SE432706B - Konceptionsforhindrande medel i form av ett immunogent konjugat av en berare och nitroderivatet av beta-hcg jemte forfarande for dess framstellning - Google Patents

Description

7807571-0 vaccin. Föreliggande försök är baserat på framdragande av anti- kroppssvar genom aktiv immunisering mot ett hormon, som är kritiskt för tillkomst och uppehàllande av graviditet.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett konceptionsförhindrande medel.

Ett ytterligare ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett sätt för framställning av ett konceptionsförhindrande medel, vilket producerar antikroppar med minimal tvärreaktion med andra endogena hormoner vid fysiologiska nivåer. I Man har nu funnit att ett~konceptionsförhindrande medel, nedan betecknat ett vaccin för förhindrande av graviditet, àstadkommes genom att bilda ett konjugat av en patientfördragsam immunogen bärare med ett preparat av nitroderivatet av betasubenheten av hCG, vilket preparat är fritt från determinanter som kan reagera med hög affinitet med anti-LH-sera.

Termen immunokemiskt renad innefattar i detta sammanhang behandling, vilken avlägsnar komponenter av betasubenhetpreparatet, vilket om det får kvarstanna skulle förorsaka bildning av anti- kroppar, som kunde sidoreagera med endogen LH. vaccinet enligt föreliggande uppfinning är i huvudsak fritt från sidoreaktioner med andra endogena hormoner, såsom de pituitära hormonerna, som krävs för normal funktion hos reproduktiva organ.

I enlighet med en föredragen utföringsform av uppfinningen separeras betasubenheten från alfasubenheten av mänskligt korion- gonadotropin i enlighet med kända förfaranden, renas därefter kemiskt medelst kända medel och renas därefter immunokemiskt med användning av ett heterologt antihLH-immunoabsorptionsmedel. vaccinet i en föredragen form är ett konjugat av en kemiskt och immunokemiskt renad form av nitroderivatet av betasubenheten av mänskligt koriongonadotropin med stelkrampstoxoid i molekylpro- portionerna ca 1:5 - 1:20. Konjugeringen äger rum i närvaro av ett kondensationsmedel, såsom glutaraldehyd eller etylaminopropyl- karbodiimid, för att erhålla ett kovalentbundet konjugat. Konjugatet utsättes därefter för de konventionella stegen dialysering, ste- rilitetskontroll och utfällning för att bilda vaccinet.

Såsom är känt inom tekniken är placenta en vävnad, som ut- vecklas endast vid graviditet; den är inte en normal del av den ' 7807571-0 ej gravida kvinnan. Vaccinet enligt föreliggande uppfinning är i stånd att motverka tillkomsten och uppehâllandet av gravidi- teten. Hos människor produceras t ex ett kritiskt hormon, mänskligt koriongonadotropin, av trofoblasterna ungefär på 8:e dagen efter befruktning. Detta hormon understöder på detta stadium korpus luteum och säkerställer uterus receptivitet. Hormonet kan även skydda blastocysten på andra sätt. Dess neutralisation resul- terar i igângsättning av menstruation, vilket sålunda förhindrar uppehâllandet av graviditet.

Mänskligt koriongonadotropin (nedan ibland kallad hCG) är ett glykoproteinhormon sammansatt av 2 subenheter: alfa och beta.

Alfasubenheten är nästan identisk med de respektive alfasub- enheterna hos hormonerna ityroidstimulerande hormon (TSH), follikel- stimulerande hormon, (FSH) och luteiniseringshormon (LH).

Betasubenheten av hormonet tillskrives i vardera fallet princi- piellt hormonspecificiteten.

