JPH10503932A - Ｃｄ４デコイレセプターを有する細胞ならびに関連する分子および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳類に、有効量の治療用細胞を投与することを含む、哺乳類におけるHIVを治療する方法が開示される。該治療用細胞は、HIV感染細胞を特異的に認識し、結合することができるが、HIV感染を媒介することがないCD4断片を含む細胞外部分を含む膜結合型のタンパク質性キメラレセプターを発現する。また、該CD4レセプターを発現する細胞、ならびに該レセプターをコードするDNAおよびベクターも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 CD4デコイレセプターを有する細胞ならびに関連する分子および方法 発明の領域 本発明は、HIVに結合するが、宿主細胞をHIV感染感受性にしないCD4断片を含 むレセプターに関する。従って、本発明は、新規かつ効果的なHIV治療を提供す る。 発明の背景 T細胞レセプターによるT細胞の抗原認識は、一定の範囲における免疫学的現象 の基礎になっている。T細胞は、いわゆる細胞性免疫を担う。これには免疫系細 胞による外来組織又は感染細胞の破壊が含まれる。免疫応答を調節する「ヘルパ ー」細胞および「サプレッサー」細胞、および異常な細胞を直接破壊することが できる細胞傷害性（または「キラー」）細胞などの多様なT細胞が存在する。 T細胞は、他の細胞の表面上に提示された固有の抗原を認識して結合すると活 性化され、増殖できるようになる。そして、それが細胞傷害性細胞であれば、結 合した細胞を破壊できるようになる。 HIVおよび免疫病理 1984年に、HIVがAIDSの病原体であることが明らかになった。それ以来、AIDS の診断基準に関する定義は何度も修正されている。しかし、診断学上のパラメー ターの変動にも関わらず、AIDSの簡単な共通の特徴は、HIV感染、ならびにそれ に続く持続性の全身症状、および、二次感染、腫瘍形成、神経性疾患などのAIDS 特有症状の発生である。ハリソンの内科学原理（Harrison's Principles of Int ernal Medicine）、第12版、マグロウヒル社（1991）。 HIVは、レンチウイルスグループに属するヒトレトロウイルスである。確認さ れている４種のヒトレトロウイルスは、２つの別々のグループに属している。す なわち、ヒトTリンパ栄養性（白血病）レトロウイルスのHTLV-1とHTLV-2、およ びヒト免疫不全ウイルスのHIV-1とHIV-2である。前者のウイルスは形質転換ウイ ルスであり、一方後者は細胞傷害性ウイルスである。 HIV-1は、世界中で、AIDSのもっとも普通の原因であることが同定されている 。HIV-1とHIV-2の配列の相同性は約40％で、HIV-2の方がサル免疫不全ウイルス （SIV）グループのいくつかのメンバーに密接に関連している（Curranら、Scien ce, 329: 1357-1359（1985）、およびWeissら、Nature，324: 572-575（1986）参照 ）。 HIVは、通常のレトロウイルスの遺伝子（env、gagおよびpol）、ならびにウイ ルスの複製その他の生物学的活性に関連した6個の特別の遺伝子をもつ。先に述 べたように、AIDSに共通の特徴は、主に細胞性免疫を、強度に免疫抑制すること である。この免疫抑制は、特にある種の感染症や腫瘍形成などのさまざまな日和 見疾患を引き起こす。 AIDSにおける免疫不全の主要原因は、胸腺由来（T）リンパ球サブセットであ るT4集団の、質的かつ量的な欠損であることが同定されている。この細胞サブセ ットは、HIVに対する細胞レセプターであることが明らかになっているCD4表面分 子の存在によって、表現形質的に定義される（Dalgleishら、Nature 312:763（1 984））。T4細胞が、HIV感染を受ける主な細胞型ではあるが、本質的には、CD4 分子を細胞表面で発現するヒト細胞であれば、いかなる細胞もHIVによる結合を 受け、感染する。 以前からCD4⁺T細胞にはヘルパー／インデューサーの役割があることが指摘さ れており、それは、B細胞へ活性化シグナルを供給する機能、または細胞傷害性 ／サプレッサー細胞になるための相互的なCD8マーカーを有するT型リンパ球を誘 導する機能を意味する（ReinherzおよびSchlossman，Cell 19:821-827（1980） ；Goldsteinら、Immunol．Rev．68:5-42（1982））。 HIVは、ウイルスエンベロープ（gp120）中のアミノ酸領域を通して、CD4分子 のN末端近くに位置するV1領域の一部に、特異的にかつ高親和性で結合する。結 合した後、ウイルスは、標的細胞膜と融合して、細胞内に入り込む。一旦入り込 むと、ウイルスは、逆転写酵素を用いてそのゲノムRNAをDNAに転写して、細胞DN Aに取り込ませ、「プロウイルス」として細胞が生きている間存在する。 プロウイルスは、潜伏したままか、mRNAおよびゲノムRNAを転写するために活 性化されて、蛋白質合成、集合、新しいウイルス粒子形成、および細胞の表面か らのウイルス出芽をもたらす。ウイルスが細胞死を誘導する正確なメカニズムは 明らかになっていないが、ウイルスが大量に細胞表面から出芽するために、原形 質膜が破壊されて、浸透圧が不均衡になることが主な機構と考えられている。 感染が起きている間、宿主生物は、主要エンベロープ糖蛋白質であるgp120お よびgp41などのウイルス蛋白質に対する抗体を産生する。この体液性免疫が起き ても、病気は進行して、致命的な免疫抑制をもたらす。この致命的な免疫抑制は 、複数の日和見感染、寄生虫血症、痴呆、および死により特徴づけられる。宿主 の抗ウイルス抗体が、病気の進行を阻止できないことが、この感染の最も深刻で 憂慮すべき局面である。従って、従来の方法に基づくワクチン作成はほとんど期 待できない。 二つの因子が、免疫不全ウイルスに対する体液性応答の効力に関与している。 第一に、他のRNAウイルス同様（特にレトロウイルスと同様）、免疫不全ウイル スも、宿主の免疫監視機構に反応して高い突然変異率を示す。第二に、エンベロ ープ糖蛋白質そのものが、高親和性抗体が結合するのに適したいくつかのエピト ープを提示する、多くの糖を付加された分子である。ウイルスエンベロープが提 示する抗原性の低い標的は、特異的な抗体の産生によってウイルス感染を抑制す るきっかけを与えない。 HIVウイルスが感染した細胞は、その表面にgp120糖蛋白質を発現する。gp120 は、ウイルスが非感染細胞に入るときと同じ反応によって、CD4⁺細胞同士の融合 を媒介して、短寿命の多核巨大細胞を形成させる。シンシチウム形成は、gp120 エンベロープ糖蛋白質とCD4蛋白質との直接の相互作用に依存する（Dalgleishら 、前記; Klatzmanら、Nature 312:763（1984）；McDougalら、Science 231: 382 （1986）；Sodroskiら、Nature 322:470（1986）；Lifsonら、Nature 323:725（ 1986）；Sodroskiら、Nature 321:412（1986））。 CD4-gp120結合が、CD4抗原をもつ細胞へのウイルス感染に関与するという証拠 の一つとして、gp120とCD4が特異的な複合体を形成するのが発見された（McDoug alら、上記）。別の研究者は、HIVが感染できない細胞系を、ヒトCD4 cDNA遺伝 子で形質転換して、これを発現させると、感染細胞系に変わることを示した（Ma ddonら、Cell 46:333-348（1986））。 可溶性CD4をウイルスの吸着とシンシチウム媒介性細胞伝達を阻害するための 受動的薬剤として用いる治療計画が、提案され、インビトロでは成功することが 、多くのグループによって示された（Deenら、Nature 331:82-84（1988）；Fish e rら、Nature 331:76-78（1988）；Husseyら、Nature 331:78-81（1988）；Smith ら、Science 238:1704-1707（1987）；Trauneckerら、Nature 331:84-86（1988 ））；そして、長い半減期と穏やかな生物活性をもったCD4イムノグロブリン融 合蛋白質が続いて作製された（Caponら、Nature 337:525-531（1989）；Traunec kerら、Nature 339，68-70（1989）；Byrnら、Nature 344:667-670（1990）；Ze ttlmeisslら、DNA Cell Biol．9:347-353（1990））。CD4イムノトキシン結合体 または融合蛋白質は、インビボで感染細胞に対し強力な細胞毒性を示す（Chaudh aryら、Nature 335:369-372（1988）；Tillら、Science 242:1166-1168（1988） ）が、免疫不全症候群には潜伏性があるため、一回投与による治療はウイルス負 荷を除く上で有効とは考えられず、外来の融合蛋白質の抗原性によって反復投与 が必要となる治療の受容度は限定されやすい。サルにSIVを感染させて調べたと ころ、可溶性CD4の動物への投与が、顕著なCD4性血球減少症を伴わない場合には 、SIVの力価を減少させ、骨髄の能力の、インビトロでの測定値を向上させるこ とができる（Watanabeら、Nature 337:267-270（1989））。しかし、治療を中断 した後に、ウイルスが速やかに再出現してくるのが観察されたため、免疫系の退 化の進行を妨げるためには、生涯投与することが必要である可能性がある。 T細胞とFcレセプター 最も多く存在する型のT細胞抗原レセプター（TCR）を細胞表面で発現させるに は、少なくとも6種以上の別々のポリペプチド鎖の共発現が必要であり（Weissら 、J．Exp．Med．160:1284-1299（1984）；Orloffhashiら、Nature 316:606-609 （1985）；Berkhoutら、J．Biol．Chem．263:8528-8536（1988）；Sussmanら、C ell 52:85-95（1988））、それらはα／β抗原結合鎖、CD3複合体の３つのポリ ペプチド、およびζである。これらのポリペプチド鎖のいずれが欠けても、複合 体の残りのメンバーは、安定的に発現することができない。ζは、完全な複合体 の表面発現を制限するポリペプチドで（Sussmanら、Cell 52:85-95（1988））、 レセプターによるリガンド認識で始まる細胞活性化プログラムの、少なくとも一 部を媒介すると考えられている（Weissmanら、EMBO J.8:3651-3656（1989）;Fra nkら、Science 249:174-177（1990））。32kDaのタイプI膜内蔵ホモ二量体、ζ （ゼータ）は、N-結合型糖付加部位を含まない9残基の細胞外ドメイン、および1 12 残基（マウス）または113残基（ヒト）の細胞内ドメインを有する（Weissmanら 、Science 238:1018-1020（1988）；Weissmanら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:9709-9713（1988））。ζのアイソフォームであるη（エータ）（Baniyashら 、J．Biol．Chem．263:9874-9878（1988）；Orloffら、J．Biol．Chem．264:148 12-14817（1989））は、選択的mRNAスプライシング経路によってでき（Jinら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3319-3233（1990））、抗原レセプターを発現し ている細胞の中に少量存在する。ζ-ηヘテロ二量体は、イノシトールリン酸の 形成を媒介し、アポトーシスと呼ばれる、レセプターによって開始されるプログ ラムされた細胞死を媒介すると考えられる（Mercepら、Science 242:571-574（1 988）；Mercepら、Science 246:1162-1165（1989））。 ζとηのように、Fcレセプター結合γ（ガンマ）鎖も、付加的なポリペプチド とともに細胞表面複合体として発現されるが、その一部はリガンド認識を媒介し 、残りは未解明の機能を持っている。γは、ホモ二量体構造をもち、全体的な機 構は、ζの機構によく似ており、また、肥満細胞／好塩基球の高親和性IgEレセ プターでもある、少なくとも３つの異なったポリペプチド鎖からなるFcεRI（Bl ankら、Nature 337:187-189（1989）；Raら、Nature 241:752-754（1989））の 構成成分であり、IgGに対する低親和性レセプターの一つでもある、マウスでは 、FcγRIIαに代表され（Raら、J．Biol．Chem．264:15323-15327（1989））、 ヒトでは、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞によって発現されるCD16 サブタイプであるCD16_TM（CD16トランスメンブレン）（Lanierら、Nature 342:8 03-805（1989）；Andersonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2274-2278（199 0））と、機能が明らかでないポリペプチドに代表されるレセプターの構成成分 でもある（Andersonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2274-2278（1990）） 。最近になって、γが、マウスのT細胞系であるCTLによって発現され、γ-ζお よびγ-ηヘテロ二量体だけでなくホモ二量体も形成することが報告されている （Orloffら、Nature 347:J89-191（1990））。 Fcレセプターは、免疫複合体の貧食作用、トランスサイトーシスおよび抗体依 存的細胞傷害作用（ADCC）を媒介する（Ravetch and Kinet，Annu．Rev．Immuno l．9:457-492（1991）；Unkelessら、Annu．Rev．Immunol．6:251-281（1988） ；および、Mellman，Curr．Opin．Immunol．1:16-25（1988））。最近になって 、マウス低親和性FcレセプターのアイソフォームであるFcRγIIIB1の一つが、Ig でコートされた標的を、クラスリンでコートされた窪みに取り込むのを媒介し、 別の低親和性レセプターであるFcrγIIIAが、小ファミリー「トリガー分子」の1 種以上のメンバーとの結合を通してADCCを媒介することが明らかにされた。（Mi ettinenら、Cell 58:317-327（1989）；Hunziker and Mellman，J．Cell Biol. 109:3291-3302（1989））。T細胞レセプター（TCR）ζ鎖、TCRη鎖、およびFcレ セプターγ鎖などのこれらのトリガー分子は、異なった免疫系のレセプターのリ ガンド認識ドメインと相互作用して、凝集後の細胞傷害までを含む細胞のエフェ クタープログラムを自律的に開始する（Samelsonら、Cell 43:223-231（1985） ；Weissmanら、Science 239:1018-1020（1988）；Jinら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 87:3319-3323（1990）；Blankら、Nature 337:187-189（1989）；Lanier ら、Nature 342:803-805（1989）；Kurosaki and Ravetch，Nature 342:805-807 （1989）；Hibbsら、Science 246:1608-1611（1989）；Andersonら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 87:2274-2278（1990）；Irving and Weiss，Cell 64:891-901 （1991））。 ところが、マウスとヒトの低親和性Fcレセプターファミリーを比較したところ 、ヒトのFcRγIIAとCアイソフォームに対応するものがマウスにはないことが明 らかになった。これが理由の一つであるが、それらの機能は未だ明らかにされて いない。 CD4のみに基づく体液性因子は、インビボでの有効性が限定されている可能性 があるため、まずHIVに対する細胞性免疫が増加する可能性を調べた。CD4の細胞 外ドメインを、T細胞レセプター、IgG Fcレセプター、またはB細胞レセプターな どのシグナル伝達因子の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインに融合さ せた蛋白質キメラの調製物が同定されている（U.S.S.N．07/847,566および07/66 5,961、本明細書に参照として包含される）。細胞外CD4ドメインを含むキメラを 発現している細胞傷害性T細胞は、HIVのエンベロープ蛋白質を発現している細胞 性標的をMHC非依存的に強力に破壊することが分かった。この研究方法の極めて 重要で新しい部分は、凝集するだけで細胞性応答を開始させることができる、単 一の T細胞レセプター、FcレセプターおよびB細胞レセプターの鎖を同定してきたこと である。この方法を特に有用に応用したものの一つが、細胞傷害性T型リンパ球 に、HIVのgp120を発現している細胞を認識し、それを破壊することを指示する、 CD4とζ、η、またはγとの間のキメラの発明である（U.S.S.N．07/847,566およ び07/665,961、本明細書において参照として包含される）。 発明の概要 一般的に、本発明は、哺乳動物において、HIV感染細胞に対する細胞性免疫応 答を誘導する方法を特徴とする。