KR102638773B1 - 점막점착성-plga 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 점막점착성 나노입자를 이용한 비주사형 약물전달 시스템으로서, 나노입자 표면에 점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)를 결합시킴으로써, 점막 수분 등에 의한 나노입자의 변형을 방지하고 점막 점착력을 강화시켜 유실을 방지하는 점막점착성 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 점막점착성 나노입자를 포함하는 항원제시세포 성숙화용 조성물, 감염성 질환 치료용 조성물 및 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수지상 세포(Dendritic Cell, DC)를 비롯한 항원제시세포 기반 암치료 면역요법을 위한 면역활성물질(항원 및 어쥬번트 등)을 탑재한 점막점착성 나노입자 및 이를 포함하는 면역항암치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

점막점착성-PLGA 나노입자{Mucoadhesive-PLGA nanoparticles}
본 발명은 점막점착성 나노입자를 이용한 비주사형 약물전달 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 표면에 점막점착성 고분자가 결합된 점막점착성-PLGA 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이며, 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 포함하는 항원제시세포 성숙화 유도용 조성물, 감염성 질환 치료용 조성물 및 암치료용 조성물에 관한 것이다.
면역 요법(immunotherapy)은 환자 자신의 면역체계를 이용하여 암을 치료하는 방법으로서, 수술, 화학요법, 방사선 요법 등과 더불어 현재 주로 행해지는 암 치료방법의 하나이다. 이러한 암 치료방법 중 면역 요법은 가장 부작용이 적고 안전하며 효과가 높은 것으로 여겨지고 있다.
면역 요법에 사용되는 면역 항암제 중, 특히 수지상 세포(Dendritic Cell, DC)를 기반으로 한 방법이 활발히 연구되고 있다. 수지상 세포는 대표적인 항원 제시 세포로서, 종양 특이적 항원을 제시하여 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 종양 특이적 활성화를 도움으로써 항암 면역을 강화시키는 역할을 한다. 이와 같은 수지상 세포 기반 면역 요법의 효과적인 치료 효능을 달성하기 위해서는 항원 전달이 첫 번째 핵심 단계이다. 이를 위해 주사기 기반 투여 방법이 일반적으로 활용되고 있으나, 주사기 기반 투여는 혈관 쇠약, 혈관 수축, 혈관 폐쇄 등의 부작용뿐만 아니라, 바늘 공포증, 주사 거부 반응 등과 같은 심각한 증상이 빈번히 발생하는 문제가 있다. 따라서 주사기를 사용하지 않으면서 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 대체 주입 경로 및 전달 방법이 요구되고 있는 실정이다.
이와 관련하여, 구강 또는 비강에 분무하여 점막을 통한 약물전달 방식을 이용하는 비주사형 약물전달 치료제에 대한 연구가 진행되고 있으나, 약물을 탑재한 나노입자의 점막 점착성이 낮아 대부분 점막에 점착되지 못하고 유실되어 소화기 등으로 전달되는 문제가 있다. 관련 선행기술로 대한민국공개특허 제10-2021-0057072호 및 대한민국공개특허 제10-2021-0124277호 등에서 나노입자에 약물을 탑재하여 분무하거나 흡입하는 등의 약물전달 방법이 개시된 바 있으나, 상기 선행기술들은 나노입자에 약물을 탑재하기 위하여 약물제제를 제형화하는 기술 또는 나노입자의 비강 흡입 등을 통하여 폐를 통해 체내로 전달하는 기술 등에 주된 특징이 있는 것으로, 나노입자의 점막 점착성을 개선하는 것과 관련하여서는 전혀 개시하고 있는 바가 없다. 또한, 나노입자를 이용한 암치료제 선행기술의 대부분은 나노입자에 항암제에 해당하는 화학 의약품을 탑재하여 표적 위치(암세포, 종양)에 직접 전달하는 것을 주된 기술적 특징으로 하고 있어, 수지상 세포를 포함한 항원제시세포 기반 면역요법에 활용되기에 적합하지 않은 한계가 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 개발된, 점막점착성 나노입자를 이용한 비주사형 약물전달 시스템으로서, 나노입자 표면에 점막점착성 고분자를 결합시킴으로써, 점막 수분 등에 의한 나노입자의 변형을 방지하고 점막 점착력을 강화시켜 유실을 방지하는 점막점착성 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 점막점착성 나노입자를 포함하는 항원제시세포 성숙화용 조성물, 감염성 질환 치료용 조성물 및 암치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 수지상 세포(Dendritic Cell, DC)를 비롯한 항원제시세포 기반 암치료 면역요법을 위한 면역활성물질(항원 및 어쥬번트 등)을 탑재한 점막점착성 나노입자 및 이를 포함하는 면역항암치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로 본 발명은 PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide)) 나노입자의 표면에 점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)가 결합된 점막점착성-PLGA 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 항원제시세포(Antigen-presenting cells; APC)의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 상기의 기재에 국한되지 않으며 본 발명을 활용하여 적절한 효과를 얻을 수 있는 모든 경우를 목적으로 하여 제공된다.
본 발명은 PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide)) 나노입자의 표면에 점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)가 결합된, 점막점착성-PLGA 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 점막점착성 고분자가 카테콜(catechol; CAT), 카라기난(carrageenan), 젤라틴(gelatin), 펙틴(pectin) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 점막점착성-PLGA 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 점막점착성 고분자가 카테콜(catechol; CAT)인 것인, 점막점착성-PLGA 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자 내부에 항원을 함유하는 것인, 점막점착성-PLGA 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항원이 펩티드, siRNA 및 mRNA로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 점막점착성-PLGA 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자 내부에 어쥬번트(adjuvant)를 추가로 함유하는 것인, 점막점착성-PLGA 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 항원제시세포(Antigen-presenting cells; APC)의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항원제시세포가 수지상 세포(dendritic cell)인 것, 항원제시세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물이 구강 내 분무용인 것인, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물이 항원제시세포(Antigen-presenting cells; APC)의 성숙화를 유도하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물이 세포독성 CD8+ T 세포(cytotoxic CD8+ T-cell)를 활성화시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물이 구강 내 분무용인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 항원 및 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 수용액과, PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide))를 포함하는 유기용액을 혼합하는 단계; 및 b) 상기 혼합물에 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol; PVA)에 아미노기가 도입된 PVA-NH2 및 카복실기가 도입된 점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)가 서로 화학적으로 결합된 화합물을 혼합하는 단계; 를 포함하는, PLGA 나노입자의 표면에 점막점착성 고분자가 결합된, 점막점착성-PLGA 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 항원 및 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 수용액과, PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide))를 포함하는 유기용액을 혼합하는 단계; 및 b) 상기 혼합물에 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol; PVA)에 아미노기가 도입된 PVA-NH2 및 3,4-디히드록시히드로신남산(3,4-Dihyroxyhydrocinnamic acid; CAT-COOH)이 서로 화학적으로 결합된 화합물(PVA-CAT)을 혼합하는 단계; 를 포함하는, PLGA 나노입자의 표면에 카테콜(catechol; CAT)이 결합된 CAT-PLGA 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예로서 PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide)) 나노입자의 표면에 점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)가 결합된, 점막점착성-PLGA 나노입자를 제공한다.
