SK283643B6

SK283643B6 - Bunka poskytujúca expresiou proteínovej membrány viazaný chimérny receptor, chimérny receptor, vektor, DNA a protilátka

Info

Publication number: SK283643B6
Application number: SK956-93A
Authority: SK
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: The General Hospital Corporation
Priority date: 1991-03-07
Filing date: 1992-03-06
Publication date: 2003-11-04
Also published as: NZ241855A; PT100207B; EP0574512A1; CA2104957C; WO1992015322A1; RU2161044C2; HU9302524D0; ATE232107T1; NO933169D0; AU1555992A; DE69232921D1; JPH06509462A; FI117900B; BR9205736A; CZ281881B6; KR100257780B1; SK95693A3; HU218732B; CZ184093A3; AU689289B2

Abstract

Je opísaná bunka, ktorá expresiou poskytuje proteínovou membránou viazaný chimérny receptor obsahujúci: a) extracelulárnu časť schopnú špecificky rozpoznávať a viazať infekčné činidlo, bunku, infikovanú infekčným činidlom, nádorovú alebo rakovinovú bunku alebo autoimúnne generovanú bunku, b) intracelulárnu alebo transmembránovú časť odvodenú od T bunkového receptora zeta, eta, CD3 delta alebo T3 gama proteínu, Fc receptora gama proteínu alebo B bunkového receptora mbl alebo B29 proteínu, ktorá je schopná signalizovať bunke, aby ničila činidlo alebo bunku naviazané na receptor, pričom uvedená bunka je vybraná zo skupiny zahrnujúcej T alebo B lymfocyty, cytotoxické T lymfocyty, prírodné usmrcujúce bunky, neutrofily, granulocyty, makrofágy, žírne bunky, HeLa bunky a embryové kmeňové (ES) bunky. Ďalej je opísaná DNA kódujúca chimérny receptor, vektor, ktorý ju obsahuje, a protilátka špecificky rozpoznávajúca a viažuca chimérny receptor. ŕ

Description

Vynález sa týka bunky poskytujúcej expresiou proteínovej membrány viazaný chimérny receptor, chimérneho receptora, vektora, DNA a protilátky.

Podrobnejšie sa tento vynález týka regulácie lymfocytov, makrofágov, prírodných buniek zabíjača lebo granulocytov expresiou v uvedených bunkách chimér, ktoré spôsobujú, že bunky odpovedajú na ciele rozoznávané chimérami. Tento vynález sa týka tiež funkčných T bunkových receptorových chimér, Fc receptorových chimér lebo B bunkových receptorových chimér, ktoré sú schopné presmerovať terapeutické bunky tak, aby špecificky rozpoznávali a ničili buď bunky infikované špecifickým infekčným činidlom, infekčné činidlo samé, nádorovú bunku lebo autoimúnne generovanú bunku. Podrobnejšie sa tento vynález týka prípravy T bunkových receptorových chimér lebo Fc receptorových chimér, ktoré sú schopné smerovať cytotoxickc T lymfocyty tak, aby špecificky rozoznávali a lýzovali bunky, ktoré expresiou poskytujú HIV obalové protcíny. Tento vynález sa teda týka terapie takých ochorení, ako je napríklad AIDS (syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti), ktoré sú spôsobované vírusom HIV.

Doterajší stav techniky

Základ imunologických javov je rozoznávanie T buniek antigénu receptorom T buniek. T bunky riadia to, čo sa nazýva imunita sprostredkovaná bunkami. Tento jav zahrnuje deštrukciu bunkami imunitného systému cudzích tkaní lebo infikovaných buniek. Existujú rôzne druhy T buniek, vrátane „helper“ (pomocných) lebo „supressor“ (supresorových) buniek, ktoré modulujú imunitnú odpoveď, a cytotoxických buniek (alebo „zabíjačov“, t. j. „killer“) buniek, ktoré môžu priamo zabíjať abnormálne bunky.

T bunka, ktorá rozoznáva a viaže jedinečný antigén nachádzajúci sa na povrchu inej bunky, sa aktivuje. Potom sa môže rozmnožiť a ak je to cytotoxická bunka, môže zabiť naviazanú bunku.

Autoimúnne ochorenie je charakterizované tým, že dochádza k produkcii buď protilátok, ktoré reagujú s hostiteľským tkanivom, alebo imúnnych efektorových T buniek, ktoré sú autoreaktívne. V niektorých prípadoch sa protilátky získajú ako odpoveď normálnych T- a B-buniek aktivovaných cudzími zlúčeninami lebo organizmami, ktoré obsahujú antigény, ktoré krížovo reagujú s podobnými zlúčeninami v telesných tkanivách. Príklady klinicky relevantných protilátok sú protilátky proti acetylcholínovým receptorom pri myastenii gravis a anti-DNA, anti-erytrocytové a anti-doštičkové protilátky pri systémovej lupus erythromatodes.

HIV a imunopatogenéza: Roku 1984 bolo preukázané, že HIV je etiologickým agens AIDS. Od toho času bola definícia AIDS mnoho razy revidovaná, pokiaľ ide o kritéria diagnózy. Napriek fluktuácii v diagnostických parametroch, jednoduchým všeobecným menovateľom AIDS je infekcia HIV a následný vývoj perzistentných konštitučných symptómov a AIDS definujúcich chorôb, ako sú napríklad sekundárne infekcie, novotvary' a neurologické ochorenia. Harrison's Principles of Intemal Medicíne, 12. vydanie, McGrawHill (1991).

HIV je ľudský rctrovírus zo skupiny lentivírusov. Štyri rozoznané ľudské retrovírusy náležia k dvom rôznym skupinám: medzi ľudské T lymfotrópne (lebo leukemické) retrovírusy, HTLV-1 a HTLV-2, a vírusy ľudskej imunitnej nedostatočnosti, IIIV-1 a HIV-2. Prvé z nich sú transformujúce vírusy, druhé dva sú cytopatické vírusy.

HIV-1 bol identifikovaný ako najobvyklejší prípad AIDS po celom svete. Homológia sekvencií medzi HIV-2 a HIV-1 je asi 40 % s tým, že HIV-2 je príbuznejší s niektorými skupinami opičieho vírusu imunitnej nedostatočnosti (SIV). Pozri Curran J. a spol.: Science 329. 1357 až 1359 (1985), Weiss R. a spol.: Náture 324, 572 až 575 (1986).

HIV má zvyčajné retrovirusové gény (env, gag, a pol) a tiež šesť ďalších génov zapojených do replikácie a ďalších biologických aktivít vírusu. Ako bolo uvedené, obvyklý menovateľ AIDS je zásadné potlačenie imunity, prevažne imunity sprostredkovávanej bunkami. Toto potlačenie imunity vedie k rôznym príležitostným ochoreniam, osobitne k istým infekciám a k nádorovým ochoreniam.

Ako hlavná príčina poruchy imunity pri AIDS bola definovaná kvantitatívna a kvalitatívna nedostatočnosť v podtriede lymfocytov odvodených od týmu (T), T4 populácie. Tato podtrieda buniek je fenotypicky definovaná prítomnosťou CD4 povrchovej molekuly, o ktorej bolo ukázané, že je bunkovým receptorom HIV. Dalgleish a spol.: Náture 312, 763 (1984). Aj keď T4 bunka je hlavným bunkovým typom infikovaným HIV, v podstate akákoľvek ľudská bunka, ktorá expresiou poskytuje na svojom povrchu CD4 molekulu, je schopná naviazať sa na HIV a schopná byť infikovaná HIV.

Tradične sa CD4+ T bunkám pripisuje úloha pomocných/indukčných buniek (helper/inducer), čo ukazuje na ich funkciu v poskytovaní aktivačného signálu B bunkám lebo indukcii T lymfocytov nesúcich CD8 marker tak, že sa stanú cytotoxickými /supresorovými bunkami. Reinherz a Schlossman: Celí 19, 821 až 827 (1980), Goldstein a spol.: Immunol. Rev. 68, 5 až 42 (1982).

HIV sa viaže špecificky a s vysokou afinitou, prostredníctvom extcndovaných aminokyselín vo vírusovom obale (gpl20), na časť VI oblasti CD4 molekuly umiestnenej blízko jej N-konca. Po naviazaní vírus fuzuje s membránou cieľovej bunky a intemalizuje sa. Len čo je raz intemalizovaný, použije enzým reverznú transkriptázu k transkripcii (prepisu) svojej genómovej RNA na DNA, ktorá sa integruje do bunkovej DNA, kde existuje počas života, čiže do bunky ako „provírus“.

Provírus môže zostať latentný, lebo môže byť aktivovaný pre transkripciu mRNA a genómovej RNA, čo vedie k syntéze proteínov, zostaveniu, tvorbe nového viriónu a vypučeniu vírusu z povrchu bunky. Aj keď presný mechanizmus, ktorým vírus indukuje smrť bunky nie je určený, pociťuje sa, že hlavným mechanizmom je masívne vírusové pučenie z povrchu bunky, ktoré vedie k porušeniu plazmatickej membrány a výsledok jc porušenie osmotickej rovnováhy.

Počas postupu infekcie hostiteľský organizmus vytvára protilátky proti vírusovým proteínom, vrátene hlavných obalových glykoproteinov gpl20 a gp41. Napriek humorálnej imunite ochorenie pokračuje, čo vedie k letálnemu potlačeniu imunity, ktoré je charakterizované početnými príležitostnými infekciami, parazitémiou, demenciou a smrťou. Zlyhanie hostiteľských protivírusových protilátok pri bránení postupu ochorenia predstavuje jeden z najnepríjemnejších a alarmujúcich aspektov tohto vynálezu a znamená súčasne len slabý popud na očkovanie, ktoré by bolo založené na konvenčných prístupoch.

V účinnosti humorálnej odpovede na vírusy imunitnej nedostatočnosti môžu mať úlohu dva faktory. Prvým, podobne ako pri iných RNA vírusoch (a osobitne podobne ako pri retrovírusoch) je to, že vírusy imunitnej nedostatočnosti majú vysokú intenzitu mutácií pri odpovedi na hosti teľský imunitný dozor. Druhým faktorom je to, že obalové glykoproteiny samé sú rozsiahle glykozylované molekuly, ktoré majú niekoľko epitopov vhodných na naviazanie protilátky s vysokou afinitou. Slabý antigénový cieľ, aký vírusový obal predstavuje, poskytuje hostiteľovi len malú príležitosť v obmedzení vírusovej infekcie produkciou špecifických protilátok.

Bunky, ktoré sú infikované HIV vírusom, exprimujú na svojom povrchu glykoproteín gpl20. Gpl20 sprostredkuje fúziu medzi CD4+ bunkami reakciou podobnou tej, ktorou vírus vstupuje do neinfikovaných buniek, čo vedie k tvorbe viacjadrových obrovských buniek s krátkou životnosťou. Tvorba syncýtia (bunkového celku) závisí od priamej interakcie obalového glykoproteínu gpl20 s CD4 proteínom. Dalgleish a spol.: pozri skôr; Klatzman D. a spol.: Náture 312, 763 (1984); McDougal J. S. a spol.: Science 231, 382 (1986); Sodroski J. a spol.: Náture 322, 470 (1986); Lifson J. D. a spol.: Náture 323, 725 (1986); Sodroski J. a spol.: Náture 321,412 (1986).

Dôkaz, že väzba CD4-gpl20 je zodpovedná za vírusovú infekciu buniek nesúcich CD4 antigén, zahrnuje zistenie, že sa medzi gpl20 a CD4 tvorí špecifický komplex. McDougal a spol.: pozri skôr. Ďalší výskumníci ukázali, že bunkové línie, ktoré neboli infekčné pre HIV, boli prevedené na infikovateľné bunkové línie po transfekcii a expresii ľudského CD4 cDNA génu. Maddon a spol.: Celí 46. 333 až 348(1986).

Boli navrhnuté a úspešne in vivo demonštrované početnými skupinami (Deen a spol.: Náture 331, 82 až 84 (1988); Fisher a spol.: Náture 331. 76 až 78 (1988); Hussey a spol: Náture 331, 78 až 81 (1988); Smith a spol.: Scince 238, 1704 až 1707 (1987); Traunecker a spol.: Náture 331, 84 až 86 (1988).) terapeutické programy založené na rozpustnom CD4 ako pasívnom činidle, ktoré interferuje s vírusovou adsorpciou a syncytiom sprostredkovanou bunkovou transmisiou. Následne boli vyvinuté CD4 imunoglobulinové napojené proteíny s predĺženou životnosťou a miernou biologickou aktivitou (Capon a spol.: Náture 337, 525 až 531 (1989); Traunecker a spol.: Náture 339, 68 až 70 (1989); Bym a spol.: Náture 344, 667 až 670 (1990) a Zettlmeissl a spol.: DNA Celí Biol.: 9, 347 až 353 (1990).). Aj keď CD4 imunotoxínové konjugáty, lebo fúzované proteíny majú silnú cytotoxicitu na infikované bunky in vitro (Chaundhary a spol.: Náture 335. 369 až 372 (1988); Till a spol.: Scince 242. 1166 až 1168 (1988).), bezpríznakové obdobie choroby syndrómu imunitnej nedostatočnosti spôsobuje, že by bolo nepravdepodobné, aby nejaká jednoduchá terapia bola účinná pri odstraňovaní vírusových problémov, a antageničnosť cudzích fúzovaných proteínov pravdepodobne obmedzuje ich prijateľnosť pri liečbe, ktoré vyžaduje opakovanie dávok. Pokusy s opicami s SIV ukázali, že rozpustný CD4, ak sa podáva zvieraťu bez význačnej CD4 cytopénie, môže znížiť SIV titer a zlepšiť in vivo miery myeloidneho potenciálu (Watanabe a spol.: Náture 337. 267 až 270 (1989).). Ale po tom, čo sa preruší liečenie, sa objaví okamžitá náhla vírusová príhoda, čo ukazuje na to, že by bolo nutné dlhodobé podávanie, aby sa zabránilo oslabeniu progresívneho imunitného systému.

T bunkové a Fc receptory: Expresia najvhodnejšej formy T bunkového antigénového receptora (TCR) povrchom buniek vyžaduje koexpresiu aspoň 6 rôznych polypeptidových reťazcov (Weiss a spol.: J. Exp. Med. 160, 1284 až 1299 (1984); Orloffhashi a spol: Náture 316. 606 až 609 (1985); Berkhout a spol.: J. Biol. Chem. 263, 8528 až 8536 (1988); Sussman a spol.: Celí 52, 85 až 95 (1988).), a/ antigén viažucich reťazcov, troch polypeptidov CD3 komplexu a zeta. Ak nie je prítomný ktorýkoľvek z reťaz cov, nedochádza ku stabilnej expresii zostávajúcich členov komplexu. Zeta je limitujúci polypeptid povrchovej expresie úplného komplexu (Sussman a spol.: Celí 52, 85 až 95 (1988).). Predpokladá sa, že sprostredkováva aspoň časť bunkových aktivačných programov spúšťaných receptorovým rozoznaním ligandu (Weissman a spol.: EMBO J. 8, 3651 až 3656 (1989); Frank a spol.: Science 249, 147 až 177 (1990).). Integrálny membránový homodimér typu I s molekulovoou hmotnosťou 32 000 zeta má extracelulámu doménu s 9 zvyškami s žiadnym miestom na adíciu N-naviazaného glykánu a intracelulárnu doménu so 112 zvyškami (myšací) alebo s 113 zvyškami (ľudskou) (Weissman a spol.: Science 238, 1018 až 1020 (1988a); Weissman a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9709 až 9713 (1988b).). Izoforma zety nazývaná eta (Baniyash a spol.: J. Biol. Chem. 263, 9874 až 9878 (1988); Orloff a spol.: J. Biol. Chem. 264, 14812 až 14817 (1989).), ktorá vzniká pri alternatívnom mRNA zostrihu (Jin a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87. 3319 až 3233 (1990).), je prítomná vo zníženom množstve v bunkách, ktoré expresiou poskytujú antigénový receptor. Predpokladá sa, že zeta-eta heterodiméry sprostredkovávajú tvorbu inozitol-fosfátov a tiež receptorom iniciovanú programovanú smrť buniek nazývanú apoptóza (Mercep a spol.: Science 242, 571 až 574 (1988); Mercep a spol.: Science 246, 1162 až 1165 (1989).).

Podobne ako zeta a eta, s Fc receptorom asociovaný gama (τ) reťazec sa získava expresiou v komplexe z bunkového povrchu spolu s ďalšími polypeptidmi, z ktorých niektoré sprostredkovávajú rozpoznávanie ligandu a iné majú nedefinovanú funkciu. Gama nesie homodimérnu štruktúru. Celková organizácia je veľmi podobná organizácii ety. Gama je zložkou ako IgE receptora žírnych buniek/bazofilných s vysokou afinitou, Fc#RI, ktorý pozostáva z aspoň troch rozdielnych polypcptidových reťazcov (Blank a spol.: Náture 337, 187 až 189 (1989); Ra a spol.: Náture 141, 752 až 754 (1989).), tak jedného z receptorov pre IgG s nízkou afinitou, pri myšiach reprezentovaného FcrRIIa (RA a spol.: J. Biol. Chem. 264, 15323 až 15327 (1989).) a u ľudí CD16 subtypom expresie makrofágmi a prirodzenými zabíjačmi, CD16TM (CD16 transmembrána) (Lanier a spol.: Náture 342, 803 až 805 (1989); Anderson a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2274 až 2278 (1990).) tak polypeptidom neidentifikovanej funkcie (Anderson a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2274 až 2278 (1990).). Nedávno bolo opísané, že k expresii gama dochádza myšacími T bunkovými líniami, CTL, v ktorých sa tvoria homodiméry rovnako ako heterodiméry gama-zeta a gama-eta (Orloff a spol.: Náture 347, 189 až 191 (1990).).

Fc receptory sprostredkovávajú fagocytózu imunitných komplexov, transcytózu a od protilátok závislú bunkovú cytotoxicitu (ADCC) (Ravetch a Kinet: Annu. Rev. Immunol. 9, 457 až 492 (1991); Unkeless a spol.: Annu. Rev. Immunol. 6, 251 až 281 (1988) a Mellman: Curr. Opin. Imimunol. f, 16 až 25 (1988).). Nedávno bolo ukázané, že jedna z myšacích nizkoafmitných Fc receptorových izoforiem (FcRrlIIBl) sprostredkováva internalizáciu Ig-potiahnutých cieľov v jamkách potiahnutých klathrínom a že nízkoafmitný receptor (FcRrllIA) sprostredkováva ADCC asociáciou s jedným alebo viac členmi malej rodiny „spúšťacích molekúl“ (Miettinen a spol.: Celí 58, 317 až 327 (1989) a Hunziker a Mellman: j. Celí Biol. 109. 3291 až 3302 (1989).). Tieto spúšťacie molekuly, T bunkový receptorový (TCR) zeta reťazec, TCR eta reťazec a Fc receptorový gama reťazec interagujú s ligandovými rozpoznávacími doménami rôznych receptorov imunitného systému a môžu autonómne iniciovať bunkové efektorové programy vrátane cytolýzy nasledujúcej po agregácii (Samelson a spol.: Celí 43, 223 až 231 (1985); Weissman a spol.: Science 239, 1018 až 1020 (1988); Jin a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 až 3323 (1990); Blank a spol.: Náture 337, 187 až 189 (1989); Lanier a spol.: Náture 342. 803 až 805 (1989); Kurosaki a Ravetch: Náture 342, 805 až 807 (1989); Hibbs a spol.: Science 246. 1608 až 1611 (1989); Anderson a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2274 až 2278 (1990) a Irving a Weiss: Celí 64, 891 až 901 (1991).).

Pri vytváraní paralel medzi myšacími a ľudskými nízkoafinitnými Fc receptorovými čeľaďami je však zrejmé, že ľudské FcRrlIA a C izoformy nemajú žiadny myšací náprotivok. Sčasti pretože tieto ich funkcie ešte neboli definované.

Pretože humorálne činidlá na báze CD4 môžu mať obmedzenú užitočnosť in vivo, vynálezcovia začali skúmať možnosť zvýšenia bunkovej imunity na HIV. Výsledok, ktorý tu uvádzajú, je príprava proteínových chimér, v ktorých extraceluláma doména CD4 je napojená na transmembránovú a/alebo intracelulámu doménu signálnych transdukujúcich prvkov T bunkového receptora, IgG Fc receptora alebo B bunkového receptora. Chiméry exprimujúce cytolytické T bunky, ktoré zahrnujú extracelulárnu CD4 doménu, majú silnú od MHC nezávislú deštrukciu bunkových cieľov exprimujúcich HIV obalové proteíny. Mimoriadne dôležitou a novou zložkou tohto prístupu je identifikácia reťazcov jediného T bunkového receptora lebo Fc receptora a B bunkového receptora, ktorých agregácia postačuje na iniciáciu bunkovej odpovede.

Jednou osobitne dôležitou aplikáciou tohto prístupu je vynález chimér medzi CD4 a zeta, eta lebo gama, ktoré smerujú cytolytické U lymfocyty na rozpoznávanie a zabíjanie buniek, ktoré expresiou poskytujú HIV gpl20.

Podstata vynálezu

Aj keď receptory prírodnej T bunky, B bunky lebo Fc sú alebo môžu byť veľmi komplikované multiméme štruktúry, ktoré sa neprepožičiavajú na vhodnú manipuláciu, tento vynález demonštruje možnosť vytvorenia chimér medzi intracelulámou doménou ktorejkoľvek z mnohých molekúl, ktoré sú schopné splniť úlohu cieľového rozpoznávania. Príprava chimér pozostávajúcich z intracelulárnej časti T bunkových/Fc receptorových zeta, eta alebo gama reťazcov spojených s extracelulámou častou vhodne pripravenej molekuly protilátky umožňuje, aby cieľový rozoznávací potenciál imunitného systému bunky bol špecificky presmerovaný na antigén rozoznávaný extracelulámou časťou protilátky. Teda protilátkovou časťou schopnou rozoznávať determinantu na povrchu patogénu, by bunky imunitného systému vyzbrojené chimérou odpovedali na prítomnosť patogénu efektorovým programom príslušným ich rodu; napr. pomocné T lymfocyty by odpovedali cytotoxickou aktivitou na cieľ a B lymfocyty by boli aktivované tak, aby syntetizovali protilátku. Makrofágy a granulocyty by vykonávali ich efektorové programy, vrátene uvoľňovania cytokínu, fagocytózy a generovania reaktívneho kyslíka. Podobne by sa časti protilátok schopných rozoznávať nádorové bunky priaznivo zvýšila odpoveď imunitného systému na nádor. Pomocou protilátky schopnej rozoznávať imunitné bunky, ktoré nemajú príslušnú reaktivitu s ich determinantmi, by mohli byť autoreaktívne bunky selektívne cielené na deštrukciu. Aj keď tieto príklady vykresľujú použitie protilátkových chimér ako vhodný vysvetľujúci nástroj, tento vynález nie je obmedzený pokiaľ ide o rozsah protilátkových chimér. A skutočne, použitie špecifických extra celulárnych domén môže mať dôležité výhody. Napríklad extraceluláma časť, ktorá je receptorom pre vírus, baktériu alebo parazit, buniek vyzbrojených chimérami by špecificky smerovala na bunky, ktoré expresiou poskytujú vírusové, bakteriálne lebo parazitáme determinanty. Výhodou tohto postupu v porovnaní s používaním protilátok je to, že prírodný receptor pre patogén môže mať jedinečne vysokú selektivitu lebo afinitu pre patogén, čo umožňuje väčší stupeň precízneho smerovania výslednej imunitnej odpovede. Podobne, vypustenie buniek imunitného systému, ktoré príslušne nereagujú so svojím antigénom, môže postačovať na pripojenie antigénu (buď ako neporušený protein, v prípade vyčerpania terapie B bunkami, alebo ako MHC komplex, v prípade vyčerpania terapie T bunkami) k intracelulárnym zeta, eta alebo gama reťazcom a tým ovplyvňovať špecifické cielenie buniek príslušne neodpovedajúcich na svoje determinanty.

