DE2518546A1

DE2518546A1 - Kontrazeptiver impfstoff

Info

Publication number: DE2518546A1
Application number: DE19752518546
Authority: DE
Inventors: Gursaran Parshad Talwar
Original assignee: All India Institute of Medical Sciences AIIMS
Current assignee: All India Institute of Medical Sciences AIIMS
Priority date: 1975-01-28
Filing date: 1975-04-25
Publication date: 1976-07-29
Also published as: NL7505412A; US4161519A; FI54997C; DK145283B; NO145083C; DK206975A; IL47177A; FI751746A; CA1054937A; SE7505411L; NO145083B; SE432706B; IL47177A0; AR217615A1; NO751680L; CH614626A5; SE432526B; SE7807571L; DK145283C; FI54997B

Description

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff zur Verhinderung der Schwangerschaft sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Impfstoffes; erläutert wird ferner die Art der Anwendung dieses Impfstoffes, um Schwangerschaften zu verhindern.

Es gibt zahlreiche Methoden, um die Fortpflanzungsfähigkeit zu steuern und unerwünschte Schwangerschaften zu verhindern oder abzubrechen. Es gibt auf dem Markt zahlreiche mechanische Hilfsmittel wie Kondome und Intrauterinpessare, chemische Verhütungsmittel wie spermicide Cremes und Gelees, Schaumtabletten sowie oral einzunehmende Dragees und anderes mehr. Diese verschiedenen Mittel sind in unterschiedlicher wirksam und in ihrer Anwendungsmöglichkeit beschränkt. Die meisten von ihnen setzen eine konstante Motivierung auf Seiten der Gebraucher voraus;

*¥eise

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ORIGINAL INSPECTED

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manche sollen nur unter fachärztlicher Überwachung angewandt werden.

Die Entwicklung von immunologischen Methoden zur Beeinflussung der Fruchtbarkeit beruht auf Versuchen, die mindestens bis zum Beginn dieses Jahrhunderts zurückreichen. Eine Anzahl von Versuchen werden von Albert Tyler in "Approaches to the Control of Fertility Based on Immunological Phenomena", Journal of Reproduction and Fertility, (1961)2-, Seiten 473-506 beschrieben.

Zu den in den letzten Jahren von Forschern unternommenen Versuchen gehören die Immunisierung mit Placenta- und Fötusmaterial und mit Hormonen. Bisher ist aber trotz allem noch kein wirksamer kontrazeptiver Impfstoff entwickelt worden.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß durch aktive Immunisierung eine Antikörper-Reaktion auf ein für die Entstehung und Erhaltung der Schwangerschaft kritisches Hormon hervorgerufen werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein kontrazeptiver Impfstoff zur wirksamen Verhinderung von Schwangerschaft, der frei ist von unangenehmen und schädlichen Nebenreaktionen. Der Impfstoff erzeugt Antikörper mit minimaler Kreuzreaktion mit anderen endogenen Hormonen bei physiologischer Dosierung. Der Impfstoff kann von medizinische:m Hilfspersonal verabreicht werden und erfordert nur periodisch zusätzliche Behandlung.

Es hat sich gezeigt, daß ein Impfstoff zur Verhinderung der Schwangerschaft bereitgestellt werden kann, wenn man ein Konjugat aus einem als Antigen bzw. Immunogen wirkenden Träger mit einem Präparat der ß-Subeinheit von Choriongonadotropin (HCG) herstellt, wobei dieses Präparat frei

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ist von Faktoren, die mit hoher Affinität mit anti-LH Seren wirken können. Dies wird erreicht mit Hilfe von Verfahren, die die Kreuzreaktionsfreudigkeit mit luteinisierendem Hormon (LH) auf ein Minimum herabmindern, beispielsweise durch Immunosorption mit heterologem LH Antiserum vor der Konjugation. Im einzelnen enthält der kontrazeptive Impfstoff Konjugate der genannten Träger mit einer Substanz aus einer der folgenden Gruppen:

1. C-endständigen Fragmenten der ß-Subeinheit von HCG, die 30 bis 38 Aminosäurereste aufweisen,

2. das Nitroderivat der ß-Subeinheit von HCG und

3. die immunochemisch gereinigte ß-Subeinheit von HCG,

wobei alle Substanzen frei sind von Faktoren, die mit hoher Affinität mit LH Antisera reagieren können. Der Begriff immunochemisch gereinigt bedeutet in diesem Zusammenhang Behandlungen, durch die solche Faktoren aus dem ß-Subeinheitpräparat entfernt werden, die die Bildung von Antikörpern verursachen würden, welche mit endogenem LH kreuz- bzw. wechselseitig reagieren würden. Der Impfstoff nach der Erfindung ist im wesentlichen frei von Kreuzreaktion mit anderen endogenen Hormonen, beispielsweise den Hypophysenhormoner} die für die normale Funktion der Fortpflanzungsorgane benötigt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die ß-Subeinheit von der o^-Subeinheit von HCG mit Hilfe bekannter Verfahren abgetrennt, darauf mit Hilfe bekannter Mittel chemisch gereinigt und schließlich immunochemisch gereinigt unter Verwendung eines heterologen Anti-LH~-Immunosorbens, Der Impfstoff enthält in einer bevorzugten Ausführungsform ein Konjugat aus einer chemisch und immunochemisch gereinigten Form der ß-Subeinheit von HCG mit Tetanus-Toxoid

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in einem Molverhältnis von etwa 1 : 5 bis etwa 1 : 20. Die Konjugation erfolgt in Gegenwart eines Kondensierungsmittels wie Glutaraldehyd.oder Athylaminopropylcarbodiimid und führt zu kovalent gebundenen Konjugaten. Das Konjugat wird darauf zur Bildung des Impfstoffes den üblichen Stufen der Dialyse, Sterilitätskontrolle und Ausfällung unterworfen.

