DK145283B - Vaccine til forhindring af graviditet og fremgangsmaade til fremstilling af vaccinen - Google Patents

Description

i 145283

Den foreliggende opfindelse angår en vaccine til forhindring af graviditet, hvilken vaccine indeholder beta-under-enheden af humant koriongonadotropin eller et derivat eller fragment heraf, og en fremgangsmåde til fremstil-5 ling af vaccinen.

Der kendes allerede mange metoder til regulering af fertiliteten og til forhindring og afbrydelse af graviditet.

Flere sådanne, såsom kondomer, intrauterine kontraceptiske 10 anordninger, mekaniske anordninger, spermicide cremer og geler, skumtabletter, orale piller og lignende, er almindeligt tilgængelige til forhindring af graviditet. Disse metoder har, til trods for at de er effektive i forskellig udtrækning, forskellige begrænsninger. De fleste af 15 dem kræver konstant motivation hos anvenderen. En del kræver specialiseret medicinsk overvågning.

Udviklingen inden for immunologiske metoder til kontrol af fertilitet har været genstand for forsøg så langt til-20 bage som i det mindste i begyndelsen af dette århundrede.

Et antal forsøg er beskrevet af Albert Tyler i "Approaches to the Control of Fertility Based on Immunological Phenomena", Journal of Reproduction and Fertility, (1961) 2, p. 473-506.

25

Blandt forsøgene i de senere år er forekommet immunisering med placental, foetale materialer og hormoner. Hidtil er der dog ikke udviklet nogen effektiv fertilitetsvaccine.

Den foreliggende opfindelse er baseret på udvikling af 30 antistofreaktion ved aktiv immunisering mod et hormon, som er kritisk for etablering og opretholdelse af graviditet.

Den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe en vaccine til forhindring af graviditet.

Det er endvidere et formål med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine til 35 145283 2 forhindring af graviditet, hvilken vaccine producerer antistoffer med minimal tværreaktion med andre endogene hormoner ved fysiologiske niveauer.

5 Der er nu ifølge opfindelsen tilvejebragt en vaccine til forhindring af graviditet, hvilken vaccine er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte.

Den omhandlede vaccine udmærker sig ved at være dannet ved 10 rensning af beta-underenheden af HCG, således at det ikke blot er kemisk rent, men også er immunkemisk rent. Denne ekstra rensning hjælper til at eliminere uønskede krydsreaktioner af antistof produceret af vaccinen med andre humane hormoner end HCG.

15

Fra beskrivelsen til DK patentansøgning nr. 2*177/74 kendes modificerede polypeptider, der er aktive til immunisering imod svangerskab eller til at afbryde svangerskab. I disse produkter er beta-underenhederne ikke immunokemisk rensede, 20 og som følge deraf har vaccinen uantagelige bivirkninger som følge af tilstedeværelsen af determinanter, der kan reagere med høj affinitet med anti-LH-sera.

Derivatet eller fragmentet af beta-underenheden af HCG kan 25 ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt være (a) et C-ende- fragment af beta-underenheden af HCG med 30—38 aminosyre-rester, eller (b) nitroderivatet af beta-underenheden af HCG. Derved nedsættes i særlig grad uønskede krydsreaktioner .

30

Det har ifølge opfindelsen vist sig hensigtsmæssigt, at det immunogene bærestof er tetanus toxoid.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af den 35 omhandlede vaccine er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 4 anførte. På denne måde fås en vaccine, der er effektiv til· forhindring af graviditet uden i 3 145283 væsentlig grad at producere antistoffer, der krydsreagerer med andre endogene hormoner, således at vaccinen kan anvendes uden at give væsentlige uønskede bivirkninger.

5 En særlig effektiv vaccine med ringe bivirkninger kan opnås ved de i krav 5 _ 7 beskrevne udførelsesformer.

Vaccinen ifølge den foreliggende opfindelse er i hovedsagen fri for sidereaktioner med andre endogene hormoner, 10 såsom de pituitære hormoner, der kræves til normal funktion hos reproduktive organer.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gås ud fra kemisk renset beta-underenhed eller et derivat eller fragment 15 heraf, der er separeret fra alfa-underenheden af humant koriongonadotropin. Produktet renses derefter immunokemisk under anvendelse af et heterologt anti-LH-immunoabsorp-tionsmiddel og konjugeres med et immunogent bærestof.

Vaccinen i en foretrukken form er et konjugat af en kemisk 20 og immunokemisk renset form af beta-underenheden af menneskeligt koriongonadotropin med tetanustoxoid i molekylvægtforholdene 5:1-20:1. Konjugeringen finder sted i nærværelse af et konjugeringsmiddel, såsom glutar-aldehyd eller ethylaminopropylcarbodiimid, til at opnå 25 et kovalent bundet konjugat. Konjugatet udsættes derefter for de konventionelle behandlinger ved dialysering, sterilitetskontrol og udfældning for at danne vaccinen.

Som det er kendt i teknikken, er placenta et væv, som 50 kun udvikles ved graviditet; det er ikke en normal del af den gravide organisme. Vaccinen ifølge den foreliggende opfindelse er i stand til at modvirke etableringen og opretholdelsen af graviditet. Hos mennesker produceres f.eks. et kritisk hormon, human koriongonadotropin, af 35 trofoblasterne ca. 8 dage efter befrugtningen. Dette hormon udstøder på dette stadium corpus luteum og sikrer modtageligheden i uterus. Hormonet kan også beskytte 145283 4 blastocyter på andre måder. Dets neutralisation resulterer i igangsættelse af menstruation, der forhindrer opretholdelse af graviditet.

5 Humant koriongonadotropin (i det efterfølgende omtalt som HCG) er et glycoproteinhormon sammensat af 2 underenheder: alfa og beta. Alfa-underenheden er næsten identisk med de respektive alfa-underenheder i hormonerne tyroidstimulerende hormon (TSH), follikelstimulerende hormon (PSH) og 10 luteiniseringshormon (LH). Beta-underenheden af hormonet tilskrives i hvert tilfælde principielt hormonspecificiteten .

Beta-underenheden af HCG er et polypeptid med 146-147 15 aminosyrer med 3 af 4 carbonhydratrester i C-slutenden.

En del af beta-underenheden oppebærer aminosyrehomologe med beta-underenheden i LH. Beta-HCG fremstillet ved dissociering af højrenset HCG har en betydelig grad af mikroheterogenitet. Proteinet opløses i 8 bånd ved elektro-20 forese på analytiske polyakrylamidgeler. Denne mikroheterogenitet iagttages hos kommercielt tilgængeligt HCG, som fremstilles ud fra graviditetsurin. Mikroheterogeniteten kan bero på en variabel grad af spaltning og/eller modificering af molekylet under dets passage gennem forskel-25 lige væv.