Betasubenheten av hCG är en polypeptid med 146-147 aminosyror med 3 av 5 kolhydratrester i C-slutänden. En del av betasubenheten uppbär aminosyrahomologer med betasubenheten i LH. Beta-hCG framställd genom dissociering av högrenad hCG har en ansenlig grad av mikroheterogenitet. Proteinet upplöses i 8 band genom elektrofores på analytiska polyakrylamidgeler. Denna mikrohetero- genitet iakttas hos kommersiellt tillgänglig hCG,'som framställs från graviditetsurin. Mikroheterogeniteten kan bero på en variabel grad av klyvning och/eller modifiering av molekylen under dess passage genom olika vävnader. hCG som en hel molekyl eller betasubenheten av hCG åstad- kommer, när den injiceras på kvinnor, inte bildningen av anti- kroppar som kan neutralisera hCG-aktiviteten. Det kan emellertid göras antigeniskt genom koppling med starkt antigena haptener.

Diazotiserade sulfanilinsyraderivat har Provats och det har visats att anti-hCG-antikroppar induceras hos postmenopausala kvinnor.

Detta beskrivs av Vernon C. Stevens och C. Deans Crystle i “Effects of Immunization with Hapten-Coupled HCG on the Human Menstrual Cycle", Obstetrics and Gynecology, vol. 42, No. 4, oktober 1973. Emellertid fick patienterna en sänkning eller ett utplânande av medelcykel-LH-toppar, vilket antyder att antikroppar- na sidoreagerade in vivo med endogen LH. En sådan sidoreaktion med ett pituitärt hormon, som krävs för normal funktion av de reproduktiva organen, är oönskad och potentiellt farlig. 7867571-0 Det är viktigt enligt föreliggande uppfinning att betasub- enheten av hCG, som används i reaktionsblandningen, är högrenad både kemiskt och immunokemiskt. Den kemiska reningen av betasub- enheten kan åstadkommas på vilket som helst inom tekniken känt sätt, såsom det förfarande som beskrivs i Morgan, F.J. och R.E.

Canfield, Endocrinolog 88, 1045, 1971, och F.J. Morgan, R.E.

Canfield, J.L. Vaitukaitis och G.T. Ross, Endocrinology 94, pp 1601-1605, 1974. Ett annat lämpligt sätt att erhålla en kemiskt ren betasubenhet av hCG beskrivs av Swaminathan, N. och Bahl, O.P. i "Dissociation and Recombination of Subunits of Human Chorionic Gonadotropin", Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 40, p 422, (1970). Emellertid är dessa kemiska reningsmetoder inte tillräckliga för att avlägsna determinanter som kan reagera med hög affinitet med anti-LH-sera.

Det immunokemiška reningssteget består av upplösning av den.kemiskt renade betasubenheten av mänskligt koriongonadotropin i ett fysiologiskt lösningsmedel, såsom fosfatbuffrad koksalt- lösning, och omröring av lösningen vid rumstemperatur under en reglerad tidsperiod med ett immunoabsorptionsmedel, såsom kanin- antiovin-LH. Behandlingen med ett heterologt anti-LH-ímmuno- absorptionsmedel, under omsorgsfullt reglerade betingelser, är avsedd att avlägsna de delar av preparatet, som har determinanter som kan reagera med hög affinitet med anti-LH-sera. Det i för- farandet enligt föreliggande uppfinning använda immunoabsorptions- medlet.kan väljas bland åtskilliga heterologa LH-antisera, såsom kaninantiovin-LH, apantiovin- ellerantibovfirLH. Omröringen utföres vid en temperatur av exempelvis 25°C, under perioder av l-60 min eller mer, beroende på temperaturen, naturen hos den särskilda klassen av betasubenheten av hCG och potensen hos det använda immunoabsorptionsmedlet. De optimala betingelserna skall bestämmas för varje prov av betasubenhetpreparat och för varje immuno- absorptionsmedel. Preparatet utsättes därefter för centrifugering, fällningen bortkastas och filtratet innehåller kemiskt och 'immunokemiskt renad betasubenhet av mänskligt koriongonadotropin.

Nitroderivatet av betasubenheten av hCG kan framställas genom det förfarande, som beskrivs i Sokolousky et al., Biochemistry 5, pp 3582-3589 (1966).

