DE2440926B2 - lnjizierbarer 'inaktivierter Impfstoff gegen Hepatitis B und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
lnjizierbarer 'inaktivierter Impfstoff gegen Hepatitis B und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
Es wird angenommen, daß HB-Ag (Hepatitis-B-Anti- r>
gen) ein Virus oder ein virusähnliches Gebilde ist, das beim Menschen Serumhepatitis hervorruft. Plasma-HB-Ag
gehört elektrophoretisch zu den <x- oder j9-GlobuIen und ist bei einer Plasmafraktionierung nach
üblichen Verfahren in den meisten Fraktionen verteilt, -to
Um die Infektiosität von HB-Ag zu beseitigen, wird HB-Ag enthaltendes humanes Plasmaprotein einer
Hitzebehandlung unterworfen. Im allgemeinen wird ein Plasmaalbuminpräparat 10 Stunden auf 60°C erhitzt.
Bei der Verabreichung derartiger Präparate läßt sich ·»·> jedoch die Bildung von HB-Ag (Hepatitis-B-Antikörper)
im Blut nicht beobachten. Offenbar bleibt auch die Antigenität nicht intakt. Da Gewebekulturen von
HB-Ag bisher nicht erfolgreich durchgeführt werden konnten, stand kein Verfahren zur Herstellung von
konzentrierten Impfstoffen gegen Virushepatitis B zur Verfügung.
In der US-PS 37 37 004 ist die Herstellung eines inaktivierten Impfstoffs gegen Virushepatitis B durch 1-bis
3minütiges Erhitzen auf höchstens 98° C eines verdünnten Serums beschrieben, das an Hepatitis B
erkrankten Patienten entnommen worden war. Durch intramuskuläre Verabfolgung dieses Impfstoffs soll das
Auftreten von Virushepatitis B verhindert und bei bereits hervorgerufener Hepatitis der Krankheitsverlauf
gemildert werden. Im allgemeinen wird jedoch auch die Antigenität bei der Hitzeinaktivierung herabgesetzt.
Zur besseren Prophylaxe und Therapie von Virushepati tis B besteht daher ein Bedarf an einem inaktivierten
HB-Ag-Impfstoff mit hoher Antigenität und geringer oder fehlender Infektiosität, der Menschen in großen
Dosen verabfolgt werden kann.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von
HB-Ag enthaltendem humanem Plasmaprotein erhaltenen inaktivierten HB-Ag-Impfstoff mit hoher Antigenität
zu schaffen, der zur Prophylaxe und Therapie von Virushepatitis B beim Menschen eingesetzt werden
kann. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß beim Erhitzen der
wäßrigen Lösung des Plasmaproteins in Gegenwart von Harnstoff oder Guanidin bzw. Guanidin-hydrochlorid
die Antigenität von HB-Ag gesteigert wird, wodurch sich bei der Verabfolgung der Lösung an Menschen eine
starke Antikörperbildung ergibt.
Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Der Impfstoff kann intramuskulär, subcutan oder intracutan gegeben werden.
Eine wäßrige Pufferlösung mit 1% (Gewicht/Volumen) humanem Plasmaprotein und einem HB-Ag-Titer
von 1 :8, gemessen durch gekreuzte Immunelektrophorese
(im folgenden als IES-Verfahren bezeichnet; vgl. Shojiro Nakumura, Electrophoretic Experimental
Methods, S. 287, verlegt bei Bunko-do, 1963), wird durch
Lösen der x- und /?-Globulinfraktionen von humanem Plasma in 0,06-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6
hergestellt Teile dieser Lösung werden bis zu einer Konzentration von 2-m bzw. 6-m mit Harnstoff und bis
zu einer Konzentration von 2-m mit Guanidin versetzt. Diese Lösungen werden jeweils auf Temperaturen von
60 bis 120° C erhitzt. Die Abhängigkeit des H B-Ag-Titers
von der Erhitzungsdauer ist in Tabelle I angegeben.