HCG som et helt molekyle eller beta-underenheden af HCG bevirker, når det injiceres på kvinder, ingen dannelse af antistoffer, som kan neutralisere HCG-aktiviteten. Det 30 kan imidlertid gøres antigent ved kobling med stærkt antigene haptener. Diazoterede sulfanilinsyrederivater er prøvet, og det har vist sig, at anti-HCG-antistoffer induceres hos post-menopausale kvinder. Dette beskrives af Vernon C. Stevens og C. Deans Crystle i "Effects of Immuni-35 zation with Hapten-Coupled HCG on the Human Menstrual

Cycle", Obstetrics and Gynecology, Vol. 42, No. 4, October 1973. Imidlertid opnåede patienterne en sænkning eller ud- 145283 5 jævning af middelcykle-LH-toppene, hvilket tyder på, at antistofferne sidereagerede in vivo med endogent LH. En sådan sidereaktion med et pituitært hormon, som kræves for normal funktion af de reproduktive organer, er uønsket 5 og potentielt farlig.

Det er vigtigt for opnåelse af en tilfredsstillende vaccine ifølge den foreliggende opfindelse, at beta-under-enheden af HCG, som anvendes i reaktionsblandingen, er 10 højrenset både kemisk og immunokemisk. Den kemiske rensning af beta-underenheden kan iværksættes på vilkårlig i og for sig kendt måde, såsom ved procedurerne beskrevet af Morgan, F.J. og R.E. Canfield, Endocrinology 88. 1045, 197 og F.J. Morgan, R.E. Canfield, J.L. Vaitukaitis og 15 G.T. Ross, Endocrinology 94, s. 16OI-1605, 1974. En anden egnet metode til opnåelse af kemisk ren beta-underenhed af HCG er beskrevet af Swaminathan, N og Bahl, O.P. i "Dissociation and Recombination of Subunits of Human Chorionic Gonadotropin", Biochem. Biophys. Res. Commun., 20 Vol. 40, side 422 (1970). Imidlertid er disse kemiske rensningsmetoder ikke tilstrækkelige til at fjerne determinanter, som kan reagere med høj affinitet med anti-LH-sera.

25 Det immunokemiske rensningstrin består af opløsning af den kemisk rensede beta-underenhed af humant koriongonado-tropin i et fysiologisk opløsningsmiddel, såsom phosphat-pufret kogsaltopløsning, og omrøring af opløsningen ved stuetemperatur i et reguleret tidsrum med et immunoabsorp-30 tionsmiddel, såsom kanin-antiovin-LH. Behandlingen med et heterologt anti-LH-immunoabsorptionsmiddel under omhyggeligt regulerede betingelser har til formål at fjerne de dele af præparatet, som har determinanter, der kan reagere med høj affinitet med anti-LH-sera. Det ved fremgangsmåden 35 ifølge opfindelsen anvendte immunoabsorptionsmiddel kan vælges blandt adskillige heterologe LH-antisera, såsom kanin-antiovin-LH, abeantiovin-LH, kanin-antibovin-LH eller abeantibovin-LH.

145283 6

Omrøringen udføres ved en temperatur på f.eks. 25° C i et tidsrum på 1 - 60 minutter eller mere i afhængighed af temperaturen, arten af den særlige gruppe af beta-under-enheder af HCG og potensen af det anvendte immunoabsorp-5 tionsmiddel. De optimale betingelser skal bestemmes for hver prøve af beta-underenhedspræparatet og for hvert immunoabsorptionsmiddel. Præparatet udsættes derefter for centrifugering, bundfaldet bortkastes, og filtratet indeholder kemisk og immunokemisk renset beta-underenhed 10 af humant koriongonadotropin.

C-endefragmentet af beta-underenheden kan fremstilles gennem enzymspaltning af beta-underenheder af HCG eller ved syntese af C-endepeptiderne ved standardmetoderne 15 ifølge Merrifield, R.B., Journal of Am. Chem. Soc.,

Vol. 86, 304, 1964. Egnede metoder til anvendelse af enzymspaltning er beskrevet i Bahl et al., Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 48, 4l6, 1972, og Morgan et al., Mol.

Cell. Biochem. 2, 97, 1973- 20

Nitro-derivaterne af beta-underenheder af HCG kan fremstilles som beskrevet af Sokolousky et al., Biochemistry 5, s. 3582-3589 (1966).

25 Disse præparater udsættes for det immunokemiske rensningstrin for at udelukke determinanter, der kan reagere med høj affinitet med anti-LH-sera.

Udtrykket "høj affinitet", som det anvendes i den fore-30 liggende beskrivelse, benyttes til beskrivelse af en egenskab hos de dele, som forenes med anti-LH-sera med høj hastighed ved den anvendte temperatur. Anti-LH-sera til dette formål er fortrinsvis heterolog LH.

35 Fremstillingen af beta-underenheden af humant koriongonadotropin, befriet for determinanter, der kan reagere med høj affinitet med anti-LH-sera, bringes derefter til at 7 145283 reagere med en fysiologisk tolerabel immunogen bærer, såsom tetanus toxoid i ønskede mængdeforhold, under anvendelse af et konjugeringsmiddel, hvorved beta-under-enheden konjugeres med bæreren. Passende bærere til an-5 vendelse ved fremstilling af vaccinen ifølge den foreliggende opfindelse omfatter tetanus toxoid, polymeriseret flagellin, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), dextran, varme- eller bestrålingsinaktiveret polio- og gul febervirus, varme- eller bestrålingsinaktiveret tyfoid- og 10 paratyfoidvaccine, koleratoxoid, BCG, antiplasmodium- vaccine, pertussis- og difteritoxoid og bionedbrydningsbare polymere, såsom polymælkesyre, polyglykolsyre, kollagen, syntetiske polypeptider og polynucleotider.

15 Ifølge en af de foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse er reaktionsproduktet en komplex polymer af tetanus toxoid og den kemisk og immunokemisk rensede beta-underenhed af humant koriongonadotropin, konjugeret kovalent i molekylforholdene 1:5 - 1:20 i 20 nærværelse af et konjugeringsmiddel, såsom glutaraldehyd eller l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.

Når konjugeringsmidlet består af l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid, blandes renset tetanus toxoid 25 og beta-underenhed af humant koriongonadotropin i molekylforholdene i det ovenfor angivne område sammen med konjugeringsmidlet, og blandingen inkuberes derefter ved en temperatur, der ikke overstiger 25°C, og i et tidsrum . på ikke over 6 timer i afhængighed af temperaturen·. Det 30 foretrækkes, at reaktionen udføres ved en temperatur på ikke over 10°C og i et tidsrum på 4 - 6 timer.