Detta preparat utsätts för det immunokemiska reningssteget för att utesluta determinanter som kan reagera med hög affinitet med anti-LH-sera. 7807571-0 Termen “hög afíinitet", såsom den används i föreliggande upp- finning, beskriver en egenskap hos de delar, som förenas med anti- -LH-sera med hög hastighet vid den använda temperaturen. Anti-LH- -sera för detta ändamål upphöjes företrädesvis till heterolog LH.

Preparatet av nitroderivatet av betasubenheten av mänskligt koriongonadotropin, fritt från determinanter som kan reagera med hög affinitet med anti-LH-sera, bringas därefter att reagera med en patientfördragsam immunogen bärare, såsom stelkrampstoxoid i önskade proportioner, med användning av ett kondenseringsmedel, var- igenom betasubenheten konjugeras med bäraren. Lämpliga bärare för an- vändning vid framställning av vaccinet enligt föreliggande uppfinning innefattar stelkrampstoxoid, polymeriserad flagellin, KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin), dextran, värme- eller bestràlningsinaktiverat polio- och gulafebervirus, värme- eller besträlningsinaktiverade tyfoid- och paratyfoidvaccin, koleratoxoid, BCG, antiplasmodium- vaccin, pertussis- och difteritoxoid och bionedbrytningsbara poly- merer, såsom polymjölksyra, polyglykolsyra, kollagen, syntetiska polypeptider och polynukleotider.

I enlighet med en av de föredragna utföringsformerna av före- liggande uppfinning är reaktionsprodukten en komplex polymer av stelkrampstoxoid och det kemiskt och immunokemiskt renade nitro- derivatet av betasubenheten av mänskligt koriongonadotropin, kon- jugerade kovalent i molekylproportionerna ca 1:5 - ca 1:20 i närvaro av ett kondenserings- eller kopplingsmedel, Såsom glutaraldehyd eller l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid.

När kondenseringsmedlet består av l-etyl-3-(3-dimetyl-amino- propyl)karbodiimid, blandas renad stelkrampstoxoid och nitroderi- vatet av betasubenhet av mänskligt koriongonadotropin i molekyl- proportioner inom det ovan angivna området tillsammans med konden- seringsmedlet och blandningen inkuberas därefter vid en temperatur ej överstigande 25°C och under en period ej överstigande 6 h be- roende pà temperaturen. Det föredrages att reaktionen genomföres vid en temperatur ej överstigande l0°C och under en period av 4-6 h.

När kondenseringsmedlet består av glutaraldehyd, blandas renad stelkrampstoxoid och nitroderivatet av betasubenheten av mänskligt koriongonadotropin i de önskade molekylproportionerna tillsammans med kondenseringsmedlet och blandningen inkuberas därefter vid en temperatur ej överstigande 37°C och under en period av ej mer än 6 h. Företrädesvis genomföres inkubationssteget vid en temperatur av ca 20-30°C och under en period av 2-4 h. 7807571-0 Den så erhållna föreningen dialyseras därefter noggrant mot fosfatbuffrad koksaltlösning med pH-värdet 7,2, 0,005 M i kyla, t ex SÖC och uppsamlas i ett sterilt röà med användning av en milliporfilter- och sprutanordning, med användning av koksalts- lösning för överföringen. Preparatet utsättes därefter för steri- litetspróvning på ett inom tekniken känt sätt för att säkerställa frånvaron av mikroorganismer.

Efter steriliseringen utfälles preparatet på kaliumalnmi- niumsulfat med användning av sterila kaliumaluminiumsulfat- och sterila natriumkarbonatlösningar. I stället för kaliumaluminium- sulfat kan även andra lämpliga hjälpmedel användas. Emellertid har man funnit att fällningen på kaliumalüminiumsulfat skyddar den aktiva substansen från absorption på glasbehållare och åstad- kommer även ett långvarigt gensvar. Vaccinet användes företrädes- vis som en emulsion med vegetabiliska oljor med injektionstill- fället och detta förbättrarytterligare antigeniciteten.