本発明は、哺乳動物に治療用細胞を有効量投与 することを含むが、この治療用細胞は、（a）HIV感染細胞を特異的に認識して結 合することができるが、HIV感染を媒介しない、CD4の断片を含む細胞外部分、お よび（b）レセプターに結合したHIV感染細胞を破壊するシグナルを治療用細胞に 送ることができる細胞内部分を含む、膜結合型蛋白質キメラレセプターを発現し ている。 関連する局面において、本発明は、（a）HIV感染細胞を特異的に認識し結合す ることができるがHIV感染を媒介しないCD4断片を含む細胞外部分、および（b） レセプターに結合したHIV感染細胞を破壊するシグナルを治療用細胞に伝達する ことができる細胞内部分、を含む膜結合型蛋白質性キメラレセプターを発現する 細胞を特徴とする。 第二の局面において、本発明は、HIV感染細胞を特異的に認識し結合すること ができるがHIV感染を媒介しないCD4断片を有する細胞外部分を含む膜結合型蛋白 質性キメラレセプターを発現する治療用細胞を有効量哺乳動物に投与することを 含む、哺乳動物におけるHIVを治療する方法を特徴とする。 関連する局面において、本発明は、HIV感染細胞を特異的に認識し結合するこ とができるがHIV感染を媒介しないCD4断片を有する細胞外部分を含む膜結合型蛋 白質性キメラレセプターを発現する細胞を特徴とする。 これら２つの局面の好ましい態様において、CD4断片は、CD4の1〜394番目のア ミノ酸、またはCD4の1〜200番目のアミノ酸でありる。；CD4断片は、図26に示さ れたCD7の膜貫通ドメインにより、または図25に示されたヒトIgG1分子のヒンジ 、CH2およびCH3ドメインにより、細胞内部分から分離されている。；CD4断片は 、少 なくとも48オングストローム(好ましくは、少なくとも72オングストローム)治療 用細胞から分離されている。第一の局面の好ましい態様において、細胞内部分は 、T細胞レセプター蛋白質（例えばζ）、B細胞レセプター蛋白質、またはFcレセ プター蛋白質のシグナル伝達部分である。；治療用細胞は、（a）Tリンパ球、（ b）細胞傷害性Tリンパ球、（c）ナチュラルキラー細胞、（d）好中球、（e）顆 粒球、（f）マクロファージ、（g）肥満細胞、（h）ヒーラ細胞、および（i）胚 性未分化細胞（ES）からなる群より選択される。 別の関連する局面において、本発明は、本発明のキメラレセプターをコードす るDNAを特徴とし、また、そのキメラレセプターDNAを含むベクターを特徴とする 。 本発明の特別な態様は、CD4とゼータとのキメラであるが、例えば、顆粒球ま たはB型リンパ球のレセプターのように、これらの分子と類似の機能をもつレセ プター鎖であれば、本明細書で開示されている目的のために用いることができよ う。望ましい免疫細胞誘因分子に特徴的な性質には、自律的に発現できること（ すなわち、一本鎖として）、細胞外CD4ドメインに融合して、その結果できたキ メラが治療用細胞の表面に存在できること、および標的リガンドとの会合に次い で起こる凝集によって細胞エフェクタープログラムを開始できることが含まれる 。 今のところ、キメラを免疫系細胞に輸送するための最も便利な方法は、遺伝子 治療の何らかの形による。しかし、細胞を、適当に可溶化した精製キメラ蛋白質 と混合することにより、キメラレセプターをもつ免疫系細胞を再構築すると、HI V感染標的に応答することができる加工された細胞集団が形成される。例えば、 治療目的でCD4分子を赤血球に導入するために、同様の方法が用いられている。 この場合、加工された細胞集団は、自己再生できないこともある。 本発明は、免疫細胞にHIV感染細胞を認識して溶解させることができる、CD4断 片とT細胞レセプター、B細胞レセプター、またはFcレセプターのサブユニットと の間にできた、機能的で単純なキメラに関連する。哺乳動物において、細胞応答 を誘導するための方法は、HIV感染細胞を認識して破壊することができる治療用 細胞（例えば、細胞傷害性Tリンパ球）を有効量、哺乳動物に投与することを含 む。 本発明はまた、細胞傷害性Tリンパ球がHIV感染細胞を認識して溶解するよう誘 導するキメラレセプター蛋白質、キメラレセプターを含むベクターによって形質 転換された宿主細胞、およびキメラレセプターに対する抗体を含む。 本発明の、これらおよびその他の無制限の態様は、以下の本発明に関する詳細 な説明を読めば、当業者には明らかであろう。 以下の詳細な説明において、分子生物学および免疫学の分野における当業者に 知られたさまざまな方法論が参照されるであろう。参照された既知の方法論を示 した出版物その他は、本明細書に、すべてが示されているものとして参照として 包含される。 組み換えDNA技術の一般原理を述べた標準的な参照文献には、「ワトソンら、 遺伝子の分子生物学、第1巻および第2巻、ベンジャミン／カミングス出版社刊、 カリフォルニア州メンロパーク（1987）」、「ダーネルら、分子細胞生物学、サ イエンティフィックアメリカン出版社刊、ニューヨーク州ニューヨーク（1986） 」、「レウイン、遺伝子II、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ社刊、ニューヨー ク州ニューヨーク（1985）」、「オールドら、遺伝子操作の原理:遺伝子工学へ の手引き、第二版、カリフォルニア大学出版部刊、カリフォルニア州バークレー （1981）」、「マニアティスら、分子クローニング:実験手引き、第二版、コー ルドスプリングハーバー研究所刊、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー （1989）」、および「オースベルら、分子生物学最新プロトコール、ウイリー出 版刊、ニューヨーク州ニューヨーク（1989）」などがある。定義 「クローニング」とは、インビトロの組み換え技術を利用し、特定の遺伝子ま たはDNA配列をベクター分子に挿入することを意味する。 「cDNA」とは、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によって、RN Aを鋳型にして作出された相補的DNAまたは複製DNAを意味する。したがって、「c DNAクローン」とは、クローンニングベクターにより運搬される、目的とするRNA 分子に相補的な二重鎖DNA配列を意味する。 「cDNAライブラリー」とは、cDNAライブラリー作製時に細胞によって発現され ているmRNAのDNAコピーを含むcDNA挿入物を含む組換えDNA分子の集合を意味する 。このようなcDNAライブラリーは、当業者に既知の、例えば、オースベルら（前 記）およびマニアティスら（前記）で開示されている方法にしたがって調製され るであろう。一般的に、まずRNAは、クローニングしようとしている特定の遺伝 子が含まれているゲノムをもつ生物の細胞から分離される。本発明の目的にとっ て好ましいのは、哺乳動物、特にヒトのリンパ球細胞系である。この目的にとっ て好ましいベクターは、今のところワクシニアウイルスのWR株である。 「ベクター」とは、DNA断片を挿入またはクローニングすることができる、例 えばプラスミド、バクテリオファージ、または哺乳類もしくは昆虫のウイルスに 由来するDNA分子を意味する。ベクターは、一つ以上の独特の制限酵素部位をも ち、クローン化した配列を一定の宿主または媒介生物の中で自律的に複製できる 。したがって、「DNA発現ベクター」とは、組換えペプチドの合成を行わせるこ とができるいかなる自律的要素をも意味する。このようなDNA発現ベクターには 、細菌のプラスミド、ファージ、ならびに哺乳類および昆虫のプラスミドおよび ウイルスが含まれる。 「実質的に純粋な」とは、例えば、蛋白質、ポリペプチド、または抗体などの化 合物が、本来それに付随している化合物を実質的に含まないことを意味する。一 般的には、目的の化合物が試料中の全物質量の、少なくとも60％、好ましくは75 ％以上、最も好ましくは90％以上であれば、実質的に純粋であるという。純度は 、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分 析などの適当な方法で測定できる。核酸に関して、「実質的に純粋な」とは、本 発明のDNAが由来する生物の本来のゲノム中では、両方のコーディング配列に直 接（すなわち、一方が5'末端ともう一方が3'末端と）連結しているが、どちらの コーディング配列とも直接には連結（すなわち、共有結合）していない核酸の配 列、分節、または断片を意味する。 本発明のcDNA配列のように、分子の「断片」とは、分子の連続的なヌクレオチ ドの部分集合を指すものとする。分子の「類似体」とは、自然に存在する分子の 全体または断片と、実質的に類似した、自然には存在しない分子を指す。二つの 分子のアミノ酸配列が実質的に同じであれば、ある分子は、もう一方の分子と「 実質的に類似」しているといえる。特に、「実質的に類似した」アミノ酸配列と は、天然または参照のアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは85％、最も好 ましくは95％の同一性を示すアミノ酸配列、および／または天然もしくは参照の アミノ酸配列と保存的なアミノ酸置換によってのみ異なるアミノ酸配列である。 実質的に類似したアミノ酸分子は、類似した生物学的活性をもつと思われる。本 明細書において用いられるように、ある分子が通常は持たない化学的構成部分を 含んでいれば、その分子はもとの分子の「化学的誘導体」といえる。このような 構成部分は、分子の可溶性、吸着性、生物学的半減期などを増加させよう。また は、この構成部分は分子の毒性を軽減したり、分子の何らかの有害な副作用を除 去したり、減少させたりするであろう。このような効果を媒介できる構成部分は 、例えば「レミントンの薬剤学、第16版、マック出版社、ペンシルバニア州イー ストン（1980）」に開示されている。 本発明のレセプターキメラ遺伝子の「機能的誘導体」とは、ヌクレオチド配列 が「実質的に類似」する遺伝子の「断片」または「類似体」を含むことを意味す る。「実質的に類似」している核酸は、実質的に類似したアミノ酸配列（前記で 定義されている）をコードしており、適当なハイブリダイゼーション条件下で天 然または参照の核酸配列とハイブリダイズできる核酸配列を含んでいてもよい（ 適当なハイブリダイゼーション厳密度については例えば、オースベル（Ausubel ）ら、分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biolo gy）、ウィリー出版社（Wiley Press）、ニューヨーク州ニューヨーク（1989） 参照のこと）。 「実質的に類似」しているキメラレセプターは、「野生型」のT細胞、B細胞、 またはFcレセプターキメラと類似の活性を有する。該誘導体は、野生型レセプタ ーキメラの活性の好ましくは40％、より好ましくは70％、最も好ましくは90％を 有する。機能的キメラレセプター誘導体の活性には、HIV感染細胞への（細胞外C D4部分による）特異的結合、およびその結果起こる該細胞の破壊が含まれる。； さらに、キメラレセプターは、レセプターをもつ細胞にHIV感染に対する感受性 をもたらさない。キメラレセプターの活性は、例えば、本明細書に記載の、いか なるアッセイ法を用いて測定してもよい。 本発明のCD4レセプターのキメラをコードするDNA配列、またはその機能的誘導 体を、通常の技術にしたがって、ベクターDNAに組み込ませてもよい。これらの 技 術には、ライゲーションのための平滑末端もしくは付着末端、適当な末端を提供 するための制限酵素消化、適当な付着末端にするための補填、不要な結合を防ぐ ためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なリガーゼによるライゲーショ ンが含まれる。このような操作のための技術は、マニアティスら（前記）によっ て開示されており、当業者に周知である。 DNAのような核酸分子は、転写および翻訳を制御する情報を含む塩基配列を含 み、この配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と「機能的に連結」 していれば、ポリペプチドを「発現することができる」といわれる。機能的な連 結とは、制御のためのDNA配列と、発現させようとするDNA配列とを、遺伝子発現 できるような方法で結びつけた連結をいう。遺伝子発現に必要とされる制御領域 の厳密な性質は、生物によってさまざまであろうが、一般的には、プロモーター 領域を含み、原核生物においては、プロモーター（RNA転写開始を促す）、なら びにRNAに転写されてから蛋白質合成の開始のシグナルとなるDNA配列の両方が含 まれる。このような領域には通常、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列 など、転写および翻訳の開始に関わる5'非翻訳配列が含まれるであろう。 必要であれば、蛋白質をコードする遺伝子配列の3'側非翻訳領域を、上述の方 法によって得ることができる。この領域は、転写終結およびポリアデニル化など の転写終結の制御配列として保持されているのかもしれない。したがって、蛋白 質をコードするDNA配列に本来隣接している3'領域を保持することで、転写終結 シグナルが提供されるかもしれない。発現宿主細胞で、転写終結シグナルが十分 に機能しないときは、宿主細胞中で機能する3'領域に置き換えてもよい。 二つのDNA配列（プロモーター領域の配列およびCD4レセプターのキメラをコー ドする配列）は、二つのDNA配列の間の結合の性質が、（1）フレームシフト突然 変異を誘導しない、（2）プロモーター領域の配列の、レセプターのキメラ遺伝 子配列を転写を促す能力を阻害しない、または（3）レセプターのキメラ遺伝子 配列の、プロモーター領域配列によって転写される可能性を阻害しないならば、 機能的に結合しているといわれる。プロモーター領域は、プロモーターがDNA配 列の転写に効果をもたらすようであれば、そのDNA配列に機能的に連結されたこ とになるであろう。したがって、蛋白質を発現させるためには、転写および翻訳 シグナル が適当な宿主によって認識されることが必要である。 本発明には、CD4レセプターのキメラ蛋白質（またはその機能的誘導体）の、 原核細胞または真核細胞における発現も含まれる。しかし、真核細胞（特にヒト リンパ球）で発現するものが好ましい。 本発明による抗体は、さまざまな方法のうちの何れによって調製してもよい。 例えば、CD4レセプターキメラ蛋白質またはその機能的誘導体を発現している細 胞を動物に投与すれば、キメラに結合できるポリクローナル抗体を含んだ血清の 産生を誘導することができる。 好ましい態様において、本発明による抗体はモノクローナル抗体である。この ようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの技術を用いて調製することがで きる（Kohlerら、Nature 256:495（1975）；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6:511 （1976）；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6:292（1976）；Hammerlingら、モノク ローナル抗体とT細胞ハイブリドーマ，Elsevier,ニューヨーク州エルスヴィアー （Elsevier）、563-684頁（1981））。一般的に、このような処理過程には、CD4 レセプターキメラ抗原で動物を免疫することが含まれる。この動物の脾細胞を抽 出して、適当なミエローマ細胞系と融合させる。適当なミエローマ細胞系であれ ば如何なるものも、本発明にしたがって用いることができる。融合させた後、得 られたハイブリドーマ細胞は、選択的にHAT培地中で維持され、次にワンズら（G astroenterology 80:225-232（1981））が述べているように、限られた希釈度で クローニングされる。それから、このような選択によって得たハイブリドーマ細 胞を、キメラに結合できる抗体を分泌するクローンを同定するために調べる。 また、本発明による抗体はポリクローナル抗体、または好ましくは領域特異的 ポリクローナル抗体であってもよい。 本発明によるCD4レセプターキメラに対する抗体は、患者におけるキメラレセ プター（またはキメラレセプターをもつ細胞）の量を測定するために用いられう る。このような抗体は、フォワードサンドイッチアッセイ、リバースサンドイッ チアッセイ、および同時サンドイッチアッセイなどのイムノメトリックまたは「 サンドイッチ」アッセイを含む、当業者に知られている標準的な免疫診断アッセ イに用いるのに非常に適している。この抗体は、適当な特異性、感度、および精 度 をもつ免疫アッセイ法を作成するための不必要な実験を行わずに、当業者によっ て決められた、いくつもの組み合わせにおいて用いることができる。 免疫学の一般原理について述べられた標準的な参照文献には、「ロイト、免疫 学要論、第６版、ブラックウエル科学出版社刊、オクスフォード（1988）」、「 キンボール、免疫学への手引き、第２版、マクミラン出版社刊、ニューヨーク（ 1986）」、「ロイトら、免疫学、ゴワー医学出版社刊、ロンドン（1985）」、「 キャンベル、「モノクローナル抗体の技術」、バードンら編による「生化学およ び分子生物学における実験技術」、第13巻、エルスビア社刊、アムステルダム（ 1984）」、「クライン、「免疫学：自己-非自己認識の科学」、ジョンウイリー ・アンド・サン社刊、ニューヨーク（1982）」、および「ケネットら編、「モノ クローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的解析の新次元」、プレナムプレス社 刊、ニューヨーク（1980）」が含まれる。 「検出」とは、ある物質の存在の有無を判定またはその量を定量することを含 むものとする。したがって、この用語は、定性的および定量的な測定を行うため に、本発明の物質、組成物、および方法を利用することに関連する。 