Når konjugeringsmidlet består af paraldehyd, blandes renset tetanus toxoid og beta-underenhed af humant korion-35 gonadotropin i de ønskede molekylforhold sammen med konjugeringsmidlet, og blandingen inkuberes derefter ved en temperatur på ikke over 37°C og i et tidsrum på ikke 145283 8 over 6 timer. Fortrinsvis udføres inkubationstrinnet ved en temperatur på 20 - 30°C og i et tidsrum på 2 - 4 timer.

Ved en udførelsesform, hvorved der anvendes C-endefrag-5 menterne af beta-HCG, kombineres disse med tetanus toxoidet i molekylforholdet toxoid:fragment 1:10 - 1:100, fortrinsvis 1:40. Når nitroderivatet anvendes i konjugatet, anvendes det i molekylforholdet toxoid:derivat 1:5 - 1:20.

10 Den således opnåede forbindelse dialyseres derefter nøjagtigt mod phosphatpufret kogsaltopløsning med en pH-værdi på 7,2, 0,005 M i kulden, f.eks. 5°C, og opsamles i et sterilt rør under anvendelse af en milliporefilter- og sprøjteanordning, idet der anvendes kogsaltopløsning til 15 overføringen. Præparatet udsættes derefter for sterili-tetsprøvning på i og for sig kendt måde til sikring af fraværelse af mikroorganismer.

Efter steriliseringen udfældes præparatet på alun under 20 anvendelse af sterile kaliumaluminiumsulfat- og sterile natriumcarbonatopløsninger. I stedet for alun kan også anvendes andre passende midler. Imidlertid har det vist sig, at fældningen på alun beskytter det aktive stof fra absorption på glasbeholdere og medfører også et lang-25 varigt respons. Vaccinen anvendes fortrinsvis som en emulsion med vegetabilske olier på injektionstidspunktet, og dette forbedrer yderligere antigeniciteten.

Opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nær-30 mere ved hjælp af nogle eksempler.

EKSEMPEL 1

En vaccine til forhindring af graviditet fremstilles på 35 følgende måde: 9 145283 A. Kemisk rensning af beta-underenheder af humant koriongonadotropin_

Renset humant koriongonadotropin fremstilles ud fra råt 5 HCG som beskrevet af Canfield et al. Recent Progr. Horm.

Res. 27., 124, 1971. Det inkuberes ved 40°C i 1 time med 8 M frisk fremstillet carbamidopløsning, som var renset på en blandet kation-anionbytterkolonne, nemlig et lag af lige dele "Dowex”®-1 X-8 og "Dowex" ® -50 X-4, 10 partikelstørrelse mindre end 74yUm. Kolonnestørrelsen var 2 x 40 cm. Beta-underenhederne fradissocierede i nærværelse af urinstof, og de separeredes derefter som beskrevet af Morgan og Canfield, Endocrinology 88, 1045, 1971· Ved denne proces føres blandingen gennem ionbytter-15 kolonner og "Sephadex" ® -kolonner gentagne gange for at frigive den dissocierede beta-underenhed med minimal forurening af hele molekylet af humant koriongonadotropin, eller dets alfa-underenhed.

20 B. Immunokemisk rensning af beta-underenheden af humant koriongonadotropin_

Af beta-underenheden af HCG, fremstillet i ovennævnte trin A, udtoges mikroprøver. En serie af lOO^ug prøver, 25 5 i antal, af beta-underenheden af HCG opløstes hver i 0,1 ml 100 millimolær natriumphosphat (NaHgPOjj og Na2HP0^), pufret kogsaltopløsning (0,85¾ NaCl) (PBS) (pH = 1,2).

Hver prøve omrørtes ved stuetemperatur (25°C) med et immunoabsorptionsmiddel af kaninantiovin-LH, fremstillet 30 på den nedenfor under C angivne måde. Omrøringstiderne varierede mellem 1, 5, 10, 20 og 30 minutter. Efter blandingen centrifugeredes rørene i 10 minutter ved 0 - 4°C. Den ovenstående væske fra hvert rør undersøgtes for reaktivitet over for anti-HCG og anti-LH. Ved denne 35 prøve bestemtes de passende betingelser for rensning af hele portionen af beta-underenhed af HCG, fremstillet i A, til at være 30 minutters omrøring ved 25°C. Valget 145283 10 af 30 minutter baseredes på den iagttagelse, at prøven fik en på overfladen flydende del ved minimalt niveau for reaktivitet med LH.

5 Egenskaberne af beta-HCG af den rensede beta-underenhed af HCG, fremstillet ifølge ovennævnte A, sammenlignedes med det immunokemisk rensede beta-underenhedspræparat, fremstillet ovenfor i B. Pig·. 1 og 2 på tegningen viser reaktiviteten af de forskellige præparater med anti-HCG 10 og anti-LH-serum før (fig. 1) og efter (fig. 2) immuno-absorptionsrensningstrinnet. Absorptionstrinnet forbedrer også mikroheterogeniteten af blandingen. Med henvisning til fig. 1 og 2 udsættes beta-HCG-blandingen for elektroforese i 7,5¾ analytiske polyacrylamidgeler 15 ved pH-værdien 9,0. Et sæt af gelen farvedes for densi-metriske målinger, og en anden identisk gel blev skåret i skiver på tværs i ca. 2,5 mm tykke segmenter. I hver af figurerne 1 og 2 betegner kurven (-) proteiner målt ved densitometri, kurven (.-.) betegner proteiner, 20 som konkurrerer med beta-HCG "Ύ for binding med anti-beta- HCG-serum, og kurven (.-----.) betegner proteiner, som 125 konkurrerer med HLH I, hvad angår dannelse af anti-HLH-serum. Det skal bemærkes, at.det immunokemisk rensede præparat viser en væsentlig reduktion af reaktiviteten med 25 anti-HHL-serum.

Det bemærkes, at de optimale betingelser, hvad angår omrøringstid og temperatur, er bestemt af arten af den særlige portion af beta-underenhed og af potensen af det an-30 vendte immunoabsorptionsmiddel. Det ses, at potensen af immunoabsorptionsmidlet varierer med titeren af det anvendte antiserum og med immunoabsorptionsmidlets lagringsperiode.

35 C. Fremstilling af immunoabsorptionsmiddel 10 ml antiserum (kaninantiovin-LH), opnået ved immuni- 11 145283 sering af kaniner med ovin-LH, dialyseredes nøjagtigt mod PBS ved 0 - 4°C, og pH-værdien indstilledes på 5 med 1M natriumacetatpuffer. 3 nil af en 2,5¾ vandig opløsning af glutaraldehyd tilsattes forsigtigt under omrøring.

