WO2003086455A1 - Immunoadjuvant - Google Patents

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WO2003086455A1
WO2003086455A1 PCT/JP2003/004767 JP0304767W WO03086455A1 WO 2003086455 A1 WO2003086455 A1 WO 2003086455A1 JP 0304767 W JP0304767 W JP 0304767W WO 03086455 A1 WO03086455 A1 WO 03086455A1
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tuberculin
soluble protein
immunoadjuvant
antigen
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Tadao Ohno
Eiji Uchimura
Lan Huang
Ming Kuang
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Riken
Cell-Medicine,Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to immunoadjuvants.
  • Tuberculin has long been used as a test drug to detect a clear history of Mycobacterium tuberculosis infection
  • Mycobacterium bovis BCG (BCG) has been used as a test drug to detect stagnation after administration to rice fields.
  • Purified tuberculin in which the protein component in tuberculin is purified by ammonium sulfate precipitation method, shows a slight booster effect in the so-called tuberculin reaction test even if it is repeatedly administered to humans (Singh, D. et al. , Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, Sep 15; 164 (6): 962-4), which is extremely safe without excessive skin inflammatory response.
  • an antitumor immune response against tumor cells can be efficiently induced by administering a solidified or micronized tumor tissue together with at least one type of cytodynamic or cytokine inducer to the body.
  • PCT / JP00 / 00692 a solidified or micronized tumor tissue together with at least one type of cytodynamic or cytokine inducer to the body.
  • PCT / JP00 / 00692 a stronger antitumor immune response against tumor cells could be induced.
  • the component of tuberculin can be used as an immunoadjuvant, but it has a drawback that it is rapidly eliminated from the administration site by diffusion because the component of tuberculin is soluble.
  • the components in the culture filtrate of M. tuberculosis have only a weak adjuvant activity in the dissolved state, but are known to promote the T cell reaction by binding to polystyrene microparticles (Wilkinson, KA, et al., J. Immunol. Methods, 235: 1-9, 2000).
  • a dissolved adjuvant is immobilized on an insoluble adjuvant carrier, it does not rapidly diffuse and disappear, but exhibits strong adjuvant activity.
  • the polystyrene microparticles in this immobilized product are phagocytosed by antigen-presenting cells, but become undesirable plastics that remain in the body without being decomposed inside the cells.
  • this literature also cites a method of binding a component in a bacterial culture filtrate to fine particles of a biodegradable synthetic polymer (Vordermeier, HM, et al. , Vaccine, 13, 1576-1582, 1995; Ertl, HC, et al., Vaccine, 14, 879-885, 1996; Jones DH, et al., J. Biotechnology, 44, 29-36, 1996; Venkataprasad, N., et al., Vaccine, 17, 1814-1819, 1999).
  • the synthetic polymer poly (DL-lactide co-glycolide) (PLG) described is known to generate lactic acid when decomposed and acidify the local environment of the decomposition. Not desirable.
  • adjuvants which are solid and biodegradable and have no undesired effects as described above are desired. Further, according to the conventional technique, when a tumor tissue or tumor cells containing a complex and diverse tumor antigen is physically denatured in the body of an individual animal of syngeneic animal, and an immunological adjuvant is administered into the denatured tissue, the living tissue is not affected. No immunological adjuvant could efficiently stimulate an anti-tumor immune response to tumor cells.
  • tuberculin has only a weak adjuvant activity in the dissolved state, but is extremely safe even if administered repeatedly to humans.
  • An object of the present invention is to provide an immunoadjuvant that can exert a strong adjuvant activity efficiently while avoiding an undesired state for a living body using tuberculin.
  • the inventors of the present invention have found that, upon the sustained release of tuberculin, when albumin and heparin are mixed to form a precipitate by coacervation, the tuberculin protein is involved in the precipitate to form insoluble fine particles, and We found that when these insoluble microparticles were administered together with an antigen and soluble purified tuberculin to the body, they exhibited a strong tumor protective effect, and that when administered to heat-denatured in vivo tumor tissue, they could induce a strong antitumor immune response.
  • the present invention has been completed based on these findings. That is, according to the present invention, there is provided an immunoadjuvant,
  • the above-mentioned immunoadjuvant wherein the soluble protein of the component (a) is albumin, and the mucopolysaccharide of the component (b) is heparin; the precipitate was cross-linked by an interprotein cross-linking agent
  • a cell, a tumor cell component, and an immunoadjuvant as described above which is Z or a tumor antigen peptide is provided.
  • the present invention relates to an immunoadjuvant comprising (c) a soluble protein contained in tuberculin and (d) an insoluble protein molecule, wherein the components (c) and (d) are combined with an interprotein crosslinker.
  • An immunoadjuvant in the form of a crosslinked insoluble microparticle is provided by the present invention.
  • the above-mentioned immunoadjuvant wherein the insoluble protein molecule is collagen.
  • the above-mentioned immunoadjuvant for inducing a systemic immune response to the antigen after mixing with the antigen and then administering the mixture to the body of mammals including humans; Cells, tumor cell components, and / or tumor antigen peptides
  • An immunological adjuvant as described above is provided.
  • the present invention provides a tumor vaccine containing the above-mentioned immune adjuvant.
  • the above-mentioned tumor vaccine for inducing an anti-tumor immune response by administering into a tumor tissue denatured by physical means; the physical means being microwave irradiation, radio frequency coagulation;
  • Tumor vaccine which is a means selected from the group consisting of the following methods: freeze-coagulation, electric scalpel heating, hot water injection, alcohol injection, embolization, irradiation, laser irradiation, and ultrasonic destruction;
  • the above tumor vaccine for stimulating the immune response in the body by administering after mixing with cells;
  • the immunocompetent cells consist of dendritic cells, B lymphocytes, T lymphocytes, and natural killer cells
  • the above-mentioned tumor vaccine selected from the group; and the above-mentioned tumor vaccine, which is administered outside the body in combination with an immunocompetent cell and an antigen.
