FI119868B - CD4-houkutusreseptoreita ilmentävien solujen käyttö - Google Patents

Description

CD4-houkufcusreseptoreita ilmentävien solujen käyttö Keksinnön aihepiiri Tämä keksintö koskee sellaisten terapeuttisten so-5 lujen käyttöä, jotka ilmentävät reseptoreja, jotka sisältävät CD4-fragmentteja, jotka sitovat HIV:ta, mutta jotka eivät tee isäntäsaluista alttiita HIV-infektiolle. Keksintö tarjoaa siten uuden ja tehokkaan hoidon HIV:lie.

Keksinnön tausta 10 T-solureseptorien välittämä antigeenin tunnistus T-soluissa on perusta sarjalle immunologisia ilmiöitä. T-solut ohjaavat soluvälitteiseksi immuniteetiksi kutsuttua tapahtumaa. Se sisältää immuunijärjestelmän solujen aikaansaaman vieraiden kudosten tai infektoitujen solujen tuhoa-15 misen. On olemassa erilaisia T-soluja, joihin kuuluvat ''auttaja"- ja " suppressor!"-solut, jotka moduloivat immuunivastetta, ja sytotoksiset {tai "tappaja"-solut), jotka voivat suoraan tappaa epänormaalit solut.

Toisen solun pinnalla esiteltävän ainutlaatuisen 20 antigeenin tunnistava ja sitova T-solu aktivoituu; se voi sen jälkeen lisääntyä, ja jos se on sytotoksinen solu, se • · · * voi tappaa sitoutuneen solun.

• · · ’· “ HIV ja isranunopatogeiieesi • · · ···· Vuonna 1984 HlV:n osoitettiin olevan AIDS: in etio- • · · *...* 25 loginen aiheuttaja. Tämän ajankohdan jälkeen AIDS:in määri- • ’·· telmää on tarkistettu useita kertoja sen suhteen, mitä kri- : teerejä tulisi sisällyttää diagnoosiin. Kuitenkin huolimat ta diagnostisten parametrien vaihtelusta, AIDS:in yksinker- ;V; täinen yhteinen nimittäjä on HIV-infektio ja sitä seuraava • · .···. 30 pysyvien perusoireiden ja AIDS:ia määrittelevien sairauksi- • · / < en, kuten sekundääristen infektioiden, neoplasmien ja neu- • · · *· ”· rologisen sairauden kehittyminen. Harrison's Principles of ’**’· Internal Medicine, 12. painos McGraw Hill (1991).

HIV on lentivirusryhmään kuuluva ihmisen retrovi- • · ....: 35 rus. Neljä tunnistettua ihmisen retrovirus ta kuuluvat kah- • · teen eri ryhmään: ihmisen T-Iymfotrooppiset (tai leukemia-) 2 retrovirukset, HTLV-1 ja HTLV-2 ja ihmisen immuunikatovirukset , Hiv-l ja HIV-2. Edelliset ovat transformoivia viruksia, kun taas jälkimmäiset ovat sytopaattisia viruksia, HIV-1 on tunnistettu yleisimmäksi AIDS:in aiheutta-5 jaksi koko maailmassa. Sekvenssihomologia HlV-2:n ja HIV-l:n välillä on noin 40 %; näistä HIV-2 on läheisemmin sukua joillekin apinoiden immuunikatoviruksille (SIV). Katso Curran et ai, Science 329: 1357 - 1359 (1985); Weiss et ai, Nature 324: 572 - 575 (1986).

10 HIV:llä on tavalliset retrovirusgeenit (env, gag ja pol) , samoin kuin kuusi ylimääräistä geeniä, jotka liittyvät viruksen replikaatioon ja muihin biologisiin toimintoihin. Kuten aikaisemmin on tähdennetty, AIDS:in yleinen nimittäjä on huomattava immunosuppressio, pääasiassa soluva- 15 litteisen immuniteetin suppressio. Tämä immunosuppressio johtaa joukkoon opportunistisia sairauksia, erityisesti tiettyjä infektioita ja neoplasmeja.

Pääsyyksi immuunipuutokseen AIDS:issa on tunnistettu kvantitatiivinen ja kvalitatiivinen puutos kateenkorvas- 20 ta peräisin olevien (T) lymfosyyttien, T4-populaation osa- . ^ joukossa. Tätä solujen osajoukkoa määrittelee fenotyyppi- **. sesti CD4-pintamolekyylin läsnäolo; CD4-pintamolekyylin on • · · *· " osoitettu olevan solureseptori HIV:lie. Dalgleish et ai.,

Nature 312: 763 (1984). Vaikka T4-solu on pääasiallisin so- ··· 25 lutyyppi, jota HIV infektoi, olennaisesti mikä tahansa ih- ♦ · • *·· missolu, joka ilmentää CD4-molekyyliä pinnallaan, voi si~ : : : toutua HIV:iin ja tulla HIV:n infektoimaksi.

Perinteisesti CD4+-T-soluille on annettu auttajan/ indusoi jän rooli, mikä osoittaa niiden toimintaa aktivoivan • · .···. 30 signaalin antajina B-soluille, tai T-lymfosyyttien indusoi- • · #· # jina, kun T-lymfosyyteillä on vastaava CD8-merkki, jotta ne • · · '· '· tulevat sytotoksisiksi/suppressorisoluiksi. Reinherz ja ’* ** Schlossman, Cell 19: 821 - 827 (1980); Goldstein et ai, Im- munol. Rev. 68: 5 - 42 (1982).

• · 35 HIV sitoutuu erityisesti ja suurella affiniteetilla • · viruksen vaipassa olevan aminohappojuosteen välityksellä 3 (gpl20) CD4~moiekyylin Vl-alueen osaan, joka sijaitsee sen N-pään lähellä. Sitoutumisen jälkeen virus fuusioituu kohdesolun membraanin kanssa ja se otetaan sisälle soluun. Kun virus on otettu solun sisälle, se käyttää entsyy-5 miä käänteistranskriptaasi-transkriptoimaan sen genomisen RNA:n DNA:ksi, joka integroituu solun DNArhan, jossa se säilyy solun eliniän “esiviruksena".

Esivirus voi säilyä latenttina tai aktivoitua tran-skriptoimaan mRNA:ta ja genomista ENA: ta, mikä johtaa pro-10 teiinisynteesiin, kokoamiseen, uuteen virioninmuodostukseen ja viruksen silmikoitumiseen solun pinnalta. Vaikka täsmällistä mekanismia, jolla virus indusoi solun kuoleman, ei ole vahvistettu, uskotaan, että pääasiallinen mekanismi on viruksen massiivinen silmikoituminen solun pinnasta, mikä 15 johtaa plasmamembraanin hajoamiseen ja siitä seuraavaan osmoottiseen epätasapainoon.

Infektion kulun aikana isäntäorganismi kehittää vasta-aineita virusproteiineja vastaan; näihin kuuluvat vaipan tärkeimmät glykoproteiinit gpl20 ja gp41. Tästä hu-20 moraalisesta immuniteetista huolimatta sairaus etenee joh- . taen letaaliin iminunosuppressioon, jota luonnehtivat monet • · · ! *. opportunistiset infektiot, parasitemia, dementia ja kuole- • · · *· / ma. Isännän virustenvastaisten vasta-aineiden epäonnistumi- • · · ···! nen sairauden etenemisen pysäyttämisessä edustaa erästä • · · 25 kaikkein piinaavimmista ja hälyttävimmistä infektion näkö- • · • *·· kohdista ja on huonona enteenä rokotusyrityksille, jotka perustuvat tavanomaisiin lähestymistapoihin.

Kahdella tekijällä voi olla vaikutusta humoraalisen .*.*· vasteen tehokkuuteen immuunikatoviruksia vastaan. Ensinnä- • · · • · .···. 30 kin, kuten muut RNA-virukset (ja kuten erityisesti retrovi- • · *·* rukset), immuunikatovirukset osoittavat korkeaa mutaatiota- • · • · · *· *J soa vasteena isännän immuuni valvonnalle. Toiseksi vaipan *·**· glykoproteiinit ovat itse voimakkaasti glykosyloituneita molekyylejä, joilla on vähän epitooppeja, jotka sopivat • · 35 vasta-aineen sitoutumiseen suurella affiniteetilla. Huonos- • · ti antigeeninen kohde, jollaista virusvaippa edustaa, antaa 4 isännälle vähän mahdollisuuksia rajoittaa virusinfektiota spesifisen vasta-ainetuotannon avulla.

HIV-viruksen infektoimat solut ilmentävät gpl20-glykoproteiinia solupinnoillaan. Gpl20 välittää fuusiota-5 pahtumia CD44-solujen välillä reaktiolla, joka on samanlainen kuin se, jolla virus saapuu infektoitumattorniin soluihin, mikä johtaa lyhytikäisten monitumaisten jättisolujen muodostumiseen. Solusitkosten muodostuminen riippuu gpl20 vaippaproteiinin suorasta vuorovaikutuksesta CD4-proteiinin 10 kanssa. Dalgleish et ai, supra; Klatzman et ai, Nature 312: 763 (1984); McDougal et ai, Science 231: 382 (1986);

Sodroski et ai, Nature 322: 470 (1986); Lifson et ai, Nature 323: 725 (1986).

Todiste siitä, että CD4-gpl20-sitoutuminen vastaa 15 CD4-antigeeniä kantavien solujen virusinfektiosta, sisältää sen havainnon, että gpl20:n ja CD4:n välille muodostuu spesifinen kompleksi (McDougal et ai, supra). Toiset tutkijat ovat osoittaneet, että solulinjat, jotka eivät olleet in-fektoitavissa HIV:llä, muuttuivat infektoitaviksi soluiksi 20 ihmisen CD4-cDNA-geenin transfektion ja ilmentämisen jäl-keen. Maddon et ai, Cell 46: 333 - 348 (1986) .

• · ·

Terapeuttisia ohjelmia, jotka perustuvat liukoiseen • ·· * .* CD4:ään passiivisena aineena, häiritsemään viruksen adsorp- • · · *·" tiota ja solusitkosten välittämää solujen transmissiota, • ♦ 25 ovat esittäneet ja menestyksekkäästi osoittaneet in vitro • · _ T . , |---- :’·· monet ryhmät (Deen et ai, Nature 331: 82 - 84 (1988); · Fisher et ai, Nature 331: 76 - 78 (1988); Hussey et ai, Na ture 331: 78 - 81 (1988); Smith et ai, Science 238: 1704 -1707 (1987); Traunecker et ai. Nature 331: 84 - 86 (1988), • · .·**. 30 ja sen jälkeen on kehitetty CD4-immunoglobuliini- ··· .· . fuusioproteiineja, joiden puoliintumisajat ovat pidentyneet • · · ja joilla on vaatimatonta biologista aktiivisuutta [Capon et ai, Nature 339: 68 - 70 (1989); Byrn et ai, Nature 344: 667 - 670 (1990); Zettlmeissl et ai, DNA Cell Biol. 9: 347 • · ....: 35 - 353 (1990)]. Vaikka CD4-immunotoksiinikonjugaatit tai fuusioproteiinit osoittavat tehokasta sytotoksisuutta in- 5 fektoituja soluja vastaan in vitro [Chaudhary et ai, Nature 335: 359 - 372 (1988); Till et ai, Science 242: 1166 - 1168 (1988)], immuunikato-oireyhtymän latenttisuus tekee epätodennäköiseksi, että mikään yksittäishoito olisi tehokas 5 poistamaan viruskuormitusta, ja vieraiden fuusioproteiinien antigeenisyys todennäköisesti rajoittaa niiden siedettävyyttä hoidoissa, jotka vaativat toistuvia annoksia. Kokeet SIV:n vaivaamilla apinoilla ovat osoittaneet, että liukoinen CD4 annettuna eläimille ilman merkittävää CD4-10 sytopeniaa, voi pienentää SIV:n tiitteriä ja parantaa mye-loidista potentiaalia rwatanabe et ai, Nature 337: 267 - 270 (1989)3. Havaittiin kuitenkin viruksen pikainen ilmeneminen uudelleen hoidon lopettamisen jälkeen, mikä antaa olettaa, että olisi välttämätöntä antaa hoitoa koko elämän 15 ajan, jotta estettäisiin immuunijärjestelmän etenevä heikkeneminen .

T-solu- ja Fc-reseptorit T-solun antigeenireseptorin (TCR) runsaimman muodon ilmentäminen solun pinnalla edellyttää vähintään kuuden eri 20 polypeptidiketjun ilmentämistä samanaikaisesti [Weiss et ai, J. Exp, Med. 160: 1284 - 1299 (1984) ; Orloffhashi et • · · ,·/· ai, Nature 316: 606 - 609 (1985); Berkhout et ai, J. Biol.

.* Chem. 263: 8528 - 8536 (1988); Sussman et ai, Cell 52: 85 ~ • · · **** 95 (1988)], α/S-antigeenin sitovien juosteiden, CD3- • · ]···*' 25 kompleksin kolmen polypeptidin ja ζ:η. Jos mikään ketjuista • · • ’* puuttuu, kompleksin jäljellä olevien jäsenten stabiilia il- • · · V : rientämistä ei tapahdu, ζ on rajoittava polypeptidi koko kompleksin pinta-ilmentämiselle [Sussman et ai, Cell 52: 85 ίφϊφί - 95 (1988)] ja sen ajatellaan välittävän vähintään osaa 30 solun aktivaatio-ohjelmista, jotka reseptorin ligandintun- ··· .* . nistus laukaisee [Weissman et ai, EMBO J. 8:3651 - 3656 • · · ** Ί (1989), Frank et ai, Science 249:174 - 177 (1990)]. 32 *. * kDa:n tyypin I integraalisella kalvohomodimeerillä ζ (zeta) ϊφϊφ: on 9 jäännöksen ekstrasellulaarinen domeeni, jossa ei ole •f: 3 5 kohtia N-sidotun glykaanin lisäämiselle, ja 112 jäännöksen (hiiri) tai 113 jäännöksen (ihminen) intraseilulaarinen do- 6 meeni [Weissman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709 -9713 (1988)]. ζ:η isoformi, jota kutsutaan rpksi (eta), [Baniyash et al, J. Biol. Chem. 263:9874 - 9878 (1988); Or-loff et al, J. Biol. Chern. 264: 14812 - 14817 (1989)], joka 5 saa alkunsa vuorottaisesta mRNA:n pilkkoutumisreitistä [Jin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319 - 3233 (1990)3, on läsnä vähentyneinä määrinä soluissa, jotka ilmentävät antigeenireseptoria. ζ-η-heterodimeerien ajatellaan välittävän inositolifosfaattien muodostumista, samoin kuin re-10 septorivälitteistä ohjelmoitua solujen kuolemaa, jota sanotaan apoptoosiksi [Mercep et al, Science 246: 1162 - 1165 (1989)] .

Kuten ζ ja η, FC-reseptoriin liittyvä γ (gamma) -ketju ilmentyy solun pintakomplekseilla muiden polypepti-15 dien kanssa, joista jotkin välittävät ligandin tunnistusta, ja joista toisilla on määrittelemätön funktio. y:llä on ho-modimeerinen rakenne ja kokonaisorganisaatio, joka on hyvin samanlainen kuin £:lla, ja se on komponentti sekä suuren affiniteetin syöttösolu/basofiili-IgE-reseptorissa, Fct- 20 Rl:ssä, joka koostuu vähintään kolmesta erillisestä poly- · peptidiketjusta [Blank et al, Nature 241: 752 - 754 • · · * *. (1989)], ja yhdessä matalan affiniteetin reseptoreista • · · '· ” IgG:lle; näitä reseptoreja edustaa hiirissä FcyRIla [Ra et ··« al, J„ Biol. Chem. 264:15323 - 15327 (1989)], ja ihmisissä 25 CDl6-alatyypin ilmentäminen makrofageissa ja luonnollisissa « · • *·· tappajasoluissa CD16tm (CDlS-transmembraani-) [Lanier et al, Nature 342: 803 - 805 (1989); Anderson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274 - 2278 (1990)], ja yhdessä po-lypeptidin kanssa, jonka toimintaa ei tunneta [Anderson et 30 al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274 - 2278 (1990)]. Vä- • · / # hän aikaa sitten on raportoitu, että γ ilmentyy hiiren T- • · · *· solulinjassa, CTL, jossa se muodostaa homodimeerejä, samoin •** kuin γ-ζ ja γ-η -heterodimeerejä [Orloff et al, Nature 347: 189 - 191 (1990)] .

• · · \ · j 35 Fc-resepfcorit välittäväc immuuni kompleksien fagosy- toosia, transsytoosia ja vasta-aineista riippuvaista solu- 7 sytotoksisuutta (ADCC) [Ravetch ja Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457 - 492 (1991); Unkeless et ai, Annu. Rev. Immunol. 6; 251 - 281 (1988); ja Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1: 16 - 25 (1988)]. Vähän aikaa sitten on osoitettu, että 5 yksi hiiren matalan affiniteetin Fc-reseptori-isoformeista, FcRylliBl, välittää Ig-päällystettyjen kohteiden interna-lisointia klatriinipäällysteisiin kuoppiin, ja että toinen matalan affiniteetin reseptori, FcRylllA, välittää ADCC:ta liittymisensä avulla yhden tai useamman jäsenen pienestä 10 "liipaisinmolekyylien" perheestä kanssa [Miettinen et ai, Cell 58: 317 - 327 (1989); ja Hunziker ja Mellman, J. Cell. Biol. 109: 3291 - 3302 (1989)]. Nämä liipaisinmolekyylit, T-solureseptorin (TCR) ζ-ketju, TCR:n η-ketju ja Fc-reseptorin y-ketju ovat vuorovaikutuksessa immuunijärjes-15 telmän eri reseptorien ligandin tunnistusdomeenien kanssa, ja ne voivat aloittaa itsenäisesti solun efektoriohjelmat, mukaan luettuna sytolyysi, aggregaation jälkeen [Samuelson et ai, Cell 43: 223 - 231 (1985); Weissman et ai, Science 239:1018 - 1020 (1988); Jin et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. 20 USA 87: 3319 - 3323 (1990); Blank et ai, Nature 337: 187 -t.#.t 189 (1989); Lanier et ai, Nature 342: 803 - 805 (1989); Ku- l *. rosaki ja Ravetch, Nature 342: 805 - 807 (1989); Hibbs et • · · *· / ai, Science 246: 1608 - 1611 (1989); Anderson et ai, Proc,

Natl. Acad. Sei. USA 87:2274 - 2278 (1990); sekä Irving ja 25 Weiss, Cell 64: 891 - 901 (1991)].

*· : *·· Kun vedetään yhtymäkohtia hiiren ja ihmisen matalan • · · V ί affiniteetin Fe-reseptoriperheiden välille, on kuitenkin tullut selväksi, ettei ihmisen FcRyllA- ja C-isoformeilla ;V: ole vastinetta hiirissä. Osittain tämän vuoksi niiden toi- • » .*·*. 30 mintaa ei ole vielä selvitetty.

/ . Koska yksin CD4:ään perustuvien humoraalisten teki- • · · *· ’· joiden käyttö voi olla rajallista in vivo, aikaisemmat tut- * * kimukset kartoittivat mahdollisuutta lisätä solujen immuni- teettia HlV:tä vastaan. On tunnistettu proteiinikimeerival- • · 35 misteita, joissa CD4:n ekstrasellulaarinen domeeni on fuusioituna T-solureseptorin, lgG:n Fc-reseptorin tai B- 8 solureseptorin signaalinvälityselementtien t ransmeinbr aan i-ja/tai intrasellulaarisiin domeeneihin, (U.S.S.N. 07/847 566 ja 07/665 961, jotka sisällytetään täten kirjallisuusviitteiksi) . Sytolyyttiset T-solut, jotka ilmentävät kimee-5 rejä, joihin sisältyy ekstrasellulaarinen CD4~domeeni, osoittavat tehokkaasti tuhoavansa MHC-.stä riippumattomasti solukohteita, jotka ilmentävät HIV:n vaippaproteiineja. Äärimmäisen tärkeä ja uusi tämän lähestymistavan osa on ollut tunnistaa yksittäisiä T-solureseptori-, Fc-reseptori- ja ΒΙΟ solureseptoriketjuja, joiden aggregaatio riittää aloittamaan soluvasteen. Eräs tämän lähestymistavan erityisen hyödyllinen sovellutus on ollut keksintö CD4:n ja ζ:η, η:η ja γ:η välisistä kimeereistä, jotka ohjaavat sytolyyttisiä T-lymfosvyttejä tunnistamaan ja tappamaan HIV gpl20:ta ilmen-15 täviä soluja {U.S.S.N. 07/847 566 ja 07/665 961, jotka sisällytetään täten kirjallisuusviitteiksi).

Keksinnön yhteenveto

Yleisesti ottaen tämä keksintö koskee terapeuttisten solujen käyttöä nisäkkään HIV:n hoitoon tarkoitettujen 20 aineiden valmistamiseksi. Tarkemmin määriteltynä tämä kek-sintö koskee patenttivaatimuksen 1 mukaisten terapeuttisten • · « I *. solujen käyttöä.

• · · * ,* CD4-fragmentti on aminohapot 1 - 394 CD4:stä tai • · · •••j aminohapot 1 - 200 CD4:stä, Edullisten suoritusmuotojen mu- • · *···* 25 kaisesti CD4-fragment ti erotetaan intrasellulaarisesta ·· ϊ ** osasta CD7-transmembraanidomeenilla, joka on esitetty kuvi- ··♦ \J Σ ossa 26, tai ihmisen IgGl-molekyylin sarana-, CH2- ja CD3- domeenilla, jotka on esitetty kuviossa 25 ja CD4-fragmentti on erotettu terapeuttisesta solusta vähintään 48:11a äng- • · ·'**; 30 strömillä (ja edullisesti vähintään 72:11a ängs tr omilla) .

··· .* . Edullisissa suoritusmuodoissa intrasellulaarinen osa on • · t ** *| signaalia välittävä osa T-solureseptoriproteiinista (esi merkiksi ζ), B-solureseptoriproteiinista tai Fc-resepcoriproteiinista, ja terapeuttiset solut valitaan ryh-35 mästä, johon kuuluvat: (a) T-lymfosyytit, (b) sytotoksiset T-lymfosyytit, (c) luonnolliset tappajasolut, (d) neutro- 9 fiilit, (e) granulosyytit, (f) makrofagit, (g) syöttösolut, (h} HeLa-solut ja (i) sikiön kantasolut (embryonic stem cells, ES).

5 Vaikka tämän keksinnön spesifinen suoritusmuoto on CD4:n ja zetan välinen kimeeri, mitä tahansa reseptoriket-jua, jolla on samanlainen funktio kuin näillä molekyyleillä, esim. granulosyyteissä tai B-lymfosyyteissä, voidaan käyttää tässä esitettyihin tarkoituksiin. Halutulle im-10 muunisolun liipaisinmolekyylille on ominaista kyky ilmentyä autonomisesti (ts. yhtenä juosteena), kyky fuusioitua ekst-rasellulaariseen CD4-domeeniin niin, että saatu kimeeri on läsnä terapeuttisen solun pinnalla, ja kyky aloittaa solun efektoriohjelmat aggregaation jälkeen, kohtaamisen jälkeen 15 kohdeligandin kanssa.

Tällä hetkellä käyttökelpoisin menetelmä kimeerien viemiseksi immuunijärjestelmän soluihin on jonkinlaisen geneettisen hoidon avulla. Immuunijärjestelmän solujen uudel-leenmuodostaminen kimeeristen reseptorien kanssa sekoitta-20 maila solut sopivalla tavalla liukoiseksi tehdyn, puhdiste-tun kimeerisen proteiinin kanssa johtaisi muunnetun solupo- • · · #·#*. pulaation muodostumiseen, joka kykenisi reagoimaan HIV:n • ·· infektoimiin kohteisiin. Samanlaisia sovellutuksia on käy-··· * tetty esimerkiksi viemään CD4-molekyyli erytrosyytteihin • · [···* 2 5 terapeuttisia tarkoituksia varten. Tässä tapauksessa muun- • · i ** nettu solupopulaatio ei olisi kykenevä uudistumaan itse.

• · · • · · • · · Nämä ja muut tämän keksinnön mukaiset ei- :Y: rajoittavat suoritusmuodot tulevat ilmeisiksi alan ammatti- • · 30 laisille seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauk- ·*· .* . sesta.

• · · * *| Seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa viita taan useisiin molekyylibiologian ja immunologian alojen am-:Y: mattilaisten tuntemiin metodologioihin. Julkaisut ja muu ·;··· 35 materiaali, jossa tuodaan esille tällaiset, tunnetut metodo logiat, joihin viitataan, sisällytetään tähän kirjallisuus- 10 viitteiksi kokonaisuudessaan, ikään kuin ne olisi esitetty täydellisesti.

Perusviitteisiin, joissa kuvataan yleiset rekombi-nantti-DNA-teknologian periaatteet, kuuluvat Watson et ai, 5 Molecular Biology of the Gene, osat I ja II, julkaissut the Benjämin/Cummings Publishing Company, Inc, Menlo Park, CA (1987); Darnell et ai, Molecular Cell Biology, julkaissut Scientific American Books, Inc, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, julkaissut John Wiley & Sons, New York, 10 N.Y. (1985); Old et al, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, toinen painos, julkaissut University of California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, toinen painos, julkaissut Cold Spring Harbor Labo-15 ratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; ja Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989) .

Määritelmät "Kloonauksella" tarkoitetaan in vitro 20 rekombinaatiotekniikoiden käyttöä tietyn geenin tai muun . . DNA-sekvenssin liittämiseksi vektorimolekyyliin.

• · · *;’*) "cDNA:lla" tarkoitetaan komplementaarista tai ko- • · · *· “ pio-DNA:ta, joka tuotetaan RNA-templaatista RNA:sta riippu- vaisen DNA-polymeraasin toiminnalla (käänteistranskriptaa- • · · ·...·' 25 si) . Näin ollen " cDNA-klooniM tarkoittaa dupleksi-DNA- • · : *·· sekvenssiä, joka on komplementaarinen kiinnostuksen kohtee- :*:’: na olevalle BNA-molekyylille, ja joka sisältyy kloonausvek- toriin.

"cDNA-kirjastolla" tarkoitetaan rekombinantti-DNA- • · .···. 30 molekyylien kokoelmaa, joka sisältää cDNA-inserttejä, jotka • · ]·* käsittävät mBNÄ:n DNA-kopioita, jotka ovat solun ilmentämiä *· *: sinä ajankohtana, kun cDNA.-kirjasto tehtiin. Tällainen ***** cDNA-kirjasto voidaan valmistaa menetelmillä, jotka ovat alan ammattilaisten tuntemia, ja menetelmiä kuvataan esi- • · · • · 35 merkiksi lähteessä Ausubel et al, supra sekä Maniatis et • · ------- al, supra. Yleisesti esitettynä RNA eristetään ensin sen 11 organismin soluista, jonka genomista tietty geeni halutaan kloonata. Edullisia tämän keksinnön tarkoitusta varten ovat nisäkkään, ja erityisesti ihmisen, lymfosyyttisolulinjat, Tällä hetkellä edullinen vektori tähän tarkoitukseen on 5 vaccinia-viruksen WR-kanta.

"Vektorilla” tarkoitetaan DNA-molekyyliä, joka on johdettu esim. plasmidista, bakteriofagista tai nisäkkään tai hyönteisen viruksesta, ja johon DNA-fragmentit voidaan liittää tai kloonata. Vektori sisältää yhden tai useamman 10 ainoan laatuaan olevan restriktiokohdan, ja se voi olla kykenevä autonomiseen areplikaatioon määrätyssä isännässä tai kantajaorganismissa niin, että kloonattu sekvenssi on tuotettavissa uudelleen. Näin ollen ”DNA:n ilmentämisvektoril-laM tarkoitetaan mitä tahansa autonomista elementtiä, joka 15 kykenee ohjaamaan rekombinanttipeptidin synteesiä. Tällai siin DNA:n ilmentämisvektoreihin kuuluvat bakteeriplasmidit ja faagit ja nisäkäs- ja hyönteisplasmidit ja virukset.

