CN1142941C - 带cd4引诱物受体的细胞以及相关分子和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是在哺乳动物中治疗HIV的方法，包括给该哺乳动物施用有效量的表达膜结合的蛋白质嵌合受体的治疗细胞，所述受体含有一个细胞外部分，它包括能够特异性识别并结合HIV-感染的细胞但不会介导HIV感染的CD4片段。还公开了表达这些CD4受体的细胞以及编码所述受体的DNA和载体。

Description

带CD4引诱物受体的细胞 以及相关分子和方法
发明领域
本发明涉及一些CD4片段的受体，该受体结合HIV但不易使宿主细胞发生HIV感染。因此，本发明提供了新的有效的HIV治疗方法。
发明背景
T细胞通过T细胞受体识别抗原是许多免疫学现象的基础。T细胞引发所谓细胞介导的免疫。这种免疫牵涉到破坏外源组织细胞或受感染的细胞。T细胞有各种各样的，包括调节免疫反应的“辅助”和“抵制”细胞，以及细胞毒细胞(或“杀伤细胞”)，它们能直接杀死不正常细胞。
T细胞识别并结合了在另一种细胞表面上的特异性抗原时便成为激活的细胞；然后增殖，并且如果它是细胞毒细胞，它可以杀死结合的细胞。HIV和免疫发病机理
在1984年，已研究指出了HIV和AIDS的致病因素。从那时起至今AIDS的定义已改变了很多次，该定义关系到在诊断中所应包括的标准。但是，尽管诊断参数有所改变，而简单的常见的AIDS的共同特性是HIV感染，随后持续发展成全身的症状而成为以AIDS为定义的疾病，如二级感染，肿瘤和神经病。见哈里森的内科学原理(第12版，McGraw Hill(1991))。
HIV是慢病毒属中人的反转录病毒。四种已知的人反转录病毒属于两个不同的属：人的T嗜淋巴细胞的(或白血病)反转录病毒，HTLV-1和HTLV-2；以及人的免疫缺陷型病毒，HIV-1和HIV-2。前者是转化病毒，而后者是致细胞病变的病毒。
HIV-1已经被认定为是引起全世界AIDS的最常见病因。HIV-2和HIV-1之间的序列同源性为约40％，HIV-2与猴的免疫缺陷型病毒(SIV)属中的某些成员更相近。见Curran等人的 科学( Science)) 329：1357-1359(1985；Weiss等人， 自然( Nature)324：572-575(1986)。
HIV有常见的反转录病毒基因(env，gag，和pol)以及与该病毒的复制和其他生物活性有关的6个额外的基因。如前所述，AIDS的共同特性主要是细胞介导免疫的深度免疫抑制。所述免疫抑制导致各种机会病病，特别是某些感染和肿瘤。
AIDS免疫缺陷的主要原因是胸苷-衍生的(T)淋巴细胞亚组即T4种群在数量和质量上的缺陷。通过存在的CD4表面分子来从表型上定义该细胞亚组，现已证实CD4表面分子是HIV的细胞受体。见Dalgleish等人， 自然  312：763(1984)。尽管T4细胞是HIV感染的主要细胞类型，但基本上任何在其表面上表达CD4分子的人细胞均能够结合HIV并被HIV所感染。
传统上，认为CD4+T细胞有辅助/诱导剂的作用，表明其给B细胞提供活化信号或者使携带互换CD8标记的T淋巴细胞诱发成为细胞毒/抑制细胞。见Reinherz and Schlossman， 细胞  19：821-827(1980，Goldstein等人，免疫学综述( Immunol.Rev).68：5-42(1982)。
HIV以特异性和高度的亲和性通过病毒包膜(gp120)中的一段氨基酸与位于其N-末端附近CD4分子的一部分V1区结合。结合后，病毒与靶细胞膜融合，然后内化。内化后，它用反转录酶将其基因组RNA转录成DNA，然后整合到细胞DNA中，在细胞DNA中它作为“原病毒”存在于细胞生命中。
该原病毒是潜伏的，或被激活后转录mRNA和基因组RNA，从而进行蛋白质合成、组装、形成新的病毒颗粒、以及从细胞表面进行病毒的芽殖。尽管尚未确定病毒诱导细胞死亡的精确机制，但认为主要机制是病毒从细胞表面大量芽殖，导致质膜的破坏并造成渗透失衡。
在感染过程中，宿主生物体产生抗病毒蛋白的抗体，包括主要的包膜糖蛋白gp120和gp41。尽管这是体液免疫，但疾病逐渐发展，导致以多发性机会感染、寄生物血症、痴呆和死亡为特征的致命的免疫抑制。宿主抗病毒体不能阻止疾病的发展，这是最麻烦和紧急的感染，并预示采取常规接种方法不会有效。
在免疫缺陷型病毒的体液应答效力方面可能有两种因素起作用。第一，象其他RNA病毒一样(而且特别象反转录病毒一样)，在应答宿主免疫监测中，免疫缺陷型病毒有高突变率。第二，包膜糖蛋白本身是高度糖基化的分子，在其上几乎没有适用于高亲和性抗体结合的表位。病毒包膜上只有很少的抗原靶，使得宿主几乎没有机会通过特异性抗体的产生来限制病毒感染。
被HIV病毒感染的细胞在其表面上表达gp120糖蛋白。gp120通过与该病毒进入未感染细胞相似的反应来介导CD4+细胞之间的融合作用，从而形成短命的多核巨细胞。合胞体的形成依赖于gp120包膜糖蛋白与CD4蛋白质的相互直接作用。见Dalgleish等人，同上文；Klatzman等人， 自然  312：763(1984)；McDougal等人， 科学  231：382(1986)；Sodroski等人， 自然 322：470(1986)；Lifson等人， 自然  323：725(1986)；Sodroski， 自然  321：421(1986)。
有迹象表明，CD4-gp120的结合是引起带CD4抗原的细胞感染的主要原因，该迹象包括在gp120和CD4之间形成特异性的复合物(McDougal等人，同上文)。其他研究人员发现，在转染并表达人的CD4 cDNA基因后，可将无HIV感染性的细胞系转变成可感染的细胞系。见Maddon等人， 细胞 46：333-348(1986)。
现已经提出的治疗方案是以可溶性CD4为被动试剂去干扰病毒吸附和合胞体介导的细胞传递，并由许多小组成功地进行了体外试验(Deen et al.， 自 然  331：82-84(1988)；Fisher et al.， 自然  331：76-78(1988)；Hussey etal.， 自然  331：78-81(1988)；Smith et al.， 科学  238：1704-1707(1987)；Trauecher et al.， 自然  331：84-86(1988)；随后发展了具有长半衰期和适度生物学活性的CD4免疫球蛋白融合蛋白(Capon et al.， 自然  337：525-531(1989)；Trauecher et al.， 自然  339，68-70(1989)；Bym et al.， 自然  334：667-670(1990)；Zettlmeissl et al.， DNA细胞生物学(DNACell Biol.) 9：347-353(1990))。尽管CD4免疫毒性轭合物或融合蛋白在体外对感染的细胞有强细胞毒性(Chaudhary et al.， 自然  335：369-372(1988)；Till et al.， 科学 242：1166-1168(1988))，但是免疫缺陷型症状的潜伏状态使它不可能用任何单一治疗方法来有效消除病毒负担，而外源融合蛋白的抗原性可能限制其接受重复剂量的治疗。用患有SIV的猴子进行的试验表明，可溶性CD4如果用于没有明显CD4血细胞减少症的动物，可以降低SIV效价并改善骨髓电位的体外测量值(Watanabe et al.， 自然  337：267-270(1989))。但在停止治疗后观察到很快有病毒再出现，表明需要长期用药以抑制进行性免疫系统衰弱。T细胞和Fc受体
在细胞表面表达T细胞抗原受体(TCR)的最高丰度形式需要共表达至少6种不同的多肽链(Weiss et al.，实验医学杂志(J.Exp.Med.) 160：1284-1299(1984)；Orloffhanshi et al. 自然  316：606-609(1985)；Berkhout etal.， 生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 263：8528-8536(1988)；Sussman et al.，细胞52：85-95(1988))、α/β抗原结合链、CD3复合物的三种多肽、和ζ。如果不存在这些链中的任何一条，则不可能接着稳定表达所述复合物的其他成员。ζ是限制多肽表面表达整个复合物(Sussman et al.， 细胞 52：85-95(1988))，而且认为它介导了至少部分有配体的受体识别而引发的细胞活化作用(Weissman et al.， 欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)8：3651-3656(1989)；Frank et al.， 科学  249：174-177(1990))。32kDaI型整膜同二聚体，ζ有一个9个残基人细胞外区，该区没有用于加入N-连接的聚糖的位点，还有一个112个残基(小鼠)或113个残基(人)细胞内区(Weissman etal.， 科学  238：1018-1020(1988)；Weissman et al.， 美国国家科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 85：9709-9713(1988))。一种称为η的ζ同种型(Baniyash et al.，J.Biol Chem.生物化学期刊63：9874-9878(1988)；Orloffet al.，生物化学期刊.264：14812-14817(1989)，它是从其他mRNA剪接途径得到的(Jin et al.， 美国国家科学进展  87：3319-3323(1990))，在表达抗原受体的细胞中少量存在。认为ζ-η异二聚体介导了肌醇磷酸的形成以及受体-启动的细胞程序性死亡称为细胞凋亡(Mercep et al.， 科学  242：571-574(1988)；Mercep et al.， 科学  246：1162-1165(1989))。
象ζ和η一样，在含有其他多肽的细胞表面复合物中表达Fc受体-相关的γ链，它们中有些是介导配体的识别，其他的功能还不确定。γ带有一个同二聚结构，所有的识别作用很相似于ζ，并是这样一种组分即肥大细胞/嗜碱性细胞高亲和度IgE受体、FcεRI(它由至少三种不同多肽链组成)(Blandet al.， 自然  337：187-189(1989)；Ra et al.， 自然  241：752-754(1989)、和低亲和度IgG受体之一，在小鼠中用FcγRIIα来表示(Ra et al.， 生物化学杂 志 264：15323-15327(1989))，而在人中用有巨噬细胞和自然杀伤细胞表达的CD16亚型、CD16TM(CD16跨膜)(Lanier et al.， 自然342：803-805(1989)；Anderson et al. 美国国家科学进展  87：2274-2278(1990)和一未鉴定功能度多肽(Anderson et al.，美国国家科学进展87：2274-2278(1990))。最近报道由小鼠T细胞系、CTL表达γ，其中它形成同二聚体还形成γ-ζ和γ-n异二聚体(Orloff et al 自然  347：189-191(1990))
Fc受体介导免疫复合物的吞噬作用、跨细胞作用(transcytosis)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Ravetch and Kinet， 免疫学综述年鉴(Annu.Rev.Immunol.) 9：457-492(1991)；Unkeless et al.， 免疫学综述年鉴 6：251-281(1988)；和Mellman， 目前免疫学动态(Curr.Opin.Inmmunol.) 1：16-25(1988))。最近已经表明，鼠低亲和性Fc受体同种型之一FcRγIIIBl介导Ig-包被的靶的内化作用而形成披有网格蛋白的小窝，而另一低亲和性受体FcRγIIIA则通过其与“引发剂”小家族的一个或多个成员(Meittinen etal.， 细胞  58：317-327(1989)；和Hunziker and Mellman， 细胞生物学杂 志(J.Cell Biol.) 109：3291-3302(1989))相连而介导ADCC。这些引发剂分子、T细胞受体(TCR)ζ链、TCR η链，和Fc受体γ链，与不同免疫系统受体的配体识别区相互作用，可以在聚集后自发启动细胞效应程序，包括细胞溶解以及紧接的聚集(Samelson et al.， 细胞 43：223-321(1985)；Weissman et al.， 科学  239：1018-1020(1988)；Jin et al.， 美国国家科学进 展  87：3319-3323(1990)；Blank et al.， 自然  337：187-189(1989)；Lanier et al.， 自然  342：803-805(1989)；Kurosake and Ravetch， 自然 342：805-807(1989)；Hibbs et al.， 科学  246：1608-1611(1989)；Anderson et al.， 美国国家科学进展  87：2274-2278(1990)；and Irving和Weiss， 细胞  64：891-901(1991))。
然而，在进行鼠和人低亲和性Fc受体家族之间的比较时，显然人FcRIIA和C同种型没有鼠配对物。其部分原因是它们的功能尚未确定。
由于仅以CD4为基础的体液药物可能已限制了在体内的实用性，所以以前的工作研究了增加抗HIV的细胞免疫的可能性。已经鉴定了制备蛋白质嵌合体，其中将CD4的细胞外区与T细胞受体、IgG Fc受体或B细胞受体信号传导元件的跨膜和/或细胞内区融合(U.S.S.N.07/847,566和07/665,961，引入本文作为参考)。表达嵌合体的溶解细胞的T细胞对表达HIV包膜蛋白的细胞靶有有效的MHC-独立性破坏作用，所述嵌合体包含细胞外CD4区。该方法一个极为重要和新的组成部分是鉴定了单个T细胞受体、Fc受体、和B细胞受体链，它们的聚集足以引发细胞应答。该方法的一体特别有用的专利申请是CD4和ζ、η或γ之间嵌合体的发明，该嵌合体引导溶解细胞的T淋巴细胞去识别并杀伤表达HIVgp120的细胞(U.S.S.N.07/847,566和07/665,961，引入本文作为参考)。
发明简述
概括地说，本发明的技术特征是引导哺乳动物中抗HIV-感染的细胞的细胞免疫应答的方法。所述方法包括给哺乳动物施用有效量的治疗性细胞，所述治疗细胞表达膜结合的蛋白质类嵌合受体，含有(a)一个细胞外部分，该部分包括一个能够特异性识别并结合HIV-感染的细胞但不介导HIV感染的CD4片段和(b)一个细胞内部分，它能够给治疗细胞发出信号以破坏受体-结合的HIV-感染的细胞。
一方面，本发明的特征是表达蛋白质类膜结合的嵌合受体的细胞，所述嵌合受体含有(a)一个细胞外部分，该部分包括一个能够特异性识别并结合HIV-感染的细胞但不介导HIV感染的CD4片段和(b)一个细胞内部分，它能够给治疗性细胞发出信号以破坏受体-结合的HIV-感染的细胞。
在第二个方面，本发明的特征是治疗哺乳动物中HIV的方法，包括给哺乳动物施用有效量的治疗性细胞，所述治疗性细胞表达膜结合的蛋白质类嵌合受体，所述嵌合受体含有一个细胞外部分，该部分包括能够特异性识别并结合HIV-感染的细胞但不介导HIV感染的CD4片段。
本发明有关的特征一方面是表达膜结合的蛋白质嵌合受体的细胞，所述嵌合受体含有一个细胞外部分，该部分包括一个能够特异性识别并结合HIV-感染的细胞但不介导HIV感染的CD4片段。
在第一和第二方面的优选实施方案中，CD4片段是CD4的氨基酸1-394，或CD4的氨基酸1-200；该CD4片段通过在图26中所示的CD7跨膜区或图25中所示的人IgG1分子的铰链、CH2和CH3区，将它与细胞内部分分离；并且该CD4片段与治疗性细胞至少相隔48埃(优选至少72埃)。在第一方面的优选实施方案中，细胞内部分是T细胞受体蛋白质(例如ζ)、B细胞受体蛋白质或Fc受体蛋白质的信号传导部分；而治疗性细胞选自(a)T淋巴细胞；(b)细胞毒T淋巴细胞；(c)自然杀伤细胞；(d)嗜中性细胞；(e)粒细胞；(f)巨噬细胞；(g)肥大细胞；(h)HeLa细胞；和(i)胚胎干细胞(ES)。