본 발명에서, "점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)"는 점막, 특히 생체 내 점막, 예를 들어 구강 점막 또는 비강 점막 등에 대한 점착 능력이 있는 고분자로서, 생체에 적용할 수 있고 점막 점착성이 있는 고분자라면 제한없이 모두 포함할 수 있다. 상기 점막점착성 고분자의 비제한적인 예로 카테콜(catechol; CAT), 카라기난(carrageenan), 젤라틴(gelatin), 펙틴(pectin) 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG) 등 일 수 있다. 상기 점막점착성 고분자들은 점막, 특히 생체 내 점막, 예를 들어 구강 점막 또는 비강 점막 등에 대한 점착 능력이 우수하며, 부작용없이 생체에 적용할 수 있는 이점이 있다.
본 발명에서, 상기 점막점착성 고분자는 카테콜(catechol; CAT)일 수 있다.
본 발명에서, "카테콜(catechol; CAT)"은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 1, 2-디히드록시벤젠(1,2-dihydroxybenzene)이라고도 불린다.
[화학식 1]
본 발명에서 상기 카테콜은 PLGA 나노입자의 표면에 화학적 변형을 통해 결합되어, 물리적 얽힘, 수소결합, 소수성결합 또는 이온상호작용 등을 통해 나노입자의 점막에 대한 점착, 흡착, 고정 및 침착 능력을 증가시킬 수 있다. 또한 생분해성 및 무독성으로 생체 내 부작용없이 활용 가능하며, 수분 등을 포함하는 점막, 예를 들어 구강 점막, 비강 점막 등에서 화학적 상호작용을 통해 점막층 내 기능적 아민기(amine group), 티올기(thiol group) 또는 이미다졸기(imidazole group) 등에 고정되어질 수 있다.
본 발명에서, "PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide))"는 Poly(lactic acid)(PLA)및 Poly(glycolic acid)(PGA)의 공중합체로서, 하기의 화학식 2로 표시된다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에서, x는 락트산(lactic acid) 단위의 개수를 나타내고, y는 글리콜산(glycolic acid) 단위의 개수를 나타낸다.
본 발명에서 상기 PLGA의 락트산:글리콜산의 비율(x:y)은 특별히 제한되지 않으며, PLGA 나노입자 제조 시에 사용될 수 있는 비율로 사용될 수 있다. 상기 락트산: 글리콜산의 비율의 비제한적인 예로, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 또는 10:90의 비율로 사용할 수 있으며, 보다 상세하게는 30:70 내지 70:30, 더욱 상세하게는 약 40:60 내지 60:40 내외로 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 락트산: 글리콜산의 비율이 약 50:50 내외인 PLGA를 사용하였으며, 상기 범위로 사용하는 경우 PLGA 나노입자의 생체 내 분해속도가 보다 적절히 조절되어, 나노입자 내 탑재된 약물 등의 방출속도를 보다 적절히 조절할 수 있으며, 이에 생체 내 약물전달용 PLGA 나노입자 제조에 보다 적합할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 상기 점막점착성-PLGA 나노입자는 나노입자 표면에 점막점착성 고분자가 결합되어 있어, 점막 내 수분에 의한 나노입자의 변형을 방지하여 나노입자에 탑재된 약물의 유실을 방지함과 동시에, 나노입자의 점막에 대한 점착력을 강화시켜 나노입자가 점막에 효과적으로 점착, 고정 및 침착됨으로써, 약물의 유실을 방지하여 세포에 효과적으로 전달되는 이점이 있다.
본 발명에서 상기 점막은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자가 접촉하여 점착할 수 있는 점막, 특히 생체 점막을 의미하며, 비제한적인 예로 구강 점막 또는 비강 점막 등 일 수 있다.
본 발명에서 상기 점막점착성-PLGA 나노입자는 내부에 항원을 함유할 수 있다.
본 발명에서, "항원(antigen)"은 생체 내 유입되어 면역 반응을 일으키는 모든 물질의 총칭으로, 일반적으로 생체 내에서 외부물질로 인식되어 면역 반응성 상태를 유도하고, 이에 감작된 대상체의 면역 세포 또는 항체와 반응하는 모든 물질을 의미한다. 본 발명에서, 상기 "항원"은 "면역원"이라는 용어와 동일한 의미로 통칭되어 사용될 수 있으며, 숙주 면역 체계가 그 항원에 특이적인 분비성, 체액성 또는 세포성 면역 반응을 일으키도록 촉진할 수 있는 하나 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 분자를 포함하여 의미할 수 있다. 본 발명에서, 상기 항원의 비제한적인 예로 펩티드(폴리펩티드 및 단백질 포함), siRNA 또는 mRNA 등 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 항원으로 E7 단백질을 사용하였으며, 이러한 경우 본 발명의 점막점착성-PLGA 나노입자에 보다 우수한 효율로 탑재 및 생체 내로 전달될 수 있으며, 보다 효과적으로 항원제시세포에 전달되어 항원제시세포의 성숙화 유도 및 T 세포를 활성화시킴으로써, 나아가 암치료 면역요법 등에 효과적으로 활용될 수 있는 이점이 있다.
본 발명에서 상기 점막점착성-PLGA 나노입자는 내부에 어쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다.
본 발명에서, "어쥬번트(adjuvant)"는 도움 또는 보조 등의 의미로, 약리학또는 면역학적으로 다른 물질의 작용 등에 좋은 영향을 미치는 물질을 말하며, 면역 증강제, 면역 촉진제 등으로도 불린다.
본 발명에서 상기 어쥬번트의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야, 또는 관련 분야에서 사용되는 어쥬번트를 사용할 수 있다. 상기 어쥬번트의 비제한적인 예로, TLR3 어쥬번트(Poly I:C, Poly I:CLC(hiltonol), PolyI:C12U (ampligen), Poly I:C+CAF01 (CAF05)), TLR7/ TLR8 어쥬번트(Imiquimod(R-837), Resiquimod(R-848)) 또는 TLR9 어쥬번트(CpG ODN, CpG ODN+MPL/QS21(AS15)) 등 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 어쥬번트로 Poly I:C를 사용하였으며, 이러한 경우 항원과 함께 본 발명의 점막점착성-PLGA 나노입자에 우수한 효율로 탑재 및 생체 내로 전달되어 암치료 면역요법 등에 효과적으로 활용될 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 하나의 구체예로서, 상기 본 발명의 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 항원제시세포(Antigen-presenting cells; APC)의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "항원제시세포(Antigen-presenting cells; APC)"는 단백질 항원을 세포 내 이입(endocytosis)한 후, 항원 유래 펩티드 조각을 주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 분자와 함께 T 세포에 제시하여 이를 활성화하는 세포를 의미한다. 대표적인 항원제시세포로 수지상 세포(dendritic cell, DC), B 세포, 대식세포 등이 있으며, 이들은 생체 내에서 세포성 면역을 담당하는 주요 면역 세포에 해당한다. 이 세포들은 항원 유입 시, 이를 세포 내 이입한 후 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포(T 세포 등)가 항원을 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다.