"Olennaisesti puhtaalla" tarkoitetaan yhdistettä, esim. proteiinia, polypeptidiä tai vasta-ainetta, joka on 20 olennaisesti vapaa osista, joiden kanssa se on luonnossa ..... yhdessä. Yleisesti ottaen yhdiste on olennaisesti puhdas, • · · l *. kun vähintään 60 %, edullisemmin vähintään 75 % ja edulli- • · * * .* sirnmin vähintään 90 %, näytteen kokonaismateriaalista on • · · ···· .kiinnostuksen kohteena olevaa yhdistettä. Puhtaus voidaan • · 25 määrittää millä tahansa sopivalla menetelmällä, esim. pyi- • · : *·* väskromatografiällä, polyakryyliamidigeelielektroforeesilla • · · V * tai HPLC-analyysillä. Nukleiinihappojen yhteydessä "olen naisesti puhdas" tarkoittaa nukleiinihapposekvenssiä, seg-menttiä tai fragmenttia, joka ei ole välittömästi kummankin • · .*··. 3 0 koodittavan sekvenssin vieressä (ts. kovalenttisesti sidot- • · • · · .· . tuna niihin), joiden vieressä se on välittömästi (ts. yksi • · · *· *: 5‘-päässä ja toinen 3’-päässä) organismin luonnossa esiin- * * tyvässä genomissa, josta keksinnön mukainen DNA on johdet- tu.

• » 35 Molekyylin "fragmentilla" tarkoitetaan viitata mi hin tahansa molekyylin läheiseen nukleotidiosajoukkoon. Mo- 12 lekyylin "analogilla" tarkoitetaan viitata luonnossa esiintymättömään molekyyliin, joka on olennaisesti samanlainen kuin koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyylin sanotaan olevan "olennaisesti samanlainen" toisen molekyylin kanssa, 5 jos aminohapposekvenssi kummassakin molekyylissä on olennaisesti sama. Erityisesti "olennaisesti samanlainen" aminohapposekvenssi on sellainen, jonka aminohapposekvenssi on vähintään 50-prosenttisesti, edullisesti 85-prosenttisesti ja edullisimmin 95-prosenttisesti, sama kuin luonnollinen 10 tai vertailusekvenssi ja/tai sellainen, joka eroaa luonnollisesta tai vertailuaminohapposekvenssistä ainoastaan konservatiivisilla aminohapposubstituutioilla. Olennaisesti samanlaisella aminohapposekvenssillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Tässä käytettynä molekyylin sanotaan 15 olevan toisen molekyylin "kemiallinen johdannainen", kun se sisältää kemiallisia osia, jotka eivät normaalisti ole osa molekyyliä. Tällaiset osat voivat parantaa molekyylin liukoisuutta, absorptiota, biologista puoliintumisaikaa jne. Osat voivat vaihtoehtoisesti vähentää molekyylin toksisuut-20 ta, eliminoida tai heikentää mitä tahansa ei-toivottavaa molekyylin sivuvaikutusta jne. Osia, jotka kykenevät välit- • · · I tämään tällaisia vaikutuksia, on kuvattu esimerkiksi kir- • · · • · · * .* jassa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. painos, Mack • · · •••j Publishing Co, Easton PA (1980) .

• · ’···" 25 Reseptori-kimeerigeenin "toiminnallisen johdannai- • · : ** sen" tarkoitetaan sisältävän geenin "fragmentit" tai "ana- • ·· V: logit", jotka ovat "olennaisesti samanlaiset" nukleotidise- kvenssiltään, "Olennaisesti samanlaiset" nukleiinihapot koodattavat olennaisesti samanlaisia aminohapposekvenssejä • · :***: 30 (kuten edellä on määritelty), ja voivat myös sisältää minkä ··· .* . tahansa nukleiinihapposekvenssin, joka kykenee hybridisoi- • · · * Ί tumaan luonnolliseen tai vertailunukleiinihapposekvenssiin sopivissa hybridisaatio-olosuhteissa (katso esimerkiksi kirjasta Ausubel et ai., Current Protocols in Molecular • · ·;··· 35 Biology, Wiley Press, Mew York, NY (1989) oikeita hybridi- saation ankaruuden olosuhteita.) 13 "Olennaisesti samanlaisella" kimeerisellä reseptorilla on samanlaista aktiivisuutta kuin "villityyppisellä" T-solu-, B-solu- tai Fc-reseptorikimeerillä. Edullisimmin johdannaisella on 90 %, edullisemmin 70 % ja edullisesti 40 5 %, villi tyyppisen reseptorikimeerin aktiivisuudesta. Toi minnallisen kimeerisen reseptorijohdannaisen aktiivisuuteen kuuluu spesifinen sitoutuminen (sen ekstrasellulaarisella CD4-osalla) HIV:n infektoimaan soluun, ja sen seurauksena sen solun tuhoutuminen; lisäksi kimeerinen reseptori ei tee 10 reseptorin sisältävää solua alttiiksi HIV-infektiolle. Ki-meeristä reseptoriaktiivisuutta voidaan testata käyttämällä esim. mitä tahansa tässä kuvattua analyysiä.

CD4-reseptorikimeeriä koodittava DNA-sekvenssi tai sen toiminnalliset johdannaiset voidaan yhdistää uudelleen 15 vektori--DNA;n kanssa tavanomaisten tekniikoiden mukaisesti, mukaan luettuna tylppäpäiset tai porraspäiset päät ligaa-tiota varten, pilkkominen restriktioentsyymillä, jotta tarjotaan sopivat päät, kohesiivisten päiden täyttäminen sopivalla tavalla, käsittely alkalisella fosfataasilla, jotta 20 vältetään ei-toivottavaa liittymistä, ja ligaatio sopivilla ligaaseilia. Tekniikoita tällaisille manipulaatioille on t · · kuvattu kirjassa Maniatis et ai., supra, ja ne ovat alalla • ♦· * .* hyvin tunnettuja.

··· ***j Nukleiinihappomolekyylin, kuten DNA: n, sanotaan • · *···* 25 olevan "kykenevä ilmentämään" polypeptidiä, jos se sisältää • · : ** nukleotidisekvenssit, jotka sisältävät transkription ja • · · *.· · translaation säätelyinformaation, ja jos tällaiset sekvens sit ovat "toimivasti liitetyt" nukleotidisekvensseihin, :V: jotka koodittavat polypeptidiä. Toimiva liitos on liitos, • · :***: 30 jossa säately-DNA-sekvenssit ja ilmennettäväksi aiotut DNA- • · « .* . sekvenssit on yhdistetty sillä tavalla, että geeniekspres- • · · *· *j sio mahdollistuu, Geeniekspressiota varten tarvittavien säätelyalueiden tarkka luonne voi vaihdella organismista organismiin, mutta ne sisältävät yleensä promoottorialueen • · ·;··· 35 (joka ohjaa RNA:n transkription aloitusta) , samoin kuin DNA-sekvenssit, jotka RNArksi transkriptoituna antavat sig- 14 naalin proteiinisynteesin aloittamiselle. Tällaiset alueet sisältävät normaalisti ne 5'-ei-koodittavat alueet, jotka osallistuvat transkription ja translaation aloitukseen, kuten TATA-box, capping-sekvenssi, CAAT-sekvenssi ynnä muut.

5 Jos halutaan, proteiinia koodittavan geenisekvens sin 31-suunnassa oleva ei-koodittava alue voidaan saada edellä kuvatuilla menetelmillä. Tämä alue voidaan ottaa käyttöön sen transkription lopetuksen säätelysekvenssien vuoksi, kuten terminaation ja polyadenylaation. Näin ollen 10 säilyttämällä 3'-alue, joka on luonnollisesti jatkuva proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin kanssa, voidaan tarjota käyttöön transkription lopetussignaalit. Kun transkription lopetussignaalit eivät toimi tyydyttävästi ilmentämisisän-täsolussa, voidaan se korvata 3'-alueella, joka toimii 15 isäntäsolussa.

Kahden DNA-sekvenssin (kuten promoottorialuese- kvenssin ja CD4-reseptorikimeeriä koodittavan sekvenssin) sanotaan olevan toiminnallisesti liitettyjä, jos kahden DNA-sekvenssin välisen liitoksen luonne ei (1) johda luku-20 kehysmutaatioon, (2) häiritse promoottorialuesekvenssin kv-kyä ohjata reseptorikimeerigeenisekvenssin transkriptiota • · · .·. ; tai (3) häiritse reseptorikimeerigeenisekvenssin kykyä tul- • ·· la transkriptoiduksi promoottorialuesekvenssin avulla. Pro- • · · **** moottorialue on toiminnallisesti liitetty DNA-sekvenssiin, • · 25 jos promoottori kykenee vaikuttamaan DNA-sekvenssin tran- • * • ** skriptioon. Näin ollen proteiinin ilmentämiseksi oikean • · · ·.* · isännän tunnistamat transkription ja translaation signaalit ovat välttämättömät.

CD4-reseptorikimeeriproteiinia (tai sen toiminnal- :***: 30 lista johdannaista) voidaan ilmentää joko prokaryoottisissä ··· .* . tai eukaryoottisissa soluissa, vaikka eukaryootti (ja eri- • · · *** cyisesti ihmisen lymfosyytti) -ilmentäminen on edullista.

Vasta-aineita voidaan valmistaa millä taliansa jou-kosta menetelmiä. Esimerkiksi CD4- • · ·:*·· 35 reseptorikimeeriproteiinia tai sen toiminnallista johdan naista ilmentävät solut voidan antaa eläimelle, jotta indu- 15 soidaan valmistumaan seerumia, joka sisältää polyklonaali-sia vasta-aineita, jotka kykenevät sitomaan kimeeriä.

Vasta-aineet ovat edullisesti monoklonaalisia vasta-aineita. Tällaiset monoklonaaliset vasta-aineet voidaan 5 valmistaa käyttäen hybridoomateknologiaa [Kohler et ai., Nature 256: 495 (1975); Kohler et ai., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976),- Kohler et ai., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et ai., kirjassa: Monoclonal Antibodies and Τ’-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., s. 563 - 684 (1981)].

10 Yleensä tällaisiin menetelmiin kuuluu eläimen immunisointi CD4-reseptorikimeeriantigeenillä. Tällaisen eläimen pernasolut uutetaan ja fuusioidaan sopivan myeloomasolulinjan kanssa. Mitä taliansa sopivaa myeloomasolulinjaa voidaan käyttää. Fuusion jälkeen saadut hybridoomasolut säilytetään 15 selektiivisesti HAT-kasvatusalustassa, ja kloonataan sitten rajoitetulla laimennuksella, kuten Wands et ai. ovat kuvanneet [Gastroenterology 80: 225 - 232 (1981)]. Tällaisen valinnan kautta saadut hybridoomasolut analysoidaan sitten, jotta tunnistetaan kloonit, jotka erittävät vasta-aineita, 20 jotka kykenevät sitomaan kimeerin.

vasta-aineet voivat myös olla polyklonaalisia tai • · · I *. edullisesti aluespesifisiä polyklonaalisia vasta-aineita.

• · · * CD4-reseptorikimeeriä vastaan suunnattuja vasta-• · · ··” aineita voidaan käyttää mittaamaan kimeerisen reseptorin • · *···* 25 määrää (tai kimeeristä reseptoria sisältävien solujen mää- • · : *·· rää) potilaassa. Tällaiset vasta-aineet soveltuvat hyvin • · · V · käytettäväksi alalla tunnetuissa norminmukaisissa immuno- diagnostiikkamäärityksissä, joihin kuuluvat sellaiset immu-nometriset tai "sandwich "-määritykset, kuten sandwich- • · .·*·. 30 määritys eteenpäin, käänteinen sandwich-määritys ja saman- • · · .· . aikainen sandwich-määritys. Vasta-aineita voidaan käyttää • · · *· *j kuinka monena tahansa yhdistelmänä, kuten alan ammattilai- * * set voivat määritellä ilman kohtuutonta tutkimusta, jotca saadaan aikaan immunoanalyysit, joiden spesifisyys, herk- • · ~~ 35 kyys ja tarkkuus on hyväksyttävä.

16

Vakioviitteisiin, joissa esitetään immunologian yleisiä periaatteita, kuuluvat Roitt, Essential Immunology, 6. painos, kustantaja Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2. pai-5 nos, kustantaja Macmillan Publishing Co., Mew York (1986); Roitt et al., Immunology, kustantaja Gower Medical Publishing Ltd., Lontoo (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", kirjassa Burdon et al., toim., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, osa 13, 10 kustantaja Elsevier, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, kustantaja John Wiley & Sons, Mew York (1982) ja Kennett et al., toim., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, kustantaja Plenum Press, New York (1980). 15 "Osoittamisen" tarkoitetaan sisältävän aineen ole massaolon tai puuttumisen määrittämisen tai aineen määrän määrittämisen. Määritelmällä viitataan siten materiaalien, koostumusten ja menetelmien käyttöön kvalitatiivisissa ja kvantitatiivisissa määrityksissä.

20 Vasta-aineet ja olennaisesti puhdistettu antigeeni sopivat ihanteellisesti pakkauksen (kit) valmistamiseen.

• · · • · .·, ; Tällainen pakkaus voi käsittää kantaaavälineen, jossa on • ·· *.* lokeroita, jotta saadaan pieneen tilaan yksi tai useampi ***· säilytysväline, kuten pullot, koeputket ynnä muut, jolloin • · ]···* 25 kukin mainituista säilytysvälineistä käsittää käytettävän • · • ** määrityksen eri elementit.

• · · *.* · Ne määritys tyypit, jotka voidaan sisällyttää pak kausmuotoon, ovat moninaiset, ja niihin kuuluvat esimerkik- • · si kompetitiiviset ja non-kompetitiiviset määritykset. Tyy-30 pillisiä esimerkkejä määrityksistä, joissa voidaan hyödyn- • · · / . tää vasta-aineita, ovat radioimrnunomääritykset (RIA) , ent- • · · * l syymi-immunomääritykset (EIA), entsyymiin liitetyt immu- ’ noadsorbenttimääritykset (ELISA) ja immunometriset, tai iti : sandwich-immunomääritykset.

·:*·· 35 Määritelmän " immunometrinen määritys" tai " sand wich-immunomääritys" tarkoitetaan sisältävän samanaikaiset 17 sandwich-, sandwich eteenpäin- ja käänteinen sandwich -immunomääritykset. Nämä määritelmät ovat alan ammattilaisten hyvin tuntemia. Alan ammattilaiset tietävät myös, että vasta-aineet ovat hyödyllisiä muissa määritysten variaati-5 oissa ja muodoissa, jotka ovat nykyisin tunnettuja, tai joita voidaan kehittää tulevaisuudessa. Määritelmällä "tunnistaa ja sitoo spesifisesti" tarkoitetaan, että vasta-aine tunnistaa ja sitoo kimeerisen reseptoripolypeptidin, mutta ei tunnista ja sido olennaisesti muita ei läheisiä 10 molekyylejä näytteessä, esim. biologisessa näytteessä.

Määritelmällä "terapeuttinen solu" tarkoitetaan solua, joka on transformoitu CD4-reseptorikimeerillä niin, että se kykenee tunnistamaan HIV:n infektoiman solun; tällaiset terapeuttiset solut ovat hematopoieettisen järjes-15 telmän soluja.

Määritelmällä "ekstrasellulaarinen" tarkoitetaan, että vähintään osa molekyylistä ulottuu solun pinnalle. Määritelmällä "intrasellulaarinen" tarkoitetaan, että vähintään osa molekyylistä ulottuu terapeuttisen solun syto-20 plasmaan. Määritelmällä "transmembraaninen” tarkoitetaan, että vähintään osa molekyylistä läpäisee plasmamembraanin.

• · · I\ Määritelmät "ekstrasellulaarinen osa", "intrasellulaarinen • · · * .* osa" ja "transmembraaninen osa" voivat tässä käytettynä si- ··· •••j sältää reunustavat aminohapposekvenssit, jotka ulottuvat « · *...* 25 viereisiin solun osastoihin.

·· : *·* Määritelmällä "oligomer iso idä" tarkoitetaan yhdis- ·♦· V * tymää muiden proteiinien kanssa, jotta muodostetaan dimee- rejä, trimeerejä, tetrameerejä tai muita suuremman kerta-luokan oligomeereja. Tällaiset oligomeerit voivat olla ho- • · .·**. 30 mo-oligomeereja tai hetero-oligomeereja. "Oligomerisoiva «·· / osa" on se alue molekyylistä, joka ohjaa kompleksin (ts.

♦ « · *· oligomeerin) muodostumista.

* * "Svtolyyttisellä" tarkoitetaan kykyä tuhota solu (esim. HIV-.n infektoima solu) tai kykyä tuhota infektoiva • · 35 aine (esim. HIV-virus) .

• · 18 Määritelmällä "immuunikatovirus" tarkoitetaan retrovirus ta, joka villityyppisessä muodossaan kykenee infektoimaan nisäkäsisännän T4-soluja, ja jolla on lentivirusten alaperheen viraalisen morfogeneesin ja morfologian ominais-5 piirteet. Määritelmä sisältää ilman rajoituksia kaikki HIV:n ja SIV:n variantit, mukaan luettuna HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SlVmnd, SlVsmm, SlVman, SIVmand ja SIVcps.

Määritelmällä "riippumaton MHC:stä" tarkoitetaan, että solun sytolyyttinen vaste ei edellytä MHC-luokan il 10 antigeenin läsnäoloa kohdesolun pinnalla.

Määritelmällä "toiminnallinen sytolyyttinen signaalia välittävä johdannainen" tarkoitetaan toiminnallista johdannaista (joka on, kuten edellä on määritelty), joka kykenee ohjaamaan vähintään 40 %, edullisemmin 70 % tai 15 kaikkein edullisimmin vähintään 90 %, villi tyyppisen molekyylin biologisesta aktiivisuudesta. Tässä käytettynä "toiminnallinen sytolyyttinen signaalia välittävä johdannainen" voi toimia suoraan välittämällä terapeuttiselle solulle signaali tuhota reseptoriin sitoutunut aine tai solu (esim. 20 tapauksessa, jossa on kyseessä intrasellulaarisen kimeeri-sen reseptorin osa) tai se voi toimia epäsuorasti edistä- • · · .·. j mällä oligomerisaatiota terapeuttisen solun sytolyyttisten * ·· * .* signaalia välittävien proteiinien kanssa (esim. transmem- **** braanidomeenin tapauksessa) . Tällaisten johdannaisten te- • ♦ ]···* 25 hokkuutta voidaan testata esim. käyttämällä tässä kuvattuja • » ί ** määrityksiä in vitro.

··· -----——‘ *.Σ * Määritelmällä "toiminnallinen HIV:n vaippaa sitova johdannainen" tarkoitetaan toiminnallista johdannaista (jo- : : ί ka on, kuten edellä on määritelty) , joka kykenee sitomaan :***: 30 mitä tahansa HIV:n vaippaproteiinia.

··· .* . Toiminnalliset johdannaiset voidaan tunnistaa käyt- • · · • · · * * täen esim. tässä kuvattuja määrityksiä in vitro.

Terapeuttinen anto ϊφί : Tämän keksinnön mukaisesti transformoituja soluja ·:··· 3 5 käytetään aineen valmistamiseksi immuunikatovirus terapiaan.

Nykyisiin tällaisten transformoitujen solujen antomenetel- 19 mi in kuuluvat sovitettu immunoterapia tai solusiirtoterapia. Nämä menetelmät mahdollistavat transformoitujen immuunijärjestelmän solujen palaamisen verenkiertoon. Rosenberg, Sei. Am. 62 (toukokuu 1990); Rosenberg et ai., 5 M. Engl. J. Med. 323: 570 (1990).

Farmaseuttisia koostumuksia voidaan antaa mille tahansa eläimelle, joka voi kokea yhdisteiden hyödylliset vaikutukset. Tällaisiin eläimiin kuuluvat ennen kaikkea ihmiset, vaikka keksinnön ei ole tarkoitettu rajoittuvan ih-10 misiin.

Yksityiskohtainen kuvaus

Ensimmäiseksi esitetään piirustusten kuvaus.

Piirustusten kuvaus

Kuviossa IA esitetään aminohapposekvenssi fuu-15 siokohdan CD4:n (jäännökset 1 - 369) ja eri reseptoriketju-jen (sekvenssit nro 38 - 41) ympärillä. Alleviivattu sekvenssi osoittaa fuusiorakenteessä käytetyn BamHI-kohdan koodittamien aminohappojen aseman. Transmembraanidomeenin alku on merkitty pystysuoralla viivalla, η-sekvenssi on sa-20 manlainen kuin ζ-sekvenssi aminopäästään, mutta eroaa kar-

boksyylipäästään [Jin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA

I87: 3319 - 3323 (1990)]. Kuviossa IB esitetään virtaussyto-• · · * .* metrianalyysi CD4:n, CD4^:n, CD4y:n ja CD4^:n pintailmen- • · · •••j tymisestä CVl-soluissa. Solut infektoitiin viruksella, joka • · 25 ilmensi CD4-kimeerejä tai CDl6PI:tä, inkuboitiin 9 tuntia • · : *·· 37 °C:ssa ja värjättiin fykoerytriiniin konjugoidulla anti- :T: CD4-MAb-Leu3A:11a.

Kuviossa 2 esitetään CDl6Ta:n pintailmentäminen yh-teisinfektion jälkeen yksin CDie^llä (tiheät pisteet) tai • · .***. 30 yhteis infektion jälkeen viruksella, joka ilmentää CD4:y:aa .· (katkoviiva) tai CD4^:aa (yhtenäinen viiva). Harvat pis- • · · *· teet osoittavat soluja, jotka on infektoitu ainoastaan * * CD4:ζ:11a, värjätty 3G8:lla [Fleit et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 79: 3275 - 3279 (1982)] <anti-CDl6 MAb) .

• · 35 Kuviossa 3 esitetään CDl6TM:n pintailmentäminen yh- teisinfektion jälkeen CDl6TM:ää ilmentävillä viruksilla ja 20

seuraavilla ζ-kimeereillä: Οϋ4ζ {paksu viiva), 0Ο4ζ CllG

(yhtenäinen viiva), Οϋ4ζ (katkoviiva), 0ϋ4:ζ C11G/D15G (tiheät pisteet), ei yhteisinfektiota (ainoastaan CD416tk» harvat pisteet). Soluja inkuboitiin anti-CD16 MAb 3G8:n ja 5 fykoerytriiniin konjugoitujen vuohen Fab '2-vasta-aineiden hiiren IgG:tä vastaan kanssa, ζ-kimeerien ilmentymisen taso oli olennaisesti samanlainen kuin eri analysoiduille mutan-teille ja solujen yhteisinfektio CDl6Tn:ää ja ζ-kimeerejä ilmentävien virusten kanssa ei muuttanut olennaisesti ki-10 meerien pintailmentymistä.

Kuvioissa 4A - D esitetään, kuinka intrasellulaari-sen vapaiden kalsiumionien määrä lisääntyy mutantti-ζ-kimeerien ristiliittämisen jälkeen T-solulinjassa. Jurkat E6-solut [Weiss et ai., J. Immunol. 133: 123 - 128 (1984)} 15 infektoitiin rekombinantti-vaccinia-viruksilla ja analysoi tiin virtaussytometrialla. Esitetyt tulokset ovat sisään tulleesta CD4+-populaatiosta niin, että ainoastaan oikeaa kimeeristä proteiinia ilmentävät solut on analysoitu. Violetin ja sinisen Indo-l-fluoresenssin suhteen keskiarvo 20 heijastaa intrasellulaarisen vapaan kalsiumin konsentraa- tiota koko populaatiossa ja reagoivien solujen prosentuaa- • · · I *. linen osuus heijastaa solufraktiota, joka ylittää ennalta • · · * .* määritetyn kynnyssuhteen (asetettu niin, että 10 % käsitte- • · · ···· lemättömistä soluista on positiivisia) .

• · # • · *···*' 25 Kuvioissa 4A ja 4B esitetään Jurkat-solut, jotka • · I *·· ilmentävät CD4^:ää (yhtenäinen viiva) tai CDl6:4:ta (kat- • · · V : koviiva), jotka altistettiin anti-CD4 MAb Leu3a:lle (fy- koerytriinikonjugaatti), mitä seurasi ristisidos vuohen vasta-aineen kanssa hiiren IgG:tä vastaan. Pisteviiva • · .**·. 3 0 osoittaa infektoitumattomien solujen reaktiota anti-CD3 MAb • · · . OKT3:a vastaan. Kuviot 4C ja 4D osoittavat Jurkat-soluja, • · · *· *; jotka ilmentävät CD4^Dl5G:tä (yhtenäinen viiva), ‘^ * CD4: ζΟΙίΟ/ϋΙδΘ: tä (katkoviiva) tai CD4^CllG:tä (pisteet), joita käsiteltiin ja analysoitiin, kuten kuvioissa 4A ja .1.1: 35 4B.

• · 21

Kuvioissa 5A - C esitetään, että 0Ό4:ζ~, CD4:q- ja CD4:γ-reseptorit tekevät mahdolliseksi sytolyyttisille T-lymfosyyteille (CTL) tappaa kohteet, jotka ilmentävät HIV-1:tä gp!20/41. Kuviossa 5A: täyteiset ympyrät, CTL:t, 5 jotka ilmentävät CD4ζ:aa, inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka ilmentävät gpl20:ta/41:tä; avoimet ympyrät, CTL:t, jotka ilmentävät CD4:ζ:ää inkuboituna infektoimattornien HeLa-solujen kanssa; täyteiset neliöt, infektoimattomat C.TL: t, joita inkuboitiin HeLa-solujen kanssa, jotka ilmen-10 sivät gpl20:ta/41:tä; avoimet neliöt, infektoimattomat CTL;t, joita inkuboitiin infektoimattomien HeLa-solujen kanssa. Kuviossa 5B: täyteiset ympyrät, CTL:t, jotka ilmentävät CD4:r]:ää inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka ilmentävät gpl20:ta/41:tä; avoimet ympyrät, CTL:t, jotka il-15 mentävät CD4:y;aa inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka ilmentävät gp!20:ta/41:tä; avoimet neliöt, CTL:t, jotka ilmentävät C11G/D15G kaksoismutantti-CD4:ζ-kimeeriä inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka ilmentävät gpl20/41:tä. Kuviossa 5C: virtaussytometrianalyysi kuviossa 5B käytetyn 20 CTL:n CD4-ilmentämisestä. Kohteen ja efektorin suhteiden korjaamiseksi CD4-kimeeriä ilmentävien solujen määrä pro- • · · l *. sentteinä määritettiin vähentämällä mitattu negatiivinen • * t * .* (infektoimaton) populaatio asettamalla histogrammit pääl- • · · ···* lekkäxn, vertailutarkoituksiin tässä kuviossa infektoimat- ··· • · 25 tornille soluille siirrettiin umpimähkäinen kynnys, joka an- • · • *·♦ taa karkeasti saman fraktion, joka on positiivinen muille ·«· V · solupopulaatioille kuin histogrammin vähennys olisi.

Kuviossa 6A - B esitetään CD4-ohjatun sytolyysin spesifisyys. Kuvio 6A: täyteiset ympyrät, CTL:t, jotka il- • · .**·. 30 mentävät CD4^-.aa inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka • · · ilmentävät CDl6Pi:tä; avoimet ympyrät, CTL:t, jotka ilmen- • · · *· *· tävät CD4:ää inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka ilmen- *·**· tävät gpl20: ta; täyteiset neliöt, CTL: t, jotka ilmentävät CDl6^:aa inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka ilmentävät • · 35 gpl20/41:tä; avoimet neliöt, CTL: t, jotka ilmentävät • · CD16pi:tä inkuboituna HeLa-solujen kanssa, jotka ilmentävät 22 gpl20/41:tä. Kuvio 6B: täyteiset ympyrät-, CTL: t, jotka ilmentävät CD4^:aa inkuboituna Raji (MHC-luokka II*) -solujen kanssa; avoimet ympyrät, infektoimattomat CTL-solut inkuboituna RJ2.2.5 (MHC-luokan Il"-Raji-mutantti) -5 solujen kanssa; täyteiset ympyrät, infektoimattomat CTL:t inkuboituna Raji (MHC-luokan II+) -solujen kanssa; avoimet ympyrät, CTL:t, jotka ilmentävät CD4^:aa, inkuboituna RJ2.2.5 (MHC-luokan II') -solujen kanssa. Ordinaatan asteikkoa on laajennettu.

10 Kuvioissa 7A - B esitetään kimeerisen 0ϋ16:ζ- reseptorin karakterisointi. Kuviossa 7A on kaavio Οϋ16:ζ-fuusioproteiinista. Monomeerisen CD16-.n fosfatidyyli-inositoli-liitetyn muodon ekstrasellulaarinen osa liitettiin dimeeriseen ζ:aan juuri transmembraanidomeenin ulko-15 puolelle. Proteiinisekvenssi fuusioliitoksessa on esitetty alhaalla (sekvenssit nro 42, 43) . Kuviossa 7B esitetään virtaussvtometrinen analyysi kalsiumin moblilisaatiosta CD16:ζ-kimeerin ristisitomisen jälkeen joko TCR-positiiviseen tai TCR-negatiiviseen solulinjaan. Violetin 20 ja sinisen fluoresenssin suhteen keskiarvo (suhteellisen kalsiumionikonsentraationa mitta) vasta-aineilla ajankohta- • · · na 0 käsiteltyjen solupopulaatioiden joukossa on esitetty.

