CN102918159A - 产生氢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明，在其一些实施方式中，涉及在藻类中产生氢气的光催化方法，并且更具体地，而不是排他地，涉及用于增强动力学以及提高藻类氢光生产产量的藻类-细菌共培养物。

Description

产生氢的方法
相关申请
本申请要求在35USC 119（e）下于2010年3月11日提交的美国临时专利申请号61/312,678的优先权益，其内容通过引用以其全部内容结合在此。
技术领域
本发明，在其一些实施方式中，涉及在藻类中产生氢气的光催化方法。
背景技术
因为氢气燃烧释放大量能量/重量而不产生CO2（而是产生H2O）并且氢很容易通过燃料电池转化成电力，在减轻空气污染，防止全球变暖，以及以经济可持续的方式保护环境方面，氢气（分子氢）被认为是理想的燃料。氢和电力可以组合从而在运输和发电方面提供有吸引力的选择。这两种形式的能量之间的相互转化提供了现场利用氢进行发电，而电网用于根据需要进行能源传输，分布利用，以及氢再生。然而，可再生地并且环境友好地产生大量H2气体为使用H2作为未来能源提出了具有挑战性的问题。与光电化学，或热化学过程相比较，生物氢的生产具有几个优点，因为它仅需要具有较低能量要求的简单太阳能反应器，而不是需要高能量的电池来为电化学过程供电。
蓝细菌和绿藻是具有产氧光合作用以及氢气生产两者的唯一已知的生物体。在20世纪中期，在厌氧的并且限光的条件下（暗适应）培养之后，当光照时在绿藻栅藻中首次观察到氢气产生。此后，在绿色微藻中光生物氢气的生产备受关注，目的是使用光合电子传递途径作为通过铁氧化还原蛋白连接的氢化酶途径将H+还原成氢气的电子源。此外，在厌氧条件下，碳化合物的发酵可以提供氢生产的还原当量。
可逆的Fe-氢化酶是高度氧敏感的，因此必须限制通过光合作用释放O2，从而实现当光照暗适应的培养基时由氢化酶光生产H2。已经通过用对于规模放大的培养而言是昂贵并且不切实际的惰性气体（如氩气或氮气）充入反应容器以及通过使用对于细胞具有潜在毒性的外源性还原剂（例如，用于抑制光合作用O2释放的连二亚硫酸钠或除草剂）试图建立厌氧生活。
在2000年，在伯克利大学，在通过使光合作用氧气释放（伴随碳积聚）与细胞代谢产物的消耗分离而努力地规避可逆氢化酶的严重的氧气敏感性中，研究团队发现，在光照下将莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）去除硫使PS-II（光系统II）的氧气生产失活，并且引起核酮糖二磷酸羟化酶（RuBisco）急剧下降，从而通过卡尔文本森循环以及厌氧条件导致减少的二氧化碳同化作用（Melis et al.，Plant Physiol 2000；122:127-135）。在充分照射2天之后，当藻类的环境转变成厌氧的并且所有的氧气被消耗时，藻类开始生产氢气持续很少的数天。然而，在这种系统中藻类的氢生产率未达到商业可行性，并且确保营养应激逐渐破坏，并且最终对于细胞具有毒性。因此，在梅利斯（Melis）方法中，氢气积聚的实际速率最多是细胞光合作用能力的15%至20％[Melis and Happe 2001，Plant Physiol.November；127(3):740-8]，而通过将藻类去除硫来生产氢不能无限地继续下去。在去除硫约40-70小时之后产量开始变平缓以及下降，而在去除硫约100小时之后，需要将藻类恢复到正常光合作用的阶段以便补充内源性底物。氢气光生产的引发（“第2阶段”）显著地滞后，典型地24-30小时，直至建立厌氧性条件。由于藻类使用其Fe-氢化酶生产大量氢气的潜力较高，已经例如通过重复限光循环和具有未剥硫（undeprived）光合作用循环的氧耗循环继续努力增强这种藻类或其他藻类的氢生产力（参见，例如，梅利斯等的美国专利US20010053543），通过限制光照光能和选择和/或产生具有有限光收集机制的遗传工程控制光合作用（参见，例如，梅利斯的美国专利US20080120749），减少硫的摄取（参见梅利斯等的美国专利US20050014239）或降低其氢酶的氧敏感性（参见，例如，金等（King et al）的两个美国专利US20090263846和US20060228774）。不过，到今天为止，已经取得的显著进步不大。
有人已经认为（Terauchi et al，JBC 2009；284:25867-878）这种系统中氢产量低的主要原因是剥硫期间将电子从PS-I传送至氢酶的大部分对氧敏感的已还原铁氧化还原蛋白（PetF，FDX2）被氧化，并因为培养基中缺乏硫而藻类不能有效更新铁氧化还原蛋白，铁硫蛋白的水平。此外，剥硫导致光合作用的配合物，以及酶和其他生物活性分子的许多组件转录下降。这就增加了梅利斯过程滞后时间（通常24-48h）的缺点，直至建立厌氧条件。因此，当环境变成厌氧环境时藻类已经变得虚弱而随着铁氧化还原蛋白降低，进一步降低了光生氢气产量。
有人提出共培养藻类和光合厌氧产氢细菌进行氢的藻类光生，正如以上所述。
藻类和细菌共存在于自然界，人们已经作出很多努力以识别细菌的共生体而提高，例如，污染物或生物质生产的生物修复中藻类生长的效率（参见，例如，Gonzalez-Bashan et al，Can.J.Microbiol.，2000；46:653-59；和Belaiev等的美国专利US20100311156）。
Kawaguchi等（J.Bioscience and Bioengineering 2001；91:277-282）提出将光合细菌海红菌（R.marinum）沿连同麦汁生物酸化菌（Lactobacillus amylovorus）和藻类生物质一起培养，而将藻淀粉代谢成乳酸酯作为细菌产氢的电子供体。
梅利斯的美国专利申请20030162273和20050014239公开了为了提高产氢产量的光合产氢藻类（野生型和降低硫酸盐利用的遗传设计的）与产氢细菌的共培养方法。然而，由于硫是生产铁氧化还原蛋白的关键组分，随着剥硫或缺硫的藻类中铁氧化还原蛋白减少，向Fe-氢酶的电子传输也降低，并随之导致氢产量变低。向培养基中加入厌氧产氢细菌预想能够弥补由于藻类硫酸盐摄取降低所致的藻类氢生产率损失。通过加入厌氧酵母菌如梭状芽孢杆菌获得了进一步的产氢能力。然而，藻类产氢仍然受到抑制，直至经历过漫长的潜伏期和建立移动微氧和/或厌氧培养条件。
发明内容
根据本发明一些实施方式的一方面，提供了一种产生氢气的方法，所述方法按序包括
（a）在繁殖培养基中繁殖光合藻类，这种繁殖培养基含有硫；
（b）在培养基中将藻类与细菌共培养足够长的一段时间而确保氧降低的培养条件，其中所述培养基相比于所述繁殖培养基包含的硫含量降低；
（c）在这种培养基中耗损至少一些细菌而产生细菌减少的培养基；
（d）在这种培养基中培养所述藻类足够长的一段时间而确保厌氧培养条件；
（e）在这种培养基中厌氧培养条件下培养所述藻类，由此产生氢气；和
（f）收集所述氢气。
根据本发明一些实施方式的一方面，提供了一种产生氢气的方法，这种方法包括
（a）在繁殖培养基中繁殖光合藻类，这种繁殖培养基含有硫；
（b）在相比于所述繁殖培养基包含的硫含量降低的培养基中培养所述藻类足够长的一段时间而建立厌氧培养条件，其中所述培养与所加细菌共培养至少一部分所述时间长度；
（c）在这种培养基中厌氧培养条件下培养所述藻类，由此产生氢气；和
（d）收集所述氢气，
其中相比于藻类未与所加细菌共培养的类似培养的所述时间长度步骤（b）的厌氧培养条件的时间长度减少。
根据本发明一些实施方式的一方面，提供了一种产生氢气的系统，所述系统按序包括：
（a）包含在相比于藻类繁殖培养基包含降低量的硫的培养基中共培养的光合藻类和细菌的密封培养容器；
