DE60309307T2

DE60309307T2 - Immunoadjuvant

Info

Publication number: DE60309307T2
Application number: DE60309307T
Authority: DE
Inventors: Tadao Ushiku-shi OHNO; TSUKUBA INSTITUTE Eiji c/o RIKEN Tsukuba-shi UCHIMURA; TSUKUBA INSTITUTE Lan c/o RIKEN Tsukuba-shi HUANG; TSUKUBA INSTITUTE Ming c/o RIKEN Tsukuba-shi KUANG
Original assignee: Cell-Medicine Inc Ushiku; Cell-Medicine Inc; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Cell- Medicine Inc Tsukuba-Shi Ibaraki Jp
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2003-04-15
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2023-04-16
Also published as: EP1495767A1; KR100922675B1; JP2003306444A; CN1305528C; WO2003086455A1; ATE343397T1; AU2003235158A8; JP3492671B2; CN1646159A; KR20050026382A; AU2003235158A1; EP1495767B1; CA2482929A1; DE60309307D1; US20060008478A1; ES2277099T3; EP1495767A4; CA2482929C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunadjuvans.
Technischer Hintergrund
Tuberkulin wird seit langem als Testreagens zum Nachweisen einer anamnestischen Infektion mit Mycobacterium tuberculosis oder zum Nachweisen einer positiven Umwandlung nach Verabreichung von Mycobacterium bovis BCG (im Folgenden als "BCG" abgekürzt) verwendet. Ein gereinigtes Tuberkulin, erhalten durch Reinigung von Protein-Komponenten in rohem Tuberkulin mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation ist äußerst sicher, da keine hypersensitiven inflammatorischen Reaktionen der Haut induziert werden, selbst wenn das Tuberkulin selbst wiederholt an Menschen verabreicht wird, wenn auch eine gewisse Booster-Wirkung im so genannten Tuberkulin-Reaktionstest beobachtet wird (Singh, D. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, 15. Sep.; 164(6), 962-4).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass Antitumor-Immunreaktionen gegen Tumorzellen wirkungsvoll induziert werden können durch Verabreichung von verfestigtem oder zu Mikroteilchen zerkleinertem Tumorgewebe in einen Körper zusammen mit wenigstens einer Art eines Cytokins oder Cytokin-Induktors (PCT/JP00/00692). Auch haben sie gefunden, dass eine starke Antitumor-Immunreaktion gegen Tumorzellen in obigem Prozess induziert werden kann durch gleichzeitige Verabreichung eines gereinigten Tuberkulins in löslicher Form als allgemeines Immunadjuvans (PCT/JP00/0692). Wie vorste hend beschrieben, können Komponenten von Tuberkulin als Immunadjuvans genutzt werden. Da Tuberkulin-Komponenten jedoch löslich sind, besteht bei ihnen der Nachteil, dass sie durch Diffusion rasch vom Ort der Verabreichung verschwinden.
Es ist bekannt, dass die Komponenten in einem Filtrat einer Kultur von M. tuberculosis nach Bindung an Polystyrol-Mikroteilchen T-Zellenreaktionen fördern, obwohl sie in gelöstem Zustand nur schwache Adjuvanswirkung aufweisen (Wilkinson, K.A. et al., J. Immunol. Methods 235, 1-9, 2000). Wird ein Adjuvans in gelöstem Zustand an einem unlöslichen Adjuvansträger immobilisiert, so gibt es kein rasches Verschwinden des Adjuvans durch Diffusion, und es zeigt daher starke Adjuvanswirkung. Auch wenn die Polystyrol-Mikroteilchen in diesem Immobilisierungsprodukt durch Antigen präsentierende Zellen phagozytiert werden, werden sie in den Zellen jedoch nicht abgebaut und werden so zu unerwünschten Kunststoffen im Körper.