• · · * .* Täyteiset neliöt, Jurkat-solujen reaktio anti-CD3-MAb- • · · *“j OKT3:een; täyteiset kolmiot, CDl6^:n reaktio anti-CD16- • · *···*" 25 MAb-3G8:an ristisitomiseen RSX33A TCR~-mutanttilinjaan • · : ** JRT3.T3.5; avoimet kolmiot, CD16:ζ-ristisitomisen reaktio • · · : Jurkat-soluissa; ristit, reaktio ei-kimeeriseen CD16:teen

Jurkat-soluissa ja pisteet, reaktio ei-kimeeriseen CDl6:teen REX33A-TCR"-solulinjassa.

♦ · ;***; 30 Kuvioissa 8A - B esitetään sytolyyttisen tehokkuu- ··· .* . den deleetioanalyysi. Kuviossa 8A esitetään ζ-deleetion • · · *· *j päätepisteiden asemat. Tässä, kuten muuallakin, mutaatioita (:ssa kuvaavat malli alkuperäinen jäännös - asema - mutant- :Y: tijäännös niin, että D66* esimerkiksi tarkoittaa Asp-66:n • · 35 korvaamista lopetuskodonilla. Kuviossa 8B esitetään dele-toimattoman CDl6.(:n svtolyysimäärityksen tulokset ja huo- 23 mättävät ζ-deleetiot. Hybridoomasolut, jotka ilmensivät pinta-vasta-ainetta CD16:lle, ladattiin 51Cr:llä ja niitä inkuboitiin lisääntyvien määrien kanssa ihmisen sytolyytti-siä lymfosyyttejä (CTL) , jotka oli infektoitu vaccinia-5 rekombinanteilla, jotka ilmensivät CD16:ζ-kimeerejä. Vapautuneen 51Cr:n määrä prosentteina on esitetty efekto-rin (CTL) ja kohde (hybridooma) -solun suhteen funktiona (e/t). Täyteiset ympyrät, sytolyysi, jota CD16:( (mfi 18.7) ilmentävät solut välittävät; täyteiset neliöt, sytolyysi, 10 jota Οϋ16:ζ Asp66* (mfi 940.2) ilmentävät solut välittävät; avoimet neliöt, sytolyysi, jota CDl6^Glu60* (mfi 16.0) ilmentävät solut välittävät; avoimet ympyrät, sytolyysi, jota CDl6^Tyr51* (mfi 17.4} ilmentävät solut välittävät; täyteiset kolmiot, sytolyysi, jota CD16: ζΡϊΐΘ34* (mfi 17.8) 15 ilmentävät solut välittävät; ja avoimet kolmiot, sytolyysi, jota ei-kimeeristä CD16:tta (mfi 591) ilmentävät solut välittävät. Vaikka tässä kokeessa CD16:(Asp66*:n ilmentäminen ei sopinut yhteen muiden fuusioproteiinien ilmentämisen kanssa, CDl6^:aa ilmentävien solujen aikaansaama sytolyysi 20 vastaavilla tasoilla samassa kokeessa antoi tulokset, jotka olivat olennaisesti samanlaiset kuin CD16: ζΑερβδ: ta ilmen- • · · I taville soluille on esitetty.

• · · • ·· *.* Kuvioissa 9A - D esitetään, että transmembraanivuo- ·· · ***j rovaikutusten mahdollisuuden poistaminen saa aikaan lyhyen • · *···'" 25 ζ-segmentin, joka kykenee välittämään sytolyysiä. Kuviossa • m • · : ** 9A on kaavamainen diagrammi monomeerisistä kaksiosaisista • · · : ja kolmiosaisista kimeereistä. Ylhäällä on CD16: ζ-rakenne, jota on typistetty asemasta 65 ja josta puuttuu transmem- braaniset Cys- ja A.sp-jäännökset. Alla ovat CD16:CD5:<- ja :***; 30 CDl 6 :CD7: ζ-rakenteet, ja niihin liittyvät kontrollit. In- + · · .* . trasellulaaristen domeenien peptidisekvenssit on esitetty • · · *· *| kuvion alaosassa (sekvenssit nro 45 - 47) . Kuviossa 9B esi tetään monomeeristen kimeerien deleetiomutanttien sytolyyt- :V: tinen aktiivisuus. CD16^:aa ilmentävien solujen sytolyyt- • · ·;.·· 35 tistä aktiivisuutta (täyteiset ympyrät; mfi 495) verrattiin CD16:ζΑβρδβ*:ta ilmentävien solujen sytolyyttiseen aktiivi- 24 suuteen (täyteiset neliöt; mfi 527) tai mutanttien CD16; ζ0γε1101γ/^.ρ150ΐγ/Α8ρ66* (avoimet neliöt, mfi 338) ja CD16;ζΟγΞΐΙΰΙγ/ΑβρΙδΟΙγ/ΟΙηδΟ* (täyteiset kolmiot; mfi 259} sytolyyttiseen aktiivisuuteen. Kuviossa 9C esitetään syto-5 lyyttinen aktiivisuus, jota kolmiosaiset fuusioproteiinit välittävät. Täyteiset kolmiot, CD16:ζΑ3ρ66*; avoimet neliöt, CD16:5:C(48 - 65); täyteiset neliöt CD16-.7: ζ (48 - 65), avoimet kolmiot, ΟΒΐβ:7:ζ(48 - 59); avoimet ympyrät, CD16:5; täyteiset ympyrät, CD16:7. Kuviossa 9D esitetään 10 kalsiumin mobilisaatio mutanttikimeerien ja kolmiosaisten kimeerien toimesta TCR-negatiivisessa Jurkat JRT3.T3.5 - mutanttisolulinjassa. Avoimet ympyrät, dimeeristä CD16:ζΑερδδ* ilmentävien solujen reaktio; täyteiset neliöt, CD16: ζΟγ3ΐ1Ο1γ/Α3ρ1501γ/Αερ66* ilmentävien solujen reaktio; 15 avoimet neliöt, CD16:ζ€γ3ΐ1Ο1γ/Α5ρ15Ο1γ/Ο1η60* ilmentävien solujen reaktio; täyteiset kolmiot, Οϋ16:7:ζ(48 - 65) ilmentävien solujen reaktio; ja avoimet kolmiot, ΟΒΐ6:ζ(48 -59) ilmentävien solujen reaktio.

Kuvioissa 10A - F esitetään yksittäisten aminohap-20 pojen osuus 18 jäännöksen sytolyyttisen signaalia välittä-vän aiheen aktiivisuudessa. Kuviot 10A ja 10B esittävät sy- • · ♦ I tolyyttisen aktiivisuuden ja kuvio 10C esittää kalsiumionin • ♦ · * / mobilisaation, jota pistemutaatioita lähellä karboksyyli- • ♦ « terminaalista tyrosiinia (Y62) kantavat kimeerit välittä- ··· 25 vät. Kuviot 10A ja 10B edustavat tuloksia, jotka on kerätty • *·· soluista, jotka ilmentävät pieniä ja vastaavasti suuria • · * · määriä Cdl6: ζ-fuusioproteiineja. Samoja symboleja käytetään kalsiumin mobilisaatio- ja sytolyysimäärityksissä, ja ne on esitetty yksikirjainkoodeilla oikealla. Täyteiset ympyrät, • · .*··. 30 CDl6^:aa ilmentävät solut (mfi A:ssa 21, B:ssä 376); täy- * · · / # teiset neliöt, solut, jotka ilmentävät CD16 :7: ζ (48-65) (mfi *· A:ssa 31, B:ssä 82); avoimet neliöt, ΟΒΐ6:7:ζ{48- * * 65)Glu60Gln (mfi A:ssa 33, B:ssä 92), ristit, ΟΒ16:7:ζ(48- 65)Asp63Asn (mfi A:ssa. 30, B:ssä 74), täyteiset kolmiot, • · 35 CD16:7: Π48-65)Tyr62Phe (mfi A.-ssa 24, Brssä 88); avoimet • · ' ympyrät, CD16:7:ζ(48-65)Glu61Gln (mfi Ä:ssa 20, B:ssä 62) 25 ja avoimet kolmiot, CD16:7:ζ(48-65}Tyr62Ser (mfi B:ssä 64). Kuvioissa 10D ja IDE esitetään sytolyyttinen aktiivisuus ja kuviossa 10F esitetään kalsiumionien mobilisaatio aminoter-minaalisen tyrosiinin lähellä olevia pistemutaatioita kan-5 tavien kimeerien toimesta (Y51). Kalsiumin mobilisaatiolle ja sytolyysimäärityksille käytetään samoja symboleja, ja ne on esitetty oikealla. Täyteiset ympyrät, Οϋΐ6;ζ ilmentävät solut (mfi D:ssä 21,2, E:ssä 672); täyteiset neliöt, CD16:7:ζ(48-65) ilmentävät solut (mfi D:ssä 31,3, E:ssä 10 179); täyteiset kolmiot, CD16:7: ζ(48-659Asn48Ser (mfi D:ssä 22,4, E-.ssä 209); avoimet neliöt, CD16:7 ·, ζ (48-65)Leu50Ser (mfi D:ssä 25,0, E:ssä 142); ja avoimet kolmiot, CDl 6:7: :ζ (48-65) Tyr 51 Phe (mfiD.-ssä, 32,3, S:SSä 294).

Kuvioissa 11A - B esitetään ζ:η sisäisten toistojen 15 linjaus ja niiden kyvyn vertailu tukea sytolyysiä. Kuviossa HA on kaavamainen diagrammi kimeereistä, jotka on muodostettu jakamalla ζ:η intrasellulaarinen domeeni kolmeen osaan ja lisäämällä ne CD16:7-kimeerin transmembraanidomee-niin. Intrasellulaaristen domeenien sekvenssit on esitetty 20 alla (sekvenssit nro 48 - 50), yhteiset jäännökset on reu-nustettu ja läheiset jäännökset on merkitty tähdillä. Kuvi- • · · I *. ossa 11B esitetään kolmen ζ-aladomeenin sytolyyttinen te- • · · * .* hokkuus. Täyteiset ympyrät, solut ilmentävät CD16:ζ (mfi ··· •**| 476); täyteiset neliöt, CD16:7: ζ (33-65) (mfi 68); avoimet ’··**' 25 neliöt, CD16:7: ζ (71-104) (mfi 114) ja täyteiset kolmiot, • **· CDl6 :7: ζ (104-138) (mfi 104) .

Il# V : Kuvio 12 on kaavio CD16:FcRyII-kimeereistä.

Kuvioissa 13A - B esitetään kalsiumin mobilisaatio CD4:FcRyII- ja CD16 :FcRyII-kimeerien ristisitomisen jäi- .***. 30 keen. Kuviossa 13A esitetään kalsiumille herkällä fluorofo- • · ♦ ·· .· . rilla Indo-1 ladattujen solujen emittoiman violetin ja si- • · · ’· *j nisen fluoresenssin suhde kuvattuna ajan funktiona CD16- * * ekstrasellulaarisen domeenin ristisitomisen jälkeen vasta- aineiden kanssa. Kuviossa 13B esitetään samanlainen analyy- • # 35 si violetin ja sinisen fluoresenssin suhteen noususta so- 26 luissa, jotka kantavat CD4iFcRyll-kimeerejä, ristisitomisen jälkeen vasta-aineiden kanssa.

Kuvioissa 14A - B esitetään Cd4:FcRYlI- ja CD16; FcRYlI-kimeerien sytolyysimääritykset. Kuviossa 14A esite-5 tään anti-CDl6-hybridooma (kohde) -soluista vapautuneen 51Cr:n määrä prosentteina, kun solut altistetaan lisääntyville määrille sytotoksisia T-lymfosyyttejä, jotka ilmentävät CD16:FcRYlI-kimeerejä (efektorisolut). Kuviossa 14B esitetään samanlainen analyysi sytotoksisuudesta, jota 10 CD4:FcRYlI-kimeerit välittävät HIV:n vaipan glykoproteiine-ja ilmentäviä kohdesoluja vastaan.

Kuvioissa 15A - E esitetään sytolyysille tärkeiden jäännösten tunnistus FcRyII Am hännässä. Kuvio ISA on kaavio deleeetiorakenteista. Kuvioissa 15B ja 15C esitetään 15 kalsiumin mobilisaatio ja sytolyysi CD16:FcRyII Am karbok-syyliterminaalisten deleetiovarianttien toimesta. Kuvioissa 15D ja 15E esitetään kalsiumin mobilisaatio ja sytolyysi kolmiosaisten kimeerien toimesta, jotka kantavat yhä vähemmän CD16:FcRyII Am intrasellulaarisen hännän aminopäästä. 20 Kuviossa 16 (sekvenssi nro 24) esitetään CD3 delta- reseptoriproteiinin aminohapposekvenssi, kehystetty sek- • · · 1’. venssi edustaa edullista sytolyyttistä signaalia välittävää * / osaa.

• · *

Kuviossa 17 (sekvenssi nro 25) esitetään T3- « · *···' 25 gammareseptoriproteiinin aminohapposekvenssi, kehystetty • · : ” sekvenssi edustaa edullista sytolyyttistä signaalia välit- • · · V : tävää osaa.

Kuviossa 18 (sekvenssi nro 26) esitetään mbl resep-toriproteiinin aminohapposekvenssi, kehystetty sekvenssi • · .*··. 30 edustaa edullista sytolyyttistä signaalia välittävää osaa.

• · · .· . Kuviossa 19 (sekvenssi nro 27) esitetään B29 resep- • · · *· *| toriproteiinin aminohapposekvenssi; kehystetty sekvenssi • · · · · edustaa edullista sytolyyttistä signaalia välittävää osaa.

Kuviossa 20 esitetään kaavio CD4-kimeereistä. Mole- • · 35 kyyli "A" on CD4 (Dl-D4) : Ig:CD7; molekyyli "B" on CD4(Dl, D2):ig:CD7; molekyyli "C" on CD4(D1-D4):Ig:CD7:ζ; molekyyli 27 "D" on CD4(Dl,D2):Ig:CD7:ζ ja molekyyli "E" on CD4:ζ. Ihmisen CD4-molekyylin ekstrasellulaarinen domeeni, joka vastaa aminohappoja 1 - 394 prekursorissa, liitettiin BaxnHI-

kohtaan sarana-, CHl- ja CH2-domeeneihin ihmisen IgGl-.teen, 5 kuten aikaisemmin on kuvattu [Zeittlmeissl, et ai., DNA

Cell Biol. 9: 347 (1990)], paitsi että käytettiin ihmisen

Ig-sekvenssien cDNA-versiota tekemään mahdolliseksi ilmentäminen vaccinia-virusrekombinanteissa. CD4-kimeerien kak-sidomeeniset versiot luotiin liittämällä BamHl-adapteri ai-10 noaan Nhel-kohtaan (joka vastaa aminohappoa 200) CD4- prekursori-cDNA:ssa. Membraaniin tarttumissekvenssit käsittivät 22 jäännöstä ihmisen membraaniin sitoutuneen IgGl:n ensimmäisestä eksonista; näitä seurasi CD7-jäännökset 146 -203.

15 Aminohapot 55 - 163 ζ:sta toimivat neliosaisten ra kenteiden (C ja D) liipaisinaiheena. Neliosaisissa rakenteissa, jotka sisälsivät ζ-ketjun, ζ-.n intrasellulaarinen ilmentyminen dokumentoitiin kaupallisesti saatavilla olevalla vasta-aineella intrasellulaarista domeenia vastaan 20 (Coulter).

Kuviossa 21 esitetään HIV-l:n vaipan glykoproteii- • · · e·/; nia ilmentävien kohdesolujen sytolyysi, jota välittää syto- • ·· .* toksinen T-soluklooni WH3, joka ilmentää erilaisia CD4:stä ··· ·”· johdettuja kimeerejä efektorimolekyyleinä. Sytotoksisuus- • · [···*' 25 määrityksiä varten ihmisen CD8+ CD4“ HLA B44 -rajoitteista • · • ** T-solulinjaa WH3, pidettiin yllä IMDM:llä, jota oli täyden- • · · ·.· * netty 10-prosenttisella ihmisen seerumilla, kuten tässä on aikaisemmin esitetty. Soluja stimuloitiin gammasäteilyte- :Y: tyillä (3 000 rad) B44:ää kantavilla mononukleaarisilla so- :***: 30 luilla ja fytohemagglutiinilla (PHA) 1 pg/ml. Yhden vuoro- ··« . kauden stimulaation jälkeen PHA laimennettiin 0,5 • · · * · pgtaan/ml lisäämällä tuoretta ravintoalustaa; 3 päivän jäl keen ravintoalusta vaihdettiin täysin. Soluja kasvatettiin :Y: vähintään 10 päivää ennen käyttöä svtotoksisuusmäärityksis- ·;··· 35 sä. Solut infektoitiin sopivilla rekombinantti-vaccinia- viruksilla, kuten tässä on kuvattu vPEl6:n yhteydessä. In- 28 fektioiden annettiin edetä vielä 3-4 tuntia täydellisessä ravintoalustassa, minkä jälkeen solut kerättiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoimalla uudelleen tiheyteen 1 x 107/ml. U-pohjaisen mikrotiitterilevyn kuhunkin kaivoon, 5 joka sisälsi 100 μΐ kaivoa kohti täydellistä ravintoalustaa, lisättiin 100 μΐ ja laimennettiin 2-kertaisten laimennusten sarjalla. Kaksi kaivoa kutakin näytettä ei sisältänyt lymfosyytteja, jotta tehtäisiin mahdolliseksi spontaani kromin vapautuminen ja kromin kokonaisoton määritys. Koh-10 desolut, HeLa-alalinja S3 (HeLa-S3, ATCC), infektoitiin kuten edellä, 10 cm:n maljoilla vPE16:lla. 10e infektoitua solua irrotettiin PBS:llä ja 1 mM EDTA:lla, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 100 pl:aan 51Cr-natriumkromaattia (1 mCi/ml PBSrssä) yhden tunnin ajaksi 15 37 °C:ssa ja pestiin sitten kolme kertaa PBS:llä. 100 μΐ leimattuja kohdesoluja lisättiin kuhunkin kaivoon. Mikro-tiitterilevyä sentrifugoitiin 750 x g 1 min ja inkuboitiin 4 tuntia 37 °C:ssa. Inkubaatioajänjakson lopuksi solut kussakin kaivossa suspendoitiin uudelleen pipetoimalla varo-20 vasti, otettiin näyte liittyneen radioaktiivisuuden koko-naismäärän laskemiseksi ja mikrotiitterilevyä sentrifugoi- • · · I *. tiin 750 x g 1 min. Supernatantista otettiin näytteet (100 • · · *· / μΐ) ja laskettiin gammasäteilyn tuikelaskijalla. Efekto- ··· ri:kohde-suhde korjattiin infektoitujen solujen prosentuaa- ··· 25 lisen osuuden mukaan mitattuna virtaussytometrialla.

·· • *·· Kuviossa 22 esitetään HIV-l:n replikaatio transfek- ϊ tanttisolulinjoissa. Solulinjat, jotka ilmentävät stabii- listi villityyppistä CD4:ää ja erilaisia rekombinanttiki- ;*j*: meerejä, perustettiin ihmisen sikiön munuaissolulinjan 293 • · .***. 30 alalinjaan. Valmistettiin HIV-1 IIIB -kannan virusta tiit~ • · ^ terillä n. 1Q6 infektiokykyistä partikkelia ml:aa kohti ♦ · ♦ *« " määritettynä päätepisteen laimennusanalyysillä käyttäen ih~ *·**· misen T-solulinjaa C8166 indikaattorina. Infektiot tehtiin ·*;*· MOI:n ollessa noin 1 ajanjaksona 8-12 tuntia lämpötilassa • · 35 37 °C. Seuraavana päivänä solut pestiin PBS:llä kolme ker taa, trypsinoitiin, maljattiin uusille maljoille ja viljel- 29 man. snpernatantista otettiin näyte p24-tiitteriä varten (merkittiin päiväksi 0) . Sen jälkeen 3-4 päivän välein kerättiin soluviljelyjen supernatantteja ja säilytettiin p24-analyysiä varten. Soluille syötettiin uudelleen tuoret-5 ta ravintoalustaa, joka sisälsi hygromysiini B:tä konsent-raationa 100 pg/ml. Viljelmien supematanttien analyysi tehtiin käyttäen kaupallista ELISA:an perustuvaa HIV-l:n p24-antigeenin määrityspakkausta (Coulter) valmistajan antamien ohjeiden mukaisesti. Tulokset edustavat kahta eril-10 listä koetta, joiden kestoaika oli sama.

Kuviossa 23 esitetään CD4:n (CD4 Bam) D1-D4- domeenien nukleiinihapposekvenssi (sekvenssi nro 28) ja aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 29).

Kuviossa 24 esitetään CD4:n (CD4 Nhe) D1-D2- 15 domeenien nukleiinihapposekvenssi (sekvenssi nro 30) ja aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 31).

Kuviossa 25 esitetään ihmisen IgGl:n (Igh23 Bam) sarana-, CH2- ja CH3-domeenien nukleiinihapposekvenssi (sekvenssi nro 32) ja aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 20 33).

Kuviossa 26 esitetään CD7:n (TM7 Bam Miu) transmem- • · · braanidomeenin nukleiinihapposekvenssi (sekvenssi nro 34) • ·· ja aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 35).

• · · **** Kuviossa 27 esitetään zetan (Zeta Miu Not) intra- • · ]···*’ 25 sellulaarisen domeenin nukleiinihapposekvenssi (sekvenssi • · • ** nro 36} ja aminohapposekvenssi (sekvenssi nro 37).

··· V * Kuviossa 28 esitetään synteettisen alfa-heliksin DNA-sekvenssi (sekvenssi nro 51) ja primäärinen aminohap-posekvenssi (sekvenssi nro 52).

30 Esimerkki X

··» .* . Ihmisen IgGl s reseptorikimeerien rakentaminen • · · • ·· * * Ihmisen IgGl:n raskaan ketjun sekvenssit valmistettiin liittämällä sekvenssit Cn3-domeenissa cDNA- fragmenttiin, joka oli johdettu vasta-aine~mRNA:n transmem-·:··· 35 br äänimuodon 3'-päästä. 3 ’ -päätyf ragmentti saatiin polyme- 30 raasiketjureaktiolla käyttäen tonsilla-cDNA-kirjastoa perustana ja oligonukleotideja, joiden sekvenssit olivat: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sekvenssi nro 7) ja

5 CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT

CCT GGG CCT CA (sekvenssi nro 8), jotka vastaavat halutun DNA-fragment in 5'- ja vastaavasti 3'-päätä. 5'-oligo on komplementaarinen kohdalle ihmisen IgGl:n Cnl-domeenissa ja 31-oligo on komplementaa-10 rinen kohdalle juuri 5' suuntaan sekvensseistä, jotka koo-dittavat membraanin läpi ulottuvaa domeenia. PCR-tuote pilkottiin BstXI:llä ja BamHl:llä ja ligatoitiin puolisynteettisen, muuntelevät ja vakioiset alueen sisältävän, igGl-vasta-aineen geenin BstXI- ja BamHl-kohtien väliin. 15 BstXI:stä BamHI:teen ulottuvan fragmentin liittämisen jälkeen rakenteen monistetut osat korvattiin aina Smal-kohtaan saakka CH3-.ssa restriktiofragmenttien välisellä vaihdoksella niin, että ainoastaan osa Smal-kohdan ja 3’-oligon välillä oli saatu PCR-reaktiosta.

20 Jotta luotaisiin ihmisen IgGl:ζ-kimeerinen resepto- ri, raskaan ketjun geeni, joka päättyi BamHI-kohtaan, lii- • * .·. : tettiin BamHI-kohtaan jäljempänä kuvatussa ζ-kimeerissä • ·· niin, että vasta-ainesekvenssit muodostivat ekstrasellulaa- ·»· *"* risen osan. Kimeeriä koodittavalla plasmidilla transfektoi- • · #···*' 25 tujen COS-solujen virtaus sytome tr ia osoitti vasta- • · • ** ainedeterminanttien korkean tason ilmentymistä, kun kevyen *.* * ketjun cDNA:ta koodittava ilmentämisplasmidi yhteistrans- fektoitiin, ja vasta-ainedeterminanttien kohtuullista il- • · mentymistä, kun kevyen ketjun ilmentämisplasmidi puuttui.

30 Samanlaiset kimeerit, joihin kuuluvat ihmisen IgGl ··« . fuusioituna η:aan tai y:aan (katso jäljempää) tai mikä ta- • ·· * * hansa signaalia välittävä osa T-solureseptori- tai Fc- *. * reseptoriproteiinistä, voidaan rakentaa yleisesti ottaen, • · kuten edellä on kuvattu, käyttäen molekyylibiologian tavan-·:··· 35 omaisia tekniikoita.

31

Jotta luotaisiin yksi transkriptioyksikkö, joka tekisi mahdolliseksi sekä raskaiden että kevyiden ketjujen ilmentymisen yhdestä promoottorista, luotiin bikistronista mRNA:ta koodittava plasmidi raskaita ja kevyitä ketjuja 5 koodattavista sekvensseistä, ja 78 kD:n glukoosin säätelemää proteiinia, joka tunnetaan myös grp78:na tai BiP:nä, koodittavan mRNAm 5' translatoimattomasta osasta. grp78-sekvenssit saatiin ihmisen genomisen DNA;n PCRtstä käyttäen alukkeita, joiden sekvenssit olivat: 10 CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (sek venssi nro 9) ja CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (sekvenssi nro 10) 5'- ja vastaavasti 3'-päissä. Polymeraasiketjureak-15 tiot näillä oligoilla tehtiin 10-prosenttisen dimetyyli-sulfoksidin läsnä ollessa. PCR:llä saatu fragmentti pilkottiin Notlrllä ja Hindi :11a ja liitettiin NotI- ja Hpal-kohtien väliin alavirtaan ihmisen IgGlrtä koodittavista sekvensseistä. Ihmisen IgG:n kevyen kappaketjun cDNA;ta 20 koodattavat sekvenssit liitettiin sitten alavirtaan grp78:n johtosekvenssistä käyttäen HinclI-kohtaa ja toista kohtaa • · · .·.j vektorissa. Näistä manipulaatioista saatu ilroentämisplasmi- • ·♦ di koostui semisynteettisesta raskaan ketjun geenistä, jota *::: seurasi grp78:n johtosekvenssit, joita seurasivat kevyen • · j···*" 25 kappaketjun cDNA-sekvenssit, joita seurasivat polyadenylaa- i ** tiosignaalit, jotka oli johdettu SV40:n DNA-fragmentista.

··· *.·· COS-solujen transfektio ilmentämisplasmidilla antoi raskaan ketjun determinanttien merkittävästi parantuneen ilmentymä-:Y: sen verrattuna ainoastaan raskaan ketjun determinantteja ·***· 30 koodittavan plasmidin transfektioon.

«M

.*, Jotta luotaisiin bikistroninen geeni, joka käsittää • · · ** *j raskaan ketjun / reseptorikimeerin ja kevyen ketjun, ylä- *e* virran raskaan ketjun sekvenssit voidaan korvata millä ta- hansa tässä kuvatulla kimeerisellä raskas ketju / resepto- • · ····· 35 rigeenillä.

32

Esimerkki XI

CD4-reseptorikimeerien rakentaminen

Ihmisen ζ [Weissman et ai-, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 9709 - 9713 (1988b)] ja γ [Kuester et ai., J. Biol.