Lösung
Temperatur
HB-Ag-Titer vor
dem
Erhitzen
dem
Erhitzen
HB-Ag-Titer·) Zeit (Minuten) I 3
30
Zeit (Stunden)
I 3 6
I 3 6
10
24
Phosphatpuffer
60
80
100
120
8x
8x
8x 8x
8x
8x 8x
8x
8x
8x
8x
8x 8x 8x 8x
8x 8x
8x 8x
8x 4x
4x 2x
8x
8x
2x
Ix
8x
4x
2x
0
8x
4x
1 χ
0
1 χ
0
4x
2x
0
0
4x
2x
0
0
Lösung mit | 60 | 8x | 8x | 8x | 8x | 8x | 8x | 8x | 8x | 8* ! | 16x |
2-m Harnstoff | 80 | 8x | 8x | 8x | 8x | 8x | j 16 χ | 16x | 16x | 16x | 16x |
100 | 8x | 8x | 8x | 8x | i 16x I |
16x | 16x | 16x | — | — |
Fortsct/uni!
Lösung | Tempe ratur Γ C) |
HB-Ag- Titer vor dem Erhitzen |
HB-Ag-Titer*) Zeit (Minuten) 1 3 |
8x | 10 | JO | Zeit 1 |
(Stunden) 3 |
6 | 8xJ | 10 | 24 |
Lösung mit | 60 | 8x | 8x | 8x 8x |
8x | 8x | 8x | Sx | 16x 16x |
16x | 8x | |
6-m Harnstoff | 80 100 |
8x 8x |
8x 8x |
J 16x | 8x__J Π 6 χ |
16x 16x |
32 χ 16x |
16x 16 χ |
8x | 16x | 8x | |
120 | 8x | 8x | 8x | 16x | 16x | 16x | 16x | 16x | 0 | 0 | ||
Lösung mit | 60 | 8x | 8x | 8x 8x |
8x | 8x | 8x | 8x! | 16x 16x |
16x | 8x | |
2-m Guanidin | 80 100 |
8x 8x |
8x 8x |
rJ_X„J Γΐ6χ |
16x 16x |
16x 8x |
16x 16x |
8x 8x |
8x 0 |
Die zu untersuchenden Lösungen wurden nacheinander jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt.
*) Als Maß des HB-Ag-Titers wird der Wert für die maximale Verdünnung der Lösung angegeben, bei der sich HB-Ag
nach dem IES-Verfahren noch nachweisen läßt.
**) bedeutet, daß keine Messung durchgeführt wurde.
Die gestrichelte Linie gibt die Grenze für die Erhitzungszeiten und Erhitzungstemperaturen an, bei denen sich der
Hß-Ag-Tiier erhöht.
Aus der Tabelle geht hervor, daß bei Verwendung einer 2- bis 8molaren Harnstofflösung oder einer r>
2molaren Guanidinlösung ein Anstieg des HB-Ag-Titers der Lösung erhalten wird. Dies ist überraschend, da der
HB-Ag-Titer in der Regel beim Erhitzen abnimmt, wie auch bei der Lösung zu ersehen ist, die nicht mit
Harnstoff oder Guanidin versetzt ist. Beispielsweise ergibt sich bei der 6-m Harnstofflösung ein Anstieg des
HB-Ag-Titers nach 10 Stunden bei 60°C, 30 Minuten bei
80°C, 10 Minuten bei 100°C bzw. 3 Minuten bei 120°C. Es besteht eine Tendenz, daß der auf diese Weise
erhöhte HB-Ag-Titer lange Zeit erhalten bleibt und r> anschließend abfällt. Da die Infektiosität mit Zunahme
der Erhitzungsdauer abnimmt und da die zur Erhöhung des HB-Ag-Titers notwendige minimale Erhitzungsdauer
länger ist als die Zeit, dies bisher zur Beseitigung der Infektionsität angewendet wurde, ist es nach den 4ii
erfindungsgemäßen Verfahren möglich, einen HB-Ag-Impfstoff zu erhalten, der im Vergleich zu den nach
herkömmlichen Verfahren erhaltenen Impfstoffen eine stärkere Antigenität und eine geringere Infektiosität
aufweist. 4ί
Der Mechanismus für den Anstieg des HB-Ag-Titers, der sich beim erfindungsgemäßen Verfahren erreichen
läßt, ist noch nicht genau geklärt. Es wird jedoch angenommen, daß Harnstoff oder Guanidin mit dem
HB-Ag unter Modifikation der multidimensionalen ">i>
Struktur des Proteinmoleküls reagieren, wobei mehr antigen wirkende Zentren freigesetzt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Harnstofflösung einer Konzentration von 2- bis 8m,
vorzugsweise 6- bis 8m, oder eine 2molare Guanidinlö- ·>5
sung eingesetzt. Bei relativ niedrigen Konzentrationen sind längere Zeiten bis zum Erreichen des erhöhten
HB-Ag-Titers erforderlich, der dann aber länger anhält.
