей стимуляцией перед использованием в анализе на цитотоксичность. Клетки инфицируют рекомбинантной вакциной при умножении инфекции, по крайней мере, 10, в течение одного часа в не содержащей сыворотки среде, с последующим инкубированием в полной среде в течение трех часов. Клетки собирают центрифугированием и повторно суспендируют при плотности 1 • 107 клеток/мл. 100 мкл добавляют в каждую ячейку микротитровальной пластины, содержащую 100 мкл/ячейку полной среды. Клетки разбавляют поэтапно кратно 2. По две ячейки для каждого образца не содержат лимфоцитов, чтобы обеспечить спонтанное высвобождение хрома и определить полный расход хрома. Меченые клетки из сублинии HeLa S3 инфицируют в 6,0 или 10,0 см пластинах при приблизительно moi 10 в течение одного часа в среде, не содержащей сыворотки, с последующим инкубированием в полной среде в течение трех часов. Их удаляют из чашек с помощью PBS, 1 мМ EDTA, и считают. Аликвоты в 10' мишеневых клеток /HeLa, Raji или RJ2.2.5 клетки для экспериментов с CD4 химерическими рецепторами и 3G8 10-2 клетки, Shen et al., Mol. Immunol, 26:959 /1989/ для CD16 химерических рецепторных экспериментов / центрифугируют и повторно суспендируют в 50 мкл стерильного 51Cr-натрийхромата /1 м Кюри/мл, Дюпон, Уилмингтон, DE/ в течение одного часа при 37oC с перемежающимся перемешиванием, затем промывают трижды PBS. 100 мкл меченых клеток снова суспендируют в среде при 105 клеток/мл, которые добавляют в каждую ячейку. Мишеневые клетки Raji и RJ2.2.5 мечены также как и HeLa клетки. Микротитровальные пластины вращают при 750g в течение 1 минуты и инкубируют в течение 4 часов при 37oC. К концу периода инкубирования клетки в каждой из ячеек снова ресуспендируют, осторожно взбалтывая пипеткой, образцы отбирают для определения полного количества включений, а микротитровальные пластины снова вращают при 750g в течение 1 минуты. 100 мкл аликвоты надосадочной жидкости отбирают и считают в сцинтилляционном счетчике гамма лучей. В процент киллинга вносят поправку на долю инфицированных мишеневых клеток /обычно 50 - 90%/ по данным цитометрии в потоке. Для не инфицированных эффекторных клеток отношение эффектор:мишень было исправлено на процент клеток, инфицированных /обычно 20 - 50% для экспериментов с CD4 химерическими рецепторами, и более 70% для экспериментов с CD16 химерическими рецепторами/.
T Клеточную линию WH3 человека, CD8+, CD4- HLA B44 рестриктированную цитолитическую линию выдерживали в IMDM, 10% сыворотке человека со 100U/мл IL-2, и периодически стимулировали либо неспецифически, облученными /1000 рад/ HLA несовместимыми лимфоцитами периферической крови и 1 мкг/мл фитогемагглютинина, либо специфически, облученными B44-содержащими моноядерными клетками. Спустя один день неспецифической стимуляции, PHA разбавляют до 0,5 мкг/мл, добавляя свежую среду, и спустя три дня среду меняют. Клетки выращивают в течение, по крайней мере, 10 дней с последующей стимуляцией перед использованием в анализе на цитотоксичность. Клетки инфицируют рекомбинантной вакциной при умножении инфекции, по крайней мере, 10, в течение одного часа в не содержащей сыворотки среде, с последующим инкубированием в полной среде в течение трех часов. Клетки собирают центрифугированием и повторно суспендируют при плотности 1 • 107 клеток/мл. 100 мкл добавляют в каждую ячейку микротитровальной пластины, содержащую 100 мкл/ячейку полной среды. Клетки разбавляют поэтапно кратно 2. По две ячейки для каждого образца не содержат лимфоцитов, чтобы обеспечить спонтанное высвобождение хрома и определить полный расход хрома. Меченые клетки из сублинии HeLa S3 инфицируют в 6,0 или 10,0 см пластинах при приблизительно moi 10 в течение одного часа в среде, не содержащей сыворотки, с последующим инкубированием в полной среде в течение трех часов. Их удаляют из чашек с помощью PBS, 1 мМ EDTA, и считают. Аликвоты в 10' мишеневых клеток /HeLa, Raji или RJ2.2.5 клетки для экспериментов с CD4 химерическими рецепторами и 3G8 10-2 клетки, Shen et al., Mol. Immunol, 26:959 /1989/ для CD16 химерических рецепторных экспериментов / центрифугируют и повторно суспендируют в 50 мкл стерильного 51Cr-натрийхромата /1 м Кюри/мл, Дюпон, Уилмингтон, DE/ в течение одного часа при 37oC с перемежающимся перемешиванием, затем промывают трижды PBS. 100 мкл меченых клеток снова суспендируют в среде при 105 клеток/мл, которые добавляют в каждую ячейку. Мишеневые клетки Raji и RJ2.2.5 мечены также как и HeLa клетки. Микротитровальные пластины вращают при 750g в течение 1 минуты и инкубируют в течение 4 часов при 37oC. К концу периода инкубирования клетки в каждой из ячеек снова ресуспендируют, осторожно взбалтывая пипеткой, образцы отбирают для определения полного количества включений, а микротитровальные пластины снова вращают при 750g в течение 1 минуты. 100 мкл аликвоты надосадочной жидкости отбирают и считают в сцинтилляционном счетчике гамма лучей. В процент киллинга вносят поправку на долю инфицированных мишеневых клеток /обычно 50 - 90%/ по данным цитометрии в потоке. Для не инфицированных эффекторных клеток отношение эффектор:мишень было исправлено на процент клеток, инфицированных /обычно 20 - 50% для экспериментов с CD4 химерическими рецепторами, и более 70% для экспериментов с CD16 химерическими рецепторами/.
In vitro мутагенез Z последовательности
Для создания точечных мутаций в аминокислотных остатках 11 и/или 15Z последовательности, были получены синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от BamHI сайта в обратном направлении от Z трансмембранного домена, и превращающие нативный Z остаток 11 от Cys в Gly /C11G/ или остаток 15 от Asp в Gly /D15G/ или оба /C11G /D15G/, и используют в PCR реакциях для создания мутированных фрагментов, которые снова вставлены в дикого типа CD4: Z конструкции.