EXEMPEL ,I Ett antigraviditetsvaccin framställdes genom följande för- farande: A. Kemisk rening av betasubenneten av mänskligtlgnionqonadotropin Renat mänskligt koriongonadotropin framställdes från rått hCG genom metoden enligt Canfield et al. Recent Progr. Horm. Res. 27, 124, l97l. Det inkuberades vid 40°C i l h med 8 M nyframställd karbamidlösning, som hade renats på en blandad katjon-anjonbytes- kolonn, speciellt en bädd av lika mängder Dowe l X-8 och Dowe 50 X-4, partikelstorlek mindre än 74 pm. Kolonnstorleken var 2 x 40 cm.

I närvaro av karbamid dissocierades betasubenheterna och separe- rades därefter genom metoden enligt Morgan och Canfield, Endo- crinology 88, 1045, l97l. Enligt detta förf rande får blandningen passera genom jonbytarkolonner och Sephadex-kolonner upprepade gånger för att ge den dissocierade betasubenheten med minimal förorening av hela molekylen av mänskligt koriongonadotropin, eller dess alfasubenhet.

B. Immunokemisk rening av betasubenheten av mänskligt korion- gonadotrgpin Av betasubenheten av hCG, framställd i steg A ovan, togs mikroprover. En serie av 100 pg prover, 5 till antalet, av betasubenheten av hCG löstes var och en i 0,1 ml 100 mM natrium- '7807571-0 fosfat (NaH2PO4 och Na2HPO4), buffrad koksaltlösning (O,85 % NaCl) (PBS) (pH 7,2). Varje prov omrördes vid rumstemperatur (25°C) med ett immunoabsorptionsmedel av kaninantiovin-LH, framställt på det i C. nedan beskrivna sättet. Omröringstiderna varierade mellan 1, 5, 10, 20 och 30 min. Efter blandningen centrifugerades rören - i 10 min vid O-4°C. Det på ytan flytande från varje rör provades med avseende på reaktivitet mot anti-hCG och anti-LH. Med detta prov bestämdes de lämpliga betingelserna för rening av hela satsen av betasubenhet av hCG, framställd i A., till att vara 30 min omröring vid 25°C. Valet av 30 min baserades på iakttagelsen, att provet åstadkom en på ytan flytande del med miniminivå för reaktivitet med LH.

Egenskaperna hos beta-hCG av den renade betasubenheten av hCG, framställd i A. ovan, jämfördes med det immunokemiskt renade betasubenhetspreparatet, framställt ovan i B. Fig 1 och 2 i bifo- gade ritningar visar reaktiviteten av de olika preparaten med anti-hCG och anti-LH-serum före (fig l) och efter (fig 2) immuno- absorptionsreningssteget. Absorptionssteget förbättrar även mikro- heterogeniteten hos blandningen. Med referens till fig 1 och 2 utsattes beta-hCG-blandningar för elektrofores i 7,5 % analytiska polyakrylamidgeler vid pH-värdet 9,0. Ett sätt av gelen färgades för densimetriska mätningar och en annan identisk gel skivades på tvären i ca 2,5 mm tjocka segment. Proteiner från varje segment eluerades i 0,9 % natriumkloridlösning. I var och en av figurerna l och 2 betecknar kurvan (-----) proteiner mätta genom den- o) betecknar proteiner, som konkurrerar sitometri, kurvan (¿ med beta-hCG1z5I vad avser bindning med antibeta-hCG-serum och kurvan 0 - - - - - -o betecknar proteiner som tävlar med hLH125I vad beträffar bindning med anti-hLH-serum. Det skall noteras att detinmunokemiskt renade preparatet visar en väsentlig reduktion av reaktiviteten med anti-hLH-serum.