Im erfindungsgemäß^n Verfahren können nicht nur
HB-Ag enthaltende humane Plasmaproteine verwendet w) werden, die beim Menschen Virushepatitis B hervorrufen,
sondern auch alle anderen Proteine, in denen sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren oder radioimmunologisch
(im folgenden als RIA-Verfahren bezeichnet; vgl. ShigeshiToyosh i ma et al.,»PediatricClinic«[Japan], μ
Bd. 24 [1971], S. 3044) nachweisen läßt. Es können nlso Plasma, Serum und verschiedene durch übliche Verfahren
zur Plasmafraktionierung erhaltene Proteinfraktionen von an Virushepatitis B erkrankten Spendern
verwendet werden.
Wie elektronenmikroskopisch festgestellt wurde, ist HB-Ag von unterschiedlicher Gestalt und Größe.
Ebenso hängt auch die Infektiosität spezifisch von der jeweiligen HB-Ag enthaltenden Plasmaproteinfraktion
ab. Beispielsweise weist eine Fibrinogenfraktion trotz ihres geringen HB-Ag-Gehalts, gemessen nach dem
RIA-Verfahren, eine deutlich höhere Hepatitis-B-Infektiosität auf als andere Plasmaproteinfraktionen. Dies ist
vermutlich der Tatsache zuzuschreiben, daß die Fibrinogenfraktion stark infektiöse Teilchen enthält.
Die nach dem RIA-Verfahren bestimmte HB-Ag-Menge in einer Albuminfraktion entspricht zumindest der in
der Fibrinogenfraktion enthaltenden Menge, während ihre Infektiosität so gering ist, daß sie kaum ausreicht,
Virushepatitis B zu verursachen, wenn das Präparat 10 Stunden auf 6O0C erhitzt wird. Andererseits enthalten
ca- und ji-Globulinfraktionen mehr HB-Ag als die
Albuminfraktion. Demgemäß ist die HB-Ag-Menge, die sich in aus diesen Fraktionen fraktionierten Transferrin-
und Haptoglobulimpräparaten nachweisen läßt, höher als im Albuminpräparat. Werden diese Transferrin- und
Haptoglobulinpräparate jedoch der gleichen Hitzebehandlung wie das Albuminpräparat unterzogen, so
verursachen sie beim Menschen keine Virushepatitis B. Es ist daher anzunehmen, daß das in diesen α- und
jS-Globulinfraktionen enthaltene HB-Ag nur eine
geringe Infektiosität aufweist.
Im Verfahren der Erfindung werden als Ausgangsmaterialien vorzugsweise humanes Plasma und Serum
eingesetzt, die große Mengen an HB-Ag enthalten, insbesondere oc- und jS-Globulinfraktionen, .die große
HB-Ag-Mengen enthalten und eine niedrige Infektiosität aufweisen. Diese Fraktionen werden zweckmäßigerweisfc
als Neben- und Unterfraktionen bei der Gewinnung anderer wertvoller Plasmaproteinfraktionen
erhalten. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Plasmaproteinfraktionen werden nach
üblichen Verfahren zur Fraktionierung von Plasmaproteinen erhalten, beispielsweise durch Fällung mit
Ammoniumsulfat oder durch Fraktionierung mit Äthanol in der Kälte nach Cohn; vgl. E. J. Cohn, L. E.