Для создания точечных мутаций в аминокислотных остатках 11 и/или 15Z последовательности, были получены синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от BamHI сайта в обратном направлении от Z трансмембранного домена, и превращающие нативный Z остаток 11 от Cys в Gly /C11G/ или остаток 15 от Asp в Gly /D15G/ или оба /C11G /D15G/, и используют в PCR реакциях для создания мутированных фрагментов, которые снова вставлены в дикого типа CD4: Z конструкции.
Для создания Z делеций, Z ДНК последовательности амплифицируют PCR, используя синтетические олигонуклеотидные праймеры, сконструированные для создания стоп кодона /UAG/ после остатка 50, 59 или 65. Праймеры, содержащие сайты расщепления для энзима Notl, вырезают 5 или 6 остатков с 5' конца, обычно в последовательности CGC GGG CGG CCG CTA /SEQ ID N0: 11/, где последние три остатка соответствуют стоп антикодону. За последовательностями Notl и стоп антикодона следуют 18 или более остатков, комплементарных целевому 3' концу фрагмента. Полученные химеры обозначены CD16:Z V51*, CD16:Z E60* и CD16:Z D66*, соответственно. BamHI сайт в обратном направлении от трансмембранного домена и Notl сайт используют для создания фрагментов, которые заново вводят в дикого типа CD16:Z конструкцию. Мономерные Z химеры создают, высвобождая Z трансмембранную и мембранную проксимальную внутриклеточные последовательности перевариванием BamHI и Sacl Asp- и Cys- CD4:Z конструкцию, описанную ранее, и включая фрагмент в CD16:Z E60* и CD16:Z D66* конструкции соответственно.
CD16: 7:Z /48-65/ и CD16:7:Z /48-59/ химерические конструкции, состоящие из трех частей.
Для получения конструкции CD16:Z D66*, Z кДНК последовательность, соответствующую трансмембранному домену, и последующих остатков цитоплазмического домена заменяют соответствующими трансмембранным и цитоплазмическим доменом, полученными из CD5 и CD7 кДНК. Фрагменты CD5 и CD7 создают в PCR реакции, используя форвардные олигонуклеотиды, включающие BamHI рестрикционный сайт расщепления и соответствующие участку непосредственно перед трансмембранным доменом CD5 и CD7, соответственно, с последующим обратным олигонуклеотидным перекрыванием CD5 и CD7 последовательностей, соответственно, и Z последовательности, которая содержит Sacl рестрикционный сайт расщепления.
CD5: Z: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG /SEQ ID N0: 12/
CD7: Z: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTC GTT TGG CGC CGA ATT CTT ATC CCG /SEQ ID N0: 13/.
CD7: Z: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTC GTT TGG CGC CGA ATT CTT ATC CCG /SEQ ID N0: 13/.
CD5 и CD7 PCR продукты были переварены BamHI и Sacl и лигированы с BamHI и Sacl переваренными CD16:Z E60*, и заменяют Z последовательность из BamHI до Sacl фрагментом CD7. Для создания конструкций CD16:CD5 и CD16:CD17, фрагменты CD5 и CD7 были получены с помощью PCR, используя олигонуклеотиды, содержащие Notl рестрикционный сайт расщепления и кодирующий стоп кодон /UAA/ после остатка Gln416 и Ala193 CD5 и CD7, соответственно, CD5 и CD7 PCR фрагменты были переварены BamHI и Notl и включены в CD16:Z Asp66* конструкцию.
In vitro мутагенез N-терминальных остатков с Z цитолитическим сигнальным фрагментом трансдукции
Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от Sacl сайта внутрь Z фрагмента и превращающие нативный остаток 48 из Asn в Ser /48S/, остаток 50 из Leu в Ser /LS 50S/, и остаток 51 из Туг в Phe /V52F/ были синтезированы и использованы в PCR реакции для создания фрагментов, которые снова включили в дикого типа CD16:7:Z /48-65/ конструкцию.
Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от Sacl сайта внутрь Z фрагмента и превращающие нативный остаток 48 из Asn в Ser /48S/, остаток 50 из Leu в Ser /LS 50S/, и остаток 51 из Туг в Phe /V52F/ были синтезированы и использованы в PCR реакции для создания фрагментов, которые снова включили в дикого типа CD16:7:Z /48-65/ конструкцию.
In vitro мутагенез C-терминальных остатков с Z цитолитическим сигнальным фрагментом трансдукции
Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от Notl сайта 3' до стоп кодона и превращающие нативный остаток 60 из Glu в Gln /E60Q/, остаток 61 от Glu в Gln /E61Q/, остаток 62 из Tyr в Phe /V62F или V62S/, и остаток 63 из Asp в An /D63N/ были синтезированы и использованы для создания фрагментов, которые были субклонированы в дикого типа CD16:Z D66* конструкцию от BamHI сайта до Notl сайта.
Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от Notl сайта 3' до стоп кодона и превращающие нативный остаток 60 из Glu в Gln /E60Q/, остаток 61 от Glu в Gln /E61Q/, остаток 62 из Tyr в Phe /V62F или V62S/, и остаток 63 из Asp в An /D63N/ были синтезированы и использованы для создания фрагментов, которые были субклонированы в дикого типа CD16:Z D66* конструкцию от BamHI сайта до Notl сайта.
CD16: 7: Z /33-65/, CD16:7:Z /71-104/, CD16:7:Z /104-137/ химерические конструкции
CD7 трансмембранный фрагмент, содержащий Mlul и Notl сайты по соединению между трансмембранным и внутриклеточным доменами, был получен в результате PCR с использованием олигонуклеотида со следующей последовательностью: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA /SEQ ID N0: 14/. Полученный PCR фрагмент был переварен BamHI и Notl и снова включен в CD16:7:Z /48-65/ конструкцию. Z фрагменты, кодирующие остатки 33-65, 71-104 и 104-137, получают в результате реакции PCR, с использованием пар драйверов, содержащих Mlul сайты у 5' конца форвардных праймеров и стоп кодоны с последующими Notl сайтами у 5' конца обратных праймеров. В каждом случае рестрикционные сайты были включены на шесть остатков от 5' конца праймера для обеспечения расщепления рестрикционным энзимом.
CD7 трансмембранный фрагмент, содержащий Mlul и Notl сайты по соединению между трансмембранным и внутриклеточным доменами, был получен в результате PCR с использованием олигонуклеотида со следующей последовательностью: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA /SEQ ID N0: 14/. Полученный PCR фрагмент был переварен BamHI и Notl и снова включен в CD16:7:Z /48-65/ конструкцию. Z фрагменты, кодирующие остатки 33-65, 71-104 и 104-137, получают в результате реакции PCR, с использованием пар драйверов, содержащих Mlul сайты у 5' конца форвардных праймеров и стоп кодоны с последующими Notl сайтами у 5' конца обратных праймеров. В каждом случае рестрикционные сайты были включены на шесть остатков от 5' конца праймера для обеспечения расщепления рестрикционным энзимом.