  • a method for inducing a systemic immune response which comprises the step of administering the above-mentioned immunoadjuvant to mammals including humans; a method for treating a tumor, wherein the method comprises denaturing by physical means.
  • Administering the above-mentioned tumor vaccine into a tumor tissue that has been denatured a method for inducing an anti-tumor immune response, which comprises administering the above-mentioned tumor vaccine into a tumor tissue that has been denatured by physical means.
  • a method of stimulating an immune response in the body by mixing the tumor vaccine and the immunocompetent cells outside the body in advance and then administering the mixture to a mammal, including a human.
  • FIG. 1 is a view showing the inhibitory effect of the tumor vaccine of the present invention on the growth of liver cancer.
  • the dotted line represents the cumulative survival rate (control group)
  • the solid line represents the cumulative survival rate (the group administered the microparticles of tuberculin vaccine
  • the thin dotted line represents the positive control group.
  • FIG. 2 is a graph showing the tumor recurrence-protecting effect of the tumor vaccine of the present invention administered into tumor tissue after microwave coagulation.
  • the immunoadjuvant of the present invention comprises:
  • the combination of (a) the soluble protein and (b) the mucopolysaccharide is not particularly limited as long as both of them produce precipitates by coacervation under conditions well known to those skilled in the art.
  • the coacervation is described in detail in, for example, US Pat. No. 5,759,582, but this term should not be construed in a limited manner in any way. , Must be interpreted in the broadest sense.
  • (a) albumin is preferably used as the soluble protein, and heparin is preferably used as the mucopolysaccharide, but the combination of (a) the soluble protein and (b) the mucopolysaccharide is not limited to the above combination. .
  • the soluble protein contained in the tuberculin for example, the whole protein of the purified tuberculin can be used, or the whole or a part of the soluble protein prepared from the tuberculin by a method well known to those skilled in the art can be used. .
  • a precipitate is formed by coacervation of the component (a) and the component (b).
  • the component (c) is taken into the precipitate and coprecipitated to form a precipitate. give.
  • the ratio between (c) the soluble protein contained in the tuberculin and (a) the soluble protein is not particularly limited, and any ratio may be used as long as (a) the soluble protein and (b) the mucopolysaccharide cause coacervation. It may be.
  • a 2.5% human serum albumin solution with a pH of 2.5 is used as a soluble protein
  • a heparin solution of about 5 mg / ml is used as a mucopolysaccharide
  • a mucopolysaccharide of 600 ⁇ l is used.
  • Dropping is performed while changing the amount ratio to 1 / 1.75, 1 / 1.5, 1 / 1.25, 1/1 to form fine particles by coace basin.
  • This suspension is preferably centrifuged, the protein content of the supernatant is quantified, and the volume ratio at which most of the mixed protein is incorporated into the microparticles is preferably selected.
  • the particle size of the fine particles contained in the obtained precipitate is not limited to the force S, which is usually 1 m or less, and the specific size.
  • the obtained precipitate preferably a particulate precipitate, can be used as it is as an immunoadjuvant, but the precipitate may be washed with distilled water as needed.
  • a crosslinker may be formed by the action of a protein intermolecular crosslinker to form insoluble fine particles.
  • the type of the intermolecular protein crosslinking agent is not particularly limited, and those known to those skilled in the art can be used by a known method. For example, add 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpoimide to a 20 mg / ml aqueous solution and mix with a vortex mixer to a final concentration of 0.8 to 1.5 mg / ml.
  • the cross-link formation is not limited to the above-mentioned specific conditions or the specific inter-protein cross-linking agent.
  • the immunoadjuvant obtained as described above, preferably a cross-linked immunoadjuvant, does not dissolve even when washed with water, and can be suitably used as the immunoadjuvant of the present invention.
  • a soluble protein having antigenicity and a soluble protein contained in tuberculin are mixed in advance, and the mixture is used in the same manner as above except that the mixture is used instead of the above (c).
  • an immune adjuvant containing a soluble protein having antigenicity and a soluble protein having adjuvant activity can be produced by obtaining a precipitate.
  • the present invention provides an immunoadjuvant in the form of insoluble fine particles containing a soluble protein and an insoluble protein molecule contained in tuberculin cross-linked by an interprotein cross-linking agent.
  • Insoluble protein molecules include biodegradable insoluble protein molecules.
  • collagen can be used, but is not limited thereto, and any insoluble protein molecule that can be degraded in vivo can be used.
  • the type of the intermolecular protein crosslinking agent is not particularly limited, and those well known to those skilled in the art can be used by a well-known method.
  • triethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpoimide can be used.
  • the particle size of the fine particles is usually preferably ⁇ ⁇ or less, but is not limited to a specific size.
  • the immunoadjuvant of the present invention can be used as a general immunoadjuvant.
  • the systemic immune response to the antigen can be induced by simply mixing it with the antigen and administering it to a human or animal body.
  • the antigen is a tumor tissue, a tumor cell, a tumor cell component, and / or a tumor antigen peptide
  • it can be used as a tumor vaccine.
  • an anti-tumor immune response to the cancer cell in the patient can be induced.
  • the method of using the immunoadjuvant of the present invention is not limited to the above, and any method in an ordinary form using an immunoadjuvant may be used.
  • the immunoadjuvant of the present invention is administered into the tissue, whereby anti-tumor immunity against tumor cells remaining in the patient's body is achieved.
  • a reaction can be induced.
  • the means of physical degeneration of the tumor tissue is not particularly limited.For example, microwave irradiation, radio frequency coagulation, freeze coagulation, electric scalpel heating, hot water injection, alcohol injection, embolization, irradiation, laser light Means such as irradiation and ultrasonic blasting can be adopted.