5 Reaktionen fik lov at stå ved stuetemperatur (25°C) i 3 timer. Det polymeriserede materiale homogeniseredes i en Potter Elve-Jhem-homogeniseringsanordning med Teflon-pestil. Der rensedes med PBS gentagne gange, indtil det var frit for absorberende materiale ved 280 mju (upoly-10 meriseret frit protein). Det vaskedes derefter med 200 mM glycin-HCl-puffer, pH = 2,2, og neutraliseredes med 2 M K2HP0^-opløsning og ækvilibreredes derefter med PBS. Immunoabsorptionsmidlet lagredes ved 4°C med 0,1¾ Na-azid som et konserveringsmiddel i glycin-HCl-puffer.

15 D1 Fremstilling af vaccine under anvendelse af l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid som konjugerings-middel__.___ 20 Blanding (til 40 doser) 3,2 mg beta-underenhed af HCG, fremstillet ifølge trin B foroven, blandedes med 400 Lf tetanus toxoid (1500 Lf/mg protein N) og 16 mg l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid i 6,5 ml PBS, og opløsningen inkuberedes 25 ved 10°C i 5 timer under omrystning nu og da. Molekylfor-holdene mellem tetanus toxoid og beta-underenhed af HCG var ca. 1:10. Reaktionsproduktet dialyseredes nøjagtigt med phosphatpufferopløsning med pH =7,2, 0,005 M i kulden.

Produktet opsamledes i et sterilt rør under anvendelse af 30 en milliporefilter- og sprøjteanordning og ved hjælp af kogsaltopløsning under overføringen. Produktet prøvedes for sterilitet på thioglykolatmedium i 7 dage. Det absor-beredes derefter på kaliumaluminiumsulfat under anvendelse af steril 10¾ kaliumaluminiumsulfat- og steril 10¾ 35 natriumcarbonatopløsning. Vaccinen fordeltes derefter, indelukket i ampuller, og prøvedes for pyrogener og sterilitet.

145283 12 D2 Fremstilling af vaccine under anvendelse af glutar-aldehyd som konjugeringsmiddel-blanding af en dosis 80^,ug af beta-underenheden af HCG fremstilledes ifølge 5 ovennævnte trin B og blandedes med 10 Lf-enheder tetanus toxoid og 50yUl 1% vandholdigt glutaraldehyd. Blandingen inkuberedes ved 30°C under omrøring og da i 3 timer og dialyseredes derefter nøjagtigt mod PBS, pH-værdi 7S2, 0,005 M. Resten af metoden er den samme som beskrevet 10 under blandingen D-^.

Egenskaber

Vaccinen, som fremstilledes ifølge ovennævnte trin D^, 15 i det efterfølgende betegnet beta-HCG-TT, fandtes at være immunogent over for mus, kaniner, geder, aber samt mennesker. Den under trin D2 beskrevne vaccine, fandtes at have lignende immunogene egenskaber hos aber. Begge gav anledning til et ganske langvarigt antistofrespons.

20

En enkelt injektion af vaccinen D-^, givet med Freunds adjuvant på flere steder af en ged, inducerede ønsket anti-stoftiter i ca. 27 uger, hvorefter der fulgte en nedadgående fase. En anden tillægsinjicering i den nedadgående fase ?5 førte til en skarp bøjning af antistoftiteren. Dette er vist i fig. 3-

Responsmønsteret hos 10 forsøgsaber af arten rhesus fandtes at være lignende, selv om der fandtes individuelle varia-30 tioner. Dette er også vist i fig. 3.

Ved undersøgelse af de immunologiske egenskaber hos anti(beta-HCG-TT)serum viste det sig, at et sådant serum på geder eller aber reagerer immunologisk med hele HCG-35 molekylerne. Antiserummet giver ingen sidereaktioner med humant væksthormon (HGH), humant prolaktin eller humant placentalt lactogen (HPL), FSH, TSH eller LH, prøvet ved de fysiologiske og forhøjede niveauer. Tabel I sammenfatter 13 145283 resultaterne. I kolonnen med overskriften "Maximum-koncen-tration hvor konkurrence forekommer" er anført mængden af hvert hormon, som må være til stede, før det begynder at indvirke med anti-beta-HCG-TT serum. Tabellen repræsenterer 5 iøvrigt forsøg til bestemmelse af, om antistofferne, der dannedes af vaccinen i aber og geder, reagerede med de forskellige i kolonne 1 nævnte hormoner. Reaktiviteten af antistofferne med hormonerne blev bestemt ved måling af reaktionsgraden af antistof med hvert af hormonerne. Kolonnerne 10 3 og 4 angiver ? mærket HCG, som var bundet til antisera i nærværelse af det konkurrerende hormon (nævnt i første kolonne) ved den i anden kolonne angivne koncentration. Således indicerer en værdi på 100?, at der ikke er noget tab af binding i sammenligning med værdien, når intet hormon er 15 til stede, d.v.s. der er ingen krydsreaktivitet. Kolonnerne 5 og 6 angiver differencerne mellem 100? og værdierne i kolonnerne 3 og 4.

1482 83 14 c o Ή

-P

cd β φ -p o C G ω ω o β

C β &o M &0 &0 M

0 β β β C β β β X X ω ^

1 c g I I I I LO I O I O Η H

a o s la ° a ίϋ o Η Λ

S X A

H β 0) A

X o β cd > o S Λ «Μ Φ β u o φ rHCMom^rcyooooo

φ c d CT\ ΚΛ Π— H

o 0) Φ O) β o 60 β 3

&0 X

0 β β O Φ |>-00000000000

β X & 00 DJ t— CO

(i) <! .Q Ϊ«.

cd cd ^ β o

P) O

o cd _ β *H ^ 0) OH σνοοοιηνοαοοοοοο o ra +3'— voi'oooo'io'iooooo ·Η ICQ Η Η ι—ΙΗΗ 40 •Η β ? Εη 40 Φ Η • β Ό -¾ Η ΕΗ cd Φ ^ ι ο ω JOH Ο Η ο· ·Η g CQ Κ 40 ο

< I —. J

Η cd 40 ο ,,

40 φ Ο J

φ Ο ο G W

J β m Ο ·Η 1 ρ ·· ·Η &0 •Η Q Η ΚΛΟΙΟΟΟΟΟΟΟΟΟ 400 40 — Η t— ΚΛ^-ΟΟΟΟΟΟΟ tfl Η C -6¾ Η Η Η Η Η Η Η β Ο cd β -£