Als eine Möglichkeit zur Lösung des obigen Problems wird in der Literatur ein Verfahren zitiert, bei dem Komponenten in einem Filtrat einer Bakterienkultur an biologisch abbaubare synthetische polymere Mikroteilchen gebunden werden (Vordermeier, H.M. et al., Vaccine 13, 1576-1582, 1995; Ertl, N.C. et al., Vaccine 14, 879-885, 1996; Jones D.H. et al., J. Biotechnology 44, 29-36, 1996; Venkataprasad, N. et al., Vaccine 17, 1814-1819, 1999). Es ist jedoch bekannt, dass das offenbarte synthetische Polymer, d.h., Poly(DL-lactid-coglycolid) (PLG), beim Abbau Milchsäure bildet und zu einer Ansäuerung der lokalen Umgebung führt, in der dieser Abbau stattfindet, womit auch dieses Verfahren für lebende Körper ungünstig ist.
Die europäische Patentanmeldung EP 1 159 967 offenbart Immunadjuvanzien, bestehend aus GM-CSF oder IL-2, eingebracht in Heparin/Humanserumalbumin-Mikrokügelchen, die als Impfstoff in Kombination mit fixierten Hepa 1-6-Zellen bzw. fixiertem Tumorgewebe und dem Adjuvans Titer Max Gold bzw. Tuberkulin verwendet werden. In diesem Dokument wird die therapeutische Wirksamkeit des Impfstoffs gezeigt. Des Weiteren werden Verfahren zur Herstellung von Mikroteilchen, die aus verfestigtem Tumormaterial hergestellt wurden, sowie Verfahren zur Fixierung löslicher Tumorantigene an festen Mikroteilchen offenbart. Die Zellen können mit Hilfe von physikalischen Hilfsmitteln inaktiviert werden.
Demgemäß ist auf dem Gebiet der Tumorimmunologie ein Adjuvans erwünscht, das fest, biologisch abbaubar und ohne die oben genannten unerwünschten Wirkungen ist. Zudem steht bei den herkömmlichen Techniken kein Immunadjuvans zur Verfügung, das Antitumor-Immunreaktionen gegen lebende Tumorzellen wirksam stimulieren kann, wenn es an ein denaturiertes Gewebe verabreicht wird, das vorher durch physikalische Denaturierung von Tumorgewebe oder Tumorzellen im Körper eines Individuums eines syngenetischen Tiers erhalten wurde, die komplexe und verschiedenartige Tumorantigene enthaften.
Offenbarung der Erfindung
Wie vorstehend erwähnt, ist Tuberkulin auch dann äußerst sicher, wenn es wiederholt einem Menschen verabreicht wird, obgleich Tuberkulin in gelöstem Zustand nur schwache Adjuvanswirkung aufweist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, durch Verwendung von Tuberkulin ein Immunadjuvans bereitzustellen, das starke Adjuvanswirkung effizient zeigen, aber unerwünschte Bedingungen für lebende Körper vermeiden kann.
Zur Lösung der vorstehenden Aufgabe haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung verschiedene Forschungen angestellt. Dadurch fanden sie, dass starke Adjuvanswirkung mit Erfolg erhalten wurde durch Bereitstellung eines Tuberkulin-Präparats mit Langzeitfreisetzung (Retardpräparat). Im Laufe der Untersuchungen des Tuberkulin-Retardpräparats fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung des Weiteren, dass beim Mischen von Albumin und Heparin unter Bildung von Präzipitaten durch Koazervatbildung Tuberkulin-Proteine in diese Prä zipitate aufgenommen werden, wodurch unlösliche Mikroteilchen gebildet wurden, und dass bei Verabreichung dieser unlöslichen Mikroteilchen zusammen mit einem Antigen und löslichem gereinigtem Tuberkulin in einen Körper diese eine starke tumorpräventive Wirkung zeigten, und dass bei ihrer in vivo-Verabreichung an thermisch denaturiertes Tumorgewebe Antitumor-Immunreaktionen erfolgreich induziert wurden. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde verwirklicht.
Die vorliegende Erfindung macht somit ein Immunadjuvans verfügbar, umfassend Präzipitate, die gebildet werden durch Koazervierung