S33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID N0: 15),
S71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ IS N0: 16);
S104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID N0: 17).
S71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ IS N0: 16);
S104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID N0: 17).
Конструирование FcR 11A делеционных мутантов
Карбоксильные терминальные FcR 11A делеционные мутанты были сконструированы в результате PCR таким же способом, как и для полной длины конструкций, превращая последовательности, кодирующие тирозин, в положении 282 и 298 в стоп кодоны /TAA/. N-терминальные делеции были созданы за счет амплификации фрагментов, кодирующих последовательно без внутриклеточного домена за счет PCR, с использованием олигонуклеотидов, которые позволяют включать полученные фрагменты между Mlul и Notl рестрикционными сайтами в ранее сконструированные плазмиды экспрессии, кодирующие CD16 внеклеточный домен, слитый с CD7 трансмембранным доменом, причем последний оканчивается в Mlul сайте и соединяет трансмембранный и внутриклеточный домены.
Карбоксильные терминальные FcR 11A делеционные мутанты были сконструированы в результате PCR таким же способом, как и для полной длины конструкций, превращая последовательности, кодирующие тирозин, в положении 282 и 298 в стоп кодоны /TAA/. N-терминальные делеции были созданы за счет амплификации фрагментов, кодирующих последовательно без внутриклеточного домена за счет PCR, с использованием олигонуклеотидов, которые позволяют включать полученные фрагменты между Mlul и Notl рестрикционными сайтами в ранее сконструированные плазмиды экспрессии, кодирующие CD16 внеклеточный домен, слитый с CD7 трансмембранным доменом, причем последний оканчивается в Mlul сайте и соединяет трансмембранный и внутриклеточный домены.
Другие варианты
Описанные ранее примеры демонстрируют тот факт, что аггрегации Z, η или γ химер могут инициировать цитолитическую эффекторную клеточную реакцию в T клетках. Известный интервал экспрессии Z, η и γ , который включает T лимфоциты, природные киллерные клетки, базофильные гранулоциты, макрофаги и мест-клетки, предполагает, что сохраненные фрагменты последовательности могут взаимодействовать с сенсорным аппаратом, общим для клеток кроветворного происхождения, и что важный компонент защиты хозяина в иммунной системе может быть передан посредством рецепторной аггрегации.
Описанные ранее примеры демонстрируют тот факт, что аггрегации Z, η или γ химер могут инициировать цитолитическую эффекторную клеточную реакцию в T клетках. Известный интервал экспрессии Z, η и γ , который включает T лимфоциты, природные киллерные клетки, базофильные гранулоциты, макрофаги и мест-клетки, предполагает, что сохраненные фрагменты последовательности могут взаимодействовать с сенсорным аппаратом, общим для клеток кроветворного происхождения, и что важный компонент защиты хозяина в иммунной системе может быть передан посредством рецепторной аггрегации.
Потенция цитолитической реакции и отсутствие реакции на мишеневые клетки, содержащие МНС класса II рецепторы, демонстрирует тот факт, что химеры на основе Z, η и γ создают основу для генетической интервенции для AIDS за счет адаптационной иммунотерапии. Широкое распределение эндогенных Z и η и доказательство того, что Fc рецепторы, связанные с γ передаваемой токсичностью в различных типах клеток /Fanger et al., Immunol, Today, 10: 92-99 /1989//, позволяет рассматривать для этой цели различные клетки. Так, например, нейтрофильные гранулоциты, которые имеют очень короткий срок полужизни /примерно 4 часа/ в циркуляции, и являются интенсивно цитолитическими, представляют привлекательные мишеневые клетки для экспрессии химер. Инфекция нейтрофилов HIV, по-видимому, не приводит к высвобождению вируса, и обилие этих клеток /наиболее превалирующие из лейкоцитов/ должно облегчить защиту хозяина. Другой привлекательной возможностью для клеток хозяина являются зрелые T клетки, популяция в настоящее время доступная для конструирования ретровирусов /Rosenberg, S.A. Sci. Am. 262:62-69 /1990//. С целью рекомбинации IL-2. Популяции T клеток можно размножить в культуре с относительной легкостью, и размноженная популяция обычно имеет ограниченный период полужизни /Rosenberg et al., N. England J. Med. 323:570-578 /1990//.
В соответствующих условиях HIV узнавание клетками, экспрессирующими CD4 химеры, должно также обеспечивать митогенный стимул, который предоставляет возможность популяции клеток с плечами динамично реагировать на вирусное поражение. Хотя мы сфокусировали внимание на поведении протеинов слияния в цитолитических T лимфоцитах, экспрессия химер в хелперные лимфоциты может обеспечить HIV-мобилизованный источник цитокинов, которые могут противодействовать коллапсу субсета хелперных клеток в AIDS. Недавнее описание нескольких схем конструирования устойчивости к инфекции на стадиях, отличных от проникновения вируса /Friedman et al., Nature 335; 452-454 (1988); Green et al., Cell, 58:215-223 (1989); Malim et al., Cell 58:205-214 (1989); Trono et al. , Cell 59:113-120 (1989); Buonocore et al., Nature, 345:625-628 (1990), предполагает, что клетки, содержащие CD4 химеры, можно сконструировать, и что они могут помешать продуцированию вирусов за счет экспрессии соответствующих агентов, содержащих внутриклеточный сайт действия.
Способность передавать сигналы T лимфоцитам через автономные химеры также обеспечивает способность для регуляции ретровирусно созданных лимфоцитов in vivo. Сшивая стимулы посредством, например, специфических IgM антител, сконструированных для удаления комплемент-связывающих доменов, можно дать возможность таким лимфоцитам увеличить свое количество in situ, тогда как обработкой аналогичными специфическими IgG антителами /например, распознавая аминокислотные варианты, созданные в химерической цепи/, можно селективно исчерпать сконструированную популяцию.
Кроме того, анти-CD4 IgM антитела не требуют дополнительной сшивки для мобилизации кальция в Jurkat клетках, экспрессирующих CD4:Z химеры /данные не представлены/. Способность регулировать клеточную популяцию без обращения в повторной экстракорпореальной амплификации может существенно расширить круг и эффективность текущих применений, предполагаемых для генетического конструирования T клеток.