Man kan märka att de optimala betingelserna vad beträffar omröringstid och temperatur bestäms av naturen av den särskilda satsen av betasubenhet och det använda immunoabsorptionsmedlets potens. Man kan se att den senare varierar med titern hos det använda antiserat och med immunoabsorptionsmedlets lagringsperiod. 7807571-0 C. Framställning av immunoabsorptionsmedel lO ml antiserum (kaninantiovin-LH), erhållen genom immur nisering av kaninantiovin-LH, dialyserades noggrant mot PBS \id 0-4°C och pH-värdet justerades till pH 5 med l M natriumacetat- buffert. 3 ml av en 2,5 % vattenlösning av glutaraldehyd till- sattes försiktigt under omröring. Reaktionsblandningen fick stå vid rumstemperatur (25°) i 3 h. Det polymeriserade materialet homogeniserades i en Potter ElveJhem-homogeniseringsanordning med Teflomg stamp. Det tvättades med PBS upprepade' gånger tills det var fritt från 280 mp absorberande material (opolymeriserat fritt protein). Det tvättades därefter med 200 mM glycin - HC1- buffert, pH 2,2, och neutraliserades med 2 M KZHPO4-lösning och utbalanserades slutligen med PBS. Immunoabsorptionsmedlet lagra- des vid 4°C med 0,1 % Na-azid som ett konserveringsmedel i glycin- -HCl buffert, i avvaktan på uppföljningen. _ DlrFramställning av vaccin med användning av l-etyl-3-(3-dimetyl- ~aminopropyl)karbodiimid'som kondensationsmedel §l§§ê§i§¶_Lšë§_â9_§2§s§L 3,2 mg betasubenhet av hCG, framställt såsom i B. ovan, blandades med 400 Lf stelkrampstoxoid (1500 Lf/mg protein N) och 16 mg l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)karbodiimid i 6,5 ml PBS och lösningen inkuberades vid lO°C i 5 h med omskakning då och då. Molekylproportionerna mellan stelkrampstoxoid och betasub- enhet av hCG var ca 1:10. Reaktionsprodukten dialyserades noggrant mot fosfatbuffertsaltlösning med pH 7,2, 0,005 M i kyla. Produkten uppsamlades i ett sterilt rör med användning av en milliporfilter- och sprutanordning och med användning av koksaltlösníng för över- föringen. Produkten provades med avseende på sterilitet på tio- glykolatmedium i 7 dagar. Den absorberades därefter på kalium- aluminiumsulfat med användning av steril 10 % kaliumaluminiumsul- fat- och steril 10 % natriumkarbonatlösning. Vaccinet fördelades därefter, inneslöts i ampuller och provades med avseende på pyro- gener och sterilitet.

D Framställning av vaccin med användning av glutaraldehyd som 2 7 kondensationsmedel - blandning för en dos 804r;av betasubenheten av hCG framställd enligt C. ovan, blandades med l dos stelkrampstoxoid, 10 Lf-enheter och 50 pl 1 % vattenhaltig glutaraldehyd. Blandningen inkuberades vid ' 7807571-0 30°C under omröring då och då i 3 h och dialyserades därefter noggrant mot PBS, på-värde 7,2, 0,005 M. Resten av förfarandet är detsamma som detlsom beskrivs i blandningen D1.

Easalälsees: = Det vaccin, som framställts enligt Dl ovan, nedan betecknat beta-hCG-TD befanns vara immunogent hos möss, kaniner, getter, apor, såväl som människor. Vaccinet, som beskrivs under D2, befanns ha liknande immunogena egenskaper hos apor. Båda gav upphov till ett ganska långvarigtantikroppsgensvar.

En enda injektion av vaccinet Dl, given med Freunds till- satsmedel på flera ställen av en get, inducerade ökande anti- kroppstiter i ca 9 månader, varefter en platå nåddes. Det följes av en nedåtgående trend. En andra tilläggsinjicering i den nedåtgående fasen ledde till en skarp höjning av antikroppstitern.

Detta visas i fig 3.

Gensvarsmönstret hos l0rhesusexperimentapor befanns vara liknande, trots att det fanns individuella variationer. Detta visas även i fig 3.

