DE2709488A1

DE2709488A1 - Biologisch aktives mittel

Info

Publication number: DE2709488A1
Application number: DE19772709488
Authority: DE
Inventors: Howard Milne Chandler
Original assignee: Commonwealth Serum Laboratories
Current assignee: CSL Ltd
Priority date: 1976-03-04
Filing date: 1977-03-04
Publication date: 1977-10-27
Also published as: FR2342741A1; CA1084413A; AU513400B2; GB1567503A; NZ183458A; AU2295877A; JPS52125613A

Description

Biologisch aktives Mittel

Die Erfindung bezieht sich auf ein biologisch aktives Mittel.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein biologisch aktives Mittel zur Kontrolle oder Prophylaxe von Krankheiten bei Tieren.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf injizierbare oder zur Implantation geeignete Mittel, die bei der Verabreichung die biologisch aktiven Substanzen ununterbrochen, verzögert und/oder periodisch freisetzen.

Die Erfindung ist speziell bei antigene Substanzen enthaltenden Mitteln, d.h. Impfstoffen, anwendbar und wird im Hinblick auf dieses Anwendungsgebiet insbesondere beschrieben. Es sei jedoch darauf hingewiesen,

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daß die erfindungsgemäßen Mittel ebenfalls zur Verabreichung anderer Arten biologisch aktiver Substanzen, einschließlich Hormonen, Antibiotika und Allergiestoffen, geeignet sind.

Es gibt eine Vielzahl von Situationen im Bereiche der Human- und Tiermedizin, in denen es erforderlich ist, mehrere Dosen biologisch aktiven Materials während
einer langen Zeitdauer zu verabreichen. Es ist daher von offensichtlichem Vorteil, wenn das mittels einer einzigen Verabreichung eines Arzneimittels oder eines anderen biologisch aktiven Materials geschehen kann.

Eine Schutzimpfung gegen die meisten Krankheiten erfordert die Verabreichung vieler Dosen mit Antigenen während einer ausgedehnten Zeitdauer, um eine wirksame Resistenz bzw. Immunität zu bewirken. Das führt zu wesentlichen Problemen im Hinblick auf die Verabreichung von Dosen, z.B. bei großen Gruppen von
Tieren auf Farmen, die für jede Behandlung zusammengetrieben werden müssen. Wenn ein Impfstoffe enthaltendes Mittel geschaffen werden könnte, das mittels der Verabreichung einer einzigen Dosis kontinuierlich
oder periodisch Antigene während einer ausgedehnten
Zeitdauer freisetzte und wobei die Vielfachverabreichung eines Impfstoffs simuliert würde, so bedeutete das sicherlich, daß die Schutzimpfungen zur Erreichung einer Resistenz gegenüber Infektion auf ein Minimum zurückgeführt würden, so daß daraus ein beträchtlicher Nutzen, insbesondere im Hinblick auf
die Arbeits- und Zeitersparnis resultierte.

Bisher bestand jedoch das Problem, das antigene Material in eine solche Form zu bringen, die zur Im-

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plantation und Injektion geeignet ist und die imstande ist, ununterbrochen oder periodisch im Tier freigesetzt zu werden. Es sind Versuche unternommen worden, um "Eindosis"-Impfstoffe unter Verwendung öliger Hilfsstoffe, wie des Freund"sehen Hilfsstoffs, herzustellen. Während jedoch derartige Impfstoffe einen gewissen Erfolg zeigen, so führen sie jedoch zu einer beträchtlichen Necrose und zu Schäden des Gerippes. Aus diesem Grunde werden sie im allgemeinen im landwirtschaftlichen Bereich als nicht akzeptabel angesehen. Sie werden gleichfalls für die Anwendung im humanen Bereich als nicht akzeptabel erachtet.

Es wurde nun gefunden, daß feste, biologisch abbaubare Matrizes, denen biologisch aktive Substanzen einverleibt worden sind, mittels einer einfachen Vernetzungstechnik gewonnen werden können. Derartige Matrizes sind nach der Injektion oder Implantation in Tiere imstande, eine verzögerte, ununterbrochene oder periodische Freisetzung der aktiven Bestandteile zu bewirken. Die Art und die Zeit der Freisetzung sind abhängig von den Vernetzungsbedingungen, die bei der Herstellung eingehalten werden. Die Matrizes können zur geregelten Freisetzung von Hormonen, Antibiotika, Allergiestoffen oder Antigenen verwendet werden.

Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung ein biologisch aktives Mittel, das durch eine biologisch abbaubaure Matrix und mindestens eine darin eingelagerte biologisch aktive Substanz gekennzeichnet ist, wobei die Matrix nach der Implantation oder der Injektion die biologisch aktive(n) Substanz(en) verzögert, ununterbrochen oder in periodischen Zeitabständen freisetzt. Zweckmäßigerweise ist das für die Matrix

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verwendete Material biologisch und antigen inaktiv. Es sollte während einer Zeitdauer vollständig abbaubar und zu beseitigen sein. Im allgemeinen wird das Matrixmaterial polymerer Natur sein. Wegen des Erfordernisses niedriger Toxizität und der biologischen Abbaubarkeit wird ein bevorzugtes Matrixmaterial im allgemeinen eher von natürlichen makromolekularen Substanzen als von synthetischen Polymeren herstammen. Die aktiven Substanzen können in die Matrix durch Einschluß eingelagert sein, mit der Matrix durch chemische Bindung verbunden sein oder in solcher Weise chemisch gebunden sein, daß sie Teil der Matrix werden.

Das bevorzugte Matrixmaterial ist Gelatine, die mit Glutaraldehyd vernetzt ist. Jedoch können auch andere Proteine (oder Peptide) und andere vernetzte Mittel zur Anwendung kommen.

Wenn Gelatine mit dem Dialdehyd, Glutaraldehyd, zur Reaktion gebracht wird, werden stabile Vernetzungen durch die Reaktion zwischen den Aldehydgruppen des Glutaraldehyds und den reaktiven Gruppen (insbesondere Amino-Gruppen) der Gelatinemoleküle hergestellt. Mehrere der Aminosäure-Bestandteile von Proteinen oder Peptiden reagieren mit Aldehyden, einschließlich Lysin, Histidin, Arginin, Cystein, Glutamin, Asparagin, Tryptophan und Tyrosin. Wenn eine biologisch aktive Substanz zur Einarbeitung in die Matrix derartige reaktive Gruppen enthält, dann wird sie gleichfalls chemisch mit dem Glutaraldehyd verbunden. Und so kann sie entweder mit der Gelatine-Matrix verbunden sein oder ein Teil der Matrix werden. Nicht reaktive Substanzen werden innerhalb der Matrix durch physikalischen Einschluß gehalten.

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Um entsprechend einer Blickrichtung der vorliegenden Erfindung einen Impfstoff zu erhalten, der geregelt Antigene freizusetzen imstande ist, wird ein antigenes Material mit dem die Matrix hauptsächlich bildenden Bestandteil, d.h. dem Polymeren, Monomeren oder Prepolymeren, gemischt, was zur Matrix zu vernetzen ist. Die Mischung wird dann einer Vernetzung oder Polymerisation zur Bildung der Matrix unterzogen.

Die Regelung der Geschwindigkeit oder Zeit der Freisetzung des antigenen Materials aus der Matrix wird durch Regelung des Ausmaßes der Vernetzung und/oder Polymerisation bewirkt. Auf diese Weise ist es möglich, Matrizes herzustellen, die die ununterbrochene Freisetzung, d.h. die kontinuierliche Freisetzung von antigenem Material während einer ausgedehnten Zeitdauer nach der Verabreichung ermöglichen. Des weiteren werden Matrizes zur verzögerten Freisetzung, d.h. zur Freisetzung des Ganzen odei eines Teils des antigenen Materials einige Zeit nach der Verabreichung, geschaffen. Es ist offensichtlich, daß durch eine geeignete Auswahl oder Kombination dieser beiden Matrixtypen die Möglichkeit besteht, Mittel herzustellen, die eine ausgedehnte Dosierung über lange Zeitspannen oder periodische Dosierungen über ausgedehnte Zeitspannen bewirken.

Für die Zwecke der Schutzimpfung von Tieren kann die vernetzte Matrix, deren Herstellung oben beschrieben worden ist, getrocknet und zu Körnchen geformt werden, die zur Implantation geeignet sind. Alternativ kann sie in Form feiner Partikel in einem flüssigen Träger zwecks Injektion dispergiert werden.

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Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf die Zurverfügungstellung von wirksamen "Eindosis"-Impfstoffen (one dose vaccines), die einen festen, die Freisetzung verzögernden Matrixbestandteil enthalten, der in einem üblichen flüssigen Impfstoff dispergiert ist. Bei derartigen Kombinationsimpfstoffen wird die primäre immunisierende Dosis mittels herkömmlicher Flüssigimpfstoffe und die nachfolgende Dosis mittels der Matrix zugeführt, die Bestandteile enthält, die verzögert freigesetzt werden. Auf diese Weise kann eine wirksame Immunität mittels einer Impfstoffdosis stimuliert werden, wohingegen der herkömmliche Flüssig impfstoff allein eine Vielfachdosierung erfordert.