φ β CQ

ς_ί & Ο cd < Η ·5 β a 40 ο φ χ χ χ χ χ a 4J £ X X X X X X X β •η ο ja

Ο ·Η bObO&ObObObOhflbObOMM CQ-H

Η 40 βββββββββββ Η W

<β cd β X

Η β m ο cd

ο 40 Cd ο3- C— ΙΟ LO LO CM Η S

0 ·\ *\ »\ A *\ ·> *ι

ρ, φ OOJOCMi—IOOOC\JC\JO X

CQ Ο Η ι—ί Η XX

β Ο Ο Ο β Ε Ο 1 _ g cd ε ε β 40 ο ε m w J ε οφ ο j υ eh fc α Ε Ε Μ Ε Ε Ε Ε Ε 15 145283

De biologiske egenskaber af anti-(beta-HCG-TT)-serummet, produceret på geder og aber, og serummets evne til at neutralisere HCG prøvedes i et antal systemer. Det viste sig at være effektivt til inhibering af HCG-induceret forøgelse 5 af den ventrale prostatavægt på unge, ikke-kønsmodne rotter. Forsøgsdata, der sammenfatter dette arbejde, er vist i fig. 4, hvoraf det fremgår, at injektion af ren saltopløsning forøger kirtelvægten på ikke-kønsmodne rotter til 18-20 mg/100 g.

To enheder af HCG får vægten til at stige til 65-70 mg/100 g.

10 En injektion indeholdende to enheder HCG plus anti-beta-HCG-hapten-serum dannet af hidtil kendte vacciner, som ikke er immunokemisk renset og derfor indeholder determinanter med høj affinitet til anti-LH-sera, på fig. 4 betegnet ΑΝΤΙ-β--HCG-DNA, forøger vægten til 48-50 mg/100 g, men to enheder 15 HCG plus anti-beta-HCG-tetanus toxoid-serum dannet ved vaccinen ifølge opfindelsen forøger kun kirtelvægten til 30-35 mg/100 g, hvilket kun er en smule mere end forøgelsen iagttaget med saltopløsning. Det fremgår heraf, at det ved hjælp af den omhandlede vaccine producerede anti-serum er mere 20 effektivt til at reducere effekten af HCG på prostata-kirtlen på ikke-kønsmodne rotter end det tilsvarende anti-serum dannet af hapten-koplet vaccine. Det modvirkede også den HCG-inducerede forøgelse af progesteron-produktionen i skiver af corpus luteum in vitro. Dette er vist i tabel II.

25 TABEL II

i£f§}i£_§l!_§Gfeizbeta-HCG-TT_p4_grggesteron syntese_af_corgus_luteum

Progesteron

Tilsætninger ,ug/g væv * 1. Ingen 79,4 + 15,2 30 2. + HCG (0,1/Ug/ml) 183,2 + 30,6 3. + HCG + anti-beta-HCG-TT 105,4 + 23,4 4. + anti-beta-HCG-TT 96,7 + 23,2 x Middel + statistisk standardfejl af 6 eksperimenter.

16 145283

Det af vaccinen dannede serum forhindrer også bindingen af HCG til receptorer i membran-præparater fra testiklerne og ovarierne. Eksperimentdata, som viser dette, er sammenfattet i fig. 5, der illustrerer den biologiske egenskab af anti-5 serum produceret af den omhandlede vaccine på geder og aber.

Normalt HCG er bundet til receptorer i corpus luteum. Radioaktivt iod (1^5) anvendes til mærkning af HCG for at måle, hvorledes anti-beta-HCG-TT serum produceret med den omhand-lede vaccine påvirker bindingen af mærket ^ -HCG til et 10 homogenisat af corpus luteum fra geder. Det ses, at anti-. . 125 serum først mhiberer bindingen af ^ -HCG til homogenisatet fra corpus luteum udvundet af geder, men efterhånden som mængden af anti-beta-HCG-TT serum i systemet fortyndes, . . . . 125 formindskes graden af inhibering af T -absorption, og mere 125 1 15 mærket j -HCG blev bundet til homogenisatet af corpus luteum. Alle disse prøver viser, at antistofferne, som fremkommer med forbindelsen beta-HCG-TT, har evne til ikke blot at reagere immunologisk med hele HCG-molekyler, men også til at neutralisere den biologiske aktivitet heraf.

20

Beta-HCG-TT-vaccinepræparatet D-^ prøvedes med henblik på sikkerhed ifølge kravene i britisk pharmacopeia, og det viste sig, at det ikke foranledigede dødsfald blandt marsvin i 4 ugers observationstid. Det var endvidere fri for akut 25 og sub-akut toxieitet, hvilket prøvedes på to arter, nemlig gnavere og aber. Dets tolerance er også prøvet på 65 mus, 7 kaniner og 13 aber i perioder op til 1 år og mere. Overlevelsen af de immuniserede dyr var 100¾. Andre parametre, såsom hematologi (hemoglobin, TLC/DLC, d.v.s. total lymfocyt-30 tælling/differential lymfocyttælling, PCY, d.v.s. pakket cellerumfang, peripheral udskrabningseksamination for plader, reticulocyter), heptatiske funktioner (serum bilirubin, alkalisk phosphatase, glutaminsyre-oxaleddikesyre-trans-aminase og glutaminsyre-pyrodonsyre-transaminase, lactat-35 dehydrogenase, cholinesterase), nyrefunktionstests, blod-glucose, serum-lipider, cholesterol, triglycerider, frie t45283 17 fedtsyrer og thyroid-funktionsprøver, var normale i immuniserede aber. De immuniserede aber udviklede hverken omgående (Arthus) eller forsinket hypersensitivitet over for HCG.

5 Kliniske studier

Seks' kvindelige frivillige i den frugtbare aldersgruppe på 20 - 32 år injiceredes enten med vaccinepræparatet fremstillet ifølge ovennævnte eller med alternative 10 placeboer ved blindforsøg. Eftersom formålet med disse prøver var at fastslå immunogeniteten af vaccinen ifølge opfindelsen, var de seks kvinder, der udvalgtes til denne afprøvning, de samme, som havde undergået æggelederunder-binding, hvorved undgås usikkerheden som følge af ægløs-15 ning på tilfældige tidspunkter og de dermed forbundne fysiologiske reaktioner. I samtlige tilfælde gav placeboet intet respons. Alle de tre patienter, som fik vaccinen, udviklede antistofrespons mod både tetanus toxoid og humant korion-gonadotropin. Efter en retardationsperiode, som varede 20 4-6 uger fra patient til patient, fulgte en progressiv forøgelse af antistoftiteren. Antistoffer udvikledes endog simultant over for tetanus.