（b）所述培养容器的光照光源；和
（c）从培养容器中收集氢气的装置，
其中所述细菌包含于流体连接于藻类封闭壳的细菌封闭壳，所述藻类封闭壳由此通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障与之隔离。
根据本发明的一些实施方式，所述细菌包含耗氧细菌。
根据本发明的一些实施方式，这种方法进一步包括步骤（b）之后而步骤（c）之前、或期间在这种培养基中耗损至少一些细菌而产生细菌减少的培养基。
根据本发明的一些实施方式，这种耗损实施过程中所述藻类培养物基的氧耗量等于或大于所述藻类培养物基的光合产氧量，这都在高强度光照下进行测量。
根据本发明的一些实施方式，这种细菌减少的培养基基本上没有所述细菌。
根据本发明的一些实施方式，这种繁殖培养基基本上没有所述细菌。
根据本发明的一些实施方式，所述培养基基本上没有硫。
根据本发明的一些实施方式，厌氧条件下的所述藻类培养在光照射条件下实施。
根据本发明的一些实施方式，这种方法进一步包括在厌氧条件下培养所述藻类之前在光照射条件下实施任何这些步骤。
根据本发明的一些实施方式，在厌氧条件下培养实施藻类的步骤期间所述光照强度要大于在厌氧条件下培养所述藻类之前的任何这些步骤期间的光照强度。
根据本发明的一些实施方式，实验步骤都在光照射条件下实施。
根据本发明的一些实施方式，所述细菌包含于流体连接于藻类封闭壳的细菌封闭壳，所述藻类封闭壳通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障而与细菌封闭壳隔离。
根据本发明的一些实施方式，所述细菌封闭壳位于藻类封闭壳内而由此通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障与之隔离。
根据本发明的一些实施方式，细菌封闭壳是透析袋。
根据本发明的一些实施方式，所述细菌封闭壳远离藻类封闭壳而经由流体连接装置与其流体连接并由此通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障与之隔离。
根据本发明的一些实施方式，细菌封闭壳进一步包含碳源。
根据本发明的一些实施方式，共培养基中的藻类体积比所述细菌的体积大约5~50倍。
根据本发明的一些实施方式，步骤（b）中的藻类体积比所述细菌的体积大约20倍。
根据本发明的一些实施方式，所述共培养物包含约103至约108个藻类细胞/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述共培养物包含约104至约107个藻类细胞/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述共培养物包含约105~106个藻类细胞/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述共培养物包含约3-6×106个或约3-6×107个藻类细胞/mL。
根据本发明的一些实施方式，在（b）和（c）中的所述培养进行约4至约60h。
根据本发明的一些实施方式，在（b）和（c）中的所述培养进行约10至约40h。
根据本发明的一些实施方式，在（b）和（c）中的所述培养进行约30h。
根据本发明的一些实施方式，在（b）和（c）中培养所述藻类约30h之后所述氢气产量就可检测到。
根据本发明的一些实施方式，所述藻类包括绿藻。
根据本发明的一些实施方式，所述藻类包括单细胞的光合藻类。
根据本发明的一些实施方式，所述藻类包括含有Fe-氢酶的藻类。
根据本发明的一些实施方式，所述藻类选自由海洋绿藻，紫细菌和莱茵衣藻组成的组。
根据本发明的一些实施方式，所述细菌包括耗氧细菌。
根据本发明的一些实施方式，所述细菌包括专性好氧细菌。
根据本发明的一些实施方式，所述细菌是荧光假单胞菌。
除非另有定义，本文所用所有的技术和/或科学术语都具有本发明涉及的技术领域内普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似或等同于本发明中描述的方法和材料能够用于本发明实施方式的实践或测试，但是示例性的方法和/或材料描述以下进行介绍。在发生冲突的情况下，将会由专利说明书，包括定义，决定。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而预想并非是进行必要的限制。
附图说明
本发明一些实施方式在本文中仅作为示例的方式参照附图进行了描述。现在具体详细地参照附图，需要强调的是所示的详情是通过举例的方式和对本发明实施方式举例说明性讨论之目的。在这方面，采用数字的描述，使本领域中技术人员清楚地知晓如何能够实施本发明的实施方式。
在附图中：
图1是举例说明当与细菌共培养时提高藻类培养物光生氢气初始产量的直方图。莱茵衣藻连同装于透析袋中的荧光假单胞菌一起培养于带搅拌的密封Roux培养烧瓶中的无硫TAP培养基中。密封7.5h后除去细菌，重新密封培养基，并在达到微氧/厌氧条件之后，检测气体的变化，在观察到气体产生之后第一个14h内收集气体，分析并定量气体。氢产量表示为每升培养基的毫升体积。左柱型——藻菌共培养。右柱型——未加细菌的藻类培养物中的氢产量；
图2是一个直方图，图示说明当与细菌共培养时提高藻类培养物光生氢气总产量的直方图。莱茵衣藻连同装于透析袋中的荧光假单胞菌一起培养于带搅拌的密封Roux培养烧瓶中的无硫TAP培养基中。密封7.5h后除去细菌，重新密封培养基，并在达到微氧/厌氧条件之后，检测气体的变化，在气体产生之后收集气体，分析并定量直至气体产生停止。氢产量表示为每升培养基的毫升体积。左柱型——藻菌共培养。右柱型——未加细菌的藻类培养物中的氢产量；
图3是相比于未加入细菌的相同藻类培养物中的气体产量，采用于细菌共培养的藻类培养物中气体产生快速和增强的图形演示。莱茵衣藻连同装于透析袋中的荧光假单胞菌一起培养于带搅拌的密封Roux培养烧瓶中的无硫TAP培养基中。密封7.5h后除去细菌，重新密封培养基，并在达到微氧/厌氧条件之后，检测气体的变化，通过排水法收集于量筒中的气体从密封之时起进行72h分析和定量，而在第一个12h期间频繁检测。气体产量表示为随时间（h，X轴）变化的mL体积（Y-轴）。阴影菱形
Figure BDA00002356724400081
藻菌共培养。开放菱形
Figure BDA00002356724400082
不加细菌的藻类培养物中的气体产量。请注意，第一个36h期间内藻菌共培养基中气体产生的快速动力学，而在仅仅藻类的培养基内没有显著的气体产生。
具体实施方式
本发明，在其一些实施方式中，涉及藻类中产生氢气的光催化方法，而更具体而言，而非唯一地，涉及藻菌共培养增强动力学和提高藻菌光生产生氢的产率。
在详细解释说明本发明至少一个实施方式之前，应该理解到，本发明并不仅限于其随后的描述中提及或通过实施例举例说明的细节之应用。本发明能够是其他实施方式或按照其他方式实践或实施。此外，应该理解到，本文中采用的措辞和术语是出于描述之目的，而不应该被视为限制。
分子氢是取代或补充化石燃料作为清洁能源的候选能源。天然生物法产生氢是以存在于某些绿藻和能够接收来自光系统I（PSI）的电子及其转化成氢气的光合细菌中的氢酶之存在为基础的。然而，FE-氢酶对氧的极端敏感性对于这种途径需要光生产生氢的厌氧条件。采用这种途径藻类的分子氢产量由于许多原因是很有限的，其中之一是对于生物体光照的同时启动微氧/厌氧条件的剥硫延长的严重后果。