(a) eines löslichen Proteins (mit der Maßgabe, dass ein in Tuberkulin enthaltenes lösliches Protein ausgeschlossen ist), und
(b) eines Mucopolysaccharids, des Weiteren umfassend
(c) ein lösliches Protein, das in Tuberkulin enthalten ist, wobei (c) mit den Präzipitaten kopräzipitiert wird.

Bereitgestellt wird gemäß bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das oben genannte Immunadjuvans, wobei das lösliche Protein der Komponente (a) Albumin und das Mucopolysaccharid der Komponente (b) Heparin ist; das oben genannte Immunadjuvans, wobei die Präzipitate mit einem intermolekularen Vernetzungsmittel für Proteine vernetzt sind; das oben genannte Immunadjuvans, wobei die oben genannte Komponente (c) aus einer Kombination aus einem in Tuberkulin enthaltenen löslichen Protein und einem löslichen Protein mit Antigenität besteht; sowie das oben genannte Immunadjuvans, wobei das lösliche Protein mit Antigenität aus einem Tumorgewebe, einer Tumorzelle, Tumorzellkomponente und/oder einem Tumorantigen-Peptid/tumorassoziierten Antigen stammt.
In einem weiteren Aspekt macht die vorliegende Erfindung ein Immunadjuvans in Form unlöslicher Mikroteilchen verfügbar, umfassend (c) ein in Tuberkulin enthaltenes lösliches Protein und (d) ein unlösliches Protein-Molekül, wobei die Komponenten (c) und (d) mit einem intermolekularen Vernetzungsmittel für Proteine vernetzt sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird das oben genannte Immunadjuvans bereitgestellt, wobei das unlösliche Protein-Molekül Collagen ist.
Bereitgestellt wird gemäß weiteren Ausführungsformen das oben genannte Immunadjuvans, das nach Mischen mit einem Antigen in vivo an einen Säuger, einschließlich einen Menschen, verabreicht und zur Induktion einer systemischen Immunreaktion gegen das Antigen verwendet wird; sowie das oben genannte Immunadjuvans, wobei das Antigen aus Tumorgewebe, Tumorzellen, Tumorzellen-Komponenten und/oder Tumorantigen-Peptid/tumorassoziiertem Antigen stammt.
Die vorliegende Erfindung macht des Weiteren einen Tumor-Impfstoff verfügbar, der das oben genannte Immunadjuvans enthält. Bereitgestellt wird gemäß bevorzugter Ausführungsformen dieser Erfindung der oben genannte Tumor-Impfstoff, der zur Induktion einer Antitumor-Immunreaktion durch Verabreichung an ein durch ein physikalisches Hilfsmittel denaturiertes Tumorgewebe dient; der oben genannte Tumor-Impfstoff, wobei das physikalische Hilfsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mikrowellen-Bestrahlung, Hochfrequenz-Koagulation, Gefrierkoagulation, Erhitzen mit einem elektrochirurgischen Messer, Heißwasser-Injektion, Alkohol-Injektion, Embolisierung, Bestrahlung mit radioaktiver Strahlung, Laser-Bestrahlung und Ultraschall-Zertrümmerung; der oben genannte Tumor-Impfstoff, der durch Verabreichung nach Mischen mit einer immunkompetenten Zelle außerhalb des Körpers zur Stimulierung einer in vivo-Immunreaktion dient; der oben genannte Tumor-Impfstoff, wobei die immunkompetente Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dendriten-Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und natürlichen Killerzellen; sowie der oben genannte Tumor-Impfstoff, der außerhalb des Körpers mit einer immun kompetenten Zelle und einem Antigen vermischt und anschließend verabreicht werden soll.
Bereitgestellt wird gemäß weiteren Aspekten ein Verfahren zur Induktion einer systemischen Immunreaktion, umfassend den Schritt der Verabreichung des oben genannten Immunadjuvans an einen Säuger, darunter auch einen Menschen; ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Tumors, umfassend den Schritt der Verabreichung des oben genannten Tumor-Impfstoffs an ein mit Hilfe physikalischer Hilfsmittel denaturiertes Tumorgewebe; ein Verfahren zur Induktion einer Antitumor-Immunreaktion, umfassend den Schritt der Verabreichung des oben genannten Tumor-Impfstoffs an ein mit Hilfe physikalischer Hilfsmittel denaturiertes Tumorgewebe; sowie ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunreaktion in vivo, umfassend die Schritte des ex vivo-Mischens des oben genannten Tumor-Impfstoffs mit einer immunkompetenten Zelle und die anschließende Verabreichung der Mischung an einen Körper eines Säugers, einschließlich eines Menschen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die supprimierende Wirkung des Tumor-Impfstoffs der vorliegenden Erfindung gegen Leberkrebs-Proliferation. Die punktierte Linie zeigt eine kumulative Überlebensrate (Kontrollgruppe), und die durchgezogene Linie zeigt eine kumulative Überlebensrate (Gruppe, welcher der mikroteilchenförmige Tuberkulin-Impfstoff verabreicht wurde). Die dünne punktierte Linie zeigt diejenige einer Positivkontrollgruppe.
2 zeigt die präventive Wirkung des Tumor-Impfstoffs der vorliegenden Erfindung gegen erneutes Auftreten von Tumoren, verabreicht an Tumorgewebe, das einer Mikrowellen-Koagulation ausgesetzt wurde.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Das Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es Präzipitate umfasst, gebildet durch Koazervierung

(a) eines löslichen Proteins (mit Ausnahme löslicher Proteine, die in Tuberkulin enthalten sind), und
(b) eines Mucopolysaccharids, sowie
(c) eines löslichen Proteins, das in Tuberkulin enthalten ist,