상기 항원제시세포 중, 수지상 세포는 주로 피부, 코, 폐, 위 또는 장의 내벽등과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 특히 피부에 있는 세포를 랑게르한스 세포라 한다. 수지상 세포는 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있으며, 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작되게 하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 수지상 세포는 특정 발달 단계에서 수상돌기(dendrites)라고 불리는 돌기를 뻗는 것으로 알려져 있다.
수지상 세포는 조혈 골수 전구세포 (hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래하는 것으로, 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변화하며, 높은 엔도시토시스 활성 및 T-세포 활성 능력을 나타내는 것으로 알려져 있다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식하게 되는 데, 이것은 TLR (toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체 (pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능한 것으로 알려져 있다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 화학적 특징을 인식하며, 미성숙 수지상 세포는 살아있는 자가세포로부터 니블링(nibbling)이라는 과정을 통해 세포막을 탐식하게 된다. 이들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해해서, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC 분자를 이용하여 세포 표면에 나타나게 되는 동시에, CD (Cluster of Differentiation)80, CD86, 및 CD40과 같이 T-세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시키게 된다. 이를 비 항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T-세포, 킬러 T-세포뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킬 수 있다.
수지상 세포에 의해 생산되는 사이토카인은 세포의 유형에 따라 다르다. 림프구성 수지상 세포는 다량의 타입-1 IFN(Interferon)을 생산할 수 있으며, 이는 더 많은 활성화된 대식 세포를 모아서 탐식 작용을 가능하게 한다. 림프구성 수지상 세포는 중추와 말초 면역조절에 관여하고, 골수성 수지상 세포는 외래성 항원이나 감염에 대한 면역유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상 세포가 정상 기능을 못할 경우 당뇨병, 류마티스성 관절염, 알레르기성 과민반응과 같은 자가 면역 질환이 나타나거나 감염성 질환이나 암 발생에 대해 정상적인 면역반응이 일어나지 않게 될 수 있다. 위와 같이 수지상 세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는 데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 것은 수지상 세포를 이용한 세포 면역 치료에 중요한 과제가 되고 있다.
본 발명의 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 항원제시세포의 성숙화 유도용 조성물은 나노입자에 함유된 면역활성물질(예를 들어, 항원 및 어쥬번트 등)을 효과적으로 전달하여 미성숙 항원제시세포(예를 들어, 수지상 세포)의 성숙화를 유도하는 효과를 나타낸다. 이에 항원제시세포가 성숙되면 표면 단백질 표시 인자의 발현이 증가되어 T 세포의 활성을 유도함으로써 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
구체적으로, 성숙한 항원제시세포는 MHC I형 및 Ⅱ형 항원을 미성숙한 항원제시세포 보다 더 높은 수준으로 발현시키고, CD (Cluster of Differentiation) 80+, CD83+, CD86+를 조절할 수 있다. 더 많은 MHC 발현으로 항원제시세포 표면상에서 항원 밀도의 증가를 유도하는 하고, 동시-자극의 분자 CD80 및 CD86의 상향 조절로, T 세포 상에 CD28과 같은 동시-자극의 분자 상응물을 통해서 T 세포 활성 신호를 강화할 수 있다.
상기 항원제시세포의 성숙은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터할 수 있으며, 예를 들어 세포 표면 마커를 유세포 분석기(flow cytometry) 또는 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 분석 방법으로 검출할 수 있다. 또한 상기 세포를 사이토카인 생성 분석(예를 들어, ELISA 또는 FACS 등)을 통해 모니터할 수 있다.
본 발명에서 상기 항원제시세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 그 비제한적인 예로 수지상 세포(dendritic cell), 랑게르한스 세포, 대식세포(macrophage), 단핵세포(mononuclear cell) 또는 B 세포 등 일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 수지상 세포를 타겟으로 하였으며, 상기 수지상 세포는 선천성(innate) 및 적응(adaptive) 면역 시스템의 교량 역할을 하는 가장 강력한 항원제시세포의 하나로서 보다 우수한 면역활성을 발휘하는 이점이 있다.
본 발명의 다른 하나의 구체예로서, 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 감염성 질환의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 바이러스, 세균, 진균 등과 같은 여러 병원체에 의하여 감염되어 발생하는 질환을 총칭한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예로서, 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 암의 종류(구체적인 질환명 또는 질환 부위 등)는 특별히 제한되지 않으며, 항원제시세포가 성숙되고 T 세포 등의 면역 세포 활성화에 의하여 증세가 호전되거나 예방 또는 치료할 수 있는 모든 암을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 점막점착성-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 이를 직접 접촉시키는 국소 부위에 해당하는 암뿐만 아니라, 상기 약학적 조성물에 의하여 활성화된 T 세포 등의 전신순환을 통해 생체 내 여러 기관, 장기, 조직, 세포 등에 발생된 암, 종양을 치료할 수 있으며, 이에 전신 암 종에 대한 T 세포 매개 항암면역치료를 수행할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 구강 분무용 제형으로 제조하여 이용하는 경우, 특히 구강암 또는 두경부암 치료에 보다 효과적일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 점막점착성-PLGA 나노입자에 타겟하고자 하는 암/종양에 특이적인 항원 또는 어쥬번트를 탑재함으로써, 특정 암/종양 특이적 항암면역치료를 위한 약학적 조성물로 더욱 특화시켜 제조 및 이용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 특히 항원제시세포의 성숙화를 효과적으로 유도할 수 있으며, 나아가 T 세포, 예를 들어 세포독성 CD8+ T 세포(cytotoxic CD8+ T-cell)의 활성화를 촉진할 수 있어, 효과적인 면역치료 기반 약학적 조성물로 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생체 내에 유입될 수 있는 모든 제형으로 제조될 수 있으며, 모든 투여방식에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 종래 주사기반 투여방식의 문제점을 해결하기 위하여, 특히 점막 점착, 흡착, 고정 및 침착 능력이 우수한 나노입자로 개발되었으며, 이에 점막에 대한 투여, 특히 구강 또는 비강 점막에 용이하게 투여될 수 있도록 제형화될 수 있다. 또한 보다 간편하고 효과적으로 약물이 전달 및 흡수될 수 있도록 구강 분무용 스프레이 제형으로 제조될 수 있다. 상기 분무용 제형을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야 또는 관련분야에서 사용하는 방식에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 구체예로서,
a) 항원 및 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 수용액과, PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide))를 포함하는 유기용액을 혼합하는 단계; 및
b) 상기 혼합물에 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol; PVA)에 아미노기가 도입된 PVA-NH2 및 카복실기(carboxyl group; -COOH)가 도입된 점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)가 서로 화학적으로 결합된 화합물을 혼합하는 단계; 를 포함하는, PLGA 나노입자의 표면에 점막점착성 고분자가 결합된, 점막점착성-PLGA 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 점막점착성-PLGA 나노입자는 water-in-oil-in-water (w/o/w)의 2차 에멀젼 형태로서, 1차 수상(water phase)에 항원 및 어쥬번트를, 유기용매인 오일상(oil phase)에 PLGA를 각각 용해한 후 혼합하여 1차 에멀젼을 형성하고, 상기 1차 에멀젼에 또 다른 2차 수상(water phase)인 폴리비닐알콜 및 점막점착성 고분자가 결합된 화합물의 수용액을 혼합하여 2차 에멀젼을 형성한 후, 상기 형성된 2차 에멀젼의 오일을 증발시키는 방식으로 나노입자를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 구체예로서,
a) 항원 및 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 수용액과, PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide))를 포함하는 유기용액을 혼합하는 단계; 및
b) 상기 혼합물에, 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol; PVA)에 아미노기가 도입된 PVA-NH2 및 3,4-디히드록시히드로신남산(3,4-Dihyroxyhydrocinnamic acid; CAT-COOH)이 서로 화학적으로 결합된 화합물(PVA-CAT)을 혼합하는 단계; 를 포함하는, PLGA 나노입자의 표면에 카테콜(catechol; CAT)이 결합된 CAT-PLGA 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 CAT-PLGA 나노입자는 water-in-oil-in-water (w/o/w)의 2차 에멀젼 형태로서, 1차 수상(water phase)에 항원 및 어쥬번트를, 유기용매인 오일상(oil phase)에 PLGA를 각각 용해한 후 혼합하여 1차 에멀젼을 형성하고, 상기 1차 에멀젼에 또 다른 2차 수상(water phase)인 폴리비닐알콜-카테콜(PVA-CAT) 수용액을 혼합하여 2차 에멀젼을 형성한 후, 상기 형성된 2차 에멀젼의 오일을 증발시키는 방식으로 나노입자를 제조할 수 있다.