本发明的发明人曾试图通过在剥硫的早期阶段的期间向藻类培养物中加入细菌解决这个问题。本发明的发明人发现，尽管细菌共培养具有潜在毒性，但是向光合藻类的培养基中加入细菌培养物，在剥硫期间，能够能够显著缩短潜伏性进行厌氧培养条件建立的正常长度的时间，这反过来允许所培养的藻类光生产氢相比于未加入细菌培养的类似藻类培养物更加快速（参见实施例Ⅰ，图I和图3）。与细菌共培养之后的藻菌光生产氢比未加细菌的培养基中的记录情况也更加强烈（参见实施例I和图3）。
因此，根据本发明一个实施方式的一个方面，提供了一种产生氢气的方法，所述方法按序包括：
（a）在繁殖培养基中繁殖光合藻类，所述繁殖培养基含有硫；
（b）在培养基中将所述藻类与细菌共培养足够长的一段时间而确保氧降低的培养条件，其中相比于所述繁殖培养基所述培养基包含的硫含量降低；
（c）在这种培养基中耗损至少一些细菌而产生细菌减少的培养基；
（d）在这种培养基中培养所述藻类足够长的一段时间而确保厌氧培养条件；
（e）在这种培养基中于厌氧培养条件下培养所述藻类，由此产生氢气；和
（f）收集所述氢气。
正如本文中所用的术语藻类，水藻等，是指属于原生植物门的藻类亚门的植物。这种藻类是单细胞光合藻类并属于无更、无茎或叶的非寄生植物；它们包含叶绿素，而所具有的尺寸从显微尺寸至大型海藻有很大差异。在本发明一些实施方式中，使用了绿藻，其属于真核生物—绿色植物界—绿藻门—绿藻纲。绿藻纲非限制性的实例包括杜氏藻目（Dunaliellales）、团藻目、绿球藻目、鞘藻目、环藻目、胶毛藻目、微孢藻目和四胞藻目。在一些具体的实施方式中，这种藻类选自由海洋绿藻，类球红菌和莱茵衣藻组成的组。
在一些具体的实施方式，使用了莱茵衣藻，其属于团藻目—衣藻科。在其他具体实施方式中，使用了菌株莱茵衣藻CC125。然而，在本发明中有用的藻类也可能是蓝绿色，红色或棕色的，只要这种藻类能够产生氢即可。这种光生产氢能力，在自然界中，是由能够将电子传递至氢而产生分子氢的Fe-氢酶存在所赋予的。因此，在一个具体实施方式中，这种藻类包括具有Fe-氢酶的藻类。适用于本发明的藻类包括，但不限于，天然存在的藻类（野生型），栽培藻类菌株，由杂交和选择工艺过程和遗传改性藻类产生而具有专门增强性状的藻类菌株。例如，梅利斯等已公开了硫摄取降低的突变藻类（US20050014239），而Yacobi等已经公开了含遗传改性的铁氧化还原蛋白和氢酶的藻类（参见，例如，US20100203609，US20090263846）。具有专属特性的藻类也可用于本发明一些实施方式的一些方面，例如，具有改性光敏性或光合作用组件的突变藻类（参见，例如，Grossman et al，Photosynth Res 2010；106:3-17）。突变体藻类及其生产和筛选的方法，等等由Plummer等（US20100273149）和Hankamer等（US20090221052）公开。
根据一些实施方式，这种藻类按照独立的、纯化的藻类培养物提供。在其他实施方式中，这种藻类繁殖培养基基本上没有细菌封闭壳内所包含的细菌。
衣藻培养的通用方法在本领域是公知的，而详细描述于《衣藻手册》（Chlamydomonas Handbook）（Harris，San Diego CA，Academic Press，2009，其内容结合于本文中作为参考）。藻类中光生产氢的一般方法详细描述于Hemschemeir等的论文（Photosynth Res 2009；102:523-40）中，其内容结合于本文中作为参考。
正如本文所用的词“培养”是指在有利于其保持生命力的培养基中维持活体细胞。许多培养基不仅有助于生命力，而且也有助于在合适环境条件下生长。正如本文所用的术语“生长”则定义为培养基的扩展，即在规定的一段时间培养基中的生物数量增加。最常见的生长培养基包括肉汤，明胶和琼脂，所有这些都包括作为一个组分的硫。这种培养基可能是固体或液体。培养可以按照商业规模上进行，或者在单个陪替氏培养皿中进行。
正如本文所用的术语“繁殖培养基”是指有利于合适环境条件下藻类生长的培养基。繁殖培养基，正如在本文中所用，通常含有硫化合物，其量足以维持光合藻类的光合作用。适用于本发明一些实施方式中的繁殖培养基一个非限制性例子是包含硫化合物的TAP，Tris-醋酸盐-磷酸盐。在一些实施方式中，这种繁殖培养基包含约0.05至约0.25mmol作为MgSO4、FeSO4、ZnSO4和/或CuSO4的硫。在一个具体实施方式，这种繁殖培养基包含约0.1至约0.15mmol的硫。根据本发明一些实施方式，这种繁殖培养基没有细菌封闭壳内所含的细菌。
正如本文中所用的术语“培养基”是指维持藻类处于有极少或没有生长的活体状态下一段持续培养时间的培养基。在一个实施方式，这种培养基相比于繁殖培养基所具有的硫含量降低，以至于在这种硫含量降低的培养基中培养光合藻类导致光合作用途径的放氧功能受到抑制，产生微氧或，表观上厌氧的条件。适用于本发明的培养培养基包括，但不限于，TAP培养基，其中的硫化合物（如硫酸盐）由等摩尔当量的含氯化合物代替。在水藻封闭壳内的好氧状态可以通过测定培养培养基中或培养培养基样品中的溶解氧进行监控。例如，溶解氧能够采用克拉克电极进行测定。
在一些实施方式中，这种培养培养基的硫含量(摩尔当量/升)为繁殖培养基硫含量(摩尔当量/升)的约50%，约40%，约20%，约10%，约08%，约05%，约01%或更低。在另一具体实施方式中，这种培养培养基基本上没有硫化合物。
应该理解到，藻类从繁殖培养基转入贫硫培养培养基必须进行藻类冲洗，才能出去痕量的硫。藻类能够通过温和离心（例如，室温下以3,500-5000g离心2~3min）收获，在所需的培养基中温和再悬浮进行冲洗。这可以按照必要情况进行重复而除去硫化合物。
正如本文中所用的术语“共培养”，是指在相同培养系统中同时培养两种或多种生物。水藻共培养的一个非限制性实例是在足够维持藻类和所加生物的生命力，和/或一种生物或另一种或这两种生物生长的条件下向藻类培养物中简单加入第二生物（例如，细菌）。应该理解到，本文中所用的“共培养”，是指至少依据细菌/藻类类型或组分和/或其浓度在自然界不存在的人造培养基。
在本发明一些实施方式中，藻类与细菌一起进行共培养，才能缩短剥硫和建立藻类产氢的微氧和/或厌氧条件之间的潜伏期。在一个具体实施方式中，细菌是耗氧细菌，如专性好氧或兼性厌氧细菌。微需氧细菌，厌氧细菌和耐氧细菌并不消耗显著大量的氧，但如果发现这种细菌在降硫培养基中与光合藻类共培养时有助于降低溶解氧，也能够适用于本发明。本发明中中适用于的好氧细菌的非限制性列表包括芽孢杆菌属，诺卡氏菌属，Myco细菌，假单胞菌属等。在一个具体实施方式中，好氧细菌是假单胞菌属细菌。在一些具体的实施方式，好氧细菌是荧光假单胞菌，而藻类是莱茵衣藻。
藻类封闭壳能够包含以一定数量的细胞密度培养的藻类。培养基中或共培养基中的藻类密度包括约103至约108个藻类细胞/mL，约104至约107个藻类细胞/mL，约105至约106个藻类细胞/mL。在一个具体的实施方式中，共培养基中的藻类密度包括（3~6）×106个细胞/mL。在另一个具体实施方式中，共培养基中的藻类密度包含（3~6）×107个细胞/mL。细菌细胞通常由新鲜的中等对数期细菌培养物，在建立微氧/厌氧条件之前可稀释高达1:10或更多倍使用。在一个具体的实施方式，对于每升的共培养基，来自1L细菌培养物的中等对数期细菌细胞被制成小球，在培养基中按照约1:10稀释，而将一定体积的稀释细菌培养物按照本文中详述的比率引入到细菌封闭壳中。