5 Chem. 265: 6448 - 6452 (1990)1 -cDNA:t eristet tiin polymeraasiketjureaktiolla kirjastoista, jotka oli valmistettu HPB-ALL-kasvainsolulinjasta [Aruffo et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 8573 - 8577 (1987b)] ja ihmisen luonnollisista tappajasoluista, kun taas η-cDNA [Jin 10 et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3319 - 3323 (1990)J eristettiin hiiren tymosyytti-kirjastosta, ζ, η ja Y~cDNA:t liitettiin CD4:n muunnetun muodon ekstrasellulaa-riseen domeeniin, jossa oli BamHI-kohta juuri ylävirtaan membraanin lävistävästä domeenista [Aruffo et ai., Proc. 15 Natl. Acad. Sei. USA 84: 8573 - 8577 (1987b); Zettmeissl et ai., DNA Cell Biol. 9347 - 353 (1990)1, joka liitettiin

BamHI-kohtaan, joka oli luonnostaan ζ ja η-cDNA:issa läsnä, samassa sijaintipaikassa muutaman jäännöksen päässä ylävirtaan membraanin lävistävästä domeenista (sekvenssit nro 1, 20 3, 4 ja 6). Jotta luotaisiin fuusioproteiini y:n kanssa,

BamHI-kohta liitettiin sekvenssiin, joka oli likimain sa- • · · ,·/; massa paikassa (kuvio 1, sekvenssit nro 2 ja 5). Geeni- • · · fuusiot saatettiin vaccinia-viruksen ilmentämisplasmidiin, ·· · ”” joka sisälsi E. colin gpt-geenin valikointimerkkinä, ja • · ]···* 25 liitettiin vaccinia-WR-kannan genomiin homologisella rekom- • · ί '* binaatiolla ja selektiolla kasvun mykofenolihapolla suhteen • · · : [Falkner et ai., J. Virol. 62: 1849 - 1854 (1988); Boyle et ai., Gene 65: 123 - 128 (1988)]. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että vaeeinia-rekombinantit ohjaavat Οθ4:ζ:η ja 3 0 CD4;y:n fuusioproteiinien runsasta tuotantoa solun pinnal- • · · .* . la, kun taas CD4:rpn ilmentyminen on merkitsevästi heikom- • · · * ; paa (kuvio IB). Viimeksi esitetty havainto on yhtenevä vii meaikaisen raportin kanssa, että η-cDNA:n ilmentymisplasmi-::: din transfektio hiiren hybridoomasolulinjaan antoi merkit- ·;··· 35 sevästi heikomman ilmentymisen kuin vastaavan ζ- ilmentämisplasmidin transfektio [Clayton et ai. J. Exp.

33

Med. 172: 1243 - 1253 (1990)]. Vaccinia-rekombinanteilla infektoitujen solujen immunosaostus osoitti, että fuusio-proteiinit muodostavat kovalenttisia dimeerejä, päinvastoin kuin luonnossa esiintyvä CD4-antigeeni. Monomeeristen 5 0ϋ4:ζ- ja CD4;γ-fuusioproteiinien ja natiivin CD4:n mole- kyylimassojen havaittiin olevan 63, 55 ja vastaavasti 53 kD. Fuusioproteiinien suuremmat massat ovat suunnilleen yhtenevät intrasellulaarisen osan suuremman pituuden kanssa, mikä ylittää natiivin CD4:n 75:llä (Οϋ:ζ) tai 5:llä (CD4:y) 10 jäännöksellä.

Esimerkki XXI

CD4-kimeerit voivat assosioitua muiden reseptori-ketjujen kanssa

Ihmisen FcyRIII-.n makrofagin / luonnollisen tappa-15 jasolumuodon (CD16th) solupintailmentymistä transfektan- teilla edistää kotransfektio hiiren [Kurosaki et ai., Nature 342: 805 - 807 (1989)] tai ihmisen [Hibbs et ai.,

Science 246: 1608 - 1611 (1989) y:n, samoin kuin ihmisen ζ:η (Lanier et ai., Nature 342: 803 - 805 (1989)] kanssa.

20 Yhtäpitävästi näiden raporttien kanssa kimeerien ilmentyminen teki myös mahdolliseksi CDl6TM:n pint ai Imen ty- • · · .·/. misen, kun se oli saatettu kohdesoluun joko kotransfektiol- • · · la tai koinfektiolla rekombinantti-vaccinia-virusten kanssa • · · **·; (kuvio 2). CDl6-m:n pinta! Imen tymisen parantuminen ζ:1ΐ3 • · *···*" 25 oli huomattavampaa kuin parantuminen y:lla (kuvio 2) tutki- • · • *' tuissa solulinj oissa, kun taas natiivi CD4 ei tehostanut • · · ·.· : CD16TM:n pinta!lxnentymistä.

Esimerkki XV

Asp ζ -mutantit eivät koassosioidu Fc-reseptorin • · ;*”j 3 0 kanssa ·*· .* . Jotta luotaisiin kimeerejä, jotka eivät liittyisi • · · ** *; olemassa olevan antigeeni- tai Fc-reseptorien kanssa, val mistettiin mutantti^-fuusioproteiinit, joista puuttui joko membraanin sisäinen Asp- tai membraanin sisäinen Cys- • · ·:··· 35 jäännös tai kumpikin. Virtaussytometria osoitti, että eri mutanttikimeerien solunpintailmentymisen intensiteetti ei 34 ollut arvioitavissa olevasti erilainen mutatoimattomaan prekursoriin verrattuna, ja immunosaostuskokeet osoittivat, että kimeerien kokonaisilmentyminen oli samanlaista. Kuten odotettua, mutanttikimeerien, joilta puuttui transmembraa-5 uinen kysteiinijäännös, ei havaittu muodostavan disulfidi-liitettyjä dimeerejä. Kaksi mutanttikimeeriä, joilta puuttui Asp, olivat kykenemättömiä tukemaan CDl6'nl:n pintail-mentamistä, kun taas monomeeriset kimeerit, joilta puuttui Cys, mutta jotka sisälsivät Asp:n, sallivat CDl6TM:n ilmen-10 tymisen, mutta pienemmällä tehokkuudella kuin emodimeeri (kuvio 3).

Esimerkki V

Mutanttireseptorit säilyttävät kyvyn aloittaa kal-siumvaste 15 Sen määrittämiseksi, mahdollistaisiko fuusioprote- iinien ristisitominen vapaan solunsisäisen kalsiumin kertymisen tavalla, joka olisi samankaltainen kuin se, jonka tiedetään tapahtuvan T-soluantigeenireseptorilla, ihmisen T-soluleukemialinjan solut, Jurkat E6 {ATCC talletusnumero 20 TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD), infektoitiin vaccinia-rekombinanteilla ja määritettiin suh- • · · t·/. teellinen sytoplasman kalsiumkonsentraatio ekstrasellulaa- • · · risen domeenin ristisitomisen jälkeen vasta-aineiden kans- • · · sa. Virtaussytometrimääritys tehtiin soluilla, jotka oli • · [···1 25 ladattu kalsiumherkallä värillä Xndo-1 [Grynkiewicz et ai., ϊ 2 J. Biol. Chem. 260: 3340 - 3450 (1985), Rabinovitch et ai., • · · ·.· 1 J. Immunol. 137: 952 - 961 (1986)]. Kuviot 4A - D osoitta vat tulokset kalsiumvirtauskokeesta soluilla, jotka oli in-::: fektoitu CD4^:lla ja ζ:η Asp'- ja Cys'-mutanteilla. Kimee- 30 rien ristisitominen lisäsi toistuvasti solunsisäisen kai- • · · .1 . siumin määrää. CD4:ζ ja CD4:y mahdollistivat samoin solun- • · · 1 sisäisen kalsiumin kertymisen infektoituihin soluihin. Jur- 2 • · · · · kat-solut ilmentävät matalia tasoja CD4:ää solun pinnalla, natiivin CD4:n ristisitominen CDl6:f-.n läsnä ollessa tai ·:1·; 35 puuttuessa ei kuitenkaan muuta solunsisäisiä kalsiumtasoja (kuvio 4A - B).

Esimerkki VI

CD4j£-, η- ja γ-kimeerit välittävät sytolyysiä koh teissa, jotka ilmentävät HIV:n gpl20/41stä 35

Sen määrittämiseksi, laukaisisivatko kimeeriset re-5 septorit sytolyyttiset efektoriohjelmat, luotiin mallikoh-de:efektorijärjestelmä, joka perustui HIV:n vaipan gpl20/ gp41-kompleksin CD4-tunnistukseen. HeLa-solut infektoitiin rekombinantti-vaccinia-viruksilla, jotka ilmensivät gpl20/ gp41:tä [Chakraharti et ai., Nature 320: 535 - 537 (1986), 10 Earl et ai., J. Virol. 64: 2448 - 2451 (1990)] ja leimattiin 51Cr:lla. Leimattuja soluja inkuboitiin solujen kanssa ihmisen allospesifisestä (CD8+, CD4") sytotoksisesta T- lymfosyyttilinjasta, joka oli infektoitu vaccinia-rekombinanteilla, jotka ilmensivät ΰϋ4:ζ-, CD4r|- tai CD4:y-15 kimeerejä tai CD4:ζCysllGly:AsplSGly kaksoismutanttikimee-riä. Kuvioissa 5A - C osoitetaan, että CD4~kimeerejä ilmentävät sytotoJcsiset T-lymfosyytit (CTL) lyysasivat spesifisesti gpl20/41:tä ilmentävät HeLa-solut. Infektoimattomat HeLa-solut eivät olleet CD4;ζ-kimeereillä varustetun CTL:n 20 kohteena, eikä infektoimaton CTL tunnistanut gpl20/41:tä ilmentäviä HeLa-soluja. Jotta verrattaisiin eri kimeerien • · · • · .·. : tehokkuutta, efektorin ja kohteen suhteet korjattiin CD4- • · · kimeerejä ilmentävälle CTL-fraktiolle ja gpl20/41:tä ilmen- *111 tavien HeLa-solujen fraktiolle, mikä määritettiin virtaus- • · 25 sytometrialla. Kuviossa 5C osoitetaan CD4:n ilmentymisen • · : “ sytometrinen analyysi kuvioissa 5A ja 5B esitetyssä syto- • · · : lyysikokeessa käytetyn CTL:n toimesta. Vaikka pinta-CD4: ζ :n keskimääräinen tiheys ylitti suuresti CD4:g:n keskimääräi- • · sen tiheyden, jompaakumpaa muotoa ilmentävien solujen syto- :***: 30 lyyttiset tehokkuudet olivat samanlaiset. Korjattaessa • · · . gpl20:tä ilmentävien kohteiden fraktiolle, CD4:£- ja CD4:n- • ♦ · ** * • ·· * * proteiinien välittämän sytolyysin tehokkuus on verrattavis- *. * sa parhaisiin tehokkuuksiin, joita on raportoitu spesifiin: sille T-solureseptorikohde:efektoripareille (keskimääräinen *:·*: 35 efektori/kohdesuhde 50-prosenttiselle vapautumiselle CD4: ζ ilmentävien T-solujen toimesta oli 1,9 ± 0,99, n = 10.

36 CD4: γ-fuusio oli vähemmän aktiivinen, kuten oli CD4^-fuusio, josta puuttui transmembraaniset Asp- ja Cys-jääxmökset. Kuitenkin kummassakin tapauksessa havaittiin merkitsevää sytolyysiä (kuvio 5B - C).

5 Sen mahdollisuuden kontrolloimiseksi, että vacci nia- infektio saattaisi edistää CTL:n toimesta tapahtuvaa artefaktitunnistamista, tehtiin samanlaiset sytolyysikokeet kohdesoluilla, jotka oli infektoitu vaccinia-rekombinanteilla, jotka ilmensivät CDl6:n (CDl6Pi) fosfati-10 dyyli-inositoli-liitettyä muotoa, ja leimattu 51Cr:llä, sekä CTL:illä, jotka oli infektoitu kontrollirekombinanteil-la, jotka ilmensivät joko CDl6Pi:ta tai CDl6^:aa. Kuvio 6A osoittaa, että ei-CD4-kimeerejä ilmentävät T-solut eivät tunnista natiiveja HeLa-soluja tai HeLa-soluja, jotka il-15 mentävät gpl20/41:tä, ja samalla tavalla, että T-solut, jotka ilmentävät CD4-kimeerejä, eivät tunnista HeLa-soluja, jotka ilmentävät muita vaccinian koodittsmia pintaproteiineja. Lisäksi CTL:t, jotka ilmentävät ei-kimeeristä CD4:ää, eivät merkitsevästi lyysaa HeLa-soluja, jotka il-20 mentävät gpl20/41:tä (kuvio 6A).

Esimerkki VII

* · · MHC-luokkaa II kantavat solut eivät ole kimeerien • ·· kohteena • · · *”* CD4:n ajatellaan olevan vuorovaikutuksessa MHC- • · 25 luokan II antigeenin ilmentämän ei-polymorfisen sekvenssin • “ kanssa [Gay et ai., Mature 328; 626 - 629 (1987); Sleckman • · · V · et ai., Nature 328: 351 - 353 (1987)]. Vaikka spesifistä vuorovaikutusta CD4:n ja luokan II antigeenin välillä ei : ole koskaan dokumentoitu puhdistetuilla proteiineilla, tie- 3 0 tyissä olosuhteissa adheesio CD4:ää ilmentävien solujen ja • · · .* . luokan II molekyylejä ilmentävien solujen välillä voidaan • · · ' * osoittaa [Doyle et ai., Nature 330; 256 ~ 259 (1987);

Clayton et ai., J. Exp. Med. 172: 1243 - 1253 (1990); La- marre et ai., Science 245: 743 - 746 (1989)]. Seuraavaksi • · ·;··· 3 5 tutkittiin, voitaisiinko tappaminen osoittaa luokan II mo lekyylejä kantavia soluja vastaan. Kuvio 6B osoittaa, ettei 37 ole spesifistä sytolyysiä, joka olisi CD4:(:n ohjaama Raji B -soluiinjaa vastaan, joka ilmentää runsaasti luokan II antigeeniä. Vaikka havaitaan vaatimaton (n. 5 %) sytolyysi, luokka II -puutteinen Raji-mutantti, RJ2.2.5 [Accolla, J. 5 Exp. Med. 157: 1053 - 1058 (1983)] osoittaa samanlaista herkkyyttä kuin Raji-solut, joita on inkuboitu infektoimat-tomien τ-solujen kanssa.

Esimerkki VIII

Sekvenssivaatimukset sytolyysin indusoimi seksi 10 T-soluantigeenilla / Pc-reseptorin zeta-ketjulla

Vaikka CD4:n ja ζ:η väliset kimeerit voivat varustaa sytotoksiset T-lymfosyytit (CTLj tappamaan HIV gpl20 ilmentävät kohdesolut, etsittiin vaihtoehtoa CD4:lle, jotta verrattaisiin yksiselitteisesti ihmisen T-solulinjoihin 15 vietyjen zeta-kimeerien ominaisuuksia. Tällaiset linjat voivat ilmentää CD4:ää tehden vaikeaksi määrittää spesifisesti suhdetta eri kimeerien tyyppien välillä tai kalsiumin mobilisaation astetta ja sytotoksista potentiaalia. Tämän kiertämiseksi luotiin ζ:η ja CDl6:n väliset kimeerit, jol-20 loin CDl6:n ekstrasellulaarinen domeeni on kiinnittynyt ζ:η transmembraani- ja intrasellulaarisiin sekvensseihin (kuvio • · · 7A) . Geenifuusiot liitettiin vaccinia-viruksen iimentämis- • · · • ·· *plasmidiin, joka sisälsi E. colin gpt-geenin valikoitavana ♦ "π ’ ··“ merkkinä, ja liitettiin vaccinian WR-kannan genomiin homo- • « *···*’ 25 logisella rekombinaatiolla ja valikoimalla kasvun suhteen ·· : **· mykofenolihapolla [Falkner ja Moss, J. Virol. 62; 1849 V : (1988); Boyle ja Coupar, Gene 65: 123 (1988)].

T-solulinjat infektoitiin vaccinia-rekombinanteilla ja suhteellinen sytoplasman vapaa kalsiumionikonsentraatio • · .·*·. 3 0 määritettiin ekstrasellulaarisen domeenien ristisitomisen • · ·*· .· , jälkeen vasta-aineiden kanssa. Tehtiin sekä spektrofluori- • · · *· *| metriset määritykset (bulkkipopulaatio) että virtaussyto- * * metriä (yksittäinen solu) -määritykset soluilla, joihin oli ladattu väriä Indo-1 [Grynkiewicz et ai, J. Biol. Chem.

• · 35 260:3440 (1985); Rabinovitch et ai, J. Immunol. 137: 952 (1986)]. Kuviossa 7B esitetään analyysi tiedoista, jotka 38 kerättiin ihmisen T-soluleukemiasolulinjan Jurkat-soluista, jotka oli infektoitu vaccinia-rekombinanteilla, jotka ilmensivät CD16:ζ-fuusioproteiinia. Kimeerien ristisitominen lisäsi toistettavasti intrasellulaarista kalsiumia, kun 5 taas samanlaisilla käsittelyillä soluille, jotka ilmensivät ei-kimeeristä CDl6:ta, oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta. Kun kimeeri ilmennettiin mutanttisolulinjoissa, joista puuttui antigeenireseptori, joko REX33A:ssa [Breitmeyer et ai, J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho et ai, J. Biol.

10 Chem. 264:20760 (1989)], tai Jurkat-mutantissa JRT3.T3.5 [Weiss et ai, J. Immunol. 135:123 (1984)]; voimakas reaktio CDl6-vasta-aineen ristisitomiseen oli nähtävissä. Samanlaisia tuloksia on kerätty REX20A [Breitmeyer et ai, supra, 1987; Blumberg et ai, J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)] - 15 mutanttisolulinjalla ja tässä laboratoriossa perustetun

Jurkat-solulinjan CD3/Ti-negatiivisella mutantilla. Infektio rekombinanteilla, jotka ilmentävät CD16^:, ei palauttanut reaktiota anti~CD3-vasta-ainetta vastaan osoittaen, että fuusiorproteiini ei toiminut pelastaen intrasellulaa- 20 risia CD3-kompleksiketjuja.

Jotta arvioitaisiin kimeerien kyky ohjata uudelleen • · · soluvälitteistä immuniteettia, CTL:t infektoitiin vaccinia- • · ·

• M

* .* rekombinanteilla, jotka ilmensivät CDlS-kimeerejä, ja niitä ·*« "*j käytettiin lyysaamaan spesifisesti hybridoomasoluja, jotka • · *···* 25 ilmentävät membraaniin sidottuja anti-CDl6-vasta-aineita.

·· • · : ** Tämä määritys on laajennus hybridooma- • · · : sytotoksisuusinääritykseen, joka kehitettiin alkujaan ana lysoimaan Fc-reseptoreja kantavien solujen efektorimekanis- :Y: meja (Graziano ja Fanger, J. Immunol. 138:945, 1987; • · 30 Graziano ja Fanger, J. Immunol. 139: 35 - 36, 1987; Shen et ·«· . ai, Mol. Immunol. 26: 959, 1989; Fanger et ai, Immunol. To- • · · *· *j day 10: 92, 1989). Kuviossa 8B osoitetaan, että CD16:(:n * * ilmentäminen sytotoksisissa T-lymfosyyteissä mahdollistaa varustetulle CTL:Ile tappaa 3G8 [anti~CDl6; Fleit et ai, • · 35 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:3275 (1982)] hybridoomasolut, kun taas CTL:t, jotka ilmentävät fosfati- 39 dyyli-inositoli-liitettyä muotoa CDl6:sta, ovat inaktiivisia. CTL:t, jotka on varustettu CDl6:^:lla, eivät myöskään tappaneet hybridoomasoluja, jotka ilmensivät irrelevanttia vasta-ainetta.

5 Jotta tunnistettaisiin pienimmät mahdolliset ζ- sekvenssit, jotka ovat välttämättömiä sytolyysille, valmistettiin sarja deleetiomutantteja, joissa jatkuvasti suurempi osa ζ:η intrasellulaarisesta domeenista (sekvenssi nro 44) oli poistettu karboksyylipäästä (kuvio 8A) . Suurin osa 10 zetan intrasellulaarisesta domeenista voitiin poistaa ilman suuria seuraamuksia sytolyyttiselle tehokkuudelle; cäysipi-tuinen kimeeri CD16:ζ oli olennaisesti yhtä hyvä tehokkuudeltaan kimeeriin nähden, josta oli poistettu jäännökset 65:teen asti, CDl6^Asp66* (kuvio 8B) . Olennainen sytotok-15 sisuuden väheneminen havaittiin deleetiossa ζ:η jäännökseen 59 (kimeeri CD16:ζΰΙπβΟ*), ja lisädeleetioon jäännökseen 50, mikä johti hieman pienempään aktiivisuuteen. Täydellistä aktiivisuuden puuttumista ei kuitenkaan havaittu silloinkaan, kun intrasellulaarinen Jameeni vähennettiin kol-20 men jäännöksen transmembraaniankkuriin (kuvio 8B).

Koska ζ on disulfidisidottu dimeeri, yksi selitys • · · ,·. ; sytolyyttisen aktiivisuuden säilymiselle oli se, että endo- • · · geeninen ζ muodosti heterodimeereja kimeerisen ζ-deleetion **” kanssa säilyttäen siten aktiivisuuden. Tämän ajatuksen tes- • · [···*' 25 taamiseksi ζ-jäännökset 11 ja 15 muutettiin Asprista ja • · • ** vastaavasti Cys:ista Gly:ksi (CysllGly/AsplSGly) ja tehtiin • · · V : immunosaostukset seuraavalla tavalla. Noin 2 x 105 CV1- solua infektoitiin yhden tunnin aikana seerumittomassa DMA- : :*: ravintoalustassa, jossa oli rekombinantti-vaccinia-virusta • · 3 0 infektoivan yksikön arvona vähintään kymmenen (multiplicity • · · .* . of infection, moi). Kuudesta kahdeksaan tuntia infektion • · · * * jälkeen solut irrotettiin maljoista PBS:llä / 1 mM EDTA:11a ja pintaleimattiin 0,2 mCirllä 125I:tä per 2 x 106 solua :V: käyttäen laktoperoksidaasia ja H2C>2:ta Clarkin ja Einfeldin ·:··· 35 menetelmällä (Leucosyte Typing II, s. 155 - 167, Springer

Verlag, NY, 1986). Leimatut solut kerättiin sentrifugoimal- 40 la ja lyysattiin l-%:iseen NP-40;ään, 0,1 % SDS:ää, 0,15 M NaCl, 0,5 M Tris, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 5 mM KC1, 0,2 M jodo-asetamidia ja 1 niM PMSF. Tumat poistettiin sentrifugoimalla ja CDl6-proteiinit immunosaostettiin vasta-aineella 3G8 5 (Fleit et ai., supra, 1982; Medarex) ja anti-hiiri IgG-agaroosilla (Cappel, Durham, NC) . Näytteet ajettiin elektroforeesilla 8-prosenttisen polyakryyliamidi/SDS-geelin läpi ei-pelkistävissä olosuhteissa tai 10-prosenttisen geelin läpi pelkistävissä olosuhteissa. Nämä immunosaostukset var-10 mistivat, että CD16:ζΟγΒΐΙΘίγ/ AsplSGly-kimeeri ei liittynyt disulfidiliitettyihin dimeerirakenteisiin.

Mutanttireseptorien sytolyyttinen aktiivisuus testattiin myös. Mutatoitu kimeeri, joka oli deletoitu jäännökseen 65 (ΟΒίβζΟγβΙΙΰΙγ/ΑΒρΙδΟΙγ/ΑΞρββ*) oli, riippuen 15 määritysolosuhteista, kahdesta kahdeksaan kertaa vähemmän aktiivinen sytolyysimäärityksessä kuin verrattava mutatoi-maton kimeeri (Cdl6:ζΑβρ66*), joka oli yleensä luokkaa kaksi kertaa suurempi kuin aktiivisuus CDl6^:sta tai ei erotettavissa siitä {kuvio 9B) . Mutanttikimeerien aktiivisuu-20 den väheneminen on verrattavissa vähenemiseen, joka havai-taan samanlaisen rakenteen omaavien CD4-kimeerien kohdalla • · · • · .·. j (katso edeltä) , ja se johtuu todennäköisimmin ζ-monomeerien • ·· */ pienemmästä tehokkuudesta verrattuna dimeereihin. Sitä vas- **” toin Asp--, Cys--mutatoidulla kimeerillä, joka oli deletoi- • φ ];··* 25 tu jäännökseen 59, ei ollut sytolyyttistä aktiivisuutta • · : '* (kuvio 9B) , mikä tukee oletusta, että liittyminen muiden • · · V : ketjujen kanssa, mitä välittää transmembraaninen Cys- ja/tai Asp-jäännös, vastasi sytolyyttisen aktiivisuuden • · heikosta pysyvyydestä deleetioissa, jotka tehtiin jäännöstä 30 65 lähemmäs aminopäätä.

• ti . Virtaus sy tome tr iatutkimukset osoittivat, että de- • · · ) leetiomutantit, joilta puuttuivat transmembraaniset Asp- ja . * Cys-jäännökset, voivat yhä edistää vapaan intrasellulaari- • · V.J sen kalsiumionin määrää reaktiona vasta-aineen ristisitomi- *:·*: 35 sen TCR--mutantissa Jurkat-solulinjassa (kuvio 9D) . Saman laisia tuloksia saatiin kimeereille, jotka ilmennettiin 41

Jurkat-emosolulinjassa. Tapauksessa CD16:ζΟγβΙΙΟΙγ/

Aspl5Gly/Glu60* nämä tulokset osoittavat, että kyky välittää reaktiota kalsiumiin voidaan erottaa mutaation kannalta kyvystä tukea sytolyysiä.

5 Jotta poistettaisiin ehdottomasti ζ transmembraani- jäännösten mahdollinen myötävaikutus, ζ:η transmembraani-jäännökset ja ensimmäiset 17 sytoplasmista jäännöstä korvattiin sekvensseillä, jotka koodittivat membraanin läpäisevää ja ensimmäisiä 14:ää tai ensimmäisiä 17;ää sytoplas-10 mistä jäännöstä CD5- tai vastaavasti CD7-antigeeneistä (kuvio 9A) . Saadut kolmiosaiset fuusioproteiinit CD16:5: ζ(48 - 65) ja 0016:7:ζ(48 - 65) eivät muodostaneet disulfi-disidottuja dimeerejä, kuten yksinkertaisemmat 0ϋ16:ζ-kimeerit tekevät, koska niistä puuttui kysteiinijäännös 15 ζ-transmembraanidomeenissa. Kumpikin kolmiosainen kimeeri kykeni mobilisoimaan kalsiumia Jurkat- ja TCR-negatiivisissa solulinjoissa (kuvio 9D) ja nostattamaan sy-tolyyttisen vasteen CTL:ssä (kuvio 9C ja tulokset, joita ei ole esitetty). ζ-osan typistäminen jäännökseen 59 saakka 20 kimeerissä Οϋ16:7:ζ(48 - 59) kumoaa kuitenkin kolmiosaisen fuusion kyvyn ohjata kalsiumvastetta TCR-positiivisissa tai • · · .·/. negatiivisissa Jurkat-soluissa tai sytolyysiä kypsissä • »· *.* CTL:issä (kuviot 9C ja 9D ja tulokset, joita ei ole esitet- ··· ty) .

• ♦ *···* 25 Jotta tutkittaisiin yksittäisten jäännösten myötä- ·· • · : ** vaikutusta 18-jäännöksen aiheessa, valmistimme joukon mu- • · · V : tanttivarlantteja paikkasuunnatulla mutageneesillä, ja ar vioimme niiden kyvyn välittää reseptorisuunnattua tappamis-ta olosuhteissa, joissa oli matala (kuviot 10A ja 10D) tai • · :***· 30 korkea (kuviot 10B ja 10E) kimeerisen reseptorin ilmentymi- ··· .* . nen. Kuviot 10A - F osoittavat, että vaikka joukko suhteel- • · · ** I lisen konservatiivisia substituutioita (ts. happamien jään nösten korvaaminen niiden samansukuisilla amideilla, tai tyrosiini fenyylialaniinilla), jotka ulottuivat jäännökses- • · ·;··· 35 tä 59 jäännökseen 63, tuottivat sytolyyttiselle tehokkuu delle vaatimattoman kompromissin, yleisesti ottaen varian- 42 tit säilyttivät kyvyn mobilisoida kalsiumia. Nämä jäännökset muodostavat yhdessä kuitenkin tärkeän ala-aiheen, koska niiden deleetio poistaa sytolyyttisen aktiivisuuden. Tyr 62 :n konversio joko Phetksi tai Ser-.ksi poisti sekä syto-5 toksisen että kalsiumvasteen. 18 jäännöksen segmentin ami-nopäässä Tyr 51:n korvaaminen Phe:lla kumosi sekä kalsiumin mobilisaation että sytolyyttisen aktiivisuuden, kun taas Leu:n korvaaminen Ser:llä asemassa 50 poisti kalsiumvasteen heikentäen ainostaan osittain sytolyysiä. Sitoutumatta 10 tiettyyn hypoteesiin oletetaan, että Leu50Ser-mutantin kyvyttömyys mobilisoida kalsiumia lyhytaikaisissa virtaussy-tometria-analyyseissä ei heijasta täysin sen kykyvä välittää vapaan intraseilulaarisen kalsiumionin olennaista lisääntymistä sytolyysimäärityksen pitemmällä ajanjaksolla. 15 Kalsiumille epäherkkää sytolyyttistä aktiivisuutta on raportoitu joidenkin sytolyyttisten T-solulinjojen kohdalla, ja sitä mahdollisuutta, että samanlainen ilmiö on taustana tässä kuvatuille tuloksille, ei ole hylätty. Asn48:n korvaaminen Ser:llä heikensi osittain sytotoksisuutta joissa-20 kin kokeissa, vaikka sillä oli vähän vaikutusta toisiin.