PLGA 나노입자의 에멀젼 제형 제조 시, 2차 수상으로서 일반적인 PVA를 사용하여 제조된 PLGA 나노입자의 경우, 점막 수분에 의해 나노입자가 변형되어 내부에 탑재된 약물이 유실될 수 있으며, 점막과의 점착력이 매우 약하여 나노입자가 점막에 고정되지 못하고 소화기 등으로 전달되는 등의 문제가 있다. 이와 달리, 본 발명의 나노입자는 2차 수상으로서 점막점착성 고분자(예를 들어, CAT)와 PVA가 화학적으로 결합된 PVA-점막점착성 고분자(예를 들어, PVA-CAT)를 사용하여, 표면에 점막점착성 고분자가 결합된 점막점착성-PLGA 나노입자를 제조함으로써, 점막 수분 등에 의한 나노입자의 변형을 방지하여 나노입자에 탑재된 약물의 유실을 방지함과 동시에, 나노입자의 점막에 대한 점착력을 강화시켜 나노입자가 점막에 효과적으로 점착, 고정 및 침착됨으로써, 약물의 유실을 방지하여 세포에 효과적으로 전달되도록 하는 이점이 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 CAT와 PVA가 화학적으로 결합된 PVA-CAT를 제조하는 방법 및 과정에 대한 화학반응식은 다음과 같다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 PVA-CAT를 제조하는 방법은 다음과 같다:
카르보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole, CDI) 및 에틸렌디아민(ethylenediamine, EDA)를 사용하여 PVA를 변형하여 PVA-NH2를 제조하였다. 구체적으로, CDI (74 mg)를 포함하는 DMSO (60 mL)를 PVA (400 mg)에 첨가한 다음, 24℃에서 4시간 동안 교반하였다. 그 다음, 미반응 시약을 제거하기 위해 부탄올에 침전시킨 후 CDI-활성화된 PVA (CDI-PVA)를 수득한 후, CDI-PVA를 진공 오븐에서 건조시켰다. 그 다음, CDI-PVA (400 mg) 및 EDA (4 g)을 DMSO 100 mL에 녹인 후, 50℃에서 48시간 동안 교반한 다음, 진공 오븐에서 건조시켰다. 두 번째 단계에서, N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸 카르보디이미드염산염(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride, EDC)를 사용하여 CAT-COOH를 PVA-NH2와 접합하였다. 구체적으로, NHS (68 mg) 및 EDC (108 mg)를 CAT-COOH 용액(37.3 mg/mL)에 첨가한 다음, 그 혼합물을 24℃에서 4시간 동안 교반하였다. 그 다음, PVA-NH2 (400 mg)를 상기 혼합물에 첨가하고 24℃에서 24시간 동안 추가로 교반하였다. 그 다음, 투석막(cut off Mw000)을 이용하여 CAT-표지된 PVA (PVA-CAT)를 분리한 후 동결건조하여 PVA-CAT를 수득하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 PVA-CAT를 이용하여 본 발명의 CAT-PLGA 나노입자를 제조하는 방법은 다음과 같다:
항원으로서 1 mg의 E7 및 어쥬번트로서 2 mg의 poly I:C를 200 μL의 탈이온수에 용해시킨 다음, 이를 4℃에서 30초(각각 3초 간격으로 5초 동안 6 펄스) 조건으로 프로브-타입 초음파 분쇄기(probe-type sonicator)(SONICS, Newtown, CT, USA)를 이용하여 PLGA (20 mg/ml)을 포함하는 2 mL의 클로로포름 용액과 혼합하였다. 상기 1차 에멀젼을 2차 수상(water phase)(10 mL의 1.0% w/v PVA-CAT)과 4℃에서 5분 동안 초음파 처리하여 2차(w/o/w) 에멀젼을 형성하였다. 10분 동안 증발기(evaporator)를 사용하여 클로로포름을 완전히 증발시킨 후, CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP를 15,800 × g에서 30분 동안 원심분리하여 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP를 제조하였다.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 용어들은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 해석한다. 또한, 본 발명에 기재된 “또는” 이라는 표현은 별도의 언급이 없는 경우, “및"을 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 개시되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한되지 않으며, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시되는 다양한 요소들의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다. 또한, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험을 통하여 본 발명의 특정 실시예에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있으며, 이러한 등가물은 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다.
본 발명은 점막점착성 나노입자를 이용한 비주사형 약물전달 시스템에 관한 것으로, 본 발명은 나노입자 표면에 점막점착성 고분자(mucoadhesive polymer)를 결합시킴으로써, 점막 수분 등에 의한 나노입자의 변형을 방지하여 나노입자에 탑재된 약물의 유실을 방지함과 동시에, 나노입자의 점막에 대한 점착력을 강화시켜 나노입자가 점막에 효과적으로 점착, 고정 및 침착됨으로써, 약물의 유실을 방지하여 세포에 효과적으로 전달되는 이점이 있다. 또한, 본 발명은 상기 나노입자 내부에 항원을 탑재하는 경우, 생체 내 또는 세포 내로 효과적으로 전달하여 항원제시세포 성숙화용 조성물, 감염성 질환 치료용 조성물 및 암 치료용 조성물로 다양하게 활용할 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명은 상기 나노입자에 수지상 세포(Dendritic Cell, DC)를 비롯한 항원제시세포 기반 암치료 면역요법을 위한 면역활성물질(항원 및 어쥬번트 등)을 탑재함으로써, 항원특이적 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포) 활성화를 통한 암치료 면역요법에 활용할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 스프레이-타입 CAT-PLGA-NP의 약물 전달 및 암 치료 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 화학적 변형(chemical modification)에 의한 PVA-CAT 접합(conjugation) 과정을 나타낸 화학반응식(도 2A) 및 1H-NMR 분석 결과(도 2B)를 나타낸 것이다.