Bekanntlich ist die Placenta ein Gewebe, die nur während der Schwangerschaft entwickelt wird; bei der nicht schwangeren Frau ist sie üblicherweise nicht vorhanden. Der erfindungsgemäße Impfstoff ist nun in der Lage, der Entstehung und Aufrechter ^ He²T^Schwangerschaft entgegenzuwirken. Beim Menschen wird beispielsweise ein kritisches Hormon,

das HCG, von den Trophoblasten etwa am 8. Tag nach der

erzenst
Befruchtung. Dieses Hormon unterstützt in diesem Zustand das Corpus Luteum und sichert die Aufnahmefähigkeit der Gebärmutter. Das Hormon kann auch die Blastozyste durch andere Mittel schützen. Seine Neutralisation führt zum Einsetzen der Menstruation, wodurch die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft verhindert wird.

HCG ist ein Glyko-prοteinartiges Hormon, das aus zwei Sub- oder Untereinheiten - cC und ß zusammengesetzt ist. Die ol-Subeinheit ist fast identisch mit den jeweiligen oC-Subeinheiten folgender Hormone: die Schilddrüse stimulierendes Hormon (TSH), FoHikel stimulierendes Hormon (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH). Die ß-Subeinheit des Hormons ist in jedem Falle verantwortlich für die hormoneile Spezifität.

Die ß-Subeinheit von HCG ist ein Polypeptid aus 146 bis 147 Aminosäuren mit 3 von 5 Kohlenwasserstoffresten in dem C-endständigen Teil. Ein Teil der ß-Subeinheit trägt .Aminosäureübereinstimmungen mit der ß-Subeinheit von LH.

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Das ß-HCG hergestellt durch Dissoziieren von hoch-gereinigtem HCG besitzt ziemlich viel Mikroheterogenität. Das Protein liefert bei der Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen für analytische Zwecke 8 Bänder. Diese mikroheterogene Beschaffenheit wird in handelsüblichem HCG beobachtet, das aus Schwangeren-Harn gewonnen wird. Die mikroheterogene Beschaffenheit kann auf einen unterschiedlichen Grad der Aufspaltung und/oder auf Modifizierung des Moleküls bei seirar· Wanderung durch verschiedene Gewebe zurückgeführt werden·.

Das Gesamtmolekül HCG oder seine ß-Subeinheit ruft nach der Injektion in weibliche Versuchspersonen nicht die Bildung von Antikörpern hervor, die die Aktivität von HCG neutralisieren können. Es kann jedoch Antigen-artig gemacht werden, indem man es mit stark als Antigen wirkenden Haptenen kuppelt. Diazotierte Sulfanilsäurederivate wurden versucht und es wurde nachgewiesen, daß Anti-HCG Antikörper in Frauen, die die Menopause hinter sich haben, induziert werden. Dies wird von Vernon C. Stevens und C. Deans Crystle in "Effects of Immunization with Hapten-Coupled HCG on the Human Menstrual Cycle", Obstetrics and Gynecology, Bd. 42, Nr. 4, Oktober 1973 beschrieben. Bei den Versuchspersonen zeigte sich jedoch eine Depression oder Obliteration der in der Mitte des Zyklus auftretenden LH peaks; dies legte den Forschern nahe, daß die Antikörper in vivo mit endogenem LH wechselseitig reagierten. Eine derartige wechselseitige oder Kreuzreaktion mit einem hypophysären Hormon, das für das normale Funktionieren der Fortpflanzungsorgane benötigt wird, ist unerwünscht und potentiell gefährlich.

Erfindungsgemäß ist es wichtig, daß die im Reaktionsgemisch verwendete ß-Subeinheit von HCG sowohl chemisch als auch immunochemisch hoch-gereinigt ist. Die chemische Reinigung der ß-Subeinheit kann auf beliebig bekannte ¥eise vorgenommen werden, beispielsweise nach den von Morgan, F.J. und

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von R.E. Canfield, Endocrinology 88, 1045, 197 und F.J. Morgan, R.E.· Canfield, J.L. Vaitikaitis und von G.T. Ross, Endocrinology 94, Seiten 1601-1605, 1974 beschriebenen Verfahren .für die Gewinnung von chemisch reiner ß-Subeinheit von HCG wird von Swaminathan, N. und Bahl, O.P. in "Dissociation and Recombination of Subunits of Human Chorionic Gonadotropin", Biochem. Bipphys. Res. Commun., Bd. 40, Seite 422 (1970) beschrieben. Diese chemischen Reinigungsverfahren reichen jedoch nicht aus, um alle Faktoren zu entfernen, die mit hoher Affinität mit Anti-LH-Sera reagieren können.

Zur immunochemischen Reinigung wird die chemisch gereinigte ß-Subeinheit von HCG in einem physiologischen Lösungsmittel, beispielsweise mit Phosphat gepufferter Salzsäure gelöst und die Lösung bei Raumtemperatur während einer bestimmten Zeitspanne mit einem Immunosorbens wie Kaninchen-Antifollikel (antiovine)-LH gerührt. Die Behandlung mit einem heterologen Anti-LH-Immunosorbens unter sorgfältig gesteuerten Bedingungen ist dazu bestimmt, diejenigen Teile des Präparates zu entfernen, welche Faktoren besitzen, die mit hoher Affinität mit Anti-LH-Sera reagieren können. Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Immunosorbens kann aus verschiedenen heterologen LH Antisera wie Kaninchenantifollikel-LH, Affenantifollikel-LH oder Antirinder-LH ausgewählt werden. Gerührt v/ird bei einer Temperatur von beispielsweise 25°C während Zeitspannen von 1 bis 60 min oder mehr, je nach der Temperatur, der Beschaffenheit des jeweiligen Ansatzes an ß-Subeinheit von HCG und je nach der Kraft oder Stärke des verwendeten Immunosorbens. Die optimalen Bedingungen sollen für jede Probe eines ß-Subeinheitpräparates und für jedes Immunosorbens bestimmt werden. Das Präparat wird dann

zentrifugiert; der Wiederschlag wird verworfen und das

Filtrat chemisch und immunochemisch gereinigte ß-Subeinheit von HCG.