Die genaue Art der Mechanismen, nach denen die antigenen Materialien zurückgehalten werden und aus der Matrix freigesetzt werden, ist noch zu klären. Aber es erscheint wahrscheinlich, daß sowohl der physikalische Einschluß als auch die chemische Bindung der antigenen Moleküle daran beteiligt sind. Unabhängig davon, welche Mechanismen auch ablaufen, ist es doch als überraschend anzusehen, daß die antigenen Moleküle in derartigen Matrizes gebunden sein können und anschließend ohne ersichtlichen Einfluß auf ihre antigenen Eigenschaften wieder freigesetzt werden können. Im Hinblick auf die Tatsache, daß das Binden und das Freisetzen der antigenen Moleküle so erfolgreich durchgeführt werden kann, wird es offensichtlich, daß Allergiestoffe und auch einfachere Moleküle, wie Hormone und Antibiotika, in entsprechender Weise verwendet werden können.

Die allgemeinen Grundlagen, die vorstehend im Hinblick auf die Herstellung von Impfstoffen entsprechend

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der Erfindung erörtert wurden, können herangezogen werden, um Matrizes herzustellen, die die anderen, vorher erwähnten Arten biologisch aktiver Substanzen enthalten.

Die Grundlagen und die praktische Verwirklichung der Erfindung werden des weiteren durch die folgenden Beispiele, die sich auf die Herstellung von Impfstoffen beziehen, noch näher erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert (a), daß die ununterbrochene Freisetzung von Antigen aus einer Impfstoffmatrix erreicht werden kann und (b) daß die verwendete Matrix (Gelatine mit Glutaraldehyd vernetzt) vollständig abgebaut werden kann.

Aus einer Gelatine/Antigen-Mischung geformte Kugeln wurden während ansteigender Zeitspannen durch das Diffundieren von Glutaraldehyd in die Kugeln vernetzt. Der Außenbereich der Kugeln war daher am stärksten und der Kern am geringsten vernetzt. Die so hergestellten Kugeln wurden Meerschweinchen implantiert und die zellulare und humorale Reaktion der Meerschweinchen auf die Kugeln studiert. In wöchentlichen Intervallen wurden die Kugeln und das umgebende Gewebe herausgeschnitten, kryo-geschnitten, gefärbt (stained) und mikroskopisch überprüft.

Fünf Clostridial-Antigene wurden in den Impfstoffen verwendet, nämlich:

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Aktivitätseinheiten/Dosis des

Impfstoffs

Clostridial-welchii-Typ D,

Epsilon-Toxoid 400 L+

Clostridial-tetani-Toxoid 50 Lf

Clostridial-oedematiens-

(novyi)-Toxoid 20 L+

Clostridial-septicum-Toxoid 30 L+

Clostridial-chauvoei-Zellen _

näherungsweise 40 χ 10 Zellen

Impfstoffkugeln wurden wie folgt hergestellt: Gleiche Anteile von 20% Gelatinelösung und Antigenkonzentrat wurden sorgfältig bei 37⁰C gemischt. Die Mischung wurde dann in 0,2 ml-Tropfen (Durchmesser näherungsweise 5 mm) in Paraffinöl getropft, das auf 4⁰C gekühlt worden war. Während die Mischung durch das Paraffin trat, bildeten sich Kugeln, die sich beim Abkühlen der Mischung absetzten. Nach 30 Minuten bei einer Temperatur von 4⁰C wurden die Kugeln aus dem Paraffin gewonnen, in Wasser gewaschen, um das Paraffinöl zu entfernen, und zu einer Glutaraldehyd-Lösung (1% in einem 0,1 M Phosphat-Puffer, pH-Wert 7,6 bei 4⁰C) gegeben. Das Eindringen des Glutaraldehyds in die Kugel (und folglich das Vernetzen) wurde durch Beobachten des Widerstands halbierter Kugeln beim Kochen beurteilt (vernetzte Gelatine widersteht dem Kochen, unvernetzte Gelatine löst sich rasch auf).

Chargen von Kugeln wurden hergestellt, bei denen die Vernetzung zwischen dem Minimum (äußere 1 mm der Kugel widerstanden dem Kochen) bis zum fast vollständigen Abschluß (nur das Zentrum einer Stärke von 1 bis 1,5 mm widerstand dem Kochen nicht) schwankte. Die Kugeln wurden nicht immunisierten Meerschweinchen subkutan implantiert. Danach wurde in wöchentlichen Intervallen ein

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Meerschweinchen einer jeden Kugelcharge getötet, sein Serum gesammelt und die Kugel und das umgebende Gewebe herausgeschnitten, schnellgefroren, kryo-geschnitten, gefärbt und mikroskopisch untersucht. Der Immunkörperspiegel in den Seren wurde überwacht und desgleichen die zellulare Reaktion. Das Freimachen der implantierten Kugeln wurde nach den Kälteschnitten bewertet.