Tarpeettomien sekvenssin elementtien mahdollisen • · ; roolin tutkimiseksi ζ:η intrasellulaarinen domeeni jaettiin • ·· kolmeen segmenttiin, joka ulottui jäännöksestä 33 jäännök- *1*1 seen 65, jäännöksestä 71 jäännökseen 104 ja jäännöksestä • · [”·* 25 104 jäännökseen 138. Kukin näistä segmenteistä kiinnitet- • · J *’ tiin CD16:CD7-kimeeriin Mlul-kohdan avulla tämän ollessa • · · *.* * liitetty juuri distaalisesti CD7:n intraseilulaarisen do~ meenin membraania ankkuroiviin perussekvensseihin (katso • · V.J jäljempää kuviosta 11A) . Kolmen elementin sytolyyttisen te- :***: 30 hokkuuden vertailu osoitti, että ne olivat olennaisesti yh- *·· . ta tehokkaita (kuvio 11B) . Sekvenssien vertailu (kuvio llA) • ·· * I osoittaa, että toisessa aiheessa on yksitoista jäännöstä *. * tyrosiinien välillä, kun taas ensimmäisessä ja toisessa ai- • · Σφί#Σ heessa on kymmenen.

*:**: 35 Vaikka T-solujen aktivaatioprosessin täsmällistä selvitystä ei ole tehty, on selvää, että antigeeniresepto- 43 rin aggregaatio tai ixitrasellulaariset ζ-sekvenssit sisältävien reseptorikimeerien aggregaatio laukaisee kalsiumin mobilisaation, sytokiinin ja jyväsvapautumisen ja solun pinnan merkkien aktivaation ilmenemisen, ζ:η aktiivinen 5 kohta, lyhyt lineaarinen peptidisekvenssi, joka on luultavasti liian pieni, jotta sillä olisi omaa entsymaattista aktiivisuutta, on todennäköisesti vuorovaikutuksessa yhden tai enimmillään muutaman proteiinin kanssa, jotta solujen aktivaatio välittyisi. On myös selvää, että vapaan kallo siumin mobilisaatio ei itsessään riitä solujen aktivaatiolle, koska kyky välittää sytolyysiä voidaan erottaa mutaatioiden avulla kyvystä välittää kalsiumin kertymistä.

Kuten tässä esitetään, 18 jäännöksen lisääminen ζ*.η intrasellulaarisesta domeenista kahden ei-läheisen proteii-15 nin transmembraani- ja intrasellulaariseen domeeniin, tekee mahdolliseksi saaduille kimeereille ohjata uudelleen syto-lyyttistä aktiivisuutta kohdesoluja vastaan, jotka sitoutuvat fuusioproteiinien ekstrasellulaariseen osaan. Vaikka 18 jäännöksen aihetta kantavat kimeerit ovat noin kahdeksan 20 kertaa vähemmän aktiivisia kuin kimeerit, jotka perustuvat täysipituiseen ζ:33η, vähentynyt aktiivisuus voi johtua • · .·,: transmembraanivuorovaikutusten häviämisestä, jotka normaa- • ·· \·[ listi mahdollistavat villityyppisen ζ,-n muodostaa disulfi- “I! disidottuja dimeerejä. Toisin sanoen, ζ:η deleetioraken- • · .;··*' 25 teet, joilla on sama karboksyylipää kuin aiheella ja joista • · • puuttuvat transmembraani set Cys- ja Asp-jäännökset, osoit- *·* * tavat tyypillisesti hieman vähemmän aktiivisuutta kuin ki meerit, joilla on ainoastaan 18 jäännöksen aihe.

• · ϊ.ϊ.ί Sytolyyttisellä kompetenssielementillä, johon olem- 30 me keskittyneet, on kaksi tyrosiinia eikä yhtään seriiniä . tai treoniiniä, mikä rajoittaa mahdollisia fosforylaation • · · I vaikutuksia aktiivisuuteen. Kumman tahansa tyrosiinin mu- . * taatio tuhoaa kuitenkin aktiivisuutta, ja vaikka ennakoivat • · tutkimukset eivät anna viitteitä olennaisesta tyrosiinin *:·*: 35 fosforylaatiosta 18 jäännöksen aihetta kantavien kimeeris- ten pinta-antigeenien ristisitomisen jälkeen, tällaisen 44 fosforylaation mahdollista osallistumista matalalla tasolla ei voida sulkea pois. Kahteen tyrosiinijäännökseen liittyvien havaittujen vaikutusten lisäksi joukko aminohappokor-vauksia aiheen amino- ja karboksyylipäässä heikentävät ak-5 tiivisuutta olosuhteissa, joissa reseptorin tiheys on pieni .

Sekvenssit, jotka ovat samanlaisia kuin ζ:η aktiivinen aihe, voidaan osoittaa usean muun transmembraanipro-teiinin sytoplasmisissa domeeneissa, mukaan luettuna CD3 δ-10 ja γ-molekyylit, IgM:n pintaan liittynet proteiinit mbl ja B29 ja suuren affiniteetin IgE-reseptorin β- ja γ-ketjut, PceRI (Reth, Nature 338: 383, 1989). Vaikka näiden sekvenssien toimintaa ei varmasti tunneta, jos ne ilmentyvät tehokkaasti, kukin voi kyetä autonomiseen T-soluaktivaatioon, 15 ja tällainen aktiivisuus voi selittää jäännös-TCR-vasteen, joka nähdään zeta-negatiivisessa mutanttisolulinjassa (Sussman et ai., Cell 52: 85, 1988).

ζ sisältää itsessään kolme tällaista sekvenssiä sijoittuneena suunnilleen samoin välimatkoin, ja intrasellu-20 laarisen domeenin pilkkominen karkeasti kolmeen osaan osoittaa, että kukin osa kykenee aloittamaan sytolyyttisen • · : vasteen, rpsta, ζ:η liitosisoformista (Uin et ai., supra, • · · " '1990; Clayton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 5202, ”” 1991) puuttuu kolmannen aiheen karboksyylipuoli. Koska en- • · l*··*' 2 5 simmäisen aiheen karboksyyiipuolen poistaminen hävittää ak- • · • “ tiivisuuden, näyttää todennäköiseltä, että pääosa run bio- • · · *.* : logisesta tehokkuudesta voidaan liittää kahteen ensimmäi seen aiheeseen. Vaikka eri määrityksissä η on yhtä aktiivi- • · nen kuin ζ edistämään antigeenin välittämää sytokiinien va-30 pautumista (Bauer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: • · · / . 3842, 1991) tai uudelleen ohjattua sytolyysiä (katso edel- • · · 'I tä), η ei ole fosforyloitu reaktiona reseptorin stimulaati oon (Bauer et ai., supra, 1991). Näin ollen fosforylaatioon : : : vaaditaan joko kaikkien kolmen aiheen läsnäolo, tai kolmas *:··· 35 aihe edustaa suosittua substraattia tunnistamattomalle ty~ rosiinikinaasille.

Ihmisen Fc-reseptorin aikaansaama sytolyyttinen signaalinsiirto

Esimerkki IX

45

Jotta arvioitaisiin ihmisen eri Fc-reseptorin ala-5 tyyppien toimintoja, luotiin kimeeriset molekyylit, joissa ihmisen CD4:- CD5- tai CDl6-antigeenien ekstrasellulaarinen domeeni liitettiin FcRIIyA-, Bl-, B2- ja C-alatyyppien transmembraani- ja intrasellulaarisiin domeeneihin (nimistö, Ravetch ja Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9: 457, 1991).

10 Tarkemmin sanottuna aikaisemmin kuvattujen FcRIlA-, Bl- ja B2-isoformien transmembraani- ja sytoplasmisia domeeneja vastaavat cDNA-sekvenssit monistettiin aikaisemmin olemassa olevasta kloonista PC23 tai ihmisen tonsilla-cDNA-kirjastosta (risojen) (joka on rakennettu tavanomaisilla 15 tekniikoilla) käyttäen seuraavia synteettisiä oligonukle-otidialukkeita: CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (sekvenssi nro 18, FcRII A eteenpäin), CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC 20 GTT (sekvenssi nro 19, FcRII A käänteinen)

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC

• · · .·. : G (sekvenssi nro 20, FcRII Bl ja FcRII B2 eteenpäin) ja • · · GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC) Sek- ·«· venssi nro 21, FcRII Bl ja FcRII B2 käänteinen).

• · [y* 25 Nämä alukkeet sisälsivät pilkkoutumiskohdat entsyy- • · : ** meille BamHI ja vastaavasti Notl sisennettynä 6 jäännöstä • * * * *.* ’ 5'-päästä. Notl-kohtaa seurasi välittömästi antisense-stop- kodoni, joko CTA tai TTA. Kaikki alukkeet sisälsivät 18 tai • · enemmän jäännöksiä, jotka olivat komplementaarisia haluttu-30 jen fragmenttien 5'- ja 3'-päille. FcRIIyC:n sytoplasmista ··· .* . domeenia vastaava cDNA-fraqmentti, joka eroaa IIA- • · · “ ^ • ··

* isoformista ainoastaan yhden aminohappojäännöksen osalta (L

korvattu P-.llä jäännöksenä 268) luotiin paikkaohjatulla mu-ϊ^ϊ tageneesillä limittäisellä PCR:llä käyttäen seuraavan sek- 35 venssin mukaisia alukkeita: 46 TCA GAA AGA GÄC AAC CTG AAG AAA CCA AGA A (sekvenssi nro 22) ja TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (sekvenssi nro 23) .

5 PCR-fragmentit liitettiin vaccinia-viruksen ilmen- tämisvektoreihin, jotka sisälsivät CDl6:n tai vastaavasti CD4:n ekstrasellulaariset domeenit, ja insertoitiin sen jälkeen villityyppiseen vaccinia-virukseen rekombinaatiolla tymidiinikinaasilokukseen käyttäen selektiota E. colin 10 gpt:n yhteisintegraatiota varten edistämään haluttujen re-kombinanttien tunnistamista. Kaikkien isoformien tunnistus (esitetty kuviossa 12) varmistettiin dideoksisekvensoinnil-la.

Kimeeristen reseptoriproteiinien tuotanto varmis-15 tettiin vielä immunosaostustutkimuksilla. N. 107 JRT3.T3.5-solua infektoitiin yhden tunnin aikana seerumittomassa IMDM-ravintoalustassa, jossa oli rekombinantfcista vacciniaa vähintään kymmenen infektoivaa yksikköä solua kohti. Kaksitoista tuntia infektion jälkeen solut kerättiin talteen ja 20 pintaleimattiin 0,5 mCi:llä 12:>I 107:ää solua kohti käyttäen laktoperoksidaasi/glukoosioksidaasimenetelmää (Clark ja • · · .·. : Einfeld, supra) . Leimatut solut kerättiin sentrifugoimalla • · · ' / ja lyysattiin seuraavassa: 1 % NP-40:tä, 0,1 mM MgCl2, 5 mM KC1, 0,2 M jodoasetamidi ja 1 mM PMSF. Tumat poistettiin • · 25 sentrifugoimalla ja CDl6-fuusioproteiinit immunosaostettiin • · • ** vasta-aineella 4G8- ja anti-hiiri-IgG-agaroosilla. Näytteet • · · ’.· * ajettiin elektroforeesilla pelkistävissä olosuhteissa.

Kaikkien immunosaostettujen kimeeristen reseptorimolekyyli-en molekyylimassat olivat odotetun suuruiset.

:***: 30 Kimeeristen reseptorien kyvyn testaamiseksi välit- • · · .* . tää sytoplasmisen vapaan kalsiumionin lisääntymistä käytet- • » · * * tiin rekombinanttiviruksia infektoimaan Jurkat-solulinjan JRT3.T3.5 TCR-mutantti (kuten tässä on kuvattu) ja syto- :V: plasminen vapaa kalsium määritettiin soluista (kuten tässä • · *:··· 35 on kuvattu) reseptorin ekstrasellulaaristen domeenien ris- tisitomisen jälkeen monoklonaalisen vasta-aineen 3G8 tai 47

Leu-3A kanssa (kuten tässä on kuvattu). Nämä kokeet paljastivat, että FcRYlIA:n ja C:n intrasellulaariset domeenit kykenivät välittämään sytoplasmisen vapaan kalsiumin lisääntymistä ekstrasellulaaristen domeenien ristisitomisen 5 jälkeen, kun taas FcRyll Bl:n ja B2:n intrasellulaariset domeenit olivat inaktiivisia verrattavissa olosuhteissa (kuvio 13A ja 13B) . FcRyll A:n CD4-, CD5- ja CD16-hybrideillä oli olennaisesti samanlainen kapasiteetti edistää kalsiumvastetta (kuviot 13A - B). Muut solulinjat, sekä 10 monosyyttisistä että lymfosyyttisistä linjoista, kykenivät vastaamaan signaaliin, jonka ekstrasellulaaristen domeenien ristisitominen oli aloittanut.

Jotta tutkittaisiin eri FcRyll:n intrasellulaaris-ten domeenien osallistumista sytolyysiin, ihmisen sytotok-15 siset T-lymfosyytit (CTL) infektoitiin vaccinia- rekombinanteillä, jotka ilmensivät CD16:FcRyII:n A-, Bl-, B2- ja C-kimeerejä. Infektoituja soluja yhteisviljeltiin sitten 51Cr-ladattujen hybridoomasolujen kanssa (ts. 3G8 10-2 -solujen kanssa), jotka ilmensivät solun pinnan vasta-20 ainetta CD16:ta vastaan. Tässä määrityksessä CTL:t, jotka kantoivat CDl6-kimeeriä, tappoivat hybridoomakohdesolut : (mahdollistaen vapaan 51-Cr:n vapautumisen), jos kimeerin • · · ekstrasellulaarinen domeenin CD16 on liitetty intrasellu- ΊΙΓ laariseen segmenttiin, joka kykenee aktivoimaan lymfosyyt- • · [···* 25 tiefektoriohjelman; tämä sytolyysimääritys on kuvattu yksi- • · : *' tyiskohtaisesti jäljempänä. Kuvio 14A osoittaa, että CTL:t, • · · *.* : jotka on varustettu CD16:FcRyIIA: 11a ja C:llä, mutta ei

FcRyll Bl:llä tai B2-.lla, kykenevät lyysaamaan kohdesolut, • · jotka ilmentävät solun pinnan anti-CDl6 vasta-ainetta.

30 Jotta eliminoitaisiin se mahdollisuus, että spesi- • · · . finen sytolyysi johtui jollain tavalla vuorovaikutuksesta • · · * I CD16-osan kanssa, tehtiin sytolyysikokeet, joissa FcRII:n intrasellulaariset domeenit kiinnitettiin CD4:n ekstrasel- • · lulaarxseen domeeniin. Tässä tapauksessa kohdesolut olivat ·:··· 35 HeLa-soluja, jotka ilmensivät HIV:n vaipan gpl20/41- proteiineja (spesifisesti HeLa-soluja, jotka oli infektoitu 48 vaccinia-vektorilla vPE16 (saatavilla talletuslaitoksesta National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD) . Kuten CD16-järjestelmässä, koh-desolut, jotka ilmensivät HIV-vaippaa, olivat alttiit CD4: 5 FcRyll A-kimeeriä ilmentävien T-solujen lyysaukselle, mutta eivät FcRyll :n Bl:lle tai B2:lle (kuvio 14B) .

FcRyll A:n ja C:n intrasellulaarisilla domeeneilla ei ole merkitsevää sekvenssihomologiaa minkään muun proteiinin kanssa, mukaan luettuna suurentuneen FcRy/TC^-10 perheen jäsenet. Jotta saataisiin määritettyä sekvenssiele-mentit, jotka vastaavat sytolyysin induktiosta, valmistettiin intrasellulaarista domeenia koodittavien sekvenssien 5'- ja 31-deleetiot (kuvattu jäljempänä ja esitetty kuviossa 15A) , ja niiden tehokkuus arvioitiin kalsiumin mobili-15 saatiomäärityksillä ja sytolyysimäärityksillä (kuten tässä on kuvattu). Kokeissa, joissa intrasellulaarisen domeenin amino terminaalinen pää poistettiin, FcRyll-.n transmembraa-nidomeeni korvattiin ei-läheisen CD7-antigeenin transmem-braanidomeenilla, jotta eliminoitiin mahdollinen vuorovai-20 kutusten osuus, jota membraanin lävistävä domeeni välittää.

Kuviot 15B ja 15C osoittavat, että 14 karboksyyli- • · .·. ; terminaalisen jäännöksen poistaminen, mukaan luettuna tyro- • ·· *#/ siini 298, johti sytolyyttisen kapasiteetin täydelliseen *!" häviämiseen ja kalsiumin mobilisaatiopotentiaalin olennai- • · .···* 25 seen vähenemiseen. Lisädeleetio juuri ennen tyrosiinia 282 • · ·' ** antoi identtisen fenotyypin (kuviot 15B ja 15C) . Deleetiol- • ♦ · *·* * la intrasellulaarisen domeenin N-terminuksesta jäännökseen 268 ei ollut olennaista vaikutusta kalsiumprofiiliin tai • ♦ V.J sytolyyttiseen tehoon, kun taas deleetio jäännökseen 275 :***: 30 heikensi merkittävästi kalsiumin vapautumista, mutta sillä ··· ,·) . oli vähän vaikutusta sytolyysiin (kuviot 15D ja 15E) . Lisä- • · ♦ C deleetio, jäännökseen 282, antoi FcRyll-hännät, joista . * puuttui sekä kyky mobilisoida kalsiumia että laukaista sy- • · V.: tolyysi (kuviot 15D ja 15E). Näiden raakamääritysten mää- *:**: 35 riitelemä "aktiivinen elementti" on suhteellisen suuri (36 49 aminohappoa) ja sisältää kaksi tyrosiinia, joita erottaa 16 jäännöstä.

Esimerkki X

Kohdennettu sytolyysi lymfosyyteillä, jotka kanta-5 vat kimeerisiä CD4-reseptoreja, jotka eivät pidä yllä infektiota

Kuten edellä on esitetty, voidaan valmistaa efekto-rimolekyylit, jotka jälleenohjaavat CTL:ien sytolyyttistä aktiivisuutta MHC:sta riippumattomalla tavalla. Esimerkiksi 10 kimeeri, joka koostuu CD4:n ekstrasellulaarisesta domeenis-ta fuusioituna ihmisen CTL-kloonin WH3 ζ -ketjuun, tappaa spesifisesti kohdesoiut, jotka esittelevät HIV-l:n pinnan vaipan giykoproteiinia gp!20. Koska CD4~molekyylin ekstra-sellulaarinen domeeni antaa alttiuden Hiv-infektiolle, va-15 rustetut CTL:t voivat kuitenkin tulla viruksen kohteiksi, mikä johtaa niiden tehon vähenemiseen (Dalgleish et ai., Nature 312: 767 (1984); Klatzmann et ai.. Nature 312: 767 (1984). Jotta estettäisiin tällainen seuraamus, suunniteltiin kimeeriset efektorimolekyyiit, jotka perustuvat 20 CD4:ään, ja jotka ovat tehokkaita kohdentamaan spesifisesti HIV:n infektoimat solut soluvälitteiselle tappamiselle, • · · • · .·. : mutta jotka eivät anna alttiutta HIV-infektiolle.

• ·· .* Luotiin kolmiosainen fuusioproteiini CD4:n ekstra- • · · * ‘“I sellulaarisen domeenin geneettisellä liittämisellä (kuvio • · j··* 25 23) saranaan, toiseen ja kolmanteen vakioiseen domeeniin • ·

: ** ihmisen IgGl:n raskaasta ketjusta (Zettmeissl et ai., DNA

• · · V * Cell Biol. 9: 347 (1990) (kuvio 25), liitettynä tässä tapa uksessa osaan ihmisen membraaniin sitoutuneen IgGl:n ensim- • · maisesta transmembraanieksonista, jota seurasi osa ihmisen :***: 30 CD7-antigeenista, joka käsitti sekvenssit ainoan Ig:n kai- ··♦ . täisen domeenin ja transmembraanidomeenia seuraavan lope- • · · * l tussiirtosekvenssin välillä [Aruffo ja Seed, EMBO J. 6: *. * 3313 (1987)] (kuvio 26). CD7-segmentin ekstrasellulaarisen • · domeenin primäärinen aminohapposekvenssi käsitti proliinia *:··· 35 runsaasti sisältävän alueen, mikä antaa olettaa sauvamaisen rakenteen olemassaoloa, joka ohjaa lg:n kaltaista domeenia 50 poispäin solun pinnasta [Aruffo ja Seed, EMBO J. 6: 3313 (1987)] (kuvio 26). Rekombinantti-vaccinia-virukset valmistettiin tämän ja läheisten kimeerien ilmentämiseksi, kuten tässä on kuvattu. Erityisesti luotiin rekombinantti-5 vaccinia-virukset homologisella rekombinaatiolla CV-1-soluissa. Kullekin kannalle tehtiin vähintään kaksi kierrosta plakin visualisointia QKT4:llä tai Leu3a:lla, mitä seurasi plakin puhdistus, ennen kuin valmistettiin korkean tiitterin kannat CV-l-soluihin.

10 Kolmiosainen kimeeri (CD4(D1-D4):Ig:CD7) (kuvio 20, molekyyli "A") osoittivat tehokasta solun pintaekspressiota ja testattiin sen kyky toimia Hiv-reseptorina vacciniapoli-jaisessa solusitkosten muodostusanalyysissä [Lifson et ai., Nature 323: 725 (1986); Ashorn et ai., J. Virol 64: 2149 15 (1990)]. HeLa-soluja, jotka oli infektoitu rekombinantti- vaccinia-viruksella (vPE16), joka kooditti HIV-l:n vaipan glykoproteiinia [Earl et ai., J. Virol 64: 2448 (1990)], viljeltiin yhdessä HeLa-solujen kanssa, jotka oli infektoitu joko CD4:llä, CD4:ζ:llä tai CD4(D1-D4): Ig:CD7:llä. 6 20 cm:n maljat HeLa-soluja (ATCC, Rockville, MD) 50 prosentin konf luenssissa infektoitiin seerumittomalla ravin toal us tai- • · · .·. ; la 1 tunnin ajan infektoivan yksikön (MOI) arvon ollessa • ·· noin 10. Soluja inkuboitiin vielä 5-6 tuntia täydellises- • · · sä ravintoalustassa ja ne lohkaistiin sitten fosfaatilla • · ]···* 25 puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) , joka sisälsi 1 mM ED- • * • ** TA:a. Vaippa- ja CD4-kimeeriä ilmentävät solut sekoitettiin • · · *.* * suhteessa 1:1 ja maljättiin uudelleen 6 cm:n maljoille täy delliseen ravintoalustaan. Solusitkokset arvioitiin 6-8 :V: tuntia yhteisviljelyn jälkeen ja valokuvattiin.

30 CD4:n ja vPEl6:n yhteisviljelyt johtivat helposti • · · .* . havaittavien monitumaisten jättisolujen muodostumiseen.

• · · * · Myös kimeeri, joka käsitti CD4:n ekstrasellulaarisen domee- nin fuusioituna TCR:n ζ-ketjuun (kuvio 27) (004:ζ) kykeni :V: välittämään synkytioiden muodostusta, kun taas solut, jotka ·;·*: 35 ilmensivät CD4 (D1-D4) : Ig:CD7 :ää, eivät antaneet merkkiä so- lufuusiosta. Testasimme myös rakenteen, joka ilmensi aino- 51 astaan CD4:n ensimmäistä ja toista domeenia (kuvio 24) , CD4(D1, D2):Ig:CD7 (kuvio 20, molekyyli "B"), koska toisessa yhteydessä CD4:n kahden aminoterminaalisen domeenin on osoitettu olevan välttämättömiä HIV:n infektiolle [Landau 5 et ai., Nature 334: 159 (1988)]. Tämä molekyyli osoittautui myös epäherkäksi HIV:n indusoimalle solusitkosten muodostumiselle. Sitoutumistutkimukset liukoisella 125I:llä leimatulla gpl20:lla todistivat, että sekä CD4(D1-D4):Ig:CD7:llä että CD4(Dl,D2):Ig:CD7:llä oli ehdoton affiniteetti 10 gpl20:lle.

Seuraavaksi määritimme, kykenisivätkö kimeeriset molekyylit, jotka vastustivat solusitkosten muodostumista, myös ohjaamaan uudelleen solujen kuolemaa, jos ne varustettaisiin liipaisinosalla, kuten tässä on kuvattu. Fuusioimme 15 ζ:η intrasellulaarisen domeenin (kuvio 27) CD4(D1- D4):Ig:CD7:n 3’-päähän ja CD4(D1, D2):Ig:CD7:n 3'-päähän ja valmistimme vastaavat rekombinantti-vaccinia-virukset. Nämä rakenteet, CD4(Dl-D4}:Ig:CD7:ζ ja CD4(Dl,D2):Ig:CD7:ζ (kuvio 20, molekyylit “C" ja "D"), ilmennettiin ihmisen CTL-20 kloonissa WH3, ja testattiin niiden kyky kohdentaa ja tap-paa HeLa-soluja, jotka ilmentävät HIV:n pintavaipan glyko- • · · '·'· proteiinia (käyttäen tässä kuvattuja menetelmiä) . Kuviossa • ·♦ * .* 21 esitetään, että ζ:η intrasellulaarinen domeeni fuusioi- ·;;; tuna joko CD4 (D1-D4) :Ig:CD7:ään tai CD4 (Dl, D2) : Ig: CD7:ään • · *···’ 25 voi välittää tappamiskyvyn; rakenteet, joista puuttui ζ- • ♦ i ** ketju, eivät kyenneet välittämään tätä aktiivisuutta.

··· V * Οϋ4:ζ, positiivinen kontrolli, välitti hieman tehokkaampaa sytotoksisuutta, ja CD4(Dl,D2):lg:CD7:ζ hieman vähemmän te-:V: hokasta sytotoksisuutta kuin CD4(D1-D4):IgCD7:ζ (kuvio 21).

;***; 30 On kuitenkin selvää, että sekä CD4 (D1-D4) : Ig: CO7: ζ~ että • ·· . CD4(D1,D2):Ig:Cd7:ζ-kimeereillä on kapasiteettia välittää • · · * · HIV:n vaippaproteiineja pinnallaan ilmentävien solujen spe sifistä tappamista. Neliosaiset kimeerit olivat järjestel-:V: mällisesti kykenemättömiä välittämään solusitkosten muodos- 35 tumista vacciniaan perustuvassa analyysissä. Olemme myös osoittaneet, että yksi ζ-aihe, joka on kuviossa 11A esite- 52 tyn kaltainen, on riittävä välittämään sytolyyttisen aktiivisuuden CD4{D1-D4)-kimeerille.

Radioimmunosaostuskokeet vahvistivat, että fuu-siomolekyylit olivat pääosaltaan, jolleivät täysin, dimee-5 rejä. Näissä kokeissa käytettiin proteiini-A-agaroosihelmiä immunosaostettaessa liukoiseksi tehty uute metabolisesti leimatuista HeLa-soluista, jotka oli infektoitu rekombi-nantti-vaccinialla, jotka ilmensi CD4(D1-D4):Ig:CD7:ζ- ja CD4(Dl,D2):Ig:CD7:ζ-kimeerejä. Immunosaostettu materiaali 10 fraktioitiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla pelkis tävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa. Erityisesti noin 5 x 106 HeLa-S3-solua infektoitiin, kuten edellä on kuvattu νΡΕίδ:lie, sopivalla vaccinia-viruskannalla. Solut leimattiin metabolisesti 200 pCi:llä/ml Tran3uS-Label {ICN Radio-15 chemicals, Irvine, CA) 6-8 tuntia kysteiini- ja metionii-nipuutteisessa ravintoalustassa ja lohkaistiin PBStllä, joka sisälsi 1 mM EDTA:a. Solut pelletoitiin sitten ja lyy-sattiin seuraavalla: 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5 % NP-40: tä, 0,1 % SDS:ää, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF. 20 Tumien poiston jälkeen sentrifugoimaila yksi viidennes kus-takin solu-uutteesta adsorboitiin pestyihin, proteiini-A-konjugoi turhin agaroosihelmiin 2 tunniksi lämpötilassa • ·· * .* 4 °C. Helmet pestiin sen jälkeen PBS:llä, joka sisälsi 1 % ·· · ·*·· NP-40 :tä, ja eluoitim näytepuskuriin, joka sisälsi SDS:ää • · ]···* 25 merkaptoetanolin läsnä ollessa tai puuttuessa. Tulokset • · ϊ ** näistä kokeista osoittivat, että pääosa immunosaostetuista M· V ·* CD4 (D1-D4) ; Ig:CD7 : ζ : stä ja CD4(Dl,D2): Ig:CD7 : ζ-kimeereistä kulki dimeereinä, joiden molekyylimassa oli odotettu, ei- : pelkistävissä olosuhteissa.