Iné použitie týchto chimér je regulácia populácií buniek in vivo. Napríklad bolo navrhnuté použitie nádor infiltrujúcich lymfocytov alebo buniek prirodzených zabíjačov na nesenie cytotoxických princípov na miesta nádorov. Tento vynález poskytuje vhodné prostriedky na reguláciu počtu a aktivity takýchto lymfocytov a buniek bez ich odstraňovania z tela pacienta na amplifikáciu in vitro. Pretože intraceluláme domény chimérnych receptorov sprostredkovávajú proliferačné odpovede buniek, koordinácia extracelulárnych domén rôznymi agregačnými podnetmi špecifickými pre extracelulárne domény (napr. protilátka špecifická pre extracelulárnu doménu) povedie k proliferácii buniek, ktoré nesú chiméry.

Aj keď špecifické usporiadania tohto vynálezu obsahujú chiméry medzi zeta, eta alebo gama reťazcami, alebo ich aktívnymi fragmentmi (napr. tými, čo sa rozoberajú neskôr), mohol by sa na tu opísané účele použiť akýkoľvek receptorový reťazec, ktorý má podobnú funkciu ako tieto molekuly, napr. v granulocytoch alebo B lymfocytoch. Rozoznateľnými vlastnosťami žiaducich imunitných bunkových spúšťacích molekúl sú schopnosť autonómnej expresie (t. j. ako jednoduchý reťazec), schopnosť byť fuzovaný s extracelulámou doménou tak, aby výsledná chiméra bola prítomná na povrchu terapeutickej bunky a schopnosť iniciovať bunkové efektorové programy po agregácii sekundárne pri stretnutí s cieľovým ligandom.

V tomto čase je najvhodnejším spôsobom dodávania chimér do imunitného systému bunky niektorým zo spôsobov génovej terapie. Ale rekonštituovaním buniek imunitného systému s chimérnymi receptormi zmesou buniek s vhodne solubilizovaným vyčisteným chimémym proteínom by sa tiež došlo ku tvorbe zostrojenej bunkovej populácie, ktorá je schopná odpovedať na ciele rozoznávané extracelulámou doménou chimér. Podobný prístup sa použil napríklad na zavedenie neporušeného HIV receptora, CD4, do erytrocytov na terapeutické účely. V tomto prípade by zostavená bunková populácia nebola schopná samoobnovenia.

Tento vynález sa týka funkčných zjednodušených T bunkových receptorových chimér, B bunkových receptorových chimér a Fc receptorových chimér, ktoré sú schopné presmerovať funkciu imunitného systému. Podrobnejšie sa tento systém týka regulácie lymfocytov, makrofágov, prírodných buniek zabíjača alebo granulocytov expresiou v uvedených bunkách alebo chimérach, ktoré spôsobujú, žc bunky odpovedajú na ciele rozoznávané chimérami. Tento vynález sa týka tiež spôsobu smerovania bunkovej odpovede na infekčné činidlo, nádorovú alebo rakovinovú bunku, alebo na autoimúnne generovanú bunku. Spôsob smerovania bunkovej odpovede u cicavca sa vyznačuje tým, že sa podáva efektívne množstvo terapeutických buniek uvede nému cicavcovi, pričom uvedené bunky sú schopné rozoznávať a ničiť uvedené infekčné činidlo, nádor, rakovinovú bunku lebo autoimúnne generovanú bunku.

V inom usporiadaní spôsob smerovania bunkovej odpovede na infekčné činidlo zahrnuje podávanie terapeutických buniek schopných rozoznávať, a ničiť, uvedené činidlo, pričom toto činidlo znamená špecifický vírus, baktériu, protozoa alebo huby. Dokonca ešte špecifickejšie - tento spôsob je namierený proti takým činidlám, ako je napríklad HIV a Pneumocystis carinii.

Tento vynález špecificky poskytuje spôsob smerovania bunkovej odpovede na bunku infikovanú HIV. Tento spôsob zahrnuje podávanie efektívneho množstva cytotoxických T lymfocytov pacientovi, pričom uvedené lymfocyty sú schopné špecificky rozoznávať a lýzovať bunky, ktoré sú infikované HIV.

V jednom usporiadaní sa teda podľa tohto vynálezu získava spôsob smerovania bunkovej odpovede na bunky infikované HIV, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva efektívne množstvo cytotoxických T lymfocytov, ktoré sú schopné špecificky rozoznávať a lýzovať bunky infikované HIV.

Podľa ešte iného usporiadania sa získavajú chimérnc receptorové proteíny, ktoré smerujú cytotoxické T lymfocyty tak, aby rozoznávali a lýzovali bunku infikovanú HIV. Ešte iné usporiadanie podľa vynálezu zahrnuje hostiteľské bunky, ktoré sú transformované vektorom obsahujúcim chimérne receptory.

Podľa ešte iného usporiadania tento vynález poskytuje protilátku proti chimérnym receptorom podľa vynálezu.

Aby sa získali cytotoxické T lymfocyty, ktoré špecificky viažu a lýzujú bunky infikované HIV, autori tohto vynálezu sa pokúsili získať receptorové chiméry. Tieto chiméme receptory sú funkčne aktívne a majú mimoriadnu schopnosť špecificky sa viazať a lýzovať bunky, ktoré expresiou poskytujú gpl20.

Predmetom tohto vynálezu je teda získanie spôsobu liečenia jednotlivcov, ktorí sú infikovaní HIV. Tento vynález teda poskytuje početné dôležité výhody pri terapii AIDS.

Tieto a ďalšie neobmedzujúce usporiadania tohto vynálezu budú zrejmé odborníkom z nasledujúceho podrobného opisu vynálezu.

V nasledujúcom podrobnom opise sú uvedené odkazy na rôzne spôsoby známe odborníkom pracujúcim v oblasti molekulárnej biológie a imunológie. Publikácie a ďalšie materiály, ktoré vysvetľujú takéto známe spôsoby a na ktorú sa tu odkazuje, sú tu zahrnuté ako citácie.

Štandardné citované práce vykladajú všeobecné princípy technológie rekombinantnej DNA. Patria sem práce Watsona J. D. a spol.: „Molecular Biology of tne Gene“, diely I a II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., vydavateľ, Menlo Park, Kalifornie (1987); Damell J. E. a spol.: „Molecular Celí Biology“, Scientific Američan Books, Inc., vydavateľ, New York, N. Y. (1986); Lewin B.

M. ; „Genes II“, John Wiley and Sons, vydavatelia, New York, N. Y. (1985): Old R. W. a spol.: „Principles of Gene Manipulation; An Introduction to Genetic Engineering“, druhé vydanie, University of California Press, vydavateľ, Berkeley, Kalifornie (1981); Maniatis T. a spol.: „Molecular Cloning; A Laboratory Manuál“, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory, vydávateľ, Cold Spring Harbor,

N. Y. (1989) a Ausubel a spol.: „Current Protocols in Molecular Biology“, Wiley Press, New York, N. Y. (1989).

V nasledujúcej časti tohto spisu budú uvedené a vysvetlené definície niektorých pojmov.

Pojmom „klonovanie“ sa rozumie použitie in vitro techník rekombinácie na vloženie (inzerciu) príslušného génu alebo inej DNA sekvencie do molekuly vektora. Aby sa žiadaný gén úspešne klonoval, je nutné použiť spôsoby generovania DNA fragmentov na napojenie fragmentov k vektorovým molekulám, na zavedenie zloženej DNA molekuly do hostiteľskej bunky, v ktorej sa môže replikovať a na vybranie klonu, ktorý má cieľový gén medzi hostiteľskými bunkami príjemcu.

Pojem „cDNA“ znamená komplementárnu DNA pripravenú z RNA templátu pôsobením DNA polymerázy dependentnej na RNA (reverznej transkriptázy). Potom „cDNA kloň“ teda znamená dvojvláknovú DNA sekvenciu komplementárnu k RNA molekule, o ktorú ide, nesenú v klonovacom vektore.

Pojmom „cDNA knižnica“ (cDNA banka) sa rozumie zbierka rekombinantných DNA molekúl obsahujúcich cDNA inzerty, ktoré obsahujú DNA kópie mRNA, ktorá sa získava expresiou buniek v čase, keď sa tvorí cDNA knižnica. Takáto cDNA knižnica sa môže pripravovať spôsobmi známymi odborníkom a je opísaná napríklad v knihe Maniatisa a spol.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manuál“, pozri skôr. Všeobecne je postup taký', žc RNA sa najskôr izoluje z buniek organizmu, z genómu ktorého je žiaduce klonovať príslušný gén. Na tento účel sú výhodné cicavčie a osobitne ľudské lymfocytové bunkové línie. Na účely podľa tohto vynálezu je výhodným vektorom kmeň vírusu vakcínie WR.

Pojem „vektor“ znamená DNA molekulu, odvodenú napríklad od plazmidu, bakteriofága alebo cicavčieho, či hmyzieho vírusu, do ktorého môžu byť vložené alebo klonované fragmenty DNA. Vektor bude obsahovať jedno alebo viac unikátnych reštrikčných miest. Môže byť schopný autonómnej replikácie v definovanom hostiteľovi alebo vektorovom organizme tak, že klonované sekvencie sú reprodukovateľné. Pojem „DNA vektor expresie“ potom teda znamená akýkoľvek autonómny prvok, ktorý je schopný riadiť syntézu rekombinantného peptidu. Medzi takéto DNA vektory expresie patria bakteriálne plazmidy a fágy a cicavčie a hmyzie plazmidy a vírusy.

Pojem „v podstate čistý“ znamená zlúčeninu, napríklad proteín, polypeptid lebo protilátku, ktorá v podstate neobsahuje zložky, ktoré ju prirodzene sprevádzajú. Všeobecne to znamená, že zlúčenina je v podstate čistá, ak aspoň 60 %, výhodnejšie aspoň 75 %, a najvýhodnejšie aspoň 90 % materiálu vzorky znamená zlúčeninu, o ktorú ide. Čistota môže byť meraná akýmkoľvek vhodným spôsobom, napr. chromatografiou na kolóne, elektroforézou na polyakrylamidovom géli alebo HPLC analýzou. V súvislosti s nukleovou kyselinou pojem „v podstate čistá“ znamená sekvenciu nukleovej kyseliny, segment alebo fragment, ktorý neobsahuje gény, ktoré ho obklopujú v stave, v ktorom sa prirodzene nachádza (napr. neobsahuje tie sekvencie, ktoré obklopujú nukleovú kyselinu v jej prírodnej genómovej polohe). Pojmom „funkčný derivát“ sa rozumie pojem „fragmenty“, „varianty“, „analógy“ alebo „chemické deriváty“ molekuly. Pojem „fragment“ molekuly, ako napríklad akákoľvek cDNA sekvencia podľa tohto vynálezu, znamená akúkoľvek nukleotidovú podtriedu molekuly. Pojem „variant“ takejto molekuly znamená, žc ide o prirodzene sa vyskytujúcu molekulu, ktorá je v podstate podobná buď celej molekule, alebo jej fragmentu. Pojem „analóg“ molekuly znamená prirodzene sa nevyskytujúcu molekulu, ktorá je v podstate podobná buď celej molekule, alebo jej fragmentu. O molekule sa uvádza, že je „v podstate podobná“ inej molekule, ak sekvencie aminokyselín v obidvoch molekulách sú v podstate zhodné. V podstate podobné molekuly aminokyselín majú podobné vlastnosti. Za predpokladu, že dve molekuly majú podobnú aktivitu, sú tieto dve molekuly považované za varianty podľa toho, ako je tu tento pojem používaný, aj keď jedna z týchto molekúl obsahuje ďalší alebo niekoľko ďalších zvyškov aminokyselín, ktoré druhá molekula neobsahuje, alebo ak sekvencia zvyškov aminokyselín nie je identická. O molekule sa hovorí ako o „chemickom deriváte“ inej molekuly (ako sa tento pojem tu používa), ak obsahuje ďalšie chemické časti, ktoré normálne nie sú časťou tejto molekuly. Takéto časti môžu zlepšovať stabilitu molekuly, absorpciu, biologickú životnosť atď. Takéto časti môžu tiež znižovať toxicitu molekuly, odstraňovať alebo zmierňovať akýkoľvek nežiaduci vedľajší účinok molekuly atď. Časti, ktoré sú schopné sprostredkovávať takéto účinky, sú opísané napríklad v „Remington's Pharmaceutical Sciences“, 16. vydanie, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Podobne sa pod pojmom „funkčný derivát“ receptorovej chiméry podľa tohto vynálezu rozumie to, že zahrnuje „fragmenty“, „varianty“ alebo „analógy“ génu, ktoré môžu byť „v podstate podobné“ pokiaľ ide o sekvenciu nukleotidov a ktoré kódujú molekulu majúcu podobnú aktivitu, napríklad T bunkové, B bunkové lebo Fc receptorové chiméryPojem proteín T bunkovej, B bunkovej alebo Fc receptorovej chiméry tak, ako sa tu používa, znamená tiež akýkoľvek funkčný derivát, fragment, analóg alebo chemický derivát, ktorý' môže byť v podstate podobný „divokej“ chimére (t. j. chimére prírodného typu) a ktorý má podobnú aktivitu (t. j. najvýhodnejšie 90 %, výhodnejšie 70 %, výhodne 40 % alebo aspoň 10 % aktivity receptorových chimér prírodného typu). Aktivita funkčných chimérových receptorových derivátov zahrnuje špecifické naviazanie (jeho extracelulámej časti) na cieľové činidlo alebo bunku a výslednou deštrukciu (riadenou jeho intracelulárnou alebo transmembránovou časťou) tohto činidla alebo bunky; takáto aktivita môže byť testovaná napríklad použitím akýchkoľvek tu opísaných analýz.

DNA sekvencie kódujúce T bunkovú, B bunkovú alebo Fc receptorovú chiméru podľa tohto vynálezu alebo jej funkčné deriváty môžu byť rekombinované s vektorovou DNA konvenčnými spôsobmi, medzi ktoré patrí ligácia so zarovnanými koncami alebo s prečnievajúcimi koncami, štepenie príslušného konca reštrikčným enzýmom, doplnenie kohezívných koncov podľa potreby, spracovanie s alkalickou fosfatázou tak, aby sa vyhlo nežiaducemu napojeniu a ligácia príslušnými ligázami. Spôsoby týchto manipulácií sú opísané Maniatisom T. a spol. (pozri skôr) a sú veľmi dobre známe odborníkom.

O molekule nukleovej kyseliny, ako je napríklad DNA, sa hovorí ako o molekule „schopnej expresiou poskytovať“ („schopnej exprimovať“) polypeptid, ak obsahuje sekvencie nukleotidov, ktoré obsahujú transkripčnú a translačnú regulačnú informáciu. Takéto sekvencie sú „odštiepiteľne napojené“ na sekvencie nukleotidov, ktoré kódujú polypeptid. Odštiepiteľná väzba je taká väzba, v ktorej regulačná DNA sekvencia a DNA sekvencia, ktorá má byť exprimovaná, sú spojené takým spôsobom, aby to umožnilo expresiu génu. Presná povaha regulačných oblastí potrebných na expresiu génu sa môže meniť od organizmu k organizmu, ale všeobecne bude obsahovať promótorovú oblasť, ktorá v prokaryotoch obsahuje tak promótor (ktorý riadi iniciáciu transkripcie RNA), ako aj DNA sekvenciu, ktorá, po transkribovaní na RNA, dá signál k iniciácii syntézy proteínu. Tieto oblasti budú normálne obsahovať také 5'nekódujúce sekvencie zahrnuté v iniciácii transkripcie a translácie, ako sú napríklad TATA box, sekvencia s čiapočkou, CAAT sekvencia a podobné.

Ak je to žiaduce, môže sa opísanými spôsobmi získať nekódujúca oblasť 3' k sekvencii génu kódujúceho proteín. Táto oblasť môže byť zachovaná pre transkripčné terminačné regulačné sekvencie, ako je napríklad terminácia a polyadenylácia. Zachovaním 3'-oblasti prirodzene priliehajúcej k DNA sekvencii kódujúcej proteín sa môžu získať terminačné signály transkripcie. Ak tieto terminačné signály transkripcie nie sú pri expresii uspokojivo funkčné, potom môžu byť nahradené v hostiteľskej bunke 3' oblasťou funkčnou v hostiteľskej bunke.

O týchto DNA sekvenciách (ako je napríklad sekvencia promótorovej oblasti a sekvencia kódujúca chiméry T bunkového receptora, B bunkového receptora a Fc receptora) sa dá povedať, že sú odštiepiteľne napojené, ak povaha väzby medzi týmito dvomi sekvenciami: 1. nevedie k zavedeniu posunovej mutácie,

2. neinterferuje so schopnosťou sekvencie promótorovej oblasti riadiť transkripciu sekvencie génu receptorovej chiméry alebo

3. neinterferuje so schopnosťou sekvencie génu receptorovej chiméry byť transkribovaná sekvenciou promótorovej oblasti. Promótorová oblasť by bola odštiepiteľne napojená na DNA sekvenciu, ak by promótor bol schopný uskutočniť transkripciu tejto DNA sekvencie. Na expresiu proteínu sú teda nutné transkripčné a translačné signály rozoznávané príslušným hostiteľom.

Tento vynález zahrnuje expresiu proteínu T bunkových receptorových chimér, B bunkových receptorových chimér alebo Fc receptorových chimér (alebo ich funkčných derivátov) buď v prokaryotickych alebo eukaryotických bunkách, aj keď expresia je výhodná v eukaryotických bunkách (a osobitne v ľudskom lymfocyte).

Protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu pripravovať ktorýmkoľvek z mnohých rôznych spôsobov. Napríklad bunky, ktoré expresiou poskytujú proteín receptorovej chiméry alebo jej funkčného derivátu, sa môžu podať živočíchovi, aby sa indukovala produkcia séra obsahujúceho polyklonálne protilátky, ktoré sú schopné viazať chiméru.

Podľa výhodného spôsobu protilátkami podľa tohto vynálezu sú monoklonálne protilátky. Tieto monoklonálne protilátky sa môžu pripravovať hybridómovou technológiou (Kohler a spol.: Náture 256, 495 (1975), Kohler a spol.: Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976), Kohler a spol.: Eur. J. Immunol. 6, 292 (1976), Hammerling a spol. v: „Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas“, Elsevier, N. Y., str. 563 až 684 (1981).). Všeobecne tieto procedúry zahrnujú imunizáciu živočícha antigénom chiméry T bunkového receptora, B bunkového receptora alebo Fc receptora. Splenocyty (bunky sleziny) takýchto zvierat sa extrahujú a fúzujú sa s vhodnou myelómovou bunkovou líniou. V súlade s týmto vynálezom sa môže používať akákoľvek vhodná myelómová bunková línia. Po fúzii sa výsledné hybridómové bunky selektívne uchovávajú v médiu HAT. Potom sa klonujú limitovaným zriedením, ako je to opísané Wandsem J. R. a spol.: Gastroentcrology 80. 225 až 232 (1981). Hybridómové bunky, ktoré sa získajú touto selekciou, sa testujú tak, aby sa identifikovali klony, ktoré vylučujú protilátky schopné viazať chiméru.

Protilátkami podľa tohto vynálezu môžu byť tiež polyklonálne alebo výhodne regionálne špecifické polyklonálne protilátky.

Protilátky proti chiméram T bunkového receptora, B bunkového receptora alebo Fc receptora podľa tohto vynálezu sa môžu používať na monitorovanie množstva chimérneho receptora (alebo bunky, ktorá nesie chimémy receptor) u pacienta. Takéto protilátky sú dobre vhodné na použitie v štandardnom imunodiagnostickom teste známom odborníkom, ako sú napríklad imunometrické alebo „sendvičové“ analýzy, ako je napríklad priama sendvičová, reverzná sendvičová alebo simultánna sendvičová analýza. Protilátky sa môžu používať v akomkoľvek počte kombinácií, pretože sa dajú stanoviť zručnými odborníkmi bez nepatričného experimentovania. Získajú sa tak imunoanalýzy s prijateľnou špecifickosťou, citlivosťou a presnosťou.

Štandardné odkazy vysvetľujú všeobecné princípy imunológie. Patria medzi ne práce Roitta I.: „Essential Immunology“, šieste vydanie, Blackwell Scientific Publications, vydavateľ, Oxford (1988); Kimball J. W.: „Introduction to Immunology“, druhé vydanie, Macmillan Publishing Co., vydavateľ, New York (1986); Roitt I. a spol.: „Immunology“, Gower Medical Publishing Ltd., vydavateľ, Londýn (1985); Campbell A.: „Monoclonal Antibody Technology“ v Burden R. a spol., redaktori: „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology“, diel 13, Elsevier, vydavateľ, Amsterodam (1984); Kiein J.: „Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination“, John Wiley and Sons, vydavateľ, New York (1982) a Kennett R. a spol., red.: „Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses“, Plénum Press, vydavateľ, New York (1980).).

Pojem „detegovanie“ zahrnuje stanovenie prítomnosti alebo neprítomnosti látky alebo stanovenie množstva látky. Tento pojem sa teda týka použitia materiálov, prostriedkov a spôsobov podľa tohto vynálezu na kvalitatívne a kvantitatívne stanovenia.