Fig. 6, 7 og 8 i vedlagte tegninger viser respons hos de 25 frivillige personer, som modtog vaccinen. Patienten K.W., fig. 8 i tegningerne, var 30 år gammel med 5 graviditeter og 4 levende børn. Forøgelsen af antistofferne, som reagerede mod HCG, er vist med kurven (o-o), og anti- tetanus-antistof med kurven (.-.). Anti-HCG-titeren 30 nåede et plateau og forblev på dette niveau i ca. 9 måneder efter injektionen. Prøvningerne fortsætter. Datoen for menstruationerne er vist med et X-mærke oppe på diagrammet. Patienten har menstrueret regelmæssigt. Endome-triumbiopsin, som udtoges på den 150. dag, viste bevis 35 på ægløsning, hvilket bekræftedes af marginalcytologi og progesteronniveauerne i den sekretoriske fase af cyklen.

18 145283

Den anden patient, A.M., fig. 7 var 32 år gammel med 3 graviditeter og 2 levende børn. Fig. 7 viser en lignende type af immunresponskinetik for A.M.. Endometriumbiopsin i dette tilfælde, såsom også vaginaleytologin og progeste-5 ronniveauerne, viser en tydelig ægløsning.

Den tredie patient, N.D., fig. 6, var 30 år gammel med 5 graviditeter og 3 levende børn. N.D. havde ammet et barn under de første ca. 150 dage af undersøgelsen, hvilket for-10 klarer fraværelsen af menstruation i denne periode. Immunisering med vaccinepræparatet medførte ingen forstyrrelse i mælkeproduktionen trods et ganske godt immunrespons. Hun var siden begyndt at menstruere og har haft normale menstruationsperioder .

15 Kønsdrift og andre forplantningsfunktioner har hos alle tre patienter været fuldstændig normal. Nøjagtige kliniske undersøgelser har ikke vist nogen mærkbare unormale forhold af nogen art. Andre parametre, såsom hematologi (hemoglobin, 20 TLC/DLC, PCV, peripheral udskrabningseksamination for plader, reticulocyter), hepatiske funktioner (serum bilirubin, alkalisk phosphatase, transaminaserne GOT og GPT, LDH isoenzymer, cholinesterase), Renal-funktionsprøver, blod-glucose, serum lipider, cholesterol, triglycider, frie 25 fedtsyrer og thyroid funktionsprøver var normale, og immunisation har ikke produceret nogen ændring i organfunktionerne og metabolismen. Patienterne har også udvist normal respons på insulinhypoglycemitest, udtrykt ved produktion af cortisol og væksthormon.

30

Sera fra disse tre immuniserede kvinder såvel som fra aber og geder, hyperimmuniseret med beta-HCG-TT-præparatet, er undersøgt med forskellige tests for at udelukke mulige autoimmune reaktioner over for organerne i organismen.

35 De fandtes'at være negative, hvad angår anti-nukleære antistoffer, antimikrosomale antistoffer og manglende 19 145283 rheumatoidfaktor-reaktivitet. Disse oplysninger er sammenfattet i tabel II.

TABEL II

5 Immuno£athologiske_unders^gelser_gå_immuniserede_individer

Sera fra Undersøgelser Observationer 1. N.D. 30 fig. 6 1. Antinukleær Ingen påviselig 23.8.74 antistof reaktion med nogen i n 2. N.D. 30 2. Antimikrosomal a^pr^ve<^e 20.9.74 antistof sera 3. N.D. 30 3· Latex-agglutination 2.12.74 for rheumatoid 4. A.M. 32 fig. 7 fakt0r 11.10.74 πς 5. K.w. 30 fig. 8 28.10.74 6. K.W. 30 2.12.74 7. Ikke-immuniseret kontrol 20

Det viste sig, at de også var negative, hvad angår reaktiviteten mod human thyroid, parathyroid, adrenaler, nyre, testikler og ovarier. Data, som viser disse fakta, er sammenfattet i tabel III.

20 145283

TABEL III

Reaktivitet _af<_anti_beta-TT_sera_over^for_humane_organer

Humane organer

Sera fra_____afprøvet Observationer_

Normale kvinder Thyroid Ingen reaktion af a _ π ,, . , sera set ved immu-

Immuniserede personer Parathyroid noflu0rescens med i;LS· ° nogen af organerne

Adrenal

Normale aber Nyre

Immuniserede aber Testis

Ovarier

De var også negative, hvad angår reaktiviteten mod vævssubstrat fra mus, kaniner og bavianer, såsom det er sammenfattet i tabel IV.

TABEL IV

Reaktivitet af anti beta-TT sera med vævssubstrater fra ____________________forskellige_aber___ Vævssubstrater

Sera prøvet_fra Prøver udført Observationer

Normale personer Mus a) Indirekte 1) Intet vævs- immuno- reagerende fluorescens antistof påvist

Immuniserede kvinder Kaniner b) Anti-DNA 2) Intet anti- <N-D-> flS· 6 Bavianer “tistor ™A “ti- „ .. stof fundet

Normale aber

Immuniserede aber

De stoffer, som er udviklet på de frivillige kvinder, viste sig i stand til at neutralisere den biologiske aktivitet af hele HCG. Pig. 9 i tegningen viser disse antistoffers (fra N.D.) evne til at blokere bindingen af HCG til corpus luteum-præparatet med en radioreceptorprøve. Evnen af disse 21 145283 antistoffer til at binde HCG in vivo er vist af de betingelser, som fremgår af fig. 10.

Den totale varighed af immunrespons over for HCG hos 5 mennesker efter primær immunisering med fire 14 dage gamle injektioner af vaccinen ventes at vare mere end et år, til trods for at individuelle variationer kan opstå. Aktiv immunisering har ikke udviklet uønskede reaktioner.

Patienterne har haft normale menstruationscykler. Der 10 er bevis for ægløsning. Nyre, lever, pituitær, cardio-vaskulær, thyroid- og andre organiske funktioner er normale og uforstyrrede.

EKSEMPEL 2 15

En vaccine fremstilledes under anvendelse af beta-HCG-endefragment (BEP) indeholdende de sidste 52-33 aminosyre-rester, i stedet for det immunologisk rensede beta-HCG, som anvendtes ifølge fremgangsmåden, såsom skitseret i eksem-20 pel 1. I dette eksempel er beta-HCG-endefragmentet (BEP), omfattende de sidste 32-33 aminosyrerester, kovalent bundet til tetanus toxoid i et forhold på 40:1 med anvendelse af l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. BEF fås fra beta-HCG ved papainspaltning, såsom i henhold til 25 den ovenfor beskrevne metode. I stedet kan BEP syntetiseres kemisk ved i og for sig kendte metoder.