在其他相关的方面，本发明的特征是编码本发明嵌合受体的DNA；和包含该嵌合受体DNA的载体。
尽管本发明的具体实施方案是CD4和ζ之间的嵌合体，但任何一种与在例如粒细胞或B淋巴细胞中的这些分子有相似功能的受体链均能用于本文公开的目的。所需要的免疫细胞引发分子的显著特征包括有自发表达的能力(即作为信号链)、与细胞外CD4区融合以使所得的嵌合体存在于治疗细胞表面的能力、和在发生聚集两次与靶配体相遇后启动细胞效应程序的能力。
目前，将嵌合体传递到免疫系统细胞的最方便的方法是通过某些基因治疗手段。但是，通过将细胞与适宜稳定化的纯化嵌合蛋白混合而重建含有嵌合受体的免疫系统细胞还会导致形成基因工程的细胞种群。该细胞种群能与HIV-感染的靶物进行反应。类似的方法现在已经采用，例如将CD4分子导入红细胞中以达到治疗目的。在这种情况下，该基因工程细胞种群不能自我更新。
本发明涉及CD4片段与T细胞受体、B细胞受体和Fc受体亚单位之间的功能性的和简化的嵌合体，所述亚单位是能够引导免疫细胞识别并溶解HIV-感染的细胞。引导哺乳动物中细胞应答的方法包括给所述哺乳动物施用有效量的治疗细胞(例如细胞毒T淋巴细胞)，所述细胞能够识别并破坏HIV感染的细胞。
本发明还包括能引导细胞毒T淋巴细胞去识别并溶解HIV-感染的细胞的嵌合受体蛋白质、用含有嵌合受体的载体转化的宿主细胞、以及抗嵌合受体的抗体。
从本发明的下列详细描述来看是显而易见的，对于本领域专业人员来说本发明的这些和其他非限制实施方案是清楚而显见的。
在下列的详细描述中，将参考分子生物学和免疫学领域专业人员熟知的各种方法学。对于有这些已知方法学的出版物和其他材料，均将它们作为整体全部引用和列入本发明参考文献中。
列出重组DNA技术一般原理的标准参考著作包括Watson等人， 基因的 分子生物学，I和II卷，Benjamin/Cumings PublishingCompany Inc.，Publisher，MenloPark，CA(1987)；Darnell等人， 分子细胞生物学，Scientific American Books，Inc.，Publisher，New York，N.Y(1986)；Lewin， 基因II，John Wiley & Son，Publishers，New York，N.Y(1985)；Old等人， 基因操作原理：基因工程介绍，第2版，University of California Press，publisher，Berkeley，CA(1981)；Maniatis等人， 分子克隆： 实验室手册，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，publisher，Cold Spring Harbor NY(1989)；和Ausubel等人的 分子 生物学的最新方法，Wiley Press，New York，NY(1989)。
定义
“克隆”指用体外重组技术将特定的基因或其他DNA序列插入到载体分子中。
“cDNA”指通过DNA-依赖的DNA聚合酶(反转录酶)的作用，按照RNA模板生产的互补或复制的DNA。因此“cDNA克隆”指在克隆载体中携带的，与所需RNA分子互补的双螺旋DNA序列。
“cDNA文库”指含cDNA插入片段的重组DNA分子的收集，所述插入片段含有在制备cDNA文库时由细胞表达的mRNA的DNA拷贝。用本领域专业人员熟知的方法，如由Ausubel等人(同上文)和Maniatis等人(同上文)描述的那些方法制备所述cDNA文库。总之，首先从生物体的细胞中分离RAN，需要从所述生物体的基因组中克隆特定的基因。本发明所述目的优选的是哺乳动物(特别是人)的淋巴细胞系，目前用于该目的优选的载体是牛痘病毒WR菌株。
“载体”指从质粒、噬菌体、或哺乳动物或昆虫病毒衍生的DNA分子，可以将所述DNA片段插入或克隆到其中。载体中含有一个或多个特异的限制性位点，而且能够在确定的宿主或载体生物体中自主复制，以便再生产克隆的序列。因此“DNA表达载体”指能够指导重组肽合成的任何自主元件。所述DNA表达载体包括细菌质粒、噬菌体、哺乳动物和昆虫质粒和病毒。
“基本上纯的”是指一种化合物(如蛋白质、多肽或抗体)，它基本上没有与其天然相伴的组分。通常，当样品中总物质的至少60％，优选至少75％，最优选至少为90％是所需的化合物时，该化合物就是基本上纯的。可以用任何适宜的方法，如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析等方法测量纯度。从核酸的意义上说，“基本上纯的”是指不立即与两个编码序列相连(即共价相连)的一种核酸序列、区段或片段，该编码序列在衍生本发明DNA的生物体里天然存在的基因组中是立即与其邻接的(即一个接在5′末端，一个接在3′末端)。
分子“片段”如本发明的任何cDNA序列是指所述分子任何相邻的核苷酸亚组。分子的“类似物”是指与完整分子或其某一片段基本上相似的非天然分子。如果两个分子的氨基酸序列基本上相同，则认为一个分子与另一个分子“基本上相似”。具体地说，“基本上相似”的氨基酸序列是指与天然或参考序列至少有50％，优选85％，最优选为95％的氨基酸序列相同性的序列和/或只有保守氨基酸的取代不同于天然或参考氨基酸序列的序列。基本上相似的氨基酸分子会具有某一相似的生物学活性。如本文所用的，当一分子含有不是所述分子的正常的化学部分时，此分子被认为是该分子的“化学衍生物”。所述部分可以提高所述分子的溶解性、吸附能力、生物半衰期等。另外，所述部分还可以降低所述分子的毒性，消除或减弱所述分子任何不需要的副作用等。如在 Remington′s  药物学科学(Remington′s PharmaceuticalScience)，16th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA.(1980)中已公开了能够介导所述作用的部分。
本发明受体嵌合体基因的“功能衍生物”包括所述基因的“片段”或“类似物”，它们在核苷酸序列上是“基本上相似的”。“基本上相似”的核酸编码基本上相似的氨基酸序列(如上所定义的)，而且还可包括在适宜杂交条件下，能够与天然或参考核酸序列杂交的任何核酸序列(参见例如Ausubel etal.， 分子生物学现代的方法(Current Protocols in Molecular Biology)，WileyPress，New York，NY(1989)有关适宜的杂交严谨条件)。
“基本上相似”的嵌合受体具有与“野生型”T细胞、B细胞或Fc受体嵌合体相似的活性。所述衍生物有最优选90％，更优选70％，优选40％的野生型受体嵌合体的活性。功能性的嵌合受体衍生物的活性包括与HIV-感染的细胞特异性结合(用其细胞外CD4部分)，从而导致那个细胞的死亡；另外，嵌合受体并不能使带受体的细胞对HIV易受感染。可以用例如本文描述的任何适宜的方法检测嵌合受体的活性。
按常规技术，可以将编码本发明CD4受体嵌合体，或其功能衍生物的DNA序列与载体DNA重组，包括：制成用于连接的平整末端或参差末端、限制酶消化以提供适宜的末端、按需补平粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接、以及用适宜的连接酶连接。由Maniatis等人(同上文)公开了用于所述操作的技术，这些技术在本领域是已知的。
如果核酸分子(如DNA)含有包含转录和翻译调节信息的核苷酸序列，而且所述序列与编码多肽的核苷酸序列可操作性地连接，则认为核酸分子“能够表达”多肽。可操作键是使DNA调节序列和要表达的DNA序列以一种能够表达基因的方式相连的键。基因表达所需的调节区的精确性质随生物体的不同而不同，但总的来讲，应包括启动子区，在原核生物中该区含有启动子(指导RNA转录的启动)和DNA序列，该序列转录成RNA后，发出启动蛋白质合成信号。所述区通常包括与转录和翻译启动有关的那些5′非编码序列，如TATA盒，帽序列，CAAT序列等。
如果需要，用上述方法还可以得到编码蛋白质之基因序列的3′非编码区。通常保持该区的转录终止调节序列，如终止和多聚腺苷酸化。因此通过保留与编码蛋白质DNA序列天然相连的3′区，可以提供转录终止信号。若转录终止信号在表达宿主细胞中不能有令人满意的功能，那么宿主细胞中的3′功能区可被取代。
如果两个DNA序列之间键的性质不(1)导致诱导移码突变，(2)干扰启动子区序列指导受体嵌合体基因序列转录的能力，或(3)干扰由启动子区序列转录受体嵌合体基因序列的能力，则认为这两个DNA序列(如启动子区序列和CD4-受体嵌合体编码序列)是可操作相连的。如果启动子能够影响DNA序列的转录，则可将启动子区与DNA序列可操作相连。因此要表达蛋白质，需要有由适宜宿主识别的转录和翻译信号。
本发明包括在原核或真核细胞中表达CD4-受体嵌合体蛋白质(或其功能衍生物)，尽管真核(而且特别是人淋巴细胞)表达是优选的。
可以用各种方法制备本发明的抗体。例如，可以将表达CD4-受体嵌合体蛋白质或其功能衍生物的细胞施用给动物以便诱导产生含能够结合所述嵌合体之多克隆抗体的血清。
在优选的方法中，本发明的抗体是单克隆抗体，可以用杂交瘤技术(Kohler et al.， 自然  256：495(1975)；Kohler et al.， 欧洲免疫学杂志(Eur.J.immunol.) 6：511(1976)；Kohler et al.， 欧洲免疫学杂志  6：292(1976)；Hammerling et al.， 单克隆抗体和T细胞杂交瘤(MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas)，Elsevier，N.Y.，pp.563-684(1981))制备所述单克隆抗体。总而言之，所述方法包括用CD4-受体嵌合体抗原免疫动物。提取所述动物的脾细胞，然后与适宜的骨髓瘤细胞系融合。在本发明中可以使用任何适宜的骨髓瘤细胞系。融合后，将所得的杂交瘤细胞选择性地保持在HAT培养基中，然后用Wands等人所述方法( Gastroenterology  80：225-232(1981)限制稀释克隆。然后对通过所述选择而得到的杂交瘤细胞进行检测，以鉴定能够分泌结合所述嵌合体之抗体的克隆。
本发明的抗体还可以是多克隆的，或优选的特异性的多克隆抗体区。
可以用抗本发明CD4-受体嵌合体的抗体监测患者体内的嵌合受体(或带嵌合受体的细胞)。所述抗体很适用于本领域已知的标准免疫诊断检测中，包括所述免疫测量或“夹心”检测如前向夹心、后向夹心和同时夹心的检测。本领域专业人员可以不需进行过分试验就能使用抗体确定任何数量的组合以测定免疫检测的可接受的特异性、敏感性和精确性。
列出了免疫学原理的标准参考著作包括：Roitt， 基础免疫学(EssentialInmunology)，6th ed.，Blackwell scientific Publications，publisher，Oxford1988)；Kimball， 免疫学导论(Introduction to Immunology)，2nd ed.，Macmillan Publishing Co.，publisher，New York(1986)；Roitt et al.， 免疫学(Immunology)，Gower Medical Publishing；Ltd.publisher，London，(1985)；Campbell“单克隆抗体技术”(“Monoclonal Antibody Technology”，)in Burdonet al.，eds.， 生物化学和分子生物学的实验室技术(Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)，13卷Elsevier，Publisher，Amsterdam(1984)；Kldin， 免疫学： 自体-非自体识别的科学(Immunology：the science of self-Nonself Discrimination)，Johm Wiley & Sons，publisher，New York(1982)；以及kennett et al.，eds.， 单克隆抗体， 杂交瘤：生物学分析中的新标准(Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New DimensionIn Biological Analyses)，Plenum Press，publisher，New York(1980)。
“检测”包括确定一种物质是否存在或确定一种物质的量。因此该术语指运用本发明的物质、组合物和方法来进行定性和定量的确定。
本发明的抗体和基本上纯化的抗原对于制备试剂盒是很理想的。所述试剂盒可含有被分成密封小室的载体装置，在这种封闭的小格中含有一个或多个容器如小瓶，试管等，每个所述容器含有用于检测的不同元素。
可被组合成试剂盒形式的检测类型有很多，例如包括竞争性和非竞争性检测。可以利用本发明抗体的典型实例是放射性免疫检测(RIA)、酶免疫检测(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、和免疫测量(immunometric)或夹心的免疫检测。
术语“免疫测量检测”或“夹心免疫检测”指包括同时夹心，前向夹心，反向夹心免疫检测。这些术语是本领域专业人员熟知的。本领域专业人员还理解本发明的抗体还可用于目前已知或未来可发展的检测其他变更形式中。这些也应包括在本发明的范围内。
“特异性识别和结合”是指抗体识别并结合嵌合受体多肽，但基本上并不识别和结合生物学样品中的其他不相关的分子。
“治疗细胞”是指用已经用本发明的CD4-受体嵌合体转化的一种细胞，因而它能够识别并破坏HIV-感染的细胞；优选的所述治疗细胞是造血系统的细胞。
“细胞外”是指所述分子至少有一部分暴露在细胞表面。“细胞内”是指所述分子至少有一部分暴露在治疗细胞的胞质内。“跨膜”是指所述分子至少有一部分跨原生质膜。本文所用的“细胞外部分”，“细胞内部分”以及“跨膜部分”可包括延伸到细胞连接区内的侧氨基酸序列。
“寡聚”指与其他蛋白质形成二聚体、三聚体、四聚体或其他更高级的聚集复合物。所述寡聚物可以是同寡聚物或异寡聚物。“寡聚部分”是指引导复合物(即寡聚物)形成的分子区。
“溶解细胞的”指能够破坏细胞(如HIV-感染的细胞)或能够破坏感染性因素(如HIV病毒)。
“免疫缺陷型病毒”是指某种反转录病毒，该病毒在野生型形式中，能够感染灵长类宿主的T4细胞并具有病毒形态发生以及慢性病毒亚类的形态学特征。所述术语包括但不限于HIV和SIV的所有变异体，包括HIV-1，HIV-2，SIVmac，SIVagm，SIVmnd，SIVsmm，SIVman，SIVmand和SIVcpz。
“MHC独立性的”(非依赖性的组织相容性抗原)是指细胞的细胞溶解反应不需要MHC II性抗原存在于靶细胞的表面上。
“功能细胞溶解信号传导衍生物”是指某种功能衍生物(如上所定义的)，它能带有至少40％，优选为70％或最优选为至少90％的野生型分子的生物学活性。如本文所用的，“功能细胞溶解信号传导衍生物”可以通过直接给治疗细胞发出信号以破坏受体-结合的因子或细胞(如细胞内嵌合受体部分)可发挥作用或通过间接促进与治疗细胞的细胞溶解信号传导蛋白质(如跨膜区)的寡聚也可发挥作用。可以用中本文描述的体外检测方法检测所述衍生物的效力。
“功能HIV包膜-结合的衍生物”是指能够结合任何HIV包膜蛋白质的功能衍生物(如上所定义的)。可以用例如本文描述的体外检测方法鉴定功能衍生物。
治疗性给药
本发明的转化细胞可用于免疫缺陷病毒的治疗。目前施用所述转化细胞的方法包括获得性免疫疗法或细胞转移治疗。这些方法可以使转化后的免疫系统细胞返回到血液中。见Rosinberg， 科学美国人(Sci.Am)， 62(May 1990)；Rosinberg等人， 英国新医学杂志(N.Engl.J.Med.) 323：570(1990)。
可以将本发明的药物组合物施用给任何可以体验本发明化合物有益作用的动物。所述动物中，最主要的是人，尽管本发明不限于此。
发明详细描述
首先描述附图。
附图的简要描述