本発明の抗体および実質的に精製された抗原は、理想的にはキットの調製に適 したものである。そのようなキットは、バイアルおよびチューブなどの一個以上 の容器に密封された形で受け取るために区画化された輸送手段を含む。ただし、 該容器にはそれぞれ、用いられるアッセイ法に必要な成分が別々に含まれている 。キットという形に包含されうるアッセイ法のタイプはさまざまで、例えば、競 合アッセイや非競合アッセイが含まれる。本発明の抗体を利用できる典型的なア ッセイの例は、放射性免疫アッセイ（RIA）、酵素免疫アッセイ（EIA）、固相酵 素免疫アッセイ（ELISA）、およびイムノメトリックもしくはサンドイッチ免疫 アッセイである。 「イムノメトリックアッセイ」または「サンドイッチ免疫アッセイ」とは、同 時サンドイッチ、フォワードサンドイッチ、およびリバースサンドイッチ免疫ア ッセイを含むものとする。これらの用語は、当業者に十分理解されている。また 、当業者には、本発明による抗体が、現在知られているアッセイ、または将来開 発されるアッセイの他の形式においても有用であることがわかるであろう。これ らも本発明の範囲に含まれるものとする。 「特異的に認識して結合する」とは、抗体が、キメラレセプターポリペプチド を認識して結合し、例えば生物試料などの、試料中の他の無関係な分子を実質的 には認識したり結合したりしないことを意味する。 「治療用細胞」とは、HIV感染細胞を認識して破壊するために、本発明のCD4レ セプターキメラで形質転換された細胞を意味するが、好ましくはそのような治療 用細胞は、造血系の細胞である。 「細胞外」とは、少なくとも分子の一部を細胞表面に露出させていることを意 味する。「細胞内」とは、少なくとも分子の一部を治療用細胞の細胞質に露出さ せていることを意味する。「膜貫通」とは、少なくとも分子の一部が原形質膜に 広がっていることを意味する。本明細書において用いられる、「細胞外部分」、 「細胞内部分」および「膜貫通部分」とは、隣接する細胞区画の中に続く、アミ ノ酸フランキング配列も含むものとする。 「重合」とは、二量体、三量体、四量体、またはそれ以上の多量体を形成する ために、他の蛋白質と複合体を作ることを意味する。このような多量体は、ホモ 多量体またはヘテロ多量体であろう。「重合部位」とは、複合体（すなわち、多 量体）を形成させる、分子の領域のことである。 「細胞傷害性の」とは、細胞（例えば、HIV感染細胞）を破壊できること、ま たは感染因子（例えば、HIVウイルス）を破壊できることを意味する。 「免疫不全ウイルス」とは、野生型において、宿主霊長類のT4細胞に感染する ことができ、ウイルス形態形成を行い、レンチウイルス亜科の形態的特徴を有す るレトロウイルスを意味する。この用語には、HIVおよびSIVのあらゆる変異体、 例えば、HIV-1、HIV-2、SIVmac、SIVagm、SIVmnd、SIVSmm、SIVman、SIVmand、S IVcpzなどを無制限に含む。 「MHC非依存的」とは、細胞傷害応答に、標的細胞の表面に位置するMHCクラス II抗原が存在しなくてもよいことを意味する。 「機能的な細胞傷害シグナル伝達誘導体」とは、野生型分子の生物学的活性の 少なくとも40％、より好ましくは70％、最も好ましくは90％以上を発揮できる機 能的な誘導体（既に定義されている）を意味する。本明細書において用いられる ように、「機能的な細胞傷害シグナル伝達誘導体」は、治療用細胞に、レセプタ ーに結合した病原体または細胞を破壊するよう直接シグナルを送ることによって 作用をすることもあり（細胞内にキメラレセプター部位がある場合）、または治 療用細胞の細胞傷害シグナル伝達蛋白質による重合を促進することによって間接 的に作用することもある（例えば、膜貫通ドメインの場合）。そのような誘導体 は、例えば本明細書に記載のインビトロ測定法などを用いて、その有効性を調べ てもよい。 「機能的HIVエンベロープ結合誘導体」とは、HIVのいかなるエンベロープ蛋白 質にも結合できる機能的な誘導体（既に定義されている）を意味する。機能的な 誘導体は、例えば、本明細書に記載のインビトロ測定法を用いて同定されうる。 治療用投与 本発明の形質転換細胞は、免疫不全ウイルスの治療に用いられる。このような 形質転換細胞を投与する最近の方法は、養子免疫治療法または細胞移入治療法を 含む。これらの方法においては、形質転換された免疫系細胞を血流の中に戻す。 ローゼンバーグ、Sci.Am.62（1990年5月）；ローゼンバーグら、N.Engl.J.Med.3 23:570（1990年）。 本発明の薬学的組成物は、本発明の組成物がもたらす有益な効果を受けるであ ろう動物に投与される。そのような動物の中でもとりわけヒトが重要であるが、 本発明はそれに限定するものではない。 詳細な説明 まず、図面について説明する。 図面の簡単な説明 図１Aは、CD4（1〜369残基目）と異なったレセプター鎖との間の融合部位付近 のアミノ酸配列を示す（配列番号：38〜41）。下線部の配列は、融合蛋白質を構 築するのに用いたBamHI部位がコードするアミノ酸の位置を示している。膜貫通 ドメインが開始するところを縦線で示した。η配列は、アミノ末端でゼータ配列 と一致しているが、カルボキシル末端では異なっている（Jinら、Proc．Natl．A cad．Sci．USA 87:3319-3323（1990））。図１Bは、CV1細胞中のCD4、CD4:ζ、C D4:γ、およびCD4:ηの表面発現をフローサイトメトリー分析した結果を示す。C D 4キメラまたはCD16_PIを発現するウイルスで細胞を感染させ、37℃で９時間イン キュベートして、フィコエリスリンを結合した抗CD4モノクローナル抗体Leu3Aで 染色した。 図２は、CD16_TMの表面発現を、CD16_TMのみ感染させた場合（詰まった点線）、 またはCD4:γを発現するウイルスと同時感染させた場合（鎖線）、またはCD4:ζ を発現するウイルスと同時感染させた場合（実線）について示している。間隔が 開いた点線は、CD4:ζのみを感染させた細胞を3G8で染色したものを示している （Fleitら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:3275-3279（1982））（抗CD16 MAb ）。 図３は、CD16_TMを発現するウイルスと以下のζキメラとを同時感染させた細胞 におけるCD16_TMの表面発現を示す。CD4:ζ（太線）、CD4:ζ C11G（実線）、CD4 :ζ（鎖線）、CD4:ζ C11G/D15G（濃い点線）、同時感染なし（CD16_TMのみ、薄 い点線）。細胞を抗CD16モノクローナル抗体3G8と、フィコエリスリンを結合し た、マウスIgGに対するFab'₂ヤギ抗体とでインキュベートした。ζキメラの発現 レベルは、解析に用いられた異なった変異体について、実質的に同じだった。ま た、CD16_TMとζキメラを発現するウイルスを細胞に同時感染させても、キメラの 表面発現は、認めうるほどには変化しなかった。 図４A〜Dは、T細胞系のζキメラ変異体を架橋させた後の、遊離カルシウムイ オンの細胞内での増加を示している。Jurkat E6細胞（Weissら、J．Immunol．13 3:123〜128（1984））を組換えワクシニアウイルスに感染させ、フローサイトメ トリーで解析した。CD4⁺集団をまとめたものについての結果を示す。そのため、 関連のキメラ蛋白質を発現している細胞のみを解析している。紫から青のインド -1蛍光の平均比は、集団全体における細胞内の遊離カルシウム濃度を表す。また 、反応細胞の割合は、予め決められた閾値率（無処理細胞の10％が陽性になるよ う設定した）を上回る細胞の割合を表す。図４Aおよび図４Bは、CD4:ζ（実線） またはCD16:ζ（鎖線）を発現しているJurkat細胞を抗CD4モノクローナル抗体Le u3a（フィコエリスリン結合体）に曝してから、マウスIgGに対するヤギ抗体と架 橋させた。点線は、非感染細胞の抗CD3モノクローナル抗体OKT3に対する反応を 示す。図４Cおよび４Dは、図４Aおよび図４Bと同じように処理して解析された、 CD4: ζD15G（実線）、CD4:ζC11G/D15G（鎖線）、またはCD4:ζC11G（点線）を発現 しているJurkat細胞を表している。 図５A〜Cは、CD4:ζ、CD4:ηおよびCD4:γレセプターが、細胞傷害性T型リン パ球（CTL）にHIV-1のgp120/41を発現している標的を破壊させることを示してい る。図５A：黒丸は、CD4:ζを発現しているCTLを、gp120/41を発現しているヒー ラ細胞とインキュベートしたもの、白丸は、CD4:ζを発現しているCTLを、未感 染ヒーラ細胞とインキュベートしたもの、黒四角は、非感染のCTLだけを、gp120 /41を発現しているヒーラ細胞とインキュベートしたもの、白四角は、非感染のC TLだけを、末感染のヒーラ細胞とインキュベートしたものである。図５B：黒丸 は、CD4:ηを発現しているCTLを、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とインキ ュベートしたもの、白丸は、CD4:γを発現しているCTLを、gp120/41を発現して いるヒーラ細胞とインキュベートしたもの、白四角は、C11G/D15G二重変異体のC D4:ζキメラを発現しているCTLを、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とインキ ュベートしたものである。図５C：図５Bで用いられたCTLを使ったCD4発現のフロ ーサイトメトリー解析である。標的のエフェクターに対する比率を補正するため に、ヒストグラムに上乗せされる部分から見積もられた負の（非感染）集団を引 き算して、CD4キメラを発現している細胞の百分率を決定したが、この図では、 比較し易くするために、非感染細胞に適当な閾値を与えて、ヒストグラムの引き 算をしたときのように、ほぼ同じ画分が他の細胞集団でも対応するようにした。 図６A〜Bは、CD4が左右する細胞傷害の特異性を示す。図６A：黒丸は、CD16_PI を発現しているヒーラ細胞とともにインキュベートした、CD4:ζを発現している CTLで、白丸は、gp120を発現しているヒーラ細胞とともにインキュベートした、 CD4を発現しているCTL、黒四角は、gp120/41を発現しているヒーラ細胞とともに インキュベートした、CD16:ζを発現しているCTL、白四角は、gp120/41を発現し ているヒーラ細胞とともにインキュベートした、CD16_PIを発現しているCTLであ る。図６B：黒丸は、Raji（MHC class II⁺）細胞とともにインキュベートした、 CD4:ζを発現しているCTLで、白丸は、RJ2.2.5（MHC class II-Raji変異体）細 胞とともにインキュベートした未感染のCTL、黒四角は、Raji（MHC class II⁺） 細胞とともにインキュベートした未感染のCTL、白四角は、RJ2.2.5（MHC class II^-） 細胞とともにインキュベートした、CD4:ζを発現しているCTLである。縦座標の 目盛りは拡大されている。 図７A〜Bは、CD16:ζキメラレセプターの特徴を示す。図７Aは、CD16:ζ融合 蛋白質の略図解である。ホスファチジルイノシトールに結合した形のCD16単量体 の細胞外部位を、ζ二量体と膜貫通ドメインのすぐ外側に連結した。融合部の蛋 白質の配列が一番下に示されている（配列番号：42、43）。図７Bは、CD16:ζキ メラをTCRをもつ細胞系またはTCRをもたない細胞系の何れかと架橋させた後の、 カルシウム移動のフローサイトメトリー分析を示す。抗体処理した0秒後からの 、細胞集団の紫色光と青色光の平均比（相対的なカルシウムイオン濃度の測定値 ）が示されている。黒四角、抗CD3モノクローナル抗体OKT3に対するJurkat細胞 の反応；黒三角、REX33A TCR^-変異体中で架橋したときの、抗CD16モノクローナ ル抗体3G8に対するCD16:ζの反応；白四角、Jurkat TCR^-変異系統JRT3.T3.5中の CD16:ζ架橋に対する反応；白三角、Jurkat細胞中でのCD16:ζ架橋に対する反応 ；十字、Jurkat細胞のキメラでないCD16に対する反応；および点線、REX33A TCR^- 細胞系統中のキメラでないCD16に対する反応。 図８A〜Bは、細胞傷害能力のデリーション分析を示している。図８Aにζ欠失 の終点の位置を示す。他と同じように、ここでも、ζにおける突然変異を元の残 基-位置-変異残基で表す慣例法によって示した。つまり、例えば、D66*というの は66番目のアスパラギン酸を終止コドンで置き換えたことを意味する。図８Bに 、欠失させてないCD16:ζおよび顕著なζ欠失変異体の細胞破壊測定結果を示す 。CD16に対する表面抗体を発現しているハイブリドーマ細胞に⁵¹Crを結合させて 、CD16:ζキメラを発現する組換えワクシニアウイルスを感染させたヒト細胞傷 害性リンパ球（CTL）の数を増やしながらインキュベートした。遊離した⁵¹Crの 割合を、エフェクター（CTL）の標的（ハイブリドーマ）細胞に対する比（e/t） の関数としてプロットする。黒丸、CD16:ζ（mfi 18.7）を発現している細胞に よって媒介される細胞傷害；黒四角、CD16:ζAsp66*（mfi 940.2）を発現してい る細胞によって媒介される細胞傷害；白四角、CD16:ζGlu60*（mfi 16.0）を発 現している細胞によって媒介される細胞傷害；白丸、CD16:ζTyr51*（mfi 17.4 ）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害；黒三角、CD16:ζPhe34*（m fi 17.8） を発現している細胞によって媒介される細胞傷害；白三角、キメラでないCD16（ mfi 591）を発現している細胞によって媒介される細胞傷害。この実験では、CD1 6:ζAsp66*の発現が、他の融合蛋白質の発現と異なっていたが、同じ実験で、同 程度にCD16:ζを発現している細胞による細胞傷害における結果と、CD16:ζAsp6 6を発現している細胞による細胞傷害とが本質的に同じであった。 図９A〜Dは、膜貫通相互作用をする能力を取り除くと、ζの短い断片でも細胞 傷害を媒介できることを明らかにしている。図９Aは、２つの部分からなる単量 体キメラおよび３つの部分からなる単量体キメラの概略図である。一番上は、６ ５残基目までをもつ欠失体で、膜貫通残基のシステインおよびアスパラギン酸残 基を欠失しているCD16:ζ構築体である。その下は、CD16:CD5:ζおよびCD16:CD7 :ζ構築体およびそれに関連する対照である。細胞内ドメインのペプチド配列を 下に示した（配列番号：45〜47）。図９Bは、単量体キメラ欠失変異体の細胞傷 害活性を示す。CD16:ζを発現する細胞の細胞傷害活性（黒丸；mfi 495）を、CD 16:ζAsp66*を発現する細胞の細胞障害活性（黒四角；mfi 527）もしくはCD16: ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*変異体の細胞障害活性（白四角；mfi 338）、およ びCD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*変異体の細胞障害活性（黒三角；mfi 259） と比較した。図９Cは、３つの蛋白質を融合した蛋白質に媒介される細胞傷害活 性を示す。黒三角、CD16:ζAsp66*；白四角、CD16:5:ζ（48-65）；黒四角、CD1 6:7:ζ（48-65）；白三角、CD16:7:ζ（48-59）；白丸、CD16:5；黒丸、CD16:7 。図９Dは、TCRをもたないJurkat JRT3.T3.5変異細胞系における、変異体および ３部分からなるキメラによるカルシウム移動を示したものである。白丸、二量体 CD16:ζAsp66*を発現している細胞の反応；黒四角、CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/ Asp66*を発現している細胞の反応；白四角、CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60* を発現している細胞の反応；黒三角、CD16:7:ζ（48-65）を発現している細胞の 反応；白三角、CD16:ζ（48-59）を発現している細胞の反応。 図10A〜Fは、18残基の細胞障害シグナル伝達モチーフ活性に対する各アミノ酸 の寄与を示している。図10Aおよび10Bは、細胞傷害活性を、図10Cは、カルボキ シル末端のチロシン（Y62）付近に点突然変異を有するキメラによって媒介され るカルシウムイオンの移動を示したものである。図10Aおよび10Bは、CD16:ζ融 合蛋白 質をそれぞれ少量または多量に発現する細胞について集めたデータである。カル シウム移動測定と、細胞傷害測定とは同じ記号が用いられており、右側に一文字 コードが示されている。黒丸、CD16:ζを発現している細胞（mfi Aでは21; Bで は376）；黒四角、CD16:7:ζ（48-65）を発現している細胞（mfi A、31; B、82 ）；白四角、CD16:7:ζ（48-65）Glu60Gln（mfi A、33; B、92）；十字、CD16:7 :ζ（48-65）Asp63Asn（mfi A、30; B、74）；黒三角、CD16:7:ζ（48-65）Tyr6 2Phe（mfi A、24;B、88）；白丸、CD16:7:ζ（48-65）Glu61Gln（mfi A、20; B 、62）；白三角、CD16:7:ζ（48-65）Tyr62Ser（mfi B、64）。図10Dおよび10E は、細胞傷害活性を、図10Fは、アミノ末端のチロシン（Y51）付近に点突然変異 を有するキメラによるカルシウムイオンの移動を示したものである。カルシウム 移動測定と細胞傷害測定とは同じ記号が用いられており、右側に示されている。 