도 3은 FT-IR에 의한 PVA-CAT 접합 분석 결과를 나타낸 것으로, ①은 CAT-COOH의 벤젠 방향족 고리를 나타내며, ②는 PVA-CAT의 아미드 Ⅰ 밴드를 나타낸다.
도 4는 CAT-PLGA-NP의 물리화학적 특성을 나타낸 모식도, 그래프 및 사진이다. 구체적으로, 도 4A는 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP 제조 과정을 나타낸 모식도이다. 도 4B는 CAT-PLGA NP의 크기 및 제타 전위를 입자 크기 분석기를 사용하여 레이저 광 산란에 의해 측정한 결과를 나타낸 것이다. poly I:C 및 E7의 CAT-PLGA-NP에의 탑재 효율은 각각 Nanodrop(흡광도: 260 nm) 및 BCA 단백질 분석에 의해 측정되었다. 도 4C는 분무 후 CAT-PLGA-NP의 크기 및 제타 전위, 분무 후 poly I:C 및 E7의 PLGA-NP 및 CAT-PLGA-NP에의 탑재 효율 측정 결과를 나태낸 것이다. 도 4D는 CAT-PLGA-NP의 형태를 FE-SEM (scale bar: 500 nm)에 의해 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4E는 37℃ 및 50 RPM 조건하에, CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP에서의 E7의 누적 방출 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 4F는 CAT PLGA-NP에 대한 뮤신 흡착을 263 nm에서 UV-vis 분광광도계로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 상기 데이터는 평균 ± S.D (n=3)로 표시된다(*p < 0.001).
도 5는 분무 전후의 CAT-PLGA-NP의 크기 분포를 입도 분석기(particle analyzer)를 이용한 레이저 산란에 의해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 CAT-PLGA-NP의 DC로의 결합 및 세포내 전달, 및 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP에 의해 유도되는 DC의 성숙을 측정한 그래프 및 사진이다. 구체적으로, 도 6A는 유세포 분석을 이용하여 DC에 대한 CAT PLGA-NP의 결합을 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 6B는 공초점 현미경(배율: ×200, 스케일 바: 20 μm)을 이용하여 DC에 대한 CAT-PLGA NP의 세포내 전달을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(*p < 0.001).
도 7은 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP에 의해 유도된 DC의 성숙 및 사이토카인 생성을 측정한 그래프이다. 구체적으로 도 7A는 표면 마커(CD40, CD80, CD86)의 수준을 유세포 분석으로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 7B는 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP와 함께 배양된 DC의 배양 상청액내 전염증성 사이토카인 및 DC 활성화 인자를 ELISA를 이용해 정량화한 결과를 나타낸 것이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(*p < 0.001, **p < 0.05).
도 8은 CAT-PLGA-NP 분사 후 마우스의 in-vivo 형광 이미지를 IVIS를 이용해 모니터링한 결과를 나타낸 것이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(*p < 0.01).
도 9는 쥐과 동물(Murine) 구강 점막에 대한 CAT-PLGA-NP의 점착에 대한 결과를 나타낸 것이다(배율: ×200, 스케일 바: 100 ㎛).
도 10은 TC-1 종양 혀 모델에서 CAT-PLGA-NP의 치료 효능을 나타낸 것이다. 구체적으로, PLGA(E7 + poly I:C)-NP 및 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP를 사용한 치료는 C57BL6 마우스 혀에 TC-1 종양 세포를 주사한 지 3주 후에 시작하였다. PLGA(E7 + poly I:C)-NP 및 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP를 50 ㎍ E7 및 poly I:C의 용량으로 매주 1회 분무하였다. 도 10A는 치료를 위한 실험 일정, 도 10B는 혀 무게 그래프, 도 10C는 혀 및 종양 무게 사진, 도 10D는 마우스 체중을 나타낸 그래프이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다(*p < 0.001, **p < 0.01, ***p < 0.05).
도 11은 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여, 혀, 하악 림프절 및 비장 세포에서의 세포독성 IFN-γ+CD8+ T 세포를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 *p < 0.001, **p < 0.01, ***p < 0.05).
도 12는 혀의 H&E 염색 및 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 세포 증식 마커(Ki67)의 면역 조직화학 분석 및 미세혈관 밀도(MVD, CD31), TUNEL 및 CD8+ T 세포 침윤의 측정은 마우스 혀 조직을 이용하여 수행하였다(H&E 스케일 바: 500 μm), (스케일 바: 25μm). 오차 막대는 SEM을 나타낸다(*p < 0.001, **p < 0.01, ***p < 0.05).
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시에 불과하며, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 어떠한 의미로든 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
[재료]
폴리(d,l-락티드-코-글리콜리드)(Poly(d,l-lactide-co-glycolide), PLGA, Resomer® RG502H, 50:50 단량체 비율, MW 10-12 kDa), 폴리비닐알코올(PVA, MW 9-10 kDa), 3,4-디히드록시히드로신남산(3,4-Dihyroxyhydrocinnamic acid, CAT-COOH), 카르보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole, CDI), 에틸렌디아민(ethylenediamine, EDA), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸 카르보디이미드염산염(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride, EDC), 돼지 위 유래 타입 Ⅱ 뮤신, 및 폴리이노신-폴리시티딜산나트륨염(polyinosinic-polycytidylic acid sodium salt, poly I:C)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)는 Biosesang (Bundang, Korea)로부터 구입하였다. E7 펩티드 (TNYLFSPNGPIARAW)는 Anygen (Gwangju, Korea)으로부터 구입하였다. 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)은 Welgene (Gyeongsan, Korea)으로부터 구입하였다. RPMI 1640 배지는 Biowest (Nuaille, France)로부터 구입하였다. Hoechst 33342는 Invitrogen (Carisbad, CA, USA)로부터 구입하였다. Cy5.5-NHS는 Lumiprobe (Hunt valley, MD, USA)로부터 구입하였다. FITC-표지된(labeled) 항(anti)-마우스 CD11c, PE-표지된 항-마우스 CD40, CD80, 및 CD86은Biolegend (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. FITC-표지된 항-마우스 IFN-γ, 및 마우스 TNF-α, IL-6 및 IL-1β ELISA Ready-SET-Go kit는 eBioscience (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. APC-접합된(conjugated) 항-CD8a는 Invitrogen (Waltham, MA, USA)로부터 구입하였다. 상기 모든 재료는 분석 등급(analytical grade)이며, 추가 정제없이 사용하였다.