Для создания других химер, содержащих Z, η или γ внутриклеточные последовательности, кДНК или геномные последовательности, кодирующие внеклеточный домен рецептора, можно обеспечить рестрикционным сайтом, вводимым в локус, как раз предшествующий выбранному трансмембранному домену. Фрагмент внеклеточного домена, заканчивающий его в рестрикционном сайте, можно затем соединить с Z, η или γ последовательностями. Типичные внеклеточные домены можно получить из рецепторов, которые распознают комплемент, углеводороды, вирусные протеины, бактерии, простейшие или metazoan паразиты, или продуцируемые ими протеины. Аналогично, лиганды или рецепторы, экспрессируемые патогенами или опухолевыми клетками, можно присоединить к Z, η или γ последовательностям для направления иммунной реакции против клеток, содержащих рецепторы, распознающие эти лиганды.
Хотя изобретение было описано в связи с его специфическими воплощениями, следует учитывать, что его можно в дальнейшем модифицировать, и такие применения должны охватывать варианты, использования или адаптации настоящего изобретения и включать такие отклонения от настоящего раскрытия, которые могут придти в голову специалистам, которым это изобретение предназначено, и как могут быть использованы его отличительные черты, изложенные ранее, как следует из объема прилагаемой формулы изобретения.
ПЕРЕЧИСЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
(2) Информация для последовательности N 1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) длина: 1728 пар оснований
(B) тип: нуклеиновая кислота
(C) тип цепей: двойная
(D) топология: линейная
(ii) тип молекулы: ДНК (геномная)
(iii) Описание последовательности: SEQ ID N0: 1:
(2) Информация для последовательности N 1:
(i) Характеристики последовательности:
(A) длина: 1728 пар оснований
(B) тип: нуклеиновая кислота
(C) тип цепей: двойная
(D) топология: линейная
(ii) тип молекулы: ДНК (геномная)
(iii) Описание последовательности: SEQ ID N0: 1:
Claims (32)
1. Способ направления клеточного иммунного ответа на инфекционный агент, на клетку, инфицированную указанным агентом, на опухолевую или малигнизированную клетку или на аутоиммунно направленную клетку у млекопитающего, отличающийся тем, что включает введение указанному млекопитающему эффективного количества трансформированных иммунокомпетентных клеток, причем указанные клетки экспрессируют белковый химерный рецептор, связанный с мембраной, причем указанный рецептор содержит (а) внеклеточную часть, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида CD3, ζ или η Т-клеточного рецептора, которая обладает способностью передавать указанной клетке сигнал на разрушение клетки-мишени, связанной с рецептором, или инфекционного агента-мишени, связанного с рецептором.
2. Способ по п. 1, где указанный рецепторный белок представляет собой CD3-дельта.
3. Способ по п. 1, где указанный рецепторный белок представляет собой Т3-гамма.
4. Способ по п.1, где указанный химерный рецептор включает аминокислоты, приведенные в графической части.
5. Способ по п.1, где указанные трансформированные клетки выбирают из группы, состоящей из: (а) Т-лимфоцитов, (b) цитотоксических Т-лимфоцитов, (с) натуральных киллеров, (d) нейтрофилов, (е) гранулоцитов, (f) макрофагов, (g) тучных клеток, (h) клеток HeLa и (i) эмбриональных стволовых клеток (ES).
6. Способ по п.5, где указанные цитотоксические Т-лимфоциты представляют собой CD8+-цитотоксические Т-лимфоциты.
7. Способ по пп.1, 2 или 3, где указанный инфекционный агент представляет собой вирус иммунодефицита.
8. Способ по п.7, где указанная внеклеточная часть включает участок CD4, связывающийся с оболочкой ВИЧ, или его функциональное производное, связывающееся с оболочкой ВИЧ.
9. Способ направления клеточного иммунного ответа на инфекционный агент, на клетку, инфицированную указанным агентом, на опухолевую или малигнизированную клетку или на аутоиммунно направленную клетку у млекопитающего, отличающийся тем, что включает введение указанному млекопитающему эффективного количества трансформированных иммунокомпетентных клеток, причем клетки экспрессируют белковый химерный рецептор, связанный с мембраной, причем указанный рецептор включает (а) внеклеточную часть, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида В-клеточного рецептора, которая обладает способность передавать указанной клетке сигнал на разрушение клетки-мишени, связанной с рецептором, или инфекционного агента-мишени, связанного с рецептором.
10. Способ по п.9, где указанный рецепторный белок представляет собой mb1.
11. Способ по п.9, где указанный рецепторный белок представляет собой В29.
12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанный химерный рецептор включает аминокислоты, приведенные в графической части.
13. Способ по п.9, где указанные трансформированные клетки выбирают из группы, состоящей из: (а) Т-лимфоцитов, (b) цитотоксических Т-лимфоцитов, (с) натуральных киллеров, (d) нейтрофилов, (е) гранулоцитов, (f) макрофагов, (g) тучных клеток, (h) клеток HeLa и (i) эмбриональных стволовых клеток (ES).
14. Способ по п.13, где указанные цитотоксические Т-лимфоциты представляют собой CD8+-цитотоксические Т-лимфоциты.
15. Способ по п.9, где указанный инфекционный агент представляет собой вирус иммунодефицита.
16. Способ по п.15, где указанная внеклеточная часть включает участок CD4, связывающийся с оболочкой ВИЧ, или его функциональное производное, связывающееся с оболочкой ВИЧ.
17. Способ направления клеточного иммунного ответа на инфекционный агент, на клетку, инфицированную указанным агентом, на опухолевую или малигнизированную клетку или на аутоиммунно направленную клетку у млекопитающего, отличающийся тем, что включает введение указанному млекопитающему эффективного количества трансформированных иммунокомпетентных клеток, причем клетки экспрессируют белковый химерный рецептор, связанный с мембраной, причем указанный рецептор включает (а) внеклеточную часть, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида Fc-рецептора, которая обладает способность передавать указанной клетке сигнал на разрушение клетки-мишени, связанной с рецептором, или инфекционного агента-мишени, связанного с рецептором.
18. Способ по п.17, где указанный рецепторный белок представляет собой гамма-Fc-рецептор.
19. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанный химерный рецептор включает аминокислоты, приведенные в графической части.
20. Способ по п.17, где указанные трансформированные клетки выбирают из группы, состоящей из: (а) Т-лимфоцитов, (b) цитотоксических Т-лимфоцитов, (с) натуральных киллеров, (d) нейтрофилов, (е) гранулоцитов, (f) макрофагов, (g) тучных клеток, (h) клеток HeLa и (i) эмбриональных стволовых клеток (ES).
21. Способ по п.20, где указанные цитотоксические Т-лимфоциты представляют собой CD8+-цитотоксические Т-лимфоциты.
