MXPA96003384A - Citolisis objetivada de celulas infectadas por hiv mediante celulas portadoras receptoras cd4 quimericas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para dirigir una respuesta inmunológica celular contra una célula infectada por HIV en un mamífero, que implica administrar al mamífero una cantidad efectiva de células terapéuticas que expresan un receptor quimérico proteico, ligado en membrana, que comprende (a) una porción extracelularque incluye un fragmento CD4 que es capaz de reconocer especificamente y ligarse a la célula infectada por HIV pero el cual no media la infección por HIV, y (b) una porción intracelular que es capaz de señalizar la célula terapéutica para destruir la célula infectada por HIV ligada al receptor. También se describen células que expresan los receptores quiméricos y ADN y vectores que codifican los receptores quiméricos.

Description

CITOLISIS OBJETIVADA DE CÉLULAS INFECTADAS POR HIV MEDIANTE CÉLULAS PORTADORAS- RECEPTORAS CD4 QUIMÉRICAS Campo de la Invención Esta invención fue realizada con apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo contrato No. AI 27849, otorgado por National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención. La invención concierne a quimeras funcionales entre fragmentos CD4 y receptores de células inmunes que son capaces de ordenar a las células inmunes a lisar células infectadas por HIV, pero que no hacen a las células inmunes susceptibles a infección por HIV. La invención, por consiguiente, proporciona una terapia novedosa y efectiva para HIV. Antecedentes de la Invención El reconocimiento de células T de antígenos a través del receptor de células T es la base de una gama de fenómenos inmunológicos . Las células T dirigen la llamada inmunidad mediada por células. Esta implica la destrucción por células del sistema inmunológico de tejidos extraños o células infectadas. Existe una variedad de células T, incluyendo células "de ayuda" y "supresoras" , que modulan la respuesta inmune, y células citotóxicas (o "asesinas") , que pueden matar células anormales en forma directa. Una célula T que reconoce y liga un antígeno único exhibido sobre la superficie de otra célula se torna activada; puede entonces multiplicarse, y si es una célula citotóxica, puede matar la célula ligada. HIV e Inmunopatoqénesis En 1984 se demostró que HIV era el agente etiológico del SIDA. Desde ese tiempo, la definición de SIDA ha sido revisada varias veces con relación a cuales criterios deben incluirse en el diagnóstico. Sin embargo, a pesar de la fluctuación en los parámetros de diagnóstico, el simple denominador común del SIDA es la infección con HIV y el desarrollo subsecuente de síntomas constitucionales persistentes y enfermedades que definen el SIDA tales como infecciones secundarias, neoplasmas y padecimientos neurológicos . Harrison's Principies of Internal Medicine, 12a. edición, McGra Hill (1991) . El HIV es un retrovirus humano del grupo de los lentivirus. Los cuatro retrovirus humanos reconocidos pertenecen a dos grupos distintos: los retrovirus linfotrópicos T humanos (o leucemia) , HTLV-1 y HTLV-2, y los virus de inmunodeficiencia humana, HIV-1 y HIV-2. Los primeros son virus de transformación, mientras que los segundos son virus citopáticos. Se ha identificado el HIV-1 como la causa mas común de SIDA en todo el mundo. La homología de secuencias entre HIV-1 y HIV-2 es de alrededor del 40%, HIV-2 estando mas estrechamente relacionado a algunos miembros de un grupo de virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) . Ver Curran, J. y colaboradores, Science 3_29: 1357-1359 (1985); Weiss, R. y colaboradores, Nature 324:572-575 (1986) . El HIV tiene los genes retrovirales habituales (env, gag y pol) , así como seis genes adicionales implicados en la replicación y otras actividades biológicas del virus. Como se mencionó previamente, el denominador común del SIDA es una profunda inmunosupresión, predominantemente de inmunidad mediada por células. Esta inmunosupresión lleva a una variedad de enfermedades oportunistas, particularmente ciertas infecciones y neoplasmas . La causa principal del inmunodefecto en el SIDA ha sido identificada como una deficiencia cuantitativa y cualitativa en el subconjunto de linfocitos derivados del timo (T) , la población T4. Este subconjunto de células es definido fenotípicamente por la presencia de la molécula de superficie CD4 , que se ha demostrado ser el receptor celular para HIV, Dalgleish y colaboradores, Nature 3.12:763 (1984) . Aunque la célula T4 es el tipo de célula principal infectado con HIV, esencialmente cualquier célula que expresa la molécula CD4 en su superficie es capaz de ligarse a e infectarse con HIV. Tradicionalmente, a las células CD4+ se les ha asignado el papel de ayuda/inductor, indicando su función para proporcio-nar una señal de activación a las células B, o inducir a los linfocitos T portadores del marcador CD8 recíproco a tornarse células citotóxicas/supresoras, Reinherz y Schlossman, Cell 19:821-827 (1980); Goldstein y colaboradores, Immunol . Rev . 68:5-42 (1982) . El HIV se liga específicamente y con elevada afinidad, vía una línea de aminoácidos en el envolvente viral (gpl20) , a una porción de la región VI de la molécula CD4 ubicada cerca de su término N. Después de la ligadura, el virus se fusiona con la membrana celular objetivo y es internalizado. Una vez internali-zado, usa la enzima transcriptasa inversa para transcribir su ARN genómico en ADN, que se integra en el ADN celular donde existe por toda la vida de la célula como un "provirus". El provirus puede permanecer latente o ser activado para transcribir ARNm y ARN genómico, llevando a síntesis de proteínas, ensamble, formación de nuevos viriones y brote del virus a partir de la superficie celular. Aunque el mecanismo preciso mediante el cual el virus induce la muerte celular no ha sido establecido, se cree que el mecanismo principal es brote viral masivo a partir de la superficie celular, llevando a disrupción de la membrana de plasma y desequilibrio osmótico resultante . Durante el curso de la infección, el organismo anfitrión desarrolla anticuerpos contra proteínas virales, incluyendo las glicoproteínas principales de envolvente gpl20 y gp41. A pesar de esta inmunidad tumoral, la enfermedad avanza, dando como resultado una inmunosupresión letal caracterizada por infecciones oportunistas múltiples, parasitemia, demencia y muerte. La incapacidad de los anticuerpos anti-virales del anfitrión para detener el avance de la enfermedad representa uno de los aspectos mas asombrosos y alarmantes de la infección, y augura un futuro sombrío para los esfuerzos de vacunación basados en enfoques convencionales. Dos factores pueden jugar un papel en la eficacia de la respuesta humoral a los virus de inmunodeficiencia. Primero, como otros virus de ARN (y como los retrovirus en particular) , los virus de inmunodeficiencia muestra una elevada tasa de mutación en respuesta a la vigilancia inmune del anfitrión. En segundo lugar, las glicoproteínas del envolvente mismas son moléculas sumamente glicosiladas, presentando pocos epítopes adecuados para ligadura de anticuerpos de alta afinidad. El objetivo pobremente antigénico que presenta el envolvente viral permite anfitrión poca oportunidad para restringir la infección viral por producción de anticuerpos específicos. Las células infectadas por el virus HIV expresan la glicoproteína gpl20 sobre su superficie. La gpl20 media los eventos de fusión entre células CD4+ vía una reacción similar a aquélla por la cual el virus entra a las células no infectadas, llevando a la formación de células gigantes multinucleadas de corta vida. La formación de sincitio depende de una interacción directa de la glicoproteína de envolvente gpl20 con la proteína CD4, Dalgleish y colaboradores, supra ; Klatzman, D. y colaboradores, Nature 312:763 (1984); McDougal, J.S. y colaboradores, Science 231:382 (1986); Sodroski, J. y colaboradores, Nature 322 :470 (1986); Lifson, J.D. y colaboradores, Nature 323:725 (1986); Sodroski, J. y colaboradores, Nature 321:412 (1986). La evidencia de que la ligadura CD4-gpl20 es responsable de la infección viral de células que llevan el antígeno CD4 incluye el descubrimiento de que se forma un complejo específico entre gpl20 y CD4 , McDougal y colaboradores, supra . Otros investigadores han demostrado que las líneas celulares, que no eran infecciosas para HIV, eran convertidas en líneas celulares capaces de ser infectadas después de transfección y expresión del gene humano ADNc CD4 , Maddon y colaboradores, Cell 46:333-348 (1986) . Los programas terapéuticos basados en CD4 soluble como un agente pasivo para interferir con adsorción viral y transmisión celular mediada por sincitio han sido propuestos y demostrados exitosamente in vitro por varios grupos (Deen y colaboradores, Nature 331:82-84 (1988); Fisher y colaboradores, Nature 331:76-78 (1988); Hussey y colaboradores, Nature 331:78-81 (1988); Smith y colaboradores, Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker y colaboradores, Nature 331:84-86 (1988) ) ; y proteínas de fusión de CD4 inmunoglobulina con vidas medias prolongadas y actividad biológica modesta han sido desarrolladas posteriormente (Capón y colaboradores, Nature 337:525-531 (1989); Traunecker y colaboradores, Nature 339:68-70 (1989); Byrn y colaboradores, Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl y colaboradores, DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)) . Aunque conjugados o proteínas de fusión de la inmunotoxina CD4 muestran potente citotoxicidad para células infectadas in vitro (Chaudhary y colaboradores, Nature 335:369-372 (1988); Till y colaboradores, Science 242:1166-1168 (1988) ) , la latencia del síndrome de inmunodeficiencia hace poco factible cualquier terapia de un solo tratamiento para eliminar la carga viral, y la antigenicidad de las proteínas de fusión extrañas es factible que limite su aceptabilidad en tratamientos que requieren de dosificación repetitiva. Las pruebas con monos afectados con SIV han demostrado que CD4 soluble, si se administra a animales sin citopenia CD4 marcada, puede reducir el título de SIV y mejorar las medidas in vitro de potencial mieloide (Watanabe y colaboradores, Nature 337:267-270 (1989)). Sin embargo, se observa una pronta re-emergencia viral después de descontinuar el tratamiento, sugiriendo que podría ser necesaria administración durante toda la vida para impedir debilitamiento progresivo del sistema inmunológico . Células T v Receptores Fe La expresión en la superficie celular de la forma mas abundante del receptor de antígeno de células T (TCR) requiere la co-expresión de al menos seis cadenas distintas de polipéptidos (Weiss y colaboradores, J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloffhashi y colaboradores, Nature 316:606-609 (1985); Berkhout y colaboradores, J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman y colaboradores, Cell 52:85-95 (1988)), las cadenas de ligadura de antígeno alfa/beta, los tres polipéptidos del complejo CD3 y zeta. Si cualquiera de las cadenas está ausente, no sigue expresión estable de los miembros remanentes del complejo. Zeta es el polipéptido limitante para expresión superficial del complejo completo (Sussman y colaboradores, Cel 52 : 85-95 (1988)) y se piensa que media al menos una fracción de los programas de activación celular disparados por el reconocimiento de receptor del ligando (Weissman y colaboradores, EMBO J. 8:3651-3656 (1989); Frank y colaboradores, Science 249:174-177 (1990)). Un homodímero de membrana integral tipo I, de 32 kDa, zeta, tiene un dominio extracelular de nueve residuos sin sitios para adición de glicano N-ligado, y un dominio intracelular de 112 residuos (ratón) o 113 residuos (ser humano) (Weissman y colaboradores, Science 238:1018-1020 (1988); Weissman y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)). Una isoforma de zeta llamada eta (Baniyash y colaboradores, J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff y colaboradores, J. Biol. Chem. 264:14812-14817 (1989)), que surge de una trayectoria de empalme de ARNm alternativa (Jin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3319-3233 (1990)), está presente en cantidades reducidas en células que expresan el receptor de antígeno. Se piensa que los heterodímeros zeta-eta median la formación de inositol fosfatos, así como la muerte celular programada, iniciada por receptor, llamada apóptosis (Mercep y colaboradores, Science 242:571-574 (1988); Mercep y colaboradores, Science 246:1162-1165 (1989)). Como zeta y eta, la cadena gama asociada con receptor Fe es expresada en complejos superficiales de célula con polipéptidos adicionales, algunos de los cuales median reconocimiento de ligando, y otros de los cuales tienen una función indefinida. Gama porta una estructura homodimérica y una organización global muy similares a las de zeta, y es un componente tanto del receptor IgE de alta afinidad de células de poste/basófilas, FcepsilonRI, que consiste en al menos tres cadenas distintas de polipéptidos (Blank y colaboradores, Nature 337 : 187-189 (1989); Ra y colaboradores, Nature 241:752-754 (1989) ) , y uno de los receptores de baja afinidad para IgG, representado en ratones por FcgamaRIIalfa (Ra y colaboradores, J_j_ Biol. Chem. 264:15323-15327 (1989)), y en humanos por expresión del subtipo CD16 por macrófagos y células asesinas naturales, CD16TM (transmembrana CD16) (Lanier y colaboradores, Nature 342 : 803-805 (1989); Anderson y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990) ) , y con un polipéptido de función no identificada (Anderson y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Recientemente, se ha reportado que gama es expresada por una línea celular T de ratón, CTL, en la cual forma homodímeros así como los heterodímeros gama-zeta y gama-eta (Orloff y colaboradores, Nature 347:189-191 (1990)). Los receptores Fe median fagocitosis de complejos inmunes, transcitosis y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991); Unkeless y colaboradores, Annu. Rev. Immunol . 6:251-281 (1988); y Mellman, Curr. Opin. Immunol . 1:16-25 (1988)). Recientemente, se ha demostrado que una de las isoformas de receptor Fe de baja afinidad, FcRgamalIIBl , media la internaliza-ción de objetivos revestidos con Ig en cavidades revestidas con clatrina, y que otro receptor de baja afinidad, FcrgamalIIA media ADCC a través de su asociación con uno o mas miembros de una pequeña familia de "moléculas de disparo" (Miettinen y colaboradores, Cell 58:317-327 (1989); y Hunziker y Mellman, J. Cell. Biol. 109:3291-3302 (1989)). Estas moléculas de disparo, cadena zeta de receptor de células T (TCR) , cadena TCR eta, y cadena gama de receptor Fe, interactúan con dominios de reconocimiento de ligando de diferentes receptores del sistema inmunológico y pueden iniciar autónomamente programas de efecto celular, incluyendo citólisis, siguiendo a la agregación (Samelson y colaboradores, Cell 43 :223-231 (1985); Weissman y colaboradores, Science 239:1018-1020 (1988); Jin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87 : 3319-3323 (1990); Blank y colaboradores , Nature 337:187-189 (1989); Lanier y colaboradores, Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki y Ravtech, Nature 342:805-807 (1989); Hibbs y colaboradores, Science 246:1608-1611 (1989); Anderson y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990); e Irving y Weiss, Cell 64:891-901 (1991)).

Al trazar paralelismos entre las familias de receptores Fe de baja afinidad de murino y de seres humanos, sin embargo, se ha aclarado que las isoformas FcRgamalIA y C humanas no tienen contraparte en murinos . En parte debido a ésto, su función tiene aún que definirse. Debido a que los agentes humorales basados en CD4 solo pueden tener utilidad limitada in vivo, los trabajos previos exploraron la posibilidad de aumentar la inmunidad celular a HIV. Preparaciones de quimeras de proteínas en las cuales se fusiona el dominio extracelular de CD4 con los dominios de transmembrana y/o intracelular del receptor de células T, se ha identificado el receptor IgG Fe, o elementos transductores de señal de receptor de células B (solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. de Serie 07/847,566 y 07/665,961, incorporadas en la presente por referencia) . Las células T citolíticas que expresan quimeras que incluyen un dominio CD4 extracelular muestran potente destrucción independiente de MHC de objetivos celulares que expresan las proteínas de envolvente de HIV. Un componente extremadamente importante y novedoso de este enfoque ha sido la identificación del receptor de células T sencillo, el receptor Fe, y las cadenas de receptor de células B cuya agregación basta para iniciar la respuesta celular. Una aplicación particularmente útil de este enfoque ha sido la invención de quimeras entre CD4 y zeta, eta o gama, que dirigen a los linfocitos T citolíticos a reconocer y matar células que expresan HIV gpl20 (solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos. de Serie 07/847,566 y 07/665,961, incorporadas en la presente por referencia) . Esencia de la Invención En general, la invención se refiere a un método de dirigir una respuesta inmunológica celular contra una célula infectada por HIV en un mamífero. El método implica administrar al mamífero una cantidad efectiva de células terapéuticas, las células terapéuticas expresando un receptor quimérico proteico, ligado a membrana, que comprende (a) una porción extracelular que incluye un fragmento de CD4 que es capaz de reconocer específicamente y ligar la célula infectada por HIV pero que no media la infección por HIV y (b) una porción intracelular que es capaz de ordenar a la célula terapéutica destruir la célula infectada por HIV ligada al receptor. En un método relacionado, la invención se refiere al uso de células terapéuticas que expresan un receptor quimérico proteico, ligado a membrana, que incluye (a) una porción extracelular que incluye un fragmento de CD4 que es capaz de reconocer específicamente y ligar la célula infectada por HIV pero que no media la infección por HIV, y (b) una porción intracelular que es capaz de ordenar a la célula terapéutica destruir la célula infectada por HIV ligada al receptor en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con HIV. En un segundo aspecto, la invención se refiere a una célula que expresa un receptor quimérico ligado a una membrana proteica que comprende (a) una porción extracelular que incluye un fragmento de CD4 que es capaz de reconocer específicamente y ligar la célula infectada por HIV pero que no media la infección por HIV y (b) una porción intracelular que es capaz de ordenar a la célula terapéutica destruir la célula infectada por HIV ligada al receptor. En formas de realización preferidas de ambos aspectos, el fragmento CD4 consiste en los aminoácidos 1394 de CD4 o los aminoácidos 1-200 de CD4 ; el fragmento CD4 es separado de la porción intracelular por el dominio de transmembrana CD7 mostrado en la figura 26 o por la articulación, CH2 , y los dominios CH3 de la molécula IgGl humana mostrada en la figura 25; el receptor incluye una porción de transmembrana CD7; el receptor incluye una porción de transmembrana CD5; el receptor incluye una porción de transmembrana CD34; el fragmento CD4 está separado de la membrana celular terapéutica por una o mas hélices alfa proteicas; el fragmento CD4 está separado de la membrana celular terapéutica por al menos 48 angstroms o por al menos 72 angstroms; la porción intracelular es la porción transductora de señal de una proteína receptora de células T (por ejemplo, zeta) , una proteína receptora de células B, o una proteína receptora Fe; y las células terapéuticas son seleccionadas del grupo que consiste en (a) linfocitos T; (b) linfocitos T citotóxicos; (c) células asesinas naturales; (d) neutrófilos; (e) granulocitos; (f) macrófagos; (g) células de poste; (h) células HeLa; e (i) células de tallo embriónico (ES) . En otros aspectos, la invención se refiere a ADN que codifica un receptor quimérico de la invención; y un vector que incluye ese ADN del receptor quimérico. Aunque la forma de realización específica de la presente invención es una quimera entre CD4 y zeta, puede usarse cualquier cadena receptora teniendo una función similar a estas moléculas, por ejemplo en granulocitos o linfocitos B, para los fines divulgados en la presente. Los aspectos distintivos de una molécula de disparo de célula inmune deseable comprenden la capacidad de ser expresada autónomamente (es decir, como una sola cadena) , la capacidad de fusionarse a un dominio CD4 extracelular tal que la quimera resultante esté presente en la superficie de una célula terapéutica, y la capacidad de iniciar programas de efecto celular al ocurrir agregación secundaria para encontrarse con un ligando objetivo. En la actualidad, el método mas conveniente para la entrega de quimeras a células del sistema inmunológico es mediante alguna forma de terapia genética. Sin embargo, reconstituir las células del sistema inmunológico con receptores quiméricos por medio de la mezcla de células con proteínas quiméricas purificadas, solubilizadas adecuadamente, también daría resultado en la formación de una población de células artificiales capaces de responder a objetivos infectados por HIV.