图1A是CD4(残基1-369)和不同受体链(SEQINNOS：38-41)之间融合位点的氨基酸序列。划线的序列表示BamHI位点内用于融合构建编码的氨基酸序列。用垂直棒表示跨膜区的开始。在氨基末端η序列与ζ序列相同，但在羧基末端不同(Jin et al.， 美国国家科学进展  87：3319-3323(1990))。图1B表示在CV1细胞中，表面表达的CD4，CD4：ζ，CD4：γ和CD4：η的流式细胞计数分析。用表达CD4嵌合体或CD16PI的病毒感染细胞，在37℃孵育9小时，然后用藻红蛋白-轭合的抗-CD4MAb Leu2A染色。
图2表示在CD16TM(密点)单独或与表达CD4：γ(虚线)或CD4：ζ(实线)的病毒共感染后，CD16TM的表面表达。稀点，仅用CD4：ζ感染，用3G8染色(Fleit et al.， 美国国家科学进展  79：3275-3279(1982))的细胞(抗-CD16MAb)。
图3表示用表达CD16TM和以下的ζ嵌合体：CD4：ζ(粗线)，CD4：ζC11G(实线)；CD4：ζ(虚线)；CD4：ζC11G/D15G(密点)；非共感染(仅CD16TM，稀点)的病毒共感染后，CD16TM的表面表达。将细胞与抗CD16Mab3G8及藻红蛋白-轭合的抗小鼠IgG的Fab′山羊体一起孵育。所分析的不同突变体的ζ嵌合体的表达水平基本相同，而且用表达CD16TM和ζ嵌合体的病毒共感染的细胞，其嵌合体的表面表达没有明显变化。
图4A-D表示在T细胞系内突变的ζ嵌合体交联后，细胞内游离的钙离子增加。用重组牛痘病毒感染Jurkat E6细胞(Weiss et al.， 免疫学杂志(J.Immunol.) 133：123-128(1984))，然后进行流式细胞计数分析。所列的结果是栅CD4+种群的，以致仅分析了表达相关嵌合蛋白的细胞。紫到蓝Indo-1荧光的平均率反映了整个种群中细胞内游离钙离子的浓度，而应答细胞的百分比反映了超过预先确定阀值的细胞比率(设定10％的未处理细胞是阳性)。图4A和图4B表示那些表达CD4：ζ(实线)或CD16：ζ(虚线)的Jurkat细胞它们暴露于抗CD4 Mab Leu3a(藻红蛋白轭和物)，然后与抗小鼠IgG的山羊抗体交联。点线表示未感染的细胞对抗-CD3 Mab OKT3的反应。图4C和4D表示按图4A和4B处理并分析的表达CD4：ζ D15G(实线)；CD4：ζC11G/D15G(虚线)；或CD4：ζC11G(点)的Jurkat细胞。
图5A-C表示CD4：ζ，CD4：η和CD4：γ受体可以使溶解细胞的T淋巴细胞(CTL)杀伤表达HIV gp120/41的靶细胞。图5A：实圈，与表达gp120/41的HeLa细胞孵育的表达CD4：ζ的CTL；空圈，与未感染的HeLa细胞孵育的表达CD4：ζ的CTL；实方块，与表达gp120/41的HeLa细胞孵育的未感染的CTL；空方块，与未感染的HeLa细胞孵育的未感染的CTL。图5B：实圈，与表达gp120/41的HeLa细胞孵育的表达CD4：η的CTL；空圈，与表达gp120/41的HeLa细胞孵育的表达CD4：γ的CTL；空方块，与表达gp120/41的HeLa细胞孵育的表达C11G/D15G双突变体CD4：ζ的CTL。图5C：流式细胞计数分析用图5B的CTL所表达的CD4。为了更正靶与效应物的比例，通过直方图叠加，减去成比例的负(未感染的)种群，可以确定表达CD4嵌合体的细胞的百分比；为了进行比较，在该图中设未感染的细胞是一个随机的范围，它与用直方图减法所得的其他细胞种群的正的部分大致相同。
图6A-B表示CD4-指导的细胞溶解作用的特异性。图6A：实圈，与表达CD16PI的HeLa细胞孵育的表达CD4：ζ的CTL；空圈，与表达gp120的HeLa细胞孵育的表达CD4的CTL；实方块，与表达gp120/41的HeLa细胞孵育的表达CD16：ζ的CTL；空方块，与表达gp120/41的HeLa细胞孵育的表达CD16PI的CTL。图6B：实圈，与Raji(MHC II+型)孵育的表达CD4：ζ的CTL；空圈，与RJ2.2.5(MHCII-型Raji突变体)孵育的未感染的CTL细胞；实方块，与Raji(MHC II+型)孵育的未感染的CTL细胞；空方块，与RJ2.2.5(MHC II-型)孵育的表达CD4：ζ的CTL。扩大坐标级。
图7A-B表示CD16：ζ嵌合受体的表征。图7A是CD16：ζ融合蛋白的图示。将单体CD16的磷脂酰肌醇连接形式的细胞外部分与二聚的ζ就在跨膜区的外部相连。在底部列出了融合连接处的蛋白质序列(SEQ IN NOS42，43)。图7B表示在TCR正或TCR负细胞系中，交联CD16：ζ嵌合体后，钙动员的流式细胞计数分析。列出了在时间为0时用抗体处理的细胞种群中，紫到蓝荧光的平均比(相对钙离子浓度的测量)。实方块，Jarkat细胞对抗-CD3MAb OKT3的反应；实三角，CD16：ζ对在REX33ATCR-突变体中交联的抗-CD16 Mab 3G8的反应；空方块，对在Jarkat TCR-突变体系JRT3.5中交联的CD16：ζ的反应；空三角，对在Jarkat细胞中交联的CD16：ζ的反应；十字，在Jarkat细胞中，对非嵌合CD16的反应；点，在REX33ATCR-细胞系中，对非嵌合的CD16的反应。
图8A-B表示细胞溶解潜力的缺失分析。图8A表示ζ缺失端点的位置。在ζ中任何位置的突变用原残基-位置-突变残基的惯例来表示，例如D66★表示末端密码子对Asp-66的取代。图8B表示未缺失的CD16：ζ和显著ζ缺失的细胞溶解检测结果。用51Cr负载表达CD16表面抗体的杂交瘤细胞，然后与增加量的杀伤性T细胞(CTL)孵育。该杀伤性T细胞感染表达CD16：ζ嵌合体的牛痘重组体。将释放的51Cr的百分比表示为效应物(CTL)对靶(杂交瘤)细胞比例(e/t)的函数。实圈，由表达CD16：ζ(mfi18.7)的细胞介导的细胞溶解；实方块，由表达CD16：ζAsp66★(mfi940.2)的细胞介导的细胞溶解；空方块，由表达CD16：ζ Glu60★(mfi16.0)的细胞介导的细胞溶解；空圈，由表达CD16：ζTyr51★(mfi17.4)的细胞介导的细胞溶解；实三角，由表达CD16：ζPhe34★(mfi17.8)的细胞介导的细胞溶解；空三角，由表达非嵌合的CD16(mfi591)的细胞介导的细胞溶解。尽管在该试验中，CD16：ζAsp66★的表达与其他融合蛋白的表达不匹配，但在相同试验中，相同水平的表达CD16：ζ的细胞的细胞溶解与表达CD16：ζ Aspp66之细胞的结果基本相同。
图9A-D表示由跨膜作用引起的电位的消除表明短ζ片段能够介导细胞溶解。图9A图示说明单聚的由两部分和三部分构成的嵌合体。顶上的是在65位残基截断的并没有跨膜的Cys和Asp残基的CD16：ζ构建体。下面的是CD16：CD5：ζ和CD16：CD7：ζ构建体和相关对照物。下面列出了细胞内区的肽序列(SEQ ID NOS：45-47)。图9B表示单聚嵌合体缺失突变体的细胞溶解活性。将表达CD16：ζ的细胞的细胞溶解活性(实圈；mfi495)与表达CD16：ζAsp66★(实方块；mfi527)或突变体CD16：ζCys11Gly/Asp15Gly/Asq66★(空方块；mfi338)以及CD16：ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu 60★(实三角；mfi259)的细胞溶解活性相比较。图9C表示由三部分构成的融合蛋白介导的细胞溶解活性。实三角，CD16：ζAsp66★；空方块，CD16：5：ζ(48-65)；实方块，CD16：7：ζ(48-65)；空三角，CD16：7：ζ(48-59)；空圈，CD16：5；实圈，CD16：7。图9D表示在TCR-JurkatJRT3.T3.5突变体细胞系中，突变体和三部分构成的嵌合体的钙流动性。空圈，表达二聚CD16：ζ Asp66★细胞的反应；实方块，表达CD16：ζ Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66★的细胞的反应；空方块，表达CD16：ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu 60★的细胞的反应；实三角，表达CD16：7：ζ(48-65)的细胞的反应；和空三角，表达CD16：7：ζ(48-59)的细胞的反应。
图10A-F表示单个氨基酸对18残基的细胞溶解信号传导基元的影响。图10A和10B表示细胞溶解活性，图10C表示由带靠近羧基末端的Tyr(Y62)点突变的嵌合体介导的钙离子流动性。图10A和10B表示分别从表达低和高量的CD16：ζ融合蛋白质的细胞收集的数据。用于钙流动和细胞溶解试验的符号相同，在右边用一个密码子表示。实圈，表达CD16：ζ(mfi在A，21；B，376)的细胞；实方块，表达CD16：7：ζ(48-65)(mfi在A，31，B，82)的细胞；空方块，CD16：7：ζ(48-65)Glu60Gln(mfi在A，33，B，92)；十字，CD16：7：ζ(48-65)Asp63Asn(mfi在A，30，B，74)；实三角，CD16：7：ζ(48-65)Tyr62Phe(mfi在A，24，B，88)；空圈，CD16：7：ζ(48-65)GluGln(mfi在A，20，B，62)；空三角，CD16：7：ζ(48-65)Tyr62Ser(mfi B，64)。图10D和10E表示细胞溶解活性，图10F表示由带靠近氨基末端的Tyr(Y51)点突变的嵌合体介导的钙离子流动性。用于钙流动和细胞溶解试验的符号相同，在右边用一个密码子表示。实圈，表达CD16：ζ(mfi在D，21.2；E，672)的细胞；实方块，表达CD16：7：ζ(48-65)(mfi在D，31.3；E，179)的细胞；实三角，CD16：7：ζ(48-65)Asn48Ser(mfi D，22.4；E，209)；空方块，CD16：7：ζ(48-65)Leu50Ser(mfi D，25.0；E，142)；和空三角，CD16：7：ζ(48-65)Tyr51Phe(mfi D，32.3；E，294)。
图11A-B表示ζ内部重复片段的排列以及其支持细胞溶解能力的比较。图11A图示说明通过将ζ细胞内区分成三份，然后与CD16：7嵌合体的跨膜区相连而形成的嵌合体。在下面表明了细胞内区的序列(SEQ IDNOS：48-50)，有用框框起来的共有的残基，和用星号表明的相关残基。图11B表示三个ζ亚区的细胞溶解潜力。实圈，表达CD16：ζ(mfi476)的细胞；实方块，CD16：7：ζ(33-65)(mfi68)；空方块表示CD16：7：ζ(71-104)(mfi114)；和实三角，CD16：7：ζ(104-138)(mfi 104)。
图12是CD16：FcRγII嵌合体的图示说明。
图13A-B表示是CD4：FcRγII和CD16：FcRγII嵌合体交联后钙的流动。图13A表示有钙敏感性荧光团Indo-1负载的细胞发出的紫到蓝荧光的比例，表示为CD16细胞外区与抗体交联后的时间函数。图13B表示相似分析：即在与抗体交联后，带CD4：FcRγII嵌合体的细胞发出的紫到蓝荧光比例的增加。
图14A-B表示是CD4：FcRγII和CD16：FcRγII嵌合体的细胞溶解测定。图14A表示抗细胞暴露于增加量的表达CD16：FcRγII嵌合体的细胞毒T淋巴细胞(效应物细胞)时，从抗-CD16杂交瘤细胞(靶物)释放的51Cr的百分比。图14B表示相似地分析抗表达HIV包膜糖蛋白之靶细胞的由CD4：FcRγII嵌合体介导的细胞毒性。
图15A-E鉴定对于细胞溶解很重要的在FcRγIIA尾部的残基。图15A图示说明缺失构建体。图15B和15C表示CD16：FcRγIIA羧基末端缺失变异体的钙流动和细胞溶解作用。图15D和15E表示由三部分构成的嵌合体的钙流动和细胞溶解作用，所述嵌合体逐渐减少CD16：FcRγIIA细胞内尾的氨基末端。
图16(SEQ ID NO：24)表示CD3δ受体蛋白质的氨基酸序列；框起来的序列表示优选的细胞溶解信号传导部分。
图17(SEQ ID NO：25)表示T3γ受体蛋白质的氨基酸序列；框起来的序列表示优选的细胞溶解信号传导部分。
图18(SEQ ID NO：26)表示mbl受体蛋白质的氨基酸序列；框起来的序列表示优选的细胞溶解信号传导部分。
图19(SEQ ID NO：27)表示B29受体蛋白质的氨基酸序列；框起来的序列表示优选的细胞溶解信号传导部分。
图20图示表示CD4嵌合体。分子“A”是CD4(D1-D4)：Ig：CD7；分子“B”是CD4(D1，D4)：Ig：CD7：分子“C”是CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ；分子“D”是CD4(D1，D2)：Ig：CD7：ζ；以及分子“E”是CD4：ζ。将对应于前体氨基酸1-394的人CD4分子的细胞外区通过一个BanHI位点与上述(Zettlmeissl et al.，核酸细胞生物学(DNA Cell Biol)9：347(1990))人IgG1的铰链，CH1和CH2区相连，除施用人Ig序列的cDNA以在牛痘病毒重组体中表达外，在CD4前体CDNA的特有NheI位点(对应于氨基酸200)插入BamHI衔接器来产生CD4嵌合体的两区版本。所述膜粘附序列由从人膜结合的IgG1的第一个外显子的22个残基组成，接着CD7的146-203残基。从ζ的氨基酸55-163是由四部分构成的构建体(C和D)的引发基元。在含ζ链的由四部分构成的构建体中，用市售的抗细胞内区(Coulter)的抗体为ζ的细胞内表达提供资料。
图21表示用表达各种CD4衍生的嵌合体的细胞毒T细胞克隆，WH3作为效应物分子来介导表达HIV-1包膜糖蛋白之靶细胞的细胞溶解作用。为了进行细胞毒性检测，如前所述在补充了10％人血清的IMDM中维持人CD8+CD4-HLAB44限制的T细胞系，WH3。用含γ辐射(3000 rad)B44的单核细胞和1μg/ml植物凝血素(PHA)刺激细胞。刺激1天后，通过加入新鲜的培养基将PHA稀释到0.5μg/ml；3天后完全更换培养基。在用于细胞毒性试验前，要使细胞至少生长10天。用本文上述用于vPE16的适宜重组牛痘病毒感染细胞。在完全培养基中继续感染3-4小时，此后通过离心收集细胞，并以1×107/ml的密度重悬浮。将100μl加到每孔含100μl完全培养基的U-底微滴定板的各孔中，然后在系列步骤中倍比稀释。每种样品的两个孔不含淋巴细胞以自发释放Cr，并测量摄取的总Cr。用vPE16在10cm平皿中，按上述感染靶细胞，HeLa亚系S3(HeLa-S3，ATCC)。用PBS和1mM EDTA分离106感染的细胞，离心并于37℃时，重悬在100μl51Cr铬酸钠(在PBS中1 mCi/ml)中1小时，然后用PBS洗涤三次。将100μl标记了的靶细胞加到各孔中。以750xg将微滴定板离心1分钟，然后在37℃孵育4小时。在孵育期结束时，轻轻移液重悬各孔中的细胞，取出样品以确定掺入的结合总计数，以750xg将微滴定板离心1分钟。取出等份(100μl)上清液，用γ射线闪烁计数器计数。校正效应物：靶物比例以用于用流式细胞计数测量的感染细胞的百分比。
图22表示在转染细胞系中复制HIV-1。在人胚胎肾细胞系293的亚系中建立稳定表达野生型CD4和各种重组嵌合体的细胞系。HIV-1 IIIB分离物的病毒原液的制备：用按施用人T细胞系C8166作指标的终点稀释方法测量(约等于106感染颗粒/ml的滴定度指标)。在37℃，以约1 MOI经8-12小时完成感染。1天后，用PBS将细胞洗涤三次，胰酶消化，再铺在新平皿中，取上清培养液样进行p24滴定(定为0天)。此后以3-4天的间隔，收集细胞培养上清液，以进行p24分析。用含100μg/ml潮霉素B的新鲜培养基补充细胞。培养上清液用市售的ELISA-基的HIV-1 p24抗原检测试剂盒(Coulter)，分析过程按供应商的说明。结果表示相似过程的两个独立试验。
图23表示CD4的D1-D4区(CD4 Bam)的核酸序列(SEQ ID NO：28)和氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
图24表示CD4的D1-D2区(CD4 Nhe)的核酸序列(SEQ ID NO：30)和氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。
图25表示人IgG1的铰链，CH2和CH3区(Igh23 Ban)的核酸序列(SEQID NO：32)和氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。
