KR100257780B1 - 수용체 키메라에 의한 세포 면역성의 재유도방법에 사용되는 약제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물의 세포에서, 세포가 감염원, 감염원으로 감염된 세포, 종양 또는 암 세포 또는 자가 면역-산출 세포를 특이적으로 인식하고 파괴하도록 하는 키메라 수용체를 형질발현시켜 포유동물의 세포 응답반응을 지향하는 방법, 이러한 키메라 수용체를 형질발현하는 세포 및 키메라 수용체를 암호하는 DNA에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

수용체 키메라에 의한 세포 면역성의 재유도방법에 사용되는 약제

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 면역계 기능을 재유도(redirect)할 수 있는 작용성 T 세포 수용체, Fc 수용체 또는 B 세포 수용체 키메라에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 임파구, 대식세포, 천연 킬러 세포 또는 과립구가 키메라에 의해 인식된 표적에 대해 응답 반응하게 하는 키메라를 상기 세포에서 형질발현시키므로써 상기 세포들을 조절하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감염원의 특정부, 감염원 자체, 종양 세포 또는 자가면역 산출 세포로 감염된 세포를 특이적으로 인식하고 파괴하도록 치료용 세포를 유도할 수 있는 작용성 T 세포 수용체, Fc 수용체 또는 B 세포 수용체 카메라에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 HIV 피막 단백질을 형질발현하는 세포를 특이적으로 인식하고 용균시키도록 세포독성 T 임파구를 유도할 수 있는 T 세포 수용체 또는 Fc 수용체 키메라를 제조하는 것에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 HIV 바이러스에 의해 유발되는 AIDS(후천성 면역결핍 증후군) 같은 질환의 치료 방법을 제공한다.

[발명의 배경]

T 세포 수용체를 통한 항원의 T 세포 인식은 면역학적 현상 범주의 기본이다. T 세포는 소위 세포 중개된 면역을 유도한다. 이는 면역계 세포에 의한 외래 조직 또는 감염 세포의 파괴에 관여한다. 면역 응답반응을 조절하는 “헬퍼”및 “억제인자”세포 및 비정상 세포를 직접 사멸시킬 수 있는 세포독성 (또는 “킬러”) 세포를 비롯하여 각종 T 세포가 존재한다.

다른 세포 표면상에 부여된 특이한 항원을 인식하고 이에 결합하는 T 세포는 활성화된 후, 증식할 수 있고 세포독성 세포인 경우, 결합된 세포를 사멸시킬 수 있다.

자가면역 질환은 자가반응성(autoreactive)인 면역 작동 인자 T 세포 또는 숙주 조직과 반응하는 항체의 생성을 특징으로 한다. 몇몇 경우에 있어, 자가 항체는 체조직내 유사한 화합물과 교차 반응하는 항원을 포함하는 유도체 또는 외래 물질에 의해 활성화된 정상의 T-세포 및 B-세포 응답반응에 의해 생성될 수 있다. 임상적으로 관련된 자가항체의 예로는 중증근무력중에서의 아세틸콜린 수용체에 대한 항체, 및 전신 홍반성 루푸스에서의 항DNA, 항적혈구 및 항혈소판 항체가 있다.

[HIV 및 면역 병인론]

HIV는 1984년에 AIDS의 병인체인 것으로 밝혀졌다. 이 시기 이래로, 진단시 어떤 기준을 포함해야 되는지에 관한 AIDS의 규정은 수회 수정되어 왔다. 그러나, 진단 변수의 변동에도 불구하고, AIDS의 단순한 공통적인 특성은 HIV 감염시 2 차 감염, 종양 및 신경계 질환과 같은 AIDS 규정 질환 및 지속적인 체질성 증상의 후속 발병이 이루어진다는 것이다(Harrison′s Principles of Internal Medicine. 12th ed., McGraw Hill(1991)).

HIV는 렌티바이러스 그룹의 인체 레트로바이러스이다. 4 종으로 알려져 있는 인체 레트로바이러스는 다음과 같은 2 군의 별개 그룹에 속한다 : 인체 T 림포 트로픽(또는 백혈병) 레트로바이러스인 HTLV-1 및 HTLV-2와 인체 면역결핍성 바이러스인 HIV-1 및 HIV-2. 전자는 형질전환성 바이러스인 반면, 후자는 세포변성 바이러스이다.

HIV-1은 전 세계를 통해 AIDS의 가장 보편적인 원인균으로 규명되었다. HIV-2와 HIV-1 간의 서열 상동성은 약 40%로 HIV-2가 시미안 면역결핍성 바이러스(SIV) 그룹의 일부 구성원과 더욱 밀접하게 관련되어 있다[Curran, J. et al., Science, 329 : 1357-1359(1985) ; Weiss, R. et al., Nature, 324 : 572-575(1986)].

HIV는 일반적인 레트로바이러스의 유전자(env, gag 및 pol) 뿐 아니라, 그외 바이러스의 복제 및 기타 생물학적 작용에 관여하는 6개의 특별한 유전자를 가지고 있다. 전술한 바와 같이, AIDS의 공통적인 특성은 세포-중개된 면역에 대해 우선적으로 현저한 면역억제를 나타낸다는 것이다. 이러한 면역억제는 각종 기회 감염증 질환, 특히 감염 및 종양을 일으킨다.

AIDS에 있어 면역 결핍의 주요 원인은 흉선-유도된 (T) 임파구의 서브 세트인 T4 군의 정량 및 정성적 결핍인 것으로 판명되었다. 이러한 세포의 서브세트는 HIV에 대한 세포 수용체인 것으로 입증된 CD4 표면 분자의 존재에 의한 표현형에 따라 규정된다[Dalgleish et al., Nature, 312 ; 763(1984)]. T4 세포는 HIV로 감염된 주된 세포형이지만, 표면상에 CD4분자를 형질발현하는 거의 모든 인체 세포는 HIV에 결합할 수 있고 HIV로 감염될 수 있다.

통상, CD4⁺T 세포는 헬퍼/유도인자(inducer)의 역할을 하고 있으며, 이는 B 세포로 활성화 시그날을 제공하거나 세포독성/억제인자(suppressor) 세포가 되도록 상호작용성 CD8 표시체(marker)를 보유한 T 임파구를 유도하는 작용을 나타낸다(Reinherz 및 Schlossman, Cell, 19 : 821-827(1980) ; Goldstein et al., Immunol. Rev., 68 : 5-42(1982)).

HIV는 바이러스 피막(gp120)의 연속된 아미노산을 통해, CD4분자의 N-말단부 근방에 위치한 V1 영역중 일부에 높은 친화력으로 특이 결합한다. 결합 후, 바이러스는 표적 세포막과 융합하여 그안에 내재된다. 일단 내재되면, 이 바이러스는 역 전사효소를 사용하여 게놈 RNA를 DNA로 전사하며 이는 세포 DNA 내로 통합되어 그 안에서 “프로바이러스”로서 세포의 생존 기간 동안 존재한다.

프로바이러스는 잠복된 채로 남아 있거나, mRNA 및 게놈 RNA를 전사하도록 활성화되어 단백질 합성, 조립, 새로운 비리온 형성을 일으키고 세포 표면으로 부터 바이러스를 돌출분리시킬 수 있다. 바이러스가 세포사를 유발시키는 정확한 메카니즘은 확립되지 않았지만, 주요 메카니즘은 세포 표면으로부터 바이러스 본체를 돌출분리시킴으로써 혈장막이 파괴되고 그 결과 삼투압 평형이 파괴되기 때문인 것으로 보인다.

감염 과정중에, 숙주 유기체는 주요 피막 당단백질 gp120 및 gp 41을 비롯한 바이러스 단백질에 대한 항체를 발생시킨다. 이러한 체액 면역에도 불구하고, 질환은 진전되어, 결국 다발성 기회 감염증, 기생충혈증, 치매 및 사망으로 특징되는 치명적인 면역억제를 야기시킨다. 질환의 진전을 막는데 있어 숙주 항바이러스 항체의 실패는 감염의 가장 심각하고 급박한 양상중 하나를 나타내며 통상의 방법에 의거한 예방 접종의 노력을 무의미하게 한다.

면역결핍성 바이러스에 대한 체액 응답반응의 효력에는 2 종의 요인이 작용할 수 있다. 첫째, 다른 RNA 바이러스와 마찬가지로(특히 레트로 바이러스와 마찬가지로), 면역결핍성 바이러스는 숙주 면역 감독에 대응하여 높은 돌연변이율을 나타낸다. 둘째, 피막 당단백질 자체는 고친화성 항체 결합에 적합한 에피토프를 거의 나타내지 않는 고도 글리코실화된 분자이다. 바이러스 피막이 제공하는 낮은 항원성의 표적은 숙주에게 특이적 항체 생성에 의해 바이러스 감염을 제한할 기회를 거의 주지 않는다.

HIV 바이러스에 의해 감염된 세포는 표면상에 gp120 당단백질을 형질발현 한다. gp120은 바이러스가 미감염된 세포에 들어가는 것과 유사한 반응을 통해 CD4⁺세포 간의 융합을 중개하여, 단명의 다핵성 거대 세포 형성을 일으킨다. 합포체(syncytium) 형성은 gp120 피막 당단백질과 CD4 단백질의 직접적인 상호 작용에 의거한다(상기 Dalgleish et al., 문헌 참조 ; Klatzman, D. et al., Nature, 312 : 763(1984) ; McDougal, J.S. et al., Science, 231 : 382(1986) ; Sodroski, J. et al., Nature, 322 : 470(1986) ; Lifson, J.D. et al., Nature, 323 : 725(1986) ; Sodroski, J. et al., Nature, 321 : 412(1986)).

CD4-gp120 결합에 의해 CD4 항원 보유 세포의 바이러스 감염이 일어난다는 것은 gp120과 CD4 간에 특이적 복합체가 형성된다는 사실에 근거한다(McDougal et al., supra). 다른 연구원들에 의해, HIV에 감염되지 않은 세포주가 감염뒤 인체 CD4 cDNA 유전자의 형질발현 이후에 감염성 세포주로 전환되었다는 사실이 밝혀졌다[Maddon et al., Cell, 46 : 333-348(1986)].

바이러스의 흡착 및 합포체-중개된 세포 전환을 방해하기 위한 수동적 약제로서 가용성 CD4에 의거한 치료 프로그램이 제시되어 다수의 연구진에 의해 생체외에서 성공적으로 입증된 바 있으며[Deen et al., Nature, 3321 : 82-84(1988) ; Fisher et al., Nature, 331 : 76-78(1998) ; Hussey et al., Nature, 331 : 78-81(1988) ; Smith et al., Science, 238 : 1704-1707(1987) ; Traunecker et al., Nature, 331 : 84-86(1998)] ; 이어서 연장된 반감기와 적절한 생물학적 활성을 가진 CD4 면역글로불린 융합 단백질이 개발되었다[Capon et al., Nature, 337 : 525-531(1989) ; Traunecker et al., Nature, 339 : 68-70(1989) ; Byrn et al., Nature, 344 : 667-670(1990) ; Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9 : 347-353(1990)]. CD4 면역독소 접합체 또는 융합 단백질은 생체외에서 감염된 세포에 대해 강력한 세포 독성을 나타내지만[Chaudhary et al., Nature, 335 : 369-372(1988) ; Till et al., Science, 242 : 1166-1168(1988)]. 면역결핍증의 잠재성으로 인해, 임의의 단독 치료 요법으로는 바이러스를 제거하는데 효과적인 것으로 보이지 않으며, 외래 융합 단백질의 항원성은 반복 투여를 요하는 치료에 있어 수용가능성을 제한할 것으로 여겨진다. SIV로 감염된 원숭이를 사용한 시도 결과, 두드러진 CD4 세포혈구감소증이 없는 동물에게 투여시 가용성 CD4는 SIV 역가를 감소시키고 골수양 가능성의 생체외 척도를 개선시키는 것으로 밝혀졌다[Watanabe et al., Nature, 337 : 267-270(1989)]. 그러나 치료 중단후 즉각적으로 바이러스의 재출현이 관찰되었는데, 이는 점진적인 면역계 약화를 방지하기 위해서는 평생 투약이 필요하다는 것을 의미한다.

[T 세포 수용체 및 Fc 수용체]

T 세포 항원 수용체(TCR) 중 가장 풍부한 형태의 세포 표면 형질발현은 적어도 6개의 별개의 폴리펩티드 연쇄[Weiss et al., J. Exp. Med, 160 : 1284-1299(1984) ; Orloffhashi et al., Nature, 316 : 606-609(1985) ; Berkhout et al., J. Biol. Chem., 263 : 8528-8536(1988) ; Sussman et al., Cell, 52 : 85-95(1988)]. α/β 항원 결합 연쇄, CD3 복합체의 3개의 폴리펩티드 및 ζ의 공동 형질발현을 요한다. 이들 연쇄중 하나가 부재인 경우, 나머지 복합체 구성원의 안정한 형질발현이 일어나지 않는다. ζ는 완전 복합체의 표면 형질발현에 대한 제한 폴리펩티드이며[Sussman et al., Cell, 52 : 85-95(1988)] 리간드의 수용체 인식에 의해 유도되는 세포 활성화 프로그램의 적어도 일부분을 중개하는 것으로 사료된다(Weissman et al., EMBO J., 8 : 3651-3656(1989) ; Frank et al., Science, 249 : 174-177 (1990)). 32 kDa의 타입 I 내막 동종이량체인 ζ(제타)는 N-연결된 글리칸 첨가 부위가 없는 9개 잔기의 세포외 도메인과 112개 잔기(마우스) 또는 113 잔기(인체)의 세포내 도메인을 가진다[Weissman et al., Science, 238 : 1018-1020(1988a) ; Weissman et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 85 : 9709-9713 (1988b)). 교번 mRNA 접목 경로로부터 생성되는(Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3319-3233(1990)]. η(에타)로 불리는 ζ의 이소타입[Baniyash et al., J. Biol. Chem., 263 : 9874-9878(1988) : Orloff et al., J. Biol. Chem., 264 : 14812-14817 (1989)]은 항원 수용체를 형질발현하는 세포에서 감소된 양으로 존재한다. ζ-η 이종이량체는 세포소멸로 불리는 수용체-개시성의 프로그램된 세포사 뿐 아니라 이노시톨 포스페이트의 형성을 중개하는 것으로 사료된다[Mercep et al., Science, 242 : 571-574(1988) ; Mercep et al., Science, 246 : 1162-1165 (1989)].

ζ 및 η와 마찬가지로, Fc 수용체 결합된 γ연쇄는 부가 폴리펩티드와의 세포 표면 복합체로 형질발현되며, 그중 일부는 리간드 인식을 중개하고 다른 것은 밝혀지지 않은 기능을 담당한다. γ(감마)는 동종이량체 구조를 가지며 전체 조직이 ζ와 매우 유사하고, 적어도 세개의 별개의 폴리펩티드 연쇄로 구성된 비만 세포/호염기구(basophil) 고친화성 IgE 수용체인 FcεRI[Blank et al., Nature, 337 : 187-189(1989) ; Ra et al., Nature, 241 : 752-754(1989)], 및 마우스에서 FcεRIIα(Ra et al., J. Biol. Chem., 264 : 15323-15327(1989), 및 인체내에서 대식세포 및 천연 킬러 세포에 의해 형질발현되는 CD16의 아형인 CD16TM (CD16 경막)(Lanier et al., Nature, 342 : 803-805(1989) ; Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 2274-2278(1990)]로 제시되고 미규정된 작용의 폴리펩티드(Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 2274-2278(1990))를 가진 IgG에 대한 저친화성 수용체의 성분이다. 최근 γ가 γ-ζ및 γ-η이종단량체뿐 아니라, 마우스 T 세포주, CTL에 의해 형질발현되어 동종이량체를 형성한다는 사실이 보고된 바 있다[Orloff et al., Nature, 347 : 189-191(1990)].

Fc 수용체는 면역 복합체의 포식작용, 트랜스식작용 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 중개한다[Ravetch and Kinet, Annu, Rev. Immunol. 9 : 457-492(1991) ; Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6 : 251-281(1988) ; 및 Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1 : 16-25(1998)]. 최근 쥐의 저 친화성 Fc 수용체 이소타입중 1 종(FcRγIIIB1)은 클라트린 피복된 피트내로의 Ig-피복된 표적의 내재화를 중개한다는 사실과 다른 저 친화성 수용체(FcrγIIIA)가 ‘유인 분자’의 소부류중 하나 이상의 구성원과의 결합을 통해 ADCC를 중개한다는 사실이 밝혀졌다[Miettinen et al., Cell 58 : 317-327(1989) ; 및 Hunziker and Mellman, J. Cell Biol. 109 : 3291-3302(1989)]. 이러한 유인 분자, T 세포 수용체(TCR) ζ연쇄, TCR η연쇄 및 Fc 수용체 γ연쇄는 상이한 면역계 수용체의 리간드 인식 도메인과 상호 작용하고 응집후 세포용균을 비롯한 세포 작동 인자 프로그램을 자동적으로 개시할 수 있다(Samelson et al., Cell 43 : 223-231(1985) ; Weissman et al., Science 239 : 1018-1020(1988) ; Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 3319-3323(1990) ; Blank et al., Nature 337 : 187-189(1989) ; Lanier et al., Nature 342 : 803-805(1989) ; Kurosaki and Ravetch, Nature 342 : 805-807(1989) ; Hibbs et al., Science 246 : 1608-1611(1989) ; Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87 : 2274-2278(1990) ; 및 Irving and Weiss, Cell 64 : 891-901(1991)].

쥐와 인체의 저 친화성 Fc 수용체 부류를 비교한 결과, 인체 FcRγIIA 및 C 이소타입에 대응하는 대응물은 쥐에 존재하지 않는 것으로 나타났다. 부분적으로, 이러한 이유로 그 기능이 아직까지 규정되지 않았기 때문으로 사료된다.

CD4를 기본으로 한 체액 제제는 생체내에서 제한된 유용성을 가질 수 있기 때문에, 발명자들은 HIV에 대한 세포 면역성을 향상시키는 가능성을 연구하기 시작했다. 그 결과, CD4 의 세포외 도메인이 T 세포 수용체, IgG Fc 수용체 또는 B 세포 수용체 시그날 형질도입 인자의 경막(transmenbrane) 및/또는 세포내 도메인에 융합된 단백질 키메라의 제조 방법이 보고되었다. 세포외 CD4 도메인을 포함하는 키메라를 형질발현하는 세포용균성 T 세포는 HIV 피막 단백질을 형질발현하는 세포 표적의 강력한 MHC-의존성 파괴를 나타낸다. 이러한 연구의 매우 중요하고 신규한 요소는 세포 응답반응을 개시하기에 충분히 응집되는 단일 T 세포 수용체, 또는 Fc 수용체 및 B 세포 수용체 연쇄를 규명한 것이다.