Izolácia iných hybridómov secernujúcich monoklonálne protilátky rovnakej špecifity ako sú tie, ktoré sa tu opisujú, sa vykonáva spôsobom anti-idiotypového vyhľadávania [skríning] (Potocmjak a spol.: Science 215, 1637 (1982).). V stručnosti -anti-idiotypová protilátka je protilátka, ktorá rozoznáva jedinečné determinanty prítomné na protilátke produkovanej klonom, o ktorý ide. Táto anti-idiotypová protilátka sa pripravuje imunizáciou živočícha rovnakého kmeňa, ako je zdroj monoklonálnej protilátky s monoklonálnou protilátkou, o ktorú ide. Imunizovaný živočích bude rozoznávať a odpovedať na idiotypové determinanty imunizujúcej protilátky prokudciou protilátky na tieto idiotypové determinanty (anti-idiotypová protilátka).

Na replikáciu sa hybridné bunky môžu kultivovať tak in vitro ako aj in vivo. Výhodným spôsobom kultivácie je spôsob in vivo pre svoje vysoké výťažky. V stručnosti - bunky jednotlivých hybridných kmeňov sa intraperitoneálne injekčné podávajú myšiam BALB/c. Získa sa tak ascitová tekutina, ktorá obsahuje vysoké koncentrácie žiadaných monoklonálných protilátok. Z kultivačných supematantov sa monoklonálne protilátky izotypu IgM lebo IgG môžu vyčistiť spôsobmi chromatografie na kolóne dobre známymi odborníkom.

Protilátky podľa tohto vynálezu sú osobitne vhodné na použitie pri imunoanalýzach, pri ktorých sa môžu používať v kvapalnej fáze alebo naviazané na nosič v pevnej fáze. Protilátky na tieto imunoanalýzy je možné tiež rôznymi spôsobmi označiť, aby sa dali detegovať.

Existuje mnoho rôznych markerov (značiek) a mnoho rôznych spôsobov značenia známych odborníkom. Medzi príklady typov markerov, ktoré sa môžu používať podľa tohto vynálezu, ale bez obmedzenia len na tieto, sú enzýmy, rádioizotopy, fluorescenčné zlúčeniny, chemiluminiscenčné zlúčeniny, bioluminiscenčné zlúčeniny a komplexy kovov. Odborníci poznajú iné vhodné markery na naviazanie na protilátky alebo budú schopní určiť tieto markery na základe rutinných pokusov. Naviazanie týchto značiek (markerov) na protilátky sa dá vykonávať štandardnými spôsobmi dobre známymi odborníkom.

Jeden spôsob, ktorým sa môžu protilátky podľa tohto vynálezu detegovateľne označovať, je naviazanie protilátky na enzým. Tento enzým potom, ak je vystavený pôsobeniu substrátu, bude reagovať so substrátom takým spôsobom, aby sa získala chemická častica, ktorá sa dá detegovať, napríklad spcktrofotometricky alebo fluorometrícky. Medzi príklady enzýmov, ktoré môžu byť použité na detegovateľne označené protilátky, patrí malátdehydrogenáza, staíylokoková nukleáza, delta-5-steroidná izomeráza, kvasinková alkohol-dehydrogenáza, alfa-glycerofosfát-dehydrogenáza, triosofosfát-izomeráza, biotinavidinová peroxidáza, chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, asparagináza, glukózooxidáza, -galaktosidáza, ribonukleáza, ureáza, kataláza, glukózo-6-fosfát-dehydrogenáza, glukoamyláza a acetylcholín-esteráza.

Prítomnosť detegovateľne označených protilátok sa dá tiež stanovovať značením protilátok rádioaktívnym izotopom, ktorý sa potom môže stanovovať takými prostriedkami, ako je napríklad počítač gama impulzov alebo scintilačný počítač. Izotopy, ktoré sú osobitne užitočné na účely podľa tohto vynálezu, sú 3H, 1251, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57Co, 59Fe a 75Se.

Je možné tiež detegovať naviazanie detegovateľne označených protilátok značením protilátok fluorescenčnou zlúčeninou. Ak sa fluorescenčné označená protilátka vystaví pôsobeniu svetla príslušnej vlnovej dĺžky, jej prítomnosť sa potom dá detegovať vďaka fluorescencii farbiva. Najobvyklejšie používané fluorescenčné značkovacie zlúčeniny sú fluoresceín, izotiokyanát, rhodamín, fykoerytrín, fýkokvanin, allofykokyanín, o-ftalaldehyd a fluoreskamín.

Protilátky podľa vynálezu sa môžu detegovateľne označovať tiež s použitím kovov emitujúcich fluorescenciu, ako je napríklad 152Eu alebo iné kovy zo série lantanidov. Tieto kovy sa môžu k molekule protilátky pripojiť takými chclatotvornými skupinami, ako je napríklad kyselina diethylenteramínopentaoctová (DPTA) alebo ethylendiamínotetraoctová (EDTA).

Protilátky sa môžu detegovateľne označiť tiež kondenzáciou s chemiluminiscenčnou zlúčeninou. Prítomnosť chemiluminiscenčne označenej protilátky sa potom stanoví detekciou prítomnosti luminiscencie, ktorá stúpa počas chemickej reakcie. Príkladmi osobitne užitočných chemiluminiscenčných značiacich zlúčenín sú luminal, izoluminol, aromatický akridínium-ester, imidazol, akridíniové soli, oxalátový ester a dioxetan.

Podobne sa na značenie protilátok podľa tohto vynálezu môže používať bioluminiscenčná zlúčenina. Bioluminiscencia je typ chemiluminiscencie, ktorá sa nachádza v biologických systémoch, v ktorých katalytický proteín zvyšuje účinnosť chemiluminiscenčnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscenčnej protilátky sa stanovuje detegovaním prítomnosti luminiscencie. Medzi dôležité bioluminiscenčné zlúčeniny na účely značenia patrí luciferín a luciferázový ekvorín.

Protilátky a v podstate vyčistený antigén podľa tohto vynálezu sú ideálne vhodné na prípravu súpravy. Taká súprava môže obsahovať nosiče, ktoré pozostávajú z jednotlivých zložiek, ktoré sú obsiahnuté v jednej lebo viac nádobkách, ako sú napríklad banky, skúmavky a podobné. Každá z nádobiek obsahuje jednotlivé prvky na analýzu.

Typov analýz, ktoré môže súprava zahrnovať, je veľa. Patria medzi ne napríklad analýzy kompetitívne a nekompetitívne. Typické príklady analýz, ktoré využívajú protilátky podľa tohto vynálezu, sú rádioimunoanalýzy (RIA), enzymové imunoanalýzy (EIA), analýzy typu ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) a imunometrické alebo sendvičová imunoanalýzy.

Pod pojmom „imunometrická analýza“ alebo „sendvičová imunoanalýza“ sa tu rozumie taká analýza, ktorá zahrnuje simultánnu sendvičovú, priamu sendvičovú alebo reverznú sendvičovú imunoanalýzu. Týmto pojmom dobre rozumejú odborníci. Skúsení odborníci tiež ocenia, že protilátky podľa tohto vynálezu budú užitočné v iných variáciách a formách analýz, ktoré sú dnes známe alebo ktoré môžu byť v budúcnosti vyvinuté. Tieto analýzy sú takisto zahrnuté v rozsahu tohto vynálezu.

Vo výhodnom spôsobe vykonávania analýz jc dôležité, aby v inkubačnom médiu (zvyčajne pridávanom so značenou rozpustnou protilátkou) boli prítomné isté „blokátory“. Tieto „blokátory“ sa pridávajú preto, aby sa zaistilo, aby nešpecifické proteíny, proteáza alebo ľudské protilátky na myšacie imunoglobulíny prítomné v experimentálnej vzorke nezosieťovali alebo nezničili protilátky na nosiči v pevnej fáze alebo rádioaktívne označenú indikátorovú protilátku, čím by sa získali falošne pozitívne alebo falošne negatívne výsledky. Výber „blokátorov“ teda podstatne pridáva na špecifickosti analýz, ktoré sú opísané v tomto vynáleze.

Zistilo sa, že ako „blokátory“ sa môžu používať početné nerelevantné (t. j. nešpecifické) protilátky rovnakej triedy lebo podtriedy (izotypu) ako sú tie, ktoré sa používajú pri analýze (napr. IgGl, IgG2a, IgM atd’.). Koncentrácia „blokátorov“ (normálne 1 až 100 pg/pl) je dôležitá, aby sa zachovala príslušná citlivosť a ešte sa inhibovala akákoľvek nechcená interferencia vzájomne sa vyskytujúcimi skrížené reaktívnymi proteínmi v ľudskom sére. Pufrovací systém obsahujúci „blokátory“ potrebuje byť zoptimalizovaný. Výhodné pufry sú tie, ktoré sú založené na slabých organických kyselinách, ako je napríklad imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS a podobné, pri fyziologickom rozmedzí pH. Trocha menej výhodné pufry sú anorganické pufry, ako je napríklad fosforečnan, boritan alebo uhličitan. Nakoniec by sa k pufru, ktorý obsahuje „blokátory“, pridali známe inhibítory proteázy (normálne v množstve 0,01 až 10 pg/ml).

Existuje mnoho imunoadsorbentov v pevnej fáze, ktoré sa používajú a ktoré sa môžu používať podľa tohto vynálezu. Medzi dobre známe imunoadsorbenty patrí sklo, polystyrén, polypropylén, dextrán, nylon a ďalšie materiály, vo forme skúmaviek, perličiek a mikrotitračných dosiek z týchto materiálov alebo potiahnutých týmito materiálmi, a podobne. Imobilizované protilátky môžu byť buď kovalentne, alebo fyzikálne naviazané na imunoadsorbent v pevnej fáze spôsobmi, ako je napríklad kovalentne naviazanie amidovou alebo esterovou väzbou, alebo absorpciou. Odborníci poznajú mnoho iných vhodných imunoadsorbentov v pevnej fáze a spôsobov imobilizácie protilátok na týchto imunoadsorbentoch alebo budú schopní túto imobilizáciu vykonať s jednoduchým rutinným experimentovaním.

Pri in vivo, in vitro lebo in situ diagnóze môžu byť značky (markery), ako sú napríklad radionuklidy, naviazané na protilátky podľa tohto vynálezu buď priamo alebo prostredníctvom funkčnej skupiny. Touto funkčnou skupinou, ktorá sa často používa na naviazanie rádioizotopov, ktoré existujú ako kationty kovov, na protilátky, je diethylentriaminopentaoctová kyselina (DPTA). Typické príklady kationtov kovov, ktoré sú viazané týmto spôsobom sú: 99mTc, 1231, 11 lln, 1311, 97Ru, 67Cu, 67Ga a 68Ga. Protilátky podľa tohto vynálezu môžu byť na účely diagnózy značené tiež nerádioaktívnymi izotopmi. Prvky, ktoré sú osobitne užitočné v tomto spôsobe sú 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr a 56Fe.

Antigén podľa tohto vynálezu sa môže izolovať v podstate čistej forme, ak sa používajú protilátky podľa tohto vynálezu. Usporiadanie podľa tohto vynálezu teda posky tuje v podstate čistú chiméru T bunkového receptora, B bunkového receptora alebo Fc receptora. Tento antigén sa vyznačuje tým, že je rozoznávaný a viaže sa na protilátky podľa tohto vynálezu. V inom usporiadaní tento vynález poskytuje spôsob izolácie alebo čistenia receptorového chimémeho antigénu tým, že sa vytvorí komplex uvedeného antigénu s jednou alebo viac protilátkami smerovanými proti receptorovej chimére.

V podstate čisté antigény chiméry T bunkového receptora, B bunkového receptora alebo Fc receptora podľa tohto vynálezu sa môžu tiež používať na detekciu alebo meranie protilátok chimér vo vzorke, ako je napríklad sérum alebo moč. Jedno usporiadanie tohto vynálezu teda obsahuje spôsob detegovania prítomnosti alebo množstva protilátky na antigén receptorovej chiméry vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že vzorka, ktorá obsahuje protilátku na chimérny antigén, sa uvedie do kontaktu s detegovateľne značenou receptorovou chimérou a uvedený marker sa deteguje. Je treba oceniť, že sa môžu používať tiež imunoreaktívne frakcie a imunoreaktívne analógy chiméry'. Pojem „imunoreaktívna frakcia“ znamená akúkoľvek časť chimémeho antigénu, ktorý má ekvivalentnú imunitnú odpoveď na protilátku smerovanú proti receptorovej chimére. Pojem „imunoreaktívny analóg“ znamená proteín, ktorý' sa odlišuje od proteínu receptorovej chiméry jednou alebo viac aminokyselinami, ale ktorý má ekvivalentnú imunitnú odpoveď na protilátku podľa tohto vynálezu.

Pojem „špecificky rozoznáva a viaže“ znamená protilátku, ktorá rozoznáva a viaže polypeptid chimémeho receptora, ale ktorý v podstate nerozoznáva ani neviaže iné molekuly vo vzorke, napr. v biologickej vzorke, ktorá obsahuje polypeptid receptora.

Pojem „autoimúnne-generovaná bunka“ znamená bunky, ktoré produkujú protilátky, ktoré reagujú s hostiteľským tkanivom alebo imunitné efektorové T bunky, ktoré sú autoreaktívne. Medzi takéto bunky patria protilátky proti acetylcholínovým receptorom (ktoré vedú napr. k myastenii gravis) lebo anti-DNA, anti-erytrocytové a anti-dostičkové autoprotilátky (ktoré vedú napr. k lupus erythromatodes).

Pojem „terapeutická bunka“ znamená bunku, ktorá bola transformovaná chimérou podľa tohto vynálezu tak, že je schopná rozoznávať a ničiť špecifické infekčné činidlo, bunku infikovanú špecifickým činidlom, nádorovú alebo rakovinovú bunku, alebo autoimúnne-generovanú bunku. Výhodne sú týmito terapeutickými bunkami bunky hematopoietného systému.

Pojem „extracelulárny“ znamená, že aspoň časť molekuly je na povrchu bunky. Pojem „intracelulárny“ znamená, že aspoň časť molekuly je vystavená pôsobeniu terapeutickej bunkovej cytoplazmy. Pojem „transmembrána“ znamená, že aspoň časťou molekuly je preklenutá plazmová membrána. Pojmy „extracelulárna časť“, „intracelulárna časť“ a „transmembránová časť“, tak, ako sa tu používajú, znamenajú, že môžu obsahovať obklopujúce aminokyselinové sekvencie, ktoré sa nachádzajú v priľahlých štruktúrnych častiach bunky.

Pojem „oligomerovať“ znamená vytvoriť komplex s inými proteínmi za vzniku dimérov, trimérov, tetramérov lebo iných oligomérov vyšších rádov. Tieto oligoméry môžu byť homooligoméry alebo heterooligoméry. „Oligomerizujúca časť“ je tá oblasť molekuly, ktorá riadi tvorbu komplexu (t. j. oligoméru).

Pojem „cytolytický“ znamená schopnosť ničiť bunku (napr. bunku infikovanú patogénom, nádorovú alebo rakovinovú bunku, alebo autoimunitne-generovanú bunku), alebo schopnosť ničiť infekčné činidlo (napr. vírus).

SK 283643 Β6

Pojem „vírus imunitnej nedostatočnosti“ znamená retrovírus, ktorý v svojej divokej (prírodnej) forme je schopný infikovať T4 bunky hostiteľa (primáta) a niesť vírusovú morfogenézu a morfológiu charakteristickú pre podčeľaď lentivírusov. Pod tento pojem patria, bez obmedzenia, všetky varianty HIV a SIV, vrátane HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand a SIVcpz.

Pojem „MHC-independentný“ znamená, že bunková cytolytická odpoveď nevyžaduje prítomnosť antigénu MHC triedy II na povrchu cieľovej bunky.

Pojem „ťunkčný derivát transdukujúci cytolytický signál“ znamená funkčný derivát (ako sa uvádza), ktorý je schopný riadiť, aspoň 10 %, výhodne 40 %, výhodnejšie 70 % alebo najvýhodnejšie aspoň 90 % biologickej aktivity prírodnej molekuly. Tak, ak je nasledujúci pojem používaný tu, znamená, že „funkčný derivát transdukujúci cytolytický signál“ môže pôsobiť priamo signálovaním terapeutickej bunke ničiť činidlá alebo bunku viažucu receptor (napr. v prípade časti intracelulárneho chimérneho receptora) alebo môže pôsobiť nepriamo podporovaním oligomerácie proteínov terapeutickej bunky transdukujúcich cytolytický signál (napr. v prípade transmembránovej domény). Tieto deriváty sa môžu testovať na účinnosť, napr. tu opísanými in vitro analýzami.

Pojem „funkčný derivát viažuci HIV obalový protein“ znamená funkčný derivát (uvedený), ktorý je schopný viazať akýkoľvek HIV obalový protein. Funkčné deriváty sa môžu identifikovať napríklad tu opísanými in vitro analýzami.

Terapeutické podávanie: Transformované bunky podľa tohto vynálezu sa môžu používať na terapiu početných ochorenl. Medzi bežné spôsoby podávania týchto transformovaných buniek patrí adoptívna imunoterapia alebo terapia prenosom bunky. Tieto spôsoby umožňujú návrat buniek s transformovaným imunitným systémom do krvného obehu. Rosenberg S. A.: Scientific Američan 62 (máj 1990); Rosenberg a spol.: The New England Joumal of Medicíne 323(9).570(1990).

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sa môžu podávať akémukoľvek živočíchovi, ktorému zlúčeniny podľa vynálezu prinášajú priaznivé účinky. Predovšetkým ide o človeka, aj keď tento vynález nie je zamýšľaný tak, aby bol obmedzený len na človeka.

V nasledujúcej časti tohto spisu bude vynález podrobne opísaný. Najskôr budú opísané obrázky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1. Charakterizácia CD4 chimér. Obrázok 1A ukazuje sekvenciu aminokyselín okolo miesta napojenia medzi CD4 (zvyšky 1 až 369) a rôznymi receptorovými reťazcami. Podčiarknutá sekvencia ukazuje polohu aminokyselín kódovaných vnútri miesta BamHI použitého na konštrukciu fúzie. Začiatok transmembránovej domény je označený vertikálnou čiarou. Sekvencia eta je identická so sekvenciou zeta na amínovom konci, ale rozchádza sa s ňou na karboxylovom konci (Jin a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 až 3323 (1990).).

Obrázok 1B ukazuje prietokovú cytometrickú analýzu povrchovej expresie CD4, CD4:zeta, CD4:gama a CD4:eta v bunkách CV1. Bunky boli infikované vírusom, ktorý expresiou poskytuje CD4 chiméry alebo CD16PI, inkubované 9 hodín pri teplote 37 °C a vyfarbené antiCD4 MAb Leu3A konjugovaňou s fykoerytrínom.

Obrázok 1C ukazuje imunoprecipitáciu značených CD4:zeta, CD4:gama nebo prírodnej CD4 exprimovaných v bunkách CV1. Pásy sú uvedené s redukujúcim (R) alebo bez redukujúceho (NR) činidla. Štandardy molekulovej hmotnosti v tisícoch sú uvedené vľavo.

Obrázok 2. Povrchová expresia CD16TM po koinfekcii CD16TM samotných (husté bodky) alebo koinfikovaných vírusom cxprimujícim CD4:gama (čiarky) alebo CD4:zeta (plná čiara). Riedke bodky označujú bunky infikované samotnou CD4:zeta vyfarbené 3G8 (Fleit a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79. 3275 až 3279 (1982).) (anti-CD16 MAb).

Obrázok 3. Mutantné CD4:zeta chimérové receptory, ktorým chýba zeta Asp-15, nepodporujú koexpresiu C1D16TM. Obrázok 3A je autorádiogram imunoprecipitovaných mutantných chimér po elektroforéze buď s redukujúcim činidlom (R), alebo bez redukujúceho činidla (NR). Obrázok 3B ukazuje povrchovú expresiu CD16TM po koinfekcii vírusmi, ktoré expresiou poskytujú CD16TM a nasledujúce zeta chiméry: CD4:zeta (silná čiara), CD4:zeta CllG (plná čiara), CD4:zeta (čiarkovaná čiara), CD4:zeta C I1G/D15G (husté bodky); bez koinfckcie (CD16TM samotná, riedke bodky). Bunky boli inkubované s anti-CD16 MAb 3G8 a s fykoerytrínom konjugovanými Fab'2 kožacími protilátkami na myšacie IgG. Úroveň expresie zeta chimér bola v podstate identická pre rôzne analyzované mutanty. Koinfekcia buniek vírusmi exprimujúcimi CD16TM a zeta chiméry nezmenila zreteľne povrchovú expresiu chimér (dáta nie sú uvedené).

Obrázok 4. Zvýšenie intracelulárnych voľných iónov vápnika nasleduje zosieťovanie mutantných zeta chimér v T bunkovej línii. Bunky Jurkat E6 (Weiss a spol.: J. Immunol. 133. 123 až 128 (1984).) boli infikované rekombinantným vírusom vakcinie a analyzované prietokovou cytometriou. Výsledky sú uvedené pre hradlovú CD4+ populáciu, takže sú analyzované len bunky, ktoré expresiou poskytujú relevantný chimémy protein. Stredný pomer fialovej k modrej Indo-1 fluorescencii vyjadruje intracelulárnu koncentráciu voľného vápnika v populácii ako celku. Percento zodpovedajúcich buniek znamená frakciu buniek, ktorá presahuje vopred stanovený prahový pomer (stanovený tak, aby 10 % nespracovaných buniek bolo pozitívnych). Obrázky 4A a 4B ukazujú bunky Jurkat exprimujúce CD4:zeta (plná čiara) alebo CDl6:zeta (čiarkovaná čiara), ktoré boli vystavené pôsobeniu anti-CD4 MAb Leu3a (fykoerytrínový konjugát), s nasledujúcim zosieťovaním kozou protilátkou na myšacie IgG. Bodkovaná čiara ukazuje odpoveď neinfikovaných buniek na anti-CD3 MAb OKT3. Obrázky 4C a 4D ukazujú bunky Jurkat exprimujúce CD4:zetaD15G (plná čiara), CD4:zetaCllG/D15G (čiarkovaná čiara) alebo CD4:zetaCllG (bodky), ktoré boli spracované a analyzované rovnako ako na obrázkoch 4A a 4B.