Se han usado enfoques similares, por ejemplo, para introducir la molécula CD4 en eritrocitos para fines terapéuticos. En este caso, la población de células artificiales no sería capaz de auto-renovacion . La presente invención se refiere a quimeras funcionales y simplificadas entre fragmentos CD4 y receptor de células T, receptor de células B, y subunidades de receptor Fe que son capaces de ordenar a las células inmunes a reconocer y lisar células infectadas por HIV. El método de ordenar la respuesta celular en un mamífero comprende administrar una cantidad efectiva de células terapéuticas (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos) al mamífero, las células siendo capaces de reconocer y destruir la célula infectada por HIV. La invención también incluye proteínas receptoras quiméricas que ordenan a los linfocitos T citotóxicos reconocer y lisar células infectadas por HIV, las células anfitriones transformadas con un vector que comprende los receptores quiméricos, y anticuerpos dirigidos contra los receptores quiméricos . Estas y otras formas de realización no limitativas de la presente invención serán evidentes a los técnicos en la materia a partir de la siguiente descripción detallada de la invención. En la siguiente descripción detallada, se hará referencia a diversas metodologías conocidas a los técnicos en la materia de la biología molecular y la inmunología. Publicaciones y otros materiales que establecen tales metodologías conocidas a las que se hace referencia son incorporados en la presente por referencia en su totalidad, como si se señalaran totalmente. Los trabajos estándar de referencia que establecen los principios generales de la tecnología de ADN recombinante, incluyen Watson y colaboradores, Molecular Biology of the Gene, vol. I y II, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, California (1987) ; Darnell y colaboradores, Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Nueva York, N.Y. (1986) ; Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1985) ; Oíd y colaboradores, Principies of Gene Manipulation : An Introduction to Genetic Engineering, 2a. edición, University of California Press, Berkeley, California (1981) ; Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ; y Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, Nueva York, N.Y. (1989) . Definiciones Por "clonación" se quiere decir el uso de técnicas de recombinación in vitro para insertar un gene particular u otra secuencia de ADN en una molécula vector. Por "ADNc" se quiere decir ADN complementario o copia producido a partir de un templado de ARN por la acción de polimerasa de ADN dependiente de ARN (transcriptasa inversa) . De esta* manera, una "clona de ADNc" significa una secuencia de ADN dúplex que es complementaria a una molécula de ARN de interés, llevada en un vector de clonación. Por "biblioteca de ADNc" se quiere decir una colección de moléculas de ADN recombinante que contiene insertos de cADN que comprenden copias de ADN de ARNm siendo expresado por la célula en el momento en que se hizo la biblioteca de ADNc. Tal biblioteca de ADNc puede ser preparada por métodos conocidos por los técnicos en la materia y que se describen, por ejemplo, en Ausubel y colaboradores, supra , y Maniatis y colaboradores, supra . Generalmente, primero se aisla ARN de las células de un organismo de cuyo genoma se desea clonar un gene particular. Se prefieren para los fines de la presente invención líneas celulares linfocíticas de mamíferos, y particularmente humanas. Un vector actualmente preferido para este fin es la cepa WR del virus vaccinia. > ^ Por "vector" se quiere decir una molécula de ADN, derivada por ejemplo de un plásmido, bacteriófago o virus de mamífero o insecto, en la cual pueden insertarse o clonarse fragmentos de ADN. Un vector contendrá uno o mas sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en un anfitrión u organismo vehículo definido tal que la secuencia clonada sea reproducible. De esta manera, por "vector de expresión de ADN" se quiere decir cualquier elemento autónomo capaz de ordenar la síntesis de un péptido recombinante. Tales vectores de expresión de ADN incluyen plásmidos bacterianos y fagos y plásmidos y virus de mamíferos e insectos . Por "sustancialmente puro" se quiere decir un compuesto, por ejemplo una proteína, un polipéptido o un anticuerpo, que está sustancialmente libre de los componentes que lo acompañan en forma natural. Generalmente, un compuesto es sustancialmente puro cuando al menos 60%, de preferencia al menos 75%, y con la mayor preferencia al menos 90% del material total en una muestra es el compuesto de interés. La pureza puede ser medida por cualquier método apropiado, por ejemplo cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis HPLC. En el contexto de un ácido nucleico, "sustancialmente puro" significa una secuencia de ácidos nucleicos, segmento o fragmento que no está contiguo en forma inmediata (es decir, enlazado en forma covalente) a ambas secuencias de codificación a las que está contiguo en forma inmediata (es decir, una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del cual se deriva el ADN de la invención. Un "fragmento" de una molécula, tal como cualquiera de las secuencias de ADNc de la presente invención, significa cualquier subconjunto de nucleótidos contiguos de la molécula. Un "análogo" de una molécula quiere decir una molécula no natural sustancialmente similar a la molécula completa o un fragmento de la misma. Se dice que una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos en ambas moléculas es sustancialmente la misma. Moléculas de aminoácidos sustancialmente similares poseerán una actividad biológica similar. Como se usa en la presente, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene fracciones químicas que no son normalmente parte de la molécula. Tales fracciones pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica, etc. de la molécula. Las fracciones pueden alternativamente reducir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Fracciones capaces de mediar tales efectos son divulgadas, por ejemplo, en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16a. edición, Mack Publishing Co . , Easton, Pennsylvania (1980). Un "derivado funcional" de un gene de quimera de receptor de la presente invención significa e incluye "fragmen-tos" o "análogos" del gene, que son "sustancialmente similares" en secuencia de nucleótidos, y que codifican una molécula que posee actividad similar a, por ejemplo, una célula T, una célula B, o una quimera de receptor Fe. Con la mayor preferencia, el derivado posee 90%, con mayor preferencia 70%, y con la mayor preferencia 40% de la actividad de la quimera del receptor tipo salvaje. La actividad de un derivado de receptor quimérico funcional incluye ligadura específica (con su porción CD4 extracelular) a una célula infectada por HIV y la destrucción resultante de esa célula; en adición, el receptor quimérico no hace a la célula portadora del receptor susceptible a infección por HIV. La actividad del receptor quimérico puede ser probada usando, por ejemplo, cualquiera de los ensayes descritos en la presente . Una secuencia de ADN que codifica la quimera de receptor CD4 de la presente invención, o sus derivados funcionales, puede recombinarse con un ADN vector de acuerdo con técnicas convencionales, incluyendo términos de extremos chatos o extremos apilados para ligación, digestión con enzima de restricción para proporcionar términos apropiados, llenado de extremos cohesivos como sea apropiado, tratamiento con fosfatosa alcalina para evitar unión indeseable, y ligación con ligasas apropiadas. Las técnicas para tales manipulaciones son divulgadas por Maniatis, T. y colaboradores, supra, y son bien conocidas en la materia. Una molécula de ácidos nucleicos, tal como ADN, se dice que es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información regulatoria transcripcional y traslacional y tales secuencias están "enlazadas operativamente" a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Un eslabón operable es un eslabón en el cual las secuencias de ADN regulatorias y la secuencia de ADN que se busca expresar están conectadas en forma tal que permitan la expresión del gene. La precisa naturaleza de las regiones regulatorias necesarias para la expresión del gene puede variar de organismo a organismo, pero en general incluirá una región promotora que, en procariotes, contiene tanto al promotor (el cual ordena el inicio de una transcripción de ARN) así como a las secuencias de ADN que, cuando se transcribe al ARN, señalará el inicio de la síntesis de proteínas. Tales regiones normalmente incluyen aquellas secuencias 5' de no codificación implicadas con el inicio de la transcripción y la traducción, tales como el cuadro TATA, la secuencia de remate, la secuencia CAAT, y similares. Si se desea, la región 3' que no codifica a la codificación de la secuencia del gene para la proteína puede obtenerse por los métodos antes descritos. Esta región puede ser retenida para sus secuencias regulatorias de terminación transcripcional, tales como terminción y poliadenilación. De esta manera, reteneniendo la región 3' naturalmente contigua a la secuencia de ADN que codifica la proteína, pueden proporcionarse señales de terminación transcripcional. Donde las señales de terminación transcripcional no son satisfactoriamente funcionales en la célula anfitrión de expresión, entonces puede sustituirse una región 3' funcional en la célula anfitrión. Dos secuencias de ADN (tales como una secuencia de región promotora y una secuencia que codifica una quimera de receptor CD4) se dice que están enlazadas operativamente si la naturaleza del eslabón entre las dos secuencias de ADN (1) no da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la secuencia de la región promotora, o (3) interfiere con la capacidad de la secuencia del gene de la quimera del receptor para transcribirse por la secuencia de la región promotora. Una región promotora estaría enlazada operativamente a una secuencia de ADN si el promotor fuese capaz de efectuar transcripción de esa secuencia de ADN. De esta manera, para expresar la proteína, son necesa-rias señales de transcripción y traducción reconocidas por un anfitrión apropiado. La presente invención engloba la expresión de una proteína quimérica de receptor CD4 (o un derivado funcional de la misma) en células procarióticas o eucarióticas, aunque se prefiere expresión eucariótica (y, en particular, de linfocito humano) . Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser preparados por cualquiera de una variedad de métodos . Por ejemplo, células que expresan la proteína quimérica de receptor CD4 , o un derivado funcional de la misma, pueden administrarse a un animal a fin de inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales que son capaces de ligar la quimera. En un método preferido, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son anticuerpos monoclonales. Tales anticuerpos monoclonales pueden ser preparados usando tecnología de hibridoma (Kohler y colaboradores, Nature 256:495 (1975) ; Kohler y colaboradores, Eur. J. Immunol . 6:511 (1976); Kohler y colaboradores, Eur. J. Immunol . 6:292 (1976); Hammerling y colaboradores, en Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridom s .

Elsevier, N.Y. , pp. 563-684 (1981)). En general, tales procedimientos implican inmunizar un. animal con el antígeno de quimera de receptor CD4. Los esplenocitos de tales animales son extraídos y fusionados con una línea celular de mieloma adecuada. Cualquier línea celular de mieloma adecuada puede ser empleada de acuerdo con la presente invención. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes son mantenidas selectivamente en medio HAT, y luego clonadas por dilución limitativa como se describe por Wands y colaboradores, Gastroenterology 80:225-232 (1981) . Las células de hibridoma obtenidas a través de tal selección son entonces ensayadas para identificar clonas que secretan anticuerpos capaces de ligar la quimera. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también pueden ser policlonales o, de preferencia, anticuerpos policlonales específicos de región. Los anticuerpos contra la quimera de receptor CD4 de acuerdo con la presente invención pueden ser usados para supervisar la cantidad del receptor quimérico (o células portadoras de receptor quimérico) en un paciente. Tales anticuerpos son adecuados para uso en ensayes de inmunodiagnósti-co convencionales conocidos en la materia, incluyendo tales ensayes inmunométricos o "de emparedado" como el emparedado delantero, emparedado inverso, y ensayes de emparedado simultáneo. Los anticuerpos pueden ser usados en cualquier número de combinaciones que sean determinadas por los técnicos en la materia sin experimentación indebida para efectuar inmunoensayes de especificidad, sensitividad y precisión aceptables. Trabajos de referencia estándar que establecen principios generales de inmunología incluyen Roitt, Essential Immunology, 6a. edición, Black ell Scientific Publications, Oxford (1988) ; Kimball, Introduction to Immunology, 2a. edición, McMillan Publishing Co., Nueva York (1986); Roitt y colaboradores, Immunologv, Gower Medical Publishing Ltd., Londres (1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology, en Burdon y colabordo-res, editores, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 13, Elsevier, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Nueva York (1982) ; y Kennett y colaboradores, Monoclonal Antibodies. Hvbridoma : A New Dimensión in Biological Analvses, Plenum Press, Nueva York (1980) . Por "detectar" se quiere decir determinar la presencia o ausencia de una sustancia que cuantifica la cantidad de una sustancia. El término por tanto se refiere al uso de los materiales, composiciones y métodos de la presente invención para determinaciones cualitativas y cuantitativas. Los anticuerpos y el antígeno purificado sustancialmente de la presente invención son idealmente aptos para la preparación de un kit. Tal kit puede comprender medios portadores que tienen compartimientos para recibir en confinamiento estrecho uno o mas medios contenedores tales como frascos, tubos y similares, cada uno de dichos medios contenedores comprendiendo los elementos separados del ensaye por usarse. Los tipos de ensayes que pueden ser incorporados en forma de kit son muchos e incluyen, por ejemplo, ensayes competitivos y no competitivos. Ejemplos típicos de ensayes que pueden utilizar los anticuerpos de la invención son radioinmu-noensayes (RÍA) , inmunoensayes de enzima (EIA) , ensayes inmunoad-sorbentes ligados a enzimas (ELISA) , e inmunoensayes inmunométri-cos o de emparedado . Por "ensaye inmunométrico" o " inmunoensaye de emparedado" se incluye inmunoensayes de emparedado simultáneao, de emparedado delantero, y de emparedado inverso. Estos términos son bien comprendidos por los técnicos en la materia. Los técnicos en la materia también apreciarán que anticuerpos de acuerdo con la presente invención serán útiles en otras variaciones y formas de ensayes que se conocen actualmente o que pueden desarrollarse en el futuro. Éstos están destinados a incluirse dentro de los alcances de la presente invención. Por "reconoce específicamente y liga" se quiere decir que el anticuerpo reconoce y liga el polipéptido receptor quimérico, pero no reconoce sustancialmente y liga otras moléculas no relacionadas en una muestra, por ejemplo una muestra biológica. Por "célula terapéutica" se quiere decir una célula que ha sido transformada por una quimera del receptor CD4 de la invención de modo que es capaz de reconocer y destruir una célula infectada por HIV; de preferencia, tales células terapéuticas son células del sistema hematopoyético. Por "extracelular" se quiere decir que tiene al menos una porción de la molécula expuesta en la superficie celular. Por "intracelular" se quiere decir que tiene al menos una porción de la molécula expuesta al citoplasma de la célula terapéutica. Por "transmembrana" se quiere decir que tiene al menos una porción de la molécula abarcando la membrana de plasma. Una "porción extracelular", una "porción intracelular" y una "porción de transmembrana", como se usan en la presente, pueden incluir secuencias de aminoácidos de flanco que se extienden hacia los compartimientos celulares adjuntos. Por "oligomerizar" se quiere decir formar complejos con otras proteínas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros y otros oligómeros de orden superior. Tales oligómeros pueden ser homo-oligómeros o hetero-oligómeros . Una "porción de oligomerización" es aquella región de una molécula que ordena la formación de complejos (es decir, oligómeros) . Por "citolítico" se quiere decir ser capaz de destruir una célula (por ejemplo, una célula infectada por HIV) o ser capaz de destruir un agente infeccioso (por ejemplo, un virus HIV) . Por "virus de inmunodeficiencia" se quiere decir un retrovirus que, en la forma tipo salvaje, es capaz de infectar células T4 de un anfitrión primate y posee una característica de morfogénesis y morfología viral de la sub- familia de los lentivirus. El término incluye, sin limitación, todos los variantes de HIV y SIV, incluyendo HIV-1, HIV-2, SlVmac, SlVagm, SlVmnd, SIVsmm, SlVman, SlVmand y SIVcpz . Por "independiente a MHC" se quiere decir que la respuesta citolítica celular no requiere de la presencia de un antígeno MHC clase II sobre la superficie de la célula objetivo. Por "derivado transductor de señal citolítico funcio-nal" se quiere decir un derivado funcional (como se definió antes) que es capaz de dirigir al menos 40%, con mayor preferencia 70%, o con la mayor preferencia al menos 90% de la actividad biológica de la molécula tipo salvaje. Como se usa en la presente, un "derivado transductor de señal citolítico funcional" puede actuar ordenando directamente a la célula terapéutica a destuir el agente o célula ligado a receptor (por ejemplo, en el caso de una porción de receptor quimérico intracelular) o puede actuar indirectamente promoviendo la oligomerización con proteínas transductoras de señal citolítica de la célula terapéutica (por ejemplo, en el caso de un dominio de transmembrana) . Tales derivados pueden ser probados en cuanto a eficacia, por ejemplo usando ensayes in vitro descritos en la presente . Por "derivado que liga a envolvente HIV funcional" se quiere decir un derivado funcional (como se definió antes) que es capaz de ligar cualquier proteína de envolvente HIV. Los derivados funcionales pueden ser identificados usando, por ejemplo, los ensayes in vitro descritos en la presente. Administración Terapéutica Las células transformadas de la presente invención son usadas para terapia del virus de inmunodeficiencia. Los métodos actuales de administrar tales células transformadas implican inmunoterapia adoptiva o terapia de transferencia celular. Estos métodos permiten el regreso de las células transformadas del sistema inmune a la corriente sanguínea, Rosenberg, Scientific American 62 (mayo de 1990) ; Rosenberg y colaboradores, The New England Journal of Medicine 323(9) :570 (1990) . Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas a cualquier animal que pueda experimentar los efectos benéficos de los compuestos de la invención. En forma primordial entre tales animales están los seres humanos, aunque la invención no está destinada a ser limitada en este sentido.