• · ·***· 30 Jotta arvioitaisiin suoraan CD4-fuusiomolekyylejä ··· . ilmentävien solujen kyky tukea HIV-infektiota, valmistimme • · · • ·· * ; pitkäaikaiset mfektiokykytutkimukset transfektanteilla, jotka ilmensivät CD4 (D1-D4.) : Ig: CD7 : ää ja CD4 {Dl, D2 ) : Ig: :Y: CD7:ää. CD4(D1-D4):Ig:CD7:n ja CD4(Dl,D2):Ig:CD7:n stabii- ·:*·· 35 lit transfektantit valmistettiin alalinjana 293-soluista, ihmisen sikiön munuaisesta peräisin oleva helposti trans- 53 fektoitava solulinja. Kimeeriset molekyylit alakloonattiin kaksisuuntaisiin vektoreihin, joissa hygromysiini-B:n geeni ajettiin Herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasipromoot-torilla. Solujen 60 - 70-prosenttisesti konfluentti 10 cm:n 5 malja transfektoitiin 10 pg:n kanssa tätä plasmidi-DNA:ta kalsiumfosfaattiyhteissaostuksella. Ennen transfektiota plasmidit linearisoitiin ainoasta Sfi I -kohdasta, ja päät tehtiin tasaisiksi T4-DNA-polymeraasilla. 24 tuntia trans-fektion jälkeen solut jaettiin neljään osaan ja 48 tuntia 10 transfektion jälkeen solut altistettiin selektiolle hygro-mysiini B:llä (Sigma, St. Louis, Mo} 400 pg/ml. Joka 3. - 4. vuorokausi soluille toimitettiin tuoretta ravintoalustaa, joka sisälsi hygromysiiniä.

Resistentit pesäkkeet poimittiin, kasvatettiin ja 15 niiden ilmentäminen arvioitiin epäsuoralla immunofluore-senssilla käyttäen fluoreskeiiniin konjugoitua anti-ihmis-IgG~Fc:tä (Organon Teknika, VJest Chester, PA) tai Q4120, vasta-aine, joka reagoi ihimisen CD4:n kanssa (Sigma), mitä seurasi virtaussytometria (Coulter, Hialeah, FL). Kaksi 20 kummankin rakenteen itsenäistä kloonia, joiden solupinnan m·'·' CD4~tasot olivat verrattavissa muiden solulinjojen osoitta- • · · I *. miin, valittiin analyysiä varten. Kuvio 22 osoittaa, että • · · *· / altistuksen HIV:lle jälkeen p24 osoitettiin CD4- • · · stabiileissa transfektanttiviljelmissä niin aikaisin kuin 3 • · · • · .

25 vuorokautta infektion jälkeen. Monitumaisten jättisolujen • · • *·· läsnäolo ja luonteenomainen paisuminen oli ilmeistä niin • · · v · varhain kuin 5 vuorokautta infektion jälkeen näissä viljel missä. Mitään merkitseviä p24-tasoja tai todistei-ta monitumaisista jättissoluista ei ollut osoitettavissa • ♦ .**·. 30 transfektoimattomissa emosolul in joissa, tai kummassakaan ··· .·. kahdesta itsenäisesti saadusta CD4(D1-D4):Ig:CD7:n ja • · · ***| CD4 (D1,D2) :Ig:CD7-.n johdannaisesta 32 vuorokauden kuluttua * ' viljelystä (kuvio 22).

Infektiotutkimusten täydennykseksi soluista analy- • · 35 soitiin solupinnan CD4-ilmentyminen. CD4~pintaepitoopin tiheys oli merkitsevästi vähentynyt infektoiduissa viljeimis- 54 sä, jotka ilmensivät CD4:ää, mikä oli yhtäpitävää viruksen alasmodulaation kanssa, mutta se oli ennallaan viljelmissä, jotka ilmensivät CD4(D1-D4):Ig:CD7:ää ja CD4(Dl,D2):Ig:CD7:ää. Nämä tutkimukset osoittavat, että on 5 mahdollista, luoda kimeerisiä molekyylejä, jotka kantavat CD4:n kaksi apikaalista domeenia, ja joilla T-solureseptorin ζ-ketjuun fuusioituna on kapasiteettia kohdentaa ja tappaa HIV:n infektoimia soluja, mutta jotka eivät tue CD4-väiitteistä HIV-infektiota.

10 Lisätutkimukset antavat olettaa, että juuri fysi kaalinen etäisyys CD4-molekyylin ekstrasellulaarisen domee-nin ja lipidikaksoiskerroksen välillä saa aikaan kyvyn vastustaa Hiv-infektiota. Ensimmäisessä kokeessa rakensimme kimeerisen molekyylin, joka sisälsi CD7:n varren ja trans-15 membraanidomeenin deleetion; tämä deleetio poisti proliinia runsaasti sisältävän alueen CD7:n transmenibraaniosasta. Kun tämä domeeni fuusioitiin CD4:n ekstrasellulaariseen domee-niin, se säilytti kykynsä ankkuroida tehokkaasti CD4-molekyylin ekstrasellulaarinen domeeni, kuten voitiin mää-20 rittää CD4-molekyylin solunpintailmentymisellä (kuten tässä ..... on esitetty) . Kyky vastustaa solusitkosten muodostumista, • · · I minkä HIV:n vaipan glykoproteiini indusoi, oli kuitenkin • ♦ · **/ menetetty. Näin ollen CD7-molekyylin proliinia runsaasti ♦ # · sisältävän alueen deleetio, alueen, joka todennäköisesti ··· *...* 25 muodostaa α-helikaalisen silmukkarakenteen, vähensi tehok- • · • *·· kaasti välimatkaa CD4:n ekstrasellulaarisen domeenin ja li- »·» · pidikaksoiskerroksen välillä, ja kumosi kimeerin kyvyn vas tustaa solusitkosten muodostumista.

Toisessa kokeessa osoitimme, että kyky vastustaa • · .*··. 30 HIV:n indusoimaa solusitkosten muodostumista voi riippua • · .· . CD4/CD5-kimeeristä, jonka on aikaisemmin raportoitu palve- • · · *· levän transmembraaniankkurina CD4:n ekstrasellulaariselle * * domeenille, mutta joka oli kykenemätön vastustamaan HIV:n indusoimaa solusitkosten muodostumista. Tässä kokeessa ih- • · ....: 35 misen lgGl:n raskaan ketjun sarana-, CH2- ja CH3-domeenit • · liitettiin CD4/CD5-molekyyliin; saatu kimeeri vastusti so- 55 lusitkosten muodostumista, mikä jälleen antaa olettaa, että immunoglobuliinimolekyylien tarjoama välimatka on riittävä antamaan resistenssin HIV:n indusoimalle solusitkosten muodostumiselle .

5 Kolmannessa kokeessa CD4-domeenia pidennettiin eri laisia etäisyyksiä solumembraanista käyttäen synteettisiä, eri pituisia alfaheliksejä. Erityisesti suunniteltiin synteettiset oligonukleotidit, jotka edustivat lysiini- ja glutamiinihappojäännösten toistuvia alfahelikaalisia aihei-10 ta, ja joita reunustivat kaksi alaniinijäännöstä (katso kuviosta 28 primäärisiä nukleiinihappo- ja aminohapposekvenssejä) . Aikaisemmissa tutkimuksissa tällaisten aminohapposekvenssien havaittiin esiintyvän suurella taajuudella alfa-helikseissä antaen olettaa, että tällaiset toistuvat aiheet 15 ottaisivat itselleen alfahelikaalisen konformaation, ja että tällaisten alfaheliksien asettaminen CD41,n transmembraa-nidomeenin ja ekstrasellulaarisen domeenin väliin ohjaisi CD4:ää pois solumembraanista. Vaihtelemalla alfahelikaalisen segmentin pituutta määriteltiin laskelma projektioetäi-20 syydestä, joka on välttämätön HIV:n pääsyn estämiseksi, pe-rustuen alfaheliksin korkeuden ja kiertymisen tunnettuihin • · · I 1. arvoihin. Nämä tulokset on esitetty taulukossa 1.

• · · • ·· • » ·· · ·»·· ♦ ♦♦ • · • ♦ ·♦· • · • · • · · ··· • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · • · * · • · · • · · • 1 Ή g Φ

S

ä > ...........................................]- Mil 1..............................r~.......1 s

g I

b to *ri S-i 3 I Φ B - >

>1 g I 'JS

xi r-ι -h ^ -y gt -H I I + + + + 1 M + + + I ^ -------------g ö ^

8 ‘H

U ^ « '!j o ω u M d b ±J 4J M M lH ,

H to ;fÖ :rc :<0 J

to O « :rö atJ WÖ CT

d Ό ^ E g S -S

moi

o d -H -H -H

Wgll+ + + +lt+W M M -H

.... td + + — KO — ö =(0 -H :td ® ••*1 ö Ή d g p g .3

O d O S

5-1 -U M S

4-4 CO 4-5 d to ö> to Vj

:V: f * | I

• · =fd £ • ·

• · · CO

·. ·: cn ö . CN ^ ;rö • .iä • * · · v1

+3 -H -H

·*· ϊ s $ a i g -H -H -¾ : £ *7j φ ^ h

::: +4 o o o θ «3 -S

• -U o -H -H ro ^ m β to+toto +4^+4 y εκφφ j®

4J o > > S

':::’ B + B g § g s • · , υίϋΑίίχιη ddö m

’...· H + CJ J Jj Xi Q „ .3 .H -5 S

:·.: # u + co'-— o ·· + ·—- + K Q g ru a) «j

....: E rgtNggggOUoJ^ jj E

• · >*j lXiQ4J4JJ-J4J + +,^t1(-i rj d d 3 U^r-r^r-tncMmnci s. c Φ «5 + ^0^00^^0¾1 « H? d • · · Eh κουυυυυυαΐ + ΐ ·η

. ’ · + " + + + + + + + «^1 g _4) tO

*:··: pqqqooooqH-pu^H-ij 3 UOUOUUUUU^sji n^'# Φ

m Q m i-H

t.........o · u - o o d ^pqOQOOOKH^cj^ + OU Φ ................I... t i l ................-.....-ii rj d in 57 Tässä taulukossa "CD4" edustaa CD4(D1-D4):ää, jollei toisin esitetä; “H", "CH2" ja l1CH3'' edustavat saranaa, CH2- ja vastaavasti CH3-aluetta ihmisen IgGl:n raskaasta ketjusta; "CD7tm“ ja ‘'stkn edustavat CD7:n transmembraani-5 ja varsialueita; "CD7tm (pitkä versio)" ja "CD7tm (lyhyt versio)” edustavat vastaavasti CD7:n transmembraanialuetta ja CD7:n transmembraanialuetta, josta on poistettu prolii-nia runsaasti sisältävä alue (kuten edellä on esitetty); "CD5tm" edustaa CD5:n transmembraanialuetta ja "CD34tm" 10 edustaa CD34:n transmembraanialuetta. Kohdissa J - L alfa-helikaalisen alueen pituus on merkitty ängströmeinä, nämä arvot perustuvat siihen tosiseikkaan, että alfaheliksissä on 3,6 jäännöstä kierrosta kohti, mikä vastaa 5,4 Ä:iä (tai 1,5 Ä:iä jäännöstä kohti).

15 Vastaavasti 16 jäännöksen alfaheliksi työntäisi esiin CD4:n ekstrasellulaarista domeenia noin 24 ängströ-miä. 48 :n ja 72:n angströmin alfaheliksit rakennettiin BstYl-fragmentin sekvenssin konkatemerisoinneilla fragmentin ainoaan BamHl-kohtaan (katso kuviosta 28), mitä seurasi 20 oikean orientaation omaavien kloonien valinta.

Solusitkosten muodostumista arvioitiin yhteisvilje- • · · *·'· lyanalyyseillä HeLa-soluilla, jotka ilmensivät HIV-l:n vai- • * · * .* pan glykoproteiinia vaccinia-viruksen vPE-16-rakenteesta • · · (katso edeltä) .

• · ’···' 25 Thy-l:n ilmentyminen määritettiin seuraavalla ta- • · : *· valla. Rakennettiin elävä retrovirusvektori, joka perustui • · · ·,· : HIV-1:n hxb.2-klooniin. Tässä vektorissa ei-olennainen nef- geeni korvattiin rotan thy-l;n koodittavalla sekvenssillä, tehokkaasti ilmentyvällä solun pintamolekyylillä, joka on • · 30 ankkuroitu membraaniin fos fat idyyl i - inosi toi i liitoksella.

• ·· .* . Tästä molekulaarisesta kloonista johdettu virus, joka ni- • * · 1 mettiin hxb/thy-1 ;ksi, oli infektiokykyinen, kuten sen sy- • · · · · topatologiset vaikutukset ja p24:n tuotanto infektoitujen C8166-solujen (ihmisen CD4+-leukemiasolulinja) viljelmän ·;··♦ 35 supernatanteissa todistivat. Lisäksi altistamisen jälkeen hxb:lle/thy-1:lie, HeLa-solut, jotka oli transfektoitu vä- 58 liaikaisesti CD4:llä, osoittivat merhkejä thy-l:n ilmentymisestä niin varhain kuin 18 tuntia infektion jälkeen, kuten voitaisiin olettaa lähetiltä, jota säädellään nef:n kaltaisella tavalla. Nef-geenin normaalisti koodittamat lä~ 5 hetit sopivat luokkaan virusten säätelyproteiinit, jotka ovat moninkertaisesti liitostuneet, ja joista puuttuu rev-vaste-elementti. Nämä lähetit voivat keräytyä konstitutii-visesti sytolplasmaan varhaisina viraalisina geenituottei-na. Thy-l-lähettien oletettiin olevan samalla tavalla sää-10 deltyjä, mikä tarkoittaa, että ne ilmenevät varhain viruksen elinkierrossa. Lyhyesti sanottuna tämä järjestelmä edisti HIV:n tunkeutumisen analyysiä, kun thy-l:n ilmentymistä käytettiin viruksen tunkeutumisen vastineena. Erilaisia CD4:ään perustuvia kimeerejä transfektoitiin väliaikai-15 sesti HeLa-soluihin käyttäen tavanomaisia DEAE-dekstraanimenetelmiä. Transfektoidut solut altistettiin hxb/thy-1-virukselle 48 tuntia transfektion jälkeen ja niistä arvioitiin thy-l:n ilmentyminen 24 - 48 tuntia infektion jälkeen. Taulukossa 1 esitetyissä tuloksissa thy-20 l:n ilmentyminen määritettiin 24 tuntia infektion jälkeen käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa Thy-1- • · · * *. monoklonaalista vasta-ainetta (Accurate) .

• · · • · · * .* Taulukossa 1 esitetyistä tuloksista vedimme sen ·· · •1j johtopäätöksen, että CD4:n ekstrasellulaariset domeenit tu- • · *···* 25 lisi optimaalisesti suunnata poispäin solumembraanista vä- • · : *' hintaan 48 ängströmiä, ja edullisesti vähintään 72 ängströ- * · · V miä, jotta vastustettaisiin HIV-infektiota.

Käyttäen strategiaa, joka oli samanlainen kuin täs-sä kuvattu yleinen strategia, voidaan rakentaa kimeerejä, • · 2 35 • · 2 0 jotka perustuvat HIV:n vaipan vastaisiin vasta-aineisiin, ··· . ja jotka kohdentavat HIV:n infektoimiin soluihin. Esimerk- • · · *· *| kejä tällaisista vasta-aineista on kuvattu julkaisuissa mt' Gorny et ai., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 86: 1624 (1989) ja

Marasco et ai., J. elin. Invest. 90: 1467 (1992).

• · 59

Esimerkki XX

Esiin työntyvien CD4-molekyylien käyttö HXV-ansoina

Kuten tässä on osoitettu, CD4-domeeneja kantavat solut, jotka on suunnattu pois solun pinnasta, vastustavat 5 HIV:n infektiokykyä. Vastaavasti tällaiset CD4-domeeneja kantavat solut ovat hyödyllisiä ansoina, sitomaan kiertävää HIV:tä ja vähentämään virustiittereitä HIV:n infektoimissa yksilöissä. Edullisesti CD4-domeeni on esitelty solulla, joka kulkee luonnostaan imusolmukkeiden läpi; hyödyllisiin 10 isäntäsoluihin kuuluvat mitkä tahansa solut, jotka näyttelevät osaa immuunisolupuhdistuksessa, samoin kuin mitkä tahansa muut solut, jotka ovat luonnostaan läsnä imusolmukkeiden rakkuloissa. Erityisiin esimerkkeihin kuuluvat, ilman rajoituksia, makrofagit, T-solut (esim. auttaja-T-15 solut), B-solut, neutrofiilit, dendriittisolut ja follikkelien dendriittisolut.

Mitä tahansa CD4-domeenia, joka kykenee sitomaan HIV:tä, mukaan luettuna D1-D4- ja Dl-, D2-domeenit, jotka on kuvattu tässä, voidaan käyttää tämän keksinnön mukaises-20 ti. vähintään joitakin suoritusmuotoja varten (esimerkiksi edellä kuvattuja varten) , intrasellulaarinen ja/tai trans- · · t·,*; membraanidomeeniosat kimeeristä voidaan valita mistä tähän- • · · ’ sa proteiinista tai mistä tahansa aminohapposekvenssistä.

—: Esimerkki XIX

• · · • · ’···’ 25 Muita T~solureseptoria ja B-solureseptoria laukai- • · : *** savia proteiineja ··· V · Muita tässä keksinnössä käyttökelpoisia intrasel- lulaarisia ja transmembraani-signaalin välittäjädomeeneja :V: voidaan johtaa T-solureseptoriproteiineista, CD3-delta ja :***; 30 T3-gamma, ja B-solureseptoriproteiineista, mbl ja B29. Näi- ··« .*. den proteiinien aminohapposekvenssit on esitetty kuviossa « · « ** *j 16 (CD3 delta, sekvenssi nro 24) kuviossa 17 (T3-gamma, sekvenssi nro 25), kuviossa 18 (mbl, sekvenssi nro 26) ja kuviossa 19 (B29, sekvenssi nro 27) . Sekvenssien osat, jot- • · ····· 35 ka riittävät sytolyyttiseen signaalinvälitykseen, on esi tetty hakasuluissa. Kimeeriset reseptorit, jotka sisältävät 60 nämä proteiinidomeenit, on rakennettu ja niitä käytetään keksinnön mukaisissa terapeuttisissa menetelmissä yleisesti, kuten edellä on kuvattu.

Esimerkki XIII

5 Kokeelliset menetelmät

Vaccinia-infektio ja radioimmunosaostus

Noin 5 x 106 CVl-solua infektoitiin yhden tunnin aikana seerumittomassa DME-ravintoalustassa, jossa oli re-kombinanttista vaccinia-virusta infektoivan yksikön (moi) 10 arvona vähintään kymmenen (tiitteri määritetty CV1-soluista). Solut laitettiin tuoreeseen ravintoalustaan infektion jälkeen ja leimattiin metabolisesti 200 pCi:llä/ml 35S-metioniinia plus kysteiiniä (Tran35S-leima, ICN, Costo Mesa, CA) metioniinittomassa ja kysteiinittömässä DMEM-15 ravintoalustassa (Gibco, Grand Island, NY) kuusi tuntia. Leimatut solut irrotettiin PBS:llä, joka sisälsi 1 mM ED-TA:a, kerättiin sentrifugoimalla ja lyysattiin seuraavassa: 1 % NP-40: tä, 0,1 % SDS:ää, 0,15 M NaCi, 0,05 M Tris, pH

8,0, 5 mM EDTA ja 1 mM PMSF. Tumat poistettiin sentrifugoi-20 maila ja CD4-proteiinit immunosaostettiin OKT4-vasta~ aineella ja anti-hiiri-IgG-agaroosilla (Cappel, Durham, • · · t*/. NC) . Näytteet ajettiin elektroforeesilla 8-prosenttisten • · · polyakryyliamidi/SDS-geelien läpi ei-pelkistävissä olosuh- ··· *::: teissä (NR) ja pelkistävissä (R) olosuhteissa. 35S- • · '···' 25 leimattuja näytteitä sisältävät geelit kyllästettiin • ** En3Hance:lla (New England Nuclear, Boston, MA) ennen auto- ··· ·.· · radiografiaa. CD16:n transmembraanimuodon 0016™ edistetty ilmentyminen määritettiin vertaamalla sen ilmentymistä CV1-:V: soluissa, jotka oli infektoitu yksin CD16Tt.]:llä ilmentymi- :***: 30 seen soluissa, jotka oli koinfektoitu virusten kanssa, jot- ♦ · « .* . ka koodittivat CDl6TH:ää ja ζ- tai γ-kimeerejä. Infektion • · ♦ * * jälkeen ja kuuden tunnin tai pitemmän ajan inkubaation jäl keen solut irrotettiin maljoista PBS:llä, 1 mM EDTA, ja CDl6TM:n ilmentyminen tai kimeerien ilmentyminen määritet-•j··· 35 tiin epäsuoralla immunofluoresenssilla ja virtaussytometri- alla.

61

Kalsiumvirfcausanalyysi

Jurkat-solujen alalinjan E6 [Weiss et ai., J. Immunol. 133: 123 - 128 (1984)] solut infektoitiin rekorabinant-ti-vaccinia-viruksilla yhden tunnin aikana seerumittomassa 5 iMDMrssä moi:n ollessa 10 ja inkuboitiin kolmesta yhdeksään tuntia seuraavassa: IMDM, 10 % FBS:ää. Solut kerättiin sentrifugoiroalla ja suspendoitiin uudelleen 3 x 106 so-lua/ml täydelliseen ravintoalustaan, joka sisälsi 1 mM Indo- 1-asetometoksiesteriä [Grynkiewicz et ai., J. Biol. 10 Chem. 260: 3340 - 3450 (1985)] (Molecular Probes) ja inku-bointiin 37 °C:ssa 45 minuuttia. Indo-1-ladatut solut pel-letoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1 x 106/ml seerumitto-maan IMDM:ään ja varastoitiin huoneenlämpöön pimeään. Soluista analysoitiin vapaa kalsiumioni määrittämällä saraan-15 aikaisesti violetti ja sininen fluoresenssiemissio virtaus-sytometrialla [Rabinovitch et ai., J. Immunol. 137: 952 - 961 (1986)]. Jotta aloitettaisiin kalsiumvirtaus, lisättiin joko fykoerytriiniin (PE)-konjugoitua Leu-3A(anti-CD4):ää (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) 1 pg/ml solususpensi-20 oon, mitä seurasi 10 pg/ml konjugoimatonta vuohen anti-hiiri-IgGstä ajankohtana 0 tai konjugoimatonta 3G8 (anti- * » · CD16) -monoklonaalista vasta-ainetta lisättiin solususpen- • ·· * / sioon 1 pg/ml, mitä seurasi 10 pg/ml PE-konjugoitua vuohen

Pab2' anti-hiiri-IgG:tä ajankohtana 0, Violetin/sinisen • · [···* 25 emission tason histogrammit kerättiin PE-positiivisista • · • ** (infektoiduista) solupopulaatioista, jotka tyypillisesti • · · ·.· · edustivat 40 - 80 prosenttia kaikista soluista. T-solujen antigeenireseptorivaste infektoimattomissa soluissa lau- • · : : : kaistiin vasta-aineella 0KT3 ilman ristisitomista. Kokeis- • · 30 sa, joihin liittyi kimeeriset CD16-reseptorit, näytteet, ··· . jotka osoittivat peruslinjan ajelehtimista kohti matalampaa * ’ solunsisäistä kalsiumia (ilman vasta-ainetta) poistettiin analyysistä. Histogrammitietoja analysoitiin sen jälkeen • · muuntamalla binääritiedot ASCII :ksi käyttäen Write Hand Man *;··: 35 (Cooper City, FL) ohjelmistoa, mitä seurasi analyysi koko elmalla Fortran-ohjelmia. Violetin/sinisen emissiotasoa en- 62 nen toisten vasta-ainereagenssien lisäämistä käytettiin muodostettaessa normalisoitu alkuperäinen taso, joka asetettiin mittayksiköksi, ja lepotilan kynnysarvo, joka asetetuin niin, että 10 % lepopopulaatiosta ylittäisi kyn- 5 nysarvon,

Sytolyysimääritys

Ihmisen T-solulinjaa WH3, CD8+ CD4” HLA B44 rajoitteinen sytolyyttinen linja pidettiin yllä IMDMrllä, jossa oli 10 % ihmisen seerumia, 100 U/ml lL-2:ta, ja sitä 10 stimuloitiin ajoittain joko epäspesifisesti säteriytetyllä (3 000 rad) HLA-ei-yhteensopivilla periferaalisilla veren lymfosyyteillä ja 1 pg:11a/ml fytohemagglutiinia tai spesifisesti, säteilytetyillä B44:ää kantavilla mononukleaari-silla soluilla. Yhden päivän epäspesifisen stimulaation 15 jälkeen PIIA laimennettiin 0,5 pg:aan/ml lisäämällä tuoretta ravintoalustaa, ja kolmen päivän jälkeen alusta vaihdettiin. Soluja kasvatettiin vähintään 10 päivää stimulaation jälkeen ennen käyttöä sytotoksisuusanalyyseissä. Solut in-fektoitiin rekombinantti-vaccinialla infektoivan yksikön 20 arvon ollessa vähintään 10, yhden tunnin aikana seerumitto-massa ravintoalustassa, mitä seurasi inkubointi täydelli- • · · .·/. sessä ravintoalustassa kolmen tunnin aikana. Solut kerät- • ·· * tiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen • · · "" tiheyteen 1 x 107 solua/ml. Täydellistä alustaa 100 • · [···’ 25 μΐ/kaivo sisältävän U-pohjaisen mikrotiitterilevyn kuhunkin • · ' ** kaivoon lisättiin 100 μΐ. Solut laimennettiin kaksinkertai- • ·· · sella vaihesarjalla. Kaksi kaivoa kustakin näytteestä ei sisältänyt lymfosyyttejä, jotta mahdollistettaisiin spon-ί taanin kromin vapautumisen ja kromin kokonaisoton määrittä- 30 minen. Kohdesolut HeLa-alalinjasta S3 infektoitiin 6,0 tai ··· . 10,0 cm:n maljoilla moi:n ollessa noin 10 yhden tunnin ai- • ♦ · * * kana seerumittomassa ravintoalustassa, mitä seurasi inku bointi täydellisessä ravintoalustassa kolmen tunnin aikana.

: Ne irrotettiin sitten maljoista PBS:llä, 1 mM EDTA, ja las- • · ·;··· 35 kettiin. 106 kohdesolun määrä (HeLa-, Raji- tai RJ2.2.5- soluja kokeille kimeerisillä CD4-reseptoreilla ja 3G8 10-2 63 -soluja; Shen et ai., Mol. Immunol. 26 959 (1989) kokeille kimeerisillä CDl6-reseptoreilla) sentrifugoitiin ja suspen-doitiin uudelleen 50 pliaan steriiliä 51Cr-natriumkromaattia (1 mci/ml, Dupont Wilmington, DE) yhden 5 tunnin ajaksi 37 °C:ssa sekoittaen ajoittain, sitten pestiin kolme kertaa PBSillä. 100 μΐ leimattuja soluja, jotka oli suspendoitu uudelleen ravintoalustaan 105 solua/ ml, lisättiin kuhunkin kaivoon. Raji- ja RJ2.2.5-kohdesolut leimattiin samalla tavalla kuin HeLa-solut. Mikrotiitteri-10 levyä pyöritettiin 750 x g 1 minuutin ajan ja inkuboitiin 4 tuntia 37 °C:ssa. Inkubointiajan lopuksi solut kussakin kaivossa suspendoitiin uudelleen pipetoimalla varovasti, otettiin näyte liittyneen radioaktiivisuuden määrittämiseksi (counts) ja mikrotitterilevyä pyöritettiin 750 x g 1 mi-15 nuutin ajan. Otettiin 100 μ1:η näytteet supernantantista ja laskettiin gammasäteilyn tuikelaskurilla. Tappamisprosentti korjattiin infektoltujen kohdesolujen fraktion mukaan (yleensä 50 - 90 %) määritettynä virtaussytometrialla. Infektoidu! Ile efektorisoluille efektori: kohde-suhde korjat-20 tiin infektoitunen solujen prosentuaalisen määrän mukaan (yleensä 20 - 50 % kokeissa kimeerisellä CD4-reseptorilla • · · : ja > 70 % kokeissa kimeerisellä CDl6-reseptorilla) .

• M

ζ-sekvenssin mutageneesi in vitro ··· * ..............