Vid undersökning av de immunologiska egenskaperna hos anti(Beta-hCG-TT)serum, befanns det att ett sådant serum, åstad- kommet i get eller apa , reagerar immunologiskt med hela hCG- -moleky1erna.AntiS@flmEt ger inte någon sidoreaktion med mänskligt tillväxthormon (hGH), mänskligt prolaktin eller mänskligt placentalt laktogen (hPL), FSH, TSH eller LH, provat vid de fysiologiska och förhöjda nikxna.Tabell I sammanfattar resultaten. 10 7807571-0 uomumuuøuunox zmflwoflowwmm flmäwxmä un comuwuufiwunox Mumma» noflflu amwmmn K ooH m.. H 2 o o oofi ä? 2.8 mom m: H AA o o oS oo* un? ñfi .En w.. ooTA o o oS ooH 5%: må äå | o o oS oofl u? flo wo om o o oS ooH un? üo nä: 1 w o om ooH n? io m: m o o om oS nu? NJ Em .. 2 om mo oß w: N 1 on oß om om wc ofl uum I um wa wo wß wc N 1 ä .B o 2 wo 3 oomå _ uww man Aooowflfiv uww Aooomufiv man uwvmnunm: wøwuuax _ ummmouxwuøm Inox um: .oøoxwäflxmz wuwnuuumflmaox N Hmmnonxflufim flflflu uwvuan N uoflumuuuwufiox noauom 'Elli .www moo 4.2 ämm æmmmïäoïøomàïfiezm mmm ...msHuHmHummm H QAHNQB ?uuvsv1-u 112 De biologiska egenskaperna hos anti(beta-hCG-TT)serumet, âstadkommet hos geten och apan, och serumets förmåga att neutralisera hCG provades i ett antal system. Det befanns effektivt för inhi- bering av hCG-inducerad ökning av den ventrala prostatavikten hos immatura råttor. Experimentdata, som sammanfattar detta arbete, visas i fig 4. Det motverkade även den hCG-inducerade ökningen av progesteronproduktionen i tunna gulkroppsskivor in vitro. Detta visas i tabell II.

TABELL II EFFEKT AV ANTI-ß-HCG-TT PÅ GULKROPPENS PROGESTERONSYNTES Tillsatser ' Pr Egzq vävnad* 1. ingen _ 79,4 1 15,2 2. + HCG (O,l'pg/ml) 183,2 i 30,6 3. + HCG + anti-ß-TT 105,4 i 23,4 4. + anti-B-TT 96,7 1 23,2 X Medelvärde 1 S.E. av 6 experiment.

Det förhindrar även bindningen av hCG till receptorer i mem- branpreparat från testiklarna och ovarierna. Experimentdata, som visar detta, sammanfattas i fig É. Alla dessa test visar att anti- kropparna, som uppkommer mot föreningen beta-hCG-TT, har förmågan att inte enbart reagera immunologiskt med hela hCG-molekylerna, utan även att neutralisera dess biologiska aktivitet.

Beta-hCG-TT-vaccinpreparatet D1 provades med avseende på säkerheten enligt British Pharmacopoeias krav, och befanns inte ge upphov till någon död hos marsvin under 4 veckors observations- tid. Det saknade även akut och subakut toxicitet, vilket prövades på tvâ arter, nämligen gnagare och apa. Dess tolerans har även provats på 65 möss, 7 kaniner och 13 apor under perioder av upp till 1 år och mer. överlevnanden hos de immuniserade djuren var 100 %. Andra parametrar, såsom hematologi (hemoglobin, TLC/DLC, PCV, perifer utstrykningsundersökning av blodplättar, retikulo- cyter), leverfunktioner_(serumbilirubin, alkaliskt fosfatas, transaminaserna GOT och GPT, LDH-isoenzymer, kolinesteras), njur- funktionstest, blodglukos, serumlipider, kolesterol, triglyceider, fria fettsyror och tyroidfunktionstest var normala hos immunise- rade apor. De immuniserade aporna utvecklade inte omedelbar (Arthus) eller fördröjd hypersensitivitet mot hCG.