Descripción Detallada Primero se describirán los dibujos. Breve Descripción de los Dibujos La figura ÍA presenta la secuencia de aminoácidos alrededor del sitio de fusión entre CD4 (residuos 1-369) y cadenas receptoras diferentes. La secuencia subrayada muestra la posición de los aminoácidos codificados dentro del sitio BamHl usado para construcción de fusión. El inicio del dominio de transmembrana está marcado con una barra vertical. La secuencia eta es idéntica a la secuencia zeta en el término amino, pero diverge en el término carboxilo (Jin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). La figura IB presenta análisis citométrico de flujo de la expresión superficial de CD4 , CD4:zeta, CD4:gama y CD4:eta en células CV1. Las células fueron infectadas con quimeras de CD4 que expresan virus o CD16PI, incubadas por 9 horas a 37°C, y teñidas con MAb Leu3A anti-CD4 conjugado con picoeritrina. La figura 2 muestra la expresión en superficie de CD16™ siguiendo co-infección con CD16TM solo (puntos densos) , o coinfectado con CD4:gama (puntos o CD4:zeta (línea sólida) que expresan el virus. Los puntos difusos, células infectadas con CD4:zeta solas, marcadas con 3G8 (Fleit y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:3275-3279 (1982)) (MAb anti-CD16) . La figura 3 muestra expresión superficial de CDie^ siguiendo co-infección por virus que expresan CD16TM y las siguientes quimeras zeta: CD : zeta (línea gruesa), CD4 : zeta CllG (línea sólida); CD4:zeta (línea punteada); CD4 : zeta C11G/D15G (puntos densos) ; sin co-infección (CD16™ solo, puntos difusos) . Las células fueron incubadas con MAb 3G8 anti-CD16 y anticuerpos de cabra Fab'2 conjugados con picoeritrina a IgG de ratón. El nivel de expresión de las quimeras zeta fue esencialmente idéntico para los diferentes mutantes analizados, y la co-infección de células con virus que expresan CD16™ y quimeras zeta no alteró en forma apreciable la expresión superficial de las quimeras . Las figuras 4A-D muestran ion calcio libre intracelular incrementado que sigue al eslabonamiento transversal de quimeras zeta mutantes en una línea de células T. Se infectaron células Jurkat E6 (Weiss y colaboradores, J. Immunol . 133:123-128 (1984)) con virus de vaccinia recombinante y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados mostrados son para la población CD4+ en compuerta, de modo que solo se analizan las células que expresan la proteína quimérica relevante. La proporción media de la fluorescencia Indo-1 de violeta a azul refleja la concentración de calcio libre intracelular en la población como un todo y el porcentaje de células que responden refleja la fracción de células que exceden una proporción umbral predeterminada (fija de modo que 10% de las células no tratadas sean positivas) . Las figuras 4A y 4B muestran células Jurkat que expresan CD4 : zeta (línea sólida) o CD16:zeta (línea punteada) que se expusieron a MAb Leu3A anti-CD4 (conjugado de picoeritrina) , seguidas por eslabonamiento transversal con anticuerpo de cabra a IgG de ratón. La línea punteada muestra la respuesta de células no infectadas a MAb 0KT3 anti-CD3. Las figuras 4C y 4D muestran células Jurkat que expresan CD4:zetaD15G (línea sólida); CD4 :zetaCHG/D15G (líneas); o CD4:zetaCllG (puntos), que se trataron y analizaron como en las figuras 4A y 4B . Las figuras 5A-C muestran que los receptores CD4:zeta, CD4:eta, y CD4:gama permiten a los linfocitos T citolíticos (CTL) matar objetivos que expresan gpl20/41 de HIV-1. Figura 5A: círculos sólidos, CTL que expresan CD4 : zeta incubados con células HeLa que expresan gpl20/41; círculos abiertos, CTL que expresan CD4:zeta incubados con células HeLa no infectadas; cuadros sólidos, CTL no infectados incubados con células HeLa que expresan gpl20/41; cuadros abiertos, CTL no infectados incubados con células HeLa no infectadas. Figura 5B : círculos sólidos, CTL que expresan CD4:eta incubados con células HeLa que expresan gpl20/41; círculos abiertos, CTL que expresan CD4:gama incubados con células HeLa que expresan gpl20/41; cuadros abiertos, CTL que expresan la quimera CD4:zeta mutante doble C11G/D15G incubados con células HeLa que expresan gpl20/41. Figura 5C: análisis citométrico de flujo de expresión de CD4 por los CTL usados en la figura 5B . Para corregir el objetivo a las proporciones de efecto, se determinó el porcentaje de células que expresan la quimera CD4 sustrayendo la población negativa escalada (no infectada) de la superposición de histograma; para fines de comparación en esta figura, a las células no infectadas se les asignó un umbral arbitrario que da en términos generales la misma fracción positiva para las demás poblaciones celulares que la resta de histograma. Las figuras 6A-B muestran especificidad de citólisis ordenada por CD4. Figura 6A: círculos sólidos, CTL que expresan CD4 : zeta incubados con células HeLa que expresan CD16PI; círculos abiertos, CTL que expresan CD4 incubados con células HeLa que expresan gpl20; cuadros sólidos, CTL que expresan CD16:zeta incubados con células HeLa que expresan gpl20/41; cuadros abiertos, CTL que expresan CD16PI incubados con células HeLa que expresan gpl20/41. Figura 6B : círculos sólidos, CTL que expresan CD4:zeta incubados con células Raj i (MHC clase II+) ; círculos abiertos, células CTL no infectadas, incubadas con células RJ2.2.5 (mutante Raji MHC clase II"); cuadros sólidos, CTL no infectados incubados con células Raji (MHC clase II+) ; cuadros abiertos, CTL que expresan CD4 : zeta incubados con células RJ2.2.5 (MHC clase II") . La escala de las ordenadas está expandida. Las figuras 7A-B muestran caracterización del receptor quimérico CD16:zeta. La figura 7A es un diagrama esquemático de la forma fosfatidilinositol enlazada de CD16 monomérico unido a zeta dimérico justo fuera del dominio de transmembrana. La secuencia de proteína en la unión de fusión es mostrada en la parte inferior. La figura 7B muestra un análisis citométrico de flujo de movilización de calcio después de eslabonamiento transversal de la quimera CD16 : zeta en una línea celular TCR positiva o TCR negativa. Se muestra la proporción media de fluorescencia violeta a azul (una medida de la concentración relativa del ion calcio) entre poblaciones celulares tratadas con anticuerpos en el tiempo 0. Cuadros sólidos, la respuesta de células Jurkat a MAb 0KT3 anti-CD3; triángulos sólidos, la respuesta de CD16:zeta a MAb 3G8 anti-CD16 que eslabona transver-salmente en el mutante REX33A TCR"; cuadros abiertos, la respuesta a eslabonamiento transversal de CD16 : zeta en la línea mutante Jurkat TCR" JRT3.T3.5; triángulos abiertos, la respuesta a eslabonamiento transversal de CD16:zeta en células Jurkat; cruces, la respuesta a CD16 no quimérico en células Jurkat; y puntos, la respuesta a CD16 no quimérico en la línea celular REX33A TCR". Las figuras 8A-B muestran análisis de supresiones del potencial citolítico. La figura 8A muestra las ubicaciones de los puntos finales de la supresión zeta. Aquí como en cualquier otra parte, las mutaciones en zeta son representadas por la convención original residuo-ubicación-mutante, de modo que D66*, por ejemplo, denota reemplazo de Asp-66 por un codón de terminación. La figura 8B muestra los resultados del ensaye de citólisis de CD16:zeta sin supresiones y supresiones zeta salientes. Células de hibridoma que expresan anticuerpo superficial a CD16 fueron cargadas con 51Cr e incubadas con números cada vez mayores de linfocitos citolíticos humanos (CTL) infectados con recombinantes de vaccinia que expresan quimeras CD16:zeta. El porcentaje de 51Cr liberado es graficado como una función de la proporción celular de efecto (CTL) a objetivo (hibridoma) (e/t) . Círculos sólidos, citólisis mediada por células que expresan CD16:zeta (mfi 18.7); cuadros sólidos, citólisis mediada por células que expresan CD16 : zeta Asp66* (mfi 940.2); cuadros abiertos, citólisis mediada por células que expresan CD16 : zetaGlu60* (mfi 16.0) ; círculos abiertos, citólisis mediada por células que expresan CD16 : zetaTyr51* (mfi 17.4); triángulos sólidos, citólisis mediada por células que expresan CD16 : zetaPhe34* (mfi 17.8); y triángulos abiertos, citólisis mediada por células que expresan CD16 no quimérico (mfi 591) . Aunque en este experimento no se igualó la expresión de CD16:ze-taAsp66* con la de otras proteínas de fusión, la citólis.is por células que expresan CD16:zeta a niveles equivalentes en el mismo experimento arrojó resultados esencialmente idénticos a los mostrados por células que expresan CD16 : zetaAsp66. Las figuras 9A-D muestran que la eliminación del potencial de interacciones transmembrana revela un segmento zeta corto capaz de mediar citólisis. La figura 9A es un diagrama esquemático de las quimeras bipartita y tripartita monoméricas. En la parte superior está la construcción CD16 : zeta truncada en el residuo 65 y careciendo de residuos Cys y Asp de transmembrana. Debajo están las construcciones CD16 : CD5 : zeta y CD16:CD7: zeta y controles relacionados. Las secuencias de péptidos de los dominios intracelulares son mostradas abajo. La figura 9B muestra la actividad citolítica de los mutantes de supresión de quimera monoméricos. La actividad citolítica de las células que expresan CD16:zeta (círculos sólidos; mfi 495) fue comparada con la de las células que expresan CD16 : zetaAsp66* (cuadros sólidos; mfi 527) o los mutantes CD16 : zetaCysllGly/Aspl5GLy/Asp66* (cuadros abiertos; mfi 338) y CD16 : zetaCysllGly/Aspl5Gly/Glu60* (triángulos llenos; mfi 259) . La figura 9C muestra la actividad citolítica mediada por proteínas de fusión tripartitas. Triángulos sólidos, CD16 : zetaAsp66* ; cuadrados abiertos, CD16 : 5 :zeta (48-65) ; cuadros sólidos, CD16 : 7 : (48-65) ; triángulos abiertos, CD16 : 7 : zeta (48-59) ; círculos abiertos, CD16:5; círculos sólidos, CD16:7. La figura 9D muestra la movilización de calcio por quimeras mutantes y tripartitas en la línea celular mutante Jurkat JRT3.T3.5 TCr negativa. Círculos abiertos, respuesta de células que expresan CD16 : zetaAsp66* dimérico; cuadros sólidos, respuesta de células que expresan CD16 : zetaCysllGly/Aspl5Gly/-Asp66*; cuadros abiertos, respuesta de células que expresan CD16 : zetaCysllGly/Aspl5Gly/Glu60*; triángulos sólidos, respuesta de células que expresan CD16 : 7 : zeta (48-65) ; y triángulos abiertos, respuesta de células que expresan CD16 : zeta (48-59) . Las figuras 10A-F muestran la contribución de aminoácidos individuales a la actividad del motivo transductor de señal citolítica de 18 residuos. Las figuras 10A y 10B muestran actividad citolítica y la figura 10C muestra la movilización de ion calcio mediada por mutaciones de punto portador de quimeras cerca de la tirosina carboxilo-terminal (Y62) . Las figuras 10A y 10B representan datos recolectados sobre células que expresan cantidades bajas y elevadas, respectivamente, de las proteínas de fusión CD16:zeta. Se usan símbolos idénticos para los ensayes de movilización de calcio y citólisis, y se muestran en un código de una leta a la derecha. Círculos sólidos, células que expresan CD16:zeta (mfi en A, 21; B, 376); cuadros sólidos, células que expresan CD16 :7 : zeta (48-65) (mfi A, 31; B, 82); cuadros abiertos, CD16 :7:zeta(48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92), cruces, CD16:7:ze-ta(48-65) Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); triángulos sólidos, CD16 :7 : zeta (48-65) Try62Phe (mfi A, 24; B, 88); círculos abiertos, CD16:7:zeta(48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62); y triángulos abiertos, CD16 : 7 : zeta (48-65) yr62Ser (mfi B, 64). Las figuras 10D y 10E muestran actividad citolítica y la figura 10F muestra movilización del ion calcio por quimeras portadoras de mutaciones puntuales cerca de la tirosina amino terminal (Y51) . Se usan símbolos idénticos para ensayes de movilización de calcio y de citólisis y se muestran a la derecha. Círculos sólidos, células que expresan Cdl6:zeta (mfi en D, 21.2; en E, 672); cuadros sólidos, células que expresan CD16 : 7 : zeta (48-65) (mfi en D, 31.3; E, 179); triángulos sólidos, CD16 : 7 : zeta (48-65)Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); cuadros abiertos, CD16 : 7 : zeta (48-65) Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); y triángulos abiertos , CD16 : 7 : zeta (48-65) TrySl-Phe (mfi D, 32.3; E, 294) . Las figuras 11A-B muestran la alineación de repeticio-nes internas de zeta y la comparación de su capacidad para sostener citólisis. La figura HA es un diagrama esquemático de quimeras formadas dividiendo el dominio intracelular zeta en tercios y unirlos al dominio de transmembrana de una quimera CD16:7. Las secuencias de los dominios intracelulares son mostradas abajo, con los residuos compartidos en un cuadro, y los residuos relacionados denotados por asteriscos. La figura 11B muestra la potencia citolítica de los tres sub-dominios zeta. Círculos sólidos, células que expresan CD16:zeta (mfi, 476); cuadros sólidos, CD16 : 7 : zeta (33-65) (mfi, 68); cuadros abiertos, CD16 :7:zeta(71-104) (mfi, 114); y triángulos sólidos, CD16:7:ze-ta(104-138) (mfi, 104) . La figura 12 es un diagrama esquemático de las quimeras CD16 :FcRgamaII . Las figuras 13A-B muestran movilización de calcio después de eslabonamiento transversal de quimeras CD4 :FcRgamaII y CD16 :FcRgamaII . La figura 13A muestra la proporción de fluorescencia violeta a azul emitida por células cargadas con Indo-1 fluorofora sensible a calcio mostrada como una función del tiempo después de eslabonamiento transversal del dominio extracelular CD16 con anticuerpos. La figura 13B muestra un análisis similar del incremento en la proporción de fluorescencia violeta a azul de células que llevan quimeras CD4 :FcRgamaII, después de eslabonamiento transversal con anticuerpos. Las figuras 14A-B muestran ensayes de citólisis de quimeras CD4 : FcRgamalI y CD16 : FcRgamalI . La figura 14A muestra el porcentaje de 51Cr liberado de células de hibridoma anti-CD16 (objetivo) cuando las células están expuestas a números cada vez mayores de linfocitos T citotóxicos que expresan quimeras CD16 :FcRgamaII (células de efecto). La figura 14B muestra un análisis similar de citotoxicidad mediada por quimeras CD4:FcRga-malí contra células objetivo que expresan glicoproteínas de envolvente de HIV. Las figuras 15A-E muestran la identificación de residuos en la cola FcRgamalI A que son importantes para la citólisis. La figura 15A es un diagrama esquemático de las construcciones de supresión. Las figuras 15B y 15C muestran movilización de calcio y citólisis por variantes de CD16:FcRga-mall A de supresión carboxi terminal. Las figuras 15D y 15E muestran movilización de calcio y citólisis por quimeras tripartitas que llevan progresivamente menos del término amino de la cola intracelular de CD16 : FcRgamalI A. La figura 16 (SEQ. ID. NO: 24) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora CD3 delta; la secuencia en un cuadro representa una porción transductora de señal citolítica preferida. La figura 17 (SEQ. ID. NO: 25) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora gama T3 ; la secuencia en un cuadro representa una porción transductora de señal citolítica preferida. La figura 18 (SEQ. ID. NO: 26) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora mbl; la secuencia en un cuadro representa una porción transductora de señal citolítica preferida. La figura 19 (SEQ. ID. NO: 27) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora B29; la secuencia en un cuadro representa una porción transductora de señal citolítica preferida. Las figuras 20A-E muestran un diagrama esquemático de las quimeras CD4. La molécula "A" es CD4 (D1-D4) : Ig : CD7 ; la molécula "B" es CD4 (DI, D2) : Ig:CD7; la molécula "C" es CD4 (Dl-D4) :Ig:CD7:zeta; la molécula "D" es CD4(D1,D2) : Ig:CD7 : zeta; y la molécula "E" es CD4:zeta. El dominio extracelular de la molécula CD4 humana correspondiente a los aminoácidos 1-394 del precursor fue unido a un sitio BamHl a la articulación, CH1 , y los dominios CH2 de IgGl humana como se ha descrito previamente (Zettlmeissl y colaboradores, DNA Cell Biol. 9:347 (1990)), salvo que se usó una versío de ADNc de las secuencias de Ig humana para permitir la expresión en recombinantes del virus vaccinia. La versión de dos dominios de las quimeras CD4 fue creada por inserción de un adaptador BamHl en el sitio Nhel único (correspondiente al aminoácido 200) en el ADNc precursor de CD4. Las secuencias de unión de membrana consistieron en 22 residuos del primer exón de IgGl humana ligada a membrana, seguidos por los residuos 146-203 de CD7. Los aminoácidos 55 a 163 de zeta sirvieron como el motivo de disparo de las construcciones tetrapartitas (C y D) .