Die Kälteschnitte zeigten, daß eine anfängliche zellulare Reaktion rund der Außenseite der Kugel von einer Invasion weißer Blutkörperchen zum Zentrum der Kugel von einem oder mehreren Punkten nach der Implantation folgte. Die Kugel unterlag dann fortschreitend einem Zerfall vom Zentrum zur Außenschicht, wobei die Außenschicht am hartnäckigsten war. Bei jeder Charge von Kugeln - ungeachtet des Ausmaßes der Vernetzung - war die Art und Weise der zellularen Reaktion und das Freimachen der Kugeln gleich. Das Ausmaß der Vernetzung bestimmte jedoch die Geschwindigkeit, nach der sich der Zerfall vollzog. Die am wenigsten vernetzten Kugeln wurden in weniger als sechs Tagen durchdrungen und innerhalb von zwei Wochen vollständig entfernt. Die am stärksten vernetzten Kugeln wurden langsamer durchdrungen und abgebaut und widerstanden über sechs Wochen. Die zellulare Reaktion wurde in jedem Fall hauptsächlich von polymorph-nuklearen Leukozyten, Makrophagen und Lymphozyten umfaßt.

Die Seren der Meerschweinchen zeigten Immunkörper gegen jedes Antigen. Zum Beispiel wurde der Immunkörperspiegel im Hinblick auf das Flagellen (oder H) - Antigen des Cl.chauvoei mittels des Agglutinationstests bestimmt. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt.

+/ In jedem Fall war die Kugel schließlich vollständig abgebaut.

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Vernetzung der Kugel

H-Agglutinations-Titer des Serums von mit Implantaten behandelten Meerschweinchen nach (Wochen)

(a) nicht-vernetzte Kontrollkugeln

(b) am wenigsten vernetzte K.

1280

20

160

<20

20

«20

<20

(C)	[mittlere {!Vernetzung	320	640	40	<20
(d)	stark vernetzte K.	160	640	640	.20
(e)	160	640	320	640

Die Kugeln des Typs (a) dienten der Kontrolle und sind mit den anderen Kugeln identisch, mit der Ausnahme, daß sie nicht vernetzt sind. Nach einer Woche waren sie in dem Tier nicht mehr feststellbar.

Die Immunkörper-Reaktionen, die in der Tabelle gezeigt werden, weisen darauf hin, daß die Zeit und die Dauer der Freisetzung des Antigens von dem Ausmaß der Vernetzung innerhalb der Matrix abhängen, wobei die weniger vernetzten Matrizes eine frühere Freisetzung des Antigens einer kürzeren Dauer als die letzteren? und eine stärker ununterbrochene Freisetzung ist bei den stärker vernetzten Matrizes festzustellen.

+/ zeigen

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ir

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die verzögerte Freisetzung (vgl. die im Beispiel 1 gezeigte ununterbrochene (sustained) Freisetzung).

Die Kugeln wurden wie im Beispiel 1 hergestellt, jedoch enthielten sie lediglich die Antigene Tetanus und Clostridium chauvoei. Das Eindringen des Glutaraldehyds wurde als schnell beobachtet und die Kugeln wurden hergestellt, die wie folgt zu charakterisieren waren:

(a) Nicht vernetzt, d.h. lediglich Antigen-Gelatine,

(b) vernetzt während einer Zeit, die ausreicht, um das Eindringen von Glutaraldehyd (und damit die Vernetzung) in das Kugelinnere zu ermöglichen,

(c) vernetzt während einer Zeitdauer, die neunmal so lang war wie die nach (b).

Die gewaschenen und getrockneten Kugeln wurden Meerschweinchen implantiert. Die humoralen und zellularimmunen Reaktionen wurden bei den Meerschweinchen wie im Beispiel 1 beobachtet und zwar über eine Dauer von fünf Wochen.

Die Kugeln des Typs (a) waren nach einer Woche nicht mehr feststellbar. Die gefärbten Kälteschnitte des Gewebes und der in den wöchentlichen Intervallen entfernten Kugeln, die den Meerschweinchen in der Form der Kugeln (b) und (c) implantiert worden waren, zeigten, daß eine starke Reaktion der weißen Blutkörperchen rund um die Kugeln auftrat, jedoch kein Durchdringen der Kugeln. Während der Beobachtungsdauer wurde ein fortschreitendes Aufklären der bakteriellen Zellen von der Außenseite zum inneren Teil der Kugeln bemerkt. Jedoch trat kein offensichtliches Auflösen irgendeiner der Kugeln bis nach vier Wochen auf. Nach fünf Wochen wurde bei den Kugeln des Typs (b) gefunden, daß sie in ihrer

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Btark abgenommen und eine verstärkte Reaktion Wf46er Blutkörperchen rund um die Außenseite haben. KSlteschnitte zeigten, daß die äußere Hülle und ein kleiner innerer Kern der Kugeln intakt und offensichtlich unverändert waren, wobei jedoch ein großer Lösungsbereich vorlag, der die zwischen diesen beiden zerfallene Matrix enthielt. Kugeln des Typs (c) blieben während der fünfwöchigen Beobachtung unverändert, abgesehen von dem bakteriellen Aufklären (clearing).