[실시예]
실시예 1: PVA 접합 CAT의 화학적 변형
CDI 및 EDA를 사용하여 PVA를 변형하여 PVA-NH2를 제조하였다. 구체적으로, CDI (74 mg)를 포함하는 DMSO (60 mL)를 PVA (400 mg)에 첨가한 다음, 24℃에서 4시간 동안 교반하였다. 그 다음, 미반응 시약을 제거하기 위해 부탄올에 침전시킨 후 CDI-활성화된 PVA (CDI-PVA)를 수득한 후, CDI-PVA를 진공 오븐에서 건조시켰다. 그 다음, CDI-PVA (400 mg) 및 EDA (4 g)을 DMSO 100 mL에 녹인 후, 50℃에서 48시간 동안 교반한 다음, 진공 오븐에서 건조시켰다.
두 번째 단계에서, NHS 및 EDC를 사용하여 CAT-COOH를 PVA-NH2와 접합하였다. 구체적으로, NHS (68 mg) 및 EDC (108 mg)를 CAT-COOH 용액(37.3 mg/mL)에 첨가한 다음, 그 혼합물을 24℃에서 4시간 동안 교반하였다. 그 다음, PVA-NH2 (400 mg)를 상기 혼합물에 첨가하고 24℃에서 24시간 동안 추가로 교반하였다. 그 다음, 투석막(cut off Mw000)을 이용하여 CAT-표지된 PVA (PVA-CAT)를 분리한 후 동결건조하여 PVA-CAT를 수득하였다.
상기에 따른 PVA-CAT의 형성은 1H-NMR (500 MHz, HRMAS-FT NMR, Billerica, MA, USA) 및 푸리에 변환 적외선(FT-IR)(Nicolet 5700, Thermo, Waltham, MA, USA)을 통해 확인하였다.
실시예 2: 카테콜이 결합된 PLGA 나노입자(CAT-PLGA-NP)의 제조
PLGA(E7 + poly I:C)-NP는 항원으로서 E7, 어쥬번트(adjuvant)로서 poly I:C를 포함하는 PLGA 나노입자를 의미하는 것으로, w/o/w (water-in-oil-in-water) 증발 방법으로 제조하였다. 구체적으로, 1 mg의 E7 및 2 mg의 poly I:C를 200 μL의 탈이온수에 용해시킨 다음, 이를 4℃에서 30초(각각 3초 간격으로 5초 동안 6 펄스) 조건으로 프로브-타입 초음파 분쇄기(probe-type sonicator)(SONICS, Newtown, CT, USA)를 이용하여 PLGA (20 mg/ml)을 포함하는 2 mL의 클로로포름 용액과 혼합하였다. 상기 1차 에멀젼을 2차 수상(water phase)(10 mL의 1.0% w/v PVA)과 4℃에서 5분 동안 초음파 처리하여 2차(w/o/w) 에멀젼을 형성하였다. 10분 동안 증발기(evaporator)를 사용하여 클로로포름을 완전히 증발시킨 후, PLGA(E7 + poly I:C)-NP를 15,800 × g에서 30분 동안 원심분리하여 3회 세척한 다음, 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP의 제조는 상기 PLGA(E7 + poly I:C)-NP의 제조 절차와 동일하되, PVA-CAT을 2차 수상으로 사용하여 제조하였다.
CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP의 크기 및 제타 전위는 전기영동 광산란 광도계(electrophoretic light scattering photometer)(SZ-100, HORIBA, Kyoto, Japan)를 사용하여 동적 광산란에 의해 측정하였다. E7의 로딩 효율은 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였으며, poly I:C는 260 nm에서 NanoDrop1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. PLGA-NP 및 CAT PLGA-NP의 스프레이 전후의 형태 확인은 전계방출주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM)(SU8000, HITACHI, Tokyo, Japan)를 이용하여 확인하였다.
실시예 3: CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP로부터의 E7의 방출
CAT-PLGA (E7 + poly I:C)-NP를 마이크로튜브에 첨가한 다음, 정해진 시간 동안 수조에 두었다, 그 다음, 마이크로튜브를 15,800 × g에서 60분 동안 원심분리하고 상층액을 수집하여 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP에서 E7의 누적 방출을 측정하였다. 방출된 E7의 양은 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였다.
실시예 4: CAT-PLGA-NP에 의한 뮤신 흡착
CAT-PLGA-NP의 뮤신 흡착을 확인하기 위하여 뮤신 및 CAT-PLGA-NP 혼합물을 다양한 혼합비(mucin:NP w/w, 1:0.25, 1:1, 1:4)로 제조하였다. 상기 혼합물을 15,800 × g에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 모아 UV-vis 분광광도계로 263 nm에서 비흡착 뮤신을 측정하였다.
실시예 5: 마우스 및 세포주의 준비
암컷 C57BL/6 마우스(5-6주령)는 ORIENT(Gapyeong, Korea)에서 구입하였다. 모든 마우스는 건국대학교 동물병원 동물관리위원회(Ref. No.: KU20214)에서 건국대학교의 특정 병원균이 없는 주거 시설의 적절한 사용 및 관리를 위해 승인된 프로토콜에 따라 유지되었다.
TC-1 세포(HPV16 타입 HPV E6 및 E7 단백질 발현)를 0.1% 젠타마이신 및 10% 소태아혈청(Biowest, Nuaille, France)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. DC는 C57BL/6 마우스의 골수로부터 수득하였으며, 0.1% 젠타마이신, 10% FBS 및 20 ng/mL 마우스 재조합 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
실시예 6: CAT-PLGA-NP의 결합 및 세포내 전달
CAT-PLGA-NP의 결합 및 세포내 전달을 확인하기에 앞서, 형광 염료 Cy5.5를 CAT-PLGA-NP에 모델 약물로 탑재하였다. CAT-PLGA-NP의 결합 효율을 측정하기 위하여 DC를 37℃에서 각각 5분 및 30분 동안 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP와 함께 배양하였다. 배양 후 DC를 PBS를 사용하여 세척한 다음, FITC로 표지된 항-CD11c로 염색하고 유세포 분석기(flow cytometry)(BD Facscalibur with CELLQuest software, BD biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다. 공초점 현미경 검사(confocal microscopy)의 경우, DC를 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP와 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, DC를 24℃에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(w/v)로 고정하고 PBS에서 1μM Sytox® green (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)으로 10분 동안 염색하였다. DC에서 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 세포 내 전달은 공초점 현미경(LSM 710, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용해 관찰하였다.
실시예 7: DC 성숙 및 사이토카인 생성
DC를 웰 당 5 × 106 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에서 배양하였다. DC 단독 대조군으로, poly I:C (50μg), CAT-PLGA-NP, PLGA(E7 + poly I:C)-NP (각각, E7 및 poly I:C 50μg) 및 CAT-PLGA (E7 + poly I:C)-NPs (각각, 50 μg의 E7 및 poly I:C)를 30분 동안 배양한 후, PLGA-NP를 포함하는 배지를 제거하였다. DC를 24시간 동안 추가로 배양하고 FITC-항-CD11c, PE-항-CD40, PE-항-CD80 및 PE-항-CD86으로 염색하였다. DC의 성숙은 유세포 분석을 이용하여 측정하였으며, DC로부터 분비되는 사이토카인(TNF-α, IL-6 및 IL-1β)은 사이토카인-특이적 ELISA 키트(eBioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 확인하였다.