En las construcciones tetrapartitas que contienen la cadena zeta, se documentó la expresión intracelular de zeta con un anticuerpo disponible comercialmente contra el dominio intracelular (Coulter) . La figura 21 muestra citólisis de células objetivo que expresan la glicoproteína de envolvente de HIV-1 mediada por la clona de célula T citotóxica, WH3 , expresando diversas quimeras derivadas de CD4 como moléculas de efecto. Para ensayes de citotoxicidad, se mantuvo la línea celular T restringida CD8+ CD4" HLA B44, humana, WH3 , en IMDM complementado con 10% de suero humano, como se describió previamente en la presente. Las células fueron estimuladas con células mononucleares portadoras de B44 gama-irradiadas (3000rad) y fitohemaglutinina (PHA) a 1 µg/ml . Después de un día de estimulación, se diluyó la PHA a 0.5 µg/ml por adición de medio fresco; después de tres días, el medio fue cambiado por completo. Se cultivaron células por al menos 10 días antes de uso en ensayes de citotoxicidad. Las células fueron infectadas con virus vaccinia recombinantes apropiados, como se describe en la presente para vPE16. Se permitió que prosiguieran las infecciones por 3-4 horas adicionales en medio completo, después de lo cual se cosecharon las células por centrifugación y se re-suspendieron a una densidad de 1 x 107/ml. Se añadieron 100 µl a cada cavidad de una placa de microtítulo de fondo de U conteniendo 100 µl por cavidad de medio completo y se diluyeron en pasos seriales dos veces. Dos cavidades de cada muestra no contenían linfocitos, para permitir la liberación espontánea de cromo y toma total de cromo por medirse. Las células objetivo, la sublínea HeLa S3 (HeLa-S3, ATCC) fueron infectadas como se describió anteriormente en platos de 10 cm con vPE16. Se desprendieron 106 células infectadas con PBS y EDTA lmM, se centrifugaron y re-suspendieron en 100 µl de cromato de sodio 51Cr (1 mCi/ml en PBS) por una hora a 37 °C y luego se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron a cada cavidad 100 µl de células objetivo marcadas. La placa de microtítulo fue hecha girar a 750 x g por un minuto e incubada por 4 horas a 37 °C. Al final del período de incubación, las células en cada cavidad fueron re-suspendidas por manipulación por pipeta suave, una muestra removida para determinar las cuentas totales incorporadas y la placa de microtítulo fue hecha girar a 750 x g por un minuto. Se removieron alícuotas (100 µl) del sobrenadante y se contaron en un contador de centelleo de rayos gama. La proporción de efecto : objetivo fue corregida por el porcentaje de células infectadas, según medida por citometría de flujo. La figura 22 muestra replicación de HIV-1 en líneas celulares transfectantes . Las líneas celulares que expresan en forma estable CD4 tipo salvaje y diversas quimeras recombinantes fueron establecidas en una sub-línea de la línea celular 293 de riñon embrional humano. Un material de virus del aislado HIV-1 IIIB fue preparado con un título de aproximadamente 106 partícu-las infecciosas/ml, medida por análisis de dilución de punto final usando la línea celular T humana C8166 como un indicador. Se llevaron a cabo infecciones a un MOI aproximado de 1 por un período de 8-12 horas a 37°C. El día siguiente, las células fueron lavadas por PBS tres veces, se tripsinizaron, se volvieron a colocar en nuevos platos y el sobrenadante del cultivo fue muestreado para título p24 (designado día 0) . Posteriormente, a intervalos de 3-4 días, los sobrenadantes de cultivo celular fueron recolectados y retenidos para análisis p24. Las células fueron vueltas a suministrar con medio fresco conteniendo higromicina B a una concentración de 100 µg/ml. El análisis de los sobrenadantes de cultivo fue llevado a cabo usando un kit de ensaye de antígeno p24 de HIV-1, basado en ELISA, comercial (Coulter) de acuerdo con las instrucciones suministradas por el fabricante. Los resultados son representativos de dos experimen-tos independientes de duración similar. La figura 23 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos de los dominios D1-D4 de CD4 (CD4 Bam) . La figura 24 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos de los dominios D1-D2 de CD4 (CD4 NHe) . La figura 25 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos de los dominios de articulación, CH2 y CH3 de IgGl humana (Igh23 Bam) . La figura 26 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio de transmembrana de CD7 (TM7 Bam Mlu) . La figura 27 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos del dominio intracelular de zeta (zeta Mlu Not) . La figura 28 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos primarios de una hélice alfa sintética. Ejemplo I Construcción de Quimeras I Gl :Receptor Humanas Se prepararon secuencias de cadena pesada IgGl humana uniendo secuencias en el dominio CH3 con un fragmento de ADNc derivado* del extremo 3' de la forma de transmembrana del ARNm de anticuerpo. El fragmento de extremo 3' fue obtenido por reacción de cadena de polimerasa usando una biblioteca de ADNc de anginas como sustrato, y oligonucleótidos teniendo las secuencias: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ. ID. NO: 7) y CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ. ID. NO: 8), correspondientes a los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN deseados, respectivamente. El 5' oligo es complementario a un sitio en el dominio CH1 de IgGl humana, y el 3' oligo es complementario a un sitio justo 5' de las secuencias que codifican el dominio que abarca la membrana. El producto de PCR fue digerido con BstXI y BamHl y ligado entre sitios BstXI y BamHl de un gene de anticuerpo IgGl semi-sintético portador de regiones variable y constante. Siguiendo la inserción de BstXI al fragmento BamHl, las porciones amplificadas de la construcción fueron reemplazadas hasta el sitio Smal en CH3 por intercambio del fragmento de restricción, de modo que únicamente la porción entre el sitio Smal y el 3' oligo fue derivada de la reacción PCR. Para crear un receptor quimérico IgGl:zeta, el gene de cadena pesada que termina en un sitio BamHl fue unido al sitio BamHl de la quimera zeta descrita mas adelante, de modo que secuencias de anticuerpos formaran la porción extracelular.

Citometría de flujo de células COS transfectadas con un plásmido que codifica la quimera mostró un elevado nivel de expresión de determinantes de anticuerpos cuando un plásmido de expresión que codifica un ADNc de cadena ligera estaba co-transfectado, y expresión modesta de determinantes de anticuerpos cuando el plásmido de expresión de cadena ligera estuvo ausente. Pueden construirse generalmente como se describió anteriormente, usando técnicas convencionales de la biología molecular, quimeras similares incluyendo IgGl humana fusionada a eta o gama (ver mas adelante) , o cualquier porción transductora de señal de un proteína de receptor de células T o proteína de receptor Fe. Para crear una sola unidad de transcripción que permita expresar cadenas tanto pesadas como ligeras a partir de un solo promotor, se creó un plásmido que codifica un ARNm bicistrónico a partir de secuencias de codificación de cadena pesada y ligera, y la porción 5' no traducida de ARNm que codifica la proteína regulada por glucosa de 78 kD, conocida de otra forma como grp78 o BiP. Se obtuvieron por PCR secuencias de grp78 de ADN genómico humano usando materiales primordiales teniendo las secuencias: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ. ID. NO: 9) y CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ. ID. NO: 10) en los extremos 5' y 3', respectivamente. Reacciones de cadena de polimerasa con estos oligos fueron llevadas a cabo en presencia de 10% de sulfóxido de dimetilo. El fragmento obtenido por PCR fue digerido con Notl y HincII e insertado entre sitios Notl y Hpal corriente abajo de secuencias de codificación de IgGl humana. Las secuencias que codifican un ADNc de cadena ligera IgG kapa humana fueron insertadas corriente abajo del líder grp78, usando el sitio HincII y otro sitio en el vector. El plásmido de expresión que es resultado de estas manipulaciones consistió en el gene semi-sintético de cadena pesada, seguido por secuencias de líder grp78, seguidas por las secuencias de ADNc de ---> cadena ligera kapa, seguidas por señales de poliadenilación derivadas de un fragmento de ADN SV40. Las transfección de las células COS con el plásmido de expresión dio expresión marcadamente mejorada de determinantes de cadena pesada, en comparación con transfección de determinantes de cadena pesada que codifican el plásmido solos. Para crear un gene bicistrónico que comprende una quimera de cadena pesada/receptor y una cadena ligera, las secuencias de cadena pesada corriente arriba pueden ser reemplazadas por cualquier gene quimérico de cadena pesada/receptor descrito en la presente. Ejemplo II Construcción de Quimeras de Receptor CD4 ADNc de zeta humana (Weissman y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)) y gama (Küster y colaboradores, J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990)) fueron aislados por reacción de cadena de polimerasa a partir de bibliotecas preparadas de la línea celular de tumor HPB-ALL (Aruffo y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987)) y de células asesinas humanas naturales, mientras que se aisló ADNc de eta (Jin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA_87: 3319-3323 (1990)) a partir de una biblioteca de ti ocitos de murino. ADNc de zeta, eta y gama fueron unidos al dominio extracelular de una forma artificial de CD4 poseyendo un sitio BamHl justo corriente arriba del dominio que abarca la membrana (Aruffo y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987) ; Zettlmeissl y colaboradores, DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990) ) , unido al sitio BamHl naturalmente presente en los ADNc de zeta y eta en una ubicación similar unos cuantos residuos corriente arriba del dominio que abarca la membrana (SEQ. ID. NOS: 1, 3, 4 y 6) . Para formar la proteína de fusión con gama, se manipuló un sitio BamHl en la secuencia en la misma ubicación aproximada (figura 1; SEQ. ID. NOS: 2 y 5) . Las fusiones de gene fueron introducidas en un plásmido de expresión del virus vaccinia portando el gene gpt de E. coli como un marcador seleccionable, e insertado en el genoma de la cepa WR de vaccinia por recombinación homologa y selección para cultivo en ácido micofenólico (Falkner y colaboradores, J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Boyle y colaboradores, Gene 65:123-128 (1988)). El análisis citométrico de flujo mostró que los recombinantes de vaccinia ordenan la abundante producción de proteínas de fusión CD4 : zeta y CD4:gama en la superficie celular, mientras que la /-_, expresión de CD4:eta es sustancialmente mas débil (figura IB). Este último descubrimiento es congruente con un reporte reciente en el sentido de que la transfección de un plásmido de expresión de ADNc de eta en una línea celular de hibridoma de murino dio sustancialmente menos expresión que transfección de un plásmido de expresión zeta comparable (Clayton y colaboradores, J . Exp . Med. 172:1243-1253 (1990)). La inmunoprecipitación de células infectadas con los recombinantes de vaccinia reveló que las proteínas de fusión forman dímeros covalentes, a diferencia del antígeno CD4 natural. Las masas moleculares de las proteínas de fusión CD4:zeta y CD4:gama monoméricas y CD4 nativo se encontraron ser de 63, 55 y 53 kD, respectivamente. Las mayores masas de las proteínas de fusión son aproximadamente consistentes con la mayor longitud de la porción intracelular, la cual excede la de CD4 nativo por 75 residuos (CD4:zeta) o 5 residuos (CD4:gama) . Ejemplo III ,__, Quimeras de CD4 Pueden Asociarse con Otras Cadenas Receptoras La expresión en la superficie celular de la forma de célula asesina natural/macrófago de FCgamaRIII humana (CD16TM) en transfectantes es facilitada por co-transfección con gama de murino (Kurosaki y colaboradores, Nature 342:805-807 (1989)) o humana (Hibbs y colaboradores, Science 246:1608-1611 (1989)), así como zeta humana (Lanier y colaboradores, Nature 342:803-805 (1989) ) . En congruencia con estos reportes, la expresión de las quimeras también permitió la experesión superficial de CD16™ cuando se entrega a la célula objetivo ya sea por co-transfección o por co-infección con virus vaccinia recombinantes (figura 2) . La promoción de la expresión superficial de 0016™ por zeta fue mas pronunciada que la promoción por gama (figura 2) en las líneas celulares examinadas, mientras que CD4 nativo no mejoró la expresión en superficie de CD16TM. Ej emplo IV Los Mutantes Asp Zeta No Se Co-Asocian con el Receptor Fe Para crear quimeras que no se asociarían con antígeno o receptores Fe existentes, se prepararon proteínas de fusión gama mutantes que carecían del residuo Asp intramembranoso o Cys intramembranoso o ambos. La citometría de flujo mostró que la intensidad de la expresión en superficie celular por las diferentes quimeras mutantes no fue diferente en forma apreciable del precursor no mutado, y los experimentos de inmunoprecipitación mostraron que la expresión total por las quimeras era similar. Como se esperaba, las quimeras mutantes que carecían del residuo cisteína de transmembrana no formaron dímeros disulfuro enlazados. Las dos quimeras mutantes que carecían de Asp eran incapaces de sostener la expresión superficial de CD16™, mientras que las quimeras monoméricas que carecían de Cys pero portadoras de Asp permitieron que se co-expresara CD16™, pero a una menor eficiencia que el dímero parental (figura 3) . Ejemplo V Los Receptores Mutantes Retienen la Capacidad de Iniciar una Respuesta de Calcio Para determinar si el eslabonamiento transversal de las proteínas de fusión permitiría la acumulación de calcio intrace-lular libre en una forma similar a la que se sabe que ocurre con el receptor de antígeno de células T, se infectaron células de la línea de leucemina celular T humana, Jurkat E6 (ATCC número de acceso TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos) , con recombinantes de vaccinia y la concentración de calcio citoplásmico relativo siguiendo el eslabonamiento transversal del dominio extracelular con anticuerpos fue medida. Se llevaron a cabo mediciones citométricas de flujo con células cargadas con la tintura sensible al calcio Indo-1 (Grynkiewicz y colaboradores, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch y colaboradores, J. Immunol . 137:952-961 (1986) ) . Las figuras 4A-D muestran los resultados de experimentos de flujo de calcio con células infectadas con CD4 : zeta y los mutantes Asp" y Cys" de zeta. El eslabonamiento transversal de las quimeras incrementó de manera reproducible el calcio intracelular. CD4 : zeta y CD4:gama similarmente permitieron la acumulación de calcio intracelular en células infectadas. Las células Jurkat expresan bajos niveles de CD4 en la superficie celular; sin embargo, el eslabonamiento transversal de CD4 nativo en presencia o ausencia de CD16:zeta no altera los niveles de calcio intracelular (figuras 4A-B) .

Ejemplo VI Citólisis Mediada por Quimeras CD4:zeta, eta v gama de Objetivos aue Expresan qpl20/41 HIV Para determinar si los receptores quiméricos dispara-rían los programas de efecto citolítico, se creó un sistema modelo objetivo: efecto basado en el reconocimiento CD4 del complejo gpl20/gp41 del envolvente de HIV. Se infectaron células HeLa con virus vaccinia recombinantes expresando gpl20/gp41 (Chakrabarti y colaboradores, Nature 320:535-537 (1986); Earl y colaboradores, J. Virol. 64:2448-2451 (1990)) y se marcaron con 51Cr. Las células marcadas fueron incubadas con células de una línea de linfocitos T citotóxicos humanos, aloespecíficos (CD8+, CD4") que habían sido infectadas con recombinantes de vaccinia que expresan las quimeras CD4:zeta, CD4:eta, o CD4:gama, o la quimera mutante CD4 : zetaCysllGly :Aspl5Gly doble. Las figuras 5A-C muestran que células HeLa que expresan gpl20/41 fueron lisadas específicamente por linfocitos T citotóxicos (CTL) que expresan quimeras CD4. Células HeLa no infectadas no fueron objetivo de CTL armados con quimeras CD4:zeta, y células HeLa que expresan gpl20/41 no fueron reconocidas por CTL no infectados. Para comparar la eficacia de las diversas quimeras, las proporciones de efecto a objetivo fueron corregidas por la fracción de CTL que expresan quimeras CD4, y por la fracción de células HeLa que expresan gpl20/41, medidas por citometría de flujo. La figura 5C muestra un análisis citométrico de expresión de CD4 por CTL usado en el experimento de citólisis mostrado en las figuras 5A y 5B. Aunque la densidad media de CD4 : zeta superficial excedió en gran medida la densidad media de CD4:eta, las eficiencias citolíticas de las células que se expresan en cualquiera de estas formas fueron similares. Después de corrección por la fracción de objetivos que expresan gpl20, la eficiencia de citólisis mediada por proteínas CD4 : zeta y CD4:eta, es comparable con las mejores eficiencias reportadas para pares específicos de objetivo : efecto , -- de receptor de células T (la proporción media de efecto a objetivo para 50% de liberación por células T que expresan CD4 : zeta fue de 1.9 ± 0.99, n=10) . La fusión CD4:gama fue menos activa, como lo fue la fusión CD4:zeta careciendo de los residuos Asp y Cys de transmembrana. Sin embargo, en ambos casos, se observó citólisis significativa (figuras 5B-C) . Para controlar la posibilidad de que la infección por vaccinia promoviera reconocimiento artefáctico por CTL, se llevaron a cabo experimentos similares de citólisis con células objetivo infectadas con recombinantes vaccinia que expresan la forma fosfatidilinositol enlazada de CD16 (CD16PI) y marcadas con 51Cr, y con CTL infectados con recombinantes de control que expresan ya sea CD16PI o CD16:zeta. La figura 6A muestra que las células T que expresan quimeras no CD4 no reconocen células HeLa nativas o células HeLa que expresan gpl20/41, y similarmente que células T que expresan quimeras CD4 no reconocen células HeLa que expresan otras proteínas de superficie codificadas por vaccinia.