Obrázok 5. CD4:zeta, CD4:eta a CD4:gama receptory umožňujú cytolytickým T lymfocytom (CTL) zabíjať ciele exprimujúce HIV-1 gpl20/41. Obrázok 5A: plné krúžky sa týkajú CTL exprimujúcich CD4:zeta inkubovaných s HeLa bunkami exprimujúcimi gpl20/41; prázdne krúžky sa týkajú CTL exprimujúcich CD4:zeta inkubovaných neinfikovanými HeLa bunkami; plné štvorčeky sa týkajú neinfikovaných CTL inkubovaných s HeLa bunkami exprimujúcimi gp 120/41; prázdne štvorčeky znamenajú neinfikované CTL inkubované s neinfikovanými HeLa bunkami. Obrázok 5B; plné krúžky znamenajú CTL exprimujúce CD4:eta inkubovanú s HeLa bunkami exprimujúcimi gp 120/41; prázdne krúžky znamenajú CTL exprimujúce CD4:gama inkubované s HeLa bunkami exprimujúcimi gpl20/41; prázdne štvorčeky znamenajú CTL exprimujúce C11G/D15G dvojitú mutantovú CD4:zeta chiméru inkubované s HeLa bunkami exprimujúcimi gpl 20/41. Obrázok 5C: Analýza prietokovou cytometriou CD4 expresie CTL použitých na obr.

5B. Na opravu cieľa na efektorové pomery sa stanoví percento buniek exprimujúcich CD4 chiméru odrátaním negatívnej (neinfikovanej) populácie superpozíciou histogramu. Na porovnávacie účely na tomto obrázku sa neinfikovaným bunkám priradí ľubovoľný prah, ktorý má zhruba rovnakú frakciu pozitívnu pre iné bunkové populácie, ako by malo odčítanie na histograme.

Obrázok 6. Špecifickosť CD4-smerovanej cytolýzy. Obrázok 6A: plné krúžky znamenajú CTL exprimujúce CD4:zeta inkubované s HeLa bunkami exprimujúcimi CDI6P1, prázdne krúžky znamenajú CTL exprimujúcu CD4 inkubovanú s HeLa bunkami exprimujúcimi gpl20; plné štvorčeky znamenajú CTI, exprimujúcu CD16:zeta inkubovanú s HeLa bunkami exprimujúcimi gp 120/41: prázdne štvorčeky znamenajú CTL exprimujúcu CD16PI inkubovanu s HeLa bunkami exprimujúcimi gpl20/41. Obrázok 6B: plné krúžky znamenajú CTL exprimujúcu CD4:zeta inkubovanú s Raji (MHC trieda 11+) bunkami: prázdne krúžky znamenajú neinfikované CTL bunky inkubované s RJ2.2.5 (MHC trieda II- Raji mutantu) bunkami; plné štvorčeky znamenajú neinfikované CTL inkubované s Raji (MHC trieda 11+) bunkami; prázdne štvorčeky znamenajú CTL exprimujúcu CD4:zeta inkubované s RJ2.2.5 (MHC trieda II-) bunkami. Stupnica na zvislej osi je expandovaná.

Obrázok 7. Charakterizácia CD16:zeta chimémeho receptora. Obrázok 7A je schematický diagram CD16:zeta napojeného proteínu. Extracelulárna časť fosfatidylinozitol-naviazanej formy monomérnej CD16 bola napojená na dimémy zeta externe k transmembránovej doméne. Sekvencia proteínu v mieste fúzie je uvedená v spodnej časti. Obrázok 7B ukazuje analýzu prietokovou cytometriou mobilizácie vápnika po zosieťovaní CD16:zeta chiméry v buď TCR pozitívnej, alebo TCR negatívnej bunkovej línii. Uvádza sa stredný pomer fialovej k modrej fluorescencii (miera relatívnej koncentrácie iónu vápnika) bunkových populácií spracovaných s protilátkami v čase 0. Plné štvorčeky znamenajú odpoveď Jurkat buniek na anti-CD3 MAb OKT3; plné trojuholníky znamenajú odpoveď CD16:zeta na anti-CD16 MAb 3G8 zosieťovanie v REX33A TCR- mutantu; prázdne štvorčeky znamenajú odpoveď na CD16:zeta zosieťovanie v Jurkat TCR- mutantnej línii JRT3.T3.5; prázdne trojuholníky znamenajú odpoveď na CD16:zeta zosieťovanie v Jurkat bunkách; krížiky znamenajú odpoveď na nechimérny CD 16 v Jurkat bunkách a bodky znamenajú odpoveď na nechimérny CD 16 v REX33A TCR- bunkovej línii.

Obrázok 8. Delečná analýza cytolytického potenciálu. Obrázok 8A ukazuje umiestnenie zeta delečných koncových bodov. Tu ako inde mutácie v zeta sú reprezentované pôvodnou konvenciou o umiestnení zvyškov v mutantoch, takže D66* znamená napríklad náhradu Asp-66 terminačným kodónom. Obrázok 8B ukazuje výsledky cytolytickej analýzy nedeletovanej CD16:zeta a hlavnej zeta delécie. Hybridómové bunky exprimujúce povrchovú protilátku na CD 16 boli naplnené 51Cr a inkubované so zvyšujúcimi sa počtami ľudských cytolytických lymfocytov (CTL) infikovaných rekombinantmi vakcínie exprimujúcimi CD16:zeta chiméry. Percento uvoľneného 51Cr je vynesené ako funkcia pomeru efektoru (CTL) k cieľovej (hybridómovej) bunke (e/t). Plné krúžky znamenajú cytolýzu sprostredkovanú bunkami exprimujúcimi CD16:zeta (mfi 18.7); plné štvorčeky znamenajú cytolýzu sprostredkovanú bunkami exprimujúcimi CD16:zeta Asp66* (mfi 940.2); prázdne štvorčeky znamenajú cytolýzu sprostredkovanú bunkami exprimujúcimi CD16:zetaGlu60* (mfi 16.0); prázdne krúžky znamenajú cytolýzu sprostredkovanú bunkami exprimujú cimi CD126:zetaTyr51* (mfi 17.4); plné trojuholníky znamenajú cytolýzu sprostredkovanú bunkami exprimujúcimi CD16:zetaPhe34* (mfi 17.8) a prázdne trojuholníky znamenajú cytolýzu sprostredkovanú bunkami exprimujúcimi nechimérny CD16 (mfi 591). Aj keď v týchto pokusoch sa expresia CD16:zetaAsp66* nehodila k expresii iných fúzovaných proteínov, cytolýza bunkami exprimujúcimi CD16:zeta v rovnakých hladinách v rovnakom pokuse poskytla výsledky v podstate identické s výsledkami získanými s bunkami exprimujúcimi CD16:zetaAsp66* (neuvedené).

Obrázok 9. Odstránenie potenciálu pre transmembránové interakcie odhaľuje krátky zeta segment schopný sprostredkovať cytolýzu. Obrázok 9A je schematický diagram monomémych dvojdielnych a trojdielnych chimér. Hore je CD16:zeta konštrukcia zrezaná pri zvyšku 65 s chýbajúcimi transmembránovými Cys a Asp zvyškami. Pod ňou sú konštrukcie CD16:CD5:zeta a CD16:CD7:zeta a príslušné kontroly. Peptidové sekvencie intracelulárnych domén sú uvedené nižšie. Obrázok 9B ukazuje cytolytickú aktivitu monomémych chimémych delečných mutantov. Cytolytická aktivita buniek exprimujúcich CD16:zeta (plné krúžky; mfi 495) bola porovnaná s cytolytickou aktivitou buniek exprimujúcich CD16:zetaAsp66* (plné štvorčeky; mfi 527) alebo mutantov CD16:zeta. CysllGly/Aspl5Gly/Asp66* (prázdne štvorčeky; mfi 338) a CD16: zetaCysllGly/Aspl5Gly/Glu608 (plné trojuholníky; mfi 259). Obrázok 9C ukazuje cytolytickú aktivitu sprostredkovanú trojdielnymi fuzovanými proteínmi. Plné trojuholníky znamenajú CD16:zetaAsp66*; prázdne štvorčeky znamenajú CD16:5:zeta (48 až 65), plné štvorčeky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65), prázdne trojuholníky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 59), prázdne krúžky znamenajú CD 16:5 a plné krúžky znamenajú CD 16:7. Obrázok 9D ukazuje mobilizáciu vápniku mutantom a trojdielnymi chimérami v TCR negatívnej Jurkat JRT3.T3.5 mutantnej bunkovej línii. Prázdne krúžky znamenajú odpoveď buniek exprimujúcich dimémy CD16:zetaAsp66#; plné štvorčeky znamenajú odpoveď buniek exprimujúcich CD16: zetaCysllGly/Aspl5Gly/Asp66*; prázdne štvorčeky znamenajú odpoveď buniek exprimujúcich CD16:zetaCysllGly/Aspl5Gly/Glu60*; plné trojuholníky znamenajú odpoveď buniek exprimujúcich CD16:7: zeta(48 až 65) a prázdne trojuholníky znamenajú odpoveď buniek exprimujúcich CD16:zeta (48 až 59).

Obrázok 10. Príspevok jednotlivých aminokyselín k aktivite cytolytického signál transdukujúceho motívu s 18 zvyškami. Obrázky 10A a 10B ukazujú cytolytickú aktivitu a obrázok 10C ukazuje mobilizáciu iónu vápnika sprostredkovanú chimérami nesúcimi bodovú mutáciu blízko karboxylového konca, tyrozínu (Y62). Obrázky 10A a 10B predstavujú dáta zhromaždené s bunkami exprimujúcimi nízke, respektíve vysoké množstvá CD16:zeta fúzovaných proteínov. Na mobilizáciu vápnika a analýzy cytolýzy sa používajú rovnaké symboly. Sú uvedené napravo v jednopísmenkovom kóde. Plné krúžky znamenajú bunky exprimujúce CD16:zeta (mfi v A, 21; B, 376); plné štvorčeky znamenajú bunky exprimujúce CD16:7:zeta(48 až 65) (mfi A, 31; B, 82); prázdne štvorčeky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92), krížiky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65)Asp63Asn (mfi A30; B, 74): plné trojuholníky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65)Tyr62Phe (mfi A, 14; B, 88); prázdne krúžky znamenajú CD16:7: :zeta(48 až 65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62) a prázdne trojuholníky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65)Tyr62Ser (mfi B, 64). Obrázky 10D a 10E ukazujú cytolytickú aktivitu a obrázok 10F ukazuje mobilizáciu iónov vápnika chimérami nesúcimi bodovú mutáciu blízku aminovému koncu, tyrozínu (¥51). Na mobilizáciu vápnika a analýzy cytolýzy boli použité rovnaké symboly. Tieto symboly sú uvedené na pravej strane. Plné krúžky znamenajú bunky exprimujúce CD16:zeta (mfí v D, 21,2; v E, 672); plné štvorčeky znamenajú bunky exprimujúce CD16:7:zeta(48 až 65) (mfi D, 31,3; E, 179); plné trojuholníky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65)Asn48Ser (mfi D, 22, 4; E, 209); prázdne štvorčeky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65)Leu50Ser (mfi D, 25,0; E, 142) a prázdne trojuholníky znamenajú CD16:7:zeta(48 až 65)Tyr51Phe (mfi D, 32,3; E, 294).

Obrázok 11. Usporiadanie vnútorných opakovaní zeta a porovnanie ich schopností podporovať cytolýzu. Obrázok 11A je schematický diagram chimér vytvorených rozdelením zeta intracelulárnych chimér na tretiny a ich pripojením k transmembránovej doméne chiméry CD 16:7. Ďalej sa uvádzajú sekvencie intracelulárnych domén, zdieľané zvyšky sú uvedené v rámčekoch a vzájomne súvisiace zvyšky sú označené hviezdičkami. Obrázok 11B ukazuje cytolytickú potenciu troch zeta poddomén. Plné krúžky znamenajú bunky exprimujúce CD16: zeta (mfi 476); plné štvorčeky znamenajú CD16:7:zeta(33 až 65) (mfi 68); prázdne štvorčeky znamenajú CDl6:7:zeta(71 až 104) (mfi 114) a plné trojuholníky znamenajú CD16:7:zeta(104 až 138) (mfí 104).

Obrázok 12 je schematický diagram CD16:FcRgamaII chimér.

Obrázok 13. Mobilizácia vápnika po zosieťovaní CD4:FcRgamaII a CD16:FcRgamaII chimér. Obrázok 13A ukazuje pomer fialovej k modrej fluorescencii emitovanej bunkami s náplňou fluórofóru Indo-I citlivého na vápnik, ktorý je uvedený ako funkcia času po zosieťovaní CD 16 extracelulárnej domény protilátkami. Obrázok 13B ukazuje podobnú analýzu zvýšenia pomeru fialovej k modrej fluorescencii buniek nesúcich CD4:FcRgamaII chiméry po zosieťovaní s protilátkami.

Obrázok 14. Cytolytická analýza CD4:FcRgamaII a CD16:FcRgamaII chimér. Obrázok 14A ukazuje percento 51Cr uvoľneného z anti-CD16 hybdridómových (cieľových) buniek, keď sa bunky vystavia zvyšujúcemu sa počtu cytotoxických T lymfocytov exprimujúcich CD16:FcRgamaII chiméry (efektorové bunky). Obrázok 14B ukazuje podobnú analýzu cytotoxicity sprostredkovanej CD4:FcRgamaII chimérami proti cieľovým bunkám exprimujúcim HIV obalové glykoproteíny.

Obrázok 15. Identifikácia zvyškov v FcRgamall A konci, ktoré sú dôležité pre cytolýzu. Obrázok 15A je schematický diagram delečných konštrukcií. Obrázky 15B a 15C ukazujú mobilizáciu vápnika a cytolýzu delečných variantov CD16:FcRgamalI A. Obrázky 15D a 15E ukazujú mobilizáciu vápnika a cytolýzu trojdielnymi chimérami nesúcimi progresívne menší amínový koniec intracelulárncho konca CD16:FcRgamaII A.

Obrázok 16 (sekvencia id. č. 24) ukazuje sekvenciu aminokyselín CD3 delta receptorového proteínu; sekvencia v rámčeku znamená výhodnú časť transdukujúcu cytolytický signál.

Obrázok 17 (sekvencia id. č. 25) ukazuje sekvenciu aminokyselín T3 gama receptorového proteínu; sekvencia v rámčeku znamená výhodnú časť transdukujúcu cytolytický signál.

Obrázok 18 (sekvencia id. č. 26) ukazuje sekvenciu aminokyselín mbl receptorového proteínu; sekvencia v rámčeku znamená výhodnú časť transdukujúcu cytolytický signál.

Obrázok 19 (sekvencia id. č. 27) ukazuje sekvenciu aminokyselín B29 receptorového proteínu; sekvencia v rámčeku znamená výhodnú časť transdukujúcu cytolytický signál.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Konštrukcia ľudských IgG 1 :receptorových chimér

Sekvencia ťažkých reťazcov ľudského IgG 1 sa pripraví pripojením sekvencií v CH3 doméne k cDNA fragmentu odvodenému od 3' konca transmembránovej formy protilátkovej mRNA. Fragment s 3'-koncom sa získa polymerázovou reťazovou reakciou knižnice mandľovej cDNA ako substrátu s oligonukleotidmi so sekvenciami: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sekvencia id. č. 7) a CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA CiCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (sekvencia id. č. 8), zodpovedajúcich 5' a 3' koncom fragmentov žiadanej DNA. 5' Oligo je komplementárny k miestu v CH1 doméne ľudského IgGl a 3’ oligo je komplementárny k miestu 5' sekvencií kódujúcich membránovú preklenújúcu doménu. PCR produkt sa rozštiepi pôsobením BstXI a BamHI a liguje sa medzi miesta BstXI a BamHI polosyntetického génu IgGl protilátky nesúceho variabilné a konštantné oblasti. Po inzercii BstXI BamHI fragmentu sa amplifikované časti konštrukcie nahradia až do Smal miesta v CH3 zmenou reštrikčného fragmentu, takže od PCR reakcie je odvodená len časť medzi Smal miestom a 3’ oligo.

Na vytvorenie ľudského IgGl:zeta chimémeho receptora sa gén ťažkého reťazca končiaci v BamHI mieste spojí s ďalej opísaným BamHI miestom zeta chiméry, takže sekvencia protilátok vytvorí extracelulámu časť. Prietoková cytomctria COS buniek transfektovaných plazmidom kódujúcim chiméru má vysokú úroveň expresie proti látkových determinant, ak bol kotransfekovaný plazmid expresie kódujúci cDNA ľahkého reťazca, a miernu expresiu protilátkových determinant, ak plazmid expresie s ľahkým reťazcom nebol prítomný.

Opísanými štandardnými spôsobmi molekulárnej biológie môžu byť zkonštruované podobné chiméry obsahujúce ľudský IgGl fúzovaný s eta alebo gama (pozri nižšie), alebo akákoľvek signál transdukujúca časť proteínu T bunkového receptora alebo Fc receptora.

Na vytvorenie jedinej transkripčnej jednotky, ktorá by umožnila, aby tak ťažký ako aj ľahký reťazec boli exprimované z jediného promótora, sa zo sekvencií kódujúcich ťažký a ľahký reťazec a z 5' neprekladanej časti mRNA kódujúcej proteín regulovaný glukózou s molekulovou hmotnosťou 78 000, inak známy ako grp78 alebo BiP, vytvorí plazmid kódujúci bicistronovú mRNA. Sekvencie grp78 boli získané PCR ľudskej genómovej DNA pomocou primárov, ktoré majú sekvencie: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (sekvencia id. č. 9) a CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (sekvencia id. č. 10) na 5', respektíve na 3' konci. Polymerázové reťazové reakcie s týmito oligo sa vykonávajú v prítomnosti 10 % dimetylsulfoxidu. Fragment, ktorý sa získa PCR, sa rozštiepi pôsobením Nôti a HincII a vloží sa medzi Nôti a Hpal miesta po smere reťazca od sekvencií kódujúcich ľudský IgGl. Sekvencie, ktoré kódujú ľahký reťazec cDNA ľudského IgG kapa, sa potom vložia po smere vlákna od grp78 leaderu s použitím miesta HincII a ďalšieho miesta vo vektore. Plazmid expresie, ktorý sa získa týmito manipuláciami, pozostáva v podstate z génu semisyntetického ťažkého reťazca, po ktorom nasledujú sekvencia grp78 leader, sekvencia kapa ľahkého reťazca cDNA a poíyadenylačné signály odvodené od SV40 DNA fragmentu. Transfekcia COS buniek plazmidom expresie poskytla význačne zlepšenú expresiu determinánt ťažkého

SK 283643 Β6 reťazca v porovnaní s transfekciou plazmidomu kódujúcim determinanty ťažkého reťazca samotného.

Pri tvorbe bicistronového génu obsahujúceho chiméru ťažký reťazec/receptor a ľahký reťazec sa môžu sekvencie ťažkého reťazca proti smeru vlákna nahradiť akýmkoľvek tu opísaným chimémym génom ťažký reťazec/receptor.

Príklad 2

Konštrukcia CD4 receptorových chimér

Ľudské zeta (Weissman a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9709 až 9713 (1988b).) a gama (Kuster a spol.: J. Biol. Chem. 265. 6448 až 6452 (1990).) cDNA sa izolujú poiymerázovou reťazovou reakciou z knižníc pripravených z HPB-ALL nádorovej bunkovej línie (Aruffo a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 až 8577 (1987b).) a z ľudských prírodných buniek zabíjače, zatiaľ čo eta cDNA (Jin a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 až 3323 (1990).) sa izoluje z myšacej tymocytovej knižnice. Zeta, cta a gama cDNA sa napoja na extracelulámu doménu zostavenej formy CD4 nesúcej BamHI miesto práve proti smeru vlákna membránovej preklenovacej domény (Aruffo a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 až 8577 (1987b); Zettlmeissl a spol.: DNA Celí Biol. 9, 347 až 353 (1990.), ktorá sa napojí na BamHI miesto prirodzene prítomné v zeta a eta cDNA v mieste umiestnenom niekoľko zvyškov proti smeru vlákna membránovej preklenovacej domény (sekvencie id. č. 1, 3, 4 a 6). Pri tvorbe fuzovaného proteínu s gama sa BamHI miesto zostaví tak, aby bolo v sekvencii s približne rovnakým umiestnením (obr. 1, sekvencia id. č. 2 a 5). Génové fúzie sa zavedú do plazmidu expresie vírusu vakcínie nesúceho E. coli gpt gén ako selektovateľný marker (M. Amiot a B. S., nepublikované.) a vloží sa do genómu vakcínie kmene WR homológnou rekombináciou a selekciou na rast v mykofenoíovej kyseline (Falkner a spol.: J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988); Boyle a spol.: Gene 65, 123 až 128 (1988).). Analýza prietokovou cytometriou ukázala, že rekombinanty vakcínie smerujú početnú produkciu CD4:zeta a CD4:gama fuzovaných proteínov na bunkový povrch, zatiaľ čo expresia CD4:eta je podstatne slabšia (obr. 1). Neskôr uvedené zistenie je v súlade s nedávnou správou, že transfekcia eta cDNA plazmidu expresie do myšacej hybridómovej bunkovej línie poskytuje podstatne menšiu expresiu ako transfekcia porovnateľného zeta plazmidu expresie (Clayton a spol.: J. Exp. Med. 172, 1243 až 1253 (1990).).

Imunoprecipitácia buniek infikovaných rekombinantmi vakcínie odhalila, že fúzované proteíny tvoria kovalentné diméry, na rozdiel od prirodzene sa vyskytujúceho CD4 antigénu (obr. 1). Zistilo sa, že monomérnc CD4:zeta a CD4:gama fúzované proteíny a natívne CD4 majú molekulovú hmotnosť 63 000, 55 000 a 53 000. Väčšie hmotnosti fuzovaných proteínov sú približne v súlade s väčšou dĺžkou intracelulárnej časti, ktorá presahuje prírodný CD4 o 75 (CD4:zeta) alebo 5 (CD4:gama) zvyškov.

Príklad 3

CD4 chiméry môžu asociovať s inými receptorovými reťazcami.

Expresia bunkovým povrchom formy makrofág/bunka prirodzeného zabíjača ľudského FcgamaRIII (CD16TM) na transfektantoch je uľahčená kotransfekciou s myšacím (Kurosaki a spol.: Náture 342. 805 až 807 (1989).) alebo ľudským (Hibbs a spol.: Science 246, 1608 až 1611 (1989) gama a tiež s ľudským zeta (Lanier a spol.: Náture 342. 803 až 805 (1989).).

V súlade s týmito správami expresia chimér umožňuje tiež povrchovú expresiu CD16TM, ak sa dodá do cieľovej bunky buď kotransfekciou, alebo koinfekciou vírusmi rekombinantnej vakcínie (obr. 2). Podpora (CD16TM) povrchovej expresie zetou bola význačnej šia ako podpora gamou (obr. 2) v skúmanej bunkovej línii, zatiaľ čo prírodný CD4 (dáta sa neuvádzajú) nezvyšoval CD 16TM povrchovú expresiu.