*Eine andere Methode

** enthält die 609831/0948

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Die C-terminalen Fragmente der ß-Subeinheit können mittels enzymatischer Spaltung von ß-Sut>einheiten von HCG oder durch Synthese der C-terminalen Peptide gemäß dem Standardverfahren von Merrifield, R.B., Journal of Am. Chem. Soc·? Bd. 86, 304, 1964 hergestellt werden. Geeignete Methoden unter Verwendung der enzymatischen Spaltung werden von Bahl et al.;, Biochem_o Biophys. Res. Commun. 48, 416, 1972 und Morgan et al., Mol. Cell. Biochem. 2, 97, 1973 beschrieben.

Das Nitroderivat der ß-Subeinheit von HCG kann gemäß dem Verfahren von Sokolousky et al., Biochemistry 5, Seiten 3582-3589 (1966) hergestellt werden.

Diese Präparate werden der immunochemischen Reinigungsstufe unterworfen, um Faktoren auszuschalten, die mit hoher Affinität mit Anti-LH-Sera reagieren können.

Der Begriff "hohe Affinität" wird hier zur Beschreibung einer Eigenschaft derjenigen Molekülteile verwendet, die sich bei der Versuchstemperatur sehr schnell mit den Anti-LH-Sera verbinden. Die Anti-LH-Sera zu diesem Zwecke werden vorzugsweise zu heterologem LH gebildet.

Das von Faktoren, die mit hoher Affinität mit Anti-LH-Sera reagieren können, befreite Präparat von ß-Subeinheit von HCG wird dann mit einem Personen-verträglichen immunogenartigen Träger wie Tetanus-Toxoid in den angestrebten Mengenverhältnissen unter Verwendung eines Kondensationsmittels umgesetzt; hierbei erfolgt die Konjugatbildung zwischen ß-Subeinheit und Träger. Geeignete Träger zur Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffes sind Tetanus-Toxoid, polymerisiertes Flagellin, KLH (Keyhole Lumpet Haemocyanin), Dextran, durch Hitze oder Bestrahlung inaktivierte Polio- und Gelbfieberviren, durch Hitze oder-""" Bestrahlung inaktivierte Typhus- und Paratyphus-Impfstoffe,

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Cholera-Toxoid, BCG, Antiplasmodium Impfstoff, Pertussis-

und Diphtherie-Toxoid und .biologisch abbaubare Polymere

wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Kollagen, synthetische Polypeptide und Polynucleotide.

Entsprechend einer der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Reaktionsprodukt ein komplexes Polymer ■ aus Tetanus-Toxoid und der chemisch und immunochemisch gereinigten ß-Subeinheit von HCG, kovalent konjugiert in einem Molverhältnis von etwa 1:5 bis etwa 1:20 in Gegenwart eines Kondensations- oder Kupplungsmittels wie Glutaraldehyd oder 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.

Wird als Kupplungsmittel 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl}-carbodimid verwendet, so werden das gereinigte Tetanus-Toxoid und die ß-Subeinheit von HCG in einem Molverhältnis innerhalb des oben angegebenen Bereiches*und mit dem Kupplungsmittel vermischt und das Gemisch dann bei einer Temperatur nicht über 25°C inkubiert; die Inkubation soll nicht langer als 6 Stunden dauern, je nach angewandter Temperatur. Vorzugsweise wird die Reaktion bei einer Temperatur nicht über 10⁰C und während einer Zeitspanne von 4 bis 6 Stunden durchgeführt.

Wird als Kupplungsmittel Glutaraldehyd eingesetzt, so werden das gereinigte Tetanus-Toxoid und die ß-Subeinheit von HCG in dem gewünschten Molverhältnis zusammen mit dem Kupplungsmittel vermischt und das Gemisch dann auf eine Temperatur nicht über 37⁰C und nicht länger als 6 Stunden erwärmt. Vorzugsweise wird in diesem Falle die Inkubation bei einer Temperatur von etv/a 20 bis etwa 30°C und während einer Zeitspanne von 2 bis 4 Stunden durchgeführt.

■^miteinander

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In der Ausführungsform unter Verwendung von C-terminalen Fragmenten von ß-HCG wird das Tetanus-Toxoid in einem Molverhältnis von Toxoid zu Pragmentpräparat von 1 : 10 bis 1 : 100, vorzugsweise 1 : 40 vermischt. Wird zur Bildung des Konjugats das Nitroderivat verwendet, so wird dieses in einem Molverhältnis von Toxoid zu Nitroderivat von etwa 1 : 5 bis etwa 1 : 20 eingesetzt.

Die erhaltene Verbindung wird anschließend gründlich dialysiert und zwar gegen eine kalte Phosphatpuffer-Kochsalzlösung von pH-Wert 7,2, 0,005 molar, beispielsweise bei 5 C und dann in einem sterilen Röhrchen gesammelt unter Verwendung einer Kombination aus Milliporen-Filter und Injektionsspritze sowie von Kochsalzlösung für den Transfer. Das Präparat wird dann in bekannter Weise auf Sterilität geprüft, um sicher zu gehen, daß keine Mikroorganismen enthalten sind.