Además, CTL que expresan CD4 quimérico no lisan significativamente células HeLa que expresan gpl20/41 (figura 6A) . Ejemplo VII Células Portadoras de MHC Clase II No Son Objetivadas por las Quimeras Se piensa que CD4 interactúa con una secuencia no polimórfica expresada por antígeno MHC clase II (Gay y colaboradores, Nature 328:626-629 (1987); Sleckman y colaboradores, Nature 328:351-353 (1987)) . Aunque nunca se ha documentado una interacción específica entre CD4 y antígeno clase II con proteínas purificadas, bajo ciertas condiciones la adhesión entre células que expresan CD4 y células que expresan moléculas clase II puede ser demostrada (Doyle y colaboradores, Nature 330:256-259 (1987); Clayton y colaboradores, J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990); Lamarre y colaboradores, Science 245:743-746 (1989)). Después se examinó si la mortandad podía ser detectada contra células portadoras clase II. La figura 6B muestra que no hay citólisis específica ordenada por CD4 : zeta contra la línea celular Raji B, la cual expresa antígeno clase II abundante. Aunque se observa una citólisis modesta (alrededor del 5%) , un mutante clase II negativo de Raji, RJ2.2.5 (Accolla, J . Ex . Med . 157 : 1053-1058 (1983)) muestra una susceptibilidad similar, como lo hacen células Raji incubadas con células T no infectadas. Ejemplo VIII Requerimientos de Secuencia para Inducción de Citólisis por la Cadena Zeta de Antíqeno de Células T/Receptor Fe Aunque quimeras entre CD4 y zeta pueden armar linfocitos T citotóxicos (CTL) para matar células objetivo que expresan gpl20 de HIV, se buso una alternativa a CD4 a fin de comparar de forma no ambigua las propiedades de quimeras zeta introducidas en líneas de células T humanas. Tales líneas pueden expresar CD4 , haciendo difícil definir específicamente la relación entre el tipo o grado de movilización de calcio y el potencial citotóxico de las diferentes quimeras. Para darle la vuelta a esta situación, se crearon quimeras entre zeta y CD16 en las cuales el dominio extracelular de CD16 está unido a las secuencias de transmembrana e intracelular de zeta (figura 7A) . Se introdujeron fusiones de genes en un plásmido de expresión del virus vaccinia portador del gene gpt de E. coli como un marcador seleccionable e insertado en el genoma de la cepa WR de vaccinia por recombinación homologa y selección para cultivo en ácido micofenólico (Falkner y Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle y Coupar, Gene 65:123 (1988)). Se infectaron líneas de células T con los recombinantes de vaccinia y se midió la concentración relativa del ion calcio citoplásmico libre siguiendo el eslabonamiento transversal de los dominios extracelulares con anticuerpos. Se llevaron a cabo mediciones tanto espectrofluorimétricas (población a granel) y citométricas de flujo (una sola célula) con células cargadas con la tintura Indo-1 (Grynkiewicz y colaboradores, J. Biol. Chem. 260 :3440 (1985); Rabinovitch y colaboradores , J. Immunol . 137:952 (1986) ) . La figura 7B muestra un análisis de datos recolectados de las células de la línea de leucemina humana de células Jurkat T infectadas con recombinantes de vaccinia que expresan la proteína de fusión CD16:zeta. El eslabonamiento transversal de las quimeras incrementó en forma reproducible el calcio intracelular, mientras que tratamiento similar de células que expresan CD16 no quimérica tuvo poco o ningún efecto. Cuando la quimera fue expresada en líneas celulares mutantes que carecen del receptor antigénico, se observó ya sea REX33A (Breitmeyer y colaboradores, J. Immunol . 138:726 (1987); Sancho y colaboradores, J. Biol. Chem. 264:20760 (1989)), o mutante Jurkat JRT3. T3.5 (Weiss y colaboradores, J. Immunol . 135:123 (1984)); o una respuesta fuerte a eslabonamiento transversal de anticuerpos CD16. Se han recolectado datos similares sobre la línea celular mutante REX20A (Breitmeyer y colaboradores, supra , 1987; Blumberg y colaboradores, J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)), y se estableció en este laboratorio un mutante CD3/TÍ negativo de la línea celular Jurkat . La infección con recombinantes que expresan CD16:zeta no restauró la respuesta a anticuerpos anti-CD3, mostrando que la proteína de fusión no actúo resctando las cadenas de complejo intracelular CD3. Para evaluar la capacidad de las quimeras para re-ordenar inmunidad mediada por células, CTL fueron infectados con recombinantes de vaccinia que expresan quimeras CD16 y usados para lisar específicamente células de hibridoma que expresan anticuerpos anti-CD16 ligados a membrana. Este ensaye es una extensión de un ensaye de citotoxicidad de hibridoma originalmente desarrollado para analizar los mecanismos de efecto de células portadoras de receptores Fe (Graziano y Fanger, J. Immunol . 138:945 (1987); Graziano y Fanger, J. Immunol . 139:35-36 (1987); Shen y colaboradores, Mol Immunol . 26:959 (1989); Fanger y colaboradores, Immunol . Today 10:92 (1989)). La figura 8B muestra que la expresión de CD16:zeta en linfocitos T citotóxicos permite a los CTL armados matar células de hibridoma 3G8 (anti-CD16; Fleit y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:3275 (1982)), mientras que CTL que expresan la forma de CD16 fosfati-dilinositol enlazada son inactivas. CTL armados con CD16:zeta tampoco matan células de hibridoma que expresan un anticuerpo irrelevante. Para identificar las secuencias zeta mínimas necesarias para citólisis, se preparó una serie de mutantes de supresión en los cuales se removió sucesivamente mas del dominio intracelular zeta del término carboxilo (figura 8A) . La mayor parte del dominio intracelular de zeta puede ser retirado con pocas consecuencias para el potencial citolítico; la quimera CD16:zeta de longitud completa fue esencialmente igual en eficacia a la quimera suprimida al residuo 65, CD16 : zetaAsp66* (figura 8B) . Una reducción sustancial en citotoxicidad fue observada en la supresión al residuo 59 de zeta (quimera CD16 : zetaGlu60*) , y supresión adicional al residuo 50 dio como resultado ligeramente menos actividad. Sin embargo, no ser observó pérdida completa de actividad incluso cuando el dominio intracelular fue reducido a un ancla de transmembrana de tres residuos (figura 8B) . Debido a que zeta es un dímero disulfuro enlazado, una explicación de la retención de la actividad citolítica fue que zeta endógeno estaba formando heterodímeros con la supresión zeta quimérica, con ello reconstituyendo la actividad. Para probar esta idea, los residuos zeta 11 y 15 fueron cambiados de Asp y Cys respectivamente a Gly (CysllGly/Aspl5Gly) , y se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones como sigue. Aproximadamente 2 x 106 células CV1 fueron infectadas por una hora en medio DME libre de sueron con vaccinia recombinante a una multiplicidad de infección (moi) de al menos diez. Seis a ocho horas después de la infección, las células fueron desprendidas de las placas con PBS/lmM EDTA y marcadas en superficie con 0.2 mCi de 125I por 2 x 106 células usando lactoperoxidasa y H202 por el método de Clarky Einfeld {Leukocyte Typing II, pp. 155-167, Springer-Verlag, Nueva York, 1986) . Las células marcadas fueron recolectadas por centrifugación y lisadas en 1% NP-40, 0.1% SDS, 015M NaCl , 0.05M Tris, pH 8.0, 5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.2M yodoacetamida y lmM PMSF.