Príklad 4

Asp zeta mutanty nekoasociujú s Fc receptorom

Na vytvorenie chimér, ktoré by neasociovali s existujúcimi antigénovými alebo Fc receptormi sa pripravia mutantné zeta fúzované proteíny, ktorým chýba buď intramembránový Asp, alebo intramembránový Cys zvyšok, alebo obidva. Prietoková cytometria ukázala, že intenzita expresie bunkovým povrchom rôznymi mutantnými chimérami nebola zreteľne odlišná od nemutovaného prekurzora (dáta neuvedené). Pokusy imunoprecipitácie ukázali, že celková expresia chimérami bola podobná (obr. 3). Ako sa očakávalo, bolo zistené, že mutantné chiméry, ktorým chýba transmembránový cysteínový zvyšok, netvoria diméry spojené disulfidovou väzbou (obr. 3). Dve mutantné chiméry, ktorým chýba Asp, neboli schopné podporovať povrchovú expresiu CD16TM, zatiaľ čo monoméme chiméry, ktorým chýba Cys, ale ktoré nesú Asp, umožňovali koexpresiu CD16TM, ale s nižšou účinnosťou ako rodičovský dimér (obr. 3).

Príklad 5

Mutantné receptory zachovávajú schopnosť iniciovať odpoveď vápnika

Na zistenie toho, či zosieťovanie fuzovaných proteínov umožňuje akumuláciu voľného intracelulámeho vápnika podobným spôsobom, ako je to známe pri antigénovom receptore T buniek, sa bunky leukémovej línie ľudských T buniek, Jurkat E6 (ATCC číslo TIB 152, Americká zbierka typov kultúr, Rockville, Md.) infikuje rekombinantmi vakcínie. Meria sa relatívna koncentrácia cytoplazmového vápnika po zosieťovaní extracelulámej domény protilátkami. Merania prietokovou cytometriou sa vykonávali s bunkami naplnenými farbivom Indo-1 citlivým na vápnik (Grynkiewicz a spol.: J. Biol. Chem. 260, 3340 až 3450 (1985); Rabinovítch a spol.: J. Immunol. 137. 952 až 961 (1986).). Obrázok 4 ukazuje výsledky pokusov toku vápnika s bunkami infikovaných CD4:zeta a Asp+ a Cys- mutantmi zeta. Zosieťovanie chimér reprodukovateľné zvýšilo intracelulámy vápnik. CD4:eta a CD4:gama podobne umožnili akumuláciu intracelulámeho vápnika v infikovaných bunkách (dáta sa neuvádzajú). Bunky Jurkat exprimujú nízke hladiny CD4 na povrchu buniek, ale zosieťovanie prírodného CD4 v prítomnosti lebo neprítomnosti CD16:zeta (C. R. a B. S.: nepublikované) (obr. 4 a dáta neuvedené) nemenia hladiny intracelulámeho vápnika.

Príklad 6

CD4:zeta, eta a gama chiméry sprostredkujú cytolýzu cieľov exprimujúcich HIV gp 120/41

Na stanovenie toho, či chiméme receptory spúšťajú cytolytický efektorový program, bol vytvorený modelový systém cieľ:efektor založený na CD4 rozoznávaní HIV obalového gpl20/gp41 komplexu. Bunky Hela boli infikované rekombinantnými vírusmi vakcínie, ktoré expresiou poskytujú gpl20/gp41 (Chakrabarti a spol.: Náture 320, 535 až 537 (1986) a Earl a spol.: J. Virol. 64, 2448 až 2451 (1990).), a označený 51Cr. Označené bunky boli inkubované s bunkami z ľudskej allošpecifickej (CD8+, CD4-) cytotoxickej T lymfocytovej línie, ktorá bola infikovaná rekombinantmi vakcínie, ktoré expresiou poskytujú CD4:ze ta, CD4:eta alebo CD4:gama chiméry alebo CD4:zetaCysllGly:Aspl5Gly dvojitú mutantnú chiméru. Obrázok 5 ukazuje, že bunky HeLa, ktoré expresiou poskytujú gpl20/41, boli špecificky lyzované cytotoxickými T lymfocytmi (CTL), ktoré expresiou poskytujú CD4 chiméry. Neinfikované bunky HeLa neboli cielené CTL vyzbrojenými CD4:zeta chimérami a bunky HeLa, ktoré expresiou poskytujú gpl20/41, neboli rozoznávané neinfikovanými CTL. Na porovnanie účinnosti rôznych chimér sa opravia pomery efektoru k cieľu pre frakciu CTL, ktorá exprimuje CD4 chiméry, a pre frakciu buniek HeLa, ktoré exprimujú gp 120/41, podľa toho, ako to bolo zmerané prietokovou cytometriou. Obrázok 5C ukazuje cytometrickú analýzu expresie CD4 CTL použitú pri pokusoch cytolýzy uvedených na obrázkoch 4A a 4B. Aj keď stredná hustota povrchovej CD4:zeta veľmi prevyšuje strednú hustotu CD4:eta, cytolytické účinnosti buniek exprimujúcich ktorúkoľvek formu boli podobné. Po oprave na frakciu cieľov exprimujúcich gpl20, je účinnosť cytolýzy sprostredkovanej proteínmí CD4:zeta a CD4:eta porovnateľná s najlepšími účinnosťami opísanými pre špecifické páry T bunkový receptorový cieľ.efektor (stredný pomer efektoru k cieľu pre 50 % uvoľňovanie T bunkami exprimujúcimi CD4:zeta bol 1,9 ± 0,99, n = 10). Fúzia CD4:gama bola menej aktívna ako fúzia CD4:zeta, ktorej chýbajú transmembránové zvyšky Asp a Cys. V oboch prípadoch však bola pozorovaná významná cytolýza (obrázok 5).

Na kontrolu možnosti, že infekcia vakcíniou môže podporovať artefaktové rozpoznávanie CTL, boli vykonané podobné cytolytické pokusy s cieľovými bunkami infikovanými rekombinantmi vakcínie, ktoré expresiou poskytujú fosfatidylinozitolom viazanú formu CD16 (CD16FI) a označené 51Cr, a CVTL infikovanou kontrolnými rekombinantmi exprimujúcimi buď CD16FI, alebo CD16:zeta. Obrázok 6A ukazuje, že bunky, ktoré expresiou poskytujú ne-CD4 chiméry, nerozoznávajú prírodné HeLa bunky alebo bunky HeLa exprimujúce gp 120/41, a podobne, že T bunky, ktoré expresiou poskytujú CD4 chiméry, nerozoznávajú HeLa bunky exprimujúce iné povrchové proteíny kódované vakcíniou. A ďalej , CTL, ktoré expresiou poskytujú nechimérne CD4, nelýzujú významnou mierou HeLa bunky, ktoré expresiou poskytujú gp 120/41 (obr.6A).

Príklad 7

Bunky nesúce MHC triedy II nie sú cieľom chimér

O CD4 sa predpokladá, že interaguje s nepolymorfnou sekvenciou exprimovanou antigénom MHC triedy II (Gay a spol.: Náture 328. 626 až 629 (1987); Sleckman a spol.: Náture 328. 351 až 353 (1987).). Aj keď špecifická interakcia medzi CD4 a antigénom triedy II nikdy nebola dokumentovaná s vyčistenými proteínmi, za istých podmienok sa dá preukázať adhéziou medzi bunkami exprimujúcimi CD4 a bunkami exprimujúcimi molekuly triedy II (Doyle a spol.: Náture 330. 256 až 259 (1987); Clayton a spol.: J. Exp. Med. 172, 1243 až 1253 (1990), Lamarre a spol.: Science 245, 743 až 746 (1989).). Ďalej sa skúmalo, či sa dá zistiť zabíjanie medzi bunkami nesúcimi triedu II. Obrázok 6B ukazuje, že neexistuje žiadna špecifická cytolýza riadená CD4:zeta proti Raji B bunkovej línii, ktorá exprimuje početné množstvá antigénu triedy II. Aj keď existuje mierna cytolýza (asi 5 %), mutant Raji negatívny na triedu II, RJ2.2.5 (Accolla R. S.: J. Exp. Med. 157, 1053 až 1058 (1983).) má podobnú vnímavosť ako bunky Raji, ktoré sú inkubované s neinfikovanými T bunkami.

Príklad 8

Požiadavky na sekvenciu, aby došlo k indukcii cytolýzy reťazcom T bunkový antigén/Fc receptor zeta

Aj keď chiméry medzi CD4 a zeta môžu vyzbrojiť cytotoxické T lymfocyty (CTL) tak, aby zabíjali cieľové bunky, ktoré expresiou poskytujú HIV gpl20, hľadala sa alternatíva k CD4, aby sa nedvojznačne porovnali vlastnosti zeta chimér zavedených do línií ľudských T buniek. Takéto línie môžu exprimovať CD4, čo spôsobuje ťažkosti so špecifickým definovaním vzájomného vzťahu medzi typom alebo stupňom mobilizácie vápnika a cytotoxickým potenciálom rôznych chimér. Aby sa to mohlo obísť, boli vytvorené chiméry medzi zeta a CD16, v ktorých je extracelulárna doména CD 16 pripojená k transmembránovým a intracelulámym sekvenciám zety (obrázok 7A). Do plazmidu expresie vírusu vakcínie, nesúceho E. coli gpt gén ako selektovateľný marker, sa zavedú génové fúzie a homológnou rekombináciou a selekciou na rast v mykofenolovej kyseline sa vloží do genómu vakcínie kmeňa WR (Falkner a Moss: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle a Coupar: Gene 65, 123 (1988).).

T bunkové línie sa infikujú rekombinantmi vakcínie. Po zosieťovaní extracelulámych domén s protilátkami sa meria relatívna koncentrácia cytopiazrnových voľných iónov. Boli vykonané tak spektrofluorimetrické (veľké populácie) ako aj prietokové cytometrické (jednotlivá bunka) merania s bunkami naplnenými farbivom Indo-1 (Grynkiewicz a spol.: J. Biol. Chem. 260, 3440 (1985); Rabinowitch a spol.: J. Immunol. 137, 952 (1986).). Obrázok 7B ukazuje analýzu dát získaných z buniek Jurkat leukemickej línie ľudských T buniek infikovaných rekombinantmi vakcínie exprimujúcimi CD16:zeta fúzovaný proteín. Zosieťovanie chimér reprodukovateľné zvyšuje intracelulárny vápnik, zatiaľ čo podobné spracovanie buniek, ktoré expresiou poskytujú nechimémy CD16, má malý alebo vôbec nemá žiadny vplyv. Ak chiméra je exprimovaná v mutovaných bunkových líniách, ktorým chýba antigénový receptor, je vidieť, buď REX33A (Breitmeyer a spol.: J. Immunol. 138, 726 (1987); Sancho a spol.: J. Biol. Chem. 264, 20760 (1989).), Jurkat mutant JRT3.T3.5 (Weiss a spol.: J. Immunol. 135. 123 (1984).) lebo silná odpoveď na zosieťovanie CD16 protilátkou. Podobné dáta sa získajú s REX20A (Breitmeyer a spol.: pozri skôr, 1987; Blumberg a spol.: J. Biol. Chem. 265, 14036 (1990).) mutovanou bunkovou líniou a s CD3/TÍ negatívnym mutantom bunkovej línie Jurkat získanej v tomto laboratóriu (dáta sa neuvádzajú). Infekcia rekombinantmi exprimujúcimi CD16:zeta neobnovuje odpoveď na anti-CD3 protilátku, čo ukazuje, že fúzovaný proteín nepôsobí intracelulárnymi reťazcami CD3 komplexu (dáta neuvedené).

Na vyhodnotenie schopnosti chimér presmerovať bunkovo sprostredkovanú imunitu sa CTL infikujú rekombinantmi vakcínie exprimujúcimi CD16 chiméry a použijú sa na špecifické lýzovanie hybridómových buniek exprimujúcich anti-CD16 protilátky naviazané na membránu (pozri nižšie). Táto analýza je rozšírením analýzy hybridómovej cytotoxicity pôvodne vyvinutej na analyzovanie efektorových mechanizmov buniek nesúcich Fc receptory (Graziano a Fanger: J. Immunol. 138, 945 (1987); Graziano a Fanger: J. Immunol. 139, 35 až 36 (1987); Shen a spol.: Mol. Immunol. 26, 959 (1989); Fanger a spol.: Immunol. Today 10. 92 (1989).). Obrázok 8B ukazuje, že expresia CD16:zeta v cytotoxických T lymfocytoch umožňuje vyzbrojeným CTL zabíjať 3G8 (anti-CD16; Fleit a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79. 3275 (1982).) hybridómové bunky, zatiaľ čo CTL exprimujúce fosfatidylinozitol-naviazanú formu CD16 sú neaktívne. CTL vyzbrojené

CDló.zeta tiež nezabíjajú hybridómové bunky exprimujúce irelevantnú protilátku (dáta neuvedené).

Na identifikáciu minimálnych zeta sekvencií nutných pre cytolýzu sa pripraví séria delečných mutantov, v ktorých sa z karboxylového konca odstraňuje postupne väčšia zeta intracelulárna doména (obr. 8A). Väčšina intracelulárnej domény zeta by sa mohla odstrániť s malými dôsledkami pre cytolytický potenciál. Plná dĺžka chiméry CD16:zeta mala v podstate rovnakú účinnosť ako chiméra deletovaná až ku zvyšku 65, CD16: zetaAsp66* (obr. 8B). Podstatné zníženie cytotoxicity sa pozorovalo pri delécii zeta až ku zvyšku 59 (chiméra CD 16: zetaGluóO), ďalšia delécia do zvyšku 50 viedla k mierne menšej aktivite. Ale úplná strata aktivity nebola pozorovaná ani vtedy, keď intraceluláma doména bola redukovaná na tri zvyšky transmembránovej kotvy (obr. 8B).

Pretože zeta je dimér s disulfidovým môstikom, jedným vysvetlením zachovania cytolytickej aktivity je to, že endogénna zeta vytvára heterodiméry s chimérnou deletovanou zeta a tým rekonštituujc aktivitu. Na testovanie tejto myšlienky boli zvyšky 11 a 15 v zeta zmenené z Asp a Cys na Gly (CysllGly/Aspl5Gly). Nasledujúcim spôsobom sa vykonala imunoprecipitácia. Približne 2.10⁵ buniek CV1 sa infikuje jednu hodinu v DME médiu bez séra rekombinantnou vakcíniou na multiplicitu infekcie (moi) aspoň desať. Šesť až desať hodín po infekcii sa bunky odoberú z dosiek PBS s ImM EDTA a povrchovo sa označí 0,2 mCi 1251 na 2.10⁶ buniek laktoperoxidázou a peroxidom vodíka spôsobom podľa Čiarka a Einfelda („Leukocyte Typing II“, strany 155 až 167, Springer-Verlag, NY, 1986). Označené bunky sa izolujú odstreďovaním a lýzujú sa v 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,15M NaCI, 0,05M Tris, pH 8,0, 5 mM MgC12, 5 mM KC1, 0,2M jodacetamidu a 1 mM PMSF. Jadrá sa odstránia odstreďovaním a CD16 proteíny sa vyzrážajú imunoprecipitáciou protilátkou 3G8 (Fleit a sopol.: pozri vyššie 1982; Medarex) a protimyšacou IgG agarosou (Cappel, Durham, NC). Vzorky sa elektroforézujú na 8 % polkyakrylamid/SDS géli za neredukujúcich podmienok alebo 10 % géli za redukujúcich podmienok. Táto imunoprecipitácia potvrdila, že chiméra CD 16: zetaCysllGly/Asp15Gly neasociuje vo forme dimérových štruktúr spojených disulfidovým môstikom.

Bola testovaná tiež cytolytická aktivita mutantných receptorov. Mutovaná chiméra (CD16:zetaCysl lGly/Asp15Gly/Asp66*) deletovaná až ku zvyšku 65 bola, podľa podmienok analýzy, dva až osem razy menej aktívna v teste cytolýzy ako porovnateľná nemutovaná chiméra (CD16:zetaAsp66*), ktorá bola zvyčajne dva razy alebo nerozlíšiteľne menej aktívna ako CD16:zeta (obrázok 9B). Zníženie aktivity mutantných chimér je porovnateľné so znížením pozorovaným pri CD4 chimérach s podobnou štruktúrou (pozri vyššie). Najpravdepodobnejšie sa pripisuje nižšej účinnosti zeta monomérov v porovnaní s dimérmi. Naproti tomu Asp- a Cys-mutanovaná chiméra deletovaná až ku zvyšku 59 nemá žiadnu cytolytickú aktivitu (obrázok 9B), čo podporuje hypotézu, že za slabé pretrvávanie cytolytickej aktivity v deléciach bližšie amínovému koncu ako zvyšok 65 je zodpovedná asociácia s inými reťazcami sprostredkovaná transmembránovým Cys a/lebo Asp zvyškom.

Štúdie prietokovou cytometriou ukázali, že delečné mutanty, ktorým chýbajú transmembránové Asp a Cys zvyšky, by stále ešte mohli podporovať zvýšenie voľného intracelulámeho iónu vápnika ako odpoveď na protilátkové zosieťovanie pri TCR- mutovanej Jurkat bunkovej línii (obr. 9D). Podobné výsledky boli získané s chimérami exprimovanými v rodičovskej línii Jurkat (neuvedené). V prípade CD16:zetaCysllGly/Aspl5Gly/Glu60* tieto dáta de monštrujú, žc schopnosť sprostredkovať odpoveď vápnika môže byť mutačne oddelená od schopnosti podporovať cytolýzu.

Aby sa definitívne odstránil možný príspevok zeta transmembránových zvyškov, boli transmembrána a prvých 17 cytoplazmových zvyškov nahradené sekvenciami, ktoré kódujú preklenutie membrány a prvých 14 lebo 17 cytoplazmových zvyškov CD5 lebo CD7 antigénov (obr. 9A). Výsledné trojdielne fúzované proteíny CD16:5:zeta(45 až 65) a CD16:7:zeta(48 až 65) netvoria diméry s disulfidovým môstikom ako sa deje s jednoduchšími CD16:zeta chimérami, pretože im chýba cysteínový zvyšok v zeta transmembránovej doméne. Obidve trojdielne chiméry boli schopné mobilizovať vápnik v Jurkat a TCR negatívnych bunkových líniách (obr. 9D) a vniesť cytolytickú odpoveď do CTL (obr. 9C a dáta neuvedené). Ale odrezanie zeta časti až do zvyšku 59 v chimére CD16:7:zeta(48 až 59) odstraňuje schopnosť trojdielnej fúzie riadiť odpovede vápnika v TCR pozitívnych alebo negatívnych Jurkat bunkách alebo cytolýzy v maturovanom CTL (obr. 9C a 9D a dáta neuvedené).

Pri skúmaní príspevkov jednotlivých zvyškov v motíve s 18 zvyškami sme pripravili cielenou mutagenézou početné mutované varianty a vyhodnotili sme ich schopnosť sprostredkovať receptorom riadené zabíjanie za podmienok nízkej (obr. 10A a 10D) alebo vysokej (obr. 10B až 10E) expresie chimémeho receptora. Obrázok 10 ukazuje, že zatiaľ čo početné relatívne konzervatívne substitúcie (t. j. náhrada kyslých zvyškov ich obdobnými amidmi alebo tyrozínom, či fenylalanínom), ktoré preklenujú zvyšky 59 až 63, vedú k primeranému kompromisu pokiaľ ide o cytolytickú aktivitu, všeobecne si varianty zachovávajú schopnosť mobilizovať vápnik. Súhrnne však tieto zvyšky obsahujú dôležitý submotív, vzhľadom na to, že ich delécie odstraňujú cytolytickú aktivitu. Prevedenie Tyr 62 buď na Pne, alebo Ser odstraňuje tak cytotoxickú ako vápnikovú odpoveď. Náhrada Tyr 51 Phe na amínovom konci segmentu s 18 zvyškami odstraňuje tak mobilizáciu vápnika ako cytolytickú aktivitu, zatiaľ čo substitúcia Leu za Ser v polohe 50 odstraňuje odpoveď vápnika, ale cytolýzu zhoršuje len čiastočne. Predpokladá sa, bez toho aby sme sa viazali na príslušnú hypotézu, že neschopnosť mutantu Leu50Ser mobilizovať vápnik v krátkodobých analýzach prietokovou cytometriou neodráža plne jeho schopnosť sprostredkovávať podstatné zvýšenie voľného intracelulárneho vápenatého iónu po dlhší čas cytolytickej analýzy. Pre niektoré cytolytické T bunkové línie však bola opísaná cytolytická aktivita necitlivá na vápnik. Možnosť, že podobný jav je podkladom tu opísaných výsledkov nie je vylúčená. Náhrada Asn48 za Ser v niektorých pokusoch čiastočne zhoršuje cytotoxicitu, zatiaľ čo v iných pokusoch má len malý vplyv.

Pri výskume potenciálnej úlohy nadbytočných prvkov sekvencie bola intracelulárna doména zety rozdelená na tri segmenty, zvyšky od 33 do 65, od 71 do 104 a od 104 do 138. Každý z týchto segmentov bol pripojený na CD16:CD7 chiméru miestom Mluí zavedeným práve vedľa základných sekvencií zakotvujúcich membránu intracelulárnej domény CD7 (pozri nižšie; obrázok 11 A). Porovnanie cytolytickej účinnosti týchto troch prvkov ukázalo, že boli v podstate rovnako účinné (obr. 11 B). Porovnanie sekvencií (obr. 11 A) ukazuje, že druhý motív nesie jedenásť zvyškov medzi tyrozínmi, zatiaľ čo prvý a tretí motív nesú desať zvyškov.

Aj keď presné prepočítanie procesu aktivácie T buniek nebolo vykonané, je zrejmé, že agregácia antigénového receptora alebo receptorových chimér, ktoré nesú zeta intra celuláme sekvencie, spúšťa mobilizáciu vápnika, uvoľnenie cytokínu a granúl a objavuje sa aktivácia markerov bunkového povrchu. Aktívne miesto zety, krátka lineárna peptidová sekvencia, možno príliš malá na to, aby mala prirodzenú enzymatickú aktivitu, pravdepodobne interaguje s jedným alebo niekoľko proteínmi pri sprostredkovaní bunkovej aktivácie. Je tiež nanajvýš jasné, že mobilizácia voľného vápnika nie je sama osebe dostatočná na bunkovú aktiváciu, pretože schopnosť sprostredkovať cytolýzu môže byť mutačne oddelená od schopnosti sprostredkovať akumuláciu vápnika.

Ako tu bolo ukázané, pridanie 18 zvyškov z intracelulámej domény zeta do transmembránovej a intracelulámej domény dvoch nepodobných proteínov umožňuje výsledným chiméram presmerovať cytolytickú aktivitu proti cieľovým bunkám, ktoré sa viažu na extracclulárnu časť napojených proteínov. Aj keď chiméry nesúce motív s 18 zvyškami sú približne osem razy menej aktívne ako chiméry na báze plnej dĺžky zeta, je možné pričítať zníženú aktivitu strate transmembránových interakcií, ktoré normálne umožňujú prírodnej zeta vytvoriť diméry viazané disulfidovým môstikom. To znamená, že konštrukcie zeta delécie (ktoré majú rovnaký karboxylový koniec ako motív a ktorým chýba transmembránový Cys a Asp zvyšok) typicky majú menšiu aktivitu ako chiméry nesúce len motív s 18 zvyškami.