  • the present invention is not limited to these, and any means may be used as long as it can induce cell death of tumor cells in the tumor tissue. Two or more physical means may be appropriately combined.
  • the immunoadjuvant of the present invention when a tumor tissue is heated and coagulated by microwave irradiation with a microphone mouth, and the immunoadjuvant of the present invention is administered into the coagulated tissue, an anti-tumor immune reaction against tumor cells remaining inside or around the tumor tissue is obtained. Can be induced.
  • the immune adjuvant of the present invention It is also preferable to administer the tuberculin solution at the same time when administering the drug.
  • the administration method of the immunoadjuvant of the present invention is not limited to the above-mentioned embodiment, and the degenerated tumor, the tumor in which the antigen adjuvant of the present invention is contained in the denatured tumor tissue in the antigen-presenting cells gathered in the assemblage. Any method may be employed as long as it provides an environment capable of directly stimulating antigen-presenting cells, or the ability to be taken up together with an antigen or the immunoadjuvant of the present invention.
  • the immune adjuvant of the present invention and the immunocompetent cells may be mixed outside the body in advance and then administered to the patient's body to stimulate the immune response in the body.
  • the immunocompetent cells dendritic cells, B lymphocytes, T lymphocytes, and / or natural killer cells can be preferably used, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a vaccine containing the above-mentioned immunoadjuvant as an active ingredient.
  • immunocompetent cells may be mixed simultaneously. It is also possible to use a mixture of tumor tissue and / or tumor cells as an antigen, and to treat a tumor by administering the vaccine thus obtained to a patient from which the tumor was derived.
  • the immunoadjuvant of the present invention prepared in this example may be referred to as micronized tuberculin (or a synonym thereof).
  • Example 1 Liver cancer growth inhibitory effect of the tumor vaccine of the present invention '
  • EDC 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpoimide solution
  • SIGMA 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpoimide solution
  • Hepa cancer cells Hepa 1-6 cultured to confluence in a plastic culture dish with a diameter of 10 cm were fixed with a 3% paraformaldehyde solution at room temperature for 2 hours. The plate was washed sufficiently with Dulbecco's phosphate buffered saline containing calcium and magnesium (PBS (+)), further washed and sterilized with 70% ethanol, and washed again thoroughly with PBS (+).
  • PBS (+) Dulbecco's phosphate buffered saline containing calcium and magnesium
  • micronized tuberculin vaccine 150 ⁇ l of microparticulated tuberculin suspension (containing tuberculin at a concentration of 3 ⁇ g / ml) was added, and 50 ⁇ l of PBS (+) was further added. This was designated as a micronized tuberculin vaccine.
  • an eppendorf tube containing 200 ⁇ ⁇ of 5K / ml 0K432 (Chugai Pharmaceutical, Picibanil 5KE) diluted 10-fold with PBS (+) was also prepared. did. This was the vaccine for the positive control group.
  • mice C57L / J strain, 6-9 weeks old, female syngeneic with Hepa 1-6 were intradermally injected with this microparticled tuberculin vaccine at 50 ⁇ / mouse. This was repeated one week later.
  • mice in the control group were injected with Dulbecco's phosphate-buffered saline without calcium (magnesium) alone (PBS (-)).
  • PBS (-) Dulbecco's phosphate-buffered saline without calcium (magnesium) alone
  • the positive control group was similarly injected with the positive control group vaccine prepared in 6) above.
  • Hepa 1-6 cells (1 107 cells / 0 2 ml PBS (-. )) Were injected into the right leg subcutaneously.
  • micronized tuberculin vaccine prepared by the same procedure up to the above step 6) (however, the micronized tuberculin used at the time of this vaccine preparation contains tuberculin at a concentration of 2 ⁇ g / ml) was injected intradermally at 50 ⁇ / mouse.
  • mice in the control group were injected with PBS (-) only.
  • the positive control group was similarly injected with the positive control vaccine prepared in 6) above.
  • Fig. 1 shows the results. This is the Kaplan-Meyer curve for the control group, the microparticles of the tuberculin vaccine administration group, and the positive control group.
  • Group administered with micronized tuberculin vaccine Showed a statistically significant difference between the control group and the survival rate (log-rank test, p ⁇ 0.0001). In addition, it showed a better antitumor effect than the positive control group.
  • Example 2 Prevention of tumor recurrence by micronized tuberculin administered into tumor tissue after microwave coagulation
  • mice 1 C57BL / 6 mice 1 X 10 6 syngeneic lung cancer cell right leg subcutaneously (female, 1 group 6 mice) (Lewis Lung Carcinoma cell line) injection, approximately 75 mm 3 subcutaneous lung cancer tissue on day 8 When it reached, anesthetized with pentoparbital sodium, wounded the skin beside the lung cancer tissue, and from there, Microtaze endoscopy-use mono-ball type electrode (E-24N, diameter
  • This electrode was connected to a Microtaze (HSE-8M, manufactured by Azdell), and irradiated with a microphone mouth wave at 10 W for 3 minutes to apparently completely coagulate the cancer tissue.
  • HSE-8M Microtaze
  • FIG. Each point is the average lung cancer tissue size of 6 mice. In the observations up to 33 days after the transplantation of lung cancer cells, recurrence of lung cancer tissue was clearly suppressed in group a as compared to groups b and c.
  • the immunoadjuvant of the present invention can efficiently exert a strong adjuvant activity while avoiding an undesirable state for a living body.