이 연구의 특히 유용한 응용중 하나는 HIV gp120을 형질발현하는 세포를 인식하고 사멸시키도록 세포용균성 T 임파구를 유도하는 ζ, η또는 γ와 CD4 간 키메라의 발명이다.

[발명의 개요]

본래의 T 세포, B 세포 및 Fc 수용체는 편리한 조작이 어려운 고도로 복잡한 다량체 구조이거나 이러한 구조일 수 있지만, 본 발명은 표적 인식 작업을 수행할 수 있는 각종 분자의 세포내 도메인간에 키메라 생성 가능성을 입증하는 것이다. 특히, 적절히 유전자 조작된 항체 분자의 세포외 부분에 T 세포/Fc 수용체 제타, 에타 또는 감마 연쇄의 세포내 부분의 결합으로 형성된 키메라는 면역계 세포의 표적 인식성을 세포외 항체 부분에 대해 특이적으로 유도 전환시킨다. 따라서, 병원균 표면상의 일부 결정부를 인식할 수 있는 항체부 사용시, 키메라를 가진 면역계 세포는 병원균의 존재에 대해 그 계통에 적합한 작동 인자 프로그램으로 응답 반응하는데, 예를 들면 헬퍼 T 임파구는 표적에 대항하여 세포 독성 활성에 의해 응답 반응하며 B 세포는 활성화되어 항체를 합성한다. 대식세포 및 과립구는 사이토킨 방출, 포식작용 및 반응성 산소 산출을 비롯한 작동 인자 프로그램을 수행한다. 유사하게, 종양 세포를 인식할 수 있는 항체부 사용시, 종양에 대한 면역계 응답반응은 유리하게 상승된다. 자가 결정부와의 부적절한 반응성을 지닌 면역 세포를 인식할 수 있는 항체 사용시, 자가반응성 세포는 선택적으로 표적 선정되어 파괴될 수 있다. 이들 예는 편리한 설명 도구로서 항체 키메라 사용에 의거하고 있지만, 본 발명의 범주는 항체 키메라로 제한되지 않으며, 특이적 비항체 세포외 도메인의 사용이 중요한 잇점을 가질 수도 있다. 예를 들어, 세포외 부분이 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대한 수용체인 경우, 이 키메라를 가진 세포는 바이러스, 박테리아 또는 기생충 결정부를 형질발현하는 세포를 특이적 표적으로 간주할 것이다. 항체 사용에 따른 이러한 접근 방법의 잇점은 병원균에 대한 본래 수용체가 병원균에 대해 독특하게 높은 선택성 또는 친화성을 가질 수 있어, 결과적으로 나타나는 면역 반응에서 고도의 정확도를 제공한다는 점이다. 유사하게, 자가 항원과 부적절히 반응하는 면역계 세포를 제거하기 위해서는, 항원(B 세포 결핍 치료의 경우, 원래 단백질로서 또는 T 세포 결핍 치료의 경우 MHC 복합체로서)을 세포내 제타, 에타 또는 감마 연쇄에 연결하면 자가 결정부에 부적절하게 응답반응하는 세포의 특이적 표적화에 충분히 영향을 미칠 수 있다.

키메라의 다른 용도는 생체내 세포 개체수를 조절하여 이후 다른 형태의 유전 공학을 이루는 것이다. 예를 들어, 종양 부위로 세포독성 요인을 전달하는데 있어 종양 침윤성 임파구 또는 천연 킬러 세포의 사용 방안이 제시되었다. 본 발명은 이러한 임파구와 세포를 생체외 증폭시키기 위해 환자의 체외로 분리해내지 않고서도, 그 수와 활성을 조절하는 편리한 수단을 제공한다. 즉, 키메라 수용체의 세포내 도메인은 세포의 증식성 응답반응을 중개하기 때문에, 세포외 도메인에 특이적인 각종 응집 자극물(예, 세포외 도메인에 특이적인 항체)에 의하여 세포외 도메인이 협조되면 키메라를 보유한 세포가 증식될 것이다.

본 발명의 특정 구체예는 제타, 에타 또는 감마 연쇄 또는 그것의 활성 단편(예, 전술한 것들)간의 키메라를 포함하지만, 과립구 또는 B 임파구 중의 연쇄와 같이 상기 분자와 유사한 기능을 가진 수용체 연쇄도 본 명세서에 논의된 목적에 사용될 수 있다. 바람직한 면역 세포 유인 분자의 뚜렷한 특징은 자동 형질발현될 수 있는(즉, 단일 연쇄로서) 능력, 생성된 키메라가 치료용 세포의 표면상에 존재하도록 세포외 도메인에 융합할 수 있는 능력 및 표적 리간드와 만나 이차적으로 응집하는 세포 작동 인자 프로그램을 개시할 수 있는 능력을 포함한다.

현재, 키메라를 면역계 세포로 전달하기 위한 가장 편리한 방법은 일부 유전적 치료 형태를 통한 것이다. 그러나 적절히 가용화 정제된 키메라 단백질과 세포의 혼합물에 의한 키메라 수용체와 면역계 세포의 재구성은 키메라의 세포의 도메인에 의해 인식된 표적에 대해 응답반응할 수 있는 유전자 조작된 세포 개체를 형성시킨다. 예를 들면 본래의 HIV 수용체인 CD4를 치료 목적으로 적혈구내로 도입시키는 유사한 접근 방법이 사용되었다. 이 경우, 유전자 조작된 세포 개체는 자가 재생할 수 없다.

본 발명은 면역계 기능을 유도할 수 있고 작용적으로 단순화된 T 세포 수용체, B 세포 수용체 및 Fc 수용체 키메라에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 임파구, 대식세포, 천연 킬러 세포 또는 과립구 세포가 키메라에 의해 인식된 표적에 대해 응답반응하도록 하는 키메라를 상기 세포에서 형질발현시켜 상기 임파구, 대식 세포, 천연 킬러 세포 또는 과립구를 조절하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감염원, 종양 또는 암 세포, 또는 자가면역 산출 세포에 대한 세포 응답반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 포유 동물에서 세포 응답 반응을 유도하는 방법은 상기 감염원, 종양, 암 세포 또는 자가면역 산출 세포를 인식하고 파괴할 수 있는 유효량의 치료용 세포를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.

다른 구체예에 있어, 감염원에 대한 세포 응답반응을 유도하는 방법은 상기 감염원을 인식하고 파괴할 수 있는 치료용 세포를 투여하는 것을 포하하며, 이 때 상기 감염원은 특이적 바이러스, 박테리아, 원생 동물 또는 진균류이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 HIV 및 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)와 같은 감염원에 대해 적용된다.

구체적으로, 본 발명은 HIV 감염된 세포에 대한 세포 응답반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 환자에게, HIV로 감염된 세포를 특이적으로 인식하고 용균시킬 수 있는 유효량의 세포독성 T 임파구를 투여하는 것을 포함한다.

따라서, 한 구체예에 의하면, 환자에게 HIV로 감염된 세포를 특이적으로 인식하고 용균시킬 수 있는 유효량의 세포독성 T 임파구를 투여하는 것을 포함하여, HIV 감염된 세포에 대한 세포 응답 반응을 유도하는 방법이 제공된다.

다른 구체예에 있어서는, HIV 감염된 세포를 인식하고 용균시키도록 세포 독성 T 임파구를 유도하는 키메라 수용체 단백질이 제공된다. 본 발명의 다른 구체예는 키메라 수용체를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다.

다른 구체예에 있어, 본 발명은 본 발명의 키메라 수용체에 대한 항체를 제공한다.

HIV로 감염된 세포에 특이적으로 결합하여 이를 용균시킬 수 있는 세포 독성 T 임파구를 수득하기 위해서, 본 발명자들은 수용체 키메라를 제조하기 시작했다. 이들 키메라 수용체는 작용적으로 활성이며, gp120을 형질발현하는 세포에 특이적으로 결합하여 이를 용균시킬 수 있는 뛰어난 능력을 보유하고 있다.

본 발명의 목적은 HIV로 감염된 개체를 치료하는 방법을 제공하는데 있다. 따라서, 본 발명은 AIDS 치료에 다수의 중요한 향상된 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 구체예 및 다른 비제한적 구체예는 이후 본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해 질 것이다.

하기 상세한 설명에서는 분자 생물학 및 면역학 분야의 전문가에게 공지된 다양한 방법들이 참고로 언급될 것이다. 참고로 언급된 공지의 방법들이 설명되어 있는 문헌 및 기타 자료는 설명된 것 처럼 전문 본 명세서내에 완전히 참고로 인용되어 있다.

재조합 DNA 기술의 일반 원리를 설명하는 표준 참고 문헌으로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다 : Watson, J.D. et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I 및 II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA(1987) ; Darnll, J.E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986) ; Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y. (1985) ; Old, R. W., et al., Principles of Gene Manipulation : An Introduction to Genetic Engineering, 2nd edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA(1981) ; Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY(1989) ; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).

[용어 정의]

“클로닝”은 생체외 재조합 기술을 사용하여 특정 유전자 또는 다른 DNA 서열을 벡터 분자내로 삽입하는 것을 의미한다. 목적하는 유전자를 성공적으로 클로닝하기 위해서는, 벡터 분자에 단편을 연결시키기 위한 DNA 단편들을 산출하고, DNA 분자 복합체를 복제성 숙주 세포내로 도입시키며, 수용 숙주 세포중에서 표적 유전자를 가진 클론을 선별하는 방법을 이용한다.

“cDNA”란 RNA 의존성 DNA 중합효소(역 전사효소)의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생성된 상보적 또는 카피 DNA를 의미한다. 따라서, “cDNA 클론”은 클로닝 벡터내에 내재된, 관심의 RNA 분자에 상보적인 이중 DNA 서열을 의미한다.

“cDNA 라이브러리”는 cDNA 라이브러리 제조시에 세포에 의해 형질발현되는 mRNA 의 DNA 카피를 포함하는 cDNA 삽입체를 함유한 재조합 DNA 분자 집단을 의미한다. 이러한 cDNA 라이브러리는 당업자에게 공지되고 예를 들면 문헌 “Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Supra”에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, RNA는 우선 특정 유전자를 클로닝하기에 바람직한 게놈을 가진 유기체 세포로부터 분리한다. 본 발명의 목적에 바람직한 세포주는 포유동물, 및 특히 인체 임파구 세포주이다. 현재 이러한 목적을 위해 바람직한 벡터는 백시니아 바이러스 WR 균주이다.

“벡터”란 DNA 단편이 삽입되거나 클로닝될 수 있는, 예를 들면 플라스미드, 박테리오파아지 또는 포유동물 또는 곤충 바이러스로부터 유리된 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 하나 이상의 독특한 제한 부위를 포함하게 되며, 클로닝된 서열이 재생되도록 한정된 숙주 또는 비히클 유기체에서 자율 복제할 수 있다. 따라서 “DNA 형질발현 벡터”란 재조합 펩티드의 합성을 유도할 수 있는 모든 자율 인자를 의미한다. 이러한 DNA 형질발현 벡터에는 박테리아의 플라스미드와 파아지 및 포유동물과 곤충의 플라스미드 및 바이러스가 포함된다.

“거의 순수한”이란 천연 상태에서 수반되는 성분이 거의 없는 화합물, 예를 들면 단백질, 폴리펩티드 또는 항체를 의미한다. 일반적으로 화합물은 샘플내 전체 물질중 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 및 가장 바람직하게는 적어도 90%가 관심의 화합물인 경우 거의 순수하다고 할 수 있다. 순도는 적절한 방법, 예를 들면 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다. 핵산과 관련해서 “거의 순수한”이란 자연 발생 상태에서 인접(flanking)하는 유전자가 없는(예를 들면, 본래 게놈 위치에 있는 핵산에 인접한 서열이 없음) 핵산 서열, 분절 또는 단편을 의미한다. “작용성 유도체”란 분자의 “단편”, “변이체”, “유사체” 또는 “화학적 유도체”를 의미한다. 본 발명의 cDNA 서열과 같은 분자의 “단편”은 분자의 뉴클레오티드 서브세트를 지칭한다. 이러한 분자의 “변이체”는 분자 전체 또는 그것의 단편과 거의 유사한 자연 발생적인 분자를 지칭한다. 분자의 “유사체”는 분자 전체 또는 그것의 단편과 거의 유사한 비천연 분자를 지칭한다. 두 분자의 아미노산 서열이 거의 동일한 경우, 그 분자는 다른 분자와 “거의 유사한”것으로 언급된다. 거의 유사한 아미노산 분자는 유사한 생물학적 활성을 보유한다. 따라서, 두 분자가 유사한 활성을 보유한다면, 이들은 분자중 하나가 다른 분자에서는 발견되지 않는 추가 또는 몇몇 아미노산 잔기를 포함하거나 또는 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않은 경우에라도 본 명세서에서는 변이체로 간주된다. 본 명세서에서 분자는 정상시 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 부위를 포함할 때 다른 분자의 “화학적 유도체”라고 부른다. 이러한 부위는 분자의 가용성, 흡착성, 생물학적 반감기 등을 개선할 수 있다. 또한 이 부위들은 분자의 독성을 감소시키거나 분자의 원치 않는 부작용등을 제거하거나 약화시키는 등의 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 효과를 중개할 수 있는 부위는 예를 들면 문헌 “Reminaton′s Pharmaceutical Science, 16th et., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980)”에 기재되어 있다.

유사하게, 본 발명의 수용체 키메라의 “작용성 유도체”는 뉴클레오티드 서열이 “거의 유사”할 수 있고 예를 들면 T 세포, B 세포 또는 Fc 수용체 키메라와 유사한 활성을 보유한 분자를 암호하는 유전자의 “단편”, “변이체” 또는 “유사체”를 포함하는 것을 의미한다.

따라서, 본 명세서에서 사용된 T 세포, B 세포 또는 Fc 수용체 키메라 단백질은 “와일드형”키메라와 거의 유사할 수 있고 유사한 활성을 보유하는(즉, 와일드형 수용체 키메라 활성 중 가장 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 70%, 바람직하게는 40% 또는 적어도 10% 활성 보유) 작용성 유도체, 단편, 변이체, 유사체 또는 화학적 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 작용성 키메라 수용체 유도체의 활성은 표적된 감염원 또는 세포에 대한 특이적 결합(세포외 부분에 의한 결합) 및 그 결과 일어나는 상기 감염원 또는 세포의 파괴(세포내 부분 또는 경막 부분에 의해 유도됨)을 포함하며, 이러한 활성은 예를 들면 본 명세서에 기술된 임의의 분석을 사용하여 시험될 수 있다.

본 발명의 T 세포, B 세포 또는 Fc 세포 수용체 키메라를 암호하는 DNA 서열 또는 그것의 작용성 유도체는 결찰을 위한 평활 말단화 또는 점착 말단화, 적절한 말단부를 제공하는 제한 효소 분해, 필요한 경우 점착 말단의 충전, 원치 않는 결합을 피하기 위한 적절한 알칼린 포스파타제 처리와 적절한 리가제에 의한 결찰을 비롯한 통상의 기술에 따라 벡터 DNA와 재조합할 수 있다. 이러한 조작 기술은 문헌 “Maniatis, T., et al., supra”에 기재되어 있으며 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

DNA와 같은 핵산 분자는 전사 및 해독 조절 정보를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 함유하여 이러한 서열이 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열에 “작동 가능하게 결합된” 경우 폴리펩티드를 “형질발현할 수 있는”것이라고 한다. 작동가능한 결합은 형질발현하고자 하는 DNA 서열 및 조절성 DNA 서열이 유전자 형질발현이 가능하도록 연결되어 있는 결합이다. 유전자 형질발현에 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 유기체마다 다를 수 있지만, 일반적으로, 원핵세포에서 프로모터(RNA 전사의 개시 유도) 뿐 아니라, RNA로 전사시, 단백질 합성의 개시를 시그날하는 DNA 서열 둘다를 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 이러한 영역은 정상적으로, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열등과 같이 전사 및 해독의 개시에 관여하는 5′-비-암호 서열을 포함한다.

필요에 따라서는, 단백질을 암호하는 유전자 서열에 대한 비-암호 영역 3′는 전술된 방법에 의해 얻을 수 있다. 이 영역은 종결 및 폴리아데닐화와 같은 전사 종결 조절 서열을 위해 유지된다. 즉, 단백질을 암호하는 DNA 서열에 원래부터 인접해 있는 3′-영역을 유지시킴으로써, 전사 종결 시그날이 제공될 수 있다. 전사 종결 시그날이 숙주 세포 형질발현에 만족할 만하게 작용하지 않는 경우, 숙주 세포에서 작용하는 3′-영역으로 치환될 수 있다.

두 DNA 서열(프로모터 영역 서열과 T 세포 수용체, B 세포 수용체 또는 Fc 수용체 키메라 암호 서열)은 두 DNA 서열간 결합의 성질이 (1) 구조-이동 돌연변이(frame-shift mutation)를 야기시키지 않거나 (2) 수용체 키메라 유전자 서열의 전사를 유도할 수 있는 프로모터 영역 서열의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 프로모터 영역 서열에 의한 수용체 키메라 유전자 서열의 전사 능력을 방해하지 않는 경우 작동가능하게 결합된 것이라 한다. 그 프로모터 영역은 프로모터가 DNA 서열의 전사를 실행할 수 있는 경우 DNA 서열에 작동 가능하게 결합된다. 따라서, 단백질을 형질발현하기 위해서는, 적절한 숙주에 의해 인식되는 전사 및 해독 시그날이 필요하다.

본 발명은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서의 T 세포 수용체, B 세포 수용체 또는 Fc 수용체 키메라 단백질(또는 그것의 작용성 유도체)의 형질발현을 포함하지만 진핵 세포(및 특히, 인체 임파구)의 형질발현이 바람직하다.

본 발명에 따른 항체는 다양한 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들어, 수용체 키메라 단백질 또는 그것의 작용성 유도체를 형질발현하는 세포는 키메라에 결합할 수 있는 폴리클로날 항체를 포함하는 혈청의 제조를 유발시키기 위해 동물에 투여할 수 있다.

바람직한 방법에 있어, 본 발명에 따른 항체는 모노클로날 항체이다. 이러한 모노클로날 항체는 하이브리도마 기술을 이용하여 작제할 수 있다(Kohler et al., Nature 256 : 495(1975) ; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6 : 511(1976) ; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292(1976) ; Hammerling et al., In : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier. N.Y., pp. 563-684(1981)). 일반적으로, 이러한 과정은 동물을 T 세포 수용체, B 세포 수용체 또는 Fc 수용체 키메라 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 상기 동물의 비장 세포를 추출하여 적합한 미엘로마 세포주와 융합시킨다. 적합한 미엘로마 세포주가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 융합후, 생성된 하이브리도마 세포는 HAT 배지에서 선택적으로 유지시킨 후, 문헌 “Wands, J. R., et al., Gastroenterology 80 : 225-232(1981)”에 기재된 바와 같이 한계 희석시켜 클로닝한다. 그후, 이렇게 선별하여 수득한 하이브리도마 세포를 분석하여 키메라에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 확인한다.