Die Serumimmunkörpertiter gegen das Tetanustoxin und Cl. chauvoei Η-Antigen waren nach vier und fünf Wochen wie folgt.

Kugeln Titer 4 Wochen 5 Wochen

(a)	Tetanusant i toxin	- ί	<9
	(internationale
	Einheiten,	An
	L+/10);		40
	H-Antigen,	2
	Cl. chauvoei	<20
		<2	6
(b)	Tetanus	< 20	640
	H-Antigen		<2
(C)	Tetanus	20
	H-Antigen

Aus der Tabelle ist zu erkennen, daß die Freisetzung der Flagellen und des Toxoidantigens bei Verwendung einer Matrix des Typs (b) vier Wochen lang verzögert wird.

Die Schutzimmunität gegen Cl. chauvoei wird durch bakterielle Zellen angeregt und nicht die Flagellen. Sie

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Sie wird beurteilt durch das Messen des Widerstands geimpfter Tiere bei einer beabsichtigten Infektion. Zwei Meerschweinchen, die jeweils Kugeln des Typs (a), (b) und (c) erhalten hatten, wurden intramuskulär fünf Wochen nach der Implantation mit einer mit Calciumchlorid aktivierten Spurensuspension des Cl.chauvoei angeregt (challenged). Die Meerschweinchen, die mit den Implantaten (b) und (c) behandelt worden waren, überlebten ohne Symptome, wohingegen diejenigen, denen die Kugeln (a) verabreicht worden waren, innerhalb Stunden starben. Vier nicht geimpfte Kontrollmeerschweinchen starben innerhalb von 24 Stunden nach der Infektion (challenge). Diese Ergebnisse lassen zusammen mit den an den Kälteschnitten gemachten Beobachtungen vermuten, daß die bakteriellen Zellen physikalisch eingeschlossen sind, jedoch nicht chemisch innerhalb der Matrix gebunden. Die ununterbrochene Freisetzung von Zellen (nach dem Zerbrechen ihrer Flagellen) aus der Matrix ist dadurch gegeben. Im Gegensatz dazu waren die zwei Proteinantigene (Flagellen und Tetanustoxoid) chemisch innerhalb der Matrix gebunden und wurden lediglich freigesetzt, nachdem das Auflösen der Matrix eingetreten war (d.h. verzögerte Freisetzung).

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt (a), daß die Anzahl der Impfstoffdosen, die für eine wirksame Immunität erforderlich sind, unter Verwendung einer Antigene enthaltenden vernetzten Matrix, die in einem herkömmlichen flüssigen Impfstoff dispergiert ist, reduziert werden kann, (b) daß die immunen Reaktionen, die mittels solcher Impfstoffe erregt werden, von einer früheren und größeren Bedeutung als solche sein können, die mittels herkömmlicher Impf-

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stoffe und Impfmethoden hervorgerufen werden, und (c) daß die Zeit zur Freisetzung des Antigens aus der vernetzten Matrix aufgrund veränderter Bedingungen der Vernetzung schwanken kann. Mit solchen Impfstoffen liefert der herkömmliche Flüssigimpfstoff die primäre Immunisierungsdosis und die sekundärej und die nachfolgenden Dosen werden durch die verzögerte Freisetzung von Antigen aus der Matrix bereitgestellt.

Eine feste, Antigene enthaltende Matrix wurde hergestellt, die die folgenden Antigene in den angegebenen Konzentrationen enthält.

Aktivitätseinheiten des Antigens/ Dosis der Matrix

Cl.-welchii-Typ

D-Epsilon-Toxoid 80 L+

Cl.-tetani-Toxoid 10 Lf

Cl.-oedematiens-Toxoid 4 L+

Cl.-septicum-Toxoid 6 L+

9 Cl.-chauvoei-Zellen näherungsweise 8 χ 10 Zellen

Zwei Partien gleicher Mengen 20%iger Gelatine- und Antigen-Konzentrate (auf das Zweifache der vorgenannten Konzentration) wurden sorgfältig gemischt und bei 4⁰C absetzen gelassen. Die abgesetzten Gele wurden dann extrudiert in:

A) dem zehnfachen Gelvolumen von 0,25% Glutaraldehyd in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,6) oder

B) in dem vierzigfachen Gelvolumen von 0,25% Glutaraldehyd in einem 0,1 M Phophatpuffer (pH-Wert 7,6).

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In jedem Fall wurden die Gele eine Stunde lang bei 4⁰C belassen, um das Vernetzen zu ermöglichen.