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Description

免疫アジュバント 技術分野
本発明は免疫アジュバントに関するものである。 背景技術
ッベルクリンは古くから結核菌明感染歴検出用試験薬として、 あるいは
Mycobacterium bovis BCG (以下、 BCG) 田投与後の陽転検出用試験薬として使用さ れてきた。 ッベルクリン中の蛋白成分を硫安沈殿法により精製した精製ッベルク リンでは、 それ自体を繰り返しヒトに投与したとしても、 いわゆるッベルクリン 反応試験において多少のブースター効果は認められているが （Singh, D. et al. , Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, Sep 15 ; 164 (6) : 962- 4)、 過剰な皮膚炎症 反応には至らず、 極めて安全なものである。
本発明者らは、 固体化又は微粒子化した腫瘍組織を少なくとも 1種類のサイト 力イン又はサイトカイン誘導剤とともに体内に投与することにより、 効率よく腫 瘍細胞に対する抗腫瘍免疫反応を誘導できることを見出した （PCT/JP00/00692)。 この際、 一般的な免疫アジュパントとして精製ッベルクリンを可溶性の状態のま ま同時に投与することにより、 さらに強力な腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫反応を 誘導できることも見出している （PCT/JP00/0692)。 このように、 ッベルクリンの 成分は免疫アジュパントとしても利用できるが、 ッベルクリン成分が可溶性であ ることから、 拡散により投与局所から速やかに消失してしまうという欠点があつ た。
—方、 M. tuberculosis の培養濾過液中の成分は、 溶解状態では弱いアジュパ ント活性しかないが、 ポリスチレン微粒子に結合することによって T細胞反応を 促進することが知られている （Wilkinson, K. A.， et al. , J. Immunol. Methods, 235 : 1-9， 2000)。 すなわち、 溶解状態のアジュバントを不溶性のアジュバントキ ャリア一上に固定すれば、 急速に拡散消失せず、 強いアジュバント活性を示すよ うになる。 もっとも、 この固定化物におけるポリスチレン微粒子は抗原提示細胞 に貪食されるものの、 細胞内で分解されずに体内に残存する望ましからざるブラ スチックとなる。
この問題点を解決する方法として、 この文献中には、 生分解性合成高分子の微 粒子に細菌の培養濾過液中の成分を結合させる方法も引用されている (Vordermeier, H. M.， et al. , Vaccine, 13， 1576 - 1582， 1995； Ertl, H. C. , et al. , Vaccine, 14, 879-885， 1996； Jones D. H. , et al. , J. Biotechnology, 44, 29 - 36， 1996； Venkataprasad, N.， et al. , Vaccine, 17, 1814 - 1819， 1999)。 た, だし、 記載された合成高分子 poly (DL-lactide co-glycolide) (PLG) は分解時 に乳酸を発生し、 分解局所環境を酸性化することがわかっており、 やはり生体に とっては望ましいものではない。
以上のように、 腫瘍免疫学の分野では、 固体状及び生分解性であり、 かつ上述 のような望ましからざる作用がないアジュバントが望まれている。 また、 従来の 技術では、 複雑多岐にわたる腫瘍抗原を含む腫瘍組織又は腫瘍細胞を同系動物個 体の体内で物理的に変性した上で当該変性組織中に免疫アジュバントを投与した 場合、 生きている当該腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫反応を効率的に刺激できる免 疫アジュバントはなかった。
発明の開示
上述のように、ッベルクリンは溶解状態では弱いアジュパント活性しかないが、 繰り返しヒトに投与したとしても極めて安全である。 本発明の課題は、 ッベルク リンを用いて、 生体にとっては望ましからざる状態を避けつつ、 強いアジュパン ト活性を効率的に発揮することができる免疫アジュバントを提供することにある 本発明者らは上述の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 ッベルクリンを 徐放性製剤とすることにより高いアジュバント活性が得られることを見出した。 また、 本発明者らは、 ッベルクリンの徐放化にあたり、 アルブミンとへパリンを 混合してコアセルべーションによる沈殿を形成するとッベルクリン蛋白がこの沈 殿中に巻き込まれて不溶性微粒子が形成されること、 及びこの不溶性微粒子を抗 原および可溶性の精製ッベルクリンとともに体内に投与すると強力な腫瘍防御効 果を示し、 熱変性した体内腫瘍組織に投与すると強力な抗腫瘍免疫反応を誘導で きることを見出した。 本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。 すなわち、 本発明により、 免疫アジュバントであって、
(a)可溶性蛋白 （ただしッベルクリンに含有される可溶性蛋白を除く） ；及ぴ
(b)ムコ多糖
のコアセルべーションによる沈殿を含み、 さらに該沈殿とともに共沈殿した