Anschließend an die Sterilisation wird das Präparat auf Tonerde bzw. Aluminiumoxid ausgefällt unter Verwendung von sterilen Pottasche- und Natriumcarbonatlösungen. Anstelle von AIpO, können andere geeignete Hilfsmittel eingesetzt werden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß das Ausfällen auf Al₂O-, die aktive Substanz vor der Adsorption an Glasbehälter schützt und auch eine lang anhaltende Reaktion bzw. wirkung garantiert. Der Impfstoff wird vorzugsweise in Form einer Emulsion mit pflanzlichen Ölen im Zeitpunkt der Injektion verwendet; hierdurch wird der antigene Charakter noch weiter verbessert.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1

Ein kontrazeptiver Impfstoff wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt:

A) Chemische Reinigung von ß-Subeinheit von HCG

Nach der Methode von Canfield et al., Recent Progr.Horm. Res. 27; 124 wurde aus rohem HCG gereinigtes HCG hergestellt und dieses 1 h bei 40°C mit einer frisch hergestellten 8 m Harnstofflösung inkubiert; die Harnstofflösung war durch Passieren eines Ionenaustauscherbettes auf Polystyrolharzbasis gereinigt worden; die Austauschersäule mit Durchmesser 2 cm und Höhe 40 cm enthielt gleiche Mengen Dowex-1 X-8 und Dowex-50 X-4, Korngröße 0,074 mm (200 mesh). In Gegenwart von Harnstoff dissoziierten die ß-Subeinheiten und wurden dann entsprechend der Methode von Morgan und Canfield, Endocrinology 88, 1045, 1971 getrennt. Wie bei dieser Methode vorgesehen, ließ man das Gemisch mehrere Male durch Ionenaustauschersäulen und mit dreidimensional vernetztem Polysaccharid auf Dextranbasis (Sephadex)'Säulen laufen, um die dissoziierte ß-Subeinheit mit möglichst geringer Verunreinigung durch das Gesamtmolekül HCG oder seine <jC -Subeinheit zu erhalten.

B) Immunochemische Reinigung der ß-Subeinheit von HCG

Aus der in Stuf e A) gewonnenen ß-Subeinheit von HCG wurden 5 Mikroproben von jeweils 100 /Ug entnommen; jede Probe wurde in 0,1 ml einer 100 mM , mit Natriumphosphat (Na₂PO^ und Na₂HPO^) gepufferten Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) mit pH-Wert 7,2 gegeben. Jede Probe wurde bei Raumtemperatur (25⁰C) mit einem Immunosorbens von Kaninchen-Antifollikel LH, dessen Herstellung nachfolgend beschrieben wird, gerührt und zwar unterschiedlich lang, nämlich 1, 5, 10, 20 und 30 min. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen 10 min lang bei 0 bis 4⁰C zentrifugiert.

♦gefüllte " - 11 -

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Die überstehende Lösung aus jedem Röhrchen wurde hinsichtlich ihrer Reaktionsfähigkeit gegenüber Anti-HCG und Anti-LH untersucht. Durch diesen Test wurde festgestellt, daß die geeigneten Bedingungen zum Reinigen

von
des gesamten Ansatzes ß-Subeinheit von HCG. hergestellt gemäß A). 30 min Rühren bei 25°C bedeuteten. Die Wahl der Zeitspanne von 30 min beruhte auf der Beobachtung, daß die so behandelte Probe eine überstehende Flüssigkeit mit minimalem Spiegel bzw. Gehalt an Reaktionsfähigkeit mit LH lieferte.

Die Charakteristika des ß-HCG der gereinigten ß-Subeinheit von HCG,hergestellt gemäß A),wurde mit dem immunochemisch gereinigten ß-Subeinheitpräparat gemäß B) verglichen, In den Figuren 1 und 2 der beigefügten Zeichnung wird die Reaktionsfähigkeit der jeweiligen Präparate mit Anti-HCG und Anti-LH Serum vor QPig. 1) und nach (Fig. 2) der Reinigung durch Immunosorption gezeigt. Die Absorptionsstufe verbessert auch die mikroheterogene Beschaffenheit des Präparates. Die für die Bestimmung der in Fig.1 und 2 wiedergegebenen Ergebnisse verwendeten ß-HCG Präparate wurden der Elektrophorese in 7»5 %igem Polyacrylamidgel für analytische Zwecke bei pH 9,0 unterworfen. Ein Teil des Gels wurde für Dichtebestimmungen gefärbt; ein anderes, identisches Gel wurde transversal in etwa 2,5 ml starke Scheiben geschnitten. Die Proteine aus jedem Teil oder jeder Scheibe wurden mit 0,9 %iger Natriumchloridlösung eluiert. In den beiden Figuren 1 und 2 bedeutet die durchgehend ausgezogene Kurve (■ ), die durch Dichtemessung bestimmten Proteine; die durchgehend

ausgezogene, mit Punkten versehene Kurve (· ·) be-

125 zeichnet die Proteine, die mit ß-HCG I konkui£Leren beim Binden mit Anti-ß-HCG Serum; die gestrichelte Kurve mit

125 Punkten · · bezeichnet die Proteine, die mit HLH I

konku3*ieren beim Binden mit Anti-HLH*Serum. Es fällt auf,

*(Human HL) ...

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daß das immunochemisch gereinigte Präparat eine wesentliche Verminderung der Reaktionsfähigkeit mit Anti-HLH Serum zeigt.

Die optimalen Bedingungen hinsichtlich Rührzeit und Temperatur werden bestimmt durch die Beschaffenheit des Jeweiligen Ansatzes an ß-Subeinheit und durch die Stärke des verwendeten Immunosorbens. Letztere schwankt mit den Titern des verwendeten Antiserum und mit der Aufbewahrungszeit des Immunosorbens.

C) Herstellung des Immunosorbens

10 ml Antiserum (Kaninchenantifollikel·'LH), erhalten durch Immunisieren von Kaninchenantifollikel- LH, wurde gründlich gegen die unter A) beschriebene Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung bei 0 bis 4⁰C dialysiert und der pH-Wert auf 5 eingestellt mit 1 m Natriumacetatpuffer. 3 ml einer wäßrigen 2,5 %igen Glutaraldehydlösung wurden allmählich unter Rühren zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur (25°C) stehengelassen. Das polymerisierte Material wurde in einem Potter ElveJhem Homogenisator mit Teflon Pistill homogenisiert und dann wiederholt mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung gewaschen, bis es frei war von 280 m/um absorbierendem Material (nicht polymerisiertes freies Protein). Darauf wurde mit 200 mM*Glycin-HCL-Puffer-

lösung vom pH-Wert 2,2 nachgewaschen und mit 2 m KpHPOλ Lösung neutralisiert und schließlich mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung äquilibriert. Das Immunosorbens wurde bei 4⁰C mit 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel in Glycin-HCl Puffer bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

D^) Herstellung des Impfstoffes unter Verwendung von 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid als Kupplungsmittel

Herstellung (für 40 Dosierungen)

3,2 mg ß-Subeinheit von HCG, hergestellt gemäß B) oben wurden mit 400 Lf Tetanus-Toxoid (1500 Lf/mg Protein N) und 16 mg

*mM = millimolar .