본 발명에 따른 항체는 또한 폴리클로날 항체 또는 바람직하게는 영역 특이적 폴리클로날 항체일 수 있다.

본 발명에 따른 T 세포 수용체, B 세포 수용체 또는 Fc 수용체 키메라에 대한 항체를 사용하여 환자내 키메라 수용체(또는 키메라 수용체-보유 세포)의 양을 모니터할 수 있다. 이러한 항체는 순방향 샌드위치, 역방향 샌드위치 및 동시 샌드위치와 같은 “샌드위치”분석법 또는 면역측정 분석법을 비롯한 당해 기술 분야에 공지된 표준 면역진단 분석법에서 사용하기에 매우 적합하다. 항체는 어려운 실험을 거치지 않고서도 당업자에 의해 측정될 수 있도록 임의 수를 조합하여 허용 가능한 특이성, 감수성 및 정확성에 대해 면역분석법을 수행할 수 있다.

면역학의 일반 원리에 대해 설명하는 표준 참고 문헌에는 다음과 같은 것들이 있다 : Roitt, I., Essential Immunology, Sixth Ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford(1988) ; Kimball, J. W., Introduction to Immunology, Second Ed., Macmillan Publishing Co., Publisher, New York(1986) ; Roitt, I., et al., Immunology. Gower Medical Publisher Ltd., Publisher, London. (1985) ; Campbell, A., “Monoclonal Antibody Technology,”in, Burdon, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984) ; Klein, J., Immunology : The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York (1982) ; 및 Kennett, R., et al., eds., Monoclonal Antibodies. Hybridoma : A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, New York (1980).

“검출”은 물질의 존재 또는 부재 여부를 측정하거나, 물질의 양을 정량하는 것을 포함한다. 따라서 이 용어는 정성 및 정량 측정을 목적으로 하는 본 발명의 방법, 물질 및 조성물을 사용하는데 언급된다.

본 명세서에서 기술된 바와 동일한 특이성의 모노클로날 항체를 분비하는 다른 하이브리도마의 분리는 항이디오타이프성 스크리닝 기술에 의해 수행될 수 있다[Potocmjak. et al., Science 215 : 1637(1982)]. 간략히 말하면, 항이디오타이프성 항체는 관심 클론에 의해 생성된 항체상에 존재하는 독특한 결정부를 인식하는 항체이다. 항이디오타이프성 항체는 모노클로날 항체의 공급원으로서 사용된 동일한 균주의 동물을 관심의 모노클로날 항체로 면역화시켜 제조한다. 면역된 동물은 이들 이디오타이프성 결정부에 대한 항체(항이디오타이프성 항체)를 생성하므로써 면역화 항체의 이디오타이프성 결정부를 인식하고 이것에 대해 응답반응할 것이다.

복제를 위해, 하이브리드 세포를 생체외 및 생체내에서 배양할 수 있다. 생체내 생성율이 높기 때문에 이 방법은 현재 바람직한 배양 방법이다. 이를 간략히 기술하면, 개개의 하이브리드 균주 유래의 세포를 프리스탄-프라임된 BALB/c 마우스내로 복강내 주사하면 고농도의 목적하는 모노클로날 항체를 함유하는 복수액을 산출한다. 이소타입 IgM 또는 IgG의 모노클로날 항체는 당해 기술 분야의 전문가에게 공지된 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하여 배양 상층액으로부터 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 면역 분석법에서 사용하기에 특히 적합한데, 이 때 이들은 액상중에 또는 고체상 캐리어에 결합되어 사용될 수 있다. 그외에, 이러한 면역 분석법에서 항체들은 각종 방법에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다.

당해 기술 분야에는 공지된 다수 상이한 표지체 및 표지 방법이 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 유형의 표지체의 예로는 효소, 방사성동위 원소, 형광성 화합물, 화학발광성 화합물, 생물발광성 화합물 및 금속 킬레이트가 포함되며 하지만 이들로 제한되지는 않는다. 당업자라면 항체에 결합시키기에 적합한 기타 표지체를 알고 있거나 통상의 실험 과정을 이용하므로써 확인할 수 있다. 또한, 이들 표지체는 보편적으로 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 항체에 결합시킬 수 있다.

본 발명에 따른 항체를 검출가능하게 표지시킬 수 있는 방법중 하나는 항체를 효소에 결합시키는 것이다. 이 효소는 이후 기질에 노출시, 기질과 반응하여, 예컨대 분광측정 또는 형광측정 기구에 의해 검출될 수 있는 화학적 부위를 생성한다. 항체를 검출 가능하게 표지시키는데 사용될 수 있는 효소의 예로는 말레이트 디히드로게나제, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 디히드로게나제, 알파-글리세로포스페이트 디히드로게나제, 트리오즈 포스페이트 이소머라제, 비오틴아비딘 페록시다제, 호오스래디쉬 페록시다제, 알칼린 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코오스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코오스-VI-포스페이트 디히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제가 포함된다.

검출가능하게 표지된 항체의 존재는 또한 항체를 방사성 동위원소를 표지시킨 후, 감마 계수기 또는 섬광 계수기 같은 기구를 사용하여 측정하므로써 검출할 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는³H,¹²⁵I,³²P,³⁵S,¹⁴C,⁵¹Cr,³⁶Cl,⁵⁷Co,⁵⁸Co,⁵⁹Fe 및⁷⁵Se 이다.

또한, 항체를 형광성 화합물로 표지하므로써 검출가능하게 표지된 항체의 결합을 검출하는 것도 가능하다. 형광 표지된 항체의 존재는 적정 파장의 광선에 노출시에, 염료의 형광성으로 인해 검출할 수 있다. 가장 보편적으로 사용되는 형광성 표지 화합물로는 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드 및 플루오레스아민이 있다.

본 발명의 항체는 또한¹⁵²Eu 또는 란타나이드 계열에 속하는 다른 것들과 같이 형광 방출 금속을 이용하여 검출가능하게 표지시킬 수 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이팅 그룹을 사용하여 항체 분자에 부착시킬 수 있다.

항체는 또한 화학발광성 화합물에 커플링시킴으로써 검출가능하게 표지시킬 수도 있다. 화학발광제-표지붙인 항체의 존재는 그 후 화학 반응 과정중 나타나는 발광의 존재를 검출하므로써 측정한다. 특히 유용한 화학발광체 표지 화합물의 예는 루미날, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염, 옥살레이트 에스테르 및 디옥세탄이다.

마찬가지로, 생물발광성 화합물이 본 발명에 따라 항체를 표지시키는데 사용될 수도 있다. 생물발광성은 촉매성 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증대시키는 생물학적 시스템에서 밝혀진 화학발광성의 유형이다. 생물발광성 항체의 존재는 발광성의 존재를 검출하므로써 결정된다. 표지 목적에 중요한 생물발광성 화합물에는 루시페린, 루시페라제 아에쿠오린이 포함된다.

본 발명의 항체 및 거의 정제된 항원은 이론상 킷트 제조에 적합하다. 이러한 킷트는 바이알, 튜브등과 같은 하나 이상의 용기의 폐쇄된 구획내에 분석에 사용될 각 요소들을 포함하도록 구획 구분된 캐리어 수단을 포함할 수 있다.

킷트 형태로 사용할 수 있는 분석 유형에는 여러 가지가 있으며, 예를들면 경쟁적 및 비경쟁적 분석을 포함한다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 대표적인 분석의 예는 방사성 면역분석법(RIA), 효소 면역분석법(EIA), 효소결합된 면역흡착 분석법(ELISA) 및 면역측정 또는 샌드위치 면역 분석법이다.

용어 “면역측정 분석법” 또는 “샌드위치 면역분석법”이란 동시 샌드위치, 순방향 샌드위치 및 역방향 샌드위치 면역분석법을 포괄하는 것을 뜻한다. 이들 용어는 당해 기술 분야의 전문가라면 잘 이해하고 있다. 당해 기술 분야의 전문가들은 본 발명의 항체가 현재 공지되어 있거나 이후 개발될 수 있는 분석 형태 및 기타 변형 방법에 유용할 것이라는 사실을 알 수 있을 것이다. 이들은 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 이해한다.

분석을 수행하기 위한 바람직한 방식에 있어, 특정 “차단물질”이 항온처리액(보통 표지된 가용성 항체가 첨가됨)내에 제공되어야 한다는 사실은 중요하다. “차단물질”첨가시, 실험 샘플내에 존재하는 마우스 면역글로불린에 대한 비특이성 단백질, 프로테아제 또는 인체 항체는 고체상 지지체상의 항체 또는 방사성 표지된 지시용 항체와 교차 결합하거나 이를 파괴하지 않아 허위 양성 또는 허위 음성 결과를 나타낸다. 따라서 “차단물질”의 선택에 따라 본 발명에 기재된 분석법의 특이성이 상당히 향상된다.

분석에 사용된 것(예, IgG₁, IgG₂a, IgM 등)과 동일한 부류 또는 소부류(이소타입)에 속하는 다수의 무관련(즉, 비특이성) 항체가 “차단물질”로서 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 적절한 감수성을 유지하고 인체 혈청에서 상호 작용하는 교차 반응성 단백질에 의한 원치않는 간섭을 억제하기 위해서는, 차단 물질의 농도(정상적으로 1 내지 100 ㎍/μl)가 중요하다. 또한, “차단물질”을 함유하는 완충액 시스템은 최적화될 필요가 있다. 바람직한 완충액으로는 생리적 pH 범위의 유기성 약산을 주성분으로 하는 완충액, 예를 들면 이미다졸, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS 등이 있다. 다소 덜 바람직한 완충액은 포스페이트, 보레이트 또는 카르보네이트와 같은 무기 완충액이다. 최종적으로, 공지된 프로테아제 억제제는 “차단물질”을 함유하는 완충액에 첨가되어야 한다(정상적으로 0.01 또는 10 ㎍/ml).

사용된 바 있고 본 발명에서 사용될 수 있는 다수의 고체상 면역 흡착제가 다수 있다. 잘 알려진 면역흡착제에는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 덱스트란, 나일론 및 기타 물질을 튜브, 비드 및 미량적정 평판으로 형성시킨 형태나 이들 물질로 튜브, 비드 및 미량적정 평판을 피복시킨 형태등이 포함된다. 고정시킨 항체는 아미드 또는 에스테르 결합을 통해 공유 결합과 같은 기술 또는 흡착에 의해 고체상 면역흡착제에 공유 결합 또는 물리적 결합시킬 수 있다. 당해 기술 분야의 전문가라면 다수의 다른 적합한 고체상 면역 흡착제 및 그 표면상에 항체를 고정시키는 방법을 알고 있거나 통상의 실험 정도만을 사용하여도 확인할 수 있을 것이다.

생체내, 생체외 또는 동일계내 진단을 위해, 래디오뉴클리드와 같은 표지체를 직접 또는 중개의 작용성 그룹을 사용하여 본 발명의 항체에 결합시킬 수 있다. 금속성 양이온으로 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키는데 종종 사용되는 중개 그룹은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)이다. 이러한 방식으로 결합된 금속 양이온의 대표적인 예는^99mTc,¹²³I,¹¹¹IN,¹³¹I,⁹⁷Ru,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga 및⁶⁸Ga 이다. 본 발명의 항체는 진단을 목적으로 비방사성 동위원소로 표지시킬 수도 있다. 이러한 방법에 특히 유용한 원소는¹⁵⁷Gd,⁵⁵Mn,¹⁶²Dy,⁵²Cr 및⁵⁶Fe 이다.

본 발명의 항원은 본 발명에 따른 항체를 사용하여 거의 순수한 형태로 분리될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 거의 순수한 T 세포 수용체, B 세포 수용체 또는 Fc 수용체 키메라를 제공하며, 이 항원은 본 발명에 따른 항체에 의해 인식되어 이 항체에 결합하는 것을 특징으로 한다. 다른 구체예에 있어, 본 발명은 상기 항원과 상기 수용체 키메라에 대해 지향성인 하나 이상의 항체가 복합체를 형성함으로써, 수용체 키메라 항원을 분리 또는 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 거의 순수한 T 세포 수용체, B 세포 수용체 또는 Fc 수용체 키메라 항원은 혈청 또는 소변과 같은 샘플내 키메라에 대한 항체를 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 키메라 항원에 대한 항체를 함유하는 샘플을 검출가능하게 표지시킨 수용체 키메라와 접촉시키고 상기 표지체를 검출하는 것을 포함하여, 샘플내 수용체 키메라 항원에 대한 항체의 존재 또는 양을 검출하는 방법을 포함한다. 키메라의 면역반응성 분획 및 면역반응성 유사체를 또한 사용할 수도 있다. “면역반응성 분획”이란 용어는 수용체 키메라에 대해 지향하는 항체에 대해 동등한 면역 응답반응을 나타내는 키메라 항원의 임의의 부분을 말한다. “면역반응성 유사체”란 용어는 수용체 키메라 단백질과 하나 이상의 아미노산이 다르지만, 본 발명의 항체에 대해 동등한 면역 응답반응을 나타내는 단백질을 지칭한다.

“특이적 인식 또는 결합”이란 샘플내, 예를 들면 수용체 폴리펩티드를 포함하는 생체 샘플내 존재하는 키메라 수용체 폴리펩티드는 인식하고 결합하지만, 다른 분자는 거의 인식 및 결합하지 않는 항체를 의미한다.

“자기 면역 산출된 세포”는 자가반응성인 면역 작동 인자 T 세포 또는 숙주 조직과 반응하는 항체 생성 세포를 의미하며 ; 이러한 세포로는 아세틸콜린 수용체(예를 들면, 중증근무력증 유발)에 대한 항체 또는 항DNA, 항적혈구 및 항혈소판 자가항체(예를들면, 홍반성 루푸스 유발)를 포함한다.

“치료용 세포”란 특이적 감염원, 특이적 감염원으로 감염된 세포, 종양 또는 암 세포, 또는 자가 면역 산출 세포를 인식하고 파괴할 수 있도록 본 발명의 키메라에 의해 형질전환된 세포를 의미하며 ; 이러한 치료용 세포로는 조혈계의 세포가 바람직하다.

“세포외”란 분자의 적어도 일부가 세포 표면에 노출되어 있는 것을 의미한다. “세포내”는 분자의 적어도 일부가 치료용 세포의 세포질에 노출되어 있는 것을 의미한다. “경막”은 분자의 적어도 일부가 혈장 막에 걸쳐 있는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 “세포외 부분”, “세포내 부분”및 “경막 부분”은 인접한 세포 구획내로 연장된 인접 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

“올리고머화”란 다른 단백질과 복합되어 이량체, 삼량체, 사량체 또는 기타 고급 올리고머를 형성하는 것을 의미한다. 이러한 올리고머는 호모올리고머 또는 헤테로올리고머가 가능하다. “올리고머화 부분”은 복합체(즉, 올리고머) 형성을 유도하는 분자 영역을 의미한다.

“세포용균성”은 세포(예, 병원균으로 감염된 세포, 종양 또는 암 세포 또는 자가 면역 산출 세포)를 파괴할 수 있거나 감염원(예, 바이러스)을 파괴할 수 있는 것을 의미한다.

“면역결핍성 바이러스”란, 와일드-형 형태로, 영장류 숙주의 T4 세포를 감염시킬 수 있고, 렌티바이러스 아과의 바이러스성 형태발생 및 형태 특징을 가지는 레트로바이러스를 의미한다. 이 용어는 HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand 및 SIVcpz를 비롯한 HIV 및 SIV의 모든 균주를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

“MHC 비의존성”이란 세포의 세포용균성 응답반응시 표적된 세포의 표면상에 MHC 부류 II 항원의 존재를 필요로하지 않는 것을 의미한다.

“작용성 세포용균성 시그날-형질도입 유도체”는 와일드형 분자가 나타내는 생물 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 40%, 더욱 바람직하게는 70% 또는 가장 바람직하게는 적어도 90%를 유도할 수 있는 작용성 유도체(전술한 바와 같음)를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 “작용성 세포용균성 시그날-형질도입 유도체”는 수용체-결합된 감염원 또는 세포를 파괴하기 위하여 치료용 세포를 직접 시그날함으로써 작용할 수 있거나(예를 들면, 세포내 키메라 수용체 부분의 경우) 치료용 세포의 세포용균성 시그날 형질도입 단백질로 올리고머화를 촉진시킴으로써 간접적으로 작용할 수 있다(예를 들면, 경막 도메인의 경우). 이러한 유도체는 예를들면 본 명세서에 기재된 생체외 분석을 이용하여 효력에 대해 시험할 수 있다.

“작용성 HIV 피막 결합 유도체”란 HIV 피막 단백질을 결합할 수 있는 작용성 유도체(전술한 바와 같음)를 의미한다. 작용성 유도체는 예를 들면 본 명세서에 기재된 생체외 분석을 이용하여 확인할 수 있다.

[치료 용도의 투여]

본 발명의 형질전환된 세포는 다양한 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이러한 형질전환된 세포를 투여하는 현행 방법은 입양 면역치료 또는 세포 전이 치료를 포함한다. 이들 방법은 형질전환된 면역계 세포를 혈류로 복귀시킨다[Rosenberg, S.A., Scientific American, 62(1990년 5월) ; Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine, 323(9) : 570(1990)].

본 발명의 약제 조성물은 본 발명의 화합물로 유익한 효과를 얻을 수 있는 동물에게 투여할 수 있다. 이러한 동물중 가장 중요한 것은 인체이나, 본 발명은 인체로만 제한되지 않는다.

[상세한 설명]

우선, 도면에 대해 설명한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 CD4 키메라의 특성을 나타내는 도면이다. 제1(a)도는 CD4(잔기 1-369)와 상이한 수용체 연쇄간의 융합 부위 근처의 아미노산 서열을 나타낸다. 밑줄친 서열은 융합 형성에 사용되는 BamHI 부위내에 암호된 아미노산의 위치를 나타낸다. 경막 도메인의 시작부는 수직 막대로 표시된 곳이다. η서열의 아미노 말단부는 ζ서열과 동일하지만 카르복실 말단부는 상이하다(Jin et al., Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 87 ; 3319-3323(1990)). 제1(b)도는 CV1 세포에서의 CD4, CD4 : ζ, CD4 : γ 및 CD4 : η의 표면 형질발현의 유동 세포계산 분석법을 나타낸다. 세포는 CD4 키메라 또는 CD16_PI를 형질발현하는 바이러스로 감염시키고, 37℃에서 9 시간 동안 배양한 후, 피코에리트린-결합된 항 CD4 MAb Leu3A로 염색시켰다. 제1(c)도는 CV1 세포에서 형질발현되는 표지시킨 CD4:ζ, CD4:γ, 또는 원래의 CD4의 면역침전을 나타낸다. 각 레인은 환원제 존재(R) 또는 환원제 부재(NR)하에서 전개시켰다. 분자량 표준(kD)은 좌측에 제시되어 있다.