***; Jotta luotaisiin pistemutaatioita ζ-sekvenssin ami- • · !;··* 25 nohapp o jäännöksiin 11 ja 15, valmistettiin synteettiset • * • “ oligonukleotidialukkeet, jotka ulottuivat BamHI-kohdasta • · · v · ylävirtaan ζ:η transmembraanidomeenista ja jotka muunsivat natiivin ζ-jäännöksen 11 Cysistä Gly:ksi (C11G) tai jään- nöksen 15 Aspista Glyiksi (D15G) tai sekä että (C11G/ :***: 30 D15G) , ja niitä käytettiin PCR-reaktioissa luomaan muta- ··· .* . toidut fragmentit, jotka insertoitiin uudelleen villityyp- • · · # · · ’ * pisiin CD4:ζ-rakenteisiin.

Jotta luotaisiin ζ:η deleetiot, ζ-cDNA-sekvenssit !#i]: monistettiin PCRillä käyttäen synteettisiä oligonukleoti- ·:··· 35 dialukkeita, jotka oli suunniteltu, jotta luotaisiin lope- tuskodoni (UAG) jäännöksen 50, 59 tai 65 jälkeen. Alukkeet 64 sisälsivät entsyymin No tl pilkkoutumiskohdan, joka oli sisennetty viisi tai kuusi jäännöstä 5'-päästä, yleensä sekvenssiin, jonka muoto oli CGC GGG CGG CCG CTA (sekvenssi nro 11) , jossa viimeiset kolme jäännöstä vastaavat stop-5 antikodonia. NotI- ja stop-antikodonisekvenssejä seurasi 18 tai useampi jäännös, jotka olivat komplementaariset fragmentin halutulle 3'-päälle. Saadut kimeerit nimettiin CD16:ζΥ51*:ksi, CD16:ζΕ60*:ksi ja vastaavasti CD16: ζθ66*^3ί. BamHI-kohtaa ylävirtaan transmembraanidomeenista 10 ja Notl-kohtaa käytettiin luomaan fragmentit, jotka liitettiin uudelleen villityyppiseen CDl6ζ-rakenteeseen. Luotiin monomeeriset ζ-kimeerit vapauttamalla ζ:η transmembraani-ja membraanisekvenssien viereiset intrasellulaariset sekvenssit pilkkomalla edellä kuvattu Asp" ja Cys~-CD4^~ 15 rakenne BamHI:llä ja Sacl:llä ja liittämällä fragmentti CD16:ζΕ60*- ja vastaavasti CD16;ζ066*-rakenteeseen.

Kolmiosaisten kimeerien CD16:7:ζ(48-65) ja CDl6s 7ζ(48-59) rakentaminen

Jotta valmistettaisiin rakenne Οϋ16:ζϋ66*, ζ-cDNA-20 sekvenssi, joka vastasi transmembraanidomeenia ja 17:ää seuraavaa jäännöstä sytoplasmisesta domeenista, korvattiin • · .·. : vastaavalla transmembraanidomeenilla ja sytoplasmisella do- * ·· meenilla, joka saatiin CD5- ja CD7-cDNA:sta. CD5- ja CD7- *”* fragmentit luotiin PCR-reaktiolla käyttäen eteenpäin suun- ♦ · ]···* 25 nattuja oligonukleotideja, jotka sisälsivät BamHI- • · ' ** restriktiopilkkomiskohdan, ja jotka vastasivat aluetta juu- ··· *.· * ri ylävirtaan CD5:n ja vastaavasti CD7:n transmembraanido meenista, ja seuraavia käänteisiä oligonukleotideja, jotka • · limittyivät CD5- ja vastaavasti CD7-sekvenssi en yli, ja ζ- :***: 30 sekvenssiä, joka sisälsi Sacl-restriktiopilkkomiskohdan.

···

.*. CD5:ζ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG

* * CTT CTT CTG (sekvenssi nro 12) CD7:ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT A-TC CCG (sekvenssi nro 13) .

• · *:··· 35 CD5- ja CD7-PCR-tuot teet pilkottiin BamHI :llä ja

Sacl:llä ja ligatoitiin BamHI:llä ja Sacl:llä pilkottuiin 65 CD16: ζΕ60*;ββη ja korvaten ζ-sekvenssi BamHI:stä Saclrteen CD7-fragmentiila. Jotta saataisiin tehdyksi rakenteet CD16:CD5 ja CD16:CD7, CD5- ja CD7-fragmentit saatiin PCR:llä käyttäen oligonukleotidia, joka sisälsi Notl-5 restriktiopilkkomiskohdan ja kooditti lopetuskodonia (UAA) CD5:n ja vastaavasti CD7:n jäännöksen Gln416 ja Alal93 jälkeen. CD5- ja CD7--PCR- fragment ti pilkottiin BamHl:llä ja NotI:llä ja liitettiin CDl6:ζΑερβ6*-rakenteeseen.

N-terminaalisten jäännösten mutageneesi in vitro 10 ζ:n sytolyyttisen signaalinvälitysaiheen sisällä

Syntetoitiin synteettiset oligonukleotidialukkeet, jotka ulottuivat Notl-kohdasta 3'-suuntaan lopetuskodonista ja jotka muunsivat natiivin jäännöksen 60 Glu:sta Giniksi (E60Q), jäännöksen 61 Glu:sta Gln:ksi (E61Q), jäännöksen 62 15 Tyr:stä Phe:ksi tai Serrksi (Y62F tai Y62S) ja jäännöksen 63 Asp:sta Asn:ksi {D63N), ja niitä käytettiin PCR:ssä luomaan fragmentit, jotka alakloonattiin villityyppiseen CDl6:ζθ66*-rakenteeseen BamHl-kohdasta Notl-kohtaan.

Kimeerirakenteet CDl6:7:ζ{33-65), CDl6:7:ζ(71-104), 20 CDl6i7 ϊ ζ(104-137) CD7-transmembraanifragmentti, joka sisälsi MluX- ja • ♦ · l \ Notl-kohdat liitoksessa transmembraanidomeenin ja intrasel- • · · • ♦· *.* lulaarisen domeenin välillä, saatiin PCR:llä käyttäen oli- ···

··" gonukleotidia, jonka sekvenssi on seuraava: CGC GGG GCG GCC

*···* 25 ACG CGT CCT CGC CAG CÄC ACA (sekvenssi nro 14) . Saatu PCR- ·· • · J *· fragmentti pilkottiin BamHl:llä ja NotI:llä ja liitettiin • ·· V · uudelleen CD16:7:ξ(48-65)-rakenteeseen. Jäännöksiä 33 - 65, 71 - 104 ja 104 - 137 koodittavat ζ-fragmentit saatiin FCR-reaktiolla käyttäen alukepareja, jotka sisälsivät MluI- • ♦ :***; 30 kohdat eteenpäin suuntautuvien alukkeiden 5’-päässä ja lo- ··· .* . petuskodonit, joita seurasivat Notl-kohdat käänteisten • · · ’· *5 alukkeiden 5’-päässä. Kussakin tapauksessa restriktiokohdat sisennettiin kuusi jäännöstä alukkeen 5'-päästä, jotta var- :V: Kiistettiin restriktioentsyymipilkkominen.

• ·

35 ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC

ACA {sekvenssi nro 15), 66 ζ 71: CGC GGG AC G CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (sekvenssi nro 16) ja ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (sekvenssi nro 17) .

5 FcKyllÄ-deleetiomutanttien rakentaminen

Karboksyyliterminaaliset FcRIlA-deleetiomutantit rakennettiin PCRtllä samanlaisella tavalla kuin täysipitui-set rakenteet muuntamalla tyrosiinia koodattavat sekvenssit asemissa 282 ja 298 lopetuskodoneiksi (TAA).

10 N-terminaaliset deleetiot luotiin monistamalla PCR:llä fragmentit, jotka koodittivat peräkkäin yhä vähemmän intra-sellulaarisesta domeenista, käyttäen oligonukleotideja, jotka sallivat saatujen fragmenttien liittämisen Mlul- ja Notl-restriktiokohtien väliin aikaisemmin rakennettuun il- 15 mentämisplasmidiin, joka kooditti CD16:n ekstrasellulaaris-ta domeenia fuusioituna CD7:n transmembraanidomeeniin jälkimmäisen päättyessä Mlul-kohtaan, ja liitosta transmem-braanidomeenin ja intrasellulaarisen domeenin välillä.

Muut suoritusmuodot 20 Edellä kuvatut esimerkit osoittavat, että ζ, η tai γ-kimeerien aggregaatio riittää aloittamaan sytolyyttisen • · : efektorisoluvasteen T-soluissa. ζ:η, η:η ja y:n tunnettu • ·· .·! ilmentämisen vaihtelualue, johon sisältyvät T-lymfosyytit, '111 luonnolliset tappajasolut, basofiiliset granulosyytit, mak- • · 25 rofagit ja syöttösolut, antaa olettaa, että konservoituneet • · • ’* sekvenssiaiheet voivat olla vuorovaikutuksessa sensorisen «»· • · ♦ '·* * järjestelmän kanssa, joka on yhteinen hematopoieettista al kuperää oleville soluille, ja että tärkeä osatekijä isännän • · V.· puolustuksessa immuunijärjestelmässä voi olla reseptorin 30 aggregaatiotapahtumien välittämä.

,·[ . Sytolyyttisen vasteen tehokkuus ja vasteen puuttu- • · · minen MHC-luokan II reseptoreja kantavia soluja kohtaan • · , osoittaa, että ζ:, η: tai y:aan perustuvat kimeerit. muodos- • · ί,ί.ί tavat perustan geneettiselle väliintulolle AIDS:in suhteen *:**: 35 omaksutun immunoterapian välityksellä. Endogeenisten ζ:η ja y:n laaja levinneisyys ja todisteet, että Fc-reseptorit, 67 jotka liittyvät y:aan, välittävät sytotoksisuutta eri solu-tyypeissä [Fanger et ai., Immunol. Today 10: 92 - 99 {1989}], mahdollistaa erilaisten solujen varteenottamisen tätä tarkoitusta varten. Esimerkiksi neutrofiiliset granu-5 losyytit, joilla on erittäin lyhyt elinkaari {n. 4 t) kierrossa, ja jotka ovat erittäin sytolyyttisiä, ovat houkutte-levia kohdesoluja kimeerien ilmentämiselle. Neutrofiilien infektio HIV:llä ei todennäköisesti johda viruksen vapautumiseen, ja näiden solujen runsauden (vallitsevimpia leuko-10 syyteistä) tulisi edistää isännän puolustusta. Vielä eräs houkutteleva mahdollisuus isäntäsoluiksi ovat kypsät T-solut, populaatio, joka on nykyisin helposti käsiteltävä retrovirus tekniikoissa [Rosenberg, Sei. Am. 262: 62 - 69 (1990)]. Rekombinantti-IL-2:n avulla T-solupopulaatioita 15 voidaan kasvattaa viljelmässä suhteellisen helposti, ja laajennetuilla populaatioilla on tyypillisesti rajallinen elinkaari, kun ne infusoidaan uudelleen ]Rosenberg et ai., N. Engl. J. Med. 323: 570 - 578 (1990)].

Sopivissa olosuhteissa CD4-kimeerejä ilmentävien 20 solujen HIV-tunnistuksen tulisi myös tarjota mitogeenistä ärsykettä sallien sen mahdollisuuden, että varustettu solu- • » .·, ; populaatio voisi reagoida dynaamisesti viruskuormitukseen.

• ··

Vaikka olemme keskittyneet tässä fuusioproteiinien käyttäy- *1" tymiseen sytolyyttisissä T-lymfosyyteissä, kimeerien ilmen- • · [;*·* 25 täminen auttajalymfosyyteissä saattaisi tarjota käyttöön • · : ** sytokiinien HIV:n mobilisoiman lähteen, mikä voisi kumota ··· ·.* * auttajasolujen osajoukon häviämisen AiDS:issa. viimeaikai set kuvaukset useista hankkeista resistenssin aikaansaanti- • · ί^ϊ seksi infektiolle muissa vaiheissa kuin viruksen tunkeutu- 30 misvaiheessa [Friedman et ai., Nature 335: 452 - 454 ··· . (1988); Green et ai., Cell 58: 215 - 223 (1989); Maliin et • · · * ; ai., Cell 58: 205 - 214 (1989); Trono et ai., Cell 59: 113 - 120 (1989); Buonocore et ai., Nature 345: 625 - 628 :V: (1990)] antavat olettaa, että voitaisiin suunnitellla CD4- *:··· 35 kimeerejä kantavia soluja estämään viruksen tuotanto ilmen- 68 tämällä oikeita aineita, joilla on intrasellulaarinen toimintapaikka .

Kyky välittää signaaleja T-lymfosyyteille autonomisten kimeerien välityksellä tarjoaa käyttöön myös ky-5 vyn säädellä retroviruksilla muunnettuja lymfosyyttejä in vivo. Ristisitomisärsykkeet, joita välittävät esimerkiksi spesifiset IgM-vasta-aineet, joita on käsitelty komplementtia sitovien domeenien poistamiseksi, voivat mahdollistaa tällaisten lymfosyyttien lukumäärän lisääntymistä in situ, 10 kun taas käsittely samanlaisilla spesifisillä IgG-vastaanneilla (jotka esimerkiksi tunnistavat aminohappovariaati-on, joka on liitetty kimeeriseen ketjuun), voisivat kuluttaa loppuun muunnetun populaation selektiivisesti. Lisäksi anti-CD4-IgM-%1as ta- aineet eivät vaadi ylimääräisiä ris-15 tisidoksia kalsiumin mobilisoimiseksi Jurkat-soluissa, jot ka ilmentävät CD4:ζ-kimeerejä. Kyky säädellä solupopulaatioita, ilman että turvaudutaan toistettuun monistamiseen kehon ulkopuolella, voi pidentää olennaisesti nykyisten geneettisesti muunnetuille T-soluille suunniteltujen käyttö-20 tapojen aluetta ja tehokkuutta.

Vaikka keksintöä on kuvattu sen erityisten suori- • · · tusmuotojen yhteydessä, voidaan ymmärtää, että keksintö ky- • · · * .1 kenee lisämuunnelmiin, ja tämän patenttihakemuksen tarkoi- • · · *”j tetaan kattavan keksinnön muunnelmat, käytöt tai sovellu- • · ’···1 25 tukset, mukaan luettuna sellaiset poikkeamat tästä seli- • ♦ • 1 : 2 tysosasta, jotka kuuluvat alaan, johon keksintö kuuluu, ja • · · ·.· 1 joita voidaan soveltaa tässä edellä esitettyihin olennai siin piirteisiin, kuten mukaan liitettyjen patenttivaati- :V: musten piiristä käy ilmi.

··· • · • · • · · • · · • · · • · · • · • · • · • · · • · · 2 • · 69

Sekvenssilistaus (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: Seed, Brian et ai.

(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Soluja, joissa on CD4-hou kutusreseptoreita ja vastaavia molekyylejä ja menetelmiä {iii} SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 52 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Fish & Richardson P.C.

{B) KATU: 225 Franklin Street (C) KAUPUNKI: Boston

(D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: MA

(E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO: 02110-2804 {v} KONBKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke, 3,5", 1,44 Mb

(B) TIETOKONE: IBM PS/2 malli 50Z tai 55SX

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: IBM PC-DOS (versio 3.30) (D) OHJELMISTO: Wordperfect (versio 5.0) (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 08/394 388 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 24.2.1995 iV: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: .·. j (A) HAKEMUSNUMERO: 08/284 391 *♦ ·: (B) JÄTTÖPÄIVÄ; 2.8.1994 ··· *::: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 08/195 395 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 14.2.1994 • # · (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: * (A) HAKEMUSNUMERO: 07/847 566 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 6.3.1992 • · • · · (viii) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: (A) NIMI: Karen F. Lech, Ph.D.

(B) REKISTERINUMERO: 35 238 (C) VIITE/LUETTELONUMERO: 00 786/272 001 • · • (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: .·. (A) PUHELIN: (617) 542-5070 (B) TELEFAX: (617) 542-8906 (C) TELEX: 200154 • · 70 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1 728 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC SO

GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 crxcTTAACX AAAGGTCCAT CCAAGCXGAA TGATCGCGCT GACTCAACAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA ftACTTCCCCC XGATCATGAA GAATCTTRÄG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGÄAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGÄCCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500

GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT SSO

GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 • ♦ • · · ***** GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 • · • · · ** *: ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGÄCGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 »»· • · ' *♦♦·* TGGATCACCT TTGACCTGAA GÄACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 • · • · : ** CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 • · · • · · *·’ TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGÄ AAÄCAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 • · • · · ***** GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AÄÄÄTTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 • · · • · *···* CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 : GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 • · *:**: GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 .*.*. TCAÄGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCÄCGCGGA TCCCAAACTC 1200 • · · • · TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC 1250 • · CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTGCCAACC 1300 TGCAGGACCC GAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCXAGG GCGAAGAGAG 1350 71 GAATATGACG XCXTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG 1400 CAAACAGCAG ÄGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AAXGCACTGC 1450 AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCXACAGXG AGATCGGCAC AAAAGGCGAG 1500 AGGCGGAGAG GCAAGCGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA 1550 AGCAGTGCAG TTCGGGÄACA GAAGAGAGAG AGAAGGXXCA GAACTCACAA 1500 GGACCCTXGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT 1650 AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTXCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG 1700 GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCXAA 1728 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1 389 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: AXGAACCGGG GÄGTCCCTTX TAGGCÄCXTG CXTCTGGXGC TGCAACEGGC 50 . . GCXCCXCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 • · · • · · I *. GGGAIACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 • · · • · · * .* TXCGACTGGA AAAACXCCÄA CCAGATAAAG ATXCXGGGAA ATCAGGGCXC 200 • · · "!! CTTCXTAAGX AAAGGTCCAT CCAAGCXGAA XGATCGCGCT GACXGAAGAA 250 • · ' • · GAÄGCCTXTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGAXCAXCAA GAATCXTAÄG 300 • · ATAGAAGACT CAGATACTTA CÄTCXGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 ♦ · ♦ ’** GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATXGACXGC CÄACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TXCAGGGGCA GAGCCXGACC CTGACCXTGG AGAGCCCCCC TGGXAGXAGC 450 • · • · · *·*·* CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACÄXAC AGGGGGGGÄA 500 ··· • · *···* GACCCTCTCC GTGXCXCAGC TGGAGCTCCA GGATAGXGGC ACCTGGACAT 550 GCACXGTCTX GCAGAACCAG AAGAAGGXGG AGTXCAAAAT AGACATCGXG 600 • ♦ *:·*: GXGCTAGCTT XCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AÄGAGGGGOA 650 ACAGGTGGAG TTCTGCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 • · · GCAGTGGCGA GCTGXGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 • · 12 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGCGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCXCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCGAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GXXGCATCAG GAAGTGAACC IGGXGGTCAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA CGAGGCAAAG 1050 GTCXCGAAGC GGGAGAAGCC GGXGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GXGGCAGTGT CXGCTGAGTG ACTCGGGACA GGXCCT5CXG GAAXCCAACA 1150 TCAAGGXXCT GCCCACATGG TCCACCCCGG XGCACGCGGA XCCGCAGCTC 1200 XGCTAXAXCC IGGAXGCCAX CCTGXXXTXG TAXGGTAXXG XCCXTACCCT 1250 GCTCTACXGT CGACTCAAGÄ TCCAGGXCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC 1300 GXGAGAAATC AGAXGCTGTC TACACGGGCC XGÄACACCCG GAACCAGGAG 1350 ACATATGAGA CXCTGAAACÄ TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1 599 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen {D) TOPOLOGIA: lineaarinen ;y. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) • ♦ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: ·· « ATGAACCGGG GAGTCCCXTX TAGGCACTTG CXICXGGTGC XGCAACXGGC 50 • · -• · .·" GCTCCTCCCA GCAGCCACXC AGGGAAACAA AGTGGTGCXG GGCAAAAAAC 100 • · • · · GGGATÄCAGT GGAACTGACC TGXACAGCXT CCCAGAAGAA GAGCAXACAA 150 • · · • · » TTCCACXGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG AXXCXGGGAA AXCAGGGCTC 200 • . CTTCXTAACX AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGAXCGCGCX GACXCAAGAA 250 • « · • ♦ · GAAGCCTXIG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGAXCATCAA GAAXCXXAAG 300 • · • · • · 73

GÄCCCXCTCC GTGXCXCAGC TGGAGCXCCA GGÄXAGXGGC ACCTGGACAT SSO

GCACTGTCTX GCAGAACCAG AAGAAGGXGG AGXXCAAAAX AGACAXCGTG 600 GTGCTAGCTX TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACXCGCCXT XACAGTXGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCCA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGICX 7S0 TGGATCACC? TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC S00 CCAGGACCCT AAGCXCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCXCACCC 650 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTXGCAXCAG GAAGXGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CÄGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 2000 CCTCCCCTÄA GCTGÄTGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACÄA GGAGGCAAÄG 1050 GTCICGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100

GTGGCAGTGT CTECTGAGXG ACTCGGGACA GGTCCXGCTG GÄAXCCAACA 11SO

XCAAGGXTCT GCCCACATGG XGCACCCCGG TCCACGCGGA XCCCÄAÄCXC 1200 TGCTACCTGC TGGAXGGAAT CCTCXXCATC TAXGGTGTCA XTCXCACTGC 1250 CXTGTTCCXG AGAGTGAAGT XCÄGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGXACC 1300 AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC XCAATCTAGG ACGAAGAGAG 1350 GAGTACGATC TTTTGGACAA GAGACGTGGC CGGGACCCXG AGATGGGGGG 1400 AAAGGCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCXGXACAAX GAACXGCAGA 1450 . . AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC 1500 • · « • · · * *. CGGAGGGGCA AGGGGCACGA XGGCCTTXAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC 1550 • Φ · * .* CAAGGACACC XACGACGCCC TTCACAXGCA GGCCCXGCCC CCTCGCTÄA 1599 ··· • · · · * · ·

• · H

!:**’ (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 575 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo . . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · · • · .··*. (li) MOLEKYYLI TYYPPI: proteiini ··· .·! : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: • · · • · ***** Met Asn Arg Gly Vai Pro Phe Ärg Kie Leu Leu Leu Vai Leu Gin Leu 15 10 15

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Xhr Gin Gly Asn Lys Vai Vai Leu Gly Lys * *# 20 25 30 • · 74

Ly a Gly Asp Thr Vai Glu Leu Thr Cya Thr Ala Ser Gin Lya Lys Ser 35 40 ' 45

Ile Gin Phe His Trp Lys Aan Ser Αβπ Gin Xle Lya Ile Leu Gly Aan 50 55 60

Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lya Gly Pro ser Lya Leu Aan Asp Arg Ala 65 70 75 80

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Aan Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95

Lys Aan Leu Lya Ile Glu Asp ser Asp Thr Tyr Ile Cya Glu Vai Glu 100 105 110

Asp Gin Lys Glu Glu Vai Gin Leu Leu Vai Phe Glv Leu Thr Ala Aan 115 120 125

Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Vai Gin Cye Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160

Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Vai Ser Gin Leu Glu Leu 165 170 175

Gin Aap Ser Gly Thr Trp Thr Cye Thr Vai Leu Gin Asn Gin Lye Lya 180 185 190

Vai Glu Phe Lys Ile Asp Ile Vai Vai Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser 195 200 205

Ser Ile Vai Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gin Vai Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220

Leu Ala Phe Thr Vai Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240

Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lya Ser Trp Ile Thr Phe Aap Leu 245 250 255

LyB Asn Lya Glu Vai Ser Vai Lye Arg vai Thr Gin Asp Pro Lya Leu 260 265 270

Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280 285

Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300

Thr Gly Lys Leu Kis Gin Glu Vai Asn Leu Vai Vai Met Arg Ala Thr 305 310 315 320

Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cya Glu Vai Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lya Vai Ser *·*·* 340 345 350 : Lye Arg Glu Lys Pro Vai Trp Vai Leu Asn Pro Glu Ala Gly Het Trp ” 355 360 365

Gin Cys Leu Leu Ser Aap Ser Gly Gin Vai Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 .···. Lya Vai Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Vai His Ala Aap Pro Lys Lau *...· 385 390 395 400 ;· CyB Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Lau Phe Ile Tyr Gly Vai Ile Ile Thr : ·· 405 410 415 ··· Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala V : · 420 425 430

Asn Leu Gin Aep Pro Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 . . Arg Glu Glu Tyr Asp Vai Leu Glu Lya Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu 450 455 460

Met Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg Arg Asn Pro Gin Glu Glv Vai Tyr : : 465 470 475 480 *** Aan Ala Leu Gin Lye Asp Lye Met Pro Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly .·. : 485 490 495 ·.*·· Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lya Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin 500 SOS 510

Asp Sar His Phe Gin Ala vai Gin Phe Gly Aan Arg Arg Glu Arg Glu . 515 520 525

Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lye Gly *.·.* 530 535 540

Glu ser Thr Gin Gin Sar Ser Gin Ser Cys Ala Ser Vai Phe Ser Ile * * 555 550 565 560

Pro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gin Leu 565 570 575 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: 75 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 462 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5:

Met Aan Arg Gly Vai pro Phe Arg His Leu Leu Leu Vai Leu Gin Leu 15 10 15

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Αβπ Lys Vai Vai Leu Gly Lya 20 25 30

Lya Gly Asp Thr vai Glu Leu Thr Cya Thr Ala Ser Gin Lye Lye Ser 35 40 45 lie Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Aan Gin Ile Lya Ile Leu Gly Aan 50 55 60

Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Sex Lye Leu Aen Asp Arg Ala

65 70 75 SO

Abu Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95

Lya Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Vai Glu 100 105 110

Asp Gin Lys Glu Glu Vai Gin Leu Leu Vai Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125

Ser Aep Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser ser Pro ser Vai Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160

Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Vai Ser Gin Leu Glu Leu 165 170 175

Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cye Thr Vai Leu Gin Asn Gin Lys Lya ISO 185 190

Vai Glu Phe Lys Ile Asp Ile Vai Vai Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser 195 200 205 • · Ser Ile Vai Tyr Lya Lya Glu Gly Glu Gin Vai Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 • · Leu Ala Phe Thr Vai Glu Lya Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 . Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Lau ..11’ 245 250 2S5 ... Lys Asn Lye Glu Vai Ser Vai Lys Arg Vai Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270 .. Gin Het Gly Lys Lys Leu Pro Lau His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu I *.. 275 280 285 *... Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Lau Ala Leu Glu Ala Lys : : : 290 295 300

Thr Gly Lys Leu Kis Gin Glu Vai Aan Leu Vai Vai Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 . . Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Vai Trp Gly Pro Thr Ser Pro : : : 325 330 335

Lya Leu Met Leu Ser Leu Lys Lau Glu Asn Lys Glu Ala Lys Vai Ser : : 340 345 350 *" Lys Arg Glu Lys Pro Vai Trp Vai Leu Aan Pro Glu Ala Gly Met Trp .·. : 355 360 365 ·. ·: Gin Cye Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Vai Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380

Lys Vai Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Vai His Ala Asp Pro Gin Leu 385 390 395 400

Cya Tyr Ile Leu Aap Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Vai Leu Thr • · 405 410 " 415 *:··· Leu Leu Tyr Cya Arg Leu Lys Ile Gin Vai Arg Lya Ala Aap Ile Ala 420 425 430

Ser Arg Glu Lya Ser Asp Ala Vai Tyr Thr Gly Leu Αβπ Thr Arg Asn 435 440 445

Gin Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lya Pro Pro Gin 450 455 460 462 {2} SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: 76 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 532 aminohappoa (B) tyyppi: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (XX) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6:

Het Aan Arg Gly Vai Pro Phe Arg His Leu Leu Leu vai Leu Gin Leu 15 10 IS

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lye Vai Vai Leu Gly Lys 20 25 30

Lye Gly Aap Thr Vai Glu Leu Thr Cya Thr Ala Ser Gin Lye Lya Ser 35 40 45

Ile Gin Phe His Trp Lys Aan Ser Asn Gin Ile Lya Ile Leu Gly Aan 50 55 60

Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lya Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Aen Phe Pro Leu Ile Ile 85 90 95

Lys Aan Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Vai Glu 100 10S 110

Asp Gin Lys Glu Glu Vai Gin Leu Leu Vai Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125

Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Vai Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160

Lys Aan Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Vai Ser Gin Leu Glu Leu 165 170 175

Gin Aap Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Vai Leu Gin Asn Gin Lys Lys 180 185 190

Vai Glu Phe Lys Ile Asp Ile Vai Vai Leu Ala Phe Gin Lys Ala Ser *.·.* 195 200 205 .·. : Ser Ile Vai Tyr Lye Lys Glu Gly Glu Gin Vai Glu Phe Ser Phe Pro *. *: 210 215 220