Die Kombination aus dem oben genannten löslichen Protein (a) und dem Mucopolysaccharid (b) unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, solange die beiden durch Koazervatbildung Präzipitate unter Bedingungen hervorbringen, die dem Fachmann bekannt sind. Eine ausführliche technische Erläuterung findet sich beispielsweise in US-Patent Nr. 5 759 582. Allerdings sollte dieser Begriff nicht in irgendeinem Sinne einschränkend, sondern in seiner breitesten Bedeutung ausgelegt werden. Zum Beispiel können Albumin und Heparin vorzugsweise als das lösliche Protein (a) bzw. das Mucopolysaccharid verwendet werden, doch ist die Kombination aus löslichem Protein (a) und Mucopolysaccharid (b) nicht auf die oben genannte Kombination beschränkt. Als lösliches Protein, das in Tuberkulin enthalten ist, können zum Beispiel die gesamten in gereinigtem Tuberkulin enthaltenen Proteine verwendet werden, wie auch alle oder ein Teil der löslichen Proteine, die aus Tuberkulin mit Hilfe von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Durch Rühren der oben genannten drei Arten von Komponenten werden durch Koazervierung der Komponenten (a) und (b) Präzipitate gebildet, und bei diesem Vorgang wird die Komponente (c) in die Präzipitate aufgenommen und kopräzipitiert, um Präzipitate zu ergeben.
Das Verhältnis von löslichem Protein (c), das in Tuberkulin enthalten ist, zu löslichem Protein (a) unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, solange das Verhältnis in einem solchen Bereich gewählt wird, dass das lösliche Protein (a) und das Mucopolysaccharid (b) zu einer Koazervatbildung führen. Wird zum Beispiel eine Lösung von 2,5% Humanserumalbumin mit pH 2,5 als lösliches Protein verwendet, so wird eine handelsübliche Heparin-Lösung mit etwa 5 mg/ml als Mucopolysaccharid eingesetzt, 2,5 μg eines löslichen Proteins von Tuberkulin werden in 600 μl des Mucopolysaccharids gelöst, und die oben genannte Humanserumalbumin-Lösung wird tropfenweise unter Rühren der Mischung in verschiedenen Volumenverhältnissen von 1/1,75, 1/1,5, 1/1,25 und 1/1 zugesetzt, um Mikroteilchen durch Koazervierung zu bilden. Vorzugsweise wird jede Suspension zentrifugiert, der Proteingehalt im Überstand wird quantifiziert, und es wird ein Volumenverhältnis gewählt, bei dem der größte Teil des gemischten Proteins in Mikroteilchen aufgenommen wird. Es sei darauf verwiesen, dass das Verhältnis der Komponenten (a) bis (c), die Bedingungen der Koazervatbildung und dergleichen von einem Fachmann in geeigneter Weise ausgewählt werden können. Die Teilchengröße der in den resultierenden Präzipitaten enthaltenen Mikroteilchen beträgt im Allgemeinen 1 μm oder weniger, ist jedoch nicht auf eine bestimmte Größe beschränkt.
Die resultierenden Präzipitate, vorzugsweise Präzipitate in Form von Mikroteilchen, können ohne jegliche Behandlung als Immunadjuvans verwendet werden. Falls notwendig, können die Präzipitate mit destilliertem Wasser gewaschen werden. Zur Stabilisierung der Präzipitate können unlösliche Mikroteilchen hergestellt werden durch Ausbildung von Vernetzungen unter Behandlung mit einem intermolekularen Vernetzungsmittel für Proteine. Die Art des intermolekularen Vernetzungsmittels für Proteine unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und es kann jedes dem Fachmann bekannte Mittel in bekannter Weise eingesetzt werden. Wird zum Beispiel eine 20 mg/ml wässrige Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid zu Proteinen in einer Endkonzentration von 0,8 bis 1,5 mg/ml unter Rühren mit einem Wirbelmischer gegeben und die Mischung anschließend bei Raumtemperatur 15 Minuten lang stehengelassen, so bilden sich hinreichend stabile Vernetzungen zwischen den Protein-Molekülen in den Präzipitaten. Die Bildung von Vernetzungen ist jedoch nicht auf die jenigen unter Anwendung der oben genannten speziellen Bedingungen und Verwendung der speziellen intermolekularen Vernetzungsmittel für Proteine beschränkt. Das wie vorstehend beschrieben erhaltene Immunadjuvans, vorzugsweise ein solches, das eine Vernetzungsbehandlung durchlaufen hat, geht selbst beim Waschen mit Wasser nicht in Lösung und kann bevorzugt als Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann zudem ein Immunadjuvans, das ein lösliches Protein mit Antigenität und ein in Tuberkulin enthaltenes lösliches Protein mit Adjuvanswirkung enthält, hergestellt werden durch Gewinnung von Präzipitaten in der gleichen Art wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass das lösliche Protein mit Antigenität und das in Tuberkulin enthaltene lösliche Protein vorher gemischt werden und anschließend die resultierende Mischung an Stelle des obigen (c) eingesetzt wird.
In einem weiteren Aspekt macht die vorliegende Erfindung auch ein Immunadjuvans in Form unlöslicher Mikroteilchen verfügbar, umfassend ein in Tuberkulin enthaltenes lösliches Protein und ein unlösliches Protein-Molekül, die beide mit einem intermolekularen Vernetzungsmittel für Proteine vernetzt sind. Als unlösliches Protein-Molekül können biologisch abbaubare unlösliche Protein-Moleküle verwendet werden, beispielsweise kann Collagen verwendet werden. Allerdings ist das unlösliche Protein-Molekül nicht notwendigerweise auf Collagen beschränkt, und es kann irgendein beliebiges unlösliches Protein-Molekül verwendet werden, das in vivo abbaubar ist. Die Art des intermolekularen Vernetzungsmittels für Proteine unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und es kann jedes dem Fachmann bekannte Mittel in bekannter Weise eingesetzt werden. Zum Beispiel kann 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und dergleichen verwendet werden. Im Allgemeinen ist die Teilchengröße der Mikroteilchen vorzugsweise 1 μm oder geringer, ist jedoch nicht auf die obige spezielle Größe beschränkt.