제2도는 CD16_TM단독(좁은 간격의 점선), 또는 CD4:γ(대시) 또는 CD4:ζ(실선)을 형질 발현하는 바이러스로 공동감염시킨후 CD16_TM의 표면 형질발현을 나타내는 도면이다. 넓은 간격의 점선은 CD4:ζ단독으로 감염시키고 3G8로 염색한 세포를 나타낸다[Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:3275-3279(1982)](항CD16 MAb).

제3도는 ζAsp-15가 결핍된 돌연변이체 CD4:ζ키메라 수용체가 CD16_TM의 공동형질발현을 지원하지 않는다는 사실을 나타낸다. 제3(a)도는 환원하(R) 또는 환원 부재하(NR)에서 전기영동시킨 면역침전된 돌연변이체 키메라의 오토래디오그램이다. 제3(b)도는 CD16_TM과 하기 ζ키메라: CD4:ζ(굵은선) ; CD4:C11G(실선) ; CD4:ζ(대시선) ; CD4:ζC11G/D15G(좁은 간격의 점선)을 형질발현하는 바이러스로 공동감염; 및 공동감염시키지 않은(CD16_TM단독, 넓은 간격의 점선) 후의 CD16_TM의 표면 형질발현을 나타낸다. 세포는 항CD16 MAb 3G8 및 마우스 IgG에 대한 피코에리트린-결합된 Fab′₂염소 항체와 함께 항온처리하였다. ζ키메라의 형질발현 수준은 분석한 상이한 돌연변이체에 대해 거의 동등하며 CD16_TM및 ζ키메라를 형질발현하는 바이러스를 사용한 세포의 공동감염은 키메라의 표면 형질발현을 인식될 정도로 바꾸지 않는 것으로 평가된다(데이타는 제시되어 있지 않음).

제4도는 T 세포주에서 돌연변이체 ζ키메라 교차결합후 세포내 유리 칼슘 이온의 증가를 나타내는 도면이다. 저르캇(Jurkat) E6 세포[Weiss et al., J. Immunol., 133: 123-128(1984)]를 재조합 백시니아 바이러스로 감염시키고 유동 세포계산에 의해 분석하였다. 제시된 결과는 제한된 CD4⁺개체에 대한 것이어서, 관련 키메라 단백질을 형질발현하는 세포만이 분석되었다. 바이올렛 색상 대 청색 인도-1 형광성의 평균 비율은 전체적으로 개체내 세포내 유리 칼슘 농도를 반영하며, 응답반응하는 세포의 백분율은 소정의 역치 비율을 초과하는 세포의 분획을 반영한다(무처리 세포의 10%가 양성이 되도록 고정).

제4(a)도 및 제4(b)도는 항CD4 MAb Leu3a(피코에리트린 결합체)에 노출후 마우스 IgG에 대한 염소 항체와 교차결합한 CD4:ζ(실선) 또는 CD16:ζ(대시선)를 형질발현하는 저르캇 세포를 나타낸다. 점선은 항CD3 MAb OKT3에 대한 비감염 세포의 응답반응을 나타낸다.

제4(c)도 및 제4(d)도는 제4(a)도 및 제4(b)도에서와 같이 처리하고 분석한 CD4:ζD15G(실선); CD4:ζC11G/D15G(대시); 또는 CD4:ζC11G(점선)을 형질발현하는 저르캇 세포를 나타낸다.

제5도는 CD4:ζ, CD4:η 및 CD4:γ 수용체에 의해 세포용균성 T 임파구(CTL)가 HIV-1 gp120/41을 형질발현하는 표적을 사멸시킬 수 있음을 보여준다.

제5(a)도: ●gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD4:ζ을 형질발현하는 CTL; Ｏ 비감염된 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD4:ζ을 형질발현하는 CTL; ■gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 비감염된 CTL ; □비감염된 HeLa 세포와 함께 항온처리한 비감염된 CTL.

제5(b)도 : ●gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD4:η를 형질발현하는 CTL; Ｏ gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD4:γ을 형질발현하는 CTL; □gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 C11G/D15G 이중 돌연변이체 CD4:ζ 키메라를 형질발현하는 CTL. 제5c도는 제5(b)도에서 사용된 CTL에 의한 CD4 형질발현의 유동 세포 계산 분석을 나타낸 것이다. 표적 대 작동 인자 비율을 보정하기 위해, 막대그래프의 겹침에 의한 계산된 음성(비감염) 개체를 공제함으로써 CD4 키메라를 형질발현하는 세포의 비율(%)을 측정하며; 비교용으로, 비감염된 세포는 막대그래프 공제에서와 대략적으로 동일한 다른 세포 개체에 대해 양성인 분획을 제공하는 임의의 역치가 주어졌다.

제6도는 CD4 유도된 세포용균의 특이성을 나타내는 도면이다.

제6(a)도: ●CD16_PI를 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD4:ζ를 형질발현하는 CTL; Ｏ gp120을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD4를 형질발현하는 CTL; ■gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD16;ζ을 형질발현하는 CTL ; □gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포와 함께 항온처리한 CD16_PI를 형질발현하는CTL.

제6(b)도 : ●Raji(MHC 부류 II⁺) 세포와 함께 항온처리한 CD4:ζ를 형질발현하는 CTL; Ｏ RJ2.2.5(MHC 부류 II⁺Raji 돌연변이주) 세포와 함께 항온처리한 비감염된 CTL 세포; ■Raji(MHC 부류 II⁺) 세포와 함께 항온처리한 비감염된 CTL. □RJ2.2.5(MHC 부류 II⁺) 세포와 함께 항온처리한 CD4:ζ를 형질발현하는 CTL. 세로좌표 눈금은 확대되어 있다.

제7도는 CD16:ζ키메라 수용체의 특성을 나타내는 도면이다.

제7(a)도는 CD16:ζ융합 단백질의 개요도이다. 단량체 CD16의 포스파티딜이노시톨-결합된 형태의 세포외 부분은 경막 도메인의 인접 외부인 이량체 ζ에 결합시켰다. 융합점의 단백질 서열은 하단부에 제시되어 있다.

제7(b)도는 TCR 양성 또는 TCR 음성 세포주에서 CD16;ζ키메라 교차결합 후 칼슘 이동의 유동 세포계산 분석을 나타낸다. 0 시에 항체 처리한 세포 개체중 바이올렛 색상 대 청색 형광의 평균 비율(상대적인 칼슘 이온 농도의 척도)이 제시되어 있다. ■항 CD3 MAb OKT3에 대한 저르캇 세포의 응답 반응; ▲REX33A TCR^-돌연변이체에서 항CD16 MAb 3G8 교차결합에 대한 CD16:ζ의 응답반응; □저르캇 TCR^-돌연변이주 JRT3.T3.5에서 CD16:ζ교차결합에 대한 응답반응; △저르캇 세포에서 CD16:ζ 교차결합에 대한 응답반응; +, 저르캇 세포에서 비키메라 CD16에 대한 응답반응; 및 점선, REX33A TCR^-세포주에서 비키메라 CD16에 대한 응답반응.

제8도는 세포용균성 능력 결실에 대한 분석을 나타내는 도면이다.

제8(a)도는 ζ결실 종료점의 위치를 나타낸다. 다른곳에서의 ζ돌연변이는 최초 잔기-위치-돌연변이체 잔기 규칙으로 표시하였고, 예를들어 D66^*는 ASP-66이 종결 코돈으로 대체되었음을 나타낸다.

제8(b)도는 비결실된 CD16:ζ 및 현저한 ζ결실의 세포용균 분석 결과를 나타낸다. CD16에 대한 표면 항체를 형질발현하는 하이브리도마 세포는⁵¹Cr과 함께 로딩하고 CD16:ζ 키메라를 형질발현하는 백시니아 재조합체로 감염된 인체 세포용균성 임파구(CTL)의 수를 증가시키면서 항온처리하였다.⁵¹Cr의 방출율(%)은 표적 (하이브리도마) 세포 비율에 대한 작동 인자(CTL)(e/t)의 함수로서 플로팅되어 있다. ●CD16:ζ(mfi 18.7)을 형질발현하는 세포에 의해 중개된 세포용균; ■CD16:ζAsp66^*(mfi 940.2)를 형질발현하는 세포에 의해 중개된 세포용균; □CD16:ζGlu60^*(mfi 16.0)을 형질발현하는 세포에 의해 중개된 세포용균; ＯCD16:ζTyr51^*(mfi 17.4)를 형질발현하는 세포에 의해 중개된 세포용균; ▲CD16:ζPhe34^*(mfi 17.8)을 형질발현하는 세포에 의해 중개된 세포용균; 및 △비키메라 CD16(mfi 591)을 형질발현하는 세포에 의해 중개된 세포용균. 상기 실험에 있어, CD16:ζAsp66^*의 형질발현은 다른 융합 단백질의 형질 발현과 일치되지는 않았지만, 동일 실험에서 동등한 수준으로 CD16:ζ를 형질발현하는 세포에 의한 세포용균은 CD16:ζAsp66^*을 형질발현하는 세포에 의해 밝혀진 바와 거의 동일하다 (미제시).

제9도는 경막 상호 작용에 대한 능력의 제거에 의해 세포용균을 중개할 수 있는 ζ단분절이 나타남을 제시하는 도면이다.

제9(a)도는 이분(bipartite) 및 삼분(tripartite) 단량체 키메라의 개요도이다. 상단에는 잔기 65에서 절단되고 경막 Cys 및 Asp 잔기가 결실된 CD16:ζ구성체가 제시되어 있다. 하단에는 CD16:CD5:ζ및 CD16:CD7:ζ구성체 및 관련 조절부가 있다. 세포내 도메인의 펩티드 서열은 하단에 제시되어 있다.

제9(b)도는 단량체 키메라 결실 돌연변이체의 세포용균 활성을 나타낸 것이다. CD16:ζ(●; mfi 495)를 형질발현하는 세포의 세포용균 활성을 CD16:ζAsp66^*(■; mfi 527) 또는 돌연변이체 CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66^*(□; mfi 338) 및 CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60(▲; mfi 259)를 형질발현하는 세포의 세포용균 활성과 비교하였다.

제9(c)도는 삼분체 융합 단백질에 의해 중개된 세포용균 활성을 나타낸 것이다. ▲, CD16;ζAsp66^*; △, CD16:5:ζ(48-65); ■, CD16:7:ζ(48-65); △, CD16:7:ζ(48-59); Ｏ, CD16:5; ●, CD16:7.

제9(d)도는 TCR 음성 저르캇 JRT3.T3.5 돌연변이 세포주에서 돌연변이체 및 3분체 키메라에 의한 칼슘 이동을 나타낸 것이다. Ｏ, 이량체 CD16:ζAsp66^*을 형질발현하는 세포의 응답반응; ■, CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66^*을 형질발현하는 세포의 응답반응; □, CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60^*을 형질발현하는 세포의 응답반응; ▲, CD16:7:ζ(48-65)를 형질발현하는 세포의 응답반응; 및 △, CD16:ζ(48-59)를 형질발현하는 세포의 응답반응.

제10도는 18 잔기 세포용균성 시그날-형질도입 특성의 활성에 대한 각 아미노산의 기여도에 관한 것이다. 제10(a)도 및 제10(b)도는 세포용균 활성을 나타내며 제10(c)도는 카르복실 말단 티로신(Y62) 근처에 점돌연변이를 보유한 키메라에 의해 중개되는 칼슘 이온 이동을 나타낸다. 제10(a)도 및 제10(b)도는 각각 소량 및 다량의 CD16:ζ융합 단백질을 형질발현하는 세포에 대해 수집된 데이타를 나타낸다. 칼슘 이동 및 세포용균 분석에 대해 동일한 기호를 사용하고 있으며 이는 우측에 문자코드로 제시되어 있다. ●, CD16:ζ(mfi A, 21, B, 376)를 형질발현하는 세포; ■, CD 16:7:ζ(48-65)(mfi A, 31; B, 82)를 형질발현하는 세포; □; CD 16:7:ζ(48-65)Gly60gln(mfi A, 33; B, 92), +, CD 16:7:ζ(48-65)Asp63Asn(mfi A, 30; B, 74); ▲, CD 16:7:ζ(48-65)Type62Phe(mfi A, 24; B, 88); ○, CD 16:7:ζ(48-65)Glu61Gln(mfi A, 20; B, 62) 및 △, CD 16:7:ζ(48-65)Tyr62Ser(mfi B, 64). 제10(d)도 및 제10(e)도는 세포용균 활성을 나타내며 제 10(f)도는 아미노 말단 티로신(Y51) 근처에 점돌연변이를 보유한 키메라에 의한 칼슘 이온 이동을 나타낸다. 칼슘 이동과 세포용균 분석에 대해 동일한 기호를 사용하고 있으며, 이는 우측에 제시되어 있다. ●. CD16:ζ(mfi D, 21.2; E, 672)를 형질발현하는 세포; ■:CD16:7ζ(48-65)( mfi D, 31.3; E. 179)를 형질발현하는 세포; ▲, CD16:7;ζ(48-65)Asn48Ser(mfi D, 22.4; E. 209); □, CD16:7:ζ(48-65)Leu50Ser(mfi D, 25.0; E, 142) 및 △, CD16:7:ζ(48-65)Tyr51Phe(mfi D, 32.3; E, 294).

제11도는 ζ의 내부 반복체의 배열 및 세포용균을 지원할 수 있는 이들의 능력을 비교한 것이다.

제11(a)도는 ζ세포내 도메인을 삼등분하고 이를 CD16:7 키메라의 경막 도메인에 부착시켜 형성된 키메라의 개요도이다. 세포내 도메인의 서열은 하단에 제시되어 있으며, 공통된 잔기는 박스되어 있고 연관된 잔기는^*표로 표시되어 있다.

제11(b)도는 3개의 ζ서브도메인의 세포용균 능력을 나타낸다. ●. CD16:ζ(mfi 476)을 형질발현하는 세포; ■. CD16:7:ζ(33-65)( mfi 68); □, CD16:7:ζ(71-104)(mfi 114) 및 ▲, CD16:7:ζ(104-138)(mfi 104).

제12도는 CD16:FcRγII키메라의 개요도이다.

제13도는 CD4:FcRγII와 CD16:FcRγII 키메라의 교차결합후 칼슘 이동에 대한 도면이다. 제13(a)도는 CD16 세포외 도메인과 항체의 교차결합후 시간의 함수로서 제시된 칼슘 감수성 형광단 인도-1이 로딩된 세포에 의해 방출된 바이올렛 색상 대 청색 형광 비율을 나타낸다. 제13(b)도는 항체와 교차결합이후 CD4:FcRγII 키메라를 보유한 세포의 바이올렛 색상 대 청색 형광비율 증가의 유사한 분석을 나타낸다.

제14도는 CD4:FcRγII 및 CD16:FcRγII 키메라의 세포용균 분석을 나타낸다. 제14(a)도는 CD16:FcRγII 키메라(작동 인자 세포)를 형질발현하는 세포독성 T 임파구의 수를 증가시키면서 세포를 노출시켰을때 항 CD16 하이브리도마(표적) 세포로부터 방출된⁵¹Cr의 백분율을 나타낸다. 제14(b)도는 HIV 피막 당단백질을 형질발현하는 표적 세포에 대하여 CD16:FcRγII 키메라에 의해 중개된 세포독성의 유사 분석을 나타낸다.

제15도는 세포용균에 중요한 FcRγII A 미부(tail)의 잔기의 규명에 대한 것이다. 제15(a)도는 결실 구조의 개요도이다. 제15(b)도 및 제15(c)도는 CD16:FcRγII A의 카르복실 말단 결실 변이체에 의한 세포용균 및 칼슘 이동을 나타낸다. 제15(d)도 및 제15(e)도는 CD16:FcRγII A의 세포내 미부의 아미노 말단부를 조금씩 덜 보유한 삼분체 키메라에 의한 세포용균 및 칼슘 이동을 나타낸다.

제16도(SEQ ID NO: 24)는 CD3 델타 수용액 단백질의 아미노산 서열을 나타내며; 박스안의 서열은 바람직한 세포용균성 시그날 형질도입부를 표시한다.

제17(SEQ ID NO: 25)는 T3 감마 수용체 단백질의 아미노산 서열을 나타내며; 박스안의 서열은 바람직한 세포용균성 시그날 형질도입부를 표시한다.

제18도(SEQ ID NO: 26)는 mb1 수용체 단백질의 아미노산 서열을 나타내며; 박스안의 서열은 바람직한 세포용균성 시그날 형질도입부를 표시한다.

제19도(SEQ ID NO: 27)는 B29 수용체 단백질의 아미노산 서열을 나타내며; 박스안의 서열은 바람직한 세포용균성 시그날 형질도입부를 표시한다.

[실시예 I]

[인체 IgG1 : 수용체 키메라의 작제]

인체 IgG1 중쇄 서열은 이 항체 mRNA의 경막 형태가 가진 3′말단 유래의 cDNA 단편에 C_H3 도메인내의 서열을 연결시키므로써 제조한다. 기질로서 편도조직의 cDNA 라이브러리 및 하기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 중합효소 연쇄 반응으로 3′말단 단편을 얻었다.

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO : 7) 및

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG

CCT CA

(SEQ ID NO : 8)(상기 서열은 각각 목적하는 DNA 단편의 5′및 3′말단에 상응하는 것이다). 5′올리고는 인체 IgG1의 C_H1 도메인내의 부위에 상보적이고 3′올리고는 막에 걸쳐있는 도메인을 암호하는 서열의 단지 5′부위에 상보적이다. PCR 생성물을 BstXI 및 BamHI으로 분해하여 가변 영역 및 불변 영역을 보유한 반합성된 IgG1 항체 유전자의 BstXI 및 BamHI 부위 사이에 결찰시켰다. BstXI 내지 BamHI 단편을 삽입한 다음, 제한 단편 상호교환에 의해 그 작제물의 증폭부를 C_H3 내의 SmaI 부위 이하와 교체시켜 SmaI 부위와 3′올리고 사이의 부분만이 PCR 반응으로부터 유도되도록 한다.

인체 IgG1 : ζ키메라 수용체를 제조하기 위해, BamHI 부위로 종지되는 중쇄 유전자를 하기 기술되는 ζ키메라의 BamHI 부위로 연결시켜 그 항체 서열이 세포외 부분을 형성하도록 한다. 상기 키메라를 암호하는 플라스미드로 형질감염된 COS 세포의 유동 세포계산 결과, 경쇄 cDNA를 암호하는 형질발현 플라스미드가 공동형질감염될 때에는 항체 결정부의 형질발현율이 높고, 경쇄 형질발현 플라스미드가 없을 때에는 항체 결정부의 형질발현율은 중간 정도임이 밝혀졌다.