图26表示CD7跨膜区(TM7 Ban Mlu)的核酸序列(SEQ ID NO：34)和氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。
图27表示细胞内区(ζMlu Not)的核酸序列(SEQ ID NO：36)和氨基酸序列(SEQ ID NO：37)。
图28表示合成的α螺旋的DNA序列(SEQ ID NO：51)和一级氨基酸序列(SEQ ID NO：52)。
                       实施例I构建人IgG1：受体嵌合体
通过将CH3区中的序列与从抗体mRNA的跨膜形成的3′末端延伸的cDNA片段连接而指示人IgG1重链序列。通过用扁桃体cDNA文库为底物和有下列序列的寡核苷酸的聚合酶链反应制备3′端片段，：
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC(SEQ IDNO：7)和
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGTCCT GGG CCT CA(SEQ ID NO：8)，分别对应于所需DNA片段的5′和3′末端。5′寡核苷酸与人IgG1CH1区的位点互补，而3′寡核苷酸与编码跨膜区序列的5′位点互补。用BstXI和BamHI消化PCR产物，然后连接在带可变和恒定区的半合成IgG1抗体基因的BstXI和BamHI位点之间。插入BstXI和BamHI片段后，通过限制片段交换，将构建体扩增部分取代到CH3中的SmaI位点，以便从PCR反应中仅衍生SmaI位点和3′寡核苷酸之间的部分。
为了得到人IGgG1：ζ嵌合受体，将编码BamHI位点重链基因与下文所述ζ嵌合体的BamI位点相连，以便抗体序列形成细胞外部分。用编码所述嵌合体的质粒转染COS细胞的流式细胞计数表明：当表达编码轻链cDNA的质粒被共转染时，高水平表达抗体决定基，而当不存在轻链表达质粒时，适度表达抗体决定基。
用标准分子生物学技术，按上述构建相似的嵌合体，所述嵌合体包含与η或γ(见下文)或任何T细胞受体或Fc受体蛋白质的信号传导部分相融合的人IgG1。
为了产生可以从单个启动子表达的重链和轻链的单个表达转录单位，从重链和轻链编码序列以及编码78kD葡萄糖调节蛋白质(也称为grp78或BiP)之mRNA的5′非翻译部分产生编码双顺反子mRNA的质粒。通过人基团组DNA的PCR法得到grp78序列，其引物有下列序列：
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC(SEQ IDNO：9)和
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG(SEQ IDNO：10)分别在5′和3′末端。这些寡核苷酸在10％二甲亚砜存在下完成聚合酶链反应。用NotI和HincII消化PCR得到的片段，然后插入到人IgG1编码序列下游的NotI和HpaI位点之间。然后将编码人IgG κ轻链cDNA的序列插入到grp78前导区的下游，使用在载体中的HincII位点和另一位点。从这些操作中得到的表达质粒组成了半合成的重链基团，然后是grp78前导序列，κ轻链cDNA序列，从SV40DNA片段衍生的多聚腺苷酸化信号。与只编码重链决定基的质粒转染相比，用表达质粒转染的COS细胞明显提高了重链决定基的表达。
为了得到含有重链/受体嵌合体和轻链的双顺反子基因，可以用本文所述任何嵌合重链/受体基因取代重链序列的上游。
                        实施例II构建CD4受体嵌合体
从HPB-ALL肿瘤细胞系(Aruffo等人， 美国国家科学进展  84：8573-8577(1987b))和人自然杀伤细胞制备的文库，通过聚合酶链反应分离人ζ(Weissman等人， 美国国家科学进展  85：9709-9713(1988b))和γ(Kuster等人， 生物化学杂志  265：6448-6452(1990))cDNAs，而从鼠胸腺细胞文库分离η cDNA(Jin等人， 美国国家科学进展  87：3319-3323(1990))。将ζ，η和γ cDNA与CD4的工程形式的细胞外区相连，所述CD4的工程形式在跨膜区的上游有一BamHI位点(Aruffo等人， 美国国家科学进展  84：8573-8577(1987b)；Zettlmeiss等人， DNA细胞生物学  9：347-353(1990))，所述跨膜区在跨膜区上游几个残基的相似位置处与在ζ和η中天然存在的BamHI位点相连(SEQ ID NOS：1，3，4和6)。为了与γ形成融合蛋白，将一BamHI位点在约相同的位置加到序列中(SEQ ID NO：2和5)。将融合基因导入到牛痘病毒表达质粒中，所述质粒含有大肠杆菌gpt基因作为可选择标记，然后通过同源重组插入到牛痘WR菌株的基因组中，接着在霉酚酸中选择生长(Falkner et al.， 病毒杂志(J.Virol.) 62：1849-1854(1988)；Boyle et al.， 基因(Gene) 65：123-128(1988))。流式细胞计数分析表明：牛痘重组体指导在细胞表面生产丰富的CD4：ζ和CD4：γ融合蛋白质，而CD4：η的表达较差(图1B)。后者的发现与最近的报道一致，该报道认为：将η cDNA表达质粒转染到鼠杂交瘤细胞系实质上要比可比的ζ表达质粒的转染所得的表达水平低(Clayton et al.， 实验医学杂志  172：1243-1253(1990))。免疫沉降以牛痘重组体感染的细胞表明：与天然产生的CD4抗原不同，融合蛋白质形成共价二聚体。单体的CD4：ζ和CD4：γ融合蛋白以及天然CD4的分子量分别为63、55和53KD。较大质量的融合蛋白约与较长的细胞内区一致，它比天然CD4多75(CD4：ζ)和5(CD4：γ)个残基。
                           实施例IIICD4嵌合体可与其它受体链相连
通过用鼠(Kurosake et al.， 自然  342：805-807(1989))或人(Hibbs etal.， 科学  246：1608-1611(1989))γ以及用人ζ(Lanier et al.， 自然  342：803-805(1989))共转染，促进了在转染体上人Fc γ RIII(CD16TM)巨噬细胞/自然杀伤细胞形式的细胞表面表达。
与这些报告一致，当通过共转染或用重组牛痘病毒共感染而传递到靶细胞时，嵌合体的表达也可以使得CD16TM在表面上表达(图2)。在检测的细胞系中，用ζ比用γ更显著地促进CD16TM的表面表达(图2)，而天然CD4不能增强CD16TM表面表达。
                        实施例IVAspζ突变体与Fc受体无关
为了产生与现有抗原或Fc受体无关的嵌合体，制备没有膜内Asp或膜内Cys残基或两者均无的突变体ζ融合蛋白。流式细胞计数表明，由不同突变体嵌合体进行的细胞表面表达的密度与未突变的嵌合前体没有明显的不同，免疫沉降试验表明：所述嵌合体的总表达是相似的。正如所期望的，发现没有跨膜Cys残基的突变嵌合体不形成二硫键连接的二聚体。没有Asp的两个突变嵌合体不能支持CD16TM的表面表达，而没有Cys但带Asp的单体嵌合体可使CD16TM得到共表达，但效率比亲本二聚体的低(图3)。
                       实施例V突变的受体保留了启始钙应答的能力
为了确定融合蛋白质的交联是否使细胞内的游离钙离子以类似于已知的发生在T细胞抗原受体的方式进行积累，用牛痘重组体感染人T细胞白血病细胞系的细胞(JurkatE6细胞)(ATCC存放号为TIB152，美国典型培养物保藏，Rockville，MD)并在细胞外的区域与抗体交联后测定细胞浆的相对钙浓度。对载有钙敏感染料Indo-1的细胞进行流式细胞计数测定(Grynkiewiczet al.， 生物化学杂志  260：3340-3450(1985)；Rabinovitch et al.， 免疫学 杂志  137：952-961(1986))。图4A-D显示用CD4：ζ和ζ的Asp-及Cys-突变体感染的细胞的钙通量试验的结果。嵌合体的交联可重复性地增加细胞内的钙量。CD4：η和CD4：γ类似地使受感染细胞中细胞内的钙积累。Jurkat细胞在其细胞表面表达低水平的CD4，然而，在有或没有CD16：ζ存在的情况下天然CD4的交联均不改变细胞内的钙水平(图4A-B)。
                          实施例VICD4：ζ、η和γ嵌合体介导的表达HIVgp120/41的靶细胞的细胞溶解。
为了确定嵌合的受体是否起动效应物细胞溶解程序，基于CD4对HIV包膜gp120/41复合体的识别制备了模型靶：效应物系统模型。用表达gp120/gp41的重组的牛痘病毒对Hela细胞进行感染(Chakrabarti et al.， 自然 320：535-537(1986)；Earl et al.， 病毒学杂志  64：2448-2451(1990))，并用51Cr对其进行标记。将标记的细胞与来自人同种特异性的(CD8+、CD4-)细胞毒性T淋巴细胞系的细胞一起孵育，所述的细胞毒性T淋巴细胞系的细胞是已经被牛痘重组体感染过的，该重组体表达CD4：ζ、CD4：η、或CD4：γ嵌合体、或CD4：ζCys11Gly：Asp15Gly双突变嵌合体。图5A-C显示表达gp120/41的Hela细胞被表达CD4嵌合体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性地溶解。未被感染的Hela细胞不受带有CD4：ζ嵌合体的CTL的攻击，并且表达gp120/41的Hela细胞也不被未受感染的CTL识别。为比较各种不同嵌合体的效能，通过流式细胞术以测得表达CD4嵌合体的CTL的分数和表达gp120/41的Hela细胞的分数，来对效应物与靶细胞的比值进行校准。图5C显示表达CD4的CTL的细胞计数分布，所述的CTL用于图5A和5B所示的细胞溶解试验。虽然表面CD4：ζ的平均密度大大超过了CD4：η的平均密度，表达两者中任一种形式抗原的细胞的细胞溶解效力是相似的。校正成表达gp120的靶细胞的分数，由CD4：ζ和CD4：η蛋白质介导的细胞溶解的效力可与已报道过的特异的T细胞受体靶细胞：效应物对(表达CD4：ζ的T细胞释放50％时，效应物与靶细胞的平均比值为1.9±0.99，n＝10)的最佳效力相比。CD4：γ融合体的活性较弱，如同CD4：ζ融合体一样，CD4：γ融合体缺乏转膜(transmembrane)Asp和Cys残基。然而，在这两种情况下均观察到了明显的细胞溶解作用(图5B-C)。
为了控制牛痘感染会提高CTL假识别的可能性，对被牛痘重组体感染的靶细胞进行了类似的细胞溶解试验，所述的牛痘重组体表达磷酯酰肌醇结合形的CD16(CD16PI)，并用51Cr对感染的靶细胞进行标记，且用表达CD16PI或CD16：ζ的对照重组体对CTL进行感染。图6A显示：表达非-CD4嵌合体的T细胞不识别天然Hela细胞或表达gp120/41的Hela细胞，与此相似，表达CD4嵌合体的T细胞不识别表达其它牛痘-编码的表面蛋白质的Hela细胞。另外，表达非-嵌合体的CD4的CTL不明显溶解表达gp120/41的Hela细胞(图6A)。
                      实施例VII带有II类MHC的细胞不是嵌合体攻击的目标
人们认为CD4与MHC II类抗原表达的非多态序列发生相互作用(Gay etal.， 自然  328：626-629(1987)；Sleckman et al.， 自然  328：351-353(1987))。虽然对于纯化的蛋白质来说从未有过CD4与II类抗原间发生特异性地相互作用的文献报道，在特定条件下，可证明在表达CD4的细胞与表达II类分子的细胞之间有粘附作用(Doyle et al.， 自然  330：256-259(1987)；Clayton et al.， 实验医学杂志  172：1243-1253(1990)；Lamarreet al.， 科学  245：743-746(1989))。下一步试验检查的是可否检测到对带有II类MHC的细胞的杀伤作用。图6B显示：Raji B细胞系没有由CD4：ζ引导的进攻而显示特异的细胞溶解现象，Raji B细胞系表达大量的II类抗原。虽然观察到了少量的(≈5％)细胞溶解，Raji的II类抗原阴性的突变体(RJ2.2.5)(Accolla， 实验医学杂志  157：1053-1058(1983))表现出相似的易感性，如同与未被感染的T细胞一起孵育时所显示的结果一样。
                        实施例VIII被T细胞抗原/Fe受体ζ链诱导细胞溶解的序列要求
虽然CD4和ζ链间的嵌合体可使细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤表达HIVgp120的靶细胞，但人们寻求另一种CD4以准确地比较引入到人T细胞系的ζ嵌合体的性质。这样的细胞系可以表达CD4，使人难以特异地确定钙流动的类型或程度与不同嵌合体的细胞毒性潜能间的关系。围绕这一点，制备了ζ与CD16间的嵌合体，在该嵌合体中CD16的细胞外区域附着于ζ的跨膜序列和细胞内的序列(图7A)。将该基因融合体引入到牛痘病毒表达质粒中，该表达质粒带有作为选择标记的E.Coli gpt基因，并通过同源重组及在霉酚酸中进行选择性生长使所述基因融合体插入到牛痘WR株中(Falkner和Moss， 病毒学杂志， 62：1849(1988)；Boyle和Coupar， 基因  65：123(1988))。
用牛痘重组体对T细胞系进行感染，并在细胞外的区域与抗体进行交联后，测定细胞浆内的游离钙离子的相对浓度。对负载有染料Indo-1的细胞进行荧光分光光度测定(大群体)和流式细胞计数测定(单个细胞)(Grynkiewiczet al.， 生物化学杂志  260：3440(1985)；Rabinovitch et al.， 免疫学杂志 137：952(1986))。图7B显示，对来自Jurkat人T细胞白血病细胞系的细胞收集的数据的分析，所述的细胞系是被表达CD16：ζ融合蛋白质的牛痘重组体感染过的。嵌合体的交联可重复性地提高细胞内的钙浓度，而对表达非嵌合的CD16的细胞进行的类似处理却几乎或根本没有作用。当嵌合体在缺乏抗原受体或对CD16抗体不能产生强应答的突变的细胞系中表达时，可观察到交联，所述的突变细胞系为REX33A(Breitmeyer et al.， 免疫学杂志  138：726(1987)；Sancho et al.， 生物化学杂志  264：20760(1989))、或者Jurkat突变体JRT.3.T.5(Weiss et al.， 免疫学杂志  135：123(1984))。同样的数据收集亦见于REX20A突变细胞系(Breitmeyer et al.，同上文，1987；Blumberg etal.， 生物化学杂志  265：14036(1990))和本实验室建立的Jurkat CD3/Ti阴性的突变细胞系。用表达CD16：ζ的重组体感染并不能使细胞对抗-CD3抗体恢复应答，表明融合蛋白质不能通过援救细胞内的CD3复合体链而起作用。
为了评估嵌合体再次引起细胞介导的免疫的能力，用表达CD16嵌合体的牛痘重组体对CTL进行感染，该CTL用于特异性地裂解表达膜结合的抗-CD16抗体的杂交瘤细胞。该试验是杂交瘤细胞毒性试验的延伸，所述的杂交瘤细胞毒性试验最初是为分析带有Fc受体的细胞的效应物机制而开发出来(Graziano和Fanger， 免疫学杂志  138：945，1987；Graziano和Fanger， 免疫学杂志  139：35-36，1987；Shen et al.， 分子免疫学  26：959，1989；Fanger et al.， 免疫学的今天  10：92，1989)。图8B显示在细胞毒性T淋巴细胞内表达CD16：ζ使该CTL可杀伤3G8(抗-CD16；Fleit et al.， 美国国家科学进展  79：3275，1982)杂交瘤细胞，而表达磷脂酰肌醇连结形式的CD16的CTL却是失活的。带有CD16：ζ的CTL也不能杀伤表达不相关抗体的杂交瘤细胞。