Die vernetzten Matrizes wurden dann frei von Glutaraldehyd gewaschen und in einem Volumen eines Flüssigimpfstoffs dlspergiert, das dreimal so groß war wie das der Matrix vor dem Absetzen oder Vernetzen (d.h. das Volumen der Gelatine und des Antigens). Der verwendete Flüssigimpfstoff war der "C.S.L. 5-in-1"-Impfstoff, ein Impfstoff mit Aluminium als Hilfsstoff, der die gleichen fünf Antigene wie die Matrizes enthielt. Jede Matrix wurde fein in dem Flüssigimpfstoff unter Verwendung eines Gewebehomogenisators dispergiert. Die Flüssigimpfstoffe, die so gebildet worden waren, waren nach dem Absetzen bereitwillig resuspendierbar. Es wurde gefunden, daß sie ziemlich gut zur Injektion mit einer automatischen Spritze geeignet sind.

Mit jedem der zwei Experimentierstoffe (A und B) wurden vier Schafe subkutan mit einer Dosis in Form von 4 ml des Impfstoffs geimpft. Zwölf Kontrollschafe wurden wie folgt geimpft:

a) Vier Schafen wurde eine Dosis von 4 ml des Impfstoffs gegeben, der aus einem Teil nicht vernetztem Gelatine/Antigen bestand, wobei diese Masse in drei Teilen des "5-in-1-Impfstoffs" dispergiert wurde. Dieser Impfstoff war identisch im Hinblick auf die Zusammensetzung mit den Impfstoffen A und B mit der Ausnahme, daß die Gelatine/Antigen-Masse zur verzögerten Freisetzung mittels Vernetzens mit Glutaraldehyd nicht stabilisiert war.

b) Vier Schafen wurden zwei Dosen von 2 ml "C.S.L. 5-in-1-Impfstoff" gegeben, wobei die zweite Dosis vier Wochen nach der ersten verabreicht wurde (hier-

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Io

bei handelt es sich um die empfohlene Verabreichungsweise zur Immunisierung von Schafen mit diesem Impfstoff) .

c) Vier Schafe wurden jeweils intramuskulär mit einem Impfstoff behandelt, der die gleiche Menge an Antigen enthielt, die bei den Experimentalimpfstoffen (A und B), die im Freund'sehen "vollständigen Hilfsstoff" (Complete Adjuvant) emulgiert waren.

Eine Woche nach dem Impfen wurden die Schafe im Hinblick auf die Reaktionen der Impfstoffe geprüft und keine unnormalen Knoten, Schwellungen oder Geschwüre beobachtet. In Intervallen wurden die Schafe nach der ersten Dosis bluten gelassen und die Seren entsprechend dem Datum und der Art des Impfstoffs, den sie erhalten hatten, gesammelt. Die Serumansammlungen wurden im Hinblick auf die Immunkörper mit den vier Clostridial-Toxoiden untersucht. Ihre Titer werden in internationalen Einheiten in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben.

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Antitoxischer Titer des in Intervallen (in Wochen) angesanmelten Serums nach der ersten Inpfdosis

	j	Exper imental- Inpfstoff A	O	Kontroll- Impfstoff (a)	Cl.-	-welchii-Tvp	8*	D	Antitoxischer	6*	8*	Titer	gegen	Cl.	oedematiens-Toxin	8*	12*	Cl.septicum-Toxin	4*	6*	8*	12*
Impfstoffe		■ Exper inental- Impfstoff B	CD CO	(b)		Toxin	<12		Tetanus-Toxin	4	<4				4	3	10	1	«.1	-1
	*"· (C) U)	4*	6*	19,6	12*		12	5		4*	6*	10	6	10	5	3	<1
	O -j, Veröf fentlich-	28	10	-12	3	4*	2	2	12*	18	8	8	1,5	.₂	<2
co te Ergebnisse**	81	26	<12	7	4	12	10	0,75	60	24	22	3	2	1	5	*1
Kormerzieller Impfstoff A	<12	<10	19,6		16	12	12	1,5	10	6	10	6	<2	2
	14	15		3	,6			<0,25	<.8	>24
Kommerzieller Inpfstoff B	18	18		8	7			3	10	10
					10	7,4		7						2,4
					3,4								<0,5
	6,4							14,8
	2,5					13,2

* Wochen

** G.M. Titer von 8 Schafseren in 3 Ansanmlungen. Ergebnisse von Frerichs, G.M., und Gray, A.K.,
Research in Veterinary Science, 1975, 18, 70.

Titer in Internationalen Einheiten (I.U.) beurteilt nach den in British Veterinary Codex (B.V.C.)
vorbeschriebenen Methoden.