Tilstrækkelig vaccine til 30 doser fremstilledes ved at blande 2,5 mg BEP med 300 Lf tetanus toxoid og 15 mg 1-30 ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, i phosphat-puffer-saltopløsning, pH = 7»2, til et slutrumfang på 5,0 ml. Denne inkuberes ved 4°C i 6 timer under omrøring nu og da. Produktet dialyseres over for PBS 7,2 i kulden i 48 timer med 5-6 skift for hver 1 liter puffer.

Resten af proceduren, inkl. sterilisationen og fremstillingen af vaccinen, er den samme som beskrevet i eksempel 1.

35 145283 22 EKSEMPEL 3

Der fremstilles en vaccine under anvendelse af et nitroderivat af beta-underenheden af HCG ved at følge 5 proceduren ifølge eksempel 1, D^. Molekylforholdet mellem derivatet og tetanus toxoid var 10:1. Resten af proceduren, inkl. sterilisationen og fremstillingen af vaccinen er den samme som beskrevet i eksempel 1.

10 EKSEMPEL 4

Metode 1

En vaccine mod graviditet blev fremstillet under anvendelse af polyflagellin eller "keyhole limpet hemocyanin" 15 i stedet for tetanus toxoid ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1. I stedet for trin og i nævnte eksempel blev en opløsning af beta-HCG (2 mg/ml) i destilleret vand inkuberet med samme rumfang af en 1% glutaraldehyd-opløsning i 0,2 M natriumphosphat-puffer, pH = 6,8 i 20 18 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev dialyseret over for 0,15 M saltopløsning med flere skift.

Til denne dialyserede opløsning sattes en tiendedel rumfang af 1 M carbonat-bicarbonat-puffer, pH = 9,5 og samme .25 rumfang af en opløsning af bæreren, polyflagellin (POL) eller "keyhole limpet hemocyanin" (KLH) optaget i en 0,15 M saltopløsning. Koncentrationerne varierede fra 0,4 til 1,2 mg/ml for KLH og 0,3 mg/ml til 1,2 mg/ml for polyflagellin til opnåelse af konjugater med varierende 30 sammensætning.

Reaktionsblandingen blev inkuberet under rystning uafbrudt i 24 timer ved 4°C og derefter dialyseret kraftigt over for 0,05 M natriumphosphat-puffer, pH = 7,4.

Produktet opsamledes i et sterilt rør under anvendelse af et milliporefilter i forbindelse med en sprøjte og med 35 23 145283 saltopløsning til overførsel. Produktet blev prøvet for sterilitet på thioglycolat-mediet i 7 dage. Det blev derefter adsorberet på alun under anvendelse af steril 10¾ kaliumaluminiumsulfat- og steril 10¾ natriumcarbonat-5 opløsninger. Vaccinen blev derefter fordelt i ampuller og prøvet for pyrogenitet og sterilitet.

Metode 2

Beta-HCG (2 mg/ml) i destilleret vand blev blandet med 10 samme rumfang af bæreren polyflagellin (POL) eller "keyhole limpet hemocyanin" (KLH) opløst i 0,15 M saltopløsning. Koncentrationen af bæremediet varierede fra 0,4 til 1,2 mg/ml for KLH og 0,3 til 1,2 mg/ml for POL til opnåelse af konjugater med varierende sammensætning. Reak-15 tionsblandingen blev inkuberet med et tyvendedel rumfang l-ethyl-3(3~dimethyl-amino-propyl)carbodiimid, HC1 (100 mg/ml) i 6 timer ved 4°C under fortsat omrøring.

Efter dyrkning blev reaktionsblandingen dialyseret omhyg-20 geligt over for 0,05 M natriumphosphat-pufret saltopløsning, pH = 7j^· Resten af fremgangsmåden er den samme som beskrevet i metode 1.

Egenskaber 25 Vacciner fremstillet i overensstemmelse med metode 1 og metode 2 i det efterfølgende betegnet som beta-HCG-KLH og beta-HCG-POL, viste sig at være immunogene over for aber, og de gav anledning til temmelig langvarige antistof-reaktioner .

30

En enkelt injektion af vaccinen på aben inducerede en stigning af antistof-titer i ca. 100 dage, hvorefter der opnåedes konstante værdier. Dette efterfulgtes af en faldende tendens. Dette fremgår af efterfølgende fig. 11 35 og 12.

Tabel V viser, at det dannede anti-beta-HCG-KLH

145283 2k serum ikke giver en krydsreaktion med humane væksthormoner (HGH), human prolactin og human placental lactogen (HPL), human FSH, TSH eller LH. Endvidere fremgår det af tabel V, at selv om små mængder anti-beta-HCG-KLH 5 sera kræves til at binde beta-HCG-KLH sera, behøves der mindst dobbelt så meget beta-HCG-KLH til at binde HTH, HTSH, HFSH, HPL og HGH.

De biologiske egenskaber for anti-beta-HCG-POL eller KLH 10 serum på geder og evnen af dette serum til at neutralisere HCG blev afprøvet på flere systemer. Det forhindrer binding af HCG til receptorer i membranpræparater fra corpus luteum på geder. Eksperimentelle data, som viser dette, er opregnet i fig. 13 og 14. Disse prøver viser, 15 at antistofferne udviklet over for forbindelsen beta-HCG-KLH eller -POL har evnen til ikke blot at reagere immunologisk med hele HCG-molekylet, men også at neutralisere den biologiske aktivitet.

20 Tabellerne VI og VII viser affiniteten af antistofferne for binding med HCG på aber, der er immuniseret med vaccinen. Værdien Ka i tabellerne VI og VII blev bestemt ved måling af omsætningen mellem ioderet HCG af lav specifik aktivitet og antistofferne ved en begyndelsesfortynding 25 på 1:25.