(c)ッベルクリンに含有される可溶性蛋白 - を含む免疫アジュバントが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、 成分 (a)の可溶性蛋白がアルブミンであり、 成分 (b)のムコ多糖がへパリンである上記の免疫アジュバント；沈殿物が蛋白分子 間架橋剤により架橋された上記の免疫アジュバント；及び上記成分 (c)がッベルク リンに含有される可溶性蛋白及び抗原性のある可溶性蛋白の組み合わせである上 記の免疫アジュバント ；抗原性のある該可溶性蛋白が腫瘍 ffi織、 腫瘍細胞、 腫瘍 細胞成分、 及び Z又は腫瘍抗原べプチドである上記の免疫アジュバントが提供き れる。
別の観点からは、免疫アジュバントであって、 （c)ッベルクリンに含有される可 溶性蛋白と（d)不溶性蛋白分子とを含み、上記成分 (c)及び (d)が蛋白分子間架橋剤 により架橋された不溶性微粒子形態である免疫アジュバントが本発明により提供 される。 この発明の好ましい態様によれば、 不溶性蛋白分子がコラーゲンである 上記の免疫アジュバントが提供される。
さらに別の観点からは、 抗原と混合した後、 ヒトを含む哺乳類動物の体内に投 与して該抗原に対する全身性免疫反応を誘導するための上記の免疫アジュバン ト；該抗原が腫瘍組織、 腫瘍細胞、 腫瘍細胞成分、 及び/又は腫瘍抗原べプチド である上記の免疫アジュバントが提供される。
さらに、 上記の免疫アジュバントを含む腫瘍ワクチンが本発明により提供され る。 この発明の好ましい態様によれば、 物理的手段で変性させた腫瘍組織内に投 与することにより抗腫瘍免疫反応を誘導するための上記の腫瘍ワクチン；物理的 手段がマイクロウエーブ照射、 ラジオフリークエンシー凝固法、 凍結凝固法、 電 気メス加熱、熱水注入、アルコール注入、塞栓法、放射線照射、 レーザー光照射、 及び超音波破壊からなる群から選ばれる手段である上記の腫瘍ワクチン；体外で 免疫担当細胞と混合してから投与することにより体内における免疫反応を刺激す るための上記の腫瘍ワクチン；免疫担当細胞が、 樹状細胞、 B リンパ球、 Tリン パ球、 及ぴナチュラルキラー細胞からなる群から選ばれる上記の腫瘍ワクチン； 及び体外で免疫担当細胞及び抗原と混合して投与するための上記の腫瘍ワクチン が提供される。
さらに別の観点からは、 全身性免疫反応の誘導方法であって、 ヒトを含む哺乳 類動物に上記の免疫アジュバントを投与する工程を含む方法；腫瘍の治療方法で あって、 物理的手段で変性させた腫瘍組織内に上記の腫瘍ワクチンを投与するェ 程を含む方法；抗腫瘍免疫反応を誘導する方法であって、 物理的手段で変性させ た腫瘍組織内に上記の腫瘍ワクチンを投与する工程を含む方法；及び、 あらかじ め上記の腫瘍ワクチンと免疫担当細胞とを体外で混合してからヒトを含む哺乳類 動物の体内に投与し、 体内における免疫反応を刺激する方法が提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の腫瘍ワクチンによる肝癌増殖抑制効果を示した図である。 点線は累積生存率（対照群）、実線は累積生存率（微粒子化ッベルクリンワクチン 投与群、 細点線は陽性対照群を示す。
第 2図は、 マイクロウエーブ凝固後の腫瘍組織中に投与した本発明の腫瘍ワク チンによる腫瘍再発防御効果を示した図である。 発明の実施するための最良の形態
本発明の免疫アジュバントは、
(a)可溶性蛋白 （ただしッベルクリンに含有される可溶性蛋白を除く） ；及ぴ
(b)ムコ多糖 （ただし上記（a)の可溶性蛋白とコアセルべーションにより沈殿を生 成するムコ多糖である）
のコアセルべーションによる沈殿を含み、 さらに該沈殿とともに共沈殿した
(c)ッベルクリンに含有される可溶性蛋白
を含むことを特徴としている。
上記の（a)可溶性蛋白及び (b)ムコ多糖の組み合わせとしては、 両者が当業者に 周知の条件下でコアセルべーシヨンによる沈殿を生成するものであれば特に限定 されることはない。 コアセルべーシヨンについては、 例えば米国特許第 5， 7 5 9， 5 8 2明細書に詳細に技術的説明が記載されているが、 この用語はいかなる 意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈しなければならない。 例えば (a)可溶性蛋白としてアルブミン、ムコ多糖としてへパリンを好ましく用い ることができるが、 （a)可溶性蛋白及ぴ (b)ムコ多糖の組み合わせは上記の組み合 わせに限定されることはない。 ッベルクリンに含有される可溶性蛋白としては、 例えば精製ッ ルクリンの全蛋白を用いることができるほか、 当業者に周知の方 法でッベルクリンから調製した可溶性蛋白の全部又はその一部を用いることがで きる。 上記の 3成分を攪拌することにより成分（a)と成分 (b)のコアセルべーショ ンによる沈殿が生成するが、その際に成分（c)が該沈殿に取り込まれて共沈殿して 沈殿物を与える。
(c)ッベルクリンに含有される可溶性蛋白と（a)可溶性蛋白との比率は特に限定 されず、 （a)可溶性蛋白及ぴ（b)ムコ多糖がコアセルべーシヨンを起こす範囲内で あればいかなる比率であってもよい。 一例を挙げれば、 pH 2. 5の 2. 5%ヒト血清 アルブミン溶液を可溶性蛋白として用いる場合、 ムコ多糖として約 5 mg/mlの巿 販へパリン溶液を用い、 600 μ 1のムコ多糖に対してッベルクリンの可溶性蛋白を 2. 5 溶解した後、 この混合物を撹拌しつつ上記ヒ ト血清アルブミン溶液を容 量比で 1/1. 75、 1/1. 5、 1/1. 25、 1/1となるように変化させつつ滴下し、 コアセル ベーシヨンによる微粒子を形成する。 この懸濁液を遠心し、 その上清のタンパク 質含量を定量し、 混合したタンパク質のほとんどが微粒子に取り込まれる容量比 を選ぶのが好ましい。 もっとも、 成分（a)ないし（c)の比率やコアセルべーシヨン の条件などは当業者が適宜選択できることは言うまでもない。 得られる沈殿に含 まれる微粒子の粒径は通常 1 m以下である力 S、特定のサイズに限定されるもので はない。