22. Способ по п.17, где указанный инфекционный агент представляет собой вирус иммунодефицита.
23. Способ по п.22, где указанная внеклеточная часть включает участок CD4, связывающийся с оболочкой ВИЧ, или его функциональное производное, связывающееся с оболочкой ВИЧ.
24. Вещество, включающее дезоксирибонуклеиновую кислоту, кодирующую химерный рецептор, включающий (а) внеклеточную часть, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень, и представляющая собой CD4 или CD16, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида CD3, ζ или η Т-клеточного рецептора, которая обладает способностью передавать указанной клетке сигнал на разрушение клетки-мишени, связанной с рецептором, или инфекционного агента-мишени, связанного с рецептором, причем указанная часть включает последовательность, приведенную в графической части.
25. Вещество, включающее дезоксирибонуклеиновую кислоту, колирующую химерный рецептор, включающий (а) внеклеточную часть, которая обладает способность специфически распознавать и связывать клетку-мишень, или инфекционный агент-мишень, и представляющая собой CD4 или CD16, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида В-клеточного рецептора, которая обладает способностью передавать указанной клетке сигнал на разрушение клетки-мишени, связанной с рецептором, или инфекционного агента-мишени, связанного с рецептором, причем указанная часть включает последовательность, приведенную в графической части.
26. Вещество, включающее дезоксирибонуклеиновую кислоту, кодирующую химерный рецептор, включающий (а) внеклеточную часть, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень, и представляющая сбой CD4 или CD16, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида Fc-рецептора, которая обладает способностью передавать указанной клетке сигнал на разрушение клетки-мишени, связанной с рецептором, или инфекционного агента-мишени, связанного с рецептором, причем указанная часть включает последовательность, приведенную в графической части.
27. Вектор, сконструированный на основе вакцинного штамма MR и содержащий ДНК, охарактеризованную в п.24.
28. Вектор, сконструированный на основе вакцинного штамма WR и содержащий ДНК, охарактеризованную в п.25.
29. Вектор, сконструированный на основе вакцинного штамма WR и содержащий ДНК, охарактеризованную в п.26.
30. Способ лечения ВИЧ-инфекции, включающий введение млекопитающему эффективного количества трансформированных иммунокомпетентных клеток, отличающийся тем, что указанные клетки экспрессируют белковый химерный рецептор, связанный с мембраной, причем указанный рецептор включает (а) внеклеточную часть, включающую CD4, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать ВИЧ или ВИЧ-инфицированную клетку, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида CD3, ζ или η Т-клеточного рецептора, которая обладает способность передавать указанной клетке сигнал на разрушение указанного ВИЧ или указанной ВИЧ-инфицированной клетки.
31. Способ лечения ВИЧ-инфекции, включающий введение млекопитающему эффективного количества трансформированных иммунокомпетентных клеток, отличающийся тем, что указанные клетки экспрессируют белковый химерный рецептор, связанный с мембраной, причем указанный рецептор включает (а) внеклеточную часть, включающую CD4, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать ВИЧ или ВИЧ-инфицированную клетку, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида В-клеточного рецептора, которая обладает способностью передавать указанной клетке сигнал на разрушение указанного ВИЧ или указанной ВИЧ-инфицированной клетки.
32. Способ лечения ВИЧ-инфекции, включающий введение млекопитающему эффективного количества трансформированных иммунокомпетентных клеток, отличающийся тем, что указанные клетки экспрессируют белковый химерный рецептор, связанный с мембраной, причем указанный рецептор включает (а) внеклеточную часть, включающую CD4, которая обладает способностью специфически распознавать и связывать ВИЧ или ВИЧ-инфицированную клетку, и (b) внутриклеточную или трансмембранную часть, происходящую из полипептида Fc-рецептора, которая обладает способностью передавать указанной клетке сигнал на разрушение указанного ВИЧ или указанной ВИЧ-инфицированной клетки.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US66596191A | 1991-03-07 | 1991-03-07 | |
US07/665,961 | 1991-03-07 | ||
US07/665961 | 1991-03-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU93055035A RU93055035A (ru) | 1996-05-10 |
RU2161044C2 true RU2161044C2 (ru) | 2000-12-27 |
Family
ID=24672250
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93055035/13A RU2161044C2 (ru) | 1991-03-07 | 1992-03-06 | Способ направления (индукции) иммунного ответа, днк, вектор, способ лечения |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0574512B1 (ru) |
JP (1) | JP3696232B2 (ru) |
KR (1) | KR100257780B1 (ru) |
AT (1) | ATE232107T1 (ru) |
AU (2) | AU662136B2 (ru) |
BR (1) | BR9205736A (ru) |
CA (1) | CA2104957C (ru) |
CZ (1) | CZ281881B6 (ru) |
DE (1) | DE69232921T2 (ru) |
DK (1) | DK0574512T3 (ru) |
ES (1) | ES2191006T3 (ru) |
FI (1) | FI117900B (ru) |
HK (1) | HK1011935A1 (ru) |
HU (1) | HU218732B (ru) |
IE (1) | IE920716A1 (ru) |
IL (1) | IL101147A (ru) |
MX (1) | MX9201002A (ru) |
NO (1) | NO317202B1 (ru) |
NZ (1) | NZ241855A (ru) |
PT (1) | PT100207B (ru) |
RU (1) | RU2161044C2 (ru) |
SK (1) | SK283643B6 (ru) |
UA (1) | UA41870C2 (ru) |
WO (1) | WO1992015322A1 (ru) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2653761C2 (ru) * | 2012-04-30 | 2018-05-14 | Те Трастиз Оф Дартмут Колидж | Композиции т-клеток с недостаточностью рецепторов т-клеток |
RU2700765C2 (ru) * | 2012-08-20 | 2019-09-19 | Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер | Способ и композиции для клеточной иммунотерапии |
US10570198B2 (en) | 2010-10-22 | 2020-02-25 | Novartis Ag | Stable and soluble antibodies |
RU2725807C2 (ru) * | 2014-12-08 | 2020-07-06 | 1Глоуб Байомедикал Ко., Лтд. | Растворимый универсальный усиливающий adcc синтетический слитный ген, пептидная технология и их применение |
RU2781979C2 (ru) * | 2012-04-30 | 2022-10-21 | Те Трастиз Оф Дартмут Колидж | Композиции т-клеток с недостаточностью рецепторов т-клеток |
Families Citing this family (133)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE145428T1 (de) * | 1990-12-14 | 1996-12-15 | Cell Genesys Inc | Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen |
US6319494B1 (en) | 1990-12-14 | 2001-11-20 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways |
US6407221B1 (en) | 1990-12-14 | 2002-06-18 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways |
US6004811A (en) * | 1991-03-07 | 1999-12-21 | The Massachussetts General Hospital | Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras |
US7049136B2 (en) | 1991-03-07 | 2006-05-23 | The General Hospital Corporation | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras |
US5912170A (en) | 1991-03-07 | 1999-06-15 | The General Hospital Corporation | Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras |
US5851828A (en) | 1991-03-07 | 1998-12-22 | The General Hospital Corporation | Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells |
US5843728A (en) * | 1991-03-07 | 1998-12-01 | The General Hospital Corporation | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras |
US6753162B1 (en) | 1991-03-07 | 2004-06-22 | The General Hospital Corporation | Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells |
US8211422B2 (en) | 1992-03-18 | 2012-07-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric receptor genes and cells transformed therewith |
IL104570A0 (en) | 1992-03-18 | 1993-05-13 | Yeda Res & Dev | Chimeric genes and cells transformed therewith |
CZ291754B6 (cs) * | 1993-07-16 | 2003-05-14 | The General Hospital Corporation | Proteinový chimerní receptor, terapeutická buňka, DNA kódující chimerní receptor a vektor |
WO1995026985A1 (en) * | 1994-04-05 | 1995-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modified receptors that continuously signal |
AU694222B2 (en) | 1994-05-02 | 1998-07-16 | Bernd Groner | Bifunctional protein, preparation and use |
US7354587B1 (en) | 1994-07-06 | 2008-04-08 | Immunomedics, Inc. | Use of immunoconjugates to enhance the efficacy of multi-stage cascade boosting vaccines |
US5798100A (en) * | 1994-07-06 | 1998-08-25 | Immunomedics, Inc. | Multi-stage cascade boosting vaccine |
CN1142941C (zh) * | 1994-08-02 | 2004-03-24 | 杰纳勒尔医疗公司 | 带cd4引诱物受体的细胞以及相关分子和方法 |
US5741899A (en) * | 1995-02-02 | 1998-04-21 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric receptors comprising janus kinase for regulating cellular pro liferation |
US6103521A (en) * | 1995-02-06 | 2000-08-15 | Cell Genesys, Inc. | Multispecific chimeric receptors |
EP0871495B1 (en) * | 1995-02-24 | 2005-06-15 | The General Hospital Corporation | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras |
US5916771A (en) * | 1996-10-11 | 1999-06-29 | Abgenix, Inc. | Production of a multimeric protein by cell fusion method |
US6420140B1 (en) | 1996-10-11 | 2002-07-16 | Abgenix, Inc. | Production of multimeric protein by cell fusion method |
CN1183968C (zh) * | 1996-10-23 | 2005-01-12 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 改良疫苗 |
CA2311574A1 (en) | 1997-12-02 | 1999-06-10 | Medarex, Inc. | Cells expressing anti-fc receptor binding components |
GB9809658D0 (en) * | 1998-05-06 | 1998-07-01 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological products |
US7723111B2 (en) | 2001-03-09 | 2010-05-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Activated dual specificity lymphocytes and their methods of use |
US9481878B2 (en) | 2004-02-13 | 2016-11-01 | Immunomedics, Inc. | Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity |
US7901680B2 (en) | 2005-10-19 | 2011-03-08 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Dock-and-lock (DNL) vaccines for cancer therapy |
US8652484B2 (en) | 2004-02-13 | 2014-02-18 | Immunomedics, Inc. | Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting |
US8562988B2 (en) | 2005-10-19 | 2013-10-22 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Strategies for improved cancer vaccines |
US8551480B2 (en) | 2004-02-13 | 2013-10-08 | Immunomedics, Inc. | Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity |
US8435539B2 (en) | 2004-02-13 | 2013-05-07 | Immunomedics, Inc. | Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting |
US7994298B2 (en) | 2004-09-24 | 2011-08-09 | Trustees Of Dartmouth College | Chimeric NK receptor and methods for treating cancer |
IL286053B2 (en) | 2005-10-18 | 2023-03-01 | Nat Jewish Health | A process for making red blood cells using immortal hematopoietic stem cells and erythropoietin |
KR20170078862A (ko) | 2008-05-16 | 2017-07-07 | 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 | 항체 및 그 제조 방법 |
EP3916010A1 (en) | 2008-08-28 | 2021-12-01 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Modulators of myc, methods of using the same and methods of identifying agents that modulate myc |
US9181527B2 (en) | 2009-10-29 | 2015-11-10 | The Trustees Of Dartmouth College | T cell receptor-deficient T cell compositions |
BR122021026169B1 (pt) | 2010-12-09 | 2023-12-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Uso de uma célula |
US9833476B2 (en) | 2011-08-31 | 2017-12-05 | The Trustees Of Dartmouth College | NKP30 receptor targeted therapeutics |
WO2013169691A1 (en) | 2012-05-07 | 2013-11-14 | Trustees Of Dartmouth College | Anti-b7-h6 antibody, fusion proteins, and methods of using the same |
EP3868387A1 (en) | 2012-07-20 | 2021-08-25 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment |
RU2019137208A (ru) | 2013-02-20 | 2020-02-19 | Новартис Аг | ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII |
ES2814962T3 (es) | 2013-02-20 | 2021-03-29 | Novartis Ag | Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123 |
US10272115B2 (en) | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
EP3623380A1 (en) | 2013-03-15 | 2020-03-18 | Michael C. Milone | Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy |
TWI654206B (zh) | 2013-03-16 | 2019-03-21 | 諾華公司 | 使用人類化抗-cd19嵌合抗原受體治療癌症 |
US10801070B2 (en) | 2013-11-25 | 2020-10-13 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer |
US11725237B2 (en) | 2013-12-05 | 2023-08-15 | The Broad Institute Inc. | Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data |
RU2714902C2 (ru) | 2013-12-19 | 2020-02-20 | Новартис Аг | Химерные рецепторы антигена против мезотелина человека и их применение |
JP6793902B2 (ja) | 2013-12-20 | 2020-12-02 | ノバルティス アーゲー | 調節可能キメラ抗原受容体 |
CN106456724A (zh) | 2013-12-20 | 2017-02-22 | 博德研究所 | 使用新抗原疫苗的联合疗法 |
US11028143B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-06-08 | Novartis Ag | Enhanced antigen presenting ability of RNA CAR T cells by co-introduction of costimulatory molecules |
KR20240042250A (ko) | 2014-04-07 | 2024-04-01 | 노파르티스 아게 | 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 |
MX2017001011A (es) | 2014-07-21 | 2018-05-28 | Novartis Ag | Tratamiento de cancer de usando un receptor quimerico de antigeno anti-bcma. |
US11542488B2 (en) | 2014-07-21 | 2023-01-03 | Novartis Ag | Sortase synthesized chimeric antigen receptors |
CN107109419B (zh) | 2014-07-21 | 2020-12-22 | 诺华股份有限公司 | 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症 |
RU2741120C2 (ru) | 2014-07-21 | 2021-01-22 | Новартис Аг | Лечение рака с использованием химерного антигенного рецептора cll-1 |