η또는 γ에 융합된 인체 IgG1을 함유하는 유사 키메라(하기 참조), 또는 T 세포 수용체나 Fc 수용체 단백질의 임의의 시그날-형질도입 부분에 융합된 인체 IgG1을 함유하는 유사 키메라는 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 전술한 바와 같이 일반적으로 작제될 수 있다.

중쇄 및 경쇄가 단일 프로모터로부터 형질발현되도록 하는 단일의 전사 단위를 제조하기 위해, 2중시스트론 mRNA 암호 플라스미드를 중쇄 및 경쇄 암호 서열과 grp78 또는 BiP로서 공지된 78kD 글루코오스 조절 단백질을 암호하는 mRNA의 5′비해독부로부터 작제했다. grp78 서열은 각각 5′및 3′말단부에 하기 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 인체 게놈 DNA를 PCR 반응시켜 수득했다 :

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO : 9) 및

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 10)

이들 올리고를 사용한 중합효소 연쇄 반응은 10% 디메틸 설폭시드의 존재하에서 수행되었다. PCR에 의해 얻은 단편은 NotI 및 HincII로 분해하고 인체 IgG1 암호 서열로부터 하류의 NotI 및 HpaI 부위 사이에 삽입하였다. 그후, 인체 IgG 카파 경쇄 cDNA를 암호하는 서열을 벡터내에 HincII 부위와 다른 부위를 사용하여 grp78 선도부로부터 하류에 삽입하였다. 이러한 조작에 의해 작제된 형질발현 플라스미드는 반합성된 중쇄 유전자, 이후 grp78 선도서열, 이후 카파 경쇄 cDNA 서열, 이후 SV40 DNA 단편으로부터 유래된 폴리아데닐화 시그날로 구성된다. 형질발현 플라스미드로 COS 세포를 형질감염시키면 경쇄 결정부만을 암호하는 플라스미드의 형질 감염에 비해 중쇄 결정부의 형질발현이 현저히 향상되었다.

중쇄/수용체 키메라 및 경쇄를 포함하는 2중시스트론 유전자를 생성하기 위해 상류 중쇄 서열을 본 명세서에 기재된 임의의 키메라 중쇄/수용체 유전자로 대체할 수 있다.

[실시예 II]

[CD4 수용체 키메라의 작제]

인체 ζ(Weissman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 9709-9713(1988b)) 및 γ(Kuster 등, J. Biol. Chem., 265 : 6448-6452(1990)) cDNA는 HPB-ALL 종양 세포주(Aruffo 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 8573-8577(1987b)) 및 인체 천연 킬러 세포로부터 제조된 라이브러리를 폴리머라제 연쇄 반응을 실시하므로써 분리한 반면, ηcDNA(Jin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3319-3323(1990))는 쥐의 흉선세포 라이브러리로부터 분리했다. 이 ζ, η및 γcDNA를, 막에 걸쳐 있는 도메인(SEQ ID NOS : 1,3,4 및 6)에서 몇몇 잔기 상류인 유사 위치에 있는 ζ및 ηcDNA 내에 본래 존재하는 BamHI 부위에 연결된 막에 걸쳐 있는 도메인[Aruffo 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 8573-8577(1987b) ; Zettlmeissl 등, DNA Cell Biol., 9 : 347-353(1990)]의 인접 상류에 BamHI 부위만을 보유하는 CD4의 유전자 조작된 형태의 세포외 도메인에 연결시켰다. γ와의 융합 단백질을 형성시키기 위해, BamHI 부위를 대략적으로 동일 위치의 서열내로 삽입하였다(제1도 ; SEQ ID NO:2 및 5). 그 유전자 융합물을 선별용 표지체로서 이.콜리 gpt 유전자를 갖는 백시니아 바이러스 형질발현 플라스미드내로 도입시키고(M. Amiot 및 B.S., 미공개), 상동성 재조합에 의해 백시니아 WR 균주의 게놈내로 삽입시킨 뒤 미코페놀산내에서의 성장에 대하여 선별하였다[Falkner 등, J. Virol., 62:1849-1854(1988); Boyle 등, Gene, 65 : 123-128(1988)]. 유동 세포계산 분석은 백시니아 재조합체가 세포 표면에 CD4:ζ및 CD4:γ융합 단백질의 다량 생성을 유도하는 반면 CD4:η융합 단백질은 거의 형질발현되지 않음을 나타냈다(제1도). 이 후자의 발견은 쥐 하이브리도마 세포주로의 ηcDNA 형질발현 플라스미드의 형질감염이 비교가능한 ζ형질발현 플라스미드의 형질감염보다도 훨씬 적게 형질발현된다는 최근의 보고와 일치한다[Clayton 등, J. Exp. Med., 172 : 1243-1253(1990)]. 백시니아 재조합체로 감염된 세포의 면역침전 현상은 융합 단백질이 자연 발생적인 CD4 항원과는 달리 공유 결합된 이량체를 형성한다는 것을 나타냈다(제1도). CD4:ζ융합 단백질 단량체, CD4:γ융합 단백질 단량체 및 본래 CD4의 분자량은 각각 63, 55 및 53 kD 인 것으로 밝혀졌다. 보다 큰 질량의 융합 단백질은 세포내 부위 보다 큰 길이와 대략 일치하며, 본래 CD4의 세포내 길이보다 75(CD4:ζ) 또는 5(CD4:γ) 잔기가 더 크다.

[실시예 III]

[다른 수용체 사슬과 결합할 수 있는 CD4 키메라]

형질감염체상에서 대식세포/천연 킬러 세포 형태의 인체 FcγRIII(CD16_TM)의 세포 표면 형질발현은 쥐의 γ (Kurosaki 등, Nature, 342: 805-807(1989)) 또는 인체의 γ(Hibbs 등, Science, 246 : 1608-1611(1989)), 뿐만 아니라 인체의 ζ(Lanier 등, Nature, 342 : 803-805(1989))와 공동형질감염시 촉진된다.

이런 보고와 일치하는 것으로서, 키메라의 형질발현은 재조합 백시니아 바이러스로 공동형질감염되거나 공동감염되므로써 표적 세포로 전달될 때 CD16_TM이 표면 형질발현될 수 있도록 한다(제2도). 조사된 세포주내에서 ζ에 의한(CD16_TM) 표면 형질발현의 촉진은 γ에 의한 촉진보다 더욱 현저하였으며(제2도), 반면 본래 CD4는 CD16_TM표면 형질발현을 상승시키지 못했다(데이타는 제시되지 않음).

[실시예 IV]

[Fc 수용체와 공동결합하지 않는 Asp ζ돌연변이체]

존재하는 항원이나 Fc 수용체와 결합하지 않는 키메라를 제조하기 위해, 막내 Asp 잔기 또는 막내 Cys 잔기가 결손되거나 또는 둘 모두 결실된 돌연변이 ζ융합 단백질을 제조했다. 유동 세포계산 결과, 여러 돌연변이 키메라에 의한 세포 표면 형질발현의 강도는 비돌연변이된 전구체에 의한 강도와 크게 다르지 않음이 나타났고(데이타는 제시되지 않음), 면역침전 실험 결과 키메라에 의한 총 형질발현은 유사함이 나타났다(제3도). 예상된 바와 같이, 경막 시스테인 잔기가 결손된 돌연변이 키메라는 디설파이드 결합된 이량체를 형성하지 않는 것으로 밝혀졌다(제3도). Asp가 결손된 2개의 돌연변이 키메라는 CD16^TM의 표면 형질발현을 지지할 수 없었고, 반면 Cys은 결손되나 Asp는 갖고 있는 단량체 키메라는 CD16_TM이 공동형질발현되도록 하였으나, 그 효율은 선조(parental) 이량체보다 낮았다(제3도).

[실시예 V]

[칼슘 응답반응을 개시시킬 수 있는 능력을 갖고 있는 돌연변이 수용체]

융합 단백질의 교차결합이 T 세포 항원 수용체에서 일어나는 것으로 공지된 것과 유사한 방식으로 세포내 유리 칼슘의 축적을 허용하는 지의 여부를 결정하기 위해, 인체 T 세포 백혈병계 세포인 저르캇 E6(ATCC 수탁 번호 TIB 152, 미국 모식균 배양 수집소, Rockville, MD)을 백시니아 재조합체로 감염시키고, 항체와 세포외 도메인을 교차결합시킨 다음 세포질내 상대적인 칼슘 농도를 측정했다. 칼슘 민감성 염료 인도-1과 함께 세포를 로딩하여 유동 세포계산을 실시했다(Grynkiewicz 등, J. Biol. Chem., 260 : 3340-3450(1985) ; Rabinovitch 등, J. Immunol., 137 : 952-961(1986)). 제4도는 CD4:ζ및 ζ의 Asp^-및 Cys^-돌연변이체로 감염된 세포를 가지고 칼슘 유동 실험한 결과를 나타낸다. 키메라의 교차결합은 세포내 칼슘 농도를 재생가능하게 증가시켰다. CD4:η및 CD4:γ는 유사하게 감염 세포내에 세포내 칼슘을 축적시켰다(데이타는 제시되지 않음). 저르캇 세포는 세포 표면상에 낮은 레벨로 CD4를 형질발현하나, CD16:ζ의 존재 또는 부재하에서 본래 CD4의 교차결합(C.R. 및 B.S. 미공개)(제4도 및 데이타는 제시되지 않음)은 세포내 칼슘 농도를 변화시키지 못했다.

[실시예 VI]

[HIV gp120/41을 형질발현하는 표적 세포의 세포용균을 중개하는 CD4:ζ, η, 및 γ키메라]

키메라 수용체가 세포용균 작동 인자 프로그램을 유발시키는지의 여부를 결정하기 위해, HIV 피막 gp120/gp41 복합체의 CD4 인식을 근거로 한 표적:작동인자 시스템 모델을 제조했다. HeLa 세포를 gp120/gp41을 형질발현하는 재조합 백시니아 바이러스로 감염시키고(Chakrabarti 등, Nature, 320:535-537(1986) ; Earl 등, J. Virol., 64 : 2448-2451(1990)).⁵¹Cr로 표지시켰다. 표지된 세포를 CD4:ζ, CD4:η, 또는 CD4:γ키메라, 또는 CD4:ζCys11Gly:Asp15Gly 2중 돌연변이 키메라를 형질발현하는 백시니아 재조합체로 감염된 인체 동종특이적인 (CD8⁺, CD4^-) 세포독성 T 임파구계의 세포와 함께 배양했다. 제5도는 gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포가 CD4 키메라를 형질발현하는 세포독성의 T 임파구(CTL)에 의해 특이적으로 용균된다는 것을 나타낸다. 비감염된 HeLa 세포는 CD4:ζ키메라를 아암(arm)으로 갖춘 CTL의 표적이 되지 않으며, gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포는 비감염된 CTL에 의해 인식되지 않았다. 다양한 키메라의 효능을 비교하기 위해, 표적에 대한 작동 인자의 비율을 유동 세포계산에 의해 측정된 CD4 키메라를 형질발현하는 CTL의 비율 및 gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포의 비율에 대하여 보정했다. 제5(c)도는 제4(a)도 및 제4(b)도에 나타낸 바와 같은 세포용균 실험에 사용했던 CTL에 의한 CD4 형질발현의 세포계산 분석을 나타낸다. 표면 CD4:ζ의 평균 밀도가 CD4:η의 평균 밀도를 휠씬 초과할지라도, 그 형태중 임의의 하나를 형질발현하는 세포의 세포용균 효율은 유사했다. gp120을 형질발현하는 표적의 비율에 대하여 보정하므로써, CD4:ζ및 CD4:η단백질에 의해 중개된 세포용균 효율은 특이적인 T 세포 수용체 표적 : 작동 인자쌍에 대해 보고된 바 있는 최상의 효율에 필적하는 것이다[CD4:ζ를 형질발현하는 T 세포에 의해 50% 방출시키기 위한 표적에 대한 작동 인자의 평균 비율은 1.9±0.99 였다.(n=10)]. 경막 Asp 및 Cys 잔기가 결손된 CD4:ζ융합체에서와 같이 CD4:γ융합체는 활성적이지 못했다. 그러나 상기 두가지 경우 모두 상당한 세포용균이 관찰되었다(제5도).

백시니아 감염이 CTL에 의한 인위적인 인식을 촉진시킬 수 있다는 가능성을 제어하기 위해, 유사한 세포용균 실험을⁵¹Cr로 표지되고 CD16의 포스파티딜이 노시톨 결합 형태(CD16_PI)를 형질발현하는 백시니아 재조합체로 감염된 표적 세포, 및 CD16_PI또는 CD16:ζ를 형질발현하는 조절 재조합체로 감염된 CTL로 실시했다. 제6(a)도는 비CD4 키메라를 형질발현하는 T 세포가 본래의 HeLa 세포 또는 gp120/41을 형질발현하는 헬라 세포를 인식하지 못하며, 유사하게는 CD4 키메라를 형질발현하는 T 세포도 다른 백시니아-암호된 표면 단백질을 형질발현하는 HeLa 세포를 인식하지 못한다는 것을 나타낸다. 또한, 비키메라성 CD4를 형질발현하는 CTL은 gp120/41을 형질발현하는 HeLa 세포를 거의 용균시키지 못한다(제6(a)도).

[실시예 VII]

[키메라의 표적이 되지 않는 MHC 부류 II-함유 세포]

CD4는 MHC 부류 II 항원에 의해 형질발현되는 비다형태 서열과 상호작용하는 것으로 생각된다(Gay 등, Nature, 328:626-629(1987) ; Sleckman 등, Nature, 328:351-353(1987)). CD4와 부류 II 항원 사이의 특이적인 상호작용을 정제된 단백질을 사용하여 조사한 적은 없었으나, 임의의 조건하에서 CD4를 형질발현하는 세포와 부류 II 분자를 형질발현하는 세포 사이 부착성은 입증될 수 있다(Doyle 등, Nature, 330:256-259(1987) ; Clayton 등, J. Exp. Med., 172:1243-1253(1990) ; Lamarre 등, Science, 245:743-746(1989)). 다음 부류 II를 갖는 세포에 대하여 사멸이 검출되는 지를 조사했다. 제6(b)도는 다량의 부류 II 항원을 형질발현하는 Raji B 세포주에 대하여 CD4:ζ에 의해 유도된 임의의 특이적인 세포용균이 일어나지 않음을 나타낸다. 소량의 세포용균(5%)이 관찰되나, Raji 세포의 부류 II-음성 돌연변이체인 RJ2.2.5(Accolla, R.S., J. Exp. Med., 157:1053-1058(1983))는 Raji 세포가 비감염된 T 세포와 배양될 때와 유사한 감응성을 나타낸다.

[실시예 VIII]

[T 세포 항원 / Fc 수용체 제타 연쇄에 의한 세포용균을 유도하는데 필요한 서열]

CD4 및 ζ사이의 키메라가 세포독성의 T 임파구(CTL)에 아암(arm)을 형성하여 HIV gp120을 형질발현하는 표적 세포를 사멸시킬 수는 있지만, 인체 T 세포주내로 도입된 제타 키메라의 성질과 명백하게 비교하기 위해 CD4에 대한 대용물이 탐색되었다. 상기 T 세포주들은 CD4를 형질발현할 수 있으며, 이로 인해 칼슘 이동의 유형 또는 정도와 여러 키메라들의 세포독성력 사이의 관계를 구체적으로 한정하기가 어려워진다. 이를 해결하기 위해, CD16의 세포외 도메인이 ζ의 경막 서열 및 세포내 서열에 부착되어 있는 ζ와 CD16 사이의 키메라를 제조했다(제7(a)도). 그 유전자 융합체를 선별용 표지체로서 이, 콜리 gpt 유전자를 갖는 백시니아 바이러스 형질발현 플라스미드내로 도입시키고 상동성 재조합에 의해 백시니아 WR 균주 게놈내로 삽입시킨 뒤 미코페놀산내에서의 성장에 대하여 선별했다(Falkner 및 Moss, J. Virol. 62:1849(1988) : Boyle 및 Coupar, Gene 65 : 123(1988)).

T 세포주를 백시니아 재조합체로 감염시키고 항체와 세포외 도메인을 교차 결합시킨 다음, 상대적인 세포질내 유리 칼슘 이온 농도를 측정했다. 분광형광분석(다량 집단) 및 유동 세포계산(단세포) 분석을 염료 Indo-1와 함께 로딩된 세포를 가지고 실시했다(Grynkiewicz 등, J. Biol. Chem. 260:3440(1985) ; Rabinovitch 등, J. Immunol, 137:952(1986)). 제7(b)도는 CD16:ζ융합 단백질을 형질발현하는 백시니아 재조합체로 감염된 저르캇 인체 T 세포 백혈병계 세포로부터 수집된 데이타를 분석한 것이다. 키메라의 교차결합은 세포내 칼슘을 재현 가능하게 증가시킨 반면, 비키메라성 CD16을 형질발현하는 세포를 유사처리한 결과 어떤 효과도 나타내지 않았다. 항원 수용체가 결손된 돌연변이 세포주내에서 키메라를 형질발현시킬 때 REX33A(Breitmeyer 등, J. Immunol. 138:726(1987) ; Sancho 등, J. Biol. Chem. 264:20760(1989)). 또는 저르캇 돌연변이체 JRT3.T3.5(Weiss 등, J. Immunol. 135:123(1984)) 또는 CD16 항체 교차결합에 대한 강력한 응답반응이 나타났다. 유사한 데이타가 REX20A(Breitmeyer 등, 상기참조, 1987 ; Blumberg 등, J. Biol. Chem, 265:14036(1990)) 돌연변이 세포주상에서 수집되었고, 이 실험으로 저르캇 세포주의 CD3/Ti 음성 돌연변이체도 제조되었다(데이타는 제시되지 않음). CD16:ζ를 형질발현하는 재조합체를 사용한 감염은 항CD3 항체에 대한 응답반응을 복귀시키지 못했고, 이것은 세포내 CD3 복합체연쇄를 구제하므로써 융합 단백질을 작용시키지 못한다는 것을 나타낸다(데이타는 제시 안됨).