为了鉴定出细胞溶解作用所必需的最小的ζ序列，制备了一系列的缺失突变体，在此突变体中，渐多的ζ的细胞内区域(SEQ ID NO：44)被连续地从羧基端去掉了(图8A)。大部分的ζ链的细胞内区域被去除后对于细胞溶解的可能性几乎不产生影响；完整长度的嵌合体CD16：ζ的功效与在65位残基处缺失的嵌合体CD16：ζAsp66*的功效基本上相等(图8B)。可以观察到：ζ的第59位残基的缺失(嵌合体CD16：ζGlu60*)其细胞毒性明显降低，而若使第50位的残基进一步缺失，导致其活性稍有降低。然而，即使当细胞内的区域被减少到仅剩3个残基的跨膜固定锚(anchor)时，也未观察到活性的全部丧失(图8B)。
因为ζ是二硫化物连结的二聚体，对于保留细胞溶解活性的一个解释是：内源性的ζ与嵌合的ζ缺失突变体形成了杂合二聚体，因而重新具有了活性。为检验该想法，将ζ的第11位的Asp和第15位的Cys残基分别变换成Gly(Cys11Gly/Asp15Gly)，并接如下进行免疫沉降。用重组的牛痘以至少为10的感染倍数(moi)，在不含血清的DME培养基中对约2×106个CV1细胞进行感染1小时。感染后6-8小时，用PBS/1mM EDTA将该细胞从培养板中取出，用乳过氧化物酶和H2O2，通过Clark和Einfeld的方法(LeukocyteTyping II，PP155-167，Springer-Verlag，NY，1986)，以每2×106个细胞0.2mCi的125I对细胞进行表面标记。离心收集标记的细胞，并使之在1％NP-40、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.05M Tris(pH8.0)、5mMMgCl2、5mM KCl、0.2M碘乙酰胺、和1mM PMSF中裂解。离心去核，用抗体3G8(Fleit et al.，(同上)1982；Medarex)和抗-鼠IgG琼脂糖(Cappel，Durham，NC)将CD16蛋白质免疫沉降下来。使样品在非还原条件下电泳通过8％的聚丙烯酰胺/SDS凝胶或在还原条件下通过10％的凝胶。这些免疫沉降证实了CD16：ζCysllGly/Asp15Gly嵌合体与二硫化物连结的二聚体结构无关。
还测试了突变受体的细胞溶解活性。在细胞溶解试验中，第65位残基缺失的突变嵌合体(CD16：ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*)的活性比未突变的嵌合体(CD16：ζAsp66*)的活性要低2-8倍，依赖于试验的条件，后者的活性通常在CD16：ζ活性的两倍以内，或者与CD16：ζ的活性没有区别(图9B)。突变嵌合体的活性的降低与从具有相似结构(参见上文)的CD4嵌合体中观察到的降低具有可比性，并且很可能是归因于ζ单体比二聚体效力低的原因。与此形成对照，第59位的残基缺失的Asp-、Cys-突变嵌合体设有细胞溶解活性(图9B)，支持了这样的假说：由跨膜残基Cys和/或Asp介导的与其它链的缔合导致了在比65位残基有更多氨基末端缺损的突变体中，还保留有微弱的细胞溶解活性。
流式细胞计数的研究表明缺乏跨膜残基Asp和Cys的缺失突变体仍能促进应答抗体的细胞内游离钙离子的增多，该抗体交联于TCR-突变的Jurkat细胞系(图9D)。从在亲代Jurkat细胞系表达的嵌合体中也得到了类似的结果。对于CD16：ζCys11Gly/Asp15Glu/Glu60*，这些数据表明介绍钙应答的能力可由支持细胞溶解的能力突变得来。
为了最后消除ζ链跨膜残基可能有的作用，分别用该跨膜的编码序列、CD5或CD7抗原的头14个或头17个胞质残基置换ζ链的跨膜残基及其头17个胞质残基(图9A)。所得三分的融合蛋白质CD16：5：ζ(48-65)及CD16：7：ζ(48-65)并不形成二硫化物连结的二聚体(而CD16：ζ嵌合体形成二硫化物连接的二聚体)，这是因为它们在ζ链跨膜区缺少了半胱氨酸残基。上述两个三分的嵌合体均能动员Jurkat和TCR阴性细胞系内的钙(图9D)并使之对CTL产生细胞溶解应答(图9C，数据未示出)。然而，将嵌合体CD16：7：ζ(48-59)内的ζ链截短到第59位残基将使三分融合体的某些能力丧失。此能力包括引导TCR阳性或阴性Jurkat细胞的钙应答反应和成熟CTL细胞的细胞溶解作用(图9C和9D，数据未示出)。
为检查在18-残基基元内残基的各自作用，我们通过定点诱变制备了许多突变的变异体，并且对它们在嵌合受体低表达(图10A和10D)或高表达(图10B和10E)的条件下介导受体-引起的杀伤作用的能力进行评估。图10A-F显示，尽管在许多贯穿59-63位残基的相对保守的取代(即，用其同系的酰胺来取代酸性残基，或者用苯丙氨酸取代酪氨酸)使细胞溶解功效受到了轻度的损害，各变异体在总体上还保留了动员钙的能力。然而，总而言之，这些残基含有重要的亚基元，它们缺失时，细胞溶解活性丧失。将62位的Tyr转变成Phe或Ser，均使细胞毒性应答和钙应答的能力丧失。在18个残基片段的氨基端，把51位的Tyr换成Phe，将使钙起动和细胞溶解活性均丧失，而将50位的Leu用Ser取代，使钙的应答丧失而细胞溶解作用仅受到部分损害。在不被特定的假说束缚的前提下，人们猜想，Leu50Ser突变体在短期的流式细胞计数试验中的不能动员钙的能力没有完全反映它能在时间较长的细胞溶解试验中介导细胞内的游离钙离子明显升高的能力。然而，对于一些溶细胞性的T细胞系，已有钙-不敏感性的细胞溶解活性的报道，并且还没有排除本文所述结果亦有类似现象的可能性。将Asn48用Ser置换，在一些试验中使细胞毒性受到了部分损害，而在另一些试验中却几乎没有影响。
为研究多余序列元件的潜在的作用，将ζ链的细胞内的区域分成3个片段，分别为自第33至第65位残基、自第71至第104位残基、和自第104至第138位残基片段。通过在远离CD7的细胞内区域的基本膜锚固定序列的位置处引入的MLuI位点，将这些片段的每一个与CD16：CD7嵌合体相连接(参见下文；图11A)。对这三个片段的细胞溶解功效的比较表明，它们基本上是等效的(图11B)。序列比较(图11A)表明在酪氨酸之间第二个基元含11个氨基酸残基，而第1个和第3个基元含有10个氨基酸残基。
虽然还没有T细胞活化过程的确切记述，但已清楚的是：抗原受体的聚集、或者带有ζ链的细胞内序列的受体嵌合体的聚集，引发了钙流动、细胞因子和颗粒的释放、以及活化时的细胞表面标志的出现。ζ链的活性粒点(一个线性短肽序列)可能太小以至于其不具有天然的酶活性，它可能是与一个或者最多与几个蛋白质相互作用来介导细胞的活化。由于介导细胞溶解的能力可突变地与介导钙积累的能力分开，游离钙离子的动员其本身不足以引起细胞活化，这一点是也清楚的。
正如本文所述，将ζ链的细胞内区域的18个残基引入到两个无关蛋白质的跨膜区域和细胞内区域内，使所得的嵌合体再次引导针对靶细胞的细胞溶解活性，所述的靶细胞与融合蛋白质的细胞外的部分结合。虽然带有18个残基基元的嵌合体的活性比具完整长度ζ链的嵌合体的活性小将近8倍，但活性的减小可归因于跨膜相互作用的丧失，所述相互作用一般使野生型的ζ链形成二硫化物连结的二聚体。也就是说，具有与基元相同的羧基端和缺乏跨膜Cys和Asp残基的ζ缺失的构建体，显示出的活性常常比仅含有18个残基基元的嵌合体的活性略低。
我们一直强调的细胞溶解受感元件具有2个酪氨酸，而没有丝氨酸和苏氨酸，这使磷酸化活化作用的可能性受到了限制。两个酪氨酸的任何一个突变都会破坏活性，然而，虽然初步的试验没有指出在含有18个残基基元的嵌合体表面抗原交联后发生了明显的酪氨酸的磷酸化作用，但是不能排除在低水平上有这种磷酸化作用参与的可能性。除了两个酪氨酸残基的作用外，在低受体密度的条件下，许多在基元羧基末端的氨基酸的取代使基元的活性削弱。
与ζ链活性基元相似的序列可在其它几种跨膜蛋白的胞质区内找到，这些蛋白质包括CD3ζ和y分子、表面IgM相关蛋白质mb1和B29、及高亲和力IgE受体(Fc∈RI)的β和γ链(Reth， 自然  338：383，1989)。虽然这些序列的功能还不清楚，但如果充分表达的话，每种蛋白质都能进行自主的T细胞活化，而且所述的活化可在ζ阴性突变细胞系中观察到的残留的TCR应答反应里得到解释(Sussman et al.，细胞52：85，1988)。
ζ链本身带有3个这样的序列，它们大约间隔相等，大体上分成三部分的细胞内区域表明每一部分都能启始细胞溶解应答。η是ζ的同型剪接物(Jinet al.，同上文1990；Clayton et al.， 美国国家科学进展  88：5202，1991)，η缺乏第三个基元的羧基的一半残基。因为去掉第一个基元的羧端的一半残基会使活性丧失，看起来η链的绝大部分的生物学效应可能归因于头两个基元。虽然经过不同的测量，在促进抗原介导的细胞因子释放方面(Bauer et al.，美国国家科学进展  88：3842，1991)或在重新引导细胞溶解方面(参见上文)，η与ζ的活性相等，但是在应答受体的刺激时，η不被磷酸化(Bauer etal.，同上文，1991)。因此，或者磷酸化需要三个基元均存在，或者第三个基元代表了未被鉴定的硌氨酸激酶的最适宜底物。
                         实施例IX通过人Fc受体传递细胞溶解信号
为评估不同的人Fc受体亚型的作用，制备了嵌合分子，在这些分子中，人CD4、CD5或CD16抗原的细胞外的区域与FcRIIυ A、B1、B2、和C亚型(Ravetch和Kinet命名法， 免疫综述年鉴  9：457，1991)的跨膜区和细胞内区连接起来。具体地讲，用下列合成的寡聚核苷酸探针，从已存在的克隆PC23或人扁桃体cDNA文库(以标准技术构建的)对前述的FcRIIA、B1、和B2同型(蛋白质)的跨膜区和胞质区cDNA序列进行扩增：
CCC GGATCC CAG CAT GGG CAG CTC TT(SEQ ID NO：18；FcRII A正向)；
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTCGTT(SEQ ID NO：19；FcRII A反向)；
GCG GGG GGATCC CAC TGT CCAAGC TCC CAG CTC TTC ACC G(SEQ ID NO：20；FcRII B1和FcRII B2正向)；和
GCG GGG GCG GCC GCC TAAATA CGG TTC TGG TC(SEQ ID NO：21；FcRII B1和FcRII B2反向)。
这些引物分别含有BamHI和NotI酶的切割位点，切割后产生5′端6个残基的缺口。NotI位点的后面紧接着的是反义终止密码子，即CTA和TTA。所有的引物含有与目的片段的5′和3′端互补的18个或更多的残基。
通过重叠PCR技术，运用下列序列的引物：
TCAGAAAGAGAC AAC CTG AAG AAACCAACAA(SEQ ID NO：22)和
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A(SEQ ID NO：23)由定点突变来产生对应于FcR II γ C胞质区的cDAN片段，该FcR II γ C胞质区与II A同型物仅有一个氨基酸残基的差异(在第268位P变成了L)。
将PCR片段插入到分别含有CD16或CD4的细胞外区域的牛痘病毒表达载体中，接下来通过在胸苷激酶位点的重组，将PCR片段插入到野生型牛痘中，选择与Ecol：gpt共整合的病毒有助于所需重组子的鉴定。所有同型物的一致性通过双脱氧测定得到证实(图12所示)。
嵌合受体蛋白质的产生由免疫沉降研究进一步证实。以至少为10的感染复数，在无血清的IMDM培养基中，用重组的牛痘对将近107个JRT3.T3.5细胞感染1小时。感染后12个小时，收获细胞，并使用乳过氧化物酶/葡萄糖氧化酶方法(Clark和Einfeld，同上文)，以每107个细胞0.5mCi125I的量对细胞进行表面标记。离心收集标记的细胞，使之在1％NP-40、0.1mMMgCl2、5mM KCl、0.2M碘乙酰胺和1mM PMSF的溶液中裂解。离心去除细胞核，用抗体4G8和抗-鼠IgG琼脂糖对CD16融合蛋白质进行免疫沉降。在还原条件下对样品进行电泳。所有免疫沉降的嵌合受体分子均是所预期的分子量大小。
为测试嵌合受体介导胞质游离钙离子增多的能力，用重组的病毒感染TCR-突变的Jurkat细胞系JRT3.T3.5(如本文所述)，并在受体细胞外的区域与单克隆抗体3G8或Len-3A(如本文所述)交联后，测量细胞内的胞质游离钙离子。这些试验揭示在细胞外区发生交联后，FcR γ II A和C的细胞内区能够介导胞质游离钙离子的增加，而在可比较的条件下，FcR γ II B1和B2的细胞内区域却是没有活性的(图13A和13B)。CD4、CD5和CD16与FcRγII A的杂合体促进钙应答的能力基本上相等(图13A-B)。来自单核细胞和淋巴细胞谱系的其它细胞系，能对由细胞外区的交联所引发的信号进行应答。
为探寻不同的FcRγII的细胞内区域涉及细胞溶解的程度，用表达CD16：FcRγII A、B1、B2、和C嵌合体的牛痘重组体感染人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。然后将受感染的细胞与51Cr-标记的杂交瘤细胞(即，3G810-2细胞)共同培养，所述的杂交瘤细胞表达抗CD16的细胞表面抗体。在该试验中，如果嵌合体的CD16的细胞外区域已经与能活化淋巴细胞效应物程序的细胞内的片段结合在了一起，带有CD16嵌合体的CTL将会杀伤杂交瘤靶细胞；该细胞溶解试验将于下文详细描述。图14A显示带有CD16：FcRγII A和C，而不是FcRγII B1或B2的CTL能将表达细胞表面抗-CD16抗体的靶细胞溶解。
为排除特异性的细胞溶解是在一定程度上归因于与CD16部分的相互作用的可能性，进行细胞溶解实验，在该实施中，FcRγII的细胞内区粘附于CD4的细胞外区，在该实验中，靶细胞是表达HIV包膜gp120/41蛋白质的Hela细胞，具体地讲，Hela细胞是受牛痘载体vPE16(可从the NationalInstitute of Allergy and Infection Disease AIDS Depository，Bethesda，MD得到)感染过的。正如在CD16系统中的一样，表达HIV包膜的靶细胞易于被表达CD4：FcR γII A嵌合体的T细胞溶解，而不被表达FcR γII B1或B2的T细胞溶解(图14B)。
FcRγII A和C的细胞内区域不与任何其它蛋白质共有可观的序列同源性，包括扩展的FcR γ/TCRζ家族中的成员。为确定诱导细胞溶解作用的序列元件，制备了有5′和3′端缺失的细胞内区的编码序列(描述于下，示于图15A)，并在钙动员和细胞溶解的检测(如本文所述)中，估测了它们的功效。在去除了细胞内区的氨基末端部分的实验中，用无关的CD7抗原的跨膜区域取代FcR γ II的跨膜区域，以消除由跨膜区域介导的可能的相互作用的影响。
图15B和15C显示，将14个羧基末端残基包括298位的酪氨酸去除，会导致溶解细胞能力的完全丧失和钙动员潜能的显著下降。而在282位酪氨酸之前的进一步的缺失亦导致同样的表型(图15B和15C)。自细胞内区域的N-末端至第268位残基的缺失，对于钙曲线的轮廓或溶解细胞的潜能均设有实质的影响，而至第275位残基的缺失，却对游离钙离子的释放产生明显的损害，但对细胞溶解作用几乎没有影响(图15D和15E)。至第282位残基的进一步的缺失，会使FcR γ II带有尾结构，该尾结构既缺乏动员钙的能力又无引发细胞溶解作用的能力(图15D和15E)。由这些原始测量结果所确定的“活性元件”相对地较大(36个氨基酸)并包括由16个残基隔开的二个酪氨酸。
                       实施例X通过带有不支持感染的嵌合CD4受体的淋巴细胞而定向的细胞溶解作用
正如上面所讨论的，可从遗传工程获得效应物分子，该分子以MHC-不依赖的方式重新引导CTL的细胞溶解活性。例如，由CD4的细胞外区与人CTL克隆的ζ链融合组成的嵌合体，即WH3，特异地杀伤表达HIV-1表面包膜糖蛋白，gp120的靶细胞。但因CD4分子的细胞外区域使其易于被HIV感染，带CD4的CTL可成为该病毒的靶子，导致其潜能的下降(Dalgleishet al.， 自然  312：767(1984)；Klatzmann et al.， 自然  312：767(1984))。为防止产生这样的结果，以CD为基础来设计嵌合的效应物分子，使这些分子在特异性地以H2V-感染的细胞为靶物进行细胞-介导的有效的杀伤作用，但它却不易于被HIV感染。