黒丸、CD16:ζを発現している細胞（mfi Dでは21.2; Eでは672）；黒四角、CD16 :7:ζ（48-65）を発現している細胞（mfi D、31.3; E、179）；黒三角、CD16:7: ζ（48-65）Asn48Ser（mfi D、22.4; E、209）；白四角CD16:7:ζ（48-65）Leu5 0Ser（mfi D、25.0; E、142）；白三角、CD16:7:ζ（48-65）Tyr51Phe（mfi D、 32.3; E、294）。 図11A〜Bは、ζの内部反復配列、および細胞傷害を補助する能力の比較を示す 。図11Aは、ζの細胞内ドメインを３つに分けて、それらにCD16:7キメラの膜貫 通ドメインをつけ加えて作り上げたキメラの略解図である。細胞内ドメインの配 列を下に示している（配列番号：48〜50）が、共通の残基は線で囲み、関連する アミノ酸残基は星印を付けてある。図11Bは、ζの３つの分割したドメインの細 胞傷害能力を示している。黒丸、CD16:ζを発現している細胞（mfi 476）；黒四 角、CD16:7:ζ（33-65）（mfi 68）；白四角、CD16:7:ζ（71-104）（mfi 114） ；黒三角、CD16:7:ζ（104-138）（mfi 104）。 図12は、CD16:FcRγIIキメラの略解図である。 図13A〜Bは、CD4:FcRγIIキメラ、およびCD16:FcRγIIキメラを架橋した後の 、カルシウムの移動を示したものである。図13Aは、カルシウムを識別する蛍光 体インド-1を含んだ細胞が放つ紫色光の青色光に対する比を、CD16の細胞外ドメ インに抗体を架橋してからの時間の関数として表してある。図13Bも、同じよう に、抗 体を架橋した後の、CD4:FcRγIIキメラを有する細胞の紫色光の青色光に対する 比の増加を解析したものである。 図14A〜Bは、CD4:FcRγIIキメラおよびCD16:FcRγIIキメラの細胞傷害測定を 示している。図14Aは、抗CD16ハイブリドーマ（標的）細胞に、CD16:FcRγIIキ メラ（エフェクター細胞）を発現している細胞傷害性T型リンパ球を増加させな がら接触させたとき、ハイブリドーマ細胞から遊離する⁵¹Crの割合を示している 。図14Bは、同様に、HIVエンベロープ糖蛋白質を発現している標的細胞に対する 、CD4:FcRγIIキメラによって媒介される細胞傷害の解析結果を示している。 図15A〜Eは、細胞傷害にとって重要なFcRγII Aテール中の残基を同定したも のを示す。図15Aは、欠失構造体の概略図である。図15Bおよび15Cは、CD16:FcR γII Aのカルボキシル末端側欠失変異体によるカルシウム移動および細胞傷害を 示す。図15Dおよび15Eは、アミノ末端から次第に削っていったために、CD16:FcR γII Aの細胞内のテール部分が短くなった、３つの部分からなるキメラによるカ ルシウム移動および細胞傷害を示す。 図16（配列番号:24）は、CD3デルタレセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。 線で囲った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。 図17（配列番号:25）は、T3ガンマレセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。 線で囲った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。 図18（配列番号:26）は、mb1レセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。線で囲 った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。 図19（配列番号:27）は、B29レセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。線で囲 った配列は、好ましい細胞傷害シグナル伝達部位を表している。 図20は、CD4キメラの略図を示す。分子「Ａ」は、CD4（D1-D4）:Ig:CD7；分子 「Ｂ」は、CD4（D1、D2）:Ig:CD7；分子「Ｃ」は、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζ；分 子「Ｄ」は、CD4（D1,D2）:Ig:CD7:ζ；分子「Ｅ」は、CD4:ζである。ヒトIg配 列にあたるcDNAをワクシニアウイルスの組換え体で発現させたことを除けば、既 に開示したようにして、（Zettlmeisslら、DNA Cell Biol．9:347（1990））ヒ トCD4分子の前駆体のアミノ酸1〜394に相当するCD4分子の細胞外ドメインを、ヒ トIgG1のヒンジ、CH1およびCH2ドメインにBamHI部位で連結した。CD4前駆体cDNA の 唯一のNheI部位（アミノ酸配列の200番目に相当する）にBamHIアダプターを挿入 して、CD4キメラの２つのドメインを有するキメラを作製した。ヒト膜結合IgG1 の第一エクソンの22残基からなる膜結合配列の後ろにCD7のアミノ酸残基146〜20 3をつないだ。ζの55から163までのアミノ酸を４つの部分からなる構築体のトリ ガーモチーフとして用いた（CおよびD）。ζ鎖を含む、４つの部分からなる構築 体におけるζの細胞内発現については、購入可能な、細胞内ドメインに対する抗 体を用いて行った記録がすでにある（Coulter社）。 図21は、CD4に由来するさまざまなキメラをエフェクター分子として発現して いる細胞傷害性T細胞クローンWH3によって媒介される、HIV-1エンベロープ糖蛋 白質を発現している標的細胞の破壊を示す。細胞傷害性測定のために、ヒトCD8⁺ CD4^-HLA B44に限定されたT細胞系WH3を、本明細書で既に説明されているように 、10％ヒト血清を添加したIMDMで維持した。ガンマ線照射（3000 rad）した、B4 4を有する単核細胞、および1μg/mlの植物血液凝集素（PHA）で細胞を刺激した 。刺激後1日経ったところで、新しい培地を加えてPHAを0.5μg/mlに希釈し、3日 後には完全に培地を交換した。細胞傷害を測定するまで、少なくとも10日間は細 胞を増殖させた。本明細書においてVPE16と表わされる適当な組換えワクシニア ウイルスを細胞に感染させた。完全培地中で、3〜4時間感染を継続させた後、遠 心分離で回収して、1×10⁷/mlの密度になるよう再懸濁した。このうち100μlを 、各ウエル毎に100μlの完全培地を入れたU底マイクロタイタープレートに加え 、2回段階希釈した。各サンプルにつき２つのウエルにはリンパ球を入れないで 、無作為にクロムを遊離させて、クロムの取り込み全体を測定した。ヒーラ亜系 細胞S3（HeLa-S3、ATCC）を標的細胞として、前記のように、10 cmディッシュ中 でvPE16に感染させた。10⁶個の感染細胞をPBSと1 mM EDTAで剥離、遠心してから 100μlの⁵¹Crクロム酸ナトリウム（PBS中1 mCi/ml）で再懸濁し、37℃に１時間 置いてからPBSで３回洗浄した。標識した標的細胞を100μlずつ各ウエルに加え た。マイクロタイタープレートを750×gで1分間回転し、37℃で4時間インキュベ ートした。インキュベーション時間の最後に各ウエルの細胞を緩やかなピペッテ ィングにより再懸濁し、全取り込み数を測定するため、試料の一部を取ってから 、マイクロタイタープレートを750×gで1分間回転した。上清の一部（100μl） を取って、ガンマ線シ ンチレーションカウンターで計測した。フローサイトメトリーによって測定され た感染細胞の割合に合わせて、エフェクター:標的比を補正した。 図22は、形質転換細胞系におけるHIV-1の複製を示している。野生型CD4とさま ざまな組換えキメラを安定的に発現する細胞系を、ヒト胚腎細胞系293の亜系細 胞から確立した。ヒトT細胞系C8166を指示細胞として用いた最終希釈分析で測定 して、HIV-1IIIB単離物のウイルスストックをほぼ10⁶感染粒子/mlになるよう調 製した。およそ1 MOIで、37℃、8〜12時間感染を行なった。翌日、細胞をPBSで ３回洗浄し、トリプシン処理して、新しいディッシュに再び撒いて、培養上清は p24滴定（0日目とする）を行なうためにサンプリングした。その後、3〜4日間隔 で細胞培養上清を回収して、p24分析を続けた。細胞には、濃度100μg/mlのハイ グロマイシンBを含む新しい培地を補給した。市販のELISA法に基づくHIV-1 p24 抗原測定キット（Coulter社）を、製造業者の提供する指示に従って用い、培養 上清の解析を行なった。一つの期間について２回ずつ独立した実験を行なった結 果を示す。 図23は、CD4のD1-D4ドメイン（CD4 Bam）の塩基配列（配列番号：28）とアミ ノ酸配列（配列番号:29）を示す。 図24は、CD4のD1-D2ドメイン（CD4 Nhe）の塩基配列（配列番号:30）とアミノ 酸配列（配列番号:31）を示す。 図25は、ヒトIgG1のヒンジ、CH2およびCH3ドメイン（Igh23 Bam）の塩基配列 （配列番号:32）とアミノ酸配列（配列番号:33）を示す。 図26は、CD7の膜貫通ドメイン（TM7 Bam Mlu）の塩基配列（配列番号:34）と アミノ酸配列（配列番号:35）を示す。 図27は、ゼータの細胞内ドメイン（Zeta Mlu Not）の塩基配列（配列番号:36 ）とアミノ酸配列（配列番号:37）を示す。 図28は、合成アルファヘリックスのDNA配列（配列番号:51）とアミノ酸一次配 列（配列番号:52）を示す。 実施例I ヒトIgG1:レセプターキメラの構築 C_H3ドメイン中の配列を、膜貫通型の抗体mRNAの3'末端からとったcDNA断片に 結合させて、ヒトIgG1の重鎖配列を調製した。3'末端断片は、扁桃cDNAライブラ リ ーを基質にして、目的のDNA断片の5'末端、3'末端それぞれに対応する次の配列 を有するオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得た。CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC（配列番号：7）および CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA（配列番号:8）。5 '側オリゴは、ヒトIgG1のC_H1ドメインの部位に相補的で、3'側オリゴは膜内ドメ インをコードする配列の5'端と相補的である。PCR産物をBstXIとBamHIで消化し て、可変領域と定常領域を有する半合成IgG1抗体遺伝子のBstXIとBamHI部位の間 に結合させた。BstXIからBamHIまでの断片を挿入した後、構築物の増幅された部 分のC_H3のSmaI部位までを制限酵素断片と入れ換えて、SmaI部位と3'側オリゴの 間の部分だけがPCR反応に由来するようにした。 ヒトIgG1:ζキメラレセプターを作出するために、重鎖遺伝子のBamHI部位で終 わる部分を、以下に説明するζキメラのBamHI部位に結合させて、抗体配列が細 胞外部分を作るようにした。フローサイトメトリーによって、軽鎖cDNAをコード する発現プラスミドを共感染させると、キメラをコードするプラスミドを感染さ せたCOS細胞が抗体決定基を高レベルで発現し、この発現プラスミドを共感染さ せないと、抗体決定基の発現が少なくなることが分かった。 ヒトIgG1にηまたはγを融合させたもの（下記参照）や、T細胞レセプターま たはFcレセプター蛋白質のシグナル伝達部位をもつような同様のキメラは、一般 的に、上述したように分子生物学の標準的な技術を用いて構築することができる 。 軽鎖と重鎖の両鎖を一つのプロモーターから発現させる単一の転写ユニットを 作出するために、重鎖と軽鎖をコードする配列と、grp78またはBipとして知られ る78KDのグルコース制御蛋白質をコードするmRNAの5'非翻訳領域部分から２つの シストロンをもつmRNAをコードするプラスミドを作成した。grp78の配列は、以 下の配列をもつプライマーを用いて、ヒトのゲノムDNAのPCRによって得られた。 5'端のCGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC（配列番号:9）、および3 '端のCGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG（配列番号:10）。これら のオリゴを用いたポリメラーゼチェーン反応は、10％ジメチルスルホキシド存在 下で行なった。PCRによって得た断片をNotIとHincIIで制限酵素処理して、ヒトI gG1をコードする配列の下流にあるNotIとHpaI部位の間に挿入した。次に、ヒトI gG カッパ軽鎖cDNAをコードする配列を、HincIIとベクター中の別の部位を用いて、 grp78のリーダー配列の下流部分に挿入した。これらの操作によってできた発現 プラスミドは、半合成の重鎖遺伝子の後ろにgrp78のリーダー配列があり、その 後ろにカッパ軽鎖cDNA配列があり、その後ろにSV40 DNA断片に由来するポリアデ ニル化シグナルがある。この発現プラスミドでCOS細胞を形質転換すると、重鎖 決定基だけをコードするプラスミドで形質転換したものに較べて、重鎖決定基の 発現が著しく促進された。 重鎖／レセプターキメラおよび軽鎖を含む、２シストロン性の遺伝子を作製す るために、重鎖の上流域配列を、本明細書に記載のいかなるキメラ重鎖／レセプ ター遺伝子と置き換えることもできる。 実施例II CD4レセプターキメラの構築 ヒトζ（Weissmanら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:9709-9713（1988b）） およびγ（Kusterら、J．Biol．Chem．265:6448-6452（1990））cDNAを、HPB-AL L腫瘍細胞系（Aruffoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:8573-8577（1987b） ）、またはヒトのナチュラルキラー細胞から調製されるライブラリーからポリメ ラーゼチェーン反応によって分離した。また、ηのcDNA（Jinら、Proc．Natl．A cad．Sci．USA 87:3319-3323（1990））は、マウス胸腺細胞ライブラリーから分 離した。ζ、ηおよびγ cDNAを、膜内ドメインのすぐ上流にBamHI部位をもつよ うに加工されたCD4（Aruffoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:8573-8577（19 87b）；Zettlmeisslら、DNA Cell Biol．9347-353（1990））の細胞外ドメイン に結合させた。このドメインは、膜内ドメインの数塩基上流の近い位置にあるζ およびηcDNAに本来存在するBamHI部位に連結させたものである（配列番号:1、3 、4および6）。γを有する融合蛋白質を作るために、ほぼ同じ位置にBamHI部位 を加工して配列の中に導入した（図１;配列番号:2および5）。遺伝子融合物を、 大腸菌のgpt遺伝子を選択マーカーとして有するワクシニアウイルス発現プラス ミドに導入し、相同的組み換え、およびマイコフェノール酸中での増殖の選択に よりワクシニアのWR株のゲノムに挿入した（Falknerら、J．Virol．62:1849-185 4（1988）；Boyleら、Gene 65:123-128（1988））。フローサイトメトリー分析 によ ると、ワクシニア組換え体はCD4:ζとCD4:γ融合蛋白質を細胞表面に大量に産生 させたが、CD4:ηの発現は、実質的に弱くなった（図１B）。後者の発見は、ηc DNA発現プラスミドでマウスのハイブリドーマ細胞系を形質転換したものが、ζ 発現プラスミドで同様に形質転換したものに較べて実質的に低い発現を示したと いう最近の報告（Claytonら、J．Exp．Med．172:1243-1253（1990））と矛盾し ない。ワクシニアの組換え体を感染させた細胞の免疫沈降によって、融合蛋白質 が共有結合して二量体を形成することが明らかになったが、これは天然のCD4抗 原では異なる。CD4:ζとCD4:γ融合蛋白質の単量体と本来のCD4の分子量は、そ れぞれ63、55および53 KDであることが分かった。融合蛋白質の分子量が大きい のは、細胞内の部分が長くなっているせいで、それぞれ、本来のCD4よりも75残 基（CD4:ζ）または5残基（CD4:γ）長くなっている。 実施例III CD4キメラは、他のレセプター鎖と結合できる 形質転換体における、ヒトFcγRIII（CD16_TM）のマクロファージ／ナチュラル キラー細胞形態の細胞表面での発現は、マウスγ（Kurosakiら、Nature 342:805 -807（1989））またはヒトγ（Hibbsら、Science 246:1608-1611（1989））との 同時感染により、およびヒトζ（Lanierら、Nature 342:803-805（1989））によ り促進される。 これらの報告と符合して、CD16_TMを組換えワクシニアウイルスとともに標的細 胞に同時形質転換または同時感染して送り込むと、キメラ発現とともにCD16_TMも 細胞表面で発現した（図２）。調べられた細胞系においては、ζによってCD16_TM の表面発現が促進される程度の方が、γによって促進される程度より著しかった （図２）が、CD4自体は、CD16_TMの表面発現を促進しなかった。 実施例IV Aspζ変異体は、Fcレセプターと共結合しない 現存する抗原またはFcレセプターと結合しないキメラを作出するために、膜内 のAspまたはCys残基のいずれか、またはその両方を欠失した変異体ζ融合蛋白質 を調製した。フローサイトメトリーにより、異なる変異体キメラによる細胞表面 発現の強さと、変異していない前駆体の強さとの違いは観察できなかった。また 、免疫沈殿実験によって、キメラの全発現量はほぼ同じであることが分かった。 