Strong, W. L. Hughes, D. J. Mulford, J. N. Ashworth.M. Melin und H. L. T a y I ο r, Journal of
the American Chemical Society, Bd. 68 (1946), S. 459. Beispielsweise werden die «- und 0-Globulinfraktionen
als Fraktionen IV und IV-I nach der Cohnschen Fraktionierung oder durch Fällung mit Ammoniumsulfat
bei 35- bis 50prozentiger Sättigung erhalten. Falls die > wäßrigen Lösungen der Proteinfraktionen trübe sind,
können sie zur Erleichterung der weiteren Verarbeitung geklärt werden. Die Klärung wird beispielsweise durch
Zentrifugation oder durch Erhitzen der Lösung auf 60°C bei neutralem pH-Wert und anschließendes
Abfiltrieren der entstandenen Niederschläge durchgeführt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das HB-Ag enthaltende Ausgangsmaterial
in einem wäßrigen Medium in Gegenwart von Harnstoff oder Guanidin erhitzt.
Beispiele für wäßrige Medien sind Wasser und physiologisch verträgliche wäßrige Salzlösungen, insbesondere
physiologische Kochsalzlösung Der pH-Wert der zu erhitzenden Lösung liegt vorzugsweise im
Neutralbereich und wird auf einem Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6,5 bis 7,5, gehalten. Zur Aufrechterhaltung
des pH-Werts wird vorzugsweise ein Puffer verwendet. Als Puffersubstanzen eignen sich anorganische
Salze, wie Phosphate und Carbonate, oder organische Salze, wie Acetate, Trisaminomethan-hydrochlorid
und Glykoll-hydrochlorid.
Die Lösungen werden auf Temperaturen von 60 bis 120°C erhitzt. Die Erhitzungszeit hängt von der
Erhitzungstemperatur ab. In jedem Fall wird die 3» Erhitzungszeit so gewählt, daß sie ausreicht, um die
Infektiosität zu beseitigen und die durch den HB-Ag-Titer wiedergegebene antigene Wirkung zu erhöhen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Erhitzungsdauer gegenüber den bekannten Verfahren r>
verlängert werden. Demgemäß kann bei Verwendung von Harnstoff oder Guanidin in niedrigen Konzentrationen
die übliche Erhitzungsdauer von 10 Stunden bei 60° C, die bisher beispielsweise bei der Hitzebehandlung
von Albuminfraktionen und x- und 0-Globulinfraktionen
angewendet wurden, auf mehr als 24 Stunden bei 100° C verlängert werden. Eine herkömmliche Erhitzungsdauer
von 3 Minuten kann auf Zeiträume von 30 Minuten bis mehr als 6 Stunden ausgedehnt werden. Bei
der Verwendung von Harnstoff oder Guanidin in hohen Konzentrationen können herkömmliche Erhitzungszeiten
von 3 Minuten bei 100° C auf 10 Minuten bis mehr als
6 Stunden verlängert werden. Auch bei anderen Temperaturen lassen sich die herkömmlichen Erhitzungszeiten
verlängern, so daß die Infektiosität gesenkt und die Antigenität gesteigert wird. Wenn innerhalb des
Bereichs der so verlängerten Erhitzungszeiten (bei verschiedenen Temperaturen) eine relativ kurze Erhitzungszeit
gewählt wird, bei der die Infektiosität beseitigt und die Antigenität gesteigert wird, läßt sich
ein HB-Ag-Impfstoff erhalten, dessen Infektiosität nicht höher liegt als die von herkömmlichen Präparaten, und
dessen Antigenität, ausgedrückt durch den HB-Ag-Titer, höher als vor dem Erhitzen ist. Andererseits kann
bei der Wahl relativ langer Erhitzungszeiten innerhalb t>o
des vorerwähnten Zeitraums ein inaktivierter HB-Aglmpfstoff erhalten werden, dessen Antigenität gesteigert
und dessen Infektiosität wesentlich gesenkt oder vollkommen beseitigt ist.