Das Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung kann als allgemeines Immunadjuvans verwendet werden. Das Immunadjuvans kann einfach mit einem Antigen gemischt und dem Körper eines Menschen oder Tiers verabreicht werden, so dass systemische Immunreaktionen gegen das Antigen induziert werden können. Stammt das Antigen von Tumorgewebe, Tumorzellen, Tumorzellen-Komponenten und/oder Tumorantigen-Peptid/tumorassoziierten Antigenen, so kann das Immunadjuvans als Tumorvakzin eingesetzt werden. Zum Beispiel können durch Vermischen des Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung mit Krebszellen, die aus einem Patienten isoliert und immobilisiert wurden, und anschließende intrakutane Verabreichung der Mischung an den Patienten Antitumor-Immunreaktionen gegen die Krebszellen im Patienten in vivo induziert werden. Allerdings ist das Verfahren der Anwendung des Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung nicht auf das oben genannte Verfahren beschränkt, und es kann irgendein herkömmliches Verfahren unter Nutzung eines Immunadjuvans angewandt werden.
Zudem können durch Denaturierung eines Tumorgewebes im Körper eines Patienten mittels physikalischer Hilfsmittel und anschließende Verabreichung des Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung an das Gewebe Antitumor-Immunreaktionen gegen die Tumorzellen induziert werden, die im Körper des Patienten überleben. Das physikalische Hilfsmittel zur Denaturierung des Tumorgewebes unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und zu den Beispielen dafür gehören beispielsweise Hilfsmittel zur Mikrowellen-Bestrahlung, Hochfrequenz-Koagulation, Gefrierkoagulation, Heißwasser-Injektion, Alkohol-Injektion, Embolisierung, Bestrahlung mit radioaktiver Strahlung, Laser-Bestrahlung, Ultraschall-Zertrümmerung und dergleichen. Diese Hilfsmittel sind jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt, und es kann irgendein beliebiges Hilfsmittel verwendet werden, solange dieses Hilfsmittel den Zelltod von Tumorzellen in einem Tumorgewebe induzieren kann. Es können zwei oder mehr Arten physikalischer Hilfsmittel in geeigneter Weise in Kombination eingesetzt werden.
Wird beispielsweise ein Tumorgewebe unter Erwärmen mit Mikrowellenstrahlung koaguliert und das Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung in das koagulierte Gewebe verabreicht, so können Antitumor-Immunreaktionen gegen die Tumorzellen induziert werden, die im oder um das Tumorgewebe herum überleben. Bei Verabreichung des Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung ist es auch bevorzugt, gleichzeitig eine Tuberkulin-Lösung zu verabreichen. Das Verfahren zur Verabreichung des Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die oben genannten Ausführungsformen beschränkt. Es kann irgendein beliebiges Verfahren angewandt werden, solange es mit dem Verfahren möglich ist, eine Umgebung bereitzustellen, in der das Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung in Antigen präsentierende Zellen, die zum denaturierten Tumorgewebe wandern, zusammen mit den im denaturierten Tumorgewebe enthaltenen Tumorantigenen aufgenommen wird, oder das Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung kann Antigen präsentierende Zellen direkt stimulieren.
Zudem können Immunreaktionen im Körper auch stimuliert werden, indem das Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung mit immunkompetenten Zellen vorher außerhalb des Körpers vermischt und die Mischung anschließend dem Körper eines Patienten verabreicht wird. Vorzugsweise können als immunkompetente Zellen dendritische Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und/oder natürliche Killerzellen oder dergleichen verwendet werden. Die immunkompetenten Zellen sind jedoch nicht auf diesen Zellen beschränkt.
In einem weiteren Aspekt macht die vorliegende Erfindung einen Impfstoff verfügbar, der das oben genannte Immunadjuvans als wirksamen Bestandteil umfasst. Bei Verabreichung dieses Impfstoffs können auch immunkompetente Zellen beigemischt werden. Des Weiteren können Tumorgewebe und/oder Tumorzellen durch Vermischen mit dem Impfstoff als Antigene verwendet werden. Durch Verabreichung eines wie vorstehend beschrieben erhaltenen Impfstoffs an einen Patienten, von dem der Tumor stammt, kann der Tumor therapeutisch behandelt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele eingehender erläutert werden. Der Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Das in diesen Beispielen hergestellte Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung kann als mikroteilchenförmiges Tuberkulin (oder synonym) bezeichnet werden.
Beispiel 1:
Supprimierende Wirkung des Tumorvakzins der vorliegenden Erfindung gegen Leberkrebswachstum
A. Material und Methoden
1. Herstellung des Immunadjuvans