予想通り、膜貫通部分のシステイン残基を欠失した変異体キメラは、ジスルフィ ド結合による二量体を形成しないことが分かった。Aspを欠失した２つの変異体 キメラは、CD16_TMの表面発現を維持できなかったが、一方、AspをもちCysを欠失 した単量体キメラは、元の二量体より効率は低かったが、CD16_TMを発現させた（ 図３）。 実施例V 変異体レセプターはカルシウム応答を開始する能力を保持している 融合蛋白質の架橋によって、T細胞抗原レセプターによって起きることが知ら れているような、細胞内の遊離カルシウムの蓄積が起きるか否かを判定するため に、ヒトT細胞白血病系細胞のジャーカット E6（ATCC寄託番号TIB 152、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州ロックビル）に、ワ クシニア組換え体を感染させて、細胞外ドメインと抗体との架橋後の細胞質のカ ルシウムの相対濃度を測定した。カルシウム識別用染料インド-1を含む細胞を用 いて、フローサイトメトリー測定を行なった（Grynkiewiczら、J．Biol．Chem． 260:3340-3450（1985）；Rabinovitchら、J．Immunol．137:952-961（1986）） 。図４A〜Dは、CD4:ζおよびζのAsp^-、Cys^-変異体を感染させた細胞を用いたカ ルシウム移動実験結果を示している。キメラの架橋によって、細胞内カルシウム が再現的に増加した。CD4:ηおよびCD4:γを感染させた細胞では、同じように細 胞内のカルシウムが蓄積した。ジャーカット細胞は、細胞表面でCD4を低レベル に発現するが、本来のCD4の架橋は、CD16:ζがあってもなくても細胞内のカルシ ウム量を変化させない（図４A〜B）。 実施例VI CD4:ζ、η、およびγキメラは、HIVのgp120/41を発現している標的の細胞傷害 を媒介する キメラレセプターが細胞傷害エフェクタープログラムを開始するかを調べるた めに、CD4がHIVエンベロープgp120/gp41複合体を認識することに基づく標的:エ フェクター系のモデルを作製した。gp120/gp41を発現する組換えワクシニアウイ ルスをヒーラ細胞に感染させ（Chakrabartiら、Nature 320:535-537（1986）；E a rlら、J．Virol．64:2448-2451（1990））、⁵¹Crで標識した。標識した細胞は、 CD4:ζ、CD4:η、もしくはγキメラを発現するか、またはCD4:ζCys11Gly:Asp15 Gly二重変異体キメラを発現するワクシニア組換え体を感染させた同種異系特異 的（CD8⁺、CD4^-）細胞傷害性T型リンパ細胞系の細胞とインキュベートした。図 ５A〜Cは、gp120/41を発現しているヒーラ細胞が、CD4キメラを発現している細 胞傷害性Tリンパ細胞（CTL）によって特異的に破壊されることを示している。非 感染のヒーラ細胞は、CD4:ζキメラをもつCTLの標的にはならなかった。また、 非感染のCTLは、gp120/41を発現しているヒーラ細胞を認識しなかった。さまざ まなキメラの効率を較べるためエフェクター対標的比を、CD4キメラを発現して いるCTL画分、およびgp120/41を発現しているヒーラ細胞画分に関して補正した 。これらの画分はフローサイトメトリーで測定した。図５Cは、図５Aおよび図５ Bで示した細胞傷害実験で用いたCTLによるCD4発現のサイトメトリー分析結果を 示している。表面CD4:ζの平均密度は、CD4:ηの平均密度を大きく上回るが、ど ちらのキメラを発現している細胞も、細胞傷害効率はほぼ同じであった。gp120 を発現している標的細胞画分に関する補正を行うと、CD4:ζ蛋白質とCD4:η蛋白 質によって媒介される細胞傷害効率は、特異的T細胞レセプター標的:エフェクタ ーの組み合わせについて報告された最も高い効率に匹敵した（CD4:ζを発現する T細胞が50％遊離する場合のエフェクター:標的の平均比は、1.9±0.99、n＝10） 。CD4:γ融合蛋白質は、膜通過部のAspとCysを欠いたCD4:ζと同じように活性が 低かったが、どちらの場合にも、有意な細胞傷害が観察された（図５B〜C）。 ワクシニア感染によってCTLによる認識が人為的に促進される可能性に関する 対照をとるために、ホスファチジルイノシトールに結合したCD16（CD16_PI）を発 現するワクシニア組換え体を感染させ⁵¹Crで標識した標的細胞と、CD16_PIまたは CD16:ζを発現する対照用組換え体を感染させたCTLを用いて、同様の細胞傷害実 験を行なった。図６Aは、CD4以外のキメラを発現するT細胞は、本来のヒーラ細 胞もgp120/41を発現しているヒーラ細胞も認識せず、同様に、CD4キメラを発現 しているT細胞は、他のワクシニアにコードされる表面蛋白質を発現しているヒ ーラ細胞を認識しないことを示している。さらに、CD4以外のキメラを発現するC TLは、gp120/41を発現するヒーラ細胞をほとんど破壊しない（図６Ａ）。 実施例VII MHCクラスIIを有する細胞は、キメラの標的にはならない CD4は、MHCクラスII抗原が発現する多形性のない配列と相互作用すると考えら れている（Gayら、Mature 328:626-629（1987）；Sleckmanら、Nature 328:351- 353（1987））。CD4とMHCクラスII抗原との特異的な相互作用は、精製蛋白質を 用いて証明されてはいないが、一定の条件の下では、CD4を発現する細胞とクラ スII分子を発現する細胞とが接着することを示すことができる（Doyleら、Natur e 330:256-259（1987）；Claytonら、J．Exp．Med．172:1243-1253（1990）；La marreら、Science 245:743-746（1989））。次に、クラスIIをもつ細胞に対する 傷害を検出できるかを調べた。図６Bは、大量にクラスIIを発現しているRajiB細 胞系に対してCD4:ζが特異的な細胞傷害を行わないことを示している。僅かな（ 約5％）細胞傷害は観察されたが、Raji細胞のクラスIIをもたない変異体であるR J2.2.5（Accolla，J．Exp．Med．157:1053-1058（1983））は、Raji細胞を非感 染のT細胞とともにインキュベートしたときに示すのと同程度の感受性を示す。 実施例VIII T細胞抗原/Fcレセプターゼータ鎖による細胞傷害の誘導に必要な配列 CD4とζとのキメラによって、細胞傷害性T型リンパ細胞（CTL）は、HIVのgp12 0を発現する標的細胞を破壊できるようになるが、ヒトT細胞系に導入されるゼー タキメラの性質を明確に比較するために、CD4に代わるものを探した。そのよう な細胞系はCD4を発現することができるが、そのことによりカルシウム移動の型 または程度と、異なるキメラの細胞傷害能力との間の相関関係を特に明確にする のを困難にする。これを回避するために、CD16の細胞外ドメインをζの膜通過配 列と細胞内配列に連結させて、ζとCD16のキメラを作出した（図７A）。融合遺 伝子は、大腸菌のgpt遺伝子を選択マーカーとして有する、ワクシニアウイルス の発現プラスミドに導入し、相同的組み換えによってワクシニアWR株のゲノムに 挿入して、マイコフェノール酸中での増殖によって選択した（Falkner and Moss ，J．Virol．62:1849（1988）；Boyle and Coupar，Gene 65:123（1988））。 T細胞系に、ワクシニア組換え体を感染させ、細胞外ドメインを抗体で架橋し た後、細胞質内の遊離カルシウムイオン相対的濃度を測定した。分光蛍光度計（ 集 団全体）およびフローサイトメトリー（一個ずつの細胞）測定を、インド-1染色 した細胞を用いて行なった（Grynkiewiczら、J．Biol．Chem．260:3440（1985） ；Rabinovitchら、J．Immunol．137:952（1986））。図７Bに、CD16ζ融合蛋白 質を発現するワクシニア組換え体を感染させたジャーカットヒトT細胞白血病系 の細胞から集めたデータの解析結果を示す。キメラの結合は、細胞内のカルシウ ムを再現的に増加させたが、キメラでないCD16を発現している細胞を同様に処理 しても、ほとんど効果は見られなかった。REX33A（Breitmeyerら、J．Immunol． 138:726（1987）；Sanchoら、J．Biol．Chem．264:20760（1989））か、ジャー カット変異体JRT3.T3.5（Weissら、J．Immunol．135:123（1984））何れかの、 抗原レセプターを欠いた変異体細胞系でキメラを発現させると、CD16抗体結合に 対する強い反応が見られた。同様のデータが、REX20A（Breitmeyerら、前記，19 87；Blumbergら、J．Biol．Chem．265:14036（1990））変異細胞系と、本発明者 らの実験室において確立されたCD3/Tiをもたない変異体についても集められた。 CD16:ζを発現する組換え体を感染させても、抗CD3抗体に対する応答は回復しな かった。このことは、この融合蛋白質が細胞内のCD3複合鎖を回復させるように 作用しなかったことを示している。 キメラの細胞性免疫を再指向する能力を評価するために、CD16キメラを発現す るワクシニア組換え体をCTLに感染させて、膜結合性抗CD16抗体を発現している ハイブリドーマ細胞を特異的に破壊するために用いた。このアッセイ法は、元来 は、Fcレセプターを有する細胞のエフェクター機構を解析するために作出された ハイブリドーマ細胞傷害測定法を敷衍したものである（Graziano and Fanger，J ．Immunol．138:945,1987；Granziano and Fanger，J．Immunol．139:35-36，19 87；Shenら、Mol．Immunol．26:959，1989; Fangerら、Immunol．Today 10:92， 1989）。図８Bは、細胞傷害性T型リンパ細胞においてCD16:ζを発現させると、C TLが3G8（抗CD16；Fleitら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:3275，1982）ハイ ブリドーマ細胞を破壊できるようになるが、ホスファチジルイノシトールに結合 したCD16を発現させてもCTLは不活性であることを示している。また、CD16:ζを 有するCTLは、無関係の抗体を発現するハイブリドーマ細胞は破壊しない。 細胞傷害に必要最小限のζ配列を同定するために、ζのカルボキシル末端から 細胞内ドメイン（配列番号:44）を連続的に削って、一連の欠失変異体を調製し た（図８A）。ゼータの細胞内ドメインをほとんど削っても、細胞傷害能力には ほとんど影響しなかった。全長のキメラCD16:ζも、65残基目まで欠失したキメ ラCD16:ζAsp66*もほぼ同じ効果を示した（図８B）。ζの59残基目まで削ったと き（キメラCD16:ζGlu60*）、細胞傷害性が実質的に減少し、さらに50残基目ま で削ると、僅かに活性が落ちた。しかし、細胞内ドメインを3残基の膜貫通アン カーまで削っても、活性は完全にはなくならなかった（図８B）。 ζはジスルフィド結合する二量体であるため、内生ζが欠失キメラζとヘテロ 二量体を形成して活性を回復するということで、細胞傷害活性の保持を説明する こともできる。この説明を確かめるために、ζの11残基目と15残基目のAspとCys をGlyに変え（Cys11Gly/Asp15Gly）、免疫沈降を以下のようにして行なった。お よそ2×10⁶個のCVI細胞に、組換え体ワクシニアを、無血清DHE培地中で1時間、 感染多重度（moi）10以上で感染させた。感染後、6時間から8時間に、PBS/1 mM ED TAで細胞をプレートから剥離し、クラークおよびアインフィールドの方法（ 白血球タイピングII，pp 155-167，Springer-Verlag社，NY，1986）によって、 ラクトペルオキシダーゼとH₂O₂を用いて、2×10⁶細胞当たり0.2mCi¹²⁵Iで表面標 識した。標識された細胞を遠心によって集め、１％ NP-40、0.1％ SDS、0.15 M NaCl、0.05 M Tris PH 8.0、5 mM MgCl₂、5 mM KCl、0.2M ヨードアセトアミド 、1mM PMSFに溶解した。遠心分離で核を取り除き、CD16蛋白質を抗体3G8（Fleit ら、前記，1982; Medarex社）、抗マウスIgGアガロース（Cappel社，Durham，NC ）で免疫沈降させた。試料を、非還元条件下、8％ポリアクリルアミドゲル/SDS ゲル、または還元的条件下、10％ゲルで電気泳動した。これらの免疫沈殿の結果 、CD16:ζCys11Gly/Asp15Glyキメラは、ジスルフィド結合の二量体構造をとらな いことが確認された。 変異体レセプターの細胞傷害活性も調べた。65残基目まで削った変異キメラ（ CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*）は、実験の条件にもよるが、変異を起こし ていないキメラ（CD16:ζAsp66*）に較べて、細胞傷害実験で2倍から8倍活性が 低かった。ただし、CD16:ζAsp66*は、通常CD16:ζの因子の一つ、または活性で 区別することができないキメラである（図９B）。変異体キメラの活性の低下は 、同様 の構造をとるCD4キメラ（前記参照）で見られる低下と同程度であったが、これ は、ζ単量体が、二量体に較べて効率が低いことに原因する可能性が最も高い。 これに対して、59残基目まで欠失したAsp^-Cys^-変異キメラは、細胞傷害活性を示 さなかった（図９B）が、このことは膜通過部のCysおよび／またはAsp残基によ って媒介される他のペプチド鎖との結合が65残基目よりもアミノ末端側の欠失が 細胞傷害活性の持続性を弱めることに関係があるという仮説の根拠になる。 フローサイトメトリー実験によって、膜貫通部分のAsp残基およびCys残基を欠 く欠失変異体でも、TCR^-変異ジャーカット細胞系において、抗体結合に応答する 細胞内の遊離カルシウムイオンの増加を促進できることが分かった（図９D）。 同様の結果が、親株のジャーカット細胞系で発現されたキメラについても得られ た。CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*の場合の、これらに関するデータから、 カルシウム応答性を媒介する能力と細胞傷害を補強する能力とは、突然変異によ って分離できることが示された。 ζの膜貫通部分の残基が関与する可能性を明確に排除するために、ζの膜通過 部と細胞質側の最初の17残基を、CD5またはCD7抗原の膜内部分と細胞質側のそれ ぞれ最初の14または17残基をコードする配列に置き換えた（図９A）。その結果 できた３つの部分からなる融合蛋白質CD16:5:ζ（48-65）およびCD16:7:ζ（48- 65）は、膜貫通ドメインにシステイン残基がないため、より単純なCD16:ζキメ ラのようにジスルフィド結合して二量体を形成しない。３つの部分からなるキメ ラはどちらも、ジャーカットのTCRをもたない細胞系でカルシウムを動員するこ とができ（図９D）、CTLで細胞傷害応答を開始できる（図９Cと本明細書に示し ていないデータ）。CD16:7:ζ（48-59）キメラのζの部分を59残基目まで削ると 、３つの部分からなる融合蛋白質は、TCRをもつジャーカット細胞においても、T CRをもたないジャーカット細胞においてもカルシウム応答をさせられなくなり、 成熟CTLにおける細胞傷害も指示できなくなる（図９Cおよび９Dと本明細書に示 していないデータ）。 18残基モチーフ内の各残基の寄与を調べるため、部位特異的突然変異誘発によ って、いくつかの変異体を調製して、キメラレセプターを少量発現する条件下（ 図10Aと10D）、または多量に発現する条件下（図10Bおよび10E）で、レセプター 特異的細胞傷害を媒介する能力を評価した。図10A〜Fは、59残基から63残基の間 でいくつか比較的に保存された置換（すなわち、酸性残基を同族のアミドで置き 換えたり、またはチロシンをフェニルアラニンで置き換える）を行うと、細胞傷 害効率は少し落ちたが、一般的にカルシウムを動員する能力は維持されたことを 示している。しかし、まとめてみれば、これらの残基は、欠失すれば細胞傷害活 性が失われる程度には重要な副モチーフを含む。Tyr62をPheまたはSerに変える と、細胞傷害応答もカルシウム応答もなくなった。18残基分節のアミノ末端で、 Tyr51をPheに変えると、カルシウム移動も細胞傷害活性もなくなった。一方、50 番目のLeuをSerに変えると、カルシウム応答はなくなったが、細胞傷害活性は僅 かばかり残った。特定の仮説にこだわらなければ、Leu50Ser変異体が短時間のフ ローサイトメトリー分析でカルシウムを移動できなかったことは、より長い時間 がかかる細胞傷害実験の期間中、細胞内の遊離カルシウムイオンの実質的増加を 媒介する能力を必ずしも表すものではないと考えられる。しかし、カルシウム非 感受性の細胞傷害活性がいくつかの細胞傷害性T細胞系について報告されており 、同様の現象が、ここで述べた結果の基にある可能性を排除できなかった。Asn4 8をSerで置き換えると、実験によっては細胞傷害性が部分的に低くなったが、ほ とんど影響ないものもあった。 重複した配列要素が果たしうる役割を調べるために、ζの細胞内ドメインを、 残基33から65、残基71から104、および残基104から138の範囲の３つの部分に分 けた。これらの部分をそれぞれ、CD7の細胞内ドメインの塩基性膜アンカー配列 の末端にMluI部位を導入して、CD16:CD7キメラに接続した（下記参照；図11A） 。この３つの要素の細胞傷害効力を比較すると、実質的には同等であった（図11 B）。配列を比較すると（図11A）、２番目のモチーフでは２つのチロシンの間が 11残基であるのに、１番目と３番目のモチーフでは10残基であった。 