이 키메라가 세포 중개된 면역성을 유도할 수 있는지 평가하기 위해, CD16 키메라를 형질발현하는 백시니아 재조합체로 CTL을 감염시키고 이를 사용하여 막-결합된 항CD16 항체를 형질발현하는 하이브리도마 세포를 특이적으로 용균시켰다(하기 참조). 이 분석법은 Fc 수용체를 갖는 세포의 작동 인자 기작을 분석하기 위해 원래 개발되었던 하이브리도마 세포독성 검정법을 연장시킨 것이다(Graziano 및 Fanger. J. Immunol. 138 : 945, 1987 ; Graziano 및 Fanger, J. Immunol. 139 : 35-36, 1987 ; Shen 등, Mol. Immunol. 26 : 959, 1989 ; Fanger 등, Immunol. Today 10 : 92, 1989). 제8(b)도는 세포독성 T 임파구내에서의 CD16:ζ의 형질발현에 의해 아암을 지닌 CTL 이 3G8(항CD16 : Fleit 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 3275, 1982) 하이브리도마 세포를 사멸시키도록 하는 반면 포스파티딜이노시톨 결합된 형태의 CD16를 형질발현하는 CTL은 비활성적이라는 것을 나타낸다. CD16:ζ의 아암을 지닌 CTL은 또한 관련성이 없는 항체를 형질발현하는 하이브리도마 세포는 사멸시키지 않았다(데이타는 제시되지 않음).

세포용균에 필요한 최소의 ζ서열을 규명하기 위해, 일련의 결실 돌연변이체를 제조했는데, 이때 카르복실 말단으로부터 연속적으로 더 많은 ζ세포내 도메인이 제거되었다(제8(a)도). 제타의 세포내 도메인 대부분은 세포용균력에 대해 어떤 영향을 미침이 없이 제거될 수 있었고; 총 길이의 키메라 CD16:ζ로, 잔기 65로 결손된 키메라, 즉 CD16:ζAsp66^*(제8(b)도)와 효능이 거의 동일했다. ζ의 잔기 59로 결실된 경우(키메라 CD16:ζGlu60^*). 세포독성이 상당히 감소되었고, 잔기 50 으로 추가 결실된 경우에는 약간 더 적은 활성을 나타냈다. 그러나 세포내 도메인이 3 잔기의 경막 앵커(anchor)로 감소될 지라도 활성의 완전한 상실이 관찰되지 않았다(제8(b)도).

ζ는 디설파이드 결합된 이량체이므로, 내인성의 ζ가 키메라 ζ결손체와 헤테로이량체를 형성하여 활성을 재건시킬 수 있다면 세포용균 활성이 보유된다고 설명할 수 있다. 이런 추론을 시험하기 위해 ζ의 잔기 11과 15를 Asp 및 Cys로부터 각각 Gly(Cys11Gly/Asp15Gly)으로 변경시키고 면역침전법을 다음과 같이 실시했다. 약 2×10⁶CV1 세포를 무혈청 DME 배지내에서 10 이상의 감염 다중성(moi)을 갖는 백시니아 재조합체로 1 시간 동안 감염시켰다. 6 내지 8 시간 감염 후, 세포를 PBS/1mM EDTA로 평판으로부터 분리시키고 Clark 및 Einfeld(Leukocyte Typing II, pp.155-167, Springer = Verlag, NY, 1986)의 방법에 의해 락토페록시다제 및 H₂O₂를 사용하여 2×10⁶세포당 0.2 mCi¹²⁵I로 표면 표지시켰다. 표지된 세포를 원심분리하여 수집하여, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.15M NaCl, 0.05M Tris, pH8.0, 5mM MgCl₂, 5mM KCl, 0.2M 요오도아세트아미드 및 1mM PMSF 중에서 용균시켰다. 핵을 원심분리로 분리한 뒤, CD16 단백질을 항체 3G8(Fleit 등, 상기 참조, 1982 ; Medarex) 및 항마우스 IgG 아가로오스(Cappel, Durham, NC)로 면역침전시켰다. 샘플을 비환원 조건하에서 8% 폴리아크릴아미드/SDS 겔을 통해 전기영동시키거나 환원 조건하에서 10% 겔을 통해 전기영동시켰다. 이 면역침전법은 CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly 키메라가 디설파이드-결합된 이량체 구조로 결합되지 않는다는 것을 확인시켰다.

돌연변이 수용체의 세포용균 활성을 또한 시험했다. 잔기 65로 결실된 돌연변이된 키메라(CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66^*)는 분석 조건에 따라, 비교군인 비돌연변이된 키메라(CD16:ζAsp66^*) 보다 세포용균 분석시 2 내지 8 배 적은 활성으로, 이는 일반적으로 CD16:ζ와 비교하여 2배 이내이거나, 활성면에서는 구별되지 않는 수준이었다(제9(b)도). 돌연변이 키메라의 활성 감소는 유사 구조를 갖는 CD4 키메라에서 나타난 감소에 필적할 만한 것이었는데(상기 참조), 이중 이합체과 비교하여 ζ단량체의 낮은 효율에 기인하는 것 같다. 대조적으로, 잔기 59가 결손된 Asp^-, Cys^-돌연변이 키메라는 세포용균 활성을 전혀 나타내지 않았으며(제9b도), 경막 Cys 및/또는 Asp 잔기에 의해 중개된 다른 연쇄와의 결합이 잔기 65 이외의 보다 많은 아미노 말단부의 결실시에도 세포용균 활성을 약하게 지속시킨다는 가설을 지지한다.

유동 세포계산 연구는 경막 Asp 및 Cys 잔기가 결손된 결실 돌연변이가 TCR^-돌연변이 저르캇 세포주내에서 교차결합하는 항체에 대하여 세포내 유리 칼슘 이온의 증가를 촉진시킬 수 있다는 것을 나타냈다(제9(d)도). 저르캇 모세포주내에서 형질발현되는 키메라에 대해서도 유사한 결과를 얻었다(제시되지 않음). 이런 데이타는 CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60^*의 경우에도 칼슘 응답성을 매개하는 능력이 세포용균을 지지하는 능력으로부터 돌연변이적으로 분리될 수 있다는 것을 증명한다.

ζ의 경막 잔기들의 기여 가능성을 명백히 제거하기 위해, ζ의 경막 잔기 및 처음 17개의 세포질 잔기를 CD5 또는 CD7 항원중에 막에 걸쳐 있고 처음 14개 또는 처음 17개의 세포질 잔기를 암호하는 서열로 각각 대체시켰다(제9(a)도). 이로써 산출되는 삼분 융합 단백질 CD16:5:ζ(48-65) 및 CD16:7:ζ(48-65)는 보다 단순한 CD16:ζ키메라와 같이 디설파이드-결합된 이량체를 형성하지 않았는데, 이것은 ζ경막 도메인내에 시스테인 잔기가 결손되어 있기 때문이다. 상기 삼분체 키메라는 둘다 저르캇 및 TCR 음성 세포주내에서 칼슘을 이동시킬 수 있고(제9(d)도), CTL 내에서 세포용균 응답반응을 개시시킬 수 있었다(제9(c)도 및 데이타는 제시되지 않음). 그러나 키메라 CD16:7:ζ(48-59)중의 잔기 59까지 ζ부를 절두하면 TCR 양성 또는 음성 저르캇 세포내에서의 칼슘 응답성 또는 성숙한 CTL 내에서의 세포용균을 유도할 수 있는 삼분 융합체의 능력이 제거된다(제9(c)도 도 및 제9(d)도, 데이타는 제시되지 않음).

18- 잔기의 주요소(motif)내에 개개의 잔기들의 기여도를 조사하기 위해, 부위-지향성 돌연변이유발에 의해 다수의 돌연변이 변이체를 제조하고, 키메라 수용체의 낮은 형질발현 조건(제10(a)도 및 제10(d)도) 또는 높은 형질발현 조건(제10(b)도 및 제10(e)도)하에서 수용체-유도성 사멸을 중개하는 상기 변이체의 능력을 평가했다. 제10도는 잔기 59 내지 63에 걸친 많은 비교적 보존적인 치환(즉, 산성 잔기를 동종의 아미드로 대치하거나, 또는 티로신을 페닐알라닌으로 대치)시킨 것이 적절히 절충된 세포용균력을 산출시키면서, 일반적으로 그 변이체들을 칼슘을 이동시키는 능력을 보유하고 있다는 것을 나타낸다. 그러나 집합적으로 이들 잔기들은 중요한 부요소들도 포함하고 있으며, 따라서 이 잔기들의 결손은 세포용균 활성을 제거한다. Try62를 Phe 또는 Ser으로 전환시키면 세포독성 및 칼슘 응답반응이 모두 제거된다. 아미노 말단의 18 잔기 분절에 있는 Tyr51을 Phe으로 대치시키면 칼슘 이동성 및 세포용균 활성이 모두 제거되는 반면, 위치 50의 Leu을 Ser으로 치환시키면 칼슘 응답반응은 제거되나 세포용균 반응은 단지 부분적으로 손상된다. 이것은 특정 가설에 한정됨이 없이, 칼슘을 이동시키지 못하는 Leu50Ser 돌연변이의 무능력, 즉 유동 세포계산 분석은 세포용균 분석의 장시간 동안에 걸쳐 세포내 유리 칼슘 이온의 상당한 증가를 중개하는 능력을 충분히 반영하지 못하는 것으로 추정된다. 그러나, 칼슘-비감수성 세포용균 활성은 약간의 세포용균 T 세포주에 대하여 보고된 바 있고, 유사 현상이 본원에 기술된 결과를 근거로 한다는 가능성이 제외된 적은 없다. Asn48을 Ser으로 대치시킨 결과 일부 실험에서는 세포독성을 부분적으로 손상시킨 반면 다른 실험에서는 어떤 영향도 미치지 않았다.

과다한 서열 인자들의 강력한 역할을 연구하기 위해, ζ의 세포내 도메인을 3개의 분절, 즉 33 내지 65 잔기, 71 내지 104 잔기 및 104 내지 138 잔기로 나우었다. 이들 분절들 각가은 CD7의 세포내 도메인중 기본적인 막 고착 서열과는 단지 원거리에 도입된 MluI 부위에 의하여 CD16:CD7 키메라에 부착되어 있다(하기 참조; 제11(a)도). 상기 3가지 인자들의 세포용균 효능을 비교한 결과, 그 인자들은 거의 등위적임이 나타났다(제11(b)도). 서열 비교(제11(a)도)는 제2의 주요소가 티로신 사이에 11 잔기를 갖고 있는 반면, 제1 및 제3 주요소는 10개 잔기를 갖는다는 것을 나타냈다.

T 세포 활성화 단계가 정확히 설명되어 있지 않을 지라도, 항원 수용체의 응집, 또는 ζ세포내 서열을 갖는 수용체 키메라의 응집이 칼슘 이동성, 사이토킨과 과립 방출 및 활성화의 세포 표면 표지체의 출현을 유발함이 명백하다. ζ의 활성 부위인 짧은 선형 펩티드 서열은 본래의 효소 활성을 가지기에는 너무 작으며, 세포 활성화를 중개하기 위해 하나 또는 몇몇 단백질과 상호작용하는 것 같다. 또한 세포용균을 중개하는 능력이 칼슘 축적을 중개하는 능력으로부터 돌연변이적으로 분리될 수 있는 것과 같이 유리 칼슘의 이동성은 그 자체가 세포 활성화에 충분하지는 않다는 것이 명백하다.

본원에 나타낸 바와 같이, ζ의 세포내 도메인으로부터의 18 잔기를 관련성이 없는 2가지 단백질의 경막 및 세포내 도메인에 첨가하면 산출되는 키메라가 융합 단백질의 세포외 부위에 결합하는 표적 세포에 대하여 세포용균 활성을 유도하도록 한다. 18 잔기의 주요소를 갖는 키메라가 총길이의 ζ를 기본으로 한 키메라 보다 약 8배 적은 활성을 나타낼지라도, 그 감소된 활성은 정상적으로는 야생형 ζ가 디설파이드 결합된 이량체를 형성하도록 하는 경막 상호작용이 상실됨으로써 산출되는 것이다. 즉, 주요소와 동일한 카르복실 말단부를 가지며 경막 Cys 및 Asp 잔기가 결여된 ζ결실 작제물은 일반적으로 단지 18 잔기 주요소만을 갖는 키메라 보다 약간 적은 활성을 나타낸다.

본 발명자들이 촛점을 맞춘 세포용균적인 적응 인자는 2개의 티로신을 가지며 세린 또는 트레오닌은 함유하지 않고, 활성에 대한 가능한 인산화 반응을 제한한다. 상기 티로신중 어느 하나라도 돌연변이되면, 활성을 파괴시키나, 예비 실험이 18 잔기의 주요소를 갖는 키메라 표면 항원의 교차결합 반응 다음 실질적인 티로신 인산화 반응으로 지적하지는 않았을 지라도, 그런 소량의 인산화에 가능한 관련성을 배제시킬 수는 없다. 2개의 티로신 잔기에서 지적된 효과외에도, 주요소의 아미노 및 카르복실 말단에서의 다수의 아미노산 대체는 낮은 수용체 밀도의 조건하에서 활성을 약화시킨다.

ζ활성 주요소와 유사한 서열은 여러가지 다른 경막 단백질의 세포질 도메인 내에서 발견될 수 있으며, 그 예로는 CD3 δ및 γ분자, 표면 IgM 결합된 단백질 mb1 및 B29, 및 높은 친화도를 갖는 IgE 수용체인 FcεRI의 β및 γ연쇄를 포함한다(Reth, Nature 338 383, 1989). 이들 서열들의 기능이 불확실할지라도, 이 서열들이 효과적으로 형질발현된다면, 그 각각은 자율적으로 T 세포를 활성화시킬 수 있으며, 그런 활성은 제타-음성의 돌연변이 세포주내에서 나타나는 잔류 TCR 응답성을 설명할 수 있다(Sussman 등, Cell 52 : 85, 1988).

ζ그 자체는 3개의 그런 서열을 대략 동일한 간격으로 갖고 있으며, 세포내 도메인을 대략 3등분해도 그 각각은 세포용균성 응답반응을 개시시킬 수 있다는 것을 나타낸다. ζ의 접목 이소타입인 η(Jin 등, 상기 참조, 1990 ; Clayton 등, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 88 : 5202, 1991)는 3 번째 주요소의 카르복실 절반이 결실되어 있다. 제1 주요소의 카르복실 절반의 제거는 활성을 상실시키기 때문에, η의 생물학적 효과의 대부분은 처음 2개의 주요소에 기인할 수 있는 것으로 나타난다. 여러가지 척도에 의해 η는 항원-중개의 사이토킨 방출(Bauer 등, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 88 : 3842, 1991) 또는 유도된 세포용균(상기 참조)을 촉진시키는데 있어서 ζ만큼 활성적일지라도, η는 수용체 자극에 대한 반응으로 인산화되지 않는다(Bauer 등, 상기 참조, 1991). 따라서, 모든 3개의 주요소의 존재가 인산화에 필요로 되는 것이거나, 또는 3 번째 주요소가 미확인된 티로신 키나제에 대해 바람직한 기질임을 나타낸다.

[실시예 IX]

[인체 Fc 수용체에 의한 세포용균적인 시그날 형질도입]

여러가지 인체 Fc 수용체 아형의 작용을 평가하기 위해, 인체 CD4, CD5 또는 CD16 항원의 세포외 도메인이 FcRIIγA, B1, B2 및 C 아형(Nomenclature of Ravetch and Kinet. Ann, Rev, Immunol. 9 : 457, 1991)의 경막 및 세포내 도메인에 연결되어 있는 키메라 분자를 제조했다. 구체적으로, 전술한 FcRIIA, B1 및 B2 이소타입의 경막 및 세포질 도메인에 상응하는 cDNA 서열을 하기와 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 기존의 클론 PC23 또는 인체 편도조직 cDNA 라이브러리(표준 기술로 작제됨)로부터 증폭시켰다 :

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT(SEQ ID NO:18 ; FcRIIA 순방향)

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT(SEQ ID NO:19 ; FcRIIA 역방향)

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G(SEQ ID NO: 20; FcRIIB1 및 FcRIIB2 순방향) ; 및

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC(SEQ ID NO: 21; FcRIIB1 및 FcRIIB2 역방향).

상기 프라이머들은 5′말단으로부터 6 잔기가 각각 만입된 BamHI 및 NotI 효소에 대한 절단 부위를 함유한다. NotI 부위 바로 다음에는 CTA 또는 TTA와 같은 안티센스 종결 코돈이 온다. 모든 프라이머들은 목적하는 단편의 5′및 3′말단에 상보적인 18개 또는 그 이상의 잔기를 포함한다. IIA 이소타입과 단지 하나의 아미노산 잔기가 다른(잔기 268 위치의 P 대신 L) FcRIIγC 세포질 도메인에 상응하는 cDNA 단편은 하기 서열의 프라이머를 사용하여 PCR을 중첩시킨 다음 부위 지향성 돌연변이로 제조하였다 :

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO: 22) 및

TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A(SEQ ID NO: 23).

그 PCR 단편을 각각 CD16 또는 CD4 세포외 도메인을 함유하는 백시니아 바이러스 형질발현 벡터내로 삽입시키고 이어서 목적하는 재조합체의 규명을 용이하게 하기 위해 이. 콜리 gpt를 공동통합시켜 선별용으로 사용하면서, 티미딘 키나제 부위에 재조합시켜 와일드형 백시니아 바이러스내로 삽입시킨다. 모든 이소타입의 본질을 디데옥시 서열결정법으로 확인했다(제12도에 나타냄).

키메라 수용체 단백질의 생성을 면역침전 연구로 추가 확인했다. 약 10⁷JRT3.T3.5 세포를 무혈청 IMDM 배지내에서 1 시간 동안 10 이상의 감염 다중성을 갖는 백시니아 재조합체로 감염시켰다. 감염후 12 시간 째, 세포를 수거하고 락토페록시다제/글루코오스 옥시다제 법(Clark and Einfeld, 상기 참조)을 사용하여 10⁷세포당 0.5 mCi¹²⁵I로 표면 표지시켰다. 표지된 세포를 원심분리하여 수거하고 1% NP-40, 0.1 mM MgCl₂, 5mM KCl, 0.2M 요오드아세트아미드 및 1mM PMSF로 용균시켰다. 핵을 원심분리로 분리한 뒤, CD16 융합 단백질을 항체 4G8 및 항마우스 IgG 아가로오스로 면역 침전시켰다. 샘플을 환원 조건하에서 전기영동시켰다. 모든 면역침전된 키메라 수용체 분자는 예상된 분자량을 가졌다.

세포질내 유리 칼슘 이온의 증가를 중개하는 키메라 수용체의 능력을 시험하기 위해, 바이러스 재조합체를 사용하여 TCR^-돌연변이 저르캇 세포주 JRT3.T3.5(전술한 바와 같음)를 감염시키고 수용체의 세포외 도메인을 모노클로날 항체 3G8 또는 Leu-3A (전술한 바와 같음)와 교차결합시킨 다음 세포내의 세포질 유리 칼슘을 측정했다(전술한 바와 같음). 이 실험 결과 FcRγIIA 및 C의 세포내 도메인은 세포외 도메인의 교차결합 반응후 세포질내에 유리 칼슘 이온의 증가를 중개할 수 있으나, FcRγII B1 및 B2의 세포내 도메인은 비교가능한 조건하에서 비활성적임이 밝혀졌다(제13(a)도 및 제13(b)도). FcRγIIA의 CD4, CD5 및 CD16 하이브리드는 칼슘 응답반응을 촉진시키는데 거의 동등한 능력을 공유하고 있었다(제13도 및 데이타는 제시되지 않음). 단핵구 및 임파구 계통의 다른 세포주는 세포외 도메인의 교차결합 반응에 의해 개시된 시그날에 응답반응할 수 있었다(데이타는 제시되지 않음).