SG11201700770PA (en) | 2014-08-19 | 2017-03-30 | Novartis Ag | Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment |
US10577417B2 (en) | 2014-09-17 | 2020-03-03 | Novartis Ag | Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy |
JP6815992B2 (ja) | 2014-10-08 | 2021-01-20 | ノバルティス アーゲー | キメラ抗原受容体療法に対する治療応答性を予測するバイオマーカーおよびその使用 |
EP3234130B1 (en) | 2014-12-19 | 2020-11-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods for profiling the t-cell- receptor repertoire |
EP3234193B1 (en) | 2014-12-19 | 2020-07-15 | Massachusetts Institute of Technology | Molecular biomarkers for cancer immunotherapy |
IL303247A (en) | 2014-12-29 | 2023-07-01 | Novartis Ag | Methods for preparing cells expressing a chimeric receptor antigen |
WO2016115482A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-07-21 | Novartis Pharma Ag | Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor |
WO2016126608A1 (en) | 2015-02-02 | 2016-08-11 | Novartis Ag | Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof |
MX2017012939A (es) | 2015-04-08 | 2018-05-22 | Novartis Ag | Terapias cd20, terapias cd22 y terapias de combinacion con una celula que expresa un receptor quimerico de antigeno (car) de cd19. |
US11896614B2 (en) | 2015-04-17 | 2024-02-13 | Novartis Ag | Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells |
TWI806815B (zh) | 2015-05-20 | 2023-07-01 | 美商博德研究所有限公司 | 共有之gata3相關之腫瘤特異性新抗原 |
WO2016205749A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
US11059880B2 (en) | 2015-06-30 | 2021-07-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Redirected cells with MHC chimeric receptors and methods of use in immunotherapy |
WO2017015427A1 (en) | 2015-07-21 | 2017-01-26 | Novartis Ag | Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells |
US11667691B2 (en) | 2015-08-07 | 2023-06-06 | Novartis Ag | Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins |
JP6905163B2 (ja) | 2015-09-03 | 2021-07-21 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | サイトカイン放出症候群を予測するバイオマーカー |
US20190255107A1 (en) | 2015-10-09 | 2019-08-22 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Modulation of novel immune checkpoint targets |
WO2017075465A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3 |
WO2017075478A2 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by use of immune cell gene signatures |
WO2017075451A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1 |
WO2017087708A1 (en) | 2015-11-19 | 2017-05-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity |
CN109069597A (zh) | 2015-12-22 | 2018-12-21 | 诺华股份有限公司 | 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗 |
US11549099B2 (en) | 2016-03-23 | 2023-01-10 | Novartis Ag | Cell secreted minibodies and uses thereof |
WO2017184590A1 (en) | 2016-04-18 | 2017-10-26 | The Broad Institute Inc. | Improved hla epitope prediction |
WO2018035364A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | The Broad Institute Inc. | Product and methods useful for modulating and evaluating immune responses |
US20190262399A1 (en) | 2016-09-07 | 2019-08-29 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses |
CN117866991A (zh) | 2016-10-07 | 2024-04-12 | 诺华股份有限公司 | 用于治疗癌症的嵌合抗原受体 |
US20200016202A1 (en) | 2016-10-07 | 2020-01-16 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Modulation of novel immune checkpoint targets |
GB201618106D0 (en) | 2016-10-26 | 2016-12-07 | Lift Biosciences Ltd | Cancer-killing cells |
CN113786476A (zh) | 2016-12-02 | 2021-12-14 | 泰加生物工艺学公司 | 纳米颗粒调配物 |
US11549149B2 (en) | 2017-01-24 | 2023-01-10 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide |
US11535662B2 (en) | 2017-01-26 | 2022-12-27 | Novartis Ag | CD28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy |
SI3580561T1 (sl) | 2017-02-12 | 2024-04-30 | Biontech Us Inc. | Metode, osnovane na hla, in njihove sestave ter uporabe |
WO2018160622A1 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Endocyte, Inc. | Compositions and methods for car t cell therapy |
CN110832075A (zh) | 2017-03-22 | 2020-02-21 | 诺华股份有限公司 | 用于免疫肿瘤学的组合物和方法 |
WO2018183908A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating ovarian tumors |
WO2018183921A1 (en) | 2017-04-01 | 2018-10-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer |
WO2018191553A1 (en) | 2017-04-12 | 2018-10-18 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Tumor signature for metastasis, compositions of matter methods of use thereof |
MX2019012398A (es) | 2017-04-18 | 2020-09-25 | Broad Inst Inc | Composiciones para detectar secreciones y metodos de uso. |
EP3638218A4 (en) | 2017-06-14 | 2021-06-09 | The Broad Institute, Inc. | COMPOSITIONS AND METHOD OF TARGETING COMPLEMENTING COMPONENT 3 FOR INHIBITION OF TUMOR GROWTH |
SG11202000612TA (en) | 2017-08-03 | 2020-02-27 | Taiga Biotechnologies Inc | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
US10149898B2 (en) | 2017-08-03 | 2018-12-11 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
CN111511388A (zh) | 2017-09-21 | 2020-08-07 | 博德研究所 | 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物 |
US11732257B2 (en) | 2017-10-23 | 2023-08-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Single cell sequencing libraries of genomic transcript regions of interest in proximity to barcodes, and genotyping of said libraries |
WO2019094983A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-16 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for treating cancer by targeting the clec2d-klrb1 pathway |
US11994512B2 (en) | 2018-01-04 | 2024-05-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity |
CN112292138A (zh) | 2018-01-22 | 2021-01-29 | 西雅图儿童医院(Dba西雅图儿童研究所) | Car t细胞的使用方法 |
EP3762410A4 (en) | 2018-03-06 | 2022-04-06 | The Trustees of the University of Pennsylvania | PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN CARS AND METHODS OF USE |
US11957695B2 (en) | 2018-04-26 | 2024-04-16 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses |
WO2019232542A2 (en) | 2018-06-01 | 2019-12-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients |
US20210246503A1 (en) | 2018-06-11 | 2021-08-12 | The Broad Institute, Inc. | Lineage tracing using mitochondrial genome mutations and single cell genomics |
CN112203725A (zh) | 2018-06-13 | 2021-01-08 | 诺华股份有限公司 | Bcma嵌合抗原受体及其用途 |
US20210324357A1 (en) | 2018-08-20 | 2021-10-21 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases |
WO2020068304A2 (en) | 2018-08-20 | 2020-04-02 | The Broad Institute, Inc. | Inhibitors of rna-guided nuclease target binding and uses thereof |
US20210355522A1 (en) | 2018-08-20 | 2021-11-18 | The Broad Institute, Inc. | Inhibitors of rna-guided nuclease activity and uses thereof |
US20210382068A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-12-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Hla single allele lines |