通过遗传工程将CD4的细胞外区域(图23)附着于人IgG1重链的铰链区、第二和第三恒定区(Zettlmeissl e al.， DNA细胞生物学  9：347(1990))(图25)，来制备三分融合蛋白质，在此情形下，它们与人膜-结合的IgG1的第一跨膜外显子的一部分相连，接下来是人CD7抗原的一部分，所述CD7抗原由在单个的类Ig区和跨膜区后的转移终止序列之间的序列组成(Aruffo和Seed， 欧洲分子生物实验杂志  6：3313(1987))(图26)。CD7片段的细胞外部分的一级氨基酸序列由富含脯氨酸的区域组成，这就意味着茎(Stalk)-样结构的存在，该结构使类Ig区域伸出细胞表面(Aruffo和Seed， 欧洲分子生 物实验杂志  6：3313(1987))(图26)。制备了重组的牛痘病毒来表达上述结构及其(如本文所述)相关的嵌合体。具体地讲，重组的痘苗病毒在CV-1细胞中通过同源性重组产生。在制备高滴度的CV-1细胞贮备液之前，对每一贮备液进行至少两轮的OKT4或Leu3a的噬菌斑显现试验，然后进行噬菌斑的纯化。
三分嵌合体(CD4(D1-D4)：Ig：CD7)(图20，分子“A”)显示出有效的细胞表面表达作用，并对之在痘苗基的合胞体形成试验(Lifson et al.， 自 然  232：725(1986)；Ashorn et al.， 病毒学杂志  64：2149(1990))中，测试了其作为HIV受体的能力。将用重组的痘苗病毒(vPE16)感染的Hela细胞与由CD4、或者CD4：ζ、或者CD4(D1-D4)：Ig：CD7感染的Hela细胞共同培养，所述的vPE16编码HIV-1包膜糖蛋白(Earl et al.， 病毒学杂志( J.Virol)  64：2448(1990))。在无血清培养基中，以大约为10的感染复数(MOI)，对6cm培养皿中的50％融合的Hela细胞(ATCC，Rockville，MD)感染1小时，将该细胞在完全培养基中再孵育5-6小时，然后用含有1mMEDTA的磷酸缓冲液(PBS)将其从培养基分离。以1∶1的比率混合表达包膜的细胞和CD4嵌合体的细胞，并用完全培养基置换6cm培养皿中的培养基。共培养后6-8小时，计数合胞体并拍照。
CD4和vPE16的其培养导致易于检测的多核巨细胞的形成。而且，由CD4的细胞外的区域与TCR的ζ链融合形成的嵌合体(图27)(CD4：ζ)也能介导合胞体的形成，而表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7的细胞却未示出任何细胞融合的迹象。因为在另一篇文章中已表明，CD4的氨基末端的两个区域对于被HIV的感染是必需的(Landan et al.， 自然  334：159(1988))，我们对仅表达CD4的第一和第二区域的构建体(图24)CD4(D1、D2)：Ig：CD7(图20，分子“B”)做了试验。该分子也被证明对HIV-诱导的合胞体的形成无易感性。结合用可溶性125I-标记的gp120所做的研究得出结论：CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7两者对gp120有强的亲和性。
接下来我们进行的测定是，如果嵌合分子具有如本文所述的引发部分，抗合胞体形成的嵌合体分子是否能使细胞的杀伤作用改向，我们将ζ链的细胞内区域(图27)与CD4(D1-D4)：Ig：CD7的3′末端及CD4(D1、D2)：Ig：CD7的3′末端融合，制备了相应的重组痘苗病毒。这些构建体CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ(图20，分子“C”和“D”)在人CTL克隆WH3中表达，对其靶定向和杀伤表达HIV的表面包膜糖层白的Hela细胞的能力进行了测试(使用本文所述的方法)。图21显示，ζ链的细胞内区无论与CD4(D1-D4)：Ig：CD7还是与CD4(D1、D2)：Ig：CD7融合，都具有杀伤能力；缺乏ζ链的构建体却不能介导该活性。与CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ(图21)相比，CD4：ζ(阳性对照)介导的细胞毒性效力稍强，而CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ的效力却低些。然而，已明确的是，CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ两种嵌合体都能介导在其表面表达HIV包膜蛋白的细胞特异的杀伤作用。在痘苗基的试验中，这些四分嵌合体却一直不能介导合胞体的形成。我们也已经证明了，图11A所示的那类单个的ζ基元是足以赋予CD4(D1-D4)嵌合体的细胞溶解活性。
放射免疫沉降实验表明，融合分子如果不全部是二聚体的话，其绝大部分是二聚体。在这些实验中，用蛋白质-A琼脂糖珠来免疫沉降代谢标记的Hela细胞的溶解性抽提物，所述Hela细胞是用表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ嵌合体感染过的。在还原和非还原条件下，对经免疫沉降所得的物质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳以使之进行分级分离。具体言之，如上所述，以适当的牛痘病毒贮备液，使大约5×106个Hela-S3细胞被上述的vPE16感染。在半胱氨酸和甲硫氨酸缺乏的培养基中，以200μ Ci/ml的Tran35S-Label(ICN Radiochemicals，Irvine，CA)对细胞进行代谢标记6-8小时，接着用含1mM EDTA的磷酸缓冲液(PBS)自培养基分离。随后沉降细胞并使之在150mM NaCl、50mM Tris(pH7.5)、5mM EDTA、0.5％NP-40、0.1％SDS、5mM EDTA、1mM PMSF中裂解。离心去除细胞核后，在4℃，使各细胞提取液的五分之一在洗涤过的结合蛋白质-A的琼脂糖珠上吸附2小时。接着，用含1％NP-40的PBS洗涤上述琼脂糖珠，并在有或没有巯基乙醇存在的条件下，以含SDS的样品缓冲液对之进行洗脱。这些实验的结果表明，在非还原条件下，免疫沉降得的CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ嵌合体的绝大部分以有着预期分子量的二聚体形式存在。
为直接评估表达CD4融合分子的细胞支持HIV感染的能力，我们对表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7的转染子进行了长期感染性研究。在293细胞亚系中制备了CD4(D1-D4)：Ig：CD7、CD4(D1、D2)：Ig：CD7和CD4的稳定的转染子，所述293细胞亚系是易被感染的人胚肾原细胞系。将嵌合分子亚克隆到双向载体中，在该载体中，湿霉素(hygromycin)B基因由单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子驱动。通过磷酸钙共沉降法，用10μg的该质粒DNA对60-70％融合的10cm培养皿内的细胞进行转染。在转染前，在唯一的SfiI位点使质粒线性化，末端用T4DNA聚合酶补平。转染后24小时时，细胞分裂了两次，在转染后48小时时，将细胞置于400μg/ml的湿霉素B(Sigma，St.Louis，Mo)中进行选择。每3-4天，给细胞换用含有湿霉素的新鲜培养基。
挑选出抗性克隆，扩增之，使用荧光素-结合的抗-人IgG Fc(OrganonTeknika，West Chester，PA)或Q4120(与人的GD4(Sigma)起反应的抗体)，利用间接免疫荧光法估测其表达，然后进行流式细胞术测定(Coulter，Hialeah，FL)。选择两个独立的克隆进行分析，每一克隆内的构建体具有的细胞表面CD4的量的水平可与其它细胞系所显示的量的水平相比。图22表明，暴露于HIV后，早在感染后第3天就可在CD4稳定的转染子的培养物中检测到了P24。在这些培养物中，而多核巨细胞及特征性的膨胀(ballooning)则早在感染后第5天明显出现。在培养32天之后，既没在未转染的亲代细胞系中，也没在2个独立衍生的转染子的分离物(CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7)中检测到显著的P24水平及多核巨细胞的存在(图22)。
侵染性研究完成后，对细胞进行细胞表面CD4表达的分析。在受感染的表达CD4的培养物中，CD4表面决定簇的密度明显降低，这与病毒的下向-调节作用一致，但在表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7的培养物中，决定族的密度不受影响。这些实验说明构建带有CD4的两个顶端区域的嵌合分子是可能的，当这些分子与T细胞受体ζ链融合时，具有靶定向和杀伤HIV-感染的细胞的能力，但是都不支持CD4-介导的HIV感染。
另外的实验提示，是在CD4分子的细胞外区与双脂层分子膜之间的自然距离赋予了抗HIV感染的能力。在第一个实验中，我们构建带有CD7茎缺失和跨膜区缺失的嵌合分子；所述缺失去掉了CD7跨膜部分的脯氨酸富集区。当所述的嵌合区与CD4分子的细胞外区融合时，它仍保留了有效地锚定CD4分子的细胞外区的能力，这正如细胞表面CD4分子的表达所测得的一样(如本文所述)。然而，抗由HIV包膜糖蛋白诱导的形成合胞体的能力却丧失了。因此，CD7分子的脯氨酸富集区(可能形成α-螺旋结构区)的缺失，有效地缩短了CD4的细胞外区与脂双层分子膜间的距离，就使嵌合体抗合胞体形成的能力丧失了。
在第二个实验中，我们证明了：抗HIV-诱导的合胞体形成的能力可能是通过CD4/CD5嵌合体赋予的，据以前的报道，CD4/CD5嵌合体用作CD4细胞外区的跨膜锚，但它不具有抗HIV-诱导的合胞体形成的能力。在本实验中，将人IgG1重链的铰链区、CH2和CH3区插入到CD4/CD5分子中；所得的嵌合体可抵抗合胞体的形成，再次提示由免疫球蛋白的区域提供的距离足以使细胞抵抗HIV-诱导的合胞体的形成。
在第三个实验中，使用合成的不同长度的α螺旋，使CD4区域与细胞膜间延伸至不同的距离。具体来讲即是，设计代表了赖氨酸和谷氨酸残基重复的α螺旋基元的寡聚核苷酸，所述基元的侧部为2个丙氨酸残基(关于一级核酸序列和氨基酸序列，参见图28)。在以前的研究中，发现在α螺旋产生这样的氨基酸序列有很高的频率，这提示如此重复的基元会形成α螺旋的构象，将这样的α螺旋置于跨膜区和CD4的细胞外区之间，会使CD4远远地伸出细胞膜外。通过改变α螺旋片段的长度，基于α螺旋升转(rise and turn)的已知的数值，确定了抗HIV侵入所必需的伸出距离的计算值。这些结果列于表1                       表1
合胞体形成     Thy-1表达
A.CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk     -     -
B.CD4(D1，D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk - -
C.CD4+CD7tm+stk     +/-(a)     +
D.CD4+CD7tm(长型)     +     +
E.CD4+CD7tm(短型)     +     +
F.CD4+CD5tm     +     +
G.CD4+CH2+CH3+CD5tm     -     -
H.CD4+CH3+CD5tm     -     ND
I.CD4+CD34tm     +     +
J.CD4+合成的α螺旋体(24A°)+CD34tm     ND     +
K.CD4+合成的α螺旋体(48A°)+CD34tm     ND     +/-(a)
L.CD4+：合成的α螺旋体(72A°)+CD34tm     ND     -
a合胞体数目或者表达thy-l的细胞数目明显减少。
在该表中，除非有另外的说明，“CD4”代表CD4(D1-D4)，“H”、“CH2”、和“CH3”分别代表人IgG1重链的铰链区、CH2和CH3区；“CD7tm和stk”代表CD7跨膜区和茎区；“CD7tm长型”和“CD7tm短型”分别代表CD7跨膜区和缺失了脯氨酸富集区(如上文所讨论的)CD7跨膜区；“CD5tm”代表CD5跨膜区；及“CD34tm”代表CD34跨膜区。J-L栏内，α螺旋区的长度以埃(A)表示；这些数据基于这样的事实，即每一圈α螺旋内有3.6个残基，相当于5.4埃(或每个残基相当于1.5埃)。因此，16个残基的α螺旋将伸出CD4的细胞外的区域24埃。将Bstyl片段在该片段独一的BamHl位点连续地连环化(参见图28)，接着进行适宜的定向和克隆选择，来构建48埃和72埃的α螺旋。
在共培养试验中，用表达来自牛痘病毒vPE-16构建体的HIV-1包膜糖蛋白的Hela细胞，计数合胞体的形成(参见上文)。
如下进行Thy-1表达的测定。在HIV-1的hxb.2克隆的基础上构建活的逆病毒载体。在该载体中，大鼠的thy-1编码序列取代了非必需的nef基因，所述的thy-1为在细胞表面有效表达的分子，它通过磷脂酰基-肌醇间的连接被锚定在细胞膜上。来自该分子克隆的病毒(被命名为hxb/thy-1)，通过其细胞病理学的作用及在受感染的C8166细胞(人CD4+白血症T-细胞系)的培养上清液所产生的P24，证明了它是有感染活性的。另外，暴露于hxb/thy-1后，Hela细胞立即被CD4转染，早在感染后的18个小时时即显示出thy-1表达的迹象，正如以nef-样的方式被调控的信使所预期的一样。由nef基因编码的信使通常归入病毒调控蛋白类，所述蛋白质经多次拼接，失去了逆(rev)-应答元件。作为早期病毒基因的产物，这些信使可在胞质中组成性地积累。估计thy-1信使亦被类似地调控，也就是说，这些信使在病毒生活周期的早期产生。简言之，该系统有助于检测HIV侵入，将thy-1的表达作为病毒的侵入的替代。用标准的DEAE-葡聚糖方法，将各种不同的基于CD4的嵌合体很快转染到Hela细胞中。在转染后48小时的时候，使受转染的细胞暴露于hxb/thy-1病毒，计数转染后24-48小时的thy-1的表达。表1所示的结果中，在感染后24小时，thy-1表达的结果是用市售的Thy-1单克隆抗体测定的。
从表1所列的数据，我们得出结论，CD4的细胞外的区域应伸出细胞膜至少48埃，优选则伸出细胞膜至少72埃，以抵抗HIV-1的感染。
用类似于本文所述的总体策略，可构建基于抗-HIV包膜抗体的嵌合体，该嵌合体以HIV感染的细胞为目标靶。这种抗体的例子描述于Gorny等的 美国国家科学进展  86：1624(1989)和Marasco等的 临床研究杂志(J.ClinInvest) 90：1467(1992)。
                     实施例XI将伸出的CD4分子用作HIV的诱饵
正如本文所示明的，带有伸出细胞表面以外的CD4区域的细胞可抵抗HIV的感染。因此，这样的带CD4的细胞可用作诱饵来结合循环系统中的HIV，降低HIV感染的个体内的病毒效价。CD4区优选存在于能自然地通过淋巴结的细胞；有用的宿主细胞包括在免疫细胞清除中起作用的任何细胞，以及天然存在于淋巴结滤泡中的其它任何细胞。具体的例子包括(但不限于)巨噬细胞、T细胞(例如，辅助T细胞)、B细胞、噬中性白细胞、树状细胞、及滤泡树状细胞。
任何能结合HIV的CD4区域，包括本文所述的D1-D4和D1、D2区域，均可用于本发明的方法。至少对于某些实施方案来说(例如，上面所述的那些)，嵌合体的细胞内和/或跨膜区部分可选自任何蛋白质或任何氨基酸序列。
                     实施例XII另外的T细胞受体和B细胞受体的引发蛋白质
根据本发明，其它的细胞内和跨膜信号传导区域可来自T细胞受体蛋白质CD3δ和T3γ、以及B细胞受体蛋白质mb1和B29。这些蛋白质的氨基酸序列示于图16(CD3δ；SEQ ID NO：24)、图17(T3γ；SEQ ID NO：25)、图18(mb1；SEQ ID NO：26)、和图19(B29；SEQ ID NO：27)。足以引起细胞溶解信号传导的序列部分(并因此被优选包括在本发明的嵌合受体中)标示于括弧中。包括这些蛋白质区域的嵌合受体被构建并用于本发明的治疗方法中，如按上文所述。