'IÜDCWSTPÜ i 12 Kliniska studier Sex kvinnliga frivilliga i den fertila åldersgruppen 20-32 år injicerades antingen med vaccinpreparatet framställt enligt D; ovan eller med alternativa placebon i blindförsök. Eftersom ändamålet vid dessa test var att fastställa immunogeniteten hos vaccinet enligt föreliggande uppfinning, var de sex kvinnor, som valdes för detta provningssteg, de som tidigare hade undergått äggledar- underbindning. I samtliga fall gav placebo inget svar. Var och en av de tre patienterna, som fick vaccinet, utvecklade antikroppa- svar mot både stelkrampstoxoid och mänskligt koriongonadotropin.

Efter en retardationsperiod, som varade 4-6 veckor från patient till patient, följde en progressiv ökning av antikroppstitern.

Antikroppar utvecklades även simultant mot stelkramp.

Fig 6, 7 och 8 i de bifogade ritningarna visar svaret hos de tre frivilliga personer, som erhöll vaccinet. K.W., fig 8 i rit- ningarnayvar 30 år gamal med fem graviditeter och fyra levande barn. Ökningen av antikropparna, som reagerade mot hCG, visas med kurvan (o o) och stelkrampsantikropparna med kurvan (o----|). Anti-hCG-titern nådde en platå och har förblivit på denna nivå i ca 9 mån efter injektionen. Provningarna fortsätter.

Datumen för menstruationerna visas med ett X-märke uppe på dia- grammet. Patienten har menstruerat regelbundet. Endometriumbiopsin, som togs på den l50:e dagen, visade bevis på ägglossning, vilket bekräftades av marginalcytologi och progesteronnivâerna i den sekretoriska fasen av cykeln.

Den andra patienten, A.M., fig 7, var 32 år gamal med tre graviditeter och två levande barn. Fig 7 visar en liknande typ av immunsvarskinetik för A.M.. Endometriumbiopsin i detta fall, såsom även vaginalcytologin och progesteronnivåerna, visar den tydliga ägglossningen.