Se removieron núcleos por centrifugación, y se inmunoprecipitaron proteínas CD16 con anticuerpo 3G8 (Fleit y colaboradores, supra (1982) ; Medarex) y agarosa IgG anti-ratón (Cappel, Durham, Carolina del Norte) . Se sometieron muestras a electroforesis a través de 8% de poliacrilamida/gel SDS bajo condiciones no reductoras o a través de 10% de gel bajo condiciones reductoras. Estas inmunoprecipitaciones confirmaron que la quimera CD16:ze-taCysllGly/Aspl5Gly no se asoció en estructuras de dímero disulfuro enlazado. La actividad citolítica de los receptores mutantes fue también probada. La quimera mutada suprimida al rediduo 65 (CD16 :zetaCysllGly/Aspl5Gly/Asp66*) , dependiendo de las condiciones del ensaye, era de dos a ocho veces menos activa en el ensaye de citólisis que la quimera no mutada comparable (CD16:ze-taAsp66*) , que habitualmente está dentro de un factor de dos de, indistinguible en actividad de, CD16 : zeta (figura 9B) . La reducción en actividad de las quimeras mutantes es comparable a la reducción observada con quimeras CD4 de estructura similar (ver anteriormente) y es mas factiblemente atribuible a la menor eficiencia de los monómeros zeta en comparación con los dímeros . En contraste, la quimera mutada Asp", Cys", cortada al residuo 59, no tenía actividad citolítica (figura 9B) , soportando la hipótesis de que la asociación con otras cadenas mediadas por los residuos Cys y/o Asp de transmembrana era responsable por la débil persistencia de la actividad citolítica en supresiones mas amino terminales que el residuo 65. Estudios citométricos de flujo mostraron que los mutantes cortados careciendo de residuos Asp y Cys de transmem-brana pueden todavía promover un incremento en ion calcio intracelular libre en respuesta a eslabonamiento transversal de anticuerpos en una línea celular Jurkat mutante TCR" (figura 9D) . Resultados similares fueron obtenidos para las quimeras expresadas en la línea Jurkat parental. En el caso de CD16 : zetaCysll-Gly/Aspl5Gly/Gly60*, estos datos demuestran que la capacidad de mediar capacidad de respuesta al calcio puede separarse en forma de mutación de la capacidad para soportar la citólisis. Para eliminar definitivamente la posible contribución de los residuos de transmembrana zeta, la transmembrana y los primeros 17 residuos citoplásmicos de zeta fueron reemplazados por secuencias que codifican la membrana abarcando los primeros 14 o 17 residuos citoplásmicos de los antígenos CD5 o CD7, respectivamente (figura 9A) . Las proteínas de fusión tripartitas resultantes CD16 : 5 : zeta (48-65) y CD16 : 7 : zeta (48-65) no formaron dímeros disulfuro enlazados como lo hicieron las quimeras CD16:zeta mas simples, debido a que carecían del residuo cisteína en el dominio de transmembrana zeta. Ambas quimeras tripartitas fueron capaces de movilizar calcio en líneas celulares Jurkat y TCR negativas (figura 9D) y montar una respuesta citolítica en CTL (figura 9C y datos no mostrados) . Sin embargo, el corte de la porción zeta al residuo 59 en la quimera CD16:7:zeta (48-59) abroga la capacidad de fusión tripartita para ordenar respuesta al calcio en células Jurkat TCR positivas o negativas o citólisis en CTL maduros (figuras 9C y 9D y datos no mostrados) . Para examinar las contribuciones de residuos individua-les dentro del motivo de 18 residuos, se prepararon diversas variantes mutantes por mutagénesis ordenada por sitio, y se evaluó su capacidad para mediar muerte ordenada por receptor bajo condiciones de baja (figuras 10A y 10D) o alta (figuras 10B y 10E) expresión de receptor quimérico. Las figuras 10A-F muestran que aunque varias sustituciones relativamente conservadoras (es decir, que reemplazan residuos ácidos con sus amidas relativas, o tirosina con fenilalanina) que abarcaron los residuos 59 a 63 dieron un compromiso moderado de eficacia citolítica, en general los variantes conservaron la capacidad para movilizar calcio. Sin embargo, colectivamente estos residuos comprenden un sub-motivo importante en tanto a que su supresión elimina la actividad citolítica. La conversión de Tyr 62 a Phe o Ser eliminó tanto la respuesta citotóxica como la respuesta al calcio. En el término amino del segmento de 18 residuos, el reemplazo de Tyr 51 con Phe abolió la movilización de calcio y la actividad citolítica, mientras que la sustitución de Leu con Ser en la posición 50 eliminó la respuesta a calcio mientras que solo afectó parcialmente la citólisis. Sin quedar limitados a una hipótesis en particular, se sospecha que la incapacidad del mutante Leu50Ser a movilizar calcio en ensayes citométricos de flujo de corto plazo no refleja en forma plena su capacidad de mediar un incremento sustancial en el ion calcio intracelular libre durante el lapso de mayor tiempo del ensaye de citólisis. Sin embargo, se ha reportado actividad citolítica insensible al calcio para algunas líneas celulares T citolíticas, y la posibilidad de un fenómeno similar subyace en resultados descritos en la presente, el cual no se descarta. El reemplazo de Asn48 con Ser afectó parcialmente la citotoxicidad en algunos experimentos mientras que tuvo poco efecto en otros. Para investigar el papel potencial de los elementos de secuencia redundantes, el dominio intracelular de zeta fue dividido en tres segmentos, abarcando los residuos 33 a 65, 71 a 104 y 104 a 138. Cada uno de estos segmentos fue unido a una quimera CD16:CD7 por medio de un sitio Mlul introducido justo distante a las secuencias básicas que anclan a membrana del dominio intracelular de CD7 (ver mas adelante, figura HA) . La comparación de la eficacia citolítica de los tres elementos demostró que eran esencialmente equipotentes (figura 11B) . La comparación de secuencias (figura HA) muestra que el segundo motivo lleva once residuos entre tirosinas, mientras que los motivos primero y tercero llevan diez. Aunque no se ha realizado una cuenta precisa del proceso de activación de células T, es claro que la agregación del receptor antigénico, o de las quimeras receptoras que llevan secuencias intracelulares zeta, dispara movilización de calcio, liberación de citoquina y granulos, y la aparición de marcadores en la superficie celular de activación. El sitio activo de zeta, una secuencia de péptidos lineal, corta, probablemente demasiado pequeña para tener actividad enzimática inherente, factiblemente interactúa con una o cuando mas unas cuantas proteínas para mediar la activación celular. No es claro que la movilización de calcio libre no sea por ella misma suficiente para la activación celular, pues la capacidad de mediar citólisis puede ser separada mutacionalmente de la capacidad para mediar acumulación de calcio . Como se muestra en la presente, la adición de 18 residuos del dominio intracelular de zeta a la transmembrana y del dominio intracelular de dos proteínas no relacionadas permite que las quimeras resultantes reordenen la actividad citolítica contra células objetivo que se ligan a la porción extracelular de las proteínas de fusión. Aunque quimeras que llevan el motivo de 18 residuos son aproximadamente ocho veces menos activas que quimeras basadas en zeta de longitud total, la actividad reducida puede ser atribuida a la pérdida de interacciones de transmembrana que normalmente permiten que zeta tipo salvaje forme dímeros disulfuro enlazados. Es decir, construcciones de supresión zeta que tienen el mismo término carboxilo que el motivo y carecen de residuos Cys y Asp de transmembrana típicamente muestran ligeramente menos actividad que quimeras que llevan solo el motivo de 18 residuos. El elemento de competencia citolítica en el cual se ha enfocado tiene dos tirosinas y ninguna serina o treonina, restringiendo las posibles contribuciones de la fosforilación a la actividad. La mutación de cualquier tirosina destruye la activad, no obstante, y aunque experimentos preliminares no apuntan a una fosforilación sustancial de tirosina después del eslabonamiento transversal de antígenos superficiales quiméricos que llevan el motivo de 18 residuos, la posible participación de tal fosforilación a un bajo nivel no puede excluirse. Además de los efectos anotados en los dos residuos de tirosina, varios reemplazas de aminoácidos en los términos amino y carboxilo del motivo debilitan la actividad bajo condiciones de baja densidad de receptores . Secuencias similares al motivo zeta activo pueden ser encontradas en los dominios citoplásmicos de varias otras proteínas de transmembrana, incluyendo las moléculas CD3 delta y gama, las proteínas superficiales asociadas a IgM mbl y B29, y las cadenas beta y gama del receptor IgE de alta afinidad, FcepsilonRI (Reth, Nature 338:382, 1989) . Aunque la función de estas secuencias es incierta, si se expresan en forma suficiente, cada una puede ser capaz de activación autónoma de células T, y tal actividad puede explicar la capacidad de respuesta TCR residual observada en la línea celular mutante zeta negativa (Sussman y colaboradores, Cell 52:85, 1988) . Zeta misma lleva tres de tales secuencias, aproximadamente espaciadas en igual forma, y una tri-sección gruesa del dominio intracelular muestra que cada una es capaz de iniciar una respuesta citolítica. Eta, una isoforma de empalme de zeta (Jin y colaboradores, supra , 1990; Clayton y colaboradores, Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 88:5202, 1991) , carece de la mitad carboxilo del tercer motivo. Debido a que el retiro de la mitad carboxilo del primer motivo abóle la actividad, parece factible que la mayor parte de la efectividad biológica de eta pueda ser atribuida a los primeros dos motivos. Aunque por diferentes medidas eta es igualmente activa que zeta para promover liberación de citoquina mediada por antígenos (Bauer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:3842, 1991), o citólisis reordenada (ver anteriormente) , eta no es fosforilada en respuesta a la estimulación por receptores (Bauer y colaboradores, supra , 1991) . De esta manera, ya sea la presencia de los tres motivos es requerida para fosforilación, o bien el tercer motivo representa un sustrato favorecida para una tirosina quinasa no identificada. Ejemplo IX Transducción de Señal Citolítica por el Receptor Fe Humano Para evaluar las acciones de diferentes sub-tipos de receptores Fe humanos, se crearon moléculas quiméricas en las cuales el dominio extracelular de los antígenos CD4 , CD5 o CD16 humano estaba unido a los dominios de transmembrana e intracelu-lar de los sub-tipos FcRIIgamaA, Bl, B2 y C (nomenclatura de Ravetch y Kinet , Ann . REv . Immunol . 9:457, 1991) . Específicamente, secuencias de ADNc correspondientes a los dominios de transmembrana y citoplásmico de las isoformas FcRIIA, Bl y B2 previamente descritas fueron amplificadas a partir de la clona PC23 pre-existente o de una biblioteca de ADNc de anginas humanas (construida por técnicas convencionales) usando los siguientes materiales primordiales de oligonucleótidos sintéticos: CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ. ID. NO: 18; FcRII A adelante) ; CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ. ID. NO: 19; FcRII A inversa) ; GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ. ID. NO: 20; FcRII Bl y GcRII B2 adelante); y GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ. ID. NO: 21; FcRII Bl y FcTII B2 inversos) . Estos materiales primordiales contenían sitios de corte para las enzimas BamHl y Notl, respectivamente, 6 residuos hacia adentro del extremo 5' . El sitio Notl era seguido inmediatamente por un codón de paro anti-sentido, ya. sea CTA o TTA. Todos los materiales primordiales contenías 18 o mas residuos complementarios a los extremos 5' y 3' de los fragmentos deseados. El fragmento de ADNc correspondiente al dominio citoplásmico FcRIIgamaC, que difiere de la isoforma IIA en solamente un residuo de aminoácido (L por P en el residuo 268) fue generado por mutagénesis ordenada por sitio por traslape de PCR usando materiales primordiales de la secuencia: TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACÁ A (SEQ. ID. NO: 22) ; y TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ. ID. NO: 23) . Los fragmentos PCR fueron insertados en vectores de expresión del virus vaccinia que contenían dominios extracelulares CD16 o CD4 respectivamente, e insertados subsecuentemente en vaccinia tipo salvaje por recombinación en el lugar de timidina quinasa, usando selección para co-integración de gpt de E. coli para facilitar la identificación de los recombinantes deseados. Las identidades de todas la isoformas (mostradas en la figura 12) fueron confirmadas por secuenciamiento didesoxi . La producción de proteínas receptoras quiméricas fue confirmada adicionalmente por estudios de inmunoprecipitación. Aproximadamente 107 células JRT3.T3.5 fueron infectadas por una hora en medio IMDM libre de suero con vaccinia recombinante a una multiplicidad de infección de al menos diez. Doce horas después de la infección, se cosecharon las células y se marcaron en superficie con 0.5 mCi de 125I por 107 células usando el método de lactoperoxidasa/glucosa oxidasa (Clark y Einfeld, supra) . Las células marcadas fueron recolectadas por centrifugación y lisadas con 1% NP-40, O.lmM MgCl2, 5mM KCl, 0.2M yodoacetamida, y lmM PMSF. Se removieron los núcleos por centrifugación, y se inmunoprecipitaron las proteínas de fusión CD16 con anticuerpo 4G8 y agarosa IgG anti-ratón. Las muestras fueron sometidas a electroforesis bajo condiciones de reducción. Todas las moléculas de receptor quimérico inmunoprecipitadas fueron de las masas moleculares esperadas. Para probar la capacidad de los receptores quiméricos para mediar un incremento en el ion calcio citoplásmico libre, se usaron los virus recombinantes para infectar la línea celular Jurkat mutante TCR" JRT3.T3.5 (como se describe en la presente) y se midió el calcio citoplásmico libre en las células (como se describe en la presente) después del eslabonamiento transversal de los dominios extracelulares del receptor con anticuerpo monoclonal 3G8 o Leu-3A (como se describe en la presente) . Estos experimentos revelaron que los dominios intracelulares de FcRgamalI A y C eran capaces de mediar un incremento en el ion calcio citoplásmico libre después de eslabonamiento transversal , de los dominios extracelulares, mientras que los dominios intracelulares de FcRgamalI Bl y B2 eran inactivos bajo condiciones comparables (figuras 13A y 13B) . Los híbridos CD4 , CDS y CD16 de FcRgamalI A compartieron una capacidad esencialmente igual para promover la respuesta al calcio (figuras 13A-B) . Otras líneas celulares, tanto de linajes monocíticos como linfocíticos, fueron capaces de responder a la señal iniciada por eslabonamiento transversal de los dominios extracelulares. Para explorar la implicación de los diferentes dominios intracelulares FcRgamalI en la citólisis, se infectaron linfocitos T citotóxicos humanos (CTL) con recombinantes de vaccinia que expresan quimeras CD16 : FcRgamalI A, Bl, B2 y C. Las células infectadas fueron entonces co-cultivadas con células de hibridoma cargadas de 51Cr (es decir, células 3G8 10-2) que expresaban el anticuerpo a CD16 en la superficie celular. En este ensaye, CTL portadores de la quimera CD16 mataron las células de hibridoma objetivo (permitiendo la liberación de 51Cr libre) si el dominio extracelular CD16 de la quimera estaba unido a un segmento intracelular capaz de activar el programa de efecto de linfocitos; este ensaye de citólisis es descrito mas adelante en detalle. La figura 14A muestra que CTL armados con CD16:FcRga-malIA y C, pero no FcRgamalI Bl o B2 , eran capaces de lisar células objetivo que expresan el anticuerpo anti-CD16 en la superficie celular. Para eliminar la posibilidad de que la citólisis específica fuese en cierta manera atribuible a la interacción con la fracción CD16, se condujeron experimentos de citólisis en los cuales los dominios intracelulares FcRII estaban unidos al dominio extracelular CD4. En este caso, las células objetivo eran células HeLa que expresan proteínas gpl20/41 del envolvente de HIV (específicamente, células HeLa infectadas con el vector de vaccinia vPE16 disponible de National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, Maryland) . Como en el sistema CD16, las células objetivo que expresan el envolvente de HIV eran susceptibles a lisis por células T que expresan la quimera CD4 : FcRgamalI A, pero no FcRgamalI Bl o B2 (figura 14B) . Los dominios intracelulares de FcRgamalI A y C no comparten homología de secuencias apreciable con ninguna otra proteína, incluyendo los miembros de la familia FcRgama/TCRzeta extendida. Para definir los elementos de secuencia responsables de la inducción de citólisis, se prepararon cortes 5' y 3' de las secuencias de codificación de dominio intracelular (descritos mas adelante y mostrados en la figura 15A) y se evaluaron en cuanto a su eficacia en ensayes de movilización de calcio y de citólisis (como se describe en la presente) . En los experimentos en los cuales la porción amino terminal del dominio intracelular fue removida, el dominio de transmembrana de FcRgamalI fue reemplazado con el dominio de transmembrana del antígeno CD7 no relacionado para eliminar la posible contribución de las interacciones mediadas por el dominio que abarca la membrana. Las figuras 15B y 15C muestran que el retiro de los 14 residuos carboxilo terminales, incluyendo tirosina 298, dio como resultado una pérdida completa de la capacidad citolítica y una reducción sustancial en el potencial de movilización de calcio. Cortes adicionales a justo antes de la tirosina 282 dieron un fenotipo idéntico (figuras 15B y 15C) . El corte del término N del dominio intracelular al residuo 268 no tuvo un efecto sustancial sobre el perfil de calcio o la potencia citolítica, mientras que el corte al residuo 275 afectó en forma marcada la liberación de calcio libre pero tuvo poco efecto sobre la citólisis (figuras 15D y 15E) . Cortes adicionales, al residuo 282, dieron colas de FcRgamalI que carecían de la capacidad para ya sea movilizar calcio o disparar la citólisis (figuras 15D y 15E) . El "elemento activo" definido por estas medidas crudas es relativamente grande (36 aminoácidos) y contiene dos tirosinas separadas por 16 residuos. Ejemplo X Citólisis Objetivada por Linfocitos Portadores de Receptores CD4 Quiméricos Que No Sostienen la Infección Como se discutió antes, moléculas de efecto pueden ser construidas, las cuales reordenan la actividad citolítica de CTL en una forma independiente de MHC. Por ejemplo, una quimera compuesta del dominio extracelular de CD4 fusionada a la cadena zeta en una clona de CTL humano, WH3 , mata específicamente células objetivo que exhiben la glicoproteína del envolvente superficial de HIV-1, gpl20. Sin embargo, como el dominio extracelular de la molécula CD4 confiere susceptibilidad a la infección por HIV, los CTL armados pueden convertirse en objetivos del virus, dando como resultado una reducción en su potencia (Dalgleish y colaboradores, Nature 312:767 (1984); Klatzmann y colaboradores, Nature 312 :767 (1984)) . Para impedir tal resultado, se diseñaron moléculas quiméricas de efecto basadas en CD4 las cuales son efectivas para poner como blanco específicamente células infectadas por HIV para muerte mediada por células, pero que no confieren susceptibilidad a infección por HIV. Una proteína de fusión tripartita fue creada por aposición genética del dominio extracelular de CD4 (figura 23) a los dominios de articulación, segundo y tercero constantes de cadena pesada de IgGl humana (Zettlmeissl y colaboradores, DNA Cell Biol. 9:347 (1990)) (figura 25), que estaba unida en este caso a una porción del primer exón de transmembrana de IgGl ligada a membrana humana, seguido por una porción del antígeno CD7 humano que consiste en las secuencias entre el dominio único similar a Ig y la secuencia de transferencia de paro siguiendo al dominio de la transmembrana (Aruffo y Seed, EMBO J. 6:3313 (1987) ) (figura 26) . La secuencia primaria de aminoácidos de la fracción extracelular del segmento CD7 consistió en una región rica en prolina sugestiva de una estructura similar a tallo que proyecta el dominio similar a Ig lejos de la superficie celular (Aruffo y Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (figura 26). Virus de vaccinia recombinantes fueron preparados para expresar ésta y las quimeras relacionadas, como se describe en la presente. En particular, los virus de vaccinia recombinantes fueron generados por recombinación homologa en células CV-1. Al menos dos rondas de visualización de placas con OKT4 o Leu3A seguidas por purificación de placas fueron llevadas a cabo para cada material antes de preparación de materiales de alto título en células CV-1. La quimera tripartita (CD4 (D1-D4) : Ig: CD7) (figura 20, molécula "A") mostró expresión eficiente en la superficie celular y fue probada en cuanto a la capacidad para actuar como un receptor HIV en un ensaye de formación de sincitios basado en vaccinia (Lifson y colaboradores, Nature 323:725 (1986); Ashorn y colaboradores, J. Virol. 64:2149 (1990)). Células HeLa infectadas con un virus de vaccinia recombinante (vPE16) que codifica la glicoproteína de envolvente de HIV-1 (Earl y colaboradores, J. Virol. 64:2448 (1990)), fueron cultivadas con células HeLa infectadas ya sea con CD4 , CD4 : zeta o CD4 (Dl-D4) :Ig:CD7. Platos de seis cm de células HeLa (ATCC, Rockville, Maryland) a 50% de confluencia fueron infectadas en un medio libre de suero por una hora a una multiplicidad aproximada de infección (MOI) de 10. Las células fueron incubadas por 5-6 horas adicionales en medio completo y luego desprendidas con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) conteniendo lmM EDTA. Las células que expresan el envolvente y la quimera CD4 fueron mezcladas a una proporción de 1:1, y vueltas colocar en platos de seis cm con medio completo. Se clasificaron los sincitios a 6-8 horas después de co-cultivo y se fotografiaron. Co-cultivos de CD4 y vPE16 llevaron a la formación de células gigantes multinucleadas detectables fácilmente. Asimismo, una quimera que consiste en el dominio extracelular de CD4 fusionado a la cadena zeta de TCR (figura 27) (CD4:zeta) fue capaz de mediar la formación de sincitios, mientras que las células que expresan CD4(D1-D4) : Ig : CD7 no dieron signos de fusión celular. También se probó una construcción que solo expresa los dominios primero y segundo de CD4 (figura 24), CD4(D1,D2) :Ig:CD7 (figura 20, molécula "B") , pues en otro contexto los dos dominios amino terminales de CD4 han sido demostrados ser necesarios para infectividad por HIV (Landau y colaboradores, Nature 334:159 (1988) ) . Esta molécula probó también ser no susceptible a formación de sincitios inducida por HIV. Estudios de ligadura con gpl20 marcada con 125I soluble establecieron que tanto CD4 (Dl-D4) :Ig:CD7 como CD4(D1,D2) :Ig:CD7 tenían afinidad no comprometida por gpl20. En seguida, se determinó si las moléculas quiméricas que resistían la formación de sincitios serían capaces de reordenar la muerte de células si se les impartiera una fracción de disparo tal como se describe en la presente. Se fusionó el dominio intracelular de zeta (figura 27) con el extremo 3' de CD4 (D1-D4) :Ig:CD7 y CD4 (DI , D2 ) : Ig: CD7 y se prepararon los correspondientes virus de vaccinia. Estas construcciones, CD4 (D1-D4) :Ig:CD7:zeta y CD4 (DI , D2 ) : Ig : CD7 : zeta (figura 20, moléculas "C" y "D") fueron expresadas en la clona WH3 de CTL humanos y probadas en cuanto a su capacidad para objetivar y matar células HeLa que expresan la glicoproteína de envolvente superficial de HIV (usando los métodos descritos en la presente) . La figura 21 muestra que el dominio intracelular de zeta fusionado a ya sea CD4 (D1-D4) : Ig:CD7 o CD4 (DI , D2) : Ig:CD7 puede conferir capacidad de matar, las construcciones que carecen de la cadena zeta no fueron capaces de mediar esta actividad. CD4:zeta, un control positivo, medió una citotoxicidad ligeramente mas efectiva, y CD4 (D1,D2) : Ig: CD7 : zeta una citotoxicidad ligeramente menos efectiva que CD4 (D1-D4) : Ig : CD7 : zeta (figura 21) . Sin embargo, es claro que tanto las quimeras CD4 (Dl-D4) :Ig:CD7:zeta y CD4(D1,D2) :Ig:CD7:zeta tienen la capacidad de mediar la muerte específica de células que expresan proteínas de envolvente de HIV sobre su superficie. Las quimeras tetrapartitas fueron consistentemente incapaces de mediar formación de sincitios en el ensaye basado en vaccinia. También se ha demostrado que un solo motivo zeta del tipo mostrado en la figura HA es suficiente para conferir la actividad citolítica a una quimera CD4 (D1-D4) . Experimentos de radioinmunoprecipitación establecieron que las moléculas de fusión eran predominante, sino totalmente, dímeros. En estos experimentos, se usaron perlas de agarosa de proteína A para inmunoprecipitar el extracto solubilizado de células HeLa marcadas metabólicamente, infectadas con vaccinia recombinantes que expresan las quimeras CD4(D1-D4) :Ig:CD7:zeta y CD (D1,D2) : Ig:CD7 : zeta. El material inmunoprecipitado fue fraccionado por electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones de reducción y no reducción. En particular, aproximadamente 5 x 106 células HeLa-S3 fueron infectadas como se describió anteriormente para vPE16 con el material de virus de vaccinia apropiado. Las células fueron marcadas metabólicamente con 200 µCi/ml de Trans35S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, California) por 6-8 horas en medio deficiente en cisteína y metionina y desprendidas con PBS conteniendo lmM EDTA. Posteriormente se formaron en perdigones las células y se lisaron en 150mM NaCl, 50mM Tris, pH 7.5, 5mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 5mM EDTA, lmM PMSF. Después del retiro de los núcleos por centrifugación, un quinto de cada extracto celular fue adsorbido sobre perlas de agarosa conjugada con proteína A, lavadas, por 2 horas a 4°C. Las perlas fueron posteriormente lavadas con PBS conteniendo 1% de NP-40 y eluídas en amortiguador de muestras conteniendo SDS en presencia o ausencia de mercaptoetanol . Los resultados de estos experimentos demostraron que la mayor parte de las quimeras CD4 (D1-D4) : Ig: CD7 : zeta y CD4 (DI, D2) : Ig: CD7 : zeta inmunoprecipitadas emigró como dímeros de la masa molecular esperada bajo condiciones no reductoras. Para evaluar directamente la capacidad de las células que expresan las moléculas de fusión CD4 para sostener la infección por HIV, se llevaron a cabo estudios de infectividad a largo plazo en transfectantes que expresan CD4 (D1-D4) : Ig: CD7 y CD4(D1,D2) :Ig:CD7. Transfectantes estables de CD4(D1-D4) :Ig:CD7 y CD4(D1,D2) : Ig : CD7 y CD4 fueron preparados en una sub- línea de 293 células, una línea celular fácilmente transfectable de origen en riñon embriónico humano. Las moléculas quiméricas fueron sub-clonadas en vectores bidireccionales en los cuales el gene de higromicina B fue estimulado por el promotor timidino quinasa del virus herpes simplex. Un plato de células de 10 cm, con 60-70% de confluencia, fue transfectado con 10 µg de ADN de este plásmido por co-precipitación de fosfato de calcio. Antes de la transfección, los plásmidos fueron linealizados en el sitio Sfi I único, y los extremos fueron puestos a nivel con T4 ADN polimerasa. 24 horas después de la transfección, las células fueron divididas cuatro veces y 48 horas después de la transfec-ción las células fueron puestas bajo selección con higromicina B (Sigma, St . Louis, Missouri) a 400 µg/ml. Cada 3-4 días, las células fueron suministradas con medio fresco conteniendo higromicina. Se recogieron las colonias resistentes, se expandieron y su expresión fue determinada por inmunofluorescencia indirecta usando IgG Fe anti -humano conjugada con fluorosceína (Organon Teknika, West Chester, Pennsylvania) o Q4120, un anticuerpo reactivo con CD4 humana (Sigma) , seguido por citometría de flujo (Coulter, Hialeah, Florida) . Dos clonas independientes de cada construcción con niveles de CD4 en la superficie celular comparables a los mostrados por las demás líneas celulares fueron seleccionadas para análisis. La figura 22 muestra que, después de exposición a HIV, se detectó p24 en cultivos transfectantes estables a CD4 tan pronto como tres días después de la infección. La presencia de células gigantes multi-nucleadas y formación característica de globos fueron evidentes tan pronto como cinco días después de la infección en estos cultivos. No fueron detectables niveles de p24 significativos o evidencias de células gigantes multi-nucleadas en la línea celular parental no transfectada o en cualquiera de dos aislados derivados en forma independiente de transfectantes de CD (D1-D4) : Ig: CD7 y CD4(D1,-D2) :Ig:CD7 después de 32 días en cultivo (figura 22) . Al completarse los estudios de infectividad, se analizaron las células en cuanto a expresión de CD4 en la superficie celular. La densidad de epítopes superficiales de CD4 fue reducida en forma significativa en cultivos infectados que expresan CD4 , en forma consistente con modulación viral hacia abajo, pero no se vió afectada en cultivos que expresan CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 y CD4 (DI , D2 ) : Ig : CD7. Estos experimentos establecen que es posible crear moléculas quiméricas que llevan los dos dominios apicales de CD4 los cuales, cuando se fusionan a la cadena zeta receptora de células T, tienen la capacidad de objetivar y matar células infectadas por HIV, pero que no sostienen la infección por HIV mediada por CD4. Experimentos adicionales sugieren que es la distancia física entre el dominio extracelular de la molécula de CD4 y la bi-capa lípida la que confiere la capacidad para resistir la infección por HIV. En un primer experimento, se construyó una molécula quimérica portadora de un corte del tallo CD7 y el dominio de transmembrana; este corte removió la región rica en prolina de la porción de transmembrana CD7. Cuando este dominio fue fusionado con el dominio extracelular de CD4 , mantuvo su capacidad de anclar eficientemente el dominio extracelular de la molécula de CD4 , como se mide por la expresión en la superficie celular de la molécula de CD4 (como se describe en la presente) . Sin embargo, el potencial para resistir la formación de sincitios inducida por la glicoproteína de envolvente de HIV fue perdido. De esta manera, el corte de la región rica en prolina de la molécula de CD7, una región que factiblemente forma una estructu-ra espiral alfa-helicoidal, redujo efectivamente la distancia entre el dominio extracelular de CD4 y la bi-capa líquida y abrogó la capacidad de la quimera a resistir la formación de sincitios . En un segundo experimento, se demostró que la capacidad de resistir la formación de sincitios inducida por HIV puede ser conferida a una quimera CD4/CD5 que había sido documentada previamente servir como un anclaje de transmembrana para un dominio extracelular CD4 pero que era incapaz de resistir formación de sincitios inducida por HIV. En este experimento, los dominios de articulación, CH2 y CH3 de la cadena pesada IgGl humana fueron insertados en la molécula CD4/CD5; la quimera resultante resistió la formación de sincitios, de nuevo sugiriendo que la distancia aportada por los dominios de inmunoglobulina es suficiente para conferir resistencia a formación de sincitios inducida por HIV. En un tercer experimento, se extendió un dominio CD4 distancias variadas de la membrana celular usando hélices alfa sintéticas de longitud variable . En particular, oligonucléotidos sintéticos que representan motivos alfa-helicoidales repetidos de residuos lisina y ácido glutámico flanqueados por dos residuos alanina fueron diseñados (ver figura 28 para las secuencias primarias de ácidos nucleicos y aminoácidos) . En estudios previos, se encontró que tales secuencias de aminoácidos ocurren con gran frecuencia en hélices alfa, sugiriendo que tales motivos repetidos adoptarían una conformación alfa-helicoidal y que la colocación de tales hélices alfa entre el dominio de transmembrana y los dominios extracelulares de CD4 proyectarían CD4 lejos de la membrana celular. Variando la longitud del segmento alfa-helicoidal, se determinó un calcula de la distancia de proyección necesaria para resistir la entrada de HIV con base en valores conocidos para elevación y giro de hélices alfa. Estos resultados son presentados en la Tabla 1.