                        实施例XIII
                         实验方法牛痘感染和放射免疫沉降
以至少为10的感染复数(moi)(在CV1细胞上测效价)，在无血清DME培养基中，用重组的牛痘对大约5×106个CV1细胞感染1小时。感染后给细胞更换新鲜的培养基，在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM(Gibco；Grand Island，NY)中，用每ml35S-甲硫氨酸和半胱氨酸200μ Ci(Tran35S-标记.ICV；Costo Mesa CA)的量对细胞进行6小时的代谢标记。用含有1mMEDTA的PBS将标记的细胞去附着，离心收集细胞，并使之在1％NP-40、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.05M Tris(pH8.0)、5mM EDTA、和1mM PMSF中裂解。离心去细胞核，用OKTA抗体和抗-鼠IgG琼脂糖(Cappel，Durham，NC)对CD4蛋白质进行免疫沉降。使样品在非还原条件(NR)和还原条件(R)下，电泳通过8％的聚丙烯酰胺/SDS凝胶。在放射自显影前，用En3Hance(New England Nuclear，Bosten，MA)使含有35S-标记的样品的凝胶饱和。通过比较跨膜型的CD16(CD16TM)在仅用CD16Tm感染的CV1细胞中的表达和在用编码CD16TM的病毒以及ζ或γ嵌合体共感染的细胞内的表达来测量CD16TM的易化表达。感染并孵育6个小时或更长的时间后，用PBM、1mM EDTA将细胞从培养板中脱附，通过间接免疫荧光和流式细胞术测量CD16Tm或嵌合体的表达。钙通量试验：
在无血清的IMDM中，以10的感染复数，用重组的牛痘病毒对Jurkat亚系E6(Weiss et al.， 免疫学杂志  133：123-129(1984)细胞感染1小时，并使细胞在IMDM、10％FBS中孵育3-9小时，离心收集细胞，并以3×106个细胞/ml的密度将细胞重悬于含1mM Indo-1乙酰甲氧基酯的完全培养基中(Grynkiewicz et al.， 生物化学杂志  260：3340-3450(1985))(分子探针)，并使之于37℃孵育45分钟。分离负载了Indo-1的细胞，并使之以1×106/ml的量重新悬浮于不含血清的IMDM培养基中，并于室温下避光贮存。用流式细胞计数术同时测量细胞所发出的紫色和蓝色荧光，来分析细胞的游离钙离子(Rabinovitch et al.， 免疫学杂志  137：952-961(1986))。为启始钙的流动，可将藻红蛋白(PE)-连结的Leu-3A(抗-CD4)(BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)以1μg/ml的量加入到细胞悬浮液中，接着在0时以10μg/ml的量加入非结合的羊抗-鼠IgG，或者以1μg/ml的量将非结合的3G8(抗-CD16)单克隆抗体加入到细胞悬液中，然后在0时以10μg/ml的量加入PE-结合的Fab2′羊抗-鼠IgG。自PE阳性(感染的)细胞群中收集发出的紫色荧光/蓝色荧光的比值的直方图(数据)，所述的阳性细胞通常占所有细胞的40-80％。在未发生交联的情况下，抗体OKT3引发了在未被感染的细胞内的T细胞抗原受体的应答。对于涉及CD16嵌合受体的实验，将基线移向较低的细胞内钙量(无抗体)方向的样品排除在分析之外。接着用Write Hand Man(Cooper City，FL)软件将二分数据转换成ASCII码，然后借助于FORTRAN程序对直方图的数据进行分析。在加入第二抗体试剂之前的紫/蓝发光比率用于建立正常的起始比率，将之定为标准单位，而设立的静止期的阀值比率则定为使10％的静止细胞群超过阀值。
细胞溶解试验
将人T细胞系WH3(CD8+CD4-HLA B44限制性的细胞溶解细胞系)维持于IMDM、10％的含100μ/ml IL-2的人血清中，并用辐照过的(3000rad)HLA-未匹配的外周血淋巴细胞对之进行非特异性的周期性刺激，或者用辐照过的带有B44的单核细胞对之进行特异性的周期性刺激。非特异性刺激一天之后，用新鲜的培养基将PHA稀释成0.5μg/ml，3天后，更换培养基。在用于细胞毒性试验之前，应使细胞在刺激后生长至少10天。在不含血清的培养基中，以至少为10的感染复数，用重组的痘苗感染细胞1小时，然后使细胞在完全培养基中孵育3小时。离心收获细胞，并以1×107个细胞/ml的密度使之重新悬浮。将100μl加入到每孔均含有100μl的完全培养基的U-形底的微量滴定板的各孔中。对细胞进行倍比系列稀释。各样品有两个孔不含淋巴细胞，从而使铬自发释放，并测总的铬吸收。在6.0或10.cm的培养板中，用不合血清的培养基，以大约为10的感染复数，对来自Hela亚系S3的靶细胞进行感染1时，接着使细胞在完全培养基中孵育3小时。用PBS、1mM EDTA使其从培养皿上解脱下来并计数。离心106个靶细胞的一个等分部分(对于CD4嵌合受体实验，是Hela、12aji或RJ2.2.5细胞，对于CD16嵌合受体实验，是3G8 10-2细胞，Shen et al.，分子免疫学(Mol.Immunol)26：959(1989))，并使细胞于37℃在间歇混合的情况下重新悬浮于50μl的无菌51Cr-铬酸钠(1mCi/ml，Duport Wilmington，DE)中1小时，然后以PBS洗涤细胞3次。将标记的细胞以105个细胞/ml的量重新悬浮于培养基，每孔加100μl的该标记细胞。。以标记Hela细胞同样的方式标记Raji和RJ2.2.5靶细胞。使微滴定板以750xg的速度离心1分钟，并在37℃下孵育4小时。在孵育结束时，通过温和的吸抽(pipetting)使各孔内的细胞重新悬浮，移出样品以测定掺入的总数，并使微滴定板以750xg的速率离心1分钟。取出100μl等分的上清液在γ射线闪烁计数器上计数。以流式细胞计数术测定的受感染的靶细胞的分数(通常为50-90％)来校正杀伤百分比。对于被感染的效应物细胞，以被感染的细胞的百分数(对于CD4嵌合受体实验通常为20-50％，而对于D16嵌合受体实验则通常为＞70％)来校正效应物：靶细胞的比率。
ζ序列的体外诱变
为在ζ序列的第11位和第15位氨基酸残基处产生点突变，制备从ζ链跨膜区的上游的BamHI位点处延伸的合成性寡聚核苷酸引物，使天然ζ链的第11位残基的Gys变成Gly(C11G)或第15位的Asp变成Gly(D15G)或都变成Gly(C11G/D15G)，并将之用于PCR反应中以产生突变的片段，所述的片段被重新插入到野生型CD4：ζ构建体中。
为产生ζ链的缺失突变，使用在第50、59、或65位残基后面设计成的终止密码子(UAG)的合成性寡聚核苷酸引物，通过PCR技术来扩增ζcDNA序列。引物含有NotI酶切割位点，NotI切割产生含5个或6个残基的5′端缺口，通常以CGC GGG CGG CCG CTA的序列形式存在(SEQ ID NO：11)，其中最后的3个碱基对应于终止密码子。跟在NotI和终止密码子序列的后面是与目的片段的3′末端互补的18个或更多的残基。所得的嵌合体被分别定名为CD16：ζY51*、 CD16：ζE60*和CD16：ζD66*。跨膜区的BamHI位点上游及NotI位点用于产生被重新导入到野生型CD16：ζ构建体的片段。通过BamHI和SacI对上文所述的Asp-和Cys-CD4：ζ构建体进行消化来释放出ζ链的跨膜和细胞内的近膜端的序列，并将该片段分别插入到CD16：ζE60*和CD16：ζD66*构建体中，这样就产生单体ζ嵌合体。CD16：7：ζ(48-65)和CD16：7：ζ(48-59)三嵌合体的构建
为制备CD16：ζD66*构建体，对应于膜区域及后面的细胞质区域17个残基的ζcDNA序列被来自CD5和CD7 cDNA的相应的跨膜和胞质区的序列取代。用正向寡聚核苷酸和反向寡聚核苷酸及含有SacI限制酶切割位点的ζ序列，通过PCR，来产生CD5和CD7片段。其中正向寡聚核苷酸含有有BamHI限制酶切割位点且分别对应于CD5和CD7的跨膜区上游而以下的反向寡聚核苷酸分别将CD5和CD7序列重叠。
        CD5：ζ：CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG
CTG CTT CTT CTG(SEQ ID NO：12)
        CD7：ζ：CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC
CGC CGA ATT CTT ATC CCG(SEQ ID NO：13)。
用BamHI和SacI消化CD5和CD7 PCR产物，并与BanHI和SaCI消化的CD16：ζE60*连接起来，并用CD7片段取代ζ链中自BamHI至SacI间的序列。为制备CD16：CD5和CD16：CD7构建体，以寡聚核苷酸，通过PCR来得到CD5和CD7片段。该寡聚核苷酸含有NotI限制酶切割位点和分别在CD5和CD7的Gln416、Ala193残基之后的终止密码子(UAA)。用BamHI和NotI消化该CD5和CD7片段并将之插入到CD16：ζAsp66*构建体中。
ζ细胞溶解信号传导基元内的N-末端残基的体外诱变
人工合成的自ζ基元内的SacI位点延伸的寡聚核苷酸引物，使第48位的天然残基从Asn转变成Ser(N48S)、第50位的残基从Leu变成Ser(L50S)及第51位的残基从Tyr变成Phe(Y51F)，将之用于PCR反应，以产生可被重新导入到野生型CD16：7：ζ(48-65)构建体中的片段。
ζ细胞溶解信号传导基元内的羧基(C)-末端残基的体外诱变
人工合成的寡聚核苷酸引物，NotI位点的3′延伸至终止密码子，并使第60位的天然残基从Glu变成GLn(E60Q)、第61位的残基从Glu变成Gln(E61Q)、第62位的残基从Tyr变成Phe或Ser(Y62F或Y62S)及第63位的残基从Asp变成Asn(D63N)，将这类引物用于PCR反应，以产生可被亚克隆到野生型CD16：ζD66*构建体的BamHI位点和NotI位点之间的片段。CD16：7：ζ(33-65)、CD16：7：ζ(71-104)、CD16：7：ζ(104-137)嵌合体的构建
使用序列为GGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CACACA(SEQ ID NO：14)的寡聚核苷酸，利用PCR得到CD7跨膜片段，该跨膜片段带有在跨膜和细胞内区连结处的MluI和NotI位点。将所得的PCR片段用BamHI和NotI消化，并使之重新插入到CD16：7：ζ(48-65)构建体中。使用在正向引物的5′端含有MluI位点和终止密码子的引物对利用PCR得到编码第33-65位残基、第71-104位残基、和第104-137位残基的ζ片段。密码子的后面是在反向引物5′端的NotI位点。每一限制位点自引物的5′末端有6个残基的缺刻，以保证限制酶的切割。
       ζ33：CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CACACA(SEQ ID NO：15)；
       ζ71：CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG(SEQ ID NO：16)；and
       ζ104：CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC(SEQ ID NO：17)。FcRγII A缺失突变体的构建
利用PCR，以制备全长构建体同样的方式来构建羧基末端FcRγII A缺失的突变体，使在第282和298位的酪氨酸的编码序列变成终止密码子(TAA)。使用寡聚核苷酸，利用PCR通过扩增编码渐小细胞内区的片段，来产生氨基(N)-末端缺失突变体。所述的寡聚核苷酸可使所得的片段被插入到MluI和NotI限制性位点之间，即以前构建的表达质粒，该质粒编码与CD7跨膜区融合的CD16细胞外区域。所述的CD7跨膜区终止于MluI位点和跨膜区与细胞内区间的连结区。
                         其它实施方案
上述的实施例显示ζ、η或γ嵌合体的聚集足以引起T细胞中的具有细胞溶解作用的效应器细胞的应答。已知的表达ζ、η或γ的细胞范围(包括T淋巴细胞、天然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、和肥大细胞)提示保守序列基元可能与通常对造血器官细胞敏感的装置发生相互作用，并且提示在免疫系统中，宿主防御的重要成分可能由受体聚集情况所介导。
细胞溶解应答的潜能和不能对带有II类MHC受体产生应答，这显示基于ζ、η或γ的嵌合体形成(通过继承性免疫疗法)对AIDS的遗传基因干涉的基础。内源性的ζ和γ的广泛分布以及与γ相关的Fc受体介导不同细胞种类内的细胞毒性的证据(Fanger et al.， 今日免疫学  10：92-99(1989))使我们为此目的可以考虑许多种细胞。例如，嗜中性粒细胞是用于嵌合体表达的很有吸引力的靶细胞。该细胞在循环中的寿命极短(≈4小时)，且极易被溶解。以HIV对嗜中性粒细胞感染不可能引起病毒的释放，这些细胞的大量存在(是白细胞中最多的细胞)会增强宿主防御。另外的引人注意的可能的宿主细胞是成熟T细胞-目前一个与逆病毒工程关系较近的细胞群体(Rosenbery，Sci.Am.(科学美国人)262：62-69(1990))。在重组IL-2的帮助下，T细胞群可相对容易地在培养基中扩增，扩增后的群体当再融合时，具有典型的有限的寿命(Roserberg et al.N.Engl.J.Med(新英格兰医学期刊)，323：570-578(1990))。
在适当的条件下，表达CD4嵌合体的细胞对HIV的识别也能产生促有丝分裂刺激物，使带有嵌合体的细胞群可以动态地对病毒产生应答。虽然我们已针对在细胞溶解T淋巴细胞内的融合蛋白质的行为做了强调，但在辅助淋巴细胞内的嵌合体的表达可能是HIV-起动的细胞因子的来源，所述的细胞因子能抵抗AIDS中的辅助细胞的裂解。最近对抗感染工程的几个方案步骤的描述(而不是对病毒渗入的步骤)(Friedman et al.，Nature(自然)335：452-454(1988)；Green et al.，Cell(细胞)58：215-223(1989)；Malimetal.，Cell(细胞)58：205-214(1989)；Trono et al.，Cell(细胞)59：113-120(1989)；Buonocore et al.，Nature(自然)345：625-628(1990))，提示可设计带有CD4嵌合体的细胞来阻止病毒的产生，该嵌合细胞表达具有细胞内作用位点的适当的试剂。
通过自主嵌合体将信号传递给T淋巴细胞的能力，也提供了调节体内淋巴细胞的反转录病毒工程的能力。交联刺激(例如：由特异性IgM抗体介导的以除去补体-结合区的工程)可以使所述淋巴细胞在原位的数量增加，而同样处理相似的特异性IgG抗体(例如识别工程化为嵌合链的氨基酸变异体)可选择性地减少工程种群。另外，抗-CD4IgM抗体不需另外的交联就可在表达CD4：ζ嵌合体的Jurkat细胞中动员钙。不需重复体外扩增就可调节细胞种群的能力实质上可扩大基因工程T细胞目前的用途范围和效力。
尽管已与具体实施方案相结合描述了本发明，但应明白还可作进一步的修改，而且本申请旨在包括本发明的各种变异、用途或修改，并包括与本发明公开的内容有所偏离的部分，只要它们在本发明所属的领域内，或具有本发明前述的及后附的权利要求的基本特征，即可被应用。
                            序列表(1)一般资料：
(i)申请人：Seed，Brian et al.
(ii)发明题目：用带嵌合CD4受体的细胞定位溶解HIV-感染的细胞
(iii)序列数：52
(iv)相关地址：
    (A)收件人：Fish & Richardson P.C.