这种藻菌共培养基能够包含从约1:1藻类/细菌比，至约1:2，约1:3，约1:4，约1:5，约1:10，约1:20，约1:30，约1:40，约1:50，约1:60，约1:70，约1:80，约1:90，约1:100，约1:150，约1:200，约1:400，约1:500，1:1000的藻类/细菌比，或更大的不同藻类/细菌比生物比率。藻菌共培养基中的藻类/细菌比率也能够按照体积表示—因此，根据本发明一些实施方式，共培养基的藻类和细菌组分是分开的，由此这种共培养基包含藻类封闭壳和细菌封闭壳，而共培养基中的藻类培养物体积比细菌封闭壳中细菌体积大约1~100倍，比细菌封闭壳中细菌体积大约5~50倍，比细菌封闭壳中细菌体积大约10~40倍，比细菌封闭壳中细菌体积大约20~30倍而比细菌封闭壳中细菌体积大约20~25倍。在具体实施方式中，共培养基中的藻类培养物体积比细菌封闭壳中细菌体积大约20倍，例如，在细菌封闭壳中约50mL细菌培养物而在藻类封闭壳内约1L藻类培养物。
根据一些实施方式，这种细菌和藻类共培养于独立封闭壳内。在一些实施方式中，这种封闭壳的分离是为了改善藻类培养物的光照效率。在其他实施方式中，分开操作使细菌封闭壳能够很简单地将细菌封闭壳引入和移出系统，例如，在剥硫后接近微氧/厌氧条件之后减少和/或除去细菌培养物，或在收集氢气之前从藻类培养物中减少或除去细菌培养物。
根据本发明的一些方面，藻类和细菌的封闭壳流体连接而通过流体和气体可渗透而细菌不可渗透的屏障相互分离。正如本文中所用的术语“流体连接”是指流体能够在藻类和细菌的封闭壳之间移动的能力。这种流体连接能够引导流体连接，例如，其中细菌封闭壳浸没于藻类封闭壳的培养基中，或远离而间接进行流体连接，例如，通过流体连接器如管道、管道系统、通道、导管等方式连接。在一个实施方式中，远离而间接流体连接包括藻类封闭壳的容器和细菌封闭壳的独立远程容器，通过合适的管道系统（例如，塑料，玻璃，橡胶，不锈钢）连接，可选地进一步包括泵送设备，过滤设备和控制设备（例如，阀门）而将培养基在两种封闭壳之间循环通过。藻类和细菌的封闭壳可以处于烧瓶、槽、池、套管、反向流设备，中空纤维等中，或专门设计的生物反应器中。例如，藻类和细菌的封闭壳能够是任何尺寸的，而能够容纳的体积范围为约0.1~1L，1L~约10L，10升~约1000L，1000~约10,000L，50,000L或更大。在大型池子或生物反应器的情况下，可以设想10~100，1000和更多立方米的体积。在一个具体实施方式中，藻类封闭壳是一个1.1L的Roux培养瓶而细菌封闭壳是50mL的透析袋。藻类和细菌共培养的方法和生物反应器在本领域内是众所周知的，而例如详细描述于《衣藻手册》（Chlamydomonas Handbook）（Harris，San Diego CA，Academic Press，2009，其内容结合于本文中作为参考）。为其用途的专用光生物反应器和方法由Eriksen进行了详细描述（Biotechnol Letters，2008；1525-36，其内容结合于本文中作为参考）。在一些实施方式中，这种细菌封闭壳进一步包括碳源，例如葡萄糖、淀粉，脂质，蛋白等。
产氢是在“微氧条件”下进行的，这种微氧条件是指保持最小氧浓度而使之避免氢酶失活，并且一般是指基本上厌氧的环境。为了建立微氧/厌氧条件，藻类或藻菌培养基在引入贫硫培养基之后进行密封。密封可以通过任何排除曝露空气或周围环境气体的工具，如柔性橡胶或氯丁橡胶密封件，玻璃，塑料或橡胶塞，蜡，等，或通过能够设置排出气体的两通或三通或多通阀完成。任选培养基能够在引入贫硫培养基之后用惰性气体（例如，氩）冲洗。
根据本发明一些实施方式的一个方面，藻类和细菌封闭壳通过气体和流体可渗透而细菌不可渗透的屏障相互隔离。这种屏障通常包括多孔过滤器，和/或具有孔小足以排阻细菌细胞而大至足以容许流体和培养基小分子组分自由通过的孔道的膜。这种屏障可以包括MicroporeTM或MilliporeTM过滤器，而可渗透性小于50nm孔径，坐落于插入藻类和细菌的封闭壳之间的流体连接器中的合适过滤器外壳中。
在另一实施方式中，这种屏障是藻类和细菌的封闭壳之间隔膜和隔离壁的整体部件。
在本发明一个具体实施方式中，这种细菌封闭壳和藻类封闭壳是直接流体连接的，细菌封闭壳浸没于藻类封闭壳的培养基中。在这样一个实施方式中，屏障可能包括大部分，或甚至整个细菌封闭壳表面。在一个非限制性实例中，这种细菌封闭壳包括由气体和流体可渗透而细菌不可渗透的屏障制成的袋子或套管，如透析袋。在一个具体实施方式中，细菌封闭壳是密封的透析袋，而这种屏障是纤维素或类纤维素渗透膜，可渗透高达6kD的分子，由此容许流体和小分子（例如，盐和有机溶质）组分在细菌和藻类封闭壳之间循环通过，但是排阻活的和死亡藻类和细菌细胞，以及大分子碎片。这种细菌封闭壳容许从藻类封闭壳的培养基中轻松引入和移出。
因此，根据本发明一些实施方式，在于藻类共培养之后，这种培养培养基中的细菌被消耗而产生细菌减少的培养基。细菌消耗和产生细菌减少的培养基能够通过从细菌封闭壳中除去部分（例如，1%，5%，10%，20%，40%，50%，75%或更多）细菌，有效减少这种培养培养基中的细菌数目而完成。在一些实施方式中，消耗了约100%的细菌，产生基本无细菌的培养基培养基。在细菌和藻类封闭壳间接流体连接的情况下，这很容易通过如同阀门或塞子一样中断这些封闭壳之间的流体连接而实现。在采用直接流体连接的情况下，如同细菌封闭壳直接浸没于藻类封闭壳内一样的情况，细菌封闭壳能够通过简单机械移出（例如，移出透析袋）而从藻类封闭壳中移出藻类封闭壳，在藻类封闭壳中获得基本无细菌的培养基培养基。根据一些实施方式，藻类和细菌持续共培养，直至耗尽细菌的持续时间为，约0.5，约1，约1.5，约2，约2.5，约3，约3.5，约4，约4.5，约5，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5，约9，约10，约11，约12，约13，约15，约17，约20，约25，约30，约35，约40h或更长时间。在一些实施方式中，藻类和细菌共培养持续时间为约30h。在其他实施方式中，藻类和细菌共培养持续时间为约15h。在其他实施方式中，藻类和细菌共培养持续时间为约7.5h。在其他实施方式中，藻类和细菌共培养持续时间为约4h。
在一些实施方式中，藻类和细菌共培养持续时间直至在高强度光照下光合放氧和细胞呼吸氧气消耗之间达到平衡，例如，藻类细胞呼吸耗氧大于或等于藻类通过光合作用放氧。藻类培养物的氧耗量通过在一段预定的时间（例如，5分钟）内在培养基样品中，或整个培养基中，例如，用克拉克（Clark）电极（有和无碳酸氢钠），或气相色谱仪测量溶解氧而进行测定，而同时培养基或样品无足够光照进行光合作用。在一些实施方式中，藻类和细菌共培养在将藻类培养物转入剥硫培养基中之后立即开始，而细菌部分或完全从共培养基中消耗，此时测量值指示藻类培养物消耗的氧量等于，或大于，藻类光合作用产氧量，这都在高强度光照下进行测量。在一些实施方式中，平衡在约1，约1.5，约2，约2.5，约3，约3.5，约4，约4.5，约5，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5，约9，约10，约11，约12，约13，约15，约17，约20，约25，约30，约35，约40，约45，约50，约55h或更长时间达到。在一些实施方式中，光合放氧和细胞呼吸氧气消耗之间的平衡在约30h内达到。在其他实施方式中，光合放氧和细胞呼吸氧气消耗之间的平衡在约15h内达到。在其他实施方式中，光合放氧和细胞呼吸氧气消耗之间的平衡在约7.5h内达到。在其他实施方式中，光合放氧和细胞呼吸氧气消耗之间的平衡在约4h内达到。
根据本发明一些实施方式的另一方面，在从这种培养基中将消耗细菌之后，密封藻类封闭壳，并将这种藻类培养于这种培养基中足够长的一段时间而确保微氧/厌氧条件，这对于光合藻类中的光生产氢是至关重要的。根据一些实施方式，培养的持续时间，从藻菌共培养开始，直至建立微氧/厌氧条件，为约1，约1.5，约2，约2.5，约3，约3.5，约4，约4.5，约5，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5，约9，约10，约11，约12，约13，约15，约17，约20，约25，约30，约35，约40，约45，约50，约55，约60h或更长时间。在一些实施方式中，培养，从藻菌共培养开始，直至建立微氧/厌氧条件，进行约4~约60h，约10~约40h，和约30h。