Tabla 1 cc?on sus anci en e numero e cé u as que expresan sinci ios o y- En esta tabla, "CD4" representa CD4(D1-D4) a menos que se indique lo contrario; "H" , "CH2" y "CH3" representan las regiones de articulación, CH2 y CH3 de la cadena pesada IgGl humana; "CD7tm y stk" representa las regiones de transmembrana y tallo de CD7 ; "CD7tm (versión larga)" y "CD7tm (versión corta)" representan respectivamente la región de transmembrana CD7 y la región de transmembrana CD7 cortadas del dominio rico en prolina * (como se discutió anteriormente) ; "CD5tm" representa la región de transmembrana CD5 ; y "CD34tm" representa la región de transmem-brana CD34. En los campos J-L, la longitud de la región alfa-helicoidal es denotada en Angstroms; estos valores están basados en el hecho de que hay 3.6 residuos por vuelta de una hélice alfa, correspondientes a 5.4 Angstroms (o 1.5 Angstroms por residuo) . En consecuencia, una hélice alfa de 16 residuos proyectaría el dominio extracelular de CD4 alrededor de 24 Angstroms. Las hélices alfa de 48 y 72 Angstroms fueron construidas por concatemerización secuencial del fragmento BstYl en el sitio BamHl único del fragmento (ver figura 28) , seguida por selección de clonas con la orientación apropiada. La formación de sincitios fue clasificada en ensayes de co-cultivo con células HeLa que expresan la glicoproteína de envolvente de HIV-1 a partir de la construcción vPE-16 del virus de vaccinia (ver anteriormente) . La expresión de thy-1 fue medida como sigue. Un vector de retrovirus vivo fue construido con base en la clona hxb.2 de HIV-1. En este vector, el gene nef no esencial fue reemplazado por la secuencia de codificación de thy-1 de rata, una molécula de la superficie celular expresada eficientemente que está anclada a la transmembrana por un eslabón fosfatidil-inositol . El virus derivado de esta clona molecular, designado hxb/thy-1, fue infeccioso, como se pone en evidencia por sus efectos citopatológicos y por la producción de p24 en sobrenadantes de cultivo de células C8166 infectadas (una línea de células T leucémicas CD4+ humanas) . Además, al exponerse a hxb/thy-1, las células HeLa transfectadas en forma transiente con CD4 mostraron signos de expresión de thy-1 tan pronto como 18 horas después de , la infección, como se esperaría de un mensaje regulado en una forma similar a nef. Los mensajes codificados por el gene nef normalmente caen en una clase de proteínas regulatorias virales que son de empalmes múltiples y carecen del elemento de respuesta a rev. Estos mensajes pueden acumularse en forma constitutiva en el citoplasma como productos de gene viral tempranos. Se esperaba que los mensajes de thy-1 fueran regulados en forma similar, es decir, que ocurrieran temprano en el ciclo de vida del virus. Brevemente, este sistema facilitó el ensaye de entrada de HIV, la expresión de thy-1 empleada como un sustituto de la entrada viral . Diversas quimeras basadas en CD4 fueron transfectadas en forma transiente en células HeLa usando métodos DEAE-dextran convencionales. Las células transfectadas fueron expuestas al virus hxb/thy-148 horas después de la transfección y clasificadas en cuanto a expresiónd e thy-1 24-48 después de la infección. En los resultados mostrados en la Tabla 1, se midió la expresión de thy-1 24 horas después de la infección usando un anticuerpo monoclonal Thy-1 disponible comercialmente (Accurate) . De los datos presentados en la Tabla 1, se concluyó que los dominios extracelulares de CD4 deben proyectarse lejos de la membrana celular, en forma óptima, al menos en 48 Angstroms, y de preferencia al menos en 72 Angstroms, a fin de resistir la infección por HIV-1. Usando una estrategia similar a la estrategia general descrita en la presente, pueden construirse quimeras basadas en anticuerpos de envolvente anti-HIV que ponen como objetivo células infectadas por HIV. Ejemplos de tales anticuerpos son descritos en Gorny y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1624 (1989) y Marasco y colaboradores, J. Clin. Invest. 90:1467 (1992) . Ejemplo XI Proteínas Adicionales de Receptor de Células T y de Disparo de Receptor de Células B Otros dominios transductores de señal intracelular y de transmembrana de acuerdo con la invención pueden derivarse de las proteínas receptoras de células T, CD3 delta y T3 gama, y las proteínas receptoras de células B, mbl y B29. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas son mostradas en la figura 16 (CD3 delta; SEQ. ID. NO: 24), figura 17 (T3 gama; SEQ. ID. NO: 25), figura 18 (mdl; SEQ. ID. NO: 26), y figura 19 (B29; SEQ. ID. NO: 27) . Las porciones de las secuencias suficientes para transducción de señal citolítica (y por tanto incluidas de preferencia en un receptor quimérico de la invención) son mostradas en corche-tes. Los receptores quiméricos que incluyen estos dominios de proteína son construidos y usados en los métodos terapéuticos de la invención generalmente como se ha descrito anteriormente. Ejemplo XII Métodos Experimentales Infección por Vaccinia y Radioinmunoprecipitación Aproximadamente 5 x 106 células CV1 fueron infectadas por una hora en medio DME libre de suero con vaccinia recombinante en una multiplicidad de infección (moi) de al menos diez (título medido en células CV1) . Las células fueron colocadas en medio fresco después de la infección y marcadas metabólicamente con 200 µCi/ml 35S-metionina mas cisteína (Tran35S-label, ICN; Costa Mesa, California) en DMEM libre de metionina y cisteína (Gibco, Grand Island, Nueva York) por seis horas. Las células marcadas fueron desprendidas con PBS conteniendo lmM EDTA, recolectadas por centrifugación, y lisadas en 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.05M Tris, pH 8.0, 5mM EDTA, y lmM PMSF. Los núcleos fueron removidos por centrifugación, y las proteínas CD4 inmunoprecipitadas con anticuerpo OKT4 e IgG agarosa anti-ratón (Cappel, Durham, Carolina del Norte) . Las muestras fueron sometidas a electroforesis a través de 8% de geles de poliacrila-mida/SDS bajo condiciones no reductoras (NR) y reductoras (R) . Geles conteniendo muestras 35S-marcadas fueron impregnadas con En3Hance (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) antes de auto-radiografía. La expresión facilitada de la forma transmem-brana de CD16, CD16TM, fue medida comparando su expresión en células CV1 infectadas una sola vez con CD16™ con la expresión en células co-infectadas con virus que codifican CD16™ y quimeras zeta o gama. Después de infección e incubación por seis horas o mas, las células fueron desprendidas de placas con PBS, lmM EDTA y la expresión de CD16TM o las quimeras fue medida por inmunofluo-rescencia indirecta y citometría de flujo. Ensaye de Flujo de Calcio Células Jurkat de la sub-línea E6 (Weiss y colaboradores, J. Immunol . 133:123-128 (1984)) fueron infectadas con virus de vaccinia recombinantes por una hora en IMDM libre de suero a una moi de 10 e incubadas por tres a nueve horas en IMDM, 10% FBS. Las células fueron recolectadas por centrifugación y re-suspendidas a 3 x 106 células/ml en medio completo conteniendo lmM Indo-1 acetometoxiéster (Grnkiewicz y colaboradores, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985)) (sondas moleculares) e incubadas a 37 °C por 45 minutos. Las células cargadas con Indo-1 fueron formadas en perlas y re-suspendidas a 1 x 106/ml en IMDM libre de suero y almacenadas a temperatura de habitación en la oscuridad. Las células fueron analizadas en cuanto a ion calcio libre por medición simultánea de la emisión de fluorescencia violeta y azul por citometría de flujo (Rabinovitch y colaboradores, J . Immunol . 137 : 952-961 (1986)) . Para iniciar el flujo de calcio, se añadió Leu-3A conjugada con picoeritrina (PE) (anti-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, Nueva Jersey) a 1 µg/ml de IgG anti-ratón de cabra, sin conjugar, en el tiempo 0, o anticuerpo monoclonal 3G8 sin conjugar (anti-CD16) fue añadido a la suspensión celular a 1 µg/ml seguido por 10 µg/ml de IgG anti-ratón de cabra Fab2' conjugada con PE en el tiempo 0. Se recolectaron histogramas de la proporción de emisión violeta/azul de la población de células (infectadas) PE positivas, que típicamente representó 40-80% de todas las células. La respuesta al receptor antigénico de células T en las células no infectadas fue disparada por el anticuerpo OKT3 , sin eslabonamiento transversal. Para experimentos que implican receptores quiméri-eos CD16, se excluyeron del análisis muestras que exhiben deriva de la línea de base hacia calcio intracelular inferior (sin anticuerpo) . Los datos de histograma fueron posteriormente analizados por conversión de los datos binarios a ASCII usando el software Write Hand Man (Cooper City, Florida) , seguido por análisis con una colección de programas en Fortran. La proporción de emisión violeta/azul antes de la adición de los reactivos del segundo anticuerpo fue usada para establecer la proporción inicial normalizada, fijada igual a la unidad, y la proporción de umbral en reposo, fijada de modo que 10% de la población en reposo excediera del umbral.

Ensaye de Citólisis La línea de células T humanas WH3 , una línea citolítica restringida CD8+ CD4" HLA B44, fue mantenida en IMDM, 10% de suero humano con 100 U/mld e IL-2 y fue estimulada periódicamente ya sea en forma no específica con linfocitos sanguíneos periféricos HLA-no igualados, irradiados (3000 rad) y 1 µg/ml de fitohemaglu-tinina, o específicamente con células mononucleares portadoras de B44, irradiadas. Después de un día de estimulación no específica, se diluyó PHA a 0.5 µg/ml por adición de medio fresco, y después de tres días se cambió el medio. Las células fueron cultivadas por al menos 10 días después de la estimulación antes de uso en ensayes de citotoxicidad. Las células fueron infectadas con vaccinia recombinante a una multiplicidad de infección de al menos 10 por una hora, en medio libre de suero, seguido por incubación en medio completo por tres horas. Las células fueron cosechadas por centrifugación y re-suspendidas a una densidad de 1 x 107 células/ml. Se añadieron 100 µl a cada cavidad de una placa de microtítulo de fondo de U conteniendo 100 µl/cavidad de medio completo. Las células fueron diluidas en pasos seriales dos veces. Dos cavidades de cada muestra no contenían linfocitos, para permitir liberación espontánea de cromo y toma total de cromo por medirse. Las células objetivo, de la sub-línea S3 HeLa, fueron infectadas en placas de 6.0 o 10.0 cm a una moi aproximada de 10 por una hora en medio libre de suero, seguido por incubación en medio completo por tres horas. Luego se desprendieron de los platos con PBS, lmM EDTA y se contaron. Una alícuota de 106 células objetivo (células HeLa, Raji o RJ2.2.5 para los experimentos del receptor quimérico CD4 y células 3G8 10-2; Shen y colaboradores, Mol. Immunol . 26:959 (1989) para los experimentos del receptor quimérico CD16) fue centrifugada y re-suspendida en 50 µl de cromato de sodio 51Cr estéril (lmCi/ml, DuPont, Wilmington, Delaware) por una hora a 37°C con mezclado intermitente, luego lavada tres veces con PBS. Se añadieron a cada cavidad 100 µl de células marcadas, re-suspendidas en medio a 105 células/ml. Células objetivo Raji y Rj 2.2.5 fueron marcadas de la misma manera que las células HeLa. La placa de microtítulo fue girada a 750 x g por un minuto e incubada por 4 horas a 37°C. Al final del período de incubación, las células en cada cavidad fueron re-suspendidas por medio de uso gentil de pipetas, una muestra removida para determinar las cuentas totales incorporadas, y la placa de microtítulo girada a 750 x g por un minuto. Se removieron alícuotas de 100 µl de sobrenadante y se contaron en un contador de centelleo de rayos gama. La mortandad porcentual fue corregida para la fracción de las células objetivo infectadas (habitualmente 50-90%) , medidas por citometría de flujo. Para células de efecto infectadas, la proporción de efecto : objetivo fue corregida para el porcentaje de células infectadas (habitualmente 20-50% para los experimentos del receptor quimérico CD4 y mas de 70% para los experimentos del receptor quimérico CD16) .

Muta énesis In Vitro de la Secuencia Zeta Para crear mutaciones puntuales en los residuos de aminoácidos 11 y/o 15 de la secuencia zeta, se prepararon y usaron en reacciones PCR materiales primordiales de oligonucleó-tidos sintéticos que se extienden desde el sitio BamHl corriente arriba del dominio de transmembrana zeta, y conviertiendo el residuo zeta nativo 11 de Cys a Gly (CllG) o el residuo 15 de Asp a Gly (D15G) o ambos (C11G/D15G) , para generar fragmentos mutados que fueron re-insertados en las construcciones CD4 : zeta tipo salvaje. Para crear cortes zeta, se amplificaron secuencias de ADNc zeta por PCR usando materiales primordiales de oligonucleótidos sintéticos diseñados para crear un codón de paro (UAG) después de los residuos 50, 59 o 65. Los materiales primordiales contenían el sitio de corte para la enzima Notl hacia adentro cinco o seis residuos del extremo 5', habitualmente en una secuencia de la forma CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ. ID. NO: 11), donde los últimos tres residuos corresponden al anti-codón de paro. Las secuencias Notl y anti-codón de paro fueron seguidas por 18 o mas residuos complementarios al extremo 3' deseado del fragmento. Las quimeras resultantes fueron designadas CD16:ze-taY51*, CD16 :zetaE60* y CD16 :zetaD66*, respectivamente. El sitio BamHl corriente arriba del dominio de transmembrana y el sitio Notl fueron usados para generar fragmentos que fueron re-introducidos en la construcción CD16:zeta tipo salvaje. Quimeras zeta monoméricas fueron creadas liberando las secuencias de transmembrana zeta e intracelular próxima a membrana por digestión con BamHl y Sacl de la construcción CD4 : zeta Asp" y Cys" antes descrita e insertando el fragmento en las' construcciones CD16 :zetaE60* y CD16 : zetaD66* , respectivamente. Construcción de Quimeras Tripartitas CD16 : 7 : zeta (48-65) y CD16;7;zeta(48-59) Para preparar la construcción CD16 : zetaD66* , la secuencia de ADNc zeta correspondiente al dominio de transmembra-na y los siguientes 17 residuos del dominio citoplásmico fue reemplazada por el dominio de transmembrana y citoplásmico correspondiente obtenido del ADNc de CD5 y CD7. Los fragmentos CD5 y CD7 fueron generados por una reacción PCR usando oligonucleótidos delanteros, incluyendo un sitio de corte de restricción BamHl y correspondiente a la región justo corriente arriba del dominio de transmembrana de CD5 y CD7, respectivamente, y los siguientes oligonucleótidos inversos traslapando las secuencias CD5 y CD7 respectivamente, y la secuencia zeta que contenía el sitio de corte de restricción Sacl. CD5:zeta: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ. ID. NO: 12) CD7:zeta: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ. ID. NO: 13) . Los productos CD5 y CD7 de PCR fueron digeridos con BamHl y Sacl y ligados a CD16 : zetaE60* digerida con BamHl y Sacl y reemplazan-do la secuencia zeta de BamHl a Sacl por el fragmento CD7. Para hacer las construcciones CD16:CD5 y CD16:CD7, se obtuvieron fragmentos CD5 y CD7 por PCR usando un oligonucleótido que contiene un sitio de corte de restricción Notl y codificando un codón de paro (UAA) después del residuo Gln416 y Alal93 de CD5 y CD7, respectivamente. Los fragmentos CD5 y CD7 de PCR fueron digeridos con BamHl y Notl e insertados en la construcción CD16 :zeta:Asp66* . Mutasénesis In Vitro de los Residuos N-Terminales Dentro del Motivo Transductor de Señal Citolítica Zeta Materiales primordiales de oligonucleótidos sintéticos que se extienden desde el sitio Sacl dentro del motivo zeta y convirtiendo el residuo nativo 48 de Asn en SEr (N48S) , el residuo 50 de Leu en Ser (L50S) , y el residuo 51 de Tyr en Phe (Y51F) , fueron sintetizados y usados en una reacción PCR para generar fragmentos que fueron re-introducidos en la construcción CD16 :7 : zeta (48-65) tipo salvaje. Mutasénesis In Vitro de Residuos C-Terminales Dentro del Motivo Transductor de Señal Citolítica Zeta Materiales primordiales de oligonucleótidos sintéticos que se extienden del sitio Notl 3' al codón de paro y convirtiendo el residuo nativo 60 de Glu en Gln (E60Q) , el residuo 61 de Glu en Gln (E61Q) , el residuo 62 de Tyr en Phe o Ser (Y62F o Y62S) y el residuo 63 de Asp en Asn (D63N) fueron sintetizados y usados en PCR para generar fragmentos que fueron sub-clonados en la construcción de CD16 : zetaD66* tipo salvaje del sitio BamHl al sitio Notl . Construcciones de Quimera CD16.7 ;zeta(33-65) . CD16 :7 : zeta (71-104). CD16;7:zeta(104-137) Un fragmento de transmembrana CD7 portador de sitios Mlul y Notl en la unión entre los dominios de transmembrana e intracelular fue obtenido por PCR usando un oligonucleótido con la siguiente secuencia: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACÁ (SEQ. ID. NO: 14) . El fragmento PCR resultante fue digerido con BamHl y Notl y re- insertado en la construcción CD16:7:ze-ta (48-65). Los fragmentos zeta que codifican los residuos 33 a 65, 71 a 104, y 104 a 137, fueron obtenidos por reacción PCR usando pares de materiales primordiales conteniendo sitios Mlul en el extremo 5' de los materiales primordiales delanteros y codones de paro seguidos por sitios Notl en el extremo 5' de los materiales primordiales inversos. En cada caso, los sitios de restricción estuvieron hacia adentro seis residuos del término 5' del material primordial para asegurar corte de enzima de restricción. zeta 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACÁ (SEQ. ID. NO: 15) ; zeta 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ. ID. NO: 16) ; y zeta 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ. ID. NO: 17) .