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1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid in 6,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung vermischt und die Lösung 5 h lang bei 10⁰C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Das Molverhältnis von Tetanus-Toxoid zu ß-Subeinheit von HCG betrug etwa 1 : 10. Das Reaktionsprodukt wurde gründlich gegen Phosphatpuffer-Kochsalzlösung mit pH-Wert 7,2, 0,005 m in der Kälte dialysiert. Das Produkt wurde in einem sterilen Röhrchen gesammelt unter Verwendung eines Milliporenfilters kombiniert mit einer Aufnahme· bzw. Injektionsspritze und unter Verwendung von Kochsalzlösung für den Transfer. Das Produkt wurde hinsichtlich Sterilität auf Thioglykolatmedium 7 Tage lang getestet. Darauf wurde es auf Al₂O-, absorbiert unter Verwendung von sterilen 10 % Pottasche-Tonerde- und 10 % Natriumcarbonatlösungen. Der Impfstoff wurde dann verteilt, in Ampullen eingeschmolzen und es wurden zur Bestimmung der pyrogenen Stoffe und der Sterilität Proben entnommen.

D₂) Herstellung von Impfstoff unter Verwendung von Glutaraldehyd als Kupplungsmittel - Herstellung von einer Dosis

80 /Ug ß-Subeinheit von HCG hergestellt gemäß C) oben wurden mit einer Dosis Tetanus-Toxoid, 10 Lf Einheiten und 50 /Ul wäßriger 1 ^iger Glutaraldehydlösung vermischt. Das Gemisch wurde 3 h lang bei 30⁰C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert und dann gründlich gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit pH-Wert 7,2, 0,005 m dialysiert. Anschließend wurde weiter wie unter D^) beschrieben verfahren.

Eigens chaften:

Der gemäß D^) hergestellte Impfstoff, nachfolgend als ß-HCG-TT bezeichnet, erwies sich als immunogenartig in Mäusen, Kaninchen, Ziegen, Affen und beim Menschen. Der gemäß D₂) hergestellte Impfstoff zeigte gleichartige immunogenartige Eigenschaften im Affen. Beide Impfstoffe gaben eine ziemlich

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lang anhaltende Antikörperreaktion.

Eine einzelne Injektion des Impfstoffes D^, die mit Freund'schem Adjuvants an mehreren Stellen einer Geiß verabfolgt wurde, bewirkte ansteigende Antikörpertiter während etwa 9 Monaten, worauf ein Endwert (Plateau) erreicht wurde» Darauf folgte ein abnehmender Trend« Eine zweite Auffrischungsinjektion in der Abnahmephase führte zu einem scharfen Anstieg der Antikörpertiter. Dies wird in Fig. 3 der beigefügten Zeichnung gezeigt.

Das Reaktionsmuster bei 10 Versuchs-Rhesusaffen war ähnlich, obwohl sich individuelle Schwankungen ergaben. Dies wird ebenfalls in Fig. 3 gezeigt. Der Zeitpunkt der Injektionen ist mit einem Pfeil t angegeben.

Untersucht man die immunologischen Eigenschaften des Anti-ß-HCG-TT Serum, so zeigt sich, daß ein soüies in der Geiß oder im Affen erzeugte Serum immunologisch mit den HCG Gesamtmolekülen reagiert. Das Antiserum gab keine Kreuzreaktionen mit dem Wachstumshormon (HGH), mit Prolaktin, mit HPL, FSH, TSH oder LH, wenn es in physiologischen und chirurgischen Dosen (levels) getestet wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:

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ormon

(H=Human)

' T A B E L L E

Spezif itat_ von Anti ß-HCG-TT Sera aus Affen und Ziegen

Konzentration

•gebunden an Antikörper

.Ξ*« (1:5000) ₇,_PO£(,1:4000)

Affe

Ziege

% Completion	Ziege
Affe	91
87	32
28	70
70	15
30	4
0	2
0	0
0	0
0	0
0	0
0	0
0

Maximalkonzentration bei der Konkurrenz auftritt

HCG °
co

HFSH⁰⁰

10

ng
ng

ng
l_r2 ng
0_r4 ng'
0,7 .ng

0.3 ng

2,5 ng

12,5 ng

0,25 ng

100

68

30

85

96

98

100

. 5 ng J, ι

50 ng

»100 ng »1 ug »1 ug

Basische oder tonische Konzentration Physiologische Maximalkonzentration oo

on

CD¹

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Die biologischen Eigenschaften des Anti-(ß-HCG-TT) Serums erzeugt in der Geiß und im Affen und die Fähigkeit des Serums HCG zu neutralisieren wurde in einer Anzahl von Systemen untersucht und geprüft. Es verhinderte wirksam die durch HCG hervorgerufene Gewichtszunahme der Prostata in noch nicht geschlechtsreifen Ratten. Die Versuchsdaten sind in Pig. 4 der beigefügten Zeichnung zusammengefaßt. ■ Das Serum wirkte auch der durch HCG hervorgerufenen vermehrten Produktion von Progesteron in Corpus Luteum Scheiben in vitro entgegen. Diese Ergebnisse werden nachfolgende in Tabelle 2 zusammengefaßt

tabelle 2

Wirkung von Anti-ß-HCG-TT auf Progesteron-Synthese durch Corpus Luteum

Zusatz P^ /ug/g Gewebe *

1. — 79,4 + 15,2

2. + HCG (0,1 /ug/ml) 183,2+ 30,6

3. + HCG + Anti-ß-TT 105,4 + 23,4

4. + Anti-ß-TT 96,7 + 23,2

* Mittelwert +S.E. aus 6 Versuchen

Das Serum verhindert auch die Bindung von HCG an Rezeptoren in Membranpräparaten aus Hoden und Ovarien. Die hierbei gewonnenen experimentellen Daten sind in Fig. 5 der beigefügten Zeichnung zusammengefaßt. Auf der Ordinate ist die Hemmung in % aufgetragen, auf der Abszisse eier Logarithmus d.er Antiserumverdünnung von Ziegen Anti-ß-HCG-TT. Die Kurve