세포용균시에 여러가지 FcRγII 세포내 도메인의 관련성을 탐색하기 위해, 인체 세포독성 T 임파구(CTL)를 CD16:FcRγIIA, B1, B2 및 C 키메라를 형질발현하는 백시니아 재조합체로 감염시켰다. 그 다음, 감염된 세포를 CD16에 대한 세포 표면 항체를 형질발현하는⁵¹Cr-로딩된 하이브리도마 세포(즉, 3G8 10-2 세포)와 공동배양했다. 이 검정법에서 CD16 키메라를 갖는 CTL은 그 키메라의 CD16 세포외 도메인이 임파구 작동 인자 프로그램을 활성화시킬 수 있는 세포내 분절에 연결되어 있는 경우 하이브리도마 표적 세포를 사멸시켰다(유리⁵¹Cr의 방출) ; 이 세포용균 분석법은 하기에 상술한다. 제14(a)도는 FcRγIIB1 또는 B2가 아닌 CD16:FcRγIIA 및 C의 아암을 형성하고 있는 CTL 이 세포 표면 항CD16 항체를 형질발현하는 표적 세포를 용균시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

특이적인 세포용균이 어떤 면에서는 CD16부위와의 상호작용에 의한 것이라는 가능성을 배제시키기 위해, FcRII 세포내 도메인이 CD4 세포외 도메인에 결합되어 있는 세포용균 실험을 실시했다. 이 경우에, 표적 세포는 HIV 피막 gp120/41 단백질을 형질발현하는 HeLa 세포이다[구체적으로, 백시니아 벡터 vPE16로 감염된 HeLa 세포(메릴랜드주 베데스다에 소재하는 National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository로부터 입수)]. CD16 시스템에서 처럼, HIV 피막을 형질발현하는 표적 세포는 FcRγIIB1 또는 B2가 아닌 CD4:FcRγII A 키메라를 형질발현하는 T 세포를 용균시키기가 쉬웠다(제14(b)도).

FcRγII A 및 C의 세포내 도메인은 연장된 FcRγ/TCRζ계의 구성원을 비롯한 임의의 다른 단백질과 뚜렷한 서열 상동성을 공유하지 않는다. 세포용균을 유도하는데 필요한 서열 인자를 규정하기 위해, 갖는 세포내 도메인 암호 서열의 5′및 3′결실부(하기 기술되고 제15(a)도에 나타냄)를 제조하고 칼슘 이동성의 효능 및 세포용균 분석에 대해 평가했다(전술한 바와 같음). 실험에서 세포내 도메인의 아미노 말단부가 제거된 이 실험에서, FcRγII의 경막 도메인은 관련성이 없는 CD7 항원의 경막 도메인으로 대체되어 막에 걸쳐 있는 도메인에 의해 중개된 상호작용의 기여 가능성을 제거시켰다.

제15(b)도 및 제15(c)도는 티로신 298을 비롯한 14개의 카르복시-말단 잔기의 제거가 세포용균력을 완전 상실시키고 칼슘 이동력을 상당히 감소시킴을 나타낸다. 또한 티로신 282 바로 앞의 잔기를 결실시킴으로써 동일한 표현형을 수득했다(제15(b)도 및 제15(c)도). 세포내 도메인의 N-말단으로부터 잔기 268을 결실시키면 칼슘 프로파일이나 세포용균력에는 어떤 영향도 미치지 않는 반면 잔기 275의 결실은 유리 칼슘 방출은 크게 손상시켰으나 세표용균에는 영향을 거의 미치지 않는다(제15(d)도 및 제15(e)도). 잔기 282를 추가 결실시키면 칼슘을 이동시키거나 세포용균을 유발하는 능력이 결실된 FcRγII 미부가 산출된다(제15(d)도 및 제15(e)도). 이런 개략적인 측정에 의해 규정된 ‘활성 인자’는 비교적 크고(36 아미노산) 16 잔기에 의해 분리된 2개의 티로신을 포함한다.

[실시예 X]

본 발명에 의한 다른 세포내 및 경막 시그날 형질도입 도메인은 T 세포 수용체 단백질인 CD3 델타 및 T3 감마와 B 세포 수용체 단백질인 mb1 및 B29로 부터 유도될 수 있다. 이들 단백질의 아미노산 서열을 제16도(CD3 델타 ; SEQ IN NO:24), 제17도(T3 감마 ; SEQ ID NO:25), 제18도(mbl : SEQ ID NO:26) 및 제19도(B29 ; SEQ ID NO:27)에 나타낸다. 세포용균 시그날 형질도입에 충분한 서열부(및 바람직하게는 본 발명의 키메라 수용체내에 함유됨)는 괄호로 나타낸다. 이런 단백질 도메인을 함유하는 키메라 수용체를 작제하여 전술한 바와 같은 본 발명의 치료 방법에 사용한다.

[실시예 XI]

[실험방법]

[백시니아 감염 및 방사성면역침전법]

약 5×10⁶CV1 세포를 무혈청 DME 배지내에서 약 10 이상의 감염 다중성(CV1 세포상에서 측정된 역가)을 갖는 백시니아 재조합체로 1 시간 동안 감염시켰다. 그 세포를 감염시킨 후 새 배지에 넣고 메티오닌 및 시스테인이 없는 DMEM(Gibco ; Grand Island, NY)내에 200μCi/ml의³⁵S-메티오닌+시스테인(트란스³⁵S-표지체, ICN:Costo Mesa, CA)을 첨가하여 6 시간 동안 대사적으로 표지시켰다. 표지된 세포를 1mM EDTA를 함유하는 PBS로 분리시킨 뒤, 원심분리로 수거하여 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.15M NaCl, 0.05M Tris pH 8.0, 5mM EDTA, 및 1mM PMSF 내에서 용균시켰다. 핵을 원심분리로 분리하고 CD4 단백질을 OKT4 항체 및 항마우스 IgG 아가로오스(Cappel, Durham, NC)로 면역침전시켰다. 샘플을 비환원(NR) 및 환원(R) 조건하에서 8% 폴리아크릴아미드/SDS 겔을 통해 전기영동시켰다.³⁵S-표지된 샘플을 함유하는 겔을 En³Hance(New England Nuclear, Boston, MA)으로 함침시킨 뒤 오토래디오 그래피로 검측했다. CD16의 경막 형태인 CD16_TM의 촉진된 형질발현과 CD16_TM으로 단독 감염된 CV1 세포내에서의 형질발현을 CD16_TM및 ζ또는 γ키메라를 암호하는 바이러스로 동시감염된 세포내에서의 형질발현과 비교하여 측정하였다. 감염시키고 6 시간 이상 동안 배양한 후, 세포를 PBS, 1mM EDTA로 평판으로부터 분리시키고, CD16_TM또는 그 키메라들의 형질발현을 간접 면역형광법 및 유동 세포계산법으로 측정했다.

[칼슘 유동 분석]

저르캇 아세포주 E6(Weiss 등, J. Immunol., 133 : 123-128(1984)) 세포를 10 moi를 갖는 백시니아 바이러스 재조합체로 무혈청 IMDM 내에서 1 시간 동안 감염시키고, IMDM, 10% FBS 내에서 3 내지 9 시간 동안 배양했다. 세포를 원심분리로 수거하여 1mM Indo-1 아세토메톡시에스테르를 함유하는 완전 배지(Grynkiewicz 등, J. Biol. Chem., 260 : 3340-3450(1985))(Molecular Probes)내에 3×10⁶세포/ml로 재현탁시킨 뒤 37℃에서 45분 동안 배양했다. Indo-1 로딩된 세포를 펠릿화하고 무혈청 IMDM 내에 1×10⁶/ml으로 재현탁시킨 뒤 실온의 암실내에 보관한다. 세포를 유동 세포계산에 의해 바이올렛색과 청색의 형광성 방출량을 동시에 측정함으로써 유리 칼슘 이온을 분석했다(Rabinovitch 등, J. Immunol., 137 : 952-961(1986)). 칼슘 유동을 개시시키기 위해, 피코에리트린(PE)-결합된 Leu-3A(항CD4)(Becton Dicknson, Lincoln Park, NJ) 1㎍/ml를 세포 현탁액에 첨가한 다음 0 시간째에 비결합된 염소 항마우스 IgG 10㎍/ml를 첨가하거나 또는 비결합된 3G8(항CD16) 모노클로날 항체 1㎍/ml를 세포 현탁액에 첨가한 다음 0 시간째에 PE-결합된 Fab₂′염소 항마우스 IgG 10 ㎍/ml를 첨가한다. 바이올렛/청색 방출율의 막내그라프를 PE 양성(감염된) 세포 개체로부터 수집하였는데, 이는 일반적으로 모든 세포중의 40-80%를 나타냈다. 비감염된 세포내의 T 세포 항원 수용체 응답반응은 교차결합 없이도 항체 OKT3에 의해 유발되었다. CD16 키메라 수용체를 포함하는 실험에 있어서, 낮은 세포내 칼슘 농도(항체 무)쪽으로 기준선의 변동을 나타내는 샘플을 분석에서 제외시켰다. 막대그래프 데이타는 Write Hand Man(Cooper City, FL) 소프트웨어를 사용하여 이중 데이타를 ASCII로 전환시킨 다음, FORTRAN 프로그램 집합으로 분석하여 연속 분석했다. 제2 항체 시약을 첨가하기전 바이올렛색/청색 방출율을 사용하여 표준화된 초기 비율(동일하게 설정) 및 정지 상태의 한계치 비율(정지 상태의 개체 10%가 한계치를 초과하도록 설정된 값)을 측정한다.

[세포용균 분석]

인체 T 세포주 WH3, CD8⁺CD4^-HLA B44 제한된 세포용균성 세포주를 IMDM, IL-2 100 U/ml를 함유한 10% 인체 혈청내에서 유지시키고, 비특이적으로는 조사(3000 rad)된 HLA-비부합형 말초 혈액 임파구 및 파이토헤마글루티닌 1㎍/ml로 주기적으로 자극시키거나, 또는 특이적으로는 조사된 B44-함유 단핵 세포로 주기적으로 자극시킨다. 비특이적으로 자극시킨지 1 일 후, PHA를 새 배지에 첨가하여 0.5㎍/ml로 희석하고, 3 일 후 배지를 교환해 주었다. 세포를 세포 특성 분석에 사용하기 전에 자극시킨 다음 10 일 이상 동안 성장시켰다. 그 세포를 무혈청 배지내에서 10 이상의 감염 다중성을 갖는 백시니아 재조합체로 1 시간 동안 감염시킨 다음, 완전 배지내에서 3 시간 동안 배양했다. 세포를 원심분리로 수거한 뒤 1×10⁷세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 완전 배지 100㎍/웰을 함유하는 U-바닥형 마이크로타이터 평판의 각 웰에 상기 세포 100μl를 첨가한다. 세포를 2배 연속 단계로 희석했다. 각 샘플당 2개의 웰은 임파구를 함유하지 않아 자발적인 크롬 방출 및 총 크롬 흡수를 측정할 수 있게 하였다. HeLa 아세포주 S3 유래의 표적 세포를 6.0 또는 10.0 cm 평판내에 무혈청 배지중에서 약 10 moi가 되도록 1 시간 동안 감염시킨 다음, 3 시간 동안 완전 배지내에서 배양했다. 그 다음 이 세포를 PBS, 1mM EDTA로 접시로부터 분리시키고 계수했다. 10⁶표적 세포 분취액(CD4 키메라 수용체 실험에 대해서는 HeLa 세포, Raji 세포, 또는 RJ2.2.5 세포 및 CD16 키메라 수용체 실험에 대해서는 3G8 10-2 세포 ; Shen 등, Mol. Immunol. 26 : 959(1989))을 원심분리하고, 멸균⁵¹Cr-크롬산 나트륨(1mCi/mo, Dupont Wilmington, DE) 50μl 내에 간헐적으로 혼합하면서 37℃에서 1 시간 동안 재현탁시킨 다음, PBS로 3회 세정했다. 배지내에 10⁵세포/ml로 재현탁된 표지된 세포 100μl를 각 웰에 첨가했다. Raji 표적 세포 및 RJ2.2.5 표적 세포를 HeLa 세포와 동일한 방법으로 표지시켰다. 마이크로타이터 평판을 750 xg로 1분 동안 회전시키고 37℃에서 4 시간 동안 배양했다. 배양 기간의 마지막에 각 웰내의 세포를 부드러운 피펫팅으로 재현탁시키고 혼입된 총수를 결정하기 위해 샘플을 분리하며, 마이크로타이터 평판을 750 xg로 1분 동안 회전시켰다. 상층액 100μl 분취량을 분리하여 감마선 섬광 계수기로 계수했다. 사멸율 %는 유동 세포계산에 의해 측정된 감염된 표적 세포의 비율(보통 50-90%)에 대해 보정했다. 감염된 작동 인자 세포에 있어서, 작동 인자:표적의 비율은 감염된 세포율 %에 대해 보정했다(보통 CD4 키메라 수용체 실험에 대해서는 20-50% 이고 CD16 키메라 수용체 실험에 대해서는 ＞70% 임).

[ζ서열의 생체외 돌연변이유발]

ζ서열의 아미노산 잔기 11 및/또는 15의 점 돌연변이를 산출시키기 위해, ζ경막 도메인의 상류 BamHI 부위로부터 연장되고 본래 ζ의 잔기 11에 있는 Cys를 Gly으로(C11G) 또는 잔기 15에 있는 Asp를 Gly로(D15G) 또는 둘다로(C11G/D15G) 전환된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하고 PCR 반응에 사용하여 와일드형 CD4 : ζ작제물내로 재삽입되는 돌연변이된 단편을 생성했다.

ζ결실부를 산출시키기 위해, ζcDNA 서열을 잔기 50, 59, 또는 65 다음에 종결 코돈(UAG)를 산출하도록 고안된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 프라이머는 보통 CGC GGG CGG CCG CTA(SEQ IN NO:11) 형태의 서열내에 5′말단에서 5 또는 6 잔기를 만입시키는 효소 NotI의 절단 부위를 함유하며 상기 마지막 3 잔기는 종결 안티코돈에 상응한다. NotI 및 종결 안티코돈 서열 다음에는 그 단편의 목적하는 3′말단에 상보적인 18 또는 그 이상의 잔기가 온다. 이로써 산출되는 키메라를 각각 CD16:ζY51^*, CD16:ζE60^*및 CD16:ζD66^*로 표기한다. 경막 도메인 상류의 BamHI 부위 및 NotI 부위를 사용하여 와일드형 CD16:ζ작제물내로 재도입되는 단편을 산출하였다. 단량체 ζ키메라는 전술한 Asp^-및 Cys^-CD4:ζ작제물을 BamHI 및 ScaI 분해시켜 ζ경막 및 막에 인접하는 세포내 서열을 해리시키고 그 단편을 CD16:ζE60^*및 CD16:ζD66^*작제물내로 각각 삽입시킴으로써 제조했다.

[CD16:7:ζ(48-65) 및 CD16:7:ζ(48-59) 삼분체 키메라 작제]

작제물 CD16:ζD66^*을 제조하기 위해, 경막 도메인 및 세포질 도메인의 17 다음 잔기에 상응하는 ζcDNA 서열을 CD5 5 및 CD7 cDNA로부터 수득한 상응하는 경막 및 세포질 도메인으로 대체시켰다. CD5 및 CD7 단편은 BamHI 제한 효소 절단 부위를 포함하고 CD5 및 CD7 각각의 경막 도메인 상류 영역에 상응하는 순방향 올리고뉴클레오티드 및 CD5 및 CD7 서열과 각각 중첩하는 하기의 역방향 올리고뉴클레오티드 및 SacI 제한효소 절단 부위를 함유하는 ζ서열을 사용하여 PCR 반응으로 산출했다.

CD5:ζ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID NO: 12)

CD7:ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID NO: 13).

상기 CD5 및 CD7 PCR 생성물을 BamHI 및 SacI으로 절단한 뒤, BamHI 및 SacI 절단된 CD16:ζE60^*에 결찰시키고 BamHI에서부터 SacI까지의 ζ서열을 CD7 단편으로 대체했다. CD16:CD5 및 CD16:CD7 작제물을 제조하기 위해, NotI 제한효소 절단 부위를 함유하고 CD5 및 CD7 각각의 Gln416 및 Ala193 잔기 다음에 종결 코돈(UAA)을 암호하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 CD5 및 CD7 단편을 수득했다. CD5 및 CD7의 PCR 단편을 BamHI 및 NotI으로 분해하여 CD16:ζAsp66^*작제물내에 삽입시켰다.

[ζ세포용균성 시그날-형질도입 주요소내에 있는 N-말단 잔기의 생체외 돌연변이유발]

ζ의 주요소내에 있는 SacI 부위로부터 연장하며 본래의 잔기 48의 Asn이 Ser으로(N48S), 잔기 50의 Leu 이 Ser으로(L50S), 그리고 잔기 51의 Tyr이 Phe으로(Y51F) 전환된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고 PCR 반응에 사용하여 와일드형 CD16:7:ζ(48-65) 작제물내에 재도입된 단편을 생성시켰다.

[ζ의 세포용균성 시그날-형질도입 주요소내에 C-말단 잔기의 생체외 돌연변이유발]

NotI 3′부위로부터 종결 코돈까지 연장하며 본래의 잔기 60의 Glu가 Gln으로(E60Q), 잔기 61의 Glu가 Gln으로(E61Q), 잔기 62의 Tyr 이 Phe 또는 Ser으로(Y62F 또는 Y62S) 그리고 잔기 63의 Asp가 Asn(D63N)으로 전환된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고 이를 PCR에 사용하여 와일드형 CD16:ζD66^*작제물의 BamHI 부위부터 NotI 부위에 서브클로닝되는 단편을 생성했다.