T細胞活性化プロセスの正確な説明はなされていないが、抗原レセプターの凝 集、またはζの細胞内配列を有するレセプターキメラの凝集により、カルシウム の移動、サイトカインと顆粒の放出、および活性化を示す細胞表面マーカーの出 現が開始することは明らかである。ζの活性部位は、短い一本のペプチド鎖で、 固有の酵素活性を持つにはおそらく短すぎるので、細胞の活性化を媒介する一個 か 多くとも数個の蛋白質と相互作用すると考えられる。また、突然変異によって細 胞傷害を媒介する能力とカルシウム蓄積を媒介する能力とを分離することができ ることから、遊離カルシウムの動員だけでは細胞の活性化に不十分であることも 明らかである。 本明細書に示されているように、ζの細胞内ドメインの18残基を、２つの別の 蛋白質の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに付加すると、その結果できたキ メラは、融合蛋白質の細胞外部位に結合する標的細胞に対する細胞傷害活性を再 指向することができる。18残基モチーフをもつキメラは、全長ζを有するキメラ に較べて約8倍活性が落ちるが、この活性低下は、正常ならば野生型ζにジスル フィド結合二量体を形成させる膜貫通部分の相互作用を失ったことに帰因しうる 。すなわち、モチーフと同じカルボキシル末端を有し、膜貫通部分のCys残基お よびAsp残基を欠くζ欠失構造体は、典型的には、18残基モチーフのみを有する キメラに較べて僅かに低い活性を示す。 本発明者らが注目した、細胞傷害反応能がある要素は、2個のチロシンを有す るが、セリンもスレオニンももたず、リン酸化によって活性に寄与する可能性が 制限されている。どちらのチロシンに変異を加えても、活性は損なわれる。ただ し、予備実験では、18残基モチーフをもつキメラ表面抗原との結合の後、実際に チロシンのリン酸化が起きることは示されていないが、このようなリン酸化によ る関与が、低い水準でありうることは排除できない。2つのチロシン残基につい て言及された効果以外にも、モチーフのアミノ末端およびカルボキシル末端のい くつかのアミノ酸を置き換えると、レセプター密度が低い条件下では活性が弱ま る。 ζの活性モチーフと同じ配列が、CD3δおよびγ分子、表面IgM結合蛋白質のmb 1およびB29、ならびに高親和性IgEレセプターのβ鎖およびγ鎖、FcεRIなど、 いくつかの膜貫通蛋白質の細胞質ドメインに見出されている（Reth，Nature 338 :383，1989）。これらの配列の機能は明らかではないが、十分に発現されれば、 それぞれは自律的にT細胞を活性化できるので、この活性によって、ゼータをも たない変異細胞系に見られる残留TCR応答性を説明しうる（Sussmanら、Cell 52: 85，1988）。 ζ自体はこのような配列をほぼ等間隔で３つ有し、細胞内ドメインをおおまか に３等分した切片はそれぞれ、細胞傷害応答を開始することができる。選択的ス プライシングによるζのアイソフォームであるη（Jinら、前記，1990; Clayton ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:5202，1991）は、３番目のモチーフのカル ボキシル側の半分をもたない。１番目のモチーフのカルボキシル側半分を除くと 活性が失われるので、ηの生物学的効果のほとんどは、最初の２つのモチーフに よると思われる。異なった測定をすれば、抗原媒介性のサイトカイン放出を促進 する点（Bauerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3842，1991）や、細胞傷害 の対象変更（上記参照）を促進する点では、ζと同等の活性があるが、レセプタ ー刺激に応答してリン酸化されることはない（Bauerら、前記，1991）。したが って、３つのモチーフすべての存在がリン酸化のために必要であるか、または３ 番目のモチーフがまだ同定されていないチロシンキナーゼのための好ましい基質 になっている。 実施例IX ヒトFcレセプターによる細胞傷害シグナル伝達 異なるヒトFcレセプターサブタイプの作用を評価するために、ヒトCD4、CD5ま たはCD16抗原に、FcRIIγA、B1、B2およびCサブタイプ（RavetchおよびKinetの 命名法，Ann．Rev．Immunol．9:457，1991）の膜貫通および細胞内ドメインを連 結させたキメラ分子を作出した。特に、既に述べたFcRIIA、B1およびB2アイソフ ォームの膜貫通および細胞内ドメインに相当するcDNA配列を、既にあるクローン PC23、またはヒトの扁桃cDNAライブラリー（標準的な技術によって作製したもの ）から、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT（配列番号:18；FcRIIA順方向）；CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT（配列番号:19；FcRIIA 逆方向）； GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G（配列番号:20；FcRI I B1およびFcRII B2 順方向）；およびGCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC T GG TC（配列番号:21；FcRII B1およびFcRII B2 逆方向）。これらのプライマー は、それぞれ5'末端から６塩基が一方の鎖だけ欠けたBamHIとNatI酵素による切 断部位を含んでいる。NotI部位のすぐ後は、アンチセンスがCTAまたはTTAという 停止コドンになっている。すべてのプライマーは、目的の断片の5'および3'端に 相 補的な18個以上の塩基を含んでいる。FcRIIγAアイソフォームと１アミノ酸残基 しか違わない（268残基目のPがLに変わっている）FcRIIγの細胞内ドメインに相 当するcDNA断片は、以下のプライマーを用いたオーバーラップPCRによる部位特 異的突然変異誘発によって作製した。TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA AC A A（配列番号:22）およびTTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A（配列 番号:23）。PCR断片を、それぞれCD16またはCD4の細胞外ドメインを含むワクシ ニアウイルス発現ベクターに挿入し、続いて、目的の組換え体の同定を効果的に 行うため大腸菌のgptを一緒に取り込ませる選択法を用いて、チミジンキナーゼ 遺伝子座での組み換えによって野生型ワクシニアに挿入した。すべてのアイソフ ォーム（図12に示す）の内容を、ジデオキシ配列決定法によって確認した。 キメラレセプター蛋白質の産生は、さらに、免疫沈降実験によって確認した。 約10⁷個のJRT3.T3.5細胞に、組換え体ワクシニアを、無血清IMDM培地中で1時間 、感染多重度10以上で感染させた。感染12時間後に、細胞を回収して、ラクトペ ルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ法を用いて、10⁷細胞あたり0.5 mCi^{12 5} Iで表面標識した（クラーク（Clark）およびアインフェルド（Einfeld）、前記 ）。標識された細胞を遠心によって集め、1％ NP-40、0.1 mM MgCl₂、5 mM KCl 、0.2 M ヨードアセトアミド、1mM PMSFに溶解した。遠心分離で核を取り除き、 CD16融合蛋白質を抗体4G8と抗マウスIgGアガロースで免疫沈殿させた。試料を、 非還元条件下で電気泳動した。免疫沈降したキメラレセプター分子の分子量は、 全て予想通りのものであった。 キメラレセプターが細胞質の遊離カルシウムイオンの増加を媒介できるかを調 べるために、組換えウイルスを用いて、TCR^-変異体ジャーカット細胞系JRT3.T3. 5に感染させ（本明細書で既に説明した）、レセプターの細胞外ドメインにモノ クローナル抗体3G8またはLeu-3Aを結合させて（本明細書で既に説明した）から 、細胞の細胞質遊離カルシウムを測定した（本明細書で既に説明した）。これら の実験から、FcRγIIAおよびCの細胞内ドメインは、細胞外ドメインで架橋が起 きた後細胞質の遊離カルシウムイオンの増加を媒介できるが、FcRγIIB1およびB 2は、同じ条件では不活性であることが明らかになった（図13Aおよび13B）。FcR γIIAのCD4、CD5およびCD16とのハイブリッドは、カルシウム応答を促進する点 で実質的 に同等の能力をもっていた（図13A〜B）。単球およびリンパ球系統のその他の細 胞系も、細胞外ドメインの架橋によって開始されるシグナルに応答することがで きた。 細胞傷害における、異なるFcRγIIの細胞内ドメインの関与を調べるために、C D16:FcRγIIA、B1、B2およびCキメラを発現する組換え体ワクシニアを、ヒト細 胞傷害性Tリンパ球（CTL）に感染させた。そして、感染細胞を、CD16に対する細 胞表面抗体を発現しているハイブリドーマ細胞（すなわち、3G810-2細胞）に⁵¹C rを含ませた細胞とともに培養した。この実験において、CD16キメラの細胞外ド メインにリンパ球のエフェクター作用を活性化できる細胞内分節が結合してると き、CD16キメラをもつCTLはハイブリドーマ標的細胞を破壊した（遊離⁵¹Crを放 出した）。この細胞傷害実験については、後に詳述する。図14Aは、CD16:FcRγI IAおよびCをもつCTLは、細胞表面に抗CD16抗体を発現している標的細胞を傷害で きるが、CD16:FcRγIIB1またはB2はできないことを示している。 特異的な細胞傷害がCD16の一部との相互作用による何らかの方法で起こるかも しれないという可能性を排除するために、CD4の細胞外ドメインにFcRIIの細胞内 ドメインを結合させて、細胞傷害実験を行なった。この場合、標的細胞は、HIV エンベロープgp120/41蛋白質を発現しているヒーラ細胞（特に、ワクシニアベク ターvPE16（国立アレルギーおよび感染症研究所AIDS保管所、メリーランド州ベ セスダより入手可能）を感染させたヒーラ細胞）であった。CD16システムと同じ ように、HIVエンベロープを発現している標的細胞は、CD4:FcRγIIAキメラを発 現するT細胞による細胞傷害に対して感受性であったが、CD4:FcRγIIB1またはB2 には感受性ではなかった（図14B）。 FcRγIIAおよびCの細胞内ドメインは、拡大されたFcRγ/TCRζ科に属するもの を含む何れの蛋白質とも一定の配列相同性をもたない。細胞傷害誘導に関与する 配列要素を明らかにするために、細胞内ドメインをコードする配列（後述、また 図15Aに示す）の5'側と3'側の欠失体を調製して、カルシウム動員と細胞傷害測 定（本明細書で説明されている）における効果を評価した。細胞内ドメインのア ミノ末端側を除いた実験において、FcRγIIの膜貫通ドメインを、無関係のCD7抗 原の膜貫通ドメインに置き換えて、膜貫通ドメインによって相互作用が媒介され る 可能性を排除した。 図15Bおよび15Cは、チロシン298を含む、カルボキシル末端側14残基を除去す ると、細胞傷害能が全く失われ、カルシウム移動能力もかなり低減することを示 している。さらに、チロシン282の直前まで欠失させても同一の表現型を生じた （図15Bおよび15C）。細胞内ドメインのN末端側から268残基目までを欠失させて も、カルシウムプロフィールにも細胞傷害能力にも影響を与えなかったが、275 残基目まで欠失させると、遊離カルシウムの放出が著しく減少したが、細胞傷害 にはほとんど影響しなかった（図15Dおよび15E）。さらに、282残基まで欠失さ せると、FcRγIIテールは、カルシウムを動員することも、細胞傷害の引き金を 引くこともできなくなった（図15Dおよび15E）。これらの大まかな測定によって 定義された「活性要素」は、比較的大きな（36アミノ酸）もので、16残基離れた 2つのチロシンを含んでいる。 実施例X 感染を補助しないキメラCD4レセプターを有するリンパ球による、指向化された 細胞傷害 前述のように、MHC非依存的にCTLの細胞傷害活性の特異性を変えるエフェクタ ー分子を作製した。例えば、ヒトCTLクローンWH3のζ鎖を融合したCD4の細胞外 ドメインを含むキメラは、HIV-1の表面エンベロープ糖蛋白質gp120を発現してい る標的細胞を特異的に破壊する。しかし、CD4分子の細胞外ドメインがHIV感染に 対する感受性を与えるため、これをもつCTLがウイルスの標的となり得るために 、結局これらの細胞の傷害能力が減ぜられることになる（Dalgleishら、Nature 312:767（1984）；Klatzmannら、Nature 312:767（1984））。このような結果を 避けるために、特異的にHIV感染細胞を標的にして細胞性傷害効果をもつが、HIV による感染に対しては感受性をもたないCD4を基本にして、キメラエフェクター 分子を設計した。 CD4の細胞外ドメイン(図23)の遺伝子を、この場合、ヒトの膜結合IgG1の膜通 過部分をコードする第一エクソンの位置に結合した、ヒトIgG1の重鎖のヒンジ、 第二および第三定常ドメインの遺伝子と並べ(Zettlmeisslら、DNA Cell Biol．9 :347(1990))(図25)、その後ろに、全Ig様ドメインと、膜通過ドメインに続く移 行 停止配列の間にある配列(Aruffo and Seed，EMBO J．6:3313(1987))(図26)を含 む、ヒトCD7抗原の一部を結合させて、3つの部分を融合した蛋白質を作出した。 CD7分節の細胞外部分のアミノ酸の一次配列には、細胞表面からIg様ドメインを 突出させる軸状構造の存在を示す、プロリンを多く含む領域がある（Aruffo and Seed，EMBO J．6:3313（1987））（図26）。これと、本明細書に記載のこれに 関連したキメラを発現させるために、組換えワクシニアウイルスを調製した。特 に、組換えワクシニアウイルスは、CV-1細胞の中で相同的組み換えによって作成 した。CV-1細胞で高濃度のストックを調製する前に、各ストック毎に、OKT4また はLeu3aによってプラークを可視化してからプラーク精製することを、少なくと も２回繰り返した。 3つの部分をもつキメラ（CD4（D1-D4）:Ig:CD7）（図20、分子「A」）は、効 率的に細胞表面での発現を示たため、ワクシニアによるシンシチウム形成実験で HIVレセプターとして作用することができるかを調べた（Lifsonら、Nature 323: 725（1986）；Ashornら、J．Virol．64:2149（1990））。HIV-1のエンベロープ 糖蛋白質をコードする組換えワクシニアウイルス（vPE16）を感染させたヒーラ 細胞（Earlら、J．Virol．64:2448（1990））を、CD4、CD4:ζまたはCD4（D1-D4 ）：Ig:CD7を感染させたヒーラ細胞とともに培養した。6 cmシャーレに入れられ たヒーラ細胞（ATCC、メリーランド州ロックビル）が50％の集密状態のときに、 無血清培地中、感染多重度（MOI）約10で1時間感染させた。この細胞をさらに5 〜6時間、完全培地中でインキュベートしてから、1 mM EDTAを含むリン酸緩衝食 塩水（PBS）で剥離した。エンベロープとCD4キメラを発現する細胞を1:1の割合 で混ぜて、再び完全培地とともに6 cmシャーレに撒いた。共培養後6〜8時間経過 したところでシンシチウムの数を数えて写真を撮った。 CD4とvPE16を共培養すると、容易に多核巨細胞が形成された。また、CD4の細 胞外ドメインをTCRのζ鎖に融合したキメラ（図27）（CD4:ζ）は、シンシチウ ム形成を媒介できたが、CD4（D1-D4）:Ig:CD7を発現する細胞は、細胞融合の徴 候を示さなかった。本発明者らはまた、別の研究で、HIVによる感染には、CD4の アミノ末端側の二つのドメインが必要だということが示されていた（Landauら、 Nature 334:159（1988））ので、CD4の1番目と2番目のドメインだけ（図24）を 発現す る構築体、CD4（D1,D2）:Ig:CD7（図20、分子「B」）を試験した。この分子も、 HIV誘導によるシンシチウム形成に非感受性であることが分かった。¹²⁵I-標識し た可溶性gp120を用いた結合実験で、CD4（D1-D4）:Ig:CD7もCD4（D1,D2）:Ig:CD 7もgp120に強い親和性をもつことが確認された。 次に、本発明者らは、シンシチウム形成をしなかったキメラ分子に、本明細書 に記載したような誘因分子を与えれば、細胞傷害を行わせることができるように なるか否かを判定した。ζの細胞内ドメイン（図27）をCD4（D1-D4）:Ig:CD7お よびCD4（D1,D2）:Ig:CD7の3'側に融合して、これに相応する組換えワクシニア ウイルスを調製した。これらの構築物、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζおよびCD4（D1, D2）:Ig:CD7:ζ（図20、分子「C」および「D」）を、ヒトCTLクローンWH3の中で 発現させ、（本明細書に記載の方法を用いて）HIVの表面エンベロープ糖蛋白質 を発現しているヒーラ細胞を標的にして破壊できるかを調べた。図21は、CD4（D 1-D4）:Ig:CD7またはCD4（D1,D2）:Ig:CD7に融合したζの細胞内ドメインが、細 胞傷害能をもつが、ζ鎖を持たない構築物にはこの活性を媒介できないことを示 している。正の対照であるCD4:ζは、僅かに効率的に細胞傷害を媒介し、CD4（D 1,D2）:Ig:CD7:ζは、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζよりも細胞傷害能力が少し低かっ た（図21）。しかしながら、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζキメラおよびCD4（D1,D2） :Ig:CD7:ζキメラの両方が、HIVのエンベロープ蛋白質を表面に発現している細 胞に対する特異的な傷害を媒介する能力があることは明らかである。