1) Eine 25% Humanserumalbumin-Lösung (HSA, Baxter Albumac, Baxter) wurde mit sterilisiertem Wasser auf eine Konzentration von 2,5% verdünnt und mit 4 N HCl auf pH 2,5 eingestellt.
2) Die resultierende 2,5% Humanserumalbumin-Lösung und eine Heparin-Lösung (Novo Heparin 1000, 1000 U/ml, etwa 7,69 mg/ml oder weniger, Aventis Pharma Ltd.) wurden vorher in verschiedenen Anteilen gemischt, um das optimale Mischungsverhältnis der Heparin-Lösung zu bestimmen. Die Mikroteilchen wurden zunächst in einem beliebigen Mischungsverhältnis hergestellt, mit 2500 U/min (1300 g) 15 Minuten zentrifugiert, und der Proteingehalt im Überstand wurde quantifiziert unter Verwendung eines Protein Assay Kit 1 (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., Tokio). Das optimale Mischungsverhältnis wurde definiert als das Verhältnis, mit dem Bedingungen bereitgestellt werden, unter denen nicht weniger als 99,9% der gemischten nen nicht weniger als 99,9% der gemischten Proteine in die Mikroteilchen aufgenommen wurden.
3) Tuberkulin (Japan BCG Manufacturing Co., Ltd., gereinigtes Tuberkulin für die Allgemeindiagnose (aus Tuberkulin gereinigtes Protein-Derivat, PPD) für eine Person, Menge entsprechend 0,25 μg eines Standardprodukts) wurde in einer Heparin-Lösung zur Injektion suspendiert und tropfenweise mit einer 2,5% Humanserumalbumin-Lösung in einem bestimmten Verhältnis unter Rühren mit einem Wirbelmischer versetzt.
4) Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4300 U/min (1300 g) zentrifugiert, und die Präzipitate wurden zweimal mit sterilisiertem destillierten Wasser gewaschen und in sterilisiertem destillierten Wasser resuspendiert.
5) Die Suspension wurde mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Lösung (EDC, SIGMA, gelöst in Wasser zu 20 mg/ml) unter Rühren mit einem Wirbelmischer auf eine Endkonzentration von 0,8 bis 1,5 mg/ml versetzt und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
6) Die Mischung wurde 15 Minuten mit 4300 U/min (1300 g) zentrifugiert, und die Präzipitate wurden 6-mal mit sterilisiertem destillierten Wasser gewaschen und in sterilisierter physiologischer Salzlösung in der erforderlichen Konzentration resuspendiert, um eine mikroteilchenförmige Tuberkulin-Suspension zu ergeben.