根据本发明一些实施方式的另一方面，在密封的藻类培养物中建立微氧/厌氧条件之后，藻类进一步在微氧/厌氧条件下培养而产生氢气。根据一些实施方式，微氧/厌氧条件下的培养持续时间为约1，约1.5，约2，约2.5，约3，约3.5，约4，约4.5，约5，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5，约9，约10，约11，约12，约13，约15，约17，约20，约25，约30，约35，约40，约45，约50，约55，约60，约75，约80，约90，约100，约110，约120h，约6，约7，约8，约9约10或更多天。在一些实施方式中，微氧/厌氧条件下的培养持续时间直至不再检测到放氢为止。
藻类培养物能够在光生产氢效率停止或效率显著损失之后进行再利用。这种藻类能够通过在好氧条件下返回至繁殖培养基（在经过足够冲洗和再悬浮之后），并对藻类光照足够长的一段时间重新建立强有力的光合作用和生长而“复原”，接着根据本发明的方法进行另一周期的光生产氢培养。藻类培养物的再利用通过将藻类粘附至三维半固体或固体载体、基质或凝胶组件，如藻酸盐、塑料珠、纤维、毡垫、薄板等上而能够进一步变得方便，因为这些能够能方便地从培养基或繁殖培养基中移出，冲洗并转入新鲜培养基中。
收集，检测，纯化和计算藻类培养物的氢气产率在本领域中是总所周知的，而详细描述于，例如，《衣藻手册》（Chlamydomonas Handbook）（Harris，San Diego CA，Academic Press，2009，其内容在此引用作为参考）和Hemschemeir等的论文（Hemschemeir et al，Photosynth Res 2009；102:523-40），其内容在此引用作为参考。根据一个具体实施方式，藻类培养物产生的气体经由管道排出，通过排水法收集，记录体积并通过，例如，克拉克电极，和/或色谱仪，如气相色谱分析气体组分。
正如本文所示，根据本发明的方法与所加细菌共培养的藻类培养物比未加细菌的相同培养基产生氢气更迅速，而产生的氢气量更大（参见实施例I，和附图1，2和3）。缩短藻类开始在减硫培养基中培养而建立能够光生产氢的微氧/厌氧培养条件的时间长度，无论是根据培养基中藻类的存活力还是根据藻菌光生产氢的商业价值，相比于藻类生产的竞争方法，都极具重要意义。因此，根据本发明一些实施方式的一些方面，提供了一种产生氢气的方法，这种方法包括
（a）在繁殖培养基中繁殖光合藻类，所述繁殖培养基含有硫；
（b）在相比于所述繁殖培养基包含的硫含量降低的培养基中培养所述藻类足够长的一段时间而建立厌氧培养条件，其中这个培养与所加细菌共培养至少一部分所述时间长度；
（c）在这种培养基中于厌氧培养条件下培养所述藻类，由此产生氢气；和
（d）收集氢气，
其中相比于未与所加细菌共培养的藻类类似培养时间长度步骤（b）厌氧培养条件的时间长度减少。
在一些实施方式中，厌氧条件的时间长度减少至未与所加细菌共培养的藻类相同培养基中好氧条件的时间长度的约90%，约80%，约75%，约70%，约60%，约50%，约40%，约30%，约25%，约20%，约15%，约10%或更短。
在本发明一些实施方式中，这种培养，从藻菌共培养开始，直至建立微氧/厌氧条件，进行约4~约60h，约10~约40h和约30h。在一些实施方式中，共培养的藻类培养物微氧/厌氧条件的时间长度为未共培养的藻类培养物微氧/厌氧条件的时间长度的约50%。因此，在一些实施方式中，足以建立微氧/厌氧条件的至少一部分时间长度为约1，约1.5，约2，约2.5，约3，约3.5，约4，约4.5，约5，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5，约9，约10，约11，约12，约13，约15，约17，约20，约25，约30，约35，约40，约45，约50，约55，约60h。
藻类培养物光生产氢需要光照。在一些实施方式中，光照提供于微氧/厌氧条件下培养藻类的期间。在一些实施方式中，光照提供于整个该方法的任何或所有步骤。在其他实施方式中，暗适应时间能够可选地包括于建立微氧/厌氧条件的期间。在一些实施方式中，黑暗时间从这种藻类剥（消耗）硫开始延长1，约1.5，约2，约2.5，约3，约3.5，约4，约4.5，约5，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5，约9，约10h或更长时间。在其他实施方式中，黑暗时间从剥硫开始延长5h。
在一些实施方式中，光照强度在该方法的不同部分期间是不同的。例如，在藻类的繁殖期间光照强度的范围可能出于100~250μmol光子·m-2·s-1的范围，而在剥硫和建立微氧/厌氧条件期间光照强度可能较低，而随后在微氧/厌氧培养条件下培养产氢和收集期间增大。确定光照强度要考虑的因素包括，但不限于，藻类培养中的光敏性，藻类培养物中的密度和藻类培养物的光可渗透性/不透明性，剥硫和微氧/厌氧条件下培养的代谢结果（例如，产生游离自由基，代谢废物等）。
光照通常外部提供。光照可以是自然光照，如阳光，或人工合成和提供的。对于阳光，本发明的方法通常户外实施，利用白昼期间可供使用的太阳光。其他人工光照能够在黑夜期间加入。如果需要，降低光照能够通过容器、生物反应器、槽罐、池子或其他藻类封闭壳遮光而实现。在一些实施方式中，光照可选地内部提供，即从藻类封闭壳内部，例如，通过浸没于藻类或藻菌培养基中光照装置提供。在另一实施方式中，藻类封闭壳围绕光源设计。
人造光照能够通过白炽灯，荧光灯，LED或其他光源提供。在一些实施方式中，这种光照通过荧光或LED光照，以最小化强光照期间产生的热量。在光照进行光生产氢期间，光可能来自人造光源或自然阳光，并必须足以进行光合作用。在一个实施方式中，这种光强度为15~3100μmol光子·m-2·s-1（而所有的范围为，如100~3000，1000~2000，1200~1800等）而光照持续高达120h（但可能进行较短时间，如24，48，64或96h）。可选地，可以使用高强度光照的光源提供约1300μmol光子·m-2·s-1的强度。在一些实施方式中，光生产生氢期间的光照为80μE。在一些实施方式中，光生产生氢期间的光照为200μE。
由于藻类是海洋生物，对光合作用途径中最有效的那些藻类优化光照波长可能是有利的。在野生型藻类，以及许多改性的藻类中，光化光照（类似于通过水过滤阳光）是最有效的，而能够通过照射通过1％w/v的CuSO4溶液实现。
在本发明一些实施方式中，藻类培养物和/或与细菌共培养在环境温度下实施。在其他实施方式中，温度经过控制，例如，保持培养基中约25℃。生物反应器中温度控制的方法在本领域中公知的。
进一步根据本发明的一些方面，提供了一种产生氢气的系统，所述系统包括：
（a）密封培养容器（或多个容器），包含在相比于藻类繁殖培养基硫含量降低的培养基中共培养的光合藻类和细菌；
（b）培养容器光照光源；和
（c）从所述培养容器收集氢气的装置，
其中所述细菌包含于流体连接于藻类封闭壳的细菌封闭壳内，这种藻类封闭壳由此通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障与之隔离。