[CD16:7:ζ(33-65), CD16:7:ζ(71-104), CD16:7:ζ(104-137) 키메라 작제]

경막 및 세포내 도메인 사이의 결합부에 MluI 및 NotI 부위를 갖는 CD7 경막 단편은 하기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 수득했다 : CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA(SEQ ID NO : 14). 이로써 산출되는 PCR 단편을 BamHI 및 NotI으로 분해하여 CD16:7:ζ(48-65) 작제물내로 재삽입시켰다. 잔기 33 내지 65, 71 내지 104, 및 104 내지 137을 암호하는 ζ단편은 순방향 프라이머의 5′말단에 MluI 부위를 함유하는 프라이머와 역방향 프라이머의 5′말단에 NotI 부위앞의 종결 코돈을 함유하는 프라이머를 쌍으로 사용하여 PCR 반응에 의해 수득했다. 각 경우에 제한 부위는 제한 효소의 절단을 확고히 하기 위해 프라이머의 5′말단으로부터 6개의 잔기를 만입시켰다.

ζ33 : CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA9SEQ ID NO: 15);

ζ71 : CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG(SEQ ID NO: 16); 및

ζ104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC(SEQ ID NO: 17).

[FcRγIIA 결실 돌연변이체의 작제]

카르복시 말단 FcRIIA 결실 돌연변이체는 282 및 298 위치의 티로신을 암호하는 서열을 종결 코돈(TAA)으로 전환시켜 총길이 작제물에서와 같은 방식으로 PCR에 의해 작제했다. N-말단 결실은 연속적으로 보다 적은 세포내 도메인을 암호하는 단편을 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 증폭시키고, 그 올리고뉴클레오티드는 상기 산출되는 단편이 CD7 경막 도메인에 융합된 CD16 세포외 도메인을 암호하는 사전 작제된 형질발현 플라스미드내의 MluI 및 NotI 제한 부위 사이로 삽입되도록 하며 후자는 경막 및 세포내 도메인 사이 결합부의 MluI 부위에서 종결된다.

[다른 구체예]

전술한 실시예는 ζ, η또는 γ키메라의 응집이 T 세포내에 세포용균성 작동인자 세포 응답반응을 개시시키기에 충분하다는 것을 증명한다. T 임파구, 천연 킬러 세포, 호염기구성 과립구, 대식세포 및 비만 세포를 포함하는 ζ, η및 γ의 공지된 범위의 형질발현은 보존 서열 주요소가 조혈계 기원의 세포에 일반적인 감각 장치와 상호작용할 수 있고 면역계내에 숙주 방어기작중의 주요 부분이 수용체 응집 반응에 의해 중개될 수 있다는 것을 제안한다.

세포용균성 응답반응의 효능 및 MHC 부류 II 수용체를 갖는 표적 세포에 대한 응답반응의 부재는 ζ, η또는 γ를 기본으로 하는 키메라가 입양 면역치료법을 통해 AIDS의 유전자 조정의 기본을 형성한다는 것을 증명한다. 내인성 ζ및 γ의 넓은 분포 및 γ와 결합된 Fc 수용체가 여러 세포 형태의 세포독성을 중개한다는 증거(Fanger 등, Immunol. Today, 10 : 92-99(1989))는 상기 목적을 위해 다양한 세포가 고려될 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 혈행중에서 매우 짧은 수명(??4h)을 가지며 강한 세포용균성을 나타내는 호중구성 과립구는 키메라의 형질발현을 위한 표적 세포로서 바람직하다. HIV에 의한 호중구의 감염은 쉽게 바이러스를 방출시킬 수 없으므로 이 세포들이 많으면 숙주 방어기작을 용이하게 한다(백혈구가 가장 우세함). 숙주 세포에 대한 또 다른 바람직한 가능성은 성숙한 T 세포, 즉 레트로바이러스 유전제작에 즉시 사용할 수 있는 개체이다(Rosenberg, S.A. Sci. Am., 262:62-69(1990)). 재조합체 IL-2의 원조로, T 세포 개체는 비교적 용이하게 배양물내에서 증대될 수 있고, 재주입되는 경우, 증대된 개체는 일반적으로 제한된 수명은 갖는다(Rosenberg 등, N. Engl. J. Med., 323 : 570-578(1990)).

적절한 조건하에서, CD4 키메라를 형질발현하는 세포에 의한 HIV 인식은 또한 분열촉진성 자극을 제공해야만 하며, 이로써 아암 형성된 세포집단은 바이러스에 대해 활동적으로 반응할 수 있어야 한다. 본 발명자들은 본원에서 세포용균성 T 임파구내에 융합 단백질의 양태에 대해 촛점을 맞추었지만, 헬퍼 임파구내에 키메라의 형질발현은 HIV 이동성 사이토킨원을 제공할 수 있으며, 이 사이토킨은 AIDS 내에 헬퍼 세포 서브세트의 붕괴에 반작용할 수 있다. 최근 바이러스 침투 이외의 다른 감염 단계에 내성을 부여하기 위한 여러가지 방법들의 기술(Friedman 등, Nature, 335:452-454(1988) ; Green 등, Cell, 58:215-223(1989); Malim 등, Cell, 58:205-214(1989) ; Trono 등, Cell, 59:113-120(1989) ; Buonocore 등, Nature, 345:625-628(1990))은 CD4 키메라를 갖는 세포가 세포내 작용 부위를 갖는 적절한 인자의 형질발현으로 바이러스 생성을 방해하도록 고안될 수 있다는 것을 제안하고 있다.

자율적 키메라를 통해 T 임파구에 대한 시그날을 전달하는 능력은 또한 생체내 레트로바이러스로 유전자 조작된 임파구의 조절 능력을 제공한다. 예를 들어, 보체-결합 도메인을 제거하도록 유전자 조작된 특이적인 IgM 항체에 의해 중개된 교차결합 자극은 동일계에서 그 임파구들의 수가 증가하도록 하는 반면, 유사한 특정 IgG 항체(예컨대 키메라 연쇄내로 유전자 조작된 아미노산 변동을 인식하는 것)로의 처리는 유전자 조작된 집단을 선택적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 항CD4 IgM 항체는 CD4:ζ키메라를 형질발현하는 저르캇 세포내에서 칼슘을 이동시키는데 부가적인 교차결합 반응을 필요로 하지 않는다(데이타는 제시되지 않음). 반복된 생체의 증폭에 의존함이 없이도 세포 집단을 조절할 수 있는 능력은 유전자 조작된 T 세포에 대해 제안된 현재 용도 범위와 효능을 상당히 확장시킬 수 있다.

ζ, η또는 γ세포내 서열로 이루어진 다른 키메라를 제조하기 위해, 수용체의 세포외 도메인을 암호하는 cDNA 또는 게놈 서열은 선택된 경막 도메인 바로 앞에 도입된 제한 부위를 가질 수 있다. 제한 부위로 종결되는 세포외 도메인 단편은 그 다음 ζ, η또는 γ서열에 결합할 수 있다. 통상의 세포외 도메인은 보체, 탄수화물, 바이러스 단백질, 박테리아, 원생 동물 또는 후생동물 기생충, 또는 이들로 부터 유도된 단백질을 인식하는 수용체로부터 유래될 수 있다. 유사하게는 병원균 또는 종양 세포에 의해 형질발현된 리간드 또는 수용체는 ζ, η또는 γ서열에 부착되어 그 리간드를 인식하는 수용체를 갖는 세포에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명은 그것의 구체예와 관련하여 기술되어 있지만, 추가 변형시킬 수 있고, 본 출원은 본 발명의 변형, 용도 또는 개작까지도 포함시키고자 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야에 포함되고 다음과 같은 특허 청구의 범위에 전술한 필수적인 특징에 적용될 수 있는 본 명세서의 이탈까지도 포함한다.

[서열 목록]

(1) 일반 정보:

(i) 출원인 : 더 제네럴 하스피틀 코오포레이션

(ii) 발명의 명칭 : 수용체 키메라에 의한 세포면역성 유도 방법

(iii) 서열 수 : 27

(iv) 교신처 주소 :

(A) 수신인 : 피쉬 앤드 리차드슨

(B) 거리명 : 프랜클린 스트리트 225

(C) 도시명 : 보스톤

(D) 주명 : 매사츄세츠

(E) 국가명 : 미합중국

(F) ZIP : 02110-2804

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 미디움 타입 : 3.5″디스켓, 1.44Mb

(B) 컴퓨터 : IBM PS/2 Model 50Z 또는 55SX

(C) 작동 시스템 : IBM P.C. DOS(버젼 3.30)

(D) 소프트웨어 : 워드퍼펙트(버젼 5.0)

(vi) 통용 출원 자료 :

(A) 출원 번호 :

(B) 출원 일자 :

(C) 분류 :

(vii) 선원 자료 :

(A) 출원 번호 : 07/665,961

(B) 출원 일자 : 1991년 3월 7일

(C) 분류 :

(viii) 대리인 정보 :

(A) 성함 : 클락, 폴 티.

(B) 등록 번호 : 30,162

(C) 참고/사건 번호 : 00786/119002

(ix) 통신 정보

(A) 전화번호 : (617) 542-5070

(B) 팩시밀리 번호 : (617) 542-8906

(C) 텔렉스 번호 : 200154

(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1728 염기쌍

(B) 유형 : 헥산

(C) 가닥 형태 : 2본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : DNA(게놈)

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:1:

(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 1389 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 2본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : DNA(게놈)

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:2:

(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1599 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 2본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : DNA(게놈)

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:3:

(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 575 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:4:

(2) SEQ ID NO : 5에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 462 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:5:

(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 532 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:6:

(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:7:

(2) SEQ ID NO : 8에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 50 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:8:

(2) SEQ ID NO : 9에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:9:

(2) SEQ ID NO : 10에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:10:

(2) SEQ ID NO : 11에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 15 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:11:

(2) SEQ ID NO : 12에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 42 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:12:

(2) SEQ ID NO : 13에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 48 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:13:

(2) SEQ ID NO : 14에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:14:

(2) SEQ ID NO : 15에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 36 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:15:

(2) SEQ ID NO : 16에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:16:

(2) SEQ ID NO : 17에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 33 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:17:

(2) SEQ ID NO : 18에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 26 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:18:

(2) SEQ ID NO : 19에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 42 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:19:

(2) SEQ ID NO : 20에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 30 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:20:

(2) SEQ ID NO : 21에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 32 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:21:

(2) SEQ ID NO : 22에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 31 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:22:

(2) SEQ ID NO : 23에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 31 염기

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 형태 : 1본쇄

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 핵산

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:23:

(2) SEQ ID NO : 24에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 171 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:24:

(2) SEQ ID NO : 25에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 182 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:25:

(2) SEQ ID NO : 26에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 220 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:26:

(2) SEQ ID NO : 27에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 228 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자형 : 단백질

(xi) 서열 세부사항 : SEQ ID NO:27:

Claims (20)

1. 감염원, 이 감염원으로부터 감염된 세포, 종양 또는 암 세포 또는 자가면역 산출 세포를 특이적으로 인식하고 파괴시킬 수 있는 유효량의 치료용 세포를 포함하여, 포유 동물에게 있어 상기 감염원, 이 감염원으로 감염된 세포, 종양 또는 암 세포나, 또는 자가면역 산출 세포에 대한 면역 작동 인자의 응답 반응을 유도하는 데 사용되는 약제로서, 상기 감염원은 바이러스, 박테리아, 원생 동물 또는 진균류이고, 상기 자가면역 산출 세포는 자가 반응성인 면역작동인자(effector) T 세포 또는 숙주 조직과 반응하는 항체 생산 세포이며, 상기 치료용 세포는 (A) 상기 감염원 또는 상기 세포를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 세포외 부분, 및 (B) T 세포 수용체, Fc 수용체 또는 B 세포 수용체, 또는 이들의 작용성 유도체에서 유래되고, 상기 수용체 결합된 감염원 또는 상기 수용체 결합된 세포를 파괴시키도록 이 치료용 세포에게 시그날을 줄 수 있는 세포내 부분 또는 경막 부분을 포함하는 막 결합된 단백질계 키메라 수용체를 형질발현하는 것이며, 상기 세포외 부분은 (a) 바이러스, 박테리아, 원생동물, 후생동물 또는 기생 생물의 리간도 또는 수용체, (b) 보체 단백질이나 탄수화물의 수용체, (c) 종양 세포의 리간드나 수용체, (d) CD4 또는 이것의 HIV 결합부, (e) CD16, (f) CD5 또는 (g) 면역글로불린이나 이것의 항원결합부에서 유래되는 것이고, 상기 키메라 수용체의 세포내 부분 또는 경막 부분은 ζ, η, γ, CD3 델타, T3 감마, mb1 또는 B29 폴리펩티드에서 유래되는 것임이 특징인 약제.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포 응답반응이 MHC 비의존성인 것을 특징으로 하는 약제.
3. 제1항에 있어서, 상기 키메라 수용체가 (a) SEQ ID NO:6의 아미노산 421-532 ; (b) SEQ ID NO:6의 아미노산 423-455, 438-455, 461-494 또는 494-528 ; (c) SEQ ID NO:6의 아미노산 400-420 ; (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 421-575 ; (e) SEQ ID NO:4의 아미노산 423-455, 438-455, 461-494 또는 494-528 ; (f) SEQ ID NO:4의 아미노산 400-420 ; (g) SEQ ID NO:5의 아미노산 421-462 ; (h) SEQ ID NO:4의 아미노산 402-419 ; (i) 제15a도의 아미노산 Tyr282-Tyr298 ; (j) 제16도(SEQ ID NO:24)의 아미노산 132-171 ; (k) 제17도(SEQ ID NO:25)의 아미노산 140-182 ; (l) 제16도(SEQ ID NO:26)의 아미노산 162-220 ; 또는 (m) 제16도(SEQ ID NO:27)의 아미노산 183-228을 포함하는 것임을 특징으로 하는 약제.
4. 제1항에 있어서, 상기 치료용 세포가 (a) T 임파구 ; (b) 세포독성 T 임파구 ; (c) 천연 킬러 세포 ; (d) 호중구 ; (e) 과립구 ; (f) 대식세포 ; (g) 비만 세포 ; (h) HeLa 세포 ; 및 (i) 배자(胚子)의 간세포(ES)로 구성된 그룹중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약제.
5. 제1항에 있어서, 상기 감염원이 면역결핍성 바이러스인 것을 특징으로 하는 약제.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포외 부분이 CD4의 HIV 피막 결합부 또는 그것의 작용성 HIV 피막결합 유도체를 포함하는 것임을 특징으로 하는 약제.
7. 제6항에 있어서, 상기 세포독성 T 임파구가 CD8⁺세포독성 T 임파구인 것을 특징을 하는 약제.
8. (a) 감염원, 이 감염원으로 감염된 세포, 종양 또는 암 세포 또는 자가면역 산출 세포를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 세포외 부분, 및 (b) 수용체 결합된 감염원 또는 수용체 결합된 세포를 파괴시키도록 세포에게 시그날을 줄 수 있는 T 세포 수용체, Fc 수용체 또는 B 세포 수용체로부터 유래된 세포내 부분 또는 경막 부분을 포함하는, 막 결합된 단백질계 키메라 수용체를 형질발현하는 세포.
9. 제8항에 있어서, 상기 결합이 MHC 비의존성인 것을 특징으로 하는 세포.
10. 제8항에 있어서, 상기 수용체 단백질이 ζ, η, γ, CD3 델타, T3 감마, mb1 또는 B29인 것을 특징으로 하는 세포.
11. 제10항에 있어서, 상기 키메라 수용체가 (a) SEQ ID NO:6의 아미노산 421-532 ; (b) SEQ ID NO:6의 아미노산 423-455, 438-455, 461-494 또는 494-528 ; (c) SEQ ID NO:6의 아미노산 400-420 ; (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 421-575 ; (e) SEQ ID NO:4의 아미노산 423-455, 438-455, 461-494 또는 494-528 ; (f) SEQ ID NO:4의 아미노산 400-420 ; (g) SEQ ID NO:5의 아미노산 421-462 ; (h) SEQ ID NO:4의 아미노산 402-419 ; (i) 제15(a)도의 아미노산 Tyr282-Tyr298 ; (j) 제16도(SEQ ID NO:24)의 아미노산 132-171 ; (k) 제17도(SEQ ID NO:25)의 아미노산 140-182 ; (l) 제18도(SEQ ID NO:26)의 아미노산 162-220 ; 또는 (m) 제19도(SEQ ID NO:27)의 아미노산 183-228을 포함하는 것임을 특징으로 하는 약제.
12. 제8항에 있어서, 상기 치료용 세포가 (a) T 임파구 ; (b) 세포독성 T 임파구 ; (c) 천연 킬러 세포 ; (d) 호중구 ; (e) 과립구 ; (f) 대식세포 ; (g) 비만 세포 ; (h) HeLa 세포 ; 및 (i) 배자의 간세포(ES)로 구성된 그룹중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약제.
13. 제8항에 있어서, 상기 세포외 부분이 CD4의 HIV 피막 결합부 또는 그것의 작용성 HIV 피막결합 유도체를 포함하는 것임을 특징으로 하는 세포.
14. 제13항에 있어서, 상기 세포독성 T 임파구가 CD8⁺세포독성 T 임파구인 것을 특징을 하는 세포.
15. 제8항에 있어서, 상기 세포외 부분이 면역글로불린 분자 또는 그것의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 세포.
16. (a) 감염원, 이 감염원으로 감염된 세포, 종양 또는 암 세포 또는 자가면역 산출 세포를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 세포외 부분 및 (b) 수용체 결합된 감염원 또는 수용체 결합된 세포를 파괴시키도록 세포에게 시그날을 줄 수 있는 T 세포 수용체, Fc 수용체 또는 B 세포 수용체로부터 유래된 세포내 부분 또는 경막 부분을 포함하는, 막결합된 단백질계 키메라 수용체.
17. 제16항에 있어서, 상기 결합이 MHC 비의존성인 것을 특징으로 하는 수용체.
18. 제16항에 있어서, 상기 수용체 단백질이 ζ, η, γ, CD3 델타, T3 감마, mb1 또는 B29인 것을 특징으로 하는 수용체.
19. 제16항에 있어서, 상기 키메라 수용체가 (a) SEQ ID NO:6의 아미노산 421-532 ; (b) SEQ ID NO:6의 아미노산 423-455, 438-455, 461-494 또는 494-528 ; (c) SEQ ID NO:6의 아미노산 400-420 ; (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 421-575 ; (e) SEQ ID NO:4의 아미노산 423-455, 438-455, 461-494 또는 494-528 ; (f) SEQ ID NO:4의 아미노산 400-420 ; (g) SEQ ID NO:5의 아미노산 421-462 ; (h) SEQ ID NO:4의 아미노산 402-419 ; (i) 제15(a)도의 아미노산 Tyr282-Tyr298 ; (j) 제16도(SEQ ID NO:24)의 아미노산 132-171 ; (k) 제17도(SEQ ID NO:25)의 아미노산 140-182 ; (l) 제18도(SEQ ID NO:26)의 아미노산 162-220 ; 또는 (m) 제19도(SEQ ID NO:27)의 아미노산 183-228을 포함하는 것임을 특징으로 하는 수용체.
20. 제13항에 기재된 세포를 포함하는, 면역결핍성 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제.