25 145283 i—i ¢3 -=r i“i κ s o lo s σι H<5 *\ * ·% * λ

I G? O i—I rl D\ C\I i—I i—I

nj H C— t—

jj> a- -a- -P

φ r—I H Q> n A Λ Ό 1 5 = •H ^

4J C\J

£-< rf_ ed <D ^ rQ <H y dj ·Η bO ffi 1 H ' ~ ^ in hfl toil) co 03 in oj

C C £! MD O VO 00 H

-r-j Λ Λ Λ Λ * τ3 43 Ο Ο r—i VO CO Ο Ο 'μ c (DC O O Cd = •H Ό ·Η Ο Ο £)60 Η Η Μ

C %s. >Ν C

£ 1° Ο S LO Μ

<D S

ο Ο S3 ·Η S3 Η S3

, S C

Η . ·Η ίΠ g ro CM S £ _

Φ LO

J M ra Ή _, w o i 3 ^ _ £Q m LTl O ΙΌ ΟΊ Ή -

K OOOHOJ -P -P

EH <D S3 IH ·> *> " Λ *> Φ

Ci g? η ri ni tn m (o vo »cd C

O O i—1'—ii—ii—I CO

gO ΚΊ ΚΊ Q g O

c S3 i1 i1 ° ^ y O /v <\ O S3 £ U S3 cd <D Ή ^ 'Zn bO „ M - •H (D C C *- i—i S3 i i Φ ^

i—1 *3| ·Η hO S

φ PC o 4> x ·ρ P Έ

CQ r-' C ^ 5P

C bO CD O VO LA OCC

O CS2COt— LTiLnH 43¾ f[. j V_/ #\ Λ A Λ )¾ 43 Ο Ο Η Η Ο Ο Ο (ϋ ,.

g (DC ιΗιΗΟΟ ιΗ " (D >ΰ ·Η Ο Ο rH _> ιΗ Μ Η Η < & Η β« /\ Λ £ (D id Ο Κ ΙΗ S S in

(D

ο c

<D

c ^ c fes

c IA

3d ih o\ C C S3

O <D O <D

W C S3 3d O I Si ε cd S3 S3 >a C +3C3S3COcOi-3-pS3

O (DOSIEHIxiP-iWCS

S3 CQ S3 S3 S3 S3 S3 ^ S3 26 145283 α> Β &0 c

•η O

-d σι σι η co σ\ d o o o o o • ri i—Ei—I H i—li—1 ,Ω

X * X XX

u o Pi -=r oo γά vo m

cp O CT\ CT\ CM O LA

(X, « Λ Λ Λ *1 Ί c, ι η η ιλ ιη η

ø cS rH

Cp ο ο Λ « η «\ cp 1¾ g; «ο ο σ\ ca σ\ Ο ί \ CTv ι—! γΗ Ο Ο Ο μ jj ρ ΟΟΟ ιΗΗΗ CQ -Ρ 0) ι—[ Η Η •Η 0 -Ρ XXX ^ -Ρ ,Ω ·Η X X X <11 £ Pi ΙΑ LA 00 -Ρ

Cd di ^ ri Ρ in WHO C

O) CO VO ^ η η Λ 0

H cp g cd ·< « « ^ΓΐΑσ\ S

> cd K σν in KV o JJ) η η n Q,

g] P 0 η η η OOO B

H (D Sh σν ον ον i I ι ι ι 1 o pq .p 0 OOO OOO Pi

<] d IQ 1—I 1—I H 1—Irrii—I

ti d Ή £)

•p £ XXX XXX P

rad ω

Cg cocrso ri co s ι i

0 g o ia -=r σν o in <P

»s«» β(_| «\ #\ *\ ·\ *\

s—. i—I ι—I C1— C t *H

1 u

mø -P

•P £> “ 0 cd

ι Λ rH

•H -iri a c o

•Η β bO

Q-ι O C Sh ζ-t w c ·η ω cd <u Sh > ^ -Ρ 0 Ρ ι eg m 3 m ø-π ja c\j -a- h ri σ\ X! C C^rcjco Loco^r o ø 3 ri ri rri

•Η &0 S K

-p cd S

cd Q *H

•H

o

O

CQ <D

[Q £1 r-i C\l < <; 27 145283 Ό Ο α> oo m η co σ\ σ> g ο ο ο ο ο ο

ι—I ι—I ι—I ι—I ι—I i I

Μ C XXX XX« •Η « co ^ Η co σ C ch η (Μ οο vs ·Ι_| *\ Λ *1 »V Λ ,α χ σ\ η ri co π- σ\ ri η Λ " ο J ο " *Ό " «Ο Η ο s ct\ctvh σ> Η Ρ-,^,ΟΟΟ οοο

ril ri ri ri ri Hi—IH

O) O φ

H O 4J XXX XX

<h ffi -ri X _

0 I j O C— CT\ C\J

p (j w ΙΌ ΚΊ -=r LTV LH H

CQ-p cd η η n r, η n •HUJ W ιό -=r H >-1— oj ri P i 0 £ H Λ ** *\ n r\ ±2

ctiO O i—I O O O ι—I C

d) i—I i—I i—I i—ii—li I Φ

H <ri g OOO OOO C

I—led i—IHi—I i—It—IH O

!> -P Q<

rid) XXX XXX S

J 0 ri o

Pl|+3(U ΙΛ ΐ 0 OOJIA Pi

Cd CM VOHCTi tv -T O

C3jcd*ri ΛΛΛ * * * 0

Eh-PC OJ H C\l C\J ΙΌ H ri

M 3 O

es ^ OS ^

;* -H

1 ri MØ -p

p ,D M

ø cd "®- p ^

•Η ·γΗ bO

C C O

•ri O ri *H

H O 0 ri k ril K -P 0 ® cd ·Ρ m ·> w ΦΗ ΓΌ O (M HVOH £·<

i C en in m cd in C

M 0 C Η H W

C M6 o a s

•ri Q Ή X

P

•ri o o

M 0 H C\J

M £2 < <

Claims (4)

28 145283

1. Vaccine til forhindring af graviditet, hvilken 5 vaccine indeholder beta-underenheden af humant korion-gonadotropin eller et derivat eller fragment heraf, kendetegnet ved, at den består af et konjugat af et fysiologisk tolerabelt, immunogent bærestof og beta-underenheden af humant koriongonadotropin, HCG, 10 eller et derivat eller fragment heraf, hvilken vaccine er immunokemisk renset, således at den er fri for determinanter, som kan reagere med høj affinitet med anti-luteiniserings-hormon-sera (anti-LH-sera).

2. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at derivatet eller fragmentet af beta-underenheden af HCG er: (a) et C-endefragment af beta-underenheden af HCG med 20 30 - 38 aminosyrerester, eller (b) nitroderivatet af beta-underenheden af HCG.

3. Vaccine ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det immunogene bærestof er tetanus toxoid. .25

4. Fremgangsmåde til fremstilling af vaccinen ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at 30 (a) kemisk renset beta-underenhed af HCG eller et derivat eller fragment heraf omsættes med anti-LH-sera som LH-immunoabsorptionsmiddel, hvorved det befries for determinanter, som kan reagere med høj affinitet med anti-LH-sera, og 35 (b) at beta-underenhedsproduktet fra trin (a) konjuge res med et fysiologisk tolerabelt, immunogent bærestof til opnåelse af en vaccine.