실시예 8: 마우스 구강 점막에 대한 CAT-PLGA-NP의 점착
CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 점막 점착을 평가하기 위하여, C57BL/6 마우스의 구강 점막에 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP를 분무하였다. CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 형광 신호는 생체 내 이미징 시스템(IVIS, 여기(excitation): 630 nm, 방출: 710 nm)을 사용하여 모니터링하였다. CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 점착 효과에 대한 추가 평가를 위하여, 구강 점막 조직을 사용하여 면역조직화학(IHC) 분석을 수행하였다. CAT-PLGA(Cy5.5)-NP를 구강 점막 조직층에 분사하고 30분 인큐베이션 후 점막 조직을 즉시 PBS로 2회 세척하였다. 조직은 최적 절단 온도 화합물(optimum cutting temperature compound, OCT)(Tissue Tek, Torrance, CA, USA)을 사용하여 고정하였다. IHC 분석을 수행하기 위하여 조직 슬라이드를 Hoechst 33342로 염색하고 형광 현미경(BX61-32FDIC, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다. 또한 조직을 H&E (hematoxylin and eosin, Leica biosystems, Buffalo, IL, USA)로 대조염색하고 현미경(Eclipse NI, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다.
실시예 9: CAT-PLGA-NP의 치료 효능
종양을 생성하기 위하여, TC-1 세포(25 μL HBSS 내 4 × 104 세포)를 C57BL/6 마우스의 혀에 주입하였다(그룹당 n = 5). 치료 효능을 평가하기 위하여, 종양 세포를 마우스에 주사한 지 3일 후에 백신 접종을 시작하였다. 세 그룹의 쥐, (1) 대조군(음성) (2) 대조군, (3) PLGA(E7 + poly I:C)-NP, 및 (4) CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP (각각, 50μg의 E7 및 poly I:C)에 주 1회 총 3회 백신 접종을 하고, 혀 무게 및 마우스 무게를 기록하였다. 또한, 세포독성 CD8+ T 세포의 활성화를 확인하기 위하여, 마우스로부터 혀, 하악 림프절(mandibular lymph node) 및 비장 세포를 채취하였다. 상기 조직에서 분리된 세포를 FBS 10%, 젠타마이신 0.1%, β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 1.0%를 함유하는 1 mL의 RPMI 1640에 재현탁하고, GolgiPlug (BD Biosciences, San Diego, CA, 미국) 및 E7 (1μg/mL)과 함께 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 세포를 세척하고 APC-항-CD8a 및 FITC-항-IFN-γ로 염색하여 유세포 분석을 사용하여 IFN-γ+CD8+ T 세포를 확인하였다. H&E 분석, 세포 증식(anti Ki67, Abcam, Cambridge, UK), 미세 혈관 밀도(MVD, 항-CD31, Abcam Cambridge, UK), 세포자멸사(TUNEL, Trevigen, Gaithersbug, MD, USA) 및 CD8+ T 세포 집단(항-CD8, Biolegend, San Diego, CA, USA)에 대한 IHC 분석은 마우스로부터 분리한 혀 조직을 사용하여 수행하였다. 염색된 조직은 명-시야 현미경(bright-field microscope) 및 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 분석은 각 슬라이드의 임의 필드(×400 배율에서 5개의 임의 필드)에 기록되었다.
[통계분석]
연속 변수의 차이는 두 그룹을 비교하기 위하여 student's t-test를 사용하여 분석하였으며, 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 여러 그룹 간의 차이를 비교하였다. 본 실시예의 모든 p 값 <0.05은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
[실험결과]
실험결과 1: 구강암에 있어서, 분무 가능한 CAT-PLGA-NP을 이용한 종양-특이적 항원 전달에 의한 수지상 세포(DC) 기반 항암 면역 반응 유도
본 발명자들은 스프레이 타입의 점막 고정-침착형 나노입자전달체인 CAT-PLGA-NP을 설계 및 제조하여, 주사 거부 반응을 느끼는 구강암 환자 등에 있어서 종양 특이적 항원을 DC에 간단하고 쉽게 전달함으로써, DC-기반 면역 반응을 효과적으로 유도하였다.
실험결과 2: PVA 접합 CAT의 화학적 변형
CAT-PLGA-NP를 제조하기에 앞서, CAT-COOH 및 PVA-NH2를 화학적 변형에 의해 접합하였다(도 2A). PVA-CAT의 접합은 (1) CAT-COOH의 OH (방향족 C-OH), (2) CAT-COOH의 CH2 (메틸렌) 및 (3) PVA의 CH2 (메틸렌)의 1H-NMR 스펙트럼에 의해 측정되었다(도 2B). 또한, PVA-CAT는 FT-IR을 이용하여 확인하였다(도 3). CAT-COOH 및 PVA-CAT의 1470 cm-1 ~ 1622 cm-1 사이의 흡수 피크는 방향족 고리 C=C 진동 밴드(벤젠 방향족 고리)에 기인한다. 특히, PVA-CAT에서 아미드 I 밴드의 뻗침(stretching) C=O 진동 연결 1643 cm-1 피크는 CAT 및 PVA가 CAT의 COOH 및 PVA의 NH2와 잘 접합되었음을 나타낸다.
실험결과 3: CAT-PLGA-NP의 물리적 특성
도 4A와 같이 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP를 제조하였다. PLGA-NP 및 CAT-PLGA-NP의 크기는 약 200 nm에 해당하였다(도 4B). 제타 전위는 약 -70 mV, poly I:C 및 E7의 탑재 효율은 각각 35% (poly I:C) 및 70% (E7)로 확인되었다(도 4B). 또한, 분무된 PLGA-NP 및 CAT-PLGA-NP는 "분무 전" 조건(도 4C)과 비교하여 차이를 나타내지 않았으며, 크기 분포의 차이를 나타내지 않았다(도 5). PLGA-NP 및 CAT-PLGA-NP의 형태는 FE-SEM에 의해 측정되었다(도 4D). 분무 전과 후의 CAT-PLGA-NP의 형상은 구형이었으며, 분무 후 형상의 변화는 없었다. 이러한 결과는 CAT-PLGA-NP가 스프레이 타입의 제형으로 적합함을 시사한다. 다음으로 CAT-PLGA-NP에서 E7의 방출을 확인하였다(도 4E). PLGA-NP 및 CAT-PLGA-NP로부터의 E7의 누적 방출 양상은 유사하였으며, 8시간 이내에 버스트 방출이 관찰되었다.