この４つの 部分からなるキメラは、どちらもワクシニアによるアッセイ法では、シンシチウ ム形成を媒介できなかった。本発明者らはまた、図11Aで示したように、ζモチ ーフが一個あれば、CD4（D1-D4）キメラに細胞傷害活性を与えるのに十分である ことを明らかにした。 放射性免疫沈降実験によって、融合分子が、完全ではないにしても主に二量体 を形成していることが確かめられた。これらの実験においては、CD4（D1-D4）:I g:CD7:ζおよびCD4（D1,D2）:Ig:CD7:ζキメラを発現している組換えワクシニア を感染させ、代謝を通じて標識したヒーラ細胞の可溶性抽出物を免疫沈殿させる ためにプロテインAアガロースビーズを用いた。免疫沈殿した物質は、還元的条 件下および非還元的条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動して分画した。特 に 、約5×10⁶個のヒーラS3細胞に、vPE16について既に説明したように、適当なワ クシニアウイルスストックを感染させた。細胞は、200μCi/mlのTran³⁵S-ラベル （ICNラジオケミカルズ社、カリフォルニア州アーバイン）で、システインおよ びメチオニン欠乏培地中、6〜8時間代謝標識して、1 mM EDTA含有PBSで剥離した 。続いて、細胞を沈殿させて、150 mM NaCl，50 mM Tris pH 7.5，5 mM EDTA，0 .5％ NP-40，0.1％ SDS，1 mM PMSFで溶解した。遠心分離によって核を除去した 後、各細胞抽出物の5分の1を、4℃で2時間、洗浄したプロテインA結合アガロー スビーズに吸着させた。その後、1％ NP-40を含むPBSで洗浄し、メルカプトエタ ノールを含む、または含まないSDS含有試料用緩衝液に溶出させた。これらの実 験の結果、CD4（D1-D4）:Ig:CD7:ζおよびCD4（D1,D2）:Ig:CD7:ζキメラの免疫 沈殿物のほとんどは、非還元条件下で予想通りの二量体の分子量として移動する ことが明らかになった。 CD4融合分子を発現している細胞がHIV感染を助長することができるかを直接に 評価するために、本発明者らは、CD4（D1-D4）:Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:C D7を発現する形質転換体について、長期間の感染実験を行なった。CD4（D1-D4） :Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:CD7の安定した形質転換体ならびにCD4を、形質 転換が容易な、ヒト胚の腎臓に由来する293細胞の同系系統で調製した。キメラ 分子を、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターによって制御さ れるハイグロマイシンB造伝子をもつ二方向性ベクターにサブクローニングした 。10cmシャーレで60〜70％コンフルエントになった細胞を、このプラスミドDNA1 0μgで、カルシウムリン酸共沈殿法によって形質転換した。形質転換の前に、プ ラスミドを一つしかないSfiI部位で切断して直鎖状にし、T4DNAポリメラーゼで 両末端を平滑化した。形質転換後24時間目に細胞を４倍に希釈し、48時間後にハ イグロマイシンB（Sigma社、ミズーリ州セントルイス）400μg/mlによる選抜を 行なった。３日から４日毎に、細胞にハイグロマイシンを含む新しい培地を補給 した。 抵抗性コロニーを拾って展開し、その発現を、フルオロセイン結合抗ヒトIgGF c（Organon Teknika社、ペンシルバニア州ウエストチェスター）、またはヒトCD 4に反応する抗体のQ4120（Sigma）を用いた間接免疫蛍光法によって評価し、そ の後フローサイトメトリー（Coulter社、フロリダ州ハイアレア）を行なった。 解 析のために、他の細胞系によって示される細胞表面CD4の発現レベルに匹敵する レベルを示す構築物から、それぞれ独立したクローンを2個選抜した。図22は、H IVに曝された後、早くも感染後3日目にはCD4の安定した形質転換体の培地でp24 が検出されたことを示している。感染後5日目には、これらの培地中に、多核巨 細胞と独特の風船状の細胞が存在するのが明らかになった。形質転換していない 親細胞系、またはCD4（D1-D4）:Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:CD7の形質転換体 から別々にとった2つの細胞分離株からは、32日後の培地中に、有意なレベルのp 24も、多核巨細胞の存在も検出されなかった（図22）。 感染実験を完了するにあたって、細胞表面のCD4発現について細胞の解析を行 なった。CD4を発現している感染細胞においては、CD4表面エピトープの密度が有 意に減少したが、これはウイルスによる抑制調節と符合する。しかし、CD4（D1- D4）:Ig:CD7およびCD4（D1,D2）:Ig:CD7を発現している培養細胞では、この密度 に変化はなかった。これらの実験によって、T細胞レセプターのζ鎖と融合する と、HIV感染細胞を標的にしてこれを傷害できるが、CD4によって媒介されるHIV 感染を補助しない、CD4の先端の2つのドメインを有するキメラ分子を作出できる こと確かめられた。 補足実験によって、CD4分子の細胞外ドメインおよび脂質二重膜の間の物理的 距離がHIV感染に対する抵抗性を付与するのだということが示唆された。最初の 実験で、本発明者らは、CD7の軸部および膜貫通ドメインに欠失があるキメラ分 子を構築したが、この欠失によって、CD7の膜貫通部位にあるプロリンに富む領 域が除去された。このドメインをCD4の細胞外ドメインと融合させたところ、CD4 分子の細胞表面発現で測定すると、CD4の細胞外ドメインを効果的に係留する能 力が保持されていた（本明細書で説明されている）。しかし、HIVエンベロープ の糖蛋白質に誘導されるシンシチウム形成を阻止する能力は失われた。したがっ て、α-ヘリックス構造をとると考えられる、CD7のプロリンに富む領域を欠失さ せると、CD4の細胞外ドメインと脂質二重膜との間の距離が有効に縮まって、キ メラはシンシチウム形成を阻止できなくなる。 ２番目の実験では、CD4の細胞外ドメインに対して膜貫通アンカーとして作用 するが、HIVに誘導されるシンシチウム形成を阻止できないことが以前から報告 され ているCD4/CD5キメラに、HIVに誘導されるシンシチウム形成を阻止する能力を付 与できるかもしれないことを本発明者らは明らかにした。この実験では、ヒトIg G1重鎖のヒンジ、CH2およびCH3ドメインをCD4/CD5分子に挿入した。この結果で きたキメラは、シンシチウム形成を阻止したため、免疫グロブリンのドメインに よって付与された距離が、HIVに誘導されるシンシチウム形成を阻止するのに十 分であることがさらに示された。 ３番目の実験において、さまざまな長さの合成アルファヘリックスを用いて、 CD4ドメインの細胞膜からの距離をさまざまに延長させた。特に、二つのアラニ ン残基に隣接する、リジン残基およびグルタミン酸残基の反復アルファヘリック スモチーフを表す合成オリゴヌクレオチドを設計した（塩基配列とアミノ酸配列 の一次構造については図28参照）。以前の実験で、このようなアミノ酸配列が、 高い頻度でアルファヘリックス中に存在することが分かっており、このことは、 このような反復モチーフによってアルファヘリックス構造が形成され、このよう なアルファヘリックスをCD4の膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間に置くと 、細胞膜からCD4を突き出させることができることを示している。アルファヘリ ックス部分の長さを変えて、HIVの侵入を阻止するのに必要な突出距離を、アル ファヘリックスの高さおよび回転に関する既知の値に基づいて計算して決定した 。これらの結果を表１に示す。 上記の表において、「CD4」は、特別に注記しない限り、CD4（D1-D4）を表し 、「H」、「CH2」、および「CH3」は、それぞれ、ヒトIgG1重鎖のヒンジ、CH2お よびCH3領域を表す。「CD7tmおよびstk」は、CD7の膜貫通領域および軸部（stal k）領域を表す。「CD7tm（長いキメラ）」および「CD7tm（短いキメラ）」は、 それぞれCD7の膜貫通領域、およびプロリンに富むドメイン（前述）を欠失したC D7の 膜貫通領域を表す。［CD5tm」は、CD5の膜貫通領域を表す。「CD34tm」は、CD34 の膜貫通領域を表す。項J〜Lでは、アルファヘリックス領域の長さをオングスト ロームで示してあるが、これらの値は、3.6残基毎にアルファヘリックスが一回 転し、それに相当する距離が5.4 A（すなわち１残基当たり1.5 A）であるという 事実に基づいている。したがって、16残基のアルファヘリックスは、CD4の細胞 外ドメインを約24オングストローム突出させる。48オングストロームおよび72オ ングストロームのアルファヘリックスは、BstY1断片を連続して鎖状につなぎ、 断片にしかないBamHI部位（図28参照）に挿入して構築した後、正しい方向をも つクローンを選抜した。 ワクシニアウイルスvPE-16構築体（前記参照）からのHIV-1エンベロープ糖蛋 白質を発現するヒーラ細胞との共培養実験で、シンシチウム形成を計数した。 Thy-1発現は、以下のようにして測定した。HIV-1のhxb.2クローンを基にして 活性のあるレトロウイルスベクターを作製した。このベクターにおいて、必須で ないnef遺伝子を、ホスファチジルイノシトール結合によって膜に係留される細 胞表面分子を効率よく発現するラットthy-1のコーディング配列に置換した。こ の分子クローンに由来する、hxb/thy-1と名付けられたウイルスには感染性があ るが、このことは、細胞病理学的効果、および感染させたC8166細胞（ヒトCD4⁺ 白血病T細胞系）の培養上清にp24が産生されていることから明らかである。さら に、hxb/thy-1へ曝されると、CD4で一過的に形質転換されたヒーラ細胞は、nef と同様に制御を受けるメッセージについて予想されたように、早くも感染から18 時間でthy-1発現の徴候を示した。nef遺伝子によってコードされるメッセージは 、通常、さまざまにスプライシングされ、rev応答因子を持たないウイルス制御 蛋白質として分類される。これらのメッセージは、初期ウイルス遺伝子産物とし て、細胞質に定常的に蓄積しうる。thy-1のメッセージも同じように制御される 、すなわちウイルスの生活環の初期に現れると予測された。簡単に述べると、こ の系によって、ウイルスの侵入に代わるものとしてthy-1発現を利用し、HIV侵入 実験の効率を上げた。標準的なDEAE−デキストラン法を用いて、さまざまなCD4 から作成したキメラで、ヒーラ細胞を一過的に形質転換した。形質転換細胞を、 形質転換から48時間後にhxb/thy-1ウイルスに曝し、感染から24〜48時間後にthy -1の発現を測定し た。表１に示した結果においては、thy-1の発現は、市販のThy-1モノクローナル 抗体（Accurate社）を用いて、感染から24時間後に測定した。 表１に示されたデータから、HIV-1の感染を阻止するためには、CD4の細胞外ド メインは細胞膜から少なくとも48オングストローム、好ましくは少なくとも72オ ングストローム突き出しているのが最適であると、本発明者らは結論づけた。 本明細書に開示された一般的な方法と同様の方法を用いて、抗HIVエンベロー プ抗体に基づき、HIV感染細胞を標的とするキメラを作製することもできる。こ のような抗体の例は、ゴーニーら（Gornyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1 624（1989））およびマラスコら（Marascoら、J．Clin．Invest．90:1467（1992 ））によって開示されている。 実施例XI 突出したCD4分子のHIVデコイとしての利用 本明細書で証明されたように、細胞表面から突出したCD4ドメインを有する細 胞はHIV感染に対して抵抗性である。従って、このようなCD4を有する細胞は、循 環系中のHIVに結合し、HIVに感染した個体におけるウイルスカ価を減少させるデ コイとして有用である。好ましくは、CD4ドメインは、リンパ節を本来通過する 細胞に存在する。有用な宿主細胞には、リンパ小節に本来存在するその他の細胞 と同様に、免疫細胞のクリアランスにおいて機能するいかなる細胞も含まれる。 特殊な例としては、マクロファージ、T細胞（例えばヘルパーＴ細胞）、B細胞、 好中球、樹状細胞、および濾胞樹状細胞が含まれるが、これらに限定されない。 本明細書に開示されているD1−D4ドメインおよびD1、D2ドメインを含むHIVに 結合できるあらゆるCD4ドメインが本発明の方法に利用できる。少なくともいく つかの態様に関して（例えば前述したもの）、キメラの細胞内ドメイン部位およ び／または膜貫通ドメイン部位はいかなる蛋白質またはアミノ酸配列からも選択 されうる。 実施例XII さらなるT細胞レセプターおよびB細胞レセプター刺激タンパク質 本発明によるその他の細胞内シグナル伝達ドメインおよび膜貫通シグナル伝達 ドメインは、T細胞レセプタータンパク質であるCD3デルタおよびT3ガンマ、なら びにB細胞レセプタータンパク質であるmb1およびB29に由来してもよい。これら のタンパク質のアミノ酸配列を図16（CD3デルタ；配列番号:24）、図17（T3ガン マ；配列番号:25）、図18（mb1；配列番号:26）、および図19（B29；配列番号:2 7）に示す。細胞溶解シグナル伝達に十分な部分配列（そして、それゆえにおそ らく本発明のキメラレセプターに含まれる）を枠内に示す。これらのタンパク質 ドメインを含むキメラレセプターは、一般的に前述のように構築され、本発明の 治療法において使用される。 実施例XIII 実験方法 ワクシニア感染および放射免疫沈降法 約5x10⁶のCV1細胞を無血清DME培地中で1時間、少なくとも10（CV1細胞上で測 定された力価）の感染多重度（moi）で、組換えワクシニアに感染させた。細胞 は感染後、新鮮な培地に移し換え、メチオニンおよびシステインを含まないDMEM （Gibco;Grand Island,NY）中で6時間、200μCi/mlの³⁵S−メチオニンおよびシ ステイン（Tran³⁵S標識,ICN;Costo Mesa,CA）で代謝標識した。標識した細胞は 、1mM EDTAを含むPBSで分離し、遠心により集め、1％ NP-40，0.1％ SDS，0.15M NaCl，0.05M Tris（pH8.0），5mM EDTA，および1mM PMSFで溶解した。核を遠心 により除去し、CD4タンパク質は、OKT4抗体および抗マウスIgGアガロース（Capp el，Durham，NC）で免疫沈降した。試料は、非還元（NR）条件および還元（R） 条件下で、8％ポリアクリルアミド/SDSゲルを通じて電気泳動した。³⁵S標識試料 を含むゲルは、オートラジオグラフィー前に、「En³Hance（New England Nuclea r，Boston, MA）」で飽和した。膜貫通型CD16であるCD16_TMの促進された発現は 、CD16_TMでのみ感染したCV1細胞における発現とCD16_TMおよびζキメラ又はCD16_{T M} およびγキメラをコードするウイルスで共感染した細胞における発現とを比較 することにより測定した。感染および6時間以上のインキュベーションの後、細 胞は、PBS、1mM EDTAでプレートから剥離し、CD16_TM又はキメラの発現は、間接 蛍光抗体およびフローサイトメトリーにより測定した。 カルシウム移動解析 「Jurkat subline E6（Weissら、J ．Immunol．133:123-128（1984））」細胞 は 、無血清IMDM培地中で1時間、10のmoiで、組換えワクシニアに感染させ、10％ F BS含有IMDM中で3から9時間インキュベートした。細胞を遠心により集め、1mM イ ンド-1 アセトメトキシエステル（Grynkiewiczら、J.Biol.Chem.260:3340-3450 （1985））（Molecular probes）を含む完全培地中で3x10⁶細胞/mlで再懸濁し、 37℃で45分間インキュベートした。インド-1を加えた細胞を沈殿させ、無血清IM DM中に1ｘ10⁶で再懸濁し、暗所で室温にて保存した。細胞は、フローサイトメト リーによる紫および青の蛍光放射の同時測定による遊離カルシウムイオンの解析 を行った（Rabinovitchら、J．Immunol.137:952-961（1986））。カルシウム移 動を開始するために、1μg/mlのフィコエリトリン（PE）結合Leu-3A（抗CD4）（ Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ）を細胞懸濁に加え、次いで10μg/mlの非 結合ヤギ抗マウスIgGを時間0に加えるか、又は1μg/mlの非結合3G8（抗CD16）モ ノクロナール抗体を細胞懸濁に加え、次いで10μg/mlのPE結合Fab₂'ヤギ抗マウ スIgGを時間0に加えるかした。紫／青放射比のヒストグラムは、PE陽性（感染） 細胞群から収集した。この細胞群は、概して全細胞の40〜80％に相当した。非感 染細胞におけるT細胞抗原レセプター反応は、架橋なしで、抗体OKT3により刺激 された。CD16キメラレセプターに関する実験では、（抗体なしで）低細胞内カル シウムの方へ移動する基線を示す試料は、解析から除外した。ヒストグラムデー タは、続いて、「Write Hand Man（Cooper City，FL）」ソフトウェアを用いて 、２つのデータをASCIIへ変換することにより解析し、さらに「FORTRAN」プログ ラムの収集で解析した。