得られた沈殿、 好ましくは微粒子状沈殿はそのまま免疫アジュパントとして用 いることができるが、 必要に応じて沈殿を蒸留水で洗浄してもよい。 また、 沈殿 を安定化するため、 蛋白分子間架橋剤を作用させることにより架橋を形成して不 溶性の微粒子を形成してもよい。 蛋白分子間架橋剤の種類は特に限定されず、 当 業者に周知のものを周知の方法で用いることができる。 例えば、 1-ェチル -3- (3 - ジメチルァミノプロピル）カルポジィミ ドを 20 mg/mlの水溶液とし、 終濃度 0. 8 〜1. 5 mg/ml になるようにボルテックスミキサーで混ぜながら加え、 その後、 室 温で 15分間静置すれば、沈殿中の蛋白分子間に十分安定な架橋が形成される。 も つとも、 架橋形成は、 上記の特定の条件又は特定の蛋白分子間架橋剤に限定され るものではない。 上記のようにして得られる免疫アジュバント、 好ましくは架橋 処理された免疫アジュパントは、 水で洗浄しても溶解することはなく、 本発明の 免疫アジュバントとして好適に用いることができる。
また、 本発明の別の好ましい態様によれば、 抗原性のある可溶性蛋白とッベル クリンに含有される可溶性蛋白とを混合しておき、上記（c)に替えてこの混合物を 用いて上記と同様にして沈殿物を得ることにより抗原性のある可溶性蛋白とアジ ュバント活性のあるッベルクリン可溶性蛋白とを含む免疫アジュパントを製造す ることができる。
別の観点からは、 蛋白分子間架橋剤により架橋されたッベルクリンに含有され る可溶性蛋白と不溶性蛋白分子とを含む不溶性微粒子形態の免疫アジュバントが 本発明により提供される。 不溶性蛋白分子としては生分解性の不溶性蛋白分子を 用いることができる。 例えば、 コラーゲンを用いることができるが、 必ずしもこ れに限定されるものではなく、 生体内で分解される不溶性蛋白分子であれば、 い かなるものも用いることができる。 蛋白分子間架橋剤の種類は特に限定されず、 当業者に周知のものを周知の方法で用いることができる。例えば、卜ェチル- 3- (3- ジメチルァミノプロピル）カルポジィミドなどを用いることができる。微粒子の粒 径は通常 Ι μ πι以下が好ましいが、 特定のサイズに限定されるものではない。
本発明の免疫アジュパントは、 一般的な免疫アジュバントとして使用できる。 単純に抗原と混合し、 ヒトまたは動物の体内に投与することにより該抗原に対す る全身性免疫反応を誘導できる。その抗原が腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、 及び/又は腫瘍抗原ペプチドである場合は、 腫瘍ワクチンとして利用できる。 例 えば、 患者から分離して固定化した癌細胞と本発明の免疫アジュパントとを混合 して患者の皮内に注射すれば、 患者の体内において当該癌細胞に対する抗腫瘍免 疫反応を誘導できる。 もっとも、 本発明の免疫アジュバントの使用方法は上記の ものに限定されることはなく、 免疫アジュバントを用いる通常の形態のいずれの 方法を用いても良い。
さらに、 患者の体内にある腫瘍組織を物理的手段によって変性させた後、 その 組織内に本発明の免疫アジュバントを投与することにより、 患者の体内に生残し ている腫瘍細胞に対して抗腫瘍免疫反応を誘導することができる。 腫瘍組織の物 理的変性の手段は特に限定されないが、 例えば、 マイクロウエーブ照射、 ラジオ フリークエンシー凝固法、 凍結凝固法、 電気メス加熱、 熱水注入、 アルコール注 入、 塞栓法、 放射線照射、 レーザー光照射、 超音波破壌等の手段を採用すること ができる。 もっとも、 これらに限定されるものではなく、 腫瘍組織内にある腫瘍 細胞の細胞死を誘導することができる手段であればいかなるものを用いてもよい。 2以上の物理的手段を適宜組み合わせてもよい。
例えば、 腫瘍組織をマイク口ウェーブ照射により加熱凝固し、 その凝固組織内 に本発明の免疫アジュパントを投与すると、 当該腫瘍組織内部やその周辺に生残 している腫瘍細胞に対して抗腫瘍免疫反応を誘導できる。 本発明の免疫アジュバ ントを投与するに際して、 ッベルクリン溶液を同時に投与することも好ましい。 もっとも、 本発明の免疫アジュバントの投与方法は上記の態様に限定されるもの ではなく、 当該変性腫瘍 ,祖織に集まってくる抗原提示細胞に本発明の免疫アジュ バントが変性腫瘍組織に含まれる腫瘍抗原とともに取り込まれる力、 又は本発明 の免疫アジュバントが抗原提示細胞を直接刺激できる環境を与えるものであれば、 いかなる方法を採用してもよい。
また、 あらかじめ本発明の免疫アジュパントと免疫担当細胞とを体外で混合し てから患者の体内に投与し、 体内における免疫反応を刺激することもできる。 そ の免疫担当細胞としては、 樹状細胞、 Bリンパ球、 Tリンパ球、 及び/またはナ チュラルキラー細胞などを好ましく用いることができるが、 これらに限定される ものではない。
さらに別の観点からは、 上記の免疫アジュパントを有効成分として含むワクチ ンが本発明により提供される。 このワクチンを投与するに際しては、 免疫担当細 胞を同時に混合してもよい。 また抗原として腫瘍組織及び/又は腫瘍細胞を混合 して用いることも可能であり、 このようにして得たワクチンを該腫瘍が由来した 患者に投与することにより腫瘍を治療することができる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。 本実施例において調製される本発明の免疫ァ ジュバントを微粒子化ッベルクリン （又はその類似語） と呼ぶ場合がある。
例 1 ：本発明'の腫瘍ワクチンによる肝癌増殖抑制効果
A. 材料及び方法
1 . 免疫アジュパントの作製