本发明的系统能够以进一步包括：用于在其各自的封闭壳内搅拌细菌和/或藻类培养物的装置，细菌和藻类封闭壳温度控制装置，用于从藻类和/或细菌封闭壳对培养基和气体采样的装置或气体收集装置，和密封藻类封闭壳建立和维持微氧/厌氧培养条件的合适装置。本发明的系统可以采用藻类和细菌封闭壳之间合适的常见流体连接装置，泵送、循环和流量调节装置，过滤装置和常见的氢气收集装置连接多个系统。培养容器优选由透明或半透明材料制成成形而让光透过。光生物反应器及其使用方法由Eriksen进行了详细描述（Biotechnol Letters，2008；1525-36，其内容完全结合于本文中作为参考）。
通过本发明的方法和系统生成和收集的氢可以通过低温贮藏而存储为压缩气体，液化气体，化学上作为遇热释放氢的化合物等。存储的氢可用于氨生产，石油转化成较轻燃料（加氢裂化），燃料电池等。
预期在由这种应用成熟的专利寿命期间，将会开发出许多相关方法而术语光生产氢的范围预想可推知涵盖所有这种新技术。
正如本文中所用的术语“约”是指±10％。
术语“包含”，“含有”，“包括”，“含”，“具有”和其他词法变化是指“包括但不限于”。
术语“由…构成”是指“包括而限于”。
术语“基本由..构成”是指只要其他成分、步骤和/或部件不会实质性改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性，组合物、方法或结构可能包括其他成分，步骤和/或部件。
正如本文中所用的单数形式“一个”，“一种”和“这种”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可能包括多种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明各种实施方式可能以范围形式呈现。应该理解到，按照范围格式描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该解释为对本发明范围的僵硬限制。因此，范围的描述应该当作具体公开了所有可能的子范围，以及在该范围内的各个数值。例如，描述的一个范围，例如1~6应该视为具体公开的子范围，如1~3，1~4，1~5，2~4，2~6，3~6等，以及在该范围内的各个数，例如，1，2，3，4，5和6。这无论范围的宽度如何都适用。
每当本文中指示一个数值范围时，这意味着包括指定范围内的任何引用数值（分数或整数）。短语“处于/介于”第一个指示数和第二个指示数之间和“介于从”第一个指示数“至”第二个指示数的范围在本文中可以互换使用，而是指包括第一个和第二个指示数及其之间的所有分数和整数。
正如本文中所用的术语“方法”是指完成给定任务的方式，手段，技术和过程步骤，包括但不限于，用于实现一个给定的任务，包括，但不限于，化学，药理，生物，生物化学和医学领域的从业者已知的，或方便由已知的方式，手段，技术和过程步骤开发的那些方式，手段，技术和过程步骤。
应该理解到，本发明的某些功能特性，为清楚起见，描述于独立实施方式的上下文中，也可以在单个实施方式中组合提供。相反，本发明的各种功能特性，为清楚起见，描述于单一实施方式的上下文中，也可以单独提供或以任何合适的子组合或根据合适而在任何其他描述的本发明实施方式中提供。各种实施方式上下文中描述的某些功能特性不要当作这些实施方式至关重要的功能特性，除非这个实施方式在没有这些元件就是无效的。
本文以上内容描绘的和以下权利要求部分要求授权的本发明各种实施方式和方面，将在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例，这些实施例与前面的说明一起，以非限制的方式说明本发明的一些实施方式。
总体上，在此使用的命名和在本发明中使用的实验室步骤包括分子技术，生物化学技术，微生物学技术以及重组DNA技术。这些技术在文献中进行了充分地说明。参见，例如，“Molecular Cloning: A laboratoryManual”Sambrook等人，（1989）；“Current Protocols in Molecular Biology”卷I-III，Ausubel，R.M.编著（1994）；Ausubel等人，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，NewYork(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人(编著)“Genome Analysis: A Laboratory ManualSeries”，卷1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659以及5,272,057中提出的方法；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”，卷I-III，Cellis，J.E.编著(1994)；“Culture of Animal Cell-A Manual of Basic Technique”，Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols inImmunology”卷I-III，Coligan，J.E.编著(1994)；Stites等人（编著），“Basicand Clinical Immunology”(第八版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编著)，“Selected Methods in CellularImmunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可供使用的免疫测定法广泛描述于专利和科技文献中，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771以及5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.编著(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.编著(1986)；“ImmobilizedCell and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to MolecularCloning”Perbal，B.编著(1984)和“Methods in Enzymology”卷1-317，Academic Press；“PCR Protocols:A Guide to Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用结合在此，其程度就像在此完全地提出一样。遍及本文件还提供了其他一般性参考文件。其中的步骤被认为是本领域熟知的并且提供以方便读者。其中包含的所有信息都通过引用结合在此。
实施例I-在藻-菌共培养物中快速地并且增强地光生产分子氢
为了确定需氧细菌的同时培养是否能够促进硫消耗（sulfur depletion）期间的厌氧生活以及增强光合藻类中光生产氢的效率，将细菌与绿藻共培养，并且确定氢生产的动力学和体积。
材料和方法
藻类繁殖：使莱茵衣藻菌株CC125生长于培养皿中的Tris-乙酸盐-磷酸盐固体培养基（pH 7.0）中。
将藻类接种于6个40mL塑料烧瓶中，接种于各自含有硫化合物的20mL Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基（pH=7.0）中，并且在200μmol光子·m2·s-1冷白光连续照射强度下以及在25℃温度下在振荡（80RPM）下孵化持续48小时。在达到藻类对数生长期（~1.2×106个细胞/mL）的0.2之后，将烧瓶中的培养物与2.5L TAP培养基混合于2个1.1L-Roux中并且在连续搅拌以及用空气中5%CO2鼓泡下，在200μmol光子·m2·s-1连续冷白光照射强度下进行生长，直至达到对数生长晚期（~3×107个细胞/mL）。用血球计数仪进行细胞计数来测量培养密度。