    (B)街道：225 Franklin Street
    (C)城市：波士顿
    (D)州：马萨诸萨
    (E)国家：美国
    (F)由编：02110-2804
(v)计算机可读形式：
    (A)介质类型：3.5″盘，1.44Mb
    (B)计算机：IBM PS/2 Model 50Z or 55SX
    (C)操作系统：IBM P.C.DOS(Version 3.30)
    (D)软件：Wordperfect(Version 5.0)
(vi)当前申请资料：
    (A)申请号：08/394,388
    (B)申请日：February 24,1995
(vii)当前申请资料：
    (A)申请号：08/284,391
    (B)申请日：1994年8月2日
(vii)当前申请资料：
    (A)申请号：08/195,395
    (B)申请日：1994年2月14日
(vii)当前申请资料：
    (A)申请号：07/847,566
    (B)申请日：1992年3月6日
(viii)代理人/代理资料：
    (A)姓名：Karen F.Lech，Ph.D
    (B)登记号：35,238
    (C)文献/文档号：00786/272001
(ix)电讯资料：
    (A)电话：(617)542-5070
    (B)电传：(617)542-8906
    (C)传真：200154(2)SEQ ID NO：1的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：1728个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGAACCGGG  GAGTCCCTTT  TAGGCACTTG  CTTCTGGTGC  TGCAACTGGC                   50GCTCCTCCCA  GCAGCCACTC  AGGGAAACAA  AGTGGTGCTG  GGCAAAAAAG                  100GGGATACAGT  GGAACTGACC  TGTACAGCTT  CCCAGAAGAA  GAGCATACAA                  150TTCCACTGGA  AAAACTCCAA  CCAGATAAAG  ATTCTGGGAA  ATCAGGGCTC                  200CTTCTTAACT  AAAGGTCCAT  CCAAGCTGAA  TGATCGCGCT  GACTCAAGAA                  250GAAGCCTTTG  GGACCAAGGA  AACTTCCCCC  TGATCATCAA  GAATCTTAAG                  300ATAGAAGACT  CAGATACTTA  CATCTGTGAA  GTGGAGGACC  AGAAGGAGGA                  350GGTGCAATTG  CTAGTGTTCG  GATTGACTGC  CAACTCTGAC  ACCCACCTGC                  400TTCAGGGGCA  GAGCCTGACC  CTGACCTTGG  AGAGCCCCCC  TGGTAGTAGC                  450CCCTCAGTGC  AATGTAGGAG  TCCAAGGGGT  AAAAACATAC  AGGGGGGGAA                  500GACCCTCTCC  GTGTCTCAGC  TGGAGCTCCA  GGATAGTGGC  ACCTGGACAT                  550GCACTGTCTT  GCAGAACCAG  AAGAAGGTGG  AGTTCAAAAT  AGACATCGTG                  600GTGCTAGCTT  TCCAGAAGGC  CTCCAGCATA  GTCTATAAGA  AAGAGGGGGA                  650ACAGGTGGAG  TTCTCCTTCC  CACTCGCCTT  TACAGTTGAA  AAGCTGACGG                  700GCAGTGGCGA  GCTGTGGTGG  CAGGCGGAGA  GGGCTTCCTC  CTCCAAGTCT                  750TGGATCACCT  TTGACCTGAA  GAACAAGGAA  GTGTCTGTAA  AACGGGTTAC                  800CCAGGACCCT  AAGCTCCAGA  TGGGGAAGAA  GCTCCCGCTC  CACCTCACCC                  850TGCCCCAGGC  CTTGCCTCAG  TATGCTGGCT  CTGGAAACCT  CACCCTGGCC                  900CTTGAAGCGA  AAACAGGAAA  GTTGCATCAG  GAAGTGAACC  TGGTGGTGAT                  950GAGAGCCACT  CAGCTCCAGA  AAAATTTGAC  CTGTGAGGTG  TGGGGACCCA                 1000CCTCCCCTAA  GCTGATGCTG  AGCTTGAAAC  TGGAGAACAA  GGAGGCAAAG                 1050GTCTCGAAGC  GGGAGAAGCC  GGTGTGGGTG  CTGAACCCTG  AGGCGGGGAT                 1100GTGGCAGTGT  CTGCTGAGTG  ACTCGGGACA  GGTCCTGCTG  GAATCCAACA                 1150TCAAGGTTCT  GCCCACATGG  TCCACCCCGG  TGCACGCGGA  TCCCAAACTC                 1200TGCTACTTGC  TAGATGGAAT  CCTCTTCATC  TACGGAGTCA  TCATCACAGC                 1250CCTGTACCTG  AGAGCAAAAT  TCAGCAGGAG  TGCAGAGACT  GCTGCCAACC                 1300TGCAGGACCC  CAACCAGCTC  TACAATGAGC  TCAATCTAGG  GCGAAGAGAG                 1350GAATATGACG  TCTTGGAGAA  GAAGCGGGCT  CGGGATCCAG  AGATGGGAGG                 1400CAAACAGCAG  AGGAGGAGGA  ACCCCCAGGA  AGGCGTATAC  AATGCACTGC                 1450AGAAAGACAA  GATGCCAGAA  GCCTACAGTG  AGATCGGCAC  AAAAGGCGAG                 1500AGGCGGAGAG  GCAAGGGGCA  CGATGGCCTT  TACCAGGACA  GCCACTTCCA                 1550AGCAGTGCAG  TTCGGGAACA  GAAGAGAGAG  AGAAGGTTCA  GAACTCACAA                 1600
GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT    1650
AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG    1700
GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA                            1728(2)SEQ ID NO：2的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：1389个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC                   50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG                  100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA                  150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC                  200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA                  250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG                  300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA                  350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC                  400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC                  450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA                  500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT                  550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG                  600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA                  650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG                  700
GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT                  750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC                  800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC                  850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC                  900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT                  950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA                 1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG                 1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT                 1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA          1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC          1200
TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT          1250
GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC          1300
GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG          1350
ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG                      1389(2)SEQ ID NO：3的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：1599个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC                 50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG                100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA                150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC                200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA                250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG                300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA                350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC                400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC                450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA                500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT                550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG                600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA                650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG                700
GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT                750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC                800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC                850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC                900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT                950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA            1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG            1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT            1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA            1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC            1200
TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC TATGGTGTCA TTCTCACTGC            1250
CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC            1300
AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG            1350
GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC CGGGACCCTG AGATGGGGGG            1400
AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA            1450
AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC            1500
CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC            1550
CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGCTAA             1599(2)SEQ ID NO：4的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：575个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu1               5                  10                  15Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
         20                  25                  30Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
     35                  40                  45Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
 50                  55                  60Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
             85                  90                  95Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
        100                 105                 110Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
    115                 120                 125Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130                 135                 140Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly145                         150         155                 160Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
            165                 170                 175Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
        180                 185                 190Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
    195                 200                 205Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210                 215                 220Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp225                 230                 235                 240Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
            245                 250                 255Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
        260                 265                 270Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
    275                 280                 285Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
290                 295                 300Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr305                 310                     315             320Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
            325                 330                 335Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
        340                 345                 350Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
    355                 360                 365Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
370                 375                 380Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu385                 390                 395                 400Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr
            405                 410                 415Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala
        420                 425                 430Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
    435                 440                 445Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu
450                 455                 460Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr465                 470                 475                 480Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Pro Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
            485                 490                 495Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
        500                 505                 510Asp Ser His Phe Gln Ala Val Gln Phe Gly Asn Arg Arg Glu Arg Glu
    515                 520                 525Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly
530                 535                 540Glu Ser Thr Gln Gln Ser Ser Gln Ser Cys Ala Ser Val Phe Ser Ile555                 550                 565                 560Pro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gln Leu
            565                 570                 575(2)SEQ ID NO：5的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：462个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu1               5                  10                  15Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
         20                  25                  30Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
     35                  40                  45Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
 50                  55                  60Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
             85                  90                  95Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
        100                 105                 110Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
    115                 120                 125Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130                 135                 140Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly145                 150                 155                 160Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
            165                 170                 175Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
        180                 185                 190Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
    195                 200                 205Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210                 215                 220Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp225                 230                 235                 240Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
            245                 250                 255Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
        260                 265                 270Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
    275                 280                 285Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
290                 295                 300Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr305                 310                 315                 320Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
            325                 330                 335Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
        340                 345                 350Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
    355                 360                 365Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
370                 375                 380Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Gln Leu385                 390                 395                 400Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr
            405                 410                 415Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Asp Ile Ala
        420                 425                 430Ser Arg Glu Lys Ser Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Asn
    435                 440                 445Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
450                 455                 460     462(2)SEQ ID NO：6的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：532个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu1               5                  10                  15Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
         20                  25                  30Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
     35                  40                  45Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
 50                  55                  60Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
             85                  90                  95Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
        100                 105                 110Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
    115                 120                 125Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130                 135                 140Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly145                 150                 155                 160Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
            165                 170                 175Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
        180                 185                 190Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
    195                 200                 205Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210                 215                 220Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp225                 230                 235                 240Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
            245                 250                 255Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
        260                 265                 270Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
    275                 280                 285Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
290                 295                 300Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr305                 310                 315                 320Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
            325                 330                 335Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
        340                 345                 350Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
    355                 360                 365Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
370                 375                 380Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu385                 390                 395                 400Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr
            405                 410                 415Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala
        420                 425                 430Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
    435                 440                 445Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
450                 455                 460Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn465                 470                 475                 480Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
            485                 490                 495Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
        500                 505                 510Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
    515                 520                 525Leu Pro Pro Arg
530(2)SEQ ID NO：7的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC                                  33(2)SEQ ID NO：8的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：50个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA                50(2)SEQ ID NO：9的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC                             33(2)SEQ ID NO：10的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG                             33(2)SEQ ID NO：11的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：15个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CGCGGGCGGC CGCTA                                                 15(2)SEQ ID NO：12的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：42个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG                         42(2)SEQ ID NO：13的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：48个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG                   48(2)SEQ ID NO：14的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA                                   33(2)SEQ ID NO：15的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：36个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA                                36(2)SEQ ID NO：16的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG                         33(2)SEQ ID NO：17的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：33个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC                         33(2)SEQ ID NO：18的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：26个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT                                 26(2)SEQ ID NO：19的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：42个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT                         42(2)SEQ ID NO：20的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：40个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG CTCTTCACCG                            40(2)SEQ ID NO：21的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：32个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC                                    32(2)SEQ ID NO：22的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A                                     31(2)SEQ ID NO：23的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A                           31(2)SEQ ID NO：24的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：171个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
            5                   10                  15Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
        20                  25                  30Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
    35                   40                  45Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50                  55                  60Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys65                  70                  75                  80Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
            85                  90                  95Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
        100                 105                 110Ala Ile Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
    115                 120                 125Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130                 135                 140Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr145                 150                 155                 160Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
            165                 170(2)SEQ ID NO：25的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：182个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
            5                   10                  15Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
        20                  25                  30Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
    35                  40                  45Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50                  55                  60Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp65                  70                  75                  80Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
            85                  90                  95Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
        100                 105                 110Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
    115                 120                 125Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130                 135                 140Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr145                 150                 155                 160Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
            165                 170                 175Asn Gln Leu Arg Arg Asn
        180(2)SEQ ID NO：26的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：220个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe
            5                   10                  15Leu Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala Leu Arg Val Glu
        20                  25                  30Gly Gly Pro Pro Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu
    35                  40                  45Thr Cys Glu Asn Asn Gly Arg Asn Pro Asn Ile Thr Trp Trp Phe Ser
50                  55                  60Leu Gln Ser Asn Ile Thr Trp Pro Pro Val Pro Leu Gly Pro Gly Gln65                  70                  75                  80Gly Thr Thr Gly Gln Leu Phe Phe Pro Glu Val Asn Lys Asn Thr Gly
            85                  90                  95Ala Cys Thr Gly Cys Gln Val Ile Glu Asn Asn Ile Leu Lys Arg Ser
        100                 105                 110Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu
    115                 120                 125Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile
130                 135                 140Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg145                 150                 155                 160Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp Asp Tyr
            165                 170                 175Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met
        180                 185                 190Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly
    195                 200                 205Asn Leu His Ile Gly Asp Ala Gln Leu Glu Lys Pro
210                 215                 220(2)SEQ ID NO：27的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：228个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu Phe
            5                   10                  15Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Ser Ser
        20                  25                  30Asp Leu Pro Leu Ash Phe Gln Gly Ser Pro Cys Ser Gln Ile Trp Gln
    35                  40                  45His Pro Arg Phe Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met Val Lys Phe His
50                  55                  60Cys Tyr Thr Asn His Ser Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys Arg Gly65                  70                  75                  80Ser Gln Gln Pro Gln Glu Leu Val Ser Glu Glu Gly Arg Ile Val Gln
            85                  90                  95Thr Gln Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Ile Gln Tyr
        100                 105                 110Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Lys Gln Lys Cys Asp Ser Ala Asn
    115                 120                 125His Asn Val Thr Asp Ser Cys Gly Thr Glu Leu Leu Val Leu Gly Phe
130                 135                 140Ser Thr Leu Asp Gln Leu Lys Arg Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile145                 150                 155                 160Ile Leu Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile
            165                 170                 175Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp
        180                 185                 190His Thr Tyr Glu Gly Leu Asn Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp
    195                 200                 205Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His
210                 215                 220Pro Gly Gln Glu225(2)SEQ ID NO：28的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：1304
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC     50
CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG    100
CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC    150
TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG    200
GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA    250
GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA    300
ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT    350
GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA    400
GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC    450
AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC    500
ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC    550
TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC    600
AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC    650
ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT    700
AGACATCGTG GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA    750
AAGAGGGGGA ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA    800
AAGCTGACGG GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC    850
CTCCAAGTCT TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA    900
AACGGGTTAC CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC    950
CACCTCACCC TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT   1000
CACCCTGGCC CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC   1050
TGGTGGTGAT GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG   l100
TGGGGACCCA CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA   1150
GGAGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG   1200
AGGCGCGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG   1250
GAATCCAACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA   1300(2)SEQ ID NO：29的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：398
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
            5                   10                  15Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
        20                  25                  30Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
     35                 40                  45Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
50                  55                  60Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
            85                  90                  95Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
        100                 105                 110Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
    115                 120                 125Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130                 135                 140Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly145                 150                 155                 160Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
            165                 170                 175Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
        180                 185                 190Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
    195                 200                 205Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210                 215                 220Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp225                 230                 235                 240Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
            245                 250                 255Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
        260                 265                 270Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
    275                 280                 285Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
290                 295                 300Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr305                 310                 315                 320Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
            325                 330                 335Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
        340                 345                 350Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
    355                 360                 365Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
370                 375                 380Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro385                 390                 395(2)SEQ ID NO：30的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：719
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC     50
CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG    100
CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC    150
TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG    200
GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA    250
GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA    300
ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT    350
GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA    400
GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC    450
AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC    500
ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC    550
TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC    600
AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC    650
ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAT     700
AGACATCGTG GTGCTAGCT                                      719(2)SEQ ID NO：31的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：203
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
            5                   10                  15Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
        20                  25                  30Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
    35                  40                  45Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
50                  55                  60Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
            85                  90                  95Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
        100                 105                 110Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
    115                 120                 125Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130                 135                 140Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly145                 150                 155                 160Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
            165                 170                 175Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
        180                 185                 190Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala
    195                 200(2)SEQ ID NO：32的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：768
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
GCTAGCAGAG CCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC     50
CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA    100
CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT    150
GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG    200
ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC    250
AACAGCACGT ACCGGGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG    300
GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG    350
CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA    400
CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA AGAACCAGGT    450
CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG    500
AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC    550
GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA    600
CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG    650
AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGG    700
CTGCAACTGG ACGAGACCTG TGCTGAGGCC CAGGACGGGG AGCTGGACGG    750
GCTCTGGACG ACGGATCC                                       768(2)SEQ ID NO：33的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：254
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1               5                   10                  15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
        20                  25                  30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
    35                  40                  45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65                  70                  75                  80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
            85                  90                  95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
        100                 105                 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
    115                 120                 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130                 135                 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145                 150                 155                 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
            165                 170                 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
        180                 185                 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
    195                 200                 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu Gln Leu Asp Glu Thr Cys Ala Glu225                 230                 235                 240Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Asp Pro
            245                 250(2)SEQ ID NO：34的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：174
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
CCAAGGGCCT CTGCCCTCCC TGCCCCACCG ACAGGCTCCG CCCTCCCTGA     50
CCCGCAGACA GCCTCTGCCC TCCCTGACCC GCCAGCAGCC TCTGCCCTCC    100
CTGCGGCCCT GGCGGTGATC TCCTTCCTCC TCGGGCTGGG CCTGGGGGTG    150
GCGTGTGTGC TGGCGAGGAC GCGT                                174(2)SEQ ID NO：35的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：58
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro1               5                   10                  15Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala
        20                  25                  30Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu
    35                  40                  45Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Arg
50                  55(2)SEQ ID NO：36的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：345
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
ACGCGTTTCA GCAGGAGCGC AGAGCCCCCC GCGTACCAGC AGGGCCAGAA     50
CCAGCTCTAT AACGAGCTCA ATCTAGGACG AAGAGAGGAG TACGATGTTT    100
TGGACAAGAG ACGTGGCCGG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGAGAAGG    l50
AAGAACCCTC AGGAAGGCCT GTACAATGAA CTGCAGAAAG ATAAGATGGC    200
GGAGGCCTAC AGTGAGATTG GGATGAAAGG CGAGCGCCGG AGGGGCAAGG    250
GGCACGATGG CCTTTACCAG GGTCTCAGTA CAGCCACCAA GGACACCTAC    300
GACGCCCTTC ACATGCAGGC CCTGCCCCCT CGCTAAAGCG GCCGC         345(2)SEQ ID NO：37的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：111
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：Thr Arg Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln1               5                   10              15Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
        20                  25                  30Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
    35                  40                  45Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
50                  55                  60Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg65                  70                  75                  80Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
            85                  90                  95Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
        100                 105                 110(2)SEQ ID NO：38的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：16个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：39的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：19个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu1               5                   10                  15Leu Asp Gly(2)SEQ ID NO：40的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：12个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala1               5                   10(2)SEQ ID NO：41的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：19个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Gln Leu Cys Tyr Ile1               5                   10                  15Leu Asp Ala(2)SEQ ID NO：42的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：16个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：43的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：16个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：Phe Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：44的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：142个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly1               5                   10                  15Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val
        20                  25                  30Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
    35                  40                  45Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
50                  55                  60Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg65                  70                  75                  80Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
            85                  90                  95Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
        100                 105                 110Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
    115                 120                 125Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
130                 135                 140(2)SEQ ID NO：45的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：35个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly1               5                   10                  15Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
        20                  25                  30Asp Val Leu
    35(2)SEQ ID NO：46的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：32个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：Lys Lys Leu Val Lys Lys Phe Arg Gln Lys Lys Gln Arg Gln Asn Gln1               5                   10                  15Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：47的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：35个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47：Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala1               5                   10                  15Ala Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
        20                  25                  30Asp Val Leu
    35(2)SEQ ID NO：48的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：35个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：Arg Thr Arg Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly1               5                   10                  15Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
        20                  25                  30Asp Val Leu
    35(2)SEQ ID NO：49的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：36个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：Arg Thr Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro1               5                   10                  15Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
        20                  25                  30Tyr Ser Glu Ile
    35(2)SEQ ID NO：50的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：38个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：Arg Thr Arg Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His1               5                   10                  15Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
        20                  25                  30Ala Leu His Met Gln Ala
    35(2)SEQ ID NO：51的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：63个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：基因
(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：GGATCCCAAG GCCAGGCTAA AGCCGAAGCC GCGAAGGCCG AGGCTAAGGC CGAAGCAGAT    60CTG                                                                  63(2)SEQ ID NO：52的资料
(i)序列特征：
    (A)长度：20个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：无关
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：Asp Pro Lys Ala Glu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Ala1               5                   10                  15Glu Ala Asp Leu
        20

Claims (14)

1.一种蛋白质性质的膜结合嵌合受体，其含有细胞外部分，所述细胞外部分包含能特异性识别并结合被HIV感染的细胞但不介导HIV感染的CD4片段，该CD4片段至少包括SEQ ID NO：29的氨基酸1-200。
2.权利要求1的受体，其中所述CD4片段由SEQ ID NO：29的氨基酸1-200或氨基酸1-394组成。
3.权利要求1的受体，其中所述CD4片段通过图26所示CD7跨膜区或图25所示人IgG1分子的铰链区、CH2和CH3区而与细胞内的部分分开。
4.权利要求1的受体，其中所述CD4片段与宿主细胞膜相距至少48埃或至少72埃。
5.权利要求1的受体，其中所述受体包含CD7跨膜部分、CD5跨膜部分或CD34跨膜部分。
6.权利要求1的受体，其中用一或多个蛋白质α螺旋将所述CD4片段与宿主细胞膜分开。
7.一种DNA，其编码权利要求1-6中任一项所述的受体。
8.一种载体，其含有权利要求7的DNA。
9.一种细胞，其表达权利要求1-6中任一项所述的受体。
10.权利要求9的细胞，其中所述细胞是造血细胞系统的细胞。
11.权利要求10的细胞，其中所述细胞选自T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞或滤泡树突状细胞。
12.权利要求11的细胞，其中所述细胞是细胞毒T淋巴细胞。
13.权利要求9-11中任一项所限定的细胞在制备用于治疗哺乳动物HIV感染的药物组合物中的应用。
14.一种治疗哺乳动物HIV感染的药物组合物，其包含有效量的如权利要求9-11任一项所限定的细胞以及可药用的载体。
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