2. Messung der supprimierenden Wirkung des Tumorvakzins gegen Maus-Leberkrebswachstum

1) Hepa 1-6-Leberkrebszellen, bis zur Konfluenz in einer Kunststoff-Kulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm kultiviert, wurden mit einer 3% Paraformaldehyd-Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur immobilisiert. Die Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Salzlösung nach Dulbecco, enthaltend Calcium und Magnesium (PBS(+)) gewaschen, nochmals gewaschen, mit 70% Ethanol sterilisiert und nochmals gründlich mit PBS(+) gewaschen.
2) Diese Zellen wurden mit DMEM-Medium, 10 ml pro Schale, versetzt und 2 Tage bei 37°C inkubiert.
3) Die Zellen wurden gründlich mit PBS(+) gewaschen, mit 3 ml je Schale einer Poly-L-lysin-Lösung (25 μg/ml) versetzt und 2 Stunden lang inkubiert.
4) Die Zellen wurden gründlich mit PBS(+) gewaschen, anschließend wurden alle immobilisierten Zellen mit einem Schaber abgekratzt und in PBS(+) suspendiert.
5) Ein Volumen von 200 μl der Suspension, entsprechend den Zellen von 4 Schalen, wurde in ein Eppendorf-Röhrchen gefüllt, mit 100 μl einer Tuberkulin-Lösung versetzt (0,25 μg/100 μl PBS(+)) und 2 Stunden inkubiert.
6) Die Mischung wurde mit 150 μl der Suspension mikroteilchenförmigen Tuberkulins (enthaltend Tuberkulin in einer Konzentration von 3 μg/ml) und des Weiteren mit 50 μl PBS(+) versetzt, um einen mikroteilchenförmigen Tuberkulin-Impfstoff zu ergeben. In der gleichen Weise wurden 200 μl einer Lösung, erhalten durch 10-faches Verdünnen von 5 KE/ml OK432 (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Picibanil 5KE) mit PBS(+), an Stelle von mikroteilchenförmigem Tuberkulin und PBS(+) in ein Eppendorf-Röhrchen gefüllt, um einen Impfstoff für die Positivkontrollgruppe zu ergeben.
7) Neun Mäusen, die syngenetisch waren zu den Hepa 1-6-Leberkrebszellen (C57L/J, 6 bis 9 Wochen alt, männlich), wurden 50 μl des obigen mikroteilchenförmigen Tuberkulin-Impfstoffs pro Tier intrakutan injiziert. Dieser Vorgang wurde eine Woche später wiederholt. Neun Mäusen in der Kontrollgruppe wurde lediglich Phosphat-gepufferte Salzlösung nach Dulbecco ohne Calcium und Magnesium (PBS(–)) injiziert. Des Weiteren wurde den Tieren der Positivkontrollgruppe der Impfstoff für die Positivkontrollgruppe injiziert, der in ähnlicher Weise wie in 6) oben hergestellt wurde.
8) Eine weitere Woche später wurden den Tieren Hepa 1-6-Zellen (1·10⁷ Zellen/0,2 ml PBS(–)) subkutan in den rechten Lauf injiziert.
9) Nach der obigen Belastung wurden den Tieren 50 μl eines mikroteilchenförmigen Tuberkulin-Impfstoffs pro Tier intrakutan injiziert, der in der gleichen Weise hergestellt wurde wie bis zum obigen Schritt 6) (mit der Maßgabe, dass das zur Herstellung dieses Impfstoffs verwendete mikroteilchenförmige Tuberkulin das Tuberkulin in einer Konzentration von 2 μg/ml enthielt). Den 9 Mäusen der Kontrollgruppe wurde lediglich PBS(–) injiziert. Des Weiteren wurde den Mäusen der Positivkontrollgruppe der Impfstoff für die Positivkontrollgruppe injiziert, der in ähnlicher Weise wie in 6) oben hergestellt wurde.
10) Anschließend wurde die Überlebensrate der Mäuse nach Wachstum von Leberkrebs (subkutan) bestimmt.

B. Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Diese Figur zeigt die Kaplan-Meier-Kurven für die Kontrollgruppe, die Gruppe mit Verabreichung des mikroteilchenförmigen Tuberkulin-Impfstoffs und die Positivkontrollgruppe. Die Gruppe, an die der mikroteilchenförmige Tuberkulin-Impfstoff verabreicht wurde, zeigte eine Überlebensrate, die höher war als die der Kontrollgruppe, und zwar mit statistisch signifikanter Differenz (log-Rangtest, p < 0,0001). Überdies zeigte die Gruppe mit Verabreichung eine Antitumorwirkung, die besser war als die bei der Positivkontrollgruppe beobachtete.
Beispiel 2:
Präventive Wirkung von mikroteilchenförmigem Tuberkulin gegen erneutes Auftreten von Tumoren bei Verabreichung in Mikrowellen-koaguliertes Tumorgewebe
A. Material und Methoden