Die Ergebnisse der vorstehenden Tabelle zeigen, daß die Einbeziehung einer geeigneten vernetzten Antigen-Matrix bei der Anwendung herkömmlicher Impfstoffe zu einer beträchtlichen Verbesserung der Immunkörperreaktion infolge einer einzigen Dosierung des Impfstoffes führt. Die Titer, die mittels einer einzigen Dosis des experimentellen Impfstoffes stimuliert werden, zeigen sich im Vergleich mit jenen, die man nach den obigen Experimenten mittels zwei Dosen des C.S.L. 5-in-1-Impfstoffs und einer Dosis des Freundschen kompletten Adjuvans-Impfstoffs erhält,günstig, und sind denjenigen überlegen, über die Frerichs und Gray berichten, die im Schaf mittels zwei Dosen herkömmlichen Clostridial-Impfstoffes mit einem Aluminiumhilfsstoff zu gewinnen sind.

Ferner wird gezeigt, daß die Bedingungen der Vernetzung die Zeit und die Dauer der Antigen-Freisetzung aus der Matrix beeinflussen und somit die Zeit und die Dauer des maximalen Immunkorpertiters (peak antibody titre). Die Matrix des Impfstoffs B wurde einer größeren Menge Glutaraldehyd als die des Impfstoffs A ausgesetzt. Als Ergebnis einer geeigneteren Art und Weise der Antigen-Freisetzung stimuliert er eine Immunkorperreaktion beständiger als der Impfstoff A.

Schließlich wird durch die Tabelle angezeigt, daß die Immunreaktion, die durch eine Dosis der den Impfstoff enthaltenden Matrix stimuliert wird, eher auftreten und von größerem Ausmaß sein kann als jene, die mittels zwei Dosen herkömmlichen Impfstoffs mit Aluminiumhilf sstoff stimuliert werden. Dieses wird auch durch die Fig. 1 erläutert, die ebenfalls das Immunitäts-

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niveau zeigt, das durch die British Veterinary Codex (B.V.C.) empfohlen wird,in etwa sechs Wochen nach der ersten ImpfstoffVerabreichung zu erreichen.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung der Matrix mit einem Virusantigen - Hundehepatitisvirus.

Hunde werden normalerweise gegen die Hundehepatitis entweder mit zwei Dosen eines einen inaktiven Virus in einem Gewebekulturmedium (C.C.H.-Impfstoff)-Impfstoff oder mit einer Dosis eines C.C.H.-ImpfStoffs mit einem Aluminiumhilfsstoff (K.C.H.-Impfstoff) geimpft. Der letztere Impfstoff kann unerwünschte Knoten verursachen, die sich auf dem Hund an der Injektionsstelle ausbilden, während der Vorteil der Impfung mit einer Dosis gegeben ist.

Dieses Beispiel zeigt, daß die in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellte Impfstoffmatrix gegen den Hundehepatitisvirus einen zufriedenstellenden Immunkörperspiegel mit einer Dosis liefert und keine Knoten oder andere unerwünschte Nebeneffekte hervorruft.

Um die den Virus enthaltende Matrix herzustellen, werden gleiche Mengen des C.C.H.-Impfstoffs und 20% Gelatine gemischt und absetzen gelassen. Das abgesetzte Gel wird dann aufgequellt und in einem 0,1 M Phosphatpuffer mit 0,1 % Glutaraldehyd eines pH-Wertes von 7,6 bei 4⁰C zwei Stunden lang dispergiert, wobei diese Pufferlösung das 33fache des Gelvolumens darstellt. Die vernetzte Matrix wurde dann gewaschen und in einem Volumen des C.C.H.-ImpfStoffs dispergiert, das dem des Gelatine-Antigens vor dem Absetzen gleich ist.

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Meerschweinchen wurden wie folgt geimpft:

1. Vier Meerschweinchen wurden subkutan mit 2 ml des Matriximpfstoffs geimpft.

2. Vier Meerschweinchen wurden zwei subkutane Dosen von

1 ml des C.C.H.-Impfstoffs innerhalb von zweiwöchigen Intervallen zwischen den Dosierungen verabreicht.

3. Vier Meerschweinchen wurde eine Dosis von 1 ml C.C.H.Impfstoff mit einem Aluminiumhilfsstoff (K.C.H.) subkutan verabreicht.

In Übereinstimmung mit den Erfordernissen nach British Veterinary Godex wurden die Seren der letzten Meerschweinchengruppe (3) drei Wochen nach der ersten Dosierung genommen, wohingegen die ersten zwei Gruppen vier Wochen nach der ersten Dosierung bluten gelassen wurden.