Leu Ala Phe Thr Vai Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 .···. Gin Ala Glu Arg Ala ser ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 245 250 255 ;·. Lye Asn Lys Glu Vai Ser Vai Lys Arg Vai Thr Gin Asp Pro Lya Leu : ·· 260 265 270 ··· Gin Het Gly Lye Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu V · 275 280 285

Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 . . Thr Gly Lye Leu His Gin Glu Vai Asn Leu Vai Vai Het Arg Ala Thr J.V 305 ’ 310 315 320 ... Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr cys Glu Vai Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 • Lys Leu Het Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Vai Ser ;\j 340 345 350 ’· ** Lys Arg Glu Lys Pro Vai Trp Vai Leu Asn Pro Glu Ala Gly Het Trp ....: 355 360 365

Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Vai Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380 : J ί Lys Vai Leu Pro Thr Trp ser Thr Pro Vai His Ala Asp Pro Lys Leu * *, 385 390 395 400 *!**ί Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Vai Ile Leu Thr 405 410 415

Ala Leu Phe Leu Arg Vai LyB Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala 420 425 430 77

Tyr Gin Gin Gly Gin Aan Gin Leu Tyr Aan Giu Leu Aan Leu Gly Arg 435 440 445

Arg Glu Glu Tyr Aap Vai Leu Aan Lys Arg Arg Gly Arg Aap Pro Glu 450 455 " 460

Met Gly Gly Lya Pro Arg Arg Lya Αβπ Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Aan 465 470 475 480

Glu Leu Gin Lya Asp Lya Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 485 490 495

Lya Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly 500 505 510

Lau Ser Thr Ala Thr Lys Aap Thr Tyr Asp Ala Lau Hia Het Gin Ala 515 520 525

Leu Pro Pro Arg 530 (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: 33

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC

(2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) pituus: 50 emästä {B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo ··· ·· • 1 2·· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: ♦ ·· • · ♦ Φ · · • 6Π

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA

· :.v (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: «·· • ♦ *·;·1 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : (A) PITUUS: 33 emästä 2 '· {B) TYYPPI: nukleiinihappo ·:··: (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · · V\ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: 78 CGCCGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33 (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (i i) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 15 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 11: . . CGCGGGCGGC CGCTA 15 • · · • · · * *. (2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: • · · • ·· • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo ;·[* (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen : ·· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ··♦ • · · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12: • · · • · cgcgggctcg ttatägagct ggttctggcg ctgcttcttc tg 42 • · · • « • · · • · · • · *:·*: (2) SEKVENSSIN NRO 13 TIEDOT: • :Y: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *m\ (A) PITUUS: 48 emästä ***** (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 79 {ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 13: CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG 48 (2) SEKVENSSIN NRO 14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (i i) MOLEKYYLITYYPPI: nuklei inihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 14: CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA 33 (2) SEKVENSSIN NRO 15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: {A) PITUUS: 36 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 15: CGCGGGACGC CTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA 36 • · · • · • · \'·· (2) SEKVENSSIN NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: :**V (A) PITUUS: 33 emästä .1“ (B) tyyppi: nukleiinihappo • 1·· (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i · · (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 16: • · · • · "· CGCGGGACGC GTGACCCXGA GATGGGGGGA AAG 33 • · • · · • · · • · • « · · · • · • · • · 1 ♦ · ♦ • · Φ · · « • · (2) SEKVENSSIN NRO 17 TIEDOT: 80 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo {C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen {D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLI-TYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 17: CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33 (2) SEKVENSSIN NRO 18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo <C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 18: CCCGGATCCC AGCÄTGGGCA GCTCTT 26 (2) SEKVENSSIN NRO 19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 emästä ’·*·] (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen .* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · · · .···.. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo ·♦· Γ·.. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 19: cgcggggcgg ccgctttagt tattacigtt gacatggtcg tt 42 (2) SEKVENSSIN NRO 20 TIEDOT: « · Φ • · · .··*. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ·...* (A) PITUUS: 40 emästä #·* . (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·.**: (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ....j (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 1 • · MOLEKYYLITYYPPI; nukleiinihappo • · · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 20: 81 GCGGPGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG CTCTTCACCG 40 (2) SEKVENSSIN NRO 21 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo CC) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii} MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 21: GCGGGGGCGG CCGCCTAÄAT ACGGTTCTGG TC 32 (2) SEKVENSSIN NRO 22 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 31 emästä (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yks isäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen {ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 22: • · '·.·.· TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 • · • · · • ·· (2) SEKVENSSIN NRO 23 TIEDOT: ···· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .1“ (A) PITUUS: 31 emästä : *·* (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen *·* * (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • » (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo ··· • · *♦;·’ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 23: • ♦ : TXGTTGGTrr CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 31 • · ♦ 1 SEKVENSSIN NRO 24 TIEDOT: • ♦ • · · V\ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 171 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 82 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: aminohappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 24:

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Vai Leu Ala Thr Leu Leu 5 10 15

Ser Gin Vai Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 vai Phe Vai Aan cya Aan Thr Ser Ile Thr Trp Vai Glu Gly Thr Vai 35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Axg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80

Asp Lye Glu Ser Thr Vai Gin Vai His Tyr Arg Met Cys Gin Ser Cys 85 90 95

Vai Glu Leu Asp Pro Ala Thr Vai Ala Gly Ile Ile Vai Thr Asp Vai 100 105 110

Ala Ile Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Vai Phe Cys Phe Ala Gly Kis 115 120 125

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gin Ala Leu Leu Arg 130 135 140

Asn Asp Gin Vai Tyr Gin Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gin Tyr 145 150 155 160

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Aan Lys 165 170 (2) SEKVENSSIN NRO 25 TIEDOT: <i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 182 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · * * \ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: aminohappo • · · • · · {xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 25: • · · ' * I··· : : Het Glu Gin Gly Lys Gly Leu Ala Vai Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu .:** 5 10 15 ; ·.. Leu Gin Gly Thr Leu Ala Gin Ser Ile Lyö Gly Aan His Leu Vai Lys 20 25 30

Vai Tyr Asp Tyr Gin Glu Abp Gly ser Vai Leu Leu Thr Cys Asp Ala * 35 40 45

Glu Ala Lys Aan Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Het Ile Gly Phe 50 55 60

Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp *·*.* 65 70 75 80 .***. Pro Arg Gly Het Tyr Gin Cys Lys Gly Ser Gin Asn Lys Ser Lys Pro *...· 85 90 95 .* . Leu Gin Vai Tyr Tyr Arg Het Cye Gin Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala : ·.; . loo 105 no * · Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Vai Ser Ile Phe Vai ·;··· 115 120 125

Leu Ala Vai Gly Vai Tyr Phe Ile Ala Gly Gin Asp Glv Vai Arg Gin 130 135 140 ! I ! Ser Arg Ala ser Asp Lye Gin Thr Leu Leu Pro Aan Asp Gin Leu Tyr * 145 150 155 160 *ϊ**ί Gin Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gin Tyr Ser His Leu Gin Gly 165 170 175

Asn Gin Leu Arg Arg Aen ISO

(2) SEKVENSSIN NRO 26 TIEDOT: 83 {i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 220 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen {i i) MOLEKYYLITYYPPI: aminohappo (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 26:

Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe δ 10 15

Leu Ser Tyr Ala Oya Leu Gly Pro Gly Cye Gin Ala Leu Arg Vai Glu 20 25 30

Gly Gly Pro Pro Ser Leu Thr Vai Aan Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu 35 40 45

Thr Cys Glu Aan Aan Gly Arg Aan Pro Aan Ile Thr Trp Trp Phe Ser 50 55 60

Leu Gin Ser Aan Ile Thr Trp Pro Pro Vai Pro Leu Gly Pro Gly Gin

65 70 75 SO

Gly Thr Thr Gly Gin Leu Phe Phe Pro Glu Vai Aan Lye Aan Thr Gly SS 90 95

Ala cys Thr Gly Cys Gin Vai Ile Glu Aan Aan Ile Leu Lya Arg Ser 100 105 110

Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Vai Arg Aan Pro Vai Pro Arg Pro Phe Leu 115 120 125

Asp Met Gly Glu Gly Thr Lya Aan Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile 130 135 140

Ile Leu Leu Phe Cya Ala Vai Vai Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg 145 150 155 160

Lya Arg Trp Gin Aan Glu Lya Phe Gly Vai Asp Het Pro Asp Asp Tyr 16S 170 175

Glu Asp Glu Aan Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met ISO 185 190 . . Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gin Gly Thr Tyr Gin Asp Vai Gly 195 200 205 . · Asn Leu His Ile Gly Asp Ala Gin Leu Glu Ly s Pro 210 215 220 • ·>· · • · · · :***:· (2) SEKVENSSIN NRO 27 TIEDOT: • t» \ *·· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ]·;·. (A) PITUUS: 228 aminohappoa V * (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: aminohappo » · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 27: • · • · · *· *· Met Ala Thr Leu Vai Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu Phe ·:♦*: s io is

Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Vai Pro Ala Met Thr Ser Ser 20 25 30 ϊ.*.· Asp Leu Pro Leu Asn Phe Gin Gly Ser Pro Cys Ser Gin Ile Tro Gin 35 40 45 • · 84 HIh Pro Ax g Phe Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met Vai Lys Phe His .50 55 60

Cya Tyr Thr Asti His Ser Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys Arg Gly 65 70 75 Θ0

Ser Gin Gin Pro Gin Glu Leu Vai ser Glu Glu Gly Arg Ile yal Gin 85 90 95

Thr Gin Aan Gly Ser Vai Tyr Thr Leu Thr Ile Gin Aan Ile Gin Tyr 100 105 110

Glu Asp Aan Gly Ile Tyr Phe Cys Lys Gin Lys Cys Asp ser Ala Aan 115 120 125

His Aan Vai Thr Asp Ser Cys Gly Thr Glu Leu Leu Vai Leu Gly Phe 130 135 140

Ser Thr Leu Asp Gin Leu Lya Arg Arg Aan Thr Leu Lya Asp Gly lie 145 ISO 155 160

Ile Leu Ile Gin Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Vai Pro Ile 165 170 175

Phe Leu Leu Leu Asp Lya Asp Asp Gly Lya Ala Gly Het Glu Glu Asp 180 185 190 H ia Thr Tyr Glu Gly Leu Aan Ile Aap Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp 195 200 205

He Vai Thr Leu Arg Thr Gly Glu Vai Lya Trp Ser Vai Gly Glu Hia 210 215 220

Pro Gly Gin Glu 225 (2) SEKVENSSIN NRO 28 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1 304 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUQSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo • · · • · · I1. (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 28: • · · • ti· • · •j. GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC 50 • 1 · » CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG 100 • · • · · CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC 150 • · · TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG 200 • · · GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACÄGCTT CCCAGAAGAA 250 GAGCATACAA TTCCACTGGA ÄAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA 300 • · · • · .···. atcagggctc cttcttaact AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT 350 • · • GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA 400 • · • · · ’· ’· GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CÄTCTGTGAA GTGGAGGACC 450 ····· AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC 500 acccacctgc ttcaggggca gagcctgäcc ctgaccttgg agagcccccc sso • ♦ · ·· · • · 85 TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTACGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC 600 AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC 650 ÄCCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT 700 ÄGÄCATCGTG GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA 750 AAGAGGGGGA ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA 800 AAGCTGACGG GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC 850 CTCCAAGTCT TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGÄA GTGTCTGTAA 900 AACGGGTTAC CCAGGAGCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC 950 CACCTCACCC TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT 1000 CACCCTGGCC CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC 1050 TGGTGGTGAT GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG 1100 XGGGGACCCA GCTCGCCTAÄ GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA 1150 GGÄGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG 1200 AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG 1250 GAATCCAACA TCAAGGtXCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCÄCGCGGA 1300 TCCC 1304 1 • · SEKVENSSIN NRO 29 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: {A) PITUUS: 398 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · :.*·· (ii) MOLEKYYLITYYPPI; aminohappo ··· —ϊ {xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 29: ·«· • · -• * ··· I*. Met Aan Arg G ly Vai Pro Phe Arg Hi a Leu Leu Leu Vai Leu Gin Leu ·* ** 5 10 15

Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Aan Lye Vai Vai Leu Gly Lye V ' 20 25 30

Lys Gly Asp Thr Vai Glu Leu Thr cys Thr Ala Ser Gin Lye Lys Ser 35 40 45 ·*·*. Ile Gin Phe Hia Trp Lys Aan Ser Aan Gin Ile Lys Ile Leu Gly Aan *·*·* 50 55 60 ;***· Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lya Leu Aan Asp Arg Ala ···* 65 70 75 80 ·’ . Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Aap Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile ·,’*· 35 90 95 • Lya Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Vai Glu 100 105 110 • Asp Gin Lys Glu Glu Vai Gin Leu Leu Vai Phe Gly Leu Thr Ala Asn ns 120 125 • · 86

Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gin Cya Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 l€0

Lya Aan Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 165 170 175

Gin Asp ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr val Leu Gin Asn Gin Lya Lya 180 185 190

Val Glu Phe Lya lie Asp lie Val val Leu Ala Phe Gin Lya Ala Ser 195 200 205

Ser lie Val Tyr Lya Lya Glu Gly Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220

Leu Ala Phe Thr Val Glu Lya Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240

Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys ser Trp He Thr Phe Asp Leu 245 250 255

Lys Aan Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270

Gin Het Gly Lya Lya Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 275 280 285

Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300

Thr Gly Lya Leu Hie Gin Glu Val Asn Leu Vai Vai Het Arg Ala Thr 305 310 315 320

Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cye Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Aen Lya Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350

Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365

Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn He 370 375 380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Hia Ala Asp Pro 385 390 395 . . (2) SEKVENSSIN NRO 30 TIEDOT: • · · • · · .·.*.* (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *.*·: (A) PITUUS: 719 ··. (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·*” (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen ! : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen *·· ·· : **· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo ··· • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 30:

GCCTGTTTGA GAACCÄGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGOCCCTGC SO

* · · e · .**·. CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG 100 • · ·· · ,· . CAAGGCCACA ÄTGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCÄCTTG CTTCTGGTGC 150 • · · '* TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCÄGCCÄCTC AGGGAAÄCAA AGTGGTGCTG 200 GGCAAAAAAG GGGATÄCAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA 250 • · V,: GAGCATACAA TTCCÄCTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA 300 • ♦ 87 ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AARGGTCCAT CCAAGCXGAA TGATCGCGCT 350 GACTCAAGÄA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA 400 GAATCTTÄÄG AXAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGXGAA GTGGAGGACC 450 AGAAGGAGGA GGTGCÄATTG CTAGTCTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC 500 ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC 550 TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC 600 AGGGGGGGÄA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGAXAGTGGC 650 ACCXGGACAT GCACTGTCXX GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTXCAAAAT 700 AGACÄTCGTG GIGCTAGCI 719 (2) SEKVENSSIN NRO 31 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 203 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (i i) molekyyli tyyppi : aminohappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 31:

Met Asn Arg Gly Vai Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Vai Leu Gin Leu 5 10 15 Älä Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Asn Lye Vai Vai Leu Gly Lys 20 25 30

Lye Gly Asp Xhr Vai Glu Leu Xhr Cye Thr Ala Ser Gin Lya Lye Ser 35 40 45 *.*.· Ile Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gin Ile Lye Ile Leu Gly Asn .·. ; 50 55 60 ·. *: Gin Gly Ser Phe Leu Xhr Lys Gly Pro Ser Lye Leu Aan Aap Arg Ala 65 70 75 80

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Aan Phe Pro Leu Ile Ile .···. 85 90 95 *...· Lys Aan Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Xhr Xyr Ile Cye Glu Vai Glu :·. 100 105 110 : ·· Aap Gin Lys Glu Glu Vai Gin Leu Leu Vai Phe Gly Leu Thr Ala Aan 115 120 125 *.* * Ser Asp Thr Hls Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Vai Gin Cys Arg Ser Pro Arg Glv 145 150 155 160 *.·.· Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Vai Ser Gin Leu Glu Leu .···. 165 170 175

Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cye Thr Vai Leu Gin Asn Gin Lys Lye ♦ 180 185 190 vai Glu Phe Lys Ile Aep Ile Vai Vai Leu Ala * * 195 200 • · • ♦ e · · e e · • · • e (2) SEKVENSSIN NRO 32 TIEDOT: 88 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 768 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA; lineaarinen (ii} MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 32: GCXAGCAGAG CCGAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC 50 CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA 100 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT 150 ggtggacgtg agccacgaag acccxgaggt CAAGTTCAAC TGGTACGTGG 200 ÄCGGCGXGGA GGTGCAIÄAT GCCAÄGACÄA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC 250 AACAGCACGT accgggxggt CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG 300 GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG 350 CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA 400 CAGGTGXACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAt GACCTGACCA AGAACCAGGT 450 CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG 500 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CÄCGCCXCCC 550 GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCXTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA 500 • · • · · *·*·* CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCÄTG 650 • · • · · *· N AGGCTCTGCA CAACCACTAC ÄCGCAGAÄGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGG 700 • · · •••I CTGCAACTGG ACGAGÄCCTG TGCTGAGGCC CAGGACGGGG AGCTGGACGG 750 • · .

GCTCTGGACG ACGGATCC 76Θ ·· • · • ·· (2) SEKVENSSIN NRO 33 TIEDOT: • · ♦ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 254 (B) TYYPPI: aminohappo ;***. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ··· .·! : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: aminohappo • · • · • » • · · • · · • · « · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 33: 89

Glu Pro Lyö Ser Cye Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 IS

Pro Glu Leu Leu G ly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Ly s Pro 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cya vai Vai 35 40 45

Vai Asp Vai Ser Kis Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 50 55 60

Asp Gly Vai Glu Vai HiH Aan Ala Lvs Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lya Ala 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lya Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125

Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly phe Tyr Pro ser 145 . 150 155 160

Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Aan Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Aso ser Aso Gly ser Phe Phe Leu Tyr 180 ‘ IBS ~ 190

Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe 195 200 205

Ser Cye Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Leu Gin Leu Asp Glu Thr Cys Ala Glu 225 230 235 240

Ala Gin Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Asp Pro 245 250 (2} SEKVENSSIN NRO 34 TIEDOT: • · • · · • · e l \ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: **.**: (A) PITUUS: 174 ··. (B) TYYPPI: nukleiinihappo *::: (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen : : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ··· ·· : 1·· (ii) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo • · · • · · (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 34: • ·

ί,·φϊ CCAAGGGCCT CTGCCCTCCC TGCCCCACCG ACAGGCTCCG CCCTCCCTGA SO

• · · • CCCGCAGACA GCCTCTGCCC TCCCTGACCC GCCAGCAGCC TCTGCCCTCC 100

: CTGCGGCCCT GGCGGTGATC TCCTTCCTCC TCGGGCTGGG CCTGGGGGTG ISO

• · · • · GCGTGTGTGC TGGCGAGGAC GCGT 174 • · • · · • · · • · · • · (2) SEKVENSSIN NRO 35 TIEDOT: 90 (i ) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 58 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPO LOG IA: 1 ineaar itien (ii) MOLEKYYLITYYPPI: aminohappo (xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 35:

Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly ser Ala Leu Pro 1 5 10 15

Asp Pro Gin Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala 20 25 30

Leu Pro Ala Ala Leu Ala Vai Ile Ser Phe Leu Len Gly Leu Gly Leu 35 40 45

Gly Vai Ala Cys Vai Leu Ala Arg Thr Arg 50 55 (2) SEKVENSSIN NRO 36 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 345 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen {i i) MOLEKYYLITYYPPI: nukleiinihappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 36: ACGCGTTTCA GCAGGÄGCGC AGAGCCCCCC GCGTACCAGC AGGGCCAGAA 50 • · · .·. ; CCAGCTCTAT AACGAGCTCA ATCTAGGACG AAGAGAGGAG TACGATGTTT 100

• M

TGGACAAGAG ACGTGGCCGG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGAGAAGG ISO

.···. AAGAACCCTC AGGAAGGCCT GTACAATGAÄ CTGCAGAAAG ATAAGATGGC 200 • · ··· GGAGGCCTAC AGTGAGATTG GGATGARAGG CGAGCGCCGG AGGGGCAAGG 250 • ·· GGCACGATGG CCTTTACCAG GGTCTCAGTA CAGCCACCAA GGACACCTAO 300 • · · GACGCCCTTC ACATGCAGGC CCTGCCCCCT CGCTAAAGCG GCCGC 345 • · • · · • · · .···. (2) SEKVENSSIN NRO 37 TIEDOT: • · • ΦΦ : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: '· ·: (A) PITUUS: 111 ·;··· (B) TYYPPI: aminohappo . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • e • · · *·*·* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: aminohappo (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 37: 91

Thr Arg Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gin Gin Gly Gin 15 10 15

Aan Gin Leu Tyr Aan Gin Leu Aan Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 20 25 30

Vai Leu Asp Lya Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Het Gly Gly Lys Pro 35 40 45

Arg Arg Lya Aan pro Gin Glu Gly Leu Tyr Aan Glu Leu Gin Lya Asp 50 55 60

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lya Gly Glu Arg Arg 55 70 75 80

Arg Gly Lya Gly Hia Aep Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr 85 90 95

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Hia Het Gin Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 (2) SEKVENSSIN NRO 38 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 38;

Gin Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lya Leu Cya Tyr Leu Leu Aap Gly 15 10 15 (2) SEKVENSSIN NRO 39 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *·*·] (A) PITUUS: 19 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo <C} JUOSTEISUUS: ei relevantti ..ΙΓ (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · .

[;··* (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · • ·· *... (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 39 • · · y • · ·

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Vai Kis Ala Asp Pro Lya Leu Cya Tyr Leu 15 10 15 • · • · « *·*·* Leu Asp Gly • · · 1 • · SEKVENSSIN NRO 40 TIEDOT: * • · ·'.*·· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti *·*·* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 92 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 40:

Leu Gly Glu Pro Gin Leu Cys Tyr He Leu Aep Ala 1 5 10 (2) SEKVENSSIN NRO 41 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 19 aminohappoa {B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: 1ineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 41:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Vai Kis Ala Asp Pro Gin Leu Cys Tyr Ile IS 10 IS

Leu Asp Ala (2) SEKVENSSIN NRO 42 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 16 aminohappoa (S) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini :Y: (XX) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 42: • · • · *· *· Gin Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lye Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly ·;· 1 5 10 • · · · (2) SEKVENSSIN NRO 43 TIEDOT: • · · ·· : '·· (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .‘J*. (A) PITUUS: 16 aminohappoa • (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · • · · • · **:·' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini • · • · · ‘•’I (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 43: , * Phe Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Aep 6iy

• · 2, 5 10 IS

• · · ** • · · • · • · {2) SEKVENSSIN NRO 44 TIEDOT: 93 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 142 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 44:

Gin Ser Pha Gly Leu Leu Asp Pro Lye Leu Cye Tyr Leu Leu Aap Gly 15 10 IS

Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Vai Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Vai 20 25 30

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gin Gin Gly Gin Aan 35 40 45

Gin Leu Tyr Aan Glu Leu Aan Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Vai 50 55 60

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Aap Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 65 70 75 80

Arg Lys Aan Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Aan Glu Leu Gin Lya Aap Lys Θ5 90 95

Ket Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Het Lya Gly Glu Arg Arg Arg 100 105 110

Gly Lya Gly His Aap Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 115 120 125 • * V.· Aep Thr Tyr Asp Ala Leu His Ket Gin Ala Leu Pro Pro Arg . · 130 135 140 • ♦ · • ·· • · (2) SEKVENSSIN NRO 45 TIEDOT: • ·♦ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ·*·.. (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo v : (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPx: proteiini • · C.: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 45: • ·

Arg Vai Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gin Gin Gly 15 10 15 • · • Gin Aan Gin Leu Tyr Aan Glu Leu Aan Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 • · · • · ····· Asp Vai Leu * 35 (2) SEKVENSSIN NRO 46 TIEDOT: 94 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: 1ineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (XX) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 46:

Lys Lys Lea Vai Lys Lys Phe Arg Gin Lye Lye Gin Arg Gin Aen Gin 15 10 IS

Leu Tyr Aan Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Aap Vai Leu 20 25 30 (2) SEKVENSSIN NRO 47 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI; proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 47;

Arg Thr Gin Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn sar Ala 1 5 10 15 • · · • · · » * · Ala Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr : ·.: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 25 30 • · ··· Aap Vai Leu

···· 3S

• · · • · v • · :·!* (2) SEKVENSSIN NRO 48 TIEDOT; • · · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti ’·*·* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · • · MOLEKYYLITYYPPI: proteiini 2 • · 3 • · · 4 • · · 5 • · 6 • · 7 • · 8 • · · 9 • · · 10 • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 48: 95

Arg Thr Arg Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gin Gin Gly 13 10 15

Gin Asn Gin Leu Tyr Aan Glu Leu Aen Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30

Asp Vai Leu 35 (2) SEKVENSSIN NRO 49 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 aminohappoa.

(B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 49:

Arg Thr Arg Aep Pro Glu Het Gly Gly Lya Pro Arg Arg Lya Asn Pro 15 10 15

Gin Glu Gly Leu Tyr Aan Glu Leu Gin Lye Asp Lya Het Ala Glu Ala 20 25 30

Tyr Ser Glu Ile 35 (2) SEKVENSSIN NRO 50 TIEDOT: • · • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 38 aminohappoa *··: (B) TYYPPI: aminohappo <C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · • · · (ii) mOlekyylityyppi: proteiini • · · t (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 50: • · *·*·* Arg Thr Arg Xle Gly Het Lya Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lya Gly Hia 15 10 15 • · • · · .* , Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lya Asp Ihr Tyr Asp : 20 25 30 • · ·:**: Ala Leu Hia Het; Gin Ala . 35 • · • · · • · · • · • · (2) SEKVENSSIN NRO 51 TIEDOT: 96 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS; 63 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 51: GGATCCCÄAG GCCÄGGCTAA AGCCGAAGCC GCGAAGGCCG AGGCPAAGGC CGAAGCAGAT 60 CTG 63 {2) SEKVENSSIN NRO 52 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: ei relevantti (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 52:

Asp Pro Ly s Ala Glu Ala Lye Ala Glu Ala Lys Ala Glu Ala Lye Ala IS 10 15

Glu Ala Asp Leu . . 20 • · · • · · • · • · • · · • · · • · • · · • · · · • · · • · • ·' ··» • 1 • · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · • · • · • · · • · · • ·

Claims (6)

97

1. Terapeuttisten solujen käyttö aineen valmistamiseksi, joka aine on tarkoitettu nisäkkäiden HIV:n hoitoon 5 tunnettu siitä, että mainitut terapeuttiset solut ovat hematopoieettisen järjestelmän soluja ja ne ilmentävät mem-braaniin sitoutunutta, proteiinia olevaa kimeeristä reseptoria, joka käsittää ekstrasellulaarisen osan, joka sisältää sellaisen CD4-fragmentin, joka kykenee spesifisesti tunnis-10 tamaan ja sitomaan HIV:n infektoiman solun, mutta joka ei välitä HIV-infektiota, jolloin mainitun CD4-fragmentin ja mainitun terapeuttisen solun membraanin välillä on vähintään 48 ängströmiä, ja jolloin mainittu CD4-fragmentti käsittää sekvenssin nro 2 9 aminohapot 1 - 394 tai sekvenssin nro 31 15 aminohapot 1 - 200, ja jolloin terapeuttiset solut eivät tuhoa HIV:n infektoimaa solua ja mainittu kimeerinen reseptori toimii HIV-ansana, joka sitoo kiertävää HIV:iä ja siten vähentää virustiittereitä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun- 20 nettu siitä, että mainittua CD4-fragmenttia erottaa so- ·1·2· lunsisäisestä osasta kuviossa 26 (sekvenssi nro 35) esitetty • · .·. : CD7-transmembraanidomeeni tai kuviossa 25 (sekvenssi nro 33) • ·· esitetyt ihmisen IgGl-molekyylin sarana-, CH2- ja CH3- *“! domeenit.

• · • · .3 25 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun- • t • nettu siitä, että mainitun CD4-fragmentin ja mainitun te- • · · V 1 rapeuttisen solun membraanin välillä on vähintään 72 äng strömiä . • · ν.ϊ

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun- • · · : : 30 nettu siitä, että mainittu reseptori sisältää CD7-trans- .·] ; membraaniosan, CD5-transmembraaniosan tai CD34-transmem- • · · \ braaniosan. • · • · · • · · 2 • · · 3 • · 98

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittua CD4-fragmenttia erottaa mainitun terapeuttisen solun membraanista yksi tai useampi proteiinia oleva alfa-heliksi.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että mainitut terapeuttiset solut valitaan joukosta, joka käsittää T-solut, B-solut, neutrofiilit, den-driittisolut ja follikulaari-dendriittisolut. • · • · · • · · • · • · • · · • ·· • · • · · ···· ··· • · « · ··· • · • · • ·· • · · • · · • · · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · 1 • · · • · · • ·· • ♦ • · • · • · · • · · • · 99