1 ) 25% ヒト血清アルブミン溶液 (HSA, Baxter Albumac, Baxter) を滅菌水で
2. 5%になるように希釈し、 4N HC1 で pH 2. 5 に合わせた。
2 ) 予めこの 2. 5% ヒト血清アルブミン溶液とへパリン溶液 （ノポ.へパリン注 1000、 1000 単位/ ml、約 7. 69mg/ml以下、アベンテイスファーマ株式会社）を様々 な割合で混合し、 へパリン溶液の至適混合比を決定した。 至適混合比は、 当初適 当な混合比でマイクロパーティクルを作成し、 2， 500 rpm (1300 g) にて 15分遠 心し、 その上清のタンパク質含量をプロテインアツセィキット 1 (日本バイオ' ラッド ラポラトリーズ、 東京） にて定量し、 混合したタンパク質の 99. 9%以上 がマイクロパーティクルに取り込まれる条件とした。
3 ) ッベルクリン （日本ビーシージ一製造株式会社、 一般診断用精製ッベルクリ ン （PPD) —人用、 標準品 0. 25 相当量） を注射用へパリン溶液に懸濁し、 ポ ルテックスミキサーで混ぜながら、 あらかじめ決めておいた割合で 2. 5%ヒト血 清アルブミン溶液を滴下した。
4 ) 4, 300 rpm (1300 g)で 15 分遠心し、 滅菌蒸留水で 2回洗い、 滅菌蒸留水に 再懸濁した 6
5 ) 1-ェチル- 3- (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジィミ ド溶液 （EDC、 SIGMA. 水に溶解し 20 mg/mlとしたもの） を終濃度 0. 8〜1· 5 mg/ml になるようにボルテ ックスミキサーで混ぜながら加え、 その後、 室温で 15分間静置した。
6 ) 4， 300 rpm (1300 g)で 15分遠心し、 滅菌蒸留水で 6回洗い、 必要な濃度とな るように滅菌生理食塩水に再懸濁した。 これを微粒子化ッベルクリン懸濁液とし た。
2 . 腫瘍ワクチンによるマウス肝癌増殖抑制効果測定
1 )直径 10cmのプラスチック培養デイツシュにコンフルェントになるまで培養し た肝癌細胞 Hepa 1-6を、 3%パラホルムアルデヒド溶液で室温下に 2時間固定した。 カルシウム ·マグネシウム含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 （PBS (+) ) で十 分洗浄し、 70%エタノールで更に洗浄滅菌し、 再度 PBS (+)で十分洗浄した。
2 ) これに DMEM培地をディッシュあたり 10m 1加え、 2日間 37°Cでインキュべ 一トした。
3 ) PBS (+)で十分洗浄後、 ポリ- L-リジン溶液 （25 μ g/ml) をディッシュあたり 3 ml加え 2時間インキュベートした。 4 ) PBS (+)で十分洗浄後、 スクレーパーで全部の固定細胞をかき集め、 PBS (+) に懸濁した。 ，
5 ) 4ディッシュ分の細胞に相当する 200 μ 1をエツペンドルフチューブに入れ、 ッベルクリン溶液 100 μ \ (0. 25 μ g/100 μ ΐ PBS (+) ) を添加、 2時間インキ ュベートした。
6 ) 微粒子化ッベルクリン懸濁液 150 μ 1 (ッベルクリンを 3 μ g/mlの濃度で含 む） を加え、 さらに 50 μ ΐ の PBS (+)を添加した。 これを微粒子化ッベルクリン ワクチンとした。 このとき、微粒子化ッベルクリンと PBS (+)の代わりに、 5KE/ml の 0K432 (中外製薬、 ピシバニール 5KE) を PBS (+)で 10倍希釈したもの 200 μ ϊ を加えたエツペンドルフチューブも作製した。 これは陽性対照群用ワクチンとし た。
7 ) 肝癌細胞 Hepa 1-6と同系のマウス (C57L/J系統、 6 - 9週齢、 ォス） 9匹に、 この微粒子化ッベルクリンワクチンを 1匹あたり 50 μ ΐ皮内注射した。 1週間後 にこれを繰り返した。 対照群のマウス 9匹には、 カルシウム 'マグネシウム不含 ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 （PBS ( -) ) のみを注射した。 また、 陽性対照群 には、 上記 6 ) で作製した陽性対照群用ワクチンを同様に注射した。
8 ) さらに 1週間後、 Hepa 1-6 細胞 （1 107個/0. 2 ml PBS (-)） を右脚皮下に 注射した。
9 ) このチャレンジの後、 上記 6 ) の段階まで同様な操作で作製した微粒子化ッ ベルクリンワクチン (ただし、 このワクチン作製時に用いた微粒子化ッベルクリ ンはッベルクリンを 2 μ g/mlの濃度で含むものであった） を 1匹あたり 50 μ ΐ 皮内注射した。 対照群のマウス 9匹には、 PBS (-)のみを注射した。 また、 陽性対 照群には、 上記 6 ) で作製した陽性対照群用ワクチンを同様に注射した。
10) 以後、 皮下肝癌が増大した後のマウスの生存率を測定した。
Β . 結果
結果を第 1図に示す。 これは対照群、 微粒子化ッベルクリンワクチン投与群、 陽性対照群の Kaplan- Meyerカーブである。微粒子化ッベルクリンワクチン投与群 は、 統計的有意差をもって対照群よりも生存率がよかった （log- rank test, pく 0. 0001)。 しかも、 陽性対照群よりも優れた抗腫瘍効果を示した。 例 2： マイクロウエーブ凝固後の腫瘍組織中に投与した微粒子化ッベルクリンの 腫瘍再発防御効果
A. 材料及び方法
1 . 微粒子化ッベルクリンの作製は例 1の 1 . に従った。