Den tredje patienten, N.D., fig 6, var 30 år gammal med fem graviditeter och tre levande barn. N.D. hade ammat ett barn under de första ca 150 dagarna av studien, vilket förklarar frånvaron av menstruation under denna period. Immunisering med vaccinprepa- ratet åstadkom ingen störning i mjölkproduktionen trots ett ganska gott immunsvar. Hon har sedan dess börjat menstruera och har haft normala menstruationsperioder. 7 Libido och andra fortplantningsfunktioner har hos alla tre patienterna varit fullständigt normala. Noggrann klinisk undersökning har inte visat nâgra märkbara onormala förhållanden av något slag. '1807571-'0 13' Andra parametrar, såsom hematologi, (hemoglobin, TLC/DLC, PCV, perifer utstrykningsundersökning av blodplättar, retikulocyter), leverfunktioner (serumbilirubin, alkaliskt fosfatas, transamina- serna GOT och GPT, LDH-isoenzymer, kolinesteras), njurfunktions- prov, blodglukos, serumlipider, kolesterol, triglycerider, fria fettsyror och tyroidfunktionstest var normala och immunisering har inte åstadkommit någon ändring i organfunktioner och meta- bolism. Patienterna har även uppvisat normalt svar på insulin- hypoglykemitest, uttryckt såsom produktion av kortisol och till- ' växthormon. I Sera från dessa tre immuniserade kvinnor såväl som från apor och getter hyperimmuniserade med B-hCG-TT-preparatet, har under- sökts med olika test för att utesluta möjliga autoimmunreaktioner mot kroppsorgan. De befanns vara negativa vad avser antinukleära antikroppar, antimikrosomala antikroppar och saknade reumatoid- faktorreaktivitet. Denna information sammanfattas i tabell Zf TABELL 2 Immunopatologiundersökningar på immuniserade patienter Sera från Undersökningar Iakttagelser 1. N.D. 30 fíg 6 1. Antínukleära Ingen märkbar 23.8.74 antikroppar reaktion med något av de pro- 2. N.D. 30 2. Antímíkrosomala vade serumen 20.9.74 antikroppar 3. N.D. 30 3. Latexagglutínation 2.l2.74 för Rheumatoíd- faktorn 4. A41. 32 fi; 7 11.10.74 s. m1. ao fi; s 28.lO.74 6. K.W. 30 2.12.74 7. Ej immuníserad kontroll De befanns även vara negativa vad avser reaktivitet mot människo- preparat av tyroid, paratyroid, binjurar, njurar; testiklar och ovarier. Data som visar dessa fakta sammanfattas i tabell 3. 7801571-0 1% TAaELL 3 Reaktivitet hos anti-S-TT-sera mot mänskliga organ Sera från Provade mänskliga Iakttagelser organ Normal kvinna Tyroid A Ingen reaktion Imuniserad kvinna (N.D.) fig 6 _ Paratyroid av nagct serum kunde ses genom Adrenal ímmunofluorescens med något av organen Normal apa Njut .Imuniserad apa Testikel Ovarie De var även negativa vad beträffar reaktiviteten mot Vävnads- substrat från möss, kaniner och babianer, såsom sammanfattas i tabell 4. ïêšääffl Anti-6-hCG-TT-seras reaktivitet mot vävnadssubstrat från olika arter Provade sera Vävnadssubstrat Genomförda Iakttagelser från test Normal människa möss a) indirekt 1) Inga vävnads- imuno- reagerande anti- fluorescens kroppar upptäckta Imuniserad kvinna ' B) anti-DNA- 2) Inga antí-DNA- (N.D.) fig 6 kanin -antikroppar -antikroppar funna babian Normal apa Immuniserad apa De antikroppar, som genererats hos frivilliga kvinnor, befanns i stånd att neutralisera den biologiska aktiviteten hos hela hCG.

Fig 9 i de bifogade ritningarna visar dessa antikroppars (från N.D.) förmåga att blockera bindning av hCG till gulkroppspreparat i ett radioreceptorsprov. Dessa antikroppars förmåga att binda hCG in vivo visas av de bestämningar, som anges i fig 10 i de bifogade ritningarna. I Den totala varaktigheten av immunsvaret på hCG hos människor efter primär immunisering med fyra fjorton dagars injektioner av vaccinet väntas vara mer än 1 år, trots att individuella varia- tioner kan uppträda. Aktiv immunisering har inte utvecklat oönskade 7807571-0 15 reaktioner. Patienterna har haft normala menstruationscykler. Det finns bevis för ägglossning. Njur-, lever-, pituitär-, kardio- vaskulär-, tyroid- och andra organfunktioner är normala och ostörda.

EXEMPEL II Ett vaccin framställdes med användning av ett nitroderivat av betasubenheten av hCG, enligt förfarandet i exempel I, Dl.

Molekylförhållandet mellan derivatet och stelkrampstoxoiden var l0:l. Resten av förfarandet, inklusive sterilisering och preparering av vaccinet, är detsamma som beskrivs i exempel I.

Claims (3)

1. 7807571-6 16 PATENTKRAV 1 l. Konceptionsförhindrande medel, k äin n e t e c k n a t av att det omfattar ett konjugat av en patientfördragsam immunogen bärare och antigener bestående av nitroderivatet av beta-subenheten av mänskligt koriongonadotropin.(hCG), vilka antigener är fria från determinanter som kan reagera med hög affinitet med anti-LH-sera.

2. Konceptionsförhindrande medel, k ä n n e t e c k n a t av att bäraren är stelkrampstoxoid.

3. Förfarande för framställning av ett konceptionsförhindrande medel, k äan n e t e c k n a t av att man kondenserar ett nitro- derivat av beta-subenheten av mänskligt koriongonadotropin (hCG) med en patientfördragsam immunogen bärare.