1 ?5
zeigt die Hemmung von '.1-HCG Bindung an die 10 000 g Fraktionen hergestellt aus homogenisierten Corpus Luteus Präparaten der Geiß.

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_ ₁₇ _ 1A-46 455ϊ

All diese Versuche zeigen, daß die gegen die Verbindung ß-HCG-TT gebildeten Antikörper die Fähigkeit besitzen, nicht nur immunologisch mit dem HCG Gesamtmolekül zu reagieren, sondern auch seine biologische Aktivität zu neutralisieren.

Die Sicherheit des ß-HCG-TT Impfstoffes D^ wurde entsprechend den Anforderungen der British Pharmacopoeia geprüft: der Impfstoff verursachte während der gesamten vierwöchigen Beobachtungszeit keine Todesfälle bei Meerschweinchen. Er war weiterhin frei von akuter und subakuter Toxizität; dies wurde vor allem in Versuchen gegenüber 2 Arten festgestellt, nämlich Nagetieren und Affen. Die Toleranz des Impfstoffes wurde ebenfalls geprüft und zwar in 65 Mäusen, 7 Kaninchen und 13 Affen während Zeitspannen bis zu 1 Jahr und darüber. Alle immunisierten Tiere überlebten (100 %). Andere Parameter wie Haematologie (Haemoglobin, Dünnschicht-/ Dichtschichtchromatographie, PCV, peripherer Ab- bzw. Ausstricß Untersuchung auf Plättchen, Reticulocyten), Leberfunktionen (Serum Bilirubin, Alkaliphosphatase, Transaminasen GOT und GPT, LDH Isoenzyme, Cholinesterase), Nierenfunktionuntersuchungen, Blutglucose, Serum-Lipide, Cholesterin, Triglyceride, freie Fettsäuren und Schilddrüsenfunktion waren bei den immunisierten Affen normal. Die immunisierten Affen entwickelten weder sofortige (Arthus) noch verzögerte Überempfindlichkeit gegen HCG.

Klinische Untersuchungen

6 weiblichen Versuchspersonen im gebärfähigen Alter von 20 bis 32 Jahren wurden entweder das Impfstoffpräparat D^ oder - in Blindversuchen - Placebos injiziert. Da diese Versuche zum Ziel hatten, den immunogenen Charakter des Impfstoffes nach der Erfindung festzustellen, waren für diese Versuche freiwillige Versuchspersonen ausgewählt worden, an denen zuvor eine Tubenligatur vorgenommen worden war. Die Placebos ergaben in keinem Fall eine Reaktion.

*TLC/DLC

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alten

Die drei Versuchspersonen, die den Impfstoff erhäD hatten, entwickelten Antikörperreaktion gegen Tetanus-Toxoid und gegen HCG. Auf eine Verzögerungsperiode, die je nach Versuchsperson 4 bis 6 Wochen dauerte, erfolgte .der allmähliche Anstieg des Antikörpertiters. Gleichzeitig wurden auch Antikörper gegen Tetanus gebildet.

In den Fig. 6, 7 und 8 der beigefügten Zeichnung sind die Ergebnisse der drei Versuchspersonen, die den Impfstoff erhalten hatten, aufgezeichnet. Fig. 8 bringt die Ergebnisse bei Frau K.W., 30 Jahre alt, fünf Schwangerschaften und vier lebende Kinder. Der Anstieg der Antikörper, die gegen HCG reagieren, wird durch die Kurve

(o «) und der Antitetanus-Antikörpertiter durch

die Kurve (· ·) wiedergegeben. Auf der Abszisse ist

die Zeit in Tagen aufgetragen, auf der Ordinate die

125
prozentuale Bindung von I -HCG bei 1 : 10 Verdünnung des Serums. Die Injektionen erfolgten zu Beginn, am 14., 28. und 42. Tag und sind durch einen Pfeilimarkiert.

Der Anti-HCG-Titer erreichte ein Plateau und blieb auf dieser Höhe etwa bis zu 9 Monaten nach der Injektion. Die Versuche werden noch fortgeführt. Der Zeitpunkt der -eintretenden Menses ist oben in der Figur , mit einem Kreuz angegeben. Die endometrische Biopsie wurde nach 150 Tagen durchgeführt und ergab den Wachweis für Cvulation; dies wurde durch Vaginalcytologie und durch die Progesteronspiegel in der sekretorischen Phase des Zyklus bestätigt.

Die Ergebnisse bei der zweiten Versuchsperson sind in gleicher Weise in Fig. 7 aufgeführt. Frau A.M. war 32 Jahre alt, hatte drei Schwangerschaften gehabt und zwei lebende Kinder. Fig. 7 zeigt eine ähnliche Art der Immunreaktions-Kinetik wie für die erste Versuchsperson. Die Biopsie des Endometriums zeigte auch in diesem Falle ebenso wie die Vaginalcytologie und der Progesteronspiegel die Stärke der Ovulation an. Die Ergebnisse bei der dritten Versuchs-

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1A-46 45^

"■¹⁹" . 25185A6

person sind in Fig. 6 aufgezeichnet. Frau N.D. war 30 Jahre alt, hatte fünf Schwangerschaften hinter sich und drei lebende Kinder. Während der ersten 150 Versuchstage stillte sie noch ein Kind; dies erklärt die Abwesenheit der Menses während dieser Zeit. Die Immunisierung mit dem Impfstoffpräparat führte zu keinerlei Störung der Lactation trotz einer sehr guten Immunreaktion. Die Menstruation hat seitdem wieder eingesetzt und verläuft normal und in normalen Zeitabschnitten.