2 . C57BL/6マウス（雌、 1群 6匹）の右脚皮下に 1 X 106個の同系肺癌細胞（Lewis Lung Carcinoma細胞株）を注射、 8日目に皮下肺癌組織がほぼ 75mm3に達した際、 ペントパルビタールナトリゥム麻酔し、肺癌組織脇の皮膚に傷を入れ、そこから、 癌組織内に Microtaze endoscopy- use mono-ball type electrode (E-24N, 径
2. 4mm)を差し込んだ。
3 . Microtaze (HSE - 8M型、 ァズゥエル社製）にこの electrodeをつなぎ、 10Wで 3分間マイク口ウェーブを照射、 見かけ上は完全に癌組織を熱凝固させた。
4 . 傷口を縫い合わせ、 10日目にッベルクリン溶液 （精製ッベルクリン 25 ngを 25 μ ΐ の生理食塩水中に溶解） と、懸濁した微粒子化ッベルクリン（精製ッベル クリンとして 50 ngを含有、 5 μ 1の生理食塩水に懸濁）を癌組織内に注射した。 14日目にもう一度、 この注射を繰り返した （a群）。 対照群 （b群） のマウスには マイクロウエーブの照射だけを施した。 また、 マイクロウエーブを照射しない対 照群 （c群） も設け、 微粒子化ッベルクリンの代わりに 0K- 432 (1 KE/25 1) を 使用した群 （d群）、 ッベルクリン溶液の代わりに 0K- 432 (1 KE/25 μ ΐ) を使用 した群 （e群） も設けた。
5 . 以後、 再発して腫脹してくる癌組織のサイズ （匪3) を経時的に測定した。
B . 結果
結果を第 2図に示す。 各点は 6匹のマウスの肺癌組織サイズの平均値である。 肺癌細胞移植後 3 3日目までの観察において、 b群、 c群に比較して a群では明ら かに肺癌組織の再発は抑制されていた。 特に、 微粒子化ッベルクリンとッベルク リン溶液を含む a群では、 6匹中 1匹も： S発がなく、 完全に抑制されていたのに 対し、 微粒子化ッベルクリンを含まない d群、 および、 ッベルクリン溶液を含ま ない e群では、 マイクロウエーブ照射後に一端縮小した後、 再度成長してきた糸且 織のそれぞれが小さい癌組織であり、 b群、 c群に比較して癌の増殖は抑制されて はいるものの、 6匹中 5匹に再発が見られた （表 1 )。 表 1 肺癌細胞移植後の再発
— 1群 6匹中、 肺癌が再発したマウス数 マイクロウェーブ照射 +ッベルクリン溶液 +微粒子化ッベルクリン 0 マイクロウエーブ照射 5 マイクロウェーブ照射なし 6 マイクロウェーブ照射 +0K- 432 +ッベルクリン溶液 5 マイクロウェーブ照射 + 0K-432 +微粒子化ッベルクリン 5 産業上の利用可能性
本発明の免疫アジュバントは、生体にとっては望ましからざる状態を避けつつ、 強いアジュバント活性を効率的に発揮することができる。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 免疫アジュバントであって、
(a)可溶性蛋白 （ただしッベルクリンに含有される可溶性蛋白を除く） ；及び
(b)ムコ多糖
のコアセルべーションによる沈殿を含み、 さらに該沈殿とともに共沈殿した
(c)ッベルクリンに含有される可溶性蛋白
を含む免疫アジュパント。
2 . 成分 (a)の可溶性蛋白がアルブミンであり、 成分 (b)のムコ多糖がへパリンで ある請求の範囲第 1項に記載の免疫アジュバント。
3 . 沈殿物が蛋白分子間架橋剤により架橋された請求の範囲第 1項又は第 2項に 記載の免疫アジュパント。
4 .上記成分 ( が、ッベルクリンに含有される可溶性蛋白及び抗原性のある可溶 性蛋白の組み合わせである請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載 の免疫アジュバント。
5 . 抗原性のある該可溶性蛋白が腫瘍組織、 腫瘍細胞、 腫瘍細胞成分、 及び 又 は腫瘍抗原べプチドである請求の範囲第 4項に記載の免疫アジュパント。
6 . 免疫アジュバントであって、
(c)ッベルクリンに含有される可溶性蛋白；及び
(d)不溶性蛋白分子
を含み、 上記成分 (c)及び (d)が蛋白分子間架橋剤により架橋された不溶性微粒子 の形態である免疫アジュバント。
7 . 不溶性蛋白分子がコラーゲンである請求の範囲第 6項に記載の免疫アジュバ ント。
8 . 抗原と混合した後、 ヒトを含む哺乳類動物の体内に投与して該抗原に対する 全身性免疫反応を誘導するための請求の範囲第 1項ないし第 7項のいずれか 1項 に記載の免疫アジュバント。
9 . 該抗原が腫瘍組織、 腫瘍細胞、 腫瘍細胞成分、 及び Z又は腫瘍抗原ペプチド である請求の範囲第 8項に記載の免疫アジュバント。
1 0 . 請求の範囲第 1項ないし第 9項のいずれか 1項に記載の免疫アジュパント を含む腫瘍ワクチン。
1 1 . 物理的手段で変性させた腫瘍組織内に投与することにより抗腫瘍免疫反応 を誘導するための請求の範囲第 1 0項に記載の腫瘍ヮクチン。
1 2 . 物理的手段がマイクロウエーブ照射、 ラジオフリークエンシー凝固法、 凍 結凝固法、 電気メス加熱、 熱水注入、 アルコール注入、 塞栓法、 放射線照射、 レ 一ザ一光照射、 及び超音波破壊か bなる群から選ばれる手段である請求の範囲第 1 1項に記載の腫瘍ワクチン。
1 3 . 体外で免疫担当細胞と混合してから投与することにより体内における免疫 反応を刺激するための請求の範囲第 1 0項ないし第 1 2項のいずれか 1項に記載 の腫瘍ワクチン。
1 4 . 免疫担当細胞が、 樹状細胞、 Bリンパ球、 Tリンパ球、 及びナチュラルキ ラー細胞からなる群から選ばれる請求の範囲第 1 3項に記載の腫瘍ヮクチン。
1 5 . さらに体外で抗原と混合して投与するための請求の範囲第 1 3項又は第 1 4項に記載の腫瘍ワクチン。
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