US20210379057A1 (en) | 2018-10-16 | 2021-12-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Nutlin-3a for use in treating a mycobacterium tuberculosis infection |
US20220170097A1 (en) | 2018-10-29 | 2022-06-02 | The Broad Institute, Inc. | Car t cell transcriptional atlas |
WO2020092057A1 (en) | 2018-10-30 | 2020-05-07 | Yale University | Compositions and methods for rapid and modular generation of chimeric antigen receptor t cells |
US20220062394A1 (en) | 2018-12-17 | 2022-03-03 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identifying neoantigens |
US11739156B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-08-29 | The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology | Methods and compositions for overcoming immunosuppression |
US20220154282A1 (en) | 2019-03-12 | 2022-05-19 | The Broad Institute, Inc. | Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells |
EP3942023A1 (en) | 2019-03-18 | 2022-01-26 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity |
WO2020236967A1 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | The Broad Institute, Inc. | Random crispr-cas deletion mutant |
WO2020243371A1 (en) | 2019-05-28 | 2020-12-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for modulating immune responses |
US20220282333A1 (en) | 2019-08-13 | 2022-09-08 | The General Hospital Corporation | Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof |
US20220298501A1 (en) | 2019-08-30 | 2022-09-22 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-associated mu transposase systems |
US11981922B2 (en) | 2019-10-03 | 2024-05-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment |
US11793787B2 (en) | 2019-10-07 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis |
US11844800B2 (en) | 2019-10-30 | 2023-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia |
AR120563A1 (es) | 2019-11-26 | 2022-02-23 | Novartis Ag | Receptores de antígeno quimérico cd19 y cd22 y sus usos |
GB201918341D0 (en) * | 2019-12-12 | 2020-01-29 | Lift Biosciences Ltd | Cells for treating infections |
CA3188988A1 (en) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Sidi CHEN | Compositions and methods for engineering and selection of car t cells with desired phenotypes |
WO2023173137A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Yale University | Compositions and methods for efficient and stable genetic modification of eukaryotic cells |
WO2023220644A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Yale University | Compositions and methods of synthetic ctla-4 tails for reprogramming of car-t cells and enhancement of anti-tumor efficacy |
WO2024077256A1 (en) | 2022-10-07 | 2024-04-11 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for high-throughput discovery ofpeptide-mhc targeting binding proteins |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
ATE145428T1 (de) * | 1990-12-14 | 1996-12-15 | Cell Genesys Inc | Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen |
-
1992
- 1992-03-05 IL IL10114792A patent/IL101147A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 NZ NZ241855A patent/NZ241855A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 IE IE071692A patent/IE920716A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 MX MX9201002A patent/MX9201002A/es unknown
- 1992-03-06 KR KR1019930702656A patent/KR100257780B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 WO PCT/US1992/001785 patent/WO1992015322A1/en active IP Right Grant
- 1992-03-06 PT PT100207A patent/PT100207B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 DE DE69232921T patent/DE69232921T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 EP EP92907958A patent/EP0574512B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 DK DK92907958T patent/DK0574512T3/da active
- 1992-03-06 RU RU93055035/13A patent/RU2161044C2/ru active
- 1992-03-06 SK SK956-93A patent/SK283643B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-03-06 JP JP50757592A patent/JP3696232B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 ES ES92907958T patent/ES2191006T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 AU AU15559/92A patent/AU662136B2/en not_active Expired
- 1992-03-06 BR BR9205736A patent/BR9205736A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-03-06 AT AT92907958T patent/ATE232107T1/de active
- 1992-03-06 CA CA002104957A patent/CA2104957C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 UA UA93003975A patent/UA41870C2/ru unknown
- 1992-03-06 CZ CS931840A patent/CZ281881B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-03-06 HU HU9302524A patent/HU218732B/hu unknown
- 1993-09-06 NO NO19933169A patent/NO317202B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-09-06 FI FI933882A patent/FI117900B/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-08-30 AU AU30328/95A patent/AU689289B2/en not_active Expired
-
1998
- 1998-12-11 HK HK98113233A patent/HK1011935A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Rosenberg S.A. et al., new Engl. I.Med., 1990, v.323, p.570. DNA and Cell Biology, v.9, N 5, p. 347 - 353, 1990. * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10570198B2 (en) | 2010-10-22 | 2020-02-25 | Novartis Ag | Stable and soluble antibodies |
RU2653761C2 (ru) * | 2012-04-30 | 2018-05-14 | Те Трастиз Оф Дартмут Колидж | Композиции т-клеток с недостаточностью рецепторов т-клеток |
RU2781979C2 (ru) * | 2012-04-30 | 2022-10-21 | Те Трастиз Оф Дартмут Колидж | Композиции т-клеток с недостаточностью рецепторов т-клеток |
RU2700765C2 (ru) * | 2012-08-20 | 2019-09-19 | Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер | Способ и композиции для клеточной иммунотерапии |
RU2725807C2 (ru) * | 2014-12-08 | 2020-07-06 | 1Глоуб Байомедикал Ко., Лтд. | Растворимый универсальный усиливающий adcc синтетический слитный ген, пептидная технология и их применение |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2161044C2 (ru) | Способ направления (индукции) иммунного ответа, днк, вектор, способ лечения | |
US5843728A (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
CA2209300C (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
US7049136B2 (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
KR100289253B1 (ko) | 키메라cd4수용체-포함세포에의한hiv감염세포의표적화세포용해 | |
US5912170A (en) | Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras | |
IE83939B1 (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
EP0804552B1 (en) | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras | |
EP0781095B1 (en) | Cells bearing cd4 decoy receptors and related molecules and methods | |
RU2173167C2 (ru) | Способ направления клеточного иммунного ответа против вич-инфицированной клетки млекопитающего, белковый мембранносвязанный химерный рецептор, днк |