细菌培养：在振荡（200RPM）下将荧光假单胞菌种于补充有100μg/mL氨苄青霉素的1.0LLB培养基中，转移到2.0L爱伦美氏（Erlenmeyer）烧瓶中并且在30℃下孵化4小时直至达到对数生长中期。
硫剥夺和光生产氢：藻类培养物在对数生长晚期通过离心（6,000RPM离心10分钟）进行收获并且用无硫化合物的TAP（pH 7.0）培养基（硫化合物用等摩尔的氯化合物替代）洗涤3次，并转入2个各自装有TAP-S (无硫TAP)溶液(pH 7.0)的1.1L反应器（Roux培养瓶）中。
这些反应器用200μmol光子·m2·s-1的冷白光荧光照明进行照射。在硫剥夺的第一个30小时期间，从反应器中移开培养物样品。在黑暗中测量样品的氧呼吸率，紧接着在光照下测量光合作用氧生产量以及氧呼吸作用量。
在30小时之后，当光合作用氧生产量已经降低到等于或小于氧呼吸作用时，用硅橡胶隔膜将反应器密封。
通过排水法将释放的气体收集在量筒中。
在孵化结束时，对反应器顶空的气体取样，并且确定产生的氢气量（浓度X体积）。
细菌共培养：在离心机中将细菌培养物（1L）粒化，并分离上清液。然后将培养物洗涤，悬浮于50mL无硫TAP，pH 7.0中（也用于藻类），并放入配合反应器尺寸填装的透析袋（6Kd截止值）中。加入0.5％葡萄糖。在硫剥夺开始时将细菌培养物加入藻类培养物中。
氢气收集和测量：如上所述，在产氢期间通过排水法将来自反应器的氢气收集到量筒中，或从反应器顶空取样。在50°C温度下在TCD检测器（30m）柱中通过气相色谱法测量1.0mL样品中的氢，使用氮气作为载气。根据纯氢的标准品计算出气体混合物中氢的体积。
溶解氧的测定：通过克拉克（Clark）型电极测量溶解氧。在具有和不具有碳酸氢钠下，对从反应器采集的3mL培养物样品，进行黑暗中氧呼吸率测量，紧接着进行光照下光合作用氧生产率测量，减去氧呼吸率，每次测量持续5分钟。在1,300μmol光子·m2·s-1强度下通过幻灯机照射这些样品。光通过填充有1.0%CuSO4（w/v）溶液的40mL塑料烧瓶进行过滤。
结果
通过藻-菌共培养物快速缺氧以及光生产氢气
莱茵衣藻菌株CC125与荧光假单胞菌一起培养。
在第1个实验中，将1L 3-6×106个藻/mL与50mL荧光假单胞菌一起培养于1.1L Roux瓶中。对细菌和藻类的浓度和氧呼吸作用进行测量，并且光强为80微爱因斯坦·m-2·s-1。在7.5小时之后，由于溶解氧水平下降，细菌的氧呼吸作用停止并且从反应器中移出包含细菌的透析管。在无细菌的藻类培养物中，在200微爱因斯坦·m-2·s-1光强度下，在硫剥夺期间，如果没有添加碳酸氢钠，则在40-42小时之后，在光照下藻类光合作用产氧速率等于或小于黑暗中的氧呼吸率。当藻类在硫剥夺情况下与细菌共培养时，从孵化开始约18小时可以达到微氧/厌氧条件。一旦达到厌氧，培养物就开始产氢。（在没有细菌的情况下，达到厌氧条件所花费的时间为约40-50小时）。氢气产量增加超过没有细菌的对照培养物的水平，并且与1.62mL/h/L不添加细菌的培养物相比较，确定为至少3.48mL/h/L培养物。在这个实验中，共培养的藻类培养物产氢持续14小时。收集在量筒中（水下）的气体为20mL，其中8mL确定为氢，而顶空中的气体为260mL，其中44mL是氢。
在第2个实例中，在更长的时间期间内评价了缺氧以及光生产氢。使用野生型莱茵衣藻（菌株CC125）和荧光假单胞菌。与第一个实验一样，将藻类制备于1.1L Roux中，用200μmol光子/m2·s的光强度进行照射。将在30℃下生长至对数生长期0.35的50mL细菌培养物粒化，并放入50mL透析袋中，硫剥夺开始之后进行4小时并且黑暗时间为5小时。然后用硅橡胶隔膜密封培养物，并在80μE下照射。在第一个30小时期间测量光合作用氧生产量以及氧呼吸量。根据采样培养基的测量，共培养培养物中的藻类（在3-6×107密度下），在硫剥夺之后40小时达到缺氧，而对照花费73小时。光生产氢期间光照为80μE。在硫剥夺之后45小时首次检测到氢气释放，而对照是在78小时检测到的。在实验结束时藻-菌共培养物的总体积为1,073mL。收集的氢的总体积为210mL。在共培养的培养物中氢气释放持续70小时，而对照为51小时。共培养的藻类平均氢气释放/h/L为2.8，而对照为1.6。收集在量筒中（在水下）的气体为66mL，其中24mL确定为氢，而顶空气体为225mL，其中187mL为氢。在对照中，收集在量筒中（在水下）的气体为34mL，其中8mL确定为氢，而顶空气体为239mL，其中112mL为氢。
使用和不使用细菌共培养（对于第一个实验）的藻类培养物的性能比较，清楚地表明添加细菌对于藻类产氢的优点。在硫消耗之后56小时检测到明显的氢气释放（培养物中鼓泡）。在生产的第一个14小时内藻-菌共培养系统（与孵育期的细菌共培养的藻类）的产氢速率为：在3×107个细胞/mL的细胞密度下，11.21mL/h/1.0L培养物（总计156mL氢/L），而在生产的第一个14小时内单独藻类的对照培养物的产氢速率为：在3-6×106个细胞/mL的细胞密度下，4.2mL/h/1.0L培养物（总计58.8mL氢/L）（图1）。因此，通过将需氧细菌培养物与光合藻类培养物混合，在生产的第一个14小时内光生产氢提高了2.7倍。
在第二个实验中，对于藻-菌共培养系统而言，光生产氢总量（结合顶空氢气以及通过排水法收集的氢气）（在硫剥夺之后140小时（从高强度光照开始135.5小时）测量的），为196mL，而单独藻类的对照培养物生产总计111mL氢/L培养物（参见图2）。
藻-菌共培养系统和仅有藻类的对照的气体释放测量表明这两种系统总气体产量存在显著差异。当在密封之后在孵化期间以频繁间隔监测在量筒中通过排水法测量的气体体积时，与仅有藻类的对照相比较，在藻-菌共培养系统中，观察到显著更快的气体释放动力学以及更大的气体释放能力。图3显示在仅有藻类的对照培养物中在显著的气体释放之前潜伏期为>36小时，而在培养进行6小时之前就已经从藻-菌共培养物中收集到气体（图3，阴影菱形）。虽然第一个18小时的快速动力学未向后延续，图3清楚地显示与在相同条件下仅有藻类的对照相比较，藻-菌共培养系统的优异的气体生产能力。例如，藻-菌共培养系统在不到24小时就实现收集35mL气体，而相同气体体积（35mL）代表了在仅有藻类的对照系统中通过排水法收集的最大气体体积（参见图3）。
这些结果表明，使用光合绿藻（如莱茵衣藻）以及需氧细菌（如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）），光生产氢的潜伏期得以显著地缩短，并且在硫剥夺条件下使用藻-菌共培养系统，显著地增强了氢气生产的强度。
虽然结合其具体实施方式对本发明进行了说明，应当清楚的是，许多替代方案，变更以及改变对于本领域技术人员应当是显而易见的。因此，所希望的是涵盖落在所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代方案，变更以及改变。
通过引用将本说明书中提到的所有出版物、专利以及专利申请整体结合在此，其程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请明确地并且个别地指出通过引用结合在此。此外，本申请中任何参考文件的引用或鉴别不应解释为承认该参考文件可以作为本发明的现有技术。对于使用小节标题的程度而言，它们不应解释为进行必要的限制。