Bei allen drei Versuchspersonen blieben Libido und andere Fortpflanzungsfunktionen vollständig normal. Gründliche klinische Untersuchung ergab keinerlei nachweisbare Abnormalität irgendeiner Art. Andere Parameter wie Hämatologie (Hämoglobin, TLC/DLC, PCV, peripherer Abstrich zur Untersuchung auf Plättchen, Reticulocyten), Leberfunktionen (Serum Bilirubin, Alkaliphosphatase, Transaminasen GOT und GPT, LDH Isoenzyme, Cholinesterase), Nierenfunktion, Blutglucose, Serum-Lipide, Cholesterin, Triglyceride, freie Fettsäuren und Schilddrüsenfunktionen waren normal und die Immunisierung bewirkte keine Veränderung der Organfunktionen und des Stoffwechsels. Die Versuchspersonen zeigten auch normale Reaktion auf den Insulin-Hypoglykämien Test durch Bildung von Hydrocortison und Wuchshormon.

Die Sera dieser immunisierten Frauen ebenso wie die von Affen und Ziegen, die mit dem ß-HCG-TT Präparat hyperimmunisiert worden waren, wurden zahlreichen Tests unterworfen, um mögliche Autoimmunreaktionen gegen Körperorgane auszuschließen. Diese Versuche verliefen negativ für antinucleare Antikörper, antimikrosomale Antikörper und zeigten auch keine Rheumatoidfaktor-Reaktionsfähigkeit. Diese Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

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■TABELLE 3 Immunopathologische Untersuchungen von immunisierten Versuchspersonen

	Sera	von	30,	Fig. 6
CD			74
to	1.	N.D.
OO		23.8.	30
			74
—*	2.	N.D.
CD		20.9.	30
CO			74
.P-	3.	N.D.	32	_;Fig. 7
GO		2.12.	.74
	4.	A.M. ,
		11.10

Untersuchungen

Antikörper

2. a^timiarosomal Antikörper ■

3. Latex agglutination für Rheumatoid-Faktor.

Bemerkungen

bei allen Seren
keine nachweisbare R eaktion

5. K.W. , -30 ,Fig. 8' 28.10.74

6. K.W., 30 . · 2.12.74

7. Nicht immunisierte-Kontrolle

cn

CO

cn

CT)

1A-46 455 - 21 -

Die Seren zeigten auch keinerlei Reaktionsfähigkeit gegen Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Nebenierenrinden, Nieren, Hoden und Ovarien beim Menschen. Diese Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

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TABE^-LLE 4 Reaktionsfähigkeit von Anti-ß-TT Sera gegen Organe des Menschen

O CO OO CO

CD CO .C-CO

Sera von

nicht geimpfter Frau

Immunisierter Frau ~ (N.D.) Fig.

nicht geimpften Affen Imminisiertem Affen

Untersuchte
Organe

Schilddrüse

Nebenschilddrüse

Nebennieren

Nieren

Hoden

Eierstöcke

Bemerkungen

keine durch '
Immunofloreszenz
erkennbare Reaktion

IV) IV)

fv>

7B18546

Die Versuche ergaben weiterhin keinerlei Reaktionsfähigkeit gegenüber GewebeSubstraten aus Mäusen, Kaninchen und Pavianen. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengefaßt.

Tabelle 5

■- 24 -

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TABELLE 5

Reaktionsfähigkeit von Anti ß-HCG-TT Sera-gegenüber.Gewebesubstraten

OT O CO OO CO

.P-CXi

Serum aus

nicht geimpfter Frau

immunisierter Frau (N.D.) Fig.

nicht geimpftem Affen immunisiertem Affen

.Gewebe subs trat von

Mäusen

Kaninchen Pavian

durchgeführte
Tests ■

a) Indirekte
Immune—
fluoreszenz

b) anti DNA
Antikörper

Bemerkungen -

ro

1) keine mit Ge- ⁴^ webe reagierenT ι den Antikörper nachgewiesen

2) keine anti DNA Antikörper
gefunden

Die in den freiwilligen Versuchspersonen erzeugten Antikörper neutralisierten kompetent die biologische Aktivität des HCG Gesamtmoleküls. Fig. 9 der beigefügten Zeichnung zeigt die Fähigkeit dieser Antikörper der Versuchsperson Frau N.D., die Bindung von HCG an Corpus Luteum Präparate in einem Radiorezeptor-Versuch zu blockieren. Fig. 9 zeigt die Hemmung der Bindung von ⁵I-HCG an die 10 000 g Fraktionen hergestellt aus

Homogenaten von Ziegen Corpora Lutea. Auf der Ordinate ist die prozentuale Hemmung aufgetragen, auf der Abszisse logarithmisch die Antiserumverdünnung. Fig. 10 der beigefügten Zeichnung zeigt die Fähigkeit der gleichen Antikörper in vivo sich an HCG zu binden. Die Kurve zeigt den Antikörpertiter bei Versuchsperson Frau K.W. nach einer HCG-Gabe von 5 000 internationalen Einheiten. Auf der Ordinate ist die prozentuale Bindung von ^1 bei 1 : 10 Verdünnung angegeben, auf der Abszisse die Zeit in S-fcunden nach erfolgter Injektion. Der Strich nach der Unterbrechung nach 72 Stunden gibt den 15. Tag an. Die Injektion ist wieder mit einem Pfeil f markiert.