Construcción de Mutantes de Corte FcRaamalIA Mutantes de corte FcRIIA carboxilo terminales fueron construidos por PCR de igual manera que las construcciones de longitud total, convirtiendo las secuencias que codifican tirosina en las posiciones 282 y 298 en codones de paro (TAA) . Los cortes N-terminales fueron generados amplificando fragmentos que codifican sucesivamente menos del dominio intracelular por PCR, usando oligonucleótidos que permiten que los fragmentos resultantes sean insertados entre sitios de restricción Mlul y Notl a un plásmido de expresión construido previamente que codifica el dominio extracelular CD16 fusionado al dominio de transmembrana CD7, el último terminando en un sitio ant Mlul en la unión entre el dominio de transmembrana y el dominio intracelular. Otras Formas de Realización Los ejemplos antes descritos demuestran que la agregación de quimeras zeta, eta o gama basta para iniciar la respuesta de células de efecto citolítico en células T. El rango conocido de expresión de zeta, eta y gama, que incluye linfocitos T, células asesinas naturales, granulocitos basófilos, macrófagos y células de poste, sugiere que los motivos de secuencia conservados pueden interactuar con un aparato sensor común a las células de origen hemotopoyético y que un componente importante de la defensa de anfitrión en el sistema inmune puede ser mediado por eventos de agregación de receptores.

La potencia de la respuesta citolítica y la ausencia de una respuesta a células objetivo portadoras de receptores MHC clase II demuestran que quimeras basadas en' zeta, eta o gama forman la base para una intervención genética para SIDA a través de inmunoterapia adoptiva. La amplia distribución de zeta y gama endógenas y la evidencia de que los receptores Fe asociados con gama median la citotoxicidad en diferentes tipos de células (Fanger y colaboradores, Immunol . Todav 10:92-99 (1989)), permiten considerar una amplia variedad de células para este fin. Por ejemplo, los granulocitos neutrófilos, los cuales tienen un lapso de vida muy corto (aproximadamente 4 horas) en circulación y son intensamente citolíticos, son células objetivo atractivas para expresión de las quimeras. La infección de neutrófilos con HIV posiblemente no de como resultado liberación del virus, y la abundancia de estas células (las mas prevalecientes de los leucocitos) debe facilitar la defensa del anfitrión. Otra posibilidad atractiva para células anfitrión son células T maduras, una población actualmente accesible a ingeniería retroviral (Rosenberg, S.A. Sci. Am. 262:62-69 (1990)). Con la ayuda de IL-2 recombinante, las poblaciones de células T pueden expandirse en cultivo con relativa facilidad, y las poblaciones expandidas típicamente tienen un lapso de vida limitado cuando son re-infusidas (Rosenberg y colaboradores, N. Enql . J. Med. 323:570-578 (1990) ) . Bajo las condiciones apropiadas, el reconocimiento de HIV por células que expresan quimeras CD4 debe también proporcionar estímulos mitogénicos, permitiendo la posibilidad de que la población de células armadas pueda responder dinámicamente a la carga viral. Aunque se ha enfocado la presente al comportamiento de las proteínas de fusión en linfocitos T citolíticos, la expresión de las quimeras en linfocitos de ayuda puede proporcionar una fuente movilizada por HIV de citoquinas que pueden contrarrestar el colapso del sub-conjunto de células de ayuda en SIDA. La reciente descripción de varios esquemas para construir artificialmente resistencia a la infección en pasos distintos de la penetración del virus (Friedman y colaboradores, Nature 335:442-454 (1988); Green y colaboradores, Cell 58:215-223 (1989); Malim y colaboradores, Cell 58:205-214 (1989); Trono y colaboradores, Cell 59 :113-120 (1989); Buonocoro y colaboradores, Nature 345:625-628 (1990)), sugiere que células portadoras de quimeras CD4 pueden ser diseñadas para coartar la producción de virus por expresión de agentes apropiados que tienen un sitio de acción intracelular. La capacidad para transmitir señales a linfocitos T mediante quimeras autónomas también proporciona la capacidad de regulación de linfocitos construidos viralmente in vivo. Estímulos de eslabonamiento transversal, mediados por ejemplo por anticuerpos IgM específicos construidos artificialmente para remover dominios de ligadura de complemento, pueden permitir que se incrementen en número tales linfocitos in situ, mientras que el tratamiento con anticuerpos IgG específicos similares (por ejemplo, reconociendo una variación de aminoácidos construida artificialmente en la cadena quimérica) puede agotar selectivamente la población construida artificialmente. Adicionalmente, anticuerpos IgM anti-CD4 no requieren de eslabonamiento transversal adicional para movilizar calcio en células Jurkat que expresan quimeras CD4:zeta. La capacidad de regular poblaciones celulares sin recurrir a amplificación extracorpórea repetida puede extender sustancialmente el rango y la eficacia de los usos actuales propuestos para células T construidas genéticamente en forma artificial. Aunque la invención ha sido descrita con relación a formas de realización específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y que esta solicitud está destinada a cubrir tales variaciones, usos o adaptaciones de la invención e incluyendo aquellos aspectos que se aparten de la presente divulgación que caigan dentro de la materia a que pertenece la invención y que puedan aplicarse a los aspectos esenciales establecidos anteriormente en la presente como sigue en los alcances de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: Número de Secuencias: 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1728 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómica) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l: ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200 TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC 1250 CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTGCCAACC 1300 TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGAGAG 1350 GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG 1400 CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC 1450 AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAG 1500 AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA 1550 AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA 1600 GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT 1650 AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG 1700 GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA 1728 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1389 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC 1200 TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT 1250 GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC 1300 GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG 1350 ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1599 pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD : doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200 TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC TATGGTGTCA TTCTCACTGC 1250 CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC 1300 AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG 1350 GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC CGGGACCCTG AGATGGGGGG 1400 AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA 1450 AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC 1500 CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC 1550 CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGCTAA 1599 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 575 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 : Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 40 45 lie Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln lie Lys lie Leu Gly Asn 50 55 60 •^'in Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu lie lie 85 90 95 Lys Asn Leu Lys lie Glu Asp Ser Asp Thr Tyr lie Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lys Asn lie Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu 165 170 175 Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys 180 185 190 ..Val Glu Phe Lys lie Asp lie Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser 195 200 205 Ser lie Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp lie Thr Phe Asp Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu 275 280 285 Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 ,Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn lie 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu 385 390 395 400 Cys Tyr Leu Leu Asp Gly lie Leu Phe lie Tyr Gly Val lie lie Thr 405 410 415 Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala 420 425 430 Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu 450 455 460 t Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr 465 470 475 480 Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Pro Glu Ala Tyr Ser Glu He Gly 485 490 495 Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 500 505 510 Asp Ser His Phe Gln Ala Val Gln Phe Gly Asn Arg Arg Glu Arg Glu 515 520 525 Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly 530 535 540 Glu Ser Thr Gln Gln Ser Ser Gln Ser Cys Ala Ser Val Phe Ser He 555 550 565 560 Pro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gln Leu 565 570 575 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 462 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 : Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 40 45 ''le Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln He Lys He Leu Gly Asn 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu He He 85 90 95 Lys Asn Leu Lys He Glu Asp Ser Asp Thr Tyr He Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lys Asn He Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu 165 170 175 Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys 180 185 190 Val Glu Phe Lys He Asp He Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser 195 200 205 Ser He Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp He Thr Phe Asp Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu 275 280 285 Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Jin Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn He 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Gln Leu 385 390 395 400 Cys Tyr He Leu Asp Ala He Leu Phe Leu Tyr Gly He Val Leu Thr 405 410 415 Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys He Gln Val Arg Lys Ala Asp He Ala 420 425 430 Ser Arg Glu Lys Ser Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Asn 435 440 445 '' '1n Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln 450 455 460 462 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 532 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu 1 5 10 15 ^.a Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser 40 45 He Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln He Lys He Leu Gly Asn 50 55 60 Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu He He 85 90 95 Lys Asn Leu Lys He Glu Asp Ser Asp Thr Tyr He Cys Glu Val Glu 100 105 110 Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 - Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly ' 5 150 155 160 Lys Asn He Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu 165 170 175 Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys 180 185 190 Val Glu Phe Lys He Asp He Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser 195 200 205 Ser He Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp He Thr Phe Asp Leu 245 250 255 Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu 275 280 285 x.Jro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser 340 345 350 Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn He 370 375 380 Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu 385 390 395 400 Cys Tyr Leu Leu Asp Gly He Leu Phe He Tyr Gly Val He Leu Thr 405 410 415 Ma Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala 420 425 430 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 450 455 460 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 465 470 475 480 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu He Gly Met 485 490 495 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 500 505 510 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 515 520 525 Leu Pro Pro Arg 530 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33 [ 2 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 9 : (i) CARACTERÍSITCAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 33 bases (B) TIPO: ácido' nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10 CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11 CGCGGGCGGC CGCTA 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12 CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13 CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG 48 (2) INFORMACIÓN PARA FOR SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: ^•GCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACÁ 33 2 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 36 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA 36 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16 CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17 CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18 CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: ^GCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUECIA: (A) LONGITUD: 30 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: *"GGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCILA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 21 CGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD 31 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 22 .CAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ALEATORIEDAD: singular (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 23 1TGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA: (A) LONGITUD: 171 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 24 "?et Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 5 10 15 Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys He Pro He Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser He Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Ser Asp He Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg He 50 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly He Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp He Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys 85 90 95 Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly He He Val Thr Asp Val 100 105 110 Ala He Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120 125 -'lu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys 165 170 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 182 aminoácidos (B) TTIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu He Leu Ala He He Leu 5 10 15 Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser He Lys Gly Asn His Leu Val Lys 20 25 30 Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala 40 45 Glu Ala Lys Asn He Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met He Gly Phe 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp 65 70 75 80 Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro 85 90 95 Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys He Glu Leu Asn Ala 100 105 110 lia Thr He Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu He Val Ser He Phe Val 115 120 125 Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe He Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr 145 150 155 160 Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly 165 170 175 Asn Gln Leu Arg Arg Asn 180 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 220 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26 Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe 5 10 15 Leu Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala Leu Arg Val Glu 20 25 30 Gly Gly Pro Pro Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu 40 45 Thr Cys Glu Asn Asn Gly Arg Asn Pro Asn He Thr Trp Trp Phe Ser 50 55 60 Leu Gln Ser Asn He Thr Trp Pro Pro Val Pro Leu Gly Pro Gly Gln \ 70 75 80 ijly Thr Thr Gly Gln Leu Phe Phe Pro Glu Val Asn Lys Asn Thr Gly 85 90 95 Ala Cys Thr Gly Cys Gln Val He Glu Asn Asn He Leu Lys Arg Ser 100 105 110 Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu 115 120 125 Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg He He Thr Ala Glu Gly He 130 135 140 He Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg 145 150 155 160 Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp Asp Tyr 165 170 175 Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met 180 185 190 Tyr Glu Asp He Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly 195 200 205 Asn Leu His He Gly Asp Ala Gln Leu Glu Lys Pro 210 215 220 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 228 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu Phe 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Ser Ser 20 25 30 Asp Leu Pro Leu Asn Phe Gln Gly Ser Pro Cys Ser Gln He Trp Gln 40 45 His Pro Arg Phe Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met Val Lys Phe His 50 55 60 Cys Tyr Thr Asn His Ser Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys Arg Gly 65 70 75 80 Ser Gln Gln Pro Gln Glu Leu Val Ser Glu Glu Gly Arg He Val Gln 85 90 95 Thr Gln Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Thr He Gln Asn He Gln Tyr 100 105 110 Glu Asp Asn Gly He Tyr Phe Cys Lys Gln Lys Cys Asp Ser Ala Asn 115 120 125 His Asn Val Thr Asp Ser Cys Gly Thr Glu Leu Leu Val Leu Gly Phe 130 135 140 ¿er Thr Leu Asp Gln Leu Lys Arg Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly He 145 150 155 160 He Leu He Gln Thr Leu Leu He He Leu Phe He He Val Pro He 165 170 175 Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp 180 185 190 His Thr Tyr Glu Gly Leu Asn He Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp 195 200 205 He Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His 210 215 220 Pro Gly Gln Glu 225

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de ordenar una respuesta inmune celular contra una célula infectada por HIV en un mamífero, dicho método comprendiendo administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de células terapéuticas, dichas células terapéuticas expresando un receptor quimérico proteico, ligado a membrana, que comprende (a) una porción extracelular que incluye un fragmento de CD4 que es capaz de reconocer específicamente y ligar dicha célula infectada por HIV pero que no media infección por HIV, y (b) una porción intracelular que es capaz de indicar a dicha célula terapéutica destruir dicha célula infectada por HIV ligada a receptor.
2. 2. El método de la reivindicación 1, donde dicho fragmento CD4 consiste en los aminoácidos 1-394 o los aminoácidos 1-200.
3. 3. El método de la reivindicación 1, donde dicho fragmento CD4 está separado de dicha porción intracelular por el dominio de transmembrana CD7 mostrado en la figura 26 o por los dominios de articulación, CH2 y CH3 de la molécula de IgGl humana mostrada en la figura 25.
4. 4. El método de la reivindicación 1, donde dicho fragmento CD4 es separado de dicha membrana de célula terapéutica por al menos 48 Angstroms o por al menos 72 Angstroms.
5. 5. El método de la reivindicación 1, donde dicha porción intracelular es la porción transductora de señal de una proteína receptora de células T, una proteína receptora de células B, o una proteína receptora Fe.
6. 6. El método de la reivindicación 5, donde dicha proteína receptora de células T es zeta.
7. 7. El método de la reivindicación 1, donde dichas células terapéuticas son seleccionadas del grupo que consiste en: (a) linfocitos T; (b) linfocitos T citotóxicos; (c) células asesinas naturales; (d) neutrófilos; (e) granulocitos; (f) macrófagos; (g) células de poste; (h) células HeLa; e (i) células de tallo embriónico (ES) .
8. 8. El método de la reivindicación 1, donde dicho receptor incluye una porción de transmembrana CD7, una porción de transmembrana CD5, o una porción de transmembrana CD34.
9. 9. El método de la reivindicación 1, donde dicho fragmento CD4 está separado de dicha membrana de célula terapéutica por una o mas hélices alfa proteicas.
10. 10. Una célula que expresa un receptor quimérico ligado a membrana proteica, dicho receptor comprendiendo (a) una porción extracelular que incluye un fragmento de CD4 que es capaz de reconocer específicamente y ligar dicha célula infectada por HIV pero que no media infección por HIV, y (b) una porción intracelular que es capaz de ordenar a dicha célula destruir una célula infectada por HIV ligada a receptor.
11. 11. La célula de la reivindicación 10, donde dicho fragmento CD4 consiste en los aminoácidos 1-394 o los aminoácidos
12. 12. La célula de la reivindicación 10, donde dicho fragmento CD4 está separado de dicha porción intracelular por el dominio de transmembrana CD7 mostrado en la figura 26 o por los dominios de articulación, CH2 y CH3 de la molécula de IgGl humana mostrada en la figura 25.
13. 13. La célula de la reivindicación 10, donde dicho fragmento CD4 está separado de dicha membrana celular terapéutica por al menos 48 Angstroms o por al menos 72 Angstroms.
14. 14. La célula de la reivindicación 10, donde dicha porción intracelular es la porción transductora de señal de una proteína receptora de células T, una proteína receptora de células B, o una proteína receptora Fe.
15. 15. La célula de la reivindicación 14, donde dicha proteína receptora de células T es zeta.
16. 16. La célula de la reivindicación 10, donde dicho -»• receptor incluye una porción de transmembrana CD7, una porción de transmembrana CD5 , o una porción de transmembrana CD34.
17. 17. La célula de la reivindicación 10, donde dicho fragmento CD4 está separado de dicha membrana celular terapéutica por una o mas hélices alfa proteicas.
18. 18. ADN que codifica un receptor quimérico de la reivindicación 10.
19. 19. Un vector que comprende el ADN del receptor quimérico de la reivindicación 18.