Claims (34)

1.一种产生氢气的方法，所述方法连续地包括
（a）在繁殖培养基中繁殖光合藻类，所述繁殖培养基包含硫；
（b）在培养基中将所述藻类与细菌共培养持续足以确保减少氧的培养条件的时间长度，其中与所述繁殖培养基相比较，所述培养基包含降低数量的硫；
（c）在所述培养基中消耗所述细菌中的至少一些，从而产生细菌减少的培养基；
（d）在所述培养基中培养所述藻类持续足以确保厌氧培养条件的时间长度；
（e）在厌氧培养条件下在所述培养基中培养所述藻类，由此产生氢气；以及
（f）收集所述氢气。
2.一种产生氢气的方法，所述方法连续地包括
（a）在繁殖培养基中繁殖光合藻类，所述繁殖培养基包含硫；
（b）在包含比所述繁殖培养基降低数量的硫的培养基中培养所述藻类持续足以建立厌氧培养条件的时间长度，其中所述培养是与加入的细菌共培养持续所述时间长度的至少一部分；
（c）在厌氧培养条件下在所述培养基中培养所述藻类，由此产生氢气；以及
（d）收集所述氢气，
其中与未与加入的细菌共培养的藻类的类似培养的时间长度相比较，步骤（b）的厌氧培养条件的所述时间长度减少。
3.一种用于产生氢气的系统，所述系统包括：
（a）包括在与藻类繁殖培养基相比较包含降低量的硫的培养基中共培养的光合藻类和细菌的密封培养容器；
（b）所述培养容器的光照光源；和
（c）从所述培养容器中收集氢气的装置，
其中所述细菌包含于流体连接于藻类封闭壳的细菌封闭壳，所述藻类封闭壳由此通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障与之隔离。
4.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述细菌包含耗氧细菌。
5.根据权利要求2所述的方法，进一步包括步骤（b）之后而步骤（c）之前、或期间在所述培养基中耗损至少一些细菌而产生细菌减少的培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在实施所述耗损之中所述藻类培养物的氧耗量等于或大于所述藻类培养物的光合产氧量，如在高强度光照下测量的。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述细菌减少的培养基基本上没有所述细菌。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述繁殖培养基基本上没有所述细菌。
9.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述培养基基本上没有硫。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中在厌氧条件下所述藻类的培养在光照射条件下实施。
11.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括在光照射条件下在厌氧条件下培养所述藻类之前实施任何这些步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在厌氧条件下培养所述藻类的步骤期间的光照强度要大于在厌氧条件下所述藻类的培养之前的任何所述步骤期间的光照强度。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所有步骤在光照射条件下实施。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细菌包含于流体连接于藻类封闭壳的细菌封闭壳内，所述藻类封闭壳通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障与所述细菌封闭壳隔离。
15.根据权利要求14所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述细菌封闭壳位于所述藻类封闭壳之内而由此通过所述流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障被隔离。
16.根据权利要求14所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述细菌封闭壳是透析袋。
17.根据权利要求14所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述细菌封闭壳远离所述藻类封闭壳而经由流体连接装置与其流体连接，由此通过流体-和气体-可渗透而细菌不可渗透的屏障与之隔离。
18.根据权利要求14所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述细菌封闭壳进一步包含碳源。
19.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述共培养物中的所述藻类体积比所述细菌的体积大约5~50倍。
20.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述步骤（b）中的所述藻类的体积比所述细菌的体积大约20倍。
21.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述共培养物包含约103至约108个藻类细胞/mL。
22.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述共培养物包含约104至约107个藻类细胞/mL。
23.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述共培养物包含约105至106个藻类细胞/mL。
24.根据权利要求1或2所述的方法，其中在（b）和（c）中的所述培养进行约4至约60h。
25.根据权利要求1或2所述的方法，其中在（b）和（c）中的所述培养进行约10至约40h。
26.根据权利要求1或2所述的方法，其中在（b）和（c）中的所述培养进行约30h。
27.根据权利要求25所述的方法或系统，其中所述氢气产量在（b）和（c）中培养所述藻类约30h之后是可检测的。
28.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述藻类包含绿藻。
29.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述藻类包含单细胞的光合藻类。
30.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述藻类包括含有Fe-氢酶的藻类。
31.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述藻类选自由海洋绿藻（Platymonas subcordiformis），紫细菌（Rhodobacter sphaeroide）和莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）组成的组。
32.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述细菌包含耗氧细菌。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述细菌包含专性好氧细菌。
34.根据权利要求1或2所述的方法或根据权利要求3所述的系统，其中所述细菌是荧光假单胞菌。
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