1. Mikroteilchenförmiges Tuberkulin wurde in der gleichen Weise wie in Schritt 1 von Beispiel 1 hergestellt.
2. C57BL/6-Mäusen (weiblich, 6 Tiere pro Gruppe) wurden 1·10⁶ syngenetische Lungenkrebszellen (Lewis-Lungenkarzinomzellstamm) jeweils in den rech ten Lauf intrakutan injiziert, und als die Größe des subkutanen Lungenkrebsgewebes am B. Tag etwa 75 mm³ erreicht hatte, wurden die Mäuse mit Pentobarbital-natrium anästhesiert. Anschließend wurde die Haut neben dem Lungenkrebsgewebe eingeschnitten, und es wurde eine Microtaze Einkugel-Elektrode zur endoskopischen Verwendung (E-24N, Durchmesser: 2,4 mm) in das Krebsgewebe des Schnitts eingesetzt.
3. Die Elektrode wurde an das Microtaze angeschlossen (Modell HSE-8M, Azwell Inc.), und das Gewebe wurde mit Mikrowellen mit 10 W 3 Minuten lang bestrahlt, bis das Krebsgewebe bei Erwärmen vollständige Koagulation nach Augenschein ergab.
4. Die Wunde wurde genäht, und es wurde eine Tuberkulin-Lösung (erhalten durch Lösen von 25 ng gereinigtem Tuberkulin in 25 μl physiologischer Salzlösung) und suspendiertes mikroteilchenförmiges Tuberkulin (enthaltend 50 ng gereinigtes Tuberkulin, suspendiert in 5 μl physiologischer Salzlösung) am 10. Tag in das Krebsgewebe injiziert. Am 14. Tag wurde diese Injektion noch einmal wiederholt (Gruppe a). Die Mäuse der Kontrollegruppe (Gruppe b) wurden lediglich der Mikrowellen-Bestrahlung ausgesetzt. Erstellt wurde auch eine Kontrollgruppe, die nicht mit Mikrowellen bestrahlt wurde (Gruppe c), eine Gruppe, der OK-432 (1 KE/25 μl) anstatt mikroteilchenförmiges Tuberkulin verabreicht wurde (Gruppe d), sowie eine Gruppe, der OK-432 (1 KE/25 μl) an Stelle der Tuberkulin-Lösung verabreicht wurde (Gruppe e).
5. Anschließend wurden die Veränderungen der Größe (mm³) des Krebsgewebes, das sich aufgrund des Rezidivs vergrößerte, über die Zeit gemessen.

B. Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Jeder Punkt zeigt einen Durchschnittswert der Größe des Lungenkrebsgewebes bei 6 Mäusen. Gemäß Beobachtung bis zum 33. Tag nach Transplantation der Lungenkrebszellen war das erneute Auftreten von Lungenkrebs in den Geweben bei der Gruppe a im Vergleich zu den Gruppen b und c deutlich supprimiert. Insbesondere wurde erneutes Auftreten bei keinem der 6 Tiere der Gruppe a beobachtet, die mikroteilchenförmiges Tuberkulin und die Tuberkulin-Lösung erhalten hatten, und so ergab sich bei dieser Gruppe vollständige Suppression. Bei der Gruppe d, die kein mikroteilchenförmiges Tuberkulin erhalten hatte, und bei Gruppe e, die keine Tuberkulin-Lösung erhalten hatte, schrumpften dagegen die Krebsgewebe nach der Mikrowellen-Bestrahlung und wuchsen dann wieder, und dies waren jeweils kleine Krebsgewebe. Auch wenn die Krebsproliferation im Vergleich zu den Gruppen b und c supprimiert war, wurde erneutes Auftreten bei 5 von 6 Tieren in diesen Gruppen beobachtet (Tabelle 1).
Tabelle 1
Rezidiv nach Transplantation von Lungenkrebszellen
Anzahl Mäuse aus 6 Tieren pro Gruppe, bei denen Lungenkrebs wieder auftrat
Industrielle Anwendbarkeit
Das Immunadjuvans der vorliegenden Erfindung kann starke Adjuvanswirkung effizient zeigen und unerwünschte Bedingungen für lebende Körper vermeiden.

Claims

Ein Immunoadjuvans zur Verabreichung in ein Tumorgewebe, das durch physikalische Mittel denaturiert wurde, wobei das Immunoadjuvans Folgendes umfasst: Präzipitate, die gebildet wurden durch Koazervierung: (a) eines löslichen Proteins, mit der Maßgabe, dass ein in Tuberkulin enthaltenes lösliches Protein ausgeschlossen ist; und (b) eines Mucopolysaccharids; des Weiteren umfassend: (c) ein lösliches Protein, das in Tuberkulin enthalten ist, wobei (c) mit den Präzipitaten kopräzipitiert wird.
Das Immunoadjuvans gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das physikalische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe Mikrowellen-Bestrahlung, Hochfrequenz-Koagulation, Gefrier-Koagulation, Erhitzen mit einem Elektrochirurgie-Messer, Heißwasser-Injektion, Alkohol-Injektion, Embolisierung (Blutgefäßverschluss), Bestrahlung mit radioaktiver Strahlung, Laserstrahl-Bestrahlung und Ultraschall-Zerreißung.
Ein Tumorvakzin enthaltend das Immunoadjuvans gemäß Anspruch 1 oder 2.