뮤신은 점막에서 중요한 당단백질이며 점막 구조를 담당한다. 이에 CAT-PLGA-NP의 흡착 효과를 확인하였다. 뮤신은 CAT 비-표지 PLGA-NP와 비교하여 CAT-PLGA-NP의 양이 증가함에 따라 CAT-PLGA-NP의 표면에 상당히 우수하게 흡착되었다(도 4F).
실험결과 4: CAT-PLGA-NP의 결합 및 세포내 전달
DC에 대한 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 결합을 유세포 분석을 사용하여 측정하였으며, PLGA(Cy5.5)-NP와 비교하여 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP이 더 높은 결합 효율을 나타내는 것으로 확인되었다(도 6A). 또한, CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 세포내 전달을 공초점 현미경을 이용해 측정하였다. CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 상대적인 형광 강도는 PLGA(Cy5.5)-NP 보다 높은 것으로 확인되었다(도 6B). 이러한 결과는 CAT 라벨링에 의해 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP가 PLGA(Cy5.5)-NP와 비교하여 DC에 대한 결합 및 세포내 전달에 더 적합함을 시사한다.
실험결과 5: CAT-PLGA-NP에 의해 유도된 DC의 성숙 및 사이토카인 생성
DC의 세포 표면 마커를 유세포 분석을 이용하여 측정하였다. CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP로 처리된 DC는 다른 그룹과 비교하여 CD40, CD80 및 CD86이 상당히 증가한 것으로 나타났다(도 7A). 특히 대조군, poly I:C군, CAT-PLGA-NP군과 유의한 차이를 확인하였다. 또한, 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β)이 다른 군에 비해 상당히 증가하였다(도 7B).
실험결과 6: 마우스 구강 점막에 대한 CAT-PLGA-NP의 점착
CAT-PLGA-NP의 구강 점막층에 대한 점착성을 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스의 구강 점막층에 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP를 분사하고 IVIS로 형광 강도(fluorescence intensity)를 확인하였다. 점막층에서의 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 형광 강도는 PLGA(Cy5.5)-NP 보다 더 오래 4시간 동안 유지되었다(도 8). 또한 C57BL/6 마우스로부터 구강 점막층을 분리한 후, 점막층에 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP를 분무하였다. CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 점착 특성을 형광 현미경을 이용해 확인한 결과, PLGA(Cy5.5)-NP에 비해 CAT-PLGA(Cy5.5)-NP의 점착 효과가 우수하였다(도 9).
실험결과 7: CAT-PLGA-NP의 치료적 효능
HPV 16 E6 및 E7 단백질을 발현하는 TC-1 세포는 암 면역 요법을 위한 종양 모델로 일반적으로 사용된다. 이에 CAT-PLGA-NP의 치료적 효능을 측정하기 위하여, TC-1 혀 종양 모델을 개발하였다. 마우스 혀 종양 모델을 제조하기 위하여, TC-1 세포(4 Х 104 세포/마우스)를 C57BL/6 마우스(그룹당 n=5)의 혀에 주입하였다. C57BL/6 마우스에 종양 세포를 주입한 지 3일 후에 백신 접종을 시작하였다: (1) 대조군(음성) (2) 대조군, (3) PLGA(E7 + poly I:C)-NP, 및 (4) CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP (도 10A). CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP 그룹은 대조군(56%, p < 0.001) 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP (30%, p < 0.01)에 비해 종양 성장의 유의한 억제를 나타내었다(도 10B 및 C). 그러나, CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP 그룹은 대조군(음성) 그룹과 비교하여, 혀의 무게 및 종양의 무게에서 있어서 작은 차이를 나타내었다(도 10B 및 C).
상기 결과를 바탕으로, 백신 접종 그룹의 체중을 확인하였다(도 10D). CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP는 일관성을 보인 반면, 대조군(p < 0.01)과 PLGA(E7 + poly I:C)-NP (p < 0.05)는 체중 감소를 나타내었다. 이는, 대조군 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP 그룹의 마우스는 혀의 종양 성장으로 인해 음식물 섭취에 어려움을 겪었기 때문이다(도 10D). CD8+ T 세포 활성화를 평가하기 위하여 혀, 하악 림프절 및 비장 세포에서 IFN-γ+CD8+ T 세포 집단을 확인하였다. CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP는 IFN-γ+CD8+ T 세포의 수가 대조군 및 PLGA(E7 + poly I:C)에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났으며, 구체적으로 혀 조직에서는 대조군(p < 0.001) 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP (p < 0.01), 하악 림프절에서는 대조군(p < 0.001) 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP (p < 0.05), 비장에서는 대조군(p < 0.001) 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP (p < 0.01)로 나타났다(도 11).
대조군 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP는 CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP와 비교하여 H&E 염색 분석에 의해 혀 조직에서 종양이 큰 부분을 차지함을 보여주었다(도 12). 또한 IHC 분석을 사용하여 세포 증식(ki67), 미세혈관 밀도(MVD, CD31), 세포자멸사(TUNEL) 및 CD8+ T 세포의 마커에 대한 종양을 분석하였다. CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP는 대조군(p < 0.01) 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP (p < 0.05)에 비해 세포 증식의 현저한 억제, 미세혈관 밀도 감소, 세포자멸사 세포 수의 증가를 나타내었다(도 12). 또한, CAT-PLGA(E7 + poly I:C)-NP 그룹의 혀 조직에서의 CD8+ T 세포의 수는 대조군(p < 0.001) 및 PLGA(E7 + poly I:C)-NP에 비해 증가하였다(p < 0.01) (도 12).
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (14)

  1. PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide)) 나노입자의 표면에 카테콜(catechol; CAT)이 결합되고, 상기 나노입자의 내부에 항원으로서 E6 또는 E7 단백질; 및 어쥬번트(adjuvant)로서 poly I:C가 포함된, 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 항원제시세포(Antigen-presenting cells; APC)의 성숙화(maturation)를 유도하여, 항원에 특이적인 세포 독성 T 세포를 활성화(activation) 시키는 효능을 갖는 것인, 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항원제시세포는 수지상 세포(dendritic cell)인 것인, 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 전염증성 사이토카인을 증가시키는 활성을 갖는 것인, 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 구강 또는 비강 내 분무용인 것인, 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자.
  11. 제1항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 구강암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 구강 또는 비강 내 분무용인 것인, 구강암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. a) 항원으로서 E6 또는 E7; 및 어쥬번트(adjuvant)로서 poly I:C를 포함하는 수용액과, PLGA (Poly(D,L-lactide-co-glycolide))를 포함하는 유기용액을 혼합하는 단계; 및
    b) 상기 혼합물에 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol; PVA)에 아미노기가 도입된 PVA-NH2 및 3,4-디히드록시히드로신남산(3,4-Dihyroxyhydrocinnamic acid; CAT-COOH)이 서로 화학적으로 결합된 화합물(PVA-CAT)을 혼합하는 단계; 를 포함하는, PLGA 나노입자의 표면에 카테콜(catechol; CAT)이 결합된 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자의 제조방법.
  14. 제13항에 따른 제조방법으로 제조한 구강 또는 비강 점막점착성 CAT-PLGA 나노입자.
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