Die Seren wurden auf die virenneutralisierende Aktivität entsprechend den Erfordernissen nach British Veterinary Codex untersucht und gaben die folgenden Ergebnisse:

Impfstoff	Gruppe angesammelten Serum- titers in internationalen Einheiten/ml
1. Experimenteller Matriximpfstoff 2. 2 Dosen von 1 ml des C.C.H.-Impf stoff s 3. 1 Dosis von 1 ml des K.C.H.-Impf stoff s	> 57 (bei vier Wochen) 57 (bei vier Wochen) 25 (bei drei Wochen)

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Bei den Meerschweinchen, denen der Matriximpfstoff oder zwei Dosen des C.C.H.-Impfstoffs verabreicht wurden, bildeten sich keine Knoten, wohingegen zwei von vier Meerschweinchen kleine Knoten an der Injektionsstelle nach dem Impfen mit dem K.C.H.-Impfstoff entwickelten.

Dem Fachmann wird es ohne weiteres erkennbar sein, daß die hier beschriebene Erfindung Variationen und Modifikationen zuläßt, die sich von den speziell beschriebenen unterscheiden. Dabei ist jedoch festzuhalten, daß die Erfindung sämtliche Variationen und Modifikationen erfaßt, die den gleichen Kern zeigen bzw. in deren Rahmen fallen.

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Claims

Patentansprüche

Biologisch aktives Mittel, gekennzeichnet durch eine biologisch abbaubare Matrix und mindestens eine darin eingelagerte biologisch aktive Substanz, wobei die Matrix nach der Implantation oder Injektion die biologisch aktive(n) Substanz(en) verzögert, ununterbrochen oder in periodischen Zeitabständen freisetzt.
2. Biologisch aktives Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Matrix biologisch und antigen inaktiv ist und im Verlauf der Zeit vollständig abgebaut und beseitigt werden kann.
3. Biologisch aktives Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Matrix eine natürliche makromolekulare Substanz darstellt.
4. Biologisch aktives Mittel nach einem der Ansprüche

1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die aktive(n) Substanz(en) mittels Einfangen in die

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ORiGlNAL INSPECTED

Matrix eingearbeitet worden ist (sind), mit der Matrix chemisch verbunden ist (sind) oder eine solche chemische Bindung zwischen diesen Anteilen vorliegt, daß die aktive(n) Substanz(en) Teil der Matrix wird (werden).
5. Biologisch aktives Mittel nach einem der Ansprüche

1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Matrix ein vernetztes Protein oder Peptid darstellt.
6. Biologisch aktives Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Matrix mit Glutaraldehyd vernetzte Gelatine ist.
7. Biologisch aktives Mittel nach einem der Ansprüche

1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz ein Antigen, Hormon, Antibiotikum und/oder einen Allergiestoff darstellt.
8. Biologisch aktives Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die biologisch aktive Substanz ein Antigen in Impfstofform darstellt.
9. Biologisch aktives Mittel nach Anspruch 8,- dadurch gekennzeichnet , daß der Impfstoff ein oder mehrere der folgenden Antigene

Clostridial-welchii-Typ D, Epsilon-Toxoid, Clostridial-tetani-Toxoid, Clostridial-oedematiens-(novyi)-Toxoid, Clostridial-septicum-Toxoid und/oder Clostridial-chauvoei-Zellen

einschließt.

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10. Biologisch aktives Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß es in Form einer Einheitsdosierung vorliegt.
11. Biologisch aktives Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß es der ununterbrochenen ,verzögerten und/oder periodischen Freisetzung biologisch aktiver Substanzen dient.
12. Biologisch aktives Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß es in Form von zur Implantation geeigneten Kügelchen oder in Form injizierbarer Dispersionen vorliegt.
13. Mittel mit einem in einer Dosis zu verabreichenden Impfstoff, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem festen Matrixbestandteil zur verzögerten Freisetzung und einem in einer flüssigen Impfstoffmasse dispergierten Impfstoff.
14. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Matrix nach einem der Ansprüche bis 12 enthält.
15. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz mit einem die Matrix bildenden Material gemischt und diese Mischung einer Vernetzung und/oder Polymerisation unterzogen wird.

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16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausmaß der Vernetzung und/oder Polymerisation genau eingeregelt wird, um ein Mittel mit spezifischer Geschwindigkeit und Zeit der Freisetzung der biologisch aktiven Substanz herzustellen.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet , daß das die Matrix bildende Material ein Vernetzungsmittel und ein Polymeres, Monomeres oder Vorpolymeres enthält.
18. Verfahren zur Kontrolle oder Prophylaxe von Krankheiten bei Tieren, dadurch gekennzeichn e t,daß einem Tier ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 14 injiziert oder implantiert wird.
19. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoff enthaltenden Mittels zur Verabreichung in einer Dosis, dadurch gekennzeichnet , daß eine feste, zur verzögerten Freisetzung geeignete Masse, die einen Impfstoff enthält, gebildet und in einem flüssigen Impfstoffmedium dispergiert wird.

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