Prvok s cytolytickou schopnosťou, na ktorý sme sa sústredili, má dva tyroziny a nemá žiadne seríny ani treoníny, čo obmedzuje možné príspevky fosforylácie k aktivite. Mutácia ktoréhokoľvek tyrozínu však ničí aktivitu, aj keď predbežné pokusy neukazujú na podstatnú fosforyláciu tyrozínu po zosieťovaní chimérnych povrchových antigénov nesúcich motív s 18 zvyškami. Nedá sa vylúčiť možná účasť takejto fosforylácie v nízkej hladine. Vedľa účinkov na dvoch tyrozinovýeh zvyškoch zoslabujú aktivitu za podmienok nízkej hustoty receptora početné substitúcie aminokyselín na amínovom a karboxylovom konci motívu.

Sekvencie, ktoré sú podobné zeta aktívnemu motívu, sa dajú nájsť v cytoplazmových doménach niekoľkých ďalších transmembránových proteínov, vrátane molekúl CD3 delta a gama, proteínov mbl a B29 asociovaných s IgM a beta a gama reťazcov IgE receptora s vysokou afinitou, FcepsilonRI (Reth: Náture 338. 383 (1989).). Aj keď funkcie týchto sekvenci! nie sú isté, pokiaľ sú účinne exprimované, každá môže byť schopná autonómnej aktivácie T buniek. Takáto aktivita môže vysvetľovať zvyškovú TCR odpoveď, ktorá sa dá vidieť v zeta-negatívnej mutovanej bunkovej línii (Sussman a spol.: Celí 52, 85 (1988).).

Zeta sama nesie tri také sekvencie, približne rovnako umiestnené. Hrubé rozdelenie intracelulámej domény na tri diely ukazuje, že každý diel je schopný iniciovať cytolytickú odpoveď. Eta, zostrihovej izoforme zeta (Jin a spol.: pozri vyššie, 1990; Clayton a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5202 (1991).), chýba karboxylová polovica tretieho motívu. Pretože odstránenie karboxylovej polovice prvého motívu odstraňuje aktivitu, zdá sa pravdepodobné, že hlavné biologické účinnosti ety sa dajú pripísať prvým dvom motívom. Aj keď podľa rôznych meraní je eta rovnako aktívna ako zeta pri podpore uvoľňovaní cytokínu vyvolaného antigénom (Bauer a spol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88., 3842 (1991).) alebo pri presmerovaniu cvtolýzy (pozri zhora), eta nie je fosforylovaná ako odpoveď na stimuláciu receptora (Bauer a spol.: pozri vyššie, (1991).). Na fosforyláciu je teda potrebná buď prítomnosť všetkých troch motívov, alebo tretí motív predstavuje výhodný substrát pre neidentifikovanú tyrozín-kinázu.

Príklad 9

Transdukcia cytolytického signálu ľudským Fc receptorom

Na vyhodnotenie pôsobenia rôznych podtypov ľudského Fc receptora sa vytvoria chiméme molekuly, v ktorých je extraceluláma doména ľudského CD4, CD5 alebo CD16 antigénu napojená na transmembránovú a intracelulámu doménu FcRIIgamaA, BI, B2 a C subtypov (nomenklatúra podľa Ravetcha a Kineta: Ann. Rev. Immunol. 9, 457 (1991).). Špecificky, cDNA sekvencie zodpovedajúce transmembránovým a cytoplazmovým doménam skôr opísaných FcRIIA, BI a B2 izoforiem sa amplifikujú zo skôr existujúceho klonu PC23 alebo z ľudskej mandľovej cDNA knižnice (skonštruovanej štandardnými spôsobmi) použitím oligonukleotidovych primerov:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (sekvencia id. č. 18; FcRIIA priamy),

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (sekvencia id. č. 19; FcRIIA reverzný),

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (sekvencia id. č. 20; FcRIIBl a FcRIIB2 priamy) a

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (sekvencia id. č. 21; FcRIIBl aRcRIIB2 reverzný).

Tieto printery obsahovali miesta štepenia pre enzýmy BamHI aNotl oddelené 6 zvyškami od 5’ konca. Po mieste NotI bezprostredne nasledoval stop kodón pozitívneho reťazca, buď CTA, alebo TTA. Všetky primery obsahovali 18 alebo viac zvyškov komplementárnych k 5' a 3' koncom žiadaných fragmentov. cDNA fragment zodpovedajúci FcRIIgamaC cytoplazmovej doméne (ktorá sa líši od IIA izoformy len jedným zvyškom aminokyseliny (L za P vo zvyšku 268)) sa generuje cielenou mutagenézou prekryvom PCR s použitím primerov so sekvenciami:

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (sekvencia id. č. 22) a TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (sekvencia id. č. 23).

PCR fragmenty boli vložené do vektorov expresie vérusu vakcínie, ktoré obsahovali extracelulárne domény CD16 alebo CD4 a postupne vložené do prírodnej vakcínie rekombináciou v mieste tymidín-kinázy s výberom na kointegraciu E. coli gpt, aby sa uľahčila identifikácia žiadaných rekombinantov. Identity všetkých izoforiem (uvedené na obr. 12) boli potvrdené dideoxy-sekvenovaním.

Produkcia chimérnych receptorových proteínov bola ďalej potvrdená imunoprecipitačnými štúdiami. Približne 10⁷ buniek JRT3.T3.5 sa infikuje jednu hodinu v médiu IMDM bez séra rekombinantnou vakcíniou na multiplicitu infekcie aspoň desať. Dvanásť hodín po infekcii sa bunky izolujú a povrch sa označí 0,5 mCi 1251 na 10⁷ buniek spôsobom laktoperoxidáza/ glukozooxidáza podľa Čiarka a Einfelda, pozri skôr. Označené bunky sa izolujú odstreďovaním a lyžujú sa 1 % NP-40, 0,1 mM MgCl₂, 5 mM KC1, 0,2M IAA a 1 mM PMSF. Jadrá sa odstránia odstreďovaním. CD 16 fúzované proteíny sa imunoprecipitujú protilátkou 4G8 a proti-myšacou IgG agarózou. Vzorky sa elektroforézujú za redukujúcich podmienok. Všetky imunoprecipitované molekuly chimérneho receptora mali očakávané molekulové hmotnosti.

Pri testovaní schopností chimérnych receptorov sprostredkovať (vyvolávať) zvýšenie cytoplazmového voľného iónu vápnika sa na infikovanie TCR- mutovanej Jurkat bunkovej línie JRT3.T3.5 (ako je tu opísané) používajú rekombinantné vírusy. Cytoplazmový voľný vápnik v bunkách sa meria (ako je zhora opísané) po zosieťovaní receptorových extracelulárnych domén monoklonálnou protilát kou 3G8 alebo Leu-3A (ako je tu opísané). Tieto pokusy odhalili, že intracelulárne domény FcRgamalI A a C boli schopné sprostredkovať zvýšenie cytoplazmového voľného iónu vápnika po zosieťovaní extracelulámych domén, zatiaľ čo intracelulárne domény FcRgamalI BI a B2 boli za porovnateľných podmienok neaktívne (obr. 13A a 13B). CD4, CD5 a CD16 hybridy FcRgamalI A mali v podstate rovnakú kapacitu podporovať odpoveď vápnika (obr. 13 a neuvedené dáta). Iné bunkové línie, tak z monocytických ako z lymfocytických rodov boli schopné odpovedať na signál iniciovaný zosieťovaním extracelulámych domén (dáta nie sú uvedené).

Pri výskume úlohy rôznych FcRgamalI intracelulárnyeh domén v cytolýze sa ľudské cytotoxické T lymfocyty (CTL) infikujú rekombinantmi vakcínie, ktoré expresiou poskytujú CD16:FcRgamaII A, BI, B2 a C chiméry. Infikované bunky sa potom kokultivujú s hybridómovými bunkami naplnenými 51Cr (t. j. 3G8 10-2 bunky), ktoré expresiou poskytujú na bunkovom povrchu protilátku na CD 16. Pri tomto teste CTL nesúce CD16 chiméru zabíjali hybridómové cieľové bunky (čo umožňuje uvoľňovanie voľného 51 Cr), pokiaľ CD 16 extraceluláma doména chimér je napojená na intracelulárny segment schopný aktivovať lymfocytový efektorový program; tento cytolytický test je nižšie opísaný podrobne. Obrázok 14A ukazuje, že CTL vyzbrojené CD16:FcRgamaIIA a C, ale nie FcRgamalI BI alebo B2, sú schopné lýzovať cieľové bunky, ktoré expresiou poskytujú anti-CD16 protilátky na bunkovom povrchu.

Aby sa vylúčila možnosť, že špecifická cytolýza nejako súvisí s interakciou s CD 16 časťou, boli vykonané pokusy cytolýzy, pri ktorých FcRII intracelulárne domény boli pripojené na CD4 extracelulárnu doménu. V tomto prípade boli cieľové bunky HeLa bunky exprimujúce HIV obalové gpl20/41 proteíny (špecificky HeLa bunky infikované vektorom vakcínie VPE16 (dostupným z National Inštitúte of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, Md.)). Rovnako ako v systéme CD 16 boli cieľové bunky, ktoré expresiou poskytujú HIV obalové proteíny, citlivé na lýzu T bunkami, ktoré exprimujú CD4:FcRgamall A chiméru, ale nie FcRgamalI BI alebo B2 (obr. 14B).

Intracelulárne domény FcRgamalI A a C nezdieľajú žiadnu zreteľnú homológiu sekvencií s iným proteínom, vrátane členov rozsiahlej podčeľade FcRgama/TCRzeta. Pre definíciu prvkov sekvencie, ktoré sú zodpovedné za indukciu cytolýz, boli pripravené 5’ a 3' delécie intracelulámu doménu kódujúcej sekvencie (opísané neskôr a uvedené na obrázku 15A). Boli vyhodnotené na účinnosť mobilizácie vápnika a analýzou cytolýzy (ako je tu opísané). Pri pokusoch, kde sa odstráni amínová koncová časť intracelulárnej domény, sa transmembránová doména FcRgamalI nahradí transmembránovou doménou nepríbuzného CD7 antigénu. Eliminuje sa tak možný príspevok interakcií sprostredkovaných doménou preklenujúcou membránu.

Obrázky 15B a 15C ukazujú, že odstránenie 14 zvyškov z karboxylového konca, vrátane tyrozínu 298, vedie k úplnej strate cytolytickej kapacity a k podstatnému zníženiu mobilizačného potenciálu vápnika. Ďalšia delécia až k miestu práve pred tyrozínom 282 poskytuje identický fenotyp (obrázky 15B a 15C). Delécia od N-konca íntracelulámej domény ku zvyšku 268 nemá žiadny podstatný vplyv tak na profil vápnika ako na cytolytický potenciál, zatiaľ čo delécia do zvyšku 275 význačne zhoršuje uvoľňovanie voľného vápnika, ale má malý vplyv na cytolýzu (obrázky 15D a 15E). Ďalšia delécia, do zvyšku 282, poskytuje FcRgamall koniec, ktorému chýba schopnosť buď mobilizovať vápnik, alebo spúšťať cytolýzu (obr. 15D a 15E). „Aktívny prvok“ definovaný týmito mierami je relatívne veľký (36 aminokyselín) a obsahuje dva tyrozíny oddelené 16 zvyškami.

Príklad 10

Iné domény transdukujúce intracelulárny a transmembránový signál podľa vynálezu môžu byť odvodené od proteínov T bunkového receptora, CD3 delta a T3 gama, a proteínov B bunkového receptora, mbl a B29. Sekvencia aminokyselín týchto proteínov je uvedená na obrázku 16 (CD3 delta; sekvencia id. č. 24), obrázku 17 (T3 gama; sekvencia id. č. 25), obrázku 18 (mbl; sekvencia id. č. 26) a obrázku 19 (B29: sekvencia id. č. 27). Časti sekvencií postačujúcich na transdukciu cytolytického signálu (a teda výhodne obsiahnuté v chimémom receptore podľa tohto vynálezu) sú uvedené v zátvorkách. Chiméme receptory, ktoré zahrnujú tieto proteínové domény, sú skonštruované a používané v terapeutických metódach podľa vynálezu zvyčajne ako je opísané.

Príklad 11

Metódy použité v príkladoch

Infekcia vakcíniou a rádioimunoprecipitácia

Približne 5.10⁶ CV1 buniek sa infikuje jednu hodinu v médiu DME bez séra rekombinantnou vakciniou na multiplicitu infekcie (moi) aspoň desať (titer meraný na CV1 bunkách). Lieto bunky sa po infikovaniu dajú do čerstvého média a metabolický sa značia 200 pCi/ml 35S-metioninu plus cysteínu (Trans35S-label, ICN; Costa Mesa, Ka.) v médiu DMEM bez metionínu a cysteínu (Gibco; Grand Island, NY) šesť hodín. Označené bunky sa odoberú PBS obsahujúcim 1 mM EDTA, izolujú sa odstreďovaním a lyžujú sa v 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA a 1 mM PMSF. Jadrá sa odstránia odstreďovaním a CD4 proteíny sa imunoprecipitujú protilátkou OKT4 a proti-myšacou IgG agarosou (Cappcl, Durham, NC.). Vzorky sa elektroforezujú 8 % polyakrylamidovými SDS gélmi za neredukujúcich (NR) a redukujúcich (R) podmienok. Gély obsahujúce 35S značené vzorky sa pred autoradiografiou impregnujú En3Hance (New England Nuclear, Boston, Ma.). Uľahčená expresia transmembránovej formy CD 16, CD16TM, sa meria porovnaním jej expresie v CV1 bunkách raz infikovaných CD16TM s expresiou v bunkách koinfikovaných vírusmi kódujúcimi CD16TM a zeta alebo gama chiméry. Po infikovaní a inkubácii počas šesť alebo viac hodín sa bunky odstránia z dosiek PBS a 1 mM EDTA. Expresia CD16TM alebo chimér sa meria nepriamou imunofluorescenciou a prietokovou cytometriou.

Prietoková analýza vápnika

Podlínia Ľ6 buniek Jurkat (Weiss a spol.: J. Immunol. 133. 123 až 128 (1984).) sa infikuje rekombinantným vírusom vakcínie jednu hodinu v IMDM bez séra (moi 10) a inkubuje sa tri až deväť hodín v IMDM s 10 % FBS. Bunky sa izolujú odstreďovaním, resuspendujú sa v množstve 3.10⁶ buniek na ml v úplnom médiu obsahujúcom 1 mM Indo-1 acetometoxyester (Grynkiewicz a spol.: J. Biol. Chem. 260. 3340 až 3450 (1985).) (molekulárne sondy) a inkubujú sa 45 minút pri teplote 37 °C. Bunky naplnené Indo-1 sa peletujú a resuspendujú v množstve 1.10⁶/ml v IMDM bez séra a skladujú sa pri teplote miestnosti v tme. Bunky sa analyzujú na obsah voľných iónov vápnika simultánnym meraním fialovej a modrej fluorescenčnej emisie prietokovou cytometriou (Rabinovitch a spol.: J. Immunol. 137. 952 až 961 (1986).). Na iniciáciu toku vápnika sa k bunkovej suspenzii pridá buď fykoerytrín (PE)-konju govaný s Leu-3A (anti-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ. ) v množstve 1 gg/ml s nasledujúcim pridaním 10 pg/ml nekonjugovaného kozacieho protimyšacieho IgG v čase 0 alebo sa k bunkovej suspenzii pridá nekonjugovaná 3G8 (anti-CD16) monoklonálna protilátka v množstve 1 pg/ml s nasledujúcim pridaním 10 pg/ml PE-konjugovančho Fab2' kozacieho protimyšacieho IgG v čase 0. Z PE pozitívnej (infikovanej) bunkovej populácie, ktorá typicky predstavuje 40 až 80 % zo všetkých buniek, sa odoberú histogramy emisného pomeru fialová/modrá. Odpoveď T bunkového antigénového receptora v neinfikovaných bunkách bola spustená protilátkou OKT3, bez zosieťovania. V pokusoch zahrnujúcich CD 16 chimérne receptory sa z analýzy vylúčia vzorky, ktoré majú tendenciu základnej línie smerom k nižšiemu intracelulámemu vápniku (bez protilátok). Histogramové dáta boli postupne analyzované konverziou binárnych dát na ASCII s použitím programu (softvér) „Write Hand Man“ (Cooper City, Fl.) s nasledujúcou analýzou zbierkou programov FORTRAN. Na zistenie normálneho iniciačného pomeru sa použije pomer emisie fialová/modrá pred adíciou druhého protilátkového reakčného činidla, nastaví sa na jednotnosť a zostávajúci prahový pomer sa nastaví tak, aby 10 % zostávajúcej populácie presahovalo prah.

Analýza cytolýzy

Ľudská T bunková línia WH3, CD8+ CD4- HLA B44 obmedzene cytolytická línia sa uchováva v IMDM s 10 % ľudského séra so 100 jednotkami IL-2 na mililiter a periodicky sa stimuluje buď nešpecifický ožiarenými (3000 rad) HLA-nepodobnými periférnymi krvnými lymfocytmi a 1 pg/ml fytohemaglutinínu alebo špecificky jednojadrovými bunkami nesúcimi ožiarený B44. Po jednom dni nešpecifickej stimulácie sa PHA zriedi na koncentráciu 0,5 pg/ml pridaním čerstvého média. Po troch dňoch sa médium vymení. Bunky sa po stimulácii nechajú rásť aspoň desať dní pred použitím v analýzach cytotoxicity. Tieto bunky sa infikujú rekombinantnou vakcíniou ma multiplicitu infekcie aspoň desať jednu hodinu v médiu bez séra. Nasleduje inkubácia v úplnom médiu počas troch hodín. Bunky sa izolujú odstreďovaním a resuspendujú sa na hustotu 1.10⁷ buniek na mililiter. Do každej jamky mikrotitrovacej dosky v tvare U obsahujúcej 100 μΐ média na jamku sa pridá po 100 μΐ. Bunky sa zriedia dvojnásobným seriálnym zriedením. Dve jamky každej vzorky neobsahovali lymfocyty, aby sa umožnilo spontánne uvoľňovanie chrómu. Zmeria sa celkový príjem chrómu. Cieľové bunky, z HeLa podlínie S3, sa infikujú na 6,0 alebo 10,0 cm doskách na moi približne 10 jednu hodinu v médiu bez séra. Nasleduje trojhodinová inkubácia v úplnom médiu. Potom sa pomocou PBS s 1 mM EDTA odoberú z dosiek a spočítajú. Podiel 10⁶cieľových buniek (HeLa, Raji alebo RH2.2.5 bunky na pokusy s CD4 chimémym receptorom a 3G7 10-2 bunkami (Shen a spol.: Mol. Immunol. 26, 959 (1989).) na pokusy s CD 16 chimérnym receptorom) sa odstreďuje a resuspenduje sa v 50 μΐ sterilného 51Cr-chromanu sodného (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, De.) jednu hodinu pri teplote 37 °C s prerušovaným miešaním, potom sa premyje trikrát PBS. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ označených buniek resuspendovaných v médiu v množstve 10 buniek/ml. Rovnakým spôsobom ako cieľové bunky sa označujú bunky Raji a RJ2.2.5. Mikrotitračná doska sa odstreďuje pri 750 x g jednu minútu a inkubuje sa 4 hodiny pri 37 °C. Na konci inkubačného času sa bunky v každej jamke resuspendujú opatrným pipetováním. Vzorka sa odstráni, aby sa stanovilo množstvo impulzov obsiahnutých vo vzorke. Mikrotitračná doska sa odstreďuje pri 750 x g jednu minútu. Odoberú sa μΐ podiely supcrnatantu a spočítajú sa v scintilačnom počítači lúčov gama. Percento zabitia sa opraví na frakciu infikovaných cieľových buniek (zvyčajne 50 až 90 %) zmerenú prietokovou cytometriou. Pre infikované efektorové bunky bol pomer efektor:cieľ opravený na percento infikovaných buniek (zvyčajne 20 až 50 percent pre pokusy s CD4 chimérnym receptorom a viac ako 70 % pre pokusy s CD16 chimérnym receptorom).

In vitro mutagenéza zeta sekvencie

Aby sa vytvorili mutácie vo zvyškoch aminokyselín 11 a 15 zeta sekvencie, pripravia sa syntetické oligonukleotidové primery od miesta BamHI proti smeru vlákna zeta transmembránovej domény a zmení sa prírodný zeta zvyšok 11 z Cys na Gly (C1 IG) lebo zvyšok 15 z Asp na Gly (D15G) alebo sa zmení obidvoje (C11G/D15G). Tieto primery sa použijú v PCR reakciách na generovanie mutovaných fragmentov, ktoré sa opäť vkladajú do prírodného typu konštrukcií CD4:zeta.

Aby sa vytvorili zeta delécie, boli zeta cDNA sekvencie amplifikované PCR s použitím syntetických oligonukleotidových primerov, ktoré sú určené na vytvorenie stop kodónu (UAG) po zvyšku 50, 59 alebo 65. Tieto primery obsahovali miesto štepenia pre enzým Nôti umiestnené päť alebo šesť zvyškov od 5' konca, zvyčajne v sekvencii CGC GGG CGG CCG CTA (sekvencia id. č. 11), kde posledné tri zvyšky zodpovedajú stop antikodónu. Po sekvenciách Nôti a stop antikodónu nasledovalo 18 lebo viac zvyškov komplementárnych k žiaducemu 3' koncu fragmentu. Výsledné chiméry boli označené CDl6:zetaY51*, CD16:zeta.E60* a CD16:zetaD66*. Miesto BamHI proti smeru vlákna transmembránovej domény a miesto Nôti boli použité na generovanie fragmentov, ktoré boli opäť zavedené do divokého (prírodného) typu konštrukcie CD16:zeta. Monomérne zeta chiméry sa vytvoria uvoľnením zeta transmembrány a membrány vedľa intracelulárnych sekvencii štepením pôsobením BamHI a Sací opísanej Asp- a Cys-CD4:zeta konštrukcie a vložením tohto fragmentu do konštrukcie CD 16: zetaE60*, respektíve CD16:ze-taD66.