Nach der Hitzebehandlung wird die Lösung gegebenenfalls durch Filtrieren geklärt und anschließend gegen
eine isotonische Lösung, beispielsweise eine isotonische Kochsalzlösung, dialysiert, um Stabilisatoren, Puffersalze
und entstandene niedermolekulare Substanzen zu entfernen. Durch Dialyse unter vermindertem Druck
gemäß einem üblichen Verfahren kann die Lösung gleichzeitig mit der Entfernung der vorgenannten
Verbindungen eingeengt werden. Die so erhaltene Impfstofflösung wird auf eine geeignete Konzentration
eingestellt und anschließend der Sterilfiltralion unterworfen.
Der erfindungsgemäße HB-Ag-Impfstoff weist im Vergleich zu herkömmlichen Präparaten die gleiche
oder eine höhere HB-Ag-Antigenkapazität auf und ist bei seiner Anwendung beim Menschen sicherer.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen HB-Ag-Präparates liegt nicht nur in seiner starken antigenen Wirkung,
sonern auch in seiner starken Antikörperbildung nach Verabfolgung an den Menschen. Werden beispielsweise
durch 1- bis 3minütiges Erhitzen des gleichen Ausgangsmaterials auf 98°C ein Präparat nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren und ein Präparat nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt, die beide in
bezug auf ihren HB-Ag-Titer identisch sind, und werden diese Präparate intramuskulär verabfolgt, so ist die
Antikörpermenge, die sich im Serum des Patienten mit dem erfindungsgemäß hergestellten Präparat bildet,
erheblich größer als die Menge bei einem Patienten, der mit dem herkömmlichen Präparat behandelt worden ist.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich also ein HB-Ag-Impfstoff erhalten, der in seiner Antikörperbildung
aktiviert ist. Dies bedeutet im Zusammenhang mit der Steigerung des HB-Ag-Titers durch Erhitzen,
daß es gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des gleichen Ausgangsmaterials möglich
ist, ein Präparat herzustellen, das eine wesentlich höhere Antikörperbildung als ein herkömmlich hergestelltes
Präparat aufweist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen ist der HB-Ag-Filter durch die maximale
Verdünnung der zu untersuchenden Lösung, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren noch nachweisen läßt,
angegeben. Das HB-Ag enthaltende Serum wird jeweils auf das doppelte Volumen verdünnt. Der HB-Ag-Titer
wird als maximale Verdünnung des Serums angegeben, bei der sich HB-Ag nach dem IES-Verfahren unter
Verwendung eines Standardserums, dessen HB-Ag-Titer 1 χ ist, noch nachweisen läßt.
100 ml Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 1 :8 werden nach dem Chonschen Verfahren mit
Äthanol fraktioniert. Die Fraktion IV-I wird mit Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7,6 eingestellt und
anschließend 10 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach dem Entfernen des entstandenen Niederschlags erhält man
eine klare Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1:16. 180 ml dieser Lösung werden mit Harnstoff bis zu einer
Konzentration von 6-m versetzt und anschließend 1 Stunde auf 85°C erhitzt, wobei sich der HB-Ag-Titer der
Lösung auf 1 : 32 erhöht. Anschließend wird die Lösung unter vermindertem Druck gegen eine isotonische
Kochsalzlösung dialysiert, wobei die Phosphate und der Harnstoff entfernt werden. Sodann wird die Lösung
durch ein Sterilfilter filtriert. Man erhält 80 ml einer injizierbaren Lösung.
Beispie I 2
10 Liter Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 1:4 werden einer üblichen Ammoniumsulfatfällung
unterworfen. Die bei einer 30- bis 50prozentigcn
Ammoniumsulfatsättigung erhaltenen α- und jJ-Globulinfraktionen
werden gegen Wasser dialysiert. Nach dem Entfernen des entstandenen Niederschlags erhält
man eine klare wäßrige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :64. 500 ml dieser Lösung werden bis zu einer
Konzentration von 2-m mit Harnstoff versetzt und anschließend 1 Stunde auf 1050C erhitzt, wobei sich der
HB-Ag-Titer auf 1 :128 erhöht. Anschließend wird die Lösung zur Entfernung des Harnstoffs gegen eine
isotonische Kochsalzlösung dialysiert. Nach dem Abfiltrieren der entstandenen Niederschläge wird durch
Ultrafiltration eine Konzentration bis zu einem HB-Ag-Titer von 1 :2048 erreicht. Sodann wird die
Lösung durch ein Sterilfilter filtriert. Man erhält 21 ml eines injizierbaren Präparats in isotonischer Kochsalzlösung.
1000 ml Sammelplasma mit einem HB-Ag-Titer von 1 :4 werden gemäß dem Cohnschen Verfahren fraktioniert.
Die Fraktion IV-I wird gegen Wasser dialysiert und anschließend 1 Stunde zur Ausfällung unerwünschter
Proteine auf 60°C erhitzt. Nach dem Entfernen der entstandenen Niederschläge durch Zentrifugation wird
zu dem erhaltenen Überstand von 100 ml Volumen eine konzentrierte Ammoniumsulfatlösung gegeben, bis eine
50prozentige Ammoniumsulfatsättigung erreicht ist. Anschließend wird 30 Minuten gerührt, wodurch die
Fällung vervollständigt wird. Die entstandenen Niederschläge werden abzentrifugiert und anschließend in
einer geringen Menge Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen einen Natriumchlorid enthaltenden
isotonischen Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 dialysiert. Man erhält 20 ml einer Lösung mit einem
HB-Ag-Titer von 1 :125. Diese Lösung wird bis zu einer Konzentration von 2-m mit Guanidinhydrochlorid
versetzt und anschließend 20 Minuten auf 100°C erhitzt, wodurch sich der HB-Ag-Titer auf 1 : 250 erhöht. Die in
der Lösung entstandenen geringen Mengen eines Niederschlags werden abzentrifugiert. Die Lösung wird
durch ein Sterilfilter filtriert. Man erhält 20 ml einer injizierbaren Lösung.
Die in Beispiel 2 hergestellte klare wäßrige Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :64 wird 30 Minuten auf
100° C erhitzt. Die erhaltene Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1:16 wird gemäß Beispiel 1
eingeengt. Man erhält eine Lösung mit einem HB-Ag-Titer von 1 :2048. Diese Lösung (im folgenden
als »nicht aktivierter Impfstoff« bezeichnet) und die gemäß Beispiel 2 erhaltene Präparatlösung mit einem
HB-Ag-Titer von 1 :2048 (im folgenden als »aktivierter Impfstoff« bezeichnet) werden analog dem Anwendungsschema
für Freundschen komplettes Adjuvans zur Immunisierung von Kaninchen durch Injektion verwendet.
3 Wochen lang werden jedem Kaninchen pro Woche 0,5 ml Impfstoff sub- und intrakutan verabfolgt.
Sodann wird die Behandlung für einen Monat unterbrochen. Anschließend werden nochmals 3 Injektionen
in der vorbeschriebenen Weise vorgenommen. 1 Woche nach der letzten Injektion wird Blut aus dem
Herz der Kaninchen zur Gewinnung eines Antiserums entnommen. Das Antiserum wird mit humanem
Normalserum, das kein HB-Ag enthält, adsorbiert, um ein spezifisches Aniiserum gegen HB-Ag herzustellen.
Von den Antiseren, die aus 8 mit dem nicht aktivierten
Impfstoff immunisierten Kaninchen stammen, weist eines einen HB-Ak-Titer von 1 :8, drei einen Titer von
1 :4, drei einen Titer von 1 :2 und eines keinen meßbaren Titer auf. Der Durchschnittswert beträgt
1 :3,3. Von den zehn mit dem aktivierten Impfstoff immunisierten Kaninchen zeigen fünf Antiseren einen
HB-Ak-Titer von 1:16, drei einen Titer von 1 : 8, eines einen Titer von 1 :2 und eines einen Titer von 1. Der
Durchschnittswert beträgt 1 :10,7. Dies zeigt, daß bei
K) Immunisierung von Kaninchen mit aktivierten bzw. nichtaktivierten Impfstoff, die in bezug auf ihren
HB-Ag-Titer gleichwertig sind, der Antikörpertiter der mit dem aktivierten Impfstoff immunisierten Kaninchen
etwa dreimal so groß ist wie der Antikörpertiter, der mit
η dem nichtaktivierten Impfstoff immunisierten Kaninchen.
Wird außerdem der zweifache Anstieg im HB-Ag-Titer des aktivierten Präparats berücksichtigt,
der auf den Zusatz von Harnstoff oder Guanidin zurückzuführen ist, so ist die Antikörperbildung des
aktivierten Impfstoffs etwa sechsmal größer als die des nicht aktivierten Impfstoffs.
Die Wirkung des Impfstoffs wird durch folgenden klinischen Versuchsbericht erläutert.
r> Versuch 1
Jeweils 0,05 ml eines gemäß Beispiel 2 hergestellten Hepatitis-B-Impfstoffes mit einem HB-Ag-Titer von
1 :64, bestimmt nach der Methode der gekreuzten
jo Immunelektrophorese (IES-Verfahren), werden subcutan
5 männlichen freiwilligen Probanden (25 bis 60 Jahre alt; Krankenhauspersonal einer Plasmafraktionier- und
-Sammelabteilung) mit HB-Ag und HB-Ab negativem Serum injiziert. Der HB-Ag-Titer wird durch den
Radioimmuntest, der HB-Ab-Titer durch den passiven Hämagglutinationstest bestimmt. 30 Tage nach der
Impfung werden von den Probanden Serumproben entnommen. Sämtliche 5 Probanden sind HB-Ag
negativ, während sie in allen Fällen HB-Ab positiv sind.
Der Titer im passiven Hämagglutinationstest beträgt 1 :32, 1 :256, 1 :4096, 1 :16 384 und 1 :32 768. Bei
sämtlichen Probanden sind die SGOT- und SGPT-Werte normal.
Versuch 2
An 108 bis 165 männlichen Probanden aus Krankenhauspersonal einer Plasmafraktionier- und -sammelabteilung,
die nicht geimpft wurden, wird während eines Zeitraumes von 3 Jahren der HB-Ag-Titer, der
so HB-Ab-Titer und die Leberfunktion untersucht. Bei 5 bis 8% ist das Serum HB-Ag positiv, bei 20 bis 38% ist es
HB-Ab positiv und bei 1 bis 4% der Fälle liegt der Wert für SGOT und/oder SGPT oberhalb 100.
Bei 3 Personen wurde wahrend des Zeitraumes von 3 Jahren eine Hepatitis diagnostiziert. Von diesen 3
Patienten waren 2 Patienten HB-Ag positiv und ein Patient HB-Ag und HB-Ab negativ.
Die SGOT- und SGPT-Werte wurden nach Kar-
menu. Mitarb., J. Clin. Invest., Bd. 34 (1955), S. 126 und
Proc. Soc. Exp. Bio!. Med., Bd. 91 (1956), S. 196 bestimmt.
Aus den Ergebnissen ergibt sich folgendes Bild:
Bei den geimpften Versuchspersonen wurde kein HB-Ag-Träger gefunden;
nach der Impfung wurde ein relativ hoher Prozentsaz der Personen HB-Ab positiv.
Bei den HB-Ab positiven Personen war das Risiko des Auftretens einer Hepatitis signifikant geringer.
Claims (2)
1. Durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von Hepatitis-B-Antigen enthaltendem humanen Plasmaprotein
auf Temperaturen von 60 bis 120° C hergestellter injizierbarer inaktivierter Impfstoff
gegen Hepatitis B, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Erhitzen der Lösung in
Gegenwart von Harnstoff einer Konzentration von 2- bis 8molar oder Guanidin einer Konzentration
von 2molar in einem pH-Bereich von etwa 5 bis 9 und anschließendes Entfernen des Harnstoffs bzw.
Guanidins hergestellt worden ist.
2. Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren inaktivierten Impfstoffes gegen Hepatitis B nach
Anspruch 1 durch Erhitzen einer wäßrigen Lösung von Hepatitis-B-Antigen enthaltendem humanen
Plasmaprotein auf Temperaturen von 60 bis 120° C, dadurch gekennzeichnet, daß das Erhitzen der
Lösung in Gegenwart von Harnstoff einer Konzentration von 2- bis 8molar oder Guanidin einer
Konzentration von 2molar in einem pH-Bereich von etwa 5 bis 9 durchgeführt wird und anschließend
Harnstoff bzw. Guanidin entfernt werden.
K)
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