Die Gesamtdauer der Immunreaktion gegen HCG in Menschen nach einer Primär - Immunisierung mit vier darauf folgenden ImpfstoffInjektionen alle 14 Tage beträgt allgemein

mehr als 1 Jahr, obwohl individuelle Schwankungen auftreten können. Die aktive Immunisierung hat keine unerwünschten Reaktionen hervorgerufen. Die Versuchspersonen hatten normale Menstruationszyklen. Ovulation wurde nachgewiesen. Die Nieren-, Leber-, Hypophyse-, cardiovasculären, Schilddrüsen- und anderen Organfunktionen blieben normal und ungestört.

Beispiel 2

Es wurde ein Impfstoff hergestellt unter Verwendung des ß-HCG-Endfragmentes enthaltend die letzten 32 bis 33 Aminosäurereste bzw. Gruppen anstelle des immunologisch gereinigten ß-HCG gemäß Beispiel' 1. In diesem Beispiel wurde das eingesetzte ß-HCG Endfragment kovalent gebunden an

1A-46 - 26 -

Tetanus-Toxoid in einem Verhältnis von 40 : 1 unter Verwendung von 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Das Endfragment BEF wurde aus ß-HCG durch Papain-Spaltung entsprechend der weiter oben angegebenen Methode hergestellt. Alternativ läßt sich BEF auch chemisch synthetisieren entsprechend bekannten Verfahren.

Ausreichend Impfstoff für 30 Dosen wurde hergestellt durch Vermischen von 2,5 mg BEF mit 300 Lf Tetanus-Toxoid und 15 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 bis zu einem Endvolumen von 5,0 ml. Diese Lösung wurde 6 h bei 4 C unter gelegentlichem Mischen oder Schütteln inkubiert. Das Produkt wurde dann gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit pH-Wert 7,2 in der Kälte 48 h lang dialysiert, wobei 5 bis 6 mal jeweils 1 1 Pufferlösung ausgewechselt wurde.

Die v/eitere Herstellung, Prüfung und Sterilisation des Impfstoffes erfolgte wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

In der in Beispiel 1 unter D^ angegebenen Weise wurde ein Impfstoff hergestellt unter Verwendung eines Nitroderivates der ß-Subeinheit von HCG. Das Molverhältnis des Derivats zu Tetanus-Toxoid betrug 10 : 1. Die allgemeine Verfahrensweise einschließlich Sterilisieren, Herstellen und Prüfen des Impfstoffes erfolgte wie in Beispiel 1 ·

Patentansprüche;

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Claims

Patentansprüche

(Q Kontrazeptiver Impfstoff enthaltend ein Konjugat aus einem immunogenartigen Träger land einem Präparat der ß-Subeinheit von Choriongonadotropin (HCG), das frei ist von Faktoren, die mit hoher Affinität mit Anti-LH-Sera reagieren können.

2· Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als HCG-Präparat

a) C-endständige Fragmente der ß-Subeinheit von HCG enthaltend 30 bis 38 Aminosäurereste,

b) das Nitroderivat der ß-Subeinheit von HCG oder

c) die immunochemisch gereinigte ß-Subeinheit von HCG enthält.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er als Träger Tetanus-Toxoid enthält.

4. Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Präparat der ß-Subeinheit von HCG herstellt, das frei ist von Faktoren, die mit hoher Affinität mit Anti-LH-Sera reagieren können und

b) die in Stufe a) erhaltene Substanz mit einem Personenverträglichen immunogenartigen Träger kondensiert und

c) das erhaltene Konjugat auf einem inerten Träger wie O, ausfällt und den Impfstoff abfüllt.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man C-endständige Fragmente der ß-Subeinheit von HCG, das Nitroderivat der ß-Subeinheit von HCG ader die immunochemisch gereinigte ß-Subeinheit von HCG einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger in der Stufe b) Tetanus-Toxoid verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von immunochemisch gereinigter ß-Subeinheit von HCG zunächst eine chemisch reine ß-Subeinheit von HCG herstellt und diese dann durch Reaktion mit einem LH-Immunosorbens von Faktoren befreit,edie mit hoher Affinität mit Anti-LH-Sera reagieren können.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als LH-Immunosorbens Kaninchen-Antifollikel-LH verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , daß man ein LH-Immunosorbens verwendet, das hergestellt worden ist durch

a) gründliches Bialysieren von Kaninchen-Antifollikel-LH-Sera gegen 100 mM phosphatgepufferte Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2,

b) Polymerisieren der Antisera durch Stehenlassen bei Raumtemperatur während 3 h unter Zugabe von Glutaraldehyd,

c) Homogenisieren des polymerisierten Materials und anschließendes Auswaschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung bis die Waschwässer frei sind von nicht polymerisiertem freiem Protein,

d) Auswaschen des Homogenats mit einem 200 mM Glycin-HCl-Puffer vom pH-Wert 2,2,

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e) Neutralisieren des Homogenats mit K₂HPO^ Lösung und

f) Äquilibrieren des erhaltenen Immunosorbens mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

10· Verfahren nach Anspruch 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man die behandelte ß-Sübeinheit von HCG in einem Molverhältnis von 5 : 1 bis 20 : 1 in Gegenwart eines Kupplungsmittels kondensiert und das erhaltene Konjugat anschließend dialysiert und zur Bildung des Impfstoffes auf Tonerde bzw. AlpO-z ausfällt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kupplungsmittel Glutaraldehyd und/oder ein Carbodiimid verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kupplungsmittel A-Äthyl-3-(3-aminopropyl)-carbodiimid verwendet und die Kondensierung bei einer Temperatur nicht über Raumtemperatur, insbesondere nicht über 10⁰C und während einer Zeitspanne von nicht mehr als 6 Stunden durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kupplungsmittel Glutaraldehyd verwendet und die Kondensierung bei einer Temperatur nicht über 37°C, insbesondere im Bereich von 20 bis 30°C und während einer Zeitspanne von nicht mehr als 6 Stunden durchführt.

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