Konštrukcia trojdielnej chiméry CD16:7:zeta(48 až 65) a CD16:7:zeta(48 až 59)

Pri príprave konštrukcie CD16:zetaD66* sa zeta cDNA sekvencia zodpovedajúca transmembránovej doméne a nasledujúcich 17 zvyškov cytoplazmovej domény nahradia zodpovedajúcou transmembránovou a cytoplazmovou doménou získanou z CD5 a CD7 cDNA. CD5 a CD7 fragmenty boli generované PCR reakciou s použitím priamych oligonukleotidov obsahujúcich miesto štepenia reštrikčnou endonukleázou BamHI a zodpovedajúce oblasti proti smeru vlákna transmebránovej domény CD5, respektíve CD7, s nasledujúcim použitím reverzných oligonukleotidov prekrývajúcich CD5, respektíve CD7 sekvencie a zeta sekvenciu, ktorá obsahuje miesto štepenia reštrikčnou endonukleázou Sací.

CD5:zeta: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (sekvencia id. č. 12).

CD7:zeta: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (sekvencia id. č. 13).

PCR produkty CD5 a CD7 sa rozštiepia pôsobením BamHI a Sací a ligujú sa s CD16:zetaE60* rozštiepenou pôsobením BamHI a Scal. Zeta sekvencia od BamHI do Scal sa nahradí fragmentom CD7. Aby sa pripravili konštrukcie CD16:CD5 a CD16:CD7, PCR reakciou s použitím oligonukleotidu obsahujúceho miesto štepenia reštrikčnou endonukleázou Nôti a kódujúceho stop kodon (UAA) za zvyškami Gln416 Ala 193 fragmentu CD5, respektíve CD7, sa získajú fragmenty CD5 a CD7. CD5 a CD7 PCR fragmenty sa rozštiepia pôsobením BamHI a Nôti a vložia sa do konštrukcie CD16:zetaAsp66*.

In vitro mutagenéza zvyškov na N-konci v motívu transdukujúceho zeta cytolytický signál

Syntetizujú sa syntetické oligonukleotidové primery od miesta Sací v zeta motíve a prírodný zvyšok 48 sa zmení z Asn na Ser (N48S), zvyšok 50 z Leu na Ser (L50S) a zvyšok 51 z Tyr na Phe (Y51F). Tieto primery sa použijú v PCR reakcii na generovanie fragmentov, ktoré sa opäť zavedú do prírodnej konštrukcie CD16:7:zeta(48 až 65).

In vitro mutagenéza zvyškov na C-konci v motívu transdukujúceho zeta cytolytický signál

Syntetizujú sa syntetické oligonukleotidové primery od miesta NotI na 3' konci do stop kodónu a prírodný zvyšok 60 sa prevedie z Glu na Gin (E6OQ), zvyšok 61 z Glu na Gin (E61Q), zvyšok 62 z Tyr na Phe lebo Ser (Y62F lebo Y62S) a zvyšok 63 z Asp na Asn (D63N). Tieto primery sa použijú v PCR reakcii ku generovaniu fragmentov, ktoré sa subklonujú do prírodného typu konštrukcie CD16:zetaD66* od miesta BamHI do miesta Nôti.

Konštrukcia chimér CD16:7:zeta(33 až 65), CD16:7:zeta(71 až 104) a CD16:7:zeta(104 až 137)

PCR reakciou sa s použitím oligonukleotidu s nasledujúcou sekvenciou CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (sekvencia id. č. 14) získa CD7 transmembránový fragment nesúci miesta Mlul a Nôti na spojenie medzi transmembránovou a intracelulárnou doménou. Výsledný PCR fragment sa rozštiepi pôsobením BamHI a Nôti a znova sa vloží do konštrukcie CD16:7: zeta(48 až 65). Zeta fragmenty kódujúce zvyšky 33 až 65, 71 až 104 a 104 až 137 sa získajú PCR reakciou s použitím párov primerov obsahujúcich miesta Mlul na 5' konci priamych primerov a stop kodóny nasledované miestami Nôti na 5' konci reverzných primerov. V každom prípade boli reštrikčné miesta oddelené šiestimi zvyškami od 5' konca prímeru, aby sa zaistilo štepenie reštrikčným enzýmom.

zeta 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (sekvencia id. č. 15),

Zeta 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA GGA AAG (sekvencia id. č. 16) a zeta 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (sekvencia id. č. 17).

Konštrukcia FcRgamalIA delečných mutantov

FcRgamalIA delečné mutanty na karboxylovom konci boli skonštruované PCR reakciou rovnakým spôsobom ako konštrukcie plných dĺžok, prevedením sekvencií kódujúcich tyrozín v polohách 282 a 298 na stop kodóny (TAA). Delécie na N-konci boli generované amplifikovaním fragmentov kódujúcich podstatne menšie intraceluláme domény PCR s použitím oligonukleotidov, ktoré umožňujú, že výsledné fragmenty sú vložené medzi Mlul a Nôti reštrikčné miesta do vopred skonštruovaného plazmidu expresie kódujúceho CD 16 extracelulámu doménu fúzovanú s CD7 transmembránovou doménou, z ktorých druhá končí v mieste Mlul prechodu medzi transmembránovou a intracelulámou doménou.

Iné usporiadania

Opísané príklady ukazujú, že agregácia zeta, eta a gama chimér postačuje k iniciácii bunkovej odpovede cytolytického efektoru v T bunkách. Známy rozsah expresie zeta, eta a gama, ktorý zahrnuje T lymfocyty, prírodné bunky zabíjača, bazofilné granulocyty, makrofágy a žírne bunky, ukazuje na to, že motívy zachovanej sekvencie môžu inter agovať so zmyslovým aparátom obvyklým pre bunky hematopoietného pôvodného a že dôležitá zložka hostiteľskej obrany v imunitnom systéme môže byť sprostredkovaná agregačnými udalosťami receptora.

Potencia cytolytickej odpovede a neprítomnosť odpovede na cieľové bunky nesúce MHC triedy II receptormi ukazuje, že chiméry na báze zeta, eta alebo gama tvoria základ pre genetickú intervenciu AIDS prostredníctvom adoptívnej imunoterapie. Široká distribúcia endogénnej zeta a gama a dôkaz, že Fc receptory asociované s gama sprostredkujú cytotoxicitu pri rôznych typoch buniek (Fanger a spol.: Immunol. Today K), 92 až 99 (1989).) umožňuje, aby na tento účel boli brané do úvahy rozmanité bunky. Napríklad neutrofilné granulocyty, ktoré majú veľmi krátku životnosť (asi 4 hodiny) v obehu a ktoré sú silne cytolytické, sú atraktívne cieľové bunky na expresiu chimér. Infekcia neutrofilov HIV pravdepodobne nevedie k uvoľneniu vírusu a početný výskyt týchto buniek (najvplyvnejších z leukocytov) by mal uľahčiť obranu hostiteľa. Inou atraktívnou možnosťou hostiteľských buniek sú maturované T bunky, populácia, ktorá je dnes dostupná retrovírusovým inžinierstvom (Rosenberg S. A.: Sci. Am. 262. 62 až 69 (1990).). Pomocou rekombinantu IL-2 môžu byť populácie T buniek relatívne ľahko namnožené v kultúre. Tieto namnožené populácie majú typicky obmedzenú životnosť, pokiaľ sú spätne zavedené infúziou (Rosenberg a spol.: N. Engl. J. Med. 32, 570 až 578 (1990).).

Za príslušných podmienok by mohlo rozoznávanie HIV bunkami, ktoré expresiou poskytujú CD4 chiméry, poskytovať mitogenné stimuly, čo by umožnilo, aby vyzbrojená populácia buniek dynamicky odpovedala na vírusové ťažkosti. Aj keď sme sa tu sústredili na správanie sa fúzovaných proteínov v cytolytických T lymfocytoch, expresia chimér v pomocných (helper) lymfocytoch by mohla poskytnúť HlV-mobilizovaný zdroj cytokinov, ktorý by mohol pôsobiť proti kolapsu pomocných buniek pri AIDS. Nedávny opis niekoľkých schém rezistencie (genetickým inžinierstvom) proti infekcii v iných štádiách, ako je prenikanie vírusu (Friedman a spol.: Náture 335, 452 až 454 (1988); Green a spol.: Celí 58, 215 až 223 (1989); Málim a spol.: Celí 58. 205 až 214 (1989); Trono a spol.: Celí 59, 113 až 120 (1989); Buonocore a spol.: Náture 345, 625 až 628 (1990).), navrhuje, že by mohli byť navrhnuté CD4 chiméry, ktoré by marili produkciu vírusu expresiou príslušných činidiel, ktoré majú intraceluláme miesto pôsobenia.

Schopnosť prenášať signály na T lymfocyty autonómnymi chimérami poskytuje tiež schopnosť regulácie retrovirusovo zostrojených lymfocytov in vivo. Zosieťovanie stimulov, sprostredkované napríklad špecifickými IgM protilátkami zostrojenými tak, aby odstránili domény viažuce komplement, môže umožniť, aby sa zvýšil počet takých lymfocytov in situ, zatiaľ čo pôsobením podobných špecifických IgG protilátok (napríklad rozoznávajúcich variáciu aminokyselín vloženú do chimémeho reťazca spôsobom génového inžinierstva) by mohlo selektívne ochudobniť túto zostrojenú populáciu. A ďalej, anti/CD4 IgM protilátky nevyžadujú ďalšie zosieťovanie na mobilizáciu vápnika v Jurkat bunkách exprimujúcich CD4:zeta chiméry (dáta nie sú uvedené). Schopnosť regulovať bunkové populácie bez pomoci opakovania mimotelovej amplifikácie môže podstatne rozšíriť rozsah a účinnosť bežného použitia navrhovaného pre T bunky pripravené génovým inžinierstvom.

Na vytvorenie iných chimér pozostávajúcich zo zeta, eta alebo gama intracelulárnych sekvencií sa môžu cDNA alebo genomové sekvencia kódujúca extracelulámu doménu receptora vybaviť reštrikčným miestom zavedeným v mieste práve predchádzajúcom zvolenú transmembránovu doménu. Fragment extracelulámej membrány končiaci v reštrikčnom mieste sa potom môže spojiť so sekvenciami zeta, eta alebo gama. Typické extraceluláme domény môžu byť odvodené od receptorov, ktoré rozoznávajú komplement, sacharidy, vírusové proteíny, baktérie, protozoické alebo metazoické parazity, alebo proteíny nimi indukované. Podobne ligandy alebo receptory pochádzajúce z expresie patogénmi alebo nádorovými bunkami, môžu byť pripojené na sekvencie zeta, eta alebo gama, aby riadili imunitné odpovede proti bunkám nesúcim receptory rozoznávajúce tieto ligandy.

Aj keď je tento vynález opísaný v súvislosti so špecifickými usporiadaniami, je tomu treba rozumieť tak, že sú možné ďalšie modifikácie. Táto prihláška je zamýšľaná tak, že zahrnuje variácie použitia alebo adaptácie tohto vynálezu a tiež také odchýlky od tu uvedeného opisu, o ktorých je odborníkom zrejmé, že náležia k tomuto vynálezu a ktoré majú podstatné rysy tu uvedené a spadajú teda do rozsahu pripojených nárokov.

Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:

(1) Žiadatelia: The Generál Hospital Corporation (ii) Názov vynálezu: Bunka poskytujúca expresiou proteínovej membrány viazaný chimérny receptor, chimémy receptor, vektor, DNA a protilátka (iii) Počet sekvencií: 27 (iv) Korešpondenčná adresa:

(A) adresát: Fish and Richardson (B) ulica: 225 Franklin Street (C) mesto: Boston (D) štát: Ma.

(E) zem: USA (F) poštovné smerovacie číslo: 02110-2804 (v) Počítačová čítacia forma:

(A) typ média: disketa 3,5, 1,44 Mb (B) počítač: IBM PS/2 model 50Z alebo 55SX (C) operačný systém: IBM P.C. DOS (verzia 3.30) (D) počítačový program (softvér): Wordperfect (verzia 5.0) (vi) Údaje o súčasnej prihláške:

(A) číslo prihlášky:

(B) dátum podania:

(C) klasifikácia:

(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) číslo prihlášky: 07/665,961 (B) dátum podania: 7. marca 1991 (C) klasifikácia:

(viii) Informácia o zástupcovi:

(A) Meno: Clark Paul T.

(B) číslo registrácie: 30,162 (C) odkaz/číslo spisu: 00786/119002 (ix) Informácia o spojení:

(A) telefón: (617) 542-5070 (B) fax: (617) 542-8906 (C) telex: 200154 (2) Informácia o sekvencií id. č. 1:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 1728 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: dvojvláknová (D) topológia: lineárna (i i) typ molekuly: DNA (genómová) (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 1:

ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TCTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCÄCTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
CTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
KCAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
IGGATCACCT	TTGACCIGAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTOCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTCCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950
GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA	GCTGATGCTG	AGCTTGAAAC	TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
GTCTCGAAGC	GGGAGAÄGCC	GGTGTGGGTG	CTGAACCCTG	AGGCGGGGAT	1100
GTGGCAGTGT	CTGCTGAGTG	ACTCGGGACA	GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	1150
TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	TGCACGCGGA	TCCCAAACTC	1200

17GCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGGXCCC CAACCAGCTC TACAATGAGC GAATATGACG TČTTGGÄGAA GAAGCGGGCT CKAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGAAAGACÄA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGGCGGAGAG GCAAGGGGCÄ CGATGGCCTT AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA

TACGGAGTCA TCATCACAGC 1250 TGCAGAGACT GCTGCCAACC 1300 TCAATCTAGG GCGAAGAGAG 1350 CGGGATCCAG AGATGGGAGG 1400 AGGCGTATAC AATGCACTGC 1450 AGATCGGCAC AAAAGGCGAG 1500 TACCÄGGACA GCCACTTCCA 1550 AGAAGGTTCA GAACTCACAA 1600 GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT 1650 CCCACTCTCT GGAGTCCATG 1700 1728 (2) Informácia o sekvencií id. č. 2:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 1389 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: dvojvláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (genómová) (ix) opis sekvencie: sekvencia id. Č. 2:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT TTCCACTGGÄ AAAACTCCAA CCAGATAAAG CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA G5TGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA

CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550

GCACTCTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG CTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA ACAGGTCCAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT GCAGTGGCGA GCTGTCGTGG CAGGCGGACA TGGATCACCT ttgacctoaa gaacaaggaa CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA tgccccaggc cttccctcag tatgciccct CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CCTCCCCTAA GCTGATCCTG AGCTTGAAAC GTCTCCAAGC GCGAGAAGCC GGTGTGGGTG GTGGCAGTGT CTCCTGAGTG ACTCGGGACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCACGTCCC GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA

AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	800
GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950
CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
CTGAACCCTG	AGGCGGGGAT	1100
GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	1150
TGCACGCGGA	TCCGCAGCTC	1200
TATGGTATTG	TCCTTACCCT	1250
AAAGGCAGAC	ATAGCCAGCC	1300
TGAACACCCG	GAACCAGGAG	1350
CCCCAATAG		1389

(2) Informácia o sekvencii id. č. 3:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 1599 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: dvojvláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (genómová) (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 3:

ATGAACCGGG	gagtcccttt	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	ctagtgttcg	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT	TTGACCTOAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950
GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA	GCTGATGCTG	AGCTTGAAAC	TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
GTCTCGAAGC	GGGAGAAGCC	GGTGTGGGTG	CTGAACCCTG	AGGCGGGGAT	1100
GTGGCAGTGT	CTCCTGAGTG	ACTCGGGACA	GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	1150
TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	TGCACGCGGA	TCCCAAACTC	1200
TGCTACCTGC	TGGATGGAAT	CCTCTTCATC	TATGGTGTCA	TTCTCACTGC	1250
CTTCTTCCTG	AGAGTGAAGT	TCAGCAGGAG	CGCAGAGCCC	CCCGCGTACC	1300
AGCAGGGCCA	GAACCAGCTC	TATAACGAGC	TCAATCTAGG	ACGAAGAGAG	1350
GAGTACGATG	TTTTGGACAA	GAGACGTGGC	CGGGACCCTG	AGATGGGGGG	1400
AAAGCCGAGA	AGGAAGAACC	CTCAGGAAGG	CCTGTACAAT	GAACTGCAGA	1450
AAGATAAGAT	GGCGGAGGCC	TACAGTGAGA	TTGGGÄTGAA	AGGCGAGCGC	1500
CGGAGGGGCA	AGGGGCACGA	TGGCCTTTAC	CAGGGTCTCA	GTACAGCCAC	1550
CAAGGACACC	TACGACGCCC	TTCACATGCA	GGCCCTGCCC	CCTCGCTAA	1599

(2) Informácia o sekvencii id. č. 4:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 575 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (ix) opis sekvencie: sekvencia id. č. 4:

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

His

Leu

val

Leu

Gin

Leu

1

5

10

15

A la

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lye

20

25

30

Lye

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

íle

Gin

Phe

HiS

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

íle

Lye

íle

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

ser

Lys

Leu

Asn

Αβρ

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Xle

íle

85

»0

95

Lye

Asn

Leu

Lys

íle

G1U

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

íle

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pre

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

íle

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

01y

Thr

Trp

Thr

cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Pha

Lys

11·

Asp

íle

val

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

íle

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

G1U

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

ser

Ser

Lys

Ser

Trp

íle

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

.Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Lsu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

200

285

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gin

Glu

val

Asn

Leu

val

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

G1U

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

G1U

Ala

Gly

Het

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

íle

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Αβρ

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cye

Tyr

Leu

Asp

Gly

íle

Leu

Phe

íle

Tyr

Gly

Val

íle

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Tyr

Leu

Arg

Ala

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Thr

Ala

4 20

425

430

Asn

Leu

Gin

Asp

Pro

Asn

Glu

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Clu

Tyr

Asp

Val

Leu

Glu

Lys

Arg

Ala

Arg

Asp

Pro

G1U

450

455

460

Met

Gly

Lys

Gin

Arg

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Val

Tyr

465

470

475

480

Asn

Ala

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Pro

G1U

Ala

Tyr

Ser

Glu

íle

Gly

485

490

495

Thr

Lys

Gly

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

500

50S

510

Asp

Ser

His

Phe

Gin

Ala

Val

Gin

Phe

Gly

Asn

Arg

Glu

Arg

Glu

515

520

525

Gly

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ala

Arg

Pro

Lys

Gly

530

535

540

Glu

Ser

Thr

Gin

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Ser

Val

Phe

Ser

íle

545

550

555

560

Pro

Thr

Leu

Trp

Ser

Pro

Trp

Pro

ser

Ser

Gin

Leu

565

570

575

(2) Informácia o sekvencii id. č. 5:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 462 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: protein (ix) opis sekvencie: sekvencia id. č. 5:

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

His

Leu

Val

Leu

Gin

Leu

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Lye

Ser

35

40

45

íle

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

íle

Lys

íle

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

ALa

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

íle

85

90

95

Lye

Asn

Leu

Lys

íle

G1U

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

íle

Cys

Glu

val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lye

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

J

.20

1

25

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

1S0

15S

160

Lye

Asn

íle

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

cín

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Tie

Asp

Tie

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

ser

íle

Val

Tyr

Lys

G1U

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

24 3

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

íle

Trp

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

val

Ser

val

Lys

Arg

val

Thr

cín

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

Hla

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lye

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

val

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

íle

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Gin

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

íle

Leu

Asp

Ala

íle

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

íle

Val

Leu

Thr

405

410

415

Leu

Tyr

Cys

Arg

Leu

Lys

11«

Gin

val

Arg

Lys

Ala

Asp

íle

Ala

4 20

425

430

ser

Arg

Glu

Lys

Ser

Asp

Ala

Val

Tyr

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr

Arg

Asn

435

440

445

Gin

Glu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Lys

His

Glu

Lys

Pre

Pro

Gin

450

455

460

462

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

íle

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

íle

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

íle

cys

Glu

val

Glu

100

105

11O

Asp

Gin

Lys

Clu

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

14S

15G

155

160

Lys

Asn

íle

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

íle

Asp

íle

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

íle

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gin

val

G1U

Phe

ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

GLU

Arg

hla

Ser

Lye

Ser

Trp

íle

Thr

Phe

Asp

Lau

245

250

255

ILys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lye

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

Hla

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gin

ľyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

G1U

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

H1S

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

c-in

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

33&

Lye

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lye

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

GlU

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

cys

Leu

ser

Asp

ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Íle

370

375

380

Lys

val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

val

His

Ala

Asp

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Leu

Asp

Gly

íle

Leu

Phe

íle

Tyr

Gly

Val

íle

Leu

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro

ΡΓΟ

Ala

420

425

430

Tyr

Gin

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Asp

Lys

Arg

Glu

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

465

470

475

480

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

ILe

Gly

Met

485

490

495

Lys

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

500

505

510

Leu

Ser

Thr

Ala

The

Lys

ASP

Thr

Tyr

Asp

Ala

Leu

His

Met

Gin

Ala

515 520 525

Leu Pro Pro Arg

530 (2) Informácia o sekvencii id. č. 6:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 532 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (ix) opis sekvencie: sekvencia id. č. 6:

(2) Informácia o sekvencii id. č. 7:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknovä (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 7:

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

HÍS

Leu

Val

Leu

Gin

Leu

1

5

10

15

Ala

Leu

pre

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lya

val

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

G1U

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

íle

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

íle

Lys

íle

Leu

Gly

Asn

50

5S

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lye

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

so

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC (2) Informácia o sekvencii id. č. 8:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 50 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknovä (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 8:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) Informácia o sekvencii id. č. 9:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 9:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33 (2) Informácia o sekvencii id. č. 10 (1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 10:

CCCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) Informácia o sekvencii id. č. 11:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 15 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 11:

CGCGGGCGGC CGCTA 15 (2) Informácia o sekvencii id. č. 12:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 42 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 12:

CGCGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG 42 (2) Informácia o sekvencii id. č. 13:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 48 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. ¢.13:

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG 48 (2) Informácia o sekvencii id. č. 14 (1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 14:

CGCGGCGCGG CCACGCCTCC TCGCCAGCAC ACA 33 (2) Informácia o sekvencii id. č. 15:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 36 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 15:

CGCCGCACCC GTTTCAGCCG TCCCTCGCCAG CACACA 34 (2) Informácia o sekvencii id. č. 16:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 16:

CGCGCGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 33 (2) Informácia o sekvencii id. č. 17:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. i. 17:

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33 (2) Informácia o sekvencii id. č. 18:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 26 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jedno vláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 18:

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT (2) Informácia o sekvencii id. č. 19:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 42 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: j ednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 19:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42 (2) Informácia o sekvencii id. č. 20:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 30 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 20:

GCGGGGCCAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG 30 (2) Informácia o sekvencii id. č. 21:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 32 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 21:

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC 32 (2) Informácia o sekvencii id. č. 22:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 31 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 22:

TCAGÄAAGAG ACAACCTGAA GÄAACCAACA A 31 (2) Informácia o sekvencii id. č. 23:

(1) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 31 párov nukleotidov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: nukleová kyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 23:

'l'TG'ITCCTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 31 (2) Informácia o sekvencii id. č. 24:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 171 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: aminokyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 24:

Met

G1U

His

Ser

Thr

Pne

Leu

Ser

Gly

Leu

val

Leu

Ala

Thr

Leu

5

10

15

Ser

Gin

Val

Ser

Pro

Phe

Lys

íle

Pro

íle

Glu

Leu

Glu

Asp

Arg

20

25

30

Val

Phe

Val

Asn

Cys

Asn

Thr

Ser

íle

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Thr

Val

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Ser

Asp

íle

Thr

Arg

Leu

Asp

Leu

Gly

Lys

Arg

íle

50

55

60

Leu

Asp

Pro

Arg

Gly

íle

Tyr

Arg

cys

Aan

Gly

Thr

ASp

íle

Tyr

Lys

65

70

75

80

Asp

Lys

GlU

Ser

Thr

Val

Gin

Val

His

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Ser

Cys

05

90

95

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Gly

íle

Val

Thr

Asp

Val

1OO

105

110

Ala

íle

Thr

Leu

Ala

Leu

Gly

Val

Phe

cys

Phe

Ala

Gly

His

115

120

125

Glu

Thr

Gly

Arg

Leu

Ser

Gly

Ala

Asp

Thr

Gin

Ala

Leu

Arg

130

135

140

Asn

Asp

Gin

Val

Tyr

Gin

Pro

Leu

Arg

Asp

Arg

Asp

Ala

Gin

Tyr

145

150

155

150

Ser

His

Leu

Gly

GLy

Asn

Trp

Ala

Arg

Asn

Lys

165 170 (2) Informácia o sekvencii id. č. 25:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 182 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: aminokyselina (xi) opis sekvencie: sekvencia id. č. 25:

10 15

Leu

Gin

Gly

Thr

Leu

Ala

Gin

Ser

íle

Lys

Gly

Asn

His

Leu

Val

Lys

20

25

30

Val

Tyr

Asp

Tyr

Gin

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Leu

Thr

Cys

Asp

Ala

35

40

45

Glu

Ala

Lys

Asn

íle

Thr

Trp

Phe

Lys

Asp

Gly

Lys

Met

íle

Gly

Phe

50

55

60

Leu

Thr

GlU

Asp

Lys

Trp

Asn

Leu

Gly

Ser

Asn

Ala

Lys

Asp

65

70

7'5

80

Pro

Arg

Gly

Met

Tyr

Gin

Cys

Lys

Gly

Ser

Gin

Asn

Lys

Ser

Lys

Pro

Θ5

90

95

Leu

Gin

Val

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Asn

Cys

íle

Glu

Leu

Ash

Ala

100

105

110

Ala

Thr

íle

Ser

Gly

Phe

Leu

Phe

Ala

Glu

íle

Val

Ser

íle

Phe

Val

115

120

12S

Leu

Ala

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

íle

Ala

Gly

Gin

Asp

Gly

Val

Arg

Gin

130

135

140

Ser

ALg

Ala

Ser

Asp

Lys

Gin

Thr

Leu

Pro

Asn

Asp

Gin

Leu

Tyr

145

150

155

160

Gin

Pro

Leu

Lys

Asp

Arg

Glu

Asp

Gin

Tyr

Ser

His

Leu

Gin

Gly

165

170

175

Asn

Gin

Leu

Arg

Asn

ιβο (2) Informácia o sekvencii id. č. 26:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 220 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: aminokyselina (ix) opis sekvencie: sekvencia id. č. 26:

Met

Pro

Gly

Leu

Gin

Ala

Leu

Arg

Ala

Leu

Pro

Leu

Phe

5

10

1S

Leu

Ser

Tyr

Ala

Cys

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Arg

Val

Glu

20

25

30

Gly

pro

Pro

ser

Leu

Thr

val

Asn

Leu

Gly

Glu

Ala

Arg

Leu

35

40

45

Thr

Cys

Glu

Asn

Gly

Arg

Asn

Pro

Asn

íle

Thr

Trp

Phe

Ser

50

55

60

Leu

Gin

Ser

Asn

Iln

Thr

Trp

Pro

Val

Pro

Leu

Gly

Pro

Gly

Gin

65

70

75

80

Gly

Thr

Gly

Gin

Leu

Phe

Pro

Glu

Val

Asn

Lys

Asn

Thr

Gly

85

90

95

Ala

Cys

Thr

Gly

Cys

Gin

Val

íle

Glu

Asn

Aen

íle

Leu

Lys

Arg

Ser

100

1C5

110

Cys

Gly

Thr

Tyr

Leu

Arg

val

Arg

Asn

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Phe

Leu

115

120

125

Asp

Met

Gly

Glu

Gly

Thr

Lys

Asn

Arg

íle

Thr

Ala

Glu

Gly

íle

130

135

140

íle

Leu

Phe

Cys

Ala

val

Pro

Gly

Thr

Leu

Phe

Arg

145

150

155

160

Lys

Arg

Trp

Gin

Asn

Glu

Lys

Phe

Gly

Val

Asp

Met

Pro

Asp

Tyr

16S

170

175

Glu

Asp

Glu

Asn

Leu

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Leu

Asp

Cys

Ser

Het

180

185

190

Tyr

Glu

Asp

íle

Ser

Arg

Gly

Leu

Glu

Gly

Thr

Tyr

Gin

Asp

Val

Gly

195

200

205

Asn

Leu

His

íle

Gly

Asp

Ala

Gin

Leu

GLu

Lys

Pro

210

215

220

(2) Informácia o sekvencii id. č. 27:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) dĺžka: 228 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: aminokyselina (ix) opis sekvencie: sekvencia id. č. 27:

Met

Ala

Thr

Leu

val

Leu

Ser

Met

Pro

cys

His

Trp

Leu

Phe

5

10

15

Leu

Phe

Ser

Gly

Glu

Pro

Val

Pro

Ala

Met

Thr

Ser

20

25

30

Asp

Leu

Pro

Leu

Asn

Phe

Gin

Gly

Ser

Pro

Cys

Ser

Gin

íle

Trp

Gin

35

40

45

His

Pro

Arg

Phe

Ala

Lys

Arg

ser

Ser

Met

val

Lys

Phe

H18

50

55

60

cys

Tyr

Thr

Aen

His

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Trp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

Ser

Gin

Pro

Gin

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Arg

íle

Val

Gin

85

90

95

Thr

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

íle

Gin

Asn

íle

Gin

Tyr

100

105

110

Glu

Asp

Aen

Gly

íle

Tyr

Phe

Cys

Lye

Gin

Lye

Cys

Asp

Ser

Ala

Asn

115

120

125

His

Asn

Val

Thr

Asp

Ser

Cys

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Phe

Ser

Thr

Leu

Asp

Gin

Leu

Lys

Arg

Asn

Thr

Leu

Lys

Asp

Gly

íle

145

150

155

160

íle

Leu

Íle

Gin

Thr

Leu

íle

Leu

Phe

íle

Val

Pro

íle

165

170

175

Phe

Leu

Asp

Lys

Asp

Gly

Lys

Ala

Gly

Met

Glu

Asp

180

185

190

His

Thr

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

íle

Asp

Gin

Thr

Ala

Thr

Tyr

Glu

Asp

195

200

205

íle

val

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Val

Lys

Trp

Ser

Val

Gly

G1U

His

210

215

220

Pro

Gly

Gin

Glu

225

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Bunka poskytujúca expresiou proteínovej membrány viazaný chimérny receptor, ktorý obsahuje a) extracelulárnu časť schopnú špecificky rozpoznávať a viazať infekčné činidlo, bunku infikovanú infekčným činidlom, nádorovú alebo rakovinovú bunku, alebo autoimúnne generovanú bunku, b) intracelulámu alebo transmembránovú časť odvodenú od T bunkového receptora zeta, eta, CD3 delta alebo T3 gama proteínu, Fc receptora gama proteínu alebo B bunkového receptora mbl, alebo B29 proteínu, ktorá je schopná signalizovať bunke, aby ničila činidlo alebo bunku naviazané na receptor, pričom uvedená bunka je vybraná zo skupiny zahrnujúcej T alebo B lymfocyty, cytotoxické T lymfocyty, prírodné usmrcujúce bunky, neutrofily, granulocyty, makrofágy, žírne bunky, HeLa bunky a embryové kmeňové (ES) bunky.
2. Bunka podľa nároku 1 obsahujúca naviazanie nezávislé od MHC.

3. Bunka podľa nárokov 1 a 2 s chimérnym receptorom obsahujúcim a) aminokyseliny 421 a 632 sekvencie id. č. 6:

Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lys Val val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala ser Gin Lys Lys Ser 35 40 45 íle Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gin íle Lys íle Leu Gly Asn 50 55 60 Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lye Gly Pro ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu íle íle 85 90 95 Lys Asn Leu Lys íle G1U Asp Ser Asp Thr Tyr íle Cys Glu Val Glu 100 205 220 Asp Gin Lys GlU Glu Val Gin Leu Leu val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr HiS Leu Leu Gin Gly Gin Sar Leu Thr Leu Thr Leu Clu

130 135 140

ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gin Cya Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 15S 160 Lys Aan íle Gin Gly Gly Lys Thr Leu ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 165 170 175 Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr cys Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 180 185 190 Val Glu Phe Lye íle A«P íle val val Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser 195 200 205 Ser íle Val Tyr Lye Lys Glu Gly Clu Gin Val Glu Phe ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 Z30 215 240 Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lye ser Trp íle Thr Phe Asp Leu 245 350 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gin Met Gly Lye Lye Leu Pro Leu HiS Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280 285 Pro Gin Tyr Ala Gly ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Ž9O 295 300 Thr Gly Lys Leu Hla Gin Glu Val Aen Leu Val val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gin Leu Gin Lye Asn Leu Thr cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lye Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Clu Lys Pro val Trp val Leu Asn Pro G1U Ala Gly Met Trp 355 340 365 Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Aen íle 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu 385 390 395 400 Cye Tyr Leu Leu A*p Gly íle Leu Phe íle Tyr Gly Val íle Leu Thr 405 410 415 Ala Leu Phe Leu Arg Val Lye Phe Ser Arg Ser Ala Clu Pro Pro Ala 420 429 430 Tyr Gin Gin Gly Gin Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp val Leu Asp Lys Arg Arg Glu Arg A»P Pro Glu 450 455 460 Met Gly Gly vy· Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Asn 465 470 475 480 Glu Leu Gin Ly» Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu íle Gly Met 485 490 495 Lys Gly GLu Arg Arg ΑΓ9 Gly Lys Gly MÍS Asp Gly Leu Tyr Gin Gly 500 505 510 Leu Ser Thr Ala The Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Cln Ala 515 520 S25 Leu Pro Pro Arg £10

Thr Gly Lye Leu His Gin Glu val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gin Leu Gin Ly· Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Cly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Mat Leu Ser Leu Lys Leu GlU Asn Lys Glu Ala Lys val Ser 340 345 350 Lye Arg Glu Lye Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Aía Gly Met Trp 355 360 365 Gin cye Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu ser Asn íle 370 375 380 Lye val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala ASp Pro Lys Leu 385 390 395 400 cya Tyr Leu Leu Asp Gly íle Leu Phe íle Tyr Gly Val íle íle Thr 405 410 415 Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe ser Arg ser Ala G1U Thr Ala Ala 420 425 430 Aan Leu Gin Asp Pro Asn Glu Leu Tyr Asn G1U Leu Aen Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Kap Pro Glu 450 455 460 Mat Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg Arg Asn Pro Gin G1U Gly val Tyr 465 470 475 480 Asn Ala Leu Gin Lys Asp Lys Met Pro Glu Ala Tyr Ser Glu íle Gly 485 490 495 Thr Lys Gly Gly Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Αβρ Gly Leu Tyr Gin 500 505 510 Asp Ser His Phe Gin Ala val Gin Phe Gly Asn Arg Arg Glu Arg Glu 515 520 S25 Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly 530 535 540 GLu Ser Thr Gin Gin Ser Ser Gin Ser cys Ale Ser Val Phe Ser íle 545 5S0 5SS 560 Piro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gin Leu

565 570 575

e) aminokyseliny 423 až 455, 438 až 455, 461 až 494 alebo

494 až 528 uvedenej sekvencie id. č. 4,

f) aminokyseliny 400 až 420 uvedenej sekvencie id. č. 4,

g) aminokyseliny 421 až 462 sekvencie id. č. 5

b) aminokyseliny 423 až 455, 438 až 455, 461 až 494 alebo

494 až 528 uvedenej sekvencic id. č. 6,

c) aminokyseliny 400 až 420 uvedenej sekvencie id. č. 6,

d) aminokyseliny 421 až 575 sekvencie id. č. 4

Met 1 Aen Arg Gly V«1 Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala ser Gin Ly· Lys ser 35 40 45 íle Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Aan Gin íle Lys íle Leu Gly Asn 50 55 50 Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Glý Asn pne Pro Leu íle íle 85 90 95 Lys Asn Leu Lys íle Glu Asp Ser A«P Thr Tyr ne Cys Glu val Glu 100 105 110 Asp Gin Lys Glu Glu val Gin Leu Leu val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gin Cya Arg 3er Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lys Asn íle Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser val Ser cín Leu G1U Leu 165 170 175 Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 180 185 190 Val Glu Phe Lys íle Asp íle Val val Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser 195 200 205 Ser Íle Val Tyr Lys Lys Clu Gly Glu Gin Val Glu Phe ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ale Phe Thr val Glu Lye Leu Thr Gly Ser Gly Clu Leu Trp Trp 225 330 235 240 Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys ser Trp íle Thr Phe ASP Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lye Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro L«u Hla Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280 285 Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Aen Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 100

Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lys Val val Lau oiy Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Lau Thr Cys Thr Ala Ser Gin Ly. lys Ser 35 40 45 118 Gin Phe His Trp Lys Asn ser Asn Gin íle Lys íle Leu Gly Asn 50 55 60 Gin Cly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 -kap Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu íle íle 85 90 95 Lye Asn Leu Lys íle Glu Asp Ser Asp Thr Tyr íle Cya Clu Val Clu 100 105 110 Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 íier Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 s;«r Pro Pro Gly ser ser Pro ser val cm cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 185 160 Ly. Aan 11» Gin Gly Gly Lye Thr Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 165 170 175 Cín Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr val Leu Gin Aan Gin Lys Lys 180 185 190 Val Glu Phe Lye íle Asp Zle Val Val Leu Ala Phe Gin Lye Ala Ser 195 200 205 Ser íle val Tyr Ly. Lys Glu Gly Glu Gin val Glu Phe Ser Phe Pro 21« 215 220 Lau Ala Phe Thr Val Glu Lye Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp íle Trp Phe Asp Leu 245 250 255 Ly» Asn Lys Glu Val Ser Val Lye Arg Val Thr Gin Aap Pro Lys Leu 260 265 270 GLn Het Sly Ly. Ly. Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280 385 Piro Cln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Lau Ala Leu Glu Ala Ly· 290 295 3 00 Thr Gly Lye Leu His Gin Glu Val Asn Leu val Val Het Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser pro 325 330 335 Ly. Leu Het Leu Ser Leu Ly. Leu Glu Asn Lys Glu Ala Ly. Val ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Pro val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 3 60 365 Gin Cys Leu Leu Sor Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn íle

370 375 380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Sor Thr 385 J9O Cys Tyr 11« Leu Asp A1A 11« Leu 405 Leu Leu Tyr Cys Arg Leu bye íle 420 Ser Arg Glu Lys Ser Asp Ala val 435 440 Gin Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys 460 455

Pro >.·> L His J95 Ma Aep Pro Gin Lf-M jno Phe Leu Tyr Gly 11« Val Leu Thr 410 415 Gin Val Arg Lys Ala Asp íle Ala 425 4 30 Tyr Thr Gly Leu Aan Thr Arg Asn 445 Hla Glu Lys Pro Pro Gin 450 462

Lys Arg Trp Gin Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Het Pro Asp ASp Tyr 165 170 175 CLu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Het 180 185 190 Tyr Glu ASp íle Ser Arg Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Gin Asp Val Gly 195 200 205 Asn Leu His íle Gly Asp Ala Gin Leu Glu Lys Pro 210 215 220

m) aminokyseliny 183 až 228 sekvencie id. č. 27:

h) aminokyseliny 402 až 419 uvedenej sekvencie id. č. 5,

i) aminokyseliny Tyr282 až Tyr298 vrátane, ako je uvedené na obrázku 15 A,

j) aminokyseliny 132 až 171 sekvencie id. č. 24:

Met Glu Hla Ser Thr Phe Leu ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 5 10 15 Ser Gin val Ser Pro Ph« Lys íle Pro íle Glu Clu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 val Phe val Asn Cys Asn Thr Ser íle Thr Trp val Glu Gly Thr Val 05 40 45 Gly Thr Leu Leu Ser Asp íle Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg íle so 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly íle Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp íle Tyr Lys ¢5 70 75 80 A«p Lys Glu Ser Thr Val Gin Val Kla Tyr Arg Met Cys Gin Ser Cys 85 90 95 Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly íle 11« Val Thr Asp Val 100 105 110 Ala 11« Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120 125 Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gin Ala KU L«U Arg 130 135 140 Aen Asp Gin Val Tyr Gin Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala cín Tyr 145 150 155 160 Ser Kla Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Aen Lys

1«5 170

Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Ku Leu Phe 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro val Pro Ala Het Thr Ser Ser 20 25 30 Asp Leu Pro Leu Asn Phe Gin Gly Ser Pro cys Ser Gin íle Trp Gin 35 40 45 His Pro Arg Phe Ala Ala Lys Lys Arg ser ser Met Val Lys Phe His 50 55 60 Cys Tyr Thr Asn His s«r Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys Arg Gly 65 70 75 80 Ser Gin Gin Pro Gin Glu Leu Val Ser Glu Glu Gly Arg íle Val Gin 85 90 95 Thr Gin Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Thr 11« Gin Asn íle Gin Tyr 100 105 110 Glu Asp Asn Gly íle Tyr Phe Cys Lys Gin Lys cya Asp s«r Ala Asn 115 120 125 His Asn val Thr Asp Ser Cys Gly Thr Clu Leu Leu Val Leu Gly Pha 130 135 140 Ser Thr Leu Asp Gin Leu Lys Arg Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly íle 145 150 155 160 Ha Leu íle Gin Thr Leu Leu íle íle Leu Phe íle 11« Val Pro íle 165 170 175 Phe Leu Leu Leu A«P Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Het Glu Glu Asp 190 185 190 His Thr Tyr Glu Gly Leu Aen Tie Asp Gin Thr Ale Thr Tyr Glu Asp 195 200 205 íle Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu val Lys Trp Ser Val Gly Glu HÍ6 210 215 220

k) aminokyseliny 140 až 182 sekvencie id. č. 25:

Pro Gly Gin Glu

225

Met Glu Glr> Cly Lys Cly Leu Ale Vaj Leu > íle ' Leu . Ala Xle íle Leu 5 10 15 Leu Gin Gly Thr Leu Ala Gin Ser íle Lys Gly Asn His Leu Val Lye 20 23 30 Val Tyr Asp Tyr Gin Glu Asp Gly Ser val Leu Leu Thr Cys Asp Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Asn íle Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Xle Gly Phe 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Ku Gly Ser Asn Ala Lys Asp 65 70 75 80 Pro Arg Gly Het Tyr Gin Cys Lys Gly Ser Gin Asn Lys Set Lys Pro 85 90 95 Leu Gin Val Tyr Tyr Arg Met cys Gin Asn Cy· íle Glu Leu Asn Ala 100 105 110 Ala Thr 11« Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu íle val Ser íle Phe val 115 120 125 Leu Ala Val Cly Val Tyr Phe íle Ala Gly Gin Asp Gly val Arg Gin 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gin Thr Ku Leu Pro Asn Asp Gin Leu Tyr 145 150 155 160 Gin Pro Leu Lys Asp Arg G1U Asp Asp Gin Tyr Ser His Leu Gin Gly 1 65 170 175 Asn Gin Leu Arg Arg Asn 180

1) aminokyseliny 162 až 220 sekvencie id. č. 26:

Met Pro Gly Gly Leu Gin Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Ku Leu Phe 5 10 15 Leu Ser Tyr Ala Cys Ku Gly Pro Gly Cys Cln Ala Ku Arg Val Glu 20 25 30 Gly Gly Pro Pro Ser Leu Thr Val Aan Ku Gly Glu Glu Ala Arg Ku 35 40 45 Thr Cys Glu Asn Asn Gly Arg Asn Pro Asn íle Thr Trp Trp Phe Ser 50 5$ 60 Leu Gin Ser Asn Iln Thr Trp Pro Pro Val Pro Ku Gly Pro Gly Gin 65 70 75 80 cly Thr Thr Gly Gin Ku Phe Pha Pro Glu Val Asn Lys Asn Thr Gly 85 90 95 Ala cys Thr Gly Cys Gin Val 11« Clu Asn Asn íle Ku Lys Arg Ser 100 105 110 Cys Gly Thr Tyr L«u Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu 115 120 125 Asp Met Gly Glu Gly Thr Ly» Asn Arg íle íle Thr Ala Clu Gly íle 130 135 140 íle Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro oiy Thr Ku KU Ku Ph« Arg 145 150 155 160

4. Bunka podľa nároku 1, s extracelulámou časťou obsahujúcou časť CD4 viažuci HIV obalový proteín alebo jej funkčný derivát viažuci HIV obalový proteín.
5. Bunka podľa nároku 1, v ktorej sa ako cytotoxický T lymfocyt používajú CD8⁺ cytotoxické T lymfocyty.
6. Bunka podľa nároku 1, v ktorej extracelulámou časťou je imunoglobulínová molekula alebo jej antigén viažuci fragment.
7. DNA kódujúca chimérny receptor podľa nároku 1.
8. Vektor obsahujúci DNA chimémeho receptora podľa nároku 7.
9. Protilátka špecificky rozpoznávajúca a viažuca chimémy receptor podľa nároku 1.
10. Chimérny receptor podľa nároku 1 viazaný proteínovou membránou, obsahujúci

a) extracelulárnu časť schopnú špecificky rozpoznávať a viazať infekčné činidlo, bunku infikovanú infekčným činidlom, nádorovú alebo rakovinovú bunku, alebo autoimúnne generovanú bunku, a

b) intracelulámu alebo transmembránovú časť odvodenú od T bunkového receptora zeta, eta, CD3 delta alebo T3 gama proteínu, Fc receptora gama proteínu alebo B bunkového receptora mbl, alebo B29 proteínu, ktorá je schopná signalizovať hostiteľskej bunke nesúci uvedený receptor, aby ničila činidlo alebo bunku naviazané na receptor.