二次抗体試薬の添加前の紫／青放射比は、統一した標準 初期値と残余群の10％が臨界を越えるようにした残余臨界比を確立するために用 いた。 細胞溶解アッセイ ヒトT細胞株WH3、CD8⁺CD4^-HLA B44制限細胞溶解株をIMDM、100U/mlのIL-2を含 む10％ヒト血清中で継代し、放射線照射した（3000rad）HLA-不適合末梢血リン パ球および1μg/mlのフィトヘマグルチニンで非特異的に、または放射線照射し たB44を有する単核細胞で特異的に、周期的に刺激した。非特異的刺激の1日後、 新鮮培地を添加することによりPHAを0.5μg/mlにまで希釈し、さらに3日後に培 地を交換した。細胞は、刺激後、細胞傷害アッセイで使用するまで少なくとも10 日間培養した。細胞を、無血清培地中で1時間、少なくとも10の感染多重度で組 換えワク ニシアで感染させ、次に3時間完全培地中でインキュベーションした。細胞を遠 心分離により回収し、1×10⁷細胞／mlの濃度で再懸濁させた。100μl／ウェルの 完全培地を含むU底マイクロタイタープレートの各ウェルに、100μlを添加した 。細胞を二段階希釈した。各試料のうち2ウェルには、自発的なクロム放出およ び全クロム取り込みを測定するため、リンパ球を加えなかった。HeLa細胞亜株S3 からの標的細胞を、6.0または10.0cmのプレートで、無血清培地中で、1時間およ そ10のmoiで感染させ、続いて完全培地で３時間インキュベーションした。それ らを、PBS、1mM EDTAを用いてシャーレから分離し、計数した。10⁶個の標的細胞 （CD4キメラレセプター実験では、HeLa、Raji、またはRJ2.2.5細胞、CD16キメラ レセプター実験では、3G8 10-2細胞；Shenら、Mol.Immunol.26:959（1989））を 等分したものを遠心し、37℃で1時間、断続的に攪拌しながら50μlの無菌⁵¹Crナ トリウムクロム酸（1mCi/ml,Dupont,Wilmington,DE）中に再懸濁させ、それから PBSで3回洗浄した。10⁵細胞／mlで培地中に再懸濁した標識細胞100μlを、各ウ ェルに添加した。Raji標的細胞およびRJ2.2.5標的細胞を、HeLa細胞と同様に標 識した。マイクロタイタープレートを750×gで1分間遠心し、37℃で4時間インキ ュベーションした。インキュベーション時間の最後に、静かにピペッティングす ることにより、各ウェルの細胞を再懸濁させ、総取り込み量を決定するために試 料を取り出し、マイクロタイタープレートを750×gで1分間遠心した。100μlに 等分した上清を取り出し、ガンマ線シンチレーション計数器で計数した。破壊率 を、フローサイトメトリーにより測定した感染標的細胞の画分（通常50〜90％） に対して補正した。感染エフェクター細胞について、エフェクター：標的比を、 感染した細胞の割合（通常、CD4キメラレセプター実験では20〜50％、CD16キメ ラレセプター実験では＞70％）に対して補正した。 ζ配列のインビトロ突然変異誘発 ζ配列のアミノ酸残基11およびまたは15に点突然変異を生じさせるため、ζ膜 貫通ドメインの上流のBamHI部位から延びる合成オリゴヌクレオチドプライマー で、天然ζの残基11をCysからGlyに変換したもの（C11G）、残基15をAspからGly に変換したもの（D15G）、またはその両方を変換したもの（C11G/D15G）を調製 し、変異断片を生成するためのPCR反応に用いて、その断片を野生型CD4：ζ構築 体へ と再び挿入した。 ζ欠失を作製するため、ζcDNA配列を、残基50、59、または65の後に停止コド ン（UAG）を生じるように設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い たPCRにより増幅した。プライマーは、通常、CGC GGG CGG CCG CTA（配列番号： 11）の配列中に5'末端から5または6残基一方の鎖が欠けた、酵素NotIの切断部位 を含んでいた。該配列の最後の3残基は、停止アンチコドンに相当する。NotIお よび停止アンチコドン配列には、断片の望ましい3'末端に相補的な18以上の残基 が続いていた。得られたキメラを、それぞれCD16：ζY51＊、CD16：ζE60＊、お よびCD16：ζD66＊と名付けた。膜貫通ドメインの上流のBamHI部位、およびNotI 部位を断片を生成するために用い、その断片を野生型CD16：ζ構築体へと再挿入 した。前述のAsp^-およびCys^-CD4：ζ構築体をBamHIおよびSacIで消化して、ζ膜 貫通配列および膜に近接する細胞内配列を作製し、断片をそれぞれCD16：ζE60 ＊およびCD16：ζD66＊構築体中に挿入することにより、単量体ζキメラを作製 した。 三部からなるCD16：７：ζ（48-65）キメラおよびCD16：７：ζ（48-59）キメラ の構築 構築体CD16：ζD66＊を調製するため、膜貫通ドメインに相当するζcDNA配列 およびそれに続く細胞質ドメインの17残基を、CD5およびCD7 cDNAから得た膜貫 通ドメインおよび細胞質ドメインの相当部分と置換した。CD5断片およびCD7断片 は、PCR反応により作製した。PCRには、BamHI制限切断部位を含み、それぞれCD5 、CD7の膜貫通ドメインのすぐ上流の領域に相当する順向きオリゴヌクレオチド ならびにそれぞれCD5、CD7配列、およびSacI制限切断部位を含むζ配列にオーバ ーラップする以下の逆向きオリゴヌクレオチドを用いた。 CD5およびCD7のPCR産物をBamHIおよびSacIで消化し、BamHIおよびSacIで消化し たCD16：ζE6０＊とライゲーションし、BamHIからSacIまでのζ配列をCD7断片と 置換した。構築体CD16：CD5およびCD16：CD7を作製するため、CD5断片およびCD7 断 片をPCRにより得た。PCRには、NotI制限切断部位を含み、それぞれCD5、CD7のGl n416、Ala193残基の後に停止コドン（UAA）をコードするオリゴヌクレオチドを 用いた。CD5およびCD7のPCR断片をBamHIおよびNotIで消化し、CD16：ζAsp66＊ 構築体中に挿入した。 ζ細胞溶解シグナル伝達モチーフ内のN末端残基のインビトロ突然変異誘発 ζモチーフ内のSacI部位から延びる合成オリゴヌクレオチドプライマーであり 、本来の残基48がAsnからSerに変換したもの（N48S）、残基50がLeuからSerに変 換したもの（L50S）、および残基51がTyrからPheに変換したもの（Y51F）を合成 し、PCR反応に用いて断片を生成し、その断片を野生型CD16：７：ζ（48-65）構 築体へと再び挿入した。 ζ細胞溶解シグナル伝達モチーフ内のC末端残基のインビトロ突然変異誘発 NotI部位の3'から停止コドンまで延びる合成オリゴヌクレオチドプライマーで あり、本来の残基60がGluからGlnに変換したもの（E60Q）、残基61がGluからGln に変換したもの（E61Q）、残基62がTyrからPheまたはSerに変換したもの（Y62F またはY62S）、および残基63がAspからAsnに変換したもの（D63N）を合成し、PC Rに用いて断片を生成し、その断片を野生型CD16：ζD66＊構築体のBamHI部位か らNotI部位までにサブクローニングした。 CD16：7：ζ（33-65）キメラ、CD16：7：ζ（71-104）キメラ、CD16：7：ζ（10 4-137）キメラの構築 膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの結合部にMluI部位とNotI部位を有するCD 7膜貫通断片を、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより得た 。CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA（配列番号：14）。得られたP CR断片をBamHIおよびNotIで消化し、CD16：７:ζ（48-65）構築体へと再び挿入 した。残基33から65、71から104、および104から137をコードするζ断片を、PCR 反応により得た。用いたプライマー対は、順向きプライマーの5'末端にMluI部位 、および停止コドン、それに続く逆向きプライマーの5'末端にNotI部位を含む。 各々の場合において、制限酵素切断を確実にするため、制限部位はプライマーの 5'末端から6残基一方の鎖が欠けていた。 FcRγIIA欠失変異体の構築 全長構築体と同様な方法でPCRにより、カルボキシル末端FcRIIA欠失変異体を 構築し、282位および298位のチロシンをコードする配列を停止コドン（TAA）に 変換した。N末端欠失は、すでに構築されている発現プラスミドのMluI制限部位 とNotI制限部位の間に得られた断片が挿入されるようにすることができるオリゴ ヌクレオチドを用いて、PCRを行うことにより、連続的に短縮した細胞内ドメイ ンをコードする断片を増幅することにより作製した。該発現プラスミドは、CD7 膜貫通ドメインに融合したCD16細胞外ドメインをコードし、CD7膜貫通ドメイン はMluI部位、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの結合部で終了する。 その他の態様 前述の実施例により、ζ、η、またはγキメラの凝集が、T細胞における細胞 溶解エフェクター細胞反応を開始するために十分であることが示された。Tリン パ球、ナチュラルキラー細胞、好塩基性顆粒球、マクロファージ、および肥満細 胞を含む既知の範囲のζ、η、およびγの発現により、保存された配列モチーフ が、造血系に由来する細胞に共通の知覚装置と相互作用するのかもしれないとい うこと、および免疫系における宿主防御の重要な成分がレセプター凝集過程によ り媒介されるかもしれないということが示された。 細胞溶解反応を起こすことができ、MHCクラスIIレセプターを有する標的細胞 に対する反応を起こさないということは、ζ、η、またはγに基づいたキメラが 、養子免疫治療によりAIDSを遺伝学的に防止するための基礎となることを示して いる。内因性ζおよびγは広範に分布し、γと相互作用したFcレセプターは異な る細胞型において細胞毒性を媒介するという証拠により（Fangerら、Immunol.To day 10:92-99（1989））、様々な細胞をこの目的の対象とすることができる。例 えば、循環系における寿命が非常に短い（約４時間）好中性顆粒球は非常に強い 細胞溶解性で、キメラ発現のための都合のよい標的細胞である。好中球にHIVが 感染してもウイルス放出が起こる可能性は低く、これらの細胞は豊富である（白 血球の中で最も多く存在する）ため、宿主の防御が促進される。宿主細胞として 都合の よいもう一つの可能性は、現在レトロウイルスを用いた遺伝子工学により入手可 能な細胞群、即ち成熟T細胞である（Rosenberg,S.A.Sci.Am.262:62-69（1990） ）。組換えIL-2の助けを借りることにより、T細胞群は、比較的容易に培地中で 増殖させることができ、増殖した群は典型的に、再注入した際に限られた寿命を もつ（Rosenbergら、N.Engl.J.Med.323:570-578（1990））。 適当な条件の下で、CD4キメラを発現する細胞によるHIV認識はまた、分裂促進 刺激をも提供し、それにより武装細胞群はウイルス負荷に対して劇的に反応する ことができる可能性がある。本発明者らは、本明細書において、細胞溶解性Tリ ンパ球における融合タンパク質の作用に焦点を当ててきたが、ヘルパーリンパ球 におけるキメラの発現は、AIDSにおけるヘルパー細胞サブセットの破壊に対抗す るHIV動員性の（HIV-mobilized）サイトカイン源を提供しうる。ウイルス侵入以 外の段階における感染に対して、遺伝子工学的に抵抗するためのいくつかの手段 が最近開示されているが（Friedmanら、Nature 335:452-454（1988）;Greenら、 Cell 58:215-223（1989）;Malimら、Cell 58:205-214（1989）;Tronoら、Cell 5 9:113-120（1989）;Buonocoreら、Nature 345:625-628（1990））、それらは、C D4キメラを有する細胞が、細胞内の作用部位を有する適当な物質の発現により、 ウイルス産生を妨害するために設計されうるということを示している。 自律的なキメラによりTリンパ球へシグナルを伝達することができるため、レ トロウイルス遺伝子工学により作製したリンパ球をインビボで調節することもで きる。例えば、補体結合ドメインを除去する操作を受けた特異的IgM抗体により 媒介されるような架橋刺激により、このようなリンパ球をインサイチューで増加 させることができ、同様な（例えば、キメラ鎖中に挿入されたアミノ酸変異を認 識する）特異的IgG抗体で処理することにより、変異を受けた群を選択的に減少 させることができる。さらに、抗CD4 IgH抗体は、CD4：ζキメラを発現するジャ ーカット細胞において、カルシウムを動員するためにさらなる架橋を必要としな い。反復体外増幅に頼らずに細胞群を調節できるということは、現在提唱されて いる遺伝子工学によるT細胞の使用の範囲および効率を実質的に拡大しうる。 本発明をその特定の態様との関連において開示してきたが、さらに修飾を加え ることが可能であり、本願は、本発明の修飾、使用、または適用を含むものであ り、また本発明が属する分野において本開示から行われ、本明細書または添付の 請求の範囲に記載された本質的な特徴に適用される改良も含むということを理解 すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＵ，ＳＩ，ＵＡ (72)発明者 ロメオ チャールズ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ベ ルモント チェスター ロード 45 (72)発明者 コラヌス ワルデマー ドイツ国 ミュンヘン ゴスウィンストラ ッセ ７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1.哺乳類に有効量の治療用細胞を投与することを含む、哺乳類におけるHIV感染 を治療する方法であって、該治療用細胞が、HIV感染細胞を特異的に認識し結合 することができるがHIV感染を媒介することがないCD4断片を含む細胞外部分を含 む膜結合型のタンパク質性キメラレセプターを発現するものである、方法。 2.CD4断片が1〜394番目のアミノ酸または1〜200番目のアミノ酸を含む、請求項1 の方法。 3.CD4断片が、図26に示されたCD7膜貫通ドメインにより、または図25に示された ヒトIgG1分子のヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインにより、細胞 内部分から分離されている、請求項1の方法。 4.CD4断片が、少なくとも48オングストローム、または少なくとも72オングスト ローム、治療用細胞の細胞膜から分離されている、請求項1の方法。 6.レセプターが、CD7膜貫通部分、CD5膜貫通部分、またはCD34膜貫通部分を含む 、請求項1の方法。 7.CD4断片が、一つまたは複数のタンパク質性アルファヘリックスにより、治療 用細胞の細胞膜から分離されている、請求項1の方法。 8.治療用細胞が、T細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、または濾胞樹状細胞からな る群より選択される、請求項1の方法。 9.HIV感染細胞を特異的に認識し結合することができるがHIV感染を媒介すること がないCD4断片を含む細胞外部分を含むタンパク質性の膜結合型キメラレセプタ ーを発現する細胞。 10.CD4断片が1〜394番目のアミノ酸または1〜200番目のアミノ酸を含む、請求項 9の細胞。 11.CD4断片が、図26に示されたCD7膜貫通ドメインにより、または図25に示され たヒトIgG1分子のヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインにより、細 胞内部分から分離されている、請求項9の細胞。 12.CD4断片が、少なくとも48オングストローム、または少なくとも72オングスト ローム、細胞膜から分離されている、請求項9の細胞。 13.レセプターがCD7膜貫通部分、CD5膜貫通部分、またはCD34膜貫通部分を含む 、 請求項9の細胞。 14.CD4断片が、一つまたは複数のタンパク質性アルファヘリックスにより、細胞 膜から分離されている、請求項9の細胞。 15.T細胞、B細胞、好中球、樹状細胞、または濾胞樹状細胞からなる群より選択 される、請求項9の細胞。 16.HIV感染細胞を特異的に認識し結合することができるがHIV感染を媒介するこ とがないCD4断片を含む細胞外部分を含む膜結合型のタンパク質性キメラレセプ ター。 17.CD4断片が1〜394番目のアミノ酸または1〜200番目のアミノ酸を含む、請求項 16のレセプター。 18.CD4断片が、図26に示されたCD7膜貫通ドメインにより、または図25に示され たヒトIgG1分子のヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインにより、細 胞内部分から分離されている、請求項16のレセプター。 19.CD4断片が、少なくとも48オングストローム、または少なくとも72オングスト ローム、宿主細胞の細胞膜から分離されている、請求項16のレセプター。 20.レセプターがCD7膜貫通部分、CD5膜貫通部分、またはCD34膜貫通部分を含む 、請求項16のレセプター。 21.CD4断片が、一つまたは複数のタンパク質性アルファヘリックスにより、宿主 細胞の細胞膜から分離されている、請求項16のレセプター。 22.HIV感染細胞を特異的に認識し結合することができるがHIV感染を媒介するこ とがないCD4断片を含む細胞外部分を含む膜結合型のタンパク質性キメラレセプ ターをコードするDNA。 23.請求